JP2004008218A - 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 - Google Patents

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Abstract

【課題】　ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質のヒト可変（Ｖ）領域、連結（Ｊ）領域、および定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む、免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖トランスジェン構成物を提供すること。
【解決手段】　Ｉｇタンパク質のＶ領域、Ｊ領域、および定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む、Ｉｇ軽鎖トランスジェン構成物であって、これらの配列は、転写調節配列に作用可能に連結されており、そして非ヒトトランスジェニック動物に組み込まれた場合に、生体内で遺伝子再配列を受けて、ヒト軽鎖ポリペプチドをコードする再配列された遺伝子を産生し得、ここでこの構成物は、以下：機能的な可変ＶＫ遺伝子セグメント、機能的な連結ＪＫ領域遺伝子セグメント、ならびに少なくとも１つの機能的な定常ＣＫ領域遺伝子セグメントおよびヒト３’Ｋエンハンサーのうちの少なくとも１つを含む。
【選択図】　なし

Description

　（技術分野）
　本発明は、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物、そのようなトランスジェニック動物を産生するのに使うトランスジェン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えにおいて異種Ｄ遺伝子を機能的に再配列させることのできるトランスジェン、異種抗体を産生することのできる不死化Ｂ細胞、多数のイソタイプの異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトランスジェン、内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現を不活性化または抑制する方法およびそのためのトランスジェン、生殖細胞系列の再配列された可変領域配列に比較すると可変領域配列が体細胞変異を含んで成る異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトランスジェン、並びにヒト一次配列を有する抗体を産生し且つヒト抗原に結合するトランスジェニック非ヒト動物に関する。
　（発明の背景）
　ヒトにおけるモノクローナル抗体の生体内治療および診断用途の開発に直面する主な障害の１つは、非ヒト免疫グロブリンの本質的免疫原性である。例えば、免疫寛容性のヒト患者に治療量の齧歯類モノクローナル抗体を投与すると、患者は齧歯類免疫グロブリン配列に対して抗体を産生し、それらのヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は治療抗体を中和し、急性毒性を引き起こし得る。よって、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗体と反応性であるヒト免疫グロブリンを作製することが望ましい。
　モノクローナル抗体を作製するための現在の技術は、動物（通常はラットまたはマウス）を抗原に予備暴露するか、または抗原で感作せしめ、該動物からＢ細胞を収得し、そしてハイブリドーマクローンのライブラリーを作製することを伴う。ハイブリドーマ集団を抗原結合特異性（イディオタイプ）についてスクリーニングし、更に免疫グロブリンクラス（イソタイプ）についてもスクリーニングすることにより、所望の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することが可能である。
　しかしながら、モノクローナル抗体を作製する現行法を、ヒト抗原に対して結合特異性を有するヒト抗体を産生せしめる目的に適用すると、ヒトは典型的には自己抗原に対しては免疫応答を生じないであろうから、ヒト免疫グロブリンを産生するＢリンパ球を得ることは深刻な妨げになる。
　よって、ヒト抗原と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を作製する現行法は明らかに不十分である。ハイブリドーマを作製するためのＢ細胞源として非ヒト種を使用する場合にも、真の自己抗原に対するモノクローナル抗体を作製することに同じ制限が当てはまる。
　機能的異種免疫グロブリントランスジェンを含有するトランスジェニック動物の作製は、自己抗原と反応する抗体を産生させることができる方法である。しかしながら、療法上有用な抗体の発現、またはそのような抗体を産生するハイプリドーマクローンを得るためには、トランスジェニック動物がＢリンパ球発生過程を経て成熟することのできるトランスジェニックＢ細胞を産生しなければならない。そのような成熟はトランスジェニックＢ細胞上の表面ＩｇＭの存在を必要とするが、療法利用にはＩｇＭ以外のイソタイプが所望される。よって、機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を受けて組換え多様性と接合多様性を生じることのできるトランスジェンおよびそのようなトランスジェンを有する動物が要求される。更に、そのようなトランスジェンとトランスジェニック動物は、好ましくは、Ｂ細胞成熟に必要とされる第一のイソタイプから優れた療法的効用を有する次なるイソタイプヘのイソタイプ転換を促進するシス作用性配列を含有する。
　多数の実験は、Ｉｇ遺伝子再配列に必要な特異的ＤＮＡ配列を決定するためのトランスフェクトされた細胞系の使用を報告している〔ＬｅｗｉｓおよびＧｅｌｌｅｒｔ（１９８９），Ｃｅｌｌ，５９，５８５−５８８〕。そのような報告は推定上の配列を同定し、そして再配列に使う組換え酵素へのそれらの配列の近づきやすさ（ａｃｃｅｓｉｂｉｌｉｔｙ）が転写により変更されると結論づけている〔ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓおよびＡｌｔ（１９８５），Ｃｅｌｌ，４０，２７１−２８１〕。Ｖ（Ｄ）Ｊ結合のための配列は、報告によれば、高度に保存されたほぼ回文式のヘプタマーと、１２または２３ｂｐのいずれかのスペーサーにより隔てられたあまり保存されていない高ＡＴナノマーである〔Ｔｏｎｅｇａｗａ（１９８３），Ｎａｔｕｒｅ，３０２，５７５−５８１；Ｈｅｓｓｅら（１９８９），Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｄｅｖ．，３，１０５３−１０６１〕。効率的組換えは、伝えられるところによれば、異なる長さのスペーサー領域を有する組換えシグナル配列を含む部位の間でのみ起こる。
　Ｉｇ遺伝子再配列は、組織培養細胞において研究されているが、トランスジェニックマウスでは詳しく研究されていない。マウス中に導入された再配列試験構成物を記載している少数の報告が発表されているに過ぎない〔Ｂｕｃｈｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６；４０９−４１１（１９８７）（再配列されていないニワトリλトランスジェン）；Ｇｏｏｄｈａｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４；４２２９−４２３３（１９８７）（再配列されていないウサギκ遺伝子）；およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：６７０９−６７１３（１９８９）（ハイブリッドマウス−ヒト重鎖）〕。しかしながら、そのような実験の結果は変動的であり、場合によって、トランスジェンの不完全なまたは最小の再配列を生じることがある。
　更に、分子のＦｃ部分により抗体分子の多様な生物学的機能、例えばＦｃεを介したマスト細胞または好塩基球との相互作用、およびＦｃμまたはＦｃγによる補体の結合、が発揮され、イソタイプの変化により特定の特異性を有する機能的に多様な抗体を生成せしめることが更に望ましい。
　異種抗体の１または複数の鎖をコードするトランスジェンを含むトランスジェニック動物は作製されているけれども、好結果のイソタイプスイッチを受ける異種トランスジェンについての報告は全くない。イソタイプをスイッチすることのできないトランスジェニック動物は単一のイソタイプの異種抗体を産生するものに限定され、より詳しくは、Ｂ細胞成熟に不可欠であるイソタイプ、例えばＩｇＭとおそらくＩｇＤを産生するものに限定され、それらの抗体は療法的効用が限定され得る。
　上記に基づくと、第二の種において産生される第一の種の遺伝子配列によってコードされる異種抗体を効率的に産生せしめる方法に対する要求が存在することは明らかである。より詳しくは、組換え多様性に貢献するＤセグメントの全部または一部を含む機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子再配列を受けることができる異種免疫グロブリントランスジェンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在する。更に、（１）機能的なＢ細胞発達が起こり、そして（２）療法上有用な異種抗体が産生されるようにＶ−Ｄ−Ｊ組換えとイソタイプスイッチングを支えることができるトランスジェンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存在する。抗体が設計される特定の種において療法または診断用のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができるＢ細胞源に対する要求も存在する。機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよび／またはイソタイプスイッチングを受けることができる異種免疫グロブリントランスジェンはそれらの要求を満たすことができる。
　従って、本発明は以下を提供する。
　（１）単離された免疫グロブリン重鎖トランスジェンであって、次の式：
（ＶＨ）ｘ−（Ｄ）ｙ−（ＪＨ）ｚ−（ＳＤ）ｍ−（Ｃ１）ｎ−［（Ｔ）−（ＳＡ）ｐ−（Ｃ２）］ｑ（上式中、ｘ，ｙ，ｚ，ｍ，ｎ，ｐおよびｑは整数であり、ｘは２〜１００、ｎは１〜１０、ｙは２〜５０、ｐは１〜１０、ｚは１〜５０、ｑは０〜５０、そしてｍは０〜１０である）
のＤＮＡ配列を含んで成るポリヌクレオチドの少なくとも１つの組み込まれたコピーを含有するトランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞において発現される前記免疫グロブリン重鎖トランスジェン。
　（２）前記ポリヌクレオチドが、機能的に再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ配列中に組み込まれ得る少なくとも１つの異種Ｄ遺伝子セグメントを含んで成る、項目１のトランスジェン。
　（３）前記異種ＤＮＡセグメントが少なくとも１つのヒトＤ遺伝子を含んで成る、項目１のトランスジェン。
　（４）前記ポリヌクレオチドがヒトμＣＨ遺伝子セグメントとヒトγ１ＣＨ遺伝子セグメントを含んで成る、項目１のトランスジェン。
　（５）ｑが少なくとも１であり、ｍが少なくとも１であり、ｎが少なくとも１であり、そして前記ポリヌクレオチドが生殖細胞スイッチ配列のすぐ上流の少なくとも約５０塩基対のセグメントを含んで成る、項目１のトランスジェン。
　（６）前記ポリヌクレオチドがヒト生殖細胞γ１スイッチ配列のすぐ上流の約２００塩基対の配列を含んで成る、項目１のトランスジェン。
　（７）前記ＳＤセグメントがγ１スイッチ配列である、項目１のトランスジェン。
　（８）前記ポリヌクレオチドがヒト生殖細胞γ１スイッチ配列の上流の約２００塩基対を含んで成り、そして前記２００塩基対がヒトγ１スイッチ配列に作用可能に連結される、項目１のトランスジェン。
　（９）前記Ｄ領域が異種Ｄ遺伝子のみを含んで成る、項目１のトランスジェン。
　（１０）前記Ｄ領域がヒトＤ遺伝子のみを含んで成る、項目９のトランスジェン。
　（１１）前記ポリヌクレオチドが生体内で機能的に再配列され、認識可能なＤ領域遺伝子配列を含む再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子セグメントを生じる、項目１のトランスジェン。
　（１２）前記非ヒト動物の生殖細胞中に項目１のトランスジェンを含んで成るトランスジェニック非ヒト動物。
　（１３）前記トランスジェンが再配列されている、項目１２のトランスジェニック非ヒト動物。
　（１４）前記トランスジェンが再配列されていない、項目１２のトランスジェニック非ヒト動物。
　（１５）前記Ｂ細胞が異種抗体を産生する、項目１４のトランスジェニック非ヒト動物。
　（１６）前記Ｂ細胞が複数のイソタイプの異種抗体の集団を産生する、項目１５のトランスジェニック非ヒト動物。
　（１７）前記トランスジェンがＶＨ，Ｄ，ＪＨおよびＣＨ領域をコードする、項目１２のトランスジェニック非ヒト動物。
　（１８）前記非ヒト動物が齧歯類である、項目１２のトランスジェニック非ヒト動物。
　（１９）前記動物の血清が、認識可能なＤ領域遺伝子配列を含むヒト抗体を含んで成る、項目１２のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２０）前記動物の少なくとも１つのリンパ球が異種免疫グロブリン鎖をコードするｍＲＮＡを含有する、項目１２のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２１）前記ｍＲＮＡが認識可能なＤ領域遺伝子配列を含有する、項目２０のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２２）前記ｍＲＮＡが機能的に再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ配列を含有する、項目２１のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２３）前記トランスジェニック動物が、ヒト配列μ鎖を含んで成り且つ抗原に特異的に結合する異種抗体を含んで成る、項目１２のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２４）ヒト配列γ鎖を含んで成り且つ抗原に特異的に結合する異種抗体を更に含んで成る、項目２３のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２５）前記抗原がヒト抗原である、項目２４のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２６）前記ヒト抗原がＣＥＡまたはヒト血液細胞抗原である、項目２５のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２７）前記トランスジェニック動物が、免疫グロブリントランスジェンによりコードされる可変領域のＣＤＲ領域中にクラスターを形成した体細胞変異を有するｍＲＮＡ種の集団を含有するリンパ系組織を更に含んで成る、項目１のヒトトランスジェンを含んで成るトランスジェニック非ヒト動物。
　（２８）前記免疫グロブリントランスジェンがＨＣ１に相当する重鎖小遺伝子座である、項目２７のトランスジェニック非ヒト動物。
　（２９）Ｂ細胞を不死化することができる第二の細胞と融合されたトランスジェニック非ヒトＢ細胞を含んで成るハイブリドーマであって、前記非ヒト動物にとって異種であるモノクローナル抗体を産生する前記ハイブリドーマ。
　（３０）前記異種抗体が、認識可能なＤ領域遺伝子配列を含むヒト重鎖を含んで成る、項目２９のハイブリドーマ。
　（３１）前記Ｂ細胞がマウス起源のものである、項目２９のハイブリドーマ。
　（３２）前記モノクローナル抗体が少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和力でヒト抗原に結合する、項目２９のハイブリドーマ。
　（３３）項目２９のハイブリドーマにより産生されるヒトモノクローナル抗体。
　（３４）検出可能な異種抗体を含んで成る血清を有し且つ少なくとも１つの抑制された内因性免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニック非ヒト動物。
　（３５）トランスジェニック非ヒト動物から異種免疫グロブリンを生産せしめる方法であって、ここで前記動物は少なくとも１つの項目１のトランスジェンの生殖細胞コピーを含んで成るゲノムを有し、
内因性免疫グロブリン遺伝子座を抑制し；
該動物を予め選択された抗原と接触せしめ；そして
前記異種免疫グロブリンを収集する；
ことを含んで成る方法。
　（３６）前記抑制がアンチセンスポリヌクレオチドにより引き起こされる、項目３５に記載の方法。
　（３７）前記アンチセンスポリヌクレオチドが組み込まれたアンチセンストランスジェンから転写される、項目３６に記載の方法。
　（３８）前記アンチセンストランスジェンの転写が、第二の配列に連結されたアンチセンス配列を含有する転写物を生成する、項目３７に記載の方法。
　（３９）前記非ヒト動物が、少なくとも１つの軽鎖免疫グロブリントランスジェンの生殖細胞コピーを含んで成るゲノムを有する、項目３７に記載の方法。
　（４０）トランスジェニック非ヒト動物において少なくとも１つの内因性免疫グロブリン遺伝子座を抑制する方法であって、
アンチセンストランスジェンを非ヒト動物に導入し、アンチセンストランスジェンを有する非ヒトトランスジェニック動物を作製し；
前記アンチセンストランスジェンから生体内でアンチセンスＲＮＡを転写し；
前記アンチセンスＲＮＡを、内因性免疫グロブリン配列を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズせしめ；そして
内因性免疫グロブリン鎖の発現を抑制する
段階を含んで成る方法。
　（４１）前記アンチセンストランスジェンが、内因性κ鎖免疫グロブリン遺伝子配列に相同であるヌクレオチド配列を含有する、項目４０に記載の方法。
　（４２）前記アンチセンストランスジェンが、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子配列に相同であるヌクレオチド配列を含有する、項目４０に記載の方法。
　（４３）内因性免疫グロブリン遺伝子を不活性化する方法であって、標的指向ベクターを内因性免疫グロブリン遺伝子中に組み込み；そして
組み込まれた標的指向ベクターを有する細胞について選択する
段階を含んで成る方法。
　（４４）前記組み込まれた標的指向ベクターのコピーを有する非ヒト動物の系統を作製する段階を更に含んで成る、項目４３に記載の方法。
　（４５）前記内因性免疫グロブリン遺伝子が軽鎖遺伝子である、項目４３に記載の方法。
　（４６）前記軽鎖遺伝子がκ軽鎖遺伝子である、項目４５に記載の方法。
　（４７）前記内因性免疫グロブリン遺伝子が重鎖遺伝子である、項目４３に記載の方法。
　（４８）前記内因性免疫グロブリン遺伝子がマウス免疫グロブリン遺伝子である、項目４３に記載の方法。
　（４９）前記非ヒト動物がマウスである、項目４４に記載の方法。
　（５０）前記マウスが項目１のヒト免疫グロブリントランスジェンを更に含んで成る、項目４９に記載の方法。
　（５１）前記細胞が胎児性幹細胞である、項目４３に記載の方法。
　（５２）不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有する非ヒト動物を作製する方法であって、
項目４４の方法により作製された非ヒト動物の系統を繁殖させ；そして
不活性化された免疫グロブリン遺伝子について同型接合性である個々の非ヒト動物子孫を同定する
段階を含んで成る方法。
　（５３）前記子孫が１つの不活性化された重鎖免疫グロブリン遺伝子と少なくとも１つの不活性化された軽鎖免疫グロブリン遺伝子を有する、項目５２に記載の方法。
　（５４）不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物。
　（５５）組み込まれた標的指向ベクターが生殖細胞ＤＮＡ中に存在する、項目５４の非ヒト動物。
　（５６）軽鎖免疫グロブリン遺伝子が不活性化されている、項目５５の非ヒト動物。
　（５７）重鎖免疫グロブリン遺伝子が不活性化されている、項目５５の非ヒト動物。
　（５８）少なくとも１つの不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子について同型接合性である、項目５５の非ヒト動物。
　（５９）免疫グロブリン遺伝子配列と実質的に同じであるポリヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含んで成るアンチセンストランスジェン。
　（６０）項目５９のアンチセンストランスジェンを有するトランスジェニック非ヒト動物。
　（６１）機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座と異種免疫グロブリン重鎖トランスジェンを含んで成るトランスジェニック非ヒト動物であって、抗原による免疫化の後で抗体応答を生じるトランスジェニック非ヒト動物。
　（６２）前記機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座がＪＨ領域相同組換え破壊物であり、前記異種免疫グロブリン重鎖トランスジェンがＨＣｌヒト小遺伝子トランスジェンであり、そして前記抗原がヒト抗原である、項目６１のトランスジェニック非ヒト動物。
　（６３）前記抗体応答が、ヒトμ鎖含有免疫グロブリンとヒトγ鎖含有免疫グロブリンを含んで成る抗体集団を含んで成る、項目６１のトランスジェニック非ヒト動物。
　（６４）前記異種抗体が、ＣＤＲに密集している可変領域中の体細胞変異を含む異種免疫グロブリンの集団を含んで成る、項目６３のトランスジェニック非ヒト動物。
　（６５）前記抗原が、ヒト血液細胞表面抗原、ＫＬＨおよびヒトＣＥＡから成る群より選択される、項目６３のトランスジェニック非ヒト動物。
　上記目的に従って、異種抗体、例えばヒト抗体、を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
　更に、異種抗体を発現することができるそのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞であって、特定抗原に特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化されている前記Ｂ細胞を提供することが本発明の目的である。
　この上記目的に従って、そのような異種モノクローナル抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞を提供することが本発明の更なる目的である。
　更にまた、上述の非ヒトトランスジェニック動物の製造に有用な再配列されていないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジェンを提供することが本発明の目的である。
　更にまた、トランスジェニック動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊する方法を提供することが本発明の目的である。
　更にまた、上述のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導する方法を提供することが本発明の目的である。本発明の更なる目的は、本発明の１または複数のトランスジェンを作製するために使われる免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントレパートリーを作製する方法を提供することである。
　上記の参考文献は、単に本出願の出願日より前のそれらの開示のために提供される。本発明者らが先行発明によってそのような開示より以前は権利がないと認めることと解釈してはならない。
　（発明の要約）
　異種抗体、例えばヒト抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。そのような異種抗体は、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＭ，ＩｇＡ１，ＩｇＡ２，ＩｇＡｓｅｃ，ＩｇＤまたはＩｇＥを含む様々なイソタイプのものであることができる。そのようなトランスジェニック非ヒト動物が免疫応答を行うには、Ｂ細胞の発達と抗原刺激成熟を果たすためにトランスジェニックＢ細胞および前Ｂ細胞が表面結合型免疫グロブリン、特にＩｇＭ（ことによるとＩｇＤ）イソタイプのものを産生することが必要である。そのようなＩｇＭ（またはＩｇＤ）表面結合型免疫グロブリンの発現はＢ細胞発達の抗原刺激成熟期の間にのみ要求され、一時期には一回スイッチしたイソタイプだけが産生されるが、成熟Ｂ細胞は他のイソタイプを産生し得る。
　典型的には、Ｂ細胞系統の細胞は一時期に単一のイソタイプだけを産生するだろうが、μＳ（分泌型μ）およびμＭ（膜結合型μ）型、並びにμおよびδ免疫グロブリン鎖で天然に起こるような、シスまたはトランス二者択一ＲＮＡスプライシングは、単一細胞による複数のイソタイプの同時代発現をもたらし得る。従って、複数のイソタイプの異種抗体、特に療法上有用なＩｇＧ，ＩｇＡおよびＩｇＭイソタイプの異種抗体を産生せしめるためには、イソタイプスイッチングが起こることが必要である。そのようなイソタイプスイッチングは古典的クラススイッチであってもよく、または１もしくは複数の非古典的イソタイプスイッチ機構から生じてもよい。
　本発明は、異種免疫グロブリントランスジェンおよびそのようなトランスジェンを有するトランスジェニック動物を提供し、ここで該トランスジェニック動物はイソタイプスイッチを受けることにより複数のイソタイプの異種抗体を産生することができる。古典的イソタイプスイッチは、トランスジェン中の少なくとも１つのスイッチ配列領域を巻き込む組換え現象によって起こる。非古典的イソタイプスイッチは、例えば、ヒトσμ配列とヒトΣμ配列の間の相同組換え（δ一関連欠失）により起こり得る。別の非古典的スイッチ機構、例えば特にトランスジェン間および／または染色体間組換えは、イソタイプスイッチを果たすことができる。そのようなトランスジェンおよびトランスジェニック動物は、抗原刺激型Ｂ細胞成熟に必要である第一の免疫グロブリンイソタイプを産生し、そして療法的および／または診断的効用を有する１または複数の第二の異種イソタイプをコードし産生するようにスイッチすることができる。よって本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、一態様では、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列によりコードされ且つ高親和力で特異的ヒト抗原に結合するＩｇＧ，ＩｇＡおよび／またはＩｇＥ抗体を産生することができる。
　本発明は、様々なイソタイプの異種抗体を発現することのできるトランスジェニック動物からのＢ細胞にも関し、そのようなＢ細胞は、特定抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化される。そのようなＢ細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞は、そのような異種モノクローナル抗体の１つの源として働くことができる。
　本発明は、上述の非ヒトトランスジェニック動物中でまたはそのようなトランスジェニック動物から外植されたＢ細胞系統のリンパ球中で生体内イソタイプスイッチを受けることができる、再配列されていないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジェンを提供する。そのようなイソタイプスイッチは自然に起こるか、またはトランスジェニック動物もしくは外植されたＢ細胞系統リンパ球をイソタイプスイッチ促進剤、例えばＴ細胞由来のリンホカイン（例えばＩＬ−４およびＩＦＮγ）で処理することによって誘導することができる。
　更に、本発明は、上述のトランスジェニック非ヒト動物中での異種抗体産生を誘導する方法を包含し、ここでそのような抗体は様々なイソタイプのものであることができる。それらの方法は、異種抗体、特にスイッチされたイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ）の異種抗体の産生のためにトランスジェニック非ヒト動物において抗原刺激型免疫応答を生じさせることを含む。
　本発明は、トランスジェニック動物中で産生される異種免疫グロブリンおよび前記動物のＢ細胞から誘導されるモノクローナル抗体クローンが多様なイソタイプのものであり得るように、トランスジェンがイソタイプスイッチを果たす配列を含む方法を提供する。
　本発明は更に、特定のイソタイプ間のスイッチが、生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座中で典型的に起こるよりもずっと高頻度もしくは低頻度でおこるかまたは異なる時間順序で起こるように、トランスジェンのイソタイプスイッチを促進する方法を提供する。スイッチ領域は、様々なＣＨ遺伝子から移植しそしてトランスジェン構成物中の別のＣＨ遺伝子に連結せしめることができる。そのような移植スイッチ配列は典型的には結合されたＣＨ遺伝子とは独立的に機能し、そのため、トランスジェン構成物中でのスイッチは結合されたスイッチ領域の元の機能であろう。あるいはまた、スイッチ配列と共に、δ−結合欠失配列が様々なＣＨ遺伝子に連結され、２つのδ−結合欠失配列の間の配列の欠失により非古典的スイッチを果たすことができる。よって、特定のＣＨ遺伝子が異なるスイッチ配列に連結され、それによって天然に結合されたスイッチ領域を使用した時に起こるよりも頻繁にスイッチされるトランスジェンを作製することができる。
　本発明はまた、免疫グロブリントランスジェンを含有するトランスジェニック動物においてトランスジェン配列のイソタイプスイッチが起こったかどうかを決定する方法を提供する。
　本発明は、その内の幾つかは生殖細胞の免疫グロブリン遺伝子座配列（欠失を含んでもよい）のサブセットを含有する免疫グロブリントランスジェン構成物、および免疫グロブリントランスジェン構成物の作製方法を提供する。本発明は、免疫グロブリントランスジェンの容易なクローニングと作製のための特別な方法であって、２つのユニークＮｏｔＩ部位により隣接されたユニークＸｈｏＩおよびＳａ１Ｉ制限部位を使用するベクターを必要とする方法を包含する。
　本発明のトランスジェンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る重鎖トランスジェンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジェンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されていないようなトランスジェンが作製される。そのような再配列されていないトランスジェンは、トランスジェニック非ヒト動物が抗原に暴露されると、前記動物中での該遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）並びに生成した再配列された免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の発現を可能にする。
　本発明の一観点によれば、異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジェンは、再配列された異種ＤＮＡの比較的大きい断片を含んで成る。そのような断片は、典型的には異種免疫グロブリン遺伝子座からのＣ，Ｊ（および重鎖の場合にはＤ）セグメントの実質的部分を含む。加えて、そのような断片は可変遺伝子セグメントの実質的部分も含んで成る。
　一態様では、そのようなトランスジェン構成物は、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、組換えシグナル、異種ＤＮＡから誘導された対応配列等を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を、本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジェン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列を有するトランスジェン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを組み合わせることができる。
　本発明の方法では、生殖細胞再配列されていない軽鎖および重鎖免疫グロブリントランスジェン−即ちＤ細胞分化中にＶＤＪ結合を受けるもの−を抗原と接触せしめ、二次レパートリーＢ細胞における異種抗体の産生を誘導する。
　本発明に使われる非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するベクターおよび方法も本発明に包含される。そのようなベクターおよび方法は、トランスジェン、好ましくはポジティブ−ネガティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）選別ベクターを使用し、該ベクターは、それが本発明において使用する非ヒト動物にとって内因性である重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンをコードする遺伝子セグメントのクラスの機能的破壊を標的するように構成される。そのような内因性遺伝子セグメントとしては、多様性領域、連結領域および定常領域遺伝子セグメントが挙げられる。本発明のこの観点によれば、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターを少なくとも１つの非ヒト動物の胎児性幹細胞と接触させた後、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターが相同組換えによって非ヒト動物のゲノム中に組み込まれている細胞を選択する。移植後、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、該ベクターの相同組み込みの結果として、免疫グロブリン媒介の免疫応答を開始することが実質的に不可能である。そのような免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全症の研究に使うことができ、または異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジェンの受容体として使うことができる。
　本発明はまた、内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊することなく、１または複数の種の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用なベクター、方法および組成物を提供する。そのような方法は、トランスジェンによってコードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を許容しながら、トランスジェンによってコードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用である。内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座の遺伝的破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖発現の抑制は、破壊された内因性Ｉｇ遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック動物の確立に必要である時間のかかる飼育を必要としない。内因性Ｉｇ遺伝子破壊法に比較した時の抑制法の追加の利点は、ある態様では、個体動物内で鎖抑制が可逆的であることである。例えば、Ｉｇ鎖抑制は、（１）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡをコードし発現するトランスジェン、（２）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、および（３）内因性Ｉｇ鎖ポリペプチドに特異的に結合する免疫グロブリン、を使って達成することができる。
　本明細書中に引用された参考文献は本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。先行発明によって本発明者らがそのような開示よりも先であるという権利を与えられることを認めるものと解釈してはならない。
　表１はベクターｐＧＰｅの配列を示す。
　表２は遺伝子ＶＨ４９．８の配列を示す。
　表３は本発明のトランスジェニックマウスの血清中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧの検出を示す。
　表４はＶＤＪ接合の配列を示す。
　表５は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＪセグメントに対する、ｐＨＣ１トランスジェンによってコードされる転写物中に組み込まれたＪセグメントの分布を示す。
　表６は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＤセグメントに対する、ｐＨＣ１トランスジェンによってコードされる転写物中に組み込まれたＤセグメントの分布を示す。
　表７は、ｐＨＣ１トランスジェニックマウス中またはヒトＰＢＬ中のフレーム内ＶＤＪ接合を有する転写物からのＣＤＲ３ペプチドの長さを示す。
　表８は、ｐＨＣ１トランスジェニックマウスから分析された３０クローンのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。
　表９は、指摘の実験において使用したライン１１２のトランスジェニックマウスを示す；（＋）は各トランスジェンの存在を示し、（＋＋）は該動物がＪＨＤ突出トランスジェンについてホモ接合性であることを示す。
　図４６は、同時に注入された２つの重複断片の間での相同組換えによる軽鎖小遺伝子座の形成を示す。
　（詳細な説明）
　上述したように、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗原と反応するヒト免疫グロブリンを製造することが望ましい。しかしながら、ヒト抗原と特異的に結合するヒト免疫グロブリンは問題がある。
　第一に、Ｂ細胞源として働く免疫処置動物が、与えられた抗原に対して免疫応答を生じなければならない。動物が免疫応答を生じるには、与えられた抗原が外来でなければならず、且つ動物が該抗原に寛容性でなければならない。よって、例えばヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗体を製造しようと所望するならば、自己寛容性がヒトタンパク質に対する実質的な免疫応答を生じるのを妨げるだろう。何故なら、免疫原性となり得る該抗原の唯一のエピトープが、ヒト集団の中のタンパク質の多形性に由来するもの（同種異系間エピトープ）であろうからである。
　第二に、ハイブリドーマを形成させるためのＢ細胞の源として働く動物（一例ではヒト）が真正自己抗原に対して免疫応答を生じるならば、該動物において深刻な自己免疫病が発生し得る。ハイブリドーマ用のＢ細胞源としてヒトを使う場合には、そのような自己免疫化は現代の道徳的規範により非論理的であると見なされる。
　ヒト抗原と特異的に反応するヒト抗体を得るのに利用することができる１つの方法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジェン構成物を含有するトランスジェニックマウスの製造である。簡単に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の全部もしくは部分を含有するトランスジェン、またはヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の必須機能要素を含んで成る合成「小遺伝子座」（下記、並びに１９９０年８月２９日に出願された同時係属米国出願第０７／５７４，７４８号および１９９０年８月３１日に出願された同第０７／５７５，９６２号、並びに１９９１年８月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１８５号中に記載されている）を含有するトランスジェンを使ってトランスジェニック非ヒト動物を作製する。そのようなトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する能力を有し、その上、ヒト抗原に対して免疫応答を生じることができるだろう。よって、そのようなトランスジェニック非ヒト動物は特定のヒト抗原と反応する免疫血清の源として働くことができ、そのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞をミエローマ細胞と融合せしめることにより、ヒト抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを製造することができる。
　様々な形の免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの製造は以前に報告されている。トランスジェニックマウスの製造には、再配列されたマウス免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子が使われている。加えて、μまたはγ１定常領域を含む機能的に再配列されたヒトＩｇ遺伝子がトランスジェニックマウス中で発現されている。しかしながら、トランスジェンが再配列されていない（再配列されないＶ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ）免疫グロブリン遺伝子を含んで成る実験は変動的であり、場合によって、トランスジェンの不完全なまたは最少の再配列を生じることがあった。しかし、トランスジェン中のＣＨ遺伝子間での好結果のイソタイプスイッチを受ける再配列されたまたは再配列されていない免疫グロブリントランスジェンの例は１つも報告されていない。
