KR20190141154A

KR20190141154A - 안정적인 다중특이적 항체

Info

Publication number: KR20190141154A
Application number: KR1020197031275A
Authority: KR
Inventors: 유진 주코브스키; 올리비에 레제; 리차드 제이 모스
Original assignee: 바이오뮤넥스 파마슈티컬스
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2019-12-23
Also published as: MX2019011585A; RU2019134211A3; AU2018241881A1; BR112019019998A2; JP2020515253A; CN111094355A; SG11201908825TA; CA3057567A1; US20200299413A1; JP7432365B2; US11560437B2; IL269559A; JP2023175760A; IL269559B1; WO2018178101A1; EP3601366A1; RU2019134211A; ZA201906981B

Abstract

본 발명은 CH1 및 CL 도메인의 경계면에서 특별한 세트의 돌연변이를 갖는 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항체 구축물에 관한 것이며, 상기 돌연변이는 중쇄/경쇄 쌍형성오류를 방지한다.

Description

안정적인 다중특이적 항체

본 발명은 의학 분야에서 유용한, 다중특이적 항체 분자의 생산에 관한 것이다.

이중특이적 항체 (bsAb) 는 두 개의 항체의 특이성을 조합하고, 상이한 항원 또는 에피토프를 동시에 다룬다. '두-표적' 기능을 갖는 BsAb 는, 예를 들어 암, 증식 또는 염증 과정과 연관되는, 복수의 표면 수용체 또는 리간드를 간섭할 수 있다. BsAb 는 또한 표적을 아주 근접하게 배치하여, 세포 상에서 단백질 복합체 형성을 지지하거나, 또는 세포 사이에서 접촉을 유발할 수 있다. '강제적인-연결' 기능의 예는 응고 캐스케이드에서의 단백질 복합체화를 지지하는 bsAb, 또는 종양-표적화되는 면역 세포 동원자 및/또는 활성화인자이다. 수년 간의 연구 개발 후에, 첫번째 bsAb 가 2009 년도에 승인되었다.

초기에, 이중특이적 항체는 화학적 접합에 의해, 또는 두 가지 상이한 mAb 를 생산하는 두 개의 하이브리도마 세포주 사이의 융합으로부터 초래되는 쿼드로마의 사용에 의해 제조되었다. 그러나, 화학적 접합은 때때로 항원 결합 자리를 변경하여, 항체의 생물학적 특성의 손상을 초래할 수 있다. 쿼드로마 접근법은 두 가지 상이한 항체로부터의 중쇄 및 경쇄의 무작위 쌍형성이 이론적으로 열 가지 동등한 가능한 조합을 초래하여 면역글로불린 분자의 혼합물을 산출하며, 그 중 오직 하나만 요망되는 이중특이적 산물이고, 이것이 잘못 쌍을 형성한 산물로부터 분리되어야 한다는 결점을 갖는다.

유전자 조작은 현재 선택되는 이중특이적 항체 생산 방법이 되었고, 여러 가지 상이한 재조합 이중특이적 항체 포맷의 개발을 초래했다. 이들 이중특이적 항체 중 일부는 매우 단순하고, 두 가지 (또는 그 이상의) 상이한 항체로부터의 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로부터 유도되며, 적당한 펩티드 링커를 통해 연합된다. 이들 항체는 상대적으로 생산하기 용이하고, 이들 항체는 단일 폴리펩티드 사슬에 의해 형성되고 부모 항체의 Fv 영역만 함유하므로, 사슬 사이에 쌍형성오류의 문제가 없다. 그러나, 이들 항체는 전장 면역글로불린보다 작고, 불변 영역이, 특히 Fc 영역이 없다. 이는 일부 응용에서, 예를 들어 Fc-매개되는 효과를 회피하기를 원할 때 유리할 수 있지만, Fc-매개되는 효과기 기능이 요망될 때에는 불리하다. 또한, 그들의 작은 크기 및 Fc 영역의 결여로 인해, 그들은 매우 짧은 반감기를 생체 내에서 갖는다.

그러므로, 자연적으로 발생하는 면역글로불린 분자를 매우 가깝게 모방하고, 특히 전체 Fc 영역을 갖는, 다른 이중특이적 재조합 항체 포맷이 디자인되었다. 그들은 두 가지 주요 포맷으로 분류될 수 있다.

첫번째 포맷 (IgG scFv) 에서, 항체 A 로부터의 scFv 단편이 항체 B 의 중쇄의 단부 (일반적으로는 C-말단 단부) 에 융합된다. 결과적인 항체는 항체 B 의 VH, CH1, CH2 및 CH3 도메인 및 항체 A 의 VH 및 VL 도메인을 함유하는 오직 하나의 유형의 중쇄 및 항체 B 의 VL 및 CL 도메인을 함유하는 하나의 유형의 경쇄를 갖고, 사슬 사이에서 쌍형성오류가 발생하지 않는다. 그러한 포맷은 예를 들어 Qu et al. (Blood, 111, 2211-2219, 2008) 에 의해 기재된다.

두번째 포맷에서, 항체 A 로부터의 중쇄 및 경쇄는 항체 B 로부터의 중쇄 및 경쇄와 쌍을 형성한다. 이러한 포맷은 쿼드로마에 의해 생산되는 이중특이적 항체를 재현하고, 그러므로 유사한 쌍형성오류의 문제를 일으킨다. 중쇄의 쌍형성오류의 문제를 해결하기 위해서, 항체의 CH3 도메인을 돌연변이시켜서 그들의 이종이합체화 (즉, 중쇄 A 와 중쇄 B 의 쌍형성) 를 촉진하게 하고 그들의 동종이합체화를 방지하는 것이 제안되었다. 이것은 소위 "놉 인투 홀 (knob into holes)" 접근법 (Ridgway et al, Protein Eng, 9, 617-21, 1996; 미국 특허 7,695,936) 에 의해 해결되었다. 작은 아미노산을 더 큰 아미노산으로 대체하는 것으로 이루어지는 "놉 (knob)" 돌연변이가 항체 A 의 중쇄의 CH3 이합체 경계면에 도입되어, 입체 장애를 초래함으로써 동종이합체화를 방지한다. 동시에 이종이합체화를 촉진하기 위해서, 큰 아미노산을 더 작은 아미노산으로 대체하는 것으로 이루어지는 상보적인 "홀 (hole)" 돌연변이가 항체 B 의 CH3 도메인 내에 도입된다. 중쇄/경쇄 쌍형성오류의 문제를 해결하기 위해서, scFv 파지 라이브러리로부터 이전에 확인된, 상이한 특이성을 갖는 그러나 공통 경쇄를 공유하는 항체를 사용하는 것이 제안되었다 (Merchant et al., Nat Biotechnol, 16, 677-81, 1998; 미국 특허 7,183,076). 이러한 접근법의 결점은 공통 경쇄를 갖는 항체를 확인함에 있어서의 곤란성이다.

국제 특허 출원 WO2013/005194 는 CH1 및 CL 도메인의 경계면에서 일부 열쇠 (key) 잔기를 돌연변이시킴으로써 중쇄/경쇄 쌍형성오류를 방지하고 그에 따라 사슬의 요망되는 쌍형성를 보장하는 것이 가능하다고 제안했다.

본 발명의 발명자들은 이제 신규한 세트의 돌연변이가 다중특이적 항체 분자에서 사슬의 쌍형성를 추가로 개선할 수 있다는 것을 발견했다.

본 발명은 CH1 및 CL 도메인의 경계면에서 특별한 세트의 돌연변이를 갖는 상이한 Fab 단편을 포함하는 다중특이적, 예를 들어 이중특이적, 항체 구축물에 관한 것이며, 상기 돌연변이는 중쇄/경쇄의 동족 쌍형성를 촉진하고 그들의 쌍형성오류를 방지한다.

CH1 및 CL 도메인에 관해 본원에서 사용되는 서열 위치 번호는 Kabat 넘버링 (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242, pp 662,680,689, 1991) 을 참조한다.

본원에서 제공되는 것은 하기로부터 선택되는 돌연변이된 Fab 단편이다:

a) 하기로 이루어지는 Fab 단편:

- 관심의 항체의 VH 및 VL 도메인;

- 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 192 에서 트레오닌 잔기의 아스파르트산 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CH1 도메인 및

- 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 137 에서 아스파라긴 잔기의 라이신 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 114 에서 세린 잔기의 알라닌 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CL 도메인; 및

b) 하기로 이루어지는 Fab 단편:

- 관심의 항체의 VH 및 VL 도메인;

- 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 124 에서 류신 잔기의 글루타민 잔기에 의한 치환 및 상기 CH1 도메인의 위치 188 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CH1 도메인; 및

- 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 133 에서 발린 잔기의 트레오닌 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 176 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CL 도메인.

그러한 돌연변이된 Fab 단편을 포함하는 임의의 구축물, 바람직하게는 임의의 단백질 구축물이 본 발명의 일부이다.

특히 제공되는 것은 상이한 CH1 및 CL 도메인을 갖는 적어도 두 개의 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단편이며, 각각의 Fab 단편은 관심의 상이한 에피토프를 인지하고, 상기 Fab 단편은 임의의 순서로 일렬로 배열되어 있으며, 제 1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단 단부는 그 다음의 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단 단부에 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있으며,

적어도 하나의 Fab 단편, 더욱 바람직하게는 두 개의 단편은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다

a) 하기로 이루어지는 Fab 단편:

- 항체의 VH 및 VL 도메인;

b) 하기로 이루어지는 Fab 단편:

- 항체의 VH 및 VL 도메인;

바람직한 실시형태에 따르면, CH1 도메인은, 유리하게는 IgG1 아형의, IgG 면역글로불린으로부터 유도된다. CL 도메인은 바람직하게는 카파 유형이다. 바람직하게는, 인간 치료법에서 사용하기 위해서, 돌연변이된 CH1 및 돌연변이된 CL 도메인이 유도되는 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다.

VH 및 VL 도메인은 표적화하고자 하는 에피토프를 인지하는, 선천 (native) 또는 유전자 조작된, 임의의 항체로부터 유도될 수 있다.

본 발명의 돌연변이된 Fab 단편은 중쇄/경쇄의 동족 쌍형성를 촉진하고 그들의 쌍형성오류를 방지하는 것이 필수적인 경우에 임의의 다중특이적 항체 구축물에서 사용될 수 있다.

유리하게는, 돌연변이된 Fab 단편은, 링커에 의해 분리되는, 일렬로 배열된 Fab 단편으로 각각 본질적으로 이루어지는, 항원-결합 단편을 포함하는 다중특이적 항체 분자에서 사용될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 또다른 목적은 하기로부터 선택되는 적어도 두 개의, 및 여섯 개 이하의, 상이한 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단편이다:

- 면역글로불린의 야생형 CH1 및 CL 도메인을 포함하는 Fab 단편 (본원에서 또한 "야생형 Fab 단편" 으로서 정의됨);

- 위에서 정의된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편 (a);

- 위에서 정의된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편 (b);

각각의 Fab 단편은 관심의 상이한 에피토프를 인지하고, 상기 Fab 단편은 임의의 순서로 일렬로 배열되어 있으며, 제 1 하나의 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단 단부는 그 다음의 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단 단부에 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있으며;

또는 하나의 또는 두 개의 Fab 단편은 임의의 순서로 일렬로 배열되어 있고, 폴리펩티드 링커를 통해 CH3 도메인의 C-말단, 또는 힌지 서열의 C-말단에 연결되어 있으며, 한편 또다른 Fab, 또는 두 개의 임의의 순서로 일렬로 배열된 Fab 는 힌지 서열의 N-말단에 부착되어 있다.

상기 힌지 서열은 전형적으로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, 또는 IgD 로부터, 가장 바람직하게는 IgG1 로부터 수득되는 천연 힌지 서열이거나, 또는 변형된 힌지 서열이 80 개 미만의 아미노산, 바람직하게는 60 개 미만의 아미노산, 더욱 바람직하게는 40 개 미만의 아미노산으로 이루어지도록 아미노산의 부가 및/또는 점 돌연변이를 통해 그의 변형된 서열일 수 있다.

