KR20210111767A - 절단된 다가 다량체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2개 이상의 결합 도메인을 포함하는 절단된 다가 다량체에 관한 것으로, 각각의 결합 도메인은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합하고, 상기 결합 도메인들 중 2개는 힌지(hinge) 영역을 통해 쌍형성되며, 상기 다량체는 CH2 또는 CH3 영역이 결여되어 있다. 본 발명은 2개의 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 상기 2개의 폴리펩티드는 그들 각각의 C-말단에서 또는 그 부근에서, 2개 이상의 이황화 가교(disulfide bridge)를 포함하여 쌍형성되며, 상기 폴리펩티드 각각은 가변 영역을 포함하는 가변 결합 도메인을 포함하며, 각각의 가변 영역은 동일하거나 상이한 항원 또는 항원 상의 에피토프에 결합한다.
Description
본 발명은, 2개 이상의 결합 도메인을 가지며, 이들은 그들의 C-말단에서 힌지(hinge)를 통해 쌍형성(pairing)된, 다가 다량체, 및 그러한 다가 다량체의 제조 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 2개 이상의 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있는 다가 다량체의 구성 폴리펩티드들에 관한 것이며, 그러한 폴리펩티드들은 이황화 가교(disulfide bridge)를 포함하는 공유 결합을 통해 쌍형성된다.
2개의 항원 또는 2개의 에피토프에 결합할 수 있는 다가 항체, 예컨대 이중특이성 항체가 당업계에 알려져 있다. 그러한 다가 결합 단백질은 세포 융합, 화학적 접합 또는 재조합 DNA 기법을 비롯한 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
항체는 전형적으로 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 포함하는 4개의 단백질로 구성되는 다량체이며, 여기서 중쇄는 1개의 가변 도메인(VH), 및 3개의 불변 영역(CH1, CH2, CH3)으로 구성되고, 경쇄는 1개의 가변 경쇄 도메인(VL) 및 1개의 불변 영역(CL)으로 구성된다. 전형적으로, 경쇄는 비공유 상호작용의 영향을 통해, 그리고 또한 이황화 결합을 통해 중쇄와 쌍형성한다. 2개의 중쇄는 이황화 결합을 통해 힌지 영역에서 쌍형성하고 2개의 CH3 도메인 사이의 계면에서의 아미노산 상호작용을 통해 쌍형성한다. VH와 VL의 쌍형성은 항원 결합 도메인을 형성하고, 전형적으로 가변성이 상보성 결정 영역 또는 CDR인 VH 및 VL 도메인의 3개의 표면 상의(superficial) 루프 형성 영역에서 발견된다.
2개의 상이한 항원, 또는 동일한 항원 내의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는, 2개의 상이한 결합 도메인을 갖는 항체, 예컨대 이중특이성 항체와 같은 소정의 다가 포맷이 당업계에 알려져 있다. 그러한 포맷은 다가 다량체가 1개의 항원을 발현하는 건강한 세포를 표적화하지 않으면서 종양 세포와 같은 2개의 항원 또는 에피토프를 발현하는 세포 또는 표적에 선택적으로 표적화되도록 하거나, 더 낮은 수준으로 1개의 항원을 발현하는 그러한 건강한 세포를 표적화할 수 있게 하는 보정된 결합의 사용을 가능하게 할 수 있다. 유사하게, 이중특이성 항체와 같은 다가 다량체 상에 2개의 상이한 결합 도메인을 갖는 것은 상이한 항원의 결합을 가능하게 할 수 있어서, 상기 다가 다량체는 단일 세포 또는 2개의 상호작용 세포 상의 억제 및 자극 분자를 모두 표적화하는 데 사용되어 다가 다량체의 향상된 효력을 가져올 수 있다. 다가 포맷은 또한 세포, 예를 들어 면역조절 세포를 재유도하는 데 사용될 수 있으며, 종양으로 재유도될 수 있다.
소정 다가 항체가 당업계에 기술되어 있지만, 다가 항체 포맷의 효율적인 생성을 가능하게 하는 새로운 포맷, 및 새로운 링커, 및 그러한 포맷을 제조하기 위한 새로운 방법이 당업계에 필요하며, 이를 위해서는 일련의 항원에 대한 결합 도메인이 용이하게 제조되고, 효율적으로, 안정하게, 그리고 매우 다양한 항원 및 에피토프에 결합할 수 있는 다가 다량체로 전환될 수 있으며, 이러한 포맷에는, CH2 및/또는 CH3 영역을 포함하는 Fc 영역이 (부분적으로 또는 전체적으로) 결여되어 있는 포맷이 포함된다.
F(ab')2 또는 F(ab')n(여기서, n = 2 이상) 포맷과 같이 Fc가 결여되어 있는 다중특이성 포맷을 생성하는 것은 기존의 다중특이성 항체에 비해 이익을 제공할 수 있다. 예를 들어, 면역조절 세포의 결합 또는 재유도가 그러한 세포 및 관심 항원을 표적화하는 것을 통해 이루어지도록 요구될 수 있는 경우, 그러한 표적화 모이어티(targeting moiety) 상의 Fc 성분의 존재는 소정의 응용에 있어서 효능에 악영향을 줄 수 있다.
유사하게, F(ab')n 다중특이성 포맷은 더 작은 크기가 바람직한 경우에 전장(full length) 포맷과 대비하여 바람직할 수 있으며, 이에는 고형 종양을 침윤시키고/시키거나 더 짧은 반감기를 제공할 잠재성으로 인해 바람직한 경우가 포함되며, 이때 그러한 특징은 투여 계획(dosing regimen)에 이익이 될 수 있는 경우에 해당된다. 중요한 점은, 상이한 표적을 갖는 2개 초과의 결합 도메인을 함유하는 F(ab')n을 조작하는 것은 전통적으로 시간-소모적이고/이거나, 비효율적이고/이거나, 비용이 많이 들었다는 것이다. 예를 들어, 다양한 방식을 통해 F(ab')2 모이어티를 생성하는 것이 당업계에 알려져 있으며, 이들 각각은 그 목적이 치료적 응용을 위한 그러한 모이어티의 균질한 배치(batch)의 대량 생산을 가져오는 것이라는 결점을 갖는다.
당업계에 알려진 F(ab')2를 생성하는 한 가지 방법은 화학적 수단에 의한 것이었다. Nisonoff 및 Rivers는 수십년 전에 화학적 쌍형성의 생성을 사용하였다(문헌[Nisonoff A, Rivers MM (1961) Arch Biochem Biophys 93:460]). 후속으로, 동종이작용성 및 이종이작용성 화학 시약을 사용하는 다양한 방법이 개발되어 왔다. 현재까지, 치료용 다중특이성 F(ab')n 후보의 개발을 위한 접근법으로서 효율적이게 또는 실현가능하게 사용될 수 있는 화학적 방법은 존재하지 않는데, 이는, 그러한 화학적 수단을 통해 초래될 수 있는 시간, 비용, 낮은 양 및 불균질성 때문이다. 유사하게, F(ab')n 모이어티의 화학적 합성의 그러한 수단은 또한 2개의 Fab 도메인을 쌍형성하는 합성 수단의 사용으로 인해 불리하였는데, 이러한 합성 수단은 치료적 응용에 있어서의 용도뿐만 아니라 생산 이슈에 관한 별도의 문제를 초래한다.
예를 들어, F(ab')2는 o-PDM을 사용하여 생성될 수 있다. 항체 "A"의 Fab' 단편을 o-PDM과 반응시켜, o-PDM(R)과 복합체화된 이웃자리(vicinal) 다이티올을 생성하고, SH 기 중 하나는 유리 말레이미드 기가 잔존하는 o-PDM에 결합되어 있다. Fab A-o-PDM을 유리 Fab' "B" 단편과 반응시켜, 2개의 Fab 사이에 티오에테르 결합을 생성한다. 이들 합성 생성 수단과 연관된 어려움은 그러한 실체(entity)들을 균질하게 정제하는 데 있어서의, 그리고 인간 항체의 힌지 영역을 변경시키지 않고서(이는 면역원성 및 생체내에서의 안정성의 결여로 이어질 수 있음) 그러한 모이어티를 작제하는 데 있어서의 어려움을 포함함에 유의해야 한다.
실제로, 그러한 인공 항체는 2000년대 동안 생성되었고, 화학적으로 쌍형성된 Fab를 사용한 임상 시험을 다양한 유형의 암의 치료를 위해 수행하였지만, 그 개념은 급강하되어 온 것으로 나타나는데, 그 이유에는 그들의 실현가능성의 결여로 인한 것이 포함된다.
F(ab')2 모이어티를 생성하는 다른 수단은 비특이적 프로테아제, 예컨대 파파인에 의한 부분 단백질 분해적 분해(proteolytic digestion)를 통해 수행되어 왔다. 그러한 효소는, 중쇄들을 쌍형성하는 이황화 결합을 함유하는 IgG 항체의 힌지 영역을 절단할 수 있지만, 또한 경쇄와 중쇄 사이의 이황화 결합의 부위 아래에서도 절단할 수 있다. 그러한 기법은 분해되지 않은 IgG의 존재, 과다분해, 및 재현성의 결여로 인한 문제가 있었다. 그러한 비특이적 프로테아제의 사용은 또한 전장 항체를 분해하여 Fc를 절단하는 것을 통해 F(ab')2 모이어티를 생성하는 수단으로서 사용되어 왔다. 이들 기법은 또한 시간-소모적이었으며, IgG-특이적 최적화, 및 프로테아제의 억제 또는 그들의 분해를 방지하기 위한 Fab의 정제를 필요로 하였다. 더욱이, 이들 분해는, 지나치게 분해되고, 불충분하게 분해되고, 절단 부위에 대해 정밀도가 없는 모이어티들의 불균질 집단으로 이어졌으며, 이는 연구 및 치료적 응용을 위한 그러한 모이어티의 사용을 비실용적이게 하였다. 단지 상부 힌지 영역만이 절단되고, 또한, 절단되는 항체의 구조 및 가요성에 따라 존재할 수 있는 대안적인 부위에서는 그렇지 않도록 파파인 분해를 제어하기란 어려웠다. 따라서, 파파인을 통해 2개 이상의 결합 도메인을 갖는 다가 항체를 분해하는 것은 소정 응용에 있어서는 부적절하고 실현 불가능하다. 유사하게, 펩신이 온전한 F(ab')2를 얻고자 하는 목적으로 항체를 힌지 영역 아래에서 절단하는 데 사용되어 왔다. 펩신에 대한 결점은 파파인과 유사하였다.
최근에는, 전장 면역글로불린의 Fc로부터 Fab 부분을 절단하여 개별 Fab 모이어티 또는 F(ab')2를 생성할 수 있는 효소가 문헌에 기재되어 왔다. 그러한 효소는 결합력(avidity) vs. 친화도의 차이를 평가하는 것 또는 주어진 다량체의 구성 부분의 분자량 또는 조성을 분석하는 것을 포함한 제한된 특성화 응용을 위한 것에서 기술되어 왔다.
따라서, Fc의 전부 또는 일부분이 결여되어 있고, Fab 영역들(F(ab')n)을 쌍형성하거나 가교하는 천연(화학적으로 합성되지 않은) 힌지를 갖고, 효율적으로 균질하게 생성될 수 있는 절단된 다가 다량체의 생성을 위한 2개 이상의 인간 가변 영역 및 링커를 갖는 다가 항원-결합 다량체에 대한 새롭고 유용한 포맷에 대한 필요성이 존재한다. Fc 영역이 결여되어 있고, 항원을 표적화할 수 있고, 치료적 응용에 사용할 수 있는 절단된 다가 다량체의 생성이 본 명세서에 기재된다.
본 발명은 2개 이상의 결합 도메인을 포함하는 다가 다량체에 관한 것으로, 각각의 결합 도메인은 상이한 항원 또는 에피토프 또는 동일한 항원 또는 에피토프에 결합하고, 상기 결합 도메인들 중 2개는 힌지(hinge) 영역을 통해 쌍형성되며, 상기 다량체는 CH2 또는 CH3 영역을 포함한 불변 도메인이 결여되어 있다.
본 발명은 2개의 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 상기 2개의 폴리펩티드는 그들 각각의 C-말단에서 또는 그 부근에서, 이황화 가교를 포함하여 쌍형성되며, 상기 폴리펩티드 각각은 가변 영역을 포함하며, 각각의 가변 영역은 동일하거나 상이한 항원 또는 항원 상의 에피토프에 결합한다. 상기 결합 도메인들은 바람직하게는 이들 자체가 가변 영역과 쌍형성되어 결합 도메인, 전형적으로는 VL-CL과 쌍형성된 VH-CH1을 형성하며, 여기서 VL 또는 VH는 다량체의 각각의 결합 도메인에서 공유되는 공통 사슬이다.
일 실시 형태에서, 다가 다량체는 가변 영역(VH1)의 짧은 아암 및 2개의 가변 영역(VH2 및 VH3)을 포함하는 긴 아암을 포함하는 3개 이상의 인간 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 각각의 중쇄는 scFv를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 각각의 중쇄 영역은 CH1 도메인을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 각각의 중쇄 가변 영역은 공통 경쇄(VLc)와 쌍형성된다. 다른 실시 형태에서, 공통 경쇄는 VL-CL을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 공통 경쇄는 서열 번호 1의 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 다량체의 각각의 중쇄는 공통 가변 영역(VHc)을 포함한다.
일 실시 형태에서, 가변 영역들, 바람직하게는 중쇄 가변 영역들 중 2개는 가변 영역 및 CH1 도메인을 통해 연결된다(도 1에서 파선 참조). 다른 실시 형태에서, 가변 영역들은 폴리펩티드 링커를 통해 연결된다. 다른 실시 형태에서, 폴리펩티드 상의 가변 영역들을 연결하는 링커는 서열 번호 2 내지 25를 포함하는 군으로부터 선택되는 서열, 또는 상기 서열들 중 하나와 적어도 약 85%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 링커는 짧거나, 길거나, 하전되거나, 강성이거나, 가요성이다. 다른 실시 형태에서, 링커의 아미노산 서열은 천연-발생 서열을 포함하거나 천연-발생 서열로부터 유래되는 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 링커는 중간 힌지 영역 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 링커는 상부 및 하부 힌지 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 링커는 나선-형성 서열을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 2개 이상의 상기 중쇄 가변 영역 중 2개는 그들 각각의 C-말단에서 또는 그 부근에서, 바람직하게는 2개 이상의 이황화 가교를 포함하여 서로 쌍형성되며(이량체화되며), 상기 이황화 가교는 CH1 영역과 CH2 영역 사이에 존재하는 천연 IgG 항체의 것과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 힌지 이황화 결합의 수는 면역글로불린 하위부류들 중에서 달라지며, 이들 각각은 본 명세서에 기재된 본 발명에 포함되는 것으로 당업계에서 이해된다(문헌[Papadea and Check 1989]).
일 실시 형태에서, 다량체의 각각의 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
다른 실시 형태에서, 다가 다량체는 적어도 2개의 상이한 항원에 결합한다.
본 발명은 또한 다가 다량체의 생성 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
공통 경쇄 가변 영역, 및 2개 이상의 표적에 특이적으로 결합하는 재배열된 중쇄를 포함하는 항체들의 패널을 얻는 단계;
상기 공통 경쇄 가변 영역, 및 2개 이상의 재배열된 중쇄를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에 통합시키는 단계 - 상기 재배열된 중쇄들 중 2개는 쌍형성할 수 있는 CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 불변 영역을 포함함 -;
상기 공통 경쇄 및 2개 이상의 재배열된 중쇄를 포함하는 온전한 다가 다량체의 발현을 제공하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 - 상기 재배열된 중쇄들 중 2개는 상기 2개의 재배열된 중쇄 각각의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에서 쌍형성됨 -; 및
상기 온전한 다가 다량체를 상기 2개의 재배열된 중쇄 각각으로부터 상기 CH2 및/또는 CH3 영역을 절단하는 효소로 처리하여, 상기 2개의 재배열된 중쇄의 쌍형성을 유지하여 상기 다가 다량체를 형성하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 다른 실시 형태에서, 항체들의 패널은 공통 경쇄 가변 영역 및 재배열되지 않은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자도입 동물을 표적으로 면역화함으로써 얻어진다.
본 명세서에 개시된 다른 실시 형태에서, 쌍형성은 2개 이상의 이황화 가교를 통해 이루어진다.
일 실시 형태에서, CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는, 상기 재배열된 중쇄들 중 2개의 중쇄 불변 영역은 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 변형은 면역글로불린 CH2 또는 CH3 영역 내에 있다. 다른 실시 형태에서, 변형은 각각의 2개의 중쇄에 대한 노브 인투 홀(knob into hole) 변형, 정전기(electrostatic) 변형, 또는 DEKK 변형이다. 다른 실시 형태에서, 숙주 세포에 의해 발현되는 다량체는 제2 CH3 도메인과 이량체화되는 제1 CH3 도메인을 포함하며, 이의 제1 CH3은 위치 351 및 366에 또는 이에 상응하는 위치에 아미노산 잔기 라이신을 포함하고, 이의 제2 CH3은 351에 또는 이의 상응하는 위치에 아스파르트산의 아미노산 잔기를 포함하고 368에 또는 이의 상응하는 위치에 글루탐산의 아미노산 잔기를 포함하며, 이때, 잔기 위치는 EU 넘버링에 따른다.
