JP2015500002A - 抗体を精製する方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】抗体を精製する方法に関する。【解決手段】本発明は、概して、個々の鎖の等電点（複数可）を調節することにより、所望のヘテロ二量体と混入するホモ二量体免疫グロブリン変異体との混合物から所望の種を精製するための組成物および方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／５４５，４９８号、および２０１２年２月１４日に出願された同第６１／５９８，６８６号、および２０１２年２月１日に出願された同第６１／５９３，８４６号の利益を主張するものであり、また、２０１２年８月６日に出願された米国特許出願第１３／５６８，０２８の一部継続出願でもある（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。
等電点を調節することによって、混入するホモ二量体抗体変異体から所望のヘテロ二量体種を精製するための方法を提供する。
抗体は、特定の抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物において、抗体は、対になった重鎖および軽鎖のポリペプチドから構築される。各鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインで構成され、したがって、そのようなタンパク質には免疫グロブリンという一般名称が用いられる。各鎖は、可変領域および定常領域と称される２つの異なる領域で構成される。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗体間で顕著な配列多様性を示し、標的抗原の結合に関与する。定常領域は、それほど高い配列多様性は示さず、重要な生化学的事象を誘発する多数の天然タンパク質の結合に関与する。ヒトには、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ならびにＩｇＭを含む、５つの異なるクラスの抗体が存在する。これらの抗体クラス間の顕著な特徴はそれらの定常領域であるが、Ｖ領域にさらに微妙な相違が存在し得る。ＩｇＧ抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖からなる四量体タンパク質である。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、それぞれ、重鎖可変ドメイン、重鎖定常ドメイン１、重鎖定常ドメイン２、および重鎖定常ドメイン３を意味するＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順に連結された４つの免疫グロブリンドメインからなる（それぞれ、重鎖可変ドメイン、γ１定常ドメイン、γ２定常ドメイン、およびγ３定常ドメインを意味するＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３とも称される）。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、それぞれ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを意味するＶＬ−ＣＬの順に連結された２つの免疫グロブリンドメインからなる。
抗体は、１〜３週間の範囲に及ぶｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を有する。この好ましい特性は、全長分子のサイズが大きいことに起因する腎臓濾過の除外と、抗体のＦｃ領域と新生児型Ｆｃ受容体ＦｃＲｎとの相互作用とによるものである。ＦｃＲｎへの結合により、取り込まれた抗体がエンドソームから血流へと戻され再利用される（Ｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８：７３９−７６６（両方とも、参照により全体が組み込まれる））。
抗体の他の特性によって、そのｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度（例えば、安定性および半減期）が決定され得る。抗体のＦｃＲｎ受容体への結合に加えて、クリアランスおよび半減期に寄与する他の要因は、血清凝集、血清中の酵素分解、免疫系による除去をもたらす抗体の固有の免疫原性、抗原媒介性取り込み、ＦｃＲ（非ＦｃＲｎ）媒介性取り込み、および（例えば、異なる組織コンパートメントにおける）非血清分布である。
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体も、より長い血清半減期を有し得ることが提案された（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２；米国特許出願公開第２０１１／００７６２７５号（両方とも、参照により全体が組み込まれる））。しかしながら、この機序はいまだ十分に理解されておらず、実際のところ、筆者は、可変領域の改変は、Ｆｃ領域の改変の代替であると提案する。さらに、可変領域は、抗体ごとに異なる。そのため、各可変領域は、結合親和性に大きな影響を及ぼすことなく変化させなければならない。
したがって、本出願は、荷電状態が抗体の薬物動態に与える影響を定義し、血清半減期を向上させるための定常領域における新規改変変異体を提供する。
したがって、解決されるべき１つの問題は、定常ドメインを変化させることにより抗体の血清半減期を増加させ、それによって、同じ定常領域を異なる抗原結合配列、例えば、ＣＤＲを含む可変領域とともに使用できるようにし、免疫原性の変化の可能性を最小限に抑えることである。このように、抗体に低いｐＩおよび延長された半減期を有する定常領域変異体を提供することにより、本明細書に記載されるように、抗体の薬物動態特性を向上させるためのよりモジュール的な手法を提供する。さらに、本明細書に概説する方法により、著しい免疫原性を導入することなくｐＩが減少されるように、異なるＩｇＧアイソタイプ由来のｐＩ変異体を組み込むことによって、ｐＩ変異体によってもたらされる免疫原性の可能性が著しく減少される。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含量を有する低ｐＩ定常ドメインの解明であり、例えば、いずれの特定の位置においても、非ヒト残基を最小化すること、または回避することである。
解決されるべきさらなる問題は、トランスフェクションおよび標準的なプロテインＡクロマトグラフィーによる精製の後に得られる混合物から、所望の抗体ヘテロ二量体種を精製することに係るものである。ヘテロ二量体Ｆｃの突然変異（米国特許出願第２０１１／００５４１５１Ａ１号およびＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ ＪＢＣ．２８５（２５）：１９６３７−１９６４６に記載されるような）ならびに「ノブインホール」形態（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．９（７）：６１７−６２１；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７ ＪＭＢ．２７０，２６−３５；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６，６７７−６８１）等のヘテロ二量体抗体を作製するための多くの方法の短所は、これらの形態が相当量の望ましくないホモ二量体の生成をもたらす可能性があり、特に、混入する種は、それらの特性（分子量等）の多くにおいて所望の種とほぼ同一であるため、さらなるかつ困難であることが多い精製ステップを必要とすることである。所望のヘテロ二量体種と混入するホモ二量体種との間の等電点の差が増加するように各鎖を改変することにより、電荷に基づいて精製する方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）による高収率で所望の種を得る簡単な方法を使用して、高収率で所望のヘテロ二量体を得ることができる。
したがって、本発明は、第１および第２の単量体を含むヘテロ二量体タンパク質を含む組成物を提供する。第１の単量体は、第１の変異体重鎖定常領域および第１の融合パートナーを含み、第２の単量体は、第２の変異体重鎖定常領域を第２の融合パートナーとともに含み、第１および第２の変異体重鎖定常領域のｐＩは、少なくとも０．５ｌｏｇ離れている。
いくつかの実施形態において、融合パートナーは、免疫グロブリン成分、ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、免疫受容体、および血液因子からなる群から独立してかつ任意選択的に選択される。好ましい免疫グロブリン成分は、Ｆａｂ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、ｄＡｂ、異なる重鎖可変領域（例えば、より従来的な二重特異性抗体を形成するため）、および異なる一本鎖Ｆｖ領域からなる群から選択されるものを含む。好ましい実施形態において、各単量体は、全長重鎖である。
本発明のさらなる態様は、第１および第２の単量体のｐＩが少なくとも０．５ｌｏｇ離れている。代替として、第１および第２の変異体重鎖定常領域のｐＩは、少なくとも０．５ｌｏｇ離れている。
さらなる態様において、第１および／または第２の単量体にさらなる融合パートナーが加えられる。
追加の態様において、本発明は、Ｑ１９６Ｋ、Ｐ２１７Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｎ２７６Ｋ、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む変異体重鎖定常領域を提供する。さらなる態様において、変異体重鎖定常領域のうちの１つは、Ｓ１１９Ｅ、Ｋ１３３Ｅ、Ｋ１３３Ｑ、Ｒ１３３Ｅ（ＩｇＧ２〜４の場合）、Ｒ１３３Ｑ（ＩｇＧ２〜４の場合）、Ｔ１６４Ｅ、Ｋ２０５Ｅ、Ｋ２０５Ｑ、Ｎ２０８Ｄ、Ｋ２１０Ｅ、Ｋ２１０Ｑ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ３２０Ｅ、Ｋ３２２Ｅ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３３４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４４７の欠失、Ｃ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加、Ｇ１３７Ｅ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２７４Ｑ、Ｒ３５５Ｑ、Ｋ３９２ＮおよびＱ４１９Ｅ、３４９Ａ、３４９Ｃ、３４９Ｅ、３４９Ｉ、３４９Ｋ、３４９Ｓ、３４９Ｔ、３４９Ｗ、３５１Ｅ、３５１Ｋ、３５４Ｃ、３５６Ｋ、３５７Ｋ、３６４Ｃ、３６４Ｄ、３６４Ｅ、３６４Ｆ、３６４Ｇ、３６４Ｈ、３６４Ｒ、３６４Ｔ、３６４Ｙ、３６６Ｄ、３６６Ｋ、３６６Ｓ、３６６Ｗ、３６６Ｙ、３６８Ａ、３６８Ｅ、３６８Ｋ、３６８Ｓ、３７０Ｃ、３７０Ｄ、３７０Ｅ、３７０Ｇ、３７０Ｒ、３７０Ｓ、３７０Ｖ、３９２Ｄ、３９２Ｅ、３９４Ｆ、３９４Ｓ、３９４Ｗ、３９４Ｙ、３９５Ｔ、３９５Ｖ、３９６Ｔ、３９７Ｅ、３９７Ｓ、３９７Ｔ、３９９Ｋ、４０１Ｋ、４０５Ａ、４０５Ｓ、４０７Ｔ、４０７Ｖ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４１１Ｄ、４１１Ｅ、４１１Ｋ、４３９Ｄ、３４９Ｃ／３６４Ｅ、３４９Ｋ／３５１Ｋ、３４９Ｋ／３５１Ｋ／３９４Ｆ、３４９Ｋ／３５４Ｃ、３４９Ｋ／３９４Ｆ、３４９Ｋ／３９４Ｆ／４０１Ｋ、３４９Ｋ／３９４Ｙ、３４９Ｋ／４０１Ｋ、３４９Ｋ／４０５Ａ、３４９Ｔ／３５１Ｅ／４１１Ｅ、３４９Ｔ／３９４Ｆ、３４９Ｔ／３９４Ｆ／４０１Ｋ、３４９Ｔ／３９４Ｆ／４１１Ｅ、３４９Ｔ／４０５Ａ、３４９Ｔ／４１１Ｅ、３５１Ｅ／３６４Ｄ、３５１Ｅ／３６４Ｄ／４０５Ａ、３５１Ｅ／３６４Ｅ、３５１Ｅ／３６６Ｄ、３５１Ｋ／３６４Ｈ／４０１Ｋ、３５１Ｋ／３６６Ｋ、３６４Ｄ／３７０Ｇ、３６４Ｄ／３９４Ｆ、３６４Ｅ／４０５Ａ、３６４Ｅ／４０５Ｓ、３６４Ｅ／４１１Ｅ、３６４Ｅ／４１１Ｅ／４０５Ａ、３６４Ｈ／３９４Ｆ、３６４Ｈ／４０１Ｋ、３６４Ｈ／４０１Ｋ／４０５Ａ、３６４Ｈ／４０５Ａ、３６４Ｈ／４０５Ａ／４１１Ｅ、３６４Ｙ／３７０Ｒ、３７０Ｅ／４１１Ｅ、３７０Ｒ／４１１Ｋ、３９５Ｔ／３９７Ｓ／４０５Ａ、ならびに３９７Ｓ／４０５Ａからなる群から選択される変異体をさらに含む。
追加の態様において、ヘテロ二量体抗体は、変異体軽鎖を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、変異体軽鎖は、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ、Ｃ末端でのＤＥＤＥの付加、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ、およびＱ１９９Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、第１および第２の変異体重鎖定常領域は、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。追加の態様において、それらは、任意選択的なヒンジ領域とともにＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。
さらなる態様において、本発明は、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインから選択される定常ドメインにおける非天然アミノ酸による置換を含む、少なくとも６つのアミノ酸突然変異を導入することにより、抗体の単量体の等電点を調節するための方法を提供し、変異体抗体の前記等電点が少なくとも０．５ｌｏｇ低下するように、置換されたアミノ酸は天然のアミノ酸よりも低いｐＩを有する。場合によっては、重鎖定常ドメインのみを変化させ、場合によっては、軽鎖定常ドメインのみ、また場合によっては、重鎖および軽鎖両方の定常ドメインを突然変異させたアミノ酸を含む。
別の態様において、方法は、１１９位の非天然グルタミン酸；１３１位の非天然システイン；１３３位の非天然アルギニン、リジン、またはグルタミン；１３７位の非天然グルタミン酸；１３８位の非天然セリン；１６４位の非天然グルタミン酸；１９２位の非天然アスパラギン；１９３位の非天然フェニルアラニン、１９６位の非天然リジン、１９９位の非天然スレオニン、２０３位の非天然アスパラギン酸、２０５位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２０８位の非天然アスパラギン酸、２１０位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２１４位の非天然スレオニン、２１７位の非天然アルギニンおよび２１９位の非天然システイン、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはスレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の非天然グルタミン酸、３３９位の非天然スレオニン、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸（ＥＵ番号付け）からなる群から選択されるアミノ酸突然変異による、これらの変異体の生成を提供する。
さらなる態様において、本発明は、変異体抗体の前記等電点が少なくとも０．５ｌｏｇ低下するように、軽鎖定常ドメインに少なくとも２つのアミノ酸突然変異を導入することにより抗体の等電点を調節するための方法を提供し、前記変異体抗体は、１２６位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１４５位の非天然グルタミン、グルタミン酸、またはスレオニン；１５２位の非天然アスパラギン酸、１５６位の非天然グルタミン酸、１６９位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１９９位の非天然グルタミン酸、２０２位の非天然グルタミン酸、および２０７位の非天然グルタミン酸（ＥＵ番号付けを使用）からなる群から選択される置換を含む。
追加の態様において、本発明は、変異体抗体の前記等電点が少なくとも０．５ｌｏｇ低下するように、ａ）重鎖定常ドメインに少なくとも６つのアミノ酸突然変異を導入することであって、前記変異体抗体は、１１９位の非天然グルタミン酸；１３１位の非天然システイン；１３３位の非天然アルギニン、リジン、またはグルタミン；１３７位の非天然グルタミン酸；１３８位の非天然セリン；１６４位の非天然グルタミン酸；１９２位の非天然アスパラギン；１９３位の非天然フェニルアラニン、１９６位の非天然リジン、１９９位の非天然スレオニン、２０３位の非天然アスパラギン酸、２０５位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２０８位の非天然アスパラギン酸、２１０位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２１４位の非天然スレオニン、２１７位の非天然アルギニンおよび２１９位の非天然システイン、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはスレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の非天然グルタミン酸、３３９位の非天然スレオニン、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸からなる群から選択される突然変異を含む、導入することと、ｂ）軽鎖定常ドメインの少なくとも２個の非天然アミノ酸を置換することであって、前記変異体抗体は、１２６位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１４５位の非天然グルタミン、グルタミン酸、またはスレオニン；１５２位の非天然アスパラギン酸、１５６位の非天然グルタミン酸、１６９位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１９９位の非天然グルタミン酸、２０２位の非天然グルタミン酸、および２０７位の非天然グルタミン酸（ＥＵ番号付けを使用）からなる群から選択される置換を含む、置換することによって、抗体の等電点を調節するための方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、変異体重鎖定常ドメインをコードする核酸および／または変異体軽鎖定常ドメインをコードする核酸を含む、抗体をコードする核酸を提供する。また、核酸を含む宿主細胞および抗体を生成する方法も含まれる。
追加の態様において、本発明は、以下の式を有する変異体重鎖定常ドメインを有する抗体を提供する：
Ａ−Ｘ１１９−Ｔ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ−Ｐ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｘ１３１−Ｓ−Ｘ１３３−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｘ１３７−Ｘ１３８−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｃ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｄ−Ｙ−Ｆ−Ｐ−Ｅ−Ｐ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｗ−Ｎ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｘ１６４−Ｓ−Ｇ−Ｖ−Ｈ−Ｔ−Ｆ−Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｌ−Ｑ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｖ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｘ１９２−Ｘ１９３−Ｇ−Ｔ−Ｘ１９６−Ｔ−Ｙ−Ｘ１９９−Ｃ−Ｎ−Ｖ−Ｘ２０３−Ｈ−Ｘ２０５−Ｐ−Ｓ−Ｘ２０８−Ｔ−Ｘ２１０−Ｖ−Ｄ−Ｋ−Ｘ２１４−Ｖ−Ｅ−Ｘ２１７−Ｋ−Ｘ２１９−Ｃ−Ｘ２２１−Ｘ２２２−Ｘ２２３−Ｘ２２４−Ｘ２２５−Ｃ−Ｐ−Ｐ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｘ２３３−Ｘ２３４−Ｘ２３５−Ｘ２３６−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ−Ｌ−Ｆ−Ｐ−Ｐ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｔ−Ｌ−Ｍ−Ｉ−Ｓ−Ｒ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｖ−Ｖ−Ｖ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｈ−Ｅ−Ｄ−Ｐ−Ｅ−Ｖ−Ｘ２７４−Ｆ−Ｎ−Ｗ−Ｙ−Ｖ−Ｄ−Ｇ−Ｖ−Ｅ−Ｖ−Ｈ−Ｎ−Ａ−Ｋ−Ｔ−Ｋ−Ｐ−Ｒ−Ｅ−Ｅ−Ｑ−Ｘ２９６−Ｎ−Ｓ−Ｔ−Ｘ３００−Ｒ−Ｖ−Ｖ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｘ３０９−Ｈ−Ｑ−Ｄ−Ｗ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｋ−Ｅ−Ｙ−Ｘ３２０−Ｃ−Ｘ３２２−Ｖ−Ｓ−Ｎ−Ｘ３２６−Ｘ３２７−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ−Ｅ−Ｘ３３４−Ｔ−Ｉ−Ｓ−Ｋ−Ｘ３３９−Ｋ−Ｇ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｅ−Ｐ−Ｑ−Ｖ−Ｙ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｘ３５５−Ｅ−Ｅ−Ｍ−Ｔ−Ｋ−Ｎ−Ｑ−Ｖ−Ｓ−Ｌ−Ｔ−Ｃ−Ｌ−Ｖ−Ｋ−Ｇ−Ｆ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｅ−Ｗ−Ｅ−Ｓ−Ｘ３８４−Ｇ−Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｎ−Ｎ−Ｙ−Ｘ３９２−Ｔ−Ｔ−Ｐ−Ｐ−Ｘ３９７−Ｌ−Ｄ−Ｓ−Ｄ−Ｇ−Ｓ−Ｆ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｋ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｄ−Ｋ−Ｓ−Ｒ−Ｗ−Ｑ−Ｘ４１９−Ｇ−Ｎ−Ｖ−Ｆ−Ｓ−Ｃ−Ｓ−Ｖ−Ｘ４２８−Ｈ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｈ−Ｘ４３４−Ｈ−Ｙ−Ｔ−Ｑ−Ｋ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｐ−Ｇ−Ｘ４４７、
式中、Ｘ１１９は、ＳおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ１３１は、ＳおよびＣからなる群から選択され、
式中、Ｘ１３３は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、およびＱからなる群から選択され、
式中、Ｘ１３７は、ＧおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ１３８は、ＧおよびＳからなる群から選択され、
式中、Ｘ１６４は、ＴおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ１９２は、ＳおよびＮからなる群から選択され、
式中、Ｘ１９３は、ＬおよびＦからなる群から選択され、
式中、Ｘ１９６は、ＱおよびＫからなる群から選択され、
式中、Ｘ１９９は、ＩおよびＴからなる群から選択され、
式中、Ｘ２０３は、ＮおよびＤからなる群から選択され、
式中、Ｘ２０５は、Ｋ、Ｅ、およびＱからなる群から選択され、
式中、Ｘ２０８は、ＮおよびＤからなる群から選択され、
式中、Ｘ２１０は、Ｋ、Ｅ、およびＱからなる群から選択され、
式中、Ｘ２１４は、ＫおよびＴからなる群から選択され、
式中、Ｘ２１７は、ＰおよびＲからなる群から選択され、
式中、Ｘ２１９は、ＳおよびＣからなる群から選択され、
式中、Ｘ２２０は、Ｃ、ＰＬＧ、およびＧからなる群から選択され、
式中、Ｘ２２１は、Ｄおよび欠失からなる群から選択され、
式中、Ｘ２２２は、Ｋ、Ｖ、およびＴからなる群から選択され、
式中、Ｘ２２３は、Ｔおよび欠失からなる群から選択され、
式中、Ｘ２２４は、ＨおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ２２５は、Ｔおよび欠失からなる群から選択され、
式中、Ｘ２３３は、ＥおよびＰからなる群から選択され、
式中、Ｘ２３４は、ＬおよびＶからなる群から選択され、
式中、Ｘ２３５は、Ｌ、Ａ、および欠失からなる群から選択され、
式中、Ｘ２３６は、Ｇ、Ａ、および欠失からなる群から選択され、
式中、Ｘ２７４は、Ｋ、Ｑ、およびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ２９６は、ＹおよびＦからなる群から選択され、
式中、Ｘ３００は、ＹおよびＦからなる群から選択され、
式中、Ｘ３０９は、ＬおよびＶからなる群から選択され、
式中、Ｘ３２０は、ＫおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ３２２は、ＫおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ３２６は、ＫおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ３２７は、ＡおよびＧからなる群から選択され、
式中、Ｘ３３４は、ＫおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ３３９は、ＡおよびＴからなる群から選択され、
式中、Ｘ３５５は、Ｒ、Ｑ、およびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ３８４は、ＮおよびＳからなる群から選択され、
式中、Ｘ３９２は、Ｋ、Ｎ、およびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ３９７は、ＶおよびＭからなる群から選択され、
式中、Ｘ４１９は、ＱおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ４２８は、ＭおよびＬからなる群から選択され、
式中、Ｘ４３４は、ＮおよびＳからなる群から選択され、
式中、Ｘ４４７は、Ｋ、ＤＥＤＥ、および欠失から選択され、
式中、前記変異体重鎖定常ドメインは、配列番号２と比較して少なくとも６つの置換を含み、前記変異体は配列番号３ではない。
さらなる態様において、本発明は、配列番号２と比較して少なくとも１０個または１５個の置換を含む変異体重鎖定常ドメインを提供する。
追加の態様において、本発明は、以下の式を有する変異体軽鎖定常ドメインを有する抗体を提供する：
Ｘ１０８−Ｔ−Ｖ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ−Ｉ−Ｆ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｄ−Ｅ−Ｘ１２４−Ｌ−Ｘ１２６−Ｓ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｓ−Ｖ−Ｖ−Ｃ−Ｌ−Ｌ−Ｎ−Ｘ１３８−Ｆ−Ｙ−Ｐ−Ｒ−Ｅ−Ａ−Ｘ１４５−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｋ−Ｖ−Ｄ−Ｘ１５２−Ａ−Ｌ−Ｑ−Ｘ１５６−Ｇ−Ｎ−Ｓ−Ｑ−Ｅ−Ｓ−Ｖ−Ｔ−Ｅ−Ｑ−Ｄ−Ｓ−Ｘ１６９−Ｄ−Ｓ−Ｔ−Ｙ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｔ−Ｌ−Ｓ−Ｋ−Ａ−Ｄ−Ｙ−Ｅ−Ｋ−Ｈ−Ｋ−Ｖ−Ｙ−Ａ−Ｃ−Ｅ−Ｖ−Ｔ−Ｈ−Ｘ１９９−Ｇ−Ｌ−Ｘ２０２−Ｓ−Ｐ−Ｖ−Ｔ−Ｘ２０７−Ｓ−Ｆ−Ｎ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｘ２１４、
式中、Ｘ１０８は、ＲおよびＱからなる群から選択され、
式中、Ｘ１２４は、ＱおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ１２６は、Ｋ、Ｅ、およびＱからなる群から選択され、
式中、Ｘ１３８は、ＮおよびＤからなる群から選択され、
式中、Ｘ１４５は、Ｋ、Ｅ、Ｑ、およびＴからなる群から選択され、
式中、Ｘ１５２は、ＮおよびＤからなる群から選択され、
式中、Ｘ１５６は、ＳおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ１６９は、Ｋ、Ｅ、およびＱからなる群から選択され、
式中、Ｘ１９９は、ＱおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ２０２は、ＳおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ２０７は、ＫおよびＥからなる群から選択され、
式中、Ｘ２１４は、ＣおよびＣＤＥＤＥからなる群から選択され、
式中、前記変異体軽鎖定常ドメインは、配列番号１１２と比較して少なくとも２つの置換を含む。
本明細書において使用される野生型定常領域のアミノ酸配列である。 重鎖ＣＨ１ドメインの改変である。４つのＩｇＧアイソタイプに関するＣＨ１残基、露出の割合、およびｐＩを低下させるために行うことができる置換の例の一覧表である。番号付けは、ＥＵインデックスに従っている。 軽鎖ＣＫドメインの改変である。ＣＫ残基、露出の割合、およびｐＩを低下させるために行うることができる置換の一覧表である。番号付けは、ＥＵインデックスに従っている。 ｐＩを改変した定常領域ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）およびＣＫ−ｐＩ（６）のアミノ酸配列である。 本発明において使用される野生型抗ＶＥＧＦのＶＨおよびＶＬ可変領域のアミノ酸配列である。 本発明において使用されるｐＩを改変した抗ＶＥＧＦ抗体ＸＥＮＰ９４９３ ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）−ＣＫ−ｐＩ（６）の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列である。 ＸＥＮＰ９４９３ ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）−ＣＫ−ｐＩ（６）におけるｐＩを低下させる突然変異の位置を示す抗体のＦａｂドメインの構造である。 高い純度を示す、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上のｐＩを改変した抗ＶＥＧＦ変異体の分析である。 高い純度を示す、ＳＥＣ上のｐＩを改変した抗ＶＥＧＦ変異体の分析である。 変異体が変化したｐＩを有することを示す、ＩＥＦゲル上のｐＩを改変した抗ＶＥＧＦ変異体の分析である。 ＶＥＧＦに結合するベバシズマブおよびｐＩを改変した抗ＶＥＧＦの結合アッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ）である。 高い熱安定性を示す、ＣＨ１およびＣＫのｐＩを改変した抗ＶＥＧＦのＤＳＣ分析である。 ｈｕＦｃＲｎマウスにおけるベバシズマブ変異体のＰＫである。ｐＩを改変したＣＨ１およびＣＫドメインを有する９４９３変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長する。 ｈｕＦｃＲｎマウスにおける４つの別個のｉｎ ｖｉｖｏ試験における、ベバシズマブの天然ＩｇＧ１型のＰＫである。平均ＩｇＧ１半減期は３．２日であった。 ｈｕＦｃＲｎマウスにおけるベバシズマブの天然ＩｇＧ２型のＰＫである。 様々な定常鎖を有する抗体変異体の半減期と等電点（ｐＩ）との間の相関関係である。 ＩｇＧサブクラスのアミノ酸配列アラインメントである。四角で囲まれた残基は、ＩｇＧ間でのアイソタイプの違いを示す。より高いｐＩに寄与する残基（Ｋ、Ｒ、およびＨ）またはより低いｐＩに寄与する残基（ＤおよびＥ）が太字で強調されている。ｐＩを低下させるかまたはエピトープを伸長するように設計された置換はグレーで示されている。 ＣＫおよびＣλ定常軽鎖のアミノ酸配列である。より高いｐＩに寄与する残基（Ｋ、Ｒ、およびＨ）またはより低いｐＩに寄与する残基（ＤおよびＥ）が太字で強調されている。ｐＩを低下させるために修飾することができる好ましい位置はグレーで示されている。 ｐＩを改変した変異体重鎖のアミノ酸配列である。 ｐＩを改変した変異体軽鎖のアミノ酸配列である。 ｈｕＦｃＲｎマウスにおけるｐＩを改変した変異体ベバシズマブ抗体のＰＫの結果である。 ｐＩを改変した修飾を、ＦｃＲｎへの結合を増強するＦｃ修飾と組み合わせた変異体のＰＫの結果である。 天然ベバシズマブ抗体、低いｐＩを有するｐＩを改変した変異型、ならびにヒトＦｃＲｎへの結合を向上させるＦｃ修飾を組み込んだ、天然型およびｐＩ改変型、の半減期と等電点（ｐＩ）との間の相関関係である。 ＩｇＧサブクラスを有する新規アイソタイプＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３のアミノ酸配列アラインメントである。青色は、ｐＩ−Ｉｓｏ３と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の４つの天然ＩｇＧにおける残基との間のマッチを意味する。四角で囲まれた残基は、ｐＩを低下させるＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３に組み込まれたＩｇＧアイソタイプの違いを示す。 ヒンジおよびＦｃ領域におけるＩｇＧ１とＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３との間の違いである。 ＣＨ１領域におけるＩｇＧ１とＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３との間の違いである。 ＣＫ−ｐＩ（４）変異体のアミノ酸を示す。赤色は、天然ＣＫ定常軽鎖と比較した、リジンからグルタミン酸への荷電置換を示す。 ｐＩを改変した定常重鎖および定常軽鎖のアミノ酸配列である。 露出の割合と、ＷＴ残基のエネルギーに対して正規化されたＧｌｕへの置換のために計算されたエネルギーとを示す、抗体のＦｃ領域における塩基性残基の分析である。高い露出の割合と、Ｇｌｕへの置換に有利なΔＥとを有する塩基性残基が、ｐＩを低下させるための電荷交換突然変異の標的である。 電荷交換突然変異が抗体のｐＩに与える効果を示すプロットである。ｐＩが低下するにつれて、１回の電荷交換当たりのｐＩの変化が減少する。 ｈｕＦｃＲｎマウスにおける、ｐＩを改変したアイソタイプ変異体ベバシズマブ抗体（ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３）と、置換Ｎ４３４Ｓとの組み合わせのＰＫの結果である。 ｈｕＦｃＲｎマウスにおける、ｐＩを改変したアイソタイプ変異体ベバシズマブ抗体と、置換Ｎ４３４Ｓとの組み合わせのＰＫの結果である。 ｈｕＦｃＲｎマウスにおける、ｐＩを改変したアイソタイプ変異体ベバシズマブ抗体と、置換Ｎ４３４Ｓとの組み合わせのＰＫの結果の散布図である。各点は、試験からの１匹のマウスを表す。これらのｐＩ抗体の各々には４２８Ｌ置換も加えることができることに留意されたい。 ｐＩを改変した変異体ｐＩと半減期（ｔ１／２）との間の相関関係を示すプロットである。 ＣＫおよびＣλドメインの構造アラインメントである。 ２０個のアミノ酸の文献によるｐＩである。列挙したｐＩは、遊離アミノ酸として計算されていることに留意されたい。タンパク質に関連して任意の側鎖の実際のｐＩは異なり、よって、この一覧表は、本発明の目的のために、絶対数ではなく、ｐＩの傾向を示すために使用される。 以下を列挙する、例となるｐＩを改変した変異体のデータ表 個々の鎖の等電点を調節するように改変することにより、混入するホモ二量体種の混合物から所望のヘテロ二量体抗体種を精製する方法の概要である。 ヘテロ二量体構築物および二重特異性構築物を含む、ｐＩを改変した変異体の配列である。 陰イオン交換クロマトグラフィーによるホモ二量体種からのｐＩを改変した変異体ＸＥＮＰ１０６５３のヘテロ二量体種の精製を示すＩＥＦゲルである。レーン３を見ると分かるように、所望のヘテロ二量体が高純度で得られる。 個々の鎖の等電点を調節するように改変することにより、混入するホモ二量体種の混合物から所望のヘテロ二量体の二重特異性ｍＡｂ−Ｆｖを精製する方法の概要である。 個々の鎖の等電点を調節するように改変することにより、混入するホモ二量体種の混合物から所望のヘテロ二量体の二重特異性二重ｓｃＦｖ−Ｆｃを精製する方法の概要である。 ヒトＩｇＧ１の重鎖および軽鎖の残基、ならびに露出表面積の割合の一覧表である。番号付けはＥＵインデックスに従っている。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、重鎖において行うことができる酸性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、重鎖において行うことができる塩基性から中性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、重鎖において行うことができる塩基性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、重鎖において行うことができる酸性から中性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、軽鎖において行うことができる酸性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、軽鎖において行うことができる塩基性から中性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、軽鎖において行うことができる塩基性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 ヘテロ二量体種の容易な精製を促進するために、軽鎖において行うことができる酸性から中性置換の例である。ゼロ置換ホモ二量体（ＩｇＧ１／ＩｇＧ１）、１置換でｐＩを改変したヘテロ二量体（ｐＩ／ＩｇＧ１）、および２置換でｐＩを改変したホモ二量体（ｐＩ／ｐＩ）について、ベバシズマブに関連してｐＩ計算値が列挙される。