TW202039577A

TW202039577A - 截斷的多價多元體

Info

Publication number: TW202039577A
Application number: TW108148421A
Authority: TW
Inventors: 寇尼斯Ａ迪克夫
Original assignee: 荷蘭商美勒斯公司
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-11-01
Also published as: CN113439089A; WO2020141974A1; EP3906256A1; MA54643A; JP7440516B2; CA3124688A1; US20220380440A1; CN114249818A; SG11202105926QA; JP2022519338A; KR20210111767A; EA202191242A1; IL283701A

Abstract

本發明係關於一種包含二個或多於二個結合域之截斷的多價多元體，其中每一結合域結合不同抗原或抗原決定基，且其中該等結合域中之二個經由鉸鏈區配對，其中該多元體缺乏CH2或CH3區。本發明進一步包含在其包含二個或多於二個二硫橋鍵之各別C末端處或附近配對的二個多肽，其中該多肽各自包含可變結合域，該可變結合域包含可變區，其中每個可變區結合相同或不同的抗原或結合一抗原上之相同或不同抗原抗原決定基。

Description

截斷的多價多元體

發明領域

本發明係關於具有在C末端經由鉸鏈配對之二個或多於二個結合域的多價多元體，以及用於製備此類多價多元體之方法。本發明進一步係關於能夠結合二個或多於二個抗原決定基或抗原之多價多元體的組成多肽，其中此類多肽經由包含二硫橋鍵之共價鍵配對。

發明背景

能夠結合二種抗原或二個抗原決定基之多價抗體，諸如雙特異性抗體係此項技術中已知的。此類多價結合蛋白可使用各種技術產生，該等技術包括細胞融合、化學綴合或重組DNA技術。

抗體典型地係包含四種蛋白質之多元體，該四種蛋白質包括二個一致重鏈及二個一致輕鏈，其中該重鏈包含一個可變域(VH)及三個恆定區(CH1、CH2、CH3)，且其中該輕鏈包含一個可變輕鏈域(VL)及一個恆定區(CL)。典型地，該輕鏈經由非共價相互作用之影響以及經由二硫鍵與該重鏈配對。該二個重鏈在鉸鏈區處經由二硫鍵且經由在該二個CH3域之間之界面中的胺基酸相互作用配對。VH與VL配對形成抗原結合域，且典型地在VH及VL域中之三個表面環形成區，即互補決定區或CDR中發現變化。

此項技術中已知可結合兩種不同抗原，或結合同一抗原內之兩個不同抗原決定基的某些多價形式，諸如具有兩個不同結合域之抗體，諸如雙特異性抗體。此類形式可允許使用經校準之結合，該結合將允許該多價多元體選擇性靶向表現二種抗原或抗原決定基之細胞或目標，諸如腫瘤細胞，而不靶向表現一種抗原之健康細胞或以較低位準靶向表現一種抗原之此類健康細胞。類似地，在多價多元體，諸如在雙特異性抗體上具有二個不同結合域可允許結合不同抗原，由此可使用該多價多元體靶向單細胞上或二個相互作用之細胞上的抑制及刺激分子，使得該多價多元體之效力增強。多價形式亦可用於使細胞，例如免疫調節細胞重定向，可使該等細胞重定向至腫瘤。

儘管此項技術中已描述某些多價抗體，但此項技術中仍需要新形式、及新連接子、以及用於製備此類形式之新方法，其允許高效地製造多價抗體形式，其中可容易地製備針對一組抗原之結合域並將其高效、穩定地轉化成多價多元體，且其能夠結合一大組抗原及抗原決定基，包括缺乏(部分或完全地)含CH2及/或CH3區之Fc區的此類形式。

產生缺乏Fc之多特異性形式，諸如F(ab')2或F(ab')n(其中n=二個或多於二個)形式可提供優於現有多特異性抗體之益處。舉例而言，在可能希望經由靶向此類細胞及感興趣的抗原來接合或重定向免疫調節細胞的情況下，此類靶向部分上Fc組分之存在可能在某些應用中不利地影響功效。

類似地，在較小尺寸較佳之情況下，相較於全長形式，F(ab')n多特異性形式可為所希望的，包括可能浸潤實體腫瘤及/或提供較短半衰期，其中此類特徵可有益於給藥方案。重要的是，工程改造含有超過二個具有不同目標之結合域的F(ab')n在傳統上係耗時、低效及/或昂貴的。舉例而言，此項技術中已知可經由多種方式產生F(ab')2部分，該等方式各自具有缺點，其中目標係大量製造此類部分之均勻批料以用於治療應用。

此項技術中已知的產生F(ab')2之一種方式係藉由化學方式實現。Nisonoff及Rivers在數十年前採用化學配對之製造。Nisonoff A, Rivers MM(1961) Arch Biochem Biophys 93:460。隨後，已開發出使用同型雙官能及異型雙官能化學試劑之多種方法。到目前為止，歸因於可經由此類化學方式製造之時間、成本、低數量及異質性，尚無化學方法能高效地或可行地用作開發治療性多特異性F(ab')n候選物之方法。類似地，此類化學合成F(ab')n部分之方式亦由於使用使該二個Fab域配對之合成方式而不利，該方式引起有關用於治療應用之獨立問題，以及製造問題。

舉例而言，F(ab')2可使用o - PDM產生。抗體「A」之Fab'片段與o -PDM反應，使得鄰近二硫醇與o - PDM(R)形成複合物，且一個SH基團結合至o - PDM，並殘留一個游離順丁烯二醯亞胺基。Fab A-o -PDM與游離Fab'「B」片段反應，由此在二個Fab之間形成硫醚鍵。應注意，與此等合成產生方式相關的困難包括難以將此類實體純化至均質，以及難以在不改變人類抗體鉸鏈區情況下構築此類部分，而改變人類抗體鉸鏈區會引起免疫原性及活體內穩定性之缺乏。

實際上，儘管此類人工抗體在2000年間就已產生且利用以化學方式配對之Fab進行了治療各種類型癌症之臨床試驗，但包括其可行性缺乏在內之原因，該概念看來已經不再討論。

產生F(ab')2部分之另一種方式係經由用諸如木瓜蛋白酶之類非特異性蛋白酶部分蛋白水解消化IgG實行。此類酶可切割IgG抗體中含有使重鏈配對之二硫鍵以及在輕鏈與重鏈之間之二硫鍵位點下部的鉸鏈區。此類技術有存在未消化之IgG、過度消化及缺乏再現性之問題。此類非特異性蛋白酶之使用亦被用作一種經由消化全長抗體以裂解Fc而產生F(ab')2部分之方式。此等技術亦相當耗時且需要IgG特異性優化及抑制蛋白酶或純化Fab以防止其降解。另外，此等消化產生過度消化、不充分消化之部分的異質群，且缺乏有關裂解位點之精確性，使得使用此類部分進行研究及治療應用不切實際。困難的是，控制木瓜蛋白酶消化以使僅上部鉸鏈區裂解，且在替代性位點處不裂解，此可取決於所裂解抗體之結構及可撓性而發生。因此，對於某些應用而言，經由木瓜蛋白酶消化具有二個或多於二個結合域之多價抗體係不適當且不可行的。類似地，已採用胃蛋白酶裂解抗體之下部鉸鏈區，旨在獲得完整F(ab')2。利用胃蛋白酶之缺點與利用木瓜蛋白酶類似。

近來，文獻中已描述能夠裂解全長免疫球蛋白中遠離Fc之部分以產生個別Fab部分或F(ab')2的酶。已關於有限的表徵應用描述此類酶，包括用於評價親合力相對於親和力之差異或分析給定多元體中組成部分之分子量或組成。

因此，需要具有二個或多於二個人類可變區及連接子之多價抗原結合多元體之新穎且有用的形式，其用於製造截斷的多價多元體，該等截斷的多價多元體缺乏Fc之全部或一部分，具有天然(不以化學方式合成)鉸鏈配對或橋連Fab區(F(ab')n)且可高效地且均質地產生。本文描述了截斷的多價多元體之產生，該等截斷的多價多元體缺乏Fc區，能夠靶向抗原且能夠用於治療應用。

發明概要

本發明係關於一種包含二個或多於二個結合域之多價多元體，其中每個結合域結合不同抗原或抗原決定基，或結合相同抗原或抗原決定基，且其中該等結合域中之二個經由鉸鏈區配對，其中該多元體缺乏恆定域，包括CH2或CH3區。本發明進一步包含在含二硫橋鍵之各別C末端處或附近配對的二個多肽，其中該等多肽各自包含可變區，其中每個可變區結合相同或不同抗原或一種抗原上之相同或不同抗原決定基。該等結合域較佳地自身與可變區配對形成結合域，典型地VH-CH1與VL-CL配對，其中該VL或VH係該多元體之每個結合域中共有的共同鏈。

在一個實施例中，該多價多元體包含三個或多於三個人類重鏈可變區，其包括含一個可變區(VH1)之短臂及含二個可變區(VH2及VH3)之長臂。在另一個實施例中，每條重鏈包含scFv。在另一個實施例中，每個重鏈區包含CH1域。在另一個實施例中，每個重鏈可變區與共同輕鏈(VLc)配對。在另一個實施例中，該共同輕鏈包含VL-CL。在另一個實施例中，該共同輕鏈包含SEQ ID NO:1之序列。在另一個實施例中，該多元體之每條重鏈包含一共同可變區(VHc)。

在一個實施例中，該等可變區，較佳地重鏈可變區中之二個係經由可變區及CH1域(參見圖1中之細線)連接。在另一個實施例中，該等可變區係經由多肽連接子連接。在另一個實施例中，連接多肽上之可變區的連接子包含選自包含SEQ ID NO:2-25之群之序列或與該等序列中之一個具有至少約85%一致性的多肽。在另一個實施例中，該連接子係短、長、帶電、剛性或可撓性連接子。在另一個實施例中，該連接子之胺基酸序列包含天然存在之序列或包含來源於天然存在之序列的序列。在另一個實施例中，該連接子包含中間鉸鏈區序列。在另一個實施例中，該連接子包含上部及下部鉸鏈序列。在另一個實施例中，該連接子包含螺旋形成序列。

在另一個實施例中，該二個或多於二個重鏈可變區中之二個在其各別C末端處或附近彼此配對(二聚化)，該C末端較佳地包含二個或多於二個二硫橋鍵，其中該等二硫橋鍵與在CH1與CH2區之間存在的天然IgG抗體中之二硫橋鍵相同或實質上相同。此項技術中應理解，鉸鏈二硫鍵之數量在免疫球蛋白亞類間不同，該等免疫球蛋白亞類各自涵蓋在此處所描述之發明內(Papadea及Check, 1989)。

在一個實施例中，該多元體之每個可變區特異性結合不同抗原決定基。

在另一個實施例中，該多價多元體結合至少二種不同抗原。本發明亦關於一種製造多價多元體之方法，其包含：獲得一組特異性結合至二個或多於二個目標之抗體，該等抗體包含共同輕鏈可變區及經重排重鏈；將編碼共同輕鏈可變區及二個或多於二個經重排重鏈之核酸整合至宿主細胞中，其中該等經重排重鏈中之二個包含恆定區，該恆定區包含能夠配對之CH1、CH2及/或CH3域；在使包含該共同輕鏈及二個或多於二個經重排重鏈之完整多價多元體表現的條件下培養該宿主細胞，其中該等經重排重鏈中之二個在該二個經重排重鏈各自之CH1與CH2域之間配對；以及

用裂解該等經重排重鏈中之二個各自之CH2及/或CH3區的酶處理該完整多價多元體，維持該等經重排重鏈中之二個進行之配對以形成該多價多元體。

在本文所揭示之另一個實施例中，藉由用目標對基因轉殖動物免疫接種獲得一組抗體，該基因轉殖動物包含編碼共同輕鏈可變區及未經重排之重鏈可變區的核酸。

在本文所揭示之另一個實施例中，該配對係經由二個或多於二個二硫橋鍵實現。

在一個實施例中，包含CH1、CH2及/或CH3域的該等經重排重鏈中之二個的重鏈恆定區包含促進異二聚化之修飾。在另一個實施例中，該修飾係在免疫球蛋白CH2或CH3區中。在另一個實施例中，該修飾係對各別二個重鏈之孔中節修飾、靜電修飾或DEKK修飾。在另一個實施例中，該宿主細胞表現之多元體包含與第二CH3域二聚化之第一CH3域，根據EU編號，該第一CH3域在位置351及366處或在與其對應之位置處包含胺基酸殘基離胺酸，且該第二CH3域包含胺基酸殘基天冬胺酸在351處及麩胺酸在368處或在與其等對應之位置處。

在另一個實施例中，宿主細胞整合有編碼能夠結合不同抗原之二個或多於二個不同輕鏈可變區的核酸，且該二個或多於二個重鏈可變區係共同的，使得該等輕鏈可變區之不同結合特異性賦予多特異性多元體結合二種或多於二種抗原或抗原決定基的能力。

在一個實施例中，該等共同可變區係由一核酸編碼，該核酸係獲自、來源於或基於由在生殖系中包含編碼經重排可變鏈之核酸的基因轉殖動物，較佳地嚙齒動物編碼的核酸。

在一個實施例中，該方法進一步包含回收該多價多元體。

在一個實施例中，對裂解該二個重鏈之CH2及/或CH3域的酶加標籤，使其可經由親和層析法移除，且接著純化酶、多價多元體及恆定域片段之混合物。在另一個實施例中，該酶係帶電的，使其可自多價多元體之混合物移除且經由基於電荷之層析法裂解恆定域。

