CZ20021035A3 - Prevence a léčba nemocí souvisejících s poruchami krevní sráľlivosti - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Zvíře transplantované buňkami nesoucími gen pro lidský tkáňový faktor je modelem pro hyperkoagulační stav. Tento model je užitečný pro výzkum a vývoj terapeutických látek pro léčbu nemocí vyznačujících se přetrvávajícím hyperkoagulačním stavem.

CZ 2002 -1035 A3 • · · ·

Prevence a léčba nemocí souvisejících s poruchami krevní srážlivosti

Oblast techniky • · · · ·· ·· • « · · · · · · · · · · · · · • · · · · · · ·· ·· · · ····

4»11

7/j

Předkládaný vynález se týká metody přípravy zvířecího modelu, který se vyznačuje přetrvávajícím hyperkoagulačním stavem; preventivních anebo léčebných přípravků pro léčbu nemocí, vyznačujících se hyperkoagulačním stavem; preventivních anebo léčebných přípravků pro léčbu hyperkoagulačních stavů vzniklých na podkladě infekce; preventivních anebo léčebných přípravků určených k léčbě žilních nebo tepenných trombóz; a preventivních anebo léčebných přípravků pro léčbu nemocí vzniklých na podkladě hypertrofie médie cév.

Dosavadní stav techniky*

Srážení krve je reakce, kde dochází k postupné aktivaci prekurzorů serinových proteáz pomocí aktivovaných proteáz, a v konečném kroku dochází k tvorbě thrombinu, kteiý vede k tvorbě fibrinu. Trombóza vzniká jako následek přehnané koagulační reakce, způsobené změnou vplasmatické koagulaci a fibrinolytickém systému, ve funkci krevních destiček, leukocytů a cévních endoteliálních buněk, které souvisejí s progresí daného onemocnění. Počátečním faktorem krevní koagulace je tkáňový faktor. V případě akutních koronárních syndromů, jako například infarkt myokardu anebo nestabilní angína, dochází k iniciaci krevního srážení poté, co se z rozpadlých aterosklerotických plaků, přítomných v cévách postižených aterosklerózou, uvolní do krve nahromaděný tkáňový faktor.

U syndromu disseminované intravaskulámí koagulace, který je spojen se sepsí a maligními nádory, exprimují aktivované monocyty a makrofágy anebo nádorové buňky tkáňový faktor, což vede k zvýšené krevní koagulaci. Jakmile se tkáňový faktor dostane do kontaktu s krví, rychle dochází ke koagulační reakci a k tvorbě krevních sraženin. Tudíž pro prevenci tvorby trombů je nevyhnutné blokovat reakce krevního srážení, které můžou být iniciovány v jakoukoliv dobu anebo se rovněž můžou vyskytovat permanentně. Z těchto důvodů je pro vývoj efektivních antitrombotických látek nevyhnutný experimentální model, který se vyznačuje konstantním hyperkoagulačním stavem. Všechny dosavadní modely trombotického stavu se vyznačují tím, že je trombus vytvořen za velmi krátkou dobu.

Podle jednoho z hledisek předkládaného vynálezu, je nárokovaný experimentální model unikátní tím, že se vyznačuje přetrvávajícím hyperkoagulačním stavem, založeným na trvalém kontaktu lidského tkáňového faktoru s krví.

·· ···· ·· ·· ·· ·· • · · _· · · ·«·· ··· «···· ·· » • ·· · · · · · · · · • · · · ·· ·· ·· ····

Srážení krve je reakce, kde dochází k postupné aktivaci prekurzorů serinových proteáz pomocí aktivovaných proteáz, a v konečném kroku dochází k tvorbě thrombinu, který vede k tvorbě fibrinu. Trombóza vzniká jako následek přehnané koagulační reakce, způsobené změnou vplasmatické koagulaci a fibrinolytickém systému, ve funkci krevních destiček, leukocytů a cévních endoteliálních buněk, které souvisejí s progresí daného onemocnění. Počátečním faktorem krevní koagulace je tkáňový faktor (TF).

U akutních koronárních syndromů, jakými jsou akutní infarkt myokardu a nestabilní angína, je proces koagulace vyvolán uvolněním TF z rozpadajících se plaků, které se tvoří progresí aterosklerózy a obsahují velké množství tkáňového faktoru.

U syndromu disseminované intravaskulámí koagulace, který je spojen se sepsí a maligními nádory, exprimují aktivované monocyty a makrofágy anebo nádorové buňky tkáňový faktor, což vede k zvýšené krevní koagulaci. Jakmile se TF dostane do kontaktu s krví, rychle dochází ke koagulační reakci a k tvorbě krevních sraženin. Tudíž pro prevenci tvorby trombů je nevyhnutné blokovat reakce krevního srážení, které můžou být iniciovány v jakoukoliv dobu anebo se rovněž můžou vyskytovat permanentně. Proto je potřeba připravit efektivní antitrombotické léčivo, které je schopné blokovat trvalý hyperkoagulační stav.

Vzhledem k druhému hledisku předkládaného vynálezu, je navržena nová preventivní anebo léčebná účinná látka, vhodná k léčbě nemocí, vyznačujících se přetrvávajícím hyperkoagulačním stavem.

Těžké infekce jsou často spojeny s hyperkoagulačním stavem, který může způsobit multiorgánové selhání anebo disseminovanou intravaskulámí koagulaci, a jsou faktorem, který významně zhoršuje prognózu pacienta. V případě těžkých infekcí a systémových infekcí, jakými jsou například sepse, bylo zjištěno, že vyvolávajícím momentem orgánového selhání jsou léze cévních endoteliálních buněk. V případě sepsí, způsobených gram-negativními bakteriemi, hraje důležitou úlohu buněčný komponent bakteriální stěny, lipopolysacharid (LPS).

LPS uvolněný do krevního oběhu nejenom že aktivuje monocyty, čímž dochází k tvorbě tkáňového faktoru (TF), vedoucímu k hyperkoagulačnímu stavu, ale rovněž vyvolává uvolňování cytokinů, jako například TNF, IL-Ιβ, a IL-8. Tyto cytokiny aktivují neutrofily a vaskulámí endoteliální buňky. Aktivované neutrofily adherují na vaskulámí endoteliální buňky a uvolňují toxické substance, jakými jsou aktivní enzymy a elastázy, které poškozují endoteliální buňky. Ve vaskulámích endoteliálních buňkách, aktivovaných cytokiny anebo poškozených neutrofily, dochází ke zvýšené tvorbě TF, který dále zhoršuje hyperkoagulační · 9 9

9 99 stav. Výsledkem je, že se systémově objevují mikrotromby, které způsoují selhání mikrocirkulace, což vede k multiorgánovému selhání.

Tudíž je velká potřeba vývoje preventivní anebo léčebné účinné látky, vhodné k léčbě koagulačních stavů způsobených infekcí.

Vzhledem k třetímu hledisku předkládaného vynálezu, je navržena nová preventivní anebo léčebná účinná látka vhodná k ovlivnění koagulačních stavů způsobených infekcí.

Důležitou roli ve vývoji žilní trombózy hrají zpomalení žilní cirkulace, poškození cévní stěny a zvýšená tendence ke krevní srážlivosti. Konkrétně, invazivní chirurgické výkony, porod a trauma způsobují fyzikální poškození cévní stěny a abnormality vkoagulačním a fibrinolytickém systému. Dekubity po chirurgických zákrocích způsobují zpomalení krevní cirkulace. Nejenom, že v cévách vznikající krevní sraženiny způsobují selhání cirkulace v končetinách, ale krevní sraženiny samotné se uvolňují do krevního oběhu a dostávají se do plicní tepny, čímž dochází ke smrtelné plicní embolizaci. Tudíž prevence embolizmu je považována za mimořádně důležitou. Z toho plyne, že je potřeba připravit účinné látky, které jsou schopny účinně bránit anebo léčit žilní trobmózu.