ホモ二量体とヘテロ二量体とのｐＩにおける平均差（ΔｐＩ）も列挙する。 同一の重鎖定常ドメイン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｉｓｏ１、ｉｓｏ２、ｉｓｏ３、ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋ＲＲ）、ＩＳＯ（＋）を含む）の配列アラインメントである。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４について、ＩｇＧ１配列との違いがグレーで強調されている。アイソタイプｐＩ変異体について、ＩｇＧ１との違いを白抜き文字とともに黒で示している。 ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋）、ＩＳＯ（＋ＲＲ）、抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（−）重鎖、抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（＋）重鎖、および抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（＋ＲＲ）重鎖の配列である。 ＸＥＮＰ１０７８３、抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（−）×ＩｇＧ１（ＷＴ）の配列である。予想される３つの種と、トランスフェクションおよびプロテインＡ精製後のそれらの各ｐＩも列挙する。 ＸＥＮＰ１０７８４、抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（＋ＲＲ）×ＩｇＧ１（ＷＴ）の配列である。予想される３つの種と、トランスフェクションおよびプロテインＡ精製後のそれらの各ｐＩも列挙する。 ＸＥＮＰ１０８９６、抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（−）×ＩＳＯ（＋ＲＲ）の配列である。予想される３つの種と、トランスフェクションおよびプロテインＡ精製後のそれらの各ｐＩも列挙する。 ＸＥＮＰ１０９０１、抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（−）×ＩＳＯ（＋）の配列である。予想される３つの種と、トランスフェクションおよびプロテインＡ精製後のそれらの各ｐＩも列挙する。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のアイソタイプの置換から作製された、全ての考えられるｐＩの低い変異体の一覧表である。予想される３つの種のｐＩ値と、変異体重鎖をＩｇＧ１−ＷＴ重鎖でトランスフェクトした時に存在するヘテロ二量体と２つのホモ二量体種との間の平均ΔｐＩを示す。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のアイソタイプの置換から作製された、全ての考えられるｐＩの高い変異体の一覧表である。予想される３つの種のｐＩ値と、変異体重鎖をＩｇＧ１−ＷＴ重鎖でトランスフェクトした時に存在するヘテロ二量体と２つのホモ二量体種との間の平均ΔｐＩを示す。 抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（−）、ＩｇＧ１−ＷＴ、および抗ＶＥＧＦ ＷＴ軽鎖を一緒にトランスフェクトした時に存在するヘテロ二量体種の精製を実証するクロマトグラムおよびＩＥＦゲルである。５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を使用してＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムで精製を行い、ＮａＣｌの直線勾配（０〜１３０ｍＭ）を用いて溶出した。 抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（＋ＲＲ）、ＩｇＧ１−ＷＴ、および抗ＶＥＧＦ ＷＴ軽鎖を一緒にトランスフェクトした時に存在するヘテロ二量体種の精製を実証するクロマトグラムおよびＩＥＦゲルである。５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を使用してＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムで精製を行い、ＮａＣｌの直線勾配（０〜１８０ｍＭ）を用いて溶出した。 抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋ＲＲ）、および抗ＶＥＧＦ ＷＴ軽鎖を一緒にトランスフェクトした時に存在するヘテロ二量体種の精製を実証するクロマトグラムおよびＩＥＦゲルである。５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を使用してＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムで精製を行い、ＮａＣｌの直線勾配（０〜１８０ｍＭ）を用いて溶出した。 抗ＶＥＧＦ ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋）、および抗ＶＥＧＦ ＷＴ軽鎖を一緒にトランスフェクトした時に存在するヘテロ二量体種の精製を実証するクロマトグラムおよびＩＥＦゲルである。５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を使用してＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムで精製を行い、ＮａＣｌの直線勾配（０〜１８０ｍＭ）を用いて溶出した。 一般的なｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体の構造および配列である。白色または黒色で塗りつぶされたドメインは、ｐＩが改変され得る。 図６４に示した、考えられるｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体を構築するために使用することができるＶＨおよびＶＬ領域の例である。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ ｍＡｂ−Ｆｖの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ２−Ｆｃの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ ＤＡＲＴ−Ｆｃの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３二重ｓｃＦｖ−Ｆｃの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ ｍＡｂ−ｓｃＦｖの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ ｍＡｂ−ｄＡｂの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ Ｆｖ−Ｆａｂ−Ｆｃの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３共通軽鎖ｍＡｂの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ３の１アームｍＡｂの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−Ｆｖ−Ｆｃの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ Ｆｖ−Ｆｖ−Ｆｃの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には一価性抗ＣＤ３ｍＡｂの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３中心ｍＡｂ−Ｆｖの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３ Ｆａｂ−Ｆａｂ−Ｆｃの一例の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変され得るドメインが、白色または黒色で塗りつぶされている。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３二重ｓｃＦｖ−Ｆｃである、ＸＥＮＰ１１３５５の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変されるドメインが、白色（ＩＳＯ（−））または黒色（ＩＳＯ（＋ＲＲ））で塗りつぶされている。 所望のＸＥＮＰ１１３５５ヘテロ二量体種の精製（ピークおよびレーンＢ）を実証するクロマトグラム（パネルＡ、Ｂ）およびＬｏｎｚａ ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲルプレート（パネルＣ）である。緩衝液Ａ＝５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）と、緩衝液Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）および１Ｍ ＮａＣｌとを使用して、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ 陽イオン交換カラム（５ｍＬ）で精製を行う。直線勾配（１０〜３５％緩衝液Ｂ）を用いて、平衡化（０％緩衝液Ｂ）および高塩洗浄（１００％緩衝液Ｂ）ステップに加えて所望の溶出に影響を与えた。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３２ｂ二重ｓｃＦｖ−Ｆｃである、ＸＥＮＰ１１１３９の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変されるドメインが、白色（ＩＳＯ（−））または黒色（ＩＳＯ（＋））で塗りつぶされている。 所望のＸＥＮＰ１１１３９ヘテロ二量体種の精製（ピークおよびレーンＢ）を実証するクロマトグラム（パネルＡ、Ｂ）およびＬｏｎｚａ ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲルプレート（パネルＣ）である。緩衝液Ａ＝５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）と、緩衝液Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）および１Ｍ ＮａＣｌとを使用して、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ 陽イオン交換カラム（１ｍＬ）で精製を行う。直線勾配（０〜１５％緩衝液Ｂ）を用いて、平衡化（０％緩衝液Ｂ）および高塩洗浄（１００％緩衝液Ｂ）ステップに加えて所望の溶出に影響を与えた。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３二重ｓｃＦｖ−Ｆｃである、ＸＥＮＰ１１３３８の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変されるドメインが、白色（ＩＳＯ（−））または黒色（ＩＳＯ（＋））で塗りつぶされている。 所望のＸＥＮＰ１１３３８ヘテロ二量体種の精製（ピークおよびレーンＢ）を実証するクロマトグラム（パネルＡ、Ｂ）およびＬｏｎｚａ ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲルプレート（パネルＣ）である。緩衝液Ａ＝５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）と、緩衝液Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）および１Ｍ ＮａＣｌとを使用して、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ 陽イオン交換カラム（１ｍＬ）で精製を行う。直線勾配（１０〜４０％緩衝液Ｂ）を用いて、平衡化（０％緩衝液Ｂ）および高塩洗浄（１００％緩衝液Ｂ）ステップに加えて所望の溶出に影響を与えた。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には一価性抗ＣＤ４０ｍＡｂである、ＸＥＮＰ１１２３３の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変されるドメインが、白色（ＩＳＯ（−））または黒色（ＩＳＯ（＋））で塗りつぶされている。 所望のＸＥＮＰ１１２３３ヘテロ二量体種の分離（矢印で示される）を実証するＬｏｎｚａ ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲルプレートである。 ｐＩを改変したヘテロ二量体免疫グロブリン変異体、具体的には抗ＣＤ４０の１アームｍＡｂである、ＸＥＮＰ１１２３８の構造および配列である。所望のヘテロ二量体種および混入するホモ二量体種のｐＩ計算値が列挙される。ｐＩが改変されるドメインが、白色（ＩＳＯ（＋））または黒色（ＩＳＯ（−））で塗りつぶされている。 所望のＸＥＮＰ１１２３８ヘテロ二量体種の分離（矢印で示される）を実証するＬｏｎｚａ ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲルプレートである。 以下を列挙する例となる、ｐＩを改変した変異体のデータ表 識別因子の名称、タンパク質の名称、ならびにＨＣおよびＬＣの名称の相関関係。 図８９のＨＣ ｐＩ変異体の配列 図８９のＬＣ ｐＩ変異体の配列
Ｉ．概要
抗体技術における継続的な問題は、一般に、２つの異なる抗原に同時に結合して、異なる抗原を近接させ、新しい機能性および新しい治療薬をもたらす「二重特異性」抗体への要望である。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖の遺伝子を宿主細胞に含めることによって作製される。これにより、通常、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）ならびに２つのホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ）が形成される。しかしながら、多重特異性抗体の形成における大きな障害は、ホモ二量体抗体からヘテロ二量体抗体を精製する際の困難性である。
本発明は、概して、ヘテロ二量体抗体およびヘテロ二量体融合タンパク質を含む多重特異性ヘテロ二量体タンパク質の作製を対象とする。二量体の各タンパク質は、後述するように、抗体の変異体重鎖定常領域の全てまたは一部と、融合パートナーとを含む。当該技術分野で既知のように、２つの重鎖定常領域は、会合して重鎖の二量体を形成する。一般に、ヘテロ二量体を形成する能力は、ホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ）からヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）を容易に精製できるように、二量体（ＡおよびＢ）の各タンパク質の重鎖定常領域にアミノ酸変異体を組み込む機能である。これは、通常、二量体の各タンパク質のｐＩを互いから離れるように変化させるアミノ酸変化を用いて、本明細書に概説されるように行われ、ひいては、タンパク質の異なるｐＩを用いて（例えば、イオン交換カラムまたはゲル上で）ヘテロ二量体とホモ二量体の分離を可能にする。後に概説するように、これらの変異体は、一方または両方の単量体ポリペプチドに導入することができる：すなわち、単量体の一方（本明細書では単純に「単量体Ａ」と称される）のｐＩを単量体Ｂから離れるように改変することができるか、または、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを低下させて、単量体ＡおよびＢの両方を変更することができる。同様に、いずれかまたは両方の単量体のｐＩの変化は、荷電残基を除去もしくは付加することによって（例えば、中性アミノ酸が、正または負に荷電するアミノ酸残基によって、例えば、グリシンからグルタミン酸に、置き換えられる）、荷電残基を正電荷もしくは負電荷から反対の電荷に変更することによって（アスパラギン酸からリジンに）、または荷電残基を中性残基に変更することによって（例えば、電荷の損失：リジンからセリンに）行うことができる。
このように、本発明は、ホモ二量体からヘテロ二量体を分離することができるように、単量体のうちの少なくとも１つに十分なｐＩの変化をもたらすことを提供する。当業者には理解されるように、また後に詳述するように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、ｐＩを増加または低下させるように改変された変異体領域（ｗｔＡ−＋ＢもしくはｗｔＡ−−Ｂ）とを用いることによって、あるいは、一方の領域を増加させ、他方の領域を低下させることによって（Ａ＋−Ｂ−）行うことができる。
よって、一般に、本発明は、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を一方または両方の単量体に組み込むことにより、二量体タンパク質の（両方ではないにせよ）少なくとも１つの単量体の等電点（ｐＩ）を変化させて「ｐＩヘテロ二量体」（タンパク質が抗体の場合、これらは「ｐＩ抗体」と称される）を形成することを対象とする。本明細書に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが最低ｐＨ０．１単位だけ異なる場合に達成することができ、０．２、０．３、０．４、および０．５またはそれ以上であれば、全て本発明に用いられる。
重鎖の定常領域を用いることによって、抗体を含む多重特異性タンパク質を設計および精製するための、よりモジュール的な手法を提供する。
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの、特定の位置におけるよりｐＩの低いアミノ酸の「組み込み」に依存しており、そうすることで、不要な免疫原性が変異体に導入される可能性を減少させるかまたは排除する。すなわち、高いエフェクター機能を含む様々な理由のために、ＩｇＧ１が、治療用抗体のための一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重鎖定常領域は、ＩｇＧ２の重鎖定常領域よりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。ＩｇＧ１骨格の特定の位置にＩｇＧ２残基を導入することにより、結果として得られるタンパク質のｐＩが低下し、付加的により長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有する：グルタミン酸を組み込むことは、結果として得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。後述するように、多くのアミノ酸置換は、通常、変異体抗体のｐＩに著しい影響を与えることが要求される。しかしながら、後述するように、たとえＩｇＧ２分子における変化であっても血清半減期の増加を可能にすることに留意されたい。よって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含量を有する低ｐＩ定常ドメインの解明であり、例えば、いずれの特定の位置においても、非ヒト残基を最小化すること、または回避することである。
また、このｐＩの改変に伴って生じる可能性のある付随的な利益は、血清半減期の延長およびＦｃＲｎの結合の増加でもある。すなわち、米国特許出願第１３／１９４，９０４（参照によりその全体が組み込まれる）に記載されるように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見出されるものを含む）のｐＩを低下させることにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの血清滞留時間をより長くすることができる。血清半減期の増加のためのこれらのｐＩ変異体はまた、精製のためにｐＩの変化も促進する。よって、いくつかの実施形態において、血清半減期を増加させるｐＩ半減期変異体も、精製中に重鎖を分離する能力に寄与する。これらのｐＩ半減期変異体は、後述するような「ｐＩ変異体」の定義に含まれ、任意のｐＩ変異体および後述するような変異体の「ノブとホール」セットとともに用いることができる。
ｐＩを変化させるアミノ酸変化に加えて、ヘテロ二量体の形成に有利であり、かつホモ二量体の形成に不利な立体効果を生じるアミノ酸改変に依存する以前の研究も、任意選択的に用いることができる；これは、時に「ノブとホール」と称される。ここでも、「ノブとホール」の変異体を、任意選択的にかつ独立して、ｐＩ半減期変異体を含むｐＩ変異体と組み合わせることができる。
さらに、後述するように、Ｆｃ受容体への結合を変化させるＦｃ変異体、親和性成熟のために行われるアミノ酸置換等の、他の機能性のためのさらなるアミノ酸置換が本発明のｐＩ抗体に含まれてもよい。
変異体重鎖定常ドメインの全てまたは一部に加えて、一方または両方の単量体は、ヘテロ二量体が多価タンパク質を形成するように、１つまたは２つの融合パートナーを含んでもよい。図に一般的に示すように、融合パートナーは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤと表され、あらゆる組み合わせが可能である。一般に、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、ヘテロ二量体がさらなるタンパク質と相互作用する能力において少なくとも二重特異性または二価性であるように選択される。
当業者には理解されるように、また後に詳述するように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、図に一般的に示すような様々な構成をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」にある種の特異性が存在し、他方の「アーム」には異なる特異性が存在する「シングルエンド」構成を示している。他の図は、分子の「上部」に少なくとも１種類の特異性が存在し、分子の「下部」に１つ以上の異なる特異性が存在する「デュアルエンド」構成を示している。さらに図示されるように、これらの２つの構成を組み合わせることができ、特定の組み合わせに基づいて３通りまたは４通りの特異性が存在し得る。よって、本発明は、多重特異性抗体を含む「多重特異性」結合タンパク質を提供する。
ＩＩ．本発明の説明
ここには、いくつかの定義を記載する。そのような定義は、文法上の均等物を包含することが意図される。
本明細書において使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在反応を意味する。
本明細書において使用される「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシスは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす細胞介在反応を意味する。
本明細書において使用される「アミノ酸」および「アミノ酸識別」は、天然に存在する２０個のアミノ酸のうちの１つ、または特定の定義された位置に存在し得る任意の非天然の類似体を意味する。
本明細書において使用される「ＣＤＣ」または「補体依存性細胞傷害」は、１つ以上の補体タンパク質成分が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす反応を意味する。
本明細書において使用される「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用によってもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ等のＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、およびＣＤＣ等の補体媒介性エフェクター機能を含む。さらに、エフェクター機能は、抑制機能（例えば、Ｂ細胞応答、例えば、体液性免疫応答の下方制御、低下、抑制等）等のＦｃγＲＩＩｂ媒介性エフェクター機能を含む。
本明細書において使用される「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃおよび／または補体受容体を発現し、１つ以上のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγδＴ細胞を含むがこれらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む限定されない、いずれの生物に由来してもよい。
本明細書において使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、Ｖ＿Ｈ、ＣＨ１、Ｖ＿Ｈ、およびＣ＿Ｌの免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域を単独で指してもよいか、または、全長抗体もしくは抗体断片に関連してこの領域を指してもよい。
本明細書において使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、また場合によってはヒンジの一部を意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端の柔軟なヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、単離されたこの領域、または、後述するようにＦｃポリペプチドに関連してこの領域を意味してもよい。
本明細書において使用される「Ｆｃポリペプチド」は、Ｆｃ領域の全てまたは一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、およびＦｃ断片を含む。免疫グロブリンは、Ｆｃポリペプチドであり得る。
本明細書において使用される「Ｆｃ融合体」は、１つ以上のポリペプチドが、Ｆｃドメイン、特に変異体Ｆｃドメインに、操作可能に連結されたタンパク質を意味する。従来技術（Ｃｈａｍｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：５２−６０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１９５−２００（両方とも、参照により全体が本明細書に組み込まれる））において使用されているように、Ｆｃ融合体は、本明細書において、用語「イムノアドヘシン」、「Ｉｇ融合体」、「Ｉｇキメラ」、および「受容体グロブリン」（ダッシュを伴う場合もある）と同義であることを意味する。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃ領域を、一般に、いずれのタンパク質、ポリペプチド、または小分子であってもよい融合パートナーと組み合わせる。Ｆｃ融合体の非Ｆｃ部分（本発明のほとんどの場合、ｐＩドメイン）、すなわち融合パートナーの役割は、標的結合を媒介することであり、したがって、それは抗体の可変領域に機能的に類似する。事実上、いずれのタンパク質または小分子もＦｃに連結してＦｃ融合体を形成してもよい。タンパク質融合パートナーは、限定されないが、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、またはいくつかの他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインを含んでもよい。小分子融合パートナーは、Ｆｃ融合体を治療標的に誘導する任意の治療剤を含んでもよい。そのような標的は、任意の分子、例えば、疾患に関与する細胞外受容体であってもよい。
本明細書において使用される「Ｆｃガンマ受容体」または「ＦｃγＲ」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、実質的にＦｃγＲ遺伝子によってコードされる、タンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーは、限定されないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５（参照により全体が組み込まれる）、そして任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含む。ＦｃγＲは、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、いずれの生物に由来してもよい。マウスＦｃγＲは、限定されないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含む。
本明細書において使用される、「Ｆｃリガンド」または「Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ−リガンド複合体を形成する任意の生物からの分子、例えば、ポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドは、限定されないが、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、およびウイルス性ＦｃγＲを含む。Ｆｃリガンドはまた、ＦｃγＲと相同なＦｃ受容体の１ファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）も含む（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９０：１２３−１３６）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含んでもよい。
本明細書における「修飾」は、タンパク質、ポリペプチド、抗体、または免疫グロブリンの物理的、化学的、または配列特性の変化を意味する。本明細書に記載される修飾は、アミノ酸修飾およびグリコフォーム修飾を含む。
本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列の特定の位置にあるアミノ酸を、別の異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。明確にするために述べると、「アミノ酸置換」は、置換される位置に親アミノ酸とは異なるアミノ酸を必要とする。例えば、置換Ｓ２６７Ｅは、変異体ポリペプチド、この場合、２６７位のセリンがグルタミン酸で置き換えられた定常重鎖変異体を指す。本明細書において使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」は、親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。本明細書において使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」は、親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。
本明細書において使用される「グリコフォーム修飾」または「修飾されたグリコフォーム」または「改変されたグリコフォーム」は、タンパク質、例えば、抗体に共有結合的に付着した炭水化物組成物を意味し、前記炭水化物組成物は、親タンパク質と化学的に異なる。修飾されたグリコフォームは、典型的には、異なる炭水化物またはオリゴ糖を指し、したがって、例えば、Ｆｃ変異体は、修飾されたグリコフォームを含み得る。代替として、修飾されたグリコフォームは、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＦｃ変異体を指してもよい。
本明細書において使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「親免疫グロブリン」「前駆体ポリペプチド」、「前駆体タンパク質」、または「前駆体免疫グロブリン」とは、本明細書に記載される少なくとも１つのアミノ酸修飾の鋳型および／または基盤としての役割を果たす変異体、例えば、任意のポリペプチド、タンパク質、または免疫グロブリンを生成するように後に修飾される、未修飾のポリペプチド、タンパク質、または免疫グロブリンを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってもよいか、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは改変型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、本明細書において使用される「親Ｆｃポリペプチド」は、変異体Ｆｃポリペプチドを生成するように修飾されるＦｃポリペプチドを意味し、本明細書において使用される「親抗体」は、変異体抗体を生成するように修飾される抗体を意味する（例えば、親抗体は、限定されないが、天然に存在するＩｇの定常領域を含むタンパク質を含み得る）。
本明細書において使用される「位置」は、タンパク質の配列における場所を意味する。位置は、順に番号付けされてもよいか、確立された形式、例えば、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従ってもよい。例えば、位置２９７は、ヒト抗体ＩｇＧ１における位置である。
本明細書において使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合的に付着したアミノ酸を意味する。
本明細書において使用される「残基」は、タンパク質おける位置およびその関連するアミノ酸の識別を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ ２９７とも称され、またＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１における残基である。
本明細書において使用される「標的抗原」は、所与の抗体の可変領域によって結合される分子、またはＦｃ融合物の融合パートナーを意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化学化合物であってもよい。抗体またはＦｃ融合物は、標的抗原に対して親和性を有することに基づいて、所与の標的抗原に「特異的」であると言われる。様々な標的抗原を後に列挙する。
本明細書において使用される「標的細胞」は、標的抗原を発現する細胞を意味する。
本明細書において使用される「可変領域」は、それぞれ、κ遺伝子座、λ遺伝子座、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶｋ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる、１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。
本明細書において使用される「変異体ポリペプチド」、「ポリペプチド変異体」、または「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親ポリペプチド配列とは異なるポリペプチド配列を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドもしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであってもよいか、またはＷＴポリペプチドの修飾型であってもよい。変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸を指してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される変異体ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）は、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、約１〜約１０個のアミノ酸修飾、約１〜約５個のアミノ酸修飾等を有してもよい。変異体ポリペプチド配列は、親ポリペプチド配列と少なくとも約８０％の相同性、例えば、少なくとも約９０％の相同性、９５％の相同性等を有し得る。したがって、本明細書において使用される「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親Ｆｃ配列と異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、Ｆｃ領域のみを包含してもよいか、または抗体、Ｆｃ融合体、単離されたＦｃ、Ｆｃ断片、もしくは実質的にＦｃによってコードされる他のポリペプチドに関連して存在してもよい。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。本明細書において使用される「Ｆｃポリペプチド変異体」または「変異体Ｆｃポリペプチド」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親Ｆｃポリペプチドと異なるＦｃポリペプチドを意味する。本明細書において使用される「タンパク質変異体」または「変異体タンパク質」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親タンパク質と異なるタンパク質を意味する。本明細書において使用される「抗体変異体」または「変異体抗体」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親抗体と異なる抗体を意味する。本明細書において使用される「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親ＩｇＧと異なる抗体を意味する。本明細書において使用される「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親免疫グロブリン配列と異なる免疫グロブリン配列を意味する。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」は、対立遺伝子を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧ等は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
Ｂ．抗体