다른 실시 형태에서, 숙주 세포에는 상이한 항원에 결합할 수 있는 2개 이상의 상이한 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산이 통합되고, 2개 이상의 중쇄 가변 영역은 공통이며, 이에 따라 2개 이상의 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있는 다중특이성 다량체의 능력은 경쇄 가변 영역의 상이한 결합 특이성에 의해 기여된다.
일 실시 형태에서, 공통 가변 영역은 생식세포계열 내에 재배열된 가변 사슬을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자도입 동물, 바람직하게는 설치류에 의해 인코딩된 핵산으로부터 얻어지거나, 이로부터 유래되거나, 이를 기반으로 하는 핵산에 의해 인코딩된다.
일 실시 형태에서, 상기 방법은 다가 다량체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 2개의 중쇄의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 절단하는 효소는 친화성 크로마토그래피를 통해 제거될 수 있도록 태깅되고, 이어서 효소, 다가 다량체 및 불변 도메인 단편의 혼합물이 정제된다. 추가의 실시 형태에서, 효소는 전하-기반 크로마토그래피를 통해 다가 다량체와 절단된 불변 도메인의 혼합물로부터 제거될 수 있도록 하전된다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성되거나 얻어질 수 있는 다가 다량체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 다가 다량체로 조립될 수 있는 폴리펩티드들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 다가 다량체 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의학적 적응증(medical indication)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 다가 다량체의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 요법에 사용하기 위한 본 발명의 다가 다량체에 관한 것이다.
도 1a: 이전에 기재된 다가 다량체의 예시적인 포맷을 나타내고, 도 1b: 본 명세서에 개시된 본 발명의 예시적인 포맷을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 다가 다량체는 2개 이상의 이황화 가교를 통해 그들 각각의 C-말단에서 쌍형성된 2개의 폴리펩티드를 포함한다.
도 2a 내지 도 2e: 환원성 조건 및 비환원성 조건 하에서의 IgG, Fab, F(ab')2의 SDS-PAGE 분석.
도 3: 본 명세서에 개시된 방법을 통해 생성된 이중특이성 F(ab')2의 효능을 보여주는 헤레굴린(Heregulin)-의존적 MCF-7 증식 검정.
도 4a: 이전에 개시된 예시적인 다중특이성 포맷을 나타낸 것으로, 이 포맷은 공통 경쇄, 상이한 항원에 결합할 수 있는 3개의 별개의 재배열된 중쇄를 포함하며, 상기 별개의 중쇄들 중 2개는 DEKK 이종이량체화를 통해 쌍형성된다. 본 명세서에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 2019/190327호를 참조한다. 도 4b: 도 4b1에서 F(ab')3을 포함하는, 본 명세서에 개시된 본 발명의 예시적인 다가 다량체를 나타낸 것으로, 2개의 중쇄는 2개의 이황화 가교를 통해 그들 각각의 C-말단에서 쌍형성된다. 또한, 도 4b2에는 2Fab'(여기서는, 중쇄들을 쌍형성하는 이황화 가교가 절단되고, 2개의 Fab가 본 명세서에 기재된 링커를 통해 연결됨), 그리고 도 4b3에는 Fab가 도시되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 2Fab' 및 Fab는 3가 다량체가 각자의 중쇄 각각에 대해 CH1과 CH2 사이의 영역에서 절단될 때 생성된다. 이 도면은 제한적이지 않은데, 그 이유는, 추가의 결합 도메인이 VL 또는 VH 영역 중 어느 하나의 N-말단 영역에 링커를 부가하여 CH1-VH 또는 CL-VL 도메인 - 이는 동족 도메인과 쌍형성하여 추가의 결합 도메인을 형성할 수 있음 - 을 연결함으로써 베이스 F(ab')2 모이어티에 모듈러 포맷으로 부가될 수 있기 때문이다.
도 5의 A 내지 도 5의 D: 환원성 및 비환원성 조건 하에서의 3가 IgG 분자의 SDS-PAGE 분석으로서, 이는 IgG, Fab, F(ab')3 다량체의 성공적인 생성을 입증한다.
도 2a 내지 도 2e: 환원성 조건 및 비환원성 조건 하에서의 IgG, Fab, F(ab')2의 SDS-PAGE 분석.
도 3: 본 명세서에 개시된 방법을 통해 생성된 이중특이성 F(ab')2의 효능을 보여주는 헤레굴린(Heregulin)-의존적 MCF-7 증식 검정.
도 4a: 이전에 개시된 예시적인 다중특이성 포맷을 나타낸 것으로, 이 포맷은 공통 경쇄, 상이한 항원에 결합할 수 있는 3개의 별개의 재배열된 중쇄를 포함하며, 상기 별개의 중쇄들 중 2개는 DEKK 이종이량체화를 통해 쌍형성된다. 본 명세서에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 2019/190327호를 참조한다. 도 4b: 도 4b1에서 F(ab')3을 포함하는, 본 명세서에 개시된 본 발명의 예시적인 다가 다량체를 나타낸 것으로, 2개의 중쇄는 2개의 이황화 가교를 통해 그들 각각의 C-말단에서 쌍형성된다. 또한, 도 4b2에는 2Fab'(여기서는, 중쇄들을 쌍형성하는 이황화 가교가 절단되고, 2개의 Fab가 본 명세서에 기재된 링커를 통해 연결됨), 그리고 도 4b3에는 Fab가 도시되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 2Fab' 및 Fab는 3가 다량체가 각자의 중쇄 각각에 대해 CH1과 CH2 사이의 영역에서 절단될 때 생성된다. 이 도면은 제한적이지 않은데, 그 이유는, 추가의 결합 도메인이 VL 또는 VH 영역 중 어느 하나의 N-말단 영역에 링커를 부가하여 CH1-VH 또는 CL-VL 도메인 - 이는 동족 도메인과 쌍형성하여 추가의 결합 도메인을 형성할 수 있음 - 을 연결함으로써 베이스 F(ab')2 모이어티에 모듈러 포맷으로 부가될 수 있기 때문이다.
도 5의 A 내지 도 5의 D: 환원성 및 비환원성 조건 하에서의 3가 IgG 분자의 SDS-PAGE 분석으로서, 이는 IgG, Fab, F(ab')3 다량체의 성공적인 생성을 입증한다.
본 발명은 2개 이상의 가변 영역을 포함하는 다가 다량체에 대한 새로운 모듈러 포맷에 기초하며, 가변 영역들 중 2개는 그들 각각의 C-말단에서 천연 IgG 항체에서와 같이 상기 가변 영역들을 쌍형성하는 2개 이상의 이황화 가교를 포함하며, 상기 다가 다량체는 2개 이상의 상이한 항원 또는 에피토프를 결합할 수 있다. 상기 다가 다량체는 항체 Fc 영역(CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함함)이 결여되어 있고, 상기 다가 다량체가 F(ab')n을 포함하도록 생성될 수 있으며, 여기서 n은 2 이상이다.
이들 다가 다량체는 전형적인 항체 단편, 예컨대 통상적인 F(ab')2와는 상이한데, 그 이유는, 본 명세서에 기재된 F(ab')2 또는 F(ab')n을 포함한 다가 다량체는 동일하거나 상이한 항원에 결합할 수 있고, IgG의 펩신 분해 이후에 생성된 Fab' 단편의 환원 및 재산화에 의해 얻어지지 않고, 오히려, DEKK 조작에 의한 것을 포함한 이종이량체화 쌍형성 이후의 Fc의 효소적 절단 후에 얻어지기 때문인데, 이때 효소적 절단은 이황화 가교를 통해 F(ab')n 폴리펩티드들을 연결하는 천연 힌지를 온전하게 남긴다. 이들 다가 다량체는 각각의 결합 도메인에서 공통 사슬(중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나)을 선택적으로 포함하고, 링커를 사용하여 상기 결합 도메인들 중 2개 이상을 연결한다.
이들 다가 다량체는 더 짧은 반감기 - 이는 체내의 더 적은 축적과 연관될 수 있으며, 그럼으로써 그들의 분해 생성물로부터 야기될 수 있는 위험을 감소시킬 수 있음 -, 및 항체 농도에 대한 더 신속한 조정 - 이는, 예를 들어 치료용 다가 다량체가 임상 효능을 갖지만, 신체로부터의 신속한 클리어런스를 필요로 하는 경우에 이익일 수 있음 - 의 잠재적인 이점을 갖다. 또한, 다가 다량체는 결합 도메인들을 쌍형성하기 위한 합성 성분, 예컨대 (scFv)2, 다이-scFv 및 다이아바디 모이어티를 함유하는 온전한 항체 또는 항체 결합 단편보다 더 적은 면역원성을 나타낼 수 있다. F(ab')n 모이어티의 본 명세서에 개시된 발명은 각각의 결합 도메인, 예컨대 Fab에서 공통 사슬을 포함하여 새롭고 용이하게 생성가능하며, 링커를 통해 2개 이상의 Fab를 연결하면서, 안정성을 증가시키는 CH1/CL 쌍형성을 포함하며, 여기서 상기 링커는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 단백질 분해 효소에 의해 인식되는 모티프를 포함하지 않는다.
정의
"항체"는 항원 상의 에피토프와 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유하는, 단백질의 면역글로불린 부류에 속하는 단백질성 분자이며, 여기서 그러한 도메인은 항체의 가변 영역으로부터 유래되거나 그와 서열 상동성을 공유한다.
항체 결합은 특이성 및 친화도를 포함하여 다양한 특성을 갖는다. 특이성은 어느 항원 또는 그의 에피토프가 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는지를 결정한다. 친화도는 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합의 강도에 대한 척도이다. 본 명세서에서, 항체의 '특이성'은 특정 항원에 대한 그의 선택성을 지칭하는 반면에, '친화도'는 항체의 항원 결합 부위와 이것이 결합하는 에피토프 간의 상호작용 강도를 지칭한다는 것에 주목하는 것이 편리하다.
따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합 특이성"은 항원 결정기와 반응하는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 다량체의 결합 부위는 Fab 도메인에 위치하고, 중쇄 및/또는 경쇄의 초가변 영역으로 구성된다.
"친화도"는 단일 항원 결합 부위와 이의 항원 사이의 상호작용 강도이다. 항원에 대한 본 발명의 다량체의 단일 항원 결합 부위는 해리 상수(KD)로 표현될 수 있다. 전형적으로, 치료적 응용을 위한 항체는 최대 1x1010 M 또는 심지어 그 이상의 친화도를 가질 수 있다.
"항원"은 숙주 생물에서 (항체를 생성하기 위해) 면역반응을 유도할 수 있고/있거나 항체에 의해 표적화될 수 있는 분자이다. 분자 수준에서, 항원은 항체의 항원 결합 부위에 의해 결합되는 그의 능력을 특징으로 한다. 또한, 항원의 혼합물은 '항원'으로 간주될 수 있는데, 즉, 당업자는 때때로 종양 세포 용해물 또는 바이러스 입자가 '항원'으로 표시될 수 있는 반면에, 그러한 종양 세포 용해물 또는 바이러스 입자 제제는 많은 항원 결정기(예를 들어, 에피토프)를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 항원은 적어도 하나의, 그러나 종종 더 많은 에피토프를 포함한다.
"에피토프" 또는 "항원 결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위이다. 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 불연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다(이른바 각각 선형 에피토프 및 입체구조 에피토프). 연속 선형 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시에 보유되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프의 경우는, 그들의 입체구조가 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간 입체구조 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함할 수 있다.
용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열(또는 이의 기능성 단편)을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한, 임의의 유기체로부터의 중쇄 가변 도메인(또는 이의 기능성 단편)을 포함한다. 용어 "중쇄 가변 도메인"은 달리 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, 및 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 (N-말단에서 C-말단으로), 가변 도메인, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 그리고 CH3 도메인을 포함한다. 중쇄의 기능성 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 중쇄는, 예를 들어 동족 경쇄에 의해 선택적으로 결합된 에피토프에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다.
용어 "경쇄" 또는 "면역글로불린 경쇄"는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 또는 VL(또는 이의 기능성 단편); 및 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 불변 도메인, 또는 CL(또는 이의 기능성 단편) 서열을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "경쇄"는 인간 카파, 람다 및 이들의 조합으로부터 선택되는 경쇄를 포함할 수 있다. 경쇄 가변(VL) 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 경쇄는 동족 중쇄에 의해 선택적으로 결합된 에피토프에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다.
본 발명의 다가 다량체에 사용하기에 적합한 경쇄는 기존 항체 라이브러리(웨트 라이브러리 또는 컴퓨터 모의실험(in silico))에서 가장 일반적으로 사용되는 경쇄를 스크리닝하여 확인될 수 있는 것과 같은 공통 경쇄를 포함하며, 상기 경쇄는 중쇄의 에피토프 결합 도메인의 친화도 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않으며, 일련의 중쇄와 쌍형성하는 데에도 적합하다. 예를 들어, 적합한 경쇄는 게놈에 통합된 공통 경쇄를 포함하고, 항원에 노출 시에 중쇄에 다양성을 갖는 공통 경쇄 항체의 대형 패널을 생성하는 데 사용될 수 있는 유전자도입 동물, 예컨대 유전자도입 설치류로부터 유래된 것을 포함한다. 다가 다량체 발명에서 사용하기에 적합한 중쇄는 유사하게 공통 중쇄를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "공통 경쇄"는 동일할 수 있거나, 본 발명의 다량체의 결합 특이성에 영향을 주지 않으면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있으며, 즉, 상기 차이가 기능성 결합 영역의 형성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 경쇄를 지칭한다.
예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 공통 사슬의 정의의 범위 내에서는, 예를 들어 보존적 아미노산 변화, 동족 사슬과 쌍형성할 때 결합 특이성에 기여하지 않거나 단지 부분적으로 기여하는 영역 내에서의 아미노산의 변화 등을 도입 및 시험함으로써, 동일하지 않지만 여전히 기능적으로 등가인 가변 사슬을 제조하거나 찾아내는 것이 가능하다. 따라서, 그러한 변이체는 또한 다양한 동족 사슬에 결합하고, 기능성 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '공통 경쇄'는 동일할 수 있거나, 중쇄와 쌍형성한 후에 생성된 항체의 결합 특이성을 유지하면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 지칭한다. 특정 공통 경쇄와 그러한 기능적으로 동등한 변이체의 조합은 용어 "공통 경쇄" 내에 포함된다.
용어 "천연 힌지 영역"은 면역글로불린 부류의 중쇄의 중심 부분에서 변형되지 않은 가요성 도메인간 영역을 지칭하며, 이것은 이황화 결합에 의해 이들 2개의 사슬을 연결한다.
힌지 영역은 면역글로불린 부류의 중쇄의 중심부(즉, Fab를 Fc에 연결하는 부분)의 가요성 아미노산 스트레치이며, 이황화 결합에 의해 이들 2개의 중쇄와 쌍형성한다. 이는 시스테인 및 프롤린 아미노산이 풍부하며, 임의의 다른 면역글로불린 영역과 거의 유사하지 않다.
"Fab 도메인"은 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 전형적으로 쌍형성된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 의미한다. Fab 도메인은 불변 경쇄 도메인(CL) 및 VL 도메인과 쌍형성된 CH1 및 VH 도메인을 포함한 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다. 그러한 쌍형성은, 예를 들어 CH1 및 CL 도메인에서의 이황화 가교를 통한 공유 결합으로서 일어날 수 있다.
"변형된 Fab 도메인"은 CH1 및 VH 도메인을 포함하는 결합 도메인을 의미하며, 상기 VH는 VL 도메인과 쌍형성되고, CL 도메인은 존재하지 않는다. 대안적으로, "변형된 Fab 도메인"은 CL 및 VL 도메인을 포함하는 결합 도메인이며, 상기 VL은 VH 도메인과 쌍형성되고, CH1 도메인은 존재하지 않는다. CH1 또는 CL 영역이 쌍형성되지 않은 형태로 존재할 수 있기 위해서는, 소수성 영역의 길이를 제거하거나 줄이는 것이 필요할 수 있다. 단일 사슬 항체를 천연적으로 발현하는 동물종, 예를 들어 라마 또는 낙타와 같은 낙타과 동물 또는 상어의 CH1 영역이 사용될 수 있다. 변형된 Fab 도메인의 다른 예에는 동족 영역과 쌍형성되지 않는 불변 영역, CH1 또는 CL 및/또는 동족 영역과 쌍형성되지 않는 가변 영역 VH 또는 VL을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "온전한" 항체는 항원-결합 부위뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
용어 "재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 외인성 DNA가 내부로 도입된 세포를 지칭한다. 그러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 지칭한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후세대에서 소정의 변형이 일어날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 일 실시 형태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 진핵 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 숙주 세포는 원핵 세포주 E. 콜라이(E. Coli); 포유류 세포주 CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 및 PER.C6; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '면역 이펙터 세포' 또는 '이펙터 세포'는 표적 세포의 생존력에 영향을 주도록 활성화될 수 있는 포유류 면역 시스템 내의 세포들의 천연 레퍼토리 내의 세포를 지칭한다. 면역 이펙터 세포는 림프계 계통의 세포, 예컨대 자연 살해(NK) 세포, T 세포(세포독성 T 세포를 포함함), 또는 B 세포를 포함하지만, 또한 골수계 계통의 세포가 면역 이펙터 세포로 간주될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 단핵구 또는 대식세포, 수지상 세포 및 호중구성 과립구가 있다. 바람직한 이펙터 세포는 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구성 과립구를 포함한다.