　（定義）
　本明細書中で使用する時、用語「抗体」は、少なくとも２本の同一の軽ポリペプチド鎖と２本の同一の重ポリペプチド鎖を含んで成る糖タンパク質を言う。重および軽ポリペプチド鎖は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領域（通常はポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重および軽ポリペプチド鎖は各々、ポリペプチド鎖の定常領域（通常はカルボキシ末端部分）も含んで成り、その配列の一部は、免疫系の種々の細胞、或る種の食細胞および典型的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒介する。
　本明細書中で使用する時、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニック非ヒト動物から成らない生物において見つかるものに対応するアミノ酸配列を有するかまたはＤＮＡ配列をコードする抗体である。
　本明細書中で使用する時、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物体起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を言う。例えば、マウス軽鎖と会合されたヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
　本明細書中で使用する時、「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を言う。本明細書中で使用する時、「イソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはイソタイプが或るＩｇクラスから別のＩｇクラスのうちの１つへ変化する現象を言う。
　本明細書中で使用する時、「非スイッチイソタイプ」は、イソタイプスイッチが起こらなかった時に産生される重鎖のクラスを言う。非スイッチイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、典型的には機能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流の最初のＣＨ遺伝子である。
　本明細書中で使用する時、用語「スイッチ配列」は、スイッチ組換えを招くそれらのＤＮＡ配列を言う。「スイッチ供与体」配列、典型的にはμスイッチ領域は、スイッチ組換え中に欠失されるであろう定常領域の５’（即ち上流）にあるだろう。「スイッチ受容体」領域は、欠失されるであろう定常領域と代替定常領域（例えばγ，ε等）との間であろう。組換えが常に起こる特異部位は１つもないので、典型的には最終遺伝子配列は構成物から予想不可能であろう。本明細書中で使用する時、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より詳しくは免疫グロブリンタンパク質に共有結合している炭化水素単位のパターンとして定義される。当業者が異種抗体のグリコシル化パターンをトランスジェンのＣＨ遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種の中のグリコシル化パターンに一層類似していると認識するような時には、異種抗体のグリコシル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質上類似していると特徴付けることができる。
　本明細書中で使用する時、「特異的結合」は、抗体が（１）予め決定された抗原に少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和力で結合し、そして（２）予め決定された抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合親和力よりも少なくとも２倍大きい親和力で、予め決定された抗原に優先的に結合する性質を言う。
　本明細書中で使用する時「天然に存在する」という用語は、対象物に用いた時に対象物が天然に見つけることができることを言う。例えば、天然源から単離することができ且つ人間によって実験室で故意に変更されていない、生物体（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、「天然に存在する」ものである。
　本明細書中で使用する時「再配列された」という用語は、Ｖセグメントがそれぞれ本質的に完全なＶＨまたはＶＬドメインをコードする構造においてＤ−ＪまたはＪセグメントのすぐ近くに位置する重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を言う。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は生殖細胞ＤＮＡとの比較によって同定することができ；再配列された遺伝子座は少なくとも１つのヘプタマー／ナノマー相同性要素を有するだろう。
　Ｖセグメントに関して本明細書中で使用する時、「再配列されていない」または「生殖細胞配置」なる用語は、ＤまたはＪセグメントのすぐ近くになるようにＶセグメントが組換えられない配置を言う。
　（異種抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物）
　異種抗体レパートリーによる外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物のデザインは、トランスジェニック動物の内部に含まれた異種免疫グロブリントランスジェンがＢ細胞発達経路を通して正しく機能することを必要とする。好ましい態様では、異種重鎖トランスジェンの正しい機能がイソタイプスイッチを含む。従って、イソタイプスイッチを生じ且つ下記のうちの１つまたは複数をもたらすように本発明のトランスジェンが作製される：（１）高レベルで且つ細胞型特異的な発現、（２）機能的な遺伝子再配列、（３）対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル形質導入、（６）体細胞高度突然変異（ｈｙｐｅｒ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）、および（７）免疫応答の間のトランスジェン抗体遺伝子座の優性化。
　下記開示から明らかなように、上記の基準の全てを満たす必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊されるそれらの態様では、トランスジェンは対立遺伝子排除を活性化する必要がない。更に、トランスジェンが機能的に再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含んで成る態様では、２番目の基準である機能的な遺伝子再配列は、少なくとも既に再配列されているトランスジェンには不要である。分子免疫学に関する背景については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９），Ｐａｕｌ　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｅ．編，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる。
　本発明の一観点では、トランジェニック動物の生殖細胞（ジャームライン）中に再配列された、再配列されていない、または再配列されたものと再配列されていないものとの組み合わせの、異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジェンを含有する、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。重鎖トランスジェンの各々は少なくとも１つのＣＨ遺伝子を含んで成る。加えて、重鎖トランスジェンは、トランスジェニック動物のＢ細胞中で多数のＣＨ遺伝子をコードする異種トランスジェンのイソタイプスイッチを支持することができる機能的イソタイプスイッチ配列を含んでもよい。そのようなスイッチ配列は、トランスジェンＣＨ遺伝子の源として働く種からの生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然に存在するものであることができ、またはトランスジェン構成物を受け入れることになっている種（トランスジェニック動物）に存在するものから誘導することもできる。例えば、トランスジェニックマウスを製造するのに使われるヒトトランスジェン構成物は、それがマウス重鎖遺伝子座中に天然に存在するものに類似したスイッチ配列を含むならば、より高頻度のイソタイプスイッチ現象をもたらすことができる。というのは、恐らくマウススイッチ配列はマウススイッチレコンビナーゼ酵素系が機能するように最適化されるが、一方ヒトスイッチ配列は最適化されないだろうからである。スイッチ配列は、常用のクローニング法により単離しクローニングすることができ、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する発表された配列情報に基づいてデザインした重複合成オリゴヌクレオチドから初めから合成することができる（Ｍｉｌｌｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：７３０５−７３１６（１９９１）；Ｓｉｄｅｒｒａｓら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：６３１−６４２（１９８９）、これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
　上記トランスジェニック動物の各々について、機能的に再配列された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジェンは、トランスジェニック動物の有意な率（少なくとも１０パーセント）のＢ細胞中に検出される。
　本発明のトランスジェンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る重鎖トランスジェンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジェンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導されるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されていないようなトランスジェンが作製される。そのような再配列されていないトランスジェンは、抗原に暴露されると、トランスジェニック非ヒト動物内でＶ，ＤおよびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）を支持し、そして好ましくは結果として得られる再配列された免疫グロブリン重鎖中へのＤ領域遺伝子セグメントの全部または部分の組み込みを支持する。
　本発明の別の観点によれば、該トランスジェンは、再配列された「小遺伝子座」を含んで成る。そのようなトランスジェンは、典型的にはＣ，ＤおよびＪセグメントの実質的部分並びにＶセグメントのサブセットを含んで成る。そのようなトランスジェン構成物では、様々な調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセシング用のスプライス供与体およびスプライス受容体、組換えシグナル等は、異種ＤＮＡから誘導された対応配列を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジェン中に組み込むことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、トランスジェン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と組み合わせることができる。あるいは、トランスジェン中に合成調節配列を組み込むこともでき、この場合、そのような合成調節配列は哺乳類のゲノム中に天然に存在することが知られている機能的ＤＮＡ配列とは相同でない。合成調節配列は共通規則に従ってデザインされ、例えば、スプライス受容体部位またはプロモーター／エンハンサーモチーフの許容配列を特定するものである。
　本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジェンを有する生殖細胞を含有するトランスジェニック動物にも関し、ここで前記トランスジェンの一方は再配列された遺伝子セグメントを含み、他方は再配列されていない遺伝子セグメントを含む。好ましい態様では、再配列されたトランスジェンが軽鎖免疫グロブリントランスジェンであり、再配列されていないトランスジェンが重鎖免疫グロブリントランスジェンである。
　（抗体の構造および産生）
　全ての免疫グロブリンの基本構造は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドとから成る単位に基づく。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域として知られる２つの領域を含んで成る。同様に、免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖領域および定常重鎖領域と呼ばれる２つの領域を含んで成る。
　重鎖または軽鎖の定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域遺伝子（ＣＨ）セグメントと呼ばれるゲノム配列によりコードされる。特定の重鎖遺伝子セグメントの使用が免疫グロブリンのクラスを限定する。例えば、ヒトでは、μ定常領域遺伝子セグメントが抗体のＩｇＭクラスを限定し、一方でγ，γ２，γ３またはγ４定常領域遺伝子セグメントが抗体のＩｇＧクラス並びにＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１〜ＩｇＧ４を限定する。同様に、α１またはα２定常領域遺伝子セグメントの使用が抗体のＩｇＡクラス並びにＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブクラスを限定する。δおよびε定常領域遺伝子セグメントがそれぞれＩｇＤおよびＩｇＥ抗体クラスを限定する。
　重鎖および軽鎖免疫グロブリンの可変領域は、一緒になって抗体の抗原結合領域を含む。広範囲の抗原を結合できるようにするために抗体のこの領域に多様性が必要なため、初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、特定の可変領域遺伝子セグメントのファミリーに由来する多数の異なるＤＮＡセグメントを含んで成る。軽鎖可変領域の場合、そのようなファミリーは可変（Ｖ）遺伝子セグメントと連結（Ｊ）遺伝子セグメントを含んで成る。よって、軽鎖の初期可変領域は１つのＶ遺伝子セグメントと１つのＪ遺伝子セグメントによってコードされ、各セグメントはその生物のゲノムＤＮＡ中に含まれるＶおよびＪ遺伝子セグメントのファミリーから選ばれる。重鎖可変領域の場合、重鎖の初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、１つの重鎖Ｖ遺伝子セグメント、１つの重鎖多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび１つのＪ遺伝子セグメントを含んで成り、各セグメントはゲノムＤＮＡ中の適当な免疫グロブリン遺伝子セグメントのＶ，ＤおよびＪファミリーから選ばれる。
　抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様性を増加させるために、重鎖トランスジェンが再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列中にＤ領域の全部または部分を組み込むことができる機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を支持するシス作用性配列を含むことが好ましい。典型的には、発現されたトランスジェンによってコードされる重鎖（またはｍＲＮＡ）の少なくとも約１％がＶ領域中に認識可能なＤ領域配列を含有する。好ましくは、トランスジェンによってコードされるＶ領域の少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約３０％、最も好ましくは５０％が認識可能なＤ領域配列を含有する。
　認識可能なＤ領域配列は一般に、重鎖トランスジェンのＤ領域遺伝子セグメント中に存在する配列に相当する少なくとも約８個の連続するヌクレオチドおよび／またはそのようなＤ領域ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。例えば、トランスジェンがＤ領域遺伝子ＤＨＱ５２を含むならば、Ｖ遺伝子セグメント配列とＪ遺伝子セグメント配列の間のＶ領域中に配列５’−ＴＡＡＣＴＧＧＧ−３’を含有するトランスジェンによってコードされるｍＲＮＡは、Ｄ領域配列、特にＤＨＱ５２配列を含むものとして認識可能である。同様に、例えば、トランスジェンがＤ領域遺伝子ＤＨＱ５２を含むならば、Ｖ遺伝子セグメントアミノ酸配列とＪ遺伝子セグメントアミノ酸配列の間のＶ領域中に置かれたアミノ酸配列−ＤＡＦ−を含有するトランスジェンによってコードされる重鎖ポリペプチドは、Ｄ領域配列、特にＤＨＱ５２配列を含むものとして認識可能である。
　しかしながら、体細胞突然変異またはＮ領域付加のために、幾つかのＤ領域は、認識可能であるが連続するＤ領域配列と全く同一には一致しないことがある。例えば、ヌクレオチド配列５’−ＣＴＡＡＸＴＧＧＧＧ−３’（ここでＸはＡ，ＴまたはＧであり、該配列は重鎖Ｖ領域中にあり、Ｖ領域遺伝子配列とＪ領域遺伝子配列によって隣接されている）は、ＤＨ５２配列５’−ＣＴＡＡＣＴＧＧＧ−３’に相当すると認識され得る。同様に、例えば、Ｖ領域中にありそしてアミノ末端側でトランスジェンＶ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されそしてカルボキシ末端側でトランスジェンＪ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されているポリペプチド配列−ＤＡＦＤＩ−，−ＤＹＦＤＹ−または−ＧＡＦＤＩ−は、Ｄ領域配列として認識され得る。
　従って、体細胞突然変異やＮ領域付加はトランスジェンＤ領域に由来する配列中に変異をもたらし得るので、認識可能なＤ領域配列の存在を決定するための指標として次の定義が与えられる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は次のような場合にＤ領域として認識可能である：（１）該配列がＶ領域中に存在し、一方の側がＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接されており、そして他方の側がＪ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接されており、且つ（２）該配列が既知のＤ遺伝子配列（，ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）と実質的に同じであるかまたは実質的に相同である場合。
　ここで使用する用語「実質的な同一」は、ポリペプチド配列が参照配列に比較して少なくとも５０％の配列一致を有し、核酸配列が参照配列に比較して少なくとも７０％の配列一致を有する、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の特徴を表す。配列一致の％は、参照配列の合計３５％未満である小さな欠失または付加を除いて計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列はポリヌクレオチドの場合長さが少なくとも８ヌクレオチドであり、ポリペプチドの場合長さが少なくとも３アミノ酸残基である。典型的には、参照配列は少なくとも８〜１２ヌクレオチドまたは少なくとも３〜４アミノ酸であり、好ましくは１２〜１５ヌクレオチドもしくはそれ以上または少なくとも５アミノ酸である。
　ここで使用する用語「実質的な相同」は、ポリペプチド配列が参照配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する、ポリペプチド配列の性質を表す。配列相同性の％は、同一アミノ酸または位置保存性アミノ酸置換を相同であるとして数えることにより算出される。位置保存性アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換から生じ得るものである。単一ヌクレオチド置換により最初のアミノ酸のコドンと二番目のアミノ酸のコドンが異なり得る場合、最初のアミノ酸が二番目のアミノ酸と置き換えられる。例えば、配列−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａ１−は配列−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−と実質的に相同である。何故なら、コドン配列−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＡＧＡ−ＧＵＵ−は、わずか３つの置換変異（２つの元のコドンのうちの３つに単一ヌクレオチド置換）を導入することによって−ＡＡＣ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＧＵＵ−に変異せしめることができるからである。参照配列はより大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列は長さが少なくとも４アミノ酸残基である。典型的には参照配列は少なくとも５アミノ酸であり、好ましくは６アミノ酸またはそれ以上である。
　（一次レパートリー）
　重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡを作製する方法は、主としてＢ細胞を発達させることに存する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの結合前、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、大部分、一次レパートリーＢ細胞の前駆体中にＶ，Ｄ，ＪおよびＣ遺伝子セグメントのクラスターとして見つかる。通常、重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの全てが単一の染色体上に比較的近くに密接して置かれている。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換え前のそのようなゲノムＤＮＡは、本明細書中「再配列されていない」ゲノムＤＮＡと呼称される。Ｂ細胞分化の間に、Ｖ，Ｄ，Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶとＪのみ）の適当なファミリーメンバーのいずれが１つの遺伝子セグメントが組み換えられて機能的に再配列された重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を形成する。そのような機能的再配列は、機能的な可変領域をコードするＤＮＡを形成する可変領域セグメントの再配列である。この遺伝子セグメント再配列過程は連続的であると思われる。最初に、重鎖Ｄ−Ｊ接合が作られ、次いで重鎖Ｖ−ＤＪ接合と軽鎖Ｖ−Ｊ接合が作られる。軽鎖および／または重鎖中の機能的可変領域のこの初期形態をコードするＤＮＡは、「機能的に再配列されたＤＮＡ」または「再配列されたＤＮＡ」と呼ばれる。重鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列された重鎖ＤＮＡ」と呼ばれ、そして軽鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列された軽鎖ＤＮＡ」と呼ばれる。本発明のトランスジェンの機能的再配列を記述するためにも同様な用語が使われる。
　機能的な重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの組換えは、組換え応答能のあるＶ，ＤおよびＪセグメントに隣接する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）により媒介される。組換えを指令するのに必要且つ十分なＲＳＳは、二分子対称ヘプタマー、高ＡＴノナマー、および１２塩基対または２３塩基対のいずれかの中断スペーサー領域を含んで成る。それらのシグナルは、Ｄ−Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行いそして機能的に相互交換可能である異なる遺伝子座および種の間で保存されている。Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１５１７−１５２３およびその中に引用された参考文献を参照のこと。配列ＣＡＣＡＧＴＧまたはその類似体を含んで成るヘプタマーの後に非保存性配列のスペーサー、次いで配列ＡＣＡＡＡＡＡＣＣまたはその類似体を有するノナマーが存在する。それらの配列は、各ＶおよびＤ遺伝子セグメントのＪ側、即ち下流側上に見つかる。生殖細胞型たおよびＪ遺伝子セグメントの直前に、再び２つの組換えシグナル配列があり、最初にノナマーそして非保存性配列により隔てられて次にヘプタマーがある。ＶＬ，ＶＨまたはＤセグメントの後ろのヘプタマーおよびノナマー配列は、それらが組み換わるＪＬ，ＤまたはＪＨセグメントの前方のものと相補的である。ヘプタマーとノナマー配列との間のスペーサーは１２塩基対の長さかまたは２２〜２４塩基対の長さかのいずれかである。
　Ｖ，ＤおよびＪセグメントの再配列に加えて、軽鎖のＶセグメントとＪセグメントとの間および重鎖のＤセグメントとＪセグメントとの問の可変的組換えによって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおいて更なる多様性が生まれる。そのような様々な組換えは、そのようなセグメントが結合する正確な場所の変位（ずれ）によって生成される。軽鎖におけるそのようなずれは、典型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドンの内部およびＪセグメントの最初のコドンの内部に起こる。同様な結合のずれは、重鎖染色体上ではＤセグメントとＪＨセグメントとの間に起こり、１０ヌクレオチドほどの多数に及ぶことがある。更に、ＤセグメントとＪＨセグメントとの間およびＶＨセグメントとＤセグメントとの間に、ゲノムＤＮＡによりコードされない幾つかのヌクレオチドが挿入されることがある。それらのヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として知られている。
　ＶＪおよび／またはＶＤＪ再配列の後、再配列された可変領域遺伝子セグメントおよび再配列された可変領域の下流に置かれた１または複数の定常領域遺伝子セグメントの転写は、一次ＲＮＡ転写物を生成し、これが適当なＲＮＡスプライシングを受けると、全長の重鎖または軽鎖免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡを生じる。そのような重鎖および軽鎖は、Ｂ細胞の経膜領域中への免疫グロブリンの挿入および／またはＢ細胞からの分泌を行うリーダー配列を含む。このシグナル配列をコードするＤＮＡは、免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域を形成するのに使うＶセグメントの第一エクソンの内部に含まれる。コードされる免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチド（これは互いとの適切な会合によって抗体分子を形成する）を生成するｍＲＮＡの翻訳を調節するためにｍＲＮＡ中に適当な調節配列も存在する。
　可変領域遺伝子セグメント中のそのような再配列およびそのような連結中に起こり得る可変的組換えの最終結果は、一次抗体レパートリーの生成である。一般に、この段階まで分化された各Ｂ細胞は、単一の一次レパートリー抗体を産生する。この分化過程の間に、機能的に再配列されたＩｇ遺伝子内に含まれるもの以外の遺伝子セグメントの機能的再配列を抑制する細胞現象が起こる。二倍体Ｂ細胞がそのような単一特異性を維持する過程は、対立遺伝子排除と呼ばれる。
　（二次レパートリー）
　一次レパートリーを含んで成る配列の組の中からの免疫グロブリンを発現するＢ細胞クローンは、外来抗原に応答させるのにすぐに利用できる。単純なＶＪおよびＶＤＪ結合により生じる限定された多様性のため、いわゆる一次応答によって産生される抗体は比較的低い親和性のものである。２つの異なる型のＢ細胞がこの初期応答を作成する：一次抗体形成細胞の前駆体および二次レパトリーＢ細胞の前駆体〔Ｌｉｎｔｏｎら、Ｃｅ１１，５９：１０４９−１０５９（１９８９）〕。最初の型のＢ細胞は或る種の抗原に応答してＩｇＭ分泌性形質細胞に成熟する。他方のＢ細胞は、Ｔ細胞依存性成熟過程に入ることにより、抗原への初期暴露に応答する。
　抗原により感作されたＢ細胞クローンのＴ細胞依存性成熟の間に、細胞表面上の抗体分子の構造が２つの経路で変化する。第一は、定常領域が非ＩｇＭサブタイプにスイッチし、そして可変領域の配列が多数の単一アミノ酸置換により変更されて一層高い親和性の抗体分子を生成することができる。
　前に指摘したように、Ｉｇ重鎖または軽鎖の各可変領域は、抗原結合領域を含む。二次応答の間の体細胞突然変異は、アミノ酸および核酸配列決定により、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３；これは超可変領域１，２または３とも呼ばれる）を含むＶ領域の至るところで起こることが決定されている〔Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。ＣＤＲ１とＣＤＲ２は可変遺伝子セグメント内部に位置し、一方ＣＤＲ３は大部分がＶ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間またはＶ，ＤおよびＪ遺伝子セグメントの間の組換えの結果である。ＣＤＲ１，２または３を構成しない可変領域の部分は、一般に、ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４と名付けられたフレームワーク領域と呼ばれる。図１を参照のこと。高度突然変異の間に、再配列されたＤＮＡが変異されて異なるＩｇ分子を有する新しいクローンを生じる。外来抗原に対して一層高い親和性を有するそれらのクローンがヘルパーＴ細胞によって選択的に増大されて、発現抗体の親和力成熟を引き起こす。クローン選択は、典型的にはＣＤＲ１，ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域中に新規変異を含むクローンの発現をもたらす。しかしながら、抗原結合領域の特異性および親和性に影響を及ぼすようなそれらの領域の外側の変異も起こる。
　（異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物）
　本発明の１観点では、トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリントランスジェン（後述）を非ヒト動物の接合子または初期胚中に導入することにより製造される。本発明に有用である非ヒト動物は、一般に、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列して一次抗体応答を生ぜしめることができる任意の哺乳類を包含する。そのような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、および当業界で既知である他のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が挙げられる。特に好ましい非ヒト動物はマウスまたは超歯類の他のメンバーである。
　しかしながら、本発明はマウスの使用に限定されない。むしろ、一次および二次抗体応答を開始することができる任意の非ヒト哺乳動物を使うことができる。そのような動物としては、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ウシ、ヒツジおよびブタの種、謁歯科の他のメンバー、例えばラット、並びにウサギおよびモルモットが挙げられる。特に好ましい動物はマウス、ラット、ウサギおよびモルモットであり、最も好ましくはマウスである。
　本発明の一態様では、ヒトゲノム由来の様々な遺伝子セグメントが再配列されていない形で重鎖および軽鎖トランスジェンに使われる。この態様では、そのようなトランスジェンがマウスに導入される。軽鎖および／または重鎖トランスジェンの再配列されていない遺伝子セグメントは、マウスゲノム中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントと識別可能である、ヒト種に固有のＤＮＡ配列を有する。それらは生殖細胞やＢ細胞から成らない体細胞では再配列されていない形態でそしてＢ細胞では再配列された形態で容易に検出することができる。
　本発明の別の態様では、トランスジェンは、再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリントランスジェンを含んで成る。そのようなトランスジェンの機能的に再配列されたＶＤＪまたはＶＪセグメントに相当する特定セグメントは、マウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントから明らかに識別可能である免疫グロブリンＤＮＡ配列を含む。
　そういったＤＮＡ配列の相違は、マウスＢ細胞によりコードされるアミノ酸配列に比較するとそのようなヒト免疫グロブリントランスジェンによりコードされるアミノ酸配列にも反映される。よって、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントによりコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体を使って、本発明のトランスジェニック非ヒト動物において、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を検出することができる。
　ヒトまたは他の種由来の再配列されていないトランスジェンを含有するトランスジェニックＢ細胞は、適当な遺伝子セグメントを機能的に組換えると、機能的に再配列された軽鎖および重鎖可変領域を形成する。そのような再配列されたトランスジェンによりコードされる抗体は、本発明を実施するのに用いる非ヒト動物中で通常遭遇するものとは異種であるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を有することは容易に明らかであろう。
　（再配列されていないトランスジェン）
　本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン重鎖トランスジェン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。前記重鎖トランスジェンの各遺伝子セグメントは、前記トランスジェンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン重鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。同様に、本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン軽鎖トランスジェン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。ここで、前記軽鎖トランスジェンの各遺伝子セグメントは、前記軽鎖トランスジェンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当する配列を有する。
　本発明のこの観点でのそのような重鎖および軽鎖トランスジェンは、再配列されていない形態で上述の遺伝子セグメントを含有する。即ち、重鎖トランスジェン中のＶ，ＤおよびＪセグメントの間および軽鎖トランスジェン中のＶとＪセグメントの間には、適当な組換えシグナル配列（ＲＳＳ）が置かれる。加えて、そのようなトランスジェンは、定常領域遺伝子セグメントをＶＪまたはＶＤＪ再配列された可変領域と結合するための適当なＲＮＡスプライシングシグナルも含む。
　複数のＣ領域遺伝子セグメント、例えばヒトゲノムからのＣμおよびＣγ１を含む重鎖トランスジェン内でのイソタイプスイッチを促進するために、各定常領域遺伝子セグメントの上流で且つ可変領域遺伝子セグメントの下流に、免疫グロブリンクラススイッチ、例えばＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチを考慮した前記定常領域間の組換えを可能にするため、下記に説明するような「スイッチ」領域が組み込まれる。そのような重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジェンは、可変領域遺伝子セグメントの上流に置かれたプロモーター領域を含む転写調節配列（典型的にはＴＡＴＡモチーフを含む）も含有する。プロモーター領域は、下流配列に作用可能に連結されると該下流配列の転写を指令することができるＤＮＡ配列として大体定義することができる。プロモーターは、効率的転写を指令するために連結された追加のシス作用性配列の存在を必要とすることがある。更に好ましくは、繁殖不能性転写物の転写に関係する他の配列が含まれる。繁殖不能性転写物の発現に関係する配列の例は、Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６２１−６２７（１９９０）；Ｒｅｉｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：８４０−８４４（１９８９）；Ｓｔａｖｎｅｚｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５；７７０４−７７０８（１９８８）およびＭｉｌｌｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：７３０５−７３１６（１９９１）（この各々は参考として本明細書中に組み込まれる）を包含する、発表文献中に見つけることができる。それらの配列は、典型的にはスイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約５０ｂｐ、好ましくはスイッチ領域の上流の少なくとも約２００ｂｐ、より好ましくはスイッチ領域の少なくとも約２００〜１０００ｂｐまたはそれ以上を含む。適当な配列はヒトＳγ１，Ｓγ２，Ｓγ３，Ｓγ４，Ｓα１，Ｓα２およびＳεスイッチ領域のすぐ上流に存在するが、ヒトＳγ１およびＳγ３スイッチ領域のすぐ上流の配列が好ましい。特に、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導性転写調節要素、例えばＩＦＮ誘導性エンハンサーがトランスジェンスイッチ配列のすぐ上流に含まれるのが好ましい。
　プロモーターに加えて、主にＢ系列細胞中で機能する他の調節配列が使われる。例えば、軽鎖トランスジェン上の好ましくはＪセグメントと定常領域遺伝子セグメントとの間に置かれた軽鎖エンハンサー配列は、トランスジェンの発現を増強し、それによって対立遺伝子排除を促進するために使われる。重鎖トランスジェンの場合、調節エンハンサーも使われる。そのような調節配列は、トランスジェンの転写および翻訳を最大にし、その結果対立遺伝子排除を誘導しそして比較的高いレベルのトランスジェン発現を提供するために用いられる。
　上述のプロモーターおよびエンハンサー調節配列は包括的に記載されているけれども、そのような調節配列は非ヒト動物に対して異種であることができ、異種トランスジェン免疫グロブリン遺伝子セグメントが得られるゲノムＤＮＡから誘導することができる。あるいは、そのような調節遺伝子セグメントは、重鎖および軽鎖トランスジェンを含む、非ヒト動物または密接に関連した種のゲノム中の対応する調節配列から誘導される。
　好ましい態様では、遺伝子セグメントはヒトから誘導される。そのような重鎖および軽鎖トランスジェンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、そのような動物に投与される特異抗原に対してＩｇ介在型免疫応答を開始することができる。そのような動物中では異種ヒト抗体を産生することのできるＢ細胞が産生される。不死化後、および適当なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）、例えばハイブリドーマの選択後、治療用ヒトモノクローナル抗体の源が提供される。そういったヒトＭａｂは、ヒトに療法的に投与した時に実質的に減少された免疫原性を有する。
　好ましい態様はヒト遺伝子セグメントを含む重鎖および軽鎖トランスジェンの作製を開示するけれども、本発明はそれに限定されない。この点に関しては、本明細書中に記載される教示は、ヒト以外の種からの免疫グロブリン遺伝子セグメントの使用に合わせて容易に改変できると理解すべきである。例えば、本発明の抗体によるヒトの療法的処置に加えて、適切な遺伝子セグメントによりコードされた療法的抗体を用いて獣医科学において使用するためのモノクローナル抗体を生成せしめることができる。
　（再配列されたトランスジェン）
