TW202229354A - 多特異性抗原結合蛋白 - Google Patents

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TW202229354A
TW202229354A TW110145279A TW110145279A TW202229354A TW 202229354 A TW202229354 A TW 202229354A TW 110145279 A TW110145279 A TW 110145279A TW 110145279 A TW110145279 A TW 110145279A TW 202229354 A TW202229354 A TW 202229354A
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姜福偉
王蕾蕾
陳思萌
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Abstract

本揭露關於多特異性抗原結合蛋白。具體而言，本揭露關於在CH1和CL中包含一個或多個胺基酸取代的多特異性抗原結合蛋白，以及包含其的組成物、其製備方法和醫藥用途。本揭露的多特異性抗原結合蛋白有效地減少了輕鏈的錯配。

Description

多特異性抗原結合蛋白
本揭露屬於生物醫藥領域，具體關於多特異性抗原結合蛋白及其製備方法和醫藥用途。
由於可以識別不同的抗原分子或者識別同一抗原分子的不同表位，雙特異性抗體具有單株抗體不具備的獨特生物學功能，並逐漸受到市場的認可。儘管關於雙特異性抗體的相關技術已經發展了二十年，但仍然有很多現實的技術問題制約著雙特異性抗體的生產開發。隨著技術的進步，用來改造和生產雙特異性抗體新型的分子形式和解決策略層出不窮。以1+1非對稱(Fab A+Fab B)雙抗為例，為了避免輕鏈錯配(針對抗原A的輕鏈配對到針對抗原B的重鏈上，或者針對抗原B的輕鏈配對到針對抗原A的重鏈上)，迄今為止多種方法已被報導。
共同輕鏈抗體：有人報導使用體外展示技術或者從具有共同輕鏈的小鼠篩選特異性輕鏈(WO2012067176；WO2013134263)，以配對針對抗原A的重鏈和針對抗原B的重鏈，並維持相對應抗體的原有生物功能。二合一(Two-in-one)抗體：有人報導藉由噬菌體展示和理性設計(WO2010027981)，將與抗原A結合的抗體進行優化，使其保留對抗原A的原有結合能力並具有與抗原B結合的能力，實現一個抗體結合兩種靶 點。以上兩種方法均需要大量的工程化改造，技術難度大，普適性仍有待證明。因此，具有正交特性的Fab(VH/VL或/和CH1/CL相互作用界面)改造近年來越來越受到業內的關注。
IgG/TCR(WO2014014796；WO2019057122)：鑒於TCR恆定區和抗體CH1/CL中的結構相似性，有人報導藉由替換FabA的CH1/CL為TCR的恆定區，以避免潛在的輕鏈錯配問題。Crossmab(WO2012023053)：藉由互換針對某Fab的VH/VL、CH1/CL、或HC/LC，降低輕鏈錯配的可能性。DuetMab(WO2013096291)：在針對抗原A的Fab的CH1/CL引入非天然二硫鍵替換原有二硫鍵，降低輕鏈錯配的可能性。計算機輔助設計：藉由計算機輔助設計(WO2014150973；WO2016172485)，避免輕鏈錯配。
作為新型藥物形式，雙特異性抗體有著特殊結構，製備與產業化也較單株抗體更為困難。雖已有多種方式試圖解決重鏈和輕鏈之間的錯配問題，但由此進行的結構調整可能會改變分子的穩定性、免疫原性或藥動學特徵，仍然需要開發新的技術以提高多特異性抗體(例如雙特異性抗體)的產率。
本揭露藉由在CH1/CL界面中去除天然二硫鍵並引入非天然二硫鍵，或者藉由在CH1/CL界面中引入靜電互補的胺基酸對，或者藉由在CH1/CL界面中去除天然二硫鍵並引入非天然二硫鍵，並同時引入靜電互補的胺基酸對，相對於野生型提高了多特異性抗體輕重鏈的正確配對比例。
本揭露提供了一種二聚化多肽，其包含重鏈恆定區1(CH1)和輕鏈恆定區(CL)，其中，CH1和CL在選自(i-1)至(i-6)的位置中的一組或多組包含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代：
(i-1)CH1的第170位和CL的第164位，
(i-2)CH1的第128位和CL的第121位，
(i-3)CH1的第129位和CL的第121位，
(i-4)CH1的第131位和CL的第119位，
(i-5)CH1的第141位和CL的第135位，和
(i-6)CH1的第171位和CL的第165位。
在本揭露的上下文中，重鏈位置編號根據EU編號系統確定，例如CH1的胺基酸取代的位置是以人IgG1的CH1(SEQ ID NO：88)為基準計數並；輕鏈位置編號根據Kabat編號系統確定，例如CL的胺基酸取代的位置是以人κ輕鏈(IGLC，SEQ ID NO：89)為基準計數。
Figure 110145279-A0202-12-0003-1
(SEQ ID NO：88)
Figure 110145279-A0202-12-0003-2
(SEQ ID NO：89)
所屬技術領域具有通常知識者應理解，IgG1以外的其他IgG亞型如IgG2、IgG3和IgG4在與IgG1 CH1中包含本揭露所述胺基酸突變 的位置相對應的位置上包含相同類型的胺基酸突變也在本揭露的保護範圍內。
在一些實施方案中，CH1和CL之間包含或不包含天然二硫鍵。
在一些實施方案中，CH1保留第220位天然半胱胺酸，CL保留第214位天然半胱胺酸。
在一些實施方案中，CH1第220位的天然半胱胺酸和/或CL的第214位天然半胱胺酸被半胱胺酸以外的胺基酸取代。
在一些實施方案中，CH1包含胺基酸取代C220A，CL包含胺基酸取代C214A。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
(b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
(b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和(b)CH1中的F170C和CL中的T164C。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和(b)CH1中的P171C和CL中的S165C。
在一些實施方案，CH1和CL包含使得CH1和CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代。
在一些實施方案中，使得CH1和CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代位於CH1的第139位和CL的第114位。
在一些實施方案中，CH1第139位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸，CL第114位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸；或者CH1第139位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸，CL第114位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸。
在一些實施方案中，帶正電荷的胺基酸選自K、R和H；帶負電荷的胺基酸選自D和E。
在一些實施方案中，CH1和CL包含選自以下任一組中的胺基酸取代：
(1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
(2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
(3)CH1中的T139K和CL中的S114E；
(4)CH1中的T139K和CL中的S114D；
(5)CH1中的T139D和CL中的S114K；
(6)CH1中的T139D和CL中的S114R；
(7)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
(8)CH1中的T139E和CL中的S114R。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
(b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
(b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)選自以下中的任一組：
(c-1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
(c-2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
(c-3)CH1中的T139K和CL中的S114E；和
(c-4)CH1中的T139K和CL中的S114D。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下組中的至少一組：
(b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)選自以下中的任一組：
(c-1)CH1中的T139D和CL中的S114K；
(c-2)CH1中的T139D和CL中的S114R；
(c-3)CH1中的T139E和CL中的S114K；
(c-4)CH1中的T139E和CL中的S114R。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；(b)CH1中的F170C和CL中的T164C；和(c)CH1中的T139R和CL中的S114E。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；(b)CH1中的F170C和CL中的T164C；和(c)CH1中的T139D和CL中的S114K。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：(a)C220A和C214A；(b)CH1中的P171C和CL中的S165C；和(c)CH1中的T139R和CL中的S114E。
在一些實施方案中，CH1和CL包含以下胺基酸取代：(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；(b)CH1中的P171C和CL中的S165C；和(c)CH1中的T139D和CL中的S114K。
在一些實施方案中，CL來自抗體λ輕鏈(Cλ)或κ輕鏈(Cκ)。
本揭露提供了一種抗原結合蛋白，其包含上述二聚化多肽。
在一些實施方案中，抗原結合蛋白包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含Fab，該Fab包含第一重鏈可變區VH1、第一輕鏈可變區VL1和該二聚化多肽，該二聚化多肽中該CH1為第一CH1，該CL為第一CL；VH1與第一CH1直接連接或藉由接頭連接，VL1與第一CL直接連接或藉由接頭連接。在一些實施方案中，VH1的C端與第一CH1的 N端直接連接或藉由接頭連接，VL1的C端與第一CL的N端直接連接或藉由接頭連接。
在一些實施方案中，接頭是肽接頭。在一些實施方案中，肽接頭是具有長度為至少5個胺基酸的胺基酸序列的肽，在一個實施方案中，長度為5至100，在進一步的實施方案中為10至50個胺基酸。在一個實施方案中，該肽接頭是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸和(x=3，n=3、4、5或6、和m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5和m=0、1、2或3)。在一個實施方案中x=4和n=3或4。在一個實施方案中，該肽接頭是(G4S)4。
在一些實施方案中，抗原結合蛋白包含第一抗原結合域和第二抗原結合域，其中該第二抗原結合域包含第二重鏈可變區VH2和第二輕鏈可變區VL2，並且該第一抗原結合域和第二抗原結合域結合不同的抗原或者結合同一種抗原上的不同的表位；在一些實施方案中，該第二抗原結合域包含Fab。該Fab包含第二重鏈可變區VH2、第二重鏈恆定區1(第二CH1)、第二輕鏈可變區VL2和第二輕鏈恆定區(第二CL2)。在一些實施方案中，VH2的C端與第二CH1的N端直接連接或藉由接頭連接，VL2的C端與第二CL的N端直接連接或藉由接頭連接。
在一些實施方案中，第二CH1和第二CL中不包含選自以下的一組或多組天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代：
(i-1)第二CH1的第170位和第二CL的第164位，
(i-2)第二CH1的第128位和第二CL的第121位，
(i-3)第二CH1的第129位和第二CL的第121位，
(i-4)第二CH1的第131位和第二CL的第119位，
(i-5)第二CH1的第141位和第二CL的第135位，和
(i-6)第二CH1的第171位和第二CL的第165位。
在本揭露的上下文中，重鏈位置編號根據EU編號系統確定，例如CH1的胺基酸取代的位置是以人IgG1的CH1(SEQ ID NO：88)為基準計數並；輕鏈位置編號根據Kabat編號系統確定，例如CL的胺基酸取代的位置是以人κ輕鏈(IGLC，SEQ ID NO：89)為基準計數。
Figure 110145279-A0202-12-0009-3
(SEQ ID NO：88)
Figure 110145279-A0202-12-0009-4
(SEQ ID NO：89)
所屬技術領域具有通常知識者應理解，IgG1以外的其他IgG亞型如IgG2、IgG3和IgG4在與IgG1 CH1中包含本揭露所述胺基酸突變的位置相對應的位置上包含相同類型的胺基酸突變也在本揭露的保護範圍內。
在一些實施方案中，第二CH1和第二CL中不含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代。
在一些實施方案中，第二CH1和第二CL中保留天然半胱胺酸220C和214C。
在一些實施方案中，第二CH1和第二CL中不含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代，且保留天然半胱胺酸220C和214C。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
(b)選自以下組中的至少一組：
(b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；
並且第二CH1和第二CL中不含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代，且保留天然半胱胺酸220C和214C。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
(b)CH1中的F170C和CL中的T164C；
並且第二CH1和第二CL中不含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代，且保留天然半胱胺酸220C和214C。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和(b)CH1中的P171C和CL中的S165C；並且第二CH1和第二CL中不含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代，且保留天然半胱胺酸220C和214C。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含使得第一CH1和第一CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代；和/或
第二CH1和第二CL包含使得第二CH1和第二CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代。
在一些實施方案中，第一CH1和第二CH1中用於形成靜電相互作用界面的胺基酸的帶電性相反，且第一CL和第二CL中用於形成靜電相互作用界面的胺基酸的帶電性相反。
在一些實施方案中，使得第一CH1和第一CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代位於第一CH1的第139位和第一CL的第114位；和/或
使得第二CH1和第二CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代位於第二CH1的第139位和第二CL的第114位。
在一些實施方案中，第一CH1的第139位和第二CH1的第139位分別被帶相反電荷的胺基酸取代，且第一CL的第114位和第二CL的第114位分別被帶相反電荷的胺基酸取代。
在一些實施方案中，第一CH1第139位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸，第一CL第114位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸；或者第一CH1第139位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸，第一CL第114位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸；和/或
第二CH1第139位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸，第二CL第114位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸；或者第二CH1第139位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸，第二CL第114位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸。
在一些實施方案中，帶正電荷的胺基酸選自K、R和H；帶負電荷的胺基酸選自D和E。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含選自以下任一組的胺基酸取代：
(1)CH1中的T139R和CL中的S114E；CH1中的T139R和CL中的S114D；CH1中的T139K和CL中的S114E；CH1中的T139K和CL中的S114D；CH1中的T139D和CL中的S114K；CH1中的T139D和CL中的S114R；CH1中的T139E和CL中的S114K；和CH1中的T139E和CL中的S114R；和/或
第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：CH1中的T139R和CL中的S114E；CH1中的T139R和CL中的S114D；CH1中的T139K和CL中的S114E；CH1中的T139K和CL中的S114D；CH1中的T139D和CL中的S114K；CH1中的T139D和CL中的S114R；CH1中的T139E和CL中的S114K；和CH1中的T139E和CL中的S114R。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含選自以下的胺基酸取代：CH1中的T139R和CL中的S114E；CH1中的T139R和CL中的S114D；CH1中的T139K和CL中的S114E；CH1中的T139K和CL中的S114D；和/或
第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：CH1中的T139D和CL中的S114K；CH1中的T139D和CL中的S114R；CH1中的T139E和CL中的S114K；和CH1中的T139E和CL中的S114R。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含選自以下的胺基酸取代：CH1中的T139D和CL中的S114K；CH1中的T139D和CL中的S114R；CH1中的T139E和CL中的S114K；和CH1中的T139E和CL中的S114R；和/或
第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：CH1中的T139R和CL中的S114E；CH1中的T139R和CL中的S114D；CH1中的T139K和CL中的S114E；CH1中的T139K和CL中的S114D。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下中的至少一組：CH1中的F170C和CL中的T164C；CH1中的L128C和CL中的S121C；CH1中的A129C和CL中的S121C；CH1中的S131C和CL中的P119C；CH1中的A141C和CL中的L135C；和CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)選自以下中的一組：CH1中的T139R和CL中的S114E；CH1中的T139R和CL中的S114D；CH1中的T139K和CL中的S114E；CH1中的T139K和CL中的S114D；