本發明亦關於藉由本發明之方法製造或可獲得的多價多元體。

本發明亦關於一種細胞，其包含編碼能夠組裝成本發明之多價多元體之多肽的核酸。

本發明亦關於一種醫藥組合物，其包含本發明之多價多元體及醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑。

本發明亦關於一種治療罹患醫學適應症之個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量的本發明之多價多元體。

本發明亦關於用於療法中的本發明之多價多元體。

詳細說明

本發明係基於包含二個或多於二個可變區之多價多元體的新穎模組形式，其中該等可變區中之二個在其各別C末端處包含二個或多於二個二硫橋鍵，該等二硫橋鍵使該等可變區如天然IgG抗體中一般配對，其中該多價多元體能夠結合二個或多於二個不同抗原或抗原決定基。該等多價多元體缺乏抗體Fc區(包含CH2及/或CH3域)且可製造成使得該等多價多元體包括F(ab')n，其中n=二個或多於二個。

此等多價多元體不同於典型抗體片段，諸如習知之F(ab')2，因為包括本文所描述之F(ab')2或F(ab')n在內的多價多元體可結合相同或不同抗原，且並非藉由胃蛋白酶消化IgG，隨後還原及再氧化所得Fab'片段得到，而是在異二聚化配對之後獲得，包括藉助於DEKK工程改造，隨後酶裂解Fc獲得，由此使經由二硫橋鍵連接F(ab')n多肽之天然鉸鏈保持完整。此等多價多元體任擇地在每個結合域處包含共同鏈(重鏈或輕鏈)，且使用連接子連接該等結合域中之二個或多於二個。

此等多價多元體具有較短半衰期及較快抗體濃度調整之潛在優勢，該較短半衰期可與體內之較少積累相關，由此使可能由其降解產物引起之風險降低，且較快的抗體濃度調整在例如治療性多價多元體具有臨床功效但需要快速自體內清除之情況下可能為有益的。另外，該等多價多元體的免疫原性可低於完整抗體或含有用於使結合域配對之合成組分的抗體結合片段，諸如(scFv)2、二-scFv及雙功能抗體部分。本文所揭示之發明F(ab')n部分係新穎且可容易地產生的，其在每個結合域處帶有共同鏈，諸如Fab，且包括增加穩定性之CH1/CL配對，同時經由連接子連接二個或多於二個Fab，其中該等連接子較佳地不包含由用於本文所描述之方法中之蛋白水解酶識別的基元。定義

「抗體」係屬於免疫球蛋白類蛋白質之蛋白質分子，其含有結合抗原上之抗原決定基的一或多個域，其中該等域係來源於抗體可變區或與該可變區共有序列同源性。

抗體結合具有不同品質，包括特異性及親和力。特異性決定該結合域特異性結合之抗原或其抗原決定基。親和力係對於與特定抗原或抗原決定基結合之強度的量度。此處應注意，抗體之『特異性』係指其對特定抗原之選擇性，而『親和力』係指抗體之抗原結合位點與其所結合之抗原決定基之間相互作用的強度。

因此，如本文所使用，「結合特異性」係指個別抗體結合位點與抗原決定子反應之能力。典型地，本發明多元體之結合位點係位於Fab域中且由重鏈及/或輕鏈之高變區構築。

「親和力」係單一抗原結合位點與其抗原之間相互作用的強度。本發明之多元體針對抗原之單抗原結合位點可以解離常數(KD)表示。典型地，用於治療應用之抗體可具有至多1×10¹⁰ M或甚至更高之親和力。

「抗原」係能夠在宿主生物體中誘導免疫反應(以產生抗體)及/或作為抗體目標之分子。在分子層面上，抗原係以其被抗體之抗原結合位點所結合之能力為特徵。抗原之混合物亦可被視為『抗原』，亦即，技術人員應理解，腫瘤細胞之溶解產物、或病毒粒子有時可視為『抗原』，而此類腫瘤細胞溶解產物或病毒粒子製劑包含許多抗原決定子(例如抗原決定基)。抗原包含至少一個，但通常更多個抗原決定基。

「抗原決定基」或「抗原決定子」係抗原上由免疫球蛋白或抗體特異性結合之位點。抗原決定基可由連續胺基酸或因蛋白質之三級摺疊而相鄰之非連續胺基酸形成(分別為所謂的線性及構形抗原決定基)。由連續、線性胺基酸形成之抗原決定基典型地在暴露於變性溶劑後保留，而藉由三級摺疊形成的抗原決定基典型地在變性溶劑處理後消失。抗原決定基可典型地包括呈特有空間構形之3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。

術語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」包括免疫球蛋白重鏈恆定區序列(或其功能片段)，且除非另外說明，否則包括來自任何生物體之重鏈可變域(或其功能片段)。除非另外說明，否則術語重鏈可變域包括三個重鏈CDR及四個構架(FR)區。重鏈之片段包括CDR及FR，以及其組合。典型重鏈包括(自N末端至C末端)可變域、CH1域、鉸鏈、CH2域及CH3域。重鏈之功能片段包括能夠特異性識別抗原且包含至少一個CDR之片段。可用於本發明之重鏈包括例如不選擇性結合同源輕鏈所選擇性結合之抗原決定基的重鏈。

術語「輕鏈」或「免疫球蛋白輕鏈」包括免疫球蛋白輕鏈可變域或V_L (或其功能片段)；以及來自任何生物體之免疫球蛋白恆定域，或C_L (或其功能片段)序列。除非另外說明，否則術語輕鏈可包括選自人類κ、λ及其組合之輕鏈。除非另外說明，否則輕鏈可變(V_L )域典型地包括三個輕鏈CDR及四個構架(FR)區。一般而言，全長輕鏈自N末端至C末端包括V_L 域，其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；以及輕鏈恆定域。可用於本發明之輕鏈包括不選擇性結合同源重鏈所選擇性結合之抗原決定基的輕鏈。

適合用於多價多元體發明之輕鏈包括共同輕鏈，諸如可藉由篩選現有抗體文庫(濕式文庫或計算機模擬)中最常採用之輕鏈鑑別的輕鏈，其中該等輕鏈不會實質上干擾重鏈之抗原決定基結合域的親和力及/或選擇性，而且亦適合與一系列重鏈配對。舉例而言，適合輕鏈包括來自基因轉殖動物，諸如基因轉殖嚙齒動物之輕鏈，該基因轉殖動物包含整合至其基因組中之共同輕鏈且在暴露於抗原後，可用於產生在重鏈處具有多樣性之多組共同輕鏈抗體。適合用於多價多元體發明之重鏈可類似地包括共同重鏈。

根據本發明，術語「共同輕鏈」係指可一致或具有一些胺基酸序列差異但不影響本發明多元體之結合特異性的輕鏈，亦即，該等差異不會顯著地影響功能結合區之形成。

舉例而言，藉由例如引入並測試保守胺基酸變化、當與同源鏈配對時不會促成或僅部分地促成結合特異性的區域中之胺基酸變化及類似變化來製備或發現不一致但仍在功能上等效之可變鏈可在如本文所使用之共同鏈之定義的範圍內。因此，該等變異體亦能夠結合不同的同源鏈且形成功能性抗原結合域。因此，如本文所使用，術語『共同輕鏈』係指可一致或具有一些胺基酸序列差異但在與重鏈配對之後仍保持所得抗體之結合特異性的輕鏈。某一共同輕鏈及該等功能等效變異體之組合涵蓋在術語「共同輕鏈」內。

術語「天然鉸鏈區」係指在各免疫球蛋白種類之重鏈之中心部分中的未修飾之可撓性域間區，其藉由二硫鍵連接該等2條鏈。

鉸鏈區係在各免疫球蛋白種類之重鏈之中心部分中的可撓性胺基酸鏈段(亦即，該將Fab連接至Fc之部分)，其藉由二硫鍵使此等二條重鏈配對。其富含半胱胺酸及脯胺酸胺基酸，且與任何其他免疫球蛋白區具有極小相似性。

「Fab域」意謂包含可變區之結合域，典型地為包含配對之重鏈可變區及輕鏈可變區的結合域。Fab域可包含恆定區域，包括CH1；及與恆定輕鏈域(CL)及VL域配對之VH域。此類配對可例如經由在CH1及CL域處之二硫橋鍵以共價鍵聯形式進行。

「經修飾Fab域」意謂包含CH1及VH域之結合域，其中該VH與VL域配對且不存在CL域。或者，經修飾Fab域係包含CL及VL域之結合域，其中該VL與VH域配對且不存在CH1域。為了使CH1或CL區能以不配對形式存在，可需要移除疏水性區或減小疏水性區之長度。可使用來自天然地表現單鏈抗體之動物物種，例如來自諸如駱馬或駱駝之類駱駝科動物，或來自鯊魚之CH1區。經修飾Fab域之其他實例包括不與其同源區配對之恆定區CH1或CL，及/或存在不與其同源區配對之可變區VH或VL。

如本文所使用，「完整」抗體係包含抗原結合位點以及一個CL及至少重鏈恆定域CH1、CH2及CH3之抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。

術語「重組宿主細胞」或「宿主細胞」係指引入了外源性DNA之細胞。此類術語不僅係指特定個體細胞，而且亦指此類細胞之後代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而出現在隨後數代中，所以此類後代可能實際上與親本細胞不一致，但仍包括在如本文所使用之術語「宿主細胞」的範圍內。在一個實施例中，宿主細胞包括原核及真核細胞。在一個實施例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。在另一個實施例中，宿主細胞包括但不限於原核細胞株大腸桿菌(E. Coli)；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293、COS、NS0、SP2及PER.C6；昆蟲細胞株Sf9；以及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

如本文所使用，術語「免疫效應細胞」或「效應細胞」係指在哺乳動物免疫系統中之天然細胞譜系內可經活化以影響目標細胞之存活的細胞。免疫效應細胞包括淋巴譜系之細胞，諸如自然殺手(NK)細胞、包括細胞毒性T細胞在內之T細胞、或B細胞，而且骨髓譜系之細胞亦可被視為免疫效應細胞，諸如單核球或巨噬細胞、樹突狀細胞及嗜中性粒細胞。較佳之效應細胞包括NK細胞、T細胞、B細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞或嗜中性粒細胞。

當在本文中提及核酸或胺基酸序列之「一致性百分比(%)」定義為在對準序列達到最佳比較目的之後候選序列中與選定序列中之殘基一致之殘基的百分比。比較核酸序列之序列一致性百分比係使用Vector NTI Program Advance 10.5.2軟體之AlignX應用程式，使用預設設置測定，該等預設設置採用改進之ClustalW演算法(Thompson, J.D., Higgins, D.G.及Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680)、swgapdnarnt分數矩陣、空位開放罰分15及空位延伸罰分6.66。胺基酸序列係利用Vector NTI Program Advance 11.5.2軟體之AlignX應用程式，使用預設設置比對，該等預設設置採用改進之ClustalW演算法(Thompson, J.D., Higgins, D.G.及Gibson T.J., 1994)、blosum62mt2分數矩陣、空位開放罰分10及空位延伸罰分0.1。

在本文中，術語「連接(connected)」或「連接(linked)」係指在一級胺基酸序列藉助於肽鍵將各域彼此接合。舉例而言，重鏈中包含VH-CH1-CH2-CH3之可變區部分可經由連接子(將在CH1處重鏈之額外結合域連接至可變區部分之VH區)連接至重鏈之額外結合域VH-CH1(或將額外結合域連接至額外結合域)，其一起構成一條多肽鏈。類似地，CH1域可連接至可變重鏈區且CL域可連接至可變輕鏈區。術語「連接子」意謂胺基酸殘基或包含藉由用於連接二個多肽之肽鍵接合之二個或多於二個胺基酸殘基的多肽。

「配對」係指構成本發明之多價多元體之多肽之間的相互作用，該相互作用使其可多聚化。舉例而言，額外結合域可包含與輕鏈區(VL-CL)配對之重鏈區(VH-CH1)，其中CH1與CL配對形成該結合域。類似地，二個重鏈多肽可在每一多肽之各別CH1與CH2域之間如IgG1所發生一般經由形成二個或多於二個二硫鍵(或如在例如IgG3中一般經由形成更多二硫鍵)配對在一起，該二個重鏈多肽各自包含可變區、CH1、CH2及/或CH3域。二個重鏈多肽可在CH3域處進一步配對。如本文所描述，抗體域(例如重鏈及輕鏈)之配對可因非共價相互作用以及經由二硫鍵進一步發生，且可經由本文所揭示之技術及藉由此項技術中已知之方法工程改造。

在本說明書及所附申請專利範圍通篇，詞語「包含(comprise)」、「包括(include)」及「具有(having)」以及變化形式，諸如「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「包括(includes)」及「包括(including)」擬以包容性含義解釋。亦即，在上下文允許之情況下，此等詞語意欲表示可能包括未具體敍述之其他要素或整數。

冠詞「一個(種)(a/an)」在本文中用於指該冠詞之語法對象中之一個(種)或多於一個(種)(亦即，一個(種)或至少一個(種))。舉例而言，「一種要素」可意謂一種要素或多於一種元素。多價多元體之不同形式

本發明提供一種截斷的多價多元體，其能夠經由其二個或多於二個結合域結合至其一或多個目標。本發明之多價多元體可包含能夠結合抗原之二個或多於二個可變區，或其部分。重要的是，該多元體缺乏Fc區之全部或一部分，較佳地缺乏整個Fc。本文所揭示之發明的多元體包含在其各別C末端處經由鉸鏈，較佳地經由天然鉸鏈且更佳地包含二個或多於二個二硫鍵配對的二個重鏈區。

