JP2020515253A

JP2020515253A - 安定な多重特異性抗体

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Publication number: JP2020515253A
Application number: JP2019552972A
Authority: JP
Inventors: ジュコーフスキー，ウジェーヌ; レジェ，オリヴィエ; モールス，リシャール・ジ
Original assignee: Biomunex Pharmaceuticals
Current assignee: Biomunex Pharmaceuticals
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2020-05-28
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: AU2018241881A1; BR112019019998A2; RU2019134211A3; CA3057567A1; IL269559A; IL269559B1; IL269559B2; SG11201908825TA; ZA201906981B; MX2019011585A; JP2023175760A; US11560437B2; KR20190141154A; JP7432365B2; US20200299413A1; RU2019134211A; CN111094355A; WO2018178101A1; EP3601366A1

Abstract

本発明は、CH1ドメインとCLドメインとの境界面に特定の突然変異セットを有するFab断片を含む多重特異性抗体コンストラクトであって、該突然変異が重鎖／軽鎖の誤対合を防ぐコンストラクトに関する。

Description

本発明は、医学分野において有用な多重特異性抗体分子の生成に関する。

発明の背景：
二重特異性抗体（bsAb）は、２つの抗体の特異性を併せ持ち、そして、異なる抗原又はエピトープに同時に対処する。「二標的（two-targets）」機能を有するbsAbは、例えば、癌、増殖、又は炎症のプロセスに関連する複数の表面受容体又はリガンドに干渉することができる。また、bsAbは、１つの細胞におけるタンパク質複合体の形成を支援するか又は細胞間の接触を誘発するために、標的を極めて近接して配置することもできる。「強制接続（forced-connection）」機能の例は、凝固カスケードにおけるタンパク質複合体化、又は腫瘍が標的とする免疫細胞の動員因子及び／若しくは活性化因子を支援するbsAbである。何年にもわたる研究開発の末、２００９年に最初のbsAbが承認された。

当初、二重特異性抗体は、化学的コンジュゲーションによって、又は２つの異なるmAbを生成する２つのハイブリドーマ細胞株間の融合から得られるクアドローマを使用することによって調製されていた。しかし、化学的コンジュゲーションは、時に抗原結合部位を変化させることがあり、その結果、抗体の生物学的特性が損なわれる。クアドローマアプローチは、２つの異なる抗体由来の重鎖及び軽鎖がランダムに対合することによって理論的には１０の組み合わせが等確率で生じ、その結果、免疫グロブリン分子の混合物が生じ、そのうちの１つだけが所望の二重特異性生成物であるので、これを誤対合した生成物から分離しなければならないという問題点を有する。

遺伝子操作は、現在、二重特異性抗体を生成するための第一選択方法になりつつあり、そして、多種多様な異なる組換え二重特異性抗体フォーマットの開発につながっている。これら二重特異性抗体の一部は非常に単純であり、そして、適切なペプチドリンカーを介して会合している２つの（又はそれ以上の）異なる抗体の単鎖Fv（scFv）断片に由来している。これら抗体は、生成が比較的容易であり、そして、該抗体は単一のポリペプチド鎖によって形成されかつ親抗体のFv領域のみを含有しているので、鎖間の誤対合の問題がない。しかし、該抗体は完全長免疫グロブリンよりも小さく、そして、定常領域、具体的にはFc領域を有していない。それは一部の用途、例えばFcによって媒介される作用を回避したいときには好都合である場合もあるが、Fcによって媒介されるエフェクタ機能が望ましいときは不都合である。また、サイズが小さくかつFc領域を有しないことから、該抗体はインビボにおける半減期が非常に短い。

したがって、天然に存在する免疫グロブリン分子をより厳密に模倣する、具体的には、完全なFc領域を有する他の二重特異性組換え抗体フォーマットが設計された。該フォーマットは２つの主なフォーマットに分類することができる。

第１のフォーマット（IgG scFv）では、抗体Ａ由来のscFvを抗体Ｂの重鎖の末端（一般的に、Ｃ末端）に融合させる。得られる抗体は、抗体ＢのVH、CH1、CH2、及びCH3のドメイン並びに抗体ＡのVH及びVLのドメインを含有する１種の重鎖と、抗体ＢのVL及びCLのドメインを含有する１種の軽鎖のみを有するので、鎖間の誤対合が発生しない。このようなフォーマットは、例えば、Qu et al. (Blood, 111, 2211-2219, 2008)によって記載されている。

第２のフォーマットでは、抗体Ａ由来の重鎖及び軽鎖を抗体Ｂ由来の重鎖及び軽鎖と対合させる。このフォーマットは、クアドローマによって生成される二重特異性抗体を再現するものであるので、同様の誤対合の問題が生じる。重鎖の誤対合の問題を解決するために、そのヘテロ二量体化（すなわち、重鎖Ａと重鎖Ｂとの対合）を優先させ、そして、ホモ二量体化を防ぐために、抗体のCH3ドメインに変異導入することが提案されている。これは、いわゆる「ノブ・インツー・ホール（knob into holes）」アプローチによって行われた（Ridgway et al, Protein Eng, 9, 617-21, 1996；米国特許第７，６９５，９３６号）。小さなアミノ酸がより大きなアミノ酸によって置換されている「ノブ」突然変異を抗体Ａの重鎖のCH3二量体の境界面に導入すると、ホモ二量体化を妨げる立体障害が生じる。同時に、ヘテロ二量体化を促進するために、大きなアミノ酸がより小さなアミノ酸によって置換されている相補的「ホール」突然変異を抗体ＢのCH3ドメインに導入する。重鎖／軽鎖の誤対合の問題を解決するために、scFvファージライブラリから既に同定されている、特異性は異なるが共通の軽鎖を共有している抗体を使用することが提案されている（Merchant et al., Nat Biotechnol, 16, 677-81, 1998；米国特許第７，１８３，０７６号）。このアプローチの問題点は、共通の軽鎖を有する抗体を同定することが困難である点である。

国際公開公報第２０１３／００５１９４号では、CH1及びCLのドメインの境界面におけるいくつかの重要な残基に変異導入することによって、重鎖／軽鎖の誤対合を防ぎ、それによって、鎖の所望のマッチングを保証できることが提案された。

発明の概要：
本発明者らは、新規突然変異セットによって、多重特異性抗体分子における鎖のマッチングを更に改善できることを見出した。

本発明は、CH1及びCLのドメインの境界面に特定の突然変異セットを有する異なるFab断片を含む多重特異性、例えば、二重特異性の抗体コンストラクトであって、該突然変異が重鎖／軽鎖の同種対合を促進し、そして、誤対合を防ぐ抗体に関する。

CH1及びCLのドメインに対して本明細書で使用される配列位置番号は、Kabat付番（Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n 91-3242, pp 662,680,689, 1991）を指す。

ａ）
− 対象となる抗体のVH及びVLのドメイン、
− 免疫グロブリンのCH1ドメインの１９２位におけるトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって該CH1ドメインから得られるCH1ドメイン、及び
− 免疫グロブリンのCLドメインの１３７位におけるアスパラギン残基をリジン残基で置換し、そして、該CLドメインの１１４位におけるセリン残基をアラニン残基で置換することによって該CLドメインから得られるCLドメイン
からなるFab断片、並びに
ｂ）
− 対象となる抗体のVH及びVLのドメイン、
− 免疫グロブリンのCH1ドメインの１２４位におけるロイシン残基をグルタミンで置換し、そして、該CH1ドメインの１８８位のセリン残基をバリン残基で置換することによって該CH1ドメインから得られるCH1ドメイン、及び
− 免疫グロブリンのCLドメインの１３３位におけるバリン残基をトレオニン残基で置換し、そして、該CLドメインの１７６位のセリン残基をバリン残基で置換することによって該CLドメインから得られるCLドメイン
からなるFab断片
から選択される変異型Fab断片が本明細書に提供される。

このような変異型Fab断片を含む任意のコンストラクト、好ましくは任意のタンパク質コンストラクトも本発明の一部である。

具体的には、異なるCH1及びCLのドメインを有する少なくとも２つのFab断片を含む多重特異性抗原結合断片であって、各Fab断片が対象となる異なるエピトープを認識し、そして、該Fab断片が任意の順序でタンデムに配置されており、第１のFab断片のCH1ドメインのＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して次のFab断片のVHドメインのＮ末端に連結されており、
少なくとも１つのFab断片、そして、より好ましくは２つの断片が、
ａ）
− 抗体のVH及びVLのドメイン、
− 免疫グロブリンのCH1ドメインの１９２位におけるトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって該CH1ドメインから得られるCH1ドメイン、及び
− 免疫グロブリンのCLドメインの１３７位におけるアスパラギン残基をリジン残基で置換し、そして、該CLドメインの１１４位におけるセリン残基をアラニン残基で置換することによって該CLドメインから得られるCLドメイン
からなるFab断片、並びに
ｂ）
− 抗体のVH及びVLのドメイン、
− 免疫グロブリンのCH1ドメインの１２４位におけるロイシン残基をグルタミンで置換し、そして、該CH1ドメインの１８８位のセリン残基をバリン残基で置換することによって該CH1ドメインから得られるCH1ドメイン、及び
− 免疫グロブリンのCLドメインの１３３位におけるバリン残基をトレオニン残基で置換し、そして、該CLドメインの１７６位のセリン残基をバリン残基で置換することによって該CLドメインから得られるCLドメイン
からなるFab断片
からなる群から選択される、多重特異性抗原結合断片が提供される。

好ましい実施態様によれば、CH1ドメインは、有利にはIgG1サブタイプのIgG免疫グロブリンに由来する。CLドメインは、好ましくはカッパ型である。好ましくは、ヒトの処置において使用する場合、変異型CH1及び変異型CLのドメインが由来する免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。

VH及びVLのドメインは、標的としたいエピトープを認識する、ネイティブの又は遺伝子操作された任意の抗体に由来していてよい。

本発明の変異型Fab断片は、重鎖／軽鎖の同種対合を促進し、そして、その誤対合を防ぐことが必要な場合、任意の多重特異性抗体コンストラクトで使用することができる。

有利には、該変異型Fab断片は、各断片が、リンカーによって分離されているタンデムに配置されたFab断片から本質的になる、抗原結合断片を含む多重特異性抗体分子において使用してよい。

したがって、本発明の別の目的は、
− 免疫グロブリンの野生型のCH1及びCLのドメインを含むFab断片（本明細書では「野生型Fab断片」としても定義される）
− 上に定義した通りの変異型Fab断片（ａ）、
− 上に定義した通りの変異型Fab断片（ｂ）
から選択される少なくとも２つかつ６つ以下の異なるFab断片を含む多重特異性抗原結合断片であって、
各Fab断片が、対象となる異なるエピトープを認識し、そして、該Fab断片が、任意の順序でタンデムに配置されており、第１の１つのFab断片のCH1ドメインのＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して次のFab断片のVHドメインのＮ末端に連結されているか、
又は１つ若しくは２つのFab断片が、任意の順序でタンデムに配置されており、そして、ポリペプチドリンカーを介してCH3ドメインのＣ末端若しくはヒンジ配列のＣ末端に連結されているが、別のFab若しくは任意の順序でタンデムに配置されている２つのFabは、ヒンジ配列のＮ末端に結合している、多重特異性抗原結合断片である。