본 명세서에서 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 언급할 때 "퍼센트(%) 동일성"은 최적의 비교 목적을 위하여 선택된 서열과 후보 서열을 정렬시킨 후, 선택된 서열 내의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 잔기의 백분율로서 정의된다. 핵산 서열들을 비교하는 퍼센트 서열 동일성은, 변형된 ClustalW 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680]), swgapdnarnt 점수 행렬, 15의 갭 개방 페널티(gap opening penalty) 및 6.66의 갭 연장 페널티(gap extension penalty)를 채택하는, 디폴트 설정을 사용한 Vector NTI Program Advance 10.5.2 소프트웨어의 AlignX 애플리케이션을 사용하여 결정된다. 아미노산 서열들은 변형된 ClustalW 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994]), blosum62mt2 점수 행렬, 10의 갭 개방 페널티 및 0.1의 갭 연장 페널티를 채택하는, 디폴트 설정을 사용한 Vector NTI Program Advance 11.5.2 소프트웨어의 AlignX 애플리케이션을 사용하여 정렬된다.
본 명세서에서, 용어 "연결된" 또는 "결합된"은 1차 아미노산 서열에서의 펩티드 결합에 의해 서로 결합되는 도메인들을 지칭한다. 예를 들어, VH-CH1-CH2-CH3를 포함하는 가변 영역 부분의 중쇄는 링커(CH1에서의 추가의 결합 도메인의 중쇄를 가변 영역 부분의 VH 영역에 연결함)를 통해 추가의 결합 도메인 VH-CH1(또는 추가의 결합 도메인-추가의 결합 도메인)의 중쇄에 연결될 수 있으며, 이는 함께 하나의 폴리펩티드 사슬을 구성한다. 유사하게, CH1 도메인은 가변 중쇄 영역에 연결될 수 있고, CL 도메인은 가변 경쇄 영역에 연결될 수 있다. 용어 "링커"는 아미노산 잔기, 또는 2개의 폴리펩티드를 연결하는 데 사용되는 펩티드 결합에 의해 결합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.
"쌍형성"은 다량체화할 수 있도록 본 발명의 다가 다량체를 구성하는 폴리펩티드들 사이의 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 추가의 결합 도메인은 경쇄 영역(VL-CL)에 쌍형성된 중쇄 영역(VH-CH1)을 포함할 수 있으며, 여기서 CH1 및 CL은 쌍형성하여 상기 결합 도메인을 형성한다. 유사하게, 가변 영역, CH1, CH2, 및/또는 CH3 도메인을 각각 포함하는 2개의 중쇄 폴리펩티드는, IgG1에 대해 일어날 때 2개 이상의 이황화 결합(또는, 예를 들어 IgG3에서와 같이 그 이상의 이황화 결합)의 형성을 통해 각각의 폴리펩티드의 각각의 CH1 및 CH2 도메인 사이에서 함께 쌍형성될 수 있다. 2개의 중쇄 폴리펩티드는 CH3 도메인에서 추가로 쌍형성될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체 도메인(예를 들어, 중쇄 및 경쇄)의 쌍형성은 비공유 상호작용으로 인해, 그리고 또한 이황화 결합을 통해 추가로 일어날 수 있으며, 본 명세서에 개시된 기법을 통해 그리고 당업계에 알려진 방법에 의해 조작될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다", "구비하다" 및 "갖는" 및 변형 형태, 예컨대 "포함한다", "포함하는", "구비한다" 및 "구비하는"은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이러한 단어는 문맥상 허용되는 경우, 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소 또는 정수의 포함 가능성을 전하고자 한다.
관사("a" 및 "an")는 본 명세에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 하나 또는 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미할 수 있다.
다가 다량체의 다양한 포맷
본 발명은 절단된 다가 다량체를 제공하며, 상기 절단된 다가 다량체는 그의 2개 이상의 결합 도메인을 통해 그의 표적 또는 표적들에 결합할 수 있다. 본 발명의 다가 다량체는 항원에 결합할 수 있는 2개 이상의 가변 영역 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 중요한 점은, 상기 다량체는 Fc 영역의 전부 또는 일부분, 바람직하게는 전체 Fc가 결여되어 있다는 것이다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 다량체는 2개의 중쇄 영역을 포함하며, 이들은 힌지, 바람직하게는 천연 힌지, 그리고 더 바람직하게는 2개 이상의 이황화 결합을 포함하는 천연 힌지를 통해 그들 각각의 C-말단에서 쌍형성된다.
일부 실시 형태에서, 다량체는 하나 이상의 추가의 결합 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 다량체는 VL-CL 영역에 쌍형성된 VH-CH1 영역을 포함하는 Fab 도메인을 포함한다.
따라서, 상기 다가 다량체는 3개의 VH 영역 및 3개의 VL 영역을 포함할 수 있다. VH 또는 VL 중 어느 것도 에피토프 또는 항원에 대한 결합 특이성이 비공통 사슬에 의해 부여된 것, 또는 동족 사슬의 재배열된 가변 영역에 쌍형성된 공통 가변 영역(VHc 또는 VLc)일 수 있다. 예를 들어, 3개의 VL 영역은 공통 사슬(VLc)일 수 있고, 각각의 VH 영역(VH1 내지 VH3)은 재배열된 가변 영역을 포함할 수 있으며, 상기 VH1, VH2 및 VH3 영역은 동일한 에피토프 또는 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 도 1a에 도시된 바와 같이, VH1은 짧은 아암을 지칭하는 데 사용되고, VH2 및 VH3은 긴 아암을 지칭하는 데 사용되며, 여기서 VH2는 내측 아암으로서, 이는 그들 각각의 C-말단에서 VH1에 쌍형성되고, VH3은 원위 아암을 지칭하는 데 사용된다.
여기서, 다가 다량체는 공통 경쇄(VLc) 및 3개의 중쇄 가변 영역(VH1 내지 VH3)을 포함하며, VLc-CL과 쌍형성된 VH3-CH1로 구성된 추가의 Fab 도메인은 VH2 영역 또는 VLc와 추가의 Fab 도메인의 CH1 또는 추가의 Fab 도메인의 CL 사이에 위치된 링커를 통해 가변 영역에 연결될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 다가 다량체를 구성하는 개별 폴리펩티드는 동일한 단백질 내의 중쇄와 경쇄를 혼합할 수 있다. 본 발명의 다가 다량체는 변형된 Fab 도메인을 포함할 수 있다. 변형된 Fab 도메인은 변형된 CH1을 포함할 수 있어서, CL과 쌍형성할 필요가 없다. 예를 들어, CH1은 낙타과 동물의 CH1일 수 있거나, 낙타과 동물의 CH1을 기반으로 하거나, 당업계에 알려진 기법을 통해 소수성 잔기가 결여되도록 변형될 수 있다. 각각의 VH 또는 VL은 공통 또는 재배열된 가변 영역일 수 있다.
본 발명의 다가 다량체는 CH1과 쌍형성할 필요가 없는 변형된 Fab 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, CL은 소수성 영역을 제거하도록 조작될 수 있다. 변형된 Fab 도메인의 각각의 VH 또는 VL은 공통 또는 재배열된 가변 영역일 수 있다. 추가의 변형된 Fab 도메인은 가변 영역 부분의 VL과 변형된 Fab 도메인의 CL 사이에 위치된 링커를 통해 가변 영역 부분에 연결될 수 있다. 변형된 Fab 도메인의 VH 및 VL은 시스테인 가교를 통해 쌍형성될 수 있다. 본 발명의 다가 다량체는 CH1과 쌍형성할 필요가 없는 변형된 CL을 포함하는 변형된 Fab 도메인을 포함할 수 있다.
다가 다량체의 생성
일 실시 형태에서, 다가 다량체는 온전한 다가 항체의 효소적 분해에 의해 생성되거나, 또는 상기 다가 다량체를 천연 힌지 또는 상기 다가 다량체의 폴리펩티드들의 쌍형성을 온전하게 남기는 특정 영역에서 절단함으로써 생성될 수 있다. 온전한 항체는 전장 면역글로불린, 예를 들어 전장 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 부분일 수 있지만, 바람직하게는 IgG, 더 바람직하게는 IgG1일 수 있다.
다가 다량체의 중쇄는 온전한 항체의 CH3 영역에서 DEKK 변형을 조작하는 것과 같은 당업자에게 알려진 기법을 통해 우선적으로 쌍형성하도록 설계될 수 있다. 중쇄들의 이종이량체화를 유도하기 위한 CH3 영역에서의 조작을 보여주는 국제 특허 출원 공개 WO2013/157954호 및 문헌[De Nardis et al., J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706-14717]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 이종이량체화를 유도하기 위한 대안적인 접근법이 사용될 수 있으며, 이에는 노브-인-홀(knob-in-hole) 포맷(국제 특허 출원 공개 WO1998/050431호) 및 전하 조작(charge engineering)의 사용(문헌[Gunasekaran, JBC 2010, vol 285, pp 19637-19646]), 및 당업계에 알려진 다른 적합한 기법이 포함된다.
다가 다량체 포맷에 사용하기 위한 링커
본 발명의 다가 다량체는 하나 이상의 가변 영역을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 링커가 연결된 결합 도메인과 함께, 다가 다량체의 기능성을 적어도 부분적으로 결정할 수 있다.
링커는 힌지 서열을 포함하거나, 힌지 서열을 기반으로 하는 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 적합한 링커의 아미노산 서열은 천연-발생 서열을 포함하거나, 천연-발생 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 한 서열을 포함할 수 있다. 그러한 서열의 사용은 본 발명의 다가 항체의 개발 가능성에 도움이 될 수 있고/있거나, 낮은 면역원성을 보장하는 데 도움이 될 수 있다. 본 출원의 목적상, 링커는 Fc로부터 Fab 또는 F(ab')n을 절단하는 데 사용되는 임의의 효소에 대한 효소 인식 부위를 함유하지 않는 것이 바람직하며, 이에 따라 효소는 결합 도메인들 사이의 결합을 유사하게 절단하게 될 것이다. 예를 들어, 공통 경쇄(VLc) 및 3개의 중쇄 가변 영역(VH1 내지 VH3)을 포함하는 3개의 Fab 도메인을 포함하는 절단된 다가 다량체가 생성되는 경우, VLc-CL과 쌍형성된 VH3-CH1을 VH1 또는 VH2 영역 또는 VLc 영역에 연결하는 링커는 Fab, 2Fab' 또는 F(ab')3으로부터 Fc를 절단할 수 있는 효소에 의해 인식되는 아미노산 모티프를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
따라서, 하나 이상의 추가의 결합 도메인을 2개 이상의 가변 영역에 연결하기에 적합한 링커는 IgG 또는 IgA 힌지 서열로부터 유래될 수 있다. 링커 영역은 IgG1 힌지 영역, IgG2 힌지 영역, IgG3 힌지 영역 또는 IgG4 힌지 영역을 기반으로 할 수 있다.
전형적으로, 사용되는 힌지 영역의 유형은 링커가 연결된 추가의 Fab 도메인의 불변 영역, 예를 들어 CH1의 유형과 일치된다. 즉, 링커가 IgG1 힌지 영역으로부터의 서열 또는 서열들을 기반으로 하는 경우, 연결된 추가의 Fab 도메인의 CH1은 IgG1으로부터의 CH1이다.
항체의 링커는 상부, 중간 또는 하부 힌지 영역, 또는 그러한 영역의 하위세트를 기반으로 할 수 있다.
IgG1 힌지 영역은 서열: EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(서열 번호 26)을 갖는다.
상부 힌지 영역은 EPKSCDKTHT(서열 번호 3)로 정의된다.
중간 힌지 영역은 CPPCP(서열 번호 27)로 정의된다.
하부 힌지 영역은 APELLGG(서열 번호 28)로 정의된다.
따라서, 본 발명의 다량체에서, 링커는 이들 서열 중 하나 이상 및/또는 이들 서열 중 하나 이상으로부터 유래되거나 이를 기반으로 하는 서열을 포함할 수 있다.
IgG2 힌지 영역은 서열: ERKCCVECPPCPAPPVAG(서열 번호 29)를 갖는다.
상부 힌지 영역은 ERKCCVE(서열 번호 30)로 정의된다.
중간 힌지 영역은 CPPCP(서열 번호 27)로 정의된다.
하부 힌지 영역은 APPVAG(서열 번호 31)로 정의된다.
따라서, 본 발명의 다량체에서, 링커는 이들 서열 중 하나 이상 및/또는 이들 서열 중 하나 이상으로부터 유래되거나 이를 기반으로 하는 서열을 포함할 수 있다.
IgG3 힌지 영역은 서열:
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPEFLGG(서열 번호 32)를 갖는다.
상부 힌지 영역은 ELKTPLGDTTHT(서열 번호 7)로 정의된다.
중간 힌지 영역은 CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP(서열 번호 33)로 정의된다
하부 힌지 영역은 APEFLGG(서열 번호 34)로 정의된다.
IgG4 힌지 영역은 서열: ESKYGPPCPSCPAPEFLGG(서열 번호 35)를 갖는다.
상부 힌지 영역은 ESKYGPP(서열 번호 2)로 정의된다
중간 힌지 영역은 CPSCP(서열 번호 36)로 정의된다.
하부 힌지 영역은 APEFLGG(서열 번호 34)로 정의된다.
컨센서스 서열 CXXC를 갖는 중간 영역은 야생형 IgG와 관련하여 두 IgG 중쇄 모두를 연결하며, 강성이다. 이러한 이황화 가교는 현재 응용에 필요하지 않으며, 따라서 링커가 중간 힌지 서열을 포함하는 경우, 바람직하게는 CXXC 컨센서스의 하나 또는 둘 모두의 Cys 잔기는, 예를 들어 Ser 잔기로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, CxxC는 SxxS일 수 있다.
본 발명의 다가 다량체에 사용하기에 적합한 링커는 중간 힌지 서열, 예를 들어 중간 힌지 서열을 포함하지만 하부 및/또는 상부 힌지 서열을 포함하지 않는 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 한 것일 수 있다. 본 발명의 다가 다량체에 사용하기에 적합한 링커는 상부 힌지 서열, 예를 들어 상부 힌지 서열을 포함하지만 하부 및/또는 중간 힌지 서열을 포함하지 않는 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 한 것일 수 있다. 본 발명의 다가 다량체에 사용하기에 적합한 링커는 중간 힌지 서열을 포함하지 않는 것, 예를 들어 하부 힌지 서열과 상부 힌지 서열의 조합을 포함하는 서열로 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다량체에서, 링커는 이들 서열 중 하나 이상 및/또는 이들 서열 중 하나 이상으로부터 유래되거나 이를 기반으로 하는 서열을 포함할 수 있다. 링커는 중간 힌지 영역 서열로 본질적으로 이루어지거나, 그러한 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 할 수 있거나, 또는 상부 및 하부 힌지 영역 서열로 본질적으로 이루어지거나, 그러한 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 할 수 있다.
본 발명의 다량체에 사용하기에 적합한 링커는 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가(또는 이들의 조합)가 이루어진 본 명세서에 기재된 임의의 링커 서열의 아미노산 서열을 포함하는 서열에 대하여 정의될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 본 명세서에 기재된 링커 서열에 대하여, 0 내지 4개, 바람직하게는 0 내지 3개, 바람직하게는 0 내지 2개, 바람직하게는 0 또는 1개, 바람직하게는 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가(또는 이들의 조합)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
적합한 링커는 길이가 약 7 내지 약 29개의 아미노산, 예를 들어 길이가 약 10 내지 약 20개의 아미노산일 수 있다. 그러나, 적합한 링커는 짧은 링커, 예를 들어 길이가 약 7 내지 약 10개의 아미노산일 수 있거나, 긴 링커, 예를 들어 길이가 약 20 내지 약 29개의 아미노산일 수 있다.
링커는 Ig 힌지 영역을 포함할 수 있거나 링커와 동일한 하위부류의 CH1 영역에 연결된 IgG 힌지 영역으로부터 유래되거나 이를 기반으로 한 서열을 포함할 수 있으며, 공통 경쇄의 공유 결합을 위한 시스테인을 포함할 수 있다.
본 발명의 다량체에 사용하기에 적합한 링커는 IgG1 힌지 영역, IgG2 힌지 영역, IgG3 힌지 영역 또는 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되거나 이를 기반으로 할 수 있다.
(G4S)n 서열이 사용되는 경우, 바람직하게는 IgG 이외의 동종형 또는 IgG1 이외의 하위부류로부터의 힌지 서열과 조합하여 사용되며, CH1 영역을 포함한다.
본 발명의 다량체에서, 링커는 강성이거나 가요성일 수 있고, 하전된 서열을 포함할 수 있고, 직선이거나 구부러질 수 있다.