在一些實施例中，該多元體包含一或多個額外結合域。在一個實施例中，該多元體包含Fab域，其包含與VL-CL區配對之VH-CH1區。

因此，該多價多元體可包含三個VH區及三個VL區。VH或VL中之任一個可為與同源鏈之經重排可變區配對的共同可變區(VHc或VLc)，或非共同鏈賦予與抗原決定基或抗原之結合特異性者。舉例而言，該三個VL區可為共同鏈(VLc)，且每個VH區(VH1-VH3)可包含經重排可變區，其中該VH1、VH2及VH3區可結合相同抗原決定基或三個不同的抗原決定基。如圖1A中所示，VH1用於指短臂，VH2及VH3用於指長臂，其中VH2係內部臂，其與VH1在其各別C末端處配對，且VH3用於指遠端臂。

其中，該多價多元體包含一個共同輕鏈(VLc)及三個重鏈可變區(VH1-VH3)，包含與VLc-CL配對之VH3-CH1的額外Fab域可經由定位於VH2區或VLc與額外Fab域之CH1或額外Fab域之CL之間的連接子連接至可變區。

在另一個實施例中，構成該多價多元體之個別多肽可在同一蛋白質內混合重鏈及輕鏈。本發明之多價多元體可包含經修飾Fab域。經修飾Fab域可包含經修飾之CH1，由此使其不需要與CL配對。舉例而言，CH1可為駱駝科CH1或基於駱駝科CH1，或經由此項技術中已知之技術修飾成缺乏疏水性殘基。每個VH或VL可為共同或經重排可變區。

本發明之多價多元體可包含不需要與CH1配對之經修飾Fab域。舉例而言，CL可經工程改造以移除疏水性區。經修飾Fab域的每個VH或VL可為共同或經重排可變區。額外經修飾Fab域可經由定位於可變區部分之VL與經修飾Fab域之CL之間的連接子連接至可變區部分。經修飾Fab域的VH與VL可經由半胱胺酸橋配對。本發明之多價多元體可包含不需要與CH1配對之經修飾Fab域，其包含經修飾CL。多價多元體之產生

在一個實施例中，該等多價多元體可藉由酶消化完整多價抗體，或裂解該等多價抗體之特定區域，使該多價多元體之多肽的天然鉸鏈或配對保持完整來製造。完整抗體可為全長免疫球蛋白，例如全長IgG、IgA、IgE、IgD或IgM部分，但較佳地為IgG且更佳地為IgG1。

該等多價多元體之重鏈可設計成經由熟習此項技術者已知之技術，諸如工程改造完整抗體CH3區中之DEKK修飾優先配對。參見以引用的方式併入本文中的WO2013/157954及De Nardis等人, J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706-14717，其展示在驅動重鏈異二聚化之CH3區中進行的工程改造。可用於本發明中的用於驅動異二聚化之替代性方法包括孔中節形式(WO1998/050431)及使用電荷工程改造(charge engineering)(Gunasekaran, JBC 2010, 第285卷, 第19637-19646頁)，以及此項技術中已知之其他適合技術。用於多價多元體形式中之連接子

本發明之多價多元體可包含連接一或多個可變區之一或多個連接子。該連接子連同連接子所連接之結合域一起可至少部分地決定該多價多元體之功能性。

該連接子可包含鉸鏈序列或包含基於鉸鏈序列之序列。因此，適合連接子之胺基酸序列可包含天然存在之序列或包含來源於或基於天然存在之序列的序列。使用此類序列可幫助本發明多價抗體之可開發性及/或幫助確保低免疫原性。出於本申請案之目的，較佳的是，該連接子不含用於自Fc裂解Fab或F(ab')n之任何酶的酶識別位點，使得該酶將以類似方式裂解結合域之間的鍵聯。舉例而言，在製造包括含一個共同輕鏈(VLc)及三個重鏈可變區(VH1-VH3)之三個Fab域的截斷之多價多元體的情況下，較佳的是，將與VLc-CL配對之VH3-CH1連接至VH1或VH2區或VLc區的連接子不包括能夠將Fc自Fab、2Fab'或F(ab')3裂解之酶所識別的胺基酸基元。

因此，將一或多個額外結合域連接至二個或多於二個可變區之適合連接子可來源於IgG或IgA鉸鏈序列。連接子區可基於IgG1鉸鏈區、IgG2鉸鏈區、IgG3鉸鏈區或IgG4鉸鏈區。

典型地，所用鉸鏈區之類型與連接子所連接之額外Fab域之恆定區的類型，例如CH1相配。亦即，若連接子係基於來自IgG1鉸鏈區之一或多個序列，則其所連接之額外Fab域的CH1係來自IgG1之CH1。

抗體之連接子可基於上部、中間或下部鉸鏈區，或此類區域之子集。

IgG1鉸鏈區具有序列：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID NO: 26)。上部鉸鏈區定義為：EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 3) 中間鉸鏈區定義為：CPPCP (SEQ ID NO: 27) 下部鉸鏈區定義為：APELLGG (SEQ ID NO: 28)

因此，在本發明之多元體中，連接子可包含此等序列中之一或多個及/或來源於或基於此等序列中之一或多個的序列。

IgG2鉸鏈區具有序列：ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID NO: 29)。上部鉸鏈區定義為：ERKCCVE (SEQ ID NO: 30) 中間鉸鏈區定義為：CPPCP (SEQ ID NO: 27) 下部鉸鏈區定義為：APPVAG(SEQ ID NO: 31)

IgG3鉸鏈區具有序列：ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 32) 上部鉸鏈區定義為：ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 7) 中間鉸鏈區定義為：CPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO: 33) 下部鉸鏈區定義為：APEFLGG (SEQ ID NO: 34)

IgG4鉸鏈區具有序列：ESKYGPPCPSCPAPEFLGG (SEQ ID NO: 35)。上部鉸鏈區定義為：ESKYGPP (SEQ ID NO: 2) 中間鉸鏈區定義為：CPSCP (SEQ ID NO: 36)

下部鉸鏈區定義為：APEFLGG (SEQ ID NO: 34)。

在野生型IgG之情況下，具有共同序列CXXC之中間區連接兩條IgG重鏈且為剛性的。此等二硫橋鍵並非本申請案所需的，且因此，在連接子包含中間鉸鏈序列之情況下，較佳地，CXXC共同序列中之一個或兩個Cys殘基經例如Ser殘基取代。因此，在一個實施例中，CxxC可為SxxS。

適用於本發明之多價多元體中的連接子可為來源於或基於中間鉸鏈序列的連接子，例如包含中間鉸鏈序列但不包含下部及/或上部鉸鏈序列之序列。適用於本發明之多價多元體中的連接子可為來源於或基於上部鉸鏈序列的連接子，例如包含上部鉸鏈序列但不包含下部及/或中間鉸鏈序列之序列。適用於本發明之多價多元體中的連接子可為不包含中間鉸鏈序列之連接子，例如包含下部與上部鉸鏈序列之組合的序列。

因此，在本發明之多元體中，連接子可包含此等序列中之一或多個及/或來源於或基於此等序列中之一或多個的序列。連接子可基本上由中間鉸鏈區序列組成或來源於或基於此類序列，或基本上由上部及下部鉸鏈區序列組成或來源於或基於此類序列。

適用於本發明之多元體中的連接子可參照包含如本文所闡述之任何連接子序列之胺基酸序列的序列定義，在該序列中產生0至5個胺基酸插入、缺失、取代或添加(或其組合)。在一些實施例中，該連接子包含相對於如本文所闡述之連接子序列包含0至4個、較佳地0至3個、較佳地0至2個、較佳地0至1且較佳地0個胺基酸插入、缺失、取代或添加(或其組合)之胺基酸序列。

適合連接子可為約7至約29個胺基酸長度，例如約10至約20個胺基酸長度。然而，適合連接子可為短連接子，例如長度為約7至約10個胺基酸，或可為長連接子，例如長度為約20至約29個胺基酸。

連接子可包含Ig鉸鏈區或包含來源於或基於連接至與該連接子相同亞類之CH1區的IgG鉸鏈區之序列，且可包含半胱胺酸用於共同輕鏈之共價鍵聯。

適用於本發明之多元體中的連接子可來源於或基於IgG1鉸鏈區、IgG2鉸鏈區、IgG3鉸鏈區或IgG4鉸鏈區。

若打算使用(G₄ S)_n 序列，則較佳地，將其與來自除IgG外之同型或除IgG1外之亞類的鉸鏈序列組合使用且包括CH1區。

在本發明之多元體中，連接子可為剛性或可撓性的，可包含帶電序列，可為筆直或彎曲的。

出於本發明之目的，剛性序列係Karplus及Schulz可撓性預測值為約1.015或更低之序列。部分可撓性之序列係Karplus及Schulz可撓性預測值為約1.015至約1.04之序列。出於本發明之目的，可撓性序列係Karplus及Schulz可撓性預測值為至少約1.015之序列(Karplus PA, Schulz GE. Prediction of Chain Flexibility in Proteins - A tool for the Selection of Peptide Antigens. Naturwissenschaften 1985; 72:212-3；http://tools.immuneepitope.org/bcell/)。可撓性預測值係在沿著序列之連續7個殘基之窗內(1個殘基步長)計算，得到每個窗之預測「可撓性」指數。在連接子序列內之總體可撓性係以全序列之平均值給出。

IgG鉸鏈區中Cys殘基之移除或取代可基於該鉸鏈使連接子可撓性變高，包括經由用絲胺酸(Ser)置換Cys殘基。或者，鑒於螺旋形成序列之存在，連接子可為剛性連接子。因此，中間鉸鏈區，例如保守CPPCP(SEQ ID NO: 90)基元可經螺旋形成序列，例如(EAAAK)₂ (SEQ ID NO:91)置換，由此將在連接子中產生短剛性螺旋。因此，在本發明之多元體中，連接子可包含螺旋形成序列，例如包含胺基酸序列(EAAAK)₂ (SEQ ID NO:91)。使用此類序列可幫助增加剛度。

本發明之連接子可包含如SEQ ID NO:4至6、8至12或14至25中之任一個中所闡述之胺基酸序列，或與其中任一個具有至少約90%序列一致性，較佳地與其中任一個具有至少約95%序列一致性，更佳地與其中任一個具有至少97%序列一致性，更佳地與其中任一個具有至少約98%序列一致性，更佳地與其中任一個具有至少約99%序列一致性的胺基酸序列。

舉例而言，適用於本發明之多價多元體中的連接子可參照包含SEQ ID NO:2至25中之任一個之胺基酸序列的序列定義，在該序列中產生0至5個胺基酸插入、缺失、取代或添加(或其組合)。在一些實施例中，連接子包含相對於SEQ ID NO:4至6、8至12或14至25中所闡述之序列具有0至4個、較佳地0至3個、較佳地0至2個、較佳地0至1個且較佳地0個胺基酸插入、缺失、取代或添加(或其組合)的胺基酸序列。

適用於本發明之多價多元體中之連接子可參照包含SEQ ID NO:2至25中之任一個之胺基酸序列或與其中任一個具有至少約85%序列一致性，諸如與其中任一個具有至少約90%序列一致性，例如與其中任一個具有至少約95%序列一致性，諸如與其中任一個具有至少約98%序列一致性，例如與其中任一個具有至少約99%序列一致性之胺基酸序列的序列定義。表 1 ： 所使用之24 種 不同連接子 / 構築體之序列及其名稱

連接子名稱	序列	連接子尺寸 (aa)

IgG4 UH	ESKYGPP (SEQ ID NO: 2)	7
IgG1 UH	EPKSCDKTHT (SEQ ID NO: 3)	10
IgG2A G4SS	GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:4)	10
IgG2A MH	ERKSSVESPPSP (SEQ ID NO: 5)	12
IgG2B MH	ERKCSVESPPSP (SEQ ID NO: 6)	12
IgG3 UH	ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 7)	12
IgG4 MH	ESKYGPPSPSSP (SEQ ID NO: 8)	12
IgG2A UL	ERKSSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 9)	13
IgG2B UL	ERKCSVEAPPVAG (SEQ ID NO: 10)	13
IgG4 UL	ESKYGPPAPEFLGG (SEQ ID NO: 11)	14
IgG1 MH	EPKSCDKTHTSPPSP (SEQ ID NO: 12)	15
IgG1 G4S	EPKSCDGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 13)	16
IgG2 G4SL	GGGGSGGGGSAPPVAG (SEQ ID NO: 14)	16

IgG1 UL	EPKSCDKTHTAPELLGG (SEQ ID NO: 15)	17
IgG2A H	ERKSSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 16)	18
IgG2B H	ERKCSVESPPSPAPPVAG (SEQ ID NO: 17)	18
IgG3 ULH	ELKTPLGDTTHTAPEFLGG (SEQ ID NO: 18)	19
IgG4 H	ESKYGPPSPSSPAPEFLGG (SEQ ID NO 19)	19
IgG1 H	EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGG (SEQ ID NO: 20)	22
IgG2A R	ERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 21)	23
IgG2B R	ERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAG (SEQ ID NO: 22)	23
IgG4 R	ESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID NO: 23)	24
IgG1 R	EPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGG (SEQ ID NO: 24)	27
IgG3 R	ELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGG (SEQ ID NO: 25)	29

使用連接子使額外結合域各區域配對

本文所使用之連接子可將一或多個可變區連接到至少一個額外結合域。此外，在至少一個額外結合域係Fab域或包含重鏈可變區與輕鏈可變區之配對的情況下，連接子可經由共價鍵聯，典型地經由二硫橋鍵使重鏈與輕鏈配對。因此，在連接子連接各可變區之情況下，其形成多肽之初級胺基酸序列的一部分，例如VH1-CH1-連接子-VH2-CH1。相比之下，在連接子使二個可變域配對之情況下，其將此等域橋連在一起，包括例如藉由產生接觸點、共價鍵，例如在該二個可變域之間之二硫鍵將此等域橋連在一起，由此構成獨立多肽。