Vzhledem ke čtvrtému hledisku předkládaného vynálezu, je navržena nová preventivní anebo léčebná účinná látka vhodná k léčbě žilní trombózy.

V případě tepenné trombózy se krevní sraženiny vyskytují v krevních cévách postižených rozsáhlou aterosklerózou. Propuknutí tepenné trombózy v důležitých orgánech, jakými jsou mozek anebo srdce ve většině případů konči fatálně. Konkrétně, akutní koronární syndromy, jako například nestabilní angína anebo akutní infarkt myokardu jsou považovány za nebezpečné stavy, které jsou často příčinou syndromu náhlé smrti. Zcela nedávno bylo zjištěno, že rozpad aterosklerotických plátů a nasedající trombus jsou důležitými faktory v mechanismu vzniku nemoci.

Rovněž bylo zjištěno, že se tkáňový faktor (TF), který je spouštěcím faktorem tvorby trombu, nachází na povrchu a vintersticiu aterosklerotických plátů. Předpokládá se, že exposice tkáňového faktoru (TF) z rozpadajícícho se plátu krevnímu oběhu je hlavní příčinou arterielní trombózy.

Z toho plyne, že je potřeba připravit novou účinnou látku, která je schopná účinně bránit anebo léčit arterielní trobmózu.

Vzhledem k pátému hledisku předkládaného vynálezu, je navržena nová preventivní anebo léčebná účinná látka vhodná k léčbě arterielní trombózy.

Perkutánní transluminální koronární angioplastika (PTCA) zaujímá přední místo v léčbě koronárních onemocnění. Nicméně restenózy, které se vyskytují několik měsíců po • 44 4« 44 44 44

44 444 4444

444 44444 «4 4

444 »4 444 4 4

444 4 4 4 4 444

444 44 4· ·· 4· 4444 operaci, snižují efektivitu této léčebné metody a jsou tudíž značným problémem. Za příčinu restenózy je považován trombus, který je tvořen v akutní a subakutní fáze poškození endoteliálních buněk. Kontakt krve s tkáňovým faktorem, produkovaným poškozenými endoteliálními buňkami, buňkami hladké svaloviny cév a fibroblasty v subendoteliální tkáni, je považován za příčinu tvorby trombu. Buňky cévní stěny rostou a snaží se překrýt trombus, což má za následek zužování průsvitu cévy. Růst tkáně cévní stěny per se a zúžení průměru cévy rovněž přispívají k zužování průsvitu cévy, čímž představují přímý faktor restenózy.

Z toho plyne, že je potřeba připravit novou účinnou látku, která je schopná účinně bránit anebo léčit restenózy.

Vzhledem k pátému hledisku předkládaného vynálezu, je navržena nová preventivní anebo léčebná účinná látka vhodná k léčbě nemocí způsobených hypertrofií médie krevních cév.

Podstata vynálezu

Po intenzivním a náročném výzkumu zaměřeném na vyřešení výše nastíněného problému, bylo zjištěno, že experimentální zvíře, kterému byl implantován štěp buněk geneticky upravených vnesením genu pro lidský tkáňový faktor (TF) a schopných konstantně produkovat vysokou hladinu lidského tkáňového faktor (TF), je charakteristické přetrvávajícím hyperkoagulačním stavem, tudíž zcela splňuje nároky předkládaného vynálezu. Podle prvního z hledisek předkládaného vynálezu, uvádí předkládaný vynález experimentální zvíře, kterému byl implantován štěp geneticky upravených buněk, tak, že jim byl vložen gen pro lidský tkáňový faktor (TF) anebo pro jeho část. Gen pro lidský tkáňový faktor je exprimován. Uvedený zvířecí model se vyznačuje přetrvávajícím hyperkoagulačním stavem.

Část výše uvedeného lidského tkáňového faktoru je ku příkladu část molekuly, která nemá intracelulární část. Výše uvedené buňky štěpu jsou s výhodou savčí buňky, s výhodou buňky lidského myelomu. Výše uvedené experimentální zvíře je s výhodou myš. Hyperkoagulační stav je definován alespoň jedním z uvedených fenoménů: zvýšení plasmatické koncentrace lidského tkáňového faktoru, snížení počtu krevních destiček, snížení hladiny fibrinogenu, zvýšení koncentrace solubilních komplexů fibrin-monomerů a zvýšení koncentrace komplexů thrombin-antithrombin III.

Předkládaný vynález rovněž představuje metodu přípravy výše uvedeného zvířete, do kterého jsou implantovány buňky, geneticky upravené tak, že nesou gen pro lidský tkáňový • · • · « · • · • ft · · · · faktor, anebo jeho část, a tento gen je exprimován. Takto upravené buňky jsou vloženy jako štěp do zvířete, které se následně vyznačuje trvalým hyperkoagulačním stavem.

Předkládaný vynález rovněž představuje metodu pro hledání antitrombotických látek pomocí uvedeného experimentálního zvířecího modelu.

Na základě intenzivního a náročného výzkumu zaměřeného na vyřešení výše uvedeného problému bylo zjištěno, že protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru (antihuman TF antibody), je schopna zabránit přetrvávání hyperkoagulačního stavu.

Vzhledem k druhému hledisku předkládaného vynálezu, předkládaný vynález představuje preventivní anebo léčebnou účinnou látku, kterou je protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru.

Výše uvedená protilátka je například polyklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je monoklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je rekombinantní protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je modifikovaná protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je chimemí anebo humanizovaná protilátka. Výše uvedená humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2. Výše uvedená protilátka je ku příkladu modifikovaná protilátka. Výše uvedená modifikace protilátky zahrnuje například fragment protilátky Fab, F(ab')₂,Fv anebo jeden řetězec Fv (scFv).

Na základě intenzivního a náročného výzkumu zaměřeného na vyřešení výše uvedeného třetího problému bylo zjištěno, že protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru (anti-human TF antibody) je schopná zabránit anebo léčit hyperkoagulační stav, který je následkem infekce.

Tudíž, podle čtvrtého hlediska předkládaného vynálezu, předkládaný vynález představuje preventivní anebo léčebnou účinnou látku pro léčbu žilní trombózy. Zmíněnou léčebnou látkou je protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru.

Výše uvedená protilátka je například polyklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je monoklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je rekombinantní protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je modifikovaná protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je chimemí anebo humanizovaná protilátka. Výše uvedená humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2. Výše uvedená protilátka je ku příkladu modifikovaná protilátka. Výše uvedená modifikace protilátky zahrnuje například fragment protilátky Fab, F(ab')₂, Fv anebo jeden řetězec Fv (scFv).

Na základě intenzivního a náročného výzkumu zaměřeného na vyřešení výše uvedeného pátého problému bylo zjištěno, že protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru (anti-human TF antibody) je schopná zabránit anebo léčit arterielní trombózu.

·· ···· ·· ·· ·· ·· «4 «_«·· · · · «

Tudíž, podle pátého hlediska předkládaného vynálezu, předkládaný vynález představuje preventivní anebo léčebnou účinnou látku pro léčbu arterielní trombózy. Zmíněnou léčebnou látkou je protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru.