"항원-결합 단편" 은 상이한 에피토프를 각각 인지하는, 둘 이상의 항원-결합 영역을 갖는 분자로서 본원에서 정의된다. 상이한 에피토프는 동일한 항원성 분자에 의해 또는 상이한 항원성 분자에 의해 보유될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 위에서 정의된 바와 같은, 다중특이적 항원-결합 단편, 즉, 복수의 (즉, 하나 초과의) 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 단편으로 각각 이루어지는, 두 개의 동일한 항원-결합 팔을 갖는 다중특이적 항체가 추가로 제공된다.

특정 실시형태에서, 다중특이적 항체는 면역글로불린-유사 구조를 갖고, 하기를 포함한다

- 위에서 정의된 바와 같은 그러한 다중특이적 항원-결합 단편으로 각각 이루어지는 두 개의 동일한 항원-결합 팔;

- 면역글로불린의 이합체화된 CH2 및 CH3 도메인;

- 항원-결합 팔의 CH1 도메인의 C-말단 단부를 CH2 도메인의 N-말단 단부로 연결시키는, IgA, IgG, 또는 IgD 의 힌지 영역.

더욱 특히 본 발명의 주제는 두 개의 중쇄 및 네 개의 경쇄를 포함하는 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적, 항체이며, 각각의 중쇄는 하기

- 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하고,

- 이러한 Fc 영역은 항체 1 (Ab1) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 상기 힌지 도메인에 의해 연결되며,

- 이는 결국 항체 2 (Ab2) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 폴리펩티드 링커 서열에 의해 연결되고, 폴리펩티드 링커 서열은 Ab1 의 상기 Fab 중쇄 VH 도메인의 N-말단을 Ab2 의 상기 CH1 도메인의 C-말단과 연결시키고,

네 개의 경쇄는 그들의 동족 중쇄 도메인과 연합되는 Ab1 의 Fab 경쇄 CL-VL 및 Ab2 의 Fab 경쇄 CL-VL 를 포함하며;

Ab1 및 Ab2 는 상이한 에피토프를 인지하고,

Ab1 또는 Ab2 중 하나의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 192 에서 트레오닌 잔기의 아스파르트산 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 137 에서 아스파라긴 잔기의 라이신 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 114 에서 세린 잔기의 알라닌 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고/이거나,

Ab1 또는 Ab2 중 하나 또는 다른 하나의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 124 에서 류신 잔기의 글루타민 잔기에 의한 치환 및 상기 CH1 도메인의 위치 188 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 133 에서 발린 잔기의 트레오닌 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 176 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이다.

추가로 기재되는 것은 하기로부터 선택되는 임의의 단백질 사슬이다:

- 본 발명의 돌연변이된 Fab 단편의 경쇄;

- 본 발명의 돌연변이된 Fab 단편의 중쇄;

- 본 발명의 항원-결합 단편의 중쇄;

- 본 발명의 면역글로불린-유사 다중특이적 항체의 중쇄.

본 공개는 본 발명의 단백질 사슬을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 부가적 서열을 포함할 수 있다: 특히 상기 폴리뉴클레오티드는 유리하게는 상기 단백질 사슬의 분비를 허용하는 리더 서열 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.

도 1 은 환원 및 비환원 조건 하에서의 BiXAb-6567 의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 보여준다. 레인 1: 환원 조건 하에서의 BiXAb-6567 의 이동; 레인 2: 각각의 밴드의 중량이 표시되어 있는 분자량 마커; 레인 3: 비환원 조건 하에서의 BiXAb-6567 의 이동.
도 2 는 BiXAb-6567 의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 보여준다.
도 3 은 시차 주사 열량측정법에 의해 확인되는 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1) 및 BiXAb-6567 의 용융 프로파일을 보여준다.
도 4A 는 직접 CD38 항원 결합 ELISA 에서의 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1) 및 BiXAb-6567 의 결합 프로파일을 보여준다. 도 4B 는 직접 PD-L1 항원 결합 ELISA 에서의 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1) 및 BiXAb-6567 의 결합 프로파일을 보여준다. 도 4C 는 이중 항원 (PD-L1 및 CD38) 결합 ELISA 에서의 BiXAb-6567 의 결합 프로파일을 보여준다.
도 5A 내지 5C 는 세 가지 상이한 세포주에서의 두 개의 부모 mAbs (항-CD38 및 항-PD-L1) 및 BiXAb-6567 의 형광-활성화된 세포 분류 프로파일을 보여준다, 5A: 다발성 골수종 RPMI-8226, 5B: 전장 CD38 로 안정적으로 트랜스펙션된 CHO 세포, 및 5C: 난소암 세포주 SKOV-3.
도 6 은 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1), BiXAb-6567, 및 음성 대조군 항-CD20 항체에서의 CHO-CD38 세포주에서의 적정 결합 프로파일을 보여준다.
도 7 은 다발성 골수종 세포주, RPMI-8226 을 표적 세포로서 및 미분획된 비-사전-활성화된 단핵 세포를 효과기 세포로서 이용하는 ADCC 어세이에서의 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1), BiXAb-6567, 및 두 개의 음성 대조군 항체, 항-CD20 및 항-HER2 의 세포독성 활성 프로파일을 보여준다.
도 8 은 CHO-CD38 세포주를 표적 세포로서 및 미분획된 비-사전-활성화된 단핵 세포를 효과기 세포로서 이용하는 ADCC 어세이에서의 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1), BiXAb-6567, 및 두 개의 음성 대조군 항체, 항-CD20 및 항-HER2 의 세포독성 활성 프로파일을 보여준다.
도 9 는 SKOV-3 세포주를 표적 세포로서 및 풍부한 (enriched) IL-12 사전-활성화된 NK 세포를 효과기 세포로서 이용하는 ADCC 어세이에서의 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1), BiXAb-6567, 및 두 개의 음성 대조군 항체, 항-CD20 및 항-HER2 의 세포독성 활성 프로파일을 보여준다.
도 10 은 SKOV-3 세포주를 표적 세포로서 및 풍부한 IL-15 사전-활성화된 NK 세포를 효과기 세포로서 이용하는 ADCC 어세이에서의 두 개의 부모 항체 (항-CD38 및 항-PD-L1), BiXAb-6567, 및 두 개의 음성 대조군 항체, 항-CD20 및 항-HER2 의 세포독성 활성 프로파일을 보여준다.
도 11 은 두 개의 중쇄, 및 네 개의 경쇄를 포함하고, 상이한 조합의 돌연변이를 보여주는, 본 발명의 이중특이적 항체의 도해적 표현이다.

상세한 설명

정의:

자연적으로 발생하는 항체 분자의 기본 구조는, 비-공유 상호작용 및 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 함께 고정된 두 개의 동일한 중쇄 및 두 개의 동일한 경쇄로 이루어지는 Y-형상의 사량체 사차 구조이다.

포유동물 종에서, 5 가지 유형의 중쇄: α, δ, ε, γ 및 μ 가 존재하고, 이는 각각 면역글로불린의 클래스 (아이소타입): IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 을 결정한다. 중쇄 N-말단 가변 도메인 (VH) 에는 뒤이어, 중쇄 γ, α 및 δ 에서 3 개의 도메인 (N-말단에서 C-말단으로 CH1, CH2 및 CH3 으로 넘버링됨) 을 함유하는 불변 영역이 존재하는 한편, 중쇄 μ 및 ε 의 불변 영역은 네 개의 도메인 (N-말단에서 C-말단으로 CH1, CH2, CH3 및 CH4 로 넘버링됨) 으로 구성된다. IgA, IgG 및 IgD 의 CH1 및 CH2 도메인은 가요성 힌지에 의해 분리되며, 상기 힌지는 상이한 클래스 사이에 길이가 가변적이며, IgA 및 lgG 의 경우, 상이한 아형 사이에 길이가 가변적이다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 는 각각 15, 12, 62 (또는 77) 및 12 개 아미노산의 힌지를 갖고, IgA1 및 IgA2 는 각각 20 및 7 개 아미노산의 힌지를 갖는다.

2 개 유형의 경쇄가 존재한다: 임의의 중쇄 아이소타입과 연관될 수 있으나, 주어진 항체 분자에서 둘 모두 동일한 유형의 것인, λ 및 κ. 두 경쇄 모두는 기능적으로 동일한 것으로 나타난다. 그의 N-말단 가변 도메인 (VL) 에는 뒤이어, CL 로 지칭되는 단일 도메인으로 이루어지는 불변 영역이 존재한다.

중쇄 및 경쇄는 CH1 및 CL 도메인 사이의 단백질/단백질 상호작용에 의해, 그리고 VH/VL 상호작용을 통해 쌍을 형성하며 두 개의 중쇄는 그의 CH3 도메인 사이의 단백질/단백질 상호작용에 의해 연관된다. 면역글로불린 분자의 구조는 일반적으로, CH1 과 CL 도메인 사이 및 힌지 사이의 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 안정화된다.

항원-결합 부위는, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 형성하는 완전한 경쇄 각각으로 이루어지며 Fab 단편 (항원 결합 단편 (Fragment antigen binding)) 으로 호칭되는, Y-형상 구조의 팔에 상응한다. Fab 단편은 먼저 힌지 영역에서, 사슬간 다이설파이드 결합의 아미노-말단측 상에서, 항체 분자를 절단하여 그에 따라 두 개의 동일한 항원-결합 팔을 방출하는 파파인 소화에 의해, 선천 면역글로불린 분자로부터 생성된다. 펩신과 같은 다른 프로테아제는 또한, 힌지 영역에서, 그러나 사슬간 다이설파이드 결합의 카르복시-말단측 상에서 항체 분자를 절단하여, 두 개의 동일한 Fab 단편으로 이루어지는 단편을 방출하고 다이설파이드 결합을 통해 연결되게 남아 있으며; F(ab')2 단편에서의 다이설파이드 결합의 환원이 Fab' 단편을 생성시킨다.

VH 및 VL 도메인에 상응하는 항원 결합 영역의 일부는 Fv 단편 (가변적 단편에 대함) 으로 지칭되고; 이는 항원-결합 자리 (파라토프로도 지칭) 를 형성하는 CDR (상보성 결정 영역) 을 함유한다.

효과기 분자 또는 세포에 대한 결합을 담당하는 항체의 효과기 영역은 Y-형상 구조의 줄기에 상응하며, 중쇄의 쌍을 형성하는 CH2 및 CH3 도메인 (또는 항체 클래스에 따라 CH2, CH3 및 CH4 도메인) 을 함유하고, Fc (결정화가능 단편에 대함) 부위로 지칭된다.

두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄의 동일성으로 인해, 자연적으로 발생하는 항체 분자는 두 개의 동일한 항원-결합 자리를 갖고, 그에 따라 두 개의 동일한 에피토프에 동시에 결합한다.

본 발명의 맥락에서, "다중특이적 항원-결합 단편" 은 상이한 에피토프를 각각 인지하는, 둘 이상의 항원-결합 영역을 갖는 분자로서 본원에서 정의된다. 상이한 에피토프는 동일한 항원성 분자에 의해 또는 상이한 항원성 분자에 의해 보유될 수 있다. 용어 "인지하는" 또는 "인지한다" 는 단편이 표적 항원에 특이적으로 결합한다는 것을 의미한다.

"다중특이적 항체" 는 적어도 두 개의 다중특이적 항원-결합 단편/팔로 구성되고, 둘, 셋 또는 그보다 많은 상이한 항원에 결합할 수 있다.

다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합활성으로, 보다 쉽게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 결합한다면, 항체는 표적 항원에 "특이적으로 결합한다". "특이적 결합" 또는 "우선적 결합" 은 (포함할 수 있음에도 불구하고) 배타적 결합을 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시 그렇지는 않지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.

용어 "돌연변이된 유도체", "돌연변이체", 또는 "기능적 변이체" 는 하나 또는 여러 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입에 의해 나타내어지는 부모 서열과 상이한 서열을 지정한다. 바람직하게는, 돌연변이된 유도체는 선천 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 상동성 서열을 바람직하게 나타낸다. 특정 실시형태에서, 돌연변이는 항체의 기능에 실질적으로 영향을 주지 않는다.

돌연변이된 유도체, 또는 기능적 변이체는 본원에 인용된 임의의 참조 서열과 적어도 85% (예를 들어, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬, 본원에 인용된 임의의 참조 서열과 적어도 85% (예를 들어, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 사슬, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 이들 변이체는 표적 항원에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 변이체는 상기 기재한 참조 항체에 관하여 유사한 항원-결합 친화성을 갖는다 (예를 들어, 1 x 10^-7M, 10^-8 M 미만, 바람직하게는 1 x 10^-9 M 또는 1 x 10^-10 M 미만의 KD 를 가짐).

