JP7439201B2 - 抗体産生非ヒト哺乳動物 - Google Patents
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Description
(実施例1)
ヒト軽鎖V遺伝子クローン
本実施例は、2種のヒト軽鎖V遺伝子、1種の遺伝子はκ型および1種の遺伝子はλ型の選択の背景にある論理的証拠を説明し、軽鎖発現トランスジェニックマウスに関する概念の証明として使用される。De Wildtら、1999(de Wildtら、(1999) J. Mol. Biol. 285(3): 895頁)は、末梢IgG陽性B細胞におけるヒト軽鎖の発現を分析した。これらのデータに基づき、IGKV1-39(O12)およびIGLV2-14(2a2)はB細胞レパートリーにおいて十分提示されていたので、IGKV1-39(O12)およびIGLV2-14(2a2)を軽鎖として選択した。軽鎖のJ-セグメント配列は、IGKV1-39はGenBank ABA26122で(Rabquer, B.J.、Smithson, S.L.、Shriner, A.K.およびWesterink, M.A.J.)およびIGLV2-14はGenBank AAF20450(Ignatovich, O.、Tomlinson, I.M.、Popov, A.V.、Bruggemann, M.およびWinter, G. J. Mol. Biol. 294 (2), 457~465頁(1999))で表される配列に基づき選択されている。
ヒトIGKV1-39遺伝子セグメントとペアリングし、機能性抗体結合部位を形成するマウス重鎖V遺伝子の獲得
本実施例は、単一の再構成ヒト生殖細胞系列IGKV1-39/J領域とペアリングできるマウス重鎖V遺伝子の同定を記載する。破傷風トキソイドを用いて免疫化されたマウスに由来する脾臓のVHレパートリーを、単一のヒトIGKV1-39-Cκ軽鎖を用いてファージディスプレイFabベクター内にクローン化し、破傷風トキソイドに対するパニングに供した。1ラウンドのパニング後に得られたクローンを、それらの結合特異性に関して分析した。破傷風トキソイド特異的Fab断片をコードするマウスVH遺伝子を、配列分析に供し、唯一のクローンを同定し、VH、DHおよびJHの利用を指定した。
BALB/cマウスに、破傷風トキソイドを用いた免疫化を1回行い、6週間後に、破傷風トキソイドを用いて追加免疫した。
脾臓細胞懸濁液の調製。解剖後、脾臓を、PBSを用いて洗浄し、20mlのPBSを含む60mmペトリ皿に移した。20mlのPBSを含む、キャップをした注射器およびG20の針を使用して、脾臓を繰り返し洗い流した。洗い流した細胞を、PBSを用いて洗浄後、20mlのPBSを使用して、細胞を慎重に懸濁液にし、5分間ベンチに放置し、脾細胞を、デブリおよび細胞クラスターから分離した。脾細胞懸濁液をFicoll-Paque(商標)PLUSを満たしたチューブの上端に移し、リンパ球の単離のために製造業者(Amersham Biosciences)の手順に従って処理した。
リンパ球の単離およびペレット化の後で、細胞を全RNAの単離のために、添付の製造業者のプロトコルに従ってTRIzol LS Reagent(Invitrogen)に懸濁し、1マイクログラムのRNA、Superscript III RTとdT20との組合せを使用して、製造業者の手順(Invitrogen)に従って逆転写反応に供した。
cDNAを、15 VHファミリーに属するおよそ110のさまざまなマウスV遺伝子の増幅を可能にするプライマーの組合せを使用して、PCR反応において増幅した(Table 1(表1); RefSeq NG_005838; Thiebeら、1999。European Journal of Immunology 29: 2072~2081頁)。第1ラウンドにおいて、V遺伝子の5'末端およびJ領域の3'末端に結合するプライマーの組合せを使用した。第2ラウンドにおいて、MJH-Rev2プライマーを用いて作製されたPCR産物を、3'領域に改変を導入し、産物の有効なクローン化を可能にするために増幅した。増幅の最終ラウンドにおいて、全PCR産物を、5'末端にSfil制限部位および3'末端にBstEII制限部位を導入するプライマーを使用して増幅した(図1および2、ならびにTable 1(表1)を参照されたい)。
精製した産物を、BstEIIおよびSfiIを用いて、2ステップで消化した。まず、1マイクログラムのDNAを、10マイクロリットルの10* NEB緩衝液3(New England Biolabs)、1マイクロリットルの100*BSA、12.5単位のBstEIIおよび滅菌水からなる、100マイクロリットル反応液中で、ストーブにおいて60℃で6時間消化した。この産物を、Qiagen社によるQiaquick PCR Purificationキットを使用して、取り扱い説明書に従って精製し、40マイクロリットルの水に溶出した。次に、全産物をSfiIを用いて、10マイクロリットルの10* NEB緩衝液2(New England Biolabs)、1マイクロリットルの100*BSA、12.5単位のSfiIおよび滅菌水からなる、100マイクロリットルの反応液中で、ストーブにおいて50℃で12時間消化した。消化された断片を、20cmの1.5%アガロースTBE+臭化エチジウムゲル上で、80Vにおけるゲル分離後、Qiaquick Gel Extractionキットにより精製した。100マイクログラムのアクセプターベクター(MV1043、図3および12)を、50単位のEco91Iを用いて、標準条件下で600マイクロリットル(Tango緩衝液)中で消化し、次に、0.9%のアガロースゲル上で精製した。規定条件下で400単位のSfilを用いて、500マイクロリットル中で12時間の第2の消化ステップ後、100単位のBsrGIを50℃で3時間加えた。
個々のPCR産物を、以下のスキームに従って個別に連結した: 70ngの消化PCR産物、300ngの消化アクセプターベクター、100単位のT4リガーゼ(NEB)、1*リガーゼ緩衝液30マイクロリットル中で、12℃において16時間。連結反応液をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出液を用い、その後製造業者のプロトコルに従って、グリコーゲン沈降(Sigma-Aldrich #G1767)によって精製し、最終的に25マイクロリットルの滅菌水に溶解した。