　別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生殖細胞中に機能的に少なくとも１つの再配列された異種重鎖免疫グロブリントランスジェンを含有する。そのような動物は上述のような再配列された重鎖トランスジェンを発現する一次レパートリーＢ細胞を含有する。そのようなＢ細胞は、好ましくは、抗原と接触すると体細胞突然変異を受け、該抗原に対して高い親和性を特異性を有する異種抗体を形成することができる。前記再配列されたトランスジェンは、少なくとも２つのＣＨ遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を含むだろう。
　本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジェンを有する生殖細胞を含み、前記トランスジェンのうちの一方が再配列された遺伝子セグメントを含み、他方が再配列されていない遺伝子セグメントを含む、トランスジェニック動物にも関する。そのような動物では、重鎖トランスジェンが少なくとも２つのＣＨ遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。
　本発明は更に、本発明のトランスジェンにおいて使うことができる合成可変領域遺伝子セグメントレパートリーを作製する方法にも関する。該方法は、免疫グロブリンＶセグメントＤＮＡの集団を作製することを含んで成る。ここで前記ＶセグメントＤＮＡの各々は免疫グロブリンＶセグメントをコードし、そして各末端に制限エンドヌクレアーゼの開裂認識部位を含む。免疫グロブリンＶセグメントＤＮＡの前記集団は、その後、鎖状に連結されて合成免疫グロブリンＶセグメントレパートリーを形成する。そのような合成可変領域重鎖トランスジェンは、少なくとも２つのＣＨ遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。
　（イソタイプスイッチ）
　Ｂリンパ球の発達過程において、該細胞は、生産的に再配列されたＶＨおよびＶＬ領域によって決定される結合特異性を有するＩｇＭを最初に産生する。続いて、各Ｂ細胞とその子孫の細胞が同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成するが、それらはＨ鎖のイソタイプをスイッチすることができる。
　μまたはδ定常領域の使用は、大部分は、ＩｇＭおよびＩｇＤを単一細胞中で同時発現できるようにする、交互スプライシングによって決定される。その他の重鎖イソタイプ（γ，αおよびε）は、遺伝子再配列現象がＣμおよびＣδエクソンを欠失させた後で本質的にのみ発現される。この遺伝子再配列過程はイソタイプスイッチと呼ばれ、典型的には各重鎖遺伝子（δを除く）のすぐ上流に置かれたいわゆるスイッチセグメントの間での組換えによって起こる。個々のスイッチセグメントは長さが２〜１０ｋｂであり、主として短い反復配列から成る。組換えの正確な位置は個々のクラススイッチ現象ごとに異なる。ｃＤＮＡ由来のＣＨプローブを用いるサザンブロット法または溶液ハイブリダイゼーション速度論を使った実験は、スイッチが細胞からのＣＨ配列の消失に関係し得ることを確証した。
　μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域、Ｓμは、コード配列の約１〜２ｋｂ　５’側に位置し、そして（ＧＡＧＣＴ）ｎ（ＧＧＧＧＴ）の形の配列の多数の縦列反復から成る。ここでｎは通常２〜５であるが、１７ほどの大きさに及ぶことができる〔Ｔ．Ｎｉｋａｉｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ，２９２：８４５−８４８（１９８１）を参照のこと。〕。
　他のＣＨ遺伝子の５’にも、数キロ塩基対に及ぶ同様な内部反復性スイッチ配列が見つかっている。Ｓα領域は配列決定されており、縦列に反復した８０ｂｐの相同性単位から成ることが判明した。一方、Ｓ２ａ，Ｓ２ｂおよびＳ３は全て、互いに非常に類似している反復した４９ｂｐの相同性単位を含む〔Ｐ．Ｓｚｕｒｅｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３５：６２０−６２６（１９８５）およびＴ．Ｎｉｋａｉｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：７３２２−７３２９（１９８２）を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。全ての配列決定されたＳ領域は、Ｓμ遺伝子の基本的反復配列であるペンタマーＧＡＧＣＴおよびＧＧＧＧＴの多数の存在を含む〔Ｔ．Ｎｉｋａｉｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：７３２２−７３２９（１９８２）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕；他のＳ領域では、それらのペンタマーはＳμのようには正確に縦列に反復されていないが代わりに大きな反復単位中に埋もれている。Ｓγ１領域は追加の高次構造を有し、即ち、２つの直接反復配列が４９ｂｐの縦列反復の２つのクラスターの各々に隣接する〔Ｍ．Ｒ．Ｍｏｗａｔｔら、Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１３６；２６７４−２６８３（１９８６）を参照のこと；これは引用して本明細書中に組み込まれる〕。
　ヒトＨ鎖遺伝子のスイッチ領域はそれらのマウス同族体に非常に類似していることがわかっている。実際、ＣＨ遺伝子の５’側のヒトクローンとマウスクローンの間の類似性はＳ領域に限られることがわかっており、これは、それらの領域の生物学的重要性を確証する事実である。
　μ遺伝子とα遺伝子の間のスイッチ組換えは複合Ｓμ−Ｓα配列をもたらす。典型的には、組換えが常に起こるような特異部位はＳμ領域中にも他のＳ領域中にも存在しない。
　一般に、Ｖ−Ｊ組換えの酵素的機構とは異なり、スイッチ機構は、明らかに生殖細胞Ｓ前駆体の反復相同領域の種々の整列を適応させることができ、次いで該配列を異なる位置で一直線上に連結することができる〔Ｔ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９：４５０９−４５２４（１９８１）およびＪ．Ｒａｖｅｔｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：６７３４−６７３８（１９８０）を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる。〕。
　特定のイソタイプヘのスイッチを選択的に活性化する機構の詳細は未知である。リンホカインやサイトカインのような外因性影響物質はイソタイプ特異的レコンビナーゼを増加調節するかもしれないが、この酵素機構はあらゆるイソタイプヘのスイッチを触媒し、そして特異性がこの酵素機構の標的を特定のスイッチ領域に向けることにある可能性もある。
　Ｔ細胞由来のリンホカインＩＬ−４およびＩＦＮγは、幾つかのイソタイプの発現を特異的に促進することが証明されている：ＩＬ−４はＩｇＭ，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３発現を減少させ、ＩｇＥおよびＩｇＧ１発現を増加させる；ＩＦＮγはＩｇＧ２ａ発現を選択的に刺激し拮抗する一方、ＩｇＥとＩｇＧ１発現の増加を誘導する〔Ｃｏｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１．１３６：９４９−９５４（１９８６）およびＳｎａｐｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：９４４−９４７（１９８７）；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
　スイッチに関するＴ細胞作用に関係する実験のほとんどは、特定のスイッチ組換えを有する細胞において観察される増加が事前スイッチされた細胞または事前傾倒された細胞の選択を反映し得る可能性を無視することができなかった。しかし、最もありそうな説明はリンホカインが実際にスイッチ組換えを促進するというものである。
　クラススイッチの誘導は、スイッチセグメントの上流で始まる繁殖不能転写物（ｓｔｅｌｉｌｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に関係があるらしい〔Ｌｕｔｚｅｋｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８：１８４９（１９８８）；Ｓｔａｖｎｅｚｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：７７０４（１９８８）；ＥｓｓｅｒおよびＲａｄｂｒｕｃｈ，ＥＭＢＯ　Ｊ．８；４８３（１９８９）；Ｂｅｒｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６；２８２９（１９８９）；Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６２１（１９９０）；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。例えば、観察されるＩＬ−４によるγ１繁殖不能転写物の誘導およびＩＦＮγによる阻害は、ＩＬ−４がＢ細胞中でのγ１へのクラススイッチを促進し、ＩＦＮγがγ１発現を阻害するという観察結果と一致する。従って、繁殖不能転写物の転写に影響を及ぼす調節配列の包含は、イソタイプスイッチの速度にも影響を及ぼし得る。例えば、特定の繁殖不能転写物の転写を増加せしめることが、典型的には近隣のスイッチ配列を伴うイソタイプスイッチ組換えの頻度を増加させると期待できる。
　それらの理由により、トランスジェンがイソタイプに使用する予定の各スイッチ領域の約１〜２ｋｂ上流以内に転写調節配列を含むことが望ましい。それらの転写調節配列は、好ましくはプロモーターとエンハンサー要素を含み、より好ましくはスイッチ領域と生来関連している（即ち生殖細胞配置で存在する）５’隣接（即ち上流）領域を含む。この５’隣接領域は、典型的には長さが少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約２００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５００〜１０００ヌクレオチドである。
　１つのスイッチ領域からの５’隣接配列をトランスジェン構成物用の別のスイッチ領域に作用可能に連結させることができる（例えば、ヒトＳγ１スイッチからの５’隣接配列をＳα１スイッチのすぐ上流に融合させることができる）けれども、或る態様では、トランスジェン構成物中に含まれる各スイッチ領域が、天然に存在する生殖細胞配置においてすぐ上流に存在する５’隣接配列を有することが好ましい。
　（トランスジェニック一次レパートリー）
　（Ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座）
　トランスジェン機能のための重要な必要条件は、広範囲の抗原に対して二次免疫応答を開始させるのに十分な程度に多様である一次抗体レパートリーの作製である。再配列された重鎖遺伝子は、シグナルペプチドエクソン、可変領域エクソン、および各々が数個のエクソンによりコードされる多ドメイン定常領域の縦列整列領域から成る。定常領域遺伝子の各々は異なる免疫グロブリンクラスの定常部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、定常領域に近いＶ領域が欠失されて新規重鎖クラスの発現をもたらす。各重鎖クラスについては、ＲＮＡスプライシングの別パターンが経膜型と分泌型の両方の免疫グロブリンをもたらす。
　ヒト重鎖遺伝子座は、２Ｍｂにわたる約２００個のＶ遺伝子セグメント、約４０ｋｂにわたる約３０個のＤ遺伝子セグメント、３ｋｂの範囲内に密集した６個のＪセグメント、および約３００ｋｂにわたる９個の定常領域遺伝子セグメントから成る。全遺伝子座は、染色体１４の長い方の腕の遠位部分約２．５Ｍｂに及ぶ（図４）。
　（Ｂ．遺伝子断片トランスジェン）
　（１．重鎖トランスジェン）
　好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジェンは、ヒト由来の再配列されていないゲノムＤＮＡを含んで成る。重鎖の場合、好ましいトランスジェンは６７０〜８３０ｋｂの長さを有するＮｏｔＩ断片を含んで成る。この断片の長さは、３’制限部位が実際にマッピングされていないため、不明瞭である。しかしながら、α１とφα遺伝子セグメントとの間にあることが知られている。この断片は、６っの既知ＶＨファミリーの全部のメンバー、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、並びにμ，δ，γ３，γ１およびα１定常領域を含む。Ｂｅｒｍａｎら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７：７２７−７３８（１９８８）。このトランスジェンを含有するトランスジェニックマウス系は、Ｂ細胞の発達に必要とされる重鎖クラス（ＩｇＭ）を正しく発現し、そしてほとんどの抗原に対して二次応答を開始せしめのに十分な程多数のレパートリーと共に、少なくとも１つのスイッチされた重鎖クラス（ＩｇＧ１）を発現する。
　（２．軽鎖トランスジェン）
　ヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび調節配列を全て含有するゲノム断片を同様に作製することができる。そのような構成物は本実施例中に記載のようにして作製される。
　（Ｃ．生体内組換えにより細胞内的に作製されるトランスジェン）
　単一ＤＮＡ断片上の重鎖遺伝子座の全部または一部分を単離する必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの６７０−８３０ｋｐ　ＮｏｔＩ断片は、トランスジェン作製（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）の間に非ヒト動物の生体内で形成させることができる。そのような生体内トランスジェン作製は、２以上の重複するＤＮＡ断片を非ヒト動物の胎児性核に導入することにより行われる。ＤＮＡ断片の重複部分は、実質的に相同であるＤＮＡ配列を有する。胎児性核内に含まれるレコンビナーゼに暴露されると、重複しているＤＮＡ断片が適切な方向において相同的に組み換わって６７０−８３０ｋｂのＮｏｔＩ重鎖断片を形成する。
　生体内トランスジェン作製は、そのサイズのために現存の技術による作製または操作が困難であるかまたは不可能である多数の免疫グロブリントランスジェンを形成せしめるのに使うことができると理解すべきである。例えば、生体内トランスジェン作製は、ＹＡＣベクター〔ＭｕｒｒａｙおよびＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：１８９−１９３（１９８３）〕により操作することができるＤＮＡ断片よりも大きい免疫グロブリントランスジェンを作製するのに有用である。そのような生体内トランスジェン作製は、トランスジェニック非ヒト動物から成らない種の実質的に完全な免疫グロブリン遺伝子座を非ヒト動物中に導入する場合にも使うことができる。
　ゲノム免疫グロブリントランスジェンを形成させることに加えて、実施例に記載の如く「小遺伝子座」トランスジェンを形成させるのにも生体内相同組換えを使うことができる。
　生体内トランスジェン作製を利用する好ましい態様では、各々の重複するＤＮＡ断片は、好ましくは第一のＤＮＡ断片の末端部分と第二のＤＮＡ断片の末端部分の間で重複する実質的に相同なＤＮＡ配列を有する。ＤＮＡ断片のそのような重複部分は、好ましくは約５００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、最も好ましくは１．０ｋｂ〜２．０ｋｂを含む。生体内でトランスジェンを形成させるための重複ＤＮＡ断片の相同組換えは、１９９２年３月１９日に公開された「哺乳類細胞における相同性組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ）と称するＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１７に更に詳しく記載されている。
　（Ｄ．小遺伝子座トランスジェン）
　本明細書中で使用する時、「免疫グロブリン小遺伝子座」なる用語は、通常は約１５０ｋｂ未満、典型的には約２５〜１００ｋｂのＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列が少なくとも１つの実質的不連続性（例えば、相同ゲノムＤＮＡ配列に関して、通常は少なくとも約２〜５ｋｂ、好ましくは１０〜２５ｋｂまたはそれ以上の欠失）を有するような、次のものを各々少なくとも１つ含むＤＮＡ配列を言う：機能的可変（Ｖ）遺伝子セグメント、機能的連結（Ｊ）領域セグメント、少なくとも１つの機能的定常（Ｃ）領域遺伝子セグメント、および重鎖小遺伝子座の場合には、機能的多様性（Ｄ）領域セグメント。軽鎖小遺伝子座トランスジェンは、長さが少なくとも２５ｋｂ、典型的には５０〜８０ｋｂであるだろう。重鎖トランスジェンは、スイッチ領域に作用可能に連結された２つの定常領域を有する、典型的には約７０〜８０ｋｂ、好ましくは少なくとも約６０ｋｂの長さであろう。更に、小遺伝子座の個々の要素は好ましくは生殖細胞（ジャームライン）配置にあり、そして小遺伝子座の該要素により完全にコードされる多様な抗原特異性を有する機能的抗体分子を発現するように、トランスジェニック動物の前駆体Ｂ細胞において遺伝子再配列を受けることができる。更に、少なくとも２つのＣＨ遺伝子と必要なスイッチ配列とを含んで成る重鎖小遺伝子座は、典型的には、異なる免疫グロブリンクラスの機能的抗体分子が生成されるように、イソタイプスイッチを受けることができる。そのようなイソタイプスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物内に存在するＢ細胞中で生体内で起こるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から外植されたＢ細胞系列の培養細胞中で起こり得る。
　他の好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジェンはＶＨ，ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントを各々１つまたは複数並びにＣＨ遺伝子を２つ以上含んで成る。適当なタイプの遺伝子セグメントの少なくとも１つが小遺伝子座トランスジェンに組み込まれる。重鎖トランスジェンのＣＨセグメントに関しては、トランスジェンが少なくとも１つのμ遺伝子セグメントと、少なくとも１つの他の定常領域遺伝子セグメント、より好ましくはγ遺伝子セグメント、最も好ましくはγ３またはγ１遺伝子セグメントとを含むことが好ましい。この優先性は、コードされる免疫グロブリンのＩｇＭ形とＩｇＧ形の間のクラススイッチおよび分泌形の高親和性非ＩｇＭ免疫グロブリンの産生を考慮したものである。他の定常領域遺伝子セグメント、例えばＩｇＤ，ＩｇＡおよびＩｇＥの産生をコードするものも使うことができる。
　当業者は、重鎖ＣＨ遺伝子の発生の順序が該ＣＨ遺伝子の供与体として働く種の生殖細胞において見つかる天然に存在する空間的順序とは異なるであろうトランスジェンも作製するだろう。
　更に、当業者は、１つの種の複数の個体からＣＨ遺伝子を選択することができ（例えば、同種異系ＣＨ遺伝子）、そしてイソタイプスイッチを受けることができる過剰のＣＨ遺伝子として前記遺伝子をトランスジェン中に組み込むことができる。次いで、結果として生じたトランスジェン非ヒト動物は、或る態様では、トランスジェンＣＨ遺伝子を得た前記種に象徴されるアロタイプの全てを包含する様々なクラスの抗体を生産することができる。
　更にまた、当業者は、異なる種からＣＨ遺伝子を選択してトランスジェン中に組み込むことができる。各ＣＨ遺伝子と共に機能的スイッチ配列が含まれるが、使用するスイッチ配列は必ずしもＣＨ遺伝子の隣に天然に存在するものである必要はない。種間のＣＨ遺伝子組み合わせは、様々な種からのＣＨ遺伝子に相当する多様なクラスの抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物をもたらすだろう。種間ＣＨトランスジェンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、獣医学用のモノクローナルを産生するハイブリドーマを作製するためのＢ細胞の源として働くことができる。
　ヒトの重鎖Ｊ領域セグメントは、３ｋｂのＤＮＡ長さにおいて密集した６個の機能的Ｊセグメントと３個の偽遺伝子を含んで成る。それが比較的小さいサイズであることとそれらのセグメントがμ遺伝子およびδ遺伝子の５’部分と一緒に単一の２３ｋｂ　ＳＦｉＩ／ＳｐｅＩ断片として単離できること〔Ｓａｄｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５４：２４６−２７１（１９８８）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を仮定すれば、小遺伝子座構成物において全部のＪ領域遺伝子セグメントを使うことが好ましい。更に、この断片はμ遺伝子とδ遺伝子の間の領域に広がるため、μ発現に必要とされるシス結合した３’調節要素の全部を含むことが適当である。更に、この断片は完全なＪ領域を含むため、重鎖エンハンサーとμスイッチ領域を含む〔Ｍｉｌｌｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３０６：８０９（１９８３）；ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓおよびＡｌｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４；３３９−３６８（１９８６）；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。それは、ＶＤＪ結合を開始させて一次レパートリーＢ細胞を形成させる転写開始部位も含む〔ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓおよびＡｌｔ，Ｃｅｌｌ　４０：２７１−２８１（１９８５）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。あるいは、２３ｋｂ　ＳｆｉＩ／ＳｐｅＩ断片の代わりに、Ｄ領域の一部を含む３６ｋｂ　ＢｓｓＨｌｌ／ＳｐｅＩ断片を使うことができる。そのような断片の使用は、効率的Ｄ−Ｊ結合を促進させる５’隣接配列の量を増加させる。
　ヒトＤ領域は、縦列に結合した４または５個の相同な９ｋｂの亜領域から成る〔Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　２９４：６３１−６３５（１９８１）〕。各亜領域は１０個までの個々のＤセグメントを含む。それらのセグメントの一部はマッピングされており、それを図４に示す。２つの異なる方策を使って小遺伝子座Ｄ領域を作製する。第一の方策は、１つまたは２つの反復Ｄ亜領域を含む短いＤＮＡの連続鎖の中に置かれたそれらのＤセグメントのみを使うものである。候補となるのは、１２個の個々のＤセグメントを含む単一の１５ｋｂ断片である。ＤＮＡのこの断片は２つの連続するＥｃｏＲＩ断片から成り、そ．して完全に配列決定されている〔Ｉｃｈｉｈａｒａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７：４１４１−４１５０．（１９８８）〕。１２のＤセグメントが一次レパートリーに十分であろう。しかしながら、Ｄ領域の分散性質があるとすれば、別の方策は、幾つかの不連続Ｄ断片含有断片を一緒に連結して、より多数のセグメントを有する一層小型のＤＮＡ断片を作製することである。例えば、特徴的な隣接ノナマーまたはヘプタマー配列（前傾）の存在により、および文献への参照により、追加のＤセグメント遺伝子を同定することができる。
　重鎖小遺伝子座トランスジェンを作製するのには、少なくとも１つ、好ましくは複数のＶ遺伝子セグメントが使われる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセグメントは、「異種性抗体を生産することができるトランスジェニック非−ヒト動物」（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　Ａｒｔｉｂｏｄｉｅｓ）と称する。１９９２年３月１９日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８に記載の通りに単離することができる。
　隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセグメント、Ｄセグメント、ＪセグメントおよびＣ遺伝子は、１９９２年３月１９日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９２／０３９１８に記載の通りに単離することができる。
　小遺伝子座軽鎖トランスジェンは、ヒトλまたはκ免疫グロブリン遺伝子座から同様にして作製することができる。すなわち、例えば、複数のＤＮＡ断片、少なくとも２つ、３つまたは４つのＤＮＡ断片から、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常領域配列（各配列はヒト遺伝子配列に実質的に相同である）をコードする、例えば約７５ｋｂの、免疫グロブリン重鎖小遺伝子座トランスジェン構成物を形成せしめることができる。好ましくは、前記配列は転写調節配列に作用可能に連結され、そして再配列を受けることができる。２以上の適当に置かれた定常領域配列（例えばμおよびγ）およびスイッチ領域では、スイッチ組換えも起こる。典型的な軽鎖トランスジェン構成物は、１９９０年８月２９日出願の同時係属出願ＵＳＳＮＯ７／５７４，７４８に記載の通りに、ヒトＤＮＡに実質的に相同であり且つ再配列を受けることのできる複数のＤＮＡ断片から同様に形成せしめることができる。
　（Ｅ．イソタイプスイッチを受けることができるトランスジェン構成物）
　理想的には、クラススイッチを受けることになっているトランスジェン構成物は、繁殖不能転写物を調節するのに必要なシス作用性配列の全てを含むべきである。天然に存在するスイッチ領域並びに上流のプロモーターおよび調節配列（例えばＩＦＮ誘導性要素）は、イソタイプスイッチを受けることができるトランスジェン構成物中に含まれる好ましいシス作用性配列である。スイッチ領域、好ましくはヒトγ１スイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約５０塩基対、好ましくは少なくとも約２００塩基対、より好ましくは少なくとも５００〜１０００塩基対またはそれ以上の配列が、スイッチ配列、好ましくはヒトγ１スイッチ配列に作用可能に連結されるだろう。更に、スイッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣に天然には存在しないＣＨ遺伝子の上流に（且つ近隣に）連結せしめることができる。例えば、限定のつもりでないが、ヒトγ１スイッチ領域をヒトα２ＣＨ遺伝子の上流に連結してもよく、またはマウスγ１スイッチ領域をヒトＣＨ遺伝子に連結してもよい。
　トランスジェニックマウスにおいて非古典的イソタイプスイッチ（例えばδ−関連欠失）を得るための別法は、ヒトμ遺伝子に隣接する４００ｂｐの直接反復配列（σμおよびεμ）〔Ｙａｓｕｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１３９９（１９８９））の包含を伴う。それらの二配列の間の相同組換えはＩｇＤ型のみのＢ細胞においてμ遺伝子を欠失せしめる。重鎖トランスジェンは、次の式によって表すことができる：
　（ＶＨ）ｘ−（Ｄ）ｙ−（ＪＨ）ｚ−（ＳＤ）ｍ−（Ｃ１）ｎ−［（Ｔ）−（ＳＡ）ｐ−（Ｃ２）］ｑ上式中、
　ＶＨは重鎖可変領域遺伝子セグメントであり、
　Ｄは重鎖Ｄ（多様性）領域遺伝子セグメントであり、
　ＪＨは重鎖Ｊ（連結）領域遺伝子セグメントであり、
　ＳＤはイソタイプスイッチが起こるようなＳａ受容体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる供与体領域セグメントであり、
　Ｃ１はＢ細胞発達において使われるイソタイプ（例えばμまたはδ）をコードする重鎖定常領域遺伝子セグメントであり、
　Ｔは少なくともプロモーターを含有するシス作用性転写調節領域セグメントであり、
　ＳＡはイソタイプスイッチが起こるような選択されたＳＤ供与体領域セグメントとの組換え現象に参加することのできる受容体領域セグメントであり、
　Ｃ２はμ以外のイソタイプ（例えばγ１，γ２，γ３，γ４，α１，α２，ε）をコードする封鎖定常領域遺伝子セグメントであり、
　ｘ，ｙ，ｚ，ｍ，ｎ，ｐおよびｑは整数であり、ｘは１〜１００、ｎは０〜１０、ｙは１〜５０、ｐは１〜１０、ｚは１〜５０、ｑは０〜５０、ｍは０〜１０である。典型的には、トランスジェンがイソタイプスイッチを受けることができる時、ｑは少なくとも１であり、ｍは少なくとも１であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｍはｎと等しいかまたはそれより大きくなければならない。
　ＶＨ，Ｄ，ＪＨ，ＳＤ，Ｃ１，Ｔ，ＳＡおよびＣ２セグメントは様々な種、好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞ＤＮＡから選択することができる。
　ＶＨセグメントは、ヒト生殖細胞中に天然に存在するＶＨセグメント、例えばＶＨ２５１から選択することができる。典型的には、約２個のＶＨセグメント、好ましくは約４個、より好ましくは少なくとも約１０個のＶＨセグメントが含まれる。
　典型的には少なくとも１個のＤセグメントが含まれるが、好ましくは少なくとも１０個のＤセグメントが含まれ、態様によっては、１０個以上のＤセグメントが含まれる。幾つかの好ましい態様はヒトＤセグメントを含む。
　典型的には少なくとも１個のＪＨセグメントがトランスジェンに含まれるが、約６個のＪＨセグメントを含むことが好ましく、幾つかの好ましい態様は約６個以上のＪＨセグメントを含み、非ヒトＪＨセグメントを１つも含まない。
　ＳＤセグメントは該トランスジェンのＳＡセグメントとの組換え現象に参加することができる供与体領域である。古典的なイソタイプスイッチでは、ＳＤおよびＳＡ領域はＳμ，Ｓγ１，Ｓγ２，Ｓγ３，Ｓγ４，Ｓα，Ｓα２およびＳεといったスイッチ領域である。好ましくは、スイッチ領域はマウスまたはヒトであり、より好ましくはＳＤがヒトまたはマウスＳμであり、ＳＡがヒトまたはマウスＳγ１である。非古典的イソタイプスイッチ（δ関連欠失）では、ＳＤおよびＳＡ領域は、好ましくはヒトμ遺伝子に隣接する４００塩基対の直接反復配列である。
　Ｃ１セグメントは、典型的にはμまたはδ遺伝子であり、好ましくはμ遺伝子であり、より好ましくはヒトまたはマウスμ遺伝子である。
　Ｔセグメントは、典型的には天然に存在する（即ち生殖細胞）スイッチ領域に隣接する５’隣接配列を含む。Ｔセグメントは典型的には長さが少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約２００ヌクレオチド、より好ましくは長さが少なくとも５００〜１０００ヌクレオチドである。好ましくはＴセグメントは、生殖細胞配置においてヒトまたはマウススイッチ領域のすぐ上流に存在する５’隣接配列である。前記Ｔセグメントが動物の生殖細胞に天然に存在しないシス作用性転写調節配列（例えばウイルスのエンハンサーおよびプロモーター、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、および真核細胞に感染する他のウイルス中に見つかるもの）を含んでもよいことは当業者にとって明白である。
　Ｃ２セグメントは、典型的にはγ１，γ２，γ３，γ４，α１，α２またはεＣＨ遺伝子であり、好ましくはそれらのイソタイプのヒトＣＨ遺伝子であり、より好ましくはヒトγ１またはγ３遺伝子である。様々な種からの下流（スイッチされる）イソタイプ遺伝子としてマウスγ２ａおよびγ２ｂを使ってもよい。重鎖トランスジェンが免疫グロブリン重鎖小遺伝子座を含む場合、該トランスジェンの全長は典型的には１５０キロ塩基対未満であろう。
　一般に、該トランスジェンは、生来の重鎖Ｉｇ遺伝子座以外のものであるだろう。例えば、不必要な領域の欠失または他の種からの対応領域との置換が存在するだろう。
　（Ｆ．Ｉｇトランスジェン中の機能的イソタイプスイッチを決定する方法）
　トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイッチの発生は、当業界で公知である任意の方法によって同定することができる。好ましい態様としては次のものが挙げられ、それらは単独でまたは組み合わせて使用される。
　１．δ以外の少なくとも１つのトランスジェン下流ＣＨ遺伝子に相同である配列とトランスジェンＶＨ−ＤＨ−ＪＨ再配列された遺伝子に相同である隣接配列とを含有するｍＲＮＡ転写物の検出；そのような検出はノーザンハイブリダイゼーション、Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡクローニングまたはその他の方法によることができる。
　２．トランスジェニック動物の血清中の、または該トランスジェニック動物のＢ細胞から作製したハイブリドーマ細胞の培養上清中の、下流ＣＨ遺伝子によりコードされる免疫グロブリンタンパク質の検出。ここで免疫化学的方法により、そのようなタンパク質が機能的可変領域を含んで成ることを証明することもできる。
　３．トランスジェニック動物のＢ細胞からのＤＮＡ中の、またはハイブリドーマ細胞からのゲノムＤＮＡ中の、該トランスジェン中のイソタイプスイッチの発生と一致するＤＮＡ再配列の検出。そのような検出はサザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、ゲノムクローニングまたは他の方法によって達成することができる。
　４．イソタイプスイッチの他の徴候、例えば繁殖不能転写物の産生、スイッチに関与する特徴的な酵素の産生（例えば「スイッチレコンビナーゼ」）、あるいは現行技術によって検出、測定または観察され得る他の徴候の同定。
　各々のトランスジェニック系列はトランスジェンの異なる組み込み部位とトランスジェン挿入断片の潜在的に異なる縦列整列を表し、そしてトランスジェンと隣接ＤＮＡ配列の各々の異なる配置は遺伝子発現に影響を与え得るため、高レベルのヒト免疫グロブリン、特にＩｇＧイソタイプのものを発現し、且つ最少コピー数の該トランスジェンを含有するマウスの系統を同定しそれを使用することが好ましい。単一コピーのトランスジェニック動物は、起こり得る不完全な対立遺伝子発現の問題を最少にする。トランスジェンは典型的には宿主染色体ＤＮＡ中、最も普通には生殖細胞ＤＮＡ中に組み込まれ、そしてその後の生殖細胞系列トランスジェニック飼育用動物の飼育によって繁殖される。しかしながら、実施者は、適宜および所望により、当業界において既知であるかまたは後に開発される他のベクターおよびトランスジェニック法に置換することができる。
　（Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子鎖の機能的破壊）
　好結果に再配列された免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジェンの発現は、トランスジェニック非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子の再配列を抑制することにより優性作用を有すると予想される。しかしながら、内因性抗体を欠く非ヒト動物を生成せしめる別の方法は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を突然変異せしめることによるものである。胎児性幹細胞技術および相同組換えを使って、内因性免疫グロブリンレパートリーを容易に排除することができる。下記はマウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊を説明する。しかしながら、開示されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物における使用に合わせて容易に改変することができる。
　簡単に言えば、この技術は、生殖細胞組織に分化することができる多分化能性細胞系における、相同組換えによる遺伝子の不活性化を包含する。マウス免疫グロブリンの変更コピーを含むＤＮＡ構成物を胎児性幹細胞の核に導入する。その細胞の一部において、導入されたＤＮＡマウス遺伝子の内因性コピーと組み換わり、それを変更コピーで置き換える。新たに操作された遺伝的損傷を含む細胞を宿主マウス胚に注入し、それを受容体の雌に再移植する。それらの胚の一部が変異細胞系に完全に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発達する。従って、キメラマウスを交配することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新規系列を獲得することが可能である〔Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２により概説されている〕。
　マウスλ遺伝子座は免疫グロブリンのわずか５％に寄与するため、重鎖および／またはκ軽鎖遺伝子座の不活性化で十分である。それらの遺伝子座の各々を破壊するのには３つの方法があり、Ｊ領域の欠失、Ｊ−Ｃイントロンエンハンサーの欠失、および終結コドンの導入による定常領域コード配列の破壊である。ＤＮＡ構成物デザインの見地から、最後の方法の選択が最も簡単である。μ遺伝子の排除はＢ細胞の成熟を破壊し、それによっていずれかの機能的重鎖セグメントにクラススイッチすることを防ぐ。それらの遺伝子座を破壊（ノックアウト）する方策を下記に概説する。
　マウスμおよびκ遺伝子を破壊するためには、Ｊａｅｎｉｓｃｈおよび共同研究者〔Ｚｉｊｌｓｔｒａら（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４３５−４３８〕によりマウスβ２ミクログロブリン遺伝子の好結果の破壊に使われたデザインを基にした標的ベクターを用いる。プラスミドｐＭＣＩｎｅｏからのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を標的遺伝子のコード領域中に挿入する。ｐＭＣＩｎｅｏ挿入断片はｎｅｏ発現を指令するのにハイブリッドウイルスプロモーター／エンハンサー配列を使う。このプロモーターは胎児性幹細胞中で活性である。従って、破壊（ノックアウト）構成物の組込みのための選択マーカーとしてｎｅｏを使うことができる。ランダム挿入現象に対する陰性選択マーカーとしてＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を該構成物の末端に付加する（Ｚｉｊｌｓｔｒａら、前掲）。
　重鎖遺伝子座を破壊するための好ましい方策はＪ領域の削除である。この領域はマウスではかなり小さく、わずか１．３ｋｂに及ぶ。遺伝子標的ベクターを作製するために、分泌されるＡ定常領域エクソンの全部を含む１５ｋｂのＫｐｎＩ断片をマウスゲノムライブラリーから単離する。１．３ｋｂのＪ領域をｐＭＣＩｎｅｏからの１．１ｋｂ挿入断片により置き換える。次いで該ＫｐｎＩ断片の５’末端にＨＳＶｔｋ遺伝子を付加する。相同組換えによるこの構成物の正しい組込みは、ｎｅｏ遺伝子によるマウスＪＨ領域の置換をもたらすだろう。ｎｅｏ遺伝子を基にしたプライマーとＤ領域中のＫｐｎＩ部位の５’のマウス配列に相同のプライマーとを使って、ＰＣＲにより組換え体をスクリーニングする。
　あるいは、μ遺伝子のコード領域を破壊することにより重鎖遺伝子座を破壊（ノックアウト）する。このアプローチは、上記のアプローチで使ったものと同じ１５ｋｂのＫｐｎＩ断片を必要とする。ｐＭＣＩｎｅｏからの１．１ｋｂ挿入断片をエクソン五中のユニークＢａｍＨＩ部位の目ところに挿入し、そしてＨＳＫｔｋ遺伝子を３’ＫｐｎＩ末端に付加する。ｎｅｏ挿入断片の片側における二重交差（これはｔｋ遺伝子を削除する）を選択する。それらは、選択されたクローンのプールからＰＣＲ増幅により検出される。ＰＣＲプライマーの一方はｎｅｏ配列に由来し、そして他方は標的ベクターの外側のマウス配列に由来する。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊は実施例に記載される。
　（Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現の抑制）
　内因性Ｉｇ遺伝子座の機能的破壊に加えて、内因性Ｉｇ遺伝子座の発現を防ぐ別の方法は抑制である。内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、１または複数の組み込まれたトランスジェンから産生されるアンチセンスＲＮＡにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、および／または１または複数の内因性Ｉｇ鎖に特異的な抗血清の投与により達成することができる。
　（アンチセンスポリヌクレオチド）
　特定の遺伝子の発現を部分的または全体的に破壊するためにアンチセンスＲＮＡトランスジェンを使うことができる〔Ｐｅｐｉｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５５：７２５；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．およびＴｏｕｌｍｅ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１０４９：９９；Ｓｔｏｕｔ，Ｊ．およびＣａｓｋｅｙ，Ｔ．（１９９０）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３６９；Ｍｕｎｉｒら（１９９０）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３８３；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