결합의 친화성은 용어 ka (결합 속도 상수), kd (해리 속도 상수), 또는 KD (평형 해리) 에 의해 정의된다. 통상, 항체에 관하여 사용되는 경우, 특이적으로 결합한다는 것은 10^-7M 미만, 바람직하게는 10^-8 M 미만, 예를 들어, 10^-9 M 또는 10^-10 M 미만의 친화성 (KD) 값으로 그의 표적(들)에 특이적으로 결합하는 (이를 "인지하는") 항체를 지칭한다. 더 낮은 KD 값은 더 높은 결합 친화성 (즉, 더 강한 결합) 을 나타내어, 10^-9 의 KD 값은 10^-8 의 KD 값보다 더 높은 결합 친화성을 나타낸다.

2 개 아미노산 서열의 "동일성 퍼센트" 는 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993 에서와 같이 변형된, Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990 의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 에 통합된다. BLAST 단백질 탐색이 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어 길이=3 으로 수행되어, 관심의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 2 개 서열 사이에 갭 (gap) 이 존재하는 경우, Gapped BLAST 를 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997 에서 기재한 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST) 의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본원에서 기재한 기능적 변이체는, 하나 이상의 CDR 과 상호작용하는 것으로 예측되는 잔기에서 바람직하게는 발생하지 않는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 보존적 치환) 를 함유할 수 있다.

참조 항체와 실질적으로 동일한 돌연변이된 유도체, 또는 기능적 변이체가 본원에 기재된다.

용어 "실질적으로 동일한" 또는 "실질적이지 않은" 은 변이체의 관련 아미노산 서열 (예를 들어, 프레임워크 영역 (FR), CDR, VH 또는 VL 도메인에서의) 이 참조 항체와 비교하여 실질적이지 않게 상이 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환 포함) 하여, 변이체가 참조 항체에 관하여 실질적으로 유사한 결합 활성 (예를 들어 친화성, 특이성, 또는 둘 모두) 및 생체활성을 갖는 것을 의미한다. 이러한 변이체는 중대하지 않은 (minor) 아미노산 변화, 예를 들어 지정된 영역의 5 개 아미노산 서열에서 1 또는 2 개 치환을 포함할 수 있다. 일반적으로, 항체의 결합 기능에 부정적으로 영향 (예컨대 본래 항체와 비교하여 50% 초과로 결합 친화성을 감소시킴) 을 주지 않는 한, CDR 영역과 대조적으로, 더 많은 치환이 FR 부위에서 만들어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열 동일성은 본래 항체와 변형된 항체 사이에서 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 항체는 동일한 결합 특이성을 가지며 본래 항체의 친화성의 적어도 50% 를 갖는다.

보존적 치환은 이러한 변형이 만들어지는 분자의 기능적 및 화학적 특징과 유사한 기능적 및 화학적 특징을 갖는 분자를 생성시킬 것이다. 예를 들어, "보존적 아미노산 치환" 은 선천 아미노산 잔기의 또 다른 잔기로의 치환을 포함할 수 있는데, 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 약간의 영향이 있거나 영향이 없다. 원하는 아미노산 치환 (보존적 또는 비-보존적) 은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 분자 서열의 중요한 잔기를 확인하거나, 본원에 기재된 분자의 친화성을 증가 또는 감소시키는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체는, 이러한 방법을 정리하는 참고문헌, 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York 에서 발견되는 바와 같은, 당업자에게 공지된 폴리펩티드 서열 변경 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군 내의 아미노산 중에서 만들어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.

항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성을 통해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 단, 최종 구축물이 원하는 특징을 갖는다면, 최종 구축물이 달성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어진다. 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은 비제한적으로, 항체의 조기 제조된 변이체 또는 비-변이체 (천연) 버전의 올리고뉴클레오티드-매개되는 (또는 위치-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발을 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 항체의 평형 해리 상수 (KD) 값은 10^-7 M 미만, 특히 10^-8 M, 10^-9M 또는 10^-10 M 미만이다. 결합 친화성은 당해 분야에 공지된 기법, 예컨대 ELISA 또는 생체특이적 상호작용 분석 (예를 들어 표면 플라스몬 공명을 사용함), 또는 당해 분야에 공지된 다른 기법을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 분자는 그의 특성, 예컨대 항원-결합 활성, 항원-결합 특이성, 및 생물학적 기능을 측정하기 위해 일상적 방법에 따라 검사될 수 있다.

용어 "대상", "개체" 및 "환자" 는 본원에서 호환되게 사용되며, 치료를 위해 평가하고/하거나 치료하는 포유동물을 지칭한다. 대상은 인간일 수 있으며 또한 다른 포유동물, 특히 인간 질환을 위한 실험실 모델로서 유용한 포유동물, 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼, 개 등을 포함한다.

용어 "치료" 또는 "치료하는" 은 인간을 포함하는 대상이 대상의 병태를 직간접적으로 개선시키기 위해 의료 지원을 받는 조치, 적용 또는 치료요법을 지칭한다. 특히, 상기 용어는 일부 실시형태에서 발병률을 감소시키는 것, 또는 증상을 경감시키는 것, 재발을 없애는 것, 재발을 방지하는 것, 발병을 방지하는 것, 증상을 개선시키는 것, 예후를 개선시키는 것 또는 이의 조합을 지칭한다. 숙련가는 치료가 증상의 완전한 부재 또는 제거를 반드시 초래하지는 않는다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 암과 관련하여, "치료" 또는 "치료하는" 은 신생물성 또는 악성 세포 성장, 증식, 또는 전이를 둔화시키는 것, 신생물성 또는 악성 세포 성장, 증식, 또는 전이의 발전을 방지하거나 지연시키는 것, 또는 이들의 일부 조합을 지칭할 수 있다.

바람직한 다중특이적 항체의 디자인:

본원에서 제공되는 것은 상기 단편을 포함하는, 다중특이적 항원-결합 단편(들) 및 다중특이적 항체 구축물이며, 각각의 다중특이적 항원-결합 단편은 본 발명의 링커에 의해 분리되는, 일렬로 배열된 Fab 단편으로 본질적으로 이루어진다.

그러한 단편 및 구축물은 바람직하게는 인간 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 더욱 바람직하게는 IgG1 로부터의 사슬을 포함한다.

두 개 초과의 상이한 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단편의 경우에, Fab 단편을 분리하는 폴리펩티드 링커는 동일 또는 상이할 수 있다.

본 발명의 다중특이적 항체의 바람직한 실시형태에 따르면, 그것은, 위에서 정의된 바와 같은 복수의 (하나 초과의) 항원에 결합할 수 있는 항원-결합 단편으로 각각 이루어지는, 두 개의 동일한 항원-결합 팔을 갖는다. 항원-결합 팔은 항체에 관해 의도되는 용도에 따라 다양한 방식으로 함께 연결될 수 있다.

Fc-매개되는 효과가 없는 항체를 수득하고자 하는 경우에, 항체는 Fc 영역을 포함하지 않을 것다. 이 경우에, 두 개의 항원-결합 팔은 예를 들어 하기에 의해 함께 연결될 수 있다:

- 상기 링커(들)이 시스테인 잔기를 함유하는 경우에 Fab 단편을 분리하는 폴리펩티드 링커(들)에 의해 제공되는 사슬간 다이설파이드 결합을 통한 항원-결합 팔의 동종이합체화에 의해; 및/또는

- 각각의 항원-결합 팔의 C-말단 단부에서, 사슬간 다이설파이드 결합의 형성을 허용하는 시스테인 잔기를 함유하는 폴리펩티드 연장의 부가 및 힌지-유사 구조를 초래하는 상기 폴리펩티드 연장의 동종이합체화를 통해; 비-제한적 예로서, 상기 폴리펩티드 연장은 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgA, 또는 IgD 의 힌지 서열일 수 있다;

- 두 개의 항원-결합 팔의 중쇄의 C-말단 단부를 연결하여 단일 폴리펩티드 사슬을 형성하고 상기 항원-결합 팔을 서로에게서 충분한 거리에서 유지하는 반강성 (semi-rigid) 링커를 통해.

대안적으로, 효과기 기능 예컨대 항체-의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 식세포작용 (ADP), 및 보체-의존적 세포독성 (CDC) 이 요망되는 경우에, 본 발명의 다중특이적 항체는 이들 효과기 기능을 제공하는 Fc 도메인을 추가로 포함할 수 있다. Fc 도메인의 선택은 요망되는 효과기 기능의 유형에 따라 좌우될 것이다.

이 경우에, 본 발명의 다중특이적 항체는 하기를 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 갖는다:

- 위에서 정의된 바와 같은 두 개의 동일한 다중특이적 항원-결합 팔;

- 면역글로불린의 이합체화된 CH2 및 CH3 도메인;

- 항원-결합 팔의 CH1 도메인의 C-말단 단부를 CH2 도메인의 N-말단 단부로 연결하는 IgA, IgG, 또는 IgD 의 힌지 영역, 또는 대안적으로, CH3 도메인에 뒤따르는 CH4 도메인이 IgM 또는 IgE 에서 유래하는 경우에, 항원-결합 팔의 CH1 도메인의 C-말단 단부는, 이 경우에, CH2 도메인의 N-말단 단부에 직접 연결될 수 있다.

바람직하게는, CH2 및 CH3 도메인, 힌지 영역 및/또는 CH4 도메인은 동일한 면역글로불린으로부터 또는 항원-결합 팔의 CH1 도메인과 동일한 아이소타입 및 서브클래스의 면역글로불린으로부터 유도된다.

선천 면역글로불린으로부터의 CH2, CH3, 및 임의로 CH4 도메인, 뿐만 아니라 힌지 영역이 사용될 수 있다. 요망되는 경우에, 예를 들어 항체의 효과기 기능을 조정하기 위해서, 그들을 돌연변이시키는 것이 또한 가능하다. 일부 경우에, CH2 또는 CH3 도메인의 전체 또는 일부는 생략 될 수 있다.

본 발명 더욱 특히 각각의 그들의 표적에 대한 두 개의 결합 자리, 및 효과기 기능 예컨대 항체-의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC), 식세포작용, 및 보체-의존적 세포독성 (CDC) 의 활성화를 허용하는 기능적 Fc 도메인을 포함하는 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 사가 항체를 제공한다.

본 발명의 그러한 바람직한 항체는 전장 항체이다. 그들은 바람직하게는 인간 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 더욱 바람직하게는 IgG1 로부터의 중쇄 및 경쇄를 포함한다.

경쇄는 람다 또는 카파 경쇄일 수 있으며, 경쇄는 바람직하게는 카파 경쇄이다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 폴리펩티드 링커는 테트라-Fab 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적, 항체 포맷으로 IgG Fab 도메인의 두 개의 쌍을 연결하며, 그의 아미노산 서열은 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 적어도 두 개의 Fab 의 중쇄 서열, 이후 선천 힌지 서열, 뒤이어 IgG Fc 서열을 포함하며, 적당한 IgG 경쇄 서열과 동시발현된다.

IgG-유사 구조를 갖는, 본 발명의 바람직한 이중특이적 항체의 예를 도 11 에 예시한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 전형적으로

- Fc (힌지-CH2-CH3)

- 그에 뒤이어 항체 1 Fab 중쇄 (CH1-VH) 및 연이은 항체 2 의 Fab 중쇄 (CH1-VH) (후자는 힌지-유래 폴리펩티드 링커 서열에 의해 연결됨)

로 구축된 연속적 중쇄를 포함하고,

- 단백질 발현 동안 결과적인 중쇄는 이합체로 조립되는 한편, 동시-발현된 항체 1 및 항체 2 경쇄 (VL-CL) 는 그들의 동족 중쇄와 연합하여 최종 탠덤 F(ab)'2-Fc 분자를 형성하며,

항체 1 (Ab1) 및 항체 2 (Ab2) 는 상이하다.