上記ヒンジ配列は、典型的には、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、若しくはIgD、そして、最も好ましくはIgG1から得られる天然のヒンジ配列であり、又は改変されたヒンジ配列が８０アミノ酸未満、好ましくは６０アミノ酸未満、更に好ましくは４０アミノ酸未満からなるように、アミノ酸の点突然変異及び／若しくは付加を通じて改変された配列であってもよい。

「抗原結合断片」は、本明細書では、それぞれが異なるエピトープを認識する２つ以上の抗原結合領域を有する分子として定義される。該異なるエピトープは、同じ抗原分子に由来していてもよく、異なる抗原分子に由来していてもよい。

好ましい実施態様では、それぞれが多重特異性抗原結合断片、すなわち、上に定義した通り複数の（すなわち、１つを超える）抗原に結合することができる抗原結合断片からなる２本の同一の抗原結合アームを有する、多重特異性抗体が更に提供される。

具体的な実施態様では、該多重特異性抗体は、免疫グロブリン様構造を有し、そして、
− 各アームが上に定義した通りの多重特異性抗原結合断片からなる、２本の同一の抗原結合アーム、
− 免疫グロブリンの二量体化されたCH2及びCH3のドメイン、
− 抗原結合アームのCH1ドメインのＣ末端をCH2ドメインのＮ末端に連結する、IgA、IgG、又はIgDのヒンジ領域
を含む。

より具体的には、本発明の主題は、２本の重鎖及び４本の軽鎖を含む多重特異性、好ましくは二重特異性の抗体であって、各重鎖が、
− ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む免疫グロブリンのFc領域を含み、
− Fc領域が、該ヒンジドメインによって抗体１（Ab1）のFab重鎖のCH1-VHに連結しており、
− 次に、ポリペプチドリンカー配列によって抗体２（Ab2）のFab重鎖のCH1-VHに連結しており、そして、該ポリペプチドリンカー配列が、Ab1の該Fab重鎖のVHドメインのＮ末端をAb2の該CH1ドメインのＣ末端に連結し、
そして、該４本の軽鎖が、その同種重鎖ドメインと会合しているAb1のFab軽鎖のCL-VL及びAb2のFab軽鎖のCL-VLを含み、
Ab1及びAb2が、異なるエピトープを認識し、
そして、Ab1若しくはAb2のうちの一方のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１９２位におけるトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって該CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３７位におけるアスパラギン残基をリジン残基で置換し、そして、該CLドメインの１１４位におけるセリン残基をアラニン残基で置換することによって該CLドメインから得られる変異型ドメインである、及び／又は
Ab1若しくはAb2のうちの一方若しくは他方のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１２４位におけるロイシン残基をグルタミンで置換し、そして、該CH1ドメインの１８８位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって該CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３３位におけるバリン残基をトレオニン残基で置換し、そして、該CLドメインの１７６位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって該CLドメインから得られる変異型ドメインである、抗体である。

− 本発明の変異型Fab断片の軽鎖、
− 本発明の変異型Fab断片の重鎖、
− 本発明の抗原結合断片の重鎖、
− 本発明の免疫グロブリン様多重特異性抗体の重鎖
から選択される任意のタンパク質鎖について更に記載される。

本開示は、更に、本発明のタンパク質鎖をコードしている配列を含むポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、更なる配列を含んでいてもよく：具体的には、有利には、該タンパク質鎖を分泌させるリーダー配列又はシグナルペプチドをコードしている配列を含んでいてよい。

図１は、還元及び非還元の条件下におけるBiXAb-6567のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。レーン１：還元条件下におけるBiXAb-6567の移動；レーン２：各バンドの重量が示されている分子量マーカー；レーン３：非還元条件下におけるBiXAb-6567の移動。図２は、BiXAb-6567のサイズ排除クロマトグラフィ分析を示す。図３は、示差走査熱量測定によって決定された、２つの親抗体（抗CD38及び抗PD-L1）及びBiXAb-6567の融解プロファイルを示す。図４Ａは、直接CD38抗原結合ELISAにおける２つの親抗体（抗CD38及び抗PD-L1）及びBiXAb-6567の結合プロファイルを示す。図４Ｂは、直接PD-L1抗原結合ELISAにおける２つの親抗体（抗CD38及び抗PD-L1）及びBiXAb-6567の結合プロファイルを示す。図４Ｃは、二重抗原（PD-L1及びCD38）結合ELISAにおけるBiXAb-6567の結合プロファイルを示す。図５Ａは、３つの異なる細胞株についての２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）及びBiXAb-6567の蛍光活性化細胞選別プロファイルを示し、そのうち多発性骨髄腫RPMI-8226を示す。図５Ｂは、３つの異なる細胞株についての２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）及びBiXAb-6567の蛍光活性化細胞選別プロファイルを示し、そのうち完全長CD38で安定にトランスフェクトされたCHO細胞を示す。図５Ｃは、３つの異なる細胞株についての２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）及びBiXAb-6567の蛍光活性化細胞選別プロファイルを示し、そのうち卵巣癌細胞株SKOV-3を示す。図６は、２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）、BiXAb-6567、及びネガティブコントロールである抗CD20抗体のCHO-CD38細胞株における力価結合プロファイルを示す。図７は、標的細胞として多発性骨髄腫細胞株RPMI-8226を、そして、エフェクタ細胞として未分画のプレ活性化されていない単核細胞を使用するADCCアッセイにおける、２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）、BiXAb-6567、並びに２つのネガティブコントロール抗体である抗CD20及び抗HER2の細胞傷害活性プロファイルを示す。図８は、標的細胞としてCHO-CD38細胞株を、そして、エフェクタ細胞として未分画のプレ活性化されていない単核細胞を使用するADCCアッセイにおける、２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）、BiXAb-6567、並びに２つのネガティブコントロール抗体である抗CD20及び抗HER2の細胞傷害活性プロファイルを示す。図９は、標的細胞としてSKOV-3細胞株を、そして、エフェクタ細胞として濃縮されたIL-12でプレ活性化されたNK細胞を使用するADCCアッセイにおける、２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）、BiXAb-6567、並びに２つのネガティブコントロール抗体である抗CD20及び抗HER2の細胞傷害活性プロファイルを示す。図１０は、標的細胞としてSKOV-3細胞株を、そして、エフェクタ細胞として濃縮されたIL-15でプレ活性化されたNK細胞を使用するADCCアッセイにおける、２つの親mAb（抗CD38及び抗PD-L1）、BiXAb-6567、並びに２つのネガティブコントロール抗体である抗CD20及び抗HER2の細胞傷害活性プロファイルを示す。図１１は、２本の重鎖及び４本の軽鎖を含み、そして、異なる突然変異の組み合わせを示す、本発明の二重特異性抗体の概略図である。

発明の詳細な説明
定義：
天然に存在する抗体分子の基本構造は、非共有結合的相互作用によって、そして、鎖間ジスルフィド結合によって互いに保持されている、２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖からなるＹ字形四量体四次構造である。

哺乳類種では、５種の重鎖：α、δ、ε、γ、及びμが存在し、これらが免疫グロブリンのクラス（アイソタイプ）：それぞれ、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMを決定する。重鎖のＮ末端の可変ドメイン（VH）に続いて、重鎖γ、α、及びδでは、３つのドメイン（Ｎ末端からＣ末端に向かってCH1、CH2、及びCH3と付番される）を含有する定常領域が存在するが、重鎖μ及びεの定常領域は、４つのドメイン（Ｎ末端からＣ末端に向かってCH1、CH2、CH3、及びCH4と付番される）で構成される。IgA、IgG、及びIgDのCH1及びCH2のドメインは可撓性ヒンジによって分離されているが、この長さは異なるクラス間で異なり、そしてIgA及びIgGの場合、異なるサブタイプ間で異なる：lgG1、lgG2、IgG3、及びIgG4は、それぞれ、１５、１２、６２（又は７７）、及び１２アミノ酸のヒンジを有し、そして、IgA1及びIgA2は、それぞれ、２０及び７アミノ酸のヒンジを有する。

２種の軽鎖：λ及びκが存在し、これらは重鎖アイソタイプのいずれかと会合することができるが、所与の抗体分子では両方とも同じ種類である。両軽鎖は、機能的に同一であると思われる。そのＮ末端の可変ドメイン（VL）に続いて、CLと呼ばれる単一のドメインからなる定常領域が存在する。

重鎖と軽鎖とは、CH1ドメインとCLドメインとの間のタンパク質／タンパク質相互作用によって、そして、VH／VL相互作用を介して対合し、そして、２本の重鎖は、そのCH3ドメイン間のタンパク質／タンパク質相互作用によって会合する。免疫グロブリン分子の構造は、一般的に、CH1ドメインとCLドメインとの間及びヒンジ間の鎖間ジスルフィド結合によって安定化する。

抗原結合領域は、それぞれ重鎖のVH及びCH1のドメインと対合している完全な軽鎖からなるＹ字形構造のアームに対応し、そして、Fab断片（抗原結合断片）と呼ばれる。Fab断片は、最初、鎖間ジスルフィド結合のアミノ末端側においてヒンジ領域で抗体分子を切断して、２本の同一の抗原結合アームを放出する、パパイン消化によってネイティブな免疫グロブリン分子から生成された。ペプシン等の他のプロテアーゼも、鎖間ジスルフィド結合のカルボキシ末端側であるがヒンジ領域で抗体分子を切断し、それによって、２つの同一のFab断片からなり、そして、ジスルフィド結合を介して連結したままである断片を放出する；F(ab')2断片におけるジスルフィド結合を還元するとFab’断片が生成される。

VH及びVLのドメインに対応する抗原結合領域の部分はFv断片（可変断片）と呼ばれ；これは、抗原結合部位（パラトープとも呼ばれる）を形成するCDR（相補性決定領域）を含有する。

そのエフェクタ分子又は細胞への結合に関与している抗体のエフェクタ領域は、Ｙ字形構造の幹部に対応し、そして、重鎖の対合しているCH2及びCH3のドメイン（又は抗体のクラスによってはCH2、CH3、及びCH4のドメイン）を含有し、そして、Fc（結晶化可能断片）領域と呼ばれる。

２本の重鎖及び２本の軽鎖が同一であることから、天然に存在する抗体分子は、２つの同一の抗原結合部位を有し、したがって、２つの同一のエピトープに同時に結合する。

本発明の状況において、「多重特異性抗原結合断片」は、それぞれが異なるエピトープを認識する２つ以上の抗原結合領域を有する分子と本明細書では定義される。異なるエピトープは、同じ抗原分子に由来していてもよく、異なる抗原分子に由来していてもよい。用語「認識」又は「認識する」とは、断片が標的抗原に特異的に結合することを意味する。