精製連結産物を、1200マイクロリットルのTG1エレクトロコンピテント細菌(Stratagene #200123)/連結バッチを使用して、エレクトロポレーションによって形質転換し、4%グルコース含有LBカルベニシリンプレート上に播種した。ライブラリを、50ml LBカルベニシリン中の細菌を掻き取ることによって収集した。2000gで、4℃において20分間遠心分離した後、細菌のペレットを、氷水上で2mlの氷冷2*TY/30%グリセロールに慎重に再懸濁し、ドライアイス/エタノール上で凍結後-80℃において保存した。
ライブラリを、Kramerら、2003(Kramerら、2003。Nucleic Acids Res. 31(11): e59)により記載された手順に従って、ヘルパーファージ株としてVCSM13(Stratagene)を使用し、成長させ、収集した。
破傷風トキソイドを、2μg/mlの濃度でPBSに溶解し、MaxiSorp Nunc-Immuno Tube(Nunc 444474)に4℃において一晩コーティングした。コーティング溶液を廃棄後、このチューブを、PBS(ブロッキング緩衝液)中2%のスキムミルク(ELK)を用いて、RTにおいて1時間ブロッキングした。平行して、0.5mlのファージライブラリを、1mlのブロッキング緩衝液と混合し、室温において20分間インキュベートした。ファージをブロッキング後、ファージ溶液を破傷風トキソイドコーティングチューブに加え、ゆっくりと回転する基盤上で、RTにおいて2時間インキュベートし、結合させた。次に、チューブをPBS/0.05% Tween-20を用いて10回洗浄し、その後、1mlの50mMグリシン-HCl、pH2.2と一緒に、RTにおいて10分間、回転盤上でインキュベートすることによってファージを溶出し、次いで、0.5mlの1M Tris-HCl、pH7.5を用いて収集した溶出液を直接中和した。
O.D. 0.4の5mlのXL1-Blue MRF(Stratagene)培養液を、収集したファージ溶液に加え、振とうせずに37℃において30分間インキュベートし、ファージを感染させた。細菌を、カルベニシリン/テトラサイクリン、4%グルコース2*TYプレート上に播種し、37℃において一晩成長させた。
ファージを、Kramerら、2003(Kramerら、2003。Nucleic Acids Res. 31(11): e59)により記載されたように、ヘルパーファージ株としてVCSM13を使用して成長させ、処理した。
ELISAプレートを、PBS中2マイクログラム/mlの濃度の100マイクロリットルの破傷風トキソイド/ウェルを用いて、4℃において一晩コーティングした。PBS中2マイクログラム/mlの濃度の100マイクロリットルのチログロブリンを用いてコーティングしたプレートを、陰性対照として使用した。ウェルを空にして、ペーパータオルで軽く拭くことによって乾かし、PBS-4%スキムミルク(ELK)で完全に満たし、室温で1時間インキュベートし、ウェルをブロックした。ブロッキング溶液を廃棄後、50μlのブロッキング溶液と予備混合したファージのミニプレップを加え、RTにおいて1時間インキュベートした。次に、PBS-0.05% Tween-20を用いた5回の洗浄ステップにより、未結合のファージを取り除いた。結合したファージを、ウェルを100マイクロリットルの抗M13-HRP抗体コンジュゲート(ブロッキング緩衝液で1/5000に希釈)と一緒に、室温において1時間インキュベートすることによって検出した。遊離の抗体を、上記のような洗浄ステップを繰り返すことによって取り除き、その後、発色が可視化するまでTMB基質とインキュベートした。反応を、100マイクロリットルの2M H2SO4 /ウェルを加えることによって停止させ、ELISAリーダーで発光波長450nmにおいて分析した(Table 2(表2))。数字が大きいほど、シグナルが強い、したがってファージ-Fab複合体の特異的結合の発生が高いことを示す。
バックグラウンドシグナルの少なくとも3倍のシグナルを示すクローン(Table 2(表2))を繁殖させ、DNAミニプレップ手順に使用し(Qiagen miniPrepの取り扱い説明書を参照されたい)、ヌクレオチド配列分析に供した。配列決定を、Big Dye 1.1キットに添付の取り扱い説明書(Applied Biosystems)に従って、ヒトIgG1重鎖のCH1領域の5'配列(FabディスプレイベクターMV1043中に存在する、図3および12)を認識するリバースプライマー(CH1_Rev1、Table 1(表1))を使用して実施した。28種の破傷風トキソイド結合クローンのマウスVH配列を、Table 3(表3)に表した。結果は、選択されたマウスVH遺伝子が、異なる遺伝子ファミリーに属し、これらの遺伝子ファミリー由来の異なる個々のメンバーは、再構成ヒトIGKV1-39/J VH領域とペアリングして機能性破傷風トキソイド特異的抗体結合部位を形成できることを示す。配列分析により、マウスVH領域はDHおよびJHの遺伝子セグメントの多様性を利用すると結論付けた。
マウスκ軽鎖遺伝子座の配列決定
本実施例は、マウス内因性κ軽鎖遺伝子座のサイレンシングについて記載する。内因性κ遺伝子座を、ES細胞において相同組換えにより改変し、次いでマウス胚中への遺伝子組換えES細胞を導入し、遺伝的に適合された子孫を得た。
欠失セグメントに融合した3'および5'末端に4.5~8kbの隣接アームを受容したベクターを、ES細胞系における標的相同組換えに使用した。双方のアームは、最大の相同性を確実にするPCR手段により得た。ターゲティング戦略は、構成的KO対立遺伝子の作製を可能にする。Igkイントロンエンハンサー、Igk定常領域およびIgk3'エンハンサーを包含するマウスゲノム配列を、PuroRカセットと置き換え、PuroRカセットはF3部位に隣接し、Jk要素の下流に挿入される。選択マーカーのFlp仲介除去は、構成的KO対立遺伝子をもたらす。Igk MiEk-Igk C-Igk 3'Eゲノム領域(およそ10kb)と、F3-Puroカセット(およそ3kb)の置き換えは、相同組換えの効率を減少すると思われた。したがって、相同性のアームを伸長し、より多くのES細胞コロニーを、相同組換えクローンを同定するために形質移入した後で分析した。
遺伝子組換えES細胞の作製を、本質的に記載のように(Seiblerら、Nucleic Acid Res. 2003 Feb 15: 31(4): e12)実施した。さらに、詳細な説明に関して実施例14を参照されたい。