바람직한 실시형태에서, 기재되는 것은 하기를 포함하는 이중특이적 항체이다

- 하기로 이루어지는 상이한 돌연변이된 CH1 및 돌연변이된 CL 도메인을 갖는 두 개의 Fab 단편

a) 인간 IgG1/카파로부터 유도되는 돌연변이된 CH1 및 돌연변이된 C-카파 도메인, 및 Ab1 의 VH 및 VL 도메인을 갖는 Fab 단편,

b) 인간 IgG1/카파로부터 유도되는 돌연변이된 CH1 및 돌연변이된 C-카파 도메인, 및 Ab2 의 VH 및 VL 도메인을 갖는 Fab 단편,

c) 인간 카파 불변 도메인으로부터 유도되는, 돌연변이된 경쇄 불변 도메인,

이 때 Fab 단편은 하기 순서로 일렬로 배열되어 있다

- Ab2 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단 단부에 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있는 Ab1 Fab 단편의 돌연변이된 CH1 도메인의 C-말단 단부,

- Ab2 단편의 돌연변이된 CH1 도메인의 C-말단 단부를 CH2 도메인의 N-말단으로 연결하는 인간 IgG1 의 힌지 영역,

- 인간 IgG1 의 이합체화된 CH2 및 CH3 도메인.

Ab1 및 Ab2 는 임의의 관심의 항체, 특히 치료적 관심의 임의의 항체일 수 있다.

특정 실시형태에서, Ab1 및 Ab2 는 상이하며, 독립적으로 항-CD38 항체 (예컨대 다라투무맙) 및 항-PD-L1 항체 (예컨대 아테졸리주맙) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또다른 특정 실시형태에서, Ab1 및 Ab2 는 상이하며, 독립적으로 항-EGFR 항체 및 항-HER2/neu 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, Ab1 및 Ab2 는 상이하며, 한편으로는, 세툭시맙 또는 그의 돌연변이된 유도체 및, 다른 한편으로는, 트라스투주맙, 또는 그의 돌연변이된 유도체로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택된다.

그러한 항체는 약제로서, 더욱 특히 암을 치료함에 있어서, 유용하다.

특정 예에서, 이중특이적 분자는 a) SEQ ID NO: 7 을 각각 포함하는, 바람직하게는 그것으로 이루어지는 두 개의 중쇄 및 b) 두 개의 경쇄는 SEQ ID NO: 15 를 포함하고, 바람직하게는 그것으로 이루어지고, 다른 두 개의 경쇄는 SEQ ID NO: 18 을 포함하는, 바람직하게는 그것으로 이루어지는, 네 개의 경쇄를 포함하는, 바람직하게는 그것으로 이루어지는 이중특이적 항-CD38, 항-PD-L1 항체이다. 그러한 이중특이적 항체는 BiXAb-6567 로 지칭된다.

SEQ ID NO: 7 (중쇄) 는 하기이다:

이 중쇄 서열은 하기를 포함한다

- 다라투무맙의 VH (SEQ ID NO: 8)

- 다라투무맙 Fab 의 CH1 도메인 (돌연변이 L124Q 및 S188V 를 포함하는 G1m(3) 동종형의 인간 IgG1) (SEQ ID NO: 9)

- AP 링커 (SEQ ID NO: 3)

- 아테졸리주맙의 VH (SEQ ID NO: 10)

- Fab 아테졸리주맙의 CH1 도메인 (돌연변이 T192D 를 포함하는 G1m(3) 동종형의 인간 IgG1) (SEQ ID NO: 11)

- 인간 IgG1 의 힌지 (SEQ ID NO: 12)

- 인간 IgG1 의 CH2 도메인 (SEQ ID NO: 13)

- G1m(3) 동종형의 인간 IgG1 의 CH3 도메인 (SEQ ID NO: 14)

경쇄 SEQ ID NO: 15 (다라투무맙) 는 하기이다

이 경쇄 서열은 하기를 포함한다

- 다라투무맙의 VL (SEQ ID NO: 16)

- 돌연변이 V133T 및 S176V 를 포함하는 다라투무맙의 C카파 도메인 (SEQ ID NO: 17)

경쇄 SEQ ID NO: 18 (아테졸리주맙) 은 하기이다

이 경쇄 서열은 하기를 포함한다

- 아테졸리주맙의 VL (SEQ ID NO: 19)

- 돌연변이 S114A 및 N137K 를 포함하는 아테졸리주맙의 C카파 도메인 (SEQ ID NO: 20)

Fab 도메인의 제 3 쌍 (Fab 도메인의 제 1 및 제 2 쌍 보다는 상이한 항원 표적을 향해 유도됨) 은 또한 동일 또는 상이한 폴리펩티드 링커로: i) Fab 도메인의 상기 제 3 쌍의 중쇄의 C-말단을 통해 외부 (즉, Fc-원위) Fab 도메인의 중쇄의 N-말단으로, ii) 또는 Fab 도메인의 상기 제 3 쌍의 중쇄의 C- 또는 N-말단을 통해 Fc-도메인의 양쪽 중쇄의 C-말단으로 연결될 수 있다.

본원에서 기재된 임의의 분자는 당업계에 알려져 있고 용이하게 입수가능한 부가적 비-단백질성 모이어티를 함유하도록, 예를 들어, PEG화 또는 과당화에 의해, 변형될 수 있다. 단백질가수분해 분해에 대항하여 혈청 반감기 또는 안정성을 향상시킬 수 있는 변형이 포괄된다.

본 발명의 항체는 당화될 수 있거나 그렇지 않을 수 있거나, 또는 다양한 당화 프로파일을 나타낼 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 중쇄의 가변 영역에서 비당화되나, Fc 영역에서는 당화된다.

인간화된 형태의 레퍼런스 비-인간 항체를 사용할 수 있다. 인간화 접근법에서, 상보성 결정 영역 (CDR) 및 공여자 가변 영역으로부터의 특정한 기타 아미노산이 인간 가변성 수용체 영역에 그래프팅되고 그 후 인간 불변 영역에 연결된다. 참고, 예를 들어 Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); 미국 특허 No. 5,225,539.

본 발명의 구축물의 또다른 예는 Fc 도메인을 함유하지 않는 이중특이적 항원-결합 단편 Fab-Fab 이다.

그러한 Fab-Fab 구축물은 전형적으로 두 개의 상이한 Fab 도메인을 포함한다. 그러한 항체는 각각 항원 1 에 및 항원 2 에 결합하는 오직 하나의 Fab 도메인을 보유한다. 그들은 상응하는 BiXAb 항체에서와 동일한 경쇄를 보유한다; 그러나, Fab-Fab 의 중쇄는 그들의 가장 C-말단 잔기가 시스테인-220 (EU 넘버링에서) 이 되게 하는 방식으로 단축되어 있다.

본 발명의 구축물의 또다른 예는 이합체화된 Fab-Fab 구축물 (예를 들어 링커에서 다이설파이드를 통해 또는 C-말단-근위 Fab 도메인의 C 말단에서 힌지의 천연 다이설파이드를 통해) 이다.

링커의 디자인

"힌지-유래 폴리펩티드 링커 서열" 또는 "슈도 (pseudo) 힌지 링커" 로도 지정되는 폴리펩티드 링커는, 바람직하게는 인간 기원의, IgA, IgG 및 IgD 중에서 선택된 하나 이상의 면역글로불린(들)의 힌지 영역의 서열의 전부 또는 일부를 포함한다. 상기 폴리펩티드 링커는 단 하나의 면역글로불린의 힌지 영역의 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 면역글로불린은 인접한 CH1 도메인이 유래하는 면역글로불린과 동일한 아이소타입 및 서브클래스, 또는 상이한 아이소타입 또는 서브클래스에 속할 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리펩티드 링커는 상이한 아이소타입 또는 서브클래스의 적어도 두 개의 면역글로불린의 힌지 영역의 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 이러한 경우, CH1 도메인에 바로 뒤따르는 폴리펩티드 링커의 N-말단부는, 바람직하게는 상기 CH1 도메인이 유래하는 면역글로불린과 동일한 아이소타입 및 서브클래스에 속하는 면역글로불린의 힌지 영역의 전부 또는 일부로 이루어진다.

임의로는, 상기 폴리펩티드 링커는 면역글로불린의 CH2 도메인의 2 내지 15 개, 바람직하게는 5 내지 10 개의 N-말단 아미노산의 서열을 추가로 포함할 수 있다.

폴리펩티드 링커 서열은 전형적으로는 80 개 미만의 아미노산, 바람직하게는 60 개 미만의 아미노산, 더욱 바람직하게는 40 개 미만의 아미노산으로 이루어진다.

일부 경우에, 선천 힌지 영역으로부터의 서열이 사용될 수 있고; 다른 경우에, 점 돌연변이, 특히 선천 IgG1, IgG2 또는 IgG3 힌지 서열에서의 하나 이상의 시스테인 잔기의 알라닌 또는 세린에 의한 대체가 이들 서열에 도입되어, 원치않는 사슬내 또는 사슬간 다이설파이드 결합을 방지할 수 있다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 아미노산 서열

을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지며, 여기에서 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀ 은 동일 또는 상이하며, 임의의 아미노산이다. 특히, 폴리펩티드 링커 서열은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어질 수 있다

특정 실시형태에서, X₁, X₂ 및 X₃ 은 동일 또는 상이하며, 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이다.

또다른 특정 실시형태에서, X₁, X₂ 및 X₃ 은 동일 또는 상이하며, Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어지는 군으로부터 선택되되며, 더욱 바람직하게는 X₁, X2 및 X₃ 은 동일 또는 상이하며, Ala (A) 또는 Gly (G) 일 수 있다.

대안적으로, X₁, X₂ 및 X₃ 은 동일 또는 상이하며, Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), 바람직하게는 Leu (L), Glu (E), 또는 Gln (Q) 일 수 있다.

특정 실시형태에서, X₄ 및 X₅ 는 동일 또는 상이하며, 세린 (S), 시스테인 (C), 알라닌 (A), 및 글라이신 (G) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산이다.

바람직한 실시형태에서, X₄ 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이다.

바람직한 양태에서, X₅ 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이다.

특정 실시형태에서, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀ 은 동일 또는 상이하며, 트레오닌 (T) 또는 세린 (S) 이외의 임의의 아미노산이다. 바람직하게는 X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀ 은 동일 또는 상이하며, Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) 및 Ile (I) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

대안적으로, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀ 은 동일 또는 상이하며, Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), 바람직하게는 Leu (L), Glu (E), 또는 Gln (Q) 일 수 있다.

바람직한 실시형태에서, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀ 은 동일 또는 상이하며, Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

더욱 바람직한 실시형태에서, X₆ 및 X₇ 은 동일하고, 바람직하게는 Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 서열 SEQ ID NO: 1 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지며,

X₁, X₂ 및 X₃ 은 동일 또는 상이하며, 트레오닌 (T), 세린 (S) 이며;

X₄ 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이며;

X₅ 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이며;

X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀ 은 동일 또는 상이하며, Ala (A) 및 Gly (G) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

또다른 바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 서열 SEQ ID NO: 1 을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지며,

X₁, X₂ 및 X₃ 은 동일 또는 상이하며, Ala (A) 또는 Gly (G) 이며;

X₄ 는 세린 (S) 또는 시스테인 (C) 이며;

X₅ 는 알라닌 (A) 또는 시스테인 (C) 이며;

두 개 초과의 상이한 Fab 단편을 포함하는, 다중특이적 항원-결합 단편의 경우에, Fab 단편을 분리하는 폴리펩티드 링커는 동일 또는 상이할 수 있다.

다중특이적 항체의 생산:

당업자는 다중특이적 항체를 발현하는 일반적 기술에 관해, 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 WO2013/005194 를 참조할 수 있다.

또한, 본원에서 기재되는 것은 본 발명의 분자 또는 항체의 단백질 사슬을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 부가적 서열을 포함할 수 있다: 특히 상기 폴리뉴클레오티드는 유리하게는 상기 단백질 사슬의 분비를 허용하는 리더 서열 또는 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 숙주 세포가 또한 개시된다.

전형적으로, 통상, 상이한 모노클로날 항체의 아미노산 서열이, 임의로는 포유동물 발현에 대한 코돈 최적화 후에 DNA 서열을 설계하는데 사용된다. 중쇄에 대해, 신호 펩티드, Fab1 의 가변 영역 및 불변 CH1 도메인, 이후 힌지 링커 및 Fab2 의 가변 영역 및 불변 CH1 도메인 (제한 효소 소화를 위한 측면위치 서열을 가짐) 을 인코딩하는 DNA 가 합성된다. 경쇄에 대해, 신호 펩티드 및 가변 및 불변 카파 부위를 인코딩하는 DNA 가 합성된다.