Výše uvedená protilátka je například polyklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je monoklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je rekombinantní protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je modifikovaná protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je chimemí anebo humanizovaná protilátka. Výše uvedená humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2. Výše uvedená protilátka je ku příkladu modifikovaná protilátka. Výše uvedená modifikace protilátky zahrnuje například fragment protilátky Fab, F(ab')2,Fv anebo jeden řetězec Fv (scFv).

Na základě intenzivního a náročného výzkumu zaměřeného na vyřešení výše uvedeného šestého problému bylo zjištěno, že protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru (anti-human TF antibody) je schopná zabránit anebo léčit nemoci způsobené hypertrofií cévní médie.

Tudíž, podle šestého hlediska předkládaného vynálezu, předkládaný vynález představuje preventivní anebo léčebnou účinnou látku pro léčbu hypertrofie cévní médie. Zmíněnou léčebnou látkou je protilátka proti lidskému tkáňovému faktoru.

Výše uvedená protilátka je například polyklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je moňoklonální protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je rekombinantní protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je modifikovaná protilátka. S výhodou, výše uvedená protilátka je chimemí anebo humanizovaná protilátka. Výše uvedená humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2. Výše uvedená protilátka je ku příkladu modifikovaná protilátka. Výše uvedená modifikace protilátky zahrnuje například fragment protilátky Fab, F(ab')2, Fv anebo jeden řetězec Fv (scFv).

Vysvětlení k obrázkům

Obrázek 1 znázorňuje graf, který srovnává antigen-vazebnou aktivitu chimérické protilátky složené z H řetězce a L řetězce; protilátky složené zb humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; a protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b2 humanizované verze L řetězce.

Obrázek 2 znázorňuje graf, který srovnává aktivitu protilátek inaktivujících lidský TF (aktivita TF potřebná pro inhibici tvorby faktoru Xa), skládajících se z chimérické protilátky • · • ·· · • · «7 · · · ····· · · · / ·· ········«· • · · · ···· ··· • · · · ·· · · · · ···· složené z H řetězce a L řetězce; protilátky složené z b humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; a protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b2 humanizované verze L řetězce.

Obrázek 3 znázorňuje graf, který srovnává aktivitu protilátek inaktivujících lidský TF (aktivita TF potřebná pro inhibici tvorby faktoru X), skládajících se z chimérické protilátky složené z H řetězce a L řetězce; protilátky složené z b humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; a protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b2 humanizované verze L řetězce.

Obrázek 4 znázorňuje graf, který srovnává aktivitu protilátek inaktivujících lidský TF (aktivita TF potřebná pro inhibici plasmatické koagulace), skládajících se z chimérické protilátky složené z H řetězce a L řetězce; protilátky složené zb humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b humanizované verze L řetězce; a protilátky složené z i humanizované verze H řetězce a b2 humanizované verze L řetězce.

Obrázek 5 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn velikosti nádoru po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor (tečkovaná čára), a po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých uvedený gen nebyl vnesen (plná čára).

Obrázek 6 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn plasmatické koncentrace lidského tkáňového faktoru po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor (tečkovaná čára), a po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých uvedený gen nebyl vnesen (plná čára).

Obrázek 7 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn počtu krevních destiček po osídlení myši nádorovými buňkami, do kteiých byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor (tečkovaná čára), a po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých uvedený gen nebyl vnesen (plná čára).

Obrázek 8 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn plasmatické koncentrace fibrinogenu po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor (tečkovaná čára), a po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých uvedený gen nebyl vnesen (plná čára). Uvedené hodnoty jsou relativní, vztažené na hodnotu fibrinogenu u kontrolní myši (normál), která nebyla osídlena nádorovými buňkami, a kde hodnota fibrinogenu je 100 %.

0 9009 09 90 00 • · · _ 0 9 0 0 • 0 9 00000 00 0 • · 909 00 000 9 0 • · · · 0000 900 • · · ♦ 9 · 09 09 9099

Obrázek 9 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn plasmatické koncentrace solubilních komplexů fibrin - monomerů (sFMC) po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor (tečkovaná čára), a po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých uvedený gen nebyl vnesen (plná čára).

Obrázek 10 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn plasmatické koncentrace komplexu thrombin-antithrombin III (TAT) po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor (tečkovaná čára), a po osídlení myši nádorovými buňkami, do kterých uvedený gen nebyl vnesen (plná čára).

Obrázek 11 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn počtu krevních destiček u myši po podání protilátky proti lidskému TF v koncentraci 1 mg/kg jednou týdně po dobu 3 týdnů ode dne 45 po osídlení buňkami, kterým byl vnesen gen pro lidský TF.

Obrázek 12 znázorňuje graf, kteiý představuje plasmatickou koncentraci solubilních komplexů fibrin-monomerů (sFMC) v den 6 po posledním podání protilátky proti lidskému TF u myši po podávání protilátky proti lidskému TF v koncentraci 1 mg/kg jednou týdně po dobu 3 týdnů ode dne 45 po osídlení buňkami, kterým byl vnesen gen pro lidský TF.

Obrázek 13 znázorňuje graf, který představuje plasmatickou koncentraci komplexů thrombin-antithrombin ΙΠ (TAT) v den 6 po posledním podání protilátky proti lidskému TF u myši po podávání protilátky proti lidskému TF v koncentraci 1 mg/kg jednou týdně po dobu 3 týdnů ode dne 45 po osídlení buňkami, kterým byl vnesen gen pro lidský TF.

Obrázek 14 znázorňuje graf, který představuje časový průběh změn počtu krevních destiček u myši, nesoucí buňky s vloženým genem pro lidský TF, které byla protilátka proti lidskému TF podána v koncentraci 1 mg/kg v den 49 a anebo které byl kontinuálně po dobu 24 hodin osmotickou pumpou podáván nízkomolekulámí heparin v koncentraci 601,5 IU/kg, 1900,3 IU/kg anebo 6487,3 IU/kg.

Gen pro lidský tkáňový faktor (TF) pro použití v prvním aspektu předkládaného vynálezu byl již klonován a nukleotidová a aminokyselinová sekvence je známá (H.Morrissey et al., Cell, 1987, 50: 129-135). Plnodélková nukleotidová a aminokyselinová sekvence genu pro bdský tkáňový faktor je přístupná v SEQ databáze pod přístupovým kódem 103 a 104. Vzhledem k předkládanému vynálezu, je možné použít gen kódující bdský TF, který byl upraven tak, že z něj byla odstraněna sekvence kódující intracytoplasmatickou část, a anebo je možné použít část genu kódujícího lidský TF tak, že jeho produkt si zachovává schopnost inicializace kaskády krevního srážení.

Co se týče vektoru pro vnesení genu do savčích buněk a pro následnou expresi klonovaného genu, je možné použít jakýkoli savčí expresní vektor, jakými jsou například

4444 4« ·· 44 44

4 · _ · » · 44«

9·· 4 4444· 44 • · 444 44 444 4 4

4444 4 4 · 4 444 ·· ·· 44 · 4 · · 444 pCOSl, pSV2-neo, pMAM-neo a pSG5. V souladu s předkládaným vynálezem, dochází k expresi konstruktu složeného z promotoru, genu pro lidský tkáňový faktor a póly-A signál, umístěný 3' od genu. Co se týče promotoru/enhanceru, jsou vhodné virové promotory jako například časný promotor/enhancer viru lidské cytomegalové infekce, adenovirový promotor a promotoru z SV40 viru a promotory/enhaneery odvozené od savčích buněk, jako například lidský elongační faktor la (HEF la). Co se týče počátků replikace expresních vektorů, je možné použít počátky replikace odvozené od SV40 viru, polyoma viru, adenoviru a podobných. Dále, expresní vektory obsahují selektovatelné markéry, jako například gen pro fosfotransferázu APH (3') Π anebo I (neo), gen pro tymidinkinázu, gen pro dihydrofoíátreduktázu (DHFR) a podobně.