　「アンチセンスポリヌクレオチド」は、（１）参照配列、例えば内因性ＩｇのＣＨまたはＣＬ領域配列の全部または一部に相補的であり、且つ（２）相補的な標的配列、例えば染色体遺伝子座またはＩｇ　ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションが該ポリヌクレオチドの機能的性質として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失または転位を含んでもよい。相補的アンチセンスポリヌクレオチドとしては、個々のｍＲＮＡ種に特異的にハイブリダイズしそして該ｍＲＮＡ種の転写および／またはＲＮＡプロセシングおよび／またはコードされるポリペプチドの翻訳を防ぐことができる、可溶性アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる〔Ｃｈｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１０００６−１００１０（１９８９）；Ｂｒｏｄｅｒら、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１３：６０４−６１３（１９９０）；Ｌｏｒｅａｕら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７４：５３−５６（１９９０）；Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇら、ＷＯ９１／１１５３５；Ｕ，Ｓ．Ｓ．Ｎ　０７／５３０，１６５（「新規ヒトＣＲＩＰＴＯ遺伝子」）；ＷＯ９１／０９８６５；ＷＯ９１／０４７５３；ＷＯ９０／１３６４１およびＥＰ３８６５６３；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。アンチセンス配列は、長さが少なくとも約１５の連続ヌクレオチド、より好ましくは長さが約３０以上の連続ヌクレオチドの少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子配列に相補的であるポリヌクレオチド配列である。しかしながら、或る態様では、アンチセンスポリヌクレオチドの特性として特異的ハイブリダイゼーションが保持される限り、アンチセンス配列は相補的免疫グロブリン遺伝子配列に比較して置換、付加または欠失を有することができる。一般的に、アンチセンス配列は、免疫グロブリン鎖をコードするか、またはＤＮＡ再配列後に免疫グロブリン鎖をコードする潜在能力を有する内因性免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である。ある場合には、免疫グロブリン遺伝子配列に一致するセンス配列が特に転写を妨害することによって発現を抑制する働きをすることがある。
　従ってアンチセンスポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの産生を阻害する。この点に関して、１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の転写および／または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、内因性Ｉｇ遺伝子座によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する非ヒト動物の能力および／または特異性を変更することができる。
　アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞中、例えば個体の造血幹細胞集団の全部または一部を再構成するのに使われるトランスジェニック多分化能性造血幹細胞中、あるいはトランスジェニック非ヒト動物中で異種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、試験管内では培地中または生体内では循環系もしくは間質液中のいずれかの外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含んで成ることができる。外部環境中に存在する可溶性アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞質に接近しそして特定のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが証明されている。ある態様では、アンチセンスポリヌクレオチドがメチルホスホネート成分を含んで成るか、あるいはホスホロチオネートまたはＯ−メチルリボヌクレオチドを使用してもよく、そしてキメラオリゴヌクレオチドを使用してもよい〔Ｄａｇｌｅら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８；４７５１〕。ある用途には、アンチセンスオリゴヌクレオチドはポリアミド核酸を含んでもよい〔Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１４９７〕。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般法については、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ＤＮＡ（１９８８），Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ編，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。
　１または複数の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを使って、転写、ＲＮＡプロセシング、および／または同起源のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害し、それによってコードされる各ポリペプチドの量を減少させる。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内で１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の形成を阻害することにより治療機能を提供することができる。
　可溶性アンチセンスポリヌクレオチドとしてまたはアンチセンストランスジェンから転写されたアンチセンスＲＮＡとしてのいずれにせよ、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内の生理的状態において内因性Ｉｇ配列に優先的にハイブリダイズするように選択される。最も典型的には、選択されたアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の重鎖または軽鎖トランスジェンによりコードされる異種Ｉｇ配列にそれほど多くはハイブリダイズしないだろう（即ち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約２５〜３５％以上トランスジェンＩｇｆ発現を阻害しないであろう）。
　（抗血清抑制）
　内因性Ｉｇ鎖発現の部分的または完全な抑制は、マウスに１または複数の内因性Ｉｇ鎖に対する抗血清を注入することにより達成することができる〔Ｗｅｉｓｓら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：２１１；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。抗血清は、１または複数の内因性Ｉｇ鎖とは特異的に反応するが本発明のＩｇトランスジェンによりコードされる異種Ｉｇ鎖とは最少の反応性を有するかまたは全く反応性を持たないように選択される。よって、Ｗｅｉｓｓら（前掲）のものにより代表されるようなスケジュールに従った選択抗血清の投与は、内因性Ｉｇ鎖発現を抑制するが本発明のトランスジェンによりコードされる１または複数の異種Ｉｇ鎖の発現を許容する。
　（核酸）
　「実質的相同性」なる用語は、２つの核酸またはデザインしたその配列を最適に整列しそして比較した時に、少なくとも約８０％のヌクレオチド、通常は少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％のヌクレオチドが同一であることを指摘する。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする時、実質的相同性が存在する。核酸は完全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形で、存在することができる。核酸は、標準技術により、例えばアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド沈降、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当業界で公知の他の方法により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞性核酸もしくはタンパク質から分離精製された時、「単離され」または「実質的に純粋にされ」る。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと。
　本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って、しばしばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは混合物のいずれかからの生来の配列（修飾された制限部位等を除く）を変異せしめることができる。コード配列については、それらの変異は、所望であればアミノ酸配列に影響してもよい。特に生来のＶ，Ｄ，Ｊ，定常，スイッチおよび他の本明細書中に記載のそのような配列に実質的に相同であるかまたはそれから誘導されるＤＮＡ配列が考えられる（ここで、「誘導される」とは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは変更されていることを指摘する）。
　核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される」という。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に作用するならば、それらはコード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列については、作用可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続であって、そして２種のタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、連続であって且つ読み枠内であることを意味する。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、該配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。
　（特定の好ましい態様）
　本発明の好ましい態様は、実施例５，６，８または１４に記載の軽鎖トランスジェンの単一コピーを含有する動物と交配させた実施例１２に記載のトランスジェン（例えばｐＨＣ１またはｐＨＣ２）の少なくとも１回のコピー、典型的には２〜１０回のコピー、時には２５〜５０回以上のコピーを含有する動物、並びに実施例１０に記載のＪＨ欠失動物から繁殖させた子孫である。動物はそれらの３つの特性について同型接合に交配される。そのような動物は次の遺伝子型を有する：再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座（実施例１２に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、再配列されたヒトκ軽鎖構成物（実施例１４に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、および機能的ＪＨセグメントの全部を除去する各内因性マウス重鎖遺伝子座のところの欠失（実施例１０に記載）。そのような動物は、ＪＨセグメントあ欠失について同型接合であるマウスと交配させる（実施例１０）と、ＪＨ欠失について同型接合でありそしてヒト重鎖および軽鎖構成物については半接合である子孫を生産する。生じた動物に抗原を注入し、それらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生に使う。
　そのような動物から単離されたＢ細胞は、それらが各遺伝子の単一コピーのみを含むため、ヒト重鎖および軽鎖に関して単一特異性である。更に、それらはヒトまたはマウス重鎖に関して単一特異性であろう。というのは、実施例９および１２に記載のようにして導入されたＪＨ領域に広がる欠失によって、両方の内因性マウス重鎖遺伝子コピーが非機能的であるためである。更に、Ｂ細胞の実質的部分はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異性であろう。何故なら、再配列されたヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、Ｂ細胞の実質的部分における内因性マウスκおよびλ鎖遺伝子の再配列を対立的におよび同位的に排除するだろうからである。
　好ましい態様のトランスジェニックマウスは、理想的には生来のマウスのものと実質的に同じである、有意なレパートリーを有する免疫グロブリン産生を示すだろう。例えば、内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されている態様では、総免疫グロブリンレベルは約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ血清、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌ、理想的には少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲であろう。ＩｇＭからＩｇＧにスイッチすることができるトランスジェンをトランスジェニックマウスに導入した時、血清ＩｇＧ対ＩｇＭの成熟マウス比は好ましくは約１０：１である。もちろん、ＩｇＧ対ＩｇＭ比は、未成熟マウスではずっと低いだろう。一般に、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の約１０％より多く、好ましくは４０〜８０％が、もっぱらヒトＩｇＧタンパク質のみを発現する。
　レパートリーは理想的には非トランスジェニックマウス中にしめされるものとほぼ等しく、通常は少なくとも約１０％ほど高く、好ましくは２５〜５０％またはそれ以上高いだろう。マウスゲノム中に導入される異なるＶ，ＪおよびＤ領域の数に主として依存して、通常少なくとも約１０００種の異なる免疫グロブリン（理想的にはＩｇＧ）、好ましくは１０４〜１０６またはそれ以上の免疫グロブリンが産生されるだろう。それらの免疫グロブリンは、典型的には、高抗原性タンパク質の約半分またはそれ以上を認識するだろう。抗原性タンパク質としては、ハトチトクロームＣ、ニワトリリゾチーム、アメリカヤマゴボウのマイトジェン（ＰＷＭ）、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、インフルエンザ赤血球凝集素、スタフィロコッカスプロテインＡ、マッコウクジラミオグロビン、インフルエンザノイラミニダーゼおよびλリプレッサ一夕ンパク質が挙げられるがそれに限定されない。上記免疫グロブリンの幾つかは、予め選択された抗原に対して、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１またはそれ以上の親和性を示すだろう。
　様々な重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含むトランスジェンの再配列の前に、それらの遺伝子セグメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定により、トランスジェニック動物以外の生物種に由来するものであると容易に同定することができる。
　上記に本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様を記載したけれども、他の態様は本明細書の開示により、そしてより特定的には実施例に記載のトランスジェンにより定義される。トランスジェニック動物の４つのカテゴリーが定義され得る：
　Ｉ．再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジェンと再配列された軽鎖免疫グロブリントランスジェンとを含有するトランスジェニック動物。
　ＩＩ．再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジェンと再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランスジェンとを含有するトランスジェニック動物。
　ＩＩＩ．再配列された重鎖免疫グロブリントランスジェンと再配列されていない軽鎖免疫グロブリントランスジェンとを含有するトランスジェニック動物。
　ＩＶ．再配列された重鎖免疫グロブリントランスジェンと再配列された軽鎖免疫グロブリントランスジェンとを含有するトランスジェニック動物。
　トランスジェニック動物の上記カテゴリーの好ましい優先順序は、内因性軽鎖遺伝子（または少なくともκ遺伝子）が相同組換え（または他の方法）により破壊されている場合にはＩＩ＞Ｉ＞ＩＩＩ＞ＩＶであり、そして内因性軽鎖遺伝子が破壊されておらず且つ対立遺伝子排除により優性になるに違いない場合にはＩ＞ＩＩ＞ＩＩＩ＞ＩＶである。
　（実施例）
　（方法および材料）トランスジェニックマウスは、Ｈｏｇａｎら、”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ１”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って誘導される。
　胎児性幹細胞は、発表された方法に従って操作される〔Ｔｅｒａｔｏ−ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８７；Ｚｊｉｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：４３５−４３８（１９８９）およびＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ，Ｐ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６；７９９−８０３（１９８９）；この各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。
　ＤＮＡクローニング方法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って実施される。
　オリゴヌクレオチドは、製造業者により与えられた規格書に従ってＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのオリゴヌクレオチド合成装置上で合成される。
　ハイブリドーマ細胞および抗体は、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ　Ｌａｎｅ編，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って操作される。
　（実施例１）
　（ゲノム重鎖ヒトＩｇトランスジェン）
　この実施例は、マウスの接合子中にマイクロインジェクトされるヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジェンのクローニングとマイクロインジェクションを記載する。
　Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．ら、”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，８９−１２９頁，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）により記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはＰＢＳで洗浄したヒト精母細胞）を低融点アガロース母材中に埋め込み、ＥＤＴＡとプロテイナーゼＫで溶解せしめて高分子量ＤＮＡを暴露させ、このＤＮＡを次いでＭ．ＦｉｎｎｅｙによりＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，増補４版，１９８８，第２．５．１章）中に記載された通りにアガロース中で制限酵素ＮｏｔＩで消化する。
　次いでＮｏｔＩ消化されたＤＮＡを、Ａｎａｎｄ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１７：３４２５−３４３３（１９８９）により記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分画する。ＮｏｔＩ断片に富む画分をサザンブロットハイブリダイゼーションによりアッセイし、この断片によりコードされる１または複数の配列を検出する。そのような配列は、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメント、μおよびγ１定常領域と一緒に６種のＶＨファミリーの全部の代表物を含む〔この断片は、Ｂｅｒｍａｎら（１９８８）前掲によりＨｅＬａ細胞から６７０ｋｂ断片として同定されているが、本発明者らはヒト胎盤および精子ＤＮＡからは８３０ｋｂ断片としてであることを発見した）。このＮｏｔＩ断片を含む画分（図４参照）をプールし、そして酵母細胞中のベクターｐＹＡＣＮＮのＮｏｔＩ部位にクローニングする。プラスミドｐＹＡＣＮＮは、ｐＹＡＣ−４Ｎｅｏ〔Ｃｏｏｋ，Ｈ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：１１８１７（１９８８）〕をＥｃｏＲＩで消化しそしてオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’の存在下で連結せしめることにより調製する。
　Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎら（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１３４８−１３５１およびＧｒｅｅｎ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７；１２１３−１２１７（１９９０）（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにして、重鎖ＮｏｔＩ断片を含むＹＡＣクローンを単離する。Ｍ．Ｆｉｎｎｅｙ（前掲）により記載されたパルスフィールドゲル電気泳動により、高分子量酵母ＤＮＡからクローン化ＮｏｔＩ挿入断片を単離する。１ｍＭのスペルミンの添加によりこのＤＮＡを凝縮させ、上述の単細胞胚の核に直接マイクロインジェクトする。
　（実施例２）
　（生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトＩｇトランスジェン）
　ヒトκ軽鎖の地図はＬｏｒｅｎｚ．Ｗ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：９６６７−９６７７（１９８７）に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
　全てのＣκ、３’エンハンサー、全てのＪセグメントおよび少なくとも５つの異なるＶセグメントを含む４５０ｋｂのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を実施例１に記載の如く単離し、そして単一の細胞胚の核の中にマイクロインジェクトする。
　（実施例３）
　（生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトＩｇトランスジェン）
　前記成分の全部と少なくとも２０個多いＶセグメントとを含む７５０ｋｐＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ断片を実施例１に記載の如く単離し、そしてＢｓｓＨＩＩで消化して約４００ｋｂの断片を生成せしめる。
　４５０ｋｂＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片と約４００ｋｂ　ＭｌｕＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片は、ＢｓｓＨＩＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位とにより限定される配列重複を有する。マウス接合子のマイクロインジェクションによるそれらの２断片の相同組換えは、４５０ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片（実施例２）中に見つかるものよりも少なくとも１５〜２０個追加のＶセグメントを含むトランスジェンをもたらす。
　（実施例４）
　（重鎖小遺伝子座の作製）
　（Ａ．ｐＧＰ１およびｐＧＰ２の作製）
　ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩとＳｔｙＩで消化し、下記のオリゴヌクレオチドと連結せしめることにより、図８に記載の制限部位を有する１４７塩基対の挿入断片を含むｐＧＰ１を作製する。それらのオリゴの概括的重複は図９にも示される。
　オリゴヌクレオチドは下記のものである：
Figure 2004008218
 　このプラスミドは、マイクロインジェクション用のベクター配列から単離することができる大挿入断片を構築するための、稀少な切断性ＮｏｔＩ部位により隣接された大きなポリリンカーを含む。このプラスミドは、ｐＵＣ系プラスミドに比べて比較的低コピー数であるｐＢＲ３２２に由来する（ｐＧＰｌは複製開始点の近くにｐＢＲ３２２コピー数調節領域を保持している）。低コピー数は挿入配列の潜在的毒性を減少させる。加えて、ｐＧＰ１は、アンピシリン耐性遺伝子と前記ポリリンカーとの間に挿入された、ｔｒｐＡ由来の強力な転写ターミネ一夕ー配列〔Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：４１８０（１９８１）〕も含む。これは、アンピシリンプロモーターから起こる読み通し転写を防ぐことにより、或る種の挿入断片に関係する毒性を減少させる。
　プラスミドｐＰＧ２は、ポリリンカー中に追加の制限部位（ＳｆｉＩ）を導入するようにｐＧＰ１から誘導される。ｐＧＰｌをＭｌｕＩとＳｐｅＩで消化し・該プラスミドのポリリンカー部分の中の認識配列を切除する。このように消化されたｐＧＰ１に次のアダプターオリゴヌクレオチドを連結せしめてｐＧＰ２を作製する。
　５’　ＣＧＣＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡ　３’
　５’　ＣＴＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＧＧＣＣＡ　３’
　ｐＧＰ２はＭｌｕＩ部位とＳｐｅＩ部位の間に置かれた追加のＳｆｉＩ部位を含むこと以外はｐＧＰｌと同じである。これは挿入断片をＳｆｉＩで並びにＮｏｔＩで完全に切除することを可能にする。
　（Ｂ．ｐＲＥ３（ラットエンハンサー３’）の作製）
　ラット定常領域の下流に置かれたエンハンサー配列を重鎖構成物中に導入する。
　Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４：１６５−１６８（１９９０）により記載された重鎖領域３’エンハンサーを単離し、クローニングする。次のオリゴヌクレオチド：
５’ＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＧＧＣＴＴＧＣ３’
５’ＧＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＴＣＣ３’
を使って、ラットＩＧＨ３’エンハンサー配列をＰＣＲ増幅せしめる。
　こうして形成された３’エンハンサーをコードする二本鎖ＤＮＡをＢａｍＨＩとＳｐｈＩで切断し、ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで切断されたｐＧＰ２中にクローニングしてｐＲＥ３（ラットエンハンサー３’）を得る。
　（Ｃ．ヒトＪ一μ領域のクローニング）
　この領域の実質的部分を、λファージ挿入断片から単離された２以上の断片を組み合わせることによりクローニングする。図９を参照のこと。
　オリゴヌクレオチドＧＧＡＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧを使って、全部のヒトＪセグメントを含む６．３ｋｂ　ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片〔Ｍａｔｓｕｄａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７：１０４７−１０５１（１９８８）；Ｒａｖｅｔｅｃｈら、Ｃｅｌｌ　２７：５８３−５９１（１９８１）、これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕をヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離する。
　オリゴヌクレオチドＣＡＣＣＡＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡを使って、エンハンサー、スイッチおよび定常領域コードエクソンを含む隣接の１０ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片〔Ｙａｓｕｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１３９９−１４０３（１９８９）〕を同様にして単離する。
　プローブとしてクローンｐＭＵＭ挿入断片（ｐＭＵＭは、μ膜エクソン１オリゴヌクレオチド：ＣＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴを使ってヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離された４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片である）を使って隣接の３’　１．５ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を同様に単離し、そしてｐＵＣ１９中にクローニングする。
　ｐＧＰ１をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで消化した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理する。
　図９からの断片（ａ）および（ｂ）を前記消化ｐＧＰ１中にクローニングする。次いで５’ＢａｍＨＩ部位がＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ融合により破壊されるように置かれたクローンを単離する。それをｐＭＵと命名する（図１０参照）。ｐＭＵをＢａｍＨＩで消化し、
図９からの断片（ｃ）を挿入する。ＨｉｎｄＩＩＩ消化により方向性を確認する。生じたプラスミドｐＨＩＧ１（図１０）は、ＪおよびＣμセグメントをコードする１８ｋｂ挿入断片を含有する。
　（Ｄ．Ｃμ領域のクローニング）
　ｐＧＰ１をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理する（図１４）。このように処理された図１４の断片（ｂ）および図１４の（ｃ）を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＧＰｌ中にクローニングする。ＨｉｎｄＩＩＩ消化により断片（ｃ）の正しい方向を確認し、Ｃμ領域をコードする１２ｋｂ挿入断片を含むｐＣＯＮ１を得る。
　ｐＨＩＧ１は、ＮｏｔＩ部位により隣接されたポリリンカー中にＳｆｉＩ３’部位とＳｐｅＩ　５’部位を有する１８ｋｂ挿入断片内にＪセグメント、スイッチおよびμ配列を含む故に、再配列されたＶＤＪセグメントに使われるだろう。ｐＣＯＮ１はＪ領域を欠き１２ｋｂ挿入断片のみを含むこと以外はｐＨＩＧ１と同じである。再配列されたＶＤＪセグメントを含む断片の作製におけるｐＣＯＮ１の使用については後で記載する。
　（Ｅ．γ一１定常領域のクローニング（ｐＲＥＧ２））
　ヒトγ一１領域のクローニングは図１６に描写される。
　Ｙａｍａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：２１５２−２１５６（１９８６）は、組込み時に部分的に削除されたトランスジェン構成物からの膜結合ヒトγ一１の発現を報告している。彼らの結果は、３’ＢａｍＨＩ部位が、５ｋｂ未満のＶ−Ｃイントロンを有する経膜再配列されそしてスイッチされたγ遺伝子コピーを含む配列の輪郭となることを指摘している。従って、再配列されていないスイッチされていない遺伝子では、最初のγ一１定常エクソンの５’末端から５ｋｂ未満のところで始まる配列中にスイッチ領域全体が含まれる。従ってそれは５’　５．３ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片中に含まれる〔Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：４０７１−４０７９（１９８２）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ　２９：６７１−６７９（１９８２）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）もまた、この断片がスイッチ配列を含むことを報告しており、この断片と７．７ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とを合わせると我々がトランスジェン構成物に必要とする配列の全部を含むに違いない。イントロン配列は、特定遺伝子のイントロン中に存在する少なくとも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
　γ−１の第三エクソン（ＣＨ３）に特異的である次のオリゴヌクレオチドを使って、γ−１領域を含むファージクローンを同定し単離する。
５’　ＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧ
　　　ＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧ　３’
　７．７ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（図１１中の断片（ａ））をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩで切断されたｐＲＥ３中にクローニングしてｐＲＥＧ１を作製する。上流の５．３ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片（図１１中の断片（ｂ））をＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＲＥＧｌ中にクローニングしてｐＲＥＧ２を作製する。ＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ消化により正しい方向を確かめる。
　（Ｆ．ＣγとＣμの結合）
　上述したプラスミドｐＨＩＧ１はヒトＪセグメントとＣμ定常領域エクソンを含む。Ｃμ定常領域遺伝子セグメントを含むトランスジェンを提供するために、ｐＨＩＧ１をｓｆｉＩで消化した（図１０）。プラスミドｐＲＥＧ２もＳｆｉＩで消化し、ヒトＣγエクソンとラット３’エンハンサー配列を含む１３，５ｋｂ挿入断片を得た。それらの配列を連結し、３１．５ｋｂ挿入断片上にヒトＪセグメント、ヒトＣμ定常領域、ヒトＣγ１定常領域およびラット３’エンハンサー配列を含むプラスミドｐＨＩＧ３’を作製した（図１２）。
　ｐＣＯＮ１をＳｆｉＩで消化し、そしてｐＲＥＧ２をＳｆｉＩで消化して得られたヒトＣγ領域とラット３’エンハンサーとを含むＳｆｉＩ断片と連結せしめることにより、ヒトＣμおよびヒトＣγ１をコードするがＪセグメントを含まない第二のプラスミドを作製する。得られたプラスミドｐＣＯＮ（図１２）は、ヒトＣμ、ヒトγ１およびラット３’エンハンサー配列を有する２６ｋｂのＮｏｔＩ／ＳｐｅＩ挿入断片を含有する。
　（Ｇ．Ｄセグメントのクローニング）
　ヒトＤセグメントをクローニングするための方策は図１３に描写される。Ｄセグメントを含むヒトゲノムライブラリーからのファージクローンを、多様性領域配列〔Ｙ．ｌｃｈｉｈａｒａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７：４１４１−４１５０（１９８８）〕に特異的なプローブを使って同定しそして単離する。次のオリゴヌクレオチドを使用する。
Figure 2004008218
 　オリゴＤＸＰ１を使って同定されたファージクローンから、ＤＬＲ１，ＤＸＰ１，ＤＸＰ’１およびＤＡ１を含む５．２ｋｂ　ＸｈｏＩ断片（図１３中の断片（ｂ））を単離する。
　オリゴＤＸＰ４を使って同定されたファージクローンから、ＤＸＲ４，ＤＡ４およびＤＫ４を含む３．２ｋｂ　ＸｂａＩ断片（図１３中の断片（ｃ））を単離する。
　図１３中の断片（ｂ），（ｃ）および（ｄ）を結合し、ｐＧＰ１のＸｂａＩ／ＸｈｏＩ部位中にクローニングして、１０．６ｋｂ挿入断片を含むｐＨＩＧ２を形成せしめる。
　このクローニングは連続的に行われる。まず、図１３の５．２ｋｂ断片（ｂ）と図１３の２．２ｋｂ断片（ｄ）を子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてＸｈｏＩとＸｂａＩで消化されたｐＧＰｌ中にクローニングする。生じたクローンを該５．２ｋｂおよび２．２ｋｂ挿入断片を用いてスクリーニングする。５．２ｋｂおよび２．２ｋｂ挿入断片での試験に陽性であるそれらのクローンの半分が、ＢａｍＨＩ消化により確かめると正しい方向で５．２ｋｂ挿入断片を有する。次いで図１３の３．２ｋｂ　ＸｂａＩ断片を、断片（ｂ）と（ｄ）を含むこの中間プラスミド中にクローニングし、ｐＨＩＧ２を形成せしめる。このプラスミドは、ユニーク５’ＳｆｉＩ部位とユニーク３’ＳｐｅＩ部位を有するポリリンカー中にクローニングされた多様性セグメントを含む。完全なポリリンカーはＮｏｔＩ部位により隣接される。
　（Ｈ．重鎖小遺伝子座の作製）
　下記は、１または複数のＶセグメンントを含むヒト重鎖小遺伝子座の作製を説明する。
　Ｎｅｗｋｉｒｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１５１１−１５１８（１９８８）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）のハイブリドーマ中に含まれるＶセグメントとして同定されたものに相当する再配列されていないＶセグメントを、次のオリゴヌクレオチド：
　５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＴＴＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＴＣ−３’
を使って単離する。
　再配列されていないＶセグメントの制限地図を調べて、消化すると３’および５’隣接配列と一緒に再配列されていないＶセグメントを含む約２ｋｂの長さを有するＤＮＡ断片を提供するユニーク制限部位を同定する。５’開始配列はプロモーターおよび他の調節配列を含み、一方３’隣接配列はＶ−ＤＪ結合に必要な組換え配列を提供するだろう。この約３．０ｋｂ　Ｖセグメント挿入断片をｐＧＢ２のポリリンカー中にクローニングし、ｐＶＨ１を形成せしめる。
　ｐＶＨ１をＳｆｉＩで消化し、得られた断片をｐＨＩＧ２のＳｆｉＩ部位にクローニングしてｐＨＩＧ５’を作製する。ｐＨＩＧ２はＤセグメントのみを含むので、生成したｐＨＩＧ５’プラスミドはＤセグメントと一緒に単一のＶセグメントを含む。ｐＨＩＧ５中に含まれる挿入断片のサイズは、１０．６ｋｂ＋Ｖセグメント挿入断片のサイズである。
　ＮｏｔＩとＳｐｅＩでの消化によりｐＨＩＧ５から挿入断片を切り出す。Ｊ，ＣμおよびＣγ１セグメントを含むｐＨＩＧ３’をＳｐｅＩとＮｏｔＩで消化し、そして上記配列とラット３’エンハンサーとを含む３ｋｂ断片を単離する。それらの２断片を一緒にして、ＮｏｔＩで消化されたｐＧＰ１中に連結せしめ、Ｖセグメント、９つのＤセグメント、６っの機能的なＪセグメント、Ｃμ、Ｃγおよびラット３’エンハンサーを含むｐＨＩＧを作製する。この挿入断片のサイズは約４３ｋｂ＋Ｖセグメント挿入断片のサイズである。
　（Ｉ．相同組換えによる重鎖小遺伝子座の作製）
　前の章で指摘したように、ｐＨＩＧの挿入断片は単一のＶセグメントを使用すると約４３〜４５ｋｂである。この挿入断片サイズは、プラスミドベクター中に容易にクローニングすることができる限界かまたはそれに近い。より多数のＶセグメントの使用に備えるために、接合子またはＥＳ細胞内での相同組換えによってラット３’エンハンサー配列、ヒトＣμ、ヒトＣγ１、ヒトＪセグメント、ヒトＤセグメントおよび多数のヒトＶセグメントを含むトランスジェンを形成する、重複ＤＮＡ断片の生体内相同組換えを下記に記載する。
　ヒトＪセグメントを含む６．３ｋｂ　ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（図９中の断片（ａ）を参照のこと）を、次のアダプター：
　５’ＧＡＴＣＣＡＡＧＣＡＧＴ３’
　５’ＣＴＡＧＡＣＴＧＣＴＴＧ３’
　５’ＣＧＣＧＴＣＧＡＡＣＴＡ３’