본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 DNA 조각은, 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들)에서의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 이러한 조절 서열은 신호 서열, 프로모터, 인핸서 및 전사 종결 서열을 포함한다. 발현 벡터는 통상, 숙주 염색체 DNA 의 필수 부분으로서 또는 에피솜으로서 숙주 유기체에서 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출이 가능하도록 선택 마커, 예를 들어, 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유할 것이다.

하나의 예에서, 중쇄 및 경쇄-코딩 서열 (예를 들어, VH 및 VL, VH-CH1 및 VL-CL, 또는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 인코딩하는 서열) 둘 모두는 하나의 발현 벡터에 포함된다. 또 다른 예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄 각각은 개별 벡터에 클로닝된다. 후자의 경우, 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터는 두 사슬 모두의 발현을 위해 하나의 숙주 세포에 동시-트랜스펙션될 수 있는데, 이는 조립되어 생체내 또는 시험관내에서 온전한 항체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 중쇄를 인코딩하는 발현 벡터 및 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터는 각각의 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 상이한 숙주 세포 내에 도입될 수 있는데, 이는 그런 다음 정제 및 조립되어 시험관내에서 온전한 항체를 형성할 수 있다.

특정 실시형태에서, 숙주 세포는 3 개의 독립적인 발현 벡터, 예컨대 플라스미드로 동시-트랜스팩션되어, 모든 3 개의 사슬 (즉 각각 중쇄 HC, 및 두 개의 경쇄 LC1 및 LC2) 의 동시생성, 및 다중특이적, 예를 들어 이중특이적, 항체의 분비를 초래한다.

더욱 구체적으로 3 개의 벡터는 2:1:1 의 분자비 (HC : LC1 : LC2) 로 유리하게 사용될 수 있다.

본원에서 정의되는 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포는 하기 두 개의 상이한 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 추가로 트랜스펙션될 수 있다: 상기 중쇄의 제 1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제 1 경쇄; 상기 중쇄의 제 2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제 2 경쇄.

추가의 실시형태에서, 숙주 세포는 제 1 및 제 2 경쇄와 상이하고, 상기 중쇄의 제 3 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 이루는 제 3 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 부가적으로 트랜스펙션될 수 있다.

본원에 기재된 항체의 발현을 위한 재조합 벡터는 통상, 구성적 또는 유도성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 항체 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 함유한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물, 또는 둘 모두에서 복제 및 혼입에 적합할 수 있다. 통상적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 항체를 인코딩하는 핵산의 발현 제어에 유용한 프로모터를 함유한다. 벡터는 임의로는, 적어도 하나의 독립적인 종결자 서열, 진핵생물 및 원핵생물 둘 모두에서 카세트의 복제를 허용하는 서열, 즉, 셔틀 벡터, 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 모두에 대한 선택 마커를 함유하는 일반 발현 카세트를 함유한다.

본원에서 기재한 바와 같은 다중특이적, 예를 들어 이중특이적, 항체는 원핵 또는 진핵 발현 시스템, 예컨대 박테리아, 효모, 사상균, 식물 곤충 (예를 들어 바큘로바이러스 벡터를 사용함) 및 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. 본 발명의 재조합 항체를 진핵 세포에서 당화 또는 발현시킬 필요는 없으나; 포유동물 세포에서의 발현이 일반적으로 바람직하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 인간 배아 신장주 (293 세포), 어린 햄스터 신장 세포 (BHK 세포), 중국 햄스터 난소 세포/- 또는 + DHFR (CHO, CHO-S, CHO-DG44, Flp-in CHO 세포), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO 세포), 및 인간 간 세포 (Hep G2 세포) 이다.

온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 당해 분야에서 개발되었으므로, 포유동물 조직 세포 배양은 폴리펩티드를 발현 및 생성시키기에 바람직하며, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주 (예컨대 NS0), 또는 형질전환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적, 예를 들어 이중특이적, 항체는 CHO 세포주, 가장 유리하게는 CHO-S 또는 CHO-DG-44 세포주 또는 그의 유도체를 사용하여 생성된다.

이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터 및 인핸서, 및 필요한 프로세싱 정보 위치, 예컨대 리보솜 결합 위치, RNA 스플라이스 위치, 폴리아데닐화 위치, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등에서 유래한 프로모터이다.

관심의 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄 인코딩 서열 및 발현 조절 서열) 을 함유하는 벡터는, 세포 숙주 유형에 따라 가변적인 공지된 방법에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어 인산칼슘 처리 또는 전기천공을 다른 세포 숙주에 대해 사용할 수 있다 (일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed., 1989) 참조). 중쇄 및 경쇄가 별개의 발현 벡터에서 클로닝되는 경우, 벡터는 동시-트랜스펙션되어 온전한 면역글로불린의 발현 및 조립이 수득된다.

숙주 세포는 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션되며 (예를 들어, 화학적 트랜스펙션 또는 전기천공 방법에 의해), 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열 인코딩 유전자의 증폭을 위해 종래의 영양 배지 (또는 적절하게 변형된 배지) 에서 배양된다.

항체의 발현은 일시적이거나 안정할 수 있다.

바람직하게는, 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 항체, 예컨대 BiXAb-6567 의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 DNA 로 안정적으로 트랜스펙션된 세포주가 지속 발현할 수 있어, 치료제 제조를 가능하게 하는, 안정 발현의 방법에 의해 생성된다. 예를 들어 CHO 세포주에서의 안정 발현이 특히 유리하다.

발현되고 나면, 본 발명의 전체 항체, 그의 이합체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는 추가 어세이 및 적용을 위해 실질적으로 균질한 제조물이 수득되도록 추가 단리 또는 정제될 수 있다. 당해 분야에서 공지된 표준 단백질 정제 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 정제 절차는 면역친화성 또는 이온교환 컬럼 상의 분별화, 에탄올 침전, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE), 황산암모늄 침전, 및 겔 여과를 포함할 수 있다 (일반적으로, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982) 참조). 약학적 용도를 위해, 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99% 이상 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 가장 바람직하다.

시험관내 생성은 다량의 본 발명의 원하는 다중특이적, 예를 들어 이중특이적, 항체가 제공되도록 규모 확대 (scale-up) 를 허용한다. 이러한 방법은 예를 들어 에어리프트 (airlift) 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유, 마이크로캡슐에서, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지 상에서 고정 또는 포획된 세포 배양을 이용할 수 있다.

응용

본 발명의 단백질 구축물 또는 다중특이적 항체는 다중특이적 항체의 모든 응용에서 사용될 수 있다. 특히 그들을 사용하여 광범위한 치료적 응용 및 진단적 의학적 응용에서 환자에서 (방사성, 형광, 화학발광, 또는 임의의 기타 라벨과 접합됨), 또는 시험관 내에서 (예를 들어 면역조직화학, 면역블롯, 및 면역형광 기술을 이용하는 세포 및 조직 염색을 위해) 유용한 약제를 수득할 수 있다. 이들 의학적 또는 진단적 제품은 또한 본 발명의 목적의 일부이다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 단백질 구축물 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 발명의 또다른 양태는 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 단백질 구축물 또는 항체의 용도이다. 본 발명의 추가의 양태는 본 발명에 따른 단백질 구축물 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법이다.

또다른 양태에서, 본 발명은 약학적 담체와 함께 제형화된 본원에서 정의되는 단백질 구축물 또는 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 여러 가지 방법으로 투여될 수 있다.

하기 실시예는 예시에 의해 제공되고, 본 발명을 제한하는 것이 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1. 본 발명의 이중특이적 항체 BiXAb-6567 의 제조

유전자 합성

항-CD38 (다라투무맙) 및 항-PDL1 (아테졸리주맙) 의 아미노산 서열을, GeneScript 프로그램을 사용하여, 포유동물 발현에 대한 코돈 최적화 후, DNA 서열을 설계하는데 사용했다. 이들 항체를 "부모" 항-CD38 및 "부모" 항-PD-L1 mAb 로서 지칭한다.

중쇄의 DNA 구축물을 이와 같이 설계했다: 신호 펩티드, 뒤이어 서열 SEQ ID NO: 7 [가변 영역, 이후 Fab1 의 불변 CH1 도메인 (항-CD38) (여기서 각각 Kabat 위치 124 및 188 에서 Leu 에서 Gln 로의 및 Ser 에서 Val 로의 돌연변이가 도입됨), 뒤이어 링커, 이후 가변 영역, 이어서 Fab2 의 불변 CH1 도메인 (항-PD-L1) (여기서 Kabat 위치 192 에서 Thr 에서 Asp 로의 돌연변이가 도입됨) 으로 이루어짐]; 제한 효소 소화를 위한 측면위치 서열이 중쇄 DNA 구축물의 양 말단에 도입됨. 경쇄에 대한 DNA 구축물을 이와 같이 설계했다: 신호 펩티드 (SEQ ID NO: 21), 뒤이어 가변 영역, 이후 불변 카파 부위. 항-CD38 경쇄에 대해 (SEQ ID NO: 15), 불변 카파 도메인에서 Kabat 위치 143 (Leu 에서 Gln 로) 및 188 (Ser 에서 Val 로) 에 돌연변이가 도입되었다. 항-PDL1 경쇄에 대해, Kabat 위치 133 (Val 에서 Thr 로) 및 176 (Ser 에서 Val 로) 에서 돌연변이가 불변 카파 도메인에 도입되었다. 모든 DNA 구축물을 Gene Art 에 의해 합성했다.

PfuTurbo Hot Start 을 사용하는 PCR 반응을 실행하여, 각각 중쇄 및 경쇄에 대해 NotI 및 ApaI, 및 NotI 및 HindIII 로 소화된 삽입물을 증폭했다. 이중 소화된 중쇄 단편을, 인간 IgG1 힌지 이후 CH2-CH3 도메인이 이미 삽입된, NotI 및 ApaI 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 와 라이게이션했다. 이중-소화된 경쇄 단편을 NotI 및 HindIII 처리된 pcDNA3.1 발현 벡터 (Invitrogen) 와 라이게이션했다. 플라스미드 DNA 를 이중 가닥 DNA 서열분석에 의해 확인했다.

발현 및 정제

이중특이적 항체 BiXAb-6567 을, 현탁액 중 무혈청 배지 (CHO SFM-II 배지, Life Technologies^TM) 에 적합화된 CHO-S 세포에서 2:1:1 = HC:LC1:LC2 분자 비로 별개의 벡터 상 코딩된 3 개 유전자 (1 개의 연속 중쇄 (HC) 및 두 개의 경쇄 (LC)) 를 동시-트랜스펙션시킴으로써 일시적 유전자 발현을 이용하여 생성시켰다. 통상, 50 ㎖ 규모 발현을 위해, 총 50 ㎍ 의 플라스미드 DNA (25 ㎍ 중쇄, 12.5 ㎍ 의 항-CD38 경쇄 및 12.5 ㎍ 의 항-PD-L1 경쇄) 를 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에서 혼합한 후, 25 ㎕ 의 3 ㎎/㎖ PEI 트랜스펙션 시약 pH 7.0 (Polyplus) 을 함유하는 1 ㎖ 의 CHO SFM 배지를 첨가하고, 반응물을 실온에서 20 분 동안 인큐베이션했다. DNA-PEI 혼합물을 이후 125 ㎖ 진탕 플라스크에서 1~2x 10⁶/㎖ 에서 49 ㎖ 의 Life Technologies 의 Invitrogen FreeStyle^TM CHO-S 세포에 첨가했다. 세포를 6 일 동안 진탕했다. 3,000 rpm 에서 15 분 동안 원심분리하여, 상청액을 수확했다. 상청액 중 BiXAb-6567 의 발현 타이터를, ForteBio 의 단백질 A 바이오센서 (Octet® Systems) 를 사용하여 측정했다. BiXAb-6567 을 단백질 A 친화성 수지 (MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences) 상에서 정제했다. 항체를 0.1 M 글리신 pH 3.5 을 사용하여 단백질 A 로부터 용리하고, 용리물을 1 M TRIS 에 의해 중화했다. 둘베코 PBS (Lonza) 중 정제된 항체를 멸균-여과 (0.2 μM 멸균 필터, Techno Plastic Products AG) 하고, 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 판독하여 최종 농도를 측정했다 (Eppendorf BioSpectrometer®).