「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの多重特異性抗原結合断片／アームで構成されており、そして、２つ、３つ、又はそれ以上の異なる抗原に結合することができる。

抗体が他の物質に結合するよりも大きな親和性、結合活性で、より容易に、及び／又は長い期間結合する場合、その抗体は標的抗原に「特異的に結合する」。「特異的結合」又は「優先的結合」は、必ずしも独占的な結合を必要とするものではない（が、独占的な結合を含んでいてもよい）。一般的に、結合に対する言及は優先的結合を意味するが、必ずしもそうではない。

用語「変異型誘導体」、「変異体」、又は「機能的変種」は、１つ又は幾つかのアミノ酸の欠失、置換、又は挿入によって、その親配列とは異なる配列を意味する。好ましくは、変異型誘導体は、ネイティブ配列に対して好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、更に好ましくは少なくとも９０％の相同配列を示す。具体的な実施態様では、突然変異は、抗体の機能には実質的に影響を与えない。

変異型誘導体又は機能的変種は、本明細書に列挙される参照配列のいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一のアミノ酸配列を含むVH鎖、本明細書に列挙される参照配列のいずれかと少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％）同一のアミノ酸配列を有するVL鎖、又は両方を含み得る。これら変種は、標的抗原に結合することができる。幾つかの例では、変種は、上記参照抗体に対して類似の抗原結合親和性を有する（例えば、１×１０^−７M、１０^−８M未満、好ましくは１×１０^−９又は１×１０^−１０M未満のKDを有する）。

結合の親和性は、ka（会合速度定数）、kd（解離速度定数）、又はKD（平衡解離）という用語によって定義される。典型的には、抗体に関して使用されるとき、特異的結合とは、１０^−７M未満、好ましくは１０^−８M未満、例えば、１０^−９M又は１０^−１０M未満の親和性（KD）値でその標的に特異的に結合する（「認識する」）抗体を指す。より低いKD値は、より高い結合親和性（すなわち、より強い結合）を表すので、１０^−９のKD値は１０^−８のKD値よりも高い結合親和性を示す。

２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のように改変されたKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して求められる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLAST及びXBLASTのプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。XBLASTプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてBLASTタンパク質サーチを実施して、対象となるタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されている通りGapped BLASTを利用することができる。BLAST及びGapped BLASTのプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）のデフォルトパラメータを使用してよい。

他の実施態様では、本明細書に記載される機能的変種は、１つ以上の突然変異（例えば、保存的置換）を含有していてよいが、好ましくは、CDRのうちの１つ以上と相互作用すると予測される残基には存在しない。

参照抗体と実質的に同一である変異型誘導体又は機能的変種が本明細書に記載される。

用語「実質的に同一」又は「非実質的（insubstantial）」とは、変種が参照抗体と比べて実質に類似する結合活性（例えば、親和性、特異性、又は両方）及び生物活性を有するように、参照抗体と比べたときに変種の（例えば、フレームワーク領域（FR）、CDR、VH、又はVLのドメインにおける）関連するアミノ酸配列が実質的に異ならない（例えば、保存的アミノ酸置換を含む）ことを意味する。このような変種は、少数のアミノ酸変化、例えば、指定の領域の５アミノ酸の配列において１又は２つの置換を含んでいてもよい。一般的に、抗体の結合機能に悪影響を与える（例えば、元の抗体と比べて５０％超結合親和性を低下させる）ことのない限り、CDR領域とは対照的に、FR領域ではより多くの置換を行ってもよい。幾つかの実施態様では、元の抗体と改変抗体との間の配列同一性は、約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上であってよい。幾つかの実施態様では、改変抗体は、元の抗体と同じ結合特異性を有し、そして、元の抗体の親和性の少なくとも５０％を有する。

保存的置換によって、このような改変が行われる分子と同様の機能的及び化学的な特徴を有する分子が生成される。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響がわずかしか又は全くないように、ネイティブなアミノ酸残基を別の残基で置換することを含み得る。当業者であれば、所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）を決定することができる。例えば、アミノ酸置換を使用して、分子配列の重要な残基を同定したり、本明細書に記載される分子の親和性を増大若しくは低下させたりすることができる。１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む変種は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989又はCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York等の、このような方法を集めた参照文献にみられるような、当業者に公知のポリペプチド配列を変化させる方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸間で行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。

抗体のアミノ酸配列変種は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成を介して調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は該残基への挿入、及び／又は該残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を有するという条件で、最終コンストラクトを得るために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われる。抗体のアミノ酸配列変種をコードしている核酸分子は、当業者に公知の様々な方法によって調製することができる。これら方法は、以前に調製された変種又は非変種（天然）のバージョンの抗体のオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発法、PCR突然変異誘発法、及びカセット式突然変異誘発法を含むが、これらに限定されない。一実施態様では、本発明の抗体の平衡解離定数（KD）値は、１０^−７M未満、具体的には、１０^−８M、１０^−９M、又は１０^−１０M未満である。結合親和性は、当技術分野において公知の技術、例えば、ELISA若しくは二重特異性相互作用分析（例えば、表面プラズモン共鳴を使用）、又は当技術分野において公知の他の技術を使用して求めることができる。

常法に従って、本明細書に記載される分子のいずれかについて調べて、抗原結合活性、抗原結合特異性、及び生物学的機能等の特性を求めることができる。

用語「被験体」、「個体」、及び「患者」は、本明細書において五感的に使用され、そして、処置について評価される及び／又は処置される哺乳類を指す。被験体はヒトであってよいが、他の哺乳類、特に、ヒト疾患の実験モデルとして有用な哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ等も含んでよい。

用語「処置」又は「処置すること」とは、直接又は間接的に、被験体の病態を改善する目的で、ヒトを含む被験体を医学的支援に供する行為、適用、又は療法を指す。具体的には、該用語は、幾つかの実施態様では、発生数の減少、若しくは症状の緩和、再発の排除、再発の予防、発生の予防、症状の改善、予後の改善、又はこれらの組み合わせを指す。当業者は、処置によって必ずしも症状が完全になくなったり、取り除かれたりする訳ではないことを理解するであろう。例えば、癌に関して、「処置」又は「処置すること」とは、新生若しくは悪性細胞の成長、増殖、若しくは転移を減速させる、新生若しくは悪性細胞の成長、増殖、若しくは転移の発現を予防するか若しくは遅らせる、又はこれらの幾つかの組み合わせを指し得る。

好ましい多重特異性抗体の設計：
多重特異性抗原結合断片及び該断片を含む多重特異性抗体コンストラクトであって、各多重特異性抗原結合断片が、本発明のリンカーによって分離されているタンデムに配置されたFab断片から本質的になる断片又はコンストラクトが本明細書に提供される。

このような断片及びコンストラクトは、好ましくは、ヒト免疫グロブリン、好ましくはIgG、更に好ましくはIgG1由来の鎖を含む。

２つを超える異なるFab断片を含む多重特異性抗原結合断片の場合、Fab断片を分離するポリペプチドリンカーは、同一であっても異なっていてもよい。本発明の多重特異性抗体の好ましい実施態様によれば、該抗体は、それぞれが上に定義した通り複数の（１つを超える）抗原に結合することができる抗原結合断片からなる、２本の同一の抗原結合アームを有する。抗原結合アームは、抗体の意図する用途に応じて、多様な方法で互いに連結することができる。

Fcによって媒介される作用を有しない抗体を得たい場合、抗体はFc領域を含まない。この場合、例えば、
− Fab断片を分離するポリペプチドリンカーがシステイン残基を含有している場合、該リンカーによって提供される鎖間ジスルフィド結合を介して抗原結合アームをホモ二量体化することによって；及び／又は
− 鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含有しているポリペプチド伸長を各抗原結合アームのＣ末端に付加し、そして、該ポリペプチド伸長をホモ二量体化させてヒンジ様構造をもたらすことを通して（非限定的な例として、該ポリペプチド伸長は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgA、又はIgDのヒンジ配列であってよい）；
− ２本の抗原結合アームの重鎖のＣ末端同士を連結して単一のポリペプチド鎖を形成し、そして、互いから十分な距離で該抗原結合アームを維持する半剛性リンカーを介して、２本の抗原結合アームを互いに連結させることができる。

あるいは、エフェクタ機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、抗体依存性食作用（ADP）、及び補体依存性細胞傷害（CDC）が望ましい場合、本発明の多重特異性抗体は、これらエフェクタ機能を提供するFcドメインを更に含んでいてもよい。Fcドメインの選択は、所望のエフェクタ機能の種類に依存する。

この場合、本発明の多重特異性抗体は、
− 上に定義した通りの２本の同一の多重特異性抗原結合アーム、
− 免疫グロブリンの二量体化されたCH2及びCH3のドメイン、
− 抗原結合アームのCH1ドメインのＣ末端をCH2ドメインのＮ末端に連結するIgA、IgG、又はIgDのヒンジ領域（あるいは、CH3ドメインに続くCH4ドメインがIgM又はIgEに由来するとき、この場合、抗原結合アームのCH1ドメインのＣ末端をCH2ドメインのＮ末端に直接連結させることもできる）
を含む免疫グロブリン様構造を有する。

好ましくは、CH2及びCH3のドメイン、ヒンジ領域、及び／又はCH4ドメインは、同じ免疫グロブリン、又は抗原結合アームのCH1ドメインと同じアイソタイプ及びサブクラスの免疫グロブリンに由来する。

ネイティブな免疫グロブリン由来のCH2、CH3、及び任意でCH4のドメイン、並びにヒンジ領域を使用してよい。必要に応じて、例えば抗体のエフェクタ機能を調節するために、これらに変異導入することも可能である。幾つかの例では、CH2又はCH3のドメインの全体又は一部を取り除いてもよい。

本発明は、より具体的には、多重特異性、好ましくは二重特異性の四価抗体であって、その標的のそれぞれに対する２つの結合部位と、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）、食作用、及び補体依存性細胞傷害（CDC）等のエフェクタ機能を活性化させる機能的Fcドメインとを含む抗体を提供する。

本発明のこのような好ましい抗体は、完全長抗体である。該抗体は、好ましくは、ヒト免疫グロブリン、好ましくはIgG、更に好ましくはIgG 1由来の重鎖及び軽鎖を含む。

軽鎖は、ラムダ又はカッパの軽鎖であってよく、好ましくは、カッパ軽鎖である。

好ましい実施態様では、本発明で使用されるポリペプチドリンカーは、テトラFab多重特異性、好ましくは二重特異性の抗体フォーマットであって、そのアミノ酸配列が、適切なIgG軽鎖配列と共発現する、ポリペプチドリンカーによって連結される少なくとも２つのFabの重鎖配列、続いて、ネイティブなヒンジ配列、続いて、IgG Fc配列を含む抗体フォーマットにおけるIgG Fabドメインの２つの対を接続する。