Co se týče metody vnášení genu do buňky, je možné použít elektroporaci, kalciumfosfátovou metodu, lipofekci a podobně. Co se týče buněk, do kterých je vnášen vektor, je možné použít jakékoliv buňky, které mají schopnost usídlit se v savčím organismu. Pro tyto účely je možné použít různé tkáňové kultury, zahrnující různé savčí buňky a lidské buňky, buňky pocházející z myši, krysy, křečka a opice, přičemž nádorové buňky jsou nejvhodnější. Specifickými příklady jsou lidská myelomová linie KPMM2 a ARH-77, myší leukemická Unie P815, P388 aL1210.

Experimentálními zvířaty vhodnými k použití v předkládaném vynálezu jsou savci s výjimkou člověka, a s výhodou jsou to malá laboratorní zvířata, jako například myší, krysy a křečci, přičemž myš je nejvhodnější.

V souladu s druhým aspektem předkládaného vynálezu, hyperkoagulační stav znamená fyzikální stav navozený Udským TF, kteiý se manifestuje sníženým počtem krevních destiček a sníženou hladinou fibrinogenu, zvýšenou hladinou solubilních komplexů fibrin-monomerů (sFMC) a komplexu thrombin-antithrombin III (TAT).

AčkoUv protilátka použitá v předkládaném vynálezu je buď polyklonální anebo monoklonální, s preventivním anebo terapeutickým efektem na perzistenci hyperkoagulace způsobené lidským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonální. Je možné rovněž použít chimérické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmentu a jiné monoklonální protilátky, ovšem preferovaným typem protilátky je humanizovaná protilátka.

Ačkoliv protilátka použitá v třetím hledisku předkládaného vynálezu je buď polyklonální a anebo monoklonální, s preventivním a anebo terapeutickým efektem na perzistenci hyperkoagulace způsobené lidským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonální. Je možné rovněž použít chimérické protilátky, humanizované protilátky, • · 9 9·· · · · 9 99 99 • · · ^ · * · 9··· · í *9 9 J J J**9 9 9 9 * • •99 9999 9 99 ·· ·· 99 99 99 9999 protilátky založené na Fv fragmentu a jiné monoklonální protilátky, ovšem preferovaným typem protilátky je humanizovaná protilátka.

Ačkoliv protilátka použitá ve čtvrtém hledisku předkládaného vynálezu je buď polyklonální a anebo monoklonální, s preventivním a anebo terapeutickým efektem na perzistenci hyperkoagulace způsobené lidským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonální. Je možné rovněž použít chimérické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmentu a jiné monoklonální protilátky, ovšem preferovaným typem protilátky je humanizovaná protilátka.

Ačkoliv protilátka použitá v pátém hledisku předkládaného vynálezu je buď polyklonální a anebo monoklonální, s preventivním a anebo terapeutickým efektem na perzistenci hyperkoagulace způsobené lidským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonální. Je možné rovněž použít chimérické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmentu a jiné monoklonální protilátky, ovšem preferovaným typem protilátky je humanizovaná protilátka.

Ačkoliv protilátka použitá v šestém hledisku předkládaného vynálezu je buď polyklonální a anebo monoklonální, s preventivním a anebo terapeutickým efektem na perzistenci hyperkoagulace způsobené lidským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonální. Je možné rovněž použít chimérické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmentu a jiné monoklonální protilátky, ovšem preferovaným typem protilátky je humanizovaná protilátka.

1. Protilátka proti lidskému TF

Protilátka proti lidskému TF může být jakéhokoliv původu, druhu (monoklonální, polyklonální), jakéhokoliv tvaru. Musí mít ale schopnost bránit trvalému stavu hyperkoagulace způsobeného lidským TF.

Protilátky proti lidskému TF pro použití v předkládaném vynálezu jsou monoklonální anebo polyklonální a jsou připraveny některou ze známých metod.

V předkládaném vynálezu, jsou s výhodou použity monoklonální protilátky proti lidskému TF, s výhodou savčího původu. Monoklonální protilátky savčího původu zahrnují ty, které jsou připraveny pomocí hybridomů, a ty, které jsou připraveny pomocí hostitele, který byl transformován expresním vektorem, nesoucím gen pro protilátku. Tato protilátka inhibuje tvorbu trombu tím, že váže lidský TF;

2. Hybridomy produkující protilátky

Hybridom, produkující monoklonální protilátku je připraven pomocí známé metody, popsané níže. Lidský TF anebo jeho fragment je použit jako senzitizující antigen a je použit • · ♦·· · ·· ·♦ ·· ·· • · · - · · · ···· π ί ί ^β· · ί J í**· · · ** • ·· · · ·· · · · · ·· ·· · · ·· ·· ···· k imunizaci pomocí známé metody imunizace. Získané imunní buňky jsou poté fúzovány se známými rodičovskými buňkami pomocí běžného fuzovacího procesu. Poté jsou monoklonální protilátky produkující hybridomy testovány běžnou testovací metodou a je vybrán hybridom, nejlépe produkující protilátku.

Specifičtěji, monoklonální protilátka je připravena tímto způsobem:

TF, jako senzitizující antigen pro přípravu protilátky, je připraven expresí lidského TF genu (Aminokyselinová sekvence publikována (J.H.Morrissey et al., Cell, 1987, 50: 129135). Poté, co je gen pro lidský TF vložen do expresního vektoru, a je transformován do vhodné hostitelské buňky. Lidský TF je puntíkován z hostitelských buněk a anebo supematantu pomocí jedné ze známých metod. Tato metoda je popsaná v citaci č. 1 předkládaného vynálezu.

Dále, lidský TF použitelný jako antigen je získán a puntíkován z biologického materiálu obsahujícího TF, jakým je například lidská placenta. Postup je popsán v citaci č. 2. Poté je purifikovaný lidský TF použit jako senzitizující antigen. Alternativně, solubilní TF, s delecí transmembránové domény na jeho C-konci, připravený rekombinantní DNA technologií, je použitelný jako senzitizující antigen. Ačkoliv zvířata, která jsou imunizována senzitizujícím antigenem nejsou specificky limitována, jsou s výhodou vybírána tak, že jsou kompatibilní s rodičovskou buňkou, použitou v buněčné fúzi. Obecně, vhodnými zvířaty jsou hlodavci, jako například myši, krysy a křečci, anebo králíci a opice.

Imunizace zvířat senzitizujícím antigenem se provádí známou metodou. Obecná metoda, například, zahrnuje intraperitoneální anebo subkutánní podání senzitizujícího antigenů zvířeti. Konkrétně, senzitizující antigen, ředěný ve vhodném množství fosfátového pufru (PBS) anebo fyziologického roztoku je smíchán s vhodným množstvím běžného adjuvans, jakým je například Freundovo kompletní adjuvans. Po emulzifikaci je přípravek podáván zvířeti několikrát, každé 4 až 21 dnů. Případně, při imunizaci senzitizujícím antigenem je možné použít vhodný nosič.

Po imunizaci zvířete uvedeným způsobem a potvrzení dostatečně vysoké hladiny protilátky v séru, jsou imunní buňky vyňaty z pokusného zvířete a jsou podrobeny buněčné tuzí. S výhodou použité buňky zahrnují buňky sleziny.