遺伝子組換えES細胞を使用した、四倍体胚補完法によるESマウスの作製を、本質的に記載のように実施した(Egganら、PNAS 98、6209~6214頁; Seibler ら、Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15: 31(4): e12; Hoganら、「Summary of mouse development. Manipulating the Mouse Embryo、(1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor NY.」、253~289頁。))。
マウスλ軽鎖遺伝子座のサイレンシング
本実施例は、マウス内因性λ軽鎖遺伝子座のサイレンシングを記載する。内因性λ遺伝子座を、ES細胞において相同組換えにより改変し、次いでマウス胚中へ遺伝子組換えES細胞を導入し、遺伝的に適合された子孫を得た。
欠失セグメントに融合した、3'および5'末端に3~9.6kbの隣接アームを受容したベクターを、ES細胞系における標的相同組換えに使用した。双方のアームは、最大の相同性を確実にするPCR手段により得た。第1のステップにおいて、Igl V2-V3領域を包含するマウスゲノム配列を、F3部位に隣接するPuroRカセットと置き換え、これにより、選択マーカーのFlp-仲介除去後、構成的KO対立遺伝子がもたらされる(図19Aを参照されたい)。第2のステップにおいて、Igl V1領域を包含するマウスゲノム配列を、すでにIgl V2~V3領域が欠失しているES細胞クローンにおいて、Neoカセットと置き換えた(図19Bを参照されたい)。選択マーカー(NeoR)は、FRT部位に隣接した。選択マーカーのFlp-仲介除去後に、構成的KO対立遺伝子を得た。
遺伝子組換えES細胞の作製を、記載のように本質的に実施した(Seibler J、Zevnik B、Kuter-Luks B、Andreas S、Kern H、Hennek T、Rode A、Heimann C、Faust N、Kauselmann G、Schoor M、Jaenisch R、Rajewsky K、Kuhn R、Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15: 31(4): e12)。さらに、詳細な説明に関して実施例14を参照されたい。同じ染色体上で起こる双方のターゲティング事象を示すために、一部の二重標的クローンを、pCMV C31ΔCpGのインビトロの欠失のために選択した。このクローンを、20% FCS(PAN)および1200u/mL Leukemia Inhibitory Factor(Millipore ESG 1107)を含有するDMEM High Glucose培地中にマウス胚性線維芽細胞を含む有糸分裂を不活性化したフィーダーレイヤーにおいて、耐性菌選択圧の下で伸長した。各クローンからの1×107細胞を、20μgの環状pCMV C31ΔCpGを用いて240Vおよび500μFにおいてエレクトロポレーションし、各々4つの10cmの皿に播種した。エレクトロポレーションの2~3日後、細胞を収集し、PCRにより分析した。使用したプライマーは:
2005_5: CCCTTTCCAATCTTTATGGG
2005_7: AGGTGGATTGGTGTCTTTTTCTC
2005_9: GTCATGTCGGCGACCCTACGCC
であった。PCR反応を、5μlのPCR Buffer 10x(Invitrogen)、2μlのMgCl2(50mM)、1μlのdNTPs(10mM)、1μlの第1プライマー(5μM)、1μlの第2プライマー(5μM)、0.4μlのTaq(5U/ul、Invitrogen)、37.6μlのH2Oおよび2μlのDNAを含む混合物において実施した。使用したプログラムは、95℃で5分: その後95℃で30秒: 60℃で30秒: 72℃で1分を35サイクル: その後72℃で10分であった。
遺伝子組換えES細胞を使用した四倍体胚補完法によるマウスの作製を、本質的に記載のように実施した(Egganら、PNAS 98、6209~6214頁; Seibler J、Zevnik B, Kuter-Luks B、Andreas S、Kern H、Hennek T、Rode A、HeimannC、Faust N、Kauselmann G、Schoor M、Jaenisch R、Rajewsky K、Kuhn R、Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15: 31(4): e12; Hoganら、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor NY.)、253~289頁)。
再構成ヒト生殖細胞系列IGKV1-39/J-Ck遺伝子(IGKV1-39/J-Ck)に基づく、CAGGS発現インサートの構築
本実施例は、再構成ヒト生殖細胞系列IGKV1-39/J領域を組み込んだCAGGS発現カセットの構築を記載する。このインサート発現カセットはクローン化部位、Kozak配列、イントロンを含有するリーダー配列、再構成IGKV1-39領域のオープンリーディングフレーム、対立遺伝子a由来のラットCK定常領域および翻訳終止配列を包含する(IGKV1-39/J-Ck: 図6)。第1の構築体は、天然発生配列からなり、分析されており、内部TATA-ボックス、ポリアデニル化シグナル、カイ部位(chi-sites)、リボソーム侵入部位、富ATまたは富GC配列ストレッチ、ARE、INSおよびCRSの配列要素、反復配列、RNA二次構造、(潜在性)スプライスドナーおよびアクセプター部位ならびにスプライス分岐点(GeneArt GmbH)などの、シスに作用する望ましくない要素を除去することによって最適化される。さらに、オープンリーディングフレーム領域におけるコドンの使用は、マウスにおける発現を最適化する。イントロン配列は不変であり、したがって、ヒトIGKV1-39リーダーイントロンのコード部分と同一の配列を表す。
再構成生殖細胞系列IGLV2-14/J Vλ領域(IGLV2-14/J-Ck)に基づくCAGGS発現インサート 本実施例は、再構成生殖細胞系列IGLV2-14/J Vλ領域を組み込んだ、発現カセットの配列および挿入を記載する。このインサートは、クローン化部位、Kozak配列、イントロンを含有するリーダー配列、再構成IGLV2-14/J領域のオープンリーディングフレーム、対立遺伝子a由来のラットCK定常領域および翻訳終止配列を包含する(IGLV2-14/J-Ck: 図7)。第1の構築体は、天然発生配列からなり、分析されており、内部TATA-ボックス、ポリアデニル化シグナル、カイ部位(chi-sites)、リボソーム侵入部位、富ATまたは富GC配列ストレッチ、ARE、INSおよびCRSの配列要素、反復配列、RNA二次構造、(潜在性)スプライスドナーおよびアクセプター部位ならびにスプライス分岐点(GeneArt GmbH)などの、シスに作用する望ましくない要素を除去することによって最適化される。さらに、オープンリーディングフレーム領域におけるコドンの使用は、マウスにおける発現を最適化する。イントロン配列は不変であり、したがって、ヒトIGKV1-39リーダーイントロン同一の配列を表す。