BiXAab-6567 은 일시적 CHO 발현에서 통상 양호한 발현 타이터 (> 180 ㎎ / 리터) 를 나타냈다. 이러한 발현 수준은 종래의 모노클로날 항체에서 관찰된 발현 수준과 비슷하다.

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

정제된 BiXAb-6567 의 품질을 평가하기 위해, SDS-PAGE (Experion^TM 자동화 전기영동 시스템, BioRad) 를 수행했다. 작동 완충제 중 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 의 존재 하에, 항체가 겔에서 이동하는 속도는 주로 분자량 결정을 가능하게 하는 그의 크기에 따라 좌우된다. 이러한 어세이를 비환원 조건 및 환원 조건 하에 수행하였고; 후자는 디술피드 결합이 파괴되게 하여, 그에 따라 개별 폴리펩티드 사슬 (경쇄 및 중쇄) 이 시각화되게 한다.

SDS-PAGE 데이터를 도 1 에서 나타낸다. 비환원 조건 하에, 항체의 사차 구조가 유지되며, 관찰된 분자량은 상이한 중쇄 및 경쇄의 분자량의 합계를 나타내어야 한다. 본 발명의 이중특이적 항체 (BiXAb-6567) 는 6 개의 사슬: 두 개의 중쇄 및 네 개의 경쇄로 이루어진다. 번역후 변형 (PTM), 예를 들어 아스파라긴 297 에서 Fc 에서의 N-당화를 고려하지 않고, BiXab-6567 의 이론적 분자량은 244.40 kDa 이다. 공지된 분자량의 표준물의 혼합물을 사용하여 겔을 교정했다. 비환원 데이터는 Fc 도메인에서 위치 297 에서의 2 개 아스파라긴의 예상된 당화 및 계산된 분자량에 따라, 250 kDa 분자량 표준물에 근접하게 흐르는 주요 밴드를 나타낸다. 환원 조건 하에, 디티오트레이톨 (DTT) 은 디술피드 연결을 환원시키고 사차 구조를 파괴함으로써 BiXAb-6567 을 추가로 변성시키고, 따라서 6 개의 폴리펩티드 사슬이 그의 분자량에 따라 겔에서 개별적으로 이동하게 된다. BiXAb-6567 의 두 개의 동일한 중쇄는 단일 밴드로서 동시 이동하고, 경쇄의 2 개 쌍은, 그의 거의 동일한 분자량으로 인해, 두 번째 밴드로서 동시 이동한다. 따라서 데이터는, 분자량 표준물의 이동성을 기준으로, 대략 75 kDa 및 25 kDa 에서 두 개의 주요 밴드를 나타낸다. 각각의 중쇄는 아스파라긴 297 에서 1 개의 N-당화 위치를 갖는데, 이는 더 높은 분자량 밴드의 확장 및 계산된 것보다 약간 더 높은 관찰된 분자량 (75.44 kDa) 을 설명하는 것이며; 이러한 확장은 당화된 단백질에 대해 통상적인 것이다. 항-CD38 (23.40 kDa) 및 항-PD-L1 (23.36 kDa) 의 경쇄의 계산된 분자량은 매우 유사하며, 따라서 그의 동시 이동을 초래한다.

결론적으로, BiXAb-6567 의 SDS-PAGE 는 미환원 및 환원 조건 둘 모두 하에서 예상된 프로파일을 나타내었고, 중쇄에서 N-당화 위치의 존재를 고려시, 계산된 이론적 분자량과 일치했다.

크기 배제 크로마토그래피 분석

조작된 단백질 분자에서 단백질 응집이 빈번하게 관찰된다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 를 수행하여, 단일-단계 친화성-정제된 BiXAb-6567 제조물의 고분자량 종류 함량을 어세이했다 (변이체의 발현 및 정제 참조). SEC-s3000 (300 x 7.8 ㎜) 컬럼 (BioSep) 및 Aktapurifier 10 시스템 (GE Healthcare) 을 이용하였고; PBS 완충액 pH 7.4 를 사용하여 1 ㎖/분의 유량으로 어세이를 수행했다.

도 2 에 나타낸 SEC 크로마토그램은 주요 피크가 단량체성 BiXAb-6567 의 예상된 크기에 상응했다는 것을 입증하였으며; 이러한 피크는 총 샘플의 98.2% 를 나타냈다. 또한, 더 높은 분자량 종류 (가능하게는 이합체) 에 상응하는 작은 피크가 관찰되었으며; 이러한 피크는 총 샘플의 1.8% 를 나타냈다. 따라서, 더 높은 분자량 종류의 백분율 함량이 주요하지 않으며, CHO 발현 시스템에서 생성된 종래의 모노클로날 항체와 유사하다고 결론내려졌다. 단량체성 피크의 좁고 대칭의 형상은, BiXAb-6567 이 올바르게 조립되었으며 단일 종류를 나타냈다는 것을 제안했다.

실시예 2. 시차 주사 열량측정법 (DSC) 에 의한 BiXAb-6567 의 특성규명

시차 주사 열량측정법 (DSC) 을 사용하여, BiXAb-6567, 부모 항-CD38 mAb 및 부모 항-PD-L1 mAb 의 열 안정성을 비교했다. MicrocalTM VP-Capillary DSC 시스템 (Malvern Instruments) 을 사용하여 시차 주사 열량측정법 실험을 수행했다.

모든 샘플을 원심분리하고 (20,000x g, 5 분, 4℃), IgG 분석 프로그램을 이용하는 Nanodrop ND-1000 분광측정기 (Thermo Scientific) 를 사용하여 DSC 분석 전에 그의 단백질 함량을 정량화했다. 어세이를 위해, 모든 샘플을 1 ㎎/㎖ 의 최종 농도로 PBS 중 희석했다.

예비-평형 시간은 3 분이었고, 20 내지 110℃ 에서 60℃/시간의 스캔 속도, 25 초의 필터링 기간 및 미듐 피드백에서, 생성 온도기록도를 획득했다. 샘플 분석 전에, 5 회 완충액/완충액 스캔을 측정하여 기기를 안정화하고, 각각의 단백질/완충액 스캔 사이에 완충액/완충액 스캔을 수행했다. 사전- 및 후-전이를 기준선을 제하여 조정하여, 데이터를 비-2-상태 미폴딩 (unfolding) 모델에 피팅했다.

도 3 에서 나타낸 DSC 곡선 (50 내지 100℃ 범위 커버) 은 개별 Fv 부위가 상이한 Fab 미폴딩 프로파일을 초래할 수 있는 방식을 입증하였으며; 이러한 실험은 또한 Fv 부위가 Fab 의 겉보기 안정성을 좌우한다는 것을 입증했다. 항-CD38 mAb 의 DSC 프로파일은 2 개 전이를 나타내었는데: 큰 피크는 170 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 70.9℃ 의 Tm1 을 가지며 CH2 및 Fab 도메인 둘 모두의 미폴딩에 상응하고, 작은 피크는 20 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 81.5℃ 의 Tm2 를 가지며 CH3 도메인의 미폴딩에 상응한다. 항-PD-L1 mAb 의 DSC 프로파일은 2 개 전이를 나타내었는데: 작은 피크는 20 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 69.9℃ 의 Tm1 을 가지며 CH2 도메인의 미폴딩에 상응하고, 큰 피크는 160 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 83.4℃ 의 Tm2 를 가지며 CH3 및 Fab 도메인 둘 모두의 미폴딩에 상응한다.

BiXAb-6567 의 DSC 프로파일은 또한 두 개의 큰 피크를 갖는 2 개 전이를 나타냈다. 첫 번째 피크는 130 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 71.5℃ 의 Tm1 을 가졌으며 항-CD38 mAb 의 CH2 및 Fab 도메인의 미폴딩에 상응하였고; 두 번째 피크는 170 Kcal/몰/℃ 의 Cp max 및 81.5℃ 의 Tm2 를 가졌으며 항-PD-L1 mAb 의 CH3 및 Fab 도메인의 미폴딩에 상응했다. 따라서, BiXAb-6567 의 DSC 프로파일은 2 개 부모 mAb 의 2 개 DSC 프로파일의 중첩과 유사하였으며, BiXAb-6567 의 우수한 조립 및 안정성을 보여주었다. BiXAb-6567 의 Tonset (개시 온도) (63.3℃) 는 부모 mAb 의 개시 온도 (항-CD38 Tonset=63.5℃ 및 항-PD-L1 Tonset=63.2℃) 와 유사하였는데, 이는 BiXAb-6567 이 부모 항체와 유사한 안정성 특성을 가졌다는 것을 나타낸다. 두 개의 부모 항체에 비하여 더 큰 크기의 이중특이적 분자를 반영하여 (항-CD38 △H=963 kcal/몰 및 항-PD-L1 △H=820 kcal/몰), BiXAb-6567 의 계산된 △H 는 1560 kcal/몰이었다.

정의:

Tm 또는 변성/용융 온도는 미폴딩 및 폴딩된 종류의 농도가 동일한 지점이며, 미폴딩 전이의 중간 지점이다. 매개변수로서, 이는 열 변성에 대한 단백질의 민감성을 설명하며, 따라서 단백질의 안정성에 관한 것이다. Tm 이 더 높을수록 단백질이 더 안정하다.

Tonset 은 미폴딩 전이가 시작되는 온도이다. 이 매개변수에 대한 값은 통상 Tm 보다 5 내지 10℃ 더 낮다. 이는 또한 단백질 안정성을 설명하지만, 열 변성에 대한 저항성에 관련된 매개변수이다.

△H 는 미폴딩의 열량측정법 엔탈피이며, 단백질에서의 분자내 상호작용의 붕괴 (즉 도메인내 및 도메인간 상호작용의 파괴) 를 반영한다. 열 미폴딩 과정은 흡열성이며, 따라서 양성 엔탈피 값을 산출시킨다. 열량측정법 엔탈피 (△H) 는 열 미폴딩 전이 피크 하의 면적이다.

실시예 3. BiXAb-6567 의 무세포 결합 특성

직접 CD38 항원-결합 플레이트 ELISA 어세이

PBS pH 7.4 로 희석하여 제조된, 각각 3 ㎍/㎖ 의 농도에서의 100 ㎕ 의 부모 mAb, 항-CD38 또는 항-PDL1 을, 4℃ 에서 밤새 Maxisorp 플레이트를 코팅하는데 사용했다. 또한, PBS pH 7.4 로 희석하여 제조된, 5 ㎍/㎖ 의 농도에서의 BiXAb-6567 을, 4℃ 에서 밤새 Maxisorp 플레이트를 코팅하는데 사용했다. 플레이트를, 0.05% Tween-20 을 함유하는 1x PBS (PBST) 로 5 회 세척한 다음, 2 시간 동안 실온에서 1x PBS 중 1% BSA 200 ㎕/웰로 블로킹했다. 플레이트를 이후 1x PBST 로 5 회 세척했다. 1 ㎍/㎖ 에서 시작하여, 1x PBS 중 His/Flag-태깅된 재조합 CD38 (Creative Biomart) 의 7-점 3 배 연속 희석물을 제조하고; 각각의 희석 단계의 100 ㎕ 를 어세이 웰 당 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 1x PBST 로 5 회 세척했다. 1x PBS 중 10,000 배 희석한, 100 ㎕/웰의 항-Flag-태그 항체-접합된 HRP (Abcam) 를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1x PBST 로 5 회 세척한 후, 1x PBS 중 TMB 기질 100 ㎕/웰을 비색 판독을 위해 첨가하고, 발색을 위해 플레이트를 15 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 650 ㎚ 에서, Victor2 마이크로플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 를 이용하여 어세이 데이터를 수집했다.

BiXAb-6567 은 부모 항-CD38 항체와 매우 유사한 용량-의존적 결합 곡선을 나타냈다 (도 4A). 두 항체 모두에 대한 CD38 결합의 EC50 은 하기와 같았다: EC50[BiXAb-6567] = 171 ng/㎖ 및 EC50[항-CD38] = 199 ng/㎖. 이러한 결과는, BiXAb-6567 이 부모 항-CD38 mAb 와 유사한 결합을 나타내었으므로, BiXAb-6567 이 올바르게 조립된 항-CD38 Fab 도메인을 갖는다는 것을 제시했다. 음성 대조군으로서 사용된 부모 항-PDL1 mAb 는 예상한 바와 같이 어떠한 결합도 나타내지 않았다.