본 발명을 위한 강성 서열은 카플러스-슐츠 가요성 예측(Karplus and Schulz flexibility Prediction)이 약 1.015 이하인 서열이다. 부분적으로 가요성인 서열은 카플러스-슐츠 가요성 예측이 약 1.015 내지 약 1.04인 것이다. 본 발명을 위한 가요성 서열은 카플러스-슐츠 가요성 예측이 적어도 약 1.015인 서열이다(문헌[Karplus PA, Schulz GE. Prediction of Chain Flexibility in Proteins - A tool for the Selection of Peptide Antigens. Naturwissenschaften 1985; 72:212-3]; http://tools.immuneepitope.org/bcell/). 가요성 예측은 서열(1 잔기 스텝)을 따라 7개 잔기의 연속 윈도우에 대해 계산되어, 윈도우당 예측된 "가요성" 지수를 산출한다. 링커 서열에 대한 전체 가요성은 전체 서열에 대한 평균으로 주어진다.
IgG 힌지 영역에서의 Cys 잔기의 제거 또는 치환은 Cys 잔기를 세린(Ser)으로 치환하는 것을 포함하여, 해당 힌지를 기반으로 하는 링커를 더욱 가요성으로 만들 수 있다. 대안적으로, 링커는 나선 형성 서열의 존재를 고려하여 강성 링커일 수 있다. 따라서, 중간 힌지 영역, 예를 들어 보존된 CPPCP(서열 번호 90) 모티프는 나선 형성 서열, 예를 들어 (EAAAK)2(서열 번호 91)로 대체될 수 있으며, 이는 링커에서 짧은 강성 나선을 가져올 것이다. 따라서, 본 발명의 다량체에서, 링커는 예를 들어, 아미노산 서열을 포함하는 나선 형성 서열 (EAAAK)2(서열 번호 91)를 포함할 수 있다. 그러한 서열의 사용은 강성을 부가하는 데 도움이 될 수 있다.
본 발명의 링커는 서열 번호 4 내지 6, 8 내지 12, 또는 14 내지 25 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 이들 중 어느 하나와 적어도 약 90%의 서열 동일성, 바람직하게는 이들 중 어느 하나와 적어도 약 95%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 이들 중 어느 하나와 적어도 97%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 이들 중 어느 하나와 적어도 약 98%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 이들 중 어느 하나와 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 다가 다량체에 사용하기에 적합한 링커는 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가(또는 이들의 조합)가 이루어진, 서열 번호 2 내지 25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 서열에 대하여 정의될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 서열 번호 4 내지 6, 8 내지 12, 또는 14 내지 25에 기재된 서열에 대하여, 0 내지 4개, 바람직하게는 0 내지 3개, 바람직하게는 0 내지 2개, 바람직하게는 0개 또는 1개, 바람직하게는 0개의 아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가(또는 이들의 조합)를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다가 다량체에 사용하기에 적합한 링커는 서열 번호 2 내지 25 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이들 중 어느 하나와 적어도 약 85%의 서열 동일성, 예컨대 이들 중 어느 하나와 적어도 약 90%의 서열 동일성, 예를 들어 이들 중 어느 하나와 적어도 약 95%의 서열 동일성, 예컨대 이들 중 어느 하나와 적어도 약 98%의 서열 동일성, 예를 들어 이들 중 어느 하나와 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 서열에 대하여 정의될 수 있다.
[표 1]
추가의 결합 도메인의 영역들을 쌍형성하기 위한 링커의 사용
본 발명에 사용되는 링커는 하나 이상의 가변 영역을 적어도 하나의 추가의 결합 도메인에 연결할 수 있다. 또한, 적어도 하나의 추가의 결합 도메인이 Fab 도메인이거나, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 쌍형성으로 구성되는 경우, 링커는 중쇄와 경쇄를 공유 결합을 통해, 전형적으로 이황화 가교를 통해 쌍형성할 수 있다. 따라서, 링커가 가변 영역들을 연결하는 경우, 그것은 폴리펩티드의 1차 아미노산 서열의 일부를 형성하며, 예를 들어 VH1-CH1-링커 -VH2-CH1이다. 대조적으로, 링커가 2개의 가변 도메인을 쌍형성하는 경우, 그것은 이들 도메인을 함께 가교하는데, 이에는, 예를 들어 접촉점, 공유 결합, 예를 들어 별개의 폴리펩티드들을 구성하는 2개의 가변 도메인 사이의 이황화 결합을 생성함에 의한 것이 포함된다.
이황화 가교는 링커 내의 시스테인 잔기와 추가의 결합 도메인(들)의 가변 영역 사이에 형성될 수 있다. 링커로 인한 그러한 쌍형성은 공통 경쇄 및 대응하는 재배열된 중쇄 가변 영역을 포함하거나, 공통 중쇄 및 대응하는 재배열된 경쇄 가변 영역을 포함하는 Fab 도메인을 포함하는 추가의 결합 도메인에 적용될 수 있다.
표 2는 링커 서열이 CH1 및 VH2 영역에 연결될 수 있는 방법을 예시한다.
[표 2]
주: 링커(상기에서 밑줄 표시) 뒤의 VH2 서열은 사용된 특정 가변 영역에 따라 달라질 수 있다. 다른 실시 형태에서, 링커 뒤의 서열은 공통 경쇄를 포함한 경쇄 가변 영역일 수 있다.
다가 및 다중특이성
2개 이상의 가변 영역이 상이한 항원에 결합하는 경우, 제1 및 제2 항원은 하나의 세포 또는 상이한 세포 유형 상에 위치된 2개의 상이한 분자 또는 모이어티일 수 있다. 내인성 면역세포를 동원하고 활성화함으로써 세포독성을 매개하는 2개의 결합 도메인을 포함하는 항체는 새로이 부상하는 부류의 항체 치료제이다. 이는 표적 세포(즉, 종양 세포) 및 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, 및 대식세포)에 대한 항원 결합 특이성을 하나의 분자에 조합함으로써 달성될 수 있다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO2014/051433호 참조). 본 발명의 다량체는 적어도 2개의 결합 도메인을 포함한다. 3개 이상의 결합 도메인을 포함하는 다가 다량체는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 종양 관련 항원을 표적화하여, 건강한 세포에 대한 유해한 세포의 특이적 표적화를 허용할 수 있다. 예를 들어, 다가 다량체의 1개의 결합 도메인 또는 2개의 결합 도메인은 비정상(종양) 세포의 항원에 결합할 수 있는 반면에, 다가 다량체의 제2 또는 제3 결합 도메인은 하나 이상의 종양 관련 항원을 발현하는 종양 세포의 유도된 사멸을 유발할 수 있는 면역 이펙터 세포 상의 항원에 결합할 수 있다. 대안적으로, 다가 다량체의 2개의 결합 도메인은 종양 세포에서 발현되는 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프 또는 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 반면에, 이들 아암의 친화도는 단 하나의 항원을 발현하거나, 다가 다량체의 단 하나의 결합 도메인이 관여하는 세포에 대한 결합을 완화하기 위해 약화된다. 대안적으로, 본 발명의 다가 다량체의 3개의 결합 도메인은 3개의 상이한 항원 또는 동일한 항원에, 그러나 면역 이펙터 세포의 상이한 에피토프에서 결합할 수 있다.
유사하게, 3개 이상의 결합 도메인을 포함하는 다가 다량체는 리간드 또는 효소와 같은 기능성 표적에 결합하여, 생물학적 반응을 일으키거나 표적의 기능을 차단하여, 억제성 또는 효능적 세포 활성을 가져올 수 있다. 본 발명의 다가 다량체의 적어도 하나의 결합 도메인은 링커를 통해 가변 영역 부분의 결합 도메인에 연결된다.
가변 영역들 중 적어도 하나의 결합 도메인이 Fab 도메인인 경우, 이는, 예를 들어 VH-CH1-링커-VH-CH1의 형태를 취할 수 있으며, 여기서 링커는 하나의 가변 영역의 중쇄를 적어도 하나의 추가의 결합 도메인, 바람직하게는 Fab 도메인에 연결한다.
대안적으로, 이는 예를 들어, VL-CL-링커-VL-CL의 형태를 취할 수 있으며, 상기 링커는 하나의 가변 영역의 경쇄를 적어도 하나의 추가의 결합 도메인, 바람직하게는 Fab 도메인에 연결한다.
추가의 결합 도메인, 예컨대 Fab 도메인은 2개의 가변 영역에 각각 별개의 링커를 통해 연결될 수 있다. 추가의 가변 영역들 또는 추가의 결합 도메인들을 연결하는 2개 이상의 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 링커는 결합 도메인의 동족 사슬의 쌍형성을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 다량체가 하나 초과의 링커를 포함하는 경우, 이러한 링커는 동일하거나 상이할 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 후자의 상황의 한 예는, 다가 다량체가 3개의 링커를 포함하고, 이들 중 2개는 동일하고, 제3 링커는 (다른 2개의 것과는) 상이한 경우이다.
또한, 링커를 통해 다른 가변 영역에 연결된 가변 영역은 그 자체가 본 명세서에 기재된 링커를 통해 연결된 가변 영역에 부착될 수 있으며, 여기서 다른 가변 영역들은 링커를 통해 추가의 결합 도메인에 연결하고, 그러한 가변 영역을 링커를 통해 제2 추가의 결합 도메인에 연결하고, 등등으로 모듈 방식으로 연장될 수 있다.
이런 식으로, 본 발명의 다량체는 2개, 3개, 또는 그 이상의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 다량체는 2개, 3개 또는 그 이상의 항원에 결합할 수 있다.
본 발명의 다량체는 하나의 항원 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 2개 이상의 가변 영역, 예컨대 2개 이상의 Fab 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 다량체는 적어도 3개의 결합 도메인, 예컨대 적어도 2개의 Fab가 상이한 3개 이상의 Fab 도메인을 포함한다.
본 발명의 다른 태양은 적어도 3개의 Fab 도메인을 포함하며, 따라서 전형적으로 모두 서로 상이한 3개의 에피토프에 결합할 수 있는 다가 다량체를 포함한다.
본 발명의 다량체는 또한 다중특이성일 수 있다. "다가"는 항체가 적어도 2개의 결합 도메인을 가지며, 따라서 적어도 2개의 항원 결합 부위를 갖는다는 것을 나타낸다. 다중특이성은 항체가 적어도 2개의 상이한 에피토프, 예를 들어 2개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 2개의 에피토프에 결합할 수 있음을 나타낸다. 삼중특이성은 항체가 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있음을 나타낸다. 사중특이성(quadraspecific)은 항체가 4개의 상이한 에피토프 등에 결합할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 다량체는 동일한 표적 상에 위치된 표적 에피토프들에 결합할 수 있다. 이것은 단 하나의 에피토프가 표적화되는 상황과 비교하여, 상기 표적 분자의 (생물학적) 기능의 보다 효율적인 반작용을 허용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다량체는 항원 세포 상에 존재하는 2개 또는 3개 또는 그 이상의 에피토프, 예를 들어 종양 세포가 증식하는 데 중요한 성장 인자 수용체 또는 가용성 분자에 동시에 결합하여, 무제한 증식을 유도하는 몇몇 독립적인 신호전달 경로를 효과적으로 차단할 수 있다.
본 발명의 적어도 2개의 다량체의 임의의 조합은 표적 분자, 예컨대 성장 인자 수용체 또는 가용성 분자 상에 존재하는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 본 발명의 적어도 2개의 다량체의 조합에서, 2개의 다량체는 적어도 하나의 공통 결합 도메인을 공유할 수 있다.
표적 모이어티는 가용성 모이어티일 수 있거나, 막결합(membrane-bound) 모이어티일 수 있거나, 결합 시에 내재화되는 세포 표면 상에 존재하는 모이어티일 수 있다.
표적 에피토프는 상이한 모이어티 상에, 예를 들어 2개(즉, 제1 모이어티 상의 2개 이상의 표적 에피토프 및 제2 모이어티 상의 하나 이상의 표적 에피토프) 또는 3개의 상이한 모이어티(즉, 3개의 모이어티 각각의 모이어티 상의 적어도 하나의 표적 에피토프) 상에 위치할 수 있다. 이 경우에, 상이한 표적 모이어티들의 각각은 가용성 모이어티 또는 막결합 모이어티 또는 결합 시에 내재화하는 세포 표면 상에 존재하는 모이어티일 수 있다. 일 실시 형태에서, 상이한 표적 모이어티는 가용성 모이어티이다. 대안적으로, 적어도 하나의 표적 모이어티는 가용성 모이어티이고, 적어도 하나의 표적 모이어티는 막결합 모이어티이다. 또 다른 대안에서, 모든 표적 모이어티는 막결합 모이어티이다. 일 실시 형태에서, 상이한 표적 모이어티는 동일한 세포 상에서 발현되는 반면, 다른 실시 형태에서 상이한 표적 모이어티는 상이한 세포 상에서 발현된다.
비제한적인 예로서, 본 발명의 임의의 다량체 또는 본 발명의 다량체와 추가의 항체의 임의의 조합은 다수의 막결합 수용체를 동시에 차단하고, 종양 세포에 대한 사이토카인 또는 성장 인자와 같은 다수의 가용성 분자를 중화하거나, 다양한 바이러스 혈청형 또는 바이러스 균주를 중화시키기에 적합할 수 있다.
일 실시 형태에서, 적어도 하나의 표적 에피토프는 종양 세포 상에 위치할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 적어도 표적 에피토프는 이펙터 세포의 표면 상에 위치할 수 있다. 이것은, 예를 들어 종양 세포 사멸을 위한 T 세포 또는 NK 세포의 동원에 적합하다. 예를 들어, 본 발명의 다량체는 면역 이펙터 세포 상에 위치된 표적 분자에 특이적으로 결합함으로써, 면역 이펙터 세포, 바람직하게는 인간 면역 이펙터 세포를 동원할 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 상기 면역 이펙터 세포는 본 발명의 다량체를 표적 분자에 결합시킬 때 활성화된다. 이펙터 기전의 동원은, 예를 들어 T 세포 수용체 또는 Fc 감마 수용체와 같은 세포독성 촉발 분자에 결합하여, 하류 면역 이펙터 경로 또는 면역 이펙터 세포를 활성화시킬 수 있는, 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 Ig 유사 분자를 투여함으로써 면역조절된 세포독성의 재유도를 포함할 수 있다.
공통 가변 영역
본 발명의 다가 다량체는 2개 이상의 결합 도메인(가변 영역) 각각에서 공통 사슬을 사용할 수 있다. 기재된 바와 같이, 일 실시 형태에서, 다가 다량체는 하나의 항원에 결합하는 제1 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역(VH/VL) 조합 및 또 하나의 항원에 결합하는 제2 VH/VL 조합을 갖는다. 각각의 추가의 결합 도메인은 또한 항원 상의 추가의 에피토프에 결합하는 추가의 VH/VL 조합을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 다량체는 2개의 중쇄(하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 추가의 CH1 및 VH 도메인을 포함함) 및 각각의 CH1 및 VH 도메인과 쌍형성하는 경쇄를 포함한다. 일 실시 형태에서, 2개의 중쇄는 양립가능한 이종이량체화 도메인을 가지며, 경쇄는 공통 경쇄이다. 다른 실시 형태에서, 다량체는 2개의 경쇄(하나 또는 둘 모두는 하나 이상의 추가의 CL 및 VL 도메인을 포함함) 및 각각의 CL 및 VL 도메인과 쌍형성하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 공통 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다가 다량체가 공통 경쇄를 포함하고, 상기 경쇄가 2개 이상의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 포함하는 숙주 세포 내에서 발현되는 경우, 상기 경쇄는 각각의 이용가능한 중쇄(또는 CH1-VH1 영역)와 쌍형성할 수 있고, 이에 따라 적어도 3개의 기능성 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다.
기능성 항원 결합 도메인(가변 영역)은 항원 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시 형태에서, 공통 경쇄는 생성된 모든 중쇄(또는 CH1-VH1 영역)와 쌍형성할 수 있으며, 이에 따라 매칭되지 않은 중쇄와 경쇄의 잘못된 쌍형성이 피해지거나 다가 다량체보다 유의하게 더 낮은 비로 생성된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 다가 다량체는 일련의 중쇄 가변 영역과 조합하여 기능성 항원 결합 도메인을 갖는 다량체를 형성할 수 있는 공통 경쇄(가변 영역)를 갖는다(국제 특허 출원 공개 WO2004/009618호, WO2009/157771호).
본 발명의 다가 다량체에 사용되는 공통 경쇄(가변 영역)는 바람직하게는 인간 경쇄이다. 일 실시 형태에서, 공통 경쇄(가변 영역)는 생식세포계열 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 생식세포계열 서열은, 인간 레퍼토리에서 빈번하게 사용되고 우수한 열역학적 안정성, 수율 및 용해성을 갖는 경쇄 가변 영역이다. 바람직한 생식세포계열 경쇄는 인간 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 및 인간 불변 영역(서열 번호 1)이다. 공통 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 바람직하게는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(서열 번호 62)이다. 공통 경쇄는 바람직하게는 서열 번호 63의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 64의 인간 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함하며, 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 부가 또는 이들의 조합을 갖는다. 공통 경쇄는 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 카파 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 공통 경쇄(서열 번호 1)를 인코딩하는 핵산은 공통 경쇄 단백질을 발현하는 데 사용되는 세포 시스템에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 인코딩 핵산은 생식세포계열 핵산 서열로부터 벗어날 수 있다.