HEK293細胞系におけるIGKV1-39/J-Ckの発現(pSELECTIGKV1-39/J-Ck)
本実施例は、実施例5に記載のIGKV1-39/J-Ck構築体が、HEK293細胞においてIGKV1-39/J-CkのL鎖の発現および欠失が可能であることの検証方法を記載する。IGKV1-39/Jインサート(図6)を、5'末端において、NotI部位をSalI部位に交換することによって改変した。この変更は、産物の、発現カセットプラスミドpSELECT-hygro(InvivoGen)におけるクローン化に必要である。CAGGS発現インサートIGKV1-39/J-CkおよびpSELECT-hygroをSalIおよびNheIを用いて消化し、連結し、標準技術を使用するコンピテントXL1-Blue細胞の形質転換に使用した。コロニーを採取し、Qiagen Midi-prepカラムを使用し、製造業者の手順に従ってDNAを精製した。0817676_pSELECT_0815426と称する得られた軽鎖(LC)発現ベクターを、製造業者のプロトコルに従って、HEK293細胞にFugene6(Roche)を形質移入するために使用した。上清を、IGKV1-39/J-Ck軽鎖の存在に関して、ELISAおよび抗ラットCk抗体(Beckton Dickinson #550336および553871)および当分野において使用されるプロトコルを使用するウェスタンブロットによりスクリーニングした。
HEK293細胞系におけるIGLV2-14/J-Ckの発現(pSELECT-IGLV2-14/J-Ck)
本実施例は、実施例6に記載のIGLV2-14/J構築体が、HEK293細胞においてIGLV2-14/J-CkのL鎖の発現および検出が可能であることの検証方法を記載する。IGLV2-14/J-Ckインサート(図7)を、5'末端において、NotI部位をSalI部位に変更することによって改変した。この変化は、産物を発現カセットプラスミドのpSELECT-hygro(InvivoGen)内にクローン化するために必要である。CAGGS発現インサートIGLV2-14/J-CkおよびpSELECT-hygroを、SalIおよびNheIで消化し、連結し、標準的技術を使用してコンピテントXL1-Blue細胞を形質転換するために使用した。コロニーを採取し、DNAを、Qiagen Midi-prepカラムを使用して、製造業者の手順に従って精製した。0817678_pSELECT_0815427と称する得られた軽鎖(LC)発現ベクターを使用して、製造業者のプロトコルに従って、HEK293細胞にFugene6(Roche)を形質移入した上清を、IGLV2-14/J-Ck軽鎖の存在に関して、ELISAおよび抗ラットCk抗体(Becton Dickinson #550336および553871)を用いるウェスタンブロットによりスクリーニングした。詳細および結果に関しては、実施例7を参照されたい。
IGKV1-39/JインサートおよびマウスCK遺伝子座に由来する多重エンハンサー要素を含有する、VKプロモーター駆動性発現構築体(VkP-IGKV1-39/J-Ck; VkP-O12)の構築
本実施例は、IGKV1-39 VKプロモーター領域に基づく、再構成ヒトIGKV1-39 VK領域の、B細胞特異的かつ発生/分化段階特異的な発現を可能にする関連要素、イントロンを含有するリーダー、生殖細胞系列V遺伝子、CDR3、IGKJセグメント、JkおよびCKの間に配置されたマウス遺伝子間領域、ラットCk対立遺伝子のオープンリーディングフレームおよびマウスCK遺伝子の3'末端から3'CKエンハンサーのちょうど3'で終わるマウス遺伝子間断片を含有する発現カセットの構築を記載する。
IGLV2-14/Jクローンおよび複数のCK遺伝子座由来のエンハンサー要素を含有する、VKプロモーター駆動性発現構築体(VkP-IGLVL2-14/J-Ck; VkP-2a2)の構築。
本実施例は、IGKV1-39遺伝子およびJ-領域が唯一のV-J領域を含む最適化ヒトIGLV2-14生殖細胞系列遺伝子(VkP-IGLV2-14/J-Ck; VkP-2a2: 図9)で置き換えられた以外は、実施例9に記載の同じ構築体を記載する。
CKイントロンエンハンサー要素が欠落したIGKV1-39クローンを含有する、VKプロモーター駆動発現構築体(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1; VkP-O12-del1)の構築
実施例9に記載の構築体を、標準PCR改変およびDNAクローン化方法論(GeneArt、GmBH)により、ヒトJ領域およびラットCK領域間の遺伝子間領域に配置されたCKイントロンエンハンサー要素を除去することにより改変した。得られた発現カセットを図10に示し、VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1(VkP-O12-del1)と名付けた。
CKイントロンエンハンサー要素および切断型3'CKエンハンサー要素が欠落したIGKV1-39クローンを含有する、VKプロモーター駆動性発現構築体(VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2; VkP-O12-del2)の構築
実施例11に記載の構築体を、潜在的阻害要素を除去するために、3'CKエンハンサー要素を切断し、ラットCk遺伝子の遺伝子間領域の3'部分を欠失することによって改変した。これは、標準的方法を使用して、EcoRV部位(ラットCk遺伝子の3'に配置)および3'エンハンサーに存在するNcoI部位間の遺伝子間配列(5993bp)を除去し、3'エンハンサーBstXI部位および3'エンハンサーのBstXI部位の3'間の配列(474bp)をさらに除去することによって達成された。得られた発現カセットを図11に示し、VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2(VkP-O12-del2)と名付けた。
細胞系におけるVk構築体の発現