該二硫橋鍵可在連接子中之半胱胺酸殘基與額外結合域之可變區之間形成。該由連接子引起之配對可適用於額外結合域，包括含共同輕鏈及對應物經重排重鏈可變區或含共同重鏈及對應物經重排輕鏈可變區之Fab域。

表2示出連接子序列如何連接至CH1及VH2區。表2 ： 加下劃線之序列係連接子序列 ； 側接序列係額外Fab 之CH1 區之CH1 區以及VH2 區

#	名稱	連接子序列(加下劃線)在該連接子序列之前及之後分別含有CH1區及VH序列。在對照IgG1序列中存在CH2區(加下劃線)
1	IgG1 H	NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 37)
2	IgG1 MH	NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 38)
3	IgG1 UH	NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 39)
4	IgG1 G4S	NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 40)
5	IgG1 R	NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTEAAAKEAAAKAPELLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 41)
6	IgG1 UL	NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTAPELLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 42)
7	IgG2A H	NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVESPPSPAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 43)
8	IgG2A MH	NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVESPPSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 44)
9	IgG2A UL	NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVEAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 45)
10	IgG2B H	NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVESPPSPAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 46)
11	IgG2B MH	NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVESPPSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 47)
12	IgG2B UL	NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVEAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 48)
13	IgG2A G4SL	NVDHKPSNTKVDKTVGGGGSGGGGSAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 49)
14	IgG2A G4SS	NVDHKPSNTKVDKTVGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 50)
15	IgG2A R	NVDHKPSNTKVDKTVERKSSVEEAAAKEAAAKAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 51)
16	IgG2B R	NVDHKPSNTKVDKTVERKCSVEEAAAKEAAAKAPPVAGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 52)
17	IgG3 ULH	NVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTAPEFLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 53)
18	IgG3 UH	NVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 54)
19	IgG3 R	NVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTEAAAKEAAAKAPEFLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 55)
20	IgG4 H	NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPSPSSPAPEFLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 56)
21	IgG4 MH	NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPSPSSPEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 57)
22	IgG4 UL	NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPAPEFLGGEVQLVESGGGVVQPG( SEQ ID NO: 58)
23	IgG4 UH	NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPEVQLVESGGGVVQPG(SEQ ID NO: 59)
24	IgG4 R	NVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPEAAAKEAAAKAPEFLGGEVQLVESGGGVVQPG (SEQ ID NO: 60)
25	IgG1鉸鏈	NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM (SEQ ID NO: 61)

應注意，在連接子(以上加下劃線者)之後的VH2序列可取決於所使用之特定可變區而變化。在其他實施例中，在該連接子之後的序列可為輕鏈可變區，包括共同輕鏈。多價性及多特異性

在二個或多於二個可變區結合不同抗原之情況下，第一及第二抗原可為位於一個細胞上或不同細胞類型上的二個不同分子或部分。藉由募集並活化內源性免疫細胞介導細胞毒性的包含二個結合域之抗體係一類新興的抗體治療劑。此可藉由在一個分子中組合對目標細胞(亦即，腫瘤細胞)及效應細胞(例如T細胞、NK細胞及巨噬細胞)之抗原結合特異性來達成(參見例如WO2014/051433)。本發明之多元體包含至少二個結合域。包含三個或多於三個結合域之多價多元體可靶向一個、二個、三個或多於三個腫瘤相關抗原，由此允許相對於健康細胞，特異性靶向有害細胞。舉例而言，該多價多元體之一個結合域或二個結合域可結合異常(腫瘤)細胞上之抗原，而該多價多元體之第二或第三結合域可結合免疫效應細胞上之抗原，由此可引起對表現一或多個腫瘤相關抗原之腫瘤細胞之定向殺滅。或者，該多價多元體之二個結合域可特異性結合至在腫瘤細胞上表現的一致抗原上之兩個不同抗原決定基或不同抗原，同時使此等臂之親和力衰減以減少與僅表現一個抗原之細胞的結合，或其中僅接合該多價多元體之一個結合域。或者，本發明之多價多元體的三個結合域可結合至免疫效應細胞之三種不同抗原，或結合至一致抗原但不同的抗原決定基。

類似地，包含三個或多於三個結合域之多價多元體可結合功能目標，諸如配體或酶，觸發生物反應或阻斷該目標之功能，由此產生抑制性或促效性細胞活性。本發明之多價多元體的至少一個結合域經由連接子連接至可變區部分之結合域。

在至少一個可變區之結合域係Fab域的情況下，此可呈例如VH-CH1-連接子-VH-CH1形式，其中該連接子將重鏈之一個可變區連接到至少一個額外結合域，較佳地Fab域。

或者，此可呈例如VL-CL-連接子-VL-CL形式，其中該連接子將輕鏈之一個可變區連接到至少一個額外結合域，較佳地Fab域。

額外結合域，諸如Fab域，可連接至二個可變區，其各自經由獨立連接子連接。連接額外可變區或額外結合域的二個或多於二個連接子可為相同或不同的。另外，連接子可允許結合域各同源鏈配對。

若本發明之多元體包含多於一個連接子，則該等連接子可為相同或不同的，或其組合。後一狀況之實例係多價多元體包含三個連接子，其中二個相同且第三個不同(不同於其他二個)的情形。

另外，經由連接子連接至另一可變區的可變區可本身附接至經由本文所描述之連接子連接的可變區，其中該等其他可變區可藉由經連接子連接至額外結合域，及經連接子將該可變區連接至第二額外可變區等等以模組方式延伸。

以此方式，本發明之多元體能夠結合二個、三個或多於三個抗原決定基。

本發明之多元體能夠結合二種、三種或多於三種抗原。

本發明之多元體可包含能夠結合至一種抗原上之不同抗原決定基的二個或多於二個可變區，諸如二個或多於二個Fab域。

在一個實施例中，本發明之多元體包含至少三個結合域，諸如三個或多於三個Fab域，其中至少二個Fab係不同的。

本發明之另一態樣包括含至少三個Fab域之多價多元體且因此能夠結合至三個抗原決定基，該三個抗原決定基典型地均彼此不同。

本發明之多元體亦可為多特異性的。多價指示該抗體具有至少二個結合域且因此具有至少二個抗原結合位點。多特異性指示該抗體能夠結合至少二個不同抗原決定基，例如兩種不同抗原或同一抗原上之二個抗原決定基。三特異性指示該抗體能夠結合三個不同抗原決定基。四特異性指示該抗體能夠結合四個不同抗原決定基等等。

本發明之多元體可結合位於同一目標上之目標抗原決定基。相較於僅靶向一個抗原決定基之情況，此可更有效地抵消該目標分子之(生物)功能。舉例而言，本發明之多元體可同時結合至抗原細胞上，例如對於腫瘤細胞增殖至關重要之生長因子受體或可溶性分子上存在之2個或3個或3個以上抗原決定基，由此有效地阻斷引起不受控制之增殖的若干非依賴性信號傳導路徑。

至少二種本發明多元體之任何組合可同時結合至目標分子，諸如生長因子受體或可溶性分子上存在的2、3、4個或更多個抗原決定基。在至少二種本發明多元體之組合中，二種多元體可共有至少一個共同結合域。

目標部分可為可溶性部分，或可為膜結合部分，或可為當結合時內化的細胞表面上存在之部分。

目標抗原決定基可位於不同部分上，例如二個(亦即，第一部分上之二個或多於二個目標抗原決定基及第二部分上之一或多個目標抗原決定基)或三個不同部分(亦即，三個部分中每一個上之至少一個目標抗原決定基)上。在此情況下，該等不同目標部分各自可為可溶性部分或膜結合部分或當結合時內化之細胞表面上存在的部分。在一個實施例中，該等不同目標部分係可溶性部分。或者，至少一個目標部分係可溶性部分，而至少一個目標部分係膜結合部分。在又一替代方案中，所有目標部分均為膜結合部分。在一個實施例中，該等不同目標部分係在同一細胞上表現，而在其他實施例中，該等不同目標部分係在不同細胞上表現。

作為一個非限制性實例，任何本發明多元體或本發明多元體與額外抗體之任何組合可適合於同時阻斷多種膜結合受體，中和多個可溶性分子，諸如腫瘤細胞之細胞介素或生長因子，或中和不同病毒血清型或病毒株。

在一個實施例中，至少一個目標抗原決定基可位於腫瘤細胞上。替代地或另外，至少一個目標抗原決定基可位於效應細胞之表面上。此例如適合於募集T細胞或NK細胞進行腫瘤細胞殺滅。舉例而言，本發明之多元體能夠藉由特異性結合至位於免疫效應細胞上之目標分子來募集免疫效應細胞，較佳地募集人類免疫效應細胞。在另一個實施例中，在本發明之多元體結合至目標分子後，該免疫效應細胞被活化。效應物募集機制可例如涵蓋藉由投與由根據本發明之方法製造之Ig樣分子使免疫調節細胞毒性重定向，該Ig樣分子能夠結合至細胞毒性觸發分子，諸如T細胞受體或Fcγ受體，由此活化下游免疫效應路徑或免疫效應細胞。共同可變區

本發明之多價多元體可在二個或多於二個結合域(可變區)中之每一個處使用共同鏈。如所描述，在一個實施例中，多價多元體具有結合一種抗原之第一重鏈可變區/輕鏈可變區(VH/VL)組合以及結合另一抗原之第二VH/VL組合。每一額外結合域亦可包含結合一種抗原上之另一抗原決定基的額外VH/VL組合。

在一個實施例中，該多元體包含二個重鏈(一個或兩個包含一或多個額外CH1及VH域)及一個與各CH1及VH域配對之輕鏈。在一個實施例中，該二個重鏈具有相容之異二聚化域，且該輕鏈係共同輕鏈。在另一個實施例中，該多元體包含二個輕鏈(一個或兩個包含一或多個額外CL及VL域)及一個與各CL及VL域配對之重鏈可變區，且該重鏈可變區包含共同重鏈可變區。

在多價多元體包含共同輕鏈之情況下，當該輕鏈係在包括編碼二個或多於二個重鏈可變區之DNA的宿主細胞內表現時，該輕鏈能夠與每個可用重鏈(或CH1-VH1區)配對，由此形成至少三個功能性抗原結合域。

功能性抗原結合域(可變區)能夠特異性結合至抗原上之抗原決定基。在一個實施例中，共同輕鏈能夠與所製造之所有重鏈(或CH1-VH1區)配對，由此避免或以明顯低於該多價多元體之比率產生不匹配重鏈及輕鏈之錯配。

在一個實施例中，本發明之多價多元體具有共同輕鏈(可變區)，其可與一系列重鏈可變區組合形成具有功能性抗原結合域之多元體(WO2004/009618、WO2009/157771)。

用於本發明之多價多元體中的共同輕鏈(可變區)較佳地為人類輕鏈。在一個實施例中，該共同輕鏈(可變區)具有生殖系序列。在一個實施例中，該生殖系序列係常常用於人類譜系中且具有良好的熱力學穩定性、產率及溶解度之輕鏈可變區。較佳之生殖系輕鏈係人類IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及人類恆定區(SEQ ID NO: 1)。編碼共同輕鏈可變區之核酸較佳地為經重排之生殖系人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(SEQ ID NO:62)。共同輕鏈較佳地包含SEQ ID NO:63之輕鏈可變區胺基酸序列及SEQ ID NO:64之人類輕鏈恆定區胺基酸序列，其中具有0-5個胺基酸插入、缺失、取代、添加或其組合。共同輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，較佳地包含κ輕鏈恆定區。編碼共同輕鏈之核酸(SEQ ID NO: 1)可針對用於表現該共同輕鏈蛋白質之細胞系統進行密碼子優化。該編碼核酸可來源於生殖系核酸序列。

用於本發明之多價抗體中的共同輕鏈(可變區)可為λ輕鏈且因此，其亦被提供於本發明之上下文中，不過，κ輕鏈係較佳的。本發明之共同輕鏈可包含κ或λ輕鏈之恆定區。在一個實施例中，使用κ輕鏈之恆定區，較佳地其中該共同輕鏈係生殖系輕鏈，較佳地為包含IgV_K l-39基因區段的經重排之生殖系人類κ輕鏈，例如經重排之生殖系人類κ輕鏈IgV_K l-39*01/IGJ_K l*01。熟習此項技術者應認識到，「共同」亦指胺基酸序列不一致的輕鏈之功能等效物。該輕鏈存在許多變異體，其中存在不會顯著地影響功能結合區之形成的突變(缺失、取代、添加)。

IgVκ1-39係免疫球蛋白可變κ1-39基因之簡稱。該基因又稱為免疫球蛋白κ可變1-39；IGKV139；IGKV1-39。該基因之外部Id係HGNC：5740；Entrez基因：28930；Ensembl：ENSG00000242371。IgVκ1-39之較佳胺基酸序列係以SEQ ID NO:65給出。此列出V區之序列。該V區可與五個J區中之一個組合。共同輕鏈可變區較佳地連接至κ輕鏈恆定區。在一個較佳實施例中，用於本發明之多價多元體中的輕鏈可變區包含κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一個較佳實施例中，該多價多元體中之共同輕鏈係IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。

產生共同輕鏈之細胞可產生例如經重排之生殖系人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及包含所述輕鏈中與λ恆定區融合之可變區的輕鏈。在本文提及生殖系序列之情況下，在一個實施例中，該可變區係生殖系序列。