Savčí myelomové buňky jsou použity jako další rodičovské buňky, které jsou fúzovány svýše uvedenými imunními buňkami. Myelomové buňky s výhodou zahrnují různé známé buněčné linie jako například P3 (P3X63Ag8.653) (Keamey, J.F. et al., J. Immunol., 1979, 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Yelton, D. E. et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, 81:1-7), NS-1 (Kohler, G, andMilstein, C., Eur. J. Immunol, 1976, 6:51144 4444 41 44 ··

4 _ 4 4 4 4 4 4 4

Ϊ J *4 4 ί Ϊ ϊ**4 · ! ! 4* • 444 444 4 444 • 4 44 44 ·· «4 4444

519), MPC-11 (Margubes, D.H. et al., Cell, 1976, 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nátuře, 1978, 276: 269-270), FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Ummunol, Methods, 1980, 35: 121), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med, 1978, 148:313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nátuře, 1979, 277:131-133).

Buněčná fúze mezi výše uvedenými imunními buňkami a myelomovými buňkami se uskuteční pomocí známé metody, jako například metoda, popsaná v Milstein et al., (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol., 1981, 73:3-46).

Specifičtěji, výše uvedená buněčná fuze se uskuteční v běžném výživném médiu za přítomnosti akcelerátoru buněčné fuze. Jako akcelerátor buněčné fuze je možné použít například polyetylenglykol (PEG), Sendai virus (HVJ) apod. Jako adjuvans je možné použít například dimetylsulfoxid. Tyto přísady se přidávají pro zvýšení účinnosti fuze.

S výhodou použitý poměr imunních buněk k buňkám myelomu je stanoven empiricky a je například 1 až 10 : 1. Příklady vhodných médií použitelných pro výše uvedené buněčné fuze jsou RPMI 1640, MEM médium, a jiná běžná média vhodná pro kultivaci těchto typů buněčných linií, a rovněž vhodná pro růst buněk myelomové linie. Do média může být přidáno fetální telecí sérum (FCS).

Pro buněčnou fúzi se v kultivačním médiu důkladně smíchá určené množství imunních buněk a myelomových buněk. Do média se přidá PEG, zahřátý na 37 °C, který má průměrnou molekulovou hmotnost 1000 až 6000. PEG byl přidán na koncentraci 30 až 60 %hmotn. za vzniku fuzních buněk (hybridomů). Poté byly odstraněny všechny látky, které jsou nežádoucí pro růst buněk a to tak, že bylo opakovaně buňkám vyměňováno médium, buňky byly centrifugovány a bylo přidáno nové médium.

Získané hybridomy byly posléze kultivovány v selekčním médiu, jako například například HAT kultivační médium, obsahující hypoxantin, aminopterin a thymidin. Kultivace v uvedeném médiu po dostatečně dlouhou dobu (několik dnů až týdnů) umožňuje selekci hybridomových buněk tun, že nehybridomové buňky (nefuzované buňky) zahynou. Běžná diluční metoda odhab hybridomy, které produkují kýženou protilátku a jednotlivé klony jsou rozpěstovány.

Kromě získání hybridomů imunizací zvířete jiného než člověk antigenem, je rovněž možné získat protilátku s vazebnou aktivitou proti lidskému TF tím, že se lidské lymfocyty in vitro senzitizují bdským TF a vzniklé senzitizované bdské lymfocyty jsou fúzovány s lidskými myelomovými buňkami, jako například myelomovou linií U266 schopnou permanentního dělení, (viz Japanese Examined Patent Publication, No. 1- 59 878). Dále, protilátku proti lidskému TF je možné získat pomocí transgenního zvířete, kterému je jako antigen podán ·· 44*4 4« 44 44 44

4.444 4444 · 4 4 4 4 4 44 4 •444 4 4 4 4 ·· ·4 44 44 44 4444 lidský TF, přičemž zvíře exprimuje celý repertoár lidských imunoglobulinů a anebo jeho část. Buňky, produkující protilátku proti lidskému TF jsou poté imortalizovány (viz International Unexamined Patent Application No. WO 94/25 585, WO 93/12 227, WO 92/03 918, WO 94/02 602, WO 96/34 096 a WO 96/33 735).

Připravené hybridomy, produkující monoklonální protilátku, jsou kultivovány v běžném kultivačním médiu, a anebo jsou dlouhodobě uskladněny v tekutém dusíku.

Zhybridomů se protilátky získávají tak, že se hybridom kultivuje v běžném kultivačním médiu běžným způsobem, a protilátka je získávána ze supematantu, anebo je hybridom implantován laboratornímu zvířeti kompatibilnímu s buňkami hybridomu a protilátka je získávána z ascitu. První metoda je vhodná pro získání vysoce čisté protilátky, zatímco druhá metoda je vhodná pro produkci protilátky na veliko.

Příklad přípravy monoklonální protilátky je popsán v citaci č. 2. V tomto příkladu bylo připraveno 6 monoklonálních protilátek nazvaných ATR-2, 3, 4, 5, 7 a 8. Všechny jsou použitelné v předkládaném vynálezu, ovšem nejvýhodnější je ATR-5.

3. Rekombinantní protilátka

Rekombinantní protilátka, připravená rekombinantní DNA technologií tak, že gen kódující protilátku byl klonován a integrován do vhodného vektoru a vnesen do hostitele, je rovněž použitelná v předkládaném vynálezu jako monoklonální protilátka, (viz například Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem, 1990, 192: 767-775).

Specifičtěji, mRNA kódující variabilní oblast (V) protilátky proti lidskému TF je izolována zhybridomů, produkujícího protilátku proti lidskému TF. mRNA je izolována společně s celkovou RNA, pomocí známou metodu, jakou je například guanidinová ultracentrifugační metoda (Ghirgwin, J. M. et al., Biochemistiy, 1979, 18:5 294-5 299), a anebo AGPC metoda (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. , 1987, 162:156-159). mRNA byla poté z celkové RNA purifikována pomocí mRNA purifikačního kitu (od firmy Pharmacia). Navíc, mRNA je připravena přímo pomocí Quick Prep mRNA Purification Kit (od firmy Pharmacia).

cDNA variabilní oblasti protilátky je syntetizována z mRNA pomocí reverzní transkriptázy. Pro syntézu cDNA je možné použít AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (od firmy Seikagaku Co.). Navíc, pro syntézu a amplifikaci cDNA je možné použít 5'-Ampli FINDER RACE Kit (od firmy Clontech) a 5' - RACE metodu (Frohman, M. A. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 8 998-9 002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17: 2 919- 2 932). Metody jsou založeny na polymerázové řetězové reakci (PCR).

»···«· a« ·« «« • · ·..··· · ··· !·*··!· ··*♦ * ; · • · · · ···· · · · ·· ·« ·· ·· ·« ····

Získaný PCR produkt je purifikován a ligován do vektoru. Ligační směs je transformována do E.coli buněk, ze kterých jsou vybrány kolonie obsahující rekombinantní vektor. Sekvence klonované DNA se ověří pomocí dideoxy terminační sekvenační metody.

Když byla získána DNA kódující V region protilátky proti lidskému TF, je možné ji vložit do vektoru nesoucího konstantní oblast (C) protilátky.

Pro přípravu protilátky proti lidskému TF pro použití v předkládaném vynálezu, gen pro protilátku je vložen do expresního vektoru, tak, že gen je pod kontrolou regulačních oblastí, jakými jsou enhancer a/anebo promotor. V dalším kroku je vektor transformován do hostitelské buňky, ve které je protilátka exprimována.