実施例9~12に記載の構築体を、骨髄腫細胞系MPC11(ATCC CCL167)、B細胞リンパ腫WEHI231(ATCC CRL-1702)、T細胞リンパ腫EL4(ATCC TIB-39)およびHEK293(ATCC CRL1573)において軽鎖タンパク質を産生するそれらの能力に関して試験した。構築体中のエンハンサー要素およびプロモーター要素は、B細胞系において発現可能であるが、他の組織由来の細胞系においては発現できなかった。精製され、線形化されたDNAを使用した細胞系の形質移入後、Fugene6(Roche)細胞を一時的発現のために培養する。細胞および上清を収集し、SDS-PAGE分析、その後特異的抗ラットC-κ抗体を使用するウェスタンブロットに供した。上清を、抗ラットCK抗体(Beckton Dickinson #550336)を使用して、ELISAで、分泌L鎖に関して分析した。
トランスジェニックES系の作製
実施例3、4、5、6、9、10、11および12に記載の全構築体を使用して、相同組換えの手段により、個別の安定なトランスジェニックES系を作製した。相同組換えを介したトランスジェニックES系の作製方法は、当分野において公知である(例えば、Egganら、PNAS 98, 6209~6214頁; Seibler J、Zevnik B、Kuter-Luks B、Andreas S、Kern H、Hennek T、Rode A、HeimannC、Faust N、Kauselmann G、Schoor M、Jaenisch R、Rajewsky K、Kuhn R、Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15: 31(4): e12; Hoganら。(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor NY.)、253~289頁)。
トランスジェニックマウス系統の作製
実施例14に記載の、作製し、それらの改変に関して検証した全ES細胞系を使用して、四倍体組換えの手段により、安定なトランスジェニックマウスを作製した。この方法は、当分野において公知である。一般的に、ホルモンの投与後、過剰排卵のBalb/c雌を、Balb/cの雄と交配した。胚盤胞を、dpc 3.5で子宮から単離した。マイクロインジェクションのために、胚盤胞を、鉱油下の15% FCS含有DMEMの液滴中に置いた。フラットチップの、内径12~15マイクロメーターの圧作動型マイクロインジェクションピペットを使用して、10~15の標的C57BL/6 N.tac ES細胞を個々の胚盤胞に注入した。回収後、注入後の胚盤胞を個々の、性交後2.5日、偽妊娠NMRI雌の子宮角に移した。キメラ現象を、ES細胞対Balb/c宿主(黒色/白色)の毛色の寄与により、キメラ(G0)により測定した。高度のキメラマウスを、C57BL/6系統の雌に繁殖させた。計画の必要条件に依存して、C57BL/6の交配相手は、非突然変異体(W)またはリコンビナーゼ遺伝子の存在に関する突然変異体(Flp-DeleterもしくはCre-deleterもしくはCreER誘導可能deleterまたはFlp-deleter/CreERの組合せ)である。生殖細胞系列の遺伝を、黒色の、C57BL/6系統の子孫(G1)の存在により同定した。
繁殖
本実施例は、実施例14に記載の、得られたトランスジェニック発現カセット含有マウスおよび内因性λおよびκ遺伝子座がサイレンシングされている、ノックアウトマウスの繁殖を記載する。16番染色体上のV-λおよび7番染色体上のCD19の局在化により、標準的繁殖手順が可能である。子孫のパーセントは、両方の改変が1つの染色体上に一緒に起こるという意味の交差を示すだけなので、6番染色体上に、距離約24cMで同時局在化されたVk遺伝子座およびRosa26遺伝子座の繁殖は、スクリーニングの際に特別に注意が必要である。
4種の遺伝子座すべては、CD19-creホモ接合型またはヘテロ接合型(未記載)および改変Rosa26トランス遺伝子および他の遺伝子座のホモ接合型である単一のマウス系統において組み合わされなければならない。繁殖は標準的な繁殖技術およびそれぞれに見合ったスクリーニング技術により実施され、商業的飼業者(例えば、TaconicArtemis)により提示される。
マウスの免疫化
マウスの初回免疫化および追加免疫化を、標準的プロトコルを使用して実施する。
トランスジェニックマウス系におけるB細胞集団の免疫蛍光分析。
本実施例は、一次(骨髄)および二次(脾臓、腹膜)リンパ系器官および血液中のB細胞集団を分析するための、抗体およびフローサイトメトリの使用を記載する。方法および試薬は、Middendorpら、(2002) J. Immunol、168: 2695およびMiddendorpら、(2004) J. Immunol、172: 1371頁に記載されている。骨髄における早期B細胞の発生の分析のために、細胞を、B220、CD19、CD25、IgM、IgD、マウスCκ、マウスCλおよびラットCκに特異的な抗体(Becton Dickinson)の組合せを用いて表面染色し、それらの表面にトランス遺伝子を発現するプロB細胞、プレB細胞、大型プレB細胞、早期および後期未熟B細胞および再循環B細胞集団を検出した。DAPI染色(Invitrogen)は、分析から死細胞を排除するために含まれ、FCブロック(Becton Dickinson)は、抗体と骨髄性細胞上のFc受容体との相互作用を阻害するために含まれた。末梢リンパ系器官および血液中のB細胞集団における表面トランス遺伝子発現の分析のために、細胞を、B220、CD5、CD19、CD21、CD23、IgM、IgD、マウスCκ、マウスCλおよびラットCκに特異的な抗体(Becton Dickinson)の組合せを用いて染色した。DAPI染色は、分析から死細胞を排除するために含まれ、FCブロックは、抗体と骨髄性細胞上のFc受容体との相互作用を阻害するために含まれた。さらに、トランス遺伝子発現がB細胞コンパートメントの外側の細胞型において起こる場合、CD3、CD4、CD11b、CD11cおよびNK1.1に特異的な抗体(Becton Dickinson)の組合せを、決定のために含んだ。
IGKV1-39に関するEpibase(登録商標)のT細胞エピトーププロファイル。