用於本發明之多價多元體中的較佳共同輕鏈係包含SEQ ID NO: 1中所闡述之序列的共同輕鏈。

用於本發明之多價抗體中的共同鏈亦可為重鏈且因此，其亦被提供於本發明之上下文中。共同重鏈在此項技術中已被用於製備雙特異性抗體，且在此處可用於製備包含三個或多於三個結合域之多價多元體，該等結合域中之二個或多於二個包含此項技術中已知之共同重鏈。舉例而言，使用所有文庫成員之重鏈可變域皆相同且因此多樣性係基於輕鏈可變域的抗體文庫。此類文庫描述於例如PCT/US2010/035619及PCT/US2010/057780中，其各自以全文引用的方式併入本文中。熟練技術人員可產生此等及其他產生具有共同重鏈之結合域的技術，且該等技術可用於本發明中以產生具有本文所揭示之新穎形式的多價抗體。截斷的多價多元體之製造

在一個實施例中，宿主細胞可用編碼二個或多於二個重鏈可變區及一個共同輕鏈可變區之核酸共轉染以產生多價多元體，其中該等重鏈可變區中之二個包含恆定區，包括CH1、CH2及/或CH3，其能夠異二聚化，包括經由在CH1與CH2域之間之鉸鏈處配對而異二聚化，且其中該二個重鏈各自包含由能夠裂解CH2及/或CH3區之蛋白水解酶所識別的該鉸鏈之下部的胺基酸序列。或者，本發明之多價多元體可藉由用一或多種基因構築體共轉染個別細胞產生，該一或多種基因構築體一起編碼二個或多於二個輕鏈可變區及一個共同重鏈，其中二個共同重鏈包含恆定區，包括CH1、CH2及/或CH3，其能夠異二聚化，包括經由在CH1與CH2域之間之鉸鏈處配對而異二聚化，且其中該二個重鏈各自包含由能夠裂解CH2及/或CH3區之蛋白水解酶所識別的該鉸鏈之下部的胺基酸序列。

本發明之多價多元體亦可藉由用二個或多於二個感興趣的抗原對含有共同可變鏈之基因轉殖動物免疫接種來產生。自該基因轉殖動物獲得一組抗體，該等抗體包含共同可變鏈及特異性結合感興趣的抗原之經重排抗體鏈。接著，編碼共同鏈及可變結合鏈之核酸整合至宿主細胞中，該等宿主細胞產生完整多價抗體。接著，形成多價多元體。該多價多元體可包含一個共同輕鏈及二個或多於二個可變結合鏈，較佳地其中該等可變結合鏈中之二個係包含CH1、CH2及/或CH3之重鏈，該等重鏈經由鉸鏈，典型地在CH1與CH2域之間的包含二個或多於二個二硫橋鍵之鉸鏈配對。接著，用酶裂解該多價多元體，該酶將CH2及/或CH3區自該等重鏈移除，在重鏈之C末端處留下鉸鏈，使該多價多元體之重鏈配對，典型地經由二個或多於二個二硫鍵配對。

已公開若干方法以有利於製造呈異二聚體形式之抗體。在本發明中，相對於製造各別同二聚體，該細胞有利於製造異二聚體。此典型地藉由編碼重鏈之重鏈恆定區，較佳地CH3區之核酸來達成，由此相對於同二聚化，其有利於異二聚化(亦即，具有一個重鏈與另一個重鏈組合之二聚化)。在一個較佳實施例中，本發明之多元體包含具有相容之異二聚化域的兩個不同免疫球蛋白重鏈。

該等相容之異二聚化域較佳為相容之免疫球蛋白重鏈CH3異二聚化域。當使用野生型CH3域時，共表現兩個不同重鏈(A及B)及一個共同輕鏈將產生三種不同的抗體種類，即AA、AB及BB。AA及BB係二種同二聚體抗體之名稱且AB係異二聚體抗體之名稱。為增加所需異二聚體產物(AB)之百分比，可採用CH3工程改造，或換言之，可使用具有相容之異二聚化域之重鏈。此項技術描述了能實現重鏈之此類異二聚化的各種方式。

如本文所使用，術語『相容之異二聚化域』係指經工程改造以使經工程改造之域A'優先與經工程改造之域B'形成異二聚體且反之亦然的蛋白質域，使得A'-A'及B'-B'之間之同二聚化減少。

在美國申請案第13/866,747號(現以US 9,248,181頒佈)、美國申請案第14/081,848號(現以US 9,358,286頒佈)、WO2013/157953及WO2013/157954中，揭示使用相容之異二聚化域製造多價抗體之方法及方式。此等方式及方法亦可有利地用於本發明中。確切地說，本發明之多元體較佳地包含在第一及第二重鏈之恆定區處之殘基以基本上僅產生雙特異性全長IgG分子。較佳之殘基係第一CH3域中或與其對應之位置(『KK變異體』重鏈)處之胺基酸L351K及T366K(EU編號)(其中第一個字母對應於野生型CH3域之殘基且第二個字母對應於由CH3編碼的能夠優先參與異二聚體配對之殘基)以及在第二結構域中或在與其對應之位置(『DE變異體』重鏈)處之胺基酸L351D及L368E，或反之亦然。先前在US 9,248,181及US 9,358,286專利以及WO2013/157954 PCT申請案中展示， DE變異體與KK變異體優先配對形成異二聚體(所謂的『DEKK』雙特異性分子)。DE變異體重鏈(DEDE同二聚體)或KK變異體重鏈(KKKK同二聚體)之同二聚化不會發生或由於在一致重鏈之間之CH3-CH3界面中帶電殘基之間的斥力而僅極少量發生。

在能夠表現多聚化形成多價多元體之蛋白質的本發明之一個宿主細胞中，用編碼三種蛋白質之核酸轉型該宿主細胞。按自N末端至C末端之次序，經編碼蛋白質包括含VH3-CH1---VH2-CH1 CH2-CH3之第一蛋白質，其中連接子在該第一蛋白質上沿N末端至C末端方向將CH1連接至VH2(由「---」表示)；含VLc-CL之第二經編碼蛋白質；含VH1-CH1-CH2-CH3之第三經編碼蛋白質，其中該第一及第三經編碼蛋白質之CH1域與第二經編碼蛋白質之CL配對，且第一及第三蛋白質之經編碼CH3區分別編碼在第一CH3蛋白質中或在與其對應之位置處的胺基酸L351K及T366K(EU編號)以及在第三蛋白質中或與其對應之位置處的胺基酸L351D及L368E，或反之亦然。或者，該第一及第三蛋白質包含其他相容之異二聚化域，其引起此等蛋白質各自之CH3域的高效配對。

編碼該等蛋白質之核酸可在一或多個載體上以產生本發明之多價多元體。編碼該等蛋白質之該等核酸可進一步穩定整合至宿主細胞之基因組中，較佳地在已知用於高位準表現且不存在或減少基因沉默之染色體區處。

本發明之宿主細胞能夠產生基於表現之總免疫球蛋白計純度為至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%本發明之多價多元體的多價多元體。

本發明之宿主細胞能夠產生該多價多元體，其中至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%的所產生之多價多元體對於所有結合位點包含與同源共同鏈配對之經重排可變區。

本發明之宿主細胞能夠產生該多價多元體，其中至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%的所表現之共同鏈與該多價多元體配對且不為游離、未締合之蛋白質。

在該多價多元體暴露於在二個二聚重鏈之鉸鏈之下部裂解該多元體的蛋白水解酶後，能夠獲得本發明之截斷的多價多元體，其中至少約50%、較佳地60%、更佳地大於70%且至多大於90%濃度之原始蛋白質轉化成本發明之截斷的多價多元體。非人類動物

本文所描述之方法及組合物允許製備具有獲自、來源於或基於適合方法之結合域的適合多價結合蛋白。適合方法可包括噬菌體展示方法(包括對在噬菌體展示系統中產生之生殖系序列進行之修飾)及此項技術中已知之其他活體外方法。特別有用的方法係經由天然體細胞重組及親和力成熟方法使經基因修飾之非人類動物產生可與共同輕鏈締合併一起表現之適合重鏈可變域。

在一個實施例中，用於本發明之多價多元體中的可變域係獲自、來源於或基於非人類基因轉殖動物，例如共同輕鏈哺乳動物，諸如嚙齒動物之重鏈及輕鏈可變區，該非人類基因轉殖動物在其生殖系中包含未經重排之重鏈可變基因座且表現單一經重排人類輕鏈可變域。此類非人類基因轉殖動物在暴露於抗原後將表現與共同輕鏈配對的多種體細胞重排之重鏈可變區，接著其可用於產生編碼重鏈可變區之核酸序列，該等核酸序列獲自、來源於或基於來自能夠高效地轉型至宿主細胞中以產生多價抗體的該基因轉殖動物之核酸序列。

特定言之，來自經免疫接種之共同輕鏈動物之適合B細胞的人類可變區序列可用作本發明之多價多元體之潛在VH域的來源，該等B細胞經基因工程改造成表現來源於人類VL基因區段之人類輕鏈可變域。在各種實施例中，來自用一或多種感興趣的抗原免疫接種之該等動物的B細胞係該多價多元體將結合之抗原。對該等動物之細胞、組織或血清、脾或淋巴材料進行篩選以獲得針對感興趣的抗原展現所需特徵，例如高親和力、低親和力、阻斷能力、活化、內化或其他特徵之重鏈可變域(或表現其之B細胞)。由於該基因轉殖動物中響應於抗原刺激產生的幾乎所有重鏈可變域係與所表現的來源於較佳地不超過一個或不超過二個VL基因區段之人類免疫球蛋白輕鏈一起產生，故該等重鏈可變區能夠與該基因轉殖動物中表現之共同輕鏈域一起表現及締合。

在一個態樣中，提供如本文所描述之抗原決定基結合蛋白，其中人類VL及VH序列係由核酸編碼，該核酸係基於自本文所描述之基因轉殖小鼠，及/或如以引用之方式併入本文中的WO2009/157771中所揭示之基因轉殖動物之B細胞獲得的核酸，該基因轉殖動物已用包含感興趣的抗原決定基之抗原免疫接種。核酸序列、多肽、載體及細胞

本發明進一步提供：編碼可用於組裝本發明之多價多元體之多肽或連接子的核酸序列；包含此類核酸序列之載體；能夠產生本發明之多價多元體的細胞；以及使用此類細胞製備此類多價多元體之方法。

根據本發明之多價抗體典型地係由表現編碼該等多肽之核酸序列的細胞產生，該等多肽一起組裝形成本發明之多元體。

因此，本發明提供一種連接子，其包含如SEQ ID NO:2-25中之任一個中所闡述之胺基酸序列或與其中任一個具有至少約85%序列一致性、與其中任一個具有至少約85%序列一致性，諸如與其中任一個具有至少約90%序列一致性，例如與其中任一個具有至少約95%序列一致性，諸如與其中任一個具有至少約98%序列一致性，例如與其中任一個具有至少約99%序列一致性之多肽。

本發明進一步提供一種多肽，其包含VH3-CH1-基於鉸鏈之連接子-VH2-CH1。

在某些實施例中，VH3與VH2結合同一抗原決定基。在某一實施例中，VH3與VH2結合同一抗原，但結合不同抗原決定基。且在某些實施例中，VH3與VH2結合獨立的抗原決定基及抗原。

本發明亦提供編碼此類連接子或多肽之核酸序列及包含此類核酸序列之載體。

用於製備所述多肽之核酸序列可放入任何適合表現載體中且在適當情況下，以二個或多於二個載體放入單一宿主細胞中。

一般而言，選殖具有適當連接子及/或恆定區的編碼可變域之核酸序列並將在適合表現構築體中與啟動子可操作連接之序列放入適合細胞株中進行表現。多價多元體之表現

此項技術中已描述在重組宿主細胞中抗體之表現。編碼本發明多元體之輕鏈及重鏈的核酸分子可以染色體外複本形式存在及/或穩定整合至宿主細胞之染色體中。後一情形係較佳的，在此情況下，已知用於使基因沉默缺乏或減少的基因座可作為目標。

為實現編碼組裝為本發明多元體之多肽之核酸序列的表現，熟習此項技術者熟知，能夠驅動此類表現之序列可功能性連接至編碼該等多肽之核酸序列。功能性連接意圖描述編碼該等多肽或其前驅體之核酸序列連接至能夠驅動表現之序列，由此使此等序列能夠驅動該等多肽或其前驅體之表現。有用表現載體係此項技術中可獲得的，例如Invitrogen之pcDNA載體系列。當關於控制經編碼多肽之轉錄及轉譯的序列正確地插入編碼感興趣的多肽之序列時，由此得到的表現卡匣可用於產生感興趣的多肽，稱為表現。驅動表現之序列可包括啟動子、強化子及類似元件，以及其組合。此等序列應能夠在宿主細胞中起作用，由此驅動與其功能性連接之核酸序列的表現。啟動子可為組成性的或受調控，且可獲自各種來源，包括病毒、原核來源或真核來源，或為人工設計的。

本發明之核酸序列可由天然啟動子或其衍生物，或由完全異源之啟動子表現。一些眾所周知且常用的在真核細胞中表現之啟動子包含來源於病毒，諸如腺病毒之啟動子，例如E1A啟動子；來源於巨細胞病毒(CMV)之啟動子，諸如CMV立即早期(IE)啟動子；來源於猴病毒40(SV40)之啟動子，及類似啟動子。適合啟動子亦可來源於真核細胞，諸如金屬硫蛋白(MT)啟動子、延伸因子la(EF-la)啟動子、肌蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子及類似啟動子。能夠驅動本發明之核酸序列在宿主細胞中之表現的任何啟動子或強化子/啟動子適用於本發明中。在一個實施例中，能夠驅動表現之序列包含來自CMV啟動子之區域，較佳地包含CMV立即早期基因強化子/啟動子之核苷酸-735至+95的區域。技術人員將意識到，用於本發明中之表現序列可適當地與可使表現穩定或增強之元件，諸如絕緣子、基質附接區、STAR元件及類似元件組合。由此可增強表現之穩定性及/或位準。