Pro expresi genu pro protilátku, jsou DNA kódující těžký (H) a lehký (L) řetězec protilátky separátně vloženy do expresních vektorů a hostitelská buňka je transformovaná simultánně. Jinou možností je, že DNA pro těžký i lehký řetězec jsou klonovány do stejného expresního vektoru a hostitelská buňka je transformována tímto konstruktem. (viz International Patent Publication, WO 94/11 523).

Dále, kromě výše uvedených hostitelských buněk, je možné připravit protilátku použitím transgenniho zvířete. Například, gen pro protilátku je připraven jako fuzní tím, že je vložen do genu pro protein, který je přirozeně produkován mlékem. DNA fragment, obsahující fuzní gen pro protilátku, je injikován do kozího embrya a toto embryo je vloženo do kozy. Kýžená protilátka je získávána z mléka transgenní kozy, která vyroste z transgenniho embrya a z jejích potomků. Aby bylo možné zvýšit množství mléka obsahujícího kýženou protilátku, produkovanou transgenní kozou, jsou koze podávány hormony (Ebert, K. M. et al., BioTechnology, 1994, 12: 699-702). Příklad metody pro přípravu rekombinantní protilátky je konkrétně popsán v citaci č. 3.

4. Pozměněná protilátka

V souladu s předkládaným vynálezem, společně s výše uvedenými protilátkami, je možné použít uměle pozměněnou protilátku, jako například chimemí protilátku a humanizovanou protilátku, za účelem snížení heterologní antigenicity vůči člověku. Pozměněná protilátka, užitečná v předkládaném vynálezu, se připraví jednou zběžných metod.

Chimérická protilátka se připraví (jak bylo uvedeno výše) ligací DNA kódující V oblast protilátky s DNA kódující C oblast lidské protilátky, které jsou poté vloženy do expresního vektoru a integrovány do hostitele za účelem produkce protilátky. Použitím této známé metody je možné získat chimérickou protilátku užitečnou pro použití v předkládaném vynálezu.

·· ·«·· !·*>·!· ί**· · ! ! ♦* • · · · · · · · · · · ·· ·· ·* ·· ·· ··*·

Humanizovaná protilátka, nazývána rovněž pozměněná lidská protilátka, byla připravena přenesením komplementaritu určující oblasti (CDR) protilátky pocházející ze savce jiného než člověk, například myší protilátky, do CDR oblasti lidské protilátky. Rekombinantní

DNA technologie pro přípravu takovýchto protilátek je rovněž známá (viz European Patent

Application EP 125 023 a WO 92/02 576).

Specifičtěji, DNA sekvence, která byla určena kligaci CDR z myší protilátky s kostrovou oblastí (FR) lidské protilátky je připravena pomocí PCR metody. Početné primery byly navrženy tak, že obsahují sekvence, kterými se překrývají terminální oblasti CDR a FR (viz metoda popsaná v publikaci WO 98/13 388).

Oblast CDR, která představuje dostatečné vazebné místo pro antigen, je vybrána z FR oblasti lidské protilátky, společně s CDR. Aminokyseliny FR variabilní oblasti protilátky lze podle potřeby nahradit tak, aby CDR oblast modifikované lidské protilátky tvořila vhodné vazebné místo pro antigen (Sáto, K. et al., Cancer Res. (1993), 53, 851-856).

Pro C oblast H řetěžce chimérické protilátky a humanizované protilátky je použita oblast Cyl, Cy2, Cy3 a Cy4, zatímco pro L řetězec jsou použity Ck a CÁ. Navíc, C oblast lidské protilátky lze modifikovat, čímž se zvýší stabilita protilátky anebo její produkce.

Chimérická protilátka se skládá z variabilní oblasti protilátky pocházející ze savce, jiného než člověk; a konstantní části lidské protilátky. Na druhou stranu, humanizovaná protilátka se skládá z CDR pocházejícího ze savce, jiného než člověk; a FR a C oblastí lidské protilátky. Protože má humanizovaná protilátka v lidském těle nižší aktivitu, je užitečná jako efektivní součást terapeutické látky předkládaného vynálezu.

Metoda přípravy chimérické protilátky je specificky popsána v citaci č. 4.

Navíc, metoda přípravy humanizované protilátky je specificky popsána v citaci č. 5. V této citaci, verze a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, bl, dl, b3 a d3, které mají aminokyselinové sekvence uvedené v Tab. 1 a 2, byly použity jako humanizovaná variabilní (V) oblast těžkého (H) řetězce.

> · «« 4 ** *

Tab.l

Aminokyselinové sekvence variabilní (V) oblasti těžkého (H) retezce

FR1 Wf PM C0R2

L39l30(e)

234963íb)

H30885(c)

MS2723U)

280844(e)

L04345CO

S78322(e)

Z26827(h)

U95239O)

L03147(j)

P01742(bl)

P01742W)

280844(b3)

280844(03)

2 3 4 5 6

123456789012345678901234567890 12345 67890123456789 012A3456789012345 QVQUBSGAVLARPCTSVKISCKXSCFNíK 0ΠΜ1Ι WHORPCQCLÍfflř CKDPAWCHSMYOPKPQG — *·?·y·». «—··· -»·*·**·.«.».*«-··„· ** — — -rň*

Tab.2

Aminokyselinové sekvence variabilní (V) oblasti těžkého (H) řetězce (pokračování Tab. 1)

L3913GU)

E3WU)

M30Ž85<q)

M&2723W

Z8O8H<(í)

104345(1)

573332(8)

22882700

US5239ÍÍ)

L03147ÍÍ)

P0l742<bl)

P01142Cdi)

280844(b3)

280844(43)

W® CW KR4

8 § 10 11

67890123456789012A8G345678801234 56789012 34567890123 RAKLTAATSASIAYI.RFS5tTNBDSAVyyúAR DS&YAMDlf WQGTLVTVSS

-VT1 ~-D--TNT—M-L-~-RS--T-1---------— —.......-vmVD-KKQPS^L-V-AA-T-’-—VTí^-Ol^T-T—ML~'-R5·'*—**ř—- «β-β..-,-:

-VSI-0B-T8— M-Lřf-RS-T—F—

-VT!--DT-T-T—M-LR—RSD-T-—- *—-----.-s.

K-T-—'flŠ-S-Tr^MQL—RS——··>$--<·------—' «-···

-VTMS“9K“8-A“-0^T-“KÁS''T-I''F—

-Vrí --D-T-TVPM-L—RS-T-......----“VTF—Ď—NŤ—M*LR—RSA-T— -VT7^“&-?’TRT*rM-L”’-.ŘS--T“j·’’—

-VTl-DR-T^T—M-L—-RS^1-*——j?-—-VTI-B-“TNT-M-L--8S-T-b^‘VTI-DS-M-M-L—KS—--F— —

Navíc, verze a, b, c, bl a b2, kterých aminokyselinová sekvence je uvedená v Tab. 3, byly použity jako humanizovaná variabilní (V) oblast lehkého (L) řetězce.

*· « «· #* ·*·· 99 99 • * ·. · · 9 « · « 9 9 999

9 9 9 9 9 9 9 • 4 ·· 4« «·

9 9

9999

Tab.3

Aminokyselinová sekvence variabilní (V) oblasti lehkého (L) řetězce

Z37332(á) 5W<|SFSSi<SASYGDm)TC KAWKSFU IFVQQKFGKAPKLtl Y YATSLAO ·· — w.

F01607(c) ,g.

? I 9 10 &9®3« mŠBŠM GYPSRPSGSGSGTfiřm^ISSLQPOPATYY^ EíjHCřBSpyT FGGOTKYBU S6B§99(b) - -“.'·*<**;-;-.