IGKV1-39のタンパク質配列(図12、ヒト生殖細胞系列IGKV1-39/J Protein)を、THエピトープとしても知られる、推定HLAクラスII拘束性エピトープの存在に関してスキャンした。このため、Algonomics社のEpibase(登録商標)基盤をIGKV1-39に適用した。手短に言えば、この基盤は、標的配列に由来する10merのペプチド全候補のHLA結合特異性を分析するものである(Desmetら、Nature 1992、356: 539~542頁; Desmetら、FASEB J. 1997、11: 164~172頁: Desmetら、Proteins 2002、48: 31~43頁: Desmetら、Proteins 2005、58: 53~69頁)。プロファイリングを、20種のDRB1、7種のDRB3/4/5、13種のDQおよび7種のDP、すなわち合計で47種のHLAクラスII受容体に関してアロタイプレベルで実施した(Table 5(表5)を参照されたい)。Epibase(登録商標)は、47の個々のHLAクラスII受容体についてのペプチドの結合の自由エネルギーの量的概算値ΔGbindを算出する。その後、これらのデータは、以下のようにさらに処理され:
自由エネルギーは、ΔGbind = RT ln(Kd)を介してKd値に変換された。
ペプチドは強(S)バインダー、中(M)バインダー、弱および非(N)バインダーに分類された。
以下のカットオフを適用した:
S: 強バインダー: Kd<0.1pM
M: 中バインダー: 0.1pM≦Kd<0.8pM
N: 弱および非バインダー: 0.8pM≦Kd
自己ペプチドに対応するペプチドを、個別に処理した。自己ペプチドのリストを、293種の抗体殖細胞系列配列から抜粋した。それらは、「生殖細胞系列フィルター処理」ペプチドと称される。
SおよびMペプチドを、いわゆるエピトープマップにおいて標的配列上にマッピングする; S-親和性を、定量的にプロットする: M値を定量的に表す。結果の総括として、Table 6(表6)にDRB1、DQ、DPおよびDRB3/4/5遺伝子に対応するHLAクラスII受容体グループに関する、分析したタンパク質中の強バインダーおよび中バインダーの数を掲載した。強および中親和性バインダーに関して個別に集計した。同じグループの複数のアロタイプに対するペプチド結合は、1として集計した。括弧の間の値は、生殖細胞系列フィルター処理ペプチドを指す。Table 7(表7)において、この配列を、実験研究に適切なフォーマットで示す。この配列を、12残基が重複する、連続する15merに分解する。個々の15merに関して、乱雑性(15-merが重要なバインダーを含有する、合計47のうちのアロタイプの数)および推測される血清型を掲載した。Epibase(登録商標)のプロファイルおよびエピトープマップを図16および17に示す。
IGKV1-39の生産特性
熱力学的に安定で、優れた発現収率を示す治療抗体をもたらす抗体発見基盤に対する大きな需要がある。これらの特徴は、生産中および製剤を患者に注射後の製剤原料の安定性を確実にすることにおいて重要である。さらに、優れた発現収率は、薬剤の製造コスト、したがって価格決定、患者のアクセスおよび採算性に直接影響を与える。事実上、今日の臨床使用における全治療抗体は、ヒトIgG1およびκ定常領域から構成されているが、特異性をもたらすさまざまな重鎖および軽鎖可変領域は使用されていない。ヒト可変重鎖および軽鎖ドメインは、80%を超える配列分岐を有するファミリーに分割できる。生殖細胞系列構造の中のこれらのファミリーの再構成実施例を、組合せ、安定性および収率に関して比較した場合、この遺伝子ファミリーは生物物理学的特性に関して等しくないことが明らかである。特に、VH3、VH1およびVH5は重鎖の好ましい安定性を有し、Vk1およびVk3は、軽鎖の最も優れた安定性および収率を有する。さらに、体細胞超突然変異過程の一部として突然変異が導入された場合、突然変異はVH/VLのペアリングに干渉し得る。さまざまな比率の突然変異がさまざまな軽鎖遺伝子を有することの固定VH鎖生産特性についての効果を評価するために、6例のナイーブな健康なドナーと、免疫化ドナー由来の重鎖を結合する44TTのパネルとの組合せから軽鎖(κおよびλ)のFabファージディスプレイライブラリを構築した。1ラウンドの選択後、TT結合Fabクローンを単離した。これらのいくつかは、さまざまな軽鎖を組み合わせたTTクローンPG1433と同じVH遺伝子を共有した。Fab軽鎖断片をκ発現ベクター内に再クローン化し、PG1433の重鎖をコードするDNAと組合せ、293の細胞内に形質移入し、特定のIgGの産生をELISAにより測定した。Table 8(表8)に実証したように、PG1433 VHをさまざまな軽鎖と組み合わせて含有する選択クローンは、PG1433 VHとIGKV1-39との組合せにおいて、5から10倍低いタンパク質発現を有した。コード領域内にアミノ酸の突然変異を含有するすべての軽鎖は、VHのペアリングを破壊させ、生産安定性を減少させる恐れがあることに留意されたい。したがって、望まれない免疫原性の可能性の減少に加えて、突然変異を含まない軽鎖IGKV1-39の使用が、特異性に寄与するさまざまなVH遺伝子の生産安定性および収率の改善に寄与することが期待される。実際、すべてがIGKV1-39とペアリングしたさまざまなVH遺伝子の形質移入により作製された安定なクローンは、広範囲に継代でき、Table 9(表9)に示す堅固な生産特性を未だ保有している。
完全ヒトVHおよびVL領域を発現するマウスの作製
本発明よるトランスジェニックマウスを、すでにヒトVH遺伝子座を含有するマウスと交配させる。ヒトVH遺伝子座を含む適切なマウスの例は、Taylorら、(1992)、Nucleic Acids Res 20: 6287~95頁; Lonbergら、(1994)、Nature 368: 856~9頁: Greenら、(1994)、Nat Genet 7: 13~21頁; Dechiaraら、(2009)、Methods Mol Biol 530: 311~24頁に開示されている。
関節リウマチなどの慢性炎症性疾患の治療のための、ヒトIL6を標的とする抗体の単離、特徴づけ、Oligoclonicsのフォーマット化および生産
ヒト組換えIL6を用いて免疫化したトランスジェニックマウス由来の脾臓VHレパートリーを、単一のヒトIGKV1-39-Cκ軽鎖(マウストランス遺伝子と同一)を有するファージディスプレイFabベクター中にクローン化し、免疫原であるヒトIL6に対するパニングに供した。パニングの2から4ラウンド後に得られたクローンを、それらの結合特異性に関して分析した。IL6-特異的Fab断片をコードするVH遺伝子を配列分析に供し、唯一のクローンを同定し、VH、DHおよびJHの利用を決定する。Fab断片をIgG1分子として再フォーマットし、一時的に発現させた。その後、唯一のクローンを結合アッセイにおける非競合に基づいてグループ化し、親和性および機能性分析に供する。次いで、最も強力な抗IL6 IgG1 mAbを、OligoclonicsフォーマットにさまざまなVH領域を含む、2、3、4または5種の重鎖の組合せとして、1種のIGKV1-39-Cベースのκ軽鎖と一緒に発現させ、IL-6との複合体の形成に関してインビトロで試験する。さらに、Oligoclonicsを、マウス由来ヒトIL-6のクリアランスに関してインビボで試験した。最も強力なクリアランス活性を有するOligoclonicsを選択し、マウスVH遺伝子を従来の方法に従ってヒト化した。ヒト化IgG1を哺乳動物細胞系に形質移入し、安定なクローンを作製する。最適なサブクローンを、マスターセルバンクの作製および臨床試験材料の作製のために選択する。