本発明は、抗体、通常は治療用抗体のｐＩ変異体の生成に関する。後述するように、用語「抗体」は一般的に使用される。本発明において使用される抗体は、従来の抗体、ならびに後述する抗体の誘導体、断片、および模倣物を含む、本明細書に記載されるような多くの形式をとることができる。一般に、本発明の目的のための用語「抗体」は、限定されないが、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＬを含む、少なくとも１つの定常ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。すなわち、定常領域のｐＩの改変は、多重特異性抗体を形成するための可変領域等の「従来の」抗体技術とともに用いることができるか、または該技術は、二重特異性結合タンパク質を作製するための融合パートナーとともに用いることができる。別途記載のない限り、「抗体」は、可変領域を含む融合パートナーを含む多重特異性タンパク質を作製するための、ｐＩを改変した定常領域の使用を含む。
一般に、本明細書は、「ＣＨ１−Ｆｃドメイン」とも称される場合があるＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３成分（例えば、重鎖可変ドメインを有しない）を含む「重鎖定常ドメイン」に言及する。しかしながら、場合によっては、ｐＩ変異体は、Ｆｃ領域のみを用いて作製される。
従来の抗体の構造単位は、典型的には、四量体を含む。各四量体は、典型的には、２対の同一なポリペプチド鎖で構成され、各対が、１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）と、１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）とを有する。ヒトの軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖に分類される。本発明は、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有するＩｇＧクラスを対象とする。よって、本明細書において使用される「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的な特徴によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。治療用抗体はまた、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含むことができることを理解されたい。例えば、本明細書に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩの改変を包含する。
各鎖のアミノ末端部分は、通常、当該技術分野および本明細書において「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」と称される、主として抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域では、重鎖および軽鎖のＶドメインの各々に３つのループが集まり、抗原結合部位を形成する。ループの各々は、相補性決定領域（これ以降「ＣＤＲ」と称される）と称され、そこではアミノ酸配列の変動が最も顕著である。「可変」とは、可変領域のある特定のセグメントが、抗体間で配列が広範囲に異なるという事実を意味する。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変の一続きの領域からなり、それらは、各々９〜１５アミノ酸長またはそれより長い「超可変領域」と称される極端な可変性のより短い領域によって分離される。
いくつかの実施形態において、本発明の異種タンパク質が、第１の抗原に対する結合特異性を示す第１のｓｃＦｖを有する第１のｐＩを改変した定常鎖と、第２の抗原に対する結合特異性を示す第２のｓｃＦｖを有する第２のｐＩを改変した定常鎖とを含むように、ｐＩを改変した定常領域を一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）領域に結合することができる。代替の形式も図中に見られ、本明細書に記載される。
各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順に整列した、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と４つのＦＲとからなる。
超可変領域は、通常、軽鎖可変領域のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１：「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）あたりと、重鎖可変領域の３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１：「Ｈ」は重鎖を示す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）あたりのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と、重鎖可変領域の２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７）を包含する。本発明の特定のＣＤＲについては後に記載する。
本明細書を通して、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７、および重鎖可変領域の残基１〜１１３）に言及する場合、通常、Ｋａｂａｔの番号付けシステムが使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記参照（１９９１））。
ＣＤＲは、抗原結合、より具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとしてとして知られる、抗体分子の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖等の分子の集まったものであり、通常、特定の構造特性および特定の電荷特性を有する。単一の抗原が１つより多くのエピトープを有する場合もある。
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも称される）と、結合に直接関与していない他のアミノ酸残基、例えば、特異的な抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基とを含んでもよい：換言すると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
エピトープは、立体構造的または線状のいずれかであり得る。立体構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。立体構造的または非立体構造的エピトープは、変性溶媒の存在下において、前者との結合は失われるが、後者との結合は失われないという点において区別される。
エピトープは、特有の空間的配置において、典型的には少なくとも３つ、より一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が、別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純なイムノアッセイ（例えば「ビニング」）において確認することができる。
各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づいて、彼らは、個々の一次配列をＣＤＲとフレームワークとに分類し、そのリストを作成した（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（参照により全体が組み込まれる）を参照のこと）。
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明確な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明において興味深いのは、重鎖定常（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体に関連して、ＩｇＧアイソタイプは、各々３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧに関連する「ＣＨ」ドメインは、以下の通りである：「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスによる１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスによる２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスによる３４１〜４４７位を指す。ここに示したように、また後に記載するように、ｐＩ変異体は、ＣＨ領域および後述のヒンジ領域のうちの１つ以上に存在することができる。
本明細書に示される配列は、ＣＨ１領域、すなわち１１８位で開始し、記載されている場合を除いて可変領域が含まれていないことに留意されたい。例えば、配列番号２の最初アミノ酸は、配列表では「１」位と表されていても、ＥＵ番号付けに従うとＣＨ１領域の１１８位に対応する。
重鎖の別の種類のＩｇドメインは、ヒンジ領域である。本明細書における「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間にアミノ酸を含む柔軟なポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧのＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終端し、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは残基のＥＵ位置２３７で開始する。よって、ＩｇＧの場合、抗体ヒンジは、２２１位（ＩｇＧ１のＤ２２１）〜２３６（ＩｇＧ１のＧ２３６）を含むものと本明細書において定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに基づくものとする。いくつかの実施形態において、たとえば、Ｆｃ領域に関連して、下側のヒンジが含まれ、この「下側のヒンジ」は、通常、２２６位または２３０位を指す。本明細書に記載されるように、ｐＩ変異体は、ヒンジ領域において作製することもできる。
軽鎖は、通常、軽鎖可変ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、重鎖可変ドメインと一緒になってＦｖ領域を形成する）と、軽鎖定常領域（ＣＬまたはＣκと称されることが多い）の２つのドメインを含む。
後に概説する、さらなる置換の対象となる別の領域はＦｃ領域である。本明細書において使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、また場合によってはヒンジの一部を意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端の柔軟なヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下側ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態において、後により詳細に記載するように、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
いくつかの実施形態において、抗体は全長である。本明細書における「全長抗体」は、本明細書に概説するような１つ以上の修飾を含む可変領域および定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。
代替として、抗体は、限定されないが、抗体断片、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（本明細書に記載されるように、二重特異性、三重特異性、および四重特異性抗体を含む）、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では時に「抗体模倣物」と称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（時に「抗体コンジュゲート」と称される）、および各々の断片をそれぞれ含む、様々な構造であってもよい。
一実施形態において、ｐＩを改変することができる少なくとも１つの定常ドメインを含む限り、抗体は、抗体断片である。特定の抗体断片は、限定されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）２つのドメインを会合させて抗原結合部位の形成させるペプチドリンカーによってＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結される一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３（参照により全体が組み込まれる））、（ｉｖ）遺伝子融合によって構築される多価または多特異性断片である「二重特異性抗体」または「三重特異性抗体」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８（全て、参照により全体が組み込まれる））を含む。
使用することができる他の抗体断片は、ｐＩを改変した本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、およびＣＬドメインのうちの１つ以上を含む断片を含む。例えば、Ｆｃ融合体は、別のタンパク質に融合されたＦｃ領域（ＣＨ２およびＣＨ３、任意選択的にヒンジ領域を含む）の融合体である。多くのＦｃ融合体が当該技術分野で既知であり、本発明のｐＩ変異体の付加によって改善することができる。本発明の場合、ＣＨ１；ＣＨ１，ＣＨ２およびＣＨ３；ＣＨ２；ＣＨ３；ＣＨ２およびＣＨ３；ＣＨ１およびＣＨ３を含む抗体融合体を作製することができ、これらのいずれかまたは全ては、本明細書に記載されるｐＩ変異体の任意の組み合わせを利用して、任意選択的にヒンジ領域を用いて作製することができる。
Ｂ．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態において、抗体は、異なる種からの混合体、例えば、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であってもよい。一般に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両方は、１つより多くの種に由来する領域を組み合わせた抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、従来、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域（複数可）と、ヒト由来の定常領域（複数可）とを含む。「ヒト化抗体」は、通常、可変ドメインフレームワーク領域を、ヒト抗体に見られる配列と交換した非ヒト抗体を指す。通常、ヒト化抗体では、ＣＤＲを除く全抗体が、ヒト由来のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いて、そのような抗体と同一である。非ヒト生物に由来する核酸によって一部または全部がコードされるＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワーク内に移植して抗体を作製し、移植されたＣＤＲによってその特異性が決定される。そのような抗体の作製は、例えば、国際公開第ＷＯ９２／１１０１８号、Ｊｏｎｅｓ，１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（全て、参照により全体が組み込まれる）に記載されている。最初の移植構築物において失われた親和性を回復するために、選択されたアクセプターフレームワーク残基の対応するドナー残基への「逆変異」が必要であることが多い（米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６１号、同第５６９３７６２号、同第６１８０３７０号、同第５８５９２０５号、同第５８２１３３７号、同第６０５４２９７号、同第６４０７２１３号（全て、参照により全体が組み込まれる））。ヒト化抗体は、免疫グロブリンの定常領域（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域である）の少なくとも一部も含むことが最適であり、よって、典型的にはヒトＦｃ領域を含む。また、ヒト化抗体は、遺伝子組み換えした免疫系を有するマウスを用いて生成することもできる。Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４（参照により全体が組み込まれる）。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技術および方法が、当該技術において周知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ＆ Ｖａｓｑｕｅｚ， ２００４， Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ）、およびその中に引用される参考文献（全て、参照により全体が組み込まれる）を参照のこと）。ヒト化方法は、限定されないが、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８６：１００２９−３３；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９；Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４１８１−４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２１−８（全て、参照により全体が組み込まれる）に記載される方法を含む。ヒト化方法、または非ヒト抗体の可変領域の免疫原性を減少させる他の方法は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９−９７３（参照により全体が組み込まれる）に記載されるような表面再処理方法を含み得る。一実施形態において、親抗体は、当該技術分野において周知のように、親和性成熟されている。ヒト化および親和性成熟には、たとえば米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載されるような構造に基づく方法が利用されてもよい。限定されないが、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１６（１０）：７５３−７５９（全て、参照により全体が組み込まれる）に記載される方法を含む選択に基づく方法を利用して、抗体の可変領域をヒト化および／または親和性成熟させてもよい。限定されないが、米国特許出願第０９／８１０，５１０；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５；Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４（全て、参照により全体が組み込まれる）に記載される方法を含む他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部分のみの移植を伴う場合がある。
一実施形態において、抗体はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む最小化された抗体様タンパク質である。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１（参照により全体が組み込まれる）。本発明において、ＣＨ３ドメインは、ｐＩを改変することができる。場合によっては、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に結合されてもよく、ヒンジ領域の一部または全部を含んでもよい。
本発明の抗体は、通常、単離されるかまたは組み替えられる。本明細書に開示される種々のポリペプチドを説明するために使用される場合、「単離された」は、特定および分離された、かつ／またはそれが発現された細胞もしくは細胞培養物から回収された、ポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。
特定の抗原またはエピトープに対する「特異的結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」とは、非特異的な相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、通常は結合活性を有しない類似する構造の分子である対照分子の結合と比較して分子の結合を確認することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子との競合によって確認することができる。
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替として、少なくも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれよりも高い、抗原またはエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示されてもよい：ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味する。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対する対照分子より２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上高いＫＤを有する。
また、例えば、対照と比較して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれ以上高い抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａを有する抗体によって、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合が示される可能性もある（ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を意味する）。
Ｃ．ｐＩ変異体
したがって、本発明は、第１のドメインとして変異体重鎖定常領域を含む単量体の使用に基づいて、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。本明細書における「単量体」は、ヘテロ二量体タンパク質の半分を意味する。抗体は、実際には四量体（２つの重鎖および２つの軽鎖）であることに留意されたい。本発明の文脈において、１セットの重鎖−軽鎖が「単量体」であるとみなされる。同様に、一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を有する重鎖定常領域もまた「単量体」であるとみなされる。Ｆｖ領域が一方の融合パートナー（例えば、重鎖および軽鎖）であり、非抗体タンパク質がもう一方の融合パートナーである場合、各「半分」が「単量体」であるとみなされる。
変異体重鎖定常領域は、全長構築物、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、または例えばＣＨ２−ＣＨ３を含むその一部を含む、重鎖定常領域の全てまたは一部を含むことができる。さらに、各単量体の重鎖領域は、同じ骨格（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３またはＣＨ２−ＣＨ３）であってもよいかまたは異なってもよい。ＮおよびＣ末端の切断および付加もまた、この定義に含まれる：例えば、いくつかのｐＩ変異体は、重鎖ドメインのＣ末端への荷電アミノ酸の付加を含む（例えば、（ＤＥ）ｎ（ｎは１、２、３等であってもよい））。
さらに、本明細書に概説するｐＩ置換に加えて、重鎖領域は、後述するようなＦｃ結合を変化させるための変更を含む、さらなるアミノ酸置換も含み得る。
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩ変異体には２つの一般的なカテゴリーが存在する。すなわちタンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基変化）およびタンパク質のｐＩを低下させるもの（酸変化）である。本明細書に記載されるように、これらの変異体の全ての組み合わせを行うことができる。すなわち一方の単量体は、野生型であるか、または野生型と著しく異なるｐＩを示さない変異体であってもよく、他方の単量体は、より塩基性またはより酸性であり得る。代替として、各単量体を、より塩基性に、またより酸性に、変化させる。
さらに、後により詳細に概説するように、いくつかの単量体は、変異体重鎖定常領域と融合パートナーとの間にリンカーを用いることができる。グリシンおよびセリンの柔軟なリンカーを含む従来のペプチドリンカーが使用されてもよい。場合によっては、単量体の成分として使用されるリンカーは、ＡＤＣ構築物について後に定義されるものとは異なり、多くの実施形態において（プロテアーゼの影響を受けやすいもの等の）切断可能なリンカーではないが、いくつかの実施形態において切断可能なリンカーが使用される場合がある。
したがって、本発明は、抗体のｐＩ変異体の生成に関する。「ｐＩ」は、分子（個々のアミノ酸および抗体の両方を含む）の等電点を意味し、特定の分子または表面が正味電荷を持たないｐＨである。さらに、本発明は、本明細書において、ｐＨ７でのタンパク質の「荷電状態」における変化について言及することがある。すなわち、ＩｇＧ１の野生型重鎖定常領域は＋６の荷電状態を有し、ＩｇＧ２の重鎖定常領域は０の荷電状態を有する。変異体９４９３（配列番号１９３の重鎖定常ドメインおよび配列番号１１７の軽鎖定常ドメインを有する）は、重鎖および軽鎖の定常領域に１２個の置換を有し、−３０の荷電状態をもたらす。
本発明は、「ｐＩ抗体」を形成するための抗体のｐＩ変異体の生成に関する。ｐＩ変異体は、親分子にアミノ酸突然変異を導入することによって作製される。この文脈における「突然変異」は、通常、アミノ酸置換であるが、本明細書に示されるように、アミノ酸の欠失および挿入も行うことができ、よって、突然変異として定義される。
本明細書における「ｐＩ変異体」または「等電点変異体」または「ｐＩ置換」またはその文法上の均等物は、出発タンパク質とは異なるアミノ酸を有し、結果的にその位置でｐＩを変化させる変異体を意味する。これは、特定の位置における、元の（例えば、野生型）アミノ酸よりも低いｐＩを有するアミノ酸置換（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、これは、高いｐＩを有するアミノ酸を欠失させること（構造がそれに耐えられる場合）、またはより低いｐＩを有するアミノ酸、例えば、後述する低ｐＩ「尾部」を挿入することも意味し得る。同様に、これらのｐＩ変異体は、特定の位置における、元の（例えば、野生型）アミノ酸よりも高いｐＩを有するアミノ酸置換（複数可）を含むことができる。いくつかの実施形態において、これは、低いｐＩを有するアミノ酸を欠失させること（構造がそれに耐えられる場合）、またはより高いｐＩを有するアミノ酸、例えば、後述するＣ末端の高ｐＩ「尾部」を挿入することも意味し得る。
図３６に示すように、異なるアミノ酸は異なるｐＩを有し、この図は、アミノ酸のｐＩをタンパク質に関連してではなく、むしろ個々の組成物として示しているが、その傾向は同一である。本発明の文脈におけるｐＩ変異体は、タンパク質、この場合、ＩｇＧ抗体の少なくとも重鎖定常ドメインもしくは軽鎖定常ドメインまたはその両方のｐＩの減少に寄与するように作製される。本明細書に概説されるアミノ酸突然変異のうちの１つ以上を含むように改変される抗体も、本明細書において「ｐＩ抗体」と称されることがある。
一般に、「ｐＩ変異体」は、タンパク質のｐＩの変化をもたらす１つ以上のアミノ酸修飾を指す。これは、異なるｐＩを有するアミノ酸で置換すること、アミノ酸（複数可）を欠失させること、またはアミノ酸（複数可）を挿入することを含む、いくつかの方法で行うことができ、よって抗体の全体的なｐＩを変化させる。例えば、一方の重鎖がそのｐＩを低下するように変化させられる場合、ｐＩの高いアミノ酸をｐＩのより低いもしくは中性のアミノ酸と置き換えることができるか、または中性アミノ酸をｐＩのより低いアミノ酸と置き換えることができる（およびこれらの全ての組み合わせ）。ｐＩの高い鎖の改変についても同様である。（後に記載されるように、ｐＩ変異体を構造的に補完するために、しばしばさらなる非ｐＩ変異体が付加され、安定性の増加等がもたらされる）。ｐＩのより低いまたはより高いアミノ酸を用いた変化のために定常ドメインの位置を選択する際に、アミノ酸の溶媒露出度が考慮に入れられるが、一般的に、それが唯一の要因ではない。すなわち、ＩｇＧ分子の既知の構造に基づいて、図２に示すように、各位置は、完全に露出されるか、完全に遮蔽されるか（例えば、分子の内側において）、または部分的に露出されるかのいずれかである。この評価は、ＣＨ１ドメインおよびＣκ軽鎖における各残基の「露出の割合」として図２に示される。いくつかの実施形態において、異なるｐＩのアミノ酸を用いた置換の候補位置は、少なくとも５０％露出されており、６０、７０、８０超％を超える露出度、および効率的に１００％露出される残基が本発明において用いられる。
示されてはいないが、露出のパーセンテージを計算するための標準的な市販のプログラムを使用して、ヒンジ領域、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３、ならびに軽鎖のＣＬドメインについて同じ計算を行うことができる。
ｐＩの低下は、ｐＩのより高いアミノ酸（例えば、正の荷電状態）を中性のｐＩで置き換えること、ｐＩのより高いアミノ酸をｐＩのより低いもしくは低いアミノ酸で置き換えること、または中性のｐＩのアミノ酸をｐＩの低いアミノ酸で置き換えることのいずれかであるいくつかの方法のうちの１つで行うことができる。場合によっては、構造上可能である場合、１つ以上のアミノ酸の欠失または挿入、例えば、ｐＩの高いアミノ酸の欠失または１つ以上のｐＩの低いアミノ酸の挿入も行うことができる。よって、例えば、アルギニン（ｐＩ１１．１５）は、リジン（ｐＩ９．５９、なおも高いがアルギニンよりは低い）、グリシンもしくはセリン等のより中性のアミノ酸、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等の低ｐＩ変異体によって置き換えることができる。
ｐＩの上昇は、ｐＩのより低いアミノ酸（例えば、負の荷電状態）を中性のｐＩで置き換えること、ｐＩのより低いアミノ酸をｐＩのより高いもしくは高いアミノ酸で置き換えること、または中性のｐＩのアミノ酸をｐＩの高いアミノ酸で置き換えることのいずれかである同様の様式で行うことができる。場合によっては、構造上可能である場合、１つ以上のアミノ酸の欠失または挿入、例えば、ｐＩの低いアミノ酸の欠失または１つ以上のｐＩの高いアミノ酸の挿入も行うことができる。よって、例えば、リジン（ｐＩ９．５９）を、アルギニン（ｐＩ１１．１５）で、またはグリシンもしくはセリン等のより中性のアミノ酸によって、またはアルギニンおよびリジン等のｐＩの高い変異体によって置き換えることができる。
ｐＩ変異体は、野生型ＩｇＧ定常ドメイン（本明細書に概説するように、重鎖もしくは軽鎖のいずれか、またはその両方）であることが多い出発配列または親配列との比較によって変異体として定義される。すなわち、野生型の特定の位置にあるアミノ酸は「天然」アミノ酸と称され、この位置のアミノ酸置換（または欠失または挿入）は「非天然」アミノ酸と称される。例えば、本明細書の多くの実施形態は、ｐＩ突然変異が作製される親配列としてＩｇＧ１重鎖定常領域を使用する。よって、いくつかの実施形態において、「非天然」アミノ酸は、ＩｇＧ１配列と比較されたものである。例えば、１１９位では、ＩｇＧ１がセリンを有するため、置換することができる非天然アミノ酸はグルタミン酸である。よって、配列番号１９３は、１１９位に非天然グルタミン酸を有する。同様に、ＩｇＧ２定常ドメイン（複数可）から開始する場合、天然および非天然アミノ酸は、野生型ＩｇＧ２配列と比較される。
当業者には理解されるように、ハイブリッドＩｇＧの教示のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１３４１５０号に記載されるように、種々のＩｇＧ分子から融合体またはハイブリッドを作製することが可能である。よって、例えば、配列番号２８はハイブリッドＩｇＧ１／Ｇ２分子であり、配列番号１６４はハイブリッドＩｇＧ２／Ｇ１分子である。この文脈において、「非天然」または「非野生型」置換は、問題となる位置にあるアミノ酸が、その位置が由来する親の野生型配列とは異なることを意味する：すなわち、Ｎ末端がＩｇＧ１に由来し、ＣがＩｇＧ２に由来するように、クロスオーバーポイントがアミノ酸１００と１０１との間である場合、９０位の「非天然」アミノ酸がＩｇＧ１配列と比較される。
よって、非野生型ＩｇＧドメイン、例えば、既に変異体を有するＩｇＧドメインを出発分子または親分子として用いることが可能である。これらの場合、上記のように、野生型配列に戻らない限り、置換は「非天然」である。
重鎖ｐＩ変異体
本明細書に記載されるように、本発明のいくつかの実施形態は、２つの異なる重鎖ｐＩ変異体、例えば、一緒になって、ホモ二量体のいずれかと異なるｐＩを有するヘテロ二量体を形成する、２つの異なる単量体の使用を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のヘテロ二量体ｐＩ抗体の形成を可能にするように、ｐＩ変異体は、ＩｇＧ抗体の重鎖ドメインの少なくともＣＨ１領域において作製される。この実施形態において、突然変異は、１１９、１３１、１３３、１３７、１３８、１６４、１９２、１９３、１９６、１９９、２０３、２０５、２０８、２１０、２１４、２１７、および２１９位から独立してかつ任意選択的に選択することができる。これらの１７個の位置の全ての可能な組み合わせを作製することができる：例えば、ｐＩ抗体の単量体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個のＣＨ１のｐＩ置換を有してもよい。さらに、本明細書に記載されるように、いずれの単一のまたは組み合わせたＣＨ１変異体（複数可）が、いずれのＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジおよび／もしくはＬＣ変異体（複数可）とも任意選択的にかつ独立して組み合わされてもよく、かつ／または、後にさらに記載されるように、Ｆｃ改変変異体と独立してかつ任意選択的にいずれの組み合わせでも組み合わされてもよい。
さらに、図２に示すように、１２１、１２４、１２９、１３２、１３４、１２６、１５２、１５５、１５７、１５９、１０１、１６１、１６２、１６５、１７６、１７７、１７８、１９０、１９１、１９４、１９５、１９７、２１２、２１６、および２１８位でのアスパラギン酸またはグルタミン酸の置換を行うことができる。
ＣＨ１ドメインのｐＩを低下させる際に使用される特定の置換は、限定されないが、１１９位の非天然グルタミン酸；１３１位の非天然システイン；１３３位の非天然アルギニン、リジン、またはグルタミン；１３７位の非天然グルタミン酸；１３８位の非天然セリン；１６４位の非天然グルタミン酸；１９２位の非天然アスパラギン；１９３位の非天然フェニルアラニン、１９６位の非天然リジン、１９９位の非天然スレオニン、２０３位の非天然アスパラギン酸、２０５位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２０８位の非天然アスパラギン酸、２１０位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２１４位の非天然スレオニン、２１７位の非天然アルギニンおよび２１９位の非天然システインを含む。本明細書で論じられるように、これらの置換は、配列番号表に示されるおよび後述する好ましい組み合わせを用いて、独立してかつ任意の組み合わせにおいて行うことができる。場合によっては、ＣＨ１ドメインにおいて唯一のｐＩ置換が行われ、他の場合は、これらの置換（複数可）は、他のドメインの他のｐＩ変異体に任意の組み合わせで付加される。
特にヒトＩｇＧ１に関して、変異体重鎖定常ドメインを含む１つの単量体がより正に作製される（例えば、ｐＩを低下させる）場合、以下の置換のうちの１つ以上を行うことができる：Ｓ１１９Ｅ、Ｋ１３３Ｅ、Ｋ１３３Ｑ、Ｔ１６４Ｅ、Ｋ２０５Ｅ、Ｋ２０５Ｑ、Ｎ２０８Ｄ、Ｋ２１０Ｅ、Ｋ２１０Ｑ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ３２０Ｅ、Ｋ３２２Ｅ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３３４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４４７の欠失、Ｃ末端におけるペプチド（ＤＥ）ｎの付加（ｎは１、２、または３である）（例えば、ＤＥ、ＤＥＤＥ、およびＤＥＤＥＤＥ）、Ｇ１３７Ｅ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２７４Ｑ、Ｒ３５５Ｑ、Ｋ３９２Ｎ、およびＱ４１９Ｅ。他のアイソタイプも同様に変化させることができる。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑも使用することができる。
さらに、変異体重鎖定常ドメインを含む１つの単量体がより負に作製される（例えば、ｐＩを増加させる）場合、以下の置換のうちの１つ以上を行うことができる（ヒトＩｇＧ１野生型に言及しているが、他のアイソタイプも同様に行うことができる）：Ｑ１９６Ｋ Ｐ２１７Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｎ２７６Ｋ、およびＨ４３５Ｒ。本明細書に概説するように、また図中に示すように、これらの変化はＩｇＧ１に関連して示されているが、全てのアイソタイプ、およびアイソタイプのハイブリッドをこのように変化させることができる。これらの変化は、任意の変異体において、個々にかつ任意選択的に包含または除外することができる。
いくつかの実施形態において、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２３３、２３４、２３５、および２３６位を含むヒンジドメインに突然変異を作製する。２３３〜２３６における変更は、（３２７Ａと共に）ＩｇＧ２骨格におけるエフェクター機能を増加させるために行うことができることに留意されたい。よって、ｐＩの突然変異、特に置換は、２２１〜２２５位のうちの１つ以上において行うことができ、１、２、３、４、または５つの突然変異が本発明において使用される。ここでも同様に、単独で、または他のドメインの他のｐＩ変異体とともに、全ての可能な組み合わせが企図される。