　５’ＡＧＣＴＴＡＧＴＴＣＧＡ３’
を使って、ＭｌｕＩ／ＳｐｅＩで消化されたｐＨＩＧ５’中にクローニングする。
　生成したプラスミドをｐＨＩＧ５’０（重複）と命名する・このプラスミド中に含まれる挿入断片はヒトＶ，ＤおよびＪセグメントを含む。ｐＶＨ１からの単一Ｖセグメントが使われる時、この挿入断片のサイズは約１７ｋｂ＋２ｋｂである。この挿入断片を単離し、そしてヒトＪ，Ｃμ，γ１およびラット３’エンハンサー配列を含むｐＨＩＧ３’からの挿入断片と組み合わせる。両挿入断片は、２つのＤＮＡ断片の間の約６．３ｋｂの重複部分に備えるヒトＪ配列を含む。これらをマウス接合子中に同時注入すると、生体内相同組換えが起こり、ｐＨＩＧ中に含まれる挿入断片と同等のトランスジェンを生成する。
　このアプローチは生体内で形成されるトランスジェン中への多数のＶセグメントの付加に備える。例えば、単一のＶセグメントをｐＨＩＧ５’中に組み込む代わりに、（１）単離されたゲノムＤＮＡ、（２）ゲノムＤＮＡから誘導された連結ＤＮＡ、または（３）合成ＶセグメントレパートリーをコードするＤＮＡ、上に含まれる多数のＶセグメントをｐＨＩＧ２のＳｆｉＩ部位にクローニングしてｐＨＩＧ５’ＶＮを作製する。次いで
図９のＪセグメント断片（ａ）をｐＨＩＧ５’ＶＮ中にクローニングし、そして挿入断片を単離する。この挿入断片は、ｐＨＩＧ３’から単離した挿入断片上に含まれるＪセグメントと重複するＪセグメントと多数のＶセグメントを含むようになる。これをマウス接合子の核中に同時注入すると、相同組換えが起こり、多数のＶセグメントおよび多数のＪセグメント、多数のＤセグメント、Ｃμ領域、Ｃγ１領域（全てヒト由来）並びにラット３’エンハンサー配列をコードするトランスジェンを生成する。
　（実施例５）
　（軽鎖小遺伝子座の作製）
　（Ａ．ｐＥμ１の作製）
　ｐＥμ１の作製は図１６に描写される。オリゴ：
５’　ＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＧＡＧＧＣＴＣＴＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＡＣＴＧＡＣＴ　３’
を使ってファージクローンから６７８ｂｐのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片〔Ｊ．Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０（１９８３））においてマウス重鎖エンハンサーを単離する。
　このＥμ断片を、ＥｃｏＲＩ部位の平滑末端フィルインにより、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩ消化されたｐＧＰ１中にクローニングする。生じたプラスミドをｐＥμ１と命名する。
　（Ｂ．κ軽鎖小遺伝子座の作製）
　κ構成物は、少なくとも１つのヒトＶκセグメント、５つのヒトＪκセグメント全部、ヒトＪ−Ｃκエンハンサー、ヒトκ定常領域エクソン、および理想的にはヒト３’κエンハンサーを含む〔Ｋ．Ｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ．８：１９５９−１９６４（１９８９）〕。マウスのκエンハンサーはＣκから９ｋｂ下流である。しかしながら、ヒトではまだ同定されていない。加えて、該構成物はマウス重鎖Ｊ−Ｃμエンハンサーの１コピーも含む。
　この小遺伝子座は次の４つの成分断片から作製される：
（ａ）マウス遺伝子座との類推によりヒトＣκエクソンと３’ヒトエンハンサーとを含む１６ｋｂ　ＳｍａＩ断片；
（ｂ）５つのＪセグメント全部を含む５’隣接５ｋｂ　ＳｍａＩ断片；
（ｃ）ｐＥμ１から単離されたマウス重鎖イントロンエンハンサー（この配列は、Ｂ細胞発達のできるだけ初期に軽鎖構成物の発現を誘導するために含まれる。重鎖遺伝子は軽鎖遺伝子よりも初期に転写されるため、この重鎖エンハンサーはおそらくイントロンκエンハンサーよりも早い段階で活性であろう。）；および
（ｄ）１または複数のＶセグメントを含む断片。
　この構成物の調製は次の通りである。ヒト胎盤ＤＮＡをＳｍａＩで消化し、電気泳動によりアガロース上で分画する。同様に、ヒト胎盤ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、電気泳動により分画する。ＳｍａＩで消化したゲルから１６ｋｂ画分を単離し、同様にＢａｍＨＩで消化したＤＮＡを含むゲルから１１ｋｂ領域を単離する。
　１６ｋｂＳｍａＩ画分を、ＸｈｏＩで消化されＸｈｏＩ制限消化生成物をフィルインするためにクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼで処理されているラムダＦＩＸＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングする。１６ｋｂＳｍａＩ画分の連結はＳｍａＩ部位を破壊するがＸｈｏＩ部位はそのまま残す。
　１１ｋｂＢａｍＨＩ画分を、クローニング前にＢａｍＨＩで消化したラムダＦＩＸＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングする。
　各ライブラリーからのクローンを、Ｃκ特異的オリゴ：
５’ＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧ３’
を用いて探査する。
　ＣκがＳｍａＩに隣接するように、１６ｋｂ　ＸｈｏＩ挿入断片をＸｈｏＩで切断されたｐＥμ１中にサブクローニングする。生じたプラスミドをｐＫａｐ１と命名する。
　上記Ｃκ特異的オリゴヌクレオチドを用いてλＥＭＢＬ３／ＢａｍＨＩライブラリーを探査し、１１ｋｂクローンを同定する。５ｋｂＳｍａＩ断片（図２０の断片（ｂ））をサブクローニングし、次いでＳｍａＩで消化されたｐＫａｐ１中に挿入する。正しい方向のＪセグメント、ＣκおよびＥμエンハンサーを含むそれらのプラスミドをｐＫａｐ２と命名する。
　その後、１または複数のＶκセグメントをｐＫａｐ２のＭｌｕＩ中にサブクローニングし、ヒトＶκセグメント、ヒトＪκセグメント、ヒトＣκセグメントおよびヒトＥμエンハンサーをコードするプラスミドｐＫａｐＨを生ぜしめる。ｐＫａｐＨをＮｏｔＩで消化することによりこの挿入断片を切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製する。こうして精製された挿入断片を上述の如くマウス接合子の前核中にマイクロインジェクトする。
　（Ｃ．生体内相同組換えによるκ軽鎖小遺伝子座の作製）
　１１ｋｂＢａｍＨＩ断片を、その３’末端がＳｆｉＩ部位の方に向くように、ＢａｍＨＩで消化されたｐＧＰ１中にクローニングする。生じたプラスミドをｐＫＡＰｉｎｔと命名する。ｐＫＡＰｉｎｔ中のＢａｍＨＩ部位とＳｐｅＩ部位との間のポリリンカー中に１または複数のＶκセグメントを挿入してｐＫａｐＨＶを作製する。ｐＫａｐＨＶの挿入断片をＮｏｔＩでの消化により切り出し、そして精製する。ｐＫａｐ２からの挿入断片をＮｏｔＩでの消化により切り出し、精製する。それらの２断片の各々は、ｐＫａｐＨＶからの断片が、ｐＫａｐ２から得られる挿入断片中に含まれる５ｋｂ　ＳｍａＩ断片と実質的に相同であるＪκセグメントを含む５ｋｂのＤＮＡ配列を含むという点で、相同性領域を含有する。それ故に、それらの挿入断片は、マウス接合子中にマイクロインジェクトされると相同組換えして、Ｖκ，ＪκおよびＣκをコードするトランスジェンを形成することができる。
　（実施例６）
　（免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムクローンの単離）
　この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子のクローニングを記載する。そのような細胞は、与えられた免疫グロブリン遺伝子の多数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイブリドーマは４コピーのκ軽鎖遺伝子を含み、その２コピーは融合相手の細胞系からのものであり、２コピーは着目の免疫グロブリンを発現するもとのＢ細胞からのものである。それらの４コピーのうち、数個が再配列することができるという事実にもかかわらず、ただ１つだけが着目の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記載の手順は、κ軽鎖の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。
　（Ａ．二本鎖ｃＤＮＡ）
　ヒトハイブリドーマもしくはリンパ腫からの細胞、または細胞表面形態もしくは分泌形態またはその両形態のκ軽鎖含有ＩｇＭを合成する他の細胞系を、ポリＡ＋ＲＮＡの単離に使用する。次いで該ＲＮＡを、逆転写酵素を使ったオリゴｄＴ開始ｃＤＮＡの合成に使用する。次いで一本鎖ｃＤＮＡを単離し、ポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼ酵素を使って３’末端にＧ残基を付加する。次いでＧ末端が付けられた一本鎖ｃＤＮＡを精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：
５’−ＧＡＧＧＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’を使った第二鎖合成（ＤＮＡポリメラーゼ酵素により触媒される）のための鋳型として用いる。
　二本鎖ｃＤＮＡを単離し、発現される免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖をコードするｍＲＮＡの５’末端のヌクレオチド配列を決定するために使用する。次いで、それらの発現される遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現される軽鎖遺伝子のクローニング方法は、下記のＢ部に要約される。
　（Ｂ．軽鎖）
　Ａ部に記載された二本鎖ｃＤＮＡを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＧＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡ−３’を使った第３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。
　このプライマーは、κ軽鎖情報の定常部分に特異的な配列（ＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡ）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（ＧＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧ）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−ＧＡＧＧＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧ−３’
５’−ＧＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧ−３’
を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
　ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：
５’−ＧＡＧＧＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧ−３’
を使うジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。
　次いで、該配列の最初の４２ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成４２ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−カッパと称することにする。
　Ｉｇ発現細胞系から単離しそして個別におよびＳｍａＩを含む幾つかの異なる制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンブロットを、３２Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−カッパを用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上流に同定される。
　次いでＩｇ発現細胞系からのＤＮＡをＳｍａＩおよび第二の酵素（Ｖセグメントの内側にＳｍａＩ部位がある場合にはＢａｍＨＩまたはＫｐｎＩ）で切断する。いずれかの生成した非平滑末端をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ酵素で処理し、平滑末端化ＤＮＡ分子を与える。次いで制限部位をコードするリンカー（断片中にどの部位が存在しないかに応じてＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩまたはＸｈｏＩ）を付加し、そして対応するリンカー酵素で切断してＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩまたはＸｈｏＩ末端を有するＤＮＡ断片を与える。次いで該ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をラムダＥＭＢＬ３またはラムダＦＩＸ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングする。ユニークプローブｏ−カッパを使って、Ｖセグメント含有クローンを単離する。陽性クローンからＤＮＡを単離し、そしてｐＫａｐ１のポリリンカー中にサブクローニングする。生じたクローンをｐＲＫＬと命名する。
　（実施例７）
　（免疫グロブリン重鎖μ遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムクローンの単離）
　この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリン重鎖μ遺伝子のクローニングを記載する。この実施例に記載の手順は、μ重鎖遺伝子の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。
　上述した如く、二本鎖ｃＤＮＡを調製し単離する。この二本鎖ｃＤＮＡを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−ＧＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣ−３’
を使った３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。
　このプライマーは、μ重鎖情報の定常部分に特異的な配列（ＡＣＡＧＧＡＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣ）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（ＧＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧ）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：
５’−ＧＡＧＧＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧ−３’
５’−ＧＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧ−３’
を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
　ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：
５’−ＧＡＧＧＴＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧ−３’
を使ったジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。
　次いで、該配列の最初の４２ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成４２ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−ミューと称することにする。
　Ｉｇ発現細胞系から単離しそして個別におよびＭｌｕＩ（ＭｌｕＩは、ＪセグメントとμＣＨ１との間を開裂する稀少切断性酵素である）を含む幾つかの異なる制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンブロットを、３２Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−ミューを用いて探査する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上流に同定される。
　次いでＩｇ発現細胞系からのＤＮＡをＭｌｕＩと第二の酵素で切断する。次いでＭｌｕＩまたはＳｐｅＩアダプターリンカーを末端に連結せしめ、切断して上流部位をＭｌｕＩまたはＳｐｅＩに変換する。次いで該ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をプラスミドｐＧＰ１中に直接クローニングする。ユニークプローブｏ−ミューを使ってＶセグメント含有クローンを単離し、その挿入断片をＭｌｕＩでまたはＭｌｕＩ／ＳｐｅＩで切断されたプラスミドｐＣＯＮ２中にサブクローニングする。生じたクローンをｐＲＭＧＨと命名する。
　（実施例８）
　（ヒトκ小遺伝子座トランスジェンの作製）
　（軽鎖小遺伝子座）
　κ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングし、Ｊκ−Ｃ領域に及ぶクローンを単離した。Ｊκ１を含む５，７ｋｂ　ＣｌａＩ／ＸｈｏＩ断片をＪκ２−５とＣκを含む１３ｋｂ　ＸｈｏＩ断片と一緒にｐＧＰｌｄ中にクローニングし、そしてプラスミドｐＫｃｏｒを作製するのに使った。このプラスミドは、４，５ｋｂの５’隣接配列と９ｋｂの３’隣接配列と共に、Ｊκ１−５、κインロトンエンハンサーおよびＣκを含有する。それはＶセグメントのクローニング用のユニークな５’ＸｈｏＩ部位と追加のシス作用性調節配列の挿入用のユニークな３’ＳａｌＩ部位も有する。
　（Ｖκ遺伝子）
　Ｖκ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングし、ヒトＶκセグメントを含むクローンを単離した。ＤＮＡ配列分析により機能的Ｖセグメントを同定した。それらのクローンは、ＴＡＴＡボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−１２ｂスペーサー−ノナマー配列を含有する。該クローンのうちの３つをマッピングし、配列決定した。該クローンのうちの２つ、６５．５と６５．８が機能的であり、それらがＴＡＴＡボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−１２ｂスペーサー−ノナマー配列を含有すると思われる。３つめのクローン６５．４は、非規準的組換えヘプタマーを含むことからＶκＩ偽遺伝子をコードすると思われる。
　ＶｋＩＩＩファミリー遺伝子をコードする機能的クローンのうちの１つＶκ６５−８を使って軽鎖小遺伝子座構成物を作製した。
　（ｐＫＣｌ）
　Ｖκ６５−８を含む７．５ｋｂＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片をｐＫｃｏｒの５’ＸｈｏＩ部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座ｐＫＣ１（図３２）を作製した。注入前にＮｏｔＩでの消化により該トランスジェン挿入断片を単離した。
　精製した挿入断片を、受精した（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）Ｆ２マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、次いでＨｏｇａｎら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，１９８６，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に記載の通りに、生存している胚を偽妊娠雌に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザンブロット分析によりトランスジェン配列の存在について分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標準に比較したバンド強度により、トランスジェンコピー数を評価した。それらの動物から血清を単離し、そしてＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により記載された通りに、トランスジェンによりコードされるヒトＩｇκタンパク質の存在についてＥＬＩＳＡにより分析した。マイクロタイタープレートウエルをヒトＩｇκ（クローン６Ｅ１，＃０１７３，ＡＭＡＣ　Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）、ヒトＩｇＭ（クローンＡＦ６，＃０２８５，ＡＭＡＣ　Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）およびヒトＩｇＧ１（クローンＪＬ５１２，＃０２８０，ＡＭＡＣ　Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）に特異的なマウスモノクローナル抗体でコーティングした。血清試料を該ウエル中に系列希釈し、そしてマウス免疫グロブリンとの交差反応性を最少にするために予備吸着されているアフィニティー精製済アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇ（多価）を使って特定の免疫グロブリンの存在を検出した。
　図３５は、８匹のマウス（Ｉ．Ｄ．＃６７６，６７４，６７３，６７０，６６６，６６５，６６４および４９６）からの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。それらのマウスの最初の７匹はｐＫＣ１トランスジェン挿入断片が注入された胚から発育し、そして８番目のマウスはｐＨＣ１トランスジェン（前記）のマイクロインジェクションにより生まれたマウスに由来する。ｐＫＣ１注入胚からの７匹のマウスのうちの２匹（Ｉ．Ｄ．＃６６６と６６４）は、ＤＮＡサザンブロット分析により分析するとトランスジェン挿入断片を含んでおらず、５匹（Ｉ．Ｄ．＃６７６，６７４，６７３，６７０および６６５）は該トランスジェンを含んでいた。ｐＫＣ１トランスジェン陽性動物の一匹を除く全てが検出可能なレベルのヒトＩｇκタンパク質を発現し、残りの一匹の非発現性動物はＤＮＡサザンブロット分析に基づくと遺伝的モザイクであるらしい。ｐＨＣ１陽性トランスジェニックマウスはヒトＩｇＭとＩｇＧ１を発現するがＩｇκを発現せず、これは該アッセイに使用する試薬の特異性を証明する。
　（ｐＫＣ２）
　Ｖκ６５．５を含む８ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片をｐＫＣ１の５’ＸｈｏＩ部位に挿入することにより、κ軽鎖小遺伝子座ｐＫＣ２を作製した。２つのＶκセグメントを含む生成トランスジェン挿入断片をマイクロインジェクション前にＮｏｔＩでの消化により単離した。
　（ｐＫＶｅ２）
　この構成物は、Ｊκの５’に１．２ｋｂの追加配列を含みそしてＶκ６５，８の３’の４．５ｋｂの配列を欠いていること以外は、ｐＫＣ１と同じである。該構成物は更に、マウス重鎖Ｊ−ｍイントロンエンハンサー〔Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０（１９８２）〕を含む０．９ｋｂ　ＸｂａＩ断片と、下流に挿入されたヒト重鎖Ｊ−ｍイントロンエンハンサー〔Ｈａｙｄａｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３０７；３３４−３４０（１９８４）〕を含む１．４ｋｂ　ＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有する。この構成物を、対立遺伝子排除とイソタイプ排除を果たす軽鎖小遺伝子座の初期再配列を開始する可能性について試験する。異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの３’κまたは重鎖エンハンサー〔ＭｅｙｅｒおよびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＥＭＢＯ　Ｊ．８：１９５９−１９６４（１９８９）；Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４：１６５−１６８（１９９０）；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕を有する類似構成物を作製することができる。
　（再配列された軽鎖トランスジェン）
　ヒトＢ細胞ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するためにκ軽鎖発現カセットをデザインした。方策を図３３に示す。ＰＣＲ増幅させた軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子６５．５から単離した３．７ｋｂの５’隣接配列を含むベクターｐＫ５ｎｘ中にクローニングする。次いで、Ｊκ２−４、Ｊκイントロンエンハンサー、Ｃκおよび９ｋｂの下流配列を含むベクターｐＫ３１ｓのユニークＸｈｏＩ部位中に、５’転写調節配列に融合させたＶＪセグメントをクローニングする。生じたプラスミドは、再構成された機能的に再配列されたκ軽鎖トランスジェンを含有し、このトランスジェンは胚へのマイクロインジェクションのためにＮｏｔＩで切り出すことができる。該プラスミドは追加のシス作用性調節配列の挿入のために３’末端にユニークＳａｌＩ部位も含有する。
　ヒト脾臓ゲノムＤＮＡ由来の再配列されたκ軽鎖遺伝子を増幅せしめるのに２つの合成オリゴヌクレオチド（ｏ−１３０，０−１３１）を使った。オリゴヌクレオチドｏ−１３０（ｇｇａｃｃｃａｇａ（ｇ，ｃ）ｇｇａａｃｃａｔｇｇａａ（ｇ，ａ）（ｇ，ａ，ｔ，ｃ））は、ＶκＩＩＩファミリー軽鎖遺伝子の５’領域に相補的でありそしてリーダー配列の最初のＡＴＣと重複している。オリゴヌクレオチドｏ−１３１（ｇｔｇｃａａｔｃａａｔｔｃｔｃｇａｇｔｔｔｇａｃｔａｃａｇａｃ）は、Ｊκ１の約１５０ｂｐ３’よりの配列に相補的であり、ＸｈｏＩ部位を含む。それらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｊκ１セグメントに連結された再配列されたＶκＩＩＩ遺伝子に相当するヒト脾臓ＤＮＡからの０．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化し、個々のＰＣＲ生成物をプラスミドｐＮＮＯ３中にクローニングした。５つのクローンのＤＮＡ配列を決定すると、機能的ＶＪ連結（転写解読枠）を有する２つのクローンが同定された。追加の機能的に再配列された軽鎖クローンも収集される。機能的に再配列されたクローンは上記軽鎖発現カセット（図３３）中に個別にクローニングすることができる。再配列された軽鎖構成物を用いて生産されたトランスジェニックマウスを重鎖小遺伝子座トランスジェニックマウスと交配せしめることにより、一次レパートリーの多様性の全てが重鎖により与えられる完全にヒトの抗体のスペクトルを発現するマウス株を生産することができる。軽鎖多様性の１つの起源は体細胞突然変異からであることができる。全ての軽鎖が様々な異なる重鎖と結合する能力に関して同等であるわけではないので、各々が異なる軽鎖構成物を含有する異なるマウス株を生成せしめ試験することができる。この方策の利点は、再配列されていない軽鎖小遺伝子座の使用とは反対に、容易に重鎖と対を作りすぐに重鎖ＶＤＪ連結が起こるような軽鎖を有することから生まれる軽鎖対立遺伝子およびイソタイプ排除の増加である。この組み合わせは、完全にヒトの抗体を発現するＢ細胞の頻度の増加をもたらし、かくしてヒトＩｇ発現性ハイブリドーマの単離を容易にすることができる。
　プラスミドｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１，ｐＩｇＨ１，ｐＫＣ１およびｐＫＣ２のＮｏｔＩ挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製されたそれらの挿入断片を、受精した（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）Ｆ２マウスの前核中にマイクロインジェクトし、そしてＨｏｇａｎらにより記載された通りに〔Ｈｏｇａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６））、生存している胚を偽妊娠雌中に移した。
　（実施例９）
　（相同組換えによるマウスκ軽鎖遺伝子の不活性化）
　この実施例は、胎児性幹（ＥＳ）細胞中での相同組換えによるマウス内因性κ遺伝子座の不活性化に次いで、不活性化されたκ対立遺伝子を有する標的ＥＳ細胞を初期マウス胚（胚盤胞）中に注入することによるマウス生殖細胞系中への変異遺伝子の導入を記載する。
　方策は、Ｊκ遺伝子とＣκセグメントに及ぶ遺伝子座の４．５ｋｂセグメントが削除されそして選択マーカーｎｅｏにより置き換えられているマウスκ遺伝子座に相同なＤＮＡ配列を含むベクターを用いた相同組換えによりＪκ遺伝子とＣκ遺伝子を欠失せしめることである。
　（κ標的ベクターの作製）
　プラスミドｐＧＥＭ７（ＫＪ１）（Ｍ．Ａ．Ｒｕｄｎｉｃｋｉ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、クローニングベクター７Ｚｆ（＋）中のマウスホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）プロモーター〔ＸｂａＩ／ＴａｑＩ断片；Ａｄｒａ，Ｃ．Ｎ．ら、Ｇｅｎｅ　６０：６５−７４（１９８７）〕の転写調節下に、トランスフェクトされたＥＳ細胞の薬剤選択に使うネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含む。このプラスミドは、マウスｐｇｋ遺伝子の３’領域に由来する、ｎｅｏ遺伝子にとって異種のポリアデニル化部位〔ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片；Ｂｏｅｒ，Ｐ．Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２８：２９９−３０８（１９９０）〕も含む。このプラスミドをκ標的ベクターの作製めための出発点として使った。第一段階はｎｅｏ発現カセットの３’のκ遺伝子座に相同な配列を挿入することであった。
　Ｃκ遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ：
５’−ＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧ−３’
とＪκ遺伝子セグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ；
５’−ＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴＡＡＧ−３’
を使って、肝臓ＤＮＡから誘導されたゲノムファージライブラリーから、マウスκ鎖配列（図２０ａ）を単離した。
　陽性ファージクローンから２断片において、即ち１．２ｋｂ　ＢｇｌＩＩ／ＳａｃＩ断片と６．８ｋｂ　ＳａｃＩ断片として、マウスＣκセグメントの３’に及ぶ８ｋｂ　Ｂｇ１ＩＩ／ＳａｃＩ断片を単離し、それをＢｇｌＩＩ／ＳａｃＩで消化されたｐＧＥＭ（ＫＪ１）中にサブクローニングし、プラスミドｐＮＥＯ−Ｋ３’を作製した（図２０ｂ）。
　Ｊκ領域の５’に及ぶ１．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩ断片も陽性ファージクローンから単離した。この断片のＳｐｈＩ部位にＳｐｈＩ／ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩアダプターを連結せしめ、生じたＥｃｏＲＩ断片をｎｅｏ遺伝子および下流の３’κ配列と同じ５’→３’方向で、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＮＥＯ−Ｋ３’に連結せしめ、ｐＮＥＯ−Ｋ５’３’（図２０ｃ）を作製した。
　次いで、Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：３４８−３５２（１９８８）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにして、相同組換え体を有するＥＳクローンの富化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含めた。プラスミドｐＧＥＭ７（ＴＫ）からＨＳＶ　ＴＫカセットを得た。このカセットは、ｐＧＥＭ７（ＫＪ１）について上述したのと同様に、マウスｐｇｋプロモーターとポリアデニル化配列とにより隣接されたＨＳＶ　ＴＫ遺伝子の構造配列を含む。ｐＧＥＭ７（ＴＫ）のＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変更し、そしてＴＫカセットをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として切り出し、ｐＧＰｌｂ中にサブクローニングしてｐＧＰｌｂ−ＴＫを作製した。このプラスミドをＸｈｏＩ部位のところで線状化し、Ｊκの５’からのゲノム配列とＣκの３’からのゲノム配列とにより隣接されたｎｅｏ遺伝子を含む、ｐＮＥＯ−Ｋ５’３’由来のＸｈｏＩ断片をｐＧＰｌｂ−ＴＫ中に挿入し、標的ベクターＪ／Ｃ　ＫＩ（図２０ｄ）を作製した。Ｊ／Ｃ　Ｋｌを用いた相同組換え後のゲノムκ遺伝子座の推定構造を図２０ｅに示す。
　（κ対立遺伝子の標的不活性化によるＥＳ細胞の作製および分析）
　使用したＥＳ細胞は、本質的には記載された通りに〔Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ；Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）７１−１１２頁（１９８７）〕、分裂上不活性なＳＮＬ７６／７支持細胞層〔ＭｃＭａｈｏｎおよびＢｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｃｅｌ１　６２：１０７３−１０８５（１９９０）〕上で増殖させたＡＢ−１系であった。他の適当なＥＳ系としては、Ｅｌ４系〔Ｈｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３２６：２９２−２９５（１９８７）〕、Ｄ３系〔Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７；２７−４５（１９８５）〕、およびＣＣＥ系〔Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３２３；４４５−４４８（１９８６）〕が挙げられるが、それらに限定されない。特異的な標的変異を有するＥＳ細胞からマウス系統をうまく作製できるのは、ＥＳ細胞の多分化能性（即ち、宿主胚盤胞中に注入されれば、胚形成に参加することができ且つ生じた動物の生殖細胞に貢献することができるそれらの能力）に依存している。
　任意の与えられたＥＳ細胞系の多分化能性は、培養時間およびそれに取り払った注意によって異なり得る。多分化能性についての唯一の決定的アッセイは、使用することになっているＥＳ細胞の特定集団がＥＳゲノムの生殖細胞伝達を行うことができるキメラ体を生成することができるかどうかを決定することである。この理由により、遺伝子標的の前に、ＡＢ−１細胞の親集団の一部をＣ５７Ｂ１／６Ｊ胚盤胞中に注入し、該細胞がキメラマウスを生成できるかどうか、およびそれらのキメラ体の大部分がＥＳゲノムを子孫に伝達できるかどうかを確かめる。
　κ鎖不活性化ベクターＪ／Ｃ　Ｋ１をＮｏｔＩで消化し、そして記載された方法〔Ｈａｓｔｙ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３５０：２４３−２４６（１９９１）〕によりＡＢ−１細胞中にエレクトロポレートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を１００ｍｍ皿上に２〜５×１０６細胞／皿の密度で塗抹した。２４時間後、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍｌの活性成分）およびＦＩＡＵ（０．５μＭ）を培地に添加し、１０〜１１日に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
　サザンブロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９；４２９３（１９９１）〕クローンからＤＮＡを単離し、ＸｂａＩで消化し、そして標特的プローブとして図２０ｅに指摘の８００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の３．７ｋｂ　ＸｂａＩ断片、および標的ベクターと相同組換えされた遺伝子座中の標徴的な１．８ｋｂバンドを検出した（図２０ａおよびｅを参照のこと）。サザンブロット分析によりスクリーニングした９０１個のＧ４１８およびＦＩＡＵ耐性クローンのうち、７つのクローンがκ遺伝子のうちの１つへの相同組換えを示す１．８ｋｂ　ＸｂａＩバンドを表した。それらの４つのクローンを更にＢｇｌＩＩ，ＳａｃＩおよびＰｓｔＩ酵素で消化し、κ遺伝子のうちの１つに該ベクターが相同的に組み込まれたことを確認した。標徴的８００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片（プローブＡ）を用いて探査すると、野生型ＤＮＡのＢｇｌＩＩ，ＳａｃＩおよびＰｓｔＩ消化物がそれぞれ４．１，５．４，および７ｋｂの断片を生成し、一方標的されたκ対立遺伝子の存在はそれぞれ２．４，７．５および５．７ｋｂの断片により指摘された（図２０ａおよびｅを参照のこと）。ＸｂａＩ消化物により検出された７つの陽性クローンの全てが、κ軽鎖のところでの相同組換えに標徴的である期待のＢｇｌＩＩ，ＳａｃＩおよびＰｓｔＩ制限断片を示した。
　（不活性化されたκ鎖を有するマウスの作製）
　前の章で記載した標的されたＥＳクローンのうちの５つを、記載の如く〔Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ），１１３−１５１頁（１９８７）〕Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の子宮に移し、注入ＥＳ細胞から誘導された細胞と宿主の胚盤胞との混合物に由来するキメラマウスを作製する。黒いＣ５７Ｂ１／６Ｊ背景上において、ＥＳ細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量により、キメラ体へのＥＳ細胞の貢献の程度を外観的に同定する。標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、それらの大部分が皮膜着色への過剰のＥＳ細胞の貢献（７０％以上）を示した。ＡＢ１　ＥＳ細胞はＸＹ細胞系であり、それらの高率キメラ体の大部分が、コロニー形成された雄ＥＳ細胞による雌胚の性転換のために雄であった。雄のキメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊと交配させ、ＥＳゲノムの生殖細胞伝達の指標である優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうちの２つからのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。κ遺伝子座の唯一のコピーが注入ＥＳクローンに標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを５０％有した。尾部生検試料からのＢｇｌＩＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、標的ＥＳクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図２０ｅ）を使って、標的遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約５０％が４．１ｋｂの野生型バンドに加えて２．４ｋｂのハイブリダイズするＢｇｌＩＩバンドを示した。この結果は、標的されたκ遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。
　該変異に対して同型接合性のマウスを生成せしめるために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫のκ遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合体交配から３つの遺伝子型が誘導された：２コピーの正常κ遺伝子座を有する野生型マウス、１コピーの標的κ遺伝子と１つのＮＴκ遺伝子を有する異型接合体、およびκ変異に対して同型接合性であるマウス。それらの後者のマウスからのκ配列の欠失は、Ｊκに特異的なプローブ（プローブＣ、図２０ａ）を使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。該Ｊκプローブのハイブリダイゼーションは異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料に観察されたが、一方で同型接合体には全くハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかった。これは、標的変異の結果としての欠失によりκ遺伝子座の両方のコピーが不活性化されている新規マウス株の発生を証明する。