IgG様構造を有する本発明の好ましい二重特異性抗体の例を図１１に示す。

好ましい実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、典型的には、
− Fc（ヒンジ-CH2-CH3）で構築される連続重鎖を含み、
− 続いて、抗体１のFab重鎖（CH1-VH）及び次に続く抗体２のFab重鎖（CH1-VH）を含み、後者は、ヒンジ由来のポリペプチドリンカー配列によって連結されており、
− そして、タンパク質発現中、得られた重鎖は二量体を構築するが、一方、共発現した抗体１及び抗体２の軽鎖（VL-CL）は、最終的なタンデムF(ab)’2-Fc分子を形成するために、その同種重鎖と会合し、
該抗体１（Ab1）及び該抗体２（Ab2）は異なる。

好ましい実施態様では、
ａ）ヒトIgG1／カッパに由来する変異型CH1及び変異型Ｃ−カッパのドメイン、並びにAb1のVH及びVLのドメインを有するFab断片、
ｂ）ヒトIgG1／カッパに由来する変異型CH1及び変異型Ｃ−カッパのドメイン、並びにAb2のVH及びVLのドメインを有するFab断片、
ｃ）ヒトカッパ定常ドメインに由来する変異型軽鎖定常ドメイン
からなる異なる変異型CH1及び変異型CLのドメインを有する２つのFab断片を含み、
該Fab断片が、
− ポリペプチドリンカーを介してAb2 Fab断片のVHドメインのＮ末端に連結しているAb1 Fab断片の変異型CH1ドメインのＣ末端、
− CH2ドメインのＮ末端にAb2断片の変異型CH1ドメインのＣ末端を連結させるヒトIgG1のヒンジ領域、
− ヒトIgG1の二量体化されたCH2及びCH3のドメイン
の順序でタンデムに配置されている、二重特異性抗体が記載される。

Ab1及びAb2は、対象となる任意の抗体、特に、処置対象となる任意の抗体であってよい。

具体的な実施態様では、異なるAb1及びAb2は、独立して、抗CD38抗体（例えば、ダラツムマブ）及び抗PD-L1抗体（例えば、アテゾリズマブ）からなる群から選択される。

別の具体的な実施態様では、異なるAb1及びAb2は、独立して、抗EGFR抗体及び抗HER2/neu受容体からなる群から選択される。好ましい実施態様では、異なるAb1及びAb2は、独立して、一方はセツキシマブ又はその変異型誘導体、そして他方はトラスツズマブ又はその変異型誘導体からなる群から選択される。

このような抗体は、医薬として、より具体的には、癌の処置において有用である。

具体例では、二重特異性分子は、ａ）それぞれが配列番号７を含む、好ましくはからなる２本の重鎖と、ｂ）２本が配列番号１５を含む、好ましくはからなり、他の２本が配列番号１８を含む、好ましくはからなる４本の軽鎖とを含む、好ましくはからなる二重特異性の抗CD38、抗PD-L1抗体である。このような二重特異性抗体を、BiXAb-6567と命名する。

配列番号７（重鎖）は、

である。

この重鎖配列は、
− ダラツムマブのVH（配列番号８）

− ダラツムマブFabのCH1ドメイン（突然変異L124Q及びS188Vを有するG1m(3)アロタイプのヒトIgG1）（配列番号９）

− APリンカー（配列番号３）

− アテゾリズマブのVH（配列番号１０）

− FabアテゾリズマブのCH1ドメイン（突然変異T192Dを有するG1m(3)アロタイプのヒトIgG1（配列番号１１）

− ヒトIgG1のヒンジ（配列番号１２）

− ヒトIgG1のCH2ドメイン（配列番号１３）

− G1m(3)アロタイプのヒトIgG1のCH3ドメイン（配列番号１４）

を含む。

軽鎖配列番号１５（ダラツムマブ）は、

である。

この軽鎖配列は、
− ダラツムマブのVL（配列番号１６）

− 突然変異V133T及びS176Vを有するダラツムマブのＣカッパドメイン（配列番号１７）

を含む。

軽鎖配列番号１８（アテゾリズマブ）は、

である。

この軽鎖配列は、
− アテゾリズマブのVL（配列番号１９）

− 突然変異S114A及びN137Kを有するアテゾリズマブのＣカッパドメイン（配列番号２０）

を含む。

（Fabドメインの第１及び第２の対とは異なる抗原標的に対する）Fabドメインの第３の対が、同一の又は異なるポリペプチドリンカーで、ｉ）Fabドメインの該第３の対の重鎖のＣ末端を介して外部（すなわち、Fc遠位）Fabドメインの重鎖のＮ末端に、又はii）Fabドメインの該第３の対の重鎖のＣ末端若しくはＮ末端を介して、Fcドメインの両重鎖のＣ末端に連結されてもよい。

本明細書に記載される分子のいずれかを、例えば、ペグ化又は高度グリコシル化によって、当技術分野において公知であり、そして、容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含有するように改変してもよい。血清半減期又はタンパク質分解に対する安定性を増強することができる改変が包含される。

本発明の抗体は、グリコシル化されてもされなくてもよく、又は様々なグリコシル化プロファイルを示し得る。好ましい実施態様では、抗体は、重鎖の可変領域ではグリコシル化されないが、Fc領域においてグリコシル化される。

参照非ヒト抗体のヒト化形態を使用してもよい。ヒト化アプローチでは、ドナー可変領域由来の相補性決定領域（CDR)及び特定の他のアミノ酸をヒト可変アクセプタ領域にグラフトし、次いで、ヒト定常領域に連結させる。例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)；米国特許５，２２５，５３９号を参照。

本発明のコンストラクトの別の例は、Fcドメインを含有しない、二重特異性抗原結合断片Fab−Fabである。

このようなFab−Fabコンストラクトは、典型的には、２つの異なるFabドメインを含む。このような抗体は、それぞれ抗原１及び抗原２に結合する１つのFabドメインのみを有する。該抗体は、対応するBiXAb抗体と同じ軽鎖を有するが、Fab−Fabの重鎖は、その大部分のＣ末端残基がシステイン−２２０（EU付番）になるように短縮されている。

本発明のコンストラクトの別の例は、（例えば、リンカーにおけるジスルフィドを介して、又はＣ末端近位FabドメインのＣ末端におけるヒンジの天然のジスルフィドを介して）二量体化したFab−Fabコンストラクトである。

リンカーの設計
「ヒンジ由来ポリペプチドリンカー配列」又は「擬ヒンジリンカー」とも呼ばれるポリペプチドリンカーは、好ましくはヒト起源の、IgA、IgG、及びIgDから選択される１つ以上の免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全て又は一部を含む。該ポリペプチドリンカーは、１つの免疫グロブリンのみのヒンジ領域の配列の全て又は一部を含んでいてよい。この場合、該免疫グロブリンは、隣接するCH1ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属していてもよく、又は異なるアイソタイプ若しくはサブクラスに属していてもよい。あるいは、該ポリペプチドリンカーは、異なるアイソタイプ又はサブクラスの少なくとも２つの免疫グロブリンのヒンジ領域の配列の全て又は一部を含んでいてよい。この場合、CH1ドメインの直後のポリペプチドリンカーのＮ末端部分は、好ましくは、該CH1ドメインが由来する免疫グロブリンと同じアイソタイプ及びサブクラスに属する免疫グロブリンのヒンジ領域の全て又は一部からなる。

場合により、該ポリペプチドリンカーは、免疫グロブリンのCH2ドメインのＮ末端アミノ酸を２〜１５個、好ましくは５〜１０個更に含んでいてもよい。

ポリペプチドリンカー配列は、典型的には、８０アミノ酸未満、好ましくは６０アミノ酸未満、更に好ましくは４０アミノ酸未満からなる。

一部の場合には、ネイティブなヒンジ領域由来の配列を使用してよく、他の場合には、望ましくない鎖内又は鎖間のジスルフィド結合を回避するために、これら配列に点突然変異を導入してもよく、具体的には、ネイティブなIgG1、IgG2、又はIgG3のヒンジ配列における１つ以上のシステイン残基をアラニン又はセリンによって置換する。

具体的な実施態様では、該ポリヌクレオチドリンカー配列は、アミノ酸配列EPKX₁CDKX₂HX₃X₄PPX₅PAPELLGGPX₆X₇PPX₈PX₉PX₁₀GG（配列番号１）（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ１０は、同じであるか又は異なり、任意のアミノ酸である）を含むか又はからなる。具体的には、該ポリヌクレオチドリンカー配列は、

からなる群から選択される配列を含むか又はからなっていてよい。

具体的な実施態様では、同一であるか又は異なるＸ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）である。

別の具体的な実施態様では、同一であるか又は異なるＸ_１、Ｘ_２、及びＸ３は、Ala（Ａ）、Gly（Ｇ）、Val（Ｖ）、Asn（Ｎ）、Asp（Ｄ）、及びIle（Ｉ）からなる群から選択され、更に好ましくは、同一であるか又は異なるＸ_１、Ｘ２、及びＸ_３は、Ala（Ａ）又はGly（Ｇ）であってよい。

あるいは、同一であるか又は異なるＸ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、Leu（Ｌ）、Glu（Ｅ）、Gln（Ｑ）、Met（Ｍ）、Lys（Ｋ）、Arg（Ｒ）、Phe（Ｆ）、Tyr（Ｔ）、His（Ｈ）、Trp（Ｗ）、好ましくは、Leu（Ｌ）、Glu（Ｅ）、又はGln（Ｑ）であってよい。

具体的な実施態様では、同一であるか又は異なるＸ_４及びＸ_５は、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、及びグリシン（Ｇ）からなる群から選択される任意のアミノ酸である。

好ましい実施態様では、Ｘ_４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）である。

好ましい態様では、Ｘ_５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）である。

具体的な実施態様では、同一であるか又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、トレオニン（Ｔ）又はセリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸である。好ましくは、同一であるか又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ１０は、Ala（Ａ）、Gly（Ｇ）、Val（Ｖ）、Asn（Ｎ）、Asｐ（Ｄ）、及びIle（Ｉ）からなる群から選択される。

あるいは、同一であるか又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Leu（Ｌ）、Glu（Ｅ）、Gln（Ｑ）、Met（Ｍ）、Lys（Ｋ）、Arg（Ｒ）、Phe（Ｆ）、Tyr（Ｔ）、His（Ｈ）、Trp（Ｗ）、好ましくは、Leu（Ｌ）、Glu（Ｅ）、又はGln（Ｑ）であってよい。

好ましい実施態様では、同一であるか又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ala（Ａ）及びGly（Ｇ）からなる群から選択される。

更に好ましい実施態様では、Ｘ６及びＸ７は、同一であり、そして、好ましくは、Ala（Ａ）及びGly（Ｇ）からなる群から選択される。

好ましい実施態様では、該ポリペプチドリンカー配列は、配列番号１の配列（式中、
同一であるか又は異なるＸ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）であり、
Ｘ_４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ_５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり、
同一であるか又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ala（Ａ）及びGly（Ｇ）からなる群から選択される）
を含むか又はからなる。