본 발명의 다가 항체에 사용되는 공통 경쇄(가변 영역)는 람다 경쇄일 수 있으며, 이에 따라 이것은 본 발명과 관련하여 또한 제공되지만, 카파 경쇄가 바람직하다. 본 발명의 공통 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 카파 경쇄의 불변 영역이 사용되며, 바람직하게는 상기 공통 경쇄는 생식세포계열 경쇄, 바람직하게는 IgVKl-39 유전자 세그먼트를 포함하는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄, 예를 들어 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01이다. 당업자는 "공통"이 또한 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 기능적 등가물을 지칭함을 인식할 것이다. 상기 경쇄의 많은 변이체가 존재하는데, 이러한 변이체에는 기능성 결합 영역의 형성에 실질적으로 영향을 주지 않는 돌연변이 (결실, 치환, 부가)가 존재한다.
IgVκ1-39는 면역글로불린 가변 카파 1-39 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 면역글로불린 카파 가변 1-39; IGKV139; IGKV1-39로도 알려져 있다. 이 유전자에 대한 외부 ID는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IgVκ1-39에 대한 바람직한 아미노산 서열이 서열 번호 65에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 공통 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 카파 경쇄 불변 영역에 연결된다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 다가 다량체에 사용되는 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 다가 다량체의 공통 경쇄는 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01이다.
공통 경쇄를 생성하는 세포는, 예를 들어 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 및 람다 불변 영역에 융합된 언급된 경쇄의 가변 영역을 포함하는 경쇄를 생성할 수 있다. 본 명세서에서 생식세포계열 서열을 언급하는 경우, 일 실시 형태에서 가변 영역은 생식세포계열 서열이다.
본 발명의 다가 다량체에 사용되는 바람직한 공통 경쇄는 서열 번호 1에 기재된 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 다가 항체에 사용되는 공통 사슬은 또한 중쇄일 수 있으며, 이에 따라 이것은 본 발명과 관련하여 또한 제공된다. 공통 중쇄가 당업계에서 이중특이성 항체를 제조하는 데 사용되어 왔으며, 본 명세서에서 3개 이상의 결합 도메인을 포함하는 다가 다량체를 제조하는 데 사용될 수 있으며, 상기 결합 도메인 중 2개 이상은 당업계에 알려진 공통 중쇄를 포함한다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인이 모든 라이브러리 구성원들에 대해 동일하고, 따라서 다양성이 경쇄 가변 도메인을 기반으로 하는 항체 라이브러리의 사용이 가능하다. 그러한 라이브러리는, 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 PCT/US2010/035619호 및 PCT/US2010/057780호에 기재되어 있다. 공통 중쇄를 갖는 결합 도메인을 생성하는 이들 및 다른 기법은 당업자에 의해 창출될 수 있으며, 본 명세서에 개시된 신규한 포맷을 갖는 다가 항체를 생성하기 위해 본 발명에 사용될 수 있다.
절단된 다가 다량체의 생성
일 실시 형태에서, 숙주 세포는 2개 이상의 중쇄 가변 영역 및 공통 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산으로 공동-형질감염되어 다가 다량체를 생성할 수 있으며, 여기서 상기 중쇄 가변 영역들 중 2개는 CH1, CH2 및/또는 CH3을 포함한 불변 영역을 포함하며, 이들은 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 힌지에서의 쌍형성을 통한 것을 포함한 이종이량체화가 가능하며, 여기서 상기 2개의 중쇄는 각각, 상기 힌지 아래에 위치된, CH2 및/또는 CH3 영역을 절단할 수 있는 단백질 분해 효소에 의해 인식되는 아미노산 서열을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 다가 다량체는 2개 이상의 경쇄 가변 영역 및 공통 중쇄를 함께 인코딩하는 하나 이상의 유전자 작제물에 의한 개별 세포의 공동-형질감염에 의해 생성될 수 있으며, 여기서 2개의 공통 중쇄는 CH1, CH2 및/또는 CH3을 포함한 불변 영역을 포함하며, 이들은 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 힌지에서의 쌍형성을 통한 것을 포함한 이종이량체화가 가능하며, 여기서 상기 2개의 중쇄는 각각, 상기 힌지 아래에 위치된, CH2 및/또는 CH3 영역을 절단할 수 있는 단백질 분해 효소에 의해 인식되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다가 다량체는 또한 공통 가변 사슬을 포함하는 유전자도입 동물을 2개 이상의 관심 항원으로 면역화함으로써 생성될 수 있다. 공통 가변 사슬, 및 관심 항원에 특이적으로 결합하는 재배열된 항체 사슬을 포함하는 항체들의 패널이 유전자도입 동물로부터 얻는다. 이어서, 공통 사슬 및 가변 결합 사슬을 인코딩하는 핵산을 온전한 다가 항체를 생성하는 숙주 세포에 통합시킨다. 이어서, 다가 다량체를 형성한다. 상기 다가 다량체는 공통 경쇄 및 2개 이상의 가변 결합 사슬을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 가변 결합 사슬들 중 2개는 CH1, CH2 및/또는 CH3을 포함하는 중쇄이며, 상기 중쇄는 힌지를 통해 쌍형성되는데, 이때 힌지는 전형적으로 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 2개 이상의 이황화 가교로 구성된다. 이어서, 다가 다량체를 효소로 절단하는데, 이 효소는 상기 중쇄들로부터 CH2 및/또는 CH3 영역을 제거하여 중쇄들의 C-말단에 힌지를 남기고, 다가 다량체의 중쇄들을, 전형적으로 2개 이상의 이황화 결합을 통해 쌍형성한다.
이종이량체인 항체의 생성에 유리한 몇 가지 방법이 공개되어 있다. 본 발명에서, 세포는 각각의 동종이량체의 생성에 비하여 이종이량체의 생성에 유리하다. 이는 전형적으로 중쇄의 중쇄 불변 영역, 바람직하게는 CH3 영역을 인코딩하는 핵산에 의해 달성되며, 이에 따라 이들은 동종이량체화에 비해 이종이량체화(즉, 하나의 중쇄와 또 하나의 중쇄의 조합에 의한 이량체화)에 유리하게 된다. 일 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 다량체는 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 갖는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
양립가능한 이종이량체화 도메인들은 바람직하게는 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인들이다. 야생형 CH3 도메인이 사용되는 경우, 2개의 상이한 중쇄(A 및 B)와 공통 경쇄의 동시발현은 3개의 상이한 항체종, AA, AB 및 BB를 생성할 것이다. AA 및 BB는 2개의 동종이량체 항체에 대한 표기이고, AB는 이종이량체 항체에 대한 표기이다. 원하는 이종이량체 생성물(AB)의 백분율을 증가시키기 위하여, CH3 조작이 사용될 수 있거나, 또는 다시 말하면, 양립가능한 이종이량체화 도메인을 갖는 중쇄를 사용할 수 있다. 당업계에는 그러한 중쇄 이종이량체화가 달성될 수 있는 다양한 방법이 기술되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '양립가능한 이종이량체화 도메인'은, 조작된 도메인 A'이 조작된 도메인 B'과 함께 이종이량체를 우선적으로 형성하도록 하고 역으로도 성립되도록 하며, A'-A' 및 B'-B' 사이의 동종이량체화는 감소되도록 조작된 단백질 도메인을 지칭한다.
미국 특허 출원 제13/866,747호(현재 미국 특허 제9,248,181호로 허여됨), 미국 특허 출원 제14/081,848호(현재 미국 특허 제9,358,286호로 허여됨), 국제 특허 출원 공개 WO2013/157953호 및 WO2013/157954호에는, 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 사용하여 다가 항체를 생성하기 위한 방법 및 수단이 개시되어 있다. 이들 수단 및 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 다량체는 바람직하게는, 본질적으로 단지 이중특이성 전장 IgG 분자만을 생성하도록 제1 및 제2 중쇄의 불변 영역에서 잔기들을 포함한다. 바람직한 잔기는 제1 CH3 도메인 내의 아미노산 L351K 및 T366K(EU 넘버링)(여기서, 첫 번째 문자는 야생형 CH3 도메인의 잔기에 상응하고, 두 번째 문자는 이종이량체성 쌍형성에서 우선적으로 결합할 수 있는, CH3에 의해 인코딩된 잔기에 상응함) 또는 이에 상응하는 위치에서의 것들('KK-변이체' 중쇄), 및 제2 도메인 내의 아미노산 L351D 및 L368E 또는 이에 상응하는 위치에서의 것들('DE-변이체' 중쇄)이거나, 그 역으로도 성립된다. 본 출원인의 미국 특허 제9,248,181호 및 미국 특허 제9,358,286호뿐만 아니라 PCT 출원인 국제 특허 출원 공개 WO2013/157954호에서, DE-변이체와 KK-변이체가 우선적으로 쌍형성하여 이종이량체(이른바, 'DEKK' 이중특이성 분자)를 형성하는 것으로 이미 입증되었다. DE-변이체 중쇄의 동종이량체화(DEDE 동종이량체) 또는 KK-변이체 중쇄의 동종이량체화(KKKK 동종이량체)는 동일한 중쇄들 사이의 CH3-CH3 계면에서의 하전된 잔기들 사이의 반발력으로 인해 발생되지 않거나 단지 무시할 정도의 양으로 발생된다.
다가 다량체를 형성하도록 다량체화되는 단백질을 발현할 수 있는 본 발명의 하나의 숙주 세포에서, 상기 숙주 세포는 3개의 단백질을 인코딩하는 핵산으로 형질전환된다. N-말단에서 C-말단으로의 순서대로, 인코딩된 단백질은 VH3-CH1---VH2-CH1-CH2-CH3을 포함하는 제1 단백질 - 여기서는 링커가 N-말단에서 C-말단 방향으로 제1 단백질 상의 CH1을 VH2에 연결함("---"에 의해 표기됨) -, VLc-CL을 포함하는 제2 인코딩된 단백질, VH1-CH1-CH2-CH3을 포함하는 제3 인코딩된 단백질을 포함하며, 여기서 제1 및 제3 인코딩된 단백질의 CH1 도메인은 제2 인코딩된 단백질의 CL과 쌍형성하고, 제1 및 제3 단백질의 인코딩된 CH3 영역은, 각각, 제1 CH3 단백질에서 또는 그에 상응하는 위치에서 아미노산 L351K 및 T366K(EU 넘버링)를 인코딩하고, 제3 단백질 또는 그에 상응하는 위치에서 아미노산 L351D 및 L368E를 인코딩하거나, 또는 그 역으로도 성립된다. 대안적으로, 상기 제1 및 제3 단백질은 이들 단백질 각각의 CH3 도메인의 효율적인 쌍형성을 유도하는 다른 양립가능한 이종이량체화 도메인을 포함한다.
상기 단백질들을 인코딩하는 핵산들은 하나 이상의 벡터 상에 존재하여, 본 발명의 다가 다량체를 생성할 수 있다. 상기 단백질들을 인코딩하는 상기 핵산들은 바람직하게는 높은 발현 및 유전자 침묵(gene silencing)의 부재 또는 감소로 알려진 염색체 영역에서 숙주 세포의 게놈에 안정하게 추가로 통합될 수 있다.
본 발명의 숙주 세포는 총 발현된 면역 글로불린을 기준으로 하여, 본 발명의 다가 다량체의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%의 순도로 다가 다량체를 생성할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포는 생성된 다가 다량체의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%가 모든 결합 부위에 대해 동족 공통 사슬과 쌍형성된 가변 재배열된 영역을 포함하는 다가 다량체를 생성할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포는 발현된 공통 사슬의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%가 다가 다량체에 쌍형성되고, 유리된 비회합 단백질이 아닌 다가 다량체를 생성할 수 있다.
상기 다량체를 2개의 이량체화된 중쇄의 힌지 아래에서 절단하는 단백질 분해 효소에 대한 다가 다량체의 노출 시에, 생성되는 본 발명의 절단된 다가 다량체가 얻어질 수 있으며, 여기서 원래 단백질의 농도의 적어도 약 50%, 바람직하게는 60%, 더 바람직하게는 70% 초과 및 최대 90% 초과가 본 발명의 절단된 다가 다량체로 전환된다.
비인간 동물
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 적합한 방법으로부터 얻어지거나, 이로부터 유래되거나, 이를 기반으로 하는 결합 도메인을 갖는 적합한 다가 결합 단백질을 제조하는 것을 가능하게 한다. 적합한 방법은 파지 디스플레이 방법(파지 디스플레이 시스템에서 생성되는 생식세포계열 서열의 변형을 포함함), 및 당업계에 알려진 다른 시험관내 방법을 포함할 수 있다. 특히 유용한 방법은 유전자 변형된 비인간 동물이 체세포 재조합 및 친화성 성숙의 천연 과정을 통해 공통 경쇄와 회합되고 발현할 수 있는 적합한 중쇄 가변 도메인을 만드는 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 다가 다량체에 사용되는 가변 도메인은 재배열되지 않은 중쇄 가변 유전자좌를 생식세포계열에 포함하고, 단일 재배열된 인간 경쇄 가변 도메인, 예를 들어 설치류와 같은 공통 경쇄 포유동물을 발현하는 비인간 유전자도입 동물의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 얻어지거나, 이로부터 유래되거나, 이를 기반으로 한다. 항원에 노출 시에 그러한 비인간 유전자도입 동물은 공통 경쇄와 쌍형성된 다양한 체세포적으로 재배열된 중쇄 가변 영역을 발현할 것이며, 이는 이어서 다가 항체의 생성을 위해 숙주 세포로 효율적으로 형질전환될 수 있는 상기 유전자도입 동물의 것으로부터 얻어지거나, 이로부터 유래되거나, 이를 기반으로 하는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 개발하는 데 사용될 수 있다.
특히, 인간 VL 유전자 세그먼트(들)로부터 유래된 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하도록 유전자 조작된 면역화된 공통 경쇄 동물의 적합한 B 세포로부터의 인간 가변 영역 서열은 본 발명의 다가 다량체에 대한 잠재적 VH 도메인의 공급원으로 사용될 수 있다. 하나 이상의 관심 항원으로 면역화된 상기 동물로부터의 B 세포는 다양한 실시 형태에서, 다가 다량체가 결합할 항원이다. 상기 동물의 세포, 조직 또는 혈청, 비장 또는 림프액 물질을 스크리닝하여 관심 항원에 대해 원하는 특성, 예를 들어 고친화성, 저친화성, 차단 능력, 활성화, 내재화 또는 기타 특성을 나타내는 중쇄 가변 도메인(또는 이를 발현하는 B 세포)을 얻는다. 상기 유전자도입 동물에서 항원 자극에 반응하여 생성되는 거의 모든 중쇄 가변 도메인이, 바람직하게는 1개 이하 또는 2개 이하의 VL 유전자 세그먼트로부터 유래되어 발현된 인간 면역글로불린 경쇄와 관련하여 만들어지기 때문에, 중쇄 가변 영역은 유전자도입 동물에서 발현되는 공통 경쇄 도메인을 발현하고 이와 회합할 수 있다.
일 태양에서, 인간 VL 및 VH 서열이 본 명세서에 기재된 유전자도입 마우스 및/또는 관심 에피토프를 포함하는 항원으로 면역화된, 국제 특허 출원 공개 WO2009/157771호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 유전자도입 동물의 B 세포로부터 얻어진 핵산을 기반으로 하는 핵산에 의해 인코딩되는, 본 명세서에 기재된 에피토프 결합 단백질이 제공된다.
핵산 서열, 폴리펩티드, 벡터 및 세포
본 발명은 본 발명의 다가 다량체의 조립에 사용될 수 있는 폴리펩티드 또는 링커를 인코딩하는 핵산 서열; 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터; 본 발명의 다가 다량체를 생성할 수 있는 세포; 및 그러한 세포를 사용하여 그러한 다가 다량체를 제조하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 다가 항체는 전형적으로 함께 조립되어 본 발명의 다량체를 형성하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현하는 세포에 의해 생성된다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 2 내지 25 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 이들 중 어느 하나와 적어도 약 85%의 서열 동일성 이들 중 어느 하나와 적어도 약 85%의 서열 동일성, 예컨대 이들 중 어느 하나와 적어도 약 90%의 서열 동일성, 예를 들어 이들 중 어느 하나와 적어도 약 95%상의 서열 동일성, 예컨대 이들 중 어느 하나와 적어도 약 98%의 서열 동일성, 예를 들어 이들 중 어느 하나와 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 링커를 제공한다.
본 발명은 VH3-CH1-힌지 기반 링커-VH2-CH1을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 제공한다.
소정 실시 형태에서, VH3 및 VH2는 동일한 에피토프에 결합한다. 소정 실시 형태에서, VH3 및 VH2는 동일한 항원에 결합하지만, 상이한 에피토프에 결합한다. 그리고 소정 실시 형태에서, VH3 및 VH2는 별개의 에피토프 및 항원에 결합한다.
또한, 그러한 링커 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 및 그러한 핵산 서열을 포함하는 벡터가 본 발명에 의해 제공된다.