　（実施例１０）
　（相同組換えによるマウス重鎖遺伝子の不活性化）
　この実施例は、胎児性幹（ＥＳ）細胞中での相同組換えによる内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子の活性化を記載する。方策は、ＪＨ領域が削除されそして選択マーカー遺伝子ｎｅｏにより置き換えられている重鎖配列を含むベクターとの相同組換えにより内因性重鎖Ｊセグメントを欠失せしめることである。
　（重鎖標的ベクターの作製）
　ＪＨ４特異的オリゴヌクレオチドプローブ：
５’−ＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧ−３’
を使って、Ｄ３　ＥＳ細胞系〔Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９０６５−９０６９（１９８６）〕から誘導されたゲノムファージライブラリーから、ＪＨ領域を含むマウス重鎖配列（図２１ａ）を単離した。
　ＪＨ領域に及ぶ３．５ｋｂのゲノムＳａｃＩ／ＳｔｕＩ断片を陽性ファージクローンから単離し、それをＳａｃＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＵＣ１８中にサブクローニングした。生じたプラスミドをｐｕｃ１８ＪＨと命名した。トランスフェクトされたＥＳ細胞の薬剤選別に用いるネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）は、プラスミドｐＧＥＭ７（ＫＪ１）の修復変形から誘導された。文献中の報告〔Ｙｅｎｏｆｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８７：３４３５−３４３９（１９９０）〕は、ｐＧＥＭ７（ＫＪ１）中に使用されるｎｅｏ遺伝子の源として働いたｐＭＣｌｎｅｏ〔ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｐｅｃｈｉ，Ｃｅ１１　５１；５０３−５１２（１９８７）〕を含む幾つかの常用の発現ベクターのｎｅｏコード配列の点変異を証明している。この変異はｎｅｏ遺伝子産物の活性を減少させるが、該変異を含む制限断片を野生型ｎｅｏクローンからの対応配列と置き換えることにより修復された。ｐＧＥＭ７（ＫＪ１）中のＨｉｎｄＩＩＩ部位を合成アダプターの付加によってＳａｌＩ部位に変更し、そしてＸｂａＩ／ＳａｌＩでの消化によりｎｅｏ発現カセットを切り出した。次いでｎｅｏ断片の両端をＤＮＡ　ｐｏｌＩのクレノウ形での処理により平滑末端化し、ｐＵＣ１８　ＪＨのＮａｅＩ部位中にサブクローニングし、プラスミドｐＵＣ１８　ＪＨ−ｎｅｏ（図２１ｂ）を作製した。
　標的ベクターの更なる作製は、プラスミドｐＧＰｌｂの誘導体において行った。ｐＧＰｌｂを制限酵素ＮｏｔＩで消化し、アダプターとして次のオリゴヌクレオチド：５’−ＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＣＧＡＴＡＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＣＴＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣ−３’と連結せしめた。
　生じたプラスミド（ｐＧＥＴと命名）を使ってマウス免疫グロブリン重鎖標的構成物を構築した。
　Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ３３６：３４８−３５２（１９８８）により記載されたようにして、相同組換え体を有するＥＳクローンの富化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含めた。プラスミドｐＧＥＭ（ＴＫ）からＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりＨＳＶＴＫ遺伝子を得た。このＴＫＤＮＡ断片をｐＧＭＴのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にサブクローニングし、プラスミドｐＧＭＴ−ＴＫ（図２１ｃ）を作製した。
　標的配列に対する広範な相同性領域を提供するために、陽性ゲノムファージクローンからＸｈｏＩでのＤＮＡの限定消化およびＸｂａＩでの部分消化により、ＪＨ領域の５’に位置する５．９ｋｂのゲノムＸｂａＩ／ＸｈｏＩ断片を誘導した。図２１ａに示されるように、このＸｂａＩ部位はゲノムＤＮＡ中には存在せず、むしろ陽性ファージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入断片にすぐに隣接するファージ配列から誘導される。この断片をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＧＭＴ−ＴＫ中にサブクローニングし、プラスミドｐＧＭＴ−ＴＫ−ＪＨ５’（図２１ｄ）を作製した。
　作製の最終段階は、ｎｅｏ遺伝子および隣接するゲノム配列を含むｐＵＣ１８ＪＨ−ｎｅｏからの２．８ｋｂＥｃｏＲＩ断片の切除を含んだ。この断片をクレノウポリメラーゼにより平滑末端にし、同様に平滑末端化されたｐＧＭＴ−ＴＫ−ＪＨ５’のＸｈｏＩ部位中にサブクローニングした。生じた構成物ＪＨＫＯ１（図２１ｅ）は、ＪＨ遺伝子座を隣接する６．９ｋｂのゲノム配列を含み、ｎｅｏ遺伝子が中に挿入されているＪＨ領域に及ぶ２．３ｋｂの欠失を有する。図２１ｆは、標的用構成物との相同組換え後の内因性重鎖遺伝子の構造を示す。
　（実施例１１）
　（標的されたＥＳ細胞の生産および分析）
　本質的には記載された通りに〔Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．（１９８７）Ｔｅｒａｔｏ−ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ），７１−１１２頁〕、分裂上不活性なＳＮＬ７６／７支持細胞層〔ＭｃＭａｈｏｎおよびＢｒａｄｌｅｙ，Ｃｅｌｌ　６２：１０７３−１０８５（１９９０）〕上でＡＢ１　ＥＳ細胞を増殖させた。前の実施例に記載した通り、標的指向性構成物ＪＨＫＯ１によるＥＳ細胞のエレクトロポレーションの前に、ＥＳゲノムの生殖細胞伝達能力を有することが証明されたＡＢ−１由来のキメラの作製により、ＥＳ細胞の多分化能性を決定した。
　重鎖不活性化ベクターＪＨＫＯ１をＮｏｔＩで消化し、そして記載された方法〔Ｈａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ３５０：２４３−２４６（１９９１）〕によりＡＢ−１細胞中にエレクトロポレートせしめた。エレクトロポレートされた細胞を１００ｍｍ皿上に１〜２×１０６細胞／皿の密度で塗抹した。２４時間後、Ｇ４１８（２００ｍｇ／ｍｌの活性成分）およびＦＩＡＵ（０．５ｍＭ）を培地に添加し、８〜１０日間に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
　サザンブロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如く〔Ｌａｉｒｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：４２９３（１９９１）〕クローンからＤＮＡを単離し、ＳｔｕＩで消化し、そしてプローブＡとして図２１ｆに示される５００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩ断片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の４．７ｋｂＳｔｕＩ断片を検出し、一方で３ｋｂバンドは標的指向ベクターと内因性配列の相同組換えに標徴的である（図２１ａおよびｆを参照のこと）。サザンブロットハイブリダイゼーションによりスクリーニングした５２５個のＧ４１８およびＦＩＴＵ二重耐性クローンのうち、１２個が標的指向ベクターとの組換えに標徴的な３ｋｂ断片を含むことがわかった。それらのクローンがＪＨ遺伝子座のところに期待の標的現象（図２１ｆに示されるような）を示すことは、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩおよびＨｐａＩでの更なる消化により確認された。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩおよびＨｐａＩで消化されたＤＮＡのサザンブロットヘのプローブＡ（図２１ｆ参照）のハイブリダイゼーションは、野生型遺伝子座についてはそれぞれ２．３ｋｂ、＞１０ｋｂおよび＞１０ｋｂのバンドをもたらし、一方標的された重鎖遺伝子座についてはそれぞれ５．３ｋｂ、３．８ｋｂおよび１．９ｋｂのバンドが予想される（図２１ｆ参照）。ＳｔｕＩ消化物により検出された１２個の陽性クローンの全てが、標的ＪＨ遺伝子に標徴的な推定ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩおよびＨｐａＩバンドを示した。加えて、ｎｅｏ−特異的プローブ（プローブＢ、図２１ｆ）を使った１２個のクローン全てのＳｔｕＩ消化物のサザンブロット分析は３ｋｂの推定断片のみを生じ、それらのクローンが各々標的指向ベクターの単一コピーを含有することを証明した。
　（ＪＨ欠失を有するマウスの作製）
　前の章で記載した標的されたＥＳクローンのうちの３つを解凍し、記載の如く〔Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ），・１１３−１５１頁（１９８７）〕Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ胚盤胞中に注入し、そして偽妊娠雌の子宮に移した。黒色Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ背景上において、ＥＳ細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量から、キメラ体へのＥＳ細胞の貢献の程度を外観的に同定する。２つの標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、３つ目の標的クローンはキメラ動物を生じなかった。それらのキメラ体の大部分が皮膜着色へのＥＳ細胞のかなりの貢献度（７０％以上）を示した。ＡＢ１　ＥＳ細胞はＸＹ細胞系であり、キメラ体の大部分は、コロニー形成された雌胚が雄ＥＳ細胞により性転換されたために雄であった。雄キメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交配させ、ＥＳゲノムの生殖細胞伝達の標徴である優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうちの両方からのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。重鎖遺伝子座の唯一のコピーが注入ＥＳクローン中に標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを５０％有した。尾部生検試料からのＳｔｕＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、標的ＥＳクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図２１ｆ）を使って、標的遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約５０％が４．７ｋｂの野生型バンドに加えて約３ｋｂのハイブリダイズするＳｔｕＩバンドを示した。この結果は、標的されたＪＨ遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。
　該変異に対して同型接合のマウスを作製するために、異型接合体同士を交配し、そして上述のようにして子孫の重鎖遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合体交配から３つの遺伝子型が誘導された：２コピーの正常ＪＨ遺伝子座を有する野生型マウス、該遺伝子の１つの標的コピーと１つの正常コピーを有する異型接合体、およびＪＨ変異に対して同型接合であるマウス。それらの後者のマウスからのＪＨ配列の欠失は、ＪＨに特異的なプローブ（プローブＣ、図２１ａ）を使ったサザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料において４．７ｋｂ断片へのＪＨプローブのハイブリダイゼーションが観察されたが、一方でＪＨ変異体同型接合体からの試料には全くシグナルが検出されなかった。これは、ＪＨ配列の欠失により重鎖遺伝子の両方のコピーが変異されている新規マウス株の生成を証明する。
　（実施例１２）
　（重鎖小遺伝子座トランスジェン）
　（Ａ．大型ＤＮＡ配列をクローニングするためのプラスミドベクターの作製）
　（１．ｐＧＰｌａ）
　プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩとＳｔｙＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：
オリゴ−４２　５’−ｃａａｇａｇｃｃｃｇｃｃｔａａｔｇａｇｃｇｇｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｇｃａｔａｃｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔ−３’
オリゴ−４３　５’−ａａｔｔａｇｃｇｇｃｃｇｃａｇｔａｔｇｃａａａａａａａａｇｃｃｃｇｃｔｃａｔｔａｇｇｃｇｇｇｃｔ−３’
と連結せしめた。
　生じたプラスミドｐＧＰｌａを、稀少切断性制限酵素ＮｏｔＩにより切除することができる非常に大型ＤＮＡ構成物をクローニングするために改変する。それは、ｔｒｐＡ遺伝子に由来する強力な転写終結シグナル〔Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：４１８０（１９８１）〕の下流に（アンピシリン耐性遺伝子ＡｍｐＲに関して）ＮｏｔＩ制限部位を含む。この終結シグナルは、ＡｍｐＲ遺伝子からの読み通し転写を排除することにより、ＮｏｔＩ部位中に挿入されるコード配列の潜在的毒性を低下させる。加えて、このプラスミドは、ｐＢＲ３２２コピー数調節領域を保持しているためにｐＵＣプラスミドに比較して低コピー数である。この低コピー数も挿入配列の潜在的毒性を更に低下させ、そしてＤＮＡ複製による大型挿入断片に対する選択を減少させる。ベクターｐＧＰ１ｂ，ｐＧＰ１ｃ，ｐＧＰ１ｄおよびｐＧＰ１ｆはｐＧＰ１ａから誘導され、そして異なるポリリンカークローニング部位を含む。そのポリリンカー配列を下記に与える。
Figure 2004008218
 　それらの各プラスミドは大型トランスジェン挿入断片の作製に利用することができ、該挿入断片はＮｏｔＩで切り出すことができ、その結果トランスジェンＤＮＡをマイクロインジェクション前にベクター配列から精製することができる。
　（２．ｐＧＰ１ｂ）
　ｐＧＰ１ａをＮｏｔＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：
オリゴ−４７　５’−ｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔａｃｔｇｃｔｇｇａｔｃｃｔｔａａｔｔａａｔｃｇａｔａｇｔｇａｔｃｔｃｇａｇｇｃ−３’
オリゴ−４３　５’−ｇｇｃｃｇｃｃｔｃｇａｇａｔｃａｃｔａｔｃｇａｔｔａａｔｔａａｇｇａｔｃｃａｇｃａｇｔａａｇｃｔｔｇｃ−３’
と連結せしめた。
　生じたプラスミドｐＧＰ１ｂは、ＮｏｔＩにより隣接された短いポリリンカー領域を含む。これは、ＮｏｔＩにより切除することができる大型挿入断片の作製を容易にする。
　（３．ｐＧＰｅ）
　次のオリゴヌクレオチド：
オリゴ−４４　５’−ｃｔｃｃａｇｇａｔｃｃａｇａｔａｔｃａｇｔａｃｃｔｇａａａｃａｇｇｇｃｔｔｇｃ−３’
オリゴ−４５　５’−ｃｔｃｇａｇｃａｔｇｃａｃａｇｇａｃｃｔｇｇａｇｃａｃａｃａｃａｇｃｃｔｔｃｃ−３’
を使って、ポリメラーゼ連鎖反応技術によりラット肝臓ＤＮＡ由来の免疫グロブリン重鎖３’エンハンサー〔Ｓ．Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：１６５−１６８（１９９０）〕を増幅せしめた。
　増幅生成物をＢａｍＨＩとＳｐｈＩで消化し、そしてＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩで消化されたｐＮＮＯ３（ｐＮＮＯ３は、記載順に次の制限部位：ＮｏｔＩ，ＢａｍＨＩ，ＮｃｏＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＲＶ，ＸｂａＩ，ＳａｃＩ，ＸｈｏＩ，ＳｐｈＩ，ＰｓｔＩ，ＢｇｌＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳｍａＩ，ＫｐｎＩ，ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩを有するポリリンカーを含むｐＵＣ由来のプラスミドである）中にクローニングした。生じたプラスミドｐＲＥ３をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてラットＩｇ重鎖３’エンハンサーを含む挿入断片を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＧＰｌｂ中にクローニングした。生じたプラスミドｐＧＰｅ（図２２および表１）は、配列をクローニングすることができそして次いでＮｏｔＩ消化によって３’エンハンサーと一緒に切り出すことができる幾つかのユニーク制限部位を含有する。
Figure 2004008218
 表１　ベクターｐＧＰｅの配列。
　（Ｂ．ＩｇＭを発現する小遺伝子座トランスジェンｐＩＧＭ１の作製）
　（１．Ｊ−μ定常領域クローンの単離およびｐＪＭ１の作製）
　ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）中にクローニングしたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド；
オリゴ−１　５’−ｇｇａｃｔｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｇｔｇａｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｔｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇ−３’
を用いてスクリーニングし、そしてファージクローンλ１．３を単離した。６っのＪセグメント全部並びにＤセグメントＤＨＱ５２および重鎖Ｊ一μイントロンエンハンサーを含む、６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ断片をこのクローンから単離した。同じライブラリーをヒトμ特異的オリゴヌクレオチド：
オリゴ−２　５’−ｃａｃｃａａｇｔｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａｃａｇａｃｃｔｇａｃｃａｃｃｔａｔｇａ−３’
を用いてスクリーニングし、ファージクローンλ２．１を単離した。μスイッチ領域およびμ定常領域エクソンの全部を含む、１０．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片をこのクローンから単離した。それらの２断片を、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＮＮＯ３と一緒に連結せしめ、プラスミドｐＪＭ１を得た。
　（２．ｐＪＭ２）
　ファージクローンλ２．１から４ｋｂのＸｈｏＩ断片を単離した。該断片は、ある種のＩｇＤ発現Ｂ細胞中でのμ遺伝子のδ関連欠失に関与するいわゆるΣμ要素〔Ｈ．Ｙａｓｕｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１３９９（１９８９）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を含む、ｐＪＭ１の配列のすぐ下流の配列を含有する。この断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、そしてＸｈｏＩで切断されクレノウで処理されたｐＪＭ１と連結せしめる。生じたプラスミドｐＪＭ２（図２３）は、内部のＸｈｏＩ部位を失っているが、クレノウ酵素による不完全な反応の結果として３’ＸｈｏＩを保持している。ｐＪＭ２は完全なヒトＪ領域、重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー、μスイッチ領域およびμ定常領域エクソン全部、並びにμ遺伝子のδ関連欠失に関与する２つの０．４ｋｂの直接反復σμおよびΣμを含有する。
　（３．Ｄ領域クローンの単離およびｐＤＨ１の作製）
　次のヒトＤ領域特異的オリゴヌクレオチド：
オリゴ−４　５’−ｔｇｇｔａｔｔａｃｔａｔｇｇｔｔｃｇｇｇｇａｇｔｔａｔｔａｔａａｃｃａｃａｇｔｇｔｃ−３’
を用いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをＤ領域クローンについてスクリーニングした。ファージクローンλ４．１とλ４．３を単離した。Ｄ要素ＤＫ１，ＤＮ１およびＤＭ２〔Ｙ．Ｉｃｈｉｈａｒａら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７：４１４１（１９８８）〕を含む５．５ｋｂのＸｈｏＩ断片をファージクローンλ４．１から単離した。Ｄ要素ＤＬＲ１，ＤＸＰ１，ＤＸＰ’１およびＤＡ１を含む上流の隣接５．２ｋｂ　ＸｈｏＩ断片をファージクローンλ４．３から単離した。それらのＤ領域ＸｈｏＩ断片の各々をプラスミドベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＳａＩＩ部位中にクローニングし、２配列を結合するＸｈｏＩ部位を破壊した。次いで上流断片をＸｈｏＩとＳｍａＩで切り出し、下流断片をＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで切り出した。得られた単離断片をＳａｌＩで消化されたｐＳＰ２と一緒に連結せしめ、プラスミドｐＤＨ１を与えた。ｐＤＨ１は、少なくとも７っのＤセグメントを含みＸｈｏＩ（５’）およびＥｃｏＲＶ（３’）で切り出すことができる１０．６ｋｂの挿入断片を含有する。
　（４．ｐＣＯＲ１）
　プラスミドｐＪＭ２をＡｓｐ７１８（ＫｐｎＩのアイソシゾマー）で消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて突出末端をフィルインした。次いで生じたＤＮＡをＣｌａＩで消化し、挿入断片を単離した。この挿入断片をｐＤＨ１のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ挿入断片およびＸｈｏＩ／ＣｌａＩ消化ｐＧＰｅと連結せしめ、ｐＣＯＲ１を作製した（図２４）。
　（５．ｐＶＨ２５１）
　２つのヒト重鎖可変領域セグメントＶＨ２５１とＶＨ１０５〔Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３３１：４４６（１９８８）〕を含む１０．３ｋｂのゲノムＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＳＰ７２中にサブクローニングし、プラスミドｐＶＨ２５１を与えた。
　（６．ｐＩＧＭ１）
　プラスミドｐＣＯＲ１をＸｈｏＩで部分消化し、そしてｐＶＨ２５１の単離ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入断片を上流のＸｈｏＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＩＧＭ１（図２５）を作製した。ｐＩＧＭ１は、下記の配列要素の全部がＮｏｔＩでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離することができそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトすることができるように、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８っのヒトＤセグメント、６っのヒトＪＨセグメント全部、ヒトμエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部およびヒトΣμ要素を、ラット重鎖３’エンハンサーと共に含有する。
　（Ｃ．ＩｇＭとＩｇＧを発現する小遺伝子座トランスジェンｐＨＣ１の作製）
　（１．γ定常領域クローンの単離）
　次のヒトＩｇＧ定常領域遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド：
オリゴ−２９　５’−ｃａｇｃａｇｇｔｇｃａｃａｃｃｃａａｔｇｃｃｃａｔｇａｇｃｃｃａｇａｃａｃｔｇｇａｃ−３’
を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。ファージクローンλ２９．４とλ２９．５を単離した。γスイッチ領域を含むファージクローンλ２９．４の４ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片を使って、ファージベクターラムダＦＩＸＴＭＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。ファージクロ一ンλＳｇ１．１３を単離した。異なるγクローンのサブクラスを決定するために、鋳型として上記３つのファージクローンの各々のサブクローンを使ってそしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド：
オリゴ−６７　５’−ｔｇａｇｃｃｃａｇａｃａｃｔｇｇａｃ−３’
を使って、ジデオキシ配列決定反応を実施した。
　ファージクローンλ２９．５とλＳγ１．１３は両方ともγ１サブクラスであると決定された。
　（２．ｐγｅ１）
　γ１コード領域を含むファージクローンλ２９．５の７．８ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１８中にクローニングした。生じたプラスミドｐＬＴ１をＸｈｏＩで消化し、クレノウ断片で処理し、そして再連結せしめて内部ＸｈｏＩ部位を破壊した。生じたクローンｐＬＴｌｘｋをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、挿入断片を単離し、ｐＳＰ７２中にクローニングしてプラスミドクローンｐＬＴ１ｘｋｓを作製した。ポリリンカーＸｈｏＩ部位とヒト配列由来のＢａｍＨＩ部位のところでのｐＬＴ１ｘｋｓの消化は、γ１定常領域コードエクソンを含む７．６ｋｂ断片を与えた。この７．６ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ファージクローンλ２９．５からの隣接の下流４．５Ｒｂ　ＢａｍＨＩ断片と一緒に、ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＧＰｅ中にクローニングし、プラスミドｐγｅ１を作製した。ｐγｅ１は、ラット重鎖３’エンハンサーに連結された、５ｋｂの下流配列と共にγ１定常領域コードエクソンの全部を含有する。
　（３．ｐγｅ２）
　γ１スイッチ領域とスイッチ前繁殖不能転写物（ｓｔｅｒｉｌｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）〔Ｐ．Ｓｉｄｅｒａｓら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：６３１（１９８９）〕の第一エクソンとを含む５．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片をファージクローンλＳγ１．１３から単離し、そして挿入断片の５’末端の近隣にポリリンカーＸｈｏＩ部位を有するｐＳＰ７１中にクローニングし、プラスミドクローンｐＳγ１ｓを作製した。ｐＳγ１ｓのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入断片をＸｈｏＩで消化されたｐγｅ１中にクローニングし、プラスミドクローンｐγｅ２を作製した（図２６）。ｐγｅ２は、ラット重鎖３’エンハンサーに連結された、下流の５ｋｂ配列と共に、γ１定常領域コードエクソン全部並びに上流のスイッチ領域および繁殖不能転写物エクソンを含有する。
　（４．ｐＨＣ１）
　プラスミドｐＩＧＭ１をＸｈｏＩで消化し、４３ｋｂ挿入断片を単離し、そしてＸｈｏＩで消化されたｐγｅ２中にクローニングし、プラスミドｐＨＣ１を作製した（図２５）。ｐＨＣ１は、下記の配列要素の全部がＮｏｔＩでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製することができるように、ラット重鎖３’エンハンサーと共に、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８っのヒトＤセグメント、６っのヒトＪＨセグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（関連のスイッチ領域および繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。
　（Ｄ．ＩｇＭとＩｇＧを発現する小遺伝子鎖トランスジェンｐＨＣ２の作製）
　（１．ヒト重鎖Ｖ領域遺伝子ＶＨ４９．８の単離）
　ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーラムダＦＩＸＴＭＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を、次のヒトＶＨ１ファミリー特異的オリゴヌクレオチド：
オリゴ−４９　５’−ｇｔｔａａａｇａｇｇａｔｔｔｔａｔｔｃａｃｃｃｃｔｇｔｇｔｃｃｔｃｔｃｃａｃａｇｇｔｇｔｃ−３’
を用いてスクリーニングした。
　ファージクローンλ４９．８を単離し、そして可変セグメントＶＨ４９．８を含む６．１ｋｂ　ＸｂａＩ断片をｐＮＮＯ３中にサブクローニングし（ポリリンカーＣｌａＩ部位がＶＨ４９．８の下流にそしてポリリンカーＸｈｏＩ部位が上流にくるように）、プラスミドｐＶＨ４９．８を作製した。この挿入断片の８００ｂｐ領域を配列決定すると、ＶＨ４９．８は転写解読枠並びに完全なスプライシングシグナルおよび組換えシグナルを有することがわかり、よって該遺伝子が機能的であることを指摘する（表２）。
Figure 2004008218
 表２　ヒトＶＨＩファミリー遺伝子ＶＨ４９．８の配列
　（２．ｐＶ２）
　プラスミドｐＵＣ１２中にサブクローニングされたヒトＶＨＩＶファミリー遺伝子ＶＨ４−２１〔Ｉ．Ｓａｎｚら、ＥＭＢＯ　Ｊ．８：３７４１（１９８９）〕を含む４ｋｂ　ＸｂａＩゲノム断片をＳｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、ポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理した。平滑末端化された断片を、ＣｌａＩで消化されクレノウで処理されたｐＶＨ４９．８中にクローニングした。生じたプラスミドｐＶ２は、挿入断片の３’末端のユニークＳａｌＩ部位および５’末端のユニークＸｈｏＩ部位を使って、同じ方向でＶＨ４−２１の上流に連結された、ヒト重鎖遺伝子ＶＨ４９．８を含む。
　（３．ｐＳγ１−５’）
　近隣の上流３．１ｋｂ　ＸｂａＩ断片と一緒に０．７ｋｂ　ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（プラスミドｐγｅ２中の５．３ｋｂγ１スイッチ領域含有断片のすぐ上流で且つそれに隣接した配列を表す）をファージクローンλＳｇ１．１３から単離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化されたｐＵＣ１８ベグタ一中にクローニングした。生じたプラズミドｐＳγ１−５’は、γ１イソタイプにスイッチする前のＢ細胞中に見つかる繁殖不能転写物（ｓｔｅｒｉｌｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）〔Ｐ．Ｓｉｄｅｒａｓら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ１．，１：６３１（１９８９）〕の開始部位の上流の配列を表す３．８ｋｂ挿入断片を含む。該転写物はイソタイプスイッチの開始に関係があり、そして上流のシス作用性配列はしばしば転写調節に重要であるので、繁殖不能転写物の正しい発現および関連するスイッチ組換えを促進するためにそれらの配列がトランスジェン構成物中に含まれる。
　（４．ｐＶＧＥ１）
　ｐＳγ１−５’挿入断片をＳｍａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、クレノウ酵素で処理し、そして次のオリゴヌクレオチドリンカー：
５’−ｃｃｇｇｔｃｇａｃｃｇｇ−３’
と連結せしあた。この連結生成物をＳａｌＩで消化し、ＳａｌＩで消化されたｐＶ２に連結せしめた。生じたプラスミドｐＶＰは、２つの機能的ヒト可変遺伝子セグメントＶＨ４９．８とＶＨ４−２１（表２参照）の下流に連結された３．８ｋｂのγ１スイッチ５’隣接配列を含む。ＳａｌＩでの部分消化およびＸｈｏＩでの完全消化の後、アガロースゲル上での１５ｋｂ断片の精製により、ｐＶＰ挿入断片を単離する。次いで該挿入断片目をｐγｅ２のＸｈｏＩ部位中にクローニングし、プラスミドクローンｐＶＧＥ１（図２７）を作製する。ｐＶＧＥ１は、ヒトγ１定常遺伝子および関連のスイッチ領域の上流に２つのヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含有する。可変領域と定常領域との間のユニークＳａｌＩ部位を用いて、Ｄ，Ｊおよびμ遺伝子セグメントをクローニングすることができる。γ１遺伝子の３’末端にラット重鎖３’エンハンサーが連結され、そして挿入断片全体はＮｏｔＩ部位により隣接される。
　（５．ｐＨＣ２）
　プラスミドクローンｐＶＧＥ１をＳａｌＩで消化し、ｐＩＧＭ１のＸｈｏＩ挿入断片をその中にクローニングした。生じたクローンｐＨＣ２（図２５）は、４つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのＤセグメント、６つのヒトＪＨセグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（繁殖不能転写物開始部位の上流の４ｋｂ隣接配列と共に、関連のスイッチ領域と繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。それらのヒト配列は、前記配列要事全部をＮｏｔＩでの消化によりベクター配列を含まない単一鎖上に単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を生ぜしめることができるように、ラット重鎖３’エンハンサーに連結される。該挿入断片の５’末端のユニークＸｈｏＩ部位を使って、追加のヒト可変遺伝子セグメントをその中にクローニングし、この重鎖小遺伝子座の組換え多様性を更に増大させることができる。
　（Ｅ．トランスジェニックマウス）
　プラスミドｐＩＧＭ１およびｐＨＣ１のＮｏｔＩ挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製された挿入断片を、受精した（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）Ｆ２マウスの胚の前核中にマイクロインジェクトし、そして生存している胚を、Ｈｏｇａｎらにより記載された通りに（Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｆ．ＣｏｓｔａｎｔｉｎｉおよびＥ．Ｌａｃｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，１９８６，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）偽妊娠した雌に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザンブロット分析によりトランスジェン配列の存在について分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標準物に比較したバンド強度により、トランスジェンコピー数を評価した。３〜８週齢において、それらの動物から血清を単離し、そしてＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により記載されたように、トランスジェンによりコードされるヒトＩｇＭおよびＩｇＧｌの存在についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。マイクロタイタープレートのウエルを、ヒトＩｇＭに特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンＡＦ６，＃０２８５，ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）およびヒトＩｇＧに特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンＪＬ５１２，＃０２８０，ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）によりコーティングした。該ウエル中に血清試料を連続的に希釈し、予備吸着させることによってマウス免疫グロブリンとの交差反応性を最小限にしたアフィニティー単離されたアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇ（多価）を用いて、特異的免疫グロブリンの存在を検出した。表３と図２８は、プラスミドｐＨＣ１のトランスジェン挿入断片を注入した胚から発育した２匹の動物の血清中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧ１の存在についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。このアッセイにより試験した対照の非トランスジェニックマウスは全て、ヒトＩｇＭおよびＩｇＧの発現について陰性であった。ｐＩＧＭ１　ＮｏｔＩ挿入断片を含有する２系統のマウス（系統＃６と１５）はヒトＩｇＭを発現するがヒトＩｇＧｌを発現しない。我々はｐＨＣ１挿入断片を含む６つの系のマウスを試験した。その結果、４系統（系＃２６，３８，５７および１２２）がヒトＩｇＭとヒトＩｇＧ１の両方を発現し、２系統のマウス（系統＃１９および２１）は検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。ヒト免疫グロブリンを発現しなかったｐＨＣｌトランスジェニックマウスは、マイクロインジェクトした胚から直接発育したものであり、該トランスジェンの存在についてモザイクであり得る、いわゆるＧ０マウスであった。サザンブロット分析は、それらのマウスの多くが細胞あたり該トランスジェンの１つまたは少数のコピーを含むことを示した。ｐＩＧＭ１トランスジェニック動物の血清中のヒトＩｇＭ、並びにｐＨＣ１トランスジェニック動物の血清中のヒトＩｇＭとＩｇＧ１の検出は、トランスジェン配列がＶＤＪ連結、転写およびイソタイプスイッチを指令することにおいて正しく機能しているという証拠を提供する。１匹の動物（＃１８）は、サザンブロット分析によりトランスジェンについて陰性であり、検出可能レベルのヒトＩｇＭまたはＩｇＧ１を全く示さなかった。２番目の動物（＃３８）は、サザンブロッティングによりアッセイすると該トランスジェンの約５コピーを含んでおり、そして検出可能レベルのヒトＩｇＭとＩｇＧ１の両方を示した。トランスジェンを注入した胚から発育した１１匹の動物についてのＥＨＳＡアッセイの結果を下表（表３）に要約する。
　表３　ＥＬＩＳＡアッセイによるトランスジェニック動物の血清中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧ１の検出
Figure 2004008218
 表３は、組み込まれたトランスジェンＤＮＡの存在と血清中のトランスジェンによりコードされる免疫グロブリンとの間の相関関係を示す。ｐＨＣ１トランスジェンを含むことがわかった動物のうちの２匹は、検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現しなかった。それらは共に低コピー動物であり、該トランスジェンの完全なコピーが含まれていないか、または該動物が遺伝的モザイクを有している（動物＃２１について評価された細胞あたり＜１コピーにより指摘される）ことがあり、そしてトランスジェン含有細胞が造血系統に移っていない場合がある。あるいは、トランスジェンがそれらの発現に至らないゲノム領域中に組み込まれている場合がある。ｐＩＧＭ１トランスジェニック動物の血清中のヒトＩｇＭの検出、並びにｐＨＣ１トランスジェニック動物の血清中のヒトＩｇＭとＩｇＧ１の検出は、トランスジェン配列がＶＤＪ結合、転写およびイソタイプスイッチを指令する上で正しく機能することを指摘する。
　（Ｆ．ｃＤＮＡクローン）
　ＶＤＪ連結およびクラススイッチ、並びにＢ細胞発達および対立遺伝子排除におけるトランスジェンがコードするヒトＢ細胞レセプターの関与に関するｐＨＣ１トランスジェンの機能性を評価するために、トランスジェニックマウス脾臓ｍＲＮＡから誘導した免疫グロブリンｃＤＮＡクローンの構造を調べた。ＤおよびＪセグメント用法、Ｎ領域の付加、ＣＤＲ３の長さ分布、並びに機能的ｍＲＮＡ分子をもたらす接合部の頻度に焦点を合わせて、該トランスジェンによりコードされる重鎖の総合的多様性を調べた。ＶＨ１０５とＶＨ２５１を組み込んだＩｇＭおよびＩｇＧをコードする転写物を調べた。