別の好ましい実施態様では、該ポリペプチドリンカー配列は、配列番号１の配列（式中、
同一であるか又は異なるＸ_１、Ｘ_２、及びＸ_３は、Ala（Ａ）又はGly（Ｇ）であり、
Ｘ_４は、セリン（Ｓ）又はシステイン（Ｃ）であり、
Ｘ_５は、アラニン（Ａ）又はシステイン（Ｃ）であり、
同一であるか又は異なるＸ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、Ala（Ａ）及びGly（Ｇ）からなる群から選択される）
を含むか又はからなる。

２つを超える異なるFab断片を含む多重特異性抗原結合断片の場合、Fab断片を分離するポリペプチドリンカーは、同一であっても異なっていてもよい。

多重特異性抗体の生成：
多重特異性抗体を発現させる一般的な技術については、当業者は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２０１３／００５１９４号を参照してよい。

また、本発明の分子又は抗体のタンパク質鎖をコードしている配列を含むポリヌクレオチドも本明細書に記載される。該ポリヌクレオチドは、更なる配列を含んでいてもよく：具体的には、有利には、該タンパク質鎖を分泌させるリーダー配列又はシグナルペプチドをコードしている配列を含んでいてよい。該ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞も開示される。

典型的には、任意で哺乳類発現に対してコドンを最適化した後、異なるモノクローナル抗体のアミノ酸配列を使用してDNA配列を設計する。重鎖については、シグナルペプチド、Fab1の可変領域及び定常CH1ドメイン、続いて、ヒンジリンカー、並びに制限酵素切断のためのフランキング配列を有するFab2の可変領域及び定常CH1ドメインをコードしているDNAを合成する。軽鎖については、シグナルペプチド、並びに可変及び定常カッパの領域をコードしているDNAを合成する。

本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている核酸を発現ベクターに挿入する。軽鎖及び重鎖を同じ発現ベクターにクローニングしてもよく、又は異なる発現ベクターにクローニングしてもよい。免疫グロブリン鎖をコードしているDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を保証する、発現ベクターにおける制御配列に動作可能に連結される。このような制御配列は、シグナル配列、プロモータ、エンハンサ、及び転写終結配列を含む。発現ベクターは、典型的には、エピソームとして又は宿主の染色体DNAの一体部分として宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換された細胞を検出することができるように、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン又はネオマイシンを含有する。

一例では、重鎖及び軽鎖の両方をコードしている配列（例えば、VH及びVL、VH-CH1及びVL-CL、又は完全長重鎖及び完全長軽鎖をコードしている配列）が１つの発現ベクターに含まれる。別の例では、抗体の重鎖及び軽鎖のそれぞれを個々のベクターにクローニングする。後者の場合、両鎖を発現させるために、重鎖及び軽鎖をコードしている発現ベクターを１つの宿主細胞に共トランスフェクトしてよく、これによって、インビボ又はインビトロで該両鎖が組み立てられてインタクトな抗体を形成することができる。あるいは、重鎖及び軽鎖のそれぞれを発現させるために、重鎖をコードしている発現ベクター及び軽鎖をコードしている発現ベクターを異なる宿主細胞に導入してもよく、次いで、両鎖を精製し、そして、インビトロで組み立ててインタクトな抗体を形成することができる。

具体的な実施態様では、宿主細胞に３つの独立な発現ベクター、例えば、プラスミドを共トランスフェクトし、それによって、３本の鎖全て（すなわち、それぞれ重鎖HC並びに２本の軽鎖LC1及びLC2）が同時に生成され、そして、多重特異性、例えば、二重特異性の抗体が分泌される。

より具体的には、３つのベクターを、有利には、２：１：１（HC：LC1：LC2）の分子比で使用してよい。

本明細書に定義される重鎖をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、更に、２本の異なる軽鎖（第１の軽鎖は該重鎖の第１のVH/CH1領域と特異的に対合し、第２の軽鎖は、該重鎖の第２のVH/CH1領域に特異的に対合する）をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドで更に形質転換されてもよい。

更なる実施態様では、宿主細胞は、更に、第１及び第２の軽鎖とは異なり、そして、該重鎖の第３のVH/CH1領域と特異的に対合する第３の軽鎖をコードしているポリヌクレオチドでトランスフェクトされてもよい。

本明細書に記載される抗体を発現させるための組換えベクターは、典型的には、構成的に又は誘導可能にプロモータに動作可能に連結された抗体アミノ酸配列をコードしている核酸を含有する。該ベクターは、原核生物、真核生物、又は両方における複製及び組み込みに好適であり得る。典型的なベクターは、転写及び翻訳のターミネータ、開始配列、並びに抗体をコードしている核酸の発現の調節に有用なプロモータを含有する。ベクターは、任意で、少なくとも１つの独立なターミネータ配列、真核生物及び原核生物の両方におけるカセットの複製を可能にする配列、すなわち、シャトルベクター、並びに原核生物及び真核生物の両系のための選択マーカーを含有する遺伝子発現カセットを含有する。

本明細書に記載される多重特異性、例えば、二重特異性の抗体は、原核生物又は真核生物の発現系、例えば、細菌、酵母、糸状菌、植物昆虫（例えば、バキュロウイルスベクターを使用）、及び哺乳類の細胞で生成され得る。本発明の組換え抗体は、真核細胞でグリコシル化される又は発現する必要はないが、哺乳類細胞において発現することが一般的に好ましい。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ヒト胚腎臓株（293細胞）、仔ハムスター腎細胞（BHK細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−又は＋DHFR（CHO、CHO-S、CHO-DG44、Flp-in CHO細胞）、アフリカミドリザル腎細胞（VERO細胞）、及びヒト肝細胞（Hep G2細胞）である。

インタクトな免疫グロブリンを分泌することができる多数の好適な宿主細胞株が当技術分野において開発されているので、ポリペプチドを発現及び生成するには哺乳類組織細胞培養が好ましく、そして、CHO細胞株、様々なCos細胞株、HeLa細胞、好ましくは骨髄腫細胞株（例えば、NS0）、又は形質転換されたＢ細胞若しくはハイブリドーマを含む。

最も好ましい実施態様では、本発明の多重特異性、例えば、二重特異性の抗体は、CHO細胞株、最も有利には、CHO-S若しくはCHO-DG-44の細胞株、又はこれらの誘導体を使用することによって生成される。

これら細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモータ、及びエンハンサと、必須のプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモータである。

細胞宿主の種類に応じて異なる周知の方法によって、対象となるポリヌクレオチド配列を含有するベクター（例えば、重鎖及び軽鎖をコードしている配列、並びに発現制御配列）を宿主細胞に導入することができる。例えば、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションを使用してよい。（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989を参照）。重鎖及び軽鎖を別々の発現ベクターにクローニングするとき、該ベクターを共トランスフェクトして、インタクトな免疫グロブリンを発現させ、そして、組み立てる。

（例えば、化学的トランスフェクション又はエレクトロポレーションの方法によって）宿主細胞を該ベクターで形質転換又はトランスフェクトし、そして、プロモータを誘導する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために、従来の栄養培地（又は適宜改変）で培養する。

抗体の発現は、一過的であっても安定的であってもよい。

好ましくは、多重特異性、例えば、二重特異性の抗体は、例えばBiXAb-6567等の多重特異性、例えば、二重特異性の抗体の全てのポリペプチド鎖をコードしているDNAで安定にトランスフェクトされた細胞株が持続的に発現することができる、安定的な発現の方法によって生成され、これによって、療法薬を製造することが可能になる。例えば、CHO細胞株における安定的な発現が特に有利である。

発現したら、本発明の抗体全体、その二量体、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン形態を更に単離又は精製して、更なるアッセイ及び用途のための実質的に均質な調製品を得ることができる。当技術分野において公知の標準的なタンパク質精製方法を使用してよい。例えば、好適な精製手順は、免疫親和性又はイオン交換のカラムにおける分画、エタノール沈殿、高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、硫酸アンモニウム沈殿、及びゲル濾過を含み得る（一般に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照）。医薬用途には、少なくとも約９０〜９５％の均質性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、そして、９８〜９９％又はそれ以上の均質性が最も好ましい。

インビトロ生成によって、本発明の所望の多重特異性、例えば、二重特異性の抗体を大量に得るためにスケールアップすることが可能になる。このような方法は、例えば、エアリフト反応器若しくは連続撹拌反応器における均質懸濁培養、又は例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、若しくはセラミックカートリッジにおける固定化若しくは封入細胞培養を使用してよい。

用途
本発明のタンパク質コンストラクト又は多重特異性抗体は、多重特異性抗体の用途の全てで使用することができる。具体的には、これらを使用して、患者における（放射活性、蛍光、化学発光、又は任意の他の標識にコンジュゲートした）又はインビトロにおける（例えば、免疫組織化学、イムノブロット、及び免疫蛍光の技術を使用する細胞及び組織の染色の場合）広範な処置用途及び診断医薬用途で有用な医薬を得ることができる。これら医薬又は診断の製品も本発明の目的の一部である。

本発明の更なる態様は、本発明に係るタンパク質コンストラクト又は抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物を製造するための、本発明に係るタンパク質コンストラクト又は抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明に係るタンパク質コンストラクト又は抗体を含む医薬組成物を製造する方法である。

別の態様では、本発明は、医薬担体と共に製剤化された、本明細書に定義されるタンパク質コンストラクト又は抗体を含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。

本発明の組成物は、当技術分野において公知の様々な方法によって投与され得る。

以下の実施例は、説明のために提供され、そして、本発明を限定することを意図するものではない。

実施例
実施例１．本発明の二重特異性抗体BiXAb-6567の調製
遺伝子合成
GeneScriptプログラムを使用して、哺乳類の発現に対してコドンを最適化した後、抗CD38（ダラツムマブ）及び抗PDL1（アテゾリズマブ）のアミノ酸配列を使用して、DNA配列を設計した。これら抗体を「親」抗CD38及び「親」抗PD-L1のmAbと称する。

重鎖のDNAコンストラクトを以下のように設計した：シグナルペプチド、続いて、配列番号７の配列［可変領域、続いて、それぞれKabatの１２４位及び１８８位にLeuからGln及びSerからValへの突然変異が導入されているFab1（抗CD38）の定常CH1ドメイン、続いて、リンカー、続いて、可変領域、続いて、Kabatの１９２位にThrからAspへの突然変異が導入されているFab2（抗PD-L1）の定常CH1ドメイン］；制限酵素切断のためのフランキング配列を重鎖DNAコンストラクトの両端に導入した。軽鎖のDNAコンストラクトを以下のように設計した：シグナルペプチド（配列番号２１）、続いて、可変領域、続いて、定常カッパ領域。抗CD38軽鎖（配列番号１５）については、定常カッパドメインにおけるKabatの１４３位（LeuからGlnへ）及び１８８位（SerからValへ）に突然変異を導入した。抗PDL1軽鎖（配列番号１８）については、Kabatの１３３位（ValからThrへ）及び１７６位（SerからValへ）における突然変異を定常カッパドメインに導入した。全てのDNAコンストラクトは、Gene Artによって合成された。