並且第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：CH1中的T139D和CL中的S114K；CH1中的T139D和CL中的S114R；CH1中的T139E和CL中的S114K；和CH1中的T139E和CL中的S114R。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下中的至少一組：CH1中的F170C和CL中的T164C；CH1中的L128C和CL中的S121C；CH1中的A129C和CL中的S121C；CH1中的S131C和CL中的P119C；CH1中的A141C和CL中的L135C；和CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)選自以下中的一組：CH1中的T139D和CL中的S114K；CH1中的T139D和CL中的S114R；CH1中的T139E和CL中的S114K；CH1中的T139E和CL中的S114R；
並且第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：CH1中的T139R和CL中的S114E；CH1中的T139R和CL中的S114D；CH1中的T139K和CL中的S114E；和CH1中的T139K和CL中的S114D。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)CH1中的F170C和CL中的T164C；和
(c)CH1中的T139R和CL中的S114E；
並且第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：CH1中的T139D和CL中的S114K。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)CH1中的F170C和CL中的T164C；和
(c)CH1中的T139D和CL中的S114K；
並且第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：CH1中的T139R和CL中的S114E。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)CH1中的T139R和CL中的S114E；
並且第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：CH1中的T139D和CL中的S114K。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)CH1中的T139D和CL中的S114K；
並且第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：CH1中的T139R和CL中的S114E。
在一些實施方案中，當第一CH1和第一CL中包含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代時，第二CH1和第二CL中不含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代，且保留天然半胱胺酸CH1中的220C和CL中的214C。
在一些實施方案中，第一CL來自抗體κ輕鏈(Cκ)；第二CL來自抗體λ輕鏈(Cλ)或κ輕鏈(Cκ)。在一些實施方案中，第一CL來自κ輕鏈且第二CL來自λ輕鏈。
在一些實施方案中，抗原結合蛋白還包含Fc區，該Fc區包含能夠彼此締合的第一亞基Fc1與第二亞基Fc2。在一些實施方案中，Fc區選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc，例如人IgG1的Fc。
在一些實施方案中，Fc1和Fc2中包含這樣的胺基酸取代，使得與Fc1相比，Fc1優先與Fc2配對(或使得優先形成異源二聚體)，例如Fc1和Fc2在CH3域中包含這樣的胺基酸取代。在一些實施方案中，Fc1和Fc2中的胺基酸取代產生比不含該取代的野生型更大的靜電互補性。 測量蛋白質/蛋白質界面處的靜電互補性的方法為本領域已知，並描述於例如McCoy等(1997)J Mol Biol 268,570-584；Lee等，(2001)Protein Sci.10,362-377；和Chau等(1994)J Comp Mol Des8,51325中。在一些實施方案中，Fc1和Fc2中的胺基酸取代產生比不含該取代的野生型更大的空間互補性。測量蛋白質/蛋白質界面處的靜電互補性的方法為本領域已知，並描述於例如Lawrence等(1993)J Mol Biol 234,946-950；Walls等(1992)J Mol Biol228,277-297；和Schueler-Furman等(2005)Proteins 60,187-194中。術語“互補性”指例如本文該抗原結合蛋白的CH1和CL(或CH3和CH3)的界面處影響重鏈/輕鏈配對的相互作用的組合。“空間互補性”或“構象互補性”指例如CH1和CL(或CH3和CH3)的相互作用表面處的三維結構的相容性。“靜電互補性”指在例如CH1和CL(或CH3和CH3)的相互作用表面處放置帶負電荷和/或正電荷原子的相容性。
在一些實施方案中，在Fc1和Fc2中，例如在CH3/CH3界面內，用一個或多個具有更大側鏈體積的胺基酸殘基取代Fc1的CH3域中的一個或多個胺基酸殘基，從而在Fc1的CH3域表面產生凸起(或杵，Knob)，Fc2的CH3域中與Fc1的CH3域相互作用的一個或多個、較佳兩個或三個胺基酸殘基，用具有小側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在與Fc1的CH3域相互作用的Fc2的CH3域表面產生凹陷(或臼，Hole)。在一些實施方案中，改變Fc1和Fc2(例如本文該實施方案中任意個的Fc1和Fc2)的CH3域，使得在界面內，用等同數目的具有更大側鏈體積的胺基酸殘基取代Fc2的CH3域中的一個或兩個胺基酸殘基，從而在Fc2的CH3域的界面內產生可放置在Fc1的CH3域表面內的凹陷(或臼)的凸起(或杵)，改變Fc1的CH3域，使得在與Fc2的CH3域界面接觸的Fc2的CH3域表面內，用等同數目的具有更小側鏈體積的胺基酸殘基取代兩個或三個胺基酸 殘基，從而在與Fc1的CH3域界面內產生可以放置Fc2的CH3域界面內的凸起的凹陷。在一些實施方案中，具有更大側鏈體積的輸入殘基是苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、精胺酸(R)或色胺酸(W)。在一些實施方案中，該凸起或杵突變包含用色胺酸取代366位蘇胺酸，胺基酸編號按照Kabat等(Sequences of proteins ofimmunological interest，第5版，第1卷(1991；NIH,Bethesda,MD)中的688-696頁)的EU編號方案。在一些實施方案中，具有更小側鏈體積的輸入殘基是絲胺酸(S)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)或蘇胺酸(T)。在一個實施方案中，含有凹陷的CH3域包含取代選自蘇胺酸、亮胺酸和酪胺酸的兩個或多個原胺基酸。在一些實施方案中，含有凹陷的CH3域包含選自丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸和纈胺酸的兩個或多個輸入殘基。在一些實施方案中，杵突變修飾是T366W，臼突變修飾是T366S、L368A和Y407V中的至少一個或至少兩個。在一些實施方案中，杵突變修飾是T366W，臼突變修飾是T366S、L368A和Y407V。
在本揭露的上下文中，Fc的胺基酸取代的位置是根據EU編號系統確定的，例如以人IgG1的Fc為基準計數。
在一些實施方案中，Fc1和Fc2中，例如CH3中可以包含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的取代，例如在Fc1中包含S354C，Fc2中包含Y349C；或Fc1中包含Y349C，Fc2中包含S354C。
在一些實施方案中，Fc1和/或該Fc2包含改變該抗原結合蛋白的半衰期的修飾，其中該半衰期取決於FcRn結合親和力。
在一些實施方案中，Fc1和/或該Fc2包含改變效應子功能的修飾，其中對Fcγ受體或C1q補體蛋白的結合親和力增大或減小。
在一些實施方案中，Fc1和Fc2中，例如在Fc1 CH3/Fc2 CH3界面內，包含一組或更多組選自以下的胺基酸取代：
(1)T366Y/Y407T；
(2)T366W/Y407A；
(3)T366Y/Y407T；
(4)T394W/F405A；
(5)T366Y/F405AT394W/Y407T；
(6)T366W/F405WT394S/Y407A；
(7)F405W/T394S；
(8)D399C/K392C；
(9)T366W/T366S/L368A/Y407V；
(10)T366W/D399C/T366S/L368A/K392C/Y407V；
(11)T366W/K392C/T366S/D399C/L368A/Y407V；
(12)S354C/T366W/Y349C/T366S/L368A/Y407V；
(13)Y349C/T366W/S354C/T366S/L368A/Y407V；
(14)E356C/T366W/Y349C/T366S/L368A/Y407V；
(15)Y349C/T366W/E356C/T366S/L368A/Y407V；
(16)E357C/T366W/Y349C/T366S/L368A/Y407V；和
(17)Y349C/T366W/E357C/T366S/L368A/Y407V。
在一些實施方案中，該Fc1中包含選自T366S、L368A和Y407V中的至少一個或至少兩個胺基酸取代，該Fc2中包含T366W；或者該Fc1中包含T366W，該Fc2中包含選自T366S、L368A和Y407V中的至少一個或至少兩個胺基酸取代。
在一些實施方案中，該Fc1中包含胺基酸取代T366S、L368A和Y407V，該Fc2中包含T366W；或者該Fc1中包含T366W，該Fc2中包含胺基酸取代T366S、L368A和Y407V。
在一些實施方案中，Fc1和Fc2中還包含使得Fc1和Fc2(例如CH3和CH3)之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代。形成靜電相互作用界面的胺基酸取代可以為選自以下的一組或更多組：
(1)K370E/D399K/K439D/D356K/E357K/K409D；
(2)K409D/D399K；
(3)K409E/D399K；
(4)K409E/D399R；
(5)K409D/D399R；
(6)D339K/E356K；
(7)D399K/E356K/K409D/K392D；
(8)D399K/E356K/K409D/K439D；
(9)D399K/E357K/K409D/K370D；
(10)D399K/E356K/E357K/K409D/K392D/K370D；
(11)D399K/E357K/K409D/K392D；
(12)K392D/K409D/D399K；和
(13)K409D/K360D/D399K。
在一些實施方案中，Fc1和/或Fc2中包含來自不同抗體亞型的結構域，例如來自不同抗體亞型CH3。例如，戴維斯等人(2010，蛋白質工程設計與選擇23：195-202)描述了使用鏈交換工程化結構域(SEED)CH3區的一個異二聚體的Fc平臺，該CH3區是人IgG和IgA CH3結構域的衍生物(還參見WO 2007/110205)。
在一些實施方案中，Fc1和/或Fc2，例如CH3中，包含用於改變效應子功能的胺基酸取代。“效應子功能”指可歸因於抗體的Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)且隨抗體同種型而變的那些生物活 性。抗體效應子功能的實例包括：C1q結合和依賴補體的細胞毒性、Fc受體結合、依賴抗體的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體)的下調和B細胞激活。改變效應子功能的胺基酸取代選自以下中的一組或更多組：
(1)S298A/E333A/K334A；
(2)S239D/I332E/A330L；
(3)S239D/I332E/G236A；
(4)G236A/S239D/A330L/I332E；
(5)F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L；
(6)K326A/E333A；
(7)K326W/E333S；
(8)K326M/E333S；
(9)C221D/D222C；
(10)S267E/H268F/S324T；
(11)E345R；
(12)S298A/E333A/K334A/N434A；
(13)E294缺失/T307P/N434Y；
(14)T256N/A378V/S383N/N434Y；
(15)T252L/T253S/T254F；
(16)M252Y/S254T/T256E；
(17)M428L/N434S；
(18)L234A/L235A；
(19)S228P/L235E；
(20)L234A/L235A/P331S；
(21)L234A/L235A/P329G；
(22)D265A/E233P；
(23)H268Q/V309L/A330S/P331S；
(24)V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A300S/P331S；
(25)L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/V309L/A300S/P331S；
(26)S228P/F234A/L235A；
(27)D270A/P329A；
(28)L234F/L235E；
(29)L234F/L235E/P331S；
(30)F241A/V264A/D265A；
(31)N297G/D265A；和
(32)L234Y/G236W/S298A。
在一些實施方案中，該Fc1和/或該Fc2包含胺基酸取代L234A和L235A，或者包含胺基酸取代L234F和L235E。
在一些實施方案中，Fc1和/或Fc2，例如CH3中包含一個或多個異同種異型突變。在一些實施方案中，異同種異型突變是D356E和L358M。
在一些實施方案中，Fc1和Fc2，例如CH3中，包含用於改變半衰期的胺基酸取代。半衰期的增大可以允許減少給予患者的藥物的量並且降低給藥頻率。因此，在此的具有增大的半衰期的抗體可以藉由修飾(例如，取代、缺失或添加)鑒別為Fc與FcRn受體之間的相互作用中所涉及的胺基酸殘基來產生(U.S.7,083,784)。在一些方面，IgG1同型抗體的位置252處的一個甲硫胺酸、和/或位置254處的一個絲胺酸、和/或位置256處的一個蘇胺酸可以分別被改變為酪胺酸、蘇胺酸以及谷胺酸，這樣使得 所得抗體包括酪胺酸-252、蘇胺酸-254以及谷胺酸-256(即，M252Y、S254T、T256E)。IgG1抗體的這種Fc區包括一個YTE修飾並且在IgG2、IgG3以及IgG4抗體中，對應位置可以進行類似地修飾。另外，在此的抗體的半衰期可以藉由本領域中已知的技術藉由軛合至PEG或白蛋白而增大。在一些方面，用於增加異二聚體形成的Fc修飾可以與以下相組合：用於改變抗體的半衰期的其他修飾，包括但不限於M252Y和/或S254T和/或T256E；和/或用於改變效應子功能和/或改變與一個或多個Fc配體的結合的其他已知的Fc修飾，包括在此描述的那些。
在一些實施方案中，本揭露提供的抗原結合蛋白包含第一重鏈、第一輕鏈、第二重鏈和第二輕鏈，其中，
該第一重鏈從N端至C端依次為：[VH1]-[第一CH1]-[Fc1]，
該第一輕鏈從N端至C端依次為：[VL1]-[第一CL]，
該第二重鏈從N端至C端依次為：[VH2]-[第二CH1]-[Fc2]，
該第二輕鏈從N端至C端依次為：[VL2]-[第二CL]。
在一些實施方案中，本揭露提供的抗原結合蛋白包含重鏈、第一輕鏈和第二輕鏈，其中，
該重鏈從N端至C端依次為：[VH1]-[第一CH1]-[Fc1]-[接頭]-[VH2]-[第二CH1]；
該第一輕鏈從N端至C端依次為：[VL1]-[第一CL]，
該第二輕鏈從N端至C端依次為：[VL2]-[第二CL]。
在一些實施方案中，本揭露提供的抗原結合蛋白包含第一重鏈、第一輕鏈、第二重鏈和第二輕鏈，其中，
該第一重鏈從N端至C端依次為：[VH1]-[第一CH1]-[Fc1]-[接頭]-[VH2]-[第二CH1]；
該第一輕鏈從N端至C端依次為：[VL1]-[第一CL]，
該第二重鏈從N端至C端依次為：[VH1]-[第一CH1]-[Fc2]-[接頭]-[VH2]-[第二CH1]；
該第二輕鏈從N端至C端依次為：[VL2]-[第二CL]。
在一些實施方案中，該第一抗原結合域和/或該第二抗原結合域結合的抗原分別包括但不限於：PD-1；PD-L1；CTLA-4；LAG-3；OX40；GTIR；A2AR；B7-H3(CD276)；B7-H3；B7-H4；IDO；KIR；Tim-3；LAG-3；4-1BB(CD137)；BAFF；葉酸受體1；TEM1；CCR4；VISTA；ICOS；IFN-γ；TGF-B；EGFR；Erb(ErbB1；ErbB3；ErbB4)；HER2；TNF-α；TNF-β；TNF-γ；TNF-受體；BCMA；RANK；VEGF-A；VEGF-B；VEGFR；ROR1；BTLA；2B4；TIGIT；c-Met；GITR；FAP；PVRIG；BCMA；CAIX；CEA；EGP2；EGP-40；TROP-2；EpCAM；葉酸結合蛋白(FBP)；胎兒乙醯膽鹼受體(AChR)；神經節苷脂G2(GD2)；神經節苷脂G3(GD3)；人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)；Lewis A(CA 1.9.9)；Lewis Y(LeY)；GPC3；L1CAM；NG2D配體；癌胚抗原(h5T4)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；TAG-72；CLDN18.2；腎母細胞瘤蛋白(WT-1)；ROR1；黏蛋白家族成員(例如MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19和MUC20)；白介素及其受體(例如IL-1；IL-1α；IL-1β；IL-2；IL-2R；IL-3；IL-4；IL-5；IL-4；IL-4R；IL-6；IL-6R；IL-7；IL-8；IL-9；IL-11；IL-12；IL-12β；IL-13；IL13Rα2；IL-15；IL-15R；IL-17；IL-18；IL-23；IL-23α)；白細胞分化抗原(例如CD3；CD4；CD5；CD6；CD7；CD8；CD10；CD14；CD15；CD19；CD20；CD21；CD22；CD23；CD24；CD25；CD26；CD27； CD28；CD30；CD33；CD34；CD36；CD37；CD38；CD40；CD41；CD44；CD45；CD46；CD47；CD51；CD52；CD53；CD54；CD56；CD66；CD70；CD74；CD79a/CD79b；CD80；CD92；CD103；CD122；CD123；CD126；CD133；CD138；CD147；CD148；CD150；CD152；CD171；CD261；CD262；CD317；CD362)；CA125；間皮素；干擾素A/B受體；HLA-DR；RTN4；VWF；MCP-1；EGFR；IGF-1R；TRAIL-R2；胰島素樣生長因子1受體；DLL4；ILGF2；SLAMF7；TWEAKR；CD54；干擾素受體；整聯蛋白Avβ3；HNGF；HGF；TYRP1；IGF-1；Cldn18.2；選擇素P；SDC1；PDCD1；CFD；乙肝表面抗原；IGHE；KIR2D；TAG-72；CSF2；RON；血管生成素2；CDK4；CEACAM5/CEACAM6；CO17-1A；CO-43(血型Leb)；CO-514(血型Lea)；CTA-1；細胞角蛋白8；D1.1；D156-22；DR5；GAGE(GAGE-1；GAGE-2)；GICA 19-9；gp100；Gp37(人白細胞T細胞抗原)；gp75(黑色素瘤抗原)；gpA33；HMFG(人乳脂肪球抗原)；人乳頭瘤病毒-E6/人乳頭瘤病毒-E7；HMW-MAA(高分子量黑色素瘤抗原)；I抗原；整聯蛋白β6；KID3；KID31；KS1/4全抗原；L6和L20(人肺癌抗原)；LEA；LUCA-2；M18；M39；MAGE(MAGE-1；MAGE-3)；MART；Myl；N-乙醯葡糖胺基轉移酶；擬糖蛋白；NS-10；OFA-1；OFA-2；致癌蛋白M；p15；p97；PEM(多態上皮黏蛋白)；PEMA(多態上皮黏蛋白抗原)；PIPA；PSA(前列腺特異性抗原)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；黑素瘤中發現的R24；階段特異性胚胎抗原(例如SSEA-1；SSEA-3；SSEA-4)；T5A7；TAG-72；TL5(血型A)；TRA-1-85(血型H)；轉鐵蛋白受體；C型凝集素樣分子-1(CLL-1或CLECL1)；δ樣3(DLL3)；表皮生長因子受體變體III(EGFRvlll)；n抗原((Tn Ag)或(GaINAcu-Ser/Thr))；Fms樣酪胺酸激酶3(FLT3)；蛋白酶絲胺酸21(Testisin或PRSS21)；PDGFR-β；神經細胞黏 附分子(NCAM)；突變的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；蛋白酶體(Prosome，Macropain)亞基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由斷點簇區(BCR)和Alelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(AB1)組成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪胺酸酶；肝配蛋白A型受體2(EphA2)；岩藻糖基GM1；轉穀胺醯胺酶5(TGS5)；STEAP1；Claudin 6；促甲狀腺激素受體(TSHR)；CXORF61；ALK；聚唾液酸；PLAC1；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒細胞受體1(HAVCR1)；腎上腺素受體β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶聯受體20(GPR20)；LY6K；OR51E2；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)；黑素瘤相關抗原1(MAGE-A1)；ETV6-AML；SPA17；XAGE1；Tie2；MAD-CT-1；MAD-CT-2；FOS相關抗原1；腫瘤蛋白質p53(p53)；p53突變體；PCTA-1；hTERT；細胞凋亡的黑素瘤抑制劑(ML-IAP)；PAX3；雄激素受體；細胞週期蛋白B1；MYCN；RhoC；TRP-2；CYP1B1；SART3；PAX5；淋巴細胞特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；RAGE-1；RU1；RU2；HPV E6；HPV E7；LAIR1；LILRA2；骨髓基質細胞抗原2(BST2)；含有EGF樣模塊黏蛋白樣激素受體樣2(EMR2)；淋巴細胞抗原75(LY75)；磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受體樣5(FCRL5)；免疫球蛋白λ樣多肽1(IGLL1)。