適合表現重組核酸序列之任何細胞均可用於產生本發明之多元體。較佳地，該細胞適合懸浮生長。

本發明之多價多元體可在宿主細胞中表現，典型地藉由培養適合的本發明細胞並自該培養物收集該抗體實現。較佳地，該細胞係在無血清培養基中培養。本發明之多元體可藉由熟習此項技術者一般已知之方法自該等細胞或較佳地自細胞培養基回收。

回收之後，處理完整抗體以自該抗體裂解Fc域(例如CH2及/或CH3)。本發明之多元體可藉由使用此項技術中已知之方法回收。此類方法可包括沈澱、離心、過濾、尺寸排阻層析法、親和層析法、陽離子及/或陰離子交換層析法、疏水相互作用、層析法及類似方法。可使用親和層析法，包括基於連接子序列之親和層析法作為分離本發明之多價多元體的一種方式。截斷的多價多元體之高效產生

此項技術已採用酶消化及化學綴合來製造F(ab')2。舉例而言，已經由產生針對目標之Fab並與F(ab')2相比較來分析抗體之親和力與親合力結合的差異，由此檢查單價靶向引起的與抗原之接合是否少於二價靶向，並理解二價是否引起親合力。先前經由化學綴合及蛋白水解消化產生F(ab')2部分之方法因低效率、不穩定或潛在地免疫原性部分以及使此類部分之分離及使用不切實際的抗體片段之異質混合物的產生而不適於研究及治療應用。經由本文所描述之技術與使用能夠特異性裂解Fc之酶的組合以高純度表現新多價多元體形式之出現允許藉由消除由胃蛋白酶消化觀察到的C末端異質性而產生高濃度的該等截斷的多價多元體之產物。

可使用任何適合的酶裂解及/或消化技術，結合本文所描述之方法製造包含F(ab')n或(經修飾F(ab')n)之多價多元體，如自任何全長多元體(例如完全單株多特異性抗體)獲得。在某些實施例中，抗體片段可藉由用IdeS蛋白酶裂解獲得，IdeS蛋白酶係釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )中裂解人類IgG1在鉸鏈下部之特定位點，留下完整F(ab')n多元體之IgG降解酶，其中在F(ab')n一側上之重鏈在其各別C末端與另一側上之重鏈配對，其中該配對包含二個或多於二個二硫橋鍵。(圖4B1)。

或者，缺乏Fc區之多價多元體可藉由使用來自牙齦卟啉單胞菌(Porphyoromonas gingivalis )之半胱胺酸蛋白酶獲得，該酶消化人類IgG1在鉸鏈上部之特定位點(KSCDK/THTCPPC)(SEQ ID NO:92)，產生完整Fab(圖4B2)、2Fab'(圖4B3)及Fc(圖4B4)片段。可藉由此技術，經由表現含可變域及恆定域(例如CH1、CH2及/或CH3)之重鏈形成的多元體經由本文所描述之連接子連接至額外可變域，或與輕鏈配對，該輕鏈經由本文所描述之連接子連接至額外可變域，且其中蛋白水解酶，諸如來自牙齦卟啉單胞菌之蛋白水解酶裂解該重鏈之恆定域，取決於長臂上存在的結合域之量而留下具有較多結合域的完整截斷之2Fab'或多元體。

藉由使用本文所描述之宿主細胞，及異二聚化技術，可大批量高效產生雙特異性及多特異性部分，其Fc區(例如CH2及/或CH3)經移除，產生能夠進行高效研究及潛在治療應用的一組高濃度F(ab')n部分，由此提供與Fc沉默(例如不存在)、較短半衰期及較小尺寸相關之益處。蛋白水解酶之移除

儘管不需要，但在產生截斷的多價多元體後移除蛋白水解酶可能係較佳的。使用固定之酶(例如固定於瓊脂糖上)亦可為較佳的。酶之移除可經由此項技術中已知之多種方式實現，包括使用蛋白水解酶，該等酶包括在酶末端(較佳地在N末端)處存在之標籤，諸如HIS-NiNTI、生物素-抗生物素蛋白或VSV/FLAG-抗VSV/FLAG標籤，使得該酶能經由抗標籤親和管柱移除。該等抗體片段，諸如Fc，亦可使用親和層析法分離。類似地，可經由電荷層析法移除蛋白水解酶，或可製造具有增強之電荷的經修飾酶，由此使其此後可經由電荷層析法移除。

或者，可使本發明之多價多元體、蛋白水解酶及恆定域片段之混合物暴露於能夠使該蛋白水解酶變性，但不會實質上干擾該多價多元體配對之pH條件或溫度條件，由此促進該酶之失活及分離，同時不損害標的多價多元體。醫藥組合物及使用方法

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之多元體及醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑。

因此，本發明提供如本文所描述之多價多元體，其藉由療法治療人類或動物身體。

本發明進一步提供一種用於治療罹患醫學病況之人類或動物的方法，該方法包含向該人類或動物投與治療有效量的如本文所描述之多價多元體。

擬投與患者的根據本發明之多元體的量典型地在治療窗中，意味著使用足夠數量以獲得治療作用，同時該量不超過臨限值，以免產生不可接受程度之副作用。獲得所需治療作用需要的多價多元體之量越低，則該治療窗典型地越大。因此，在低劑量下發揮足夠治療作用的根據本發明之多價多元體較佳。

本文中引用的專利文獻或作為現有技術給出之其他內容不應視為承認該文件或內容係已知的或其所含資訊係任一申請專利範圍之優先權日期的公共常識之一部分。

本文闡述之每一參考文獻之揭露內容以全文引用的方式併入本文中。實例實例 1 ：多價多元體與完整抗體對應物之比較

使用GingisKHAN Fab套組及FabRICATOR套組(Genovis)消化5種不同抗體(PG6058p02(HER3 IgG Fc WT)SEQ ID NO: 66及67；PG3004p04(HER2 IgG Fc WT)SEQ ID NO: 68及69；雙特異性PB11247 MF6058(HER3)×MF3004(HER2)Biclonics® Fc WT DEKK(US 2017/0058035)SEQ ID NO: 66-69；PG1337(TT IgG FcWT)SEQ ID NO:70及71；PB4248(TTxTT)Biclonics® Fc WT DEKK(WO 2017/069628)SEQ ID NO:70及71)，分別產生Fab及F(ab')2片段。抗體序列提供於表3中。表 3

SEQ ID	組成	序列
66	編碼MF6058之DNA	ggcccagccg gccatggccc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgacg tgaagaagcc tggggcctca gtgaaggtca cgtgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagc tcttgagtgg atgggatgga tcaaccctca aagtggtggc acaaactatg caaagaagtt tcagggcagg gtctctatga ccagggagacgtccacaagc acagcctaca tgcagctgag caggctgaga tctgacgaca cggctacgta ttactgtgca agagatcatg gttctcgtca tttctggtct tactggggct ttgattattg gggccaaggt accctggtca cc
67	MF6058	QVQLVQSGADVKKPGASVKVTCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQALEWM GWINPQSGGTNYAKKFQGRVSMTRETSTSTAYMQLSRLRSDDTATYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVT
68	編碼MF3004之DNA	caggtgcagc tgaagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta cactttcact ggctactata taaactgggt gaagcagagg cctggacagg gacttgagtg gattgcaagg atttatcctg gaagtggtta tacttactac aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaag aatcctccag cactgcctac atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct atttctgtgc aagaccccac tatggttacg acgactggta cttcggtgtc tggggcacag gcaccacggt cacc
69	MF3004	QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTGYYINWVKQRPGQGLEWI ARIYPGSGYTYYNEKFKGKATLTAEESSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARPHYGYDDWYFGVWGTGTTVT
70	編碼MF1337之DNA	gaggtgcagc tggtggagac tggggctgag gtgaagaagc cgggggcctc agtgaaggtc tcctgcaagg cttctgacta catcttcacc aaatatgaca tcaactgggt gcgccaggcc cctggacaag ggcttgaatg gatgggatgg atgagcgcta acactggaaa cacgggctat gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccataaa cacagcctac atggagctga gcagcctgac atctggtgac acggccgttt atttctgtgc gaggagtagt cttttcaaga cagagacggc gccctactat cacttcgctc tggacgtctg gggccaaggg accacggtca cc
71	MF1337	EVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWM GWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVT

在37℃下，在2 mM半胱胺酸(溫和還原劑)存在下，將40及200個單位之GingisKHAN酶與100及500 µg/ml HER2/HER3多價抗體一起培育2小時。另外，在37℃下，在不添加還原劑情況下，將40及200個單位之FabRICrATOR LE與100及500 μg/ml HER2/HER3多價抗體一起培育2小時。接著，使用CaptureSelect CH1親和管柱(Genovis)純化兩種反應物。用Octet，使用蛋白質L感測器測定IgG、Fab及F(ab')2之濃度並顯示於下表4中。表 4 . 由 酶消化反應得到之抗體片段的定量

	PG3004p04	PG6058p02	PG1337p324	PB11247p01	PB4248pl22	體積(μl)
100 μg/ml IgG	60.7	49.7	52.6	50.2	62.9	400.0
100 μg/ml IgG + 40 U FabRICATOR反應混合物	48.2	38.9	46.2	47.3	57.8	400.0
500 μg/ml IgG + 200 U FabRICATOR反應混合物	220.7	211.6	219.5	225.3	221.2	400.0
500 μg/ml IgG + 200 U FabRICATOR經純化F(ab')2	45.6	44.2	38.9	32.3	54.8	550.0
100 μg/ml IgG + 40 U GingisKHAN反應混合物	64.1	60.9	57.0	61.5	66.0	400.0
500 μg/ml IgG + 200 U GingisKHAN反應混合物	316.1	319.1	295.1	312.2	327.5	400.0
500 μg/ml IgG + 200 U GingisKHAN經純化Fab	87.3	80.1	64.9	72.0	73.0	550.0

另外，如圖2A-E中所示，藉由SDS-PAGE分析測定純度。如圖2A-E中所示，未純化之Fab消化物及其流過物樣品(Fc)在非還原性凝膠中看來部分地還原。此可能在裂解緩衝液中由溫和還原劑(2 mM半胱胺酸)引起。在非還原性條件下，在F(ab')2反應物中未觀察到Fc。實際上，由於裂解酶切割連接該二個重鏈之鉸鏈半胱胺酸下部，故出現『半Fc』譜帶。因此，『粗』F(ab')2片段之非還原性凝膠對於F(ab')2產生97 kDa之預期譜帶尺寸且對於半Fc片段產生剛好高於25 kDa之譜帶尺寸。

藉由FACS分析來分析完整IgG、Fab及F(ab')2片段結合MCF7細胞之能力。由於MCF7細胞表現HER2及HER3，故選擇該等細胞。表 5 ： MCF7 細胞上 IgG 、 Fab 及 F ( ab ') 2 之 Facs 結合

		一次染色盤1 抗體/片段濃度(μg/ml)
		10	3.33	1.11	0.37	0.12	0.041	0.014	0.0046	0.0015	0.00051	0.00017	0
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
PG3004 lgG	A	7645	7468	7585	7449	6194	5560	5192	5037	5071	4999	5038	4840
PG6058 lgG	B	6579	7623	7696	7442	6869	6023	5584	5372	4973	4925	4904	4962
PG1337 lgG	C	4492	4548	4932	4994	5070	5020	5092	4961	4974	4983	4495	5101
PB11247 lgG	D	8950	8826	8826	8721	7919	6371	5562	5312	5207	5183	4807	4891
PG3004 F(ab')2	E	7631	8129	8205	7594	7173	6008	5672	5280	4892	5011	4914	4918
PG6058 F(ab')2	F	5376	6614	6932	6859	7408	6582	6139	5310	5226	5280	5126	5090
PG1337 F(ab')2	G	4216	4715	4630	4816	4899	4894	4980	5027	5065	5209	4926	5185
PB11247 F(ab')2	H	9167	8825	8759	8902	8626	7561	6858	5987	5332	5345	5230	5197

	一次染色盤2 抗體/片段濃度(μg/ml)
		10	3.33	1.11	0.37	0.12	0.041	0.014	0.0046	0.0015	0.00051	0.00017	0
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
PB11247lgG	A	7945	7397	7704	6819	5709	5574	5039	4863	4768	4824	5044	5010
PB4248lgG	B	4458	4637	4874	4735	5055	4941	4940	4893	4745	4723	4845	4781
PB4248F(ab')2	C	4489	4799	5005	4699	4928	5065	5004	4783	4803	5057	4965	5059
PG3004 Fab	D	6706	7180	7500	6967	6218	5722	5160	5092	4855	4925	4973	5041
PG6058Fab	E	6370	6749	6873	5985	6422	5910	5309	4840	4789	4872	4719	4895
PG1337 Fab	F	4157	4470	4649	4793	4613	4662	4588	4668	4745	4694	4975	5005
PB11247 Fab	G	7043	7447	7459	6870	6333	5859	5251	5151	5047	4826	4883	4886
PB4248Fab	H	4182	4751	4605	4759	4813	4753	4784	4832	4747	4854	4748	4948