PfuTurbo Hot Startを使用するPCR反応を実施してインサートを増幅し、次いで、これを、それぞれ重鎖及び軽鎖についてNotI及びApaI、並びにNotI及びHindIIIで切断した。二重に切断された重鎖断片を、ヒトIgG1ヒンジ、続いて、CH2-CH3ドメインが既に挿入されている、NotI及びApaIで処理されたpcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen）とライゲーションした。二重に切断された軽鎖断片を、NotI及びHindIIIで処理されたpcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen）とライゲーションした。二本鎖DNAシークエンシングによってプラスミドDNAを確認した。

発現及び精製
懸濁液中の無血清培地（CHO SFM-II培地、Life Technologies（商標））に適応させたCHO-S細胞において、２：１：１＝HC：LC1：LC2の分子比で別々のベクターにコードされている３つの遺伝子（１本の連続重鎖（HC）及び２本の軽鎖（LC）を共トランスフェクトすることによって、一過的な遺伝子発現を使用して二重特異性抗体BiXAb-6567を生成した。典型的には、５０mLスケールの発現の場合、プラスミドDNA 合計５０μg（重鎖２５μg、抗CD38軽鎖１２．５μg、及び抗PD-L1軽鎖１２．５μg）を１．５mLエッペンドルフチューブ内で混合し、次いで、３mg/mL PEIトランスフェクション試薬 pH７．０（Polyplus）２５μLを含有するCHO SFM培地１mLを添加し、そして、反応物を室温で２０分間インキュベートした。続いて、１２５mL振盪フラスコ内において、Life Technologies製のInvitrogen FreeStyle（商標）CHO-S細胞４９mLにDNA-PEI混合物を１〜２×１０６／mLで添加した。細胞を６日間振盪した。３，０００rpmで１５分間遠心分離することによって上清を収集した。ForteBio製のプロテインＡバイオセンサ（Octet（登録商標）Systems）を使用して、上清中のBiXAb-6567の発現力価を求めた。次いで、プロテインＡ親和性樹脂（MabSelect SuRe、GE Healthcare Life Sciences）でBiXAb-6567を精製した。０．１M グリシン pH３．５を使用してプロテインＡから抗体を溶出し、そして、溶出物を１M TRISで中和した。ダルベッコPBS（Lonza）中の精製抗体を滅菌濾過（０．２μM 滅菌フィルタ、Techno Plastic Products AG）し、そして、２８０nmにおける光学密度（OD）を読み取ることによって（Eppendorf BioSpectrometer（登録商標））最終濃度を求めた。

BiXAab-6567は、典型的には、一過的なCHO発現において良好な発現力価（＞１８０mg／リットル）を示した。この発現レベルは、従来のモノクローナル抗体でみられる発現レベルと同等である。

SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
精製されたBiXAb-6567の品質を評価するために、SDS-PAGE（Experion（商標）自動電気泳動システム、BioRad）を実施した。ランニングバッファ中にドデシル硫酸ナトリウム（SDS）が存在する場合、抗体がゲル中を移動する速度は主にそのサイズに依存するので、分子量を求めることが可能になる。このアッセイを非還元条件下及び還元条件下で実施した；後者は、ジスルフィド結合を破壊することができるので、個々のポリペプチド鎖（軽鎖及び重鎖）の可視化が可能になる。SDS-PAGEのデータを図１に提示する。非還元条件下では、抗体の四次構造が維持され、そして、観察される分子量は、異なる重鎖及び軽鎖の分子量の合計になるはずである。本発明の二重特異性抗体（BiXAb-6567）は、６本の鎖：２本の重鎖及び４本の軽鎖からなる。BiXab-6567の理論的分子量は２４４．４０kDaであるが、これは翻訳後修飾（PTM）、例えば、Fcのアスパラギン２９７におけるＮ−グリコシル化を考慮していない。既知の分子量の標準物質の混合物を使用してゲルを較正した。非還元データは、分子量２５０kDaの標準物質のすぐ近くにメジャーなバンドを示すが、これは分子量の計算値及びFcドメインの２９７位における２つのアスパラギンの予測グリコシル化と一致している。還元条件下では、ジスルフィド結合を還元し、そして、四次構造を破壊することによって、ジチオトレイトール（DTT）がBiXAb-6567を更に変性するので、６本のポリペプチド鎖がその分子量に従ってゲル中で別々に移動する。BiXAb-6567の２本の同一の重鎖は１本のバンドとして一緒に移動し、そして、２対の軽鎖は、その分子量がほぼ同一であることから、第２のバンドとして一緒に移動する。したがって、データは、分子量標準物質の移動度に基づいて、約７５kDa及び２５kDaに２本のメジャーなバンドを示す。各重鎖はアスパラギン２９７に１つのＮ−グリコシル化部位を有しており、このことから、より高分子量のバンドがブロードであり、そして、観察された分子量が計算値よりもわずかに高い（７５．４４kDa）ことが説明される；このブロードニングは、グリコシル化タンパク質に典型的なものである。抗CD38（２３．４０kDa）及び抗PD-L1（２３．３６kDa）の軽鎖の分子量の計算値は、非常に類似しているので、一緒に移動した。

まとめると、BiXAb-6567のSDS-PAGEは、非還元条件及び還元条件下の両方において予測されたプロファイルを示し、そして、重鎖におけるＮ−グリコシル化の存在を考慮すると、理論上の分子量計算値と一致していた。

サイズ排除クロマトグラフィ分析
操作されたタンパク質分子では、タンパク質の凝集が頻繁に観察される。サイズ排除クロマトグラフィ分析（SEC）を実施して、単一工程で親和性精製されたBiXAb-6567調製品（変種の発現及び精製を参照）の高分子量種の含有量をアッセイした。SEC-s3000（３００×７．８mm）カラム（BioSep）及びAktapurifier 10システム（GE Healthcare）を使用し、PBSバッファ pH７．４を使用して流速１mL/分でアッセイを実施した。

図２に提示するSECクロマトグラムから、主なピークが単量体BiXAb-6567の予測サイズに対応することが証明された；このピークは全サンプルの９８．２％であった。更に、より高分子量種（恐らく二量体）に対応する小さなピークも観察されたが；このピークは全サンプルの１．８％であった。したがって、より高分子量種の含有率はわずかであり、そして、CHO発現系で生成される従来のモノクローナル抗体と同様であると結論付けられた。単量体ピークの狭く、そして、対称的な形状から、BiXAb-6567が正確に組み立てられ、そして、単一種となったことが示唆された。

実施例２．示差走査熱量測定（DSC）によるBiXAb-6567の特性評価
示差走査熱量測定（DSC）を使用して、BiXAb-6567、親抗CD38 mAb、及び親抗PD-L1 mAbの熱安定性を比較した。Microcal（商標）VP-Capillary DSCシステム（Malvern Instruments）を使用して、示差走査熱量測定実験を実施した。

全てのサンプルを遠心分離（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）し、そして、Nanodrop ND-1000分光光度計（Thermo Scientific）を使用し、IgG分析プログラムを使用して、DSC分析の前にタンパク質含量を定量した。アッセイのために、全てのサンプルをPBSで最終濃度１mg/mLに希釈した。

予備平衡時間は３分間であり、そして、得られたサーモグラムは、走査速度６０℃／時、フィルタリング時間２５秒間、及びミディアムフィードバックで２０〜１１０℃にわたって取得したものであった。サンプルを分析する前に、機器を安定化するために５回のバッファ／バッファスキャンを測定し、そして、各タンパク質／バッファスキャンの間にバッファ／バッファスキャンを実施した。データを非二状態アンフォールディングモデルに適合させ、ベースラインを減じることによって転移の前及び後を調整した。

図３に提示するDSC曲線（５０〜１００℃の範囲を網羅）によって、個々のFv領域が異なるFabアンフォールディングプロファイルにつながり得る方法が証明された；この実験では、Fv領域がFabの見かけの安定性を決定づけることも証明された。抗CD38 mAbのDSCプロファイルは２つの転移：CH2及びFabのドメインの両方のアンフォールディングに対応する、１７０Kcal／モル／℃のCp max及び７０．９℃のTm1を有する大きなピークと、CH3ドメインのアンフォールディングに対応する、２０Kcal／モル／℃のCp max及び８１．５℃のTm2を有する小さなピークを呈した。抗PD-L1 mAbのDSCプロファイルは２つの転移：CH2ドメインのアンフォールディングに対応する、２０Kcal／モル／℃のCp max及び６９．９℃のTm1を有する小さなピークと、CH3及びFabのドメインの両方のアンフォールディングに対応する、１６０Kcal／モル／℃のCp max及び８３．４℃のTm2を有する大きなピークを呈した。

BiXAb-6567のDSCプロファイルも、２つの大きなピークを有する２つの転移を呈した。第１のピークは、１３０Kcal／モル／℃のCp max及び７１．５℃のTm1を有し、そして、抗CD38 mAbのCH2及びFabのドメインのアンフォールディングに対応しており；第２のピークは、１７０Kcal／モル／℃のCp max及び８１．５℃のTm2を有し、そして、抗PD-L1 mAbのCH3及びFabのドメインのアンフォールディングに対応していた。したがって、BiXAb-6567のDSCプロファイルは、２つの親mAbの２つのDSCプロファイルを重ね合わせたものに類似しており、そして、BiXAb-6567の優れた組み立て及び安定性を示した。BiXAb-6567のTonset（６３．３℃）は、親mAb（抗CD38のTonset＝６３．５℃及び抗PD-L1のTonset＝６３．２℃）に類似しており、これは、BiXAb-6567が親抗体と同様の安定性特性を有していたことを示す。BiXAb-6567のΔＨの計算値は１５６０kcal/モルであり、これは２つの親抗体に比べて二重特異性分子のサイズが大きいことを反映している（抗CD38のΔＨ＝９６３kcal/モル及び抗PD-L1のΔＨ＝８２０kcal/モル）。

定義：
Tm又は変性／融解温度は、折り畳まれていない種及び折り畳まれている種の濃度が等しい点であり、そして、アンフォールディング転移の中点である。パラメータとして、タンパク質の熱変性しやすさを表すので、タンパク質の安定性に関連している。Tｍがより高いほど、タンパク質がより安定である。

Tonsetは、アンフォールディング転移が始まる温度である。このパラメータの値は、通常、Tmよりも５〜１０℃低い。これもタンパク質の安定性を表すパラメータであるが、熱変性に対する耐性に関連している。

ΔＨは、アンフォールディングの熱量エンタルピーであり、そして、タンパク質における分子内相互作用の破壊（すなわち、ドメイン内及びドメイン間の相互作用の破壊）を反映している。熱アンフォールディングプロセスは吸熱性であるので、正のエンタルピー値が得られる。熱量エンタルピー（ΔＨ）は、熱アンフォールディング転移ピーク下面積である。