ヒンジドメインのｐＩを低下させる際に使用される特定の置換は、限定されないが、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはスレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、および２３６位の欠失または非天然アラニンを含む。ここでも上述のように、これらの突然変異は、配列番号表に示されるおよび後述する好ましい組み合わせを用いて、独立してかつ任意の組み合わせにおいて行うことができる。場合によっては、ヒンジドメインにおいて唯一のｐＩ置換が行われ、他の場合は、これらの置換（複数可）は、他のドメインの他のｐＩ変異体に任意の組み合わせで加えられる。
いくつかの実施形態において、２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４、および３３９位を含むＣＨ２領域内に突然変異を作製することができる。ここでも同様に、これらの１０個の位置の全ての可能な組み合わせを作製することができる：例えば、ｐＩ抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＣＨ２のｐＩ置換を有してもよく、それらのいずれかまたは全てを、任意選択的にかつ独立して他のｐＩ変異体と組み合わせることができる
ＣＨ２ドメインのｐＩを低下させる際に使用される特定の置換は、限定されないが、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の非天然グルタミン酸、３３９位の非天然スレオニン、ならびにＣＨ２内および他のドメインの全ての可能な組み合わせを含む。
この実施形態において、突然変異は、３５５、３８４、３９２、３９７、４１９、および４４７位から独立してかつ任意選択的に選択することができる。これらの６個の位置の全ての可能な組み合わせを作製することができる：例えば、ｐＩ抗体は、１、２、３、４、５、または６個のＣＨ１のｐＩ突然変異を有してもよい。さらに、本明細書に記載されるように、いずれの単一のまたは組み合わせたＣＨ３変異体（複数可）が、後に詳述するように、いずれのＣＨ２、ＣＨ１、ヒンジおよび／またはＬＣ変異体（複数可）と任意選択的にかつ独立して組み合わされてもよい。
ＣＨ３ドメインのｐＩを低下させる際に使用される特定の置換は、限定されないが、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸を含む。
よって、総合すると、以下の重鎖定常ドメインの突然変異の可能な組み合わせを作製することができ、各突然変異は、任意選択的に、以下を包含または除外する：１１９位の非天然グルタミン酸；１３１位の非天然システイン；１３３位の非天然アルギニン、リジン、またはグルタミン；１３７位の非天然グルタミン酸；１３８位の非天然セリン；１６４位の非天然グルタミン酸；１９２位の非天然アスパラギン；１９３位の非天然フェニルアラニン、１９６位の非天然リジン、１９９位の非天然スレオニン、２０３位の非天然アスパラギン酸、２０５位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２０８位の非天然アスパラギン酸、２１０位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２１４位の非天然スレオニン、２１７位の非天然アルギニンおよび２１９位の非天然システイン、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはスレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはスレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、および２３５位の欠失、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の非天然グルタミン酸、３３９位の非天然スレオニン、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸。
総合すると、０（ｐＩの改変が軽鎖定常ドメインのみにおいて行われる場合）、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２６、２７、２８、および２９個の突然変異（ＩｇＧ１と比較して）を有する変異体重鎖ドメインを利用するいくつかの実施形態は、図３７に示すように作製することができる。
好ましい実施形態は、「ＩＳＯ（−）」の２つの異なる重鎖ｐＩ変異体の任意の組み合わせを含むヘテロ二量体を含む。「ＩＳＯ（＋ＲＲ）」、および「ＩＳＯ（＋）」は、本明細書に記載されるような任意選択的なさらなる変異体とともに図５２に示される。
軽鎖ｐＩ変異体
いくつかの実施形態において、ｐＩ変異体は、ＩｇＧ抗体の少なくとも軽鎖ドメインにおいて作製される。この実施形態において、突然変異は、１２６、１４５、１５２、１５６、１６９、１９９、２０２、および２０７位から独立してかつ任意選択的に選択することができる。これらの８個の位置の全ての可能な組み合わせを作製することができる。例えば、ｐＩ抗体は、１、２、３、４、５、６、７個の軽鎖定常ドメインのｐＩ突然変異を有してもよい。さらに、本明細書に記載されるように、任意の単一のまたは組み合わせたＣＬドメイン突然変異を、任意の重鎖定常ドメインｐＩ変異体と組み合わせることができる。
軽鎖定常ドメインのｐＩを低下させる際に使用される特定の突然変異は、限定されないが、１２６位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１４５位の非天然グルタミン、グルタミン酸、またはスレオニン；１５２位の非天然アスパラギン酸、１５６位の非天然グルタミン酸、１６９位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１９９位の非天然グルタミン酸、２０２位の非天然グルタミン酸、および２０７位の非天然グルタミン酸を含む。
抗体に基づくヘテロ二量体の場合、例えば、単量体のうちの少なくとも１つが、重鎖ドメインの他に軽鎖を含む場合、ｐＩ変異体も軽鎖に作製することができる。軽鎖のｐＩを低下させるためのアミノ酸置換は、限定されないが、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ、および軽鎖のＣ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加を含む。λ軽鎖定常領域に基づくこのカテゴリーにおける変更は、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ、およびＱ１９９Ｅでの１つ以上の置換を含む。さらに、軽鎖のｐＩの増加も行うことができる。
総合すると、０（ｐＩの改変が重鎖定常ドメインのみにおいて行われる場合）、１、２、３、４、５、６、または１０個の突然変異（Ｃκと比較して）を有する変異体軽鎖ドメインを利用するいくつかの実施形態は、図３７に示すように作製することができる。
アイソタイプ変異体
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの、特定の位置におけるよりｐＩアミノ酸の「組み込み」に依存しており、そうすることで、不要な免疫原性が変異体に導入される可能性を減少させるかまたは排除する。すなわち、高いエフェクター機能を含む様々な理由のために、ＩｇＧ１は、治療用抗体のための一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重鎖定常領域は、ＩｇＧ２の重鎖定常領域よりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。ＩｇＧ１骨格の特定の位置にＩｇＧ２残基を導入することにより、結果として得られる単量体のｐＩが低下し（または増加し）、付加的により長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有する：グルタミン酸を組み込むことは、結果として得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。後述するように、多くのアミノ酸置換が、通常、変異体抗体のｐＩに著しい影響を与えることが要求される。しかしながら、後述するように、たとえＩｇＧ２分子における変化であっても血清半減期の増加を可能にすることに留意されたい。
他の実施形態において、結果として得られるタンパク質の全体的な荷電状態を減少させるために（例えば、より高いｐＩのアミノ酸をより低いｐＩのアミノ酸に変更することにより）、または後に詳述するように、安定性等のための構造に適応できるように、非アイソタイプのアミノ酸変化を生じさせる。
さらに、重鎖および軽鎖の両方の定常ドメインのｐＩを改変することにより、ヘテロ二量体の各単量体に著しい変化を見ることができる。本明細書で論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異ならせることにより、分離が可能となる。
ｐＩの計算
各単量体のｐＩは、変異体重鎖定常ドメインのｐＩと、変異体重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含む全単量体のｐＩとに依存し得る。よって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、図中のチャートを使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて計算される。代替として、各単量体のｐＩを比較することもできる。
重鎖および軽鎖ｐＩ変異体
図３７に示すように、多くのｐＩ抗体が、重鎖および軽鎖のｐＩ変異体を用いて作製された。本明細書に概説されるように、また本発明に含まれることが具体的に意図されるように、図３７および配列表に示される任意のｐＩを改変した重鎖を、野生型軽鎖定常ドメインまたはｐＩを改変軽鎖定常ドメインのいずれとも組み合わせることができる。同様に、たとえ図３７に具体的に示されていない場合であっても、ｐＩを改変した軽鎖定常ドメインを、野生型重鎖定常ドメインまたはｐＩを改変した重鎖定常ドメインのいずれとも組み合わせることができる。すなわち、「ＨＣの名称」および「ＬＣの名称」のカラムは、全ての可能な組み合わせを含むマトリックスを形成することを意味する。
よって、総合すると、以下の重鎖定常ドメインの突然変異と軽鎖定常ドメインとのいずれの可能な組み合わせも作製することができ、各突然変異が任意選択的に包含または除外される：ａ）重鎖：１１９位の非天然グルタミン酸；１３１位の非天然システイン；１３３位の非天然アルギニン、リジン、またはグルタミン；１３７位の非天然グルタミン酸；１３８位の非天然セリン；１６４位の非天然グルタミン酸；１９２位の非天然アスパラギン；１９３位の非天然フェニルアラニン、１９６位の非天然リジン、１９９位の非天然スレオニン、２０３位の非天然アスパラギン酸、２０５位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２０８位の非天然アスパラギン酸、２１０位の非天然グルタミン酸またはグルタミン、２１４位の非天然スレオニン、２１７位の非天然アルギニンおよび２１９位の非天然システイン、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはスレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリンまたはスレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、および２３５位の欠失、２７４位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の非天然グルタミン酸、３３９位の非天然スレオニン、３５５位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギンまたはグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、および４４７位の欠失または非天然アスパラギン酸；ならびにｂ）軽鎖：１２６位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１４５位の非天然グルタミン、グルタミン酸、またはスレオニン；１５２位の非天然アスパラギン酸、１５６位の非天然グルタミン酸、１６９位の非天然グルタミンまたはグルタミン酸、１９９位の非天然グルタミン酸、２０２位の非天然グルタミン酸、および２０７位の非天然グルタミン酸。
同様に、重鎖および軽鎖定常ドメインの好適な対において生成することができる、１〜３７に及ぶ突然変異の数を図３７に示す（「合計突然変異数」カラム）。
本発明のｐＩ抗体の特性
本発明のｐＩ抗体は、変化したｐＩを有する異なる重鎖ドメインを有するため、結果としてヘテロ二量体抗体の精製がしやすい。一般に、少なくとも０．１〜０．５ｌｏｇの差（例えば、ｐＨポイントの１０％〜半分に相当する）がこの精製の利点を可能にし、少なくとも約１、１．５、２、２．５、および３の変化が本発明において特に使用される。当該技術分野で周知のように、ｐＩは、計算することができるか、または経験的に決定することができるかのいずれかである。さらに、５．０〜５．５〜６の範囲に及ぶｐＩを有するｐＩ抗体が、良好な長期の血清半減期を示すと考えられる。当業者には理解されるように、また図３０に示すように、これよりも低いｐＩを達成することは、ますます多くの突然変異が必要であり、物理的限界に達するため、困難である。
いくつかの実施形態において、本発明のｐＩ抗体は、血清半減期の増加を示す。図に示すように、驚くべきことに、調べた全てのｐＩ抗体が、出発分子と比較して半減期の増加を示した。半減期は、Ｆｖ部分を含む多くの要因によって影響を受けるが、本発明のｐＩ抗体を使用すると、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、および２５０％またはそれ以上の増加を得ることができる。図３４に示すように、ｐＩ変異体は、約４日〜１５日超、半減期を増加させることができる。
さらに、本明細書におけるいくつかの変異体は、安定性を増加させるように作製される。本明細書に記載するように、抗体の多くの特性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス速度（例えば、半減期の安定性）に影響を与える。ＦｃＲｎ受容体に結合する抗体に加えて、クリアランスおよび半減期に寄与する他の要因は、血清凝集、血清中の酵素分解、免疫系による除去をもたらす抗体の固有の免疫原性、抗原媒介性取り込み、ＦｃＲ（非ＦｃＲｎ）媒介性取り込み、および（例えば、異なる組織コンパートメントにおける）非血清分布である。
したがって、これらの特性のうちの１つ以上をもたらす、いくつかのさらなるアミノ酸置換を行うことができる。図３７に示すように、これは、限定されないが、２２２Ｋ、２７４Ｋ、２９６Ｙ、３００Ｙ、３３９Ａ、３５５Ｒ、３８４Ｎ、３９２Ｋ、３９７Ｖ、４１９Ｑ、２９６Ｙ／３００Ｙ、３８４Ｎ／３９２Ｋ／３９７Ｖ、１３７Ｇ、１３８Ｇ、１９２Ｓ、１９３Ｌ、１９９Ｉ、２０３Ｎ、２１４Ｋ、１３７Ｇ／１３８Ｇ、１９２Ｓ／１９３Ｇ、１９９Ｉ／２０３Ｎ、２１４Ｋ／２２２Ｋ、１３８Ｇ／１９２Ｓ／１９３Ｌ、および１３７Ｇ／１３８Ｇ／１９２Ｓ／１９３Ｌを含む。
ＩＩＩ．他のアミノ酸置換
当業者には理解されるように、本発明のｐＩ抗体は、ｐＩ変異体に加えてさらなるアミノ酸置換を含むことができる。
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ｐＩ変異体に適応するように、中性の荷電状態またはさらには荷電状態の増大にもかかわらず、１つのアイソタイプからｐＩ抗体に組み込まれる。これらは、「非ｐＩアイソタイプ変異体」または「適応変異体」と称されることもある。例えば、ＩｇＧ１の１３３位にある天然リジンをＩｇＧ２由来のアルギニンで置き換えることは、そのような変化であり、１９６位のＩｇＧ１にある天然グルタミンをＩｇＧ２リジンで置き換えること、２１７位の天然ＩｇＧ１プロリンをＩｇＧ２アルギニンで置き換えることも同様である。この場合、上述のように、ｐＩ変異体は、１３３位でも作製することができ、１３３位の非天然グルタミン酸またはグルタミンの代わりとなることに留意されたい。
ヒンジ領域（２３３〜２３６位）において、エフェクター機能を増加させるための変更を行うことができる。すなわち、ＩｇＧ２はエフェクター機能が低く、その結果として、ＰＶＡ（欠失）からのこれらの位置におけるアミノ酸置換をＥＬＬＧに変更することができ、さらなるＧ３２７Ａ変異体も生成される。
ＣＨ３領域において、例えば、非天然セリンを置換する、３８４位の突然変異を作製することができる。
作製することができるさらなる突然変異は、（抗体または融合抗体の構造に依存して）ＮもしくはＣ末端のいずれかの「尾部」または１つ以上のｐＩの低いもしくは高いアミノ酸の配列を付加することを含み、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸を、ＣＨ３のＣ末端またはアルギニンまたはリジンに加えることができる：通常、１〜５個のアミノ酸が加えられ、１、２、および４個が特に有用である。
いくつかの実施形態において、例えば、ＣＤ３に対する１つの結合部位と、腫瘍抗原に対する１つの結合部位（Ｍｉｃｒｏｍｅｔの「ＢｉＴＥ」に観念的に類似する）とを用いる実施形態の場合、エフェクター機能を減少させるかまたは排除するために、Ｆｃガンマ受容体に対するＦｃ領域の全ての結合をノックアウトすることが望ましいかもしれない。この実施形態において、２３６Ｒおよび３２８Ｒのいずれかまたは両方の組み込みは、本明細書に概説する変異体の任意の組み合わせで、任意選択的かつ独立して包含または除外することができる。
「ノブとホール」ヘテロ二量体変異体
上述のｐＩ変異体に加えて、立体変異体の付加により、ヘテロ二量体の形成を促進することができる。すなわち、各重鎖においてアミノ酸を変更することにより、異なる重鎖は、同じＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、ヘテロ二量体構造を形成するために会合する確率が高い。よって、ここでも同様に、ｐＩ精製変異体の場合、これらの変異体は、「対」または「セット」として使用されることが意図され、１つの重鎖は、１セットの置換を含むように変更され、他方の鎖は、対応するセットを含むように変更される。
よって、上述のｐＩ変異体に加えて、一方または両方の変異体重鎖領域は、任意選択的に、以下の変異体のうちの１つ以上も含むことができる。本発明の一実施形態において、前記変異体Ｆｃ領域は、３４９、３５１、３５４、３５６、３５７、３６４、３６６、３６８、３７０、３９２、３９４、３９５、３９６、３９７、３９９、４０１、４０５、４０７、４０９、４１１、および４３９位からなる群から選択される位置に少なくとも１つの置換を含む（番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックスに従う）。好ましい実施形態において、前記変異体Ｆｃ領域は、３４９Ａ、３４９Ｃ、３４９Ｅ、３４９Ｉ、３４９Ｋ、３４９Ｓ、３４９Ｔ、３４９Ｗ、３５１Ｅ、３５１Ｋ、３５４Ｃ、３５６Ｋ、３５７Ｋ、３６４Ｃ、３６４Ｄ、３６４Ｅ、３６４Ｆ、３６４Ｇ、３６４Ｈ、３６４Ｒ、３６４Ｔ、３６４Ｙ、３６６Ｄ、３６６Ｋ、３６６Ｓ、３６６Ｗ、３６６Ｙ、３６８Ａ、３６８Ｅ、３６８Ｋ、３６８Ｓ、３７０Ｃ、３７０Ｄ、３７０Ｅ、３７０Ｇ、３７０Ｒ、３７０Ｓ、３７０Ｖ、３９２Ｄ、３９２Ｅ、３９４Ｆ、３９４Ｓ、３９４Ｗ、３９４Ｙ、３９５Ｔ、３９５Ｖ、３９６Ｔ、３９７Ｅ、３９７Ｓ、３９７Ｔ、３９９Ｋ、４０１Ｋ、４０５Ａ、４０５Ｓ、４０７Ｔ、４０７Ｖ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４１１Ｄ、４１１Ｅ、４１１Ｋ、および４３９Ｄからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に概説する立体変異体を、任意選択的にかつ独立して、任意のｐＩ変異体とともに単量体に組み込むことができる。
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の各単量体は、１つ以上の立体変異体を含むように改変される：すなわち、下の表１および２、ならびに参照により組み込まれる米国特許出願第１２／８９７，０１５号の図５〜７に示すように、一方の単量体が少なくとも１つの変異体を含み、他方の単量体が異なる変異体を含む。
野生型のＦｃ領域と比較してヘテロ二量体の含量を増加させた変異体Ｆｃ領域が好ましい。調べた変異体を表１に示す。好ましい変異体対を表２に提供する。
ＩＶ．任意選択的かつ付加的なＦｃの改変
ＦｃＲｎの修飾
いくつかの実施形態において、本発明のｐＩ変異体は、ＦｃＲｎ結合ドメインのアミノ酸置換と組み合わせることができる。驚くべきことに、本発明は、ｐＩ変異体を、良好な二重特異性の形成、ＦｃＲｎ受容体へのより高い結合性、および半減期の増加をもたらすＦｃ変異体と、独立してかつ任意選択的に組み合わせることができることを示す。
本明細書において使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児型Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、いずれの生物に由来してもよい。当該技術分野で既知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と称される２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。本明細書に別途記載されない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。場合によっては、ＦｃＲｎ変異体は、ヒトＦｃＲｎ受容体に結合するか、または、臨床試験を行いやすくするために、それに加えてげっ歯類もしくは霊長類の受容体にも結合する変異体を設計することが望ましい場合がある。
様々なそのような置換が知られており、米国特許出願第１２／３４１，７６９号（その全体が本明細書に組み込まれ、具体的には、ＦｃＲｎの結合／または血清半減期を増加させる特定の変異体の引用のために本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態において、ｐＩ抗体は、以下の置換のいずれをも、単独でまたは組み合わせて含むように改変することができる：４３６Ｉ、４３６Ｖ、３１１Ｉ、３１１Ｖ、４２８Ｌ、４３４Ｓ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ、３０８Ｆ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌ、３０７Ｑ／４３４Ｓ、４３４Ａ、４３４Ｈ、２５０Ｑ／４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、３０７Ｑ／４３４Ａ、３０７Ｑ／／３８０Ａ／４３４Ａ、および３０８Ｐ／４３４Ａ。番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵであり、置換は出発分子に対して非天然であることを理解されたい。以前に示したように、これらのＦｃＲｎ置換は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッド骨格において作用し、具体的には、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４骨格、ならびに任意のＩｇＧアイソフォームの誘導体にも含まれる。
いくつかの実施形態において、米国特許出願公開第２０１１／００７６２７５号（参照により、明示的に本明細書に組み込まれる）に一般的に記載されるように、フレームワークまたはＣＤＲのいずれかの可変領域に対してｐＩの改変を行うことも可能である。
他の実施形態において、抗体の可変領域（複数可）にｐＩ変異体は作製されず、例えば、ある位置のアミノ酸または全タンパク質のｐＩを意図的に減少させるアミノ酸置換は行われない。これは、抗体のその抗原に対する結合親和性を増加させるように行われるが、加えられるアミノ酸のｐＩを結果的に低下させる場合がある可変領域（複数可）における親和性成熟による置換と区別されるべきである。可変領域（複数可）のｐＩ変異体は、概して、結合親和性に関して顕著に「サイレント」である。
Ｆｃの改変
ＦｃＲｎへの結合親和性を増加させるためおよび／または血清半減期を増加させるために行われる置換に加えて、概してＦｃγＲ受容体への結合を変化させるようにＦｃ領域において他の置換を行うことができる。
本明細書において使用される「Ｆｃガンマ受容体」または「ＦｃγＲ」または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーの任意のマンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーは、限定されないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７−６５（参照により、全体が本明細書に組み込まれる）、そして任意の未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプを含む。
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を変化させるように作製することができる多くの有用なＦｃ置換が存在する。結合の増加および結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、通常、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在反応）の増加をもたらすことが分かっている。同様に、特定の状況において、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害受容体）への結合の減少も有益であり得る。本発明において用いられるアミノ酸置換は、米国特許出願第１１／１２４，６２０号（特に図４１）、同第１１／１７４，２８７号、同１１／３９６，４９５号、同１１／５３８，４０６号（これらは全て、参照によりそれらの全体が明示的に本明細書に組み込まれ、具体的には、その中に開示される変異体のために本明細書に組み込まれる）に列挙されるものを含む。用いられる特定の変異体は、限定されないが次の通りである：２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、および２９９Ｔ。
Ｖ．他の抗体修飾
親和性成熟
いくつかの実施形態において、アミノ酸修飾は、抗体のＣＤＲのうちの１つ以上において行われる。一般に、いずれか１つのＣＤＲにおいて、１個または２個または３個のアミノ酸のみが置換され、通常、ＣＤＲのセット内で多くても４、５、６、７、８、９、または１０個の変更が行われる。しかしながら、いずれのＣＤＲにおいても、ゼロ個の置換、１個、２個、または３個の置換の任意の組み合わせが、いずれの他の置換とも独立してかつ任意選択的に組み合わされてもよいことを認識されたい。
場合によっては、ＣＤＲにおけるアミノ酸修飾は、「親和性成熟」と称される。「親和性成熟」抗体とは、１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変化（複数可）を有する抗体であり、それらの変化（複数可）を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。場合によっては、まれではあるが、抗体のその抗原への親和性を低下させることが望ましい場合があるものの、通常、これは好ましくない。
親和性成熟は、抗体の抗原に対する結合親和性を、「親」抗体と比較して少なくとも約１０％から５０〜１００〜１５０％もしくはそれ以上、または１〜５倍増加するために行うことができる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモルの、またはさらにはピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、既知の手順によって生成される。例えば、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのシャッフリングによる親和性成熟について記載するＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３を参照されたい。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓ，ｅｔ ａｌ．１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９−３８１３；Ｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９；およびＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６に記載されている。
代替として、本発明の抗体のＣＤＲのうちの１つ以上において、例えば、抗原に対する抗体の親和性を著しく変化させない「サイレント」なアミノ酸修飾を行うことができる。これらは、（本発明の抗体をコードする核酸に対して行われ得るように）発現を最適化することを含む多くの理由のために行うことができる。
よって、本発明のＣＤＲおよび抗体の定義には、変異体ＣＤＲおよび抗体が含まれる：すなわち、本発明の抗体は、Ａｂ７９およびＡｂ１９のＣＤＲのうちの１つ以上にアミノ酸修飾を含むことができる。さらに、後に概説するように、アミノ酸修飾は、フレームワークおよび定常領域を含むＣＤＲ以外の任意の領域において、独立してかつ任意選択的に行うことができる。
ＡＤＣの修飾
いくつかの実施形態において、本発明のｐＩ抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するように薬物と複合体化される。一般に、ＡＤＣは、腫瘍学用途において用いられ、細胞傷害性剤または細胞静止剤を局所送達するための抗体−薬物コンジュゲートの使用により、薬物部分の腫瘍への標的送達が可能となり、より高い有効性、より低い細胞毒性等を実現することができる。この技術の概要は、Ｄｕｃｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２１：５−１３（２０１０）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．１４（３）：１５４（２００８）、およびＳｅｎｔｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２３５−２４４（２００９）（これは全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に提供される。
よって、本発明は、薬物に複合体化されたｐＩ抗体を提供する。通常、複合体化は、後に詳述するように抗体への共有結合的な付着によって行われ、通常、リンカー、大抵はペプチド結合（後述するように、標的部位でのプロテアーゼによる切断に対して感受性を示すようにまたは示さないように設計することができる）に依存する。さらに、上述のように、リンカー−薬物単位（ＬＵ−Ｄ）の結合は、抗体内のシステインへの付着によって行うことができる。当業者には理解されるように、抗体当たりの薬物部分の数は、反応条件に応じて変化する可能性があり、薬物：抗体が１：１〜１０：１まで変化し得る。当業者には理解されるように、実際の数は平均である。
よって、本発明は、薬物に複合体化されたｐＩ抗体を提供する。後述のように、ＡＤＣの薬物は、任意の数の薬剤であってもよく、限定されないが、化学療法剤を含む細胞傷害性剤、増殖阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、あるいは放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）が提供される。他の実施形態において、本発明は、ＡＤＣを使用する方法をさらに提供する。
本発明において使用される薬物は、細胞障害性薬物、特に、癌の治療に使用されるものを含む。そのような薬物は、一般に、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗薬、天然物およびそれらの類似体を含む。例示的な細胞傷害性剤のクラスとして、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤およびチミジル酸合成酵素阻害剤等の酵素阻害剤、ＤＮＡ介入物質、ＤＮＡ切断剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジイネン、ポドフィロトキシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、分化誘導剤、およびタキソールが挙げられる。
これらのクラスのメンバーは、例えば、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシンおよびポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシドまたはリン酸エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキサン（タキソール、タキソテールレチノイン酸を含む）、酪酸、Ｎ８−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、エン−ジイン、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、カリチアマイシン、カンプトテシン、メイタンシノイド（ＤＭ１を含む）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ならびにメイタンシノイド（ＤＭ４）およびそれらの類似体を含む。
毒素は、抗体−毒素コンジュゲートとして使用されてもよく、ジフテリア毒素等の細菌性毒素、リシン等の植物毒素、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３）、およびカリチアマイシン（Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）を含む。毒素は、チュブリン結合、ＤＮＡ結合、またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって、それらの細胞傷害作用および細胞静止作用を発揮することができる。
ｐＩ抗体と、１つ以上の小分子毒素、例えば、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、トリコテシン、カリチアマイシン、およびＣＣ１０６５、ならびにこれらの毒素の毒素活性を有する誘導体とのコンジュゲートが企図される。
メイタンシノイド
メイタンシノイド薬物部分として使用するのに好適なメイタンシン化合物は、当該技術分野で周知であり、既知の方法に従って天然の源から単離することができ、遺伝子工学技術を用いて生成することができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２００２）ＰＮＡＳ９９：７９６８−７９７３を参照）か、または既知の方法に従って合成的に調製されたメイタンシノールおよびメイタンシノール類似体であってもよい。後述するように、薬物は、抗体への複合体化のために、チオールまたはアミン基等の機能的に活性な基の組み込みによって修飾されてもよい。
例となるメイタンシノイド薬物部分は、修飾された芳香環を有するもの、例えば、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２の水酸化リチウムアルミニウム還元により調製されるＰ２）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−出メチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および同第４，３０７，０１６号）（ストレプトマイセスもしくはアクチノマイセスを用いた脱メチル化、またはＬＡＨを用いた脱塩素によって調製される）；およびＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（アシルクロリドを用いたアシル化によって調製される）、ならびに他の位置に修飾を有するものを含む。
例となるメイタンシノイド薬物部分はまた、修飾を有するもの、例えば、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって調製される）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジアから調製される）；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの変換によって調製される）；Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）（トレウィアヌドルフローラから単離される）；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）（ストレプトマイセスによるメイタンシノールの脱メチル化によって調製される）；ならびに４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製される）も含む。
特に利用されるのは、ＤＭ１（参照により組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号に開示される）およびＤＭ４（参照により組み込まれる米国特許第７，２７６，４９７号に開示される）である。５，４１６，０６４号、国際公開第ＷＯ／０１／２４７６３号、同第７，３０３，７４９号、同第７，６０１，３５４号、米国特許出願第１２／６３１，５０８号、国際公開第ＷＯ０２／０９８８８３号、同第６，４４１，１６３号、同第７，３６８，５６５号、国際公開第ＷＯ０２／１６３６８号、および国際公開第ＷＯ０４／１０３３２７２号（これらは全て、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる）に記載される多くのさらなるメイタンシノイド誘導体および方法も参照されたい。
メイタンシノイドを含むＡＤＣ、それを作製する方法、およびそれらの治療的用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；同第５，４１６，０６４号；同第６，４４１，１６３号、および欧州特許第ＥＰ０ ４２５ ２３５ Ｂ１号に開示され、これらの開示は、参照により明示的に本明細書に組み込まれ得る。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）は、ヒト結腸直腸癌を標的とするモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合させたＤＭ１と表されるメイタンシノイドを含むＡＤＣについて記載した。コンジュゲートは、培養された結腸癌細胞に対して高度に細胞毒性を示すことが見出され、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。
Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）は、ヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、またＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に、ジスフィルドリンカーを介してメイタンシノイドが複合体化されたＡＤＣについて記載している。細胞当たり３×１０５のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＡ．１−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を調べた。薬物コンジュゲートは、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることによって増加可能である遊離メイタンシノイド薬と同様の細胞毒性の程度を達成した。Ａ７−メイタンシノイドコンジュゲートは、マウスにおいて低い全身性の細胞毒性を示した。
アウリスタチンおよびドラスタチン
いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド類似体および誘導体であるアウリスタチンと複合体化されたｐＩ抗体を含む（米国特許第５，６３５，４８３号；同第５，７８０，５８８号）。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管の動態、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞の分裂に干渉すること（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、抗癌活性（米国特許第５，６６３，１４９号）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ （１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示されている。ドラスタチンまたはアウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に付着してもよい（国際公開第ＷＯ０２／０８８１７２号）。
例となるアウリスタチンの実施形態は、’’Ｓｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅ ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６２３，ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ Ｍａｒ．２８，２００４に開示され、米国特許公開２００５／０２３８６４８号（その開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる）に記載される、Ｎ末端で連結されたモノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含む。
例となるアウリスタチンの実施形態は、ＭＭＡＥである（図１０に示す：波形の線は、抗体薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合的な付着を意味している。参照によりその全体が明示的に組み込まれる米国特許第６，８８４，８６９号を参照のこと）。
別の例となるアウリスタチンの実施形態は、図１０に示すＭＭＡＦであり、波形の線は、抗体薬物コンジュゲートのリンカー（Ｌ）への共有結合的な付着を意味している（参照により、それらの全体が明示的に組み込まれる米国特許出願第２００５／０２３８６４９号、同第５，７６７，２３７号、および同第６，１２４，４３１号）。
ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦおよび種々のリンカー成分（本明細書において詳述する）を含むさらなる例となる実施形態は、次の構造および省略形を有する（Ａｂは抗体を意味し、ｐは１〜約８である）。
典型的には、ペプチドに基づく薬物部分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチド断片の間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。そのようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野で周知の液相合成方法（Ｅ．ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｅｂｋｅ、「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照）に従って調製することができる。アウリスタチン／ドラスタチン薬物部分は、米国特許第５，６３５，４８３号；米国特許第５，７８０，５８８号；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９８）抗Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ１３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６，７１９−７２５；Ｐｅｔｔｉｔ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ ５：８５９−８６３；およびＤｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（７）：７７８−７８４に従って調製されてもよい。
カリチアマイシン
他の実施形態において、ＡＤＣは、１つ以上のカリチアマイシン分子と複合体化された本発明の抗体を含む。例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇは、最初に市販されたＡＤＣ薬物であり、カリチアマイシンγ１をペイロードとして用いる（参照によりその全体が組み込まれる米国特許第４，９７０，１９８号を参照のこと）。さらなるカリチアマイシン誘導体は、米国特許第５，２６４，５８６号、同第５，３８４，４１２号、同第５，５５０，２４６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７７３，００１号、同第５，７６７，２８５号、同第５，８７７，２９６号（参照により全て明示的に組み込まれる）に記載される。カリチアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル濃度未満で二本鎖ＤＮＡの切断を生じさせることができる。カリチアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、同第５，８７７，２９６号（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照のこと。使用され得るカリチアマイシンの構造的類似体は、限定されないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α２Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ、およびθＩ１を含む（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄに対する前述の米国特許）。抗体を複合体化させることができる別の抗腫瘍薬は、葉酸代謝拮抗剤であるＱＦＡである。カリチアマイシンおよびＱＦＡは、どちらも細胞内の作用部位を有し、形質膜を容易に横断しない。したがって、抗体媒介性の内部移行によるこれらの薬剤の細胞取込みは、これらの細胞毒性効果を大きく増強する。
デュオカルマイシン
ＣＣ−１０６５（参照により組み込まれる４，１６９，８８８を参照）およびデュオカルマイシンは、ＡＤＣに用いられる抗腫瘍性抗生物質のファミリーのメンバーである。これらの抗生物質は、副溝内のアデニンのＮ３でＤＮＡを配列選択的にアルキル化し、アポトーシスを引き起こす事象のカスケードを開始することによって作用すると考えられる。
デュオカルマイシンの重要なメンバーは、デュオカルマイシンＡ（参照により組み込まれる米国特許第４，９２３，９９０号）およびデュオカルマイシンＳＡ（参照により組み込まれる米国特許第５，１０１，０３８号）、ならびに米国特許第７，５１７，９０３号、同第７，６９１，９６２号、同第５，１０１，０３８号；同第５，６４１，７８０号；同第５，１８７，１８６号；同第５，０７０，０９２号；同第５，０７０，０９２号；同第５，６４１，７８０号；同第５，１０１，０３８号；同第５，０８４，４６８号、同第５，４７５，０９２号、同第５，５８５，４９９号、同第５，８４６，５４５号、国際公開第ＷＯ２００７／０８９１４９号、同第ＷＯ２００９／０１７３９４Ａ１号、同第５，７０３，０８０号、同第６，９８９，４５２号、同第７，０８７，６００号、同第７，１２９，２６１号、同第７，４９８，３０２号、および同第７，５０７，４２０号（これらは全て、参照により明示的に組み込まれる）に記載されるような多数の類似体を含む。
ＶＩ．他の細胞傷害性剤
本発明の抗体と複合体化させることができる他の抗腫瘍剤は、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、および５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、同第５，７７０，７１０号に記載される集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られる薬剤のファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）を含む。
使用することができる酵素的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開された国際公開第ＷＯ９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡリボヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼＤＮａｓｅ等））との間に形成されるＡＤＣをさらに企図する。
腫瘍の選択的破壊のために、抗体は、放射性の高い原子を含んでもよい。様々な放射性同位元素が、放射性コンジュゲート抗体の生成のために利用可能である。例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。
放射性方式または他の標識が、既知の方法でコンジュゲートに組み込まれてもよい。例えば、ペプチドは、生合成されてもよいか、または例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を用いた化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、およびＩｎ１１１等の標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して付着させることができる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して付着させることができる。ヨウ素−１２３を組み込むために、ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）が使用されてもよい。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）は、他の方法を詳細に記載している。
複数の抗体を含む組成物の場合、薬物負荷は、抗体当たりの薬物分子の平均数ｐによって表される。薬物負荷は、抗体当たり１〜２０個の範囲の薬物（Ｄ）であってもよい。複合体化反応物の調製における抗体当たりの薬物の平均数は、質量分析法、ＥＬＩＳＡアッセイ、およびＨＰＬＣ等の従来の方法によって特徴付けることができる。ｐの観点からの抗体−薬物−コンジュゲートの定量的分布もまた決定することができる。
ある場合において、ｐが、他の薬物負荷を有する抗体−薬物−コンジュゲートからの特定の値である場合、均一な抗体−薬物−コンジュゲートの分離、精製、および性質決定は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動法等の手段によって達成され得る。例示的な実施形態において、ｐは、２、３、４、５、６、７、もしくは８、またはその分数である。
抗体−薬物コンジュゲート化合物の生成は、当業者に既知のいずれの技術によっても達成することができる。端的に述べると、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、抗体単位としてのｐＩ抗体、薬物、および任意選択的に、薬物と結合剤とを結合するリンカーを含むことができる。
薬物および／またはリンカーの結合剤への共有結合的な付着には、多くの異なる反応が利用可能である。これは、結合剤、例えば、抗体分子のアミノ酸残基（リジンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基、および芳香族アミノ酸の種々の部分を含む）の反応によって達成することができる。一般的に用いられる共有結合的な付着の非特異的な方法は、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基を抗体のアミノ（またはカルボキシ）基に結合するカルボジイミド反応である。また、ジアルデヒドまたはイミドエステル等の二官能性物質が、化合物のアミノ基を抗体分子のアミノ基に結合するために用いられている。
また、シッフ塩基反応も、薬物の結合剤への付着に利用可能である。この方法は、グリコールまたはヒドロキシ基を含む薬物を過ヨウ素酸酸化することを伴い、よってアルデヒドを形成し、次いでそれを結合剤と反応させる。付着は、結合剤のアミノ基を用いたシッフ塩基の形成を介して生じる。結合剤に薬物を共有結合的に付着させるためのカップリング剤として、イソチオシアネートも使用することができる。他の技術は、当業者に既知であり、本発明の範囲内である。
いくつかの実施形態において、リンカーの前駆物質である中間体を、適切な条件下で薬物と反応させる。他の実施形態において、反応性の基が、薬物および／または中間体に対して用いられる。薬物と中間体との反応の生成物、または誘導体化薬物を、その後、適切な条件下で本発明のｐＩ抗体と反応させる。
また、化合物の反応を、本発明のコンジュゲートを調製する目的により都合のよいものにするために、所望の化合物に対して化学修飾が行われてもよいことを理解されたい。例えば、官能基、例えば、アミン、ヒドロキシル、またはスルフヒドリルが、薬物の活性または他の特性に対する最小限のまたは許容可能な作用を有する位置で、薬物に付加されてもよい。
ＶＩＩ．リンカー単位
典型的には、抗体−薬物コンジュゲート化合物は、薬物単位と抗体単位との間にリンカー単位を含む。いくつかの実施形態において、リンカーの切断により、適切な環境において抗体から薬物単位が放出されるように、リンカーは、細胞内または細胞外条件下で切断可能である。例えば、特定のプロテアーゼを分泌する固体腫瘍は、切断可能なリンカーの標的として機能し得、他の実施形態において、細胞内プロテアーゼが用いられる。さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は、例えば、リソソームにおける抗体の分解によって放出される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（限定されないが、リソソームプロテアーゼもしくはエンドソームプロテアーゼを含む）によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長またはそれ以上である。
切断剤は、限定されないが、カテプシンＢおよびカテプシンＤならびにプラスミンを含むことができ、これらの全ては、標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすジペプチド薬物誘導体を加水分解することが知られている（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３を参照）。ＣＤ３８を発現する細胞に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカー。例えば、癌組織において高度に発現される、チオール依存性プロテアーゼであるカテプシン−Ｂによって切断可能なペプチジルリンカーを使用することができる（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカー（配列番号Ｘ））。そのようなリンカーの他の例は、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号（参照により、その全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる）に記載される。
いくつかの実施形態において、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例えば、ｖａｌ−ｃｉｔリンカーを用いたドキソルビシンの合成について記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）。
他の実施形態において、切断可能なリンカーはｐＨ感受性であり、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に感受性である。典型的には、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解が可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解が可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等）が、使用され得る。（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号；同第５，６２２，９２９号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照のこと。）そのようなリンカーは、例えば、血液中の条件等の中性ｐＨ条件下では比較的安定であるが、およそリソソームのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。特定の実施形態において、加水分解が可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合したチオエーテル等）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスフィルドリンカー）。例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）、およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを用いて形成することができるものを含む、様々なジスフィルドリンカーが当該技術分野で既知である。（例えば、Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４−５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ，１９８７を参照。また、米国特許第４，８８０，９３５も参照のこと）
他の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、または３’−Ｎ−アミド類似体（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
さらに他の実施形態において、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は抗体の分解によって放出される（参照により、その全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２３８６４９号を参照のこと）。
多くの実施形態において、リンカーは自壊性である。本明細書において使用される場合、用語「自壊的スペーサー」は、２つの離れた化学部分と一緒に共有結合して３成分分子を形成することができる二官能性の化学部分を指す。該スペーサーは、第１の部分への結合が切断されると、第２の化学部分から自発的に分離する。例えば、薬物と切断可能な基質とが自壊的リンカーによって任意選択的に連結される薬物切断可能な基質コンジュゲートを対象とする国際公開第ＷＯ２００７０５９４０４Ａ２号、同第ＷＯ０６１１０４７６Ａ２号、同第ＷＯ０５１１２９１９Ａ２号、同第ＷＯ２０１０／０６２１７１号、同第ＷＯ０９／０１７３９４号、同第ＷＯ０７／０８９１４９号、同第ＷＯ０７／０１８４３１号、同第ＷＯ０４／０４３４９３号、および同第ＷＯ０２／０８３１８０（これらは全て、参照により明示的に組み込まれる）を参照のこと。
リンカーは、細胞外環境に対して実質的に感受性ではないことが多い。本明細書において使用される場合、リンカーに関して「細胞外環境に対して実質的に感受性でない」とは、抗体−薬物コンジュゲート化合物が細胞外環境に（例えば、血漿中に）存在する場合、抗体−薬物コンジュゲート化合物の試料中で、リンカーが約２０％、１５％、１０％、５％、３％以下、または約１％を超えて切断されないことを意味する。
リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性でないかどうかは、例えば、抗体−薬物コンジュゲート化合物を所定の時間（例えば、２時間、４時間、８時間、１６時間、または２４時間）血漿とともにインキュベートし、次いで、血漿中に存在する遊離薬物の量を定量化することによって確認することができる。
他の相互排他的ではない実施形態において、リンカーは、細胞内部移行を促進する。特定の実施形態において、リンカーは、治療剤と複合体化された時に（すなわち、本明細書に記載される抗体−薬物コンジュゲート化合物のリンカー−治療剤部分の環境において）、細胞内部移行を促進する。さらに他の実施形態において、リンカーは、アウリスタチン化合物および本発明のｐＩ抗体の両方と複合体化された時に細胞内部移行を促進する。
本発明の組成物および方法とともに使用することができる様々な例示的なリンカーが、国際公開第ＷＯ２００４−０１０９５７号、米国特許出願公開第２００６／００７４００８号、米国特許出願公開第２００５０２３８６４９、および米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号（これらは各々、参照によりその全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＶＩＩＩ．薬物負荷
薬物負荷は、ｐによって表され、分子中の抗体当たりの薬物部分の平均数である。薬物負荷（「ｐ」）は、抗体当たり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の部分（Ｄ）であり得るが、平均数は高い頻度で分数または小数である。通常、１〜４の薬物負荷が有用であることが多く、また１〜２も有用である。本発明のＡＤＣは、１〜２０個に及ぶ薬物部分と複合体化された抗体の集合を含む。複合体化反応からのＡＤＣの調製における抗体当たりの薬物部分の平均数は、質量分析法およびＥＬＩＳＡアッセイ等の従来の手段によって特徴付けることができる。
Ｐの観点からのＡＤＣの定量的分布もまた確認することができる。いくつかの場合において、ｐが、他の薬物負荷を有するＡＤＣからの特定の値である場合、均一なＡＤＣの分離、精製、および性質決定は、電気泳動法等の手段によって達成され得る。
いくつかの抗体−薬物コンジュゲートの場合、ｐは、抗体上の付着部位の数によって限定され得る。例えば、付着部がシステインチオールである場合、前述の例示的な実施形態のように、抗体は、唯一のもしくはいくつかのシステインチオール基を有してもよいか、またはそれを介してリンカーが付着することができる唯一のもしくはいくつかの十分に反応性のチオール基を有してもよい。特定の実施形態において、より高い薬物負荷、例えば、ｐ＞５は、特定の抗体−薬物コンジュゲートの凝縮、不溶性、毒性、または細胞透過性の損失を引き起こし得る。ある特定の実施形態において、本発明のＡＤＣの薬物負荷は、１〜８、約２〜６、約３〜５、約３〜４、約３．１〜３．９、約３．２〜３．８、約３．２〜３．７、約３．２〜３．６、約３．３〜３．８、または約３．３〜３．７の範囲である。実際に、特定のＡＤＣの場合、抗体当たりの薬物部分の最適な比率は、８未満であってもよく、また約２〜５であってもよいことが示されている。米国特許出願第２００５−０２３８６４９ Ａ１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
特定の実施形態において、複合体化反応の間に、薬物部分の最大理論値よりも少ない薬物部分が抗体と複合体化される。抗体は、後述するように、例えば、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応しないリジン残基を含んでもよい。一般に、抗体は、薬物部分に連結し得る多くの遊離および反応性システインチオール基を含まない：実際には、抗体にあるほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。特定の実施形態において、反応性システインチオール基を作製するために、部分的または完全な還元条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）等の還元剤を用いて抗体が還元されてもよい。特定の実施形態において、リジンまたはシステイン等の反応性求核基を曝露するために、抗体が変性条件に供される。
ＡＤＣの負荷（薬物／抗体の比率）は、様々な方法で、例えば、（ｉ）抗体に対するモル過剰な薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬を制限することによって、（ｉｉ）複合体化反応の時間または温度を制限することによって、（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的または限定的な還元条件によって、（ｉｖ）リンカー−薬物付着部の数および／または位置を制御するためにシステイン残基の数および位置が調節されるように、組み換え技術によって抗体のアミノ酸配列を改変することによって（本明細書および国際公開第ＷＯ２００６／０３４４８８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるように調製されるチオＭａｂまたはチオＦａｂ）制御することができる。
１つ以上の求核基が、薬物−リンカー中間体またはリンカー試薬と反応し、次いで薬物部分試薬と反応する場合、結果として得られる生成物は、抗体に付着した１つ以上の薬物部分が分布するＡＤＣ化合物の混合物であることを理解されたい。抗体当たりの薬物の平均数は、抗体に特異的かつ薬物に特異的なデュアルＥＬＩＳＡ抗体アッセイによって混合物から計算することができる。個々のＡＤＣ分子は、質量分析法によって混合物中で同定し、ＨＰＬＣ、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって分離してもよい。
いくつかの実施形態において、単一の負荷値を有する均一なＡＤＣを、電気泳動またはクロマトグラフィーによって複合体化混合物から単離してもよい。
ＡＤＣの細胞傷害作用を確認する方法
薬物または抗体−薬物コンジュゲートが、細胞に対して細胞静止作用および／または細胞傷害作用を発揮するかどうかを確認する方法は既知である。一般に、抗体薬物コンジュゲートの細胞傷害活性または細胞静止活性は、抗体薬物コンジュゲートの標的タンパク質を発現する哺乳類細胞を細胞培養培地に曝露し、約６時間〜約５日の期間細胞を培養し、細胞生存率を測定することによって測定することができる。細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、生存率（増殖）、細胞傷害性、および抗体薬物コンジュゲートのアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定することができる。
体薬物コンジュゲートが細胞静止作用を発揮するかどうかを確認するために、チミジン組み込みアッセイが用いられてもよい。例えば、９６ウェルプレートに５，０００細胞／１ウェルの密度で標的抗原を発現する癌細胞を７２時間の期間にわたって培養し、７２時間の期間の最後の８時間の間に０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンに曝露することができる。３Ｈ−チミジンの培養細胞への組み込みは、抗体薬物コンジュゲートの存在下および非存在下で測定される。
細胞傷害性を確認するために、壊死またはアポトーシス（プログラム細胞死）を測定することができる。壊死は、典型的には、原形質膜の透過性の増加、細胞の膨張、および原形質膜の破裂によって達成される。アポトーシスは、典型的には、膜小胞形成、細胞質の凝集、および内因性エンドヌクレアーゼの活性化によって特徴付けられる。癌細胞に対するこれらの作用のいずれかが確認されるということは、抗体薬物コンジュゲートが癌の治療に有用であることを意味する。
細胞生存率は、ニュートラルレッド、トリパンブルー、またはＡＬＡＭＡＲ（商標）ブルー等の色素の取り込みを細胞において確認することによって測定することができる（例えば、例えば、Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３：４７３−４７６を参照のこと）。このようなアッセイでは、色素を含む培地中で細胞をインキュベートし、細胞を洗浄し、色素の細胞取り込みを反映する残留色素を分光光度的に測定する。また、タンパク質結合色素スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）を使用して細胞傷害性を測定することもできる（Ｓｋｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１０７−１２）。
代替として、生細胞を検出するが死滅細胞は検出しないことによる哺乳類細胞の生存および増殖に関する比色分析アッセイに、ＭＴＴ等のテトラゾリウム塩が用いられる（例えば、Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３を参照のこと）。
アポトーシスは、例えば、ＤＮＡ断片化を測定することによって定量することができる。ＤＮＡ断片化をｉｎ ｖｉｔｒｏで定量的に決定するための商業的な測光法が利用可能である。ＴＵＮＥＬ（断片化されたＤＮＡにおける標識ヌクレオチドの組み込みを検出する）およびＥＬＩＳＡベースのアッセイを含む、このようなアッセイの例は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ，１９９９，ｎｏ．２，ｐｐ．３４−３７（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に記載されている。
アポトーシスはまた、細胞における形態学的変化を測定することによって確認することもできる。例えば、壊死と同様に、原形質膜の完全性の喪失は、特定の色素（例えば、蛍光色素、例えば、アクリジンオレンジまたは臭化エチジウム等）の取り込みを測定することによって確認することができる。アポトーシス細胞数を測定するための方法は、Ｄｕｋｅ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９９２，ｐｐ．３．１７．１−３．１７．１６）に記載されている。また、ＤＮＡ色素（例えば、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、またはヨウ化プロピジウム）で細胞を標識し、クロマチンの凝集および核内膜に沿った辺縁趨向について細胞を観察することもできる。アポトーシスを確認するために測定することができる他の形態学的変化は、例えば、細胞質の凝集、膜小胞形成の増加、および細胞の収縮を含む。
アポトーシス細胞の存在は、培養物の付着区画および「浮遊」区画の両方において測定することができる。例えば、どちらの区画とも、上清を除去し、付着した細胞をトリプシン処理し、遠心分離による洗浄ステップ（例えば、２０００ｒｐｍで１０分）の後に調製物を組み合わせ、（例えば、ＤＮＡ断片化を測定することによって）アポトーシスを検出することによって、収集することができる。（例えば、Ｐｉａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：３１１０−１６を参照されたい）。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、本発明のｐＩ抗体の治療用組成物の効果は、好適な動物モデルにおいて評価することができる。例えば、異種癌モデルを使用することができ、癌外植片または継代された異種移植片組織が、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス等の免疫不全動物に導入される（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２−４０８）。有効性は、腫瘍形成の阻害、腫瘍の退縮または転移等を測定するアッセイを用いて予測することができる。
上述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に好適な担体を含む薬学的組成物に製剤化することができる。好適な担体は、治療用組成物と組み合わせた時に、治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ概して患者の免疫系に非反応性である、任意の材料を含む。例として、限定されないが、滅菌リン酸緩衝食塩水溶液、静菌水等を含む多くの標準的な薬学的担体のいずれかが挙げられる（一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓａｌ．，Ｅｄ．，１９８０を参照のこと）。
グリコシル化
別の種類の共有結合修飾は、グリコシル化における変化である。別の実施形態において、本明細書に開示される抗体は、１つ以上の改変されたグリコフォームを含むように修飾することができる。本明細書において使用される「改変されたグリコフォーム」は、抗体に共有結合的に付着した炭水化物組成物を意味し、前記炭水化物組成物は、親抗体の組成物とは化学的に異なる。改変されたグリコフォームは、限定されないが、エフェクター機能の増強または低減を含む、様々な目的に有用であり得る。改変されたグリコフォームの好ましい形態は脱フコシル化であり、恐らくはＦｃγＲＩＩＩａ受容体へのより密接な結合によって、ＡＤＣＣ機能の増加と相関することが示されている。この文脈において、「脱フコシル化」とは、宿主細胞において生成される抗体の大半が実質的にフコースに欠けており、例えば、生成された抗体の９０−９５−９８％が、抗体の炭水化物部分（通常、Ｆｃ領域のＮ２９７に付着する）の成分として認識できるフコースを有しないことを意味する。機能的に定義すると、脱フコシル化された抗体は、通常、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して少なくとも５０％またはそれよりも高い親和性を示す。
改変されたグリコフォームは、当該技術分野で既知の様々な方法によって生成することができる（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６−３４７３；米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ００／６１７３９Ａ１号；国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ０１／２９２４６Ａ１号；国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ０２／３１１４０Ａ１号；国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ０２／３０９５４Ａ１号（全て、参照により全体が組み込まれる）；（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術［Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ］；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）グリコシル化改変技術［Ｇｌｙｃａｒｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］）。これらの技術の多くは、例えば、改変されたまたは別様の種々の生物または細胞株（例えばＬｅｃ−１３ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）においてＩｇＧを発現させることによって、グリコシル化経路に関与する酵素（例えばＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスフェラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を制御することによって、またはＩｇＧが発現された後に炭水化物（複数可）を修飾することによって、フコシル化のレベルを制御することおよび／またはＦｃ領域に共有結合的に付着するオリゴ糖を二分することに基づいている。例えば、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「糖改変された抗体」または「ＳＥＡ技術」は、生成中のフコシル化を阻害する修飾糖類を加えることによって機能する：例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２００９０３１７８６９を参照のこと。改変されたグリコフォームは、典型的には、異なる炭水化物またはオリゴ糖を指す：よって、抗体は、改変されたグリコフォームを含むことができる。