在一些實施方案中，該第一抗原結合域特異性結合CTLA-4，該第二抗原結合域特異性結合PD-1，或者，該第一抗原結合域特異性結合PD-1，該第二抗原結合域特異性結合CTLA-4。
在一些實施方案中，第一抗原結合域包含重鏈可變區VH1和輕鏈可變區VL1，第二抗原結合域包含重鏈可變區VH2和輕鏈可變區VL2；其中該VH1包含：序列如SEQ ID NO：51所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：52所示的HCDR2，和序列如SEQ ID NO：53所示的HCDR3， 該VL1包含序列如SEQ ID NO：54所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：55所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：56所示的LCDR3；和/或該VH2包含：序列如SEQ ID NO：43所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：44所示的HCDR2，和序列如SEQ ID NO：45所示的HCDR3，該VL2包含序列如SEQ ID NO：46所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：47所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：48所示的LCDR3。
在一些實施方案中，該VH1為序列如SEQ ID NO：57所示的重鏈可變區，該VL1為序列如SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區；和/或該VH2為序列如SEQ ID NO：49所示的重鏈可變區，該VL2為序列如SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：18所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：17所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：12所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：13所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：19所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：20所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：12所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：13所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：21所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：22所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：12所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：13所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：15所示的第一輕 鏈，序列如SEQ ID NO：23所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：9所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：15所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：24所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：9所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：15所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：25所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：10所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：15所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：26所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：8所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：27所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：12所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：13所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：28所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：29所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：12所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：13所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：27所示的第一輕 鏈，序列如SEQ ID NO：25所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：10所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：15所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：31所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：32所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：19所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：20所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：12所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：30所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：35所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：36所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：33所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：34所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：14所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：15所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：25所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：10所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：45所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：46所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：37所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：38所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：41所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：42所示的第一輕 鏈，序列如SEQ ID NO：39所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：40所示的第二輕鏈。
在一些實施方案中，該第一抗原結合域特異性結合CD40，和/或該第二抗原結合域特異性結合FAP。
在一些實施方案中，第一抗原結合域包含重鏈可變區VH1和輕鏈可變區VL1，第二抗原結合域包含重鏈可變區VH2和輕鏈可變區VL2；其中該VH1包含：序列如SEQ ID NO：73所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：74所示的HCDR2，和序列為RDY的HCDR3，該VL1包含序列如SEQ ID NO：75所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：76所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：77所示的LCDR3；和/或該VH2包含：序列如SEQ ID NO：80所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：81所示的HCDR2，和序列如SEQ ID NO：82所示的HCDR3，該VL2包含序列如SEQ ID NO：83所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：84所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：85所示的LCDR3。
在一些實施方案中，該VH1為序列如SEQ ID NO：78所示的重鏈可變區，該VL1為序列如SEQ ID NO：79所示的輕鏈可變區；和/或該VH2為序列如SEQ ID NO：86所示的重鏈可變區，該VL2為序列如SEQ ID NO：87所示的輕鏈可變區。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：67所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：68所示的第一輕鏈，和序列如SEQ ID NO：69所示的第二輕鏈。
在一個實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：70所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：71所示的第一輕鏈，和序列如SEQ ID NO：72所示的第二輕鏈。
在一些實施方案中，該第一抗原結合域特異性結合和該第二抗原結合域特異性分別結合PSMA的不同表位。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：59所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：60所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：61所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：62所示的第二輕鏈。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白包含：序列如SEQ ID NO：63所示的第一重鏈，序列如SEQ ID NO：64所示的第一輕鏈，序列如SEQ ID NO：65所示的第二重鏈，和序列如SEQ ID NO：66所示的第二輕鏈。
本揭露提供了一種PD-1/CTLA-4雙特異性抗體，其包含：
(i)包含第一輕鏈和第一重鏈的PD-1抗原結合域，其中該第一重鏈的CH1和第一輕鏈的CL中包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下組中的至少一組：
(b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)選自以下組中的任一組：
(c-1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
(c-2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
(c-3)CH1中的T139K和CL中的S114E；
(c-4)CH1中的T139K和CL中的S114D；
和
(ii)包含第二輕鏈和第二重鏈的CTLA-4抗原結合域，其中並且第二重鏈的CH1和第二輕鏈的CL中包含選自以下任一組的胺基酸取代：
(1)CH1中的T139D和CL中的S114K；
(2)CH1中的T139D和CL中的S114R；
(3)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
(4)CH1中的T139E和CL中的S114R。
本揭露提供了一種PD-1/CTLA-4雙特異性抗體，其包含：
(i)包含第一輕鏈和第一重鏈的PD-1抗原結合域，其中第一重鏈的CH1和第一輕鏈的CL中包含選自以下任一組的胺基酸取代：
(1)CH1中的T139D和CL中的S114K；
(2)CH1中的T139D和CL中的S114R；
(3)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
(4)CH1中的T139E和CL中的S114R；
和
(ii)包含第二輕鏈和第二重鏈的CTLA-4抗原結合域，其中並且第二重鏈的CH1和第二輕鏈的CL中包含以下的胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下組中的至少一組胺基酸取代：
(b-1)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
(c)選自以下組中的任一組的胺基酸取代：
(1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
(2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
(3)CH1中的T139K和CL中的S114E；和
(4)CH1中的T139K和CL中的S114D。
本揭露提供了一種FAP/CD40雙特異性抗體，其包含：
(i)包含第一輕鏈和第一重鏈的CD40抗原結合域，其中第一重鏈的CH1和第一輕鏈的CL中包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
(b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；
和
(ii)包含第二輕鏈和第二重鏈的FAP抗原結合域。
本揭露提供了一種FAP/CD40雙特異性抗體，其包含：
(i)包含第一輕鏈和第一重鏈的CD40抗原結合域；
和
(ii)包含第二輕鏈和第二重鏈的FAP抗原結合域；其中第二重鏈的CH1和第二輕鏈的CL中包含以下胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
(b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C。
在一些實施方案中，第一重鏈與第二重鏈藉由接頭連接。在一些實施方案中，肽接頭是具有長度為至少5個胺基酸的胺基酸序列的肽，在一個實施方案中，長度為5至100，在進一步的實施方案中為10至50個胺基酸。在一個實施方案中，該肽接頭是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸和(x=3，n=3、4、5或6、和m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5和m=0、1、2或3)。在一個實施方案中x=4和n=3或4。在一個實施方案中，該肽接頭是(G4S)4。
本揭露提供了一種結合PSMA雙表位的抗體，其包含：
(i)結合第一表位的第一輕鏈和第一重鏈，其中第二重鏈的CH1和第二輕鏈的CL中包含以下的胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
(b-1)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；
和
(ii)結合第二表位的第二輕鏈和第二重鏈。
本揭露提供了一種結合PSMA的雙表位抗體，其包含：
(i)結合第一表位的第一輕鏈和第一重鏈；和
(ii)結合第二表位的第二輕鏈和第二重鏈，其中第二重鏈的CH1和第二輕鏈的CL中包含以下的胺基酸取代：
(a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
(b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
(b-1)CH1中的S131C和CL中的P119C；
(b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
(b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
(b-4)CH1中的F170C和CL中的T164C；
(b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
(b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C。
本揭露提供了一種抗原結合蛋白，其包含：