직접 PDL1 항원 결합 플레이트 ELISA 어세이

1x PBS pH 7.4 로 희석하여 제조된, 1 ㎍/㎖ 의 농도에서의 100 ㎕ 의 비오틴화된 인간 PD-L1 단백질 (AcroBiosystems) 을, 4℃ 에서 밤새 Maxisorp 플레이트를 코팅하는데 사용했다. 플레이트를 PBST 로 5 회 세척한 다음, 실온에서 2 시간 동안 1x PBS 중 1% BSA 200 ㎕/웰로 블로킹했다. 플레이트를 이후 1x PBST 로 5 회 세척했다. 1x PBS 중 항-CD38 mAb (0.3 ㎎/㎖ 에서 시작), 또는 항-PD-L1 mAb (0.3 ㎎/㎖ 에서 시작), 또는 BiXAb-6567 (0.5 ㎎/㎖ 에서 시작) 의 7-점 3 배 연속 희석물을 제조하고; 각각의 희석 단계의 100 ㎕ 를 어세이 웰 당 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 1x PBST 로 5 회 세척했다. 1x PBS 중 5,000 배 희석한 100 ㎕/웰의 항-인간 항체 (IgG H&L)-접합된 HRP (Abliance) 를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1x PBST 로 5 회 세척한 후, 1x PBS 중 TMB 기질 100 ㎕/웰을 비색 판독을 위해 첨가하고, 발색을 위해 플레이트를 15 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 650 ㎚ 에서, Victor2 마이크로플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 를 이용하여 어세이 데이터를 수집했다.

BiXAb-6567 은 부모 항-PD-L1 항체과 매우 유사한 용량-의존적 결합 곡선을 나타냈다 (도 4B). 두 항체 모두에 대한 PD-L1 결합의 EC50 은 하기와 같았다: EC50[BiXAb-6567] = 93 ng/㎖ 및 EC50[항-PD-L1] = 72 ng/㎖. 이러한 결과는, BiXAb-6567 이 부모 항-PD-L1 mAb 와 유사한 결합을 나타내었으므로, BiXAb-6567 이 올바르게 조립된 항-PD-L1 Fab 도메인을 갖는다는 것을 제시했다. 음성 대조군으로서 사용된 부모 항-CD38 mAb 는 예상한 바와 같이 어떠한 결합도 나타내지 않았다.

이중 항원-결합 ELISA 어세이

1x PBS pH 7.4 로 희석하여 제조한 2 ㎍/㎖ 에서의, 100 ㎕ 의 재조합 인간 Fc-태깅된 CD38 (Creative BioMart) 을, 4℃ 에서 밤새 Maxisorp 플레이트를 코팅하는데 사용했다. 플레이트를 1x PBST 로 5 회 세척한 다음, 실온에서 2 시간 동안 1x PBS 중 1% BSA 200 ㎕/웰로 블로킹했다. 플레이트를 1x PBST 로 5 회 세척했다. BiXAb-6567 (1 ㎍/㎖ 에서 시작) 의 1x PBS 중 7-점 3 배 연속 희석물을 제조하고, 각각의 희석 단계의 100 ㎕ 을 어세이 웰 당 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 1x PBST 로 5 회 세척했다. 1x PBS 중 1 ㎍/㎖ 비오틴화된 인간 PD-L1 (AcroBiosystems) 100 ㎕/웰을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1x PBST 로 5 회 세척한 후, 1x PBS 로 희석하여 제조한 0.1 ㎍/㎖ 의 스트렙타비딘-접합된 HRP (Biotechne) 100 ㎕/웰을 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 1x PBST 로 5 회 세척한 후, 1x PBS 중 TMB 기질 100 ㎕/웰을 비색 판독을 위해 첨가하고, 발색을 위해 플레이트를 15 분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 650 ㎚ 에서, Victor2 마이크로플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 를 이용하여 어세이 데이터를 수집했다.

BiXAb-6567 은 이중 ELISA 포맷에서 용량-의존적 결합 곡선을 나타내었는데, 이것이 올바르게 조립된 항-CD38 및 항-PD-L1 Fab 도메인을 갖는다는 것을 제시한다 (도 4C). 이는 BiXAb-6567 이 EC50 = 144 ng/㎖ 으로, CD38 및 PD-L1 에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항체임을 입증했다. 예상한 바와 같이, 2 개 부모 mAb, 항-CD38 또는 항-PDL1 중 아무 것도, 이중 ELISA 포맷에서 어떠한 결합도 나타내지 않았다.

실시예 4. 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 에 의한 상대 결합 활성의 측정

CHO-CD38 세포 (전장 인간 CD38 로 안정적으로 트랜스펙션된 CHO 세포) 를, 100 ㎍/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10% 소 태아 혈청 및 500 ㎍/㎖ 게네티신이 보충된 DMEM-Glutamax-I 배지에서 배양했다. SKOV-3 세포 및 RPMI-8226 세포를, 100 ㎍/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640-Glutamax-I 배지에서 배양했다.

각각의 샘플 당 3x10⁵ 세포 (CHO-CD38, 또는 SKOV-3, 또는 RPMI-8226) 를 사용했다. 세포를 PBA 용액 (1% BSA 및 0.05% Na-아자이드가 보충된 PBS) 으로 1x 세척했다. FACS 프로파일의 측정을 위해, 30 ㎕ 의 부피로 50 ㎍/㎖ 의 농도에서 각각의 항체로 세포를 염색했다. BiXAb-6567 및 부모 항-CD38 항체의 적정, 및 결합 매개변수의 후속적 측정을 위해, 30 ㎕ 의 부피로, 표시한 농도에서 각각의 항체로 CHO-CD38 세포를 염색했다. 세포를 30 분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 다음, 1 ㎖ 의 PBA 용액으로 2 회 세척했다. 세포를 30 분 동안 암환경 하 얼음 상에서 형광 표지된 항-인간 카파 또는 항-인간 IgG Fc 감마 특이적 이차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 1 ㎖ PBA 용액으로 2 회 세척하고; 마지막으로, 세포를 500 ㎕ PBA 용액의 최종 부피에 재현탁했다. 샘플을 Epics-XL 또는 Navios 유세포 측정기 (Beckman Coulter) 를 사용하여 어세이했다. 각각의 실험에서 10,000 이벤트를 획득했다.

BiXAb-6567 및 부모 항-CD38 및 항-PD-L1 부모 항체의 결합 프로파일을 도 5A-C 에서 나타낸다. 높은 수준의 CD38 및 무시할만한 수준의 PD-L1 을 발현하는 다발성 골수종 세포주, RPMI-8226 (도 5A); 안정적으로 트랜스펙션된 전장 CD38 로 인해 매우 고수준의 CD38 을 발현하는 CHO-CD38 세포주 (도 5B); 및 PD-L1 을 발현하는 것으로 공지된 난소암 세포주 SKOV-3 (도 5C) 을 시험하는 것으로 선택했다. 이들 프로파일은 3 개 세포주에서 두 부모 항체 모두의 프로파일과 매우 유사한, BiXAb-6567 에 대한 단일 피크를 나타냈다. 이는 BiXAb-6567 이 올바르게 폴딩되며 부모 항체의 결합 속성과 유사한 결합 속성을 갖는다는 것을 제시했다. 예상한 바와 같이, CHO-CD38 은 CD38 만을 발현하였고 PD-L1 은 발현하지 않은 반면, SKOV-3 은 PD-L1 만을 발현하였고 CD38 은 발현하지 않았다.

BiXAb-6567 의 결합 특성이 부모 항-CD38 항체의 결합 특성과 유사하다는 것을 정량적으로 확인하기 위해, 도 6 에서 나타낸 바와 같이, CHO-CD38 세포를 이용하여 BiXAb-6567 및 항-CD38 부모 항체의 적정을 수행했다. BiXAb-6567 의 EC50 은 17.1 nM 으로 측정되었으며 부모 항-CD38 의 EC50 은 8.5 nM 이었는데, 이는 BiXAb-6567 및 부모 항-CD38 항체에서 항-CD38 Fab 도메인의 유사한 결합 특성을 확인시켜준다. 이 실험에서 음성 대조군, 항-PD-L1 및 항-CD20 항체는, 예상한 바와 같이 CHO-CD38 세포에 결합하지 않음이 입증되었다.

실시예 5. 미분획된 비-사전활성화된 단핵 세포 (MNC) 로의 항체 의존적 세포-매개되는 세포독성 (ADCC)

CHO-CD38, SKOV-3 및 RPMI-8226 세포를 상기 실시예 4 에 기재된 바와 같이 배양했다.

MNC 의 제조를 위해 하기 절차를 이용했다. 새로이 뽑은 말초 혈액을 시트레이트로 항-응고시켰다. 후속적으로, 5 ㎖ 의 Ficoll-Paque PLUS 용액을 6 ㎖ 항-응고된 전혈로 층 형성시켰다. 샘플을 20 분 동안 2,500 rpm, RT 에서, 후속적인 원심분리 휴식 없이 원심분리했다. MNC 를 혈장 / Ficoll 계면으로부터 수집했다. MNC 세포 현탁액을 PBS 중 1:10 희석하고 5 분 동안 1,800 rpm, 실온에서 원심분리했다. 상청액을 제거하고, 30 초 동안 45 ㎖ 빙랭 증류수를 세포 현탁액에 첨가하여 적혈구를 용해하고, 그 후 5 ㎖ 의 10x PBS 를 첨가했다. 세포를 5 분 동안 1800 rpm, 실온에서 원심분리하고 1x PBS 로 3 회 세척하여 혈소판을 제거했다. 마지막으로 세포를 5 ㎖ 세포 배양 배지에 재현탁했다. ADCC 어세이에서 40:1 = 효과기 세포:종양 세포 비가 얻어지도록 세포 수를 조정했다.

ADCC ⁵¹크로뮴 방출 어세이를 위해, 1x10⁶ 표적 세포 (RPMI 8226, SKOV-3, 또는 CHO-CD38) 를 200 ㎕ PBS 중 100μCi ⁵¹크로뮴과 함께 2 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 에서 인큐베이션했다. 2 시간 인큐베이션 후, 세포를 7 ㎖ 의 배지로 3 회 세척하고, 마지막으로 0.1 x 10⁶ 세포/㎖ 의 농도에서 재현탁했다. 항체의 존재 하 표적 세포 (5,000 세포/웰) 및 MNC 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (200 ㎕ 어세이 부피) 에서 3 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 에서 인큐베이션했다. 최대 표적 세포 용해 (= 최대 cpm) 의 측정을 위해 Triton X-100 을 첨가했다. 기저 ⁵¹크로뮴 방출 (= 기저 cpm) 을 측정하기 위해 표적 세포는 추가 조작하지 않았다. 4 시간 인큐베이션 후, 마이크로타이터 플레이트를 5 분 동안 2000 rpm 에서 원심분리하고, 25 ㎕ 상청액을 125 ㎕ 의 Optiphase Supermix (Perkin Elmer) 와 혼합하고, 쉐이크 인큐베이터 (shake incubator) 에서 1 분 동안 인큐베이션했다. 샘플을 MicroBeta TriLux (Perkin Elmer) 베타-계수기에서 어세이했다. 하기 식을 사용하여 표적 세포 용해를 계산했다:

% 용해 = (실험적 cpm - 기저 cpm)/(최대 cpm - 기저 cpm) x 100.

모든 측정은 삼반복으로 수행했다.

비-사전활성화된 MNC 를 효과기 세포로서 이용하여 CD38+ 세포 (RPMI-8226 및 CHO-CD38) 의 ADCC 어세이를 수행했다 (도 7 및 8). 어세이는 각각 0.8 nM 및 0.3 nM 의 EC50 으로, RPMI-8226 세포에서 BiXAb-6567 및 항-CD38 항체의 강력한 세포독성을 나타내었고; CHO-CD38 세포에서, BiXAb-6567 및 항-CD38 항체의 세포독성은 각각 0.2 nM 및 0.07 nM 의 EC50 을 가졌다. 항-PD-L1 은 두 세포주 모두에서 최소 활성을 나타내었고; 2 개 음성 대조군 mAb, 항-CD20 및 항-HER2 는 예상한 바와 같이 어떠한 용해도 촉진시키지 않았다. 이들 결과는 CD38+ 세포에 대한 BMX-6567 의 강력한 ADCC 활성을 입증하며, 이는 부모 항-CD38 항체의 경우와 유사하다.