기재된 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 핵산 서열은 임의의 적합한 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 적절한 상황에서 단일 숙주 세포의 2개 이상의 벡터에 배치될 수 있다.
일반적으로, 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 적절한 링커 및/또는 불변 영역으로 클로닝되고, 이들 서열은, 발현에 적합한 세포주의 적합한 발현 작제물에서 프로모터와 작동가능하게 연결된 상태로 배치된다.
다가 다량체의 발현
재조합 숙주 세포에서의 항체의 발현은 당업계에 기재되어 있다. 본 발명의 다량체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 염색체외 카피로서 존재하고/하거나 숙주 세포의 염색체에 안정하게 통합될 수 있다. 후자는 유전자 침묵이 결여되어 있거나 감소된 것으로 알려진 유전자좌가 표적화될 수 있는 경우에 바람직하다.
본 발명의 다량체로서 조립되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 얻기 위해, 그러한 발현을 유도할 수 있는 서열이 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 기능적으로 연결될 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 기능적으로 연결된다는 것은 폴리펩티드 또는 이의 전구체를 인코딩하는 핵산 서열이 발현을 유도할 수 있는 서열에 연결되어, 이들 서열이 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 발현을 유도할 수 있음을 나타내고자 한다. 유용한 발현 벡터, 예를 들어 Invitrogen의 pcDNA 벡터 시리즈가 당업계에서 이용가능하다. 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이 인코딩된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 좌우하는 서열과 관련하여 적절하게 삽입되는 경우, 생성된 발현 카세트는 발현으로 지칭되는 관심 폴리펩티드를 생성하는 데 유용하다. 발현을 유도하는 서열은 프로모터, 인핸서 등 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이들은 숙주 세포에서 기능을 할 수 있어서, 이들에 기능적으로 연결된 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있어야 한다. 프로모터는 구성적이거나 조절될 수 있으며, 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있거나, 인공적으로 설계될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열의 발현은 천연 프로모터 또는 이의 유도체 또는 완전히 이종성인 프로모터로부터 유래될 수 있다. 진핵세포에서의 발현을 위해 잘 알려져 있고 많이 사용되는 일부 프로모터는 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 예를 들어 E1A 프로모터, 거대세포바이러스(CMV)로부터 유래된 프로모터, 예를 들어 CMV 전초기(IE) 프로모터, 유인원 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된 프로모터 등으로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 또한 진핵세포, 예컨대 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 연장 인자 1a(EF-1a) 프로모터, 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 열충격 프로모터 등으로부터 유래될 수 있다. 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터 또는 인핸서/프로모터가 본 발명에 적합하다. 일 실시 형태에서, 발현을 유도할 수 있는 서열은 CMV 프로모터로부터의 영역, 바람직하게는 CMV 전초기 유전자 인핸서/프로모터의 뉴클레오티드 -735 내지 +95를 포함하는 영역을 포함한다. 당업자는 본 발명에 사용되는 발현 서열이 인슐레이터, 매트릭스 부착 영역, STAR 요소 등과 같은 발현을 안정화하거나 향상시킬 수 있는 요소와 적절하게 조합될 수 있음을 알 것이다. 이는 발현의 안정성 및/또는 수준을 향상시킬 수 있다.
재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포가 본 발명의 다량체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 현탁 성장에 적합하다.
본 발명의 다가 다량체는 전형적으로 본 발명의 적합한 세포를 배양하고, 상기 항체를 상기 배양물로부터 수집함으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 무혈청 배지 중에서 배양된다. 본 발명의 다량체는 세포로부터 또는 바람직하게는 당업자에게 일반적으로 알려진 방법에 의해 세포 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
회수 후, 온전한 항체를 처리하여, 항체로부터 Fc 도메인(예를 들어, CH2 및/또는 CH3)을 절단한다. 본 발명의 다량체는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 그러한 방법은 침전, 원심분리, 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 양이온 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용, 크로마토그래피 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 다가 다량체를 분리하는 수단으로서 링커 서열을 기반으로 하는 것을 포함한 친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
절단된 다가 다량체의 효율적인 생성
본 기술은 F(ab')2의 생성을 위하여 효소 분해 및 화학적 접합을 사용하였다. 예를 들어, 항체의 친화도 대(vs.) 결합력 결합을 F(ab')2와 대비하여 표적에 대한 Fab의 생성 및 비교를 통해 분석하여, 1가 표적화가 2가 표적화보다 항원과의 더 적은 결합을 야기하는지의 여부를 조사하고, 2가가 결합력으로 이어지는지의 여부를 알아내었다. 화학적 접합 및 단백질 분해적 분해를 통해 F(ab')2 모이어티를 생성하는 종래 방법은 비효율성, 불안정하거나 잠재적으로 면역원성인 모이어티의 생성, 및 그러한 모이어티의 분리 및 사용을 비실용적이게 하는 항체 단편들의 불균질 혼합물로 인해 연구 및 치료적 응용에 있어서 매력적이지 않았다. 본 명세서에 기재된 기법을 통해 고순도로 발현되는 새로운 다가 다량체 포맷의 출현은 Fc의 특이적 절단이 가능한 효소의 사용과 조합하여, 펩신 분해로부터 관찰되는 C-말단 이질성을 제거함으로써 상기 절단된 다가 다량체의 고농도 생성물의 생성을 가능하게 한다.
임의의 적합한 효소적 절단 및/또는 분해 기법을 사용하여, 임의의 전장 다량체(예를 들어, 단일클론 다중특이성 전 항체)로부터 얻어진 바와 같이 본 명세서에 기재된 방법과 관련하여 F(ab')n 또는 (변형된 F(ab')n)을 포함하는 다가 다량체가 생성될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 항체 단편은, 인간 IgG1을 힌지 아래의 특정 부위에서 절단하여 온전한 F(ab')n 다량체를 온전하게 남기는 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 IgG-분해 효소인 IdeS 프로테아제로 절단함으로써 얻어질 수 있으며, 여기서 F(ab')n의 한쪽에 있는 중쇄는 다른 한쪽에 있는 중쇄에 그들 각각의 C-말단에서 쌍형성되며, 이때 쌍형성은 2개 이상의 이황화 가교를 포함한다(도 4b1).
대안적으로, 힌지(KSCDK / THTCPPC)(서열 번호 92) 위의 특정 부위에서 인간 IgG1을 분해하는 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis)로부터의 시스테인 프로테아제를 사용하여 온전한 Fab(도 4b2), 2Fab'(도 4b3) 및 Fc(도 4b4) 단편을 생성함으로써, Fc 영역이 결여된 다가 다량체가 얻어질 수 있다. 가변 도메인 및 불변 도메인(예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 포함하는 중쇄의 발현을 통해 이 기법을 통해 형성될 수 있는 다량체가 본 명세서에 기재된 링커를 통해 추가의 가변 도메인에 연결되거나, 또는 경쇄에 쌍형성되고, 이것이 본 명세서에 기재된 링커를 통해 추가의 가변 도메인에 연결되고, 여기서 단백질 분해 효소, 예컨대 포르피로모나스 긴기발리스로부터의 것이 상기 중쇄의 불변 도메인을 절단하여, 온전한 절단된 2Fab'을 남기거나, 얼마나 많은 결합 도메인이 긴 아암 상에 존재하는지에 따라 더 많은 결합 도메인의 다량체를 남긴다.
본 명세서에 기재된 숙주 세포, 및 이종이량체화 기술을 사용함으로써, 이중특이성 및 다중특이성 모이어티의 효율적인 생성이 Fc 영역(예를 들어, CH2 및/또는 CH3)이 제거된 대량의 배치로 생성되어, 효율적인 연구 및 잠재적인 치료적 응용이 가능한 F(ab')n 모이어티들의 고농도 풀을 생성하며, 이는 침묵된(예를 들어, 존재하지 않는) Fc, 더 짧은 반감기, 및 더 작은 크기와 연관된 이익을 제공한다.
단백질 분해 효소의 제거
필요로 하지는 않지만, 절단된 다가 다량체의 생성 시에 단백질 분해 효소를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 고정화된(예를 들어, 아가로스 상에 고정화된) 효소의 사용이 또한 바람직할 수 있다. 효소의 제거는 당업계에 알려진 다양한 수단을 통해 달성될 수 있으며, 이러한 수단에는 태그를 포함하는 단백질 분해 효소의 사용이 포함되는데, 이러한 태그에는, 예를 들어 그러한 효소의 말단(바람직하게는, N-말단)에 존재하는 HIS-NiNTI, 비오틴-아비딘 또는 VSV/FLAG - 항-VSV/FLAG 태그가 있으며, 이러한 태그는 효소가 항-태그 친화성 컬럼을 통해 제거될 수 있게 한다. 항체 단편, 예컨대 Fc는 또한 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 유사하게, 단백질 분해 효소는 전하 크로마토그래피를 통해 제거될 수 있거나, 또는 향상된 전하를 갖는 변형된 효소가 생성될 수 있으며, 이에 따라 그것은 전하 크로마토그래피를 통해 이후에 제거될 수 있게 한다.
대안적으로, 본 발명의 다가 다량체, 단백질 분해 효소 및 불변 도메인 단편의 혼합물은, 단백질 분해 효소를 변성시킬 수 있지만 다가 다량체의 쌍형성을 실질적으로 방해하지 않아서, 본 발명의 대상인 다가 다량체를 손상시키지 않고서 효소의 불활성화 및 분리를 촉진시킬 수 있는 pH 조건 또는 온도 조건에 노출될 수 있다.
약제학적 조성물 및 사용 방법
본 발명은 또한 본 발명의 다량체 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 요법에 의한 인간 또는 동물의 신체의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 다가 다량체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 다가 다량체의 치료적 유효량을 의학적 질환을 앓고 있는 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 또는 동물의 치료 방법을 제공한다.
환자에게 투여되는 본 발명에 따른 다량체의 양은 전형적으로 치료역(therapeutic window) 내에 있어야 하는데, 이는 치료적 효과를 얻는 데 충분한 양이 사용되지만, 그 양은 허용 불가능한 정도의 부작용으로 이어지는 역치 값을 초과하지 않음을 의미한다. 원하는 치료적 효과를 얻는 데 필요한 다가 다량체의 양이 낮을수록, 전형적으로 치료역은 더 클 것이다. 따라서, 낮은 투여량에서 충분한 치료적 효과를 발휘하는 본 발명에 따른 다가 다량체가 바람직하다.
선행 기술로서 주어진 특허 문서 또는 다른 자료에 대한 본 명세서에서의 언급은, 그 문서 또는 자료가 알려졌거나 그것이 포함하는 정보가 임의의 청구범위의 우선일에 공통적인 일반 지식의 일부임을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 명세서에 기재된 각각의 참고문헌의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 다가 다량체 대 온전한 항체 대응물의 비교
5개의 상이한 항체(PG6058p02(HER3 IgG Fc WT) 서열 번호 66 및 67; PG3004p04(HER2 IgG Fc WT) 서열 번호 68 및 69; 이중특이성 PB11247 MF6058(HER3)xMF3004(HER2) Biclonics® Fc WT DEKK(미국 특허 출원 공개 제2017/0058035호) 서열 번호 66 내지 69; PG1337(TT IgG FcWT) 서열 번호 70 및 71; PB4248(TTxTT) Biclonics® Fc WT DEKK(국제 특허 출원 공개 WO 2017/069628호) 서열 번호 70 및 71)를 GingisKHAN Fab 키트 및 FabRICATOR 키트(Genovis)를 사용하여 분해하여 각각 Fab 및 F(ab')2 단편을 생성하였다. 항체 서열은 표 3에 제공되어 있다.
[표 3]
40 및 200 단위의 GingisKHAN 효소를 2 mM 시스테인(온화한 환원제)의 존재 하에서 37℃에서 2시간 동안 100 및 500 ㎍/ml의 HER2/HER3 다가 항체와 함께 인큐베이션하였다. 40 및 200 단위의 FabRICrATOR LE를 또한 환원제의 첨가 없이 37℃에서 2시간 동안 100 및 500 ㎍/ml의 HER2/HER3 다가 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 두 반응 모두를 CaptureSelect CH1 친화성 컬럼(Genovis)을 사용하여 정제하였다. IgG, Fab, 및 F(ab')2의 농도를 단백질 L 센서를 사용하여 Octet으로 결정하였으며, 이는 하기 표 4에 나타나 있다.
[표 4]
도 2a 내지 도 2e에 나타낸 바와 같이 SDS-PAGE 분석에 의해 순도를 또한 결정하였다. 도 2a 내지 도 2e에 나타낸 바와 같이, 미정제된 Fab 분해물 및 그들의 관류물(flow-through) 샘플(Fc) 둘 모두는 비환원성 겔에서 부분 환원된 것으로 나타난다. 이는 절단 완충액 중의 온화한 환원제(2 mM 시스테인)에 의해 야기된 것일 가능성이 높다. 비환원성 조건 하에서, F(ab')2 반응물 중의 Fc는 관찰되지 않는다. 대신에, '하프(half) Fc' 밴드가 나타나는데, 그 이유는, 절단 효소가 2개의 중쇄를 연결하는 힌지 시스테인 아래에서 절단하기 때문이다. 따라서, '조(crude)' F(ab')2 단편의 비환원성 겔은 F(ab')2에 대해서는 97 kDa, 그리고 하프 Fc 단편에 대해서는 25 kDa 바로 위의 예상된 밴드 크기를 제공한다.
MCF7 세포에 결합하는 온전한 IgG, Fab, 및 F(ab')2 단편의 능력을 FACS 분석에 의해 분석하였다. MCF7 세포는 HER2 및 HER3 둘 모두를 발현하기 때문에 선택되었다.
[표 5]
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 생성된 Fab 및 F(ab')2 단편은 그들의 결합 특성을 보유하며, IgG 및 상응하는 F(ab')2 단편은 유사한 친화도로 결합한다. Fab 단편도 결합하지만, 예상되는 바와 같이, 더 낮은 친화도로 결합한다. 이는 PB11247(MF6058(HER3)xMF3004(HER2)) Biclonics®를 사용하여 생성된 F(ab')2 단편 내의 HER2 아암 및 HER3 아암 둘 모두가 이용가능하고 기능성임을 보여준다.
IgG 또는 Biclonics로부터 유래되는 F(ab')2 단편이 그들의 기능적 활성을 보유하는 능력은 헤레굴린-의존적 MCF-7 증식 검정을 사용하여 결정되었다. 항체 PG3004(Her2), PG6058(Her3), PG1337(TT), MF6058(HER3)xMF3004(HER2) Biclonics® Fc WT DEKK(미국 특허 출원 공개 제2017/0058035호) 및 MF1337xMF1337(TT × TT), 및 상기 항체들을 힌지 아래에서 절단가능한 효소에 노출 시에 생성된 F(ab')2 단편(조 500 ㎍/ml 반응 혼합물 및 정제된 F(ab')2 단편 둘 모두)을 (Octet 상에서 측정될 때) 10 ㎍/ml로부터 출발하여 아래로의 9점 준로그(semilog) 적정 시리즈에서 시험하였으며, 100% 차단 대조군으로서 스타우로스포린(1:200)을 사용하였다. 각각의 플레이트 상에는, 헤레굴린을 갖지 않는 2개의 웰, 헤레굴린을 갖지만 억제제를 갖지 않는 2개의 웰, 및 1:200의 스타우로스포린(최대 억제)을 갖는 2개의 웰을 포함하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, PB11247 F(ab')2 단편은 증식 검정에서 그들의 상응하는 Biclonics® 정도로 기능적이며, 정제된 F(ab')2 활성 또는 미정제된 F(ab')2 활성 사이에 명백한 차이가 없다.
실시예 2: 3가 IgG 분자로부터의 F(ab')3의 생성
다가 다량체로부터 F(ab')n 단편(F(ab')3, 2Fab', 및 Fab 단편을 포함함)을 생성하는 능력을 또한 분석하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, F(ab')3, 2Fab' 또는 Fab 단편 모두는 선택된 프로테아제(예를 들어, FabRICATOR 또는 GingisKHAN)에 기반하여 생성된다. 상이한 항원 결합 특성 및 공통 경쇄를 포함하는 하기의 3가 다량체를 분석하였다: PT23103p09(서열 번호 72 및 73의 중쇄 VH2-링커-CH1-VH3 서열을 가짐); PT23103p15(서열 번호 74 및 75의 중쇄 VH2-링커-CH1-VH3 서열을 가짐); PT23103p04(서열 번호 76 및 77의 중쇄 VH2-링커-CH1-VH3 서열을 가짐); PT23103p08(서열 번호 78 및 79의 중쇄 VH2-링커-CH1-VH3 서열을 가짐); PT23103p03(서열 번호 80 및 81의 중쇄 VH2-링커-CH1-VH3 서열을 가짐); PT23103p11(서열 번호 82 및 83의 중쇄 VH2-링커-CH1-VH3 서열을 가짐); 및 PT23103p12(서열 번호 84 및 85의 중쇄 VH2-링커-CH1-VH3 서열을 가짐) (여기서, 각각의 PT는 하기의 삼중특이성 다량체를 인코딩한다: VH3 위치에 MF1337(파상풍 톡소이드) 서열 번호 70 및 71을 포함하는 삼중특이성 다량체(상부 긴 아암), VH2 위치에 MF1122(피브리노겐) 서열 번호 86 및 87을 포함하는 삼중특이성 다량체(내측 긴 아암) 및 VH1 위치에 MF1025(티로글로불린) 서열 번호 88 및 89를 포함하는 삼중특이성 다량체(짧은 암) - 이때, 각각의 VH는 cLC와 쌍형성됨). 도 4를 참조한다. 3가 다량체 서열은 표 6에 제공되어 있다.