(i)第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含多肽H1和多肽L1，該多肽H1包含與第一VH連接的第一CH1，該多肽L1包含與第一VL連接的第一CL，其中，第一CH1和第一CL在選自(i-1)至(i-6)的位置中的一組或多組包含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代：
(i-1)第一CH1的第170位和第一CL的第164位，
(i-2)第一CH1的第128位和第一CL的第121位，
(i-3)第一CH1的第129位和第一CL的第121位，
(i-4)第一CH1的第131位和第一CL的第119位，
(i-5)第一CH1的第141位和第一CL的第135位，和
(i-6)第一CH1的第171位和第一CL的第165位；
和
(ii)第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含多肽H2和多肽L2，該多肽H2包含與第二VH連接的第二CH1，該多肽L2包含與第二VL連接的第二CL。
在一些實施方案中，多肽H1包含與第一重鏈可變區VH1連接的第一CH1；多肽L1包含與第一輕鏈可變區VL1連接的第一CL。
在一些實施方案中，多肽H1從N端至C端依次包含VH1和第一CH1；多肽L1從N端至C端依次包含VL1和第一CL。
在一些實施方案中，多肽H1從N端至C端依次包含VH1、第一CH1和Fc1；多肽L1從N端至C端依次包含VL1和第一CL。
在一些實施方案中，多肽H1是第一重鏈，多肽L1是第一輕鏈。
在一些實施方案中，多肽H2包含與第二重鏈可變區VH2連接的第二CH1；多肽L2包含與第二輕鏈可變區VL2連接的第二CL。
在一些實施方案中，多肽H2從N端至C端依次包含VH2和第二CH1；多肽L2從N端至C端依次包含VL2和第二CL。
在一些實施方案中，多肽H2從N端至C端依次包含VH2、第二CH1和Fc2；多肽L2從N端至C端依次包含VL2和第二CL。
在一些實施方案中，多肽H2是第二重鏈，多肽L2是第二輕鏈。
在一些實施方案中，多肽H1和多肽H2可以藉由接頭連接。在一些實施方案中，藉由接頭連接的多肽H1和多肽H2從N端至C端依次為[VH1]-[第一CH1]-Fc1-[接頭]-[VH2]-[第二CH1]。
在一些實施方案中，第一CH1、第一CL、第二CH1和第二CL如上所定義。
在一些實施方案中，多肽L1是抗體輕鏈，例如人IgG抗體輕鏈，其是κ輕鏈(Cκ)；多肽L2是抗體輕鏈，例如人IgG抗體輕鏈，其可以是λ輕鏈(Cλ)或κ輕鏈(Cκ)。在一些實施方案中，多肽L1是κ輕鏈且多肽L2是λ輕鏈。
在一些實施方案中，該多肽H1包含Fc1，該多肽H2包含Fc2，該Fc1和/或該Fc2選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc，例如人IgG1的Fc。
在一些實施方案中，Fc1和Fc2是如上所定義的經改造的、或經胺基酸修飾或取代的。
在一些實施方案中，Fc1和/或該Fc2包含改變該抗原結合蛋白的半衰期的修飾，其中該半衰期取決於FcRn結合親和力。
在一些實施方案中，Fc1和/或該Fc2包含改變效應子功能的修飾，其中對Fcγ受體或C1q補體蛋白的結合親和力增大或減小。
在一些實施方案中，Fc1和Fc2中包含這樣的胺基酸取代，使得與Fc1相比，Fc1優先與Fc2配對。
在一些實施方案中，該多肽L1包含胺基酸置換：S165C和C214A，該多肽H1包含胺基酸置換：P171C、C220A、L234A、L235A、 D356E、L358M、Y349C、T366S、L368A和Y407N；並且該多肽H2包含胺基酸置換：L234A、L235A、D356E、L358M、S354C和T366W；
或者
該多肽L1包含胺基酸置換：S165C和C214A，該多肽H1包含胺基酸置換：P171C、C220A、L234A、L235A、D356E、L358M、S354C和T366W；並且該多肽H2包含胺基酸置換：L234A、L235A、D356E、L358M、Y349C、T366S、L368A和Y407N。
在一些實施方案中，該多肽L1包含胺基酸置換：T164C、C214A和S114E，該多肽H1包含胺基酸置換：T139R、F170C、C220A、L234A、L235A、D356E、L358M、Y349C、T366S、L368A和Y407N；並且該多肽L2包含胺基酸置換S114K，該多肽H2包含胺基酸置換：T139D、L234A、L235A、D356E、L358M、S354C和T366W；
或者
該多肽L1包含胺基酸置換：T164C、C214A和S114E，該多肽H1包含胺基酸置換：T139R、F170C、C220A、L234A、L235A、D356E、L358M、S354C和T366W；並且該多肽L2包含胺基酸置換S114K，該多肽H2包含胺基酸置換：T139D、L234A、L235A、D356E、L358M、Y349C、T366S、L368A和Y407N。
本揭露提供了一種雙特異性二價抗原結合蛋白，其包含：
(i)第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含多肽H1和多肽L1，該多肽H1包含與第一VH連接的第一CH1，該多肽L1包含與第一VL連接的第一CL，其中，第一CH1和第一CL各自包含天然半胱胺酸至非半胱胺酸的胺基酸取代，並且第一CH1和第一CL在選自以下的位置中還包含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代：
(i-1)第一CH1的第170位和第一CL的第164位，
(i-2)第一CH1的第128位和第一CL的第121位，
(i-3)第一CH1的第129位和第一CL的第121位，
(i-4)第一CH1的第131位和第一CL的第119位，
(i-5)第一CH1的第141位和第一CL的第135位，和
(i-6)第一CH1的第171位和第一CL的第165位；
和
(ii)第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含多肽H2和多肽L2，該多肽H2包含與第二VH連接的第二CH1，該多肽L2包含與第二VL連接的第二CL；
其中該多肽H1自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc；該多肽H2自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc。
本揭露提供了一種雙特異性四價抗原結合蛋白，其包含：
(i)第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含多肽H1和多肽L1，該多肽H1包含與第一VH連接的第一CH1，該多肽L1包含與第一VL連接的第一CL，其中，第一CH1和第一CL各自包含天然半胱胺酸至非半胱胺酸的胺基酸取代，並且第一CH1和第一CL在選自以下的位置中還包含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代：
(i-1)第一CH1的第170位和第一CL的第164位，
(i-2)第一CH1的第128位和第一CL的第121位，
(i-3)第一CH1的第129位和第一CL的第121位，
(i-4)第一CH1的第131位和第一CL的第119位，
(i-5)第一CH1的第141位和第一CL的第135位，和
(i-6)第一CH1的第171位和第一CL的第165位；
和
(ii)第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含多肽H2和多肽L2，該多肽H2包含與第二VH連接的第二CH1，該多肽L2包含與第二VL連接的第二CL；
其中，該多肽H1自N端至C端由VH和CH1構成，該多肽H2自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc，該多肽H1的C端視需要地藉由肽接頭與該多肽H2的C端融合；或者該多肽H1自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc，該多肽H2自N端至C端由VH和CH1構成，該多肽H2的C端視需要地藉由肽接頭與該多肽H1的C端融合。
肽接頭表示具有胺基酸序列的肽。在一些實施方案中，肽接頭是具有長度為至少5個胺基酸的胺基酸序列的肽，在一個實施方案中，長度為5至100，在進一步的實施方案中為10至50個胺基酸。在一個實施方案中，該肽接頭是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸和(x=3，n=3、4、5或6、和m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5和m=0、1、2或3)。在一個實施方案中x=4和n=3或4。在一個實施方案中，該肽接頭是(G4S)4。
在一些實施方案中，該多肽H1自N端至C端由VH和CH1構成，該多肽H2自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc，該多肽H1的C端視需要地藉由肽接頭與該多肽H2的C端融合該多肽H2。
在一些實施方案中，該多肽H1自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc，該多肽H2自N端至C端由VH和CH1構成，該多肽H2的C端視需要地藉由肽接頭與該多肽H1的C端融合該多肽H1。
本揭露提供了一種二聚化多肽，其包含重鏈恆定區1(CH1)和輕鏈恆定區(CL)，其中，CH1的第139位和CL的第114位包含使得CH1和CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代。
在一些實施方案中，CH1第139位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸，CL第114位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸；或者CH1第139位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸，CL第114位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸。
在一些實施方案中，帶正電荷的胺基酸選自K、R和H；帶負電荷的胺基酸選自D和E。
在一些實施方案中，CH1和CL包含選自以下的胺基酸取代：T139R和S114E；T139R和S114D；T139K和S114E；T139K和S114D；T139D和S114K；T139D和S114R；T139E和S114K；和T139E和S114R。
本揭露提供了一種抗原結合蛋白，其包含上述二聚化多肽。
在一些實施方案中，抗原結合蛋白包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含Fab，該Fab包含第一重鏈可變區VH1、第一輕鏈可變區VL1和該二聚化多肽，該二聚化多肽中該CH1為第一CH1，該CL為第一CL；VH1與第一CH1直接連接或藉由接頭連接，VL1與第一CL直接連接或藉由接頭連接。在一些實施方案中，VH1的C端與第一CH1的N端直接連接或藉由接頭連接，VL1的C端與第一CL的N端直接連接或藉由接頭連接。
在一些實施方案中，抗原結合蛋白包含第一抗原結合域和第二抗原結合域，其中該第二抗原結合域包含第二重鏈可變區VH2和第二輕鏈可變區VL2，並且該第一抗原結合域和第二抗原結合域結合不同的抗原或者結合同一種抗原上的不同的表位；在一些實施方案中，該第二抗原結 合域包含Fab。在一些實施方案中，VH2的C端與第二CH1的N端直接連接或藉由接頭連接，VL2的C端與第二CL的N端直接連接或藉由接頭連接。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含使得第一CH1和第一CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代；和/或
第二CH1和第二CL包含使得第二CH1和第二CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代。
在一些實施方案中，第一CH1和第二CH1中用於形成靜電相互作用界面的胺基酸的帶電性相反，且第一CL和第二CL中用於形成靜電相互作用界面的胺基酸的帶電性相反。
在一些實施方案中，使得第一CH1和第一CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代位於第一CH1的第139位和第一CL的第114位；和/或
使得第二CH1和第二CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代位於第二CH1的第139位和第二CL的第114位。
在一些實施方案中，第一CH1的第139位和第二CH1的第139位分別被帶相反電荷的胺基酸取代，且第一CL的第114位和第二CL的第114位分別被帶相反電荷的胺基酸取代。
在一些實施方案中，第一CH1第139位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸，第一CL第114位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸；或者第一CH1第139位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸，第一CL第114位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸；和/或
第二CH1第139位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸，第二CL第114位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸；或者第二CH1第 139位的胺基酸被取代為帶正電荷的胺基酸，第二CL第114位的胺基酸被取代為帶負電荷的胺基酸。
在一些實施方案中，帶正電荷的胺基酸選自K、R和H；帶負電荷的胺基酸選自D和E。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含選自以下的胺基酸取代：T139R和S114E；T139R和S114D；T139K和S114E；T139K和S114D；T139D和S114K；T139D和S114R；T139E和S114K；和T139E和S114R；和/或
第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：T139R和S114E；T139R和S114D；T139K和S114E；T139K和S114D；T139D和S114K；T139D和S114R；T139E和S114K；和T139E和S114R。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含選自以下的胺基酸取代：T139R和S114E；T139R和S114D；T139K和S114E；T139K和S114D；和/或
第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：T139D和S114K；T139D和S114R；T139E和S114K；和T139E和S114R。
在一些實施方案中，第一CH1和第一CL包含選自以下的胺基酸取代：T139D和S114K；T139D和S114R；T139E和S114K；和T139E和S114R；和/或
第二CH1和第二CL包含選自以下的胺基酸取代：T139R和S114E；T139R和S114D；T139K和S114E；T139K和S114D。
本揭露提供了一種抗原結合蛋白，其包含：
(i)第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含多肽H1和多肽L1，該多肽H1包含與第一VH連接的第一CH1，該多肽L1包含與第一VL連接的第一CL；和
(ii)第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含多肽H2和多肽L2，該多肽H2包含與第二VH連接的第二CH1，該多肽L2包含與第二VL連接的第二CL；
其中，第一CH1的第139位和第一CL的第114位包含使得第一CH1和第一CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代；和/或
第二CH1的第139位和第二CL的第114位包含使得第二CH1和第二CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代。
在一些實施方案中，抗原結合蛋白是雙特異性二價抗原結合蛋白，其中其中該多肽H1自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc；該多肽H2自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc。
在一些實施方案中，抗原結合蛋白是雙特異性四價抗原結合蛋白，其中該多肽H1自N端至C端由VH和CH1構成，該多肽H2自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc，該多肽H1的C端視需要地藉由肽接頭與該多肽H2的C端融合；或者該多肽H1自N端至C端依次包含VH、CH1和Fc，該多肽H2自N端至C端由VH和CH1構成，該多肽H2的C端視需要地藉由肽接頭與該多肽H1的C端融合。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白是嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體、多價抗體、或抗體藥物偶聯物。
在一些實施方案中，本揭露的包含上述胺基酸取代的抗原結合蛋白與不含這些胺基酸取代的抗原結合蛋白相比，以改善的多肽H1/L1和多肽H2/L2(例如重鏈/輕鏈)配對或改善的產率在單細胞中產生。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白其多肽H1/L1和多肽H2/L2(例如重鏈/輕鏈)的正確配對比例為至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。計算公式為：多肽H1/L1和多肽H2/L2(例如重鏈/輕鏈)的正確配對比例=(正確第一抗原結合分子峰強度+正確第二抗原結合分子峰強度)/(正確第一抗原結合分子峰強度+正確第二抗原結合分子峰強度+其他雜質峰強度)×100%。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白其多肽H1/L1和多肽H2/L2(例如重鏈/輕鏈)的正確配對比例相對於野生型提高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%或50%。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白藉由在CH1/CL界面中去除天然二硫鍵並引入非天然二硫鍵，將多肽H1/L1和多肽H2/L2(例如重鏈/輕鏈)的正確配對比例相對於野生型提高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%或50%。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白藉由在CH1/CL界面中引入靜電互補的胺基酸對，將多肽H1/L1和多肽H2/L2(例如重鏈/輕鏈)的正確配對比例相對於野生型提高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%或50%。
在一些實施方案中，本揭露的抗原結合蛋白藉由在CH1/CL界面中去除天然二硫鍵並引入非天然二硫鍵，並同時引入靜電互補的胺基酸對，將多肽H1/L1和多肽H2/L2(例如重鏈/輕鏈)的正確配對比例相對於野生型提高了至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%或50%。
本揭露還提供了一種編碼前述二聚體多肽或抗原結合蛋白的核酸分子或其組合。
本揭露還提供了一種核酸表達載體或其組合，其包含前述核酸分子或其組合。
本揭露還提供了一種宿主細胞，其包含前述核酸分子或其組合。
在一些實施方案中，宿主細胞是可被工程化以產生根據本揭露的二聚體多肽或抗原結合蛋白的任何種類的細胞系統，例如真核細胞或原核細胞。真核細胞包括但不限於，例如來自於酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其它的多細胞生物的有核細胞。
本揭露還提供了一種製備前述任一種二聚體多肽或抗原結合蛋白的方法，其包括以下步驟：
(1)用前述核酸表達載體轉化宿主細胞；
(2)在容許合成該抗原結合蛋白的條件下培養該宿主細胞得到細胞培養物；和
(3)從該細胞培養物中回收抗原結合蛋白。