代替として、改変されたグリコフォームは、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体を指してもよい。当該技術分野で既知であるように、グリコシル化のパターンは、タンパク質の配列（例えば、後述する特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）、またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。具体的な発現系については後に記載する。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。よって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが用いられてもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにアミノ酸配列を変化させることによって共有結合的に達成される（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。変化はまた、出発配列への１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基の付加によって、または置換によって行われてもよい（Ｏ結合グリコシル化部位の場合）。容易にするために、特に、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが生成されるように、予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を通して抗体のアミノ酸配列を変化させることが好ましい。
抗体の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質へのグリコシドへの化学的または酵素カップリングによるものである。これらの手順は、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化のためにグリコシル化能力を有する宿主細胞におけるタンパク質の生成を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に依存して、糖（複数可）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもの等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもの等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもの等の芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させてもよい。これらの方法は、国際公開第ＷＯ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されており、両方とも、参照により全体が組み込まれる。
（例えば、翻訳後に）出発抗体に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシルは、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理は、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分または全ての糖の切断をもたらす一方で、ポリペプチドを無傷なままで残す。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２によって、およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載されており、両方とも、参照により全体が組み込まれる。ポリペプチドの炭水化物部分の酵素切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（参照により、全体が組み込まれる）によって記載されるような様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。可能性のあるグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５（参照により、全体が組み込まれる）によって記載されるような化合物ツニカマイシンの使用により防止することができる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。
抗体の別の種類の共有結合修飾は、例えば、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの２００５−２００６ ＰＥＧ Ｃａｔａｌｏｇ（Ｎｅｋｔａｒウェブサイトで入手可能）、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７（全て、参照により全体が組み込まれる）に記載される様式で、限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン等の種々のポリオールを含む種々の非タンパク質性ポリマーに抗体を結合させることを含む。さらに、当該技術分野で既知であるように、ＰＥＧ等のポリマーの付加を容易にするために、抗体内の種々の位置にアミノ酸置換が行われてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００５／０１１４０３７Ａ１（参照により全体が組み込まれる）を参照のこと。
核酸および宿主細胞
本発明には、本発明のｐＩ抗体をコードする核酸が含まれる。重鎖および軽鎖の両方の定常ドメインがｐＩ抗体に含まれる場合、通常、これらは、四量体構造の抗体を生成するために標準的な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞等）内に組み合わされる、各々をコードする核酸を用いて作製される。唯一のｐＩを改変した定常ドメインが作製される場合、単一の核酸のみが用いられる。
標識
当業者には理解されるように、多様な抗原結合ドメイン、例えば、Ｆｖ領域が、本発明において使用されてもよい。限定されないが、サイトカイン等の可溶性因子および膜結合因子の両方を含む以下に列挙する標的抗原に属する、タンパク質、サブ単位、ドメイン、部分、および／またはエピトープを含む、実質的にいずれの抗原がＩｇＧ変異体によって標的とされてもよい：膜貫通受容体：１７−ＩＡ、４−１ＢＢ、４Ｄｃ、６−ケト−ＰＧＦ１ａ、８−イソ−ＰＧＦ２ａ、８−オキソ−ｄＧ、Ａ１アデノシン受容体、Ａ３３、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、アクチビン、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＲＩＡ、アクチビンＲＩＡ ＡＬＫ−２、アクチビンＲＩＢ ＡＬＫ−４、アクチビンＲＩＩＡ、アクチビンＲＩＩＢ、ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭＴＳ、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、アドレシン、ａＦＧＦ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ、ＡＬＫ−１、ＡＬＫ−７、α−１−アンチトリプシン、α−Ｖ／β−１アンタゴニスト、ＡＮＧ、Ａｎｇ、ＡＰＡＦ−１、ＡＰＥ、ＡＰＪ、ＡＰＰ、ＡＰＲＩＬ、ＡＲ、ＡＲＣ、ＡＲＴ、アルテミン、抗Ｉｄ、ＡＳＰＡＲＴＩＣ、心房性ナトリウム利尿因子、ａｖ／ｂ３インテグリン、Ａｘｌ、ｂ２Ｍ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ、Ｂリンパ球刺激因子（ＢｌｙＳ）、ＢＡＣＥ、ＢＡＣＥ−１、Ｂａｄ、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、Ｂａｘ、ＢＣＡ−１、ＢＣＡＭ、Ｂｃｌ、ＢＣＭＡ、ＢＤＮＦ、ｂ−ＥＣＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＩＤ、Ｂｉｋ、ＢＩＭ、ＢＬＣ、ＢＬ−ＣＡＭ、ＢＬＫ、ＢＭＰ、ＢＭＰ−２ ＢＭＰ−２ａ、ＢＭＰ−３オステオゲニン、ＢＭＰ−４ ＢＭＰ−２ｂ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ Ｖｇｒ−１、ＢＭＰ−７（ＯＰ−１）、ＢＭＰ−８（ＢＭＰ−８ａ、ＯＰ−２）、ＢＭＰＲ、ＢＭＰＲ−ＩＡ（ＡＬＫ−３）、ＢＭＰＲ−ＩＢ（ＡＬＫ−６）、ＢＲＫ−２、ＲＰＫ−１、ＢＭＰＲ−ＩＩ（ＢＲＫ−３）、ＢＭＰｓ、ｂ−ＮＧＦ、ＢＯＫ、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、ＢＰＤＥ、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ、ＢＴＣ、補体因子３（Ｃ３）、Ｃ３ａ、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ１０、ＣＡ１２５、ＣＡＤ−８、カルシトニン、ｃＡＭＰ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＣＢＬ、ＣＣＩ、ＣＣＫ２、ＣＣＬ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９／１０、ＣＣＲ、ＣＣＲ１、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ７４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５２、ＣＤ１６４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＦＴＲ、ｃＧＭＰ、ＣＩＮＣ、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、ＣＫｂ８−１、ＣＬＣ、ＣＭＶ、ＣＭＶ ＵＬ、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＮ−１、ＣＯＸ、Ｃ−Ｒｅｔ、ＣＲＧ−２、ＣＴ−１、ＣＴＡＣＫ、ＣＴＧＦ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＬ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＤＡＮ、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、崩壊促進因子、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、Ｄｈｈ、ジゴキシン、ＤＮＡＭ−１、デオキシリボヌクレアーゼ、Ｄｐｐ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、Ｄｔｋ、ＥＣＡＤ、ＥＤＡ、ＥＤＡ−Ａ１、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＥＭＡ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥＮＡ、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、ｅＮＯＳ、Ｅｏｔ、エオタキシン１、ＥｐＣＡＭ、エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４、ＥＰＯ、ＥＲＣＣ、Ｅ−セレクチン、ＥＴ−１、ファクターＩＩａ、ファクターＶＩＩ、ファクターＶＩＩＩｃ、ファクターＩＸ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆａｓ、ＦｃＲ１、ＦＥＮ−１、フェリチン、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ−８、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ−３、フィブリン、ＦＬ、ＦＬＩＰ、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０、Ｇ２５０、Ｇａｓ６、ＧＣＰ−２、ＧＣＳＦ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤＦ、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３（Ｖｇｒ−２）、ＧＤＦ−５（ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１）、ＧＤＦ−６（ＢＭＰ−１３、ＣＤＭＰ−２）、ＧＤＦ−７（ＢＭＰ−１２、ＣＤＭＰ−３）、ＧＤＦ−８（ミオスタチン）、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１５（ＭＩＣ−１）、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＦＡＰ、ＧＦＲａ−１、ＧＦＲ−α１、ＧＦＲ−α２、ＧＦＲ−α３、ＧＩＴＲ、グルカゴン、Ｇｌｕｔ４、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ｇｐ１３０、ｇｐ７２、ＧＲＯ、成長ホルモン放出因子、ハプテン（ＮＰ−ｃａｐもしくはＮＩＰ−ｃａｐ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＣＣ、ＨＣＭＶ ｇＢ外被糖タンパク質、ＨＣＭＶ）ｇＨ外被糖タンパク質、ＨＣＭＶ ＵＬ、造血成長因子（ＨＧＦ）、Ｈｅｐ Ｂ ｇｐ１２０、ヘパラナーゼ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＢ糖タンパク質、ＨＳＶ ｇＤ糖タンパク質、ＨＧＦＡ、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＩＩＩＢ ｇｐ１２０Ｖ３ループ、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ＨＭＦＧ ＰＥＭ、ＨＲＧ、Ｈｒｋ、ヒト心筋ミオシン、ヒトサイトメガウイルス（ＨＣＭＶ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＨＶＥＭ、Ｉ−３０９、ＩＡＰ、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＥ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮｇ、Ｉｇ、ＩｇＡ受容体、ＩｇＥ、ＩＧＦ、ＩＧＦ結合タンパク質、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インターフェロン（ＩＮＦ）−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、インヒビン、ｉＮＯＳ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、インスリン様成長因子１、インテグリンα２、インテグリンα３、インテグリンα４、インテグリンα４／β１、インテグリンα４／β７、インテグリンα５（αＶ）、インテグリンα５／β１、インテグリンα５／β３、インテグリンα６、インテグリンβ１、インテグリンβ２、インターフェロンγ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＪＥ、カリクレイン２、カリクレイン５、カリクレイン６、、カリクレイン１１、カリクレイン１２、カリクレイン１４、カリクレイン１５、カリクレインＬ１、カリクレインＬ２、カリクレインＬ３、カリクレインＬ４、ＫＣ、ＫＤＲ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラミニン５、ＬＡＭＰ、ＬＡＰ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−１）、潜在型ＴＧＦ−１、潜在型ＴＧＦ−１ ｂｐ１、ＬＢＰ、ＬＤＧＦ、ＬＥＣＴ２、レフティー、ルイス−Ｙ抗原、ルイス−Ｙ関連抗原、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、Ｌｆｏ、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、リポタンパク質、ＬＩＸ、ＬＫＮ、Ｌｐｔｎ、Ｌ−セレクチン、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＬＴＢ４、ＬＴＢＰ−１、肺表面活性剤、黄体ホルモン、リンホトキシンβ受容体、Ｍａｃ−１、ＭＡｄＣＡＭ、ＭＡＧ、ＭＡＰ２、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＭ、ＭＣＡＭ、ＭＣＫ−２、ＭＣＰ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ、Ｍｅｒ、ＭＥＴＡＬＬＯプロテアーゼ、ＭＧＤＦ受容体、ＭＧＭＴ、ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）、ＭＩＦ、ＭＩＧ、ＭＩＰ、ＭＩＰ−１−α、ＭＫ、ＭＭＡＣ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＰＩＦ、Ｍｐｏ、ＭＳＫ、ＭＳＰ、ムチン（Ｍｕｃ１）、ＭＵＣ１８、ミュラー管抑制因子、Ｍｕｇ、ＭｕＳＫ、ＮＡＩＰ、ＮＡＰ、ＮＣＡＤ、Ｎ−カドヘリン、ＮＣＡ９０、ＮＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ネプリライシン、ニューロトロフィン−３，−４、または−６、ニュールツリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮＧＦ−β、ｎＮＯＳ、ＮＯ、ＮＯＳ、Ｎｐｎ、ＮＲＧ−３、ＮＴ、ＮＴＮ、ＯＢ、ＯＧＧ１、ＯＰＧ、ＯＰＮ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｒ、ｐ１５０、ｐ９５、ＰＡＤＰｒ、副甲状腺ホルモン、ＰＡＲＣ、ＰＡＲＰ、ＰＢＲ、ＰＢＳＦ、ＰＣＡＤ、Ｐ−カドヘリン、ＰＣＮＡ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＫ−１、ＰＥＣＡＭ、ＰＥＭ、ＰＦ４、ＰＧＥ、ＰＧＦ、ＰＧＩ２、ＰＧＪ２、ＰＩＮ、ＰＬＡ２、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、ＰｌＧＦ、ＰＬＰ、ＰＰ１４、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインＣ、ＰＳ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＴＥＮ、ＰＴＨｒｐ、Ｐｔｋ、ＰＴＮ、Ｒ５１、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＴＥＳ、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、ＲＳＶ Ｆｇｐ、Ｒｅｔ、リウマトイド因子、ＲＬＩＰ７６、ＲＰＡ２、ＲＳＫ、Ｓ１００、ＳＣＦ／ＫＬ、ＳＤＦ−１、ＳＥＲＩＮＥ、血清アルブミン、ｓＦＲＰ−３、Ｓｈｈ、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＫ−１、ＳＬＡＭ、ＳＬＰＩ、ＳＭＡＣ、ＳＭＤＦ、ＳＭＯＨ、ＳＯＤ、ＳＰＡＲＣ、Ｓｔａｔ、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ−ＩＩ、ＴＡＣＥ、ＴＡＣＩ、ＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、Ｔ−ｃｅｌｌ受容体（例えば、Ｔ細胞受容体α／β）、ＴｄＴ、ＴＥＣＫ、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＴＥＲＴ、精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、ＴｆＲ、ＴＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β汎特異的、ＴＧＦ−β ＲＩ（ＡＬＫ−５）、ＴＧＦ−β ＲＩＩ、ＴＧＦ−β ＲＩＩｂ、ＴＧＦ−β ＲＩＩＩ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５、トロンビン、胸腺Ｃｋ−１、甲状腺刺激ホルモン、Ｔｉｅ、ＴＩＭＰ、ＴＩＱ、組織因子、ＴＭＥＦＦ２、Ｔｍｐｏ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−αβ、ＴＮＦ−β２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬ Ｒ１ Ａｐｏ−２、ＤＲ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＩＣＫ−２Ａ、ＴＲＩＣＫ−Ｂ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬ Ｒ３ ＤｃＲ１、ＬＩＴ、ＴＲＩＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬ Ｒ４ ＤｃＲ２、ＴＲＵＮＤＤ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫ ＯＤＦ Ｒ、ＴＲＡＮＣＥ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧ ＯＣＩＦ、ＴＲ１）、ＴＮＦＲＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ｒ ＦＮ１４）、ＴＮ
ＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩ）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭ ＡＴＡＲ、ＨｖｅＡ、ＬＩＧＨＴ Ｒ、ＴＲ２）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ ｐ７５ＮＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡ）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ ＡＩＴＲ）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ ＴＡＪ、ＴＲＡＤＥ）、ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ（ＲＥＬＴ）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＴＮＦ ＲＩ ＣＤ１２０ａ、ｐ５５−６０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ ＲＩＩ ＣＤ１２０ｂ、ｐ７５−８０）、ＴＮＦＲＳＦ２６（ＴＮＦＲＨ３）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴｂＲ ＴＮＦ ＲＩＩＩ、ＴＮＦＣ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０ ＡＣＴ３５、ＴＸＧＰ１ Ｒ）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０ ｐ５０）、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ Ａｐｏ−１、ＡＰＴ１、ＣＤ９５）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤｃＲ３ Ｍ６８、ＴＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢ ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＤＲ６）、ＴＮＦＲＳＦ２２（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２ ＴＮＦＲＨ２）、ＴＮＦＲＳＴ２３（ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１ ＴＮＦＲＨ１）、ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３ Ａｐｏ−３、ＬＡＲＤ、ＴＲ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳＬ−１）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ Ａｐｏ−２リガンド、ＴＬ２）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンドＯＤＦ、ＯＰＧリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ Ａｐｏ−３リガンド、ＤＲ３リガンド）、ＴＮＦＳＦ１３（ＡＰＲＩＬ ＴＡＬＬ２）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＡＦＦ ＢＬＹＳ、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０）、ＴＮＦＳＦ１４（ＬＩＧＨＴ ＨＶＥＭリガンド、ＬＴｇ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ／ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８（ＧＩＴＲリガンドＡＩＴＲリガンド、ＴＬ６）、ＴＮＦＳＦ１Ａ（ＴＮＦ−ａコネクチン、ＤＩＦ、ＴＮＦＳＦ２）、ＴＮＦＳＦ１Ｂ（ＴＮＦ−ｂ ＬＴａ、ＴＮＦＳＦ１）、ＴＮＦＳＦ３（ＬＴｂ ＴＮＦＣ、ｐ３３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド ｇｐ３４、ＴＸＧＰ１）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド ＣＤ１５４、ｇｐ３９、ＨＩＧＭ１、ＩＭＤ３、ＴＲＡＰ）、ＴＮＦＳＦ６（Ｆａｓリガンド Ａｐｏ−１リガンド、ＡＰＴ１リガンド）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド ＣＤ７０）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド ＣＤ１３７リガンド）、ＴＰ−１、ｔ−ＰＡ、Ｔｐｏ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ Ｒ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＮＣＥ、トランスフェリン受容体、ＴＲＦ、Ｔｒｋ、ＴＲＯＰ−２、ＴＳＧ、ＴＳＬＰ、腫瘍関連抗原 ＣＡ １２５、腫瘍関連抗原を発現するルイスＹ関連炭水化物、ＴＷＥＡＫ、ＴＸＢ２、Ｕｎｇ、ｕＰＡＲ、ｕＰＡＲ−１、ウロキナーゼ、ＶＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＣＡＤ、ＶＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン−２、ＶＥＦＧＲ−１（ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−３（ｆｌｔ−４）、ＶＥＧＩ、ＶＩＭ、ウイルス抗原、ＶＬＡ、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、ＶＮＲインテグリン、フォン・ヴィルブランド因子、ＷＩＦ−１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ／１３、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＸＣＲ１、ＸＣＲ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＩＡＰ、ＸＰＤ、ならびにホルモンおよび成長因子の受容体。
改変のための抗体
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｐＩの改変は、治療用抗体に対して行われる。臨床試験または開発における使用が承認されている多くの抗体は、本発明のｐＩ変異体の恩恵を受け得る。これらの抗体は、本明細書において「臨床用製品および候補」と称される。よって、好ましい実施形態において、本発明のｐＩを改変した定常領域（複数可）は、幅広い臨床用製品および候補に用いることができる。例えば、ＣＤ２０を標的とする多くの抗体は、本発明のｐＩの改変の恩恵を受け得る。例えば、本発明のｐＩ変異体は、非ホジキンリンパ腫を治療するために承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（例えば米国特許第５，７３６，１３７号を参照のこと）；Ｇｅｎｍａｂが現在開発中の抗ＣＤ２０であるＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、米国特許第５，５００，３６２号に記載される抗ＣＤ２０抗体、ＡＭＥ−１３３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ｈＡ２０（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、ＨｕｍａＬＹＭ（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）、およびＰＲＯ７０７６９（国際公開特許ＰＣＴ／米国特許出願第２００３／０４０４２６号、表題「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）と実質的に同様の抗体に使用され得る。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む上皮成長因子受容体のファミリーのメンバーを標的とする多くの抗体は、本発明のｐＩを改変した定常領域（複数可）の恩恵を受け得る。例えば、本発明のｐＩを改変した定常領域（複数可）は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（例えば米国特許第５，６７７，１７１号を参照）、乳癌を治療するために承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈが現在開発中のペルツズマブ（ｒｈｕＭａｂ−２Ｃ４、Ｏｍｎｉｔａｒｇ（商標）；米国特許第４，７５３，８９４号に記載の抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｉｍｃｌｏｎｅ）（米国特許第４，９４３，５３３号；国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ９６／４０２１０号）、様々な癌について臨床治験中のキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；Ａｂｇｅｎｉｘ−Ｉｍｍｕｎｅｘ−Ａｍｇｅｎが現在開発中のＡＢＸ−ＥＧＦ（米国特許第６，２３５，８８３）号；Ｇｅｎｍａｂが現在開発中のＨｕＭａｘ−ＥＧＦｒ（米国特許出願第１０／１７２，３１７）；４２５、ＥＭＤ５５９００、ＥＭＤ６２０００、およびＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）（米国特許第５，５５８，８６４号；Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．１９８７，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５２（２）：５４９−６０；Ｒｏｄｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５（４）：３１５−２０；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３）；ＩＣＲ６２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ９５／２００４５号；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９３，２２（１−３）：１２９−４６；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９３，６７（２）：２４７−５３；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，７３（２）：２２８−３５；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０５（２）：２７３−８０）；ＴｈｅｒａＣＩＭ ｈＲ３（ＹＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎａｄａ ａｎｄ Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｕｂａ（米国特許第５，８９１，９９６号；米国特許第６，５０６，８８３号；Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（１）：７１−８１）；ｍＡｂ−８０６（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ）（Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１００（２）：６３９−４４）；ＫＳＢ−１０２（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）；ＭＲ１−１（ＩＶＡＸ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ０１６２９３１Ａ２号）；およびＳＣ１００（Ｓｃａｎｃｅｌｌ）（国際公開特許ＰＣＴ ＷＯ０１／８８１３８号）に実質的に類似する抗体に使用され得る。別の好ましい実施形態において、本発明のｐＩを改変した定常領域（複数可）は、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病の治療のために現在承認されているヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）に使用され得る。本発明のｐＩを改変した定常領域（複数可）は、限定されないが、Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎによって開発された抗ＣＤ３抗体であるムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３（登録商標））、ＩＤＥＣ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧによって開発された抗ＣＤ２０抗体であるイブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈによって開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、Ｂｉｏｇｅｎによって開発された抗ＬＦＡ−３Ｆｃ融合体であるアレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｌｉｌｌｙによって開発されたアブシキ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））、Ｎｏｖａｒｔｉｓによって開発されたバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅにより開発されたパリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、Ｃｅｎｔｏｃｏｒによって開発された抗ＴＮＦα抗体であるインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ａｂｂｏｔｔによって開発された抗ＴＮＦα抗体であるアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、Ｃｅｌｌｔｅｃｈによって開発された抗ＴＮＦα抗体であるＨｕｍｉｃａｄｅ（商標）、Ｉｍｍｕｎｅｘ／Ａｍｇｅｎによって開発された抗ＴＮＦα Ｆｃ融合体であるエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、Ａｂｇｅｎｉｘが開発中の抗ＣＤ１４７抗体であるＡＢＸ−ＣＢＬ、Ａｂｇｅｎｉｘが開発中の抗ＩＬ８抗体であるＡＢＸ−ＩＬ８、Ａｂｇｅｎｉｘが開発中の 抗ＭＵＣ１８抗体であるＡＢＸ−ＭＡ１、Ａｎｔｉｓｏｍａが開発中の抗ＭＵＣ１であるペンツモマブ（Ｒ１５４９、９０Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Ａｎｔｉｓｏｍａが開発中の抗ＭＵＣ１抗体であるＴｈｅｒｅｘ（Ｒ１５５０）、Ａｎｔｉｓｏｍａが開発中のＡｎｇｉｏＭａｂ（ＡＳ１４０５）、Ａｎｔｉｓｏｍａが開発中のＨｕＢＣ−１、Ａｎｔｉｓｏｍａが開発中のＴｈｉｏｐｌａｔｉｎ（ＡＳ１４０７）、Ｂｉｏｇｅｎが開発中の抗α−４−β−１（ＶＬＡ−４）およびα−４−β−７であるＡｎｔｅｇｒｅｎ（登録商標）（ナタリズマブ）、Ｂｉｏｇｅｎが開発中の抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体であるＶＬＡ−１ ｍＡｂ、Ｂｉｏｇｅｎが開発中の抗リンホトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ）抗体であるＬＴＢＲ ｍＡｂ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが開発中の抗ＴＧＦ−β２抗体であるＣＡＴ−１５２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＡｂｂｏｔｔが開発中の抗ＩＬ−１２抗体であるＪ６９５、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｚｙｍｅが開発中の抗ＴＧＦβ１抗体であるＣＡＴ−１９２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙが開発中の抗Ｅｏｔａｘｉｎ１抗体であるＣＡＴ−２１３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．が開発中の抗Ｂｌｙｓ抗体であるＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙおよびＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．