POieÓTXc) '“i^^ířiiSřw--/i^¾...páip

-i Λ + ř<4 .jiMěřením antigen vazebné aktivity a TF neutralizační aktivity protilátek vzniklých různými kombinacemi výše uvedených V oblastí H řetězců a V oblastí L řetězců (popsáno v citacích č.6 a 7 jako verze H řetězec V oblast a verze L řetězec V oblast) bylo zjištěno, že obzvlášť vysokou aktivitu měly kombinace b-b, i-b a i-b2. Dále, schopnost těchto humanizovaných protilátek vázat antigen je znázorněna na Obr. 1. Aktivita protilátky při neutralizaci lidského TF (aktivita inhibující produkci faktoru Xa závislou na TF) je znázorněna na Obr. 2. Aktivita protilátky při neutralizaci lidského TF (aktivita protilátky v inhibici vazby faktoru X) je znázorněna na Obr. 3. Aktivita protilátky při neutralizaci lidského TF (aktivita protilátky v inhibici plasmatické koagulace na podkladě TF) je znázorněna na Obr.4.

• · • · · * • ·

5. Modifikované protilátky

Protilátkou použitou v předkládaném vynálezu je buď fragment protilátky anebo modifikovaná protilátka, za předpokladu, že se váže na lidský TF a inhibuje aktivitu lidského TF. Příklady fragmentů protilátek zahrnují jeden řetězec Fv (scFv), ve kterém jsou fragmenty Fab, F(ab')2, Fv H řetězce a anebo L řetězce spojeny s vhodným linkerem.

Specifičtěji, protilátka je opracovaná enyzmem, jako například papain a anebo pepsin, za vzniku fragmentů protilátky. Jiným způsobem je, že se připraví geny, které kódují tyto fragmenty, inzerují se do expresních vektorů a exprimují se ve vhodném hostitelském organismu, (viz např. Co, M.S. et al., J. Immunol, 1994, 152, 2 968 - 2 976, Better, M. et Horowitz, A.H., Methods in Enzymology, 1989, 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1986, 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology, 1986, 121, 663-669, a Bird, R.E., et al., TIBTECH, 1991, 9, 132-137) scFv se získá spojením V oblasti H řetězce s V oblastí L řetězce. V tomto případě jsou

V oblast H řetězce a V oblast L řetězce spojeny pomocí linkeru, s výhodou pomocí peptidového linkeru (Huston, J.S. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 5 879-5 883).

V oblast H řetězce a V oblast L řetězce pocházejí z jakékoliv protilátky popsané v předkládaném vynálezu. Pro peptidový linker, který spojuje V oblasti, se’ použije jednořetězcový peptid, skládající se například z 12 až 19 aminokyselinových zbytků.

DNA, která kóduje scFv se získá tak, že se jako templát použije oblast DNA kódující H řetězec a/nebo V oblast H řetězce, a DNA kódující L řetězec aanebo V oblast L řetězce výše uvedené protilátky, a představuje její kompletní aanebo částečnou aminokyselinovou sekvenci. Tato sekvence je amplifikována pomocí PCR techniky a to tak, že se použije dvojice primerů, ohraničující oba její konce. Rovněž je amplifikován linker, a to tak, že se připraví pomocí dvojice primerů, pomocí kterých je poté linker napojen na řetězec H a L.

Jakmile je připravena DNA kódující scFv, je připraven expresní vektor, který nese tuto sekvenci. V souladu s rutinně používanými metodami je expresní vektor transformován do hostitele, pomocí kterého se získá scFv. Tyto fragmenty protilátek jsou tvořeny hostitelem tak, že exprimuje získaný gen. Termín „protilátka“, jak je používán v předkládaném vynálezu zahrnuje tyto fragmenty protilátek.

Jako pozměněná protilátka se rovněž použije protilátka proti lidskému TF, která je konjugována s různými molekulami, jako například polyethylenglykol. Tyto modifikované protilátky rovněž spadají pod termín „protilátka“, jak je používán v předkládaném vynálezu. Tyto modifikované protilátky se získají tak, že se protilátka různě chemicky modifikuje. Nicméně, postupy pro modifikace protilátek jsou již známy.

• · • ·

Σ i *· ♦ í · í**· · Σ Σ ···· ···· ··· • · · · ·· ·· ····

6. Exprese a příprava rekombinantní protilátky aanebo pozměněné protilátky.

Gen pro produkci protilátky je získán výše uvedeným postupem a je exprimován pomocí jednoho ze známých postupů. V případě savčích buněk je protilátka exprimovaná z konstruktu složeného z běžně používaného promotoru, genu pro protilátku, který má být exprimován a póly A sekvence na 3' konci. Příkladem promotoru/enhanceru je okamžitý brzký promotor/enhancer z lidského cytomegaloviru.

‘ Jiné příklady promotorů/enhancerů, pomocí kterých je exprimována protilátka předkládaného vynálezu zahrnují virové promotory/enhancery, jako například původem zretrovirů, polioviru, adenoviru a SV40 viru, jako i promotorové/enhancerové sekvence pocházející ze savčích buněk, jako například lidský elongační faktor la (HEF1 a).

Gen pro protilátku je snadno exprimován pomocí metody dle Mulligana et al. (nátuře, 1979, 277, 108-114), v případě, že se použije promotor/enhancer z SV40. V případě, že se použije promotor/enhancer z HEF1 a, je gen pro protilátku exprimován pomocí metody dle Mizushima et al. (Nucleic Acid Research, 1990, 18, 5322).

V případě E.coli se výše uvedený gen exprimuje z konstruktu nesoucího promotor, signální sekvenci pro sekreci protilátky a gen pro protilátku, který bude exprimován. Příklady promotorů zahrnují LacZ a araB promotor. Gen je exprimován pomocí metody dle Ward et al., (Nátuře, 1989, 341, 544-546; FASEB J., 1992, 6, 2422-2427), v případě že se použije LacZ promotor. V případě, že se použije ara B promotor, je gen exprimován pomocí metody dle Better et al, (Science, 1988, 240,1041-1043).

V případě, že se protilátka produkuje do periplasmátického prostoru E.coli, je jako signální sekvence použit pelB (Lei, S.P.et al., J. Bacteriol., 1987, 169, 4379-4383). Po izolaci protilátky produkované do periplasmátického prostoru baktérie, je tato použitá po vhodném opětovném sbalení do vhodné struktury protilátky.

Počátky replikace můžou pocházet z různých zdrojů, například SV40, polioviru, adenoviru aanebo bovinního papilomaviru (BPV) atd. Expresní vektor může obsahovat selekční markér, jako například gen pro aminoglykosyltransferázu (APH), gen pro thymidinkinázu (TK), E. coli xantinguaninfosforibosyltransferázu (Ecogpt) aanebo gen pro dihydrofolátreduktázu (dhfr).

Pro produkci protilátky v předkládaném vynálezu lze použít buď eukaryontní a/nebo prokaryontní expresní systém. Příklady eukaryontních buněk zahrnují stabilní savčí linie, hmyzí buňky a buňky hub, jako například buňky plísní a kvasinky. Příklady prokaryontních buněk zahrnují bakterielní buňky, jako například E.coli.

• · ·

Protilátka použitá v předkládaném vynálezu je s výhodou exprimována v savčí buňce, jako například CHO, COS, myelomových buňkách, BHK, Věro aanebo HeLa buňkách.