在一些實施方案中，前述核酸表達載體包括：編碼重鏈的質粒和編碼輕鏈的質粒；在轉化宿主細胞時，編碼輕鏈的質粒相對於編碼重 鏈的質粒是過量的，例如編碼重鏈的質粒與編碼輕鏈的質粒的莫耳比為1：(1-10)，例如1：(1-5)，例如2：3。
在一些實施方案中，前述核酸表達載體包括：
第一質粒，其包含編碼該多肽H1的核酸分子；
第二質粒，其包含編碼該多肽L1的核酸分子；
第三質粒，其包含編碼該多肽H2的核酸分子；和
第四質粒，其包含編碼該多肽L2的核酸分子。
在一些實施方案中，前述核酸表達載體包括：
第一質粒，其包含編碼第一重鏈的核酸分子；
第二質粒，其包含編碼第一輕鏈的核酸分子；
第三質粒，其包含編碼第二重鏈的核酸分子；和
第四質粒，其包含編碼第二輕鏈的核酸分子。在一些實施方案中，第一質粒和第二質粒在轉化宿主細胞時的莫耳比為1：1至1：10、1：1至1：9、1：1至1：8、1：1至1：7、1：1至1：6、1：1至1：5、1：1至1：4、1：1至1：3、1：1至1：2、1：1至1：1.9、1：1至1：1.8、1：1至1：7、1：1至1：1.6、1：1至1：1.5、1：1至1：1.4、1：1至1：1.3、1：1至1：1.2、1：1至1：1.1、或1：1至1：1.05。
在一個實施方案中，第一質粒和第二質粒在轉化宿主細胞時的莫耳比為1：1、1：1.05、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2.0、1：2.1、1：2.2、1：2.3、1：2.4、1：2.5、1：2.6、1：2.7、1：2.8、1：2.9、1：3.0、1：3.1、1：3.2、1：3.3、1：3.4、1：3.5、1：3.6、1：3.7、1：3.8、1：3.9、1：4.0、1：4.1、1：4.2、1：4.3、1：4.4、1：4.5、1：4.6、1：4.7、1：4.8、1：4.9、1：5.0、1：5.1、1：5.2、1：5.3、1：5.4、1：5.5、1：5.6、1：5.7、1： 5.8、1：5.9、1：6.0、1：6.1、1：6.2、1：6.3、1：6.4、1：6.5、1：6.6、1：6.7、1：6.8、1：6.9、1：7.0、1：7.1、1：7.2、1：7.3、1：7.4、1：7.5、1：7.6、1：7.7、1：7.8、1：7.9、1：8.0、1：8.1、1：8.2、1：8.3、1：8.4、1：8.5、1：8.6、1：8.7、1：8.8、1：8.9、1：9.0、1：9.1、1：9.2、1：9.3、1：9.4、1：9.5、1：9.6、1：9.7、1：9.8、1：9.9、或1：10.0。
在一些實施方案中，第三質粒和第四質粒在轉化宿主細胞時的莫耳比為1：1至1：10、1：1至1：9、1：1至1：8、1：1至1：7、1：1至1：6、1：1至1：5、1：1至1：4、1：1至1：3、1：1至1：2、1：1至1：1.9、1：1至1：1.8、1：1至1：7、1：1至1：1.6、1：1至1：1.5、1：1至1：1.4、1：1至1：1.3、1：1至1：1.2、1：1至1：1.1、或1：1至1：1.05。
在一個實施方案中，第三質粒和第四質粒在轉化宿主細胞時的莫耳比為1：1、1：1.05、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9、1：2.0、1：2.1、1：2.2、1：2.3、1：2.4、1：2.5、1：2.6、1：2.7、1：2.8、1：2.9、1：3.0、1：3.1、1：3.2、1：3.3、1：3.4、1：3.5、1：3.6、1：3.7、1：3.8、1：3.9、1：4.0、1：4.1、1：4.2、1：4.3、1：4.4、1：4.5、1：4.6、1：4.7、1：4.8、1：4.9、1：5.0、1：5.1、1：5.2、1：5.3、1：5.4、1：5.5、1：5.6、1：5.7、1：5.8、1：5.9、1：6.0、1：6.1、1：6.2、1：6.3、1：6.4、1：6.5、1：6.6、1：6.7、1：6.8、1：6.9、1：7.0、1：7.1、1：7.2、1：7.3、1：7.4、1：7.5、1：7.6、1：7.7、1：7.8、1：7.9、1：8.0、1：8.1、1：8.2、1：8.3、1：8.4、1：8.5、1：8.6、1：8.7、1：8.8、1：8.9、1：9.0、1：9.1、1： 9.2、1：9.3、1：9.4、1：9.5、1：9.6、1：9.7、1：9.8、1：9.9、或1：10.0。
在一些實施方案中，轉化宿主細胞時，第一質粒：第二質粒：第三質粒：第四質粒的莫耳比為1：(1~10)：1：(1~10)，例如1：(1~5)：1：(1~5)，例如2：3：2：3。
在一些實施方案中，轉化宿主細胞時，第一質粒：第二質粒：第三質粒：第四質粒的莫耳比為1：(1~10)：1：(1~10)、1：(1~9)：1：(1~9)、1：(1~8)：1：(1~8)、1：(1~7)：1：(1~7)、1：(1~6)：1：(1~6)、1：(1~5)：1：(1~5)、1：(1~4)：1：(1~4)、1：(1~3)：1：(1~3)或1：(1~2)：1：(1~2)。
在一個實施方案中，轉化宿主細胞時，第一質粒：第二質粒：第三質粒：第四質粒的莫耳比為1：1：1：1、1：1.05：1：1.05、1：1.1：1：1.1、1：1.2：1：1.2、1：1.3：1：1.3、1：1.4：1：1.4、1：1.5：1：1.5(或2：3：2：3)、1：1.6：1：1.6、1：1.7：1：1.7、1：1.8：1：1.8、1：1.9：1：1.9、1：2.0：1：2.0、1：2.1：1：2.1、1：2.2：1：2.2、1：2.3：1：2.3、1：2.4：1：2.4、1：2.5：1：2.5、1：2.6：1：2.6、1：2.7：1：2.7、1：2.8：1：2.8、1：2.9：1：2.9、1：3.0：1：3.0、1：3.1：1：3.1、1：3.2：1：3.2、1：3.3：1：3.3、1：3.4：1：3.4、1：3.5：1：3.5、1：3.6：1：3.6、1：3.7：1：3.7、1：3.8：1：3.8、1：3.9：1：3.9、1：4.0：1：4.0、1：4.1：1：4.1、1：4.2：1：4.2、1：4.3：1：4.3、1：4.4：1：4.4、1：4.5：1：4.5、1：4.6：1：4.6、1：4.7：1：4.7、1：4.8：1：4.8、1：4.9：1：4.9、1：5.0：1：5.0、1：5.1：1：5.1、1：5.2：1：5.2、1：5.3：1：5.3、1：5.4：1：5.4、1：5.5：1：5.5、1：5.6：1：5.6、1：5.7：1：5.7、1：5.8：1：5.8、1：5.9：1：5.9、1：6.0：1：6.0、1：6.1：1：6.1、1：6.2：1：6.2、1：6.3：1：6.3、1：6.4：1：6.4、1：6.5：1： 6.5、1：6.6：1：6.6、1：6.7：1：6.7、1：6.8：1：6.8、1：6.9：1：6.9、1：7.0：1：7.0、1：7.1：1：7.1、1：7.2：1：7.2、1：7.3：1：7.3、1：7.4：1：7.4、1：7.5：1：7.5、1：7.6：1：7.6、1：7.7：1：7.7、1：7.8：1：7.8、1：7.9：1：7.9、1：8.0：1：8.0、1：8.1：1：8.1、1：8.2：1：8.2、1：8.3：1：8.3、1：8.4：1：8.4、1：8.5：1：8.5、1：8.6：1：8.6、1：8.7：1：8.7、1：8.8：1：8.8、1：8.9：1：8.9、1：9.0：1：9.0、1：9.1：1：9.1、1：9.2：1：9.2、1：9.3：1：9.3、1：9.4：1：9.4、1：9.5：1：9.5、1：9.6：1：9.6、1：9.7：1：9.7、1：9.8：1：9.8、1：9.9：1：9.9、或1：10.0：1：10.0。
在一些實施方案中，該核酸表達載體包括：
第一質粒，其包含編碼該多肽H1的核酸分子和編碼多肽H2的核酸分子；
第二質粒，其包含編碼該多肽L1的核酸分子；和
第三質粒，其包含編碼該多肽L2的核酸分子。
在一些實施方案中，該核酸表達載體包括：
第一質粒，其包含編碼重鏈的核酸分子；
第二質粒，其包含編碼第一輕鏈的核酸分子；和
第三質粒，其包含編碼第二輕鏈的核酸分子。
在一些實施方案中，轉化宿主細胞時，第一質粒：第二質粒：第三質粒的莫耳比為1：(1~10)：(1~10)，較佳1：(1~5)：(1~5)，更佳2：3：3。
在一些實施方案中，轉化宿主細胞時，第一質粒：第二質粒：第三質粒的莫耳比為1：(1~10)：(1~10)、1：(1~9)：(1~9)、1：(1~8)： (1~8)、1：(1~7)：(1~7)、1：(1~6)：(1~6)、1：(1~5)：(1~5)、1：(1~4)：(1~4)、1：(1~3)：(1~3)或1：(1~2)：(1~2)。
在一個實施方案中，轉化宿主細胞時，重鏈質粒：第一輕鏈質粒：第二輕鏈質粒的莫耳比為1：1：1、1：1.05：1.05、1：1.1：1.1、1：1.2：1.2、1：1.3：1.3、1：1.4：1.4、1：1.5：1.5(或2：3：3)、1：1.6：1.6、1：1.7：1.7、1：1.8：1.8、1：1.9：1.9、1：2.0：2.0、1：2.1：2.1、1：2.2：2.2、1：2.3：2.3、1：2.4：2.4、1：2.5：2.5、1：2.6：2.6、1：2.7：2.7、1：2.8：2.8、1：2.9：2.9、1：3.0：3.0、1：3.1：3.1、1：3.2：3.2、1：3.3：3.3、1：3.4：3.4、1：3.5：3.5、1：3.6：3.6、1：3.7：3.7、1：3.8：3.8、1：3.9：3.9、1：4.0：4.0、1：4.1：4.1、1：4.2：4.2、1：4.3：4.3、1：4.4：4.4、1：4.5：4.5、1：4.6：4.6、1：4.7：4.7、1：4.8：4.8、1：4.9：4.9、1：5.0：5.0、1：5.1：5.1、1：5.2：5.2、1：5.3：5.3、1：5.4：5.4、1：5.5：5.5、1：5.6：5.6、1：5.7：5.7、1：5.8：5.8、1：5.9：5.9、1：6.0：6.0、1：6.1：6.1、1：6.2：6.2、1：6.3：6.3、1：6.4：6.4、1：6.5：6.5、1：6.6：6.6、1：6.7：6.7、1：6.8：6.8、1：6.9：6.9、1：7.0：7.0、1：7.1：7.1、1：7.2：7.2、1：7.3：7.3、1：7.4：7.4、1：7.5：7.5、1：7.6：7.6、1：7.7：7.7、1：7.8：7.8、1：7.9：7.9、1：8.0：8.0、1：8.1：8.1、1：8.2：8.2、1：8.3：8.3、1：8.4：8.4、1：8.5：8.5、1：8.6：8.6、1：8.7：8.7、1：8.8：8.8、1：8.9：8.9、1：9.0：9.0、1：9.1：9.1、1：9.2：9.2、1：9.3：9.3、1：9.4：9.4、1：9.5：9.5、1：9.6：9.6、1：9.7：9.7、1：9.8：9.8、1：9.9：9.9、或1：10.0：10.0。
在一些實施方案中，本領域中已知的其他方法還可以用於本揭露以平衡兩個重鏈的表達水平，如強/弱啟動子的使用。
本揭露還提供了一種醫藥組成物，其包含前述任一種抗原結合蛋白和藥學上可接受的載體。
藥學上可接受的載體是指除了活性成分之外的藥物製劑中的成分，其對受試者是無毒的。藥學上可接受的載體包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。在一個較佳的實施方案中，載體適用於靜脈內、肌肉內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如藉由注射或輸注)。
在另一些方面，本揭露還提供一種消除受試者免疫抑制相關疾病的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的如前所述的抗原結合蛋白，或如前所述的醫藥組成物，該治療有效量為單位劑量的組成物中含有0.1-3000mg的如前所述的抗原結合蛋白。
在一些實施方案中，在單次或累積的施加中，向個體施用約10μg/kg至約1000mg/kg劑量的本揭露所述的抗原結合蛋白或醫藥組成物。
本揭露還提供了前述任一種二聚化多肽或抗原結合蛋白在製備藥物中的用途。
本揭露還提供了前述任一種二聚化多肽或抗原結合蛋白在製備用於治療癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病的藥物中的用途。
本揭露還提供了一種治療和/或預防疾病例如癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用有效量的前述抗原結合蛋白或醫藥組成物。
本揭露還提供了前述任一種二聚化多肽、抗原結合蛋白或醫藥組成物，其用於治療癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病。
在一些實施方案中，癌症包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤(blastoma)、肉瘤、白血病和淋巴樣惡性腫瘤。這種癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌、骨髓瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭和頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、神經膠質瘤、何傑金淋巴瘤、非何傑金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞樣白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性髓細胞樣白血病(CML)、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、髓樣細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓異常增生綜合征(MDS)、胃腸(道)癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴細胞性白血病、淋巴細胞白血病、結腸直腸癌、子宮內膜癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、軟骨肉瘤、神經母細胞瘤、胰腺癌、多形性成膠質細胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宮頸癌、腦癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌(HCC)、透明細胞腎細胞癌(RCC)、頭和頸癌、咽喉癌、肝膽癌(hepatobiliary cancer)、中樞神經系統癌、食管癌、惡性胸膜間皮瘤、全身性輕鏈澱粉樣變性、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓異常增生綜合征、骨髓增生性腫瘤、神經內分泌腫瘤、梅克爾細胞癌、睾丸癌和皮膚癌。
在一些實施方案中，自身免疫性疾病或炎性疾病選自：類風濕關節炎、牛皮癬、克羅恩病、強硬性脊柱炎、多發性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren綜合征、移植排斥後的自體免疫性溶血性貧血、水皰性類天皰瘡、格雷夫氏病、橋本甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡(SLE)、重症肌無力、天皰瘡、惡性貧血。
圖1顯示了實施例3中的PD-1單抗產物IdeS酶切後的分子量解卷積質譜圖；
圖2顯示了實施例4中的分子形式：1+1非對稱雙特異性抗體，一臂使用天然CH1/Cκ，另一臂使用含有非天然二硫鍵的CH1/Cκ；
圖3A-3D顯示了實施例4中的雙抗初純產物木瓜蛋白酶酶切後的分子量解卷積質譜圖；
圖4A顯示了TJ030-PR1104蛋白初純產物的二步純化色譜圖；圖4B顯示了精純後的TJ030-PR1104蛋白的脫糖完整分子量總離子流圖(上)和紫外圖譜(下)以及主要峰的分子歸屬信息；圖4C顯示了精純後的TJ030-PR1104蛋白的脫糖還原分子量總離子流圖(上)和紫外圖譜(下)以及主要峰的分子歸屬信息；
圖5顯示了1+1非對稱的PD-1×CTLA-4雙抗能促成PD-1表達細胞和CTLA-4表達細胞的交聯；
圖6顯示了實施例5中的分子形式示意圖：顯示了1+1非對稱雙特異性抗體，一臂使用天然CH1/Cκ，另一臂使用含有非天然二硫鍵的CH1/Cλ；或者一臂使用含有非天然二硫鍵的CH1/Cκ，另一臂使用含有天然CH1/Cλ；
圖7A顯示了TJ030-PR1313精純後的脫糖完整分子量紫外圖譜以及主峰的分子歸屬信息；圖7B顯示了TJ030-PR1313經Lys-C酶切後的Fab分子量解卷積質譜圖；
圖8顯示了非天然二硫鍵引入CH1/CL的PSMA 1+1雙表位抗體經GingisKHAN蛋白酶處理後的產物的分子量解卷積質譜圖；
圖9A顯示了實施例8的FAP×CD40 2+2對稱雙特異性抗體分子形式示意圖；圖9B顯示了兩種FAP×CD40抗體還原分子量解卷積質譜圖；圖9C-9D顯示了兩種FAP×CD40抗體IdeS酶切後的分子量解卷積質譜圖；
圖10A顯示了FAP×CD40抗體與CD40的FACS結合EC50結果；圖10B顯示了FAP×CD40抗體與FAP的FACS結合EC50結果；圖10C和10D顯示了FAP×CD40抗體在FAP存在和不存在時對CD40的激活活性結果。
術語“抗原”是指任何能誘導機體發生免疫應答的物質，抗原的實例包括但不限於肽、蛋白質、糖蛋白、多糖、脂質和合成或天然存在的化學化合物或其組合。
術語“抗原結合蛋白”是指能夠結合抗原的蛋白，其包括但不限於全長抗體、抗體片段或抗體與其他多肽的融合蛋白。該“結合”例如可以是特異性結合。抗體片段的實例包括但不限於(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL經鏈間二硫鍵形成的抗原結合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的雙抗體、雙特異性抗體和多特異性抗體。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈 Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883)。此類單鏈抗體也包括在術語抗體片段中。使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合域。
抗體可以是不同同種型的抗體，例如，依據抗體的重鏈恆定區的胺基酸序列，抗體分為不同類型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的5種類型，進而IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等的亞型)。對應上述5種類型的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ和μ。
抗體的輕鏈基於其胺基酸序列可認為是Kappa(κ)或Lamda(λ)中任一種。
術語“(輕鏈)CL區”是指抗體輕鏈的恆定區，是相關技術領域公知的區。CL區可藉由常規方法確定，例如可利用與已知抗體等的同源性而確定目的區域是否為CL區，CL區的邊界可改變，通常在人κ鏈中，CL區由107個胺基酸殘基組成，人λ鏈中的CL區通常由106個胺基酸殘基組成。人κ鏈CL區中的天然半胱胺酸為按照Kabat編碼的第214位，人λ鏈的CL區中的天然半胱胺酸為按照Kabat編碼的第214位。
術語“(重鏈)CH1區”是指重鏈的第一恆定區，其為相關技術領域已知的區。本文定義的CH1區也可含CH1區之後的絞鏈區的一部分(可包含於Fab區的絞鏈區)。CH1區可藉由常規方法確定，例如可利用與已知抗體等的同源性而確定目的區域是否為CH1區。由於CH1區的邊界可改變，因此，在人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重鏈中，本文定義的CH1區通常是由胺基酸殘基編號118-215和額外的絞鏈區的一部分(例如胺基 酸殘基編號216-224)組成；在IgM的重鏈中，本文定義CH1區域通常是由胺基酸基編號118-216組成，但不限於此。
術語“Fc區”是指將抗體以木瓜酶切割時所得的2種片段中，對應於不具有抗原結合能力的片段的區。通常，Fc區是指抗體重鏈的C端區，其包含一部分絞鏈區、重鏈的第二恆定(CH2)區和第三恆定(CH3)區。重鏈Fc區的邊界可改變，例如人IgG1重鏈Fc區由Thr225的胺基酸殘基至CH3區的羧基端組成。
術語“依賴抗體的細胞毒性(ADCC)”指分泌的Ig結合至存在於一些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上，使得這些細胞毒性效應細胞能夠特異性結合具有抗原的靶細胞，隨後用細胞毒劑殺死靶細胞。抗體“武裝”細胞毒性細胞，且絕對為這種殺傷所需。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血細胞上的Fc表達總結在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)的第464頁上的表3中。為了評估目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，如描述於美國專利號5,500,362或5,821,337中的體外ADCC測定。用於這類測定的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。備選地，或此外，可以在體內，例如在諸如公開於Clynes等，PNAS USA 95：652-656(1998)中的動物模型的動物模型中評估目的分子的ADCC活性。