トランスジェニックマウスは、製造業者の指示書に従って、アジュバントSigma titerMaxを使用して、ヒトIL6により、2週間ごとに3回の免疫化を受ける。
最終免疫化の3日後、マウスから脾臓およびリンパ節を摘出し、70ミクロンのフィルターを介してPBS pH 7.4を含有するチューブ内に通し、単一細胞懸濁液を作製する。リンパ細胞の洗浄およびペレット化後、製造業者のプロトコルに従って全RNAの単離のために、細胞をTRIzol LS Reagent(Invitrogen)に懸濁し、1マイクログラムのRNA、Superscript III RTとdT20の組合せを使用して、製造業者の手順(Invitrogen)に従って、逆転写反応に供する。
ヒト組換えIL6を、5μg/mlの濃度でPBSに溶解し、MaxiSorp Nunc-Immuno Tube(Nunc 444474)に4℃において一晩コーティングする。コーティング溶液を廃棄後、チューブをPBS(ブロッキング緩衝液)中2%のスキムミルク(ELK)を用いて、室温(RT)において1時間ブロックする。平行して、0.5mlのファージライブラリを、1mlのブロッキング緩衝液と混合し、室温において20分間インキュベートする。ファージをブロッキング後、ファージ溶液を、IL6コーティングチューブに加え、ゆっくりと回転する基盤上で、RTにおいて2時間インキュベートし、結合させた。次に、チューブを、PBS/0.05% Tween-20を用いて10回洗浄し、その後、1mlの50mMグリシン-HCl、pH2.2と一緒に、RTにおいて10分間、回転盤上でインキュベートすることによってファージを溶出し、次いで、0.5mlの1M Tris-HCl、pH7.5を用いて収集した溶出液を直接中和した。
O.D. 0.4の5mlのXL1-Blue MRF(Stratagene)培養液を、収集したファージ溶液に加え、振とうせずに37℃において30分間インキュベートし、ファージを感染させた。細菌を、カルベニシリン/テトラサイクリン、4%グルコース2*TYプレート上に播種し、37℃において一晩成長させた。
ファージを、Kramerら、2003(Kramerら、2003。Nucleic Acids Res. 31(11): e59)により記載されたように、ヘルパーファージ株としてVCSM13を使用して成長させ、処理した。
ELISAプレートを、PBS中2.5マイクログラム/mlの濃度の100マイクロリットルのヒト組換えIL6/ウェルを用いて、4℃において一晩コーティングする。PBS中2マイクログラム/mlの濃度の100マイクロリットルのチログロブリンを用いてコーティングしたプレートを、陰性対照として使用する。ウェルを空にして、ペーパータオルで軽く拭くことによって乾かし、PBS-4%スキムミルク(ELK)で完全に満たし、室温で1時間インキュベートし、ウェルをブロックする。ブロッキング溶液を廃棄後、50μlのブロッキング溶液と予備混合したファージのミニプレップを加え、RTにおいて1時間インキュベートする。次に、PBS-0.05% Tween-20を用いた5回の洗浄ステップにより、未結合のファージを取り除く。結合したファージを、ウェルを100マイクロリットルの抗M13-HRP抗体コンジュゲート(ブロッキング緩衝液で1/5000に希釈)と一緒に、室温において1時間インキュベートすることによって検出する。遊離の抗体を、上記のような洗浄ステップを繰り返すことによって取り除き、その後、発色が可視化するまでTMB基質とインキュベートする。反応を、100マイクロリットルの2M H2SO4 /ウェルを加えることによって停止させ、ELISAリーダーで発光波長450nmにおいて分析する。
バックグラウンドシグナルの少なくとも3倍のシグナルを示すクローンを繁殖させ、DNAミニプレップ手順(Qiagen miniPrepの取り扱い説明書を参照されたい)に使用し、ヌクレオチド配列分析に供した。配列決定を、Big Dye 1.1キットに添付の取り扱い説明書(Applied Biosystems)に従って、ヒトIgG1重鎖のCH1領域の5'配列(FabディスプレイベクターMV1043中に存在する、図3および12)を認識するリバースプライマー(CH1_Rev1、Table 1(表1))を使用して実施した。マウスVH領域の配列を、DHおよびJH遺伝子セグメントの多様性に関して分析した。
ベクターMV1057(図12および22)を、トランス遺伝子(IGKV1-39)L鎖の断片を、ヒトIgG1およびκ定常領域を含有するベクターpcDNA3000Neo(Crucell、Leiden、The Netherlands)の誘導体内にクローン化することによって作製した。VH領域をMV1057内にクローン化し、全構築体に関するヌクレオチド配列を、標準的技術に従って検証する。得られた構築体を、HEK293T細胞中に一時的に発現させ、キメラIgG1を含有する上清を得、前記の標準的手順を使用して精製する(Throsby, M. 2006、J Virol 80: 6982~92頁)。
IgG1抗体を、上記のようなIL6コーティングプレートおよび抗ヒトIgGペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して、ELISAにおいて滴定する。エピトープ認識に基づくグループ抗体に対する競合ELISAを、IL6コーティングプレート上で、Fabファージと、IgG1またはIL6に対する市販の抗体(例えば、Abcamカタログ番号ab9324)とを一緒にインキュベートすることによって実施し、その後、抗M13ペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して結合Fabファージを検出する。
IL6に対する抗体の親和性を、Octet(ForteBio)についての定量的動態プロトコルを用いて決定した。抗体を、抗ヒトIgG Fc Captureバイオセンサー上に捕捉し、遊離のIL6に曝露し、個々の抗体のKdを算出するのにふさわしいソフトウェアを使用して分析する。