如表5中可見，產生之Fab及F(ab')2片段保持其結合特性且IgG及對應的F(ab')2片段以類似親和力結合。正如預期，Fab片段亦結合，但以較低親和力結合。由此顯示，使用PB11247(MF6058(HER3)×MF3004(HER2))Biclonics®產生的F(ab')2片段中之HER2及HER3臂係可用的且具有功能。

使用調蛋白(Heregulin)依賴性MCF-7增殖分析測定由IgG或biclonics得到之F(ab')2片段保持其功能活性的能力。在以10 μg/ml(如在Octet上所量測)作為100%阻斷對照逐漸降低的9點半對數滴定系列中，測試抗體PG3004(Her2)、PG6058(Her3)、PG1337(TT)、MF6058 (HER3)×MF3004(HER2)Biclonics® Fc WT DEKK(US 2017/0058035)及MF1337×MF1337)(TT×TT)以及以上抗體暴露於能夠裂解鉸鏈下部之酶後產生的F(ab')2片段(粗500 μg/ml反應混合物及經純化F(ab')2片段兩者)，星形孢菌素(Staurosporin)(1:200)用作100%阻斷對照。在每個盤上，包括二個不含調蛋白之孔、二個含調蛋白但無抑制劑之孔及二個含1:200星形孢菌素之孔(最大抑制)。如圖3中所示，PB11247 F(ab')2片段在該增殖分析中與其相應Biclonics®有同等作用，且在經純化或未純化F(ab')2活性之間無明顯差異。實例 2 ：由三價 IgG 分子製造 F ( ab ') 3

亦對由多價多元體產生F(ab')n片段(包括F(ab')3、2Fab'及Fab片段)之能力進行分析。如圖4中所示，F(ab')3、2Fab'或Fab片段係基於所選蛋白酶(例如FabRICATOR或GingisKHAN)產生。分析以下包含不同抗原結合特性及共同輕鏈之三價多元體：PT23103p09(具有SEQ ID NO:72及73之重鏈VH2-連接子-CH1-VH3序列)；PT23103p15(具有SEQ ID NO:74及75之重鏈VH2-連接子-CH1-VH3序列)；PT23103p04(具有SEQ ID NO:76及77之重鏈VH2-連接子-CH1-VH3序列)；PT23103p08(具有SEQ ID NO:78及79之重鏈VH2-連接子-CH1-VH3序列)；PT23103p03(具有SEQ ID NO:80及81之重鏈VH2-連接子-CH1-VH3序列)；PT23103p11(具有SEQ ID NO: 82及83之重鏈VH2-連接子-CH1-VH3序列)；以及PT23103p12(具有SEQ ID NO:84及85之重鏈VH2-連接子-CH1-VH3序列)，其中每種PT編碼以下三特異性多元體，其包含在VH3位置(頂部長臂)中之MF1337(破傷風類毒素)SEQ ID NO:70及71、在VH2位置(內部長臂)中之MF1122(纖維蛋白原)SEQ ID NO:86及87以及在VH1位置(短臂)中之MF1025(甲狀腺球蛋白)SEQ ID NO:88及89，其中各VH與cLC配對。參見圖4。該等三價多元體序列提供於表6中。表 6

SEQ ID		組成	序列
72	PT23103p09	編碼MF1337-CH1-IgG1 G4S連接子-MF1122之DNA	ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgacatctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatcacttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagtccacgtctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaagagctgcgacggcggtggcggcagcggcggcggaggcagcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaaggtacccttgtcaccgtctcgagt
73	PT23103p09	MF1337-CH1-IgG1 G4S連接子-MF1122	AQPAMAEVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS
74	PT23103p15	編碼MF 1377-CH1-IgG1 H連接子- MF1122之DNA	ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgacatctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatcacttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagtccacgtctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaagagctgcgacaagacccacaccagcccccccagccccgctcccgagctgctgggcggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaaggtacccttgtcaccgtctcgagt
75	PT23103p15	MF 1377-CH1-IgG1 H連接子-MF1122	AQPAMAEVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS
76	PT23103p04	編碼MF1377-CH1-IgG2A MH連接子-MF1122之DNA	ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgacatctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatcacttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggccccctgcagccggagcaccagcgagagcaccgccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacggtgcccagcagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaccgtggagcggaagagcagcgtggagagcccccccagccccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaaggtacccttgtcaccgtctcgagt
77	PT23103p04	MF1377-CH1-IgG2A MH連接子-MF1122	AQPAMAEVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSSVESPPSPEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS
78	PT23103p08	編碼MF1377-CH1-IgG1 MH連接子- MF1122之DNA	ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgacatctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatcacttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagtccacgtctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaagagctgcgacaagacccacaccagcccccccagccccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaaggtacccttgtcaccgtctcgagt
79	PT23103p08	MF1377-CH1-IgG1 MH連接子-MF1122	AQPAMAEVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS
80	PT23103p03	編碼MF1377-CH1-IgG1 UH連接子-MF1122之DNA	ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgacatctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatcacttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagtccacgtctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtcgtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaagagctgcgacaagacccacaccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaaggtacccttgtcaccgtctcgagt
81	PT23103p03	MF1377-CH1-IgG1 UH連接子-MF1122	AQPAMAEVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS
82	PT23103p11	編碼MF1377-CH1-IgG2 H連接子-MF1122之DNA	Ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgacatctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatcacttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggccccctgcagccggagcaccagcgagagcaccgccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacggtgcccagcagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaccgtggagcggaagagcagcgtggagagcccccccagccccgccccccccgtggccggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaaggtacccttgtcaccgtctcgagt
83	PT23103p11	MF1377-CH1-IgG2 H連接子-MF1122	AQPAMAEVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSSVESPPSPAPPVAGEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS
84	PT23103p12	編碼MF1377-CH1-IgG2B H連接子-MF1122之DNA	ggcccagccggccatggccgaggtgcagctggtggagactggggctgaggtgaagaagccgggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgactacatcttcaccaaatatgacatcaactgggtgcgccaggcccctggacaagggcttgaatggatgggatggatgagcgctaacactggaaacacgggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccataaacacagcctacatggagctgagcagcctgacatctggtgacacggccgtttatttctgtgcgaggagtagtcttttcaagacagagacggcgccctactatcacttcgctctggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctccagtgctagcaccaagggccccagcgtgttccccctggccccctctagccggagcaccagcgagagcaccgccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagcccgtgaccgtgagctggaacagcggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagcgtggtgacggtgcccagcagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtggaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaccgtggagcggaagtgcagcgtggagagcccccccagccccgccccccccgtggccggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatcatatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagagccctcttcacgaccatcgccatggactattggggccaaggtacccttgtcaccgtctcgagt
85	PT23103p12	MF1377-CH1-IgG2B H連接子-MF1122	AQPAMAEVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCSVESPPSPAPPVAGEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVTVSS
86		MF1122DNA	gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactat gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagagccctc ttcacgacca tcgccatgga ctattggggc caaggtaccc tggtcacc
87		MF1122AA	EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARALFTTIAMDYWGQGTLVT
88		MF1025DNA	gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc aagggccgat tggtgggcga cttttgacta ctggggccaa ggtaccctgg tcacc
89		MF1025AA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV SAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARADWWATFDYWGQGTLVT

對於每一酶反應，將最終反應體積為400µl的200 µg/ml IgG與含80個單位之FabRICATOR LE或80個單位之GingisKHAN的10×稀釋之還原緩衝液一起培育並在37℃下培育2小時。對於PT23103p09；PT23103p015；PT23103p04，使用250 µl反應混合物，使用CaptureSelect CH1管柱純化出F(ab')n。收集含有Fc及酶之流過物以及溶離份。在A280 nm下量測所有所得F(ab')n製劑之蛋白質濃度。表7顯示各消化之蛋白質濃度。表 7 ： 截斷的多價多元體 ( F ( ab ') 3 ) 及 Fab 部分之蛋白質濃度

樣品	連接子	酶	樣品	混合物中之物種	Abs (280nm)	濃度 (mg/mL)	濃度 (μM)	產率(%)
PT23103p09	lgG1 G4S	無酶	未消化之lgG	lgG	0.065	0.188	0.96	100
Fabricator	消化粗混合物	F(ab')3+2 × 半Fc +酶	0.06	0.177	0.91	94
溶離	F(ab')3	0.055	0.081	0.56	58
Gingiskhan	消化粗混合物	Fab + 2Fab' + Fc +酶	0.069	0.207	1.06	110
溶離	Fab + 2Fab'	0.052	0.066	0.46	47
PT23103p15	lgG1 H	無酶	未消化之lgG	lgG	0.066	0.201	1.03	100
Fabricator	消化粗混合物	F(ab')3 + 2 × 半Fc +酶	0.07	0.226	1.16	112
溶離	F(ab')3	0.055	0.093	0.64	55
Gingiskhan	消化粗混合物	Fab + 2Fab' + Fc +酶	0.071	0.218	1.12	108
溶離	Fab + 2Fab'	0.067	0.163	1.12	101
PT23103p04	lqG2A MH	無酶	未消化之lgG	lgG	0.061	0.189	0.97	100
Fabricator	消化粗混合物	F(ab')3 + 2 × 半Fc +酶	0.059	0.189	0.97	100
溶離	F(ab')3	0.069	0.104	0.72	74
Gingiskhan	消化粗混合物	Fab + 2Fab' + Fc +酶	0.068	0.208	1.07	110
溶離	Fab+2Fab'	0.053	0.094	0.65	61
PT23t03p08	lgGI MH	無酶	未消化之lgG	lgG	0.065	0.203	1.04	100
Fabricator	消化粗混合物	F(ab')3 + 2 × 半Fc +酶	0.064	0.219	1.12	107
Gingiskhan	消化粗混合物	Fab + 2Fab' + Fc +酶	0.063	0.204	1.04	100
PT23103p03	lgG1 UH	無酶	未消化之lgG	三價	0.062	0.198	1.02	100
Fabricator	消化粗混合物	F(ab')3 + 2 × 半Fc +酶	0.074	0.203	1.04	102
Gingiskhan	消化粗混合物	Fab + 2Fab' + Fc +酶	0.07	0.223	1.14	112
PT23103p011	lgG2A H	無酶	未消化之lgG	三價	0.059	0.186	0.95	100
Fabricator	消化粗混合物	F(ab')3 + 2 × 半Fc +酶	0.06	0.173	0.88	93
Gingiskhan	消化粗混合物	Fab + 2Fab' + Fc +酶	0.062	0.202	1.03	108
PT23103p012	lgG2B H	無酶	未消化之lgG	三價	0.061	0.15	0.77	100
Fabricator	消化粗混合物	F(ab')3+2 × 半Fc +酶	0.061	0.196	1.00	130
Gingiskhan	消化粗混合物	Fab + 2Fab' + Fc +酶	0.07	0.22	1.12	146

對於PT23103p09、PT23103p15及PT23103p04，在粗提取物中獲得的F(ab')3之百分比在55-74%範圍內。對於消化粗提取物，針對該多價多元體之起始物質分析完整蛋白質濃度，以所有多價多元體計，該多價多元體產生100%之蛋白質。產率百分比係藉由相對於分子量(Da)分析濃度(mg/ml)並與該多價多元體之起始物質相比較來計算，其中該多價多元體、截斷的多價多元體及裂解之Fc的分子量具有表8中所示之值：表 8 ： 多元體及片段之分子量

	分子量(kDa)
三價	195
lgG/同二聚體	146
F(ab')3	145
半Fc	25
Fc	51

為確定抗體片段之特異性結合，進行ELISA反應以確定與破傷風、纖維蛋白原及甲狀腺球蛋白之特異性結合。測試所產生的截斷之多價多元體、Fab及未消化之IgG在滴定範圍內與以2 µg/ml塗佈之破傷風類毒素；以10 µg/ml塗佈之纖維蛋白原；或以10 µg/ml塗佈之甲狀腺球蛋白的結合。使用以2.5 µg/ml塗佈之huEGFR-Fc作為陰性對照。分析蛋白質濃度為7.5 µg/ml的各純化部分：F(ab')3、Fab及2Fab'，且包括PG1337p324作為陰性及陽性對照。使用1/2000稀釋之CH-1偵測抗體偵測經結合F(ab')n。

如表9中所示，所有樣品(未消化樣品、粗樣品及經純化Fab)保持其在VH3位置、或在F(ab')3「長臂」上之頂部位置處與破傷風類毒素之結合(參見圖4)。未消化樣品與消化樣品之結合信號(在450 nm下之Abs)極其類似。表 9 ：破傷風類毒素結合之 ELISA 分析

接下來，分析三價截斷之多元體與纖維蛋白原之結合，該纖維蛋白原係位於VH2位置處，即在F(ab')3長臂之內部位置(參見圖4)。Fabricator F(ab')3消化樣品(未消化樣品、粗樣品及經純化Fab)均保留其與纖維蛋白原之結合(表10)。未消化樣品與消化樣品之結合信號(在450 nm下之Abs)極其類似。對於GingisKHAN 2Fab'(參見圖4)，對於連接子IgG1G4S、IgG 2AMH、IgG 2AH及IgG 2BH，結合保留，但減少。因此，具有連接子IgG1 H、IgG1 MH及IgG1 UH之IgG皆喪失其與纖維蛋白原之結合。表 10 ：纖維蛋白原結合之 ELISA 分析