術語“Fc受體”或“FcR”描述結合抗體Fc區的受體。較佳的FcR是人FcR。此外，較佳的FcR是結合IgG抗體的FcR(γ受體)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和選擇性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“激活受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有主要在其胞質結構域中不同的相似胺基酸序列。激活 受體FcγRIIA在其胞質結構域中包含基於免疫受體酪胺酸的激活基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中包含基於免疫受體酪胺酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述M.Daeron,Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR綜述於Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)中。本文的術語“FcR”涵蓋了其他FcR，包括有待在將來鑑定的那些。該術語還包括負責將母體IgG轉移至胎兒的新生兒受體FcRn(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
術語“人效應細胞”是表達一種或多種FcR並執行效應子功能的白細胞。較佳地，該細胞至少表達FcγRIII並執行ADCC效應子功能。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞；較佳PBMC和NK細胞。可以從天然來源例如從血液分離效應細胞。
術語“依賴補體的細胞毒性”或“CDC”指在補體存在下裂解靶細胞。經典補體途徑的激活由補體系統第一成分(C1q)與結合於其關連抗原的(適當亞類的)抗體的結合起始。為了評估補體激活，可以進行例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述的CDC測定。
術語“治療有效量”指在個體中治療疾病或障礙的抗體(包括多特異性抗體)、其抗原結合抗體片段、或其衍生物的量。在腫瘤(例如癌性腫瘤)的情況下，抗體或抗體片段(例如多特異性抗體或抗體片段)的治療有效量可以減少癌細胞的數目、減小原發性腫瘤大小、抑制(即在某種程度上減慢和較佳阻止)癌細胞浸潤入外周器官、抑制(即在某種程度上減慢和較 佳阻止)腫瘤轉移、在某種程度上抑制腫瘤生長、和/或在某種程度上減輕與障礙相關的一種或多種症狀。在抗體或其抗體片段、或其衍生物可以阻止生長和/或殺死現有癌細胞的程度上，它可以是細胞抑制劑和/或細胞毒劑。對於癌症治療，可以例如藉由評估存活期、疾病進展時間(TTP)、應答率(RR)、應答持續時間和/或生活質量來測量體內功效。
術語“天然二硫鍵”是指通常存在於野生型多肽(抗體等)的半胱胺酸-半胱胺酸間的共價鍵。術語“非天然二硫鍵”是指在上述“天然二硫鍵”以外的位置所形成的半胱胺酸-半胱胺酸間的共價鍵。
術語“多特異性抗體”是指結合兩個或更多個不同的表位(例如，兩個、三個、四個或更多個不同的表位)的抗體。表位可以在相同或不同的抗原上。多特異性抗體的實例之一是結合兩個不同表位的“雙特異性抗體”。
術語“價”表示抗體分子中存在特定數目的結合位點。天然抗體例如具有兩個結合位點並且是二價的。如此，術語“四價”表示抗體分子中存在四個結合位點。
術語“胺基酸”主要是指選自以下的20種天然存在的胺基酸：丙胺酸(Ala或A)、半胱胺酸(Cys或C)、天冬胺酸(Asp或D)、谷胺酸(Glu或E)、苯丙胺酸(Phe或F)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異亮胺酸(He或I)、賴胺酸(Lys或K)、亮胺酸(Leu或L)、甲硫胺酸(Met或M)、天冬醯胺(Asn或N)、脯胺酸(Pro或P)、穀胺醯胺(Gln或Q)、精胺酸(Arg或R)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、纈胺酸(Val或V)、色胺酸(Trp或W)和酪胺酸(Tyr或Y)。術語“胺基酸殘基”是指組成多肽的胺基酸在相互結合時，由於其部分基團參與了肽鍵的形成而失去一分子水，因此把多 肽中的胺基酸單位稱為胺基酸殘基，即由肽鍵鏈接的胺基酸失水後剩餘部分。本文中術語“胺基酸”和“胺基酸殘基”可互換使用。
胺基酸“帶正電荷”或“帶負電荷”是根據pH 7.4時所測定的胺基酸側鏈的電荷屬性進行的分類。胺基酸可根據常見的側鏈性質分組：(1)疏水性：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電荷)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電荷)：His、Lys、Arg；(5)影響鏈方向的殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
術語“界面”是指源自抗原結合蛋白或抗體的第一結構域中的一個或多個胺基酸與第二結構域的一個或多個胺基酸的相互作用的結合或接觸表面。示例性界面存在於例如CH1/CL之間、VH/VL之間和/或CH3/CH3之間。在一些實施方案中，界面包括例如形成界面的胺基酸之間的氫鍵、靜電相互作用或鹽橋。
術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人PD-1或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。本揭露所述的抗體 或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR加上一個或更多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人PD-1特異性結合的抗體、或者與PD-1和PD-L1兩者結合的抗體得到穩定的株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
除另有說明外，本揭露的術語“第一”和“第二”僅是通用標識符，不應被理解為標識本文提供的抗原結合蛋白的具體或特定部分；本揭露任意實施方案中“第一”和“第二”可以顛倒，例如，本揭露描述的處於第一CH1和第一CL中的任意胺基酸取代可以備選地處於第二CH1和第二CL中。
本揭露關於的序列如下：
SEQ ID NO：1(PD-1/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0061-5
SEQ ID NO：2(PD-1/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0061-6
SEQ ID NO：3(PD-1/HC，S131C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0062-7
SEQ ID NO：4(PD-1/HC，L128C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0062-8
SEQ ID NO：5(PD-1/HC，A129C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0063-9
SEQ ID NO：6(PD-1/HC，F170C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0063-10
SEQ ID NO：7(PD-1/HC，A141C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0064-11
SEQ ID NO：8(PD-1/LC，P119C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0064-12
SEQ ID NO：9(PD-1/LC，S121C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0064-13
Figure 110145279-A0202-12-0065-14
SEQ ID NO：10(PD-1/LC，T164C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0065-15
SEQ ID NO：11(PD-1/LC，L135C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0065-16
SEQ ID NO：12(PD-1/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0065-17
Figure 110145279-A0202-12-0066-18
SEQ ID NO：13(PD-1/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0066-19
SEQ ID NO：14(CTLA-4/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0066-20
SEQ ID NO：15(CTLA-4/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0067-21
SEQ ID NO：16(CTLA-4/HC，F126C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0067-22
SEQ ID NO：17(CTLA-4/LC，S121C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0067-23
SEQ ID NO：18(CTLA-4/HC，L128C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0068-24
SEQ ID NO：19(CTLA-4/HC，F170C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0068-25
SEQ ID NO：20(CTLA-4/LC，T164C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0069-26
SEQ ID NO：21(CTLA-4/HC，S131C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0069-28
SEQ ID NO：22(CTLA-4/LC，P119C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0069-29
Figure 110145279-A0202-12-0070-30
SEQ ID NO：23(PD-1/HC，F126C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0070-31
SEQ ID NO：24(PD-1/HC，L128C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0070-32
Figure 110145279-A0202-12-0071-33
SEQ ID NO：25(PD-1/HC，F170C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0071-34
SEQ ID NO：26(PD-1/HC，S131C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0071-35
Figure 110145279-A0202-12-0072-36
SEQ ID NO：27(CTLA-4/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0072-37
SEQ ID NO：28(CTLA-4/HC，P171C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0072-40
SEQ ID NO：29(CTLA-4/LC，S165C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0072-41
Figure 110145279-A0202-12-0073-42
SEQ ID NO：30(PD-1/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0073-43
SEQ ID NO：31(PD-1/HC，P171C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0073-44
SEQ ID NO：32(PD-1/LC，S165C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0074-45
SEQ ID NO：33(PD-1/HC，T139R，F170C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0074-46
SEQ ID NO：34(PD-1/LC，S114E，T164C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0074-48
SEQ ID NO：35(CTLA-4/HC，T139D下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0075-49
SEQ ID NO：36(CTLA-4/LC，S114K下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0075-50
SEQ ID NO：37(PD-1/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0075-52
Figure 110145279-A0202-12-0076-121
SEQ ID NO：38(PD-1/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0076-54
SEQ ID NO：39(PD-1/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0076-55
Figure 110145279-A0202-12-0077-56
SEQ ID NO：40(PD-1/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0077-57
SEQ ID NO：41(CTLA-4/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0077-58
SEQ ID NO：42(CTLA-4/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0077-59
Figure 110145279-A0202-12-0078-60
SEQ ID NO：43(PD-1/HCDR1)DYEMH
SEQ ID NO：44(PD-1/HCDR2)LIDPETGGTVYNQKFKD
SEQ ID NO：45(PD-1/HCDR3)ERFSYYGSTSDWYFD
SEQ ID NO：46(PD-1/LCDR1)RSSQSLVHSTGNTYLE
SEQ ID NO：47(PD-1/LCDR2)KVSNRFS
SEQ ID NO：48(PD-1/LCDR3)FQGSHVPYT
SEQ ID NO：49(PD-1/VH)
Figure 110145279-A0202-12-0078-61
SEQ ID NO：50(PD-1/VL)
Figure 110145279-A0202-12-0079-62
SEQ ID NO：51(CTLA-4/HCDR1)SYTMH
SEQ ID NO：52(CTLA-4/HCDR2)FISYDGNNKYYADSVKG
SEQ ID NO：53(CTLA-4/HCDR3)TGWLGPFDY
SEQ ID NO：54(CTLA-4/LCDR1)RASQSVGSSYLA
SEQ ID NO：55(CTLA-4/LCDR2)GAFSRAT
SEQ ID NO：56(CTLA-4/LCDR3)QQYGSSPWT
SEQ ID NO：57(CTLA-4/VH)
Figure 110145279-A0202-12-0079-63
SEQ ID NO：58(CTLA-4/VL)
Figure 110145279-A0202-12-0080-64
實施例
以下結合實施例進一步描述本揭露，但這些實施例並非限制著本揭露的範圍。本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1 實驗材料和方法
1.1 單株抗體表達純化
用生長狀態良好、處於對數生長期的CHO-S細胞(Thermo，A29133)，離心並按照6×106個細胞/mL接種250mL。將溶液2(用培養液9.2mL稀釋800μL轉染試劑，混勻)加入溶液1(用培養液10mL稀釋250μg質粒，混勻)中，總體積是20mL，輕柔混勻後室溫孵育1-5min，將混合轉染液逐滴加入細胞培養液中，邊搖邊加。然後將培養瓶置於5% CO2，32℃搖床培養，18-22個小時後加輔料Feed(Thermo，A29133)16mL，增強劑Enhancer(Thermo，A29133)0.6mL。第五天加輔料Feed(Thermo，A29133)16mL，120rpm，5% CO2，32℃培養，待第12-14天離心收集上清，親和層析法純化(MabSelect SuRe column，GE，17-5438)。
1.2 雙抗表達和純化
雙抗表達過程與單抗PD-1相同，純化策略較單抗略複雜：其中第一步的親和層析初純與單抗相似，但有時需要使用離子交換層析進行精純。根據抗體等電點性質，可以選擇不同的陰、陽離子交換層析方法。
其中，陰離子交換層析的方法是：將一步純化的樣品上樣到HiTrap Q HP column(GE，17515601)管柱，用A液(20mM PB，pH 7.0)平衡，然後用0-100% B液(20mM PB，1M NaCl，pH7.0)梯度沖提。陽離子交換層析的方法是：將一步純化的樣品上樣到Capto S ImpAct預裝管柱(GE，17-5441-22)，用A液(50mM NaAc，50mMNaCl，pH 5.0)平衡，然後用0-100% B液(50mM NaAc，500mM NaCl，pH5.0)梯度沖提。
1.3 質譜分析
本揭露中使用常規的高分辨質譜6530B ESI-Q-TOF(Agilent)和XEVO G2-XS Q-Tof(Waters)對蛋白樣品進行生物分析。
1.3.1 完整分子量
將樣品稀釋後，利用反向色譜分離並進入高分辨率質譜檢測，得到含有不同質荷比信息的原始譜圖，藉由解卷軟體處理後，獲得抗體完整分子量信息。具體為：取50μg樣品及標準品用流動相A(0.1%甲酸水溶液)稀釋至0.5mg/mL，4℃ 12000rpm離心10min，取上清至進樣瓶。進樣前用95%流動相A平衡色譜管柱(Waters，186008946)至平穩，進樣後使用流動相A和流動相B(0.1%甲酸乙腈溶液)進行梯度沖提。樣品採集結束後，在目標峰出峰處得到對應的質譜數據。
1.3.2 脫糖完整分子量
將樣品稀釋後，利用反向色譜分離並進入高分辨率質譜檢測，得到含有不同質荷比信息的原始譜圖，藉由解卷軟體處理後，獲得抗 體脫糖後完整分子量信息。具體為：取100μg供試品及標準品，各加入2μL肽N-糖苷酶F(PNGase F，BioLabs，P0704L)，加入50mM碳酸氫銨溶液補足體積至100μL，37℃脫糖3小時。孵育完成後，用流動相A稀釋蛋白濃度為0.5μg/μL，4℃ 12000rpm離心10min，取上清至進樣瓶。進樣前用95%流動相A平衡色譜管柱至平穩，進樣後使用流動相A和流動相B(0.1%甲酸乙腈溶液)進行梯度沖提。樣品採集結束後，在目標峰出峰處得到對應的質譜數據。
1.3.3 還原分子量