[표 6]
각각의 효소 반응에 대해서는, 400 μl의 최종 반응 부피 중의 200 ㎍/ml의 IgG를 10배 희석된 환원성 완충액 중 80 단위의 FabRICATOR LE 또는 80 단위의 GingisKHAN과 함께 인큐베이션하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PT23103p09; PT23103p015; PT23103p04의 경우, 250 μl 반응 혼합물을 CaptureSelect CH1 컬럼을 사용하여 F(ab')n의 정제에 사용하였다. Fc 및 효소를 함유하는 관류물을 수집하였을 뿐만 아니라 용리된 분획도 수집하였다. 모든 생성된 F(ab')n 제제의 단백질 농도를 A280 nm에서 측정하였다. 표 7은 각각의 분해에 대한 단백질 농도를 나타낸다.
[표 7]
조 추출물에서 얻어진 F(ab')3의 백분율은 PT23103p09, PT23103p15 및 PT23103p04에 대해 55% 내지 74%의 범위였다. 분해 조 추출물에 대해, 전체 단백질 농도를 다가 다량체의 출발 물질에 대해 분석하였으며, 그 결과 단백질들의 100%가 모든 다가 다량체를 차지하게 된다. % 수율은 분자량(Da)에 걸쳐 농도(mg/ml)를 분석하고 다가 다량체의 출발 물질과 대비함으로써 계산되며, 이때 다가 다량체, 절단된 다가 다량체 및 절단된 Fc의 분자량은 표 8에 나타낸 값을 갖는다:
[표 8]
항체 단편의 특이적 결합을 확인하기 위하여, 파상풍, 피브리노겐 및 티로글로불린에 대한 특이적 결합을 결정하기 위한 ELISA 반응을 실시하였다. 생성된 절단된 다가 다량체, Fab 및 분해되지 않은 IgG를 2 ㎍/ml로 코팅된 파상풍 톡소이드; 10 ㎍/ml로 코팅된 피브리노겐; 또는 10 ㎍/ml로 코팅된 티로글로불린에 대한 소정의 적정 범위에서의 결합에 대해 시험하였다. 2.5 ㎍/ml로 코팅된 huEGFR-Fc의 음성 대조군을 사용하였다. F(ab')3, Fab 및 2Fab' 각각의 정제된 모이어티에 대하여 7.5 ㎍/ml의 단백질 농도를 분석하고, PG1337p324를 음성 대조군 및 양성 대조군 둘 모두로서 포함시켰다. 결합된 F(ab')n의 검출을 1/2000 희석률로 CH-1 검출 항체를 사용하여 수행하였다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 모든 샘플(분해되지 않은 Fab, 조 Fab, 및 정제된 Fab)은 F(ab')3의 "긴 아암" 상의 VH3 위치, 또는 상부 위치에서 파상풍 톡소이드에 대한 그들의 결합을 유지하였다(도 4 참조). 결합 신호(450 nm에서의 흡광도)는 분해되지 않은 샘플과 분해된 샘플에 대해 매우 유사하다.
[표 9]
다음으로, 3가 절단된 다량체를 피브리노겐 결합에 대해 분석하였는데, 피브리노겐은 F(ab')3의 긴 아암의 내측 위치인 VH2 위치에 위치된다(도 4 참조). FabRICATOR F(ab')3 분해 샘플(분해되지 않은 Fab, 조 Fab, 및 정제된 Fab)은 모두 피브린노겐에 대한 그들의 결합을 유지하였다(표 10). 결합 신호(450 nm에서의 흡광도)는 분해되지 않은 샘플과 분해된 샘플에 대해 매우 유사하였다. GingisKHAN 2Fab'(도 4 참조)의 경우, 결합이 유지되었지만, 링커 IgG1G4S, IgG 2AMH, IgG 2AH 및 IgG 2BH에 대해서는 감소되었다. 따라서, 링커 IgG1 H, IgG1 MH 및 IgG1 UH를 갖는 IgG는 모두 피브리노겐에 대한 그의 결합을 상실하였다.
[표 10]
3가 다량체를 또한 F(ab')3의 짧은 아암 위치인 VH1에 위치된 티로글로불린 결합에 대해 분석하였다(도 4 참조). FabRICATOR F(ab')3 샘플(분해되지 않은 Fab, 조 Fab, 및 정제된 Fab)은 모두 티로글로불린에 대한 그들의 결합을 유지하였다(표 11). 결합 신호(450 nm에서의 흡광도)는 분해되지 않은 샘플과 분해된 샘플에 대해 매우 유사하였다. 이러한 Fab는 3가 절단된 다량체 내의 짧은 아암의 VH1 위치에 존재하며, 효소적 분해에 의해 영향을 받지 않았다. GingisKHAN의 경우, 모든 샘플(분해되지 않은 Fab, 조 Fab, 및 정제된 Fab)은 티로글로불린에 대한 그들의 결합을 유지하였다. 결합 신호(450 nm에서의 흡광도)는 분해되지 않은 샘플과 분해된 샘플에 대해 매우 유사하였다.
[표 11]
단편 생성은 또한 SDS-PAGE 전기영동에 의해 확인되었다. 도 5의 A 내지 도 5의 D에 나타낸 바와 같이, FabRICATOR는 각각의 3가 절단된 다가 다량체에 대한 (Fab')3 단편의 생성에 대해 잘 작용하였다. PT23103p09의 경우, 처리되지 않은 IgG(비환원됨(NR) 및 환원됨(R))는 적절한 단백질 밴드를 나타내었다. 환원성 조건 및 비환원성 조건 둘 모두 하에서, FabRICATOR 반응물 중의 Fc는 관찰되지 않았다. 대신에, "하프 Fc" 밴드가 관찰되는데, 그 이유는, 이 효소가 2개의 중쇄를 연결하는 힌지 시스테인 아래에서 절단하여 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드를 생성하기 때문이다. 미정제된 GingisKHAN 반응물 및 그의 관류물 샘플(Fc) 둘 모두는 비환원성 겔에서 환원된 것으로 나타났다. 이는 절단 완충액에 존재하는 바와 같은 온화한 환원제(2 mM 시스테인)에 의해 야기되었을 가능성이 높은데, 상기 환원제는 SDS-PAGE 샘플 제조 시에 이황화 결합의 환원을 가져온다. 정제된 GingisKHAN 반응물에서, 예상된 단편이 나타난다(도 5의 A).
PT23103p15의 경우, 처리되지 않은 IgG(NR 및 R)가 또한 적절하게 보였다. FabRICATOR 샘플은 적절한 단백질 밴드를 나타내었다. 환원성 조건 및 비환원성 조건 둘 모두 하에서, FabRICATOR 반응물 중의 Fc는 관찰되지 않았다. 대신에, "하프 Fc" 밴드가 관찰되는데, 그 이유는, 이 효소가 2개의 중쇄를 연결하는 힌지 시스테인 아래에서 절단하여 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드를 생성하기 때문이다. 미정제된 GingisKHAN 반응물 및 그의 관류물 샘플(Fc) 둘 모두는 비환원성 겔에서 환원된 것으로 나타났다. 이는 절단 완충액 중의 온화한 환원제(2 mM 시스테인)에 의해 야기되었을 가능성이 높은데, 상기 환원제는 SDS-PAGE 샘플 제조 시에 이황화 결합의 환원을 가져온다. 비환원된 SDS-PAGE에서 분석된 정제된 GingisKHAN 반응물에서는, 3개의 밴드가 약 50 kDa에서 나타난다. 이들 3개의 밴드는 F(ab')3의 3개의 단일 Fab를 나타내며, 상이한 높이로 전개되는데, 그 이유는 긴 아암으로부터의 2개의 Fab 사이의 링커의 부분 및 이들 Fab에 연결된 힌지의 부분 때문이다. 환원성 조건 하에서, 모든 단백질은 VL-CL 또는 VH-CH1 폴리펩티드의 높이에서 약 25 kDa에서 전개되었다. ELISA에서 피브리노겐에 대한 결합능은 조 반응물 및 정제된 반응물 둘 모두에서 상실되었지만, ELISA에서 파상풍 및 티로글로불린에 대한 결합능은 여전히 온전하였다(도 5의 B).
PT23103p04의 경우, 처리되지 않은 IgG(NR 및 R)가 적절하게 보였다. 모든 FabRICATOR 샘플은 적절한 단백질 밴드를 나타내었다. 비환원성 조건 하에서, FabRICATOR 반응물 중의 Fc는 관찰되지 않았다. 대신에, "하프 Fc" 밴드가 나타났는데, 그 이유는, 이 효소가 2개의 중쇄를 연결하는 힌지 시스테인 아래에서 절단하여 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드를 생성하기 때문이다. 미정제된 GingisKHAN 반응물 및 그의 관류물 샘플(Fc) 둘 모두는 비환원성 겔에서 환원된 것으로 나타났다. 이는 절단 완충액 중의 온화한 환원제(2 mM 시스테인)에 의해 야기되었을 가능성이 높은데, 상기 환원제는 SDS-PAGE 샘플 제조 시에 이황화 결합의 환원을 가져온다. 정제된 GingisKHAN 반응물에서, 예상된 단편이 나타났다(도 5의 C).
PT23103p08, PT23103p03, PT23103p11, 및 PT23103p12의 경우, 처리되지 않은 IgG(NR 및 R)가 적절하게 보였다. 모든 FabRICATOR 샘플은 적절한 단백질 밴드를 나타내었다. 비환원성 조건 하에서, FabRICATOR 반응물 중의 Fc는 관찰되지 않았다. 대신에, "하프 Fc" 밴드가 나타났는데, 그 이유는, 이 효소가 2개의 중쇄를 연결하는 힌지 시스테인 아래에서 절단하여 SDS-PAGE 샘플 제조 시에 이황화 결합의 환원을 가져오기 때문이다. 조 GingisKHAN 반응물은 비환원성 겔에서 환원된 것으로 나타났다. 이는 절단 완충액 중의 온화한 환원제(2 mM 시스테인)에 의해 야기되었을 가능성이 높은데, 상기 환원제는 SDS-PAGE 샘플 제조 시에 이황화 결합의 환원을 가져온다. PT23103p08 및 PT23103p03 샘플의 경우, FabRICATOR 반응물은 예상된 대로 F(ab')3을 나타내는 반면; GingisKHAN 반응물은 2Fab' 단편을 나타내지 않았으며, 그 대신 단일 Fab 단편에 대체로 상응하는 더 작은 밴드가 확인되었다. FabRICATOR로 분해된 PT23103p11 및 PT23103p12는 F(ab')3을 생성한다. GingisKHAN으로 분해된 PT23103p11 및 PT23103p12는 예상된 대로 2Fab' 단편을 생성하지만, 소정의 성분들은 GingisKHAN으로 분해될 때 환원되지 않는다(도 5의 D). 사용되는 시간 또는 시약을 조정함으로써 환원이 용이하게 완화될 수 있음이 이해된다.
요약하면, FabRICATOR-분해된 반응물의 경우, 모든 샘플은 예상된 단백질 밴드를 나타내었다. 비환원성 조건 하에서, FabRICATOR 반응물 중의 Fc는 관찰되지 않는다. 대신에, "하프 Fc" 또는 "CH2-CH3" 밴드가 나타났는데, 그 이유는, 이 효소가 2개의 중쇄를 연결하는 시스테인 가교 아래에서 절단하여 2개의 CH2-CH3 폴리펩티드를 생성하기 때문이다.
2Fab'을 생성하는 GingisKHAN-분해된 반응물의 경우, 일부 링커에 존재하는 바와 같은 서열(KSCDK / THT C PP C ) (서열 번호 92)은 GingisKHAN에 의해 인식되고, 하기 3가 분자들의 경우, 링커 서열은 유사하다.
PT23103p15(링커 IgG1 H) KSCDK / THT S PP S (서열 번호 93)
PT23103p08(링커 IgG1 MH) KSCDK / THT S PP S (서열 번호 93)
PT23103p03(링커 IgG1 UH) KSCDK / THT S PP S (서열 번호 93)
따라서, 이들 샘플 내의 2Fab'이 2개의 별개의 Fab로 절단되었을 가능성이 높으며, 이는 SDS-PAGE 프로파일과 상관된다. 이들 샘플의 경우, 유리 링커는 결합 부위를 방해할 수 있으며, 이는 피브리노겐에 대한 결합의 손실을 설명할 수 있다.
요약하면, FabRICATOR는 잘 작용하였으며, 본 명세서에 개시된 방법은 특이적 결합이 유지된 상태로, 그리고 각각의 Fab에 공통 경쇄를 갖고, DEKK와 같은 이종이량체화를 통해 쌍형성된, 절단된 다중특이성 다량체(F(ab')n)가 고농도로 용이하게 생성될 수 있다는 것을 확립하면서, 절단된 3가 다량체(F(ab')3)를 고농도로 생성하였다. 반면에, GingisKHAN 효소의 사용을 통한 2Fab' 단편의 생성은 변형된 IgG1 힌지 서열 KSCDK / THT S PP S (서열 번호 93)가 결여된 링커에 대해 작용하였다.
따라서, 본 명세서에 개시된 교시내용을 사용하여, 당업자는 FabRICATOR 효소의 사용에 의한 것을 포함하여, 실질적으로 순수한 절단된 다가(및 다중특이성) 다량체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 다가 다량체를 사용하여, 본 명세서에 개시된 교시내용에 따라, 추가의 결합 도메인이 GingisKHAN에 의해 인식되는 모티프가 결여되어 있는 링커를 통해 상기 다량체에 연결되는 경우, 이는 당업자가 nFab' 및 Fab의 혼합물을 생성할 수 있게 하며, 여기서 n은 2 이상이고, nFab'은 본 명세서에 기재된 링커를 통해 하나 이상의 추가의 가변 도메인에 연결되거나, 본 명세서에 기재된 링커를 통해 하나 이상의 추가의 가변 도메인에 연결된 경쇄에 쌍형성된 가변 도메인을 포함하는 중쇄로 구성된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Merus N.V.