亦分析三價多元體與位於VH1處，即F(ab')3之短臂位置處之甲狀腺球蛋白的結合(參見圖4)。FabRICATOR F(ab')3樣品(未消化樣品、粗樣品及經純化Fab)皆保留其與甲狀腺球蛋白之結合(表11)。未消化樣品與消化樣品之結合信號(在450 nm下之Abs)極其類似。此Fab係在三價截斷之多元體中之VH1，即短臂位置中且不受酶消化影響。對於GingisKHAN，所有樣品(未消化樣品、粗樣品及經純化Fab)保留其與甲狀腺球蛋白之結合。未消化樣品與消化樣品之結合信號(在450 nm下之Abs)極其類似。表 11 ：甲狀腺球蛋白結合之 ELISA 分析

亦藉由SDS-PAGE電泳確定片段之產生。如圖5(A-D)中所示，Fabricator在產生各三價截斷的多價多元體之(Fab')3片段方面表現較佳。對於PT23103p09，未處理之IgG(未還原(NR)及經還原(R))顯示適當蛋白質譜帶。在還原性及非還原性條件下，在FabRICATOR反應物中未觀察到Fc。實際上，由於該酶切割連接該二個重鏈之鉸鏈半胱胺酸下部，產生二個CH2-CH3多肽，故觀察到「半Fc」譜帶。未純化之GingisKHAN反應物及其流過物樣品(Fc)在非還原性凝膠中看來被還原。此可能係由裂解緩衝液中存在之溫和還原劑(2 mM半胱胺酸)在SDS-PAGE樣品製備時使二硫鍵還原引起。在經純化GingisKHAN反應物中，出現預期片段(圖5A)。

對於PT23103p15，未處理之IgG(NR及R)看起來亦係適當的。FabRICATOR樣品顯示適當的蛋白質譜帶。在還原性及非還原性條件下，在FabRICATOR反應物中未觀察到Fc。實際上，由於該酶切割連接該二個重鏈之鉸鏈半胱胺酸下部，產生二個CH2-CH3多肽，故觀察到「半Fc」譜帶。未純化之GingisKHAN反應物及其流過物樣品(Fc)在非還原性凝膠中看來被還原。此可能係由裂解緩衝液中之溫和還原劑(2 mM半胱胺酸)在SDS-PAGE樣品製備時使二硫鍵還原引起。在非還原性SDS-PAGE中所分析之經純化GingisKHAN反應物中，在50 kDa周圍出現3個譜帶。該3個譜帶表示F(ab')3之三個單個Fab且因來自長臂之二個Fab之間之連接子的部分以及連接至此等Fab之鉸鏈的部分而延伸至不同高度。在還原性條件下，所有蛋白質延伸至約25 kDa，達到VL-CL或VH-CH1多肽之高度。在ELISA中，粗反應物及純化之反應物與纖維蛋白原之結合能力喪失，不過在ELISA中與破傷風及甲狀腺球蛋白之結合能力仍完整。(圖5B)。

對於PT23103p04，未處理之IgG(NR及R)看起來亦係適當的。所有FabRICATOR樣品均顯示適當的蛋白質譜帶。在非還原性條件下，在FabRICATOR反應物中未觀察到Fc。實際上，由於該酶切割連接該二個重鏈之鉸鏈半胱胺酸下部，產生二個CH2-CH3多肽，故出現「半Fc」譜帶。未純化之GingisKHAN反應物及其流過物樣品(Fc)在非還原性凝膠中看來被還原。此可能係由裂解緩衝液中之溫和還原劑(2 mM半胱胺酸)在SDS-PAGE樣品製備時使二硫鍵還原引起。在經純化之GingisKHAN反應物中，出現預期片段(圖5C)。

對於PT23103p08、PT23103p03、PT23103p11及PT23103p12，未處理之IgG(NR及R)看起來係適當的。所有FabRICATOR樣品均顯示適當的蛋白質譜帶。在非還原性條件下，在FabRICATOR反應物中未觀察到Fc。實際上，由於在SDS-PAGE樣品製備時，該酶切割連接該二個重鏈之鉸鏈半胱胺酸下部，使二硫鍵還原，故出現「半Fc」譜帶。粗GingisKHAN反應物在非還原性凝膠中看來被還原。此可能係由裂解緩衝液中之溫和還原劑(2 mM半胱胺酸)在SDS-PAGE樣品製備時使二硫鍵還原引起。對於PT23103p08及PT23103p03樣品，正如預期，FabRICATOR反應顯示F(ab')3；而GingisKHAN反應顯示無2Fab'片段，而是鑑別出大致對應於單個Fab片段之較小譜帶。對於PT23103p11及PT23103p12，用FabRICATOR消化產生F(ab')3。對於PT23103p11及PT23103p12，正如預期，GingisKHAN消化產生2Fab'片段，不過當用GingisKHAN消化時，某些組分減少(圖5D)。應理解，藉由調整所用時間或試劑可容易地緩解減少。

總體而言，對於FabRICATOR消化之反應，所有樣品均顯示預期之蛋白質譜帶。在非還原性條件下，在FabRICATOR反應中未觀察到Fc。實際上，由於該酶切割連接該二個重鏈之鉸鏈半胱胺酸下部，產生二個CH2-CH3多肽，故出現「半Fc」或「CH2-CH3」譜帶。

對於產生2Fab'的GingisKHAN消化之反應物，在一些連接子中存在的序列(KSCDK/THTC PPC )(SEQ ID NO:92)被GingisKHAN識別，且對於以下三價分子，連接子序列係類似的。 PT23103p15 (連接子IgG1 H) KSCDK / THTS PPS (SEQ ID NO: 93) PT23103p08 (連接子IgG1 MH) KSCDK / THTS PPS (SEQ ID NO: 93) PT23103p03(連接子IgG1 UH) KSCDK / THTS PPS (SEQ ID NO: 93)

因此，可能的情況是，此等樣品中之2Fab'被切割成2個獨立的Fab，此與SDS-PAGE譜相關。對於此等樣品，游離連接子可能阻礙結合位點，由此可以解釋與纖維蛋白原之結合的損失。

總體而言，FabRICATOR表現良好，且本文所揭示之方法在高濃度下產生截斷的三價多元體(F(ab')3)，並維持特異性結合，且確定在高濃度下，可容易地產生在各Fab處具有共同輕鏈且經由異二聚化諸如DEKK配對之截斷的多特異性多元體(F(ab')n)。而對於缺乏經修飾IgG1鉸鏈序列KSCDK/THTS PPS (SEQ ID NO:93)之連接子，使用GingisKHAN酶表現為產生2Fab'片段。

因此，使用本文所揭示之傳授內容，熟習此項技術者可製造出實質上純的截斷之多價(及多特異性)多元體，包括藉由使用FabRICATOR酶製造。或者，使用多價多元體，在額外結合域經由缺乏GingisKHAN所識別之基元的連接子連接至該多元體情況下，遵循本文所揭示之傳授內容，使熟習此項技術者能夠製造出nFab'及Fab之混合物，其中n等於二個或多於二個，且nFab'包含重鏈，該重鏈包含經由本文所描述之連接子連接至一或多個額外可變域之可變域，或與輕鏈配對，該輕鏈經由本文所描述之連接子連接至一或多個額外可變域。

圖1A：闡述先前所描述之多價多元體之例示性形式，且圖1B闡述本文所揭示之發明之例示性形式。本文所揭示之發明的多價多元體包含在各別C末端處經由二個或多於二個二硫橋鍵配對的二個多肽。

圖2A-E：在還原性及非還原性條件下進行的IgG、Fab、F(ab')2之SDS-PAGE分析。

圖3：調蛋白依賴性MCF-7增殖分析，展示經由本文所揭示之方法產生的雙特異性F(ab')2之功效。

圖4A：闡述先前所揭示之例示性多特異性形式，其包含一個共同輕鏈及能夠結合不同抗原的三個獨特經重排重鏈，其中該等獨特重鏈中之二個經由DEKK異二聚化配對。參考WO 2019/190327，其以引用的方式併入本文中。圖4B：闡述本文所揭示之發明的例示性多價多元體，在4B1處，其包含F(ab')3，其中二個重鏈在其各別C末端處經由二個二硫橋鍵配對。4B2亦描繪2Fab'(其中使重鏈配對之二硫橋鍵裂解，且二個Fab經由本文所描述之連接子連接)，且4B3描繪Fab。如本文所描述，當三價多元體在每一各別重鏈之CH1與CH2之間的區域處裂解時，產生2Fab'及Fab。本圖不具限制性，因為額外結合域可藉由將連接子添加至VL或VH區之N末端區，連接能夠與同源域配對形成額外結合域的CH1-VH或CL-VL域以模組形式添加至基礎F(ab')2部分。

圖5A-D：在還原性及非還原性條件下進行的三價IgG分子之SDS-PAGE分析，且展示IgG、Fab、F(ab')3多元體之成功製造。

(無)

Claims

一種多價多元體(multivalent multimer)，其包含三個或多於三個結合域且包含具有一N末端及一C末端之二個或多於二個重鏈區，其中該多元體包含一使該等重鏈區中之二個在該C末端處配對的鉸鏈區。
如請求項1之多價多元體，其包含三個或多於三個人類重鏈可變區，其中二個在該鉸鏈區處配對，其中該配對包含一或多個二硫橋鍵。
如請求項1或2之多價多元體，其中每個重鏈區包含一CH1域。
如請求項1至3中任一項之多價多元體，其中二個或多於二個重鏈區包含一共同可變區。
如請求項1至3中任一項之多價多元體，其中該二個或多於二個重鏈區與一人類輕鏈區配對，其中該輕鏈區係一共同輕鏈。
如請求項5之多價多元體，其中該共同輕鏈包含一CL域。
如請求項5或6之多價多元體，其中該共同輕鏈包含SEQ ID NO:1之序列。
如請求項1至7中任一項之多價多元體，其中該多元體包含三個Fab域(Fab1、Fab2、Fab3)，其各自包含與含一可變區(VL)及一恆定區(CL)之一輕鏈配對的含一可變區(VH)及一恆定區(CH1)的一重鏈，其中Fab2與Fab3經由在Fab2之一重鏈可變區及Fab3之一CH1域處的一連接子連接，且其中該Fab1及Fab3經由一鉸鏈配對，該鉸鏈包含在Fab3之重鏈及Fab1之重鏈的C末端處存在的至少二個二硫鍵。
如請求項8之多價多元體，其中連接Fab2與Fab3之該連接子包含SEQ ID NOs:2-25之一序列或與該SEQ ID Nos: 2-25具有至少約85%一致性之一多肽。
如請求項8至9中任一項之多價多元體，其中該連接子之胺基酸序列包含一天然存在之序列或包含來源於一天然存在之序列的一序列。
如請求項10之多價多元體，其中該連接子包含一中間鉸鏈區序列。
如請求項10之多價多元體，其中該連接子包含一上部及一下部鉸鏈序列。
如請求項10之多價多元體，其中該連接子包含一螺旋形成序列。
如請求項1至13中任一項之多價多元體，其中該二個或多於二個重鏈區之可變區特異性結合一不同的抗原決定基。
如請求項1至14中任一項之多價多元體，其中該多元體結合至少二種不同抗原。
一種製造一多價多元體之方法，其包含：用二種或多於二種抗原對一基因轉殖動物免疫接種，該基因轉殖動物包含編碼一共同輕鏈可變區及一未經重排之重鏈可變區的一核酸；獲得一組特異性結合該二種或多於二種抗原之抗體，該等抗體包含該共同輕鏈可變區及經重排重鏈抗體鏈；將一核酸整合至一宿主細胞中，該核酸編碼該共同輕鏈可變區及二個或多於二個經重排重鏈，其等特異性結合該二種或多於二種抗原，其中該等經重排重鏈中之二個包含一恆定區，該恆定區包含能夠經由形成一個二硫橋鍵配對的CH1、CH2及/或CH3域；在使一包含該共同輕鏈及二個或多於二個經重排重鏈之完整多價多元體表現的條件下培養該宿主細胞，其中該等經重排重鏈中之二個經由一在該二個經重排重鏈各自之CH1與CH2域之間的二硫橋鍵配對；以及用一裂解出該二個經重排重鏈各自之CH2及/或CH3區的酶處理該完整多價多元體，維持該二個經重排重鏈經由一個二硫橋鍵進行之配對以形成該多價多元體。
如請求項16之方法，其中包含一含CH1、CH2及/或CH3域之恆定區的該二個重鏈包含促進異二聚化之互補修飾。
如請求項17之方法，其中該等修飾係在免疫球蛋白CH2或CH3區中。
如請求項17或18之方法，其中該等互補修飾包含一孔中節(knob into hole)修飾、靜電修飾或DEKK修飾。
如請求項19之方法，其中該二個重鏈中之第一個包含與該二個重鏈中之第二個的一第二CH3域二聚化的一第一CH3域，該第一CH3在位置351及366處或在與其對應的位置處包含一胺基酸殘基離胺酸且該第二CH3包含胺基酸殘基天冬胺酸在351處以及麩胺酸在368處或在與其等對應之位置處。
如請求項16至20中任一項之方法，其中該等共同可變區係由一核酸編碼，該核酸係獲自、來源於或基於由在生殖系中包含一經重排可變鏈核酸序列之一基因轉殖嚙齒動物編碼的一核酸。
如請求項16至21中任一項之方法，其進一步包含藉由對該酶加標籤並經由抗標籤親和管柱移除該酶來回收該多價多元體。
一種藉由如請求項16至22中任一項之方法製造或可獲得的多價多元體。
一種細胞，其包含編碼能夠組裝成一如請求項1至15中任一項之多價多元體之多肽的一或多個核酸序列。
一種醫藥組合物，其包含一如請求項1至15中任一項之多價多元體及一醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑。
一種治療罹患一醫學適應症之一個體的方法，其包含向該個體投與一治療有效量的一如請求項1至15中任一項之多價多元體。
如請求項1至15中任一項之多價多元體，其用於療法中。