実施例３．BiXAb-6567の無細胞結合特性
直接CD38抗原結合プレートELISAアッセイ
PBS pH７．４で希釈することによって調製した、それぞれ濃度３μg/mLの親mAbである抗CD38又は抗PDL1のいずれか１００μLを使用して、４℃で一晩、Maxisorpプレートをコーティングした。また、PBS pH７．４で希釈することによって調製した、濃度５μg/mLのBiXAb-6567を使用して、４℃で一晩、Maxisorpプレートをコーティングした。０．０５％ Tween-20（PBST）を含有する１×PBSで該プレートを５回洗浄し、次いで、室温で２時間、１×PBS中１％ BSA ２００μL/ウェルでブロッキングした。続いて、該プレートを１×PBSTで５回洗浄した。１μg/mLで出発する、１×PBS中His/Flagタグ付き組換えCD38（Creative Biomart）の７点３倍希釈系列を調製した；アッセイのウェル毎に各希釈段階１００μLを添加した。該プレートを室温で１時間インキュベートし、そして、１×PBSTで５回洗浄した。１×PBSで１０，０００倍希釈した、抗Flagタグ抗体コンジュゲートHRP（Abcam）１００μL／ウェルを添加し、そして、該プレートを室温で１時間インキュベートした。１×PBSTで５回洗浄した後、比色分析の読み取りのために１×PBS中TMB基質１００μL／ウェルを添加し、そして、発色のために該プレートを室温で１５分間インキュベートした。Victor2マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用して、６５０nmでアッセイデータを収集した。

BiXAb-6567は、親抗CD38抗体と非常に類似している用量依存結合曲線を示した（図４Ａ）。両抗体についてのCD38結合のEC50は、以下の通りであった：EC50[BiXAb-6567]＝１７１ng/mL及びEC50[抗CD38]＝１９９ng/mL。親抗CD38 mAbと同様の結合を示したので、BiXAb-6567が、正確に組み立てられた抗CD38 Fabドメインを有していることがこの結果から示唆された。ネガティブコントロールとして使用した親抗PDL1 mAbは、予想通り、全く結合を示さなかった。

直接PDL1抗原結合プレートELISAアッセイ
１×PBS pH７．４で希釈することによって調製した、濃度１μg/mLのビオチン化ヒトPD-L1タンパク質（AcroBiosystems）１００μLを使用して、４℃で一晩、Maxisorpプレートをコーティングした。該プレートをPBSTで５回洗浄し、次いで、室温で２時間、１×PBS中１％ BSA ２００μL/ウェルでブロッキングした。続いて、該プレートを１×PBSTで５回洗浄した。１×PBS中抗CD38 mAb（０．３mg/mLで出発）、又は抗PD-L1 mAb（０．３mg/mLで出発）、又はBiXAb-6567（０．５mg/mLで出発）のいずれかの７点３倍希釈系列を調製した；アッセイのウェル毎に各希釈段階１００μLを添加した。該プレートを室温で１時間インキュベートし、そして、１×PBSTで５回洗浄した。１×PBSで５，０００倍希釈した、抗ヒト抗体（IgG H&L）コンジュゲートHRP（Abliance）１００μL／ウェルを添加し、そして、該プレートを室温で１時間インキュベートした。１×PBSTで５回洗浄した後、比色分析の読み取りのために１×PBS中TMB基質１００μL／ウェルを添加し、そして、発色のために該プレートを室温で１５分間インキュベートした。Victor2マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用して、６５０nmでアッセイデータを収集した。

BiXAb-6567は、親抗PD-L1抗体と非常に類似している用量依存結合曲線を示した（図４Ｂ）。両抗体についてのPD-L1結合のEC50は、以下の通りであった：EC50[BiXAb-6567]＝９３ng/mL及びEC50[抗PD-L1]＝７２ng/mL。親抗PD-L1 mAbと同様の結合を示したので、BiXAb-6567が、正確に組み立てられた抗PD-L1 Fabドメインを有していることがこの結果から示唆された。ネガティブコントロールとして使用した親抗CD38 mAbは、予想通り、全く結合を示さなかった。

二重抗原結合ELISAアッセイ
１×PBS pH７．４で希釈することによって調製した、２μg/mL 組換えヒトFcタグ付きCD38（Creative BioMart）１００μLを使用して、４℃で一晩、Maxisorpプレートをコーティングした。１×PBSTで該プレートを５回洗浄し、室温で２時間、１×PBS中１％ BSA ２００μL/ウェルでブロッキングした。該プレートを１×PBSTで５回洗浄した。１×PBS中BiXAb-6567の７点３倍希釈系列（１μg/mLで出発）を調製し、そして、アッセイのウェル毎に各希釈段階１００μLを添加した。該プレートを室温で１時間インキュベートし、続いて、１×PBSTで５回洗浄した。１×PBS中１μg/mL ビオチン化ヒトPD-L1（AcroBiosystems）１００μL／ウェルを添加し、そして、該プレートを室温で１時間インキュベートした。１×PBSTで５回洗浄した後、１×PBSで希釈することによって調製した０．１μg/mL ストレプトアビジンコンジュゲートHRP（Biotechne）１００μL／ウェルを添加した。該プレートを室温で１時間インキュベートした。１×PBSTで５回洗浄した後、比色分析の読み取りのために１×PBS中TMB基質１００μL／ウェルを添加し、そして、発色のために該プレートを室温で１５分間インキュベートした。Victor2マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用して、６５０nmでアッセイデータを収集した。

BiXAb-6567は、二重ELISAフォーマットにおいて用量依存結合曲線を示したので、それが、正確に組み立てられた抗CD38及び抗PD-L1 Fabドメインを有していることが示唆された（図４Ｃ）。これによって、BiXAb-6567が、EC50＝１４４ng/mLでCD38及びPD-L1に同時に結合することができる二重特異性抗体であることが証明された。２つの親mAbである抗CD38も抗PDL1も、予想通り、この二重ELISAフォーマットにおいて全く結合を示さなかった。

実施例４．蛍光活性化細胞選別（FACS）による相対結合活性の決定
１００μg/mL ペニシリン、１００μg/mL ストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清、及び５００μg/mL ジェネテシンが添加されたDMEM-Glutamax-I培地中で、CHO-CD38細胞（完全長ヒトCD38で安定的にトランスフェクトされたCHO細胞）を培養した。SKOV-3細胞及びRPMI-8226細胞は、１００μg/mL ペニシリン、１００μg/mL ストレプトマイシン、及び１０％ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640-Glutamax-I培地中で培養した。

各サンプル当たり３×１０５細胞（CHO-CD38、又はSKOV-3、又はRPMI-8226）を使用した。細胞をPBA溶液（１％ BSA及び０．０５％アジ化ナトリウムを添加したPBS）で１回洗浄した。FACSプロファイルを決定するために、体積３０μL中５０μg/mLの濃度の各抗体で細胞を染色した。BiXAb-6567及び親抗CD38抗体の力価測定と、それに続く結合パラメータの決定のために、体積３０μL中指定濃度の各抗体でCHO-CD38細胞を染色した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いで、PBA溶液１mLで２回洗浄した。氷上、暗条件下で３０分間、蛍光標識された抗ヒトカッパ又は抗ヒトIgG Fcガンマの特異的二次抗体と共に細胞をインキュベートし、次いで、PBA溶液１mLで２回洗浄し；最後に、PBA溶液最終体積５００μLに細胞を再懸濁させた。Epics-XL又はNaviosフローサイトメーター（Beckman Coulter）のいずれかを使用してサンプルをアッセイした。各実験において１０．０００の事象を取得した。

BiXAb-6567並びに親抗CD38抗体及び抗PD-L1親抗体の結合プロファイルを図５Ａ〜Ｃに提示する。高レベルのCD38及び無視できるレベルのPD-L1を発現する多発性骨髄腫細胞株RPMI-8226（図５Ａ）；完全長CD38で安定的にトランスフェクトされていることから非常に高レベルのCD38を発現したCHO-CD38細胞株（図５Ｂ）；並びにPD-L1を発現することが知られている卵巣癌細胞株SKOV-3（図５Ｃ）を試験することを選択した。これらプロファイルは、BiXAb-6567についてシングルピークを示し、これは、３つの細胞株における両親抗体のプロファイルと非常に類似していた。このことから、BiXAb-6567が正確に折り畳まれており、そして、親抗体と類似する結合属性を有していることが示唆された。予想通り、CHO-CD38は、CD38のみを発現し、そして、PD-L1は発現しなかったが、一方、SKOV-3は、PD-L1のみを発現し、そして、CD38は発現しなかった。

BiXAb-6567の結合特性が親抗CD38抗体と類似していることを定量的に確認するために、図６に提示する通り、CHO-CD38細胞を使用してBiXAb-6567及び抗CD38親抗体の力価測定を実施した。BiXAb-6567のEC50は１７．１nMであると求められ、そして、親抗CD38のEC50は８．５nMであったが、これによって、BiXAb-6567及び親抗CD38抗体における抗CD38 Fabドメインの結合特性が類似していることが確認された。この実験のネガティブコントロールである抗PD-L1及び抗CD20の抗体は、予想通り、CHO-CD38細胞に結合しないことが証明された。

実施例５．未分画のプレ活性化されていない単核細胞（MNC）による抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）
CHO-CD38、SKOV-3、及びRPMI-8226の細胞を上記実施例４に記載した通り培養した。

MNCを調製するために、以下の手順を使用した。新たに採取した末梢血をクエン酸塩で抗凝固処理した。続いて、Ficoll-Paque PLUS溶液５mLに抗凝固処理された全血６mLを層状に重ねた。サンプルを室温で２０分間、２，５００rpmで遠心分離したが、その後遠心分離破壊（centrifuge breaking）は行わなかった。血漿／Ficoll界面からMNCを回収した。MNC細胞懸濁液をPBSで１：１０希釈し、そして、室温で５分間、１，８００rpmで遠心分離した。上清を除去し、そして、氷冷蒸留水４５mLを細胞懸濁液に３０分間にわたって添加することによって赤血球を溶解させ、その後、１０×PBS ５mLを添加した。室温で５分間、１８００rpmで細胞を遠心分離し、そして、１×PBSで３回洗浄して、血小板を除去した。最後に、細胞培養培地５mLに細胞を再懸濁させた。ADCCアッセイにおけるエフェクタ細胞：腫瘍細胞の比が４０：１になるように、細胞数を調整した。

ADCC ^５１クロム放出アッセイのために、１×１０^６個の標的細胞（RPMI 8226、SKOV-3、又はCHO-CD38）を、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間、PBS ２００μL中５１クロム１００μCiと共にインキュベートした。２時間インキュベートした後、培地７mLで３回細胞を洗浄し、そして、最後に、０．１×１０６細胞／mLの濃度で再懸濁させた。３７℃及び５％ＣＯ２で３時間、９６ウェルマイクロタイタープレート内において（アッセイ体積２００μL）、抗体の存在下で標的細胞（５，０００細胞／ウェル）及びMNCをインキュベートした。最大標的細胞溶解（＝最大cpm）を求める場合、Triton X-100を添加した。基底^５１クロム放出（＝基底cpm）を求める場合、標的細胞をそれ以上操作しなかった。４時間インキュベートした後、２０００rpmで５分間マイクロタイタープレートを遠心分離し、そして、上清２５μLをOptiphase Supermix（Perkin Elmer）１２５μLと混合し、そして、振盪インキュベータ内で１分間インキュベートした。サンプルをMicroBeta TriLux（Perkin Elmer）ベータカウンタ装置でアッセイした。以下の式を使用して標的細胞の溶解を計算した：
溶解％＝（実験cpm−基底cpm）／（最大cpm−基底cpm）×１００。