<120> TRUNCATED MULTIVALENT MULTIMERS
<130> P122912PC00
<150> US 62/786,806
<151> 2018-12-31
<160> 93
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Translation of common light chain (cLC)
<400> 1
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50 55 60
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100 105 110
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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210
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gly
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Ala Gly
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<211> 19
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Leu Gly Gly
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Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
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Lys Ala Pro Pro Val Ala Gly
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<213> Artificial sequence
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<223> Linker
<400> 23
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
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20
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1 5
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<211> 18
<212> PRT
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<400> 29
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
1 5 10 15
Ala Gly
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<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
1 5
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<213> Homo sapiens
<400> 31
Ala Pro Pro Val Ala Gly
1 5
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
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1 5 10 15
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20 25 30
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
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Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro
50 55 60
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<213> Homo sapiens
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20 25 30
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35 40 45
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Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
1 5
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<213> Homo sapiens
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<223> Synthetic construct
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Pro Val Ala Gly Glu
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<223> Synthetic construct
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
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<223> Synthetic construct
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50
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50
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Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
35 40 45
Gly
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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1 5 10 15
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20 25 30
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic construct
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20 25 30
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Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
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20 25 30
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
35 40 45
Gly
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 57
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ser Pro Ser Ser Pro Glu Val Gln Leu Val
20 25 30
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
35 40
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<400> 58
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Glu Val Gln
20 25 30
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
35 40
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<220>
<223> Synthetic construct
<400> 59
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Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly
35
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 60
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
1 5 10 15
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
20 25 30
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
35 40 45
Gly Val Val Gln Pro Gly
50
<210> 61
<211> 52
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 61
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
1 5 10 15
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met
50
<210> 62
<211> 321
<212> DNA
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<220>
<223> common light chain variable domain (IGKV1-39/jk1)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
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gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc 144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc cct cca 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 64
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 65
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> V-region IGKV1-39A
<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
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<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF6058 in Mase DNA
<400> 66
ggcccagccg gccatggccc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgacg tgaagaagcc 60
tggggcctca gtgaaggtca cgtgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat 120
gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagc tcttgagtgg atgggatgga tcaaccctca 180
aagtggtggc acaaactatg caaagaagtt tcagggcagg gtctctatga ccagggagac 240
gtccacaagc acagcctaca tgcagctgag caggctgaga tctgacgaca cggctacgta 300
ttactgtgca agagatcatg gttctcgtca tttctggtct tactggggct ttgattattg 360
gggccaaggt accctggtca cc 382
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<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF6058 in Mase AA
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Thr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gln Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Lys Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Arg Glu Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF3004 DNA
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caggtgcagc tgaagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
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cctggacagg gacttgagtg gattgcaagg atttatcctg gaagtggtta tacttactac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaag aatcctccag cactgcctac 240
atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagaccccac 300
tatggttacg acgactggta cttcggtgtc tggggcacag gcaccacggt cacc 354
<210> 69
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF3004 AA
<400> 69
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
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Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Gly Val Trp Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Val Thr
115
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<211> 372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1337 DNA
<400> 70
gaggtgcagc tggtggagac tggggctgag gtgaagaagc cgggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctgacta catcttcacc aaatatgaca tcaactgggt gcgccaggcc 120
cctggacaag ggcttgaatg gatgggatgg atgagcgcta acactggaaa cacgggctat 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccataaa cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgac atctggtgac acggccgttt atttctgtgc gaggagtagt 300
cttttcaaga cagagacggc gccctactat cacttcgctc tggacgtctg gggccaaggg 360
accacggtca cc 372
<210> 71
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1337 AA
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Leu Phe Lys Thr Glu Thr Ala Pro Tyr Tyr His Phe
100 105 110
Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
115 120
<210> 72
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding MF1337-CH1-IgG1 G4S linker-MF1122
<400> 72
ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct ggtggagact ggggctgagg tgaagaagcc 60
gggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctgactac atcttcacca aatatgacat 120
caactgggtg cgccaggccc ctggacaagg gcttgaatgg atgggatgga tgagcgctaa 180
cactggaaac acgggctatg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac 240
gtccataaac acagcctaca tggagctgag cagcctgaca tctggtgaca cggccgttta 300
tttctgtgcg aggagtagtc ttttcaagac agagacggcg ccctactatc acttcgctct 360
ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctccagt gctagcacca agggcccatc 420
ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagtc cacgtctggg ggcacagcgg ccctgggctg 480
cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac 540
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 600
cgtcgtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 660
caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aagagctgcg acggcggtgg 720
cggcagcggc ggcggaggca gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcgtggtcca 780
gcctgggagg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gtagctatgg 840
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gtattactgt gcaagagccc tcttcacgac catcgccatg gactattggg gccaaggtac 1080
ccttgtcacc gtctcgagt 1099
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<211> 366
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1337-CH1-IgG1 G4S linker -MF1122
<400> 73
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu
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20 25 30
Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr
50 55 60
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp
85 90 95
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ser Leu Phe Lys Thr Glu Thr
100 105 110
Ala Pro Tyr Tyr His Phe Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
260 265 270
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
290 295 300
Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
325 330 335
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Phe Thr Thr Ile Ala
340 345 350
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding MF 1377-CH1-IgG1 H linker- MF1122
<400> 74
ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct ggtggagact ggggctgagg tgaagaagcc 60
gggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctgactac atcttcacca aatatgacat 120
caactgggtg cgccaggccc ctggacaagg gcttgaatgg atgggatgga tgagcgctaa 180
cactggaaac acgggctatg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac 240
gtccataaac acagcctaca tggagctgag cagcctgaca tctggtgaca cggccgttta 300
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ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctccagt gctagcacca agggcccatc 420
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cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac 540
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 600
cgtcgtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 660
caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aagagctgcg acaagaccca 720
caccagcccc cccagccccg ctcccgagct gctgggcggc gaggtgcagc tggtggagtc 780
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<210> 75
<211> 372
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF 1377-CH1-IgG1 H linker-MF1122
<400> 75
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu
1 5 10 15
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20 25 30
Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr
50 55 60
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp
85 90 95
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ser Leu Phe Lys Thr Glu Thr
100 105 110
Ala Pro Tyr Tyr His Phe Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Glu Val Gln
245 250 255
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
260 265 270
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
275 280 285
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
290 295 300
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
305 310 315 320
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
325 330 335
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala
340 345 350
Leu Phe Thr Thr Ile Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
355 360 365
Thr Val Ser Ser
370
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<211> 1087
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding MF1377-CH1-IgG2A MH linker -MF1122
<400> 76
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cactggaaac acgggctatg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac 240
gtccataaac acagcctaca tggagctgag cagcctgaca tctggtgaca cggccgttta 300
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<213> Artificial Sequence
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<400> 77
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu
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Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr
50 55 60
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp
85 90 95
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ser Leu Phe Lys Thr Glu Thr
100 105 110
Ala Pro Tyr Tyr His Phe Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
195 200 205
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Ser Pro
225 230 235 240
Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
245 250 255
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
260 265 270
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala
290 295 300
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
305 310 315 320
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
325 330 335
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Phe Thr Thr Ile Ala Met Asp Tyr Trp
340 345 350
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360
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<211> 1096
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding MF1377-CH1-IgG1 MH linker- MF1122
<400> 78
ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct ggtggagact ggggctgagg tgaagaagcc 60
gggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctgactac atcttcacca aatatgacat 120
caactgggtg cgccaggccc ctggacaagg gcttgaatgg atgggatgga tgagcgctaa 180
cactggaaac acgggctatg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac 240
gtccataaac acagcctaca tggagctgag cagcctgaca tctggtgaca cggccgttta 300
tttctgtgcg aggagtagtc ttttcaagac agagacggcg ccctactatc acttcgctct 360
ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctccagt gctagcacca agggcccatc 420
ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagtc cacgtctggg ggcacagcgg ccctgggctg 480
cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac 540
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 600
cgtcgtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 660
caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aagagctgcg acaagaccca 720
caccagcccc cccagccccg aggtgcagct ggtggagtct gggggaggcg tggtccagcc 780
tgggaggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagta gctatggcat 840
gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg gtggcagtta tatcatatga 900
tggaagtaat aaatactatg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa 960
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tgtcaccgtc tcgagt 1096
<210> 79
<211> 365
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1377-CH1-IgG1 MH linker-MF1122
<400> 79
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu
1 5 10 15
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr
50 55 60
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp
85 90 95
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ser Leu Phe Lys Thr Glu Thr
100 105 110
Ala Pro Tyr Tyr His Phe Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
260 265 270
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
275 280 285
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
290 295 300
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
305 310 315 320
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
325 330 335
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Phe Thr Thr Ile Ala Met
340 345 350
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
<210> 80
<211> 1081
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding MF1377-CH1-IgG1 UH linker-MF1122
<400> 80
ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct ggtggagact ggggctgagg tgaagaagcc 60
gggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctgactac atcttcacca aatatgacat 120
caactgggtg cgccaggccc ctggacaagg gcttgaatgg atgggatgga tgagcgctaa 180
cactggaaac acgggctatg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac 240
gtccataaac acagcctaca tggagctgag cagcctgaca tctggtgaca cggccgttta 300
tttctgtgcg aggagtagtc ttttcaagac agagacggcg ccctactatc acttcgctct 360
ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctccagt gctagcacca agggcccatc 420
ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagtc cacgtctggg ggcacagcgg ccctgggctg 480
cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac 540
cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag 600
cgtcgtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca 660
caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc aagagctgcg acaagaccca 720
caccgaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcgtggtc cagcctggga ggtccctgag 780
actctcctgt gcagcctctg gattcacctt cagtagctat ggcatgcact gggtccgcca 840
ggctccaggc aaggggctgg agtgggtggc agttatatca tatgatggaa gtaataaata 900
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gtatctgcaa atgaacagcc tgagagctga ggacacggcc gtgtattact gtgcaagagc 1020
cctcttcacg accatcgcca tggactattg gggccaaggt acccttgtca ccgtctcgag 1080
t 1081
<210> 81
<211> 360
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1377-CH1-IgG1 UH linker-MF1122
<400> 81
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu
1 5 10 15
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr
50 55 60
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp
85 90 95
Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Ser Leu Phe Lys Thr Glu Thr
100 105 110
Ala Pro Tyr Tyr His Phe Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
245 250 255
Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
260 265 270
Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
275 280 285
Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser
290 295 300
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
305 310 315 320
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
325 330 335
Cys Ala Arg Ala Leu Phe Thr Thr Ile Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360
<210> 82
<211> 1105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding MF1377-CH1-IgG2 H linker-MF1122
<400> 82
ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct ggtggagact ggggctgagg tgaagaagcc 60
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cactggaaac acgggctatg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac 240
gtccataaac acagcctaca tggagctgag cagcctgaca tctggtgaca cggccgttta 300
tttctgtgcg aggagtagtc ttttcaagac agagacggcg ccctactatc acttcgctct 360
ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctccagt gctagcacca agggccccag 420
cgtgttcccc ctggccccct gcagccggag caccagcgag agcaccgccg ccctgggctg 480
cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc tggaacagcg gcgccctgac 540
cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc ggcctgtaca gcctgagcag 600
cgtggtgacg gtgcccagca gcaacttcgg cacccagacc tacacctgca acgtggacca 660
caagcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtggagcgg aagagcagcg tggagagccc 720
ccccagcccc gccccccccg tggccggcga ggtgcagctg gtggagtctg ggggaggcgt 780
ggtccagcct gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagcc tctggattca ccttcagtag 840
ctatggcatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg ctggagtggg tggcagttat 900
atcatatgat ggaagtaata aatactatgc agactccgtg aagggccgat tcaccatctc 960
cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agcctgagag ctgaggacac 1020
ggccgtgtat tactgtgcaa gagccctctt cacgaccatc gccatggact attggggcca 1080
aggtaccctt gtcaccgtct cgagt 1105
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<211> 368
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1377-CH1-IgG2 H linker-MF1122
<400> 83
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu
1 5 10 15
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Asp
20 25 30
Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr
50 55 60
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ala Pro Tyr Tyr His Phe Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
195 200 205
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Ser Pro
225 230 235 240
Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
260 265 270
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln
275 280 285
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly
290 295 300
Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
305 310 315 320
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
325 330 335
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Phe Thr Thr
340 345 350
Ile Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
<210> 84
<211> 1105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding MF1377-CH1-IgG2B H linker-MF1122
<400> 84
ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct ggtggagact ggggctgagg tgaagaagcc 60
gggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctgactac atcttcacca aatatgacat 120
caactgggtg cgccaggccc ctggacaagg gcttgaatgg atgggatgga tgagcgctaa 180
cactggaaac acgggctatg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac 240
gtccataaac acagcctaca tggagctgag cagcctgaca tctggtgaca cggccgttta 300
tttctgtgcg aggagtagtc ttttcaagac agagacggcg ccctactatc acttcgctct 360
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ggccgtgtat tactgtgcaa gagccctctt cacgaccatc gccatggact attggggcca 1080
aggtaccctt gtcaccgtct cgagt 1105
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1377-CH1-IgG2B H linker-MF1122
<400> 85
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Ala Glu
1 5 10 15
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20 25 30
Tyr Ile Phe Thr Lys Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
35 40 45
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Ala Asn Thr Gly Asn Thr
50 55 60
Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65 70 75 80
Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp
85 90 95
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100 105 110
Ala Pro Tyr Tyr His Phe Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
130 135 140
Ala Pro Ser Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
165 170 175
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
180 185 190
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn
195 200 205
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
210 215 220
Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Ser Val Glu Ser Pro
225 230 235 240
Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
260 265 270
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln
275 280 285
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly
290 295 300
Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
305 310 315 320
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
325 330 335
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Phe Thr Thr
340 345 350
Ile Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 86
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1122 DNA
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 87
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Leu Phe Thr Thr Ile Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr
115
<210> 88
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1025 DNA
<400> 88
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagggccgat 300
tggtgggcga cttttgacta ctggggccaa ggtaccctgg tcacc 345
<210> 89
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MF1025 AA
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Trp Trp Ala Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr
115
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG middle hinge region
<400> 90
Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG helix forming sequence
<400> 91
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> multivalent multimer lacking Fc region
<400> 92
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1 5 10
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PT23103p15 (Linker IgG1 H)
<400> 93
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser
1 5 10
Claims (27)
- 3개 이상의 결합 도메인을 포함하고, N-말단 및 C-말단을 갖는 2개 이상의 중쇄 영역을 포함하는 다가 다량체로서,
상기 C-말단에서 상기 중쇄 영역들 중 2개를 쌍형성(pairing)하는 힌지(hinge) 영역을 포함하는, 다가 다량체. - 제1항에 있어서, 3개 이상의 인간 중쇄 가변 영역을 포함하며, 이들 중 2개는 상기 힌지 영역에서 쌍형성되며, 상기 쌍형성은 하나 이상의 이황화 가교(disulfide bridge)를 포함하는, 다가 다량체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 각각의 중쇄 영역은 CH1 도메인을 포함하는, 다가 다량체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 중쇄 영역은 공통 가변 영역을 포함하는, 다가 다량체.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 중쇄 영역은 인간 경쇄 영역과 쌍형성되며, 상기 경쇄 영역은 공통 경쇄인, 다가 다량체.
- 제5항에 있어서, 상기 공통 경쇄는 CL 도메인을 포함하는, 다가 다량체.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 공통 경쇄는 서열 번호 1의 서열을 포함하는, 다가 다량체.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체는 3개의 Fab 도메인(Fab1, Fab2, Fab3)을 포함하며, 각각은 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)을 포함하는 경쇄와 쌍형성된 가변 영역(VH) 및 불변 영역(CH1)을 포함하는 중쇄를 포함하며, Fab2와 Fab3은 Fab2의 중쇄 가변 영역 및 Fab3의 CH1 도메인에서 링커를 통해 연결되고, 상기 Fab1과 Fab3은 상기 Fab1의 중쇄 및 Fab3의 중쇄의 C-말단에 존재하는 적어도 2개의 이황화 결합을 포함하는 힌지를 통해 쌍형성되는, 다가 다량체.
- 제8항에 있어서, Fab2와 Fab3을 연결하는 상기 링커는 서열 번호 2 내지 25의 서열, 또는 상기 서열 번호 2 내지 25와 적어도 약 85%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, 다가 다량체.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 링커의 아미노산 서열은 천연-발생 서열을 포함하거나 천연-발생 서열로부터 유래되는 서열을 포함하는, 다가 다량체.
- 제10항에 있어서, 상기 링커는 중간 힌지 영역 서열을 포함하는, 다가 다량체.
- 제10항에 있어서, 상기 링커는 상부 및 하부 힌지 서열을 포함하는, 다가 다량체.
- 제10항에 있어서, 상기 링커는 나선-형성 서열을 포함하는, 다가 다량체.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개 이상의 중쇄 영역의 가변 영역은 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는, 다가 다량체.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체는 적어도 2개의 상이한 항원에 결합하는, 다가 다량체.
- 다가 다량체의 생성 방법으로서,
공통 경쇄 가변 영역 및 재배열되지 않은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 유전자도입 동물을 2개 이상의 항원으로 면역화하는 단계;
상기 공통 경쇄 가변 영역, 및 상기 2개 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 재배열된 중쇄 항체 사슬을 포함하는 항체들의 패널을 얻는 단계;
상기 공통 경쇄 가변 영역, 및 상기 2개 이상의 항원에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 재배열된 중쇄를 인코딩하는 핵산을 숙주 세포에 통합시키는 단계 - 상기 재배열된 중쇄들 중 2개는 이황화 가교의 형성을 통해 쌍형성할 수 있는 CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 불변 영역을 포함함 -;
상기 공통 경쇄 및 2개 이상의 재배열된 중쇄를 포함하는 온전한 다가 다량체의 발현을 제공하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 - 상기 재배열된 중쇄들 중 2개는 상기 2개의 재배열된 중쇄 각각의 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에서 이황화 가교를 통해 쌍형성됨 -; 및
상기 온전한 다가 다량체를 상기 2개의 재배열된 중쇄 각각으로부터 상기 CH2 및/또는 CH3 영역을 절단하는 효소로 처리하여, 이황화 가교를 통해 상기 2개의 재배열된 중쇄의 쌍형성을 유지하여 상기 다가 다량체를 형성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 불변 영역을 포함하는 상기 2개의 중쇄는 이종이량체화를 촉진하는 상보적 변형을 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 변형은 면역글로불린 CH2 또는 CH3 영역 내에 있는, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 상보적 변형은 노브 인투 홀(knob into hole) 변형, 정전기(electrostatic) 변형, 또는 DEKK 변형을 포함하는, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 2개의 중쇄 중 첫 번째는 상기 2개의 중쇄 중 두 번째의 제2 CH3 도메인과 이량체화되는 제1 CH3 도메인을 포함하며, 이의 제1 CH3은 위치 351 및 366에 또는 이에 상응하는 위치에 아미노산 잔기 라이신을 포함하고, 이의 제2 CH3은 351에 또는 이의 상응하는 위치에 아스파르트산의 아미노산 잔기를 포함하고 368에 또는 이의 상응하는 위치에 글루탐산의 아미노산 잔기를 포함하는, 방법.
- 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 가변 영역은 생식세포계열(germline) 내에 재배열된 가변 사슬 핵산 서열을 포함하는 유전자도입 설치류에 의해 인코딩된 핵산으로부터 얻어지거나, 이로부터 유래되거나, 이를 기반으로 하는 핵산에 의해 인코딩되는, 방법.
- 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소를 태깅하고 상기 효소를 항-태그 친화성 칼럼을 통해 제거함으로써 상기 다가 다량체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되거나 얻어질 수 있는 다가 다량체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 다가 다량체로 조립할 수 있는 폴리펩티드들을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 다가 다량체 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
- 의학적 적응증(medical indication)을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 다가 다량체의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 요법에 사용하기 위한 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 다가 다량체.
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