選択された抗体の、IL6とIL6受容体(IL6R)との結合を阻害する能力を試験するために、ELISAベースのアッセイを使用する。さまざまな濃度の抗体を、Naokoら、2007、Can. Res. 67: 817~875頁に記載のように、固定濃度(10ng/ml)のビオチン化IL6と混合する。IL6-抗体免疫複合体を、固定化IL6Rに加える。ビオチン化IL6とIL6Rとの結合を、ホースラッディシュペルオキシダーゼ-標識ストレプトアビジンを用いて検出する。ELISAシグナルの減少が、阻害の測定結果である。IL6とIL6Rとの結合阻害の陽性対照として、抗IL6R抗体(Abcamカタログ番号ab34351: クローンB-R6)または抗IL6抗体(Abcamカタログ番号ab9324)のどちらかを使用する。選択された抗IL6抗体のインビトロのブロッキング活性を、IL6依存性細胞系7TD1を使用して、増殖アッセイにおいて測定する。簡潔にいうと、細胞を、さまざまな濃度のヒトIL6と一緒に、抗IL6抗体を伴って、または伴わないでインキュベートする。IL6の利用可能な量が、増殖の程度を決定する。したがって、加えた抗体がIL6の結合をブロックした場合、増殖の読み出しは、非結合抗体対照と比較して減少する。増殖を、BrdU増殖キット(Rocheカタログ番号11444611001)を使用する、製造業者の指示書に従った、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)の、DNAへの取り込みによって測定する。
最も強力な抗IL6抗体を、個々のエピトープグループから選択する。これらの抗体を発現する発現構築体を、さまざまな比率の3つの非競合グループにおいてHEK293T細胞内に形質移入する(1:1:1; 3:1:1; 1:3:1; 1:1:3; 3:3:1; 1:3:3; 3:1:3; 10:1:1; 1:10:1; 1:1:10; 10:10:1; 1:10:10; 10:1:10; 3:10:1; 10:3:1; 1:10:3; 3:1:10; 10:1:3; 1:3:10)。上清を含有する抗体を、上記のように収集し、精製し、特徴付けた。
抗IL6 Oligoclonicsの、免疫複合体形成能力を測定するため、およびこれらの複合体を分析するために、Size Exclusion Chromatography(SEC)を、Min-Soo Kimら、(2007) JMB 374: 1374~1388頁)により開示された取り組みに従って使用し、さまざまな抗体とTNFαとで形成される免疫複合体を特徴付ける。さまざまなモル比の抗IL6 OligoclonicsをヒトIL6と混合し、4℃または25℃において20時間インキュベートする。混合物を、サイズ排除カラムに適合されたHPLC系において分析し、さまざまな溶出時間を、分子量基準を使用して分子量と相関させる。
リード抗IL6 Oligoclonicを、上で決定したインビトロおよびインビボの有効性に基づき選択する。マウスVH遺伝子を、標準的方法に従ってヒト化し、上記の発現ベクターにおいて、完全ヒトIGKV1-39軽鎖と組み合わせる。ヒト化方法の例は、リサーフェシング(Padlan, E. A.ら、(1991). Mol. Immunol.、28、489頁)、超ヒト化(Tan, P., D. A.ら、(2002) J. Immunol.、169、1119頁)およびヒトストリング内容最適化(Lazar, G. A.ら、(2007)、Mol. Immunol.、44、1986)などのパラダイムに基づく方法を含む。この3種の構築体を、所定の最適比(上記)で、選択圧G418下において標準的方法に従ってPER. C6細胞内に形質移入する。安定な、高生産性抗IL6 Oligoclonicクローンを選択し、作業用の条件付マスターセルバンクを作製する。
Claims (11)
- 再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする核酸をネズミ科哺乳動物のゲノム中に導入するステップを含む、トランスジェニックネズミ科哺乳動物の作製方法であって、
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は生殖細胞系列配列であり;
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域は少なくとも2種の異なる重鎖可変領域とペアリング可能であり;かつ、
前記核酸は軽鎖定常領域をさらにコードするか、又は、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする核酸は、前記ネズミ科哺乳動物が前記免疫グロブリン軽鎖可変領域及び内因性軽鎖定常領域を有する抗体を産生できるように導入されている、方法。 - トランスジェニックネズミ科哺乳動物がマウスである、請求項1に記載の方法。
- 再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする核酸が、単一のヒトV遺伝子セグメント及び単一のヒトJ遺伝子セグメントをコードする、請求項1または2に記載の方法。
- 内因性軽鎖をコードする内因性遺伝子座の少なくとも1つが、機能的にサイレンシングされる、請求項1または2に記載の方法。
- 内因性κ軽鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされる、請求項4に記載の方法。
- 再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域がIGKV1-39に基づく、請求項1または2に記載の方法。
- 再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域がIGKV1-39*01/ IGKJ1*01である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記トランスジェニックネズミ科哺乳動物を、再構成されていないヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座および機能的に不活性化された内因性重鎖の免疫グロブリン遺伝子座を有するネズミ科哺乳動物と交配させるステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 軽鎖定常領域が、マウスまたはヒトの軽鎖定常領域である、請求項1または2に記載の方法。
- 軽鎖定常領域が、ヒトの軽鎖定常領域である、請求項9に記載の方法。
- 請求項1又は2に記載の方法により得ることができるトランスジェニックネズミ科哺乳動物。
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