실시예 6. 풍부한 사전활성화된 NK 세포로의 ADCC

SKOV3 세포, RPMI 8226 및 CHO-CD38 세포를 실시예 4 에서 기재한 바와 같이 배양했다. MNC 를 실시예 5 에서 기재한 바와 같이 제조했다. 제조사 지시사항에 따라 "NK 세포 단리 키트, 인간" (Miltenyi) 을 이용하는 음성 선택에 의해 NK 세포를 MNC 로부터 단리했다. NK 세포를 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 배지 중 2x10⁶ 세포/㎖ 의 시딩 밀도에서 밤새 배양했다. IL-12 또는 IL-15 를 10 ng/㎖ 의 최종 농도로 첨가했다. ADCC 어세이를, 효과기 세포:종양 세포 비를 10:1 에서 유지하고 반응의 지속기간을 3 시간으로 감소시킨 것을 제외하고는, 실시예 5 에서 설명한 바와 같이 수행했다.

BiXAb-6567 의 항-PD-L1 모이어티의 ADCC 특성을, IL-12 또는 IL-15 사전활성화된 풍부한 NK 세포를 이용하여 PD-L1+ 세포주 SKOV-3 에서 어세이했다. 결과를 도 9 및 10 에서 나타낸다. 이 실험은 BiXAb-6567 의 ADCC 특성을 부모 항-PD-L1 항체의 ADCC 특성과 비교하였고; 양성 대조군으로서 항-HER2 항체를 이용하였으며, 음성 대조군으로서 항-CD20 항체 및 부모 항-CD38 항체를 이용했다 (SKOV-3 세포가 PD-L1+/HER2+/CD20-/CD38- 이므로). 도 9 및 10 는, IL-12 또는 IL-15 를 NK 세포 배양에 이용했는지 여부에 관계없이, BiXAb-6567 및 부모 항-PD-L1 항체의 강력한 ADCC 활성을 입증한다. IL-12 를 사용한 경우, BiXAb-6567 및 부모 항-PD-L1 항체의 EC50 은 각각 0.007 nM 및 0.03 nM 이었다. IL-15 를 이용한 경우, 프로파일은 더욱더 유사하였으나; 곡선 피팅이 수렴되지 않아, 따라서 EC50 값의 계산이 저지된다. 이들 결과는 PD-L1+ 세포에 대한 BMX-6567 의 강력한 ADCC 활성을 입증하며, 이는 부모 항-PD-L1 항체의 경우와 유사하다.

SEQUENCE LISTING <110> BIOMUNEX Pharmaceuticals <120> Stable bispecific antibodies <130> B2466 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence 1 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Glu Pro Lys Xaa Cys Asp Lys Xaa His Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa 20 25 30 Gly Gly <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence 2 <400> 2 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly 20 25 30 Gly Gly <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence 3 <400> 3 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Gly Gly <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence 4 <400> 4 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Gly 20 25 30 Gly Gly <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence 5 <400> 5 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 20 25 30 Gly Gly <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence 6 <400> 6 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser 20 25 30 Gly Gly <210> 7 <211> 702 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Gln Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Val Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Glu Val 245 250 255 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 260 265 270 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile 275 280 285 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp 290 295 300 Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 305 310 315 320 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 325 330 335 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 340 345 350 Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 355 360 365 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 370 375 380 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 405 410 415 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 420 425 430 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Asp Val Pro Ser Ser Ser Leu 435 440 445 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 450 455 460 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 465 470 475 480 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 485 490 495 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 500 505 510 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 515 520 525 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 530 535 540 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 545 550 555 560 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 565 570 575 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 580 585 590 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 595 600 605 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 610 615 620 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 625 630 635 640 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 645 650 655 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 660 665 670 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 675 680 685 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 690 695 700 <210> 8 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 of daratumumab <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Gln Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Val Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of atezolizumab <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 of atezolizumab <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Asp Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 13 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC daratumumab <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Thr Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Val 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ckappa of daratumumab <400> 17 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Thr Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Val Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 18 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC atezolizumab <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL atezolizumab <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ckappa atezolizumab <400> 20 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 21 Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys

Claims

하기로부터 선택되는 돌연변이된 Fab 단편을 포함하는 단백질 구축물:
a) 하기로 이루어지는 Fab 단편:
- 대상 항체의 VH 및 VL 도메인;
- 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 192 에서 트레오닌 잔기의 아스파르트산 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CH1 도메인 및
- 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 137 에서 아스파라긴 잔기의 라이신 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 114 에서 세린 잔기의 알라닌 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CL 도메인; 및
b) 하기로 이루어지는 Fab 단편:
- 대상 항체의 VH 및 VL 도메인;
- 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 124 에서 류신 잔기의 글루타민 잔기에 의한 치환 및 상기 CH1 도메인의 위치 188 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CH1 도메인; 및
- 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 133 에서 발린 잔기의 트레오닌 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 176 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 CL 도메인.
제 1 항에 있어서, 상이한 CH1 및 CL 도메인을 갖는 적어도 두 개의 Fab 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 단편을 포함하거나, 또는 그것으로 이루어지는 단백질 구축물로서, 각각의 Fab 단편은 상이한 대상 에피토프를 인지하고, 상기 Fab 단편은 임의의 순서로 일렬로 배열되어 있으며, 제 1 Fab 단편의 CH1 도메인의 C-말단 단부는 그 다음의 Fab 단편의 VH 도메인의 N-말단 단부에 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있으며,
적어도 하나의 Fab 단편은 제 1 항에서 정의된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편으로 이루어지며, 바람직하게는 두 개의 Fab 단편은 제 1 항에서 정의된 바와 같은 돌연변이된 Fab 단편인 단백질 구축물.
제 2 항에 있어서, 제 2 항에서 정의된 바와 같은 다중특이적 항원-결합 단편으로 각각 이루어지는, 두 개의 동일한 항원-결합 팔을 갖는 다중특이적 항체인 단백질 구축물.
제 3 항에 있어서, 하기를 포함하는, 면역글로불린-유사 구조를 갖는 단백질 구축물:
- 제 1 항에서 정의된 바와 같은 다중특이적 항원-결합 단편으로 각각 이루어지는 두 개의 동일한 항원-결합 팔;
- 면역글로불린의 이합체화된 CH2 및 CH3 도메인;
- 항원-결합 팔의 CH1 도메인의 C-말단 단부를 CH2 도메인의 N-말단 단부로 연결시키는, IgA, IgG, 또는 IgD 의 힌지 영역.
제 4 항에 있어서, 바람직하게는 이중특이적 항체이고, 적어도 두 개의 중쇄 및 네 개의 경쇄를 포함하는 단백질 구축물로서,
각각의 중쇄는
a. 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하고,
b. 이러한 Fc 영역은 항체 1 (Ab1) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 상기 힌지 도메인에 의해 연결되며,
c. 이는 결국 항체 2 (Ab2) 의 Fab 중쇄 CH1-VH 에 폴리펩티드 링커 서열에 의해 연결되고, 폴리펩티드 링커 서열은 Ab1 의 상기 Fab 중쇄 VH 도메인의 N-말단을 Ab2 의 상기 CH1 도메인의 C-말단과 연결시키고,
네 개의 경쇄는 그들의 동족 중쇄 도메인과 연합되는 Ab1 의 Fab 경쇄 CL-VL 및 Ab2 의 Fab 경쇄 CL-VL 를 포함하며;
Ab1 및 Ab2 는 상이한 에피토프를 인지하고,
Ab1 또는 Ab2 중 하나의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 192 에서 트레오닌 잔기의 아스파르트산 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 137 에서 아스파라긴 잔기의 라이신 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 114 에서 세린 잔기의 알라닌 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고/이거나,
Ab1 또는 Ab2 중 하나 또는 다른 하나의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 124 에서 류신 잔기의 글루타민 잔기에 의한 치환 및 상기 CH1 도메인의 위치 188 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 133 에서 발린 잔기의 트레오닌 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 176 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인인 단백질 구축물.
제 5 항에 있어서, Ab1 의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 192 에서 트레오닌 잔기의 아스파르트산 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 137 에서 아스파라긴 잔기의 라이신 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 114 에서 세린 잔기의 알라닌 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, Ab2 의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 124 에서 류신 잔기의 글루타민 잔기에 의한 치환 및 상기 CH1 도메인의 위치 188 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 133 에서 발린 잔기의 트레오닌 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 176 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인인 단백질 구축물.
제 5 항에 있어서, Ab2 의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 192 에서 트레오닌 잔기의 아스파르트산 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 137 에서 아스파라긴 잔기의 라이신 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 114 에서 세린 잔기의 알라닌 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, Ab1 의 Fab CH1 도메인은 면역글로불린의 CH1 도메인으로부터 상기 CH1 도메인의 위치 124 에서 류신 잔기의 글루타민 잔기에 의한 치환 및 상기 CH1 도메인의 위치 188 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인이고, 동족 CL 도메인은 면역글로불린의 CL 도메인으로부터 상기 CL 도메인의 위치 133 에서 발린 잔기의 트레오닌 잔기에 의한 치환 및 상기 CL 도메인의 위치 176 에서 세린 잔기의 발린 잔기에 의한 치환에 의해 유도되는 돌연변이된 도메인인 단백질 구축물.
제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 링커 서열은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는 단백질 구축물:

여기에서 X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇,X₈, X₉, X₁₀ 은 동일 또는 상이하며, 임의의 아미노산임.
제 8 항에 있어서, 폴리펩티드 링커 서열은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 또는 그것으로 이루어지는 단백질 구축물:
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, EGFR 및 HER2/neu 둘 모두를 인지하는 단백질 구축물.
제 10 항에 있어서, 다중특이적 항체, 바람직하게는 이중특이적 항체인 단백질 구축물로서, Ab1 및 Ab2 는 상이하며, 한편으로는, 세툭시맙 또는 그의 돌연변이된 유도체 및, 다른 한편으로는, 트라스투주맙, 또는 그의 돌연변이된 유도체로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 단백질 구축물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, CD38 및 PD-L1 둘 모두를 인지하는 단백질 구축물.
제 12 항에 있어서, 다중특이적 항체, 바람직하게는 이중특이적 항체인 단백질 구축물로서, Ab1 및 Ab2 는 상이하며, 한편으로는, 다라투무맙 또는 그의 돌연변이된 유도체 및, 다른 한편으로는, 아테졸리주맙, 또는 그의 돌연변이된 유도체로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 단백질 구축물.
제 12 항에 있어서, 하기를 포함하는, 바람직하게는 그것으로 이루어지는 이중특이적 항체인 단백질 구축물:
a) SEQ ID NO: 7 을 각각 포함하는, 바람직하게는 그것으로 이루어지는 두 개의 중쇄 및
b) 두 개의 경쇄는 SEQ ID NO: 15 를 포함하고, 바람직하게는 그것으로 이루어지고, 다른 두 개의 경쇄는 SEQ ID NO: 18 을 포함하는, 바람직하게는 그것으로 이루어지는, 네 개의 경쇄.
제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항원-결합 단편의 중쇄 또는 다중특이적 항체의 중쇄를 포함하는, 바람직하게는 그것으로 이루어지는 폴리펩티드.
제 15 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포.
제 17 항에 있어서, 하기 두 개의 상이한 경쇄를 인코딩하는 적어도 두 개의 폴리뉴클레오티드로 추가로 형질전환된 숙주 세포:
상기 중쇄의 제 1 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 형성하는 제 1 경쇄;
상기 중쇄의 제 2 VH/CH1 영역과 특이적으로 쌍을 형성하는 제 2 경쇄.
제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항원-결합 단편 또는 다중특이적 항체의 생산 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
a) 적합한 배지 및 배양 조건에서 제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체 중쇄, 및 제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 항체 경쇄를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 생산된 항체를 배양 배지로부터 또는 상기 배양된 세포로부터 회수하는 단계.
약제로서 사용하기 위한, 제 2 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 다중특이적 항원-결합 단편 또는 다중특이적 항체.