が開発中の抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体であるＴＲＡＩＬ−Ｒ１ｍＡｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈが開発中の抗ＶＥＧＦ抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ、ｒｈｕＭＡｂ−ＶＥＧＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈが開発中の抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈが開発中の抗組織因子抗体である抗組織因子（ＡＴＦ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈが開発中の抗ＩｇＥ抗体であるＸｏｌａｉｒ（商標）（オマリズマブ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ａｎｄ Ｘｏｍａが開発中の抗ＣＤ１１ａ抗体であるＲａｐｔｉｖａ（商標）（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発中のＭＬＮ−０２抗体（以前はＬＤＰ−０２であった）、Ｇｅｎｍａｂが開発中の抗ＣＤ４抗体であるＨｕＭａｘ ＣＤ４、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎが開発中の抗ＩＬ１５抗体であるＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘが開発中のＨｕＭａｘ−Ｉｎｆｌａｍ、ＧｅｎｍａｂおよびＭｅｄａｒｅｘおよびＯｘｆｏｒｄ ＧｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓが開発中の抗ヘパラナーゼＩ抗体であるＨｕＭａｘ−Ｃａｎｃｅｒ、ＧｅｎｍａｂおよびＡｍｇｅｎが開発中のＨｕＭａｘ−Ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｇｅｎｍａｂが開発中のＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発中の抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるＩＤＥＣ−１３１、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発中の抗ＣＤ４抗体であるＩＤＥＣ−１５１（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発中の抗ＣＤ８０抗体であるＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発中の抗ＣＤ２３であるＤＥＣ−１５２、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが開発中の抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、Ｉｍｃｌｏｎｅが開発中の抗イディオタイプ抗体であるＢＥＣ２、Ｉｍｃｌｏｎｅが開発中の抗ＫＤＲ抗体であるＩＭＣ−１Ｃ１１、Ｉｍｃｌｏｎｅが開発中の抗ｆｌｋ−１抗体であるＤＣ１０１、Ｉｍｃｌｏｎｅが開発中の抗ＶＥカドヘリン抗体、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓが開発中ｎ抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体であるＣＥＡ−Ｃｉｄｅ（商標）（ラベツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓが開発中の抗ＣＤ２２抗体であるＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ（商標）（エプラツズマブ）、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓが開発中のＡＦＰ−Ｃｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓが開発中のＭｙｅｌｏｍａＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓが開発中のＬｋｏＣｉｄｅ、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓが開発中のＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、Ｍｅｄａｒｅｘが開発中の抗ＣＴＬＡ４抗体であるＭＤＸ−０１０、Ｍｅｄａｒｅｘが開発中の抗ＣＤ３０抗体であるＭＤＸ−０６０、Ｍｅｄａｒｅｘが開発中のＭＤＸ−０７０、Ｍｅｄａｒｅｘが開発中のＭＤＸ−０１８、ＭｅｄａｒｅｘおよびＩｍｍｕｎｏ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓが開発中の抗Ｈｅｒ２抗体であるＯｓｉｄｅｍ（商標）（ＩＤＭ−１）、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂが開発中の抗ＣＤ４抗体であるＨｕＭａｘ（商標）−ＣＤ４、ＭｅｄａｒｅｘおよびＧｅｎｍａｂが開発中の抗ＩＬ１５抗体であるＨｕＭａｘ−ＩＬ１５、ＭｅｄａｒｅｘおよびＣｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊが開発中の抗ＴＮＦα抗体であるＣＮＴＯ １４８、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ／Ｊ＆Ｊが開発中の抗サイトカイン抗体であるＣＮＴＯ １２７５、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓが開発中の抗細胞間接着分子接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体であるＭＯＲ１０１およびＭＯＲ１０２、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓが開発中の抗線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体であるＭＯＲ２０１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓが開発中の抗ＣＤ３抗体であるＮｕｖｉｏｎ（登録商標）（ビシリズ
マブ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓが開発中の抗γインターフェロン抗体であるＨｕＺＡＦ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓが開発中の抗α５β１インテグリン、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓが開発中の抗ＩＬ−１２、Ｘｏｍａが開発中の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体であるＩＮＧ−１、ならびにＸｏｍａが開発中の抗β２インテグリン抗体であるＭＬＮ０１、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓが開発中のｐＩ−ＡＤＣ抗体（この段落において上に引用した参考文献の全ては、参照により明示的に本明細書に組み込まれる）を含む、他の臨床用製品および候補に実質的に類似する様々な抗体において使用され得る。
ＩＸ．Ｉｎ Ｖｉｖｏ投与のための抗体組成物
治療における本発明のｐＩ抗体の使用は、抗原結合成分に依存する：例えば、標準的な全長治療用抗体の場合、抗体のＦｖが結合する抗原に依存する。すなわち、当業者には理解されるように、特定の疾患の治療は、分子の多重特異性および／または半減期の増加といったさらなる利益を伴って行うことができる。これにより、限定されないが、新規治療処置および機序、投薬頻度の減少（より良好な患者コンプライアンスにつながる可能性がある）、用量の減少、ならびに生産コストの削減を含む様々な利益をもたらすことができる。
別の実施形態において、本発明のｐＩの低い変異体は、限定されないが、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ−２、および補体Ｃ３およびＣ５タンパク質（またはそれらの切断生成物Ｃ３ａおよびＣ５ａ）を含む、様々な標的に対する抗体の眼内／硝子体内投与に用いることができる。目のｐＨはほぼ中性であるため、注入された治療用抗体の初期濃度が高いことと相まって、抗体のｐＩが眼内環境におけるｐＨのｐＩに近づくと、溶解性が低くなる一般的なリスクがある。この実施形態において、ヘテロ二量体は、好ましい場合もまたはそうではない場合もある：すなわち、ｐＩがより低いかまたはより高い重鎖のホモ二量体を使用することができ、よって投与されると高い溶解性を促進する。
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を、任意選択的な薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態での保存向けに調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度ではレシピエントに無毒であり、緩衝剤（リン酸、クエン酸、および他の有機酸等）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオンを含む）；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルバラベンもしくはプロピルパラベン等）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等）；親水性ポリマー（ポリビニルビロリドン等）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン等）、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）；キレート化剤（ＥＤＴＡ等）；糖類（ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール等）；塩形成対イオン（ナトリウム等）；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）を含む。
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な１つより多くの活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的活性を有するものを含んでもよい。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましい場合がある。代替的にまたは付加的に、組成物は、細胞傷害性剤、サイトカイン、成長阻害剤および／または小分子アンタゴニストを含んでもよい。そのような分子は、意図する目的に効果的な量の組み合わせで好適に存在する。
活性成分はまた、例えば、コアセルベーション法によってまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中の、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセルもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中に、それぞれ封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は無菌またはほぼ無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
徐放性剤を調製してもよい。徐放性剤の好適な例として、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは、成形された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸塩からなる注射用ミクロスフェア等）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日間以上にわたって分子を放出することができる一方で、特定のハイドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。
被包された抗体が体内に長時間残存すると、３７℃で湿気に曝露された結果として変性または凝集する場合があり、生物活性の喪失および免疫原性の可能性のある変化をもたらす。関与する機構に応じて、安定化のための合理的なストラテジーを想到することができる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスフィド交換による分子間Ｓ−−Ｓ結合の形成であることが分かった場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、含水量を制御し、適切な添加剤を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化を達成することができる。
Ｘ．投与様式
本発明の抗体および化学療法剤は、既知の方法に従って、例えば、ボーラスとしての静脈内投与、または、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、髄腔内、経口、局部、もしくは吸入経路による一定期間にわたる連続注入によって、対象に投与される。抗体の静脈内投与または皮下投与が好ましい。
ＸＩ．治療様式
本発明の方法において、疾患または状態に対して好ましい治療効果を提供するために治療が用いられる。「好ましい治療効果」とは、疾患もしくは状態における改善、および／または疾患もしくは状態に付随する症状の改善を意味する。例えば、好ましい治療効果は、以下の疾患における改善のうちの１つ以上を指す：（１）腫瘍細胞数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または状態に付随する１つ以上の症状のある程度の緩和。
任意の所与の疾患または状態における好ましい治療効果は、その疾患または状態に特有の標準化された効果判定基準によって判定される。腫瘍の反応は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）走査、Ｘ線画像、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）走査、骨スキャン画像、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環する腫瘍細胞計数を含む腫瘍生検試料採取等のスクリーニング技術を用いて、腫瘍の形態（すなわち、全体的な腫瘍負荷、腫瘍サイズ等）における変化について評価することができる。
これらの好ましい治療効果に加えて、治療を受ける対象は、疾患に付随する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
よって、Ｂ細胞腫瘍の場合、対象は、いわゆるＢ症状、すなわち、寝汗、発熱、体重減少、および／または蕁麻疹の軽減を経験し得る。前癌状態の場合、ｐＩ治療剤を用いる治療は、関連する悪性腫瘍状態の発生、例えば、意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）に罹患する患者に多発性骨髄腫が発生するのを阻止し得、かつ／または発生するまでの時間を延長し得る。
疾患における改善は、完全寛解として特徴付けることができる。「完全寛解」とは、任意の以前の異常な放射線学的検査、骨髄および脳脊髄液（ＣＳＦ）、または骨髄腫の場合は異常なモノクローナル蛋白が正常化され、臨床的に検出可能な疾患が存在しないことを意味する
そのような寛解は、本発明の方法に従った治療の後に、少なくとも４〜８週間、または時には６〜８週間持続し得る。代替として、疾患における改善は、部分的寛解として分類されてもよい。「部分的寛解」とは、新しい病変が存在しない状態で、全ての測定可能な腫瘍負荷（すなわち、対象に存在する悪性細胞の数、または測定されたバルク腫瘍量もしくは異常なモノクローナル蛋白の量）の少なくとも約５０％の減少が、４〜８週間、または６〜８週間持続し得ることを意味する。
本発明に従った治療は、使用される薬物の「治療有効量」を含む。「治療有効量」は、必要な投与量および期間で、所望の治療結果を達成するために効果のある量を指す。
治療有効量は、固体／個人の病態、年齢、性別、および体重、ならびに固体において所望の反応を誘導する薬物の能力等の要因に従って変化し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な作用が、抗体または抗体部分の任意の毒性または有害作用を上回る量でもある。
腫瘍治療の「治療有効量」はまた、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。化合物が癌を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルシステムにおいて評価されてもよい。
代替として、組成物のこの特性は、当業者に既知のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより、化合物が細胞増殖を阻害する能力またはアポトーシスを誘導する能力を調べることによって評価されてもよい。治療用化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させることができるか、またはさもなければ、対象の症状を改善することができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路等の要因に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
投薬計画は、最適な所望の反応（例えば、治療効果）を提供するように調節される。例えば、単回ボーラスを投与してもよいか、いくつかに分割した用量を経時的に投与してもよいか、または、治療状況の要件によって示される通りに用量を比例的に減少または増加してもよい。非経口的組成物は、投与の簡便性および投薬量の均一性のために、投薬単位剤形に製剤化してもよい。本明細書において使用される投薬単位剤形は、治療を受ける対象の単位投与量として適した物理的に個別の単位を指す：各単位は、必要な薬学的担体とともに所望の治療的効果を生じさせるように計算された所定の量の活性化合物を含む。
本発明の投薬単位剤形の規格は、（ａ）活性化合物に特有の特徴および達成されるべき特定の治療的効果、ならびに（ｂ）固体の感受性の治療に関する、そのような活性化合物を配合する技術に固有の限界によって決定され、かつこれらに直接依存する。
本発明において使用されるｐＩ抗体の効率的な投薬量および投薬計画は、治療される疾患または状態に依存し、当業者によって決定され得る。
本発明において使用されるｐＩ抗体の治療有効量の例示的な非限定的範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ等）、例えば約０．１〜２０ｍｇ／ｋ（約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ等）、例えば約０．５（約０．３等）、約１、または約３ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態において、抗体は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量（１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量等）、例えば、５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば、８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
当該技術分野において通常の技術を有する医療従事者は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師は、薬学的組成物中に用いられる薬物の出発用量を、所望の治療的効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで開始して、所望の効果を達成するまで徐々に投与量を増加することができる。
一実施形態において、ｐＩ抗体は、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、２００〜４００ｍｇ／ｋｇ等の週投与量で注入によって投与される。そのような投与は、例えば、１〜８回、例えば、３〜５回等、繰り返されてもよい。投与は、２〜２４時間、例えば、２〜１２時間等の期間にわたる持続注入によって行われてもよい。
一実施形態において、毒性を含む副作用を低減することが必要である場合、ｐＩ抗体は、２４時間超等の長期間にわたる緩徐な持続注入によって投与される。
一実施形態において、ｐＩ抗体は、２５０ｍｇ〜２０００ｍｇ、例えば、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇの週投与量で、最高８回、例えば４〜６回等投与される。投与は、２〜２４時間、例えば２〜１２時間等の期間にわたる持続注入によって行われてもよい。そのような治療計画は、例えば、６ヶ月または１２か月後に、必要に応じて１回以上繰り返されてもよい。投与量は、例えば、生体試料を採取し、ｐＩ抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を使用して、投与時に血中の本発明の化合物の量を測定することにより決定または調節されてもよい。
さらなる実施形態において、ｐＩ抗体は、２〜１２週間、例えば３〜１０週間等、例えば４〜８週間等に１回投与される。
一実施形態において、ｐＩ抗体は、維持療法によって、例えば、６ヶ月以上の期間の間週に１回等投与される。
一実施形態において、ｐＩ抗体は、１回の抗体の注入後、放射性同位元素と複合体化されたｐＩ抗体の注入を含む治療計画によって投与される。治療計画は、例えば、７〜９日後に繰り返されてもよい。
非限定的な例として、本発明による治療は、単回用量、または２４、１２、８、６、４、もしくは２時間ごとに分割した用量、またはそれらの任意の組み合わせを用いて、治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日目の内の少なくとも１つに、または代替として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週目のうちの少なくとも１つに、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日当たり０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｍｇ／ｋｇの量で、またはそれらの任意の組み合わせで、抗体の１日投与量として提供されてもよい。
いくつかの実施形態において、そのｐＩ抗体分子は、１つ以上のさらなる治療剤、例えば、化学療法剤と組み合わせて使用される。ＤＮＡ損傷性化学療法剤の非限定的な例として、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、およびその類似体または代謝物、ならびにドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、およびダウノルビシン）；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、およびシクロホスファミド）；ＤＮＡ介入物質（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン）；ＤＮＡ介入物質およびブレオマイシン等のフリーラジカルジェネレーター；ヌクレオシド模倣物（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン，およびヒドロキシウレア）が挙げられる。
細胞の複製を妨害する化学療法剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、および関連する類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、および関連する類似体；サリドマイド、レナリドミド、および関連する類似体（例えば、ＣＣ−５０１３およびＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブメシル酸塩およびゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）；ＩκＢキナーゼの阻害剤を含むＮＦ−κＢ阻害剤；癌において過剰発現されるタンパク質に結合し、それによって細胞の複製を下方制御する抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、およびベバシズマブ）；ならびに癌において上方制御、過剰発現、または活性化されることが分かっており、その阻害が細胞の複製を下方制御する、タンパク質または酵素の他の阻害剤を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ）を用いた治療の前、治療と同時に、または治療の後に、使用することができる。
本発明を例示説明するために、以下に実施例を提供する。これらの実施例は、本発明をいずれか特定の用途または動作理論に拘束することを意味するものではない。本発明において論じられる全ての定常領域について、番号付けはＫａｂａｔに記載されるようなＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（参照により全体が組み込まれる））に従うものとする。抗体の技術分野の当業者は、この慣習が、免疫グロブリン配列の特定の領域における不連続な番号付けから構成され、免疫グロブリンファミリーの保存された位置に対する正規化参照を可能にすることを認識するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義されるような任意の所与の免疫グロブリンの位置は、必ずしもその連続的な配列に対応しない。
実施例１．ｐＩを低下させるための非天然荷電置換の設計
定常ドメインにおいて置換を改変することにより、より低いｐＩを有するように抗体の定常鎖を修飾した。ｐＩの低下は、塩基性アミノ酸（ＫまたはＲ）から酸性アミノ酸（ＤまたはＥ）に置換を行うことにより改変することができ、それによりｐＩの最も大幅な低下がもたらされる。また、塩基性アミノ酸から中性アミノ酸へ、および中性アミノ酸から酸性アミノ酸への突然変異によっても、ｐＩの低下がもたらされる。アミノ酸のｐＫ値の一覧は、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １５：５２９−５３９の表１に見出だすことができる。
Ｆｃ領域とは異なり、抗体の薬理学的特性に影響を及ぼす天然リガンドと相互作用しないため、抗体のＣＨ１（Ｃγ１）およびＣＬ（ＣκまたはＣＫ）領域（配列を図１に示す）において置換を検討することを選択した。どの位置を突然変異させるかを決定する際に、置換または置換のセットが構造および／または機能に及ぼす影響を最小限に抑えるために、周囲環境およびＷＴアミノ酸がその周辺構造と接触する回数を考慮に入れた。各ＣＨ１およびＣＫの位置の溶媒露出度または露出の割合は、抗体Ｆａｂドメインの関連する結晶構造を用いて計算した。Ｃγ１およびＣＫについての結果を、それぞれ図２および３に示す。免疫グロブリンのアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）間のアイソタイプである位置についてＣＨ１およびＣＬドメインを調べることにより、さらに設計を誘導した。そのような変動は自然に起こるため、そのような位置は置換を受け入れられることが予測される。この分析に基づいて、ｐＩを低下させるが、ドメインの生物物理学的特性には最小限の影響を及ぼすことが予測される、多くの置換を特定した。
実施例２．より低いｐＩを有する改変ＣＨ１およびＣＫ領域を有する抗ＶＥＧＦ抗体
抗体のｐＩを低下させるために、ＩｇＧ１抗体のＣＨ１およびＣＫドメインにおいてアミノ酸修飾を改変した。上記分析に基づいて、重鎖ＣＨ１のために選択された置換は、１１９Ｅ、１３３Ｅ、１６４Ｅ、２０５Ｅ、２０８Ｄ、および２１０Ｅであり、軽鎖Ｃκの置換のための置換は、１２６Ｅ、１４５Ｅ、１５２Ｄ、１５６Ｅ、１６９Ｅ、および２０２Ｅであった。これらの変異体定常鎖は、それぞれ、ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）およびＣＫ−ｐＩ（６）と称され、これらのアミノ酸配列を図４に提供する。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする抗体に関連して、ＣＨ１およびＣＫ変異体を改変した。重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））とも称される抗体Ａ４．６．１のヒト化型のものであり、様々な癌の治療のために承認されている。これらの可変領域配列を図５に提供する。低ｐＩ置換を含む抗ＶＥＧＦ抗体変異体は、ＸＥＮＰ９４９３ベバシズマブ−ＩｇＧ１−ＣＨ１−ｐＩ（６）−ＣＫ−ｐＩ（６）と称され、この抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を図６に提供する。ＣＨ１−ｐＩ（６）の６つの置換およびＣＫ−ｐＩ（６）の６つの置換を示すＦａｂドメインの構造モデルを図７に示す。ＷＴ抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ）のｐＩ計算値は８．１４である。改変された抗ＶＥＧＦのＣＨ１変異体のｐＩ計算値は６．３３であり、抗ＶＥＧＦのＣＫ変異体では６．２２である。重鎖および軽鎖のｐＩを改変した抗ＶＥＧＦ変異体をコトランスフェクトする場合、全長抗ＶＥＧＦ ｍＡｂは、５．５１のｐＩ計算値を有する。
哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に、抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を構築した。ＩＭＡＧＥクローンからヒトＩｇＧ１定常鎖遺伝子を入手し、ｐＴＴ５ベクターにサブクローニングした。抗ＶＥＧＦ抗体をコードするＶＨおよびＶＬ遺伝子を商業的に合成し（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ ＷＡ）、適切なＣＬおよびＩｇＧ１定常鎖をコードするベクターにサブクローニングした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異誘発法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）を使用する部位特異的変異誘発を用いてアミノ酸修飾を構築した。全てのＤＮＡを配列決定して配列の忠実度を確認した。
リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用して、重鎖遺伝子（ＶＨ−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３）を含むプラスミドを軽鎖遺伝子（ＶＬ−Ｃκ）を含むプラスミドとともに２９３Ｅ細胞にコトランスフェクトし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）中で増殖させた。増殖から５日後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、プロテインＡの親和性により培養上清から抗体を精製した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により抗体濃度を決定した。
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上のＳＤＳ ＰＡＧＥ（図８）、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）（図９）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを用いた電気泳動（図１０）、Ｂｉａｃｏｒｅによる抗原ＶＥＧＦへの結合（図１１）、および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（図１２）によって、ｐＩを改変した抗ＶＥＧＦ ｍＡｂを特徴付けた。全てのｍＡｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣで高い純度を示した。ＩＥＦゲルは、各変異体が設計された等電点を有することを示した。ＢｉａｃｏｒｅでのＶＥＧＦ結合分析は、ｐＩを改変した抗ＶＥＧＦがベバシズマブと同様の親和性でＶＥＧＦに結合したことを示し、設計された置換がｍＡｂの機能を乱さなかったことが示された。ＤＳＣは、ＣＨ１およびＣＬの両方に改変された置換を有する抗ＶＥＧＦ変異体が、Ｔｍ ７１．９℃の高い熱安定性を有することを示した。
マウスＦｃＲｎのホモ接合ノックアウト、およびヒトＦｃＲｎのヘテロ接合ノックイン（ｍＦｃＲｎ−／−、ｈＦｃＲｎ＋）であるＢ６マウス（本明細書においてｈＦｃＲｎまたはｈＦｃＲｎ＋マウスと称される）において薬物動態実験を行った（Ｐｅｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（１２）：１７５９−６９（参照により全体が組み込まれる））。調べた試料は、親ＩｇＧ１／２定常領域、ＩｇＧ１＿ＣＨ−ＣＬ＿ｐＩ＿ｅｎｇと称されるｐＩ５．５１のｐＩを改変した変異体、およびヒトＦｃＲｎに対する親和性を向上させる置換Ｎ４３４Ｓを含むＩｇＧ１／２のＦｃ変異型を含んでいた。
体重（２０〜３０ｇの範囲）によって無作為割り当てした４〜７匹のメスマウスの群に、抗ＶＥＧＦ抗体の単回静脈内尾静脈注射（２ｍｇ／ｋｇ）を行った。各時点で眼窩叢から血液（約５０uｌ）を採血し、血清に処理し、分析まで−８０℃で保存した。抗体濃度はＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。抗体の血清濃度は、組換えＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−１６５、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を捕捉試薬として使用して測定し、検出は、ビオチン化抗ヒトκ抗体およびユーロピウムで標識したストレプトアビジンを用いて実行した。時間分解蛍光シグナルを収集した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡ）を使用した非コンパートメントモデルを用いて、個々のマウスについてＰＫパラメータを決定した。均一な重み付け時点で、公称時間および用量を使用した。
結果を図１３に示す。血清からの抗体の除去を特徴付けるβ相を意味する適切な半減期（ｔ１／２）の値を表１に示す。ＣＨ１およびＣＬにｐＩを減少させる置換を含むｐＩを改変した変異体は、半減期を７．４日に延長し、ＩｇＧ１／２と比較して約２．６倍向上した。ｐＩを改変した変異体は、Ｆｃ変異型Ｎ４３４Ｓに相当する半減期を有していた。抗体およびＦｃ融合体の半減期を延長するために、ｐＩを減少させ、ＦｃＲｎに対する親和性を向上させる抗体変異体の組み合わせが企図される。
実施例３．ＩｇＧ定常領域のＰＫ分析
上述のように、ｈｕＦｃＲｎマウスにおいてベバシズマブのＩｇＧ１およびＩｇＧ２アイソタイプ型のＰＫ試験を実行した。４つの別個のＰＫ試験からのＩｇＧ１の結果を図１４に示す。４つの試験からの半減期は、３．０、３．９、２．８、および２．９日であり、平均半減期は３．２日であった。ＩｇＧ２試験からのＰＫの結果を図１５に示す。ＩｇＧ２の半減期は５．９日であった。
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のＰＫの結果を、ＩｇＧ１／２およびベバシズマブのｐＩ改変型からの結果を用いて分析した。表２は、抗体の半減期とともにそれらのｐＩ計算値を示す。これらのデータを図１６にプロットする。
抗体の半減期とｐＩとの間に相関関係が観察された。これらのデータは、等電点の低下のための重鎖および軽鎖定常領域を含む抗体の定常鎖の改変が、可能性として、抗体およびＦｃ融合体の血清半減期を延長するための一般化できる新規手法であることをさらに示唆するものである。
実施例４．定常領域のｐＩ改変への改変手法
抗体またはタンパク質のｐＩの低下は、様々な手法を用いて実行することができる。最も基本的なレベルでは、高いｐＫａを有する残基（リジン、アルギニン、またある程度のヒスチジン）が中性または陰性の残基で置き換えられ、かつ／または中性残基がｐＫａの低い残基（アスパラギン酸およびグルタミン酸）で置き換えられる。特定の置き換えは、構造内の位置、機能における役割、および免疫原性を含む様々な要因に依存し得る。
免疫原性が懸案事項であるため、ｐＩを低下させる置換が免疫原性を誘発するリスクを最小限に抑えるための努力を行うことができる。リスクを最小限に抑えるための１つの方法は、変異体の変異負荷を最小限に抑えること、すなわち、最小限の数の突然変異を用いてｐＩを低下させることである。Ｋ、Ｒ、またはＨがＤまたはＥで置き換えられる電荷交換突然変異は、ｐＩの低下に最も大きな影響を与えるため、これらの置換が好ましい。免疫原性のリスクを最小限に抑える一方でｐＩを低下させるための別の手法は、相同なヒトタンパク質からの置換を用いることである。よって、抗体の定常鎖の場合、ＩｇＧのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）間のアイソタイプの違いが、リスクの低い置換を提供する。免疫認識は局所的な配列レベルで起こるため、すなわち、ＭＨＣ ＩＩおよびＴ細胞受容体が典型的には９残基長のエピトープを認識するため、ｐＩを変化させる置換は、配列において近接するアイソタイプの置換によって達成することができる。このように、天然のアイソタイプにマッチするようにエピトープを伸長することができる。よって、そのような置換は、他のヒトＩｇＧアイソタイプに存在するエピトープを構成し、寛容化されることが予想される。
図１７は、ＩｇＧサブクラスのアミノ酸配列アラインメントを示す。四角く囲った残基は、ＩｇＧ間でのアイソタイプの違いを示す。より高いｐＩに寄与する残基（Ｋ、Ｒ、およびＨ）またはより低いｐＩに寄与する残基（ＤおよびＥ）が太字で強調されている。ｐＩを低下させるか、または天然のアイソタイプにマッチするようにエピトープを伸長させるかのいずれかである、設計された置換をグレーで示す。