測定は全てトリプリケートで実施した。

エフェクタ細胞としてプレ活性化されていないMNCを使用して、CD38+細胞（RPMI-8226及びCHO-CD38）のADCCアッセイを実施した（図７及び８）。該アッセイは、RPMI-8226細胞に対するBiXAb-6567及び抗CD38抗体の強力な細胞傷害性を示し、EC50はそれぞれ０．８nM及び０．３nMであった；CHO-CD38細胞に対しては、BiXAb-6567及び抗CD38抗体の細胞傷害性は、それぞれ０．２nM及び０．０７nMのEC50を有していた。抗PD-L1は、両細胞株に対して最小の活性を示し；２つのネガティブコントロールmAbである抗CD20及び抗HER2は、予想通り、溶解を全く促進しなかった。これら結果から、CD38+細胞に対するBMX-6567の強力なADCC活性が証明され、この活性は、親抗CD38抗体に類似している。

実施例６．濃縮され、プレ活性化されたNK細胞によるADCC
SKOV3細胞、RPMI 8226、及びCHO-CD38細胞を実施例４に記載の通り培養した。MNCを実施例５に記載の通り調製した。製造業者の指示書に従って「NK cell isolation kit, human」（Miltenyi）を使用して、ネガティブセレクションによってMNCからNK細胞を単離した。１０％ウシ胎児血清を添加したRPMI培地中２×１０^６細胞／mLの播種密度で一晩NK細胞を培養した。最終濃度が１０ng/mLになるようにIL-12又はIL-15を添加した。エフェクタ細胞：腫瘍細胞の比を１０：１で維持し、そして、反応時間を３時間に短縮したことを除いて、実施例５に概説した通りADCCアッセイを実施した。

IL-12又はIL-15でプレ活性化された濃縮NK細胞を使用して、PD-L1+細胞株SKOV-3に対するBiXAb-6567の抗PD-L1部分のADCC特性をアッセイした。結果を図９及び図１０に提示する。この実験では、BiXAb-6567のADCC特性を親抗PD-L1抗体と比較した；SKOV-3細胞はPD-L1+/HER2+/CD20-/CD38-であるので、ポジティブコントロールとして抗HER2抗体を使用し、そして、ネガティブコントロールとして抗CD20抗体及び親抗CD38抗体を使用した。図９及び１０から、IL-12又はIL-15をNK細胞の培養において使用したかどうかに関係なく、BiXAb-6567及び親抗PD-L1抗体のADCC活性が強力であることが証明される。IL-12を使用したとき、BiXAb-6567及び親抗PD-L1抗体のEC50は、それぞれ０．００７nM及び０．０３nMであった。IL-15を使用したとき、プロファイルは更により類似していたが；曲線当てはめが収束しなかったので、EC50値は計算できなかった。これら結果から、PD-L1+細胞に対するBMX-6567の強力なADCC活性が証明され、この活性は、親抗PD-L1抗体に類似している。

Claims

ａ）
− 対象となる抗体のVH及びVLのドメイン、
− 免疫グロブリンのCH1ドメインの１９２位におけるトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって前記CH1ドメインから得られるCH1ドメイン、及び
− 免疫グロブリンのCLドメインの１３７位におけるアスパラギン残基をリジン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１１４位におけるセリン残基をアラニン残基で置換することによって前記CLドメインから得られるCLドメイン
からなるFab断片、並びに
ｂ）
− 対象となる抗体のVH及びVLのドメイン、
− 免疫グロブリンのCH1ドメインの１２４位におけるロイシン残基をグルタミンで置換し、そして、前記CH1ドメインの１８８位のセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CH1ドメインから得られるCH1ドメイン、及び
− 免疫グロブリンのCLドメインの１３３位におけるバリン残基をトレオニン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１７６位のセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CLドメインから得られるCLドメイン
からなるFab断片
から選択される変異型Fab断片を含むタンパク質コンストラクト。
異なるCH1及びCLのドメインを有する少なくとも２つのFab断片を含む多重特異性抗原結合断片を含むか又はからなる、請求項１記載のタンパク質コンストラクトであって、
各Fab断片が対象となる異なるエピトープを認識し、そして、前記Fab断片が任意の順序でタンデムに配置されており、第１のFab断片のCH1ドメインのＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して次のFab断片のVHドメインのＮ末端に連結されており、
少なくとも１つのFab断片が、請求項１記載の変異型Fab断片からなり、好ましくは、２つのFab断片が、請求項１記載の変異型Fab断片である、タンパク質コンストラクト。
２本の同一の抗原結合アームを有する多重特異性抗体であって、各アームが、請求項２記載の多重特異性抗原結合断片からなる、請求項２記載のタンパク質コンストラクト。
− 各アームが請求項１記載の多重特異性抗原結合断片からなる、２本の同一の抗原結合アーム；
− 免疫グロブリンの二量体化されたCH2及びCH3のドメイン；
− 抗原結合アームのCH1ドメインのＣ末端をCH2ドメインのＮ末端に連結する、IgA、IgG、又はIgDのヒンジ領域
を含む免疫グロブリン様構造を有する、請求項３記載のタンパク質コンストラクト。
好ましくは二重特異性抗体であり、そして、少なくとも２本の重鎖及び４本の軽鎖を含み、
各重鎖が、
ａ．ヒンジ-CH2-CH3ドメインを含む免疫グロブリンのFc領域を含み、
ｂ．Fc領域が、前記ヒンジドメインによって抗体１（Ab1）のFab重鎖のCH1-VHに連結しており、
ｃ．次に、ポリペプチドリンカー配列によって抗体２（Ab2）のFab重鎖のCH1-VHに連結しており、そして、前記ポリペプチドリンカー配列が、Ab1の前記Fab重鎖のVHドメインのＮ末端をAb2の前記CH1ドメインのＣ末端に連結し、
そして、前記４本の軽鎖が、その同種重鎖ドメインと会合しているAb1のFab軽鎖のCL-VL及びAb2のFab軽鎖のCL-VLを含み、
Ab1及びAb2が、異なるエピトープを認識し、
そして、Ab1若しくはAb2のうちの一方のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１９２位におけるトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって前記CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３７位におけるアスパラギン残基をリジン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１１４位におけるセリン残基をアラニン残基で置換することによって前記CLドメインから得られる変異型ドメインである、及び／又は
Ab1若しくはAb2のうちの一方若しくは他方のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１２４位におけるロイシン残基をグルタミンで置換し、そして、前記CH1ドメインの１８８位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３３位におけるバリン残基をトレオニン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１７６位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CLドメインから得られる変異型ドメインである、請求項４記載のタンパク質コンストラクト。
Ab1のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１９２位におけるトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって前記CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３７位におけるアスパラギン残基をリジン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１１４位におけるセリン残基をアラニン残基で置換することによって前記CLドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、Ab2のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１２４位におけるロイシン残基をグルタミンで置換し、そして、前記CH1ドメインの１８８位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３３位におけるバリン残基をトレオニン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１７６位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CLドメインから得られる変異型ドメインである、請求項５記載のタンパク質コンストラクト。
Ab2のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１９２位におけるトレオニン残基をアスパラギン酸で置換することによって前記CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３７位におけるアスパラギン残基をリジン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１１４位におけるセリン残基をアラニン残基で置換することによって前記CLドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、Ab1のFab CH1ドメインが、免疫グロブリンのCH1ドメインの１２４位におけるロイシン残基をグルタミンで置換し、そして、前記CH1ドメインの１８８位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CH1ドメインから得られる変異型ドメインであり、そして、同種CLドメインが、免疫グロブリンのCLドメインの１３３位におけるバリン残基をトレオニン残基で置換し、そして、前記CLドメインの１７６位におけるセリン残基をバリン残基で置換することによって前記CLドメインから得られる変異型ドメインである、請求項５記載のタンパク質コンストラクト。
前記ポリヌクレオチドリンカー配列が、アミノ酸配列EPKX₁CDKX₂HX₃X₄PPX₅PAPELLGGPX₆X₇PPX₈PX₉PX₁₀GG（配列番号１）（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１０は、同じであるか又は異なり、任意のアミノ酸である）を含むか又はからなる、請求項２〜７のいずれか記載のタンパク質コンストラクト。
前記ポリヌクレオチドリンカー配列が、

からなる群から選択される配列を含むか又はからなる、請求項８記載のタンパク質コンストラクト。
EGFR及びHER2/neuを両方認識する、請求項１〜９のいずれか記載のタンパク質コンストラクト。
多重特異性抗体、好ましくは二重特異性抗体であり、異なるAb1及びAb2が、独立して、一方はセツキシマブ又はその変異型誘導体、そして他方はトラスツズマブ又はその変異型誘導体からなる群から選択される、請求項１０記載のタンパク質コンストラクト。
CD38及びPD-L1を両方認識する、請求項１〜９のいずれか記載のタンパク質コンストラクト。
多重特異性抗体、好ましくは二重特異性抗体であり、異なるAb1及びAb2が、独立して、一方はダラツムマブ又はその変異型誘導体、そして他方はアテゾリズマブ又はその変異型誘導体からなる群から選択される、請求項１２記載のタンパク質コンストラクト。
ａ）それぞれが配列番号７を含む、好ましくはからなる２本の重鎖と、ｂ）２本が配列番号１５を含み、好ましくはからなり、他の２本が配列番号１８を含む、好ましくはからなる４本の軽鎖とを含む、好ましくはからなる二重特異性抗体である、請求項１２記載のタンパク質コンストラクト。
請求項２〜１４のいずれか記載の抗原結合断片の重鎖又は多重特異性抗体の重鎖を含む、好ましくはからなるポリペプチド。
請求項１５記載のポリペプチドをコードしている配列を含むポリヌクレオチド。
請求項１６記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
２本の異なる軽鎖をコードしている少なくとも２つのポリヌクレオチドで更に形質転換され、第１の軽鎖が前記重鎖の第１のVH/CH1領域と特異的に対合し、第２の軽鎖が、前記重鎖の第２のVH/CH1領域と特異的に対合する、請求項１７記載の宿主細胞。
請求項２〜１４のいずれか記載の抗原結合断片又は多重特異性抗体を生成する方法であって、以下の工程：ａ）請求項２〜１４のいずれか記載の抗体重鎖及び請求項２〜１４のいずれか記載の抗体軽鎖を発現する宿主細胞を、好適な培地及び培養条件で培養する工程と；ｂ）培養培地から又は前記培養された細胞から前記生成された抗体を回収する工程を含む方法。
医薬として使用するための、請求項２〜１４のいずれか記載の多重特異性抗原結合断片又は多重特異性抗体。