　第１１週の雄第二世代５７系列ｐＨＣ１トランスジェニックマウスからポリアデニル化ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを使ってオリゴｄＴ開始一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで得られたｃＤＮＡを、次の４つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使った４つの各ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として使用した：ＶＨ２５１特異的オリゴ−１４９　ｃｔａｇｃｔｃｇａｇｔｃｃａａｇｇａｇｔｃｔｇｔｇｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇ（ｇ，ａ，ｔ，ｃ）；ＶＨ１０５特異的オリゴ−１５０　ｇｔｔｇｃｔｃｇａｇｔｇａａａｇｇｔｇｔｃｃａｇｔｇｔｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇ（ｇ，ａ，ｔ，ｃ）；ヒトγ１特異的オリゴ−１５１　ｇｇｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｃｃａｃｇａｃａｃｃｇｔｃａｃｃｇｇｔｔｃ；およびヒトμ特異的オリゴ−１５２　ｃｃｔｇｃｔｃｇａｇｇｃａｇｃｃａａｃｇｇｃｃａｃｇｃｔｇｃｔｃｇ。反応１はプライマーｏ−１４９とｏ−１５１を使ってＶＨ２５１−γ１転写物を増幅せしめ、反応２はプライマーｏ−１４９とｏ−１５２を使ってＶＨ２５１−μ転写物を増幅せしめ、反応３はプライマーｏ−１５０とｏ−１５１を使ってＶＨ１０５−γ１転写物を増幅せしめ、そして反応３はプライマーｏ−１５０とｏ−１５２を使ってＶＨｌ０５−μ転写物を増幅せしめた。得られた０．５ｋｂのＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離した。対応するＥＬＩＳＡデータ（図３４）と一致して、μ転写物産物はγ転写物産物よりも豊富であった。ＰＣＲ産物をＸｈｏＩで消化し、プラスミドｐＮＮ０３中にクローニングした。４つのＰＣＲ増幅の各々からの９個のクローンのミニプレプから二本鎖プラスミドＤＮＡを単離し、そしてジデオキシ配列決定反応を実施した。該クローンのうちの２つがＤまたはＪセグメントを含まない欠失体であることがわかった。それらは正常のＲＮＡスプライシング生成物からは誘導することができなかったので、おそらくＰＣＲ増幅中に導入された欠失から生じたのであろう。該ＤＮＡ試料のうちの１つは、２つの個々のクローンの混合物であることがわかり、そして他の３つのクローンは読み取り可能なＤＮＡ配列を生成しなかった（おそらくＤＮＡ試料が十分に純粋でなかったためであろう）。残りの３０個のクローンからのＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を表４にまとめた。各配列はユニークであり、遺伝子再配列の単一経路が優性でないこと、またはトランスジェン発現性Ｂ細胞の単一クローンが優性でないことを示す。どの２配列も類似していないという事実は、免疫グロブリンの莫大な多様性が２個のＶセグメント、１０個のＤセグメントおよび６個のＪセグメントのみを含む小型の小遺伝子座から発現され得るという暗示でもある。該トランスジェン中に含まれるＶセグメントの両方、６個のＪセグメントの全部および１０個のＤセグメントの７個がＶＤＪ接合部に使われる。加えて、両定常領域遺伝子（μとγ１）が転写物中に含まれる。ＶＨ１０５プライマーは実施した反応においてＶＨ１０５に特異的であることがわかった。従って、反応３および４からのクローンの多くがＶＨ２５１転写物を含んでいた。更に、連結反応３のＰＣＲ産物から単離されたクローンはＩｇＧよりもむしろＩｇＭをコードすることがわかった；しかしながら、これは、ＤＮＡを同一ゲル上で単離したため、反応４からのＰＣＲ産物による汚染を表すかもしれない。成人末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から免疫グロブリン重鎖配列を増幅せしめそしてＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を決定した同様な実験が、細菌Ｙａｍａｄａらにより報告された〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：３９５−４０７（１９９１）；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。このヒトＰＢＬからのデータをｐＨＣ１トランスジェニックマウスからの我々のデータと比較した。
表４
Figure 2004008218
 　（Ｇ．Ｊセグメント選択）
　表５は、成人ＰＢＬ免疫グロブリン転写物中に見つかるＪセグメントに対して、ｐＨＣ１トランスジェンによりコードされる転写物中に取り込まれるＪセグメントの分布を比較した。それらの分布プロフィールは非常に類似しており、両系ともＪ４セグメントが優性セグメントであり、次いでＪ６セグメントが優性である。Ｊ２はヒトＰＢＬ中およびトランスジェニック動物中で最も稀なセグメントである。
　表５
　Ｊセグメント選択
Figure 2004008218
 　（Ｈ．Ｄセグメント選択）
　Ｙａｍａｄａらにより分析されたクローンの４９％（８２のうち４０）が、ｐＨＣ１トランスジェン中に含まれるＤセグメントを含んでいた。他の１１クローンは、該著者らにより既知Ｄセグメントのいずれにも指定されなかった配列を含んだ。それらの指定されなかった１１個のクローンのうちの２つは、ｐＨＣ１構成物中に含まれるＤＩＲ２セグメントの逆位から誘導されるようだ。Ｉｃｈｉｈａｒａら〔ＥＭＢＯ　Ｊ．７：４１４１（１９８８）〕により予想されそしてＳａｎｚ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７２０−１７２９（１９９１）〕により観察されたこの機構を、Ｙａｍａｄａら〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：３９５−４０７（１９９１）〕は考慮に入れなかった。表５は、ｐＨＣ１トランスジェニックマウスについてのＤセグメント分布とＹａｍａｄａらによりヒトＰＢＬ転写物について観察されたものとの比較である。Ｙａｍａｄａらのデータを、ＤＩＲ２使用を包含しそしてｐＨＣ１トランスジェン中にないＤセグメントを除外するように再編集した。表６は、Ｄセグメント組み込みの分布がトランスジェニックマウスとヒトＰＢＬとにおいて非常に類似していることを証明する。２つの優性なヒトＤセグメントＤＸＰ’１とＤＮ１は、トランスジェニックマウス中にも高頻度で見つかる。２つの分布間の最も大きな相違点は、ヒトに比べてトランスジェニックマウス中でのＤＨＱ５２の高頻度である。ＤＨＱ５２の高頻度はヒト胎児肝臓中のＤセグメント分布を思い出させる。Ｓａｎｚは重鎖転写物の１４％がＤＨＱ５２配列を含んだことを報告している。ｐＨＣ１中に見つからないＤセグメントを分析から除外すれば、Ｓａｎｚにより分析された胎児転写物の３１％がＤＨＱ５２を含んでいる。これは、本発明者らがｐＨＣ１トランスジェニックマウス中に観察した２７％と同等である。
　表６
　Ｄセグメント選択
Figure 2004008218
 　（Ｉ．ＶＤＪ接合部の機能性）
　表７は、ｐＨＣ１トランスジェニック動物から分析された３０個のクローンからのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。翻訳配列は、３０個のＶＤＪ接合部のうちの２３個（７７％）が可変セグメントとＪセグメントに関して枠内（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）であることを示す。
　表７
　Ｖ−Ｄ−Ｊ接合部の機能性
Figure 2004008218
 　（Ｊ．ＣＤＲ３の長さ分布）
　表８は、ｐＨＣ１トランスジェニックマウス中の枠内ＶＤＪ接合部を有する転写物からのＣＤＲ３ペプチドの長さをヒトＰＢＬ中のそれと比較したものである。ヒトＰＢＬデータは同じくＹａｍａｄａらから得られたものである。両分布は類似しているが、トランスジェニックマウスの分布はヒトＰＢＬから観察されたものよりもわずかに小さいＣＤＲ３ペプチドの方に偏っていた。トランスジェニックマウスにおけるＣＤＲ３の平均長さは１０．３アミノ酸である。これはＳａｎｚ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７２０−１７２９（１９９１）〕によりヒトＣＤＲ３ペプチドについて報告された平均サイズと実質的に同じである。
　表８
　ＣＤＲ３の長さ分布
Figure 2004008218
 　（実施例１３）
　（再配列された重鎖トランスジェン）
　（Ａ．再配列されたヒト重鎖ＶＤＪセグメントの単離）
　ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）中にクローニングされた２種のヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを含むλ１．３の１ｋｂ　ＰａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を用いてスクリーニングする。陽性クローンを、次のＶＨ特異的オリゴヌクレオチド：
オリゴ−７　５’−ｔｃａｇｔｇａａｇｇｔｔｔｃｃｔｇｃａａｇｇｃａｔｃｔｇｇａｔａｃａｃｃｔｔｃａｃｃ−３’
オリゴ−８　５’−ｔｃｃｃｔｇａｇａｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇｃａｇｃｃｔｃｔｇｇａｔｔｃａｃｃｔｔｃａｇｔ−３’
の混合物とのハイブリダイゼーションについて試験する。
　ＶプローブとＪ−μプローブの両方とハイブリダイズするクローンを単離し、そして再配列されたＶＤＪセグメントのＤＮＡ配列を決定する。
　（Ｂ．再配列されたヒト重鎖トランスジェンの作製）
　機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライスシグナル）を、プラスミド由来のＸｈｏＩ部位が挿入断片配列の５’末端に隣接するように、プラスミドベクターｐＳＰ７２中にサブクローニングする。機能的ＶＤＪセグメントを含むサブクローンをＸｈｏＩとＰａｃＩ（ＰａｃＩはＪ−μイントロンエンハンサー近くの部位を認識する稀少な切断酵素である）で消化し、そして挿入断片をＸｈｏＩ／ＰａｃＩで消化されたｐＨＣ２中にクローニングし、機能的ＶＤＪセグメント、Ｊ−μイントロンエンハンサー、μスイッチ要素、μ定常領域コードエクソンおよびγ１定常領域（これは繁殖不能転写物関連配列、γ１スイッチおよびコードエクソンを含む）を有するトランスジェン構成物を作製する。上述したように、このトランスジェン構成物をＮｏｔＩで切り出し、そしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。
　（実施例１４）
　（軽鎖トランスジェン）
　（Ａ．プラスミドベクターの作製）
　１．プラスミドベクターｐＧＰｌｃ
　プラスミドベクターｐＧＰｌａをＮｏｔＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：オリゴ−８１　５’−ｇｇｃｃｇｃａｔｃｃｃｇｇｇｔｃｔｃｇａｇｇｔｃｇａｃａａｇｃｔｔｔｃｇａｇｇａｔｃｃｇｃ−３’
オリゴ−８２　５’−ｇｇｃｃｇｃｇｇａｔｃｃｔｃｇａａａｇｃｔｔｇｔｃｇａｃｃｔｃｇａｇａｃｃｃｇｇｇａｔｇｃ−３’
をその中に連結せしめる。生じたプラスミドｐＧＰ１ｃは、ＮｏｔＩ部位により隣接されたＸｍａＩ，ＸｈｏＩ，ＳａｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を有するポリリンンカーを含む。
　２．プラスミドベクターｐＧＰ１ｄ
　プラスミドベクターｐＧＰ１ａをＮｏｔＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：
オリゴ−８７　５’−ｇｇｃｃｇｃｔｇｔｃｇａｃａａｇｃｔｔａｔｃｇａｔｇｇａｔｃｃｔｃｇａｇｔｇｃ−３’
オリゴ−８８　５’−ｇｇｃｃｇｃａｃｔｃｇａｇｇａｔｃｃａｔｃｇａｔａａｇｃｔｔｇｔｃｇａｃａｇｃ−３’
をその中に連結せしめる。生じたプラスミドｐＧＰ１ｄは、ＮｏｔＩ部位により隣接されたＳａｌＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＣｌａＩ，ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有するポリリンンカーを含む。
　（Ｂ．ＪκおよびＣκクローンの単離）
　ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒトκ軽鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド：
オリゴ−３６　５’−ｃａｃｃｔｔｃｇｇｃｃａａｇｇｇａｃａｃｇａｃｔｇｇａｇａｔｔａａａｃｇｔａａｇｃａ−３’
を用いてスクリーニングし、そしてファージクローン１３６．２と１３６．５を単離する。１３６．２からＪκ１セグメントを含む７．４ｋｂ　ＸｈｏＩ断片を単離し、プラスミドｐＮＮ０３中にサブクローニングしてプラスミドクローンｐ３６．２を作製する。Ｃκ遺伝子セグメントと共にＪκセグメント２〜５を含む近隣の１３ｋｂ　ＸｈｏＩ断片をファージクローン１３６．５から単離し、そしてプラスミドｐＮＮ０３中にサブクローニングしてプラスミドクローンｐ３６．５を作製する。それら２つのクローンを一緒にすると、Ｊκ１の７．２ｋｂ上流で始まりＣκの９ｋｂ下流で終わる領域に及ぶ。
　（Ｃ．再配列された軽鎖トランスジェンの作製）
　（１．再配列された可変セグメントを発現させるためのＣκベクターｐＣＫｌ）
　Ｃκ遺伝子を含むプラスミドクローンｐ３６．５の１３ｋｂ　ＸｈｏＩ断片を、９ｋｂの下流配列と一緒に、該挿入断片の５’末端がプラスミドＸｈｏＩ部位に隣接した状態で、プラスミドベクターｐＧＰｌｃのＳａｌＩ部位中にクローニングする。生じたクローンｐＣＫ１は、再配列されたＶＪκセグメントを含むクローン化断片をユニーク５’ＸｈｏＩ部位に収容することができる。次いで該トランスジェンをＮｏｔＩで切り出し、ゲル電気泳動によってベクター配列から精製する。得られたトランスジェン構成物は、ヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーを含むであろうし、ヒト３’κエンハンサーを含むことができる。
　（２．再配列された可変セグメントを発現させるための重鎖エンハンサー含有ＣκベクターｐＣＫ２）
　マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Ｊ．Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０（１９８３）〕を含むマウスゲノムＤＮＡの０．９ｋｂ　ＸｂａＩ断片をｐＵＣ１８中にサブクローニングし、プラスミドｐＪＨ２２．１を作製した。このプラスミドをＳｐｈＩにより線状化し、クレノウ酵素を用いて末端をフィルインした。クレノウ処理されたＤＮＡを次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてヒト重鎖μイントロンエンハンサー〔Ｈａｙｄａｙら、Ｎａｔｕｒｅ３０７：３３４−３４０（１９８４〉〕を含むファージクローンλ１．３（前の実施例）のＭｌｕＩ（クレノウ）／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をそれと連結した。生じたプラスミドｐＭＨＥ１は、両者が単一のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に切除されるように、ｐＵＣｌ８中に一緒に連結されたマウスとヒトの重鎖μイントロンエンハンサーから成る。この２．３ｋｂ断片を単離し、ｐＧＰｌｃ中にクローニングしてｐＭＨＥ２を作製する。ｐＭＨＥ２をＳａｌＩで消化し、ｐ３６．５の１３ｋｂ　ＸｈｏＩ挿入断片をその中にクローニングする。生じたプラスミドｐＣＫ２は、マウスとヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーがトランスジェン挿入断片の３’末端に融合していること以外は、ｐＣＫ１と同一である。最終トランスジェンの発現を調節するために、異なるエンハンサー、即ちマウスまたはラットの３’κまたは重鎖エンハンサー〔ＭｅｙｅｒおよびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＥＭＢＯ　Ｊ．８：１９５９−１９６４（１９８９）：Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：１６５−１６８（１９９０）〕を使って類似構成物を作製することができる。
　（３．再配列されたκ軽鎖可変セグメントの単離）
　ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）中にクローニングされた２つのヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、ｐ３６．５の３．５ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＳｍａＩ断片を含むヒトκ軽鎖Ｊ領域を用いてスクリーニングした。陽性クローンを、次のＶκ特異的オリゴヌクレオチド：
オリゴ−６５　５’−ａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃ−３’
とのハイブリダイゼーションについて試験した。ＶプローブとＪプローブの両方とハイブリダイズしたクローンを単離し、そして再配列されたＶＪκセグメントのＤＮＡ配列を決定する。
　（４．再配列されたヒト軽鎖構成物を含有するトランスジェニックマウスの作製）
　機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライススグナル）をベクターｐＣＫ１およびｐＣＫ２のＸｈｏＩ部位中にサブクローニングし、再配列されたκ軽鎖トランスジェンを作製する。ＮｏｔＩでの消化により該トランスジェン構成物をベクター配列から単離する。アガロースゲル上で精製した挿入断片をマウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製する。ヒトκ鎖を発現している動物を、重鎖小遺伝子を含有するトランスジェニック動物（実施例１４）と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作る。
　ＶＪκ組合せの全部が、広域スペクトルの種々の重鎖ＶＤＪ組合せと安定な重鎖−軽鎖複合体を形成できるわけではないので、それぞれ異なる再配列されたＶＪκクローンを使って幾つかの異なる軽鎖トランスジェン構成物を作製し、そして重鎖小遺伝子座トランスジェンを発現するマウスと交配させる。二重トランスジェニック（重鎖構成物と軽鎖構成物の両方）動物から、末梢血、脾臓およびリンパ節リンパ球を単離し、ヒトおよびマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリンに特異的な蛍光抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ．Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色し、そしてＦＡＣＳｃａｎ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使ってフローサイトメトリーにより分析する。最大数のＢ細胞の表面上に最高レベルのヒト重鎖／軽鎖複合体を生じ且つ免疫細胞区分に悪影響を与えない（ＢおよびＴ細胞サブセット特異的抗体を用いたフローサイトメトリー分析によりアッセイした時）再配列された軽鎖トランスジェン構成物を、ヒトモノクローナル抗体の産生のために選択する。
　（Ｄ．再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジェンの作製）
　（１．小遺伝子座トランスジェンを作製するためのＪκ，Ｃκ含有ベクターｐＪＣＫ１）
　ｐ３６．５の１３ｋｂのＣκ含有ＸｈｏＩ挿入断片をクレノウ酵素で処理し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されクレノウ処理されたプラスミドｐＧＰｌｄ中にクローニングする。挿入断片の５’末端がベクター由来のＣｌａＩ部位に隣接するようなプラスミドクローンを選択する。生じたプラスミドｐ３６。５−１ｄをＣｌａＩで消化し、クレノウで処理する。ｐ３６．２のＪκ１含有７．４ｋｂ　ＸｈｏＩ挿入断片をクレノウで処理し、そしてＣｌａＩで消化されクレノウ処理されたｐ３６．５−ｌｄ中にクローニングする。ｐ３６．２挿入断片がｐ３６．５挿入断片と同じ方向にあるクローンを選択する。このクローンｐＪＣＫ１（図３４）は、７．２ｋｂの上流配列および９ｋｂの下流配列と一緒に、完全なヒトＪκ領域およびＣκ領域を含む。該挿入断片はヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーも含み、ヒト３’κエンハンサーを含むこともある。該挿入断片は、追加の３’隣接配列、例えば重鎖または軽鎖エンハンサーをクローニングする目的でユニーク３’ＳａｌＩ部位により隣接される。ユニークＸｈｏＩ部位は、再配列されていないＶκ遺伝子セグメント中でクローニングする目的で該挿入断片の５’末端に置かれる。ユニークＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位は、最終のトランスジェン構成物をベクター配列から単離するために使われるＮｏｔＩ部位により隣接される。
　（２．再配列されていないＶκ遺伝子セグメントの単離およびヒトＩｇ軽鎖タンパク質を発現するトランスジェニック動物の作製）
　Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴー６５（上述）を使って、ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡを探査する。生じたクローンからの可変遺伝子セグメントを配列決定し、機能的と思われるクローンを選択する。機能性を判断するための基準は、転写解読枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列を含むことである。選択された可変遺伝子セグメントを含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＪＣＫ１のユニークＸｈｏＩ部位にクローニングし、小遺伝子座構成物を作製する。得られたクローンをＮｏｔＩで消化し、挿入断片を単離し、そしてマウス胚の前核中にマィクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。それらの動物のトランスジェンは、Ｂ細胞発達の際にＶ−Ｊ結合を受けるであろう。ヒトκ鎖を発現する動物を、重鎖小遺伝子座を含有するトランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを得る。
　（実施例１５）
　（ゲノム重鎖ヒトＩｇトランスジェン）
　この実施例は、接合子中へのマイクロインジェクションまたはＥＳ細胞中への組み込みによりマウス生殖細胞中に導入される、ヒトゲノム重鎖免疫グロブリントランスジェンのクローニングを記載する。
　Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．ら，（１９８５）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，８９−１２９頁，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄにより記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはＰＢＳで洗浄したヒト精母細胞）を０．５％低融点アガロースブロック中に埋め込み、そして核については５００ｍＭ　ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ中の１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにより、精母細胞については５００ｍＭ　ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ，１０ｍＭ　ＤＴＴ中の１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにより、５０℃にて１８時間溶解せしめる。該ブロックを４０μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ／ＴＥ中で５０℃にて３０分間インキュベートすることにより、プロテイナーゼＫを不活性化する。次いでＭ．ＦｉｎｎｅｙによりＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅ１ら編，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，増補４，１９８８，例えば第２．５．１章）中に記載されたように、アガロース中で該ＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで消化する。
　ＮｏｔＩで消化したＤＮＡを、次いでＡｎａｎｄら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：３４２５−３４３３（１９８９）により記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分画する。ＮｏｔＩ断片に富む画分をサザンハイブリダイゼーションによりアッセイし、この断片によってコードされる１または複数の配列を検出する。そのような配列は、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメントおよびγ１定常領域と共に６つのＶＨファミリー全部の代表物を含む〔この断片は、Ｂｅｒｍａｎら（１９８８），前掲によればＨｅＬａ細胞から６７０ｋｂ断片として同定されているけれども、本発明者らはそれがヒト胎盤および精子ＤＮＡからのは８３０ｋｂ断片であることを発見した〕。このＮｏｔＩ断片を含む画分（図４参照）を記載の如く〔ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ２：６５−７１（１９９０）〕ベクターｐＹＡＣＮＮのＮｏｔＩ部位中に連結せしめる。プラスミドｐＹＡＣＮＮは、ｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＥｃｏＲＩで消化しそしてオリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’の存在下で連結せしめることにより、調製される。
　Ｔｒａｖｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５８９８−５９０２（１９８９）により記載された通りに、重鎖ＮｏｔＩ断片を含むＹＡＣベクターを単離する。クローン化されたＮｏｔＩ挿入断片を、Ｍ．Ｆｉｎｎｅｙ（前掲）により記載されたようなパルスフィールドゲル電気泳動により高分子量酵母ＤＮＡから単離する。１ｍＭスペルミンの添加によりＤＮＡを濃縮し、上述した通り単細胞胚の核に直接マイクロインジェクトする。あるいは、ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動により単離し、そしてリポフェクション〔Ｇｎｉｒｋｅら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１０：１６２９−１６３４（１９９１）〕によりＥＳ細胞中に導入するか、またはＹＡＣをスフェロプラスト融合によりＥＳ細胞中に導入する。
　（実施例１６）
　（不連続ゲノム重鎖Ｉｇトランスジェン）
　ＶＨ６、Ｄセグメント、Ｊセグメント、μ定常領域および一部のγ定常領域を含むヒトゲノムＤＮＡの８５ｋｂ　ＳｐｅＩ断片は、本質的には実施例１に記載した通りのＹＡＣクローニングによって単離された。生殖細胞型可変領域由来の断片、例えば多コピーのＶ１〜Ｖ５を含む上記の６７０−８３０ｋｂ　ＮｏｔＩ断片の上流の５７０ｋｂ　ＮｏｔＩ断片、を含有するＹＡＣを上述の如く単離する。〔Ｂｅｒｍａｎら（１９８８），前掲は、各々が多数のＶセグメントを含有する２つの５７０ｋｂ　ＮｏｔＩ断片を検出した。〕この２断片を実施例１に記載の如くマウス単細胞胚の核中に同時注入する。
　典型的には、２つの異なるＤＮＡ断片の同時注入は、染色体内の同一部位のところへの両断片の組込みをもたらす。従って、該２断片各々の少なくとも１コピーを含む生じたトランスジェニック動物の約５０％が、定常領域含有断片の上流に挿入されたＶセグメント断片を有する。それらの動物のうち、８５ｋｂ　ＳｐｅＩ断片の位置に関する５７０ｋｂ　ＮｏｔＩ断片の方向性に依存して、約５０％がＤＮＡ逆位によりＶ−ＤＪ結合を行い、そして約５０％が欠失によりＶ−ＤＪ結合を行うだろう。生じたトランスジェニック動物からＤＮＡを単離し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーションにより両方のトランスジェンを含んでいることが示された動物（詳しくは、多数のヒトＶセグメントとヒト定常領域遺伝子の両方を含む動物）を、標準技術に従って、ヒト免疫グロブリンを発現する能力について試験する。
　（実施例１７）
　（トランスジェニックＢ細胞中の機能的に再配列された可変領域配列の同定）
　着目の抗原を使って、次の遺伝的特性；ＪＨの欠失（実施例１０）については内因性所有鎖遺伝子座中の同型接合性；再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジェン（実施例５および１４）の単一コピーについては半接合性；および再配列されたヒトκ軽鎖トランスジェン（実施例６および１４）の単一コピーについては半接合性、を有するマウスを免疫化する〔ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ１，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと〕。
　免疫化スケジュールの後、脾臓を取り出し、脾細胞を使ってハイブリドーマを調製する。着目の抗原と反応性である抗体を分泌する個々のハイブリドーマクローンからの細胞を使ってゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの試料を、ユニークな６塩基対配列を認識する幾つかの異なる制限酵素で消化し、そしてアガロースゲル上で分画する。サザンブロットハイブリダイゼーションを使って２〜１０ｋｂ範囲内の２つのＤＮＡ断片を同定する。該断片の一方は、再配列されたヒト重鎖ＶＤＪ配列の単一コピーを含み、もう一方は再配列されたヒト軽鎖ＶＪ配列の単一コピーを含む。それらの２断片をアガロースゲル上でサイズ分画し、ｐＵＣ１８中に直接クローニングする。クローン化された挿入断片を、定常領域配列を含む重鎖および軽鎖発現カセット中にそれぞれサブクローニングする。
　プラスミドクローンｐγｅ１（実施例１２）を重鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＤＪ配列をＸｈｏＩ部位中にクローニングする。プラスミドクローンｐＣＫ１を軽鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＪ配列をＸｈｏＩ部位中にクローニングする。生じたクローンを一緒に使ってＳＰ０細胞をトランスフェクトせしめ、着目の抗原と反応する抗体を産生せしめる〔Ｍ．Ｓ．Ｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２８６９（１９９１）〕。
　あるいは、上述のクローン化ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成するのに使う。発現されるヒト重鎖および軽鎖ＶＤＪおよびＶＪ配列を、次いでＰＣＲにより増幅し、クローニングする〔Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｈら（１９８９）Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：９３４−９３８〕。それらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同じポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＣ．Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：５４５４−５４５８（１９８９）により記載されたようにして合成発現ベクターを作製する。
　（複合抗原によるトランスジェニック動物の免疫化）
　次の実験は、トランスジェニック動物がヒト赤血球上の抗原のような複合抗原により好結果に免疫化することができ、そして正常マウスにおいて観察される応答速度論に類似した速度論で応答することができることを証明する。
　血液細胞は一般に適当な免疫原であり、赤血球と白血球の表面上には多数の異なる型の抗原を含んで成る。
　（ヒト血液による免疫化）
　一人の提供者からのヒト血液のチューブを収集し、機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座（ＪＨＤ）を有し且つヒト重鎖小遺伝子構成物（ＨＣ１）を含有するトランスジェニックマウスを免疫化するのに使った。それらのマウスを系１１２と命名する。血液を洗浄し、５０ｍｌのハンクス溶液中に再懸濁し、１×１０８細胞／ｍｌに希釈した。次いで２８ゲージの針と１ｃｃの注射器を使って０．２ｍｌ（２×１０７細胞）を腹腔内注射した。この免疫化プロトコールを６週間に渡りほぼ毎週繰り返した。眼窩後方出血から採血し、血清を収集し、それを特異抗体について試験することにより、血清抗体価をモニタリングした。免疫前出血を対照として取った。まさしく最後の免疫化の時、血清またはハイブリドーマを得るためにそれらの動物を犠牲にする３日前に、ハイブリドーマの生産を増大させるために尾部静脈内への１×１０８細胞による免疫化を１回行った。
表９
Figure 2004008218
 マウス＃２３４３と２３４８は所望の表現型を有する：重鎖破壊背景上のヒト重鎖小遺伝子トランスジェニック。
　（ハイブリドーマの作製）
　上述の通り免疫化された約１６週齢のトランスジェニックマウス（表９）のマウス脾細胞を非分泌性ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞系Ｘ６３Ａｇ８．６５３から成る融合相手と融合せしめることにより、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマクローンを培養し、血液細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する免疫グロブリンを含有するハイブリドーマ上清を、例えばフローサイトメトリーにより、同定した。
　（フローサイトメトリー）
　フローサイトメトリーを使って血清とハイブリドーマ上清を試験した。提供者からの赤血球をハンクス溶液中で４回洗浄し、５０，０００個の細胞を１．１ｍｌのポリプロピレン微小管中に入れた。細胞をハイブリドーマからの上清または抗血清と共に染色媒質〔フェノールレッドまたはビオチン（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、３％新生ウシ血清、０．１％ナトリウムアジドを含まない１×ＲＰＭＩ培地）中で氷上で３０分間インキュベートした。対照は他の遺伝子型を有する同腹マウスから成った。次いで細胞をＳｏｒｖａｌｌ　ＲＴ６００Ｂ中で１０００ｒｐｍで５〜１０分間４℃にて遠心することにより洗浄した。細胞を２回洗浄した後、蛍光生成試薬を使って細胞表面上の抗体を検出した。２種類のモノクローナル試薬を使って試験した。１つはＦＩＴＣで標識されたマウス抗ヒトμ重鎖抗体（Ｐｈａｒｍａｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）であり、もう１つはＰＥで標識されたラット抗マウスκ軽鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）であった。それらの試薬は両方とも同様な結果を与えた。全血（赤血球と白血球）および白血球のみを標的細胞として使用した。両方の組が陽性結果を与えた。
　トランスジェニックマウスおよび同腹対照の血清を提供者からの赤血球または他の個体からの白血球のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、次いで抗ヒトＩｇＭ　ＦＩＴＣ標識抗体により発色させ、フローサイトメーター中で分析した。結果は、ヒト小遺伝子座についてトランスジェニックであるマウス（マウス２３４３および２３４８）からの血清がヒトＩｇＭ反応性を示し、一方全ての同腹動物（２３４４，２３４５，２３４６，２３４７）からの血清は該反応性を示さなかった。正常マウス血清（ＮＳ）とリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）を負の対照として使用した。赤血球は未濾過であり、白血球はリンパ球のみを含むように濾過された。比較を与えるためにｘ軸とｙ軸上に線が引かれている。融合体２３４８からの１００の上清に関してフローサイトメトリーを実施した。４つの上清が血球細胞抗原に対する陽性反応性を示した。
　（実施例１８）
　（アンチセンスＲＮＡによる内因性マウス免疫グロブリン発現の減少）
　（Ａ．アンチセンスＩｇ配列の発現用のベクター）
　（１．クローニングベクターｐＧＰｌｈの作製）
　ベクターｐＧＰｌｂ（前の実施例に記載）をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド：
　５’−ｇａｔｃｃｔｃｇａｇａｃｃａｇｇｔａｃｃａｇａｔｃｔｔｇｔｇａａｔｔｃｇ−３’
　５’−ｔｃｇａｃｇａａｔｔｃａｃａａｇａｔｃｔｇｇｔａｃｃｔｇｇｔｃｔｃｇａｇ−３’
と連結せしめてプラスミドｐＧＰｌｈを作製した。このプラスミドは、次の制限部位：ＮｏｔＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢｇｌＩＩ，Ａｓｐ７１８，ＸｈｏＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩを含むポリリンカーを含有する。
　（２．ｐＢＣＥ１の作製）
　プロモーター−リーダー配列エクソン、第一イントロンおよびヒトＶＨ−Ｖファミリー免疫グロブリン可変遺伝子セグメントの第二エクソンの一部を含む、ｐＶＨ２５１（前の実施例に記載）の０．８ｋｂ　ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩ断片を、ＸｂａＩ／ＢｇｌＩＩで消化したベクターｐＮＮＯ３中に挿入してプラスミドｐＶＨ２５１Ｎを作製した。
　ヒト成長ホルモン遺伝子〔ｈＧＨ；Ｓｅｅｂｕｒｇ（１９８２）ＤＮＡｌ：２３９−２４９〕のコードエクソンを含む２．２ｋｂ　ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ　ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＧＨｌｈ中にクローニングした。生じたプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＶＨ２５１ＮのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｈＧＨ遺伝子と同じ方向において挿入し、プラスミドｐＶｈｇｈを作製した。
　マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０〕を含むマウスゲノムＤＮＡの０．９ｋｂ　ＸｂａＩ断片をｐＵＣ１８中にサブクローニングしてプラスミドｐＪＨ２２．１を作製した。このプラスミドをＳｐｈＩで直鎖状にし、末端をクレノウ酵素でフィルインした。次いでクレノウ処理したＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Ｈａｙｄａｙら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０７：３３４−３４０〕を含むファージクローンλ１．３（上記実施例）の１．４ｋｂＭｌｕＩ（クレノウ）／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をそれと連結せしめた。得られたプラスミドｐＭＨＥ１は、単一のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片において切り出すことができるようにｐＵＣ１８中に一緒に連結されたマウスおよびヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーから成る。
　ｐＭＨＥ１のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＶｈｇｈ中にクローニングし、Ｂ細胞発現ベクターｐＢＣＥ１を作製した。このベクター（図３６に描写）はユニークＸｈｏＩおよびＡｓｐ７１８クローニング部位を含有し、その中にアンチセンスＤＮＡ断片をクローニングすることができる。それらのアンチセンス配列の発現は、上流の重鎖プロモーター一エンハンサー組み合わせにより指令され、下流のｈＧＨ遺伝子配列はイントロン配列に加えてトランスジェン構成物の発現を促進するポリアデニル化配列を提供する。ｐＢＣＥ１から作製されたアンチセンストランスジェン構成物はＮｏｔＩでの消化によりベクター配列から分離することができる。