図１８は、ＣＫおよびＣλ定常軽鎖のアミノ酸配列を示す。ＣκとＣλとの間の相同性は、ＩｇＧサブクラス間ほど高くない。それにもかかわらず、置換を誘導するためにアラインメントが用いられてもよい。より高いｐＩに寄与する残基（Ｋ、Ｒ、およびＨ）またはより低いｐＩに寄与する残基（ＤおよびＥ）が太字で強調されている。グレーは、等電点を低下させるために、好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されてもよいリジン、アルギニン、およびヒスチジンを示唆する。
タンパク質および抗体をより低いｐＩに改変する別の手法は、負荷電残基をＮまたはＣ末端に融合することである。よって、例えば、主にアスパラギン酸およびグルタミン酸からなるペプチドを、抗体の重鎖、軽鎖、または両方のＮ末端またはＣ末端に融合してもよい。Ｎ末端は、構造的に抗原結合部位に近いため、Ｃ末端が好ましい。
記載した改変手法に基づいて、抗体の重鎖および軽鎖の両方の等電点を低下させるために多くの変異体を設計した。重鎖変異体は、アイソタイプの置換およびＣ末端負荷電ペプチドの様々な組み合わせを含む。陰性ＩｇＧ１と比較して、変異体は、Ｇ１３７Ｅ、Ｇ１３８Ｓ、Ｓ１９２Ｎ、Ｌ１９３Ｆ、Ｉ１９９Ｔ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２１４Ｔ、Ｋ２２２Ｔからなる群から１つ以上のアイソタイプの置換、２２１〜２２５ＤＫＴＨＴのＶＥ、Ｈ２６８Ｑ、Ｋ２７４Ｑ、Ｒ３５５Ｑ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｑ４１９Ｅへの置換、およびＫ４４７の欠失（Ｋ４４７＃と称される）を含む：番号付けはＥＵインデックスに従う。軽鎖変異体は、非アイソタイプの置換およびＣ末端負荷電ペプチドの様々な組み合わせを含む。Ｃκ変異体は、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１４５Ｅ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、およびＳ２０２Ｅからなる群からの１つ以上の置換を含む：番号付けはＥＵインデックスに従う。
変異体重鎖の配列を図１９に提供し、変異体軽鎖の配列を図２０に提供する。表３は、定常重鎖、定常軽鎖のｐＩ計算値、および抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブの可変領域（Ｆｖ）を含む全長モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のｐＩとともに、構築した変異体を列挙する。

ａ Ｂｅｖ＝抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブの可変領域
ｂｍＡｂ ｐＩ＝ベバシズマブのＦｖを含む全長モノクローナル抗体のｐＩ
実施例５．ｐＩ改変の電荷依存性の決定およびＦｃＲｎへの結合を強化するＦｃ変異体との潜在的な組み合わせ
ｐＩの低さと半減期の伸長との間の関係の２つの局面を調べるために、一連の新しいｐＩを改変した変異体を生成した。最初に、９４９３ ＩｇＧ１−ｐＩ（１２）変異体に基づいて、制御された変異体のセットを作製することにより、電荷のパラメータを調べた。これらの変異体、１００１７、１００１８、および１００１９を、それらのｐＩ、ならびにベバシズマブＩｇＧ１ ＷＴと比較した正荷電残基および負荷電残基における違いとともに表４に記載する。
ＣＨ１−ｐＩ（６）＝Ｓ１１９Ｅ Ｋ１３３Ｅ Ｔ１６４Ｅ Ｋ２０５Ｅ Ｎ２０８Ｄ Ｋ２１０Ｅ
Ｃｋ−ｐＩ（６）＝Ｋ１２６Ｅ Ｋ１４５Ｅ Ｎ１５２Ｄ Ｓ１５６Ｅ Ｋ１６９Ｅ Ｓ２０２Ｅ
Ｆｖ＝ベバシズマブで計算したｐＩ
本明細書にける実験的根拠は次の通りである。半減期の改善のための全ての機構が正電荷の除去に基づいている場合、１００１８および１００１９は９４９３と同じくらい良好であるべきであり、一方では１００１７が伸長されないであろう。機構が負電荷の増加に基づいている場合、１００１８は伸長せず、一方では１００１７および１００１９は、ＩｇＧ１と比較すると伸長されるが、９４９３よりは短い、同等の半減期を有する。全体的なｐＩ（または荷電状態）が基本である場合、結果は９４９３＞１００１９＞１００１７＝１００１８となる。
半減期改善の２つの機構、荷電状態、およびＦｃＲｎが適合するかどうかを調べるために、電荷制御変異体セットに加えて、９４９３ ＩｇＧ１−ｐＩ（１２）変異体を、ｐＨ６．０でＦｃＲｎへの結合を向上させる置換と組み合わせた。これらの変異体９９９２ ＩｇＧ１−ｐＩ（１２）−Ｎ４３４Ｓおよび９９９３ ＩｇＧ１−ｐＩ（１２）−Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを表４に列挙する。
上述のような分子生物学技術を使用して、ベバシズマブの可変領域を用いて抗体変異体を構築した。上述のように抗体を発現させ、精製し、性質決定した。上述のように、ｈｕＦｃＲｎマウスにおいて変異体および対照抗体のＰＫ試験を実行した。血清濃度の群平均を、適合するデータから得られた半減期とともに図２１および２２にプロットする。
結果は、正電荷の減少および負電荷の増加の両方が半減期の改善に寄与することを示した。さらに、結果は、半減期をさらに一層向上させるために、改変されたより低いｐＩとＦｃＲｎへの結合の増加を組み合わせて用いることができることを示した。ｈｕＦｃＲｎマウスにおいて調べた同等のＦｖ（ベバシズマブ）の変異体および天然ＩｇＧについて、半減期対ｐＩの関係のプロットを図２３に提供する。グラフは、ここでも同様に、半減期とｐＩとの間の反比例関係、およびより低いｐＩのために改変された変異体とＦｃＲｎへの結合を向上させるＦｃ変異体との組み合わせ性を示す。
実施例６． ｐＩを改変した新しい構築物
上述のように、ＩｇＧのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）間のアイソタイプの違いを利用することにより、ｐＩを低下させる置換が免疫原性を誘発するリスクを最小限に抑えるための努力を行うことができる。この原理に基づいて新規アイソタイプの新しいセットを設計した。ここでも同様に、免疫認識が局所的な配列レベルで起こるため、すなわち、ＭＨＣ ＩＩおよびＴ細胞受容体が典型的には９残基長のエピトープを認識するため、ｐＩを変化させる置換が、配列内で近接するアイソタイプの置換を伴った。このように、天然のアイソタイプにマッチするようにエピトープを伸長した。よって、そのような置換は、他のヒトＩｇＧアイソタイプに存在するエピトープを構成し、寛容化されることが予想される。
ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２−ＳＬ、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２−電荷のみ、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−ＳＬ、およびＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−電荷のみと称される設計した低ｐＩアイソタイプを、それらのｐＩおよびエフェクター機能特性とともに表５に記載する。図２４は、天然のＩｇＧアイソタイプとともにＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３の配列アラインメントを提供し、残基同一性、および天然ＩｇＧアイソタイプのうちの１つ以上と比較してｐＩを低下させる残基を示す。図２５および２６は、ＩｇＧ１とＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３との間の構造上の違いを示す。ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２−ＳＬ、およびＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２−電荷のみは、ヒンジ（２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３５Ａ）およびＣＨ２ドメイン（３２７Ｇ）中のＩｇＧ２様残基によって確認されるように、低い（弱い）エフェクター機能を有するように設計した。ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−ＳＬ、およびＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−電荷のみは、ヒンジ（２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、２３６Ｇ）およびＣＨ２ドメイン（３２７Ａ）中のＩｇＧ１様残基によって確認されるように、高い（強い）エフェクター機能を有するように設計した。「ＳＬ」と指定されたアイソタイプの低ｐＩ変異体は、これらの変異体が１９２Ｓおよび１９３Ｌを有することによりＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２およびＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３と異なることを示唆する。これらの位置のセリンおよびロイシンは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２に存在する周辺残基における違いのために、１９２Ｎ／１９３Ｆよりも適合性が高いことが分かった。「電荷のみ」と表される低ｐＩアイソタイプ変異体は、電荷に影響を与えるアイソタイプの置換を含むが、周辺の電荷を変化させない置換は含まない。新規アイソタイプは、天然の軽鎖定常領域（ＣκもしくはＣλ）、またはｐＩをさらに低下させるための置換を用いて改変された変異型と組み合わせることができる。ｐＩを改変した定常軽鎖の例は、図２７に概略的に示される、ＣＫ−ｐＩ（４）と称される新しい変異体である。さらに、新規アイソタイプは、ＦｃＲｎに対する親和性を向上させるＦｃ変異体を用いてＦｃすることができ、それによってさらに半減期を延長することができる。そのようなＦｃ変異体は、例えば、表５に記載されるような４３４Ｓもしくは４２８Ｌ／４３４Ｓ、または本明細書に記載されるような他のＦｃ変異体を含んでもよい。ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２−ＳＬ、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２−電荷のみ、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−ＳＬ、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−電荷のみ、およびＣＫ−ｐＩ（４）のアミノ酸配列を図２８に提供する。
ＳＬ＝１９２Ｓ／１９３Ｌ
ＣＫ−ｐＩ（４）＝Ｋ１２６Ｅ／Ｋ１４５Ｅ／Ｋ１６９Ｅ／Ｋ２０７Ｅ
Ｆｖ＝ベバシズマブで計算したｐＩ
新規改変アイソタイプを他のＦｃ変異体と組み合わせて、延長された半減期および他の改善された特性を有する抗体またはＦｃ融合体を生成することができる。例えば、強化されたエフェクター機能または免疫調節特性を提供するために、ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ２−ＳＬおよび／またはＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−ＳＬに、ＦｃγＲへの結合を調節する変異体２３９Ｄ、３３２Ｅ、２６７Ｅ、および／または３２８Ｆを組み込んでもよい。新規アイソタイプは、例えば、４２８Ｌ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、およびＮ４３４Ａ／Ｔ３０７Ｑを含む、ＦｃＲｎへの結合を向上させる他のＦｃ変異体と組み合わされてもよく、それによって可能性としてｉｎ ｖｉｖｏ 半減期をさらに延長する。例示的な重鎖を表６に記載する。そのような変異体は、天然の定常軽鎖（ＣＫもしくはＣλ）を有する軽鎖、または、例えば、本明細書に記載される改変された定常軽鎖（例えばＣＫ−ｐＩ（４）を含む）のうちのいずれかを含む、ｐＩを低下させる定常軽鎖修飾を組み込んだ軽鎖を用いて発現させてもよい。
ｐＩをさらに低下させるために、電荷交換突然変異（すなわち、ＫおよびＲが、上述のようにＤまたはＥで置き換えられた）を導入することにより変異負荷を最小限に抑えるように、低いｐＩを有するさらなる変異体定常重鎖を設計した。これらの変異体の設計を補助するために、露出の割合、ならびにＦｃ領域内の各ＫおよびＲ残基について、Ｇｌｕに置換した時のエネルギーの変化を計算した（図２９）。これらの新しい変異体は、ｐＩ（７）およびｐＩ（１１）と称される。ｐＩ（７）には、アミノ酸修飾Ｋ１３３Ｅ、Ｋ２０５Ｅ、Ｋ２１０Ｅ、Ｋ２７４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３９２Ｅと、４４７でのＬｙｓの欠失とを組み込み、ｐＩ（１１）には、アミノ酸修飾Ｋ１３３Ｅ、Ｋ２０５Ｅ、Ｋ２１０Ｅ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ３２０Ｅ、Ｋ３２２Ｅ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３３４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３９２Ｅと、４４７でのＬｙｓの欠失とを組み込んだ。これらの修飾を定常重鎖に導入し、強いエフェクター機能を有する抗体ＩｇＧ１−ｐＩ（７）およびＩｇＧ１−ｐＩ（１１）と、弱いエフェクター機能を有する抗体ＩｇＧ１／２−ｐＩ（７）およびＩｇＧ１／２−ｐＩ（１１）とを生じさせた。図３０を見ると分かるように、ｍＡｂのｐＩが低くなると、ｐＩをさらに低下させるためにより多数の電荷交換置換が必要となる。これらのｐＩを改変した変異体を表７に記載し、アミノ酸配列を図２８に提供する。
ＩｇＧ１−ｐＩ（７）＝Ｋ１３３Ｅ／Ｋ２０５Ｅ／Ｋ２１０Ｅ／Ｋ２７４Ｅ／Ｒ３５５Ｅ／Ｋ３９２Ｅ／Ｋ４４７＃
ＩｇＧ１−ｐＩ（１１）＝Ｋ１３３Ｅ／Ｋ２０５Ｅ／Ｋ２１０Ｅ／Ｋ２７４Ｅ／Ｋ３２０Ｅ／Ｋ３２２Ｅ／Ｋ３２６Ｅ／Ｋ３３４Ｅ／Ｒ３５５Ｅ／Ｋ３９２Ｅ／Ｋ４４７＃
ＩｇＧ１／２−ｐＩ（７）＝Ｋ１３３Ｅ／Ｋ２０５Ｅ／Ｋ２１０Ｅ／Ｑ２７４Ｅ／Ｒ３５５Ｅ／Ｋ３９２Ｅ／Ｋ４４７＃
ＩｇＧ１／２−ｐＩ（１１）＝Ｋ１３３Ｅ／Ｋ２０５Ｅ／Ｋ２１０Ｅ／Ｑ２７４Ｅ／Ｋ３２０Ｅ／Ｋ３２２Ｅ／Ｋ３２６Ｅ／Ｋ３３４Ｅ／Ｒ３５５Ｅ／Ｋ３９２Ｅ／Ｋ４４７＃
ＣＫ−ｐＩ（４）＝Ｋ１２６Ｅ／Ｋ１４５Ｅ／Ｋ１６９Ｅ／Ｋ２０７Ｅ
Ｆｖ＝ベバシズマブで計算したｐＩ
上述のような分子生物学技術を使用して、ベバシズマブの可変領域を用いて抗体変異体を構築した。上述のように抗体を発現させ、精製し、性質決定した。上述のように、ｈｕＦｃＲｎマウスにおいて変異体および対照抗体のＰＫ試験を実行した。血清濃度の群平均を、適合するデータから得られた半減期とともに図３１および３２にプロットする。個々のマウスについて半減期を図３３にプロットする。図３４に示すような半減期対ｐＩのプロットによって示されるように、データは、アイソタイプｐＩ変異体からの低いｐＩおよびＮ４３４Ｓ置換からのＦｃＲｎ結合の強化の相加性を明らかに実証している。
実施例７．アイソタイプ軽鎖定常領域変異体
（図１８に示すように）ＣＫとＣλとの間の相同性は、ＩｇＧサブクラス間ほど高くないが、配列および存在する構造上の相同性は、アイソタイプ低ｐＩ軽鎖定常領域を作製するための置換を誘導するためになおも使用され得る。図１８では、より高いｐＩに寄与する残基（Ｋ、Ｒ、およびＨ）またはより低いｐＩに寄与する残基（ＤおよびＥ）を有する位置が太字で強調されている。グレーは、等電点を低下させるために、好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されてもよいリジン、アルギニン、およびヒスチジンを示す。いくつかのＣＫ／Ｃλアイソタイプ変異体を作製するためのガイドとして、ＣＫおよびＣλの構造アラインメントを構築し（図３５）、配列アラインメントとともに使用した。これらのｐＩを改変した変異体を表８に記載し、アミノ酸配列を図２８に提供する。
上述のような分子生物学技術を使用して、ベバシズマブの可変領域を用いて抗体変異体を構築した。上述のように抗体を発現させ、精製し、性質決定した。上述のように、ｈｕＦｃＲｎマウスにおいて変異体および対照抗体のＰＫ試験を実行した。血清濃度の群平均、およびこれらの変異体（ＸＥＮＰ１０５１９−ＩｇＧ−ｐＩ−Ｉｓｏ３−ＳＬ−４３４Ｓ−ＣＫ−Ｉｓｏ（５））のうちの１つについて適合するデータから得られた半減期を図３２にプロットし、個々のマウスについての半減期を図３３にプロットした。この変異体は、図３４に示される相関プロットにも含まれる。ＣＫ−Ｉｓｏ（５）軽鎖に起因するより低いｐＩの利点が明らかに示されている。
実施例８．調節した等電点を有する抗体変異体の混合物の精製
分析および精製を容易にするために、抗体の等電点を調節する置換が、抗体変異体の１つ以上の鎖の中に導入されてもよい。例えば、米国特許出願第２０１１／００５４１５１Ａ１号に記載されるもの等のヘテロ二量体抗体は、１つの鎖の等電点を調節することによって精製することができ、そのため、発現後およびプロテインＡの精製後に存在する複数の種を、イオン交換クロマトグラフィー等の電荷の違いに基づいてタンパク質を分離する方法によって精製することができる。２つの異なる重鎖―１つは未修飾のＩｇＧ１であり、１つは調節された等電点を有する―を使用するプロセスの概要を図３８に示す。
一例として、ＷＴ−ＩｇＧ１−ＨＣ、低ｐＩ−ＨＣ、およびＷＴ−ＬＣを２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした時に、３つの種の間の電荷の違いが、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を容易にするのに十分大きくなるように、ベバシズマブの重鎖を、その等電点を低下させるための置換を導入することにより修飾した。上述のようにクローンを作製し、トランスフェクションおよびプロテインＡクロマトグラフィーによる最初の精製も上述の通りである。３つの鎖の配列を「ＸＥＮＰ１０６５３の重鎖１」、「ＸＥＮＰ１０６５３の重鎖２」、および「ＸＥＮＰ１０６５３の軽鎖」として図３９に列挙する。プロテインＡの精製後、ほぼ同一の分子量を有するが、異なる電荷を有する３つの種が得られる。これらは、ＷＴ−ＩｇＧ１−ＨＣ／ＷＴ−ＩｇＧ１−ＨＣホモ二量体（ｐＩ＝８．１２）、ＷＴ−ＩｇＧ１−ＨＣ／低ｐＩ−ＨＣヘテロ二量体（ｐＩ＝６．８９）、および低ｐＩ−ＨＣ／低ｐＩ−ＨＣホモ二量体（ｐＩ＝６．２０）である。混合物を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）中のＧＥ ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰカラムに負荷し、同じＴｒｉｓ緩衝液中の５０ｍＭ、１００ｍＭ、そして最後に２００ｍＭのＮａＣｌからなるＮａＣｌの段階的勾配を用いて溶出した。Ａ２８０により溶出を監視し、Ｎｏｖｅｘ泳動用緩衝液を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＨ ３−１０ ＩＥＦゲル上で各画分を分析し、これらの結果を図４０に示す。ＷＴ−ＩｇＧ１−ＨＣ／ＷＴ−ＩｇＧ１−ＨＣホモ二量体は、ｐＨ７．６の陰イオン交換カラムには結合せず、したがってフロースルーおよび洗浄液に存在する（レーン１〜２）。所望のヘテロ二量体は、５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し（レーン３）、低ｐＩ−ＨＣ／ｌｏｗ−ｐＩ−ＨＣホモ二量体は、１００ｍＭ（レーン４）および２００ｍＭ（レーン５）のＮａＣｌで最も密接に結合して溶出する。このように、他の２つの種と分子量が類似しているために他の手段による精製が困難である所望のヘテロ二量体変異体が、１つの鎖に低ｐＩ置換を導入することによって容易に精製される。各鎖の等電点を改変することによって抗体を精製するこの方法は、図４１および図４２に概要が示されるように、種々の二重特異性抗体構築物を精製する方法に適用することができる。この方法は、混合物中の所望の種が同様の分子量および他の特性を有するため、通常の精製技術では所望の種を高収率で分離することができない場合に、特に有用である。容易な精製のために改変された等電点を有する特定のヘテロ二量体構築物および／または二重特異性構築物と配列を、表９および１０、ならびに図３９にそれぞれ示す。
実施例９．ｐＩを変化させるための非天然荷電置換の設計
定常ドメインにおいて置換を改変することにより、抗体の定常鎖のｐＩを変化させた。ｐＩの低下は、塩基性アミノ酸（ＫまたはＲ）から酸性アミノ酸（ＤまたはＥ）に置換を行うことにより改変することができ、最も大幅なｐＩの低下がもたらされる。また、塩基性アミノ酸から中性アミノ酸へ、および中性アミノ酸から酸性アミノ酸への突然変異によっても、ｐＩの低下がもたらされる。反対に、ｐＩの増加は、酸性アミノ酸（ＤまたはＥ）から塩基性アミノ酸（ＫまたはＲ）に置換を行うことにより改変することができ、最も大幅なｐＩの増加がもたらされる。酸性アミノ酸から中性アミノ酸へ、および中性アミノ酸から塩基性アミノ酸への突然変異によっても、ｐＩの増加がもたらされる。アミノ酸のｐＫ値の一覧は、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １５：５２９−５３９の表１に見出だすことができる。
どの位置を突然変異させるかを決定する際に、置換または置換のセットが構造および／または機能に及ぼす影響を最小限に抑えるために、周囲環境およびＷＴアミノ酸がその周辺構造と接触する回数を考慮に入れた。各定常領域の位置の溶媒露出度または露出の割合は、関連する結晶構造を用いて計算した。その結果を図４３に示す。この分析に基づいて、ｐＩを低下または増加が、ドメインの生物物理学的特性には最小限の影響を及ぼすことが予測される、多くの置換を特定した。ベバシズマブに関連して概念実証の結果を図４４〜４７（重鎖）および図４８〜５１（軽鎖）に示す。
次のようにタンパク質のｐＩの計算を行った。最初に、Ｄ、Ｅ、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、およびＹアミノ酸の数、ならびにタンパク質中に存在するＮおよびＣ末端の数を数えた。次に、タンパク質が全体としてゼロの電荷を有するｐＨを特定することによりｐＩを計算した。これは、多くの試験ｐＨ値でタンパク質の正味電荷を計算することにより行った。試験ｐＨ値は、タンパク質の電荷がゼロに達するかまたはゼロを超えるまで、低いｐＨ０から高いｐＨ１４まで０．００１ずつ漸増して反復的に設定した。次の式を用いて、所与のｐＨでのタンパク質の正味電荷を計算した：
式中、

は、所与のｐＨでのタンパク質の正味電荷であり、

は、タンパク質中に存在するアミノ酸

（またはＮもしくはＣ末端）の数であり、

は、アミノ酸

（またはＮもしくはＣ末端）のｐＫである。
実施例１０．アイソタイプ定常領域変異体
上記のように、ＩｇＧのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）間のアイソタイプの違いを利用することにより、ｐＩを増加または低下させる置換が免疫原性を誘発するリスクを最小限に抑えるための努力を行うことができる。この原理に基づいて新規アイソタイプの新しいセットを設計した。可能な場合、ｐＩを変化させる置換には、配列内で近接するアイソタイプの置換を付随させた。このようにして、天然のアイソタイプにマッチするようにエピトープを伸長した。よって、そのような置換は、他のヒトＩｇＧアイソタイプに存在するエピトープを構成し、寛容化されることが予想される。これらの新しい変異体は、ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋）、およびＩＳＯ（＋ＲＲ）と称される。ＩＳＯ（−）は低いｐＩを有し、一方、ＩＳＯ（＋）およびＩＳＯ（＋ＲＲ）は高いｐＩを有する。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４におけるアイソタイプ変異体、ならびに新しいアイソタイプｐＩ変異体の配列を示す配列アラインメントを図５２に示す。また、これらの新しい変異体の配列を、単独で、かつ抗ＶＥＧＦ抗体に関連して示す（図５３〜５７）。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に由来するｐＩを低下させるアイソタイプ突然変異の全ての可能な組み合わせを図５８に示す。ｐＩを増加させるアイソタイプ突然変異の全ての可能な組み合わせを図５９に示す。
実施例１１．調節した等電点を有する抗体変異体の混合物の精製。
前述のように、分析および精製を容易にするために、抗体の等電点を調節する置換が抗体変異体の１つ以上の鎖の中に導入されてもよい。これは、ヘテロ二量体とホモ二量体との混合物を生成するヘテロ二量体構築物および／または二重特異性構築物の場合のように、非常に類似する種の混合物を含む抗体を調製する時に特に有用である。対応するホモ二量体からの、ほぼ同一の抗体ヘテロ二量体種の精製を実証するために、我々は、抗体ベバシズマブに関連して、アイソタイプのｐＩ変異体を構築した。２つの異なる重鎖ＤＮＡ（ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋）、ＩＳＯ（＋ＲＲ）、またはＩｇＧ１（ＷＴ））をベバシズマブの軽鎖でトランスフェクトすることにより変異体を構築した。変異体は、最初にプロテインＡにより精製し、次いで、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）中のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムに負荷し、ＮａＣｌの勾配で溶出した。溶出後、各ピークからの画分を分析のためにＬｏｎｚａ ＩｓｏＧｅｌ ＩＥＦプレート（ｐＨ範囲７〜１１）に負荷した。図６０〜６３にデータを示す。各場合において中央のｐＩヘテロ二量体の分離が達成され、ヘテロ二量体がホモ二量体とのより大きいｐＩ差を有する場合に分離が向上した。
実施例１２．調節した等電点を有する免疫グロブリン変異体の混合物の設計。
各鎖の等電点を改変することによって抗体を精製するこの方法は、種々の二重特異性抗体構築物を精製する方法に適用することができる。この方法は、混合物中の所望の種が同様の分子量および他の特性を有するため、通常の精製技術では所望の種を高収率で分離することができない場合に、特に有用である。一般的なヘテロ二量体免疫グロブリン変異体の略図を図６４に示す。ヘテロ二量体免疫グロブリン変異体は、それらの鎖のうちの１つ以上にＶＨまたはＶＬ可変領域を含んでもよい。ヘテロ二量体免疫グロブリン変異体の構築に使用することができるＶＨおよびＶＬ領域のいくつかの例を図６５に列挙する。容易な精製のために改変された等電点を有する特定のヘテロ二量体構築物および／または二重特異性構築物と配列を図６６〜７９に示す。
実施例１３．調節した等電点を有する二重特異性免疫グロブリン変異体の混合物の精製．
対応するホモ二量体からの、ほぼ同一の二重特異性ヘテロ二量体種の精製をさらに実証するために、我々は、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３二重ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＸＥＮＰ１１３５５、図８０を参照）、抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３２ｂ二重ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＸＥＮＰ１１１３９、図８２を参照）、および第２の抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３二重ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＸＥＮＰ１１３３８、図８４を参照）に関連して、アイソタイプｐＩ変異体を構築した。変異体は、２つの異なる重鎖ＤＮＡ（ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋）、またはＩＳＯ（＋ＲＲ））を共トランスフェクトすることにより構築した。変異体は、最初にプロテインＡにより精製し、次いで５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）中のＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰ陽イオン交換カラムに負荷し、ＮａＣｌの勾配で溶出した。溶出後、各ピークからの画分を分析のためにＬｏｎｚａ ＩｓｏＧｅｌ ＩＥＦプレート（ｐＨ範囲３〜１０）に負荷した。図８１、８３、および８５にデータを示す。データから分かるように、各場合において中央のｐＩヘテロ二量体の効率的な分離が達成されている。
実施例１４．調節した等電点を有する単一特異性一価免疫グロブリン変異体の混合物の精製
対応するホモ二量体からの、ほぼ同一の単一特異性一価ヘテロ二量体種の精製をさらに実証するために、我々は、一価性抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１１２３３、図８６を参照）および１アーム抗ＣＤ４０ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１１２３８、図８８を参照）に関連して、アイソタイプｐＩ変異体を構築した。変異体は、２つの異なる重鎖ＤＮＡ（ＩＳＯ（−）、ＩＳＯ（＋）、またはＩＳＯ（＋ＲＲ））をコトランスフェクトすることにより構築した。変異体は、最初にプロテインＡにより精製し、次いで分析のためにＬｏｎｚａ ＩｓｏＧｅｌ ＩＥＦプレート（ｐＨ範囲３〜１０）に負荷した。図８６および８８にデータを示す。データから分かるように、各場合において中央のｐＩヘテロ二量体の効率的な分離が達成されている。

Claims (27)

  1. ヘテロ二量体タンパク質を含む組成物であって、
    ａ）
    ｉ）第１の変異体重鎖定常領域と、
    ｉｉ）第１の融合パートナーと、を含む、第１の単量体と、
    ｂ）
    ｉ）第２の変異体重鎖定常領域と、
    ｉｉ）第２の融合パートナーと、を含む、第２の単量体と、を含み、
    前記第１および第２の変異体重鎖定常領域のｐＩは、少なくとも０．５ｌｏｇ離れている、組成物。
  2. 前記第１および第２の単量体の前記ｐＩは、少なくとも０．５ｌｏｇ離れている、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記第１の単量体は、第３の融合パートナーを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記第２の単量体は、第４の融合パートナーを含む、請求項１、２、または３に記載の組成物。
  5. 前記融合パートナーは、免疫グロブリン成分、ペプチド、サイトカイン、ケモカイン、免疫受容体、および血液因子からなる群から独立して選択される、請求項１、３、および４に記載の組成物。
  6. 前記免疫グロブリン成分は、Ｆａｂ、ＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ２、ｄＡｂからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記ケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１２からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記免疫受容体は、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＴＮＦＳＦタンパク質、およびＴＮＦＲＳＦからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  10. 前記血液因子は、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  11. 前記変異体重鎖定常領域のうちの１つは、Ｑ１９６Ｋ、Ｐ２１７Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｎ２７６Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、およびＹ４３６Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、いずれかの先行請求項に記載の組成物。
  12. 前記変異体重鎖定常領域のうちの１つは、Ｓ１１９Ｅ、Ｋ１３３Ｅ、Ｋ１３３Ｑ、Ｒ１３３Ｅ（ＩｇＧ２〜４の場合）、Ｒ１３３Ｑ（ＩｇＧ２〜４の場合）、Ｔ１６４Ｅ、Ｋ２０５Ｅ、Ｋ２０５Ｑ、Ｎ２０８Ｄ、Ｋ２１０Ｅ、Ｋ２１０Ｑ、Ｋ２７４Ｅ、Ｋ３２０Ｅ、Ｋ３２２Ｅ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３３４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ４４７の欠失、Ｃ末端でのペプチドＤＥＤＥの付加、Ｇ１３７Ｅ、Ｎ２０３Ｄ、Ｋ２７４Ｑ、Ｒ３５５Ｑ、Ｋ３９２Ｎ、およびＱ４１９Ｅ、３４９Ａ、３４９Ｃ、３４９Ｅ、３４９Ｉ、３４９Ｋ、３４９Ｓ、３４９Ｔ、３４９Ｗ、３５１Ｅ、３５１Ｋ、３５４Ｃ、３５６Ｋ、３５７Ｋ、３６４Ｃ、３６４Ｄ、３６４Ｅ、３６４Ｆ、３６４Ｇ、３６４Ｈ、３６４Ｒ、３６４Ｔ、３６４Ｙ、３６６Ｄ、３６６Ｋ、３６６Ｓ、３６６Ｗ、３６６Ｙ、３６８Ａ、３６８Ｅ、３６８Ｋ、３６８Ｓ、３７０Ｃ、３７０Ｄ、３７０Ｅ、３７０Ｇ、３７０Ｒ、３７０Ｓ、３７０Ｖ、３９２Ｄ、３９２Ｅ、３９４Ｆ、３９４Ｓ、３９４Ｗ、３９４Ｙ、３９５Ｔ、３９５Ｖ、３９６Ｔ、３９７Ｅ、３９７Ｓ、３９７Ｔ、３９９Ｋ、４０１Ｋ、４０５Ａ、４０５Ｓ、４０７Ｔ、４０７Ｖ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４１１Ｄ、４１１Ｅ、４１１Ｋ、４３９Ｄ、３４９Ｃ／３６４Ｅ、３４９Ｋ／３５１Ｋ、３４９Ｋ／３５１Ｋ／３９４Ｆ、３４９Ｋ／３５４Ｃ、３４９Ｋ／３９４Ｆ、３４９Ｋ／３９４Ｆ／４０１Ｋ、３４９Ｋ／３９４Ｙ、３４９Ｋ／４０１Ｋ、３４９Ｋ／４０５Ａ、３４９Ｔ／３５１Ｅ／４１１Ｅ、３４９Ｔ／３９４Ｆ、３４９Ｔ／３９４Ｆ／４０１Ｋ、３４９Ｔ／３９４Ｆ／４１１Ｅ、３４９Ｔ／４０５Ａ、３４９Ｔ／４１１Ｅ、３５１Ｅ／３６４Ｄ、３５１Ｅ／３６４Ｄ／４０５Ａ、３５１Ｅ／３６４Ｅ、３５１Ｅ／３６６Ｄ、３５１Ｋ／３６４Ｈ／４０１Ｋ、３５１Ｋ／３６６Ｋ、３６４Ｄ／３７０Ｇ、３６４Ｄ／３９４Ｆ、３６４Ｅ／４０５Ａ、３６４Ｅ／４０５Ｓ、３６４Ｅ／４１１Ｅ、３６４Ｅ／４１１Ｅ／４０５Ａ、３６４Ｈ／３９４Ｆ、３６４Ｈ／４０１Ｋ、３６４Ｈ／４０１Ｋ／４０５Ａ、３６４Ｈ／４０５Ａ、３６４Ｈ／４０５Ａ／４１１Ｅ、３６４Ｙ／３７０Ｒ、３７０Ｅ／４１１Ｅ、３７０Ｒ／４１１Ｋ、３９５Ｔ／３９７Ｓ／４０５Ａ、ならびに３９７Ｓ／４０５Ａからなる群から選択される変異体をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. ａ）第１の変異体重鎖定常領域を含む第１の重鎖と、
    ｂ）第２の変異体重鎖定常領域を含む第２の重鎖と、を含むヘテロ二量体抗体を含み、
    前記第１および第２の変異体重鎖定常領域のｐＩは、少なくとも０．５ｌｏｇ離れている、組成物。
  14. 前記変異体重鎖定常領域のうちの１つは、Ｑ１９６Ｋ、Ｐ２１７Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｎ２７６Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、およびＹ４３６Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、いずれかの先行請求項に記載の組成物。
  15. 前記抗体は、第１および第２の軽鎖をさらに含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
  16. 前記軽鎖のうちの１つは、Ｋ１２６Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｋ１４５Ｅ、Ｋ１４５Ｑ、Ｎ１５２Ｄ、Ｓ１５６Ｅ、Ｋ１６９Ｅ、Ｓ２０２Ｅ、Ｋ２０７Ｅ、Ｃ末端でのＤＥＤＥの付加、Ｒ１０８Ｑ、Ｑ１２４Ｅ、Ｋ１２６Ｑ、Ｎ１３８Ｄ、Ｋ１４５Ｔ、およびＱ１９９Ｅからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む変異体軽鎖である、１５に記載の組成物。
  17. 前記第１および第２の変異体重鎖定常領域の前記ｐＩは、少なくとも０．５ｌｏｇ離れている、請求項１３に記載のヘテロ二量体抗体を含む組成物。
  18. 前記第１および前記第２の変異体重鎖定常領域は、ＣＨ２およびＣＨ３を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
  19. 前記第１および前記第２の変異体重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
  20. 前記第１の重鎖と前記第２の重鎖とは、少なくとも４つのアミノ酸だけ異なる、請求項１３に記載の組成物。
  21. 前記第１の重鎖は４つのアミノ酸置換を含み、前記第２の鎖は１つも含まない、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記第１の重鎖は、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、前記第２の重鎖は、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、前記置換は異なる、請求項２０に記載の組成物。
  23. 請求項１〜２２に記載のタンパク質のうちのいずれかをコードする核酸。
  24. 請求項２３に記載の核酸をコードする、宿主細胞。
  25. ａ）先行請求項のいずれかに記載の組成物を提供することと、
    ｂ）前記組成物をイオン交換カラムに負荷することと、
    ｃ）ヘテロ二量体の画分を収集することと、を含む、ヘテロ二量体タンパク質を精製する方法。
  26. いずれかの先行請求項の組成物を、それを必要とする個体／個人に投与することを含む、治療の方法。
  27. Ｑ１９６Ｋ、Ｐ２１７Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、Ｎ２７６Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、およびＹ４３６Ｆからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む抗体の変異体重鎖定常領域を含む、組成物。
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