將樣品稀釋後，利用反向色譜分離並進入高分辨率質譜檢測，得到含有不同質荷比信息的原始譜圖，藉由解卷軟體處理後，獲得抗體還原分子量信息。具體為：取100μg供試品及標準品，加入50mM碳酸氫銨溶液補足體積至90μL，加入10μL DTT使終濃度為10mM，37℃孵育30min。孵育完成後，用流動相A稀釋蛋白濃度為0.5μg/μL，4℃ 12000rpm離心10min，取上清至進樣瓶。進樣前用95%流動相A平衡色譜管柱至平穩，進樣後使用流動相A和流動相B(0.1%甲酸乙腈溶液)進行梯度沖提。樣品採集結束後，在目標峰出峰處得到對應的質譜數據。
1.3.4 IdeS酶切後的F(ab’) 2 分子量
將樣品藉由免疫球蛋白G降解酶(IdeS，Promega，v7511)酶解得到Fab片段，利用反向色譜分離並進入高分辨率質譜檢測，得到含有不同質荷比信息的原始譜圖，藉由解卷軟體處理後，獲得抗體F(ab’)2片段的分子量信息，並藉由分子量信息獲得配對信息。具體為：取100μg供試品及標準品，加入50mM Tris-HCl(pH 7.50)溶液稀釋至0.5μg/μL，取100μL稀釋後樣品加入1μL IdeS，37℃孵育30min。反應完成後，加入1μL 10%甲酸水溶液，取上清至進樣瓶。進樣前用95%流動相A平衡 色譜管柱至平穩，進樣後使用流動相A和流動相B(0.1%甲酸乙腈溶液)進行梯度沖提。樣品採集結束後，在目標峰出峰處得到對應的質譜數據。
1.3.5 Lys-C或Papain酶切後的Fab分子量
將樣品藉由蛋白酶(Lys-C，RHINO BIO，QIP-004-A或者Papain，Solarbio，G8430)酶解得到Fab片段，利用反向色譜分離並進入高分辨率質譜檢測，得到含有不同質荷比信息的原始譜圖，藉由解卷軟體處理後，獲得抗體的Fab片段分子量信息，並藉由分子量信息獲得配對信息。以Lys-C酶切測定Fab分子量為例：取100μg供試品及標準品，加入50mM Tris-HCl(pH 7.50)溶液稀釋至0.5μg/μL，取100μL稀釋後樣品加入0.25μg Lys-C，37℃孵育5min。反應完成後，加入1μL 10%甲酸水溶液，取上清至進樣瓶。進樣前用95%流動相A平衡色譜管柱至平穩，進樣後使用流動相A和流動相B(0.1%甲酸乙腈溶液)進行梯度沖提。樣品採集結束後，在目標峰出峰處得到對應的質譜數據。
1.3.6 游離巰基分析
為獲取供試品游離巰基的位點和比例信息：取用250μg供試品，加入8M鹽酸胍溶液95μL，56℃孵育40min。加熱完成後加入0.1M馬來醯亞胺(NEM)5μL，混勻後暗處室溫避光反應35min。13000rpm離心15min，加入50mM Tris-HCl 100μL繼續離心，重複3次。隨後加入50mM Tris-HCl 90μL和1M DTT溶液10μL反應40min；13000rpm離心15min，加入50mM Tris-HCl 100μL繼續離心，重複3次。加入1M碘乙醯胺(IAM)20μL，混勻後暗處室溫避光反應35min；13000rpm離心15min，加入50mM Tris-HCl 100μL繼續離心，重複3次。隨後加入胰蛋白酶Trypsin，使酶和供試品比例為1：25(w/w)，37℃孵育16小時。取出後，加入1.0μL甲酸終止反應，質譜檢測，分析數據。
1.4 細胞交聯實驗
採用流式方法檢測精純後的PD-1×CTLA-4雙特異抗體對高表達人PD-1和人CTLA-4的細胞的共結合能力。首先，HEK293細胞瞬時轉染人CTLA-4質粒，轉染後24小時，將高表達CTLA-4的HEK293細胞用Cell Trace Far red(Invitrogen，C34564)標記，將CHO-K1/PD-1穩轉株用Cell Trace Violet(Invitrogen，C34557)標記，分別加入到96孔U型板中(Costar，3599)中，2E5細胞每孔，將待檢測的抗體稀釋到100nM、10nM、1nM、0.1nM和0.01nM，分別加入到96孔U型板中，50μL/孔，總體積為150μL/孔。4℃避光孵育1小時，流式檢測CTLA-4的HEK293/CTLA-4和CHO-K1/PD-1的雙陽性細胞百分比。
1.5 FAP和CD40臂的細胞結合FACS實驗
離心收集對數生長期的穩定表達人FAP的CHO細胞(即CHO/FAP細胞)以及瞬時轉染48小時後的HEK293細胞(即HEK293/CD40細胞)，PBS清洗後離心。細胞鋪板，每孔100μL 2E5個細胞，400g離心5min。加入不同濃度的待檢測抗體，冰上孵育1h，PBS清洗，400g離心5min。加入帶有熒光基團的羊抗人的二抗Alexa Fluor 488冰浴染色1小時，PBS清洗兩遍後上機檢測。
1.6 FAPxCD40雙抗對於CD40信號通路激活的影響
為了驗證FAPxCD40雙特異性抗體對CD40信號通路激活的影響以及FAP存在下對CD40信號通路激活的影響，利用人CD40高表達的陽性細胞株HEK-Blue CD40L細胞以及穩定表達人FAP的Flp-In CHO細胞株，用含10%熱滅活血清的DMEM/F12K培養基稀釋到5.5E5/mL，向96孔平底細胞培養板每孔加入90μL HEK-Blu CD40L細胞懸液，同時加入90μL培養基或者Flp-In CHO/FAP細胞株。每孔加入 20μL梯度稀釋後的抗體，無抗體組作為陰性對照，37℃ 5% CO2培養箱過夜培養。取另外96孔平底細胞培養板加入180μL Quanti-Blue檢測試劑，加入20μL細胞培養上清，室溫孵育30min後用酶標儀讀OD655數值。
實施例2 在CH1/CL相互作用界面中引入胺基酸取代
我們設計了如表1所示的引入非天然二硫鍵的位置。
Figure 110145279-A0202-12-0086-65
我們還設計了如表2所示的引入靜電效應的胺基酸突變的位置。
Figure 110145279-A0202-12-0087-66
實施例3 PD-1單株抗體表達載體的構建和蛋白表達純化
將編碼PD-1-IgG1-LALA抗體的重鏈(序列如SEQ ID NO：1所示)和輕鏈(序列如SEQ ID NO：2所示)的核酸分別構建到pTT5質粒載體上。在其基礎上，在重鏈中引入進行C220A突變(EU編碼)；在輕鏈中引入C214A突變(Kabat編碼)。同時引入這兩個突變，徹底去除了天然存在於這些位置(CH1第220位-和CL第214位)的鏈間二硫鍵。
為表達由非天然二硫鍵連接的PD-1單抗，我們在天然二硫鍵去除的重鏈中進一步引入S131C(SEQ ID NO：3)，L128C(SEQ ID NO：4)，A129C(SEQ ID NO：5)，或F170C(SEQ ID NO：6)；類似地，在天然二硫鍵去除的輕鏈中進一步引入P119C(SEQ ID NO：8)，S121C(SEQ ID NO：9)，或T164C(SEQ ID NO：10)，如表3所示。
Figure 110145279-A0202-12-0088-67
根據表3所示的PD-1單抗序列和質粒配比信息，按照實施例1.1和1.2的方法表達和純化抗體，引入非天然二硫鍵後的PD-1抗體一步純化後的蛋白表達量和純度與含天然二硫鍵的PD-1抗體相當，無明顯變化。為了確認非天然二硫鍵是否形成，我們使用IdeS酶酶切處理對應的PD-1抗體，得到了F(ab’)2的分子片段(圖1)，證明在上述特定位置S131C-P119C、L128C-S121C、A129C-S121C、F170C-T164C引入的半胱胺酸能夠形成CH1/CL鏈間二硫鍵。
為了進一步確認非天然二硫鍵的形成，特別是在抗體分子中是否存在未配對的游離半胱胺酸殘基，我們按照實施例1.3的方法進一步定量表徵了單抗分子的游離巰基。我們設定，游離巰基比例(%)=NEM修飾肽段質譜信號強度/肽段質譜總信號強度×100%。結果表明，由非天然二硫鍵S131C-P119C、L128C-S121C、A129C-S121C、F170C-T164C組成的PD-1單抗中，整體游離巰基的比例<3%，結果表明這些引入的非天然半胱胺酸殘基能夠配對形成二硫鍵。
實施例4 非天然二硫鍵引入CH1/Cκ的PD-1×CTLA-4雙抗
4.1 分子形式
鑒於非天然二硫鍵運用於PD-1單抗上的出色表現，我們進一步設計了基於KIH(S354C/T366W；Y349C/T366S/L368A/Y407V)的1+1非對稱雙特異性抗體。理論上，可以在PD-1臂或者CTLA-4臂之一上使用非天然二硫鍵；PD-1臂的Fc中包含凹陷(hole)，CTLA-4臂的Fc中包含凸起(knob)，反之亦然；由此可以形成四種組合形式。在本實施例中，使PD-1臂的Fc在包含形成凸起(knob)的胺基酸突變T366W，使CTLA-4臂的Fc中包含形成凹陷(hole)的胺基酸突變T366S/L368A/Y407V(圖2給出了結構示意圖)。
根據表4所示的PD-1×CTLA-4雙抗序列和質粒配比信息，按照實施例1.1和1.2的方法表達和純化雙特異性抗體。
Figure 110145279-A0202-12-0090-68
4.2初純產物的錯配質譜分析
4.2.1非天然二硫鍵對對應Fab的表達影響
以PD-1×CTLA-4雙抗為例，對於在CTLA-4臂引入非天然二硫鍵L128C-S121C並且在PD-1臂中保留天然二硫鍵的TJ030-PR1103，在編碼4條鏈的質粒共轉表達時，在PD-1臂的競爭下，CTLA-4臂的表達量顯著下降。雙抗初純產物經木瓜蛋白酶酶切後的分子量解卷積質譜結果(圖3)顯示，TJ030-PR1101CTLA-4臂峰強度/PD-1臂峰強度=1：2，TJ030-PR1103CTLA-4臂峰強度/PD-1峰強度=1：46。相比之下，引入非天然二硫鍵F170C-T164C的TJ030-PR1104和引入非天然二硫鍵S131C-P119C的TJ030-PR1105，在天然二硫鍵Fab臂的競爭下，並不會降低表達量，其CTLA-4臂峰強度/PD-1臂峰強度維持在1：2左右。
4.2.2輕鏈錯配比例
為進一步定量分析輕鏈錯配，根據圖3的分子量解卷積質譜結果計算正確配對比例，計算公式為：(正確PD-1臂峰強度+正確CTLA-4臂峰強度)/(正確PD-1臂峰強度+正確CTLA-4臂峰強度+其他雜質峰強度)，結果參見表5。可以看出，TJ030-PR1103(L128C-S121C)和TJ030-PR1104(F170C-T164C)無論非天然二硫鍵至於CTLA-4臂還是PD-1臂，相對於TJ030-PR1101(採用天然二硫鍵)和現有技術報導的TJ030-PR1102(F126C-S121C)，正確配對比例均有較大提高。對於TJ030-PR1105(S131C-P119C)，當非天然二硫鍵置於PD-1臂時，正確配對比例相對於TJ030-PR1101(採用天然二硫鍵)和現有技術報導的TJ030-PR1102(F126C-S121C)，正確配對比例均有較大提高。
Figure 110145279-A0202-12-0092-69
4.4精純產物的質譜錯配分析
以TJ030-PR1104為例，根據實施例1.2的方法對一步純產物精純後，如圖4A所示收集特徵峰用於後續檢測。
4.4.1完整分子量和脫糖完整分子量
採用1.3.2的方法進行脫糖完整分子量檢測，結果如圖4B所示，脫糖完整分子量質譜發現了正確配對的1+1的非對稱雙抗的目的蛋白，同時發現了H2L1(兩重鏈一輕鏈形式，缺CTLA-4臂輕鏈)的副產物以及PD-1輕鏈半胱胺酸綴合物(LCPD-1-Cys)的形成。可能是由於CTLA-4臂，特別是CTLA-4臂的輕鏈表達量不足，導致H2L1的大量產生。我們推測這類H2L1不完整的抗體分子需要額外的LCPD-1以進一步穩定結構；即便如此，經過精純後的TJ030-PR1104仍然沒有檢測到輕鏈錯配的產物。
4.4.2還原分子量檢測和脫糖還原分子量
採用1.3.3的方法進行還原分子量和脫糖還原分子量檢測，結果如圖4C所示，除了發現雙抗TJ030-PR1104對應的4條還原蛋白序列 以外，還原分子量和脫糖還原分子量質譜還檢測到了配對的CTLA-4重鏈和或輕鏈(HCCTLA-4-LCCTLA-4)，進一步確認了F170C-T164C非天然二硫鍵的正確形成。
4.5細胞交聯實驗
根據實施例1.4，採用流式方法檢測精純後的PD-1×CTLA-4雙特異抗體TJ030-PR1102(F126C-S121C置於CTLA-4臂)、TJ030-PR1104(F170C-T164C置於CTLA-4臂)、TJ030-PR1106(F126C-S121C置於PD-1臂)和TJ030-PR1108(F170C-T164C置於PD-1臂)分別對高表達人PD-1和人CTLA-4的細胞的共結合能力，其中CTLA-4單抗和IgG作為陰性對照。交聯實驗的結果表明，1+1非對稱的PD-1×CTLA-4雙抗能夠將表達PD-1的細胞和表達CTLA-4的細胞交聯到一起(表6和圖5)，並且雙抗濃度在0.03nM到10nM的濃度範圍裡，隨著濃度的逐漸提高，由細胞交聯產生的雙陽性細胞比例也逐漸升高。這種細胞交聯現象僅在雙抗分子孵育的情況下出現，單抗或IgG1孵育不會出現細胞交聯。另外，引入F170C-T164C這對非天然二硫鍵的雙抗分子TJ030-PR1104和TJ030-PR1108相對於已報導的F126C-S121C的非天然二硫鍵TJ030-PR1102在0.03nM-100nM的各濃度點均檢測到顯著更多的雙陽性細胞。
Figure 110145279-A0202-12-0094-70
實施例5 PD-1×CTLA-4雙抗表達中質粒配比的優化
採用實施例1.1的方法進行雙抗表達，在瞬轉表達過程中，我們提高了輕鏈的質粒配比(重鏈和輕鏈質粒莫耳比從1：1變為2：3)，希望降低“兩重鏈一輕鏈(H2L1)”構型抗體的對應比例。另外，我們在1+1非對稱雙抗的一個臂引入CH1/Cκ或其非天然二硫鍵突變體，另一臂引入CH1/Cλ或其非天然二硫鍵突變體，以便於後續使用Kappa Select或者Lambda Select進行純化，並且研究輕鏈亞型的選擇對降低輕鏈錯配的影響。表7給出了PD-1×CTLA-4雙抗序列和質粒配比信息。
Figure 110145279-A0202-12-0095-71
根據實施例1的方法精純PD-1×CTLA-4雙抗，並進行質譜分析。如表8所示，在PD-1×CTLA-4雙抗的CH1/CL界面引入非天然二硫鍵P171C-S165C(TJ030-PR1304和TJ030-PR1309)、F170C-T164C(TJ030-PR1317和TJ030-PR1313)後，無論將非天然二硫鍵置於CTLA-4臂還是PD-1臂，相對於採用天然二硫鍵的雙抗TJ030-PR1301和TJ030-PR1306具顯著提高了正確配對比例。
Figure 110145279-A0202-12-0096-72
以TJ030-PR1313為例，Lys-C酶切經過陽離子交換精純後的雙抗，表明Fab完全正確配對，無輕鏈錯配現象。脫糖完整分子量符合預期，無明顯缺少輕鏈的H2L1副產物出現(圖7)。
如表9所示，TJ030-PR1231和TJ030-PR1317相比，均在PD-1臂中引入胺基酸突變F170C-T164C，並且PD-1臂中輕鏈為κ亞型，兩者的區別僅在於TJ030-PR1231的CTLA-4臂中輕鏈為κ亞型，TJ030-PR1317的CTLA-4臂中輕鏈為λ亞型，TJ030-PR1317顯示出更高的正確 配對比例；即兩臂採用不同的輕鏈亞型有利於提高雙特異性抗體的正確配對比例。
Figure 110145279-A0202-12-0097-73
實施例6 引入靜電效應降低輕鏈錯配
在CH1第139位和CL第114位引入靜電效應突變後的雙抗分子TJ030-PR1220、TJ030-PR1221和TJ030-PR1222的序列和質粒配比信息在表7中示出，結果顯示引入靜電效應能夠降低輕鏈錯配。
向TJ030-PR1231的PD-1臂和CTLA-4臂的CH1第139位和CL第114位分別引入靜電效應突變後，得到雙抗分子TJ030-PR1230(序列和質粒配比信息如表7所示)，一步初純產物無輕鏈錯配(表10)，證明了HC139-LC114的靜電作用可以進一步降低輕鏈錯配。
Figure 110145279-A0202-12-0098-74
另外，結合表5可以看出，TJ030-PR1230與TJ030-PR1108相比，增加輕鏈(特別是表達弱的輕鏈CTLA-4臂)的轉染比例，也可以降低輕鏈錯配。
實施例7 非天然二硫鍵引入CH1/CL的PSMA 1+1雙表位抗體
按照表11所示的抗體序列和質粒配比構建PSMA 1+1不對稱雙表位抗體，同樣採用了KiH的方式實現重鏈的異源二聚(T366W；T366S/L368A/Y407V)的1+1非對稱雙特異性抗體，並對ProteinA初純後的產物進行質譜分析。經過GingisKHAN蛋白酶處理後的產物，均沒有發現輕鏈錯配產物(圖8)。
Figure 110145279-A0202-12-0099-75
SEQ ID NO：59(J591/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0099-76
SEQ ID NO：60(J591/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0099-77
Figure 110145279-A0202-12-0100-80
SEQ ID NO：61(006/HC，F170C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0100-81
SEQ ID NO：62(006/LC，T164C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0100-82
SEQ ID NO：63(J591/HC)
Figure 110145279-A0202-12-0101-83
SEQ ID NO：64(J591/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0101-84
SEQ ID NO：65(006/HC，P171C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0101-85
Figure 110145279-A0202-12-0102-86
SEQ ID NO：66(006/LC，S165C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0102-87
實施例8 FAP×CD40雙抗的表達純化和表徵
按照表12所示的抗體序列和質粒配比構建和表達FAP×CD40雙抗(分子形式參見圖9A)。
Figure 110145279-A0202-12-0102-78
SEQ ID NO：67(CD40-Fc-FAP/HC，P171C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0103-89
SEQ ID NO：68(CD40/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0103-90
SEQ ID NO：69(FAP/LC，S165C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0104-91
SEQ ID NO：70(CD40-Fc-FAP/HC，P171C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0104-92
SEQ ID NO：71(CD40/LC，S165C下劃線標注)
Figure 110145279-A0202-12-0105-93
SEQ ID NO：72(FAP/LC)
Figure 110145279-A0202-12-0105-94
Figure 110145279-A0202-12-0106-79
SEQ ID NO：78(CD40/VH)
Figure 110145279-A0202-12-0106-95
SEQ ID NO：79(CD40/VL)
Figure 110145279-A0202-12-0106-96
SEQ ID NO：86(FAP/VH)
Figure 110145279-A0202-12-0107-97
SEQ ID NO：87(FAP/VL)
Figure 110145279-A0202-12-0107-98
一步ProteinA純化以後的雙特異性抗體的SEC純度>99%，脫糖完整分子量，還原分子量和IdeS酶切後的分子量均符合預期，並未發現無法歸屬的副產物(圖9B、圖9C)。
如圖10A和圖10B所示，雙特異性抗體ERP2006-BS0012和ERP2006-BS0015與CD40的FACS結合EC50分別為0.471nM和0.456nM。ERP2006-BS0012和ERP2006-BS0015與FAP的FACS結合EC50分別為0.349nM和0.336nM。雙抗ERP2006-BS0012和ERP2006-BS0015對FAP的親和力與親本FAP單抗Ab10相當，對於CD40的親和力與親本CD40單抗9E5-25相當。
圖10C和圖10D顯示，ERP2006-BS0012和ERP2006-BS0015在沒有FAP存在的情況下具有CD40的激活活性，但是其活性弱於親本抗體9E5-25，這一特徵使得雙特異性抗體在FAP不存在的外周組織CD40激活活性下降，能降低CD40單抗的外周毒性。在FAP蛋白存在的情況下，ERP2006-BS0012和ERP2006-BS0015對CD40的激活活性明顯增強，說明具有FAP依賴的CD40激活活性，其對CD40的激活要強於 親本CD40單抗9E5-25，該特徵使得雙特異抗體在FAP高表達的腫瘤部位具有更強的CD40激活活性。
雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本揭露的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。

Claims (20)

  1. 一種二聚化多肽，其包含重鏈恆定區1(CH1)和輕鏈恆定區(CL)，其中，CH1和CL在選自(i-1)至(i-6)的位置中的一組或多組包含天然非半胱胺酸至半胱胺酸的胺基酸取代：
    (i-1)CH1的第170位和CL的第164位，
    (i-2)CH1的第128位和CL的第121位，
    (i-3)CH1的第129位和CL的第121位，
    (i-4)CH1的第131位和CL的第119位，
    (i-5)CH1的第141位和CL的第135位，和
    (i-6)CH1的第171位和CL的第165位。
  2. 如請求項1所述的二聚化多肽，其中，該CH1進一步包含天然半胱胺酸至非半胱胺酸的胺基酸取代，所述CL進一步包含天然半胱胺酸至非半胱胺酸的胺基酸取代；
    較佳地，該CH1進一步包含胺基酸取代C220A，該CL進一步包含胺基酸取代C214A。
  3. 如請求項1或2所述的二聚化多肽，其中，該CH1和CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
    (b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
    (b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
    (b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
    (b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
    (b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
    (b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
    (b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；
    較佳地，該CH1和CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
    (b)CH1中的F170C和CL中的T164C；或者
    較佳地，該CH1和CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中C220A和CL中的C214A；和
    (b)CH1中P171C和CL中的S165C。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的二聚化多肽，其中，該CH1和CL進一步包含使得CH1和CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代；
    較佳地，使得CH1和CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代位於CH1的第139位和CL的第114位；
    更佳地，所述CH1和CL進一步包含選自以下任一組的胺基酸取代：
    (1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
    (2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
    (3)CH1中的T139K和CL中的S114E；
    (4)CH1中的T139K和CL中的S114D；
    (5)CH1中的T139D和CL中的S114K；
    (6)CH1中的T139D和CL中的S114R；
    (7)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
    (8)CH1中的T139E和CL中的S114R。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的二聚化多肽，其中，該CH1和CL包含選自(1)-(4)中任一項的胺基酸取代：
    (1)CH1中的C220A和CL中的C214A；CH1中的F170C和CL中的T164C；和CH1中的T139R和CL中的S114E；
    (2)CH1中的C220A和CL中的C214A；CH1中的F170C和CL中的T164C；和CH1中的T139D和CL中的S114K；
    (3)CH1中的C220A和CL中的C214A；CH1中的P171C和CL中的S165C；和CH1中的T139R和CL中的S114E；和
    (4)CH1中的C220A和CL中的C214A；CH1中的P171C和CL中的S165C；和CH1中的T139D和CL中的S114K。
  6. 一種抗原結合蛋白，其包含如請求項1至5中任一項所述的二聚化多肽；較佳地，該抗原結合蛋白包含或是多特異性抗體，更佳雙特異性抗體。
  7. 如請求項6所述的抗原結合蛋白，其包含第一抗原結合域，其中該第一抗原結合域包含Fab，該Fab包含第一重鏈可變區VH1、第一輕鏈可變區VL1和如請求項1至6中任一項所述的二聚化多肽，該二聚化多肽中該CH1為第一CH1，該CL為第一CL；
    較佳地，該抗原結合蛋白還包含第二抗原結合域，其中該第二抗原結合域包含第二重鏈可變區VH2和第二輕鏈可變區VL2，並且該第一抗原結合域和第二抗原結合域結合不同的抗原或者結合同一種抗原上的不同的表位；
    更佳地，該第二抗原結合域包含Fab，該Fab包含第二重鏈可變區VH2、第二CH1、第二輕鏈可變區VL2和第二CL2。
  8. 如請求項7所述的抗原結合蛋白，其中，
    該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
    (b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
    (b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
    (b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
    (b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
    (b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
    (b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
    (b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；
    較佳地，該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
    (b)CH1中的F170C和CL中的T164C；
    或者
    較佳地，該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；和
    (b)CH1中的P171C和CL中的S165C。
  9. 如請求項7或8所述的抗原結合蛋白，其中，
    該第一CH1和第一CL進一步包含使得該第一CH1和第一CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代，
    較佳地，該胺基酸取代位於第一CH1的第139位和第一CL的第114位；和/或該第二CH1和第二CL包含使得第二CH1和第二CL之間形成靜電相互作用界面的胺基酸取代，較佳地，該胺基酸取代位於第二CH1的第139位和第二CL的第114位；
    更佳地，該第一CH1和第一CL進一步包含選自以下任一組的胺基酸取代：
    (1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
    (2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
    (3)CH1中的T139K和CL中的S114E；和
    (4)CH1中的T139K和CL中的S114D；和/或
    該第二CH1和第二CL包含選自以下任一組的胺基酸取代：
    (1)CH1中的T139D和CL中的S114K；
    (2)CH1中的T139D和CL中的S114R；
    (3)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
    (4)CH1中的T139E和CL中的S114R；或者
    更佳地，該第一CH1和第一CL包含選自以下任一組的胺基酸取代：
    (1)CH1中的T139D和CL中的S114K；
    (2)CH1中的T139D和CL中的S114R；
    (3)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
    (4)CH1中的T139E和CL中的S114R；和/或
    該第二CH1和第二CL包含選自以下任一組的胺基酸取代：
    (1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
    (2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
    (3)CH1中的T139K和CL中的S114E；和
    (4)CH1中的T139K和CL中的S114D。
  10. 如請求項7至9中任一項所述的抗原結合蛋白，其中，
    該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
    (b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
    (b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
    (b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
    (b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
    (b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
    (b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
    (b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
    (c)選自以下組中的任一組的胺基酸取代：
    (c-1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
    (c-2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
    (c-3)CH1中的T139K和CL中的S114E；和
    (c-4)CH1中的T139K和CL中的S114D；
    並且該第二CH1和第二CL包含選自以下任一組的胺基酸取代：
    (1)CH1中的T139D和CL中的S114K；
    (2)CH1中的T139D和CL中的S114R；
    (3)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
    (4)CH1中的T139E和CL中的S114R；
    或者，
    該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
    (b)選自以下組中的至少一組的胺基酸取代：
    (b-1)CH1中的F170C和CL中的T164C；
    (b-2)CH1中的L128C和CL中的S121C；
    (b-3)CH1中的A129C和CL中的S121C；
    (b-4)CH1中的S131C和CL中的P119C；
    (b-5)CH1中的A141C和CL中的L135C；和
    (b-6)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
    (c)選自以下組中的任一組的胺基酸取代：
    (c-1)CH1中的T139D和CL中的S114K；
    (c-2)CH1中的T139D和CL中的S114R；
    (c-3)CH1中的T139E和CL中的S114K；和
    (c-4)CH1中的T139E和CL中的S114R；
    並且該第二CH1和第二CL包含選自以下組中任一組的胺基酸取代：
    (1)CH1中的T139R和CL中的S114E；
    (2)CH1中的T139R和CL中的S114D；
    (3)CH1中的T139K和CL中的S114E；和
    (4)CH1中的T139K和CL中的S114D。
  11. 如請求項7至10中任一項所述的抗原結合蛋白，其中，
    (1)該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
    (b)CH1中的F170C和CL中的T164C；和
    (c)CH1中的T139R和CL中的S114E；
    並且該第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：
    CH1中的T139D和CL中的S114K；
    (2)該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
    (b)CH1中的F170C和CL中的T164C；和
    (c)CH1中的T139D和CL中的S114K；
    並且該第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：
    CH1中的T139R和CL中的S114E；
    (3)該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
    (b)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
    (c)CH1中的T139R和CL中的S114E；
    並且該第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：
    CH1中的T139D和CL中的S114K；或者
    (4)該第一CH1和第一CL包含以下胺基酸取代：
    (a)CH1中的C220A和CL中的C214A；
    (b)CH1中的P171C和CL中的S165C；和
    (c)CH1中的T139D和CL中的S114K；
    並且該第二CH1和第二CL包含以下胺基酸取代：
    CH1中的T139R和CL中的S114E。
  12. 如請求項7至11中任一項所述的抗原結合蛋白，其中，該第一CL來自抗體κ輕鏈(Cκ)；該第二CL來自抗體λ輕鏈(Cλ)或κ輕鏈(Cκ)；較佳地，該第一CL來自κ輕鏈且該第二CL來自λ輕鏈。
  13. 如請求項6至12中任一項所述的抗原結合蛋白，其中，該抗原結合蛋白還包含Fc區，該Fc區包含能夠彼此締合的第一亞基Fc1與第二亞基Fc2，該Fc1和/或該Fc2選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc。
  14. 如請求項13所述的抗原結合蛋白，其中，該Fc1和/或該Fc2包含改變該抗原結合蛋白的半衰期的修飾，其中該半衰期取決於FcRn結合親和力；該Fc1和/或該Fc2包含改變效應子功能的修飾，其中對Fcγ受體或C1q補體蛋白的結合親和力增大或減小；和/或該Fc1和Fc2中包含這樣的胺基酸取代，使得與Fc1相比，Fc1優先與Fc2配對。
  15. 如請求項7至14中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該第一抗原結合域特異性結合CTLA-4，且該第二抗原結合域特異性結合PD-1；或者，該第一抗原結合域特異性結合PD-1，且該第二抗原結合域特異性結合CTLA-4；
    較佳地，該第一抗原結合域包含：序列如SEQ ID NO：51所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：52所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：53所示的HCDR3，序列如SEQ ID NO：54所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：55所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：56所示的LCDR3；和/或該第二抗原結合域包含：序列如SEQ ID NO：43所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：44所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：45所示的HCDR3，序列如SEQ ID NO：46所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：47所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：48所示的LCDR3；或者
    該第一抗原結合域包含序列如SEQ ID NO：43所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：44所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：45所示的HCDR3，序列如SEQ ID NO：46所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：47所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：48所示的LCDR3；：和/或該第二抗原結合域包含：序列如SEQ ID NO：51所示的HCDR1，序列如SEQ ID NO：52所示的HCDR2，序列如SEQ ID NO：53所示的HCDR3，序列如SEQ ID NO：54所示的LCDR1，序列如SEQ ID NO：55所示的LCDR2，和序列如SEQ ID NO：56所示的LCDR3；
    更佳地，該第一抗原結合域包含：序列如SEQ ID NO：57所示的重鏈可變區和序列如SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區；和/或該第二抗原結合域包含：序列如SEQ ID NO：49所示的重鏈可變區和序列如SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區，或者
    該第一抗原結合域包含：序列如SEQ ID NO：49所示的重鏈可變區和序列如SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區；和/或該第二抗原結合域包含：序列如SEQ ID NO：57所示的重鏈可變區和序列如SEQ ID NO：58所示的輕鏈可變區。
  16. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至5中任一項所述的二聚化多肽或如請求項6至15中任一項所述的抗原結合蛋白。
  17. 一種宿主細胞，其包含如請求項16所述的核酸分子。
  18. 一種製備如請求項1至5中任一項所述的二聚化多肽或如請求項6至15中任一項所述的抗原結合蛋白的方法，其包括以下步驟：
    (1)用包含如請求項16所述的核酸分子的核酸表達載體轉化宿主細胞；
    (2)在容許合成該抗原結合蛋白的條件下培養該宿主細胞得到細胞培養物；和
    (3)從該細胞培養物中回收抗原結合蛋白；
    較佳地，該核酸表達載體包括編碼重鏈的質粒和編碼輕鏈的質粒，其中編碼重鏈的質粒與編碼輕鏈的質粒的莫耳比為1：(1-10)，較佳1：(1-5)，更佳2：3。
  19. 一種醫藥組成物，其包含如請求項6至15中任一項所述的抗原結合蛋白和藥學上可接受的載體。
  20. 一種如請求項1至5中任一項所述的二聚化多肽或如請求項6至15中任一項所述的抗原結合蛋白在製備藥物中的用途；
    較佳地，該藥物為治療癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病的藥物。
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