　（Ｂ．ＩｇＭアンチセンストランスジェン構成物）
　下記オリゴヌクレオチド：
　５’−ｃｇｃｇｇｔａｃｃｇａｇａｇｔｃａｇｔｃｃｔｔｃｃｃａａａｔｇｔｃ−３’
　５’−ｃｇｃｃｔｃｇａｇａｃａｇｃｔｇｇａａｔｇｇｇｃａｃａｔｇｃａｇａ−３’
を、基質としてマウス脾臓ｃＤＮＡを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスＩｇＭ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた０．３ｋｂのＰＣＲ産物をＡｓｐ７１８とＸｈｏＩで消化し、そしてＡｓｐ７１８／ＸｈｏＩで消化したｐＢＣＥ１中にクローニングしてアンチセンストランスジェン構成物ｐＭＡＳ１を作製した。ｐＭＡＳ１の精製済ＮｏｔＩ挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数の別のトランスジェン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスＩｇＭのｍＲＮＡとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってマウスＩｇＭタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。ｐＭＡＳ１とｐＨＣ１のようなヒト重鎖トランスジェン小遺伝子座とを含有する二重トランスジェニックマウス（両構成物の同時注入によるかまたは一重トランスジェニックマウスの交配により作製される）は、ヒト重鎖小遺伝子座のみについてトランスジェニックであるマウスよりも高い比率のＢ細胞上に、ヒトトランスジェンによってコードされるＩｇレセプターを発現するだろう。ヒト対マウスＩｇレセプター発現細胞の比は、一部はＢ細胞の分化と発展を促進する因子および細胞に対する２集団間の競争のためである。ＩｇレセプターはＢ細胞発達において重要な役割を果たすので、表面上に減少したレベルのＩｇＭを発現する（マウスＩｇ特異的アンチセンスダウンレギュレーションのため）マウスＩｇレセプター発現Ｂ細胞も、ヒトレセプターを発現する細胞も競争しないだろう。
　（Ｃ．Ｉｇκアンチセンストランスジェン構成物）
　次の２つのオリゴヌクレオチド：
　５’−ｃｇｃｇｇｔａｃｃｇｃｔｇａｔｇｃｔｇｃａｃｃａａｃｔｇｔａｔｃｃ−３’
　５’−ｃｇｃｃｔｃｇａｇｃｔａａｃａｃｔｃａｔｔｃｃｔｇｔｔｇａａｇｃｔ−３’
を、基質としてマウス脾臓ｃＤＮＡを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスＩｇκ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた０．３ｋｂのＰＣＲ産物をＡｓｐ７１８とＸｈｏＩで消化し、そしてＡｓｐ７１８／ＸｈｏＩで消化したｐＢＣＥ１中にクローニングしてアンチセンストランスジェン構成物ｐＫＡＳ１を作製した。ｐＭＡＳ１の精製済ＮｏｔＩ挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数の別のトランスジェン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスＩｇκ　ｍＲＮＡとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってｐＭＡＳ１について上述したのと同様にマウスＩｇκタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。
　（実施例１９）
　この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおける好結果の免疫化と免疫応答を証明する。
　（マウスの免疫化）
　１分子あたり４００以上のジニトロフェニル基と結合させたアオガイヘモシアニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（ＫＬＨ−ＤＮＰ）を以前発表された方法（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌ．ＨｕｄｓｏｎおよびＦ．Ｃ．Ｈａｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ出版，第９頁，１９８０年）に従ってミョウバン沈澱させた。ミョウバン沈澱させたＫＬＨ−ＤＮＰ　４００μｇを１００μｌのリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中の臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム１００μｇと一緒に各マウスに腹腔内注射した。６日後に眼窩後洞出血により血清試料を収集した。
　（血清中のヒト抗体反応性の分析）
　間接エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使って抗体の反応性および特異性を評価した。免疫原による抗体誘導を分析するために幾つかの標的抗原を試験した。タンパク質成分に対する反応性の同定にはアオガイヘモシアニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ハプテンおよび／または修飾アミノ基に対する反応性の同定にはウシ血清アルブミン、そして全免疫原に対する反応性の同定にはＫＬＨ−ＤＮＰを使用した。抗原へのヒト抗体結合は、マウス免疫グロブリンとの交差反応性を全く持たないＩｇＭおよびＩｇＧサブクラスに特異的な酵素接合体により検出した。簡単に言えば、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのタンパク質を３７℃にて一晩乾燥することによりマイクロタイタープレートを抗原コーティングした。ＰＢＳ、５％ニワトリ血清、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に希釈した血清試料をウエル中で室温にて１時間インキュベートし、次いで同希釈剤中の抗ヒトＩｇＧ　ＦｃおよびＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）−西洋ワサビペルオキシダーゼまたは抗ヒトＩｇＭ　Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベートした。室温で１時間後、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の添加により酵素活性を評価し、３０分後に４１５−４９０ｎｍで読み取った。
　（トランスジェニックマウス中の免疫応答におけるヒト重鎖の関与）
　図３７は、ＫＬＨ−ＤＮＰによる免疫化に対する３匹の同腹子マウスの応答を表す。第１２９６号のマウスは再配列されていないヒトＩｇＭおよびＩｇＧトランスジェンを有し、マウスＩｇ重鎖破壊について同型接合性であった。第１２９９号のマウスは無破壊の背景上にトランスジェンを有し、１３０１号のマウスはそれらの遺伝子組のいずれも遺伝しなかった。別の同腹子である第１２９７号のマウスはヒトトランスジェンを有し、マウス重鎖破壊に関して半接合性であった。それを非免疫化対照として実験に組み入れた。
　結果は、ヒトＩｇＧとＩｇＭ応答は両方ともタンパク質への接合という状況においてハプテンに対して発生したことを証明する。ヒトＩｇＭはＫＬＨに対しても発生したが、この時点では有意なレベルのヒトＩｇＧは存在しなかった。同じマウスからの免疫前血清試料では、同じ標的抗原に対するヒト抗体の力価は有意でなかった。
　（実施例２０）
　この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるヒト抗原による好結果の免疫化および免疫応答を証明し、そしてヒトトランスジェンの可変領域配列中に無作為でない体細胞変異が起こることを証明する。
　（ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖を含んで成る抗体応答の証明）
　この実験に使用するトランスジェニックマウスは、機能的内因性（マウス）重鎖生産の欠失をもたらすＪ領域のところへのトランスジェンの導入（前掲）により作製された機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座について同型接合性であった。該トランスジェニックマウスは、少なくとも１つの完全な再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジェン（ＨＣ１、前掲）も含み、該トランスジェンは単一の機能的ＶＨ遺伝子（ＶＨ２５１）、ヒトμ定常領域遺伝子、およびヒトγ１定常領域遺伝子を含んで成る。ヒト免疫グロブリントランスジェン産物を発現することが示されたトランスジェニックマウス（前掲）をヒト抗原による免疫化のため選択し、トランスジェニックマウスがヒト抗原免疫化に対して免疫応答を生じる能力を有することを証明した。ＨＣ１−２６系統のマウス３匹とＨＣ１−５７系統のマウス３匹（前掲）にヒト抗原を注射した。
　ミョウバン上に不溶化された精製済ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）１００μｇを不完全フロイントアジュバント中で０日目に注射し、次いで更に７，１４，２１および２８日目に不完全フロイントアジュバント中のミョウバン沈澱ＣＥＡを毎週注射した。ＣＥＡの注射前の各日に眼窩後方出血により血清試料を収集した。各グループ中の３匹のマウスの各々から同容量の血清を分析用にプールした。
　マイクロタイタープレート上に固定化したヒトＣＥＡに結合したヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。ヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンについてのＥＬＩＳＡアッセイの結果をそれぞれ図３８および３９に示す。７日目までは両系統について有意なヒトμ鎖Ｉｇ抗体価が検出され、約２１日目まで上昇が観察された。ヒトγ鎖Ｉｇについては、有意な抗体価は遅れ、前者がＨＣ１−５７系統で１４日目そして後者はＨＣ１−２６系統で２１日目に明らかになった。ヒトγ鎖Ｉｇの抗体価は、実験の間じゅう時間と共に増加を示し続けた。観察されたヒトμ鎖Ｉｇ応答は、平坦域に達した後、遅れて発生する上昇し続けるγ鎖応答と組み合わせると、親和性の成熟に伴って観察されるパターンに特徴的である。２１日目の試料の分析は、無関係の抗原であるアオガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する反応性の欠失を示した。これは、抗体応答が特異的な形でＣＥＡに対して向けられたことを指摘する。
　それらのデータは、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子座に関してトランスジェニックである動物が、（１）ヒト抗原（例えばヒト糖タンパク質、ＣＥＡ）に対して応答でき、（２）観察されたμからγへのクラススイッチにより例示されるようなイソタイプスイッチ（クラススイッチ）を受けることができ、そして（３）それらの体液性免疫応答における親和性の成熟の特徴を表すことを示す。一般に、それらのデータは、（１）ヒトＩｇトランスジェニックマウスが異種抗体を誘導する能力を有すること、（２）単一のトランスジェン重鎖可変領域が限定抗原に対して応答する能力を有すること、（３）一次および二次応答形成に典型的な時期に渡る応答速度論、（４）ＩｇＭからＩｇＧへの、トランスジェンによってコードされる体液性免疫応答のクラススイッチ、および（５）トランスジェニック動物がヒト抗原に対してヒト配列抗体を産生する能力を有することを指摘する。
　（ヒト重鎖トランスジェン小遺伝子座における体細胞変異の証明）
　ＨＣ１トランスジェンの多重コピーを含有するＨＣ１−５７系統のトランスジェニックマウスを免疫グロブリン重鎖欠失マウスと交配させ、ＨＣ１トランスジェンを含み且つ内因性マウス重鎖の両対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た（前掲）。それらのマウスは、マウスκおよびλ軽鎖と共にヒトμおよびγ１重鎖を発現する（前掲）。それらのマウスのうちの１匹を、１．５カ月の期間に渡る反復腹腔内注射により、ヒト癌胎児性抗原に対して高度免疫化した。このマウスを犠牲にし、脾臓、鼠径部および腸間膜のリンパ節、並びにパイヤー斑からリンパ系細胞を単離した。該細胞を合わせ、全ＲＮＡを単離した。該ＲＮＡから第一鎖ｃＤＮＡを合成し、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー：
　１４９　５’−ｃｔａｇｔｃｃｇａｇｔｃｃａａｇｇａｇｔｃｔｇｔｇｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇ（ｇ／ａ／ｔ／ｃ）−３’
　１５１　５’−ｇｇｃｇｃｔｃｇａｇｔｔｃｃａｃｇａｃａｃｃｇｔｃａｃｃｇｇｔｔｃ−３’
を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
　それらのプライマーはＶＨ２５１／γ１　ｃＤＮＡ配列を特異的に増幅する。増幅された配列をＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＮＮＯ３中にクローニングした。２３個のランダムクローンの挿入断片のＤＮＡ配列を図４０に示す；生殖細胞配列からの配列変異が指摘され、ドットは配列が生殖細胞と同じであることを示す。ＶＨ２５１トランスジェンの生殖細胞配列と該ｃＤＮＡ配列との比較は、クローンのうちの３個が完全に未変異であり、他の２３個は体細胞変異を含むことを明らかにした。３個の未変異配列のうちの１つは枠外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）ＶＤＪ連結に由来する。特定の位置において観察された体細胞変異は、ヒトリンパ球において観察されたものと同様な頻度で且つ同様な分布パターンで起こる〔Ｃａｉら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１０７３；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。体細胞変異の総体的頻度は約１％である；しかしながら、ＣＤＲ１内の頻度は約５％にまで及び、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸変化への選択を指摘する。これは、ヒト重鎖配列の抗原指令型親和性成熟を証明する。
　（実施例２１）
　この実施例は、組み換わると完全なヒト軽鎖小遺伝子座トランスジェンを形成する２つの別々のポリヌクレオチドを同時導入することによる、好結果のトランスジェンの形成を証明する。
　（２つの重複ＤＮＡ断片の同時注入による再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジェンの作製）
　（１．再配列されていない機能的Ｖκ遺伝子セグメントｖｋ６５．３，ｖｋ６５．５，ｖｋ６５．８およびｖｋ６５．１５の単離）
　Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴ−６５（５’−ａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃ−３’）を使って、ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。陽性ファージクローンからのＶκセグメントを含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。得られたクローンからの可変遺伝子断片を配列決定し、機能的であると思われるクローンを選択した。機能性を判断する基準は次のものを含む；転写解読枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列。この方法により単離された４つの異なるプラスミドクローンからの４つの機能的Ｖκ遺伝子セグメント（ｖｋ６５．３，ｖｋ６５．５，ｖｋ６５．８およびｖｋ６５．１５）のＤＮＡ配列を図４１〜４４に示す。４つのプラスミドクローンｐ６５．３ｆ，ｐ６５．５ｇ１，ｐ６５．８およびｐ６５．１５ｆ）を下記に説明する。（１ａ）Ｐ６５．３ｆ
　ファージクローンλ６５．３の３ｋｂ　ＸｂａＩ断片を、ベクター由来のＳａｌＩ部位が該挿入断片の３’末端に近位になり且つベクター由来のＢａｍＨＩ部位が該挿入断片の５’末端に近位になるようにｐＵＣ１９中にサブクローニングした。このクローンの３ｋｂ　ＢａｍＨＩ／ＳａＩＩ挿入断片をｐＧＰｌｆ中にサブクローニングしてｐ６５．３ｆを得た。（１ｂ）ｐ６５．５ｇ１
　ファージクローンλ６５．５の６．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片を、ベクター由来のＸｈｏＩ部位が該挿入断片の５’末端に近位になり且つベクター由来のＳａＩＩ部位が該挿入断片の３’末端に近位になるようにｐＧＰｌｆ中にサブクローニングした。得られたプラスミドをｐ６５．５ｇ１と命名した。（１ｃ）ｐ６５．８
　ファージクローンλ６５．８の６．５ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＳＰ７２中にクローニングしてｐ６５．８を得た。（１ｄ）ｐ６５．１５ｆ
　ファージクローンλ６５．１６の１０ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１８中にサブクローニングしてプラスミドｐ６５．１５．３を作製した。該プラスミド挿入断片中のＶκ遺伝子セグメントを４．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ小断片にマッピングし、これをｐＧＰｌｆ中にサブクローニングした。得られたクローンｐ６５．１５ｆは、挿入断片の５’および３’末端にそれぞれユニークＸｈｏＩ部位およびＳａｌＩ部位が置かれている。
　（２．ｐＫＶ４）
　ｐ６５．８のＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入断片をｐ６５．１５ｆのＸｈｏＩ部位中にクローニングしてプラスミドｐＫＶ２を作製した。ｐ６５．５ｇ１のＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入断片をｐＫＶ２のＸｈｏＩ部位中にクローニングしてｐＫＶ３を作製した。ｐＫＶ３のＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入断片をｐ６５．３ｆのＸｈｏＩ部位中にクローニングしてプラスミドｐＫＶ４を作製した。このプラスミドは、４つの機能的Ｖκ遺伝子セグメントを含む単一の２１ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入断片を含有する。ＮｏｔＩを使って挿入断片全体を切り出すことができる。
　（３．ｐＫＣ１Ｂ）
　（３ａ）ｐＫｃｏｒ
　ヒトゲノムＤＮＡファージλクローンに由来する２つのＸｈｏＩ断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。第一の断片である１３ｋｂのＪκ２−Ｊκ５／Ｃκ含有断片をクレノウ酵素で処理し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化されクレノウ処理されたプラスミドｐＧＰ１ｄ中にクローニングした。挿入断片の５’末端がベクター由来のＣｌａＩ部位に近いプラスミドクローン（ｐＫ−３１）を選択した。第二のＸｈｏＩ断片である、Ｊκ１を含有する７．４ｋｂのＤＮＡ断片を、３’挿入断片ＸｈｏＩ部位がベクターＳａＩＩ部位への連結により破壊されるように、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩで消化されたｐＳＰ７２中にクローニングした。得られたクローンｐ３６．２ｓは、Ｊκ１の４．５ｋｂ上流に挿入断片由来のＣｌａＩ部位、およびＪκ１とＪκ２の間に天然に存在するＸｈｏＩ部位の少し下流にポリリンカー由来のＣｌａＩ部位を含有する。このクローンをＣｌａＩで消化して４．７ｋｂ断片を遊離せしめ、該断片を正しい５’→３’方向において、ＣｌａＩで消化されたｐＫ−３１中にクローニングし、全部で５個のヒトＪκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、Ｃκ、４．５ｋｂの５’隣接配列を含有するプラスミドを作製した。このプラスミドｐＫｃｏｒは、挿入断片のそれぞれ５’および３’側にユニークな隣接ＸｈｏＩ部位およびＳａｌＩ部位を含有する。
　（３ｂ）ｐＫｃｏｒＢ
　ヒト３’κエンハンサーを含有する４ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片〔Ｊｕｄｄｅ，Ｊ．Ｇ．およびＭａｘ，Ｅ．Ｅ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ１，１２：５２０６（１９９２）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を、５’末端がベクターのＸｈｏＩ部位に近位になるようにｐＧＰｌｆ中にクローニングした。得られたプラスミドｐ２４ＢｆをＸｈｏＩで切断し、ｐＫｃｏｒの１７．７ｋｂ　ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ断片を該エンハンサー断片と同じ方向でその中にクローニングした。得られたプラスミドｐＫｃｏｒＢは、該挿入断片の５’および３’末端にそれぞれユニークＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位を含有する。
　（３ｃ）ｐＫＣ１Ｂ
　ｐＫｃｏｒＢのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入断片をｐ６５．３ｆのＳａｌＩ部位の中にクローニングして軽鎖小遺伝子座トランスジェンプラスミドｐＫＣ１Ｂを作製した。このプラスミドは、５個のＪκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、ヒトＣκ、およびヒト３’κエンハンサーを含有する。この２５ｋｂ挿入断片全体をＮｏｔＩ消化により単離することができる。
　（４．Ｃｏ４）
　プラスミドｐＫＶ４とｐＫＣ１Ｂからの２つのＮｏｔＩ挿入断片を各々２．５μｇ／ｍｌの濃度でマイクロインジェクション緩衝液中に混合し、そして上記実施例に記載のようにして半日マウス胚の前核中に同時注入した。生成したトランスジェン動物は、２断片が一緒に組み込まれたトランスジェン挿入断片（Ｃｏ４と命名、図４５に示した組換えの生成物）を含有する。ｐＫＶ４挿入断片の３’の３ｋｂとｐＫＣ１Ｂ挿入断片の５’の３ｋｂは全く同じである。幾つかの組み込み現象は３ｋｂの共通配列に渡って２断片の間で相同組換えが起こったことを表す。Ｃｏ４は遺伝子座はトランスジェニックマウス中のヒト配列軽鎖のレパートリーの発現を指令するだろう。
　本発明の好ましい態様の今までの記載は、例示および説明のために与えられる。それらは排他的であるつもりはなく、また本発明を正確な開示形態に制限するつもりはない。上記教示に照らして多数の改良および変更が可能である。
　本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたかのように、参考として本明細書中に組み込まれる。
　本発明を理解の明確化の目的で例示によって幾分詳細に記載してきたが、請求の範囲内で幾つかの変更および改良を行えることは明らかであろう。
図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４を表す。 図２はヒトλ鎖遺伝子座を表す。 図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。 図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。 図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５ｋｂ断片に次いでラット鎖３’エンハンサー配列を含む７００ｂｐ断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝子を含有するトランスジェン構成物を表す。 図６は、生体内相同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるために使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。 図７はｐＧＰ１の作製を示す。 図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカーの構成を示す。 図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。 図１０はｐＨＩＧ１およびｐＣＯＮ１の作製を示す。 図１１は、ｐＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３’）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。 図１２はｐＨＩＧ３’およびｐＣＯＮの作製を示す。 図１３は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。 図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。 図１５は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ遺伝子セグメントを包含する断片を示す。 図１６はｐＥμの構造を示す。 図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図１８Ａ〜１８Ｄは、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図１９Ａ〜１９Ｃは、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図１９Ａ〜１９Ｃは、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図１９Ａ〜１９Ｃは、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図２０ａ〜ｅはκ鎖標的用ベクターの構造を示す。 図２１ａ〜ｆはマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。 図２１ａ〜ｆはマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。 図２２はベクターｐＧＰｅの地図を示す。 図２３はベクターｐＪＭ２の構造を示す。 図２４はベクターｐＣＯＲｌの構造を示す。 図２５はｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す。 図２６はｐγｅ２の構造を示す。 図２７はｐＶＧＥ１の構造を示す。 図２８はｐＨＣ１トランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。 図２９はｐＪＣＫ１の構造を示す。 図３０は合成重鎖可変領域の作製を示す。 図３１は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＣＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。 図３２は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１，ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。 図３３は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。 図３４は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。 図３５は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。 図３６はプラスミドｐＢＣＥ１の略図である。 図３７は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（３７Ａ）、ＫＬＨ（３７Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（３７Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。 図３８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。 図３９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。 図４０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは小文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは小文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは小文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは小文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは小文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは小文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４１は、ヒストグラム形式での図４０のデータを示す；推定アミノ酸残基位置が縦座標として示され（左がアミノ末端方向であり、右がカルボキシ末端方向である）そして配列変異の頻度が横座標として示される。 図４２は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．３と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と総換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。 図４３は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。 図４４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。 図４５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。

Claims (23)

  1. 　ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質のヒト可変（Ｖ）領域、連結（Ｊ）領域、および定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む、免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖トランスジェン構成物であって、これらの配列は、転写調節配列に作用可能に連結されており、そして非ヒトトランスジェニック動物に組み込まれた場合に、生体内で遺伝子再配列を受けて、ヒト軽鎖ポリペプチドをコードする再配列された遺伝子を産生し得、ここでこの構成物は、以下：機能的な可変ＶＫ遺伝子セグメント、機能的な連結ＪＫ領域遺伝子セグメント、ならびに少なくとも１つの機能的な定常ＣＫ領域遺伝子セグメントおよびヒト３’Ｋエンハンサーのうちの少なくとも１つを含む、免疫グロブリン（Ｉｇ）軽鎖トランスジェン構成物。
  2. 　４ｋｂ　ＢａｍＨＩヒトゲノム軽鎖断片上に存在するヒト３’κエンハンサーをさらに含む、請求項１に記載のＩｇ軽鎖トランスジェン構成物。
  3. 　５つすべてのヒトＪκ領域断片が存在する、請求項１または２のいずれかに記載のＩｇ軽鎖トランスジェン構成物。
  4. 　１つのヒトκ定常領域エクソンが存在する、請求項１〜３のいずれかに記載のＩｇ軽鎖トランスジェン構成物。
  5. 　ヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載のＩｇ軽鎖トランスジェン構成物。
  6. 　マウス重鎖イントロンエンハンサーをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載のＩｇ軽鎖トランスジェン構成物。
  7. 　共に連結したマウスおよびヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載のＩｇ軽鎖トランスジェン構成物。
  8. 　請求項１〜７のいずれかに記載のＩｇ軽鎖トランスジェン構成物であって、前記ＤＮＡ配列は、前記Ｖセグメントと前記Ｊセグメントとの間に散在された適切な組換えシグナル配列を有し、そしてＶ、Ｊの再配列された可変領域と定常領域遺伝子セグメントとを連結するための適切なＲＮＡスプライシングシグナルを含む、Ｉｇ軽鎖トランスジェン構成物。
  9. 　請求項１〜８のいずれかに記載のトランスジェンを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、適切には齧歯類動物であって、好ましくは、ここで該トランスジェンは、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物のＢ細胞において発現され、および／またはここで、該トランスジェンは、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の生殖細胞中にあり、および／またはここで該トランスジェンは、再配列されているかもしくは再配列されていない、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  10. 　再配列されているかまたは再配列されていないＩｇ重鎖トランスジェン構成物をさらに含む、請求項９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  11. 　請求項１０に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、ここで該トランスジェンは、次の式：
    （ＶＨ）ｘ−（Ｄ）ｙ−（ＪＨ）ｚ−（ＳＤ）ｍ−（Ｃ１）ｎ−［（Ｔ）−（ＳＡ）ｐ−（Ｃ２）］ｑ
    （上式中、
    ｘ、ｙ、ｚ、ｍ、ｎ、ｐおよびｑは整数であり、必要に応じてＳＤセグメントはγ１スイッチ配列であり、そしてｘは２〜１００、ｎは１〜１０、ｙは２〜５０、ｐは１〜１０、ｚは１〜５０、ｑは１〜５０、そしてｍは０〜１０である）のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドの少なくとも１つの組み込まれたコピーを含有するトランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞において発現され；必要に応じて、ここでｍは少なくとも１であり、ｎは少なくとも１であり、そして該ポリヌクレオチドは、生殖細胞スイッチ配列のすぐ上流にある少なくとも約５０塩基対のセグメントを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  12. 　請求項９〜１１のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、ここで該哺乳動物は、抗原での免疫後に抗体応答をし、ここで好ましくは該抗原は、ヒト抗原、適切にはＣＥＡ、ＫＬＨまたはヒト血液細胞抗原であり、および／または該抗体応答は、ヒトμ鎖含有免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンを含む抗体集団を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
  13. 　請求項９〜１２のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物であって、該動物は検出可能な異種抗体を含む血清を有し、かつ、少なくとも１つの抑制された内因性免疫グロブリン遺伝子座を有し、ここで適切には、抑制はアンチセンスポリヌクレオチドによって産生され、ここで該アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、組み込まれたアンチセンストランスジェンから転写され、そして好ましくは、該アンチセンスポリヌクレオチドは、内因性κ鎖免疫グロブリン遺伝子配列に対して相同なヌクレオチド配列を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
  14. 　ヒト抗体配列を発現する複数のＢ細胞を産生するための方法であって、該方法は以下：
    　請求項９〜１３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する工程；および
    　該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫して、異種抗体の集団を産生するＢ細胞を産生する工程
    を包含し、該方法は必要に応じて、異種抗体の集団を産生する該Ｂ細胞を収集する工程をさらに包含する、方法。
  15. 　ハイブリドーマを産生する方法であって、該方法は、請求項１４に記載の方法を包含し、さらに、異種抗体の集団を産生する前記Ｂ細胞を不死化細胞と融合して、ハイブリドーマを形成する工程を包含する、方法。
  16. 　ヒト配列抗体を分泌する抗原特異的ハイブリドーマを産生する方法であって、該方法は以下：
    　予め決定された抗原で、請求項９〜１３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫する工程；
    　該トランスジェニック非ヒト哺乳動物由来のリンパ球を不死化細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する工程；および
    　該ハイブリドーマ細胞によって産生された抗体の、該予め決定された抗原への結合を決定する工程
    を包含する、方法。
  17. 　予め決定された抗原に結合するヒト配列抗体を産生する方法であって、該方法は、以下の工程：
    　予め決定された抗原で、請求項９〜１３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫する工程；
    　請求項１４に記載の方法を使用してハイブリドーマを産生する工程、および
    　抗原と反応性の抗体の存在について、形成されたハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程
    を包含し、ここで適切には、抗原と反応性の該抗体は、培養物中において該ハイブリドーマから分泌され、そして好ましくはヒト抗体である、方法。
  18. 　再配列された免疫グロブリン配列を産生する方法であって、該方法は以下：
    　請求項９〜１３のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する工程；
    　該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から、再配列された免疫グロブリン配列を得る工程
    を包含し、適切には、該得る工程は、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物から、該再配列された免疫グロブリン配列を含有するＢ細胞リンパ球を収集する工程を包含する、
    方法。
  19. 　請求項１８に記載の方法であって、前記得る工程は、ｃＤＮＡを産生するためにＢ細胞リンパ球からｍＲＮＡを単離する工程および該ｍＲＮＡを増幅する工程を包含し、必要に応じて、該方法はさらに、ｃＤＮＡから重鎖および軽鎖の可変領域配列を単離する工程および該配列を増幅する工程を包含し、必要に応じて、該配列をベクターに導入する工程を包含する、方法。
  20. 　請求項１９に記載の軽鎖可変領域配列および必要に応じて重鎖可変領域配列をコードする単離された核酸、または該核酸を含むベクターであって、適切には該ベクターは発現ベクターである、核酸。
  21. 　請求項２０に記載の核酸を含む宿主細胞、または該細胞の子孫であって、適切には該宿主細胞はＢ細胞またはＢ細胞由来の細胞である、細胞。
  22. 　再配列された免疫グロブリン配列を産生する方法であって、該方法はさらに以下：
    　請求項２１に記載の宿主細胞を、前記核酸が発現されるような条件下で培養する工程；および
    　培養された該宿主細胞またはその培養培地から、該核酸を回収する工程
    を包含し、適切には該配列は、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法を通して得られる、方法。
  23. 　トランスジェニック非ヒトＢ細胞を含むハイブリドーマであって、該トランスジェニック非ヒトＢ細胞は、該Ｂ細胞を不死化し得る第二の細胞と融合されており、ここで該ハイブリドーマは、該非ヒト動物に対して異種であるモノクローナル抗体を産生し、好ましくは、該モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であり、適切には該モノクローナル抗体は、少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和性でヒト抗原に結合する、ハイブリドーマ。
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