Transformované hostitelské buňky jsou poté inkubovány in vitro aanebo in vivo za vzniku cílové protilátky. Hostitelské buňky jsou pěstovány podle známých metod. Jako kultivační médium je možné použít DMEM, MEM, RPMI 1640 aanebo IMDM. Média jsou doplňována sérem. S výše uvedenými médii lze použít fetální telecí sérum (FCS).

7. Izolace a purifikace protilátek

Protilátka exprimována a produkována jak bylo popsáno výše je izolována z buněk a/nebo z hostitelského zvířete a purifikována do homogenity. Izolace a purifikace protilátky použité v předkládaném vynálezu se provede pomocí afinitní kolonky. Příklady kolonek využívajících protein A zahrnují Hyper D, POROS a Sepharose F.F. (Pharmacia). Dále jsou použity metody izolace a purifikace pro běžné proteiny a není žádné omezení ve výběru metod. Například, společně svýše uvedenou afinitní purifikací lze purifikaci protilátky kombinovat s purifikací pomocí chromatografické kolony, filtrací, ultrafiltrací, odsolováním aanebo dialýzou atd. (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lané, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

8/1. Měření inhibičního efektu na perzistenci hyperkoagulačního stavu

Pro studium účinnosti předkládaného vynálezu v prevenci a léčbě nemoci spojených s hyperkoagulačním stavem, je potřeba připravit nový zvířecí model. Detaily metod, použitých k ověření výše uvedených parametrů jsou popsány ve specifikaci patentové přihlášky s názvem „Zvířecí model s chronickým hyperkoagulačním stavem a metoda přípravy tohoto modelu“, kterou podává stejný navrhovatel. Specifické příklady ověřovacích metod jsou popsány jako Přiklad 1 v této specifikaci.

Výsledek experimentu, ve kterém byla použita výše uvedená humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ je znázorněn na Příkladu 2 a obrázcích 11 až 13. Podle tohoto experimentu, bylo zvířecímu myšímu modelu z Příkladu 1, kterému byly implantovány buňky nádoru nesoucího gen pro lidský TF, poté, co počet jeho krevních destiček poklesl přibližně na polovinu hodnoty běžné u myši, které tumorové buňky nesoucí gen pro lidský TF implantovány nebyly, (5 až 6 týdnů po implantaci), byla opakovaně intravenózně podávána humanizovaná protilátka proti hdskému TF (verze „i-b2“) v koncentraci 1 mg/kg. Výsledkem bylo, že počet krevních destiček byl až do konce experimentu stejný jako u myši, které nebyly implantovány buňky nádoru. Experiment trval 3 týdny od začátku podávání protilátky.

• · • · • · ·..··· ···· ·· · ····· ·· · • · · · ···· ··· ·· ·'* ·· ·· ·· ····

Podávání humanizované protilátky proti lidskému TF předkládaného vynálezu potlačuje nárůst koncentrace solubilních komplexů fibrin - monomerů (sFMC) a komplexu thrombin-antithrombin ΙΠ (TAT). Výsledky potvrdily, že podávání protilátky proti lidskému TF předkládaného vynálezu zabraňuje persistenci hyperkoagulačního stavu a udržuje normální stav.

8/2. Potvrzení terapeutického efektu na hyperkoagulační stav způsobený infekcí Jako hyperkoagulační stav jsou označovány prodloužení prothrombinového času, pokles píasmatické koncentrace fibrinogenu, nárůst sérové koncentrace fibrin-degradačních produktů apod. Podávání protilátky proti lidskému TF předkládaného vynálezu zabraňuje prodloužení prothrombinového času, poklesu píasmatické koncentrace fibrinogenu a nárůstu sérové koncentrace fibrin-degradačních produktů, indukovaných kontinuální infuzí LPS. Tento výsledek demonstruje, že protilátka proti lidskému TF předkládaného vynálezu má preventivní a/anebo terapeutický efekt na hyperkoagulační stav, vzniklý na podkladě infekce.

Tento efekt je detailně popsán v Příkladu 3.

8/3. Potvrzení preventivního a/nebo terapeutického efektu na venózní trombózu.

V Příkladu 4 je detailně uvedeno, že protilátka proti lidskému TF předkládaného vynálezu má preventivní a/nebo terapeutický efekt na venózní trombózu.

8/4. Potvrzení preventivního a/nebo terapeutického efektu na arterielní trombózu.

V Příkladě 5 je detailně uvedeno, že protilátka proti lidskému TF předkládaného vynálezu má preventivní a/nebo terapeutický efekt na arterielní trombózu.

8/5. Potvrzení preventivního a/nebo terapeutického efektu na nemoci vznikající na podkladě ztluštění médie krevních cév.

V Příkladě 6 je detailně uvedeno, že protilátka proti lidskému TF předkládaného vynálezu má preventivní a/nebo terapeutický efekt na nemoci vznikající na podkladě ztluštění médie krevních cév.

• 9 • · • · · · • ·

9. Metoda podávání a dávkové formy

Terapeutická látka předkládaného vynálezu je použita pro účely prevence, léčby anebo zlepšení nemocí spojených s hyperkoagulačním stavem, hyperkoagulačním stavem vzniklým na podkladě infekce, venózní trombózou, arterielní trombózou a nemocí vznikajících na podkladě hypertrofie vaskulámí médie.

Efektivní dávka pro jedno podání je v rozsahu od 0,001 do 1000 mg/kg tělesné hmotnosti. Alternativně, dávka je v rozsahu od 0,01 do 100 mg/kg, s výhodou od 0,1 do 10 mg/kg. Nicméně, terapeutická látka obsahující protilátku proti lidskému TF předkládaného vynálezu není na výše uvedená dávkovači rozmezí limitována.

Metoda podávání je s výhodou intravenózní injekce, intravenózní infúze a jim podobné, nicméně metoda není limitována pouze na výše uvedené.

Terapeutická látka předkládaného vynálezu obsahující jako účinnou látku protilátku proti lidskému TF může být připravena do lékové formy pomocí standardní metody (Remingtonů Pharmaceutical Science, poslední vydání, Mark Publishing Company, Easton, USA), a může obsahovat farmakologicky přijatelný nosič a/nebo aditiva.

Příklady takovýchto nosičů a aditiv jsou voda, farmakologicky přípustné organické rozpouštědlo, kolagen, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, karboxyvinylpolymer, karboxymethylcelulóza sodná, polyakryl sodný, alginát sodný, ve vodě rozpustný dextran, karboxymethylškrob sodný, pektin, methylcelulóza, ethylcelulóza, xanthanová pryskyřice, arabská guma, kasein, agar, polyethylenglykol, diglycerin, glycerin, propylenglykol, vazelína, parafin, stearylalkohol, kyselina stearová, lidský sérový albumin (HSA), manitol, sorbitol, laktóza, farmakologicky přijatelná povrchově aktivní látka apod.

Aditiva jsou vybrána (ale nejsou limitována pouze na uvedená) ze skupiny uvedené výše a můžou být vhodně jejích kombinací, podle kýžené dávkové formy terapeutické látky, předkládaného vynálezu.

Například, při použití jako injekce, je purifikovaná protilátka proti lidskému TF rozpuštěna v rozpouštědle, jako například fyziologický roztok, pufr a roztok glukózy, ke kterým se přidá anti-adsorbent, jako například Tween 80, Tween 20, želatina anebo lidský sérový albumin. Alternativně jsou aditiva lyofilizována a je potřeba je před použitím rozpustit a rekonstituovat do dávkové formy. Jako excipiencia pro lyofilizaci se používají cukerné alkoholy a cukry, jako například manitol a glukóza.

• ·

9 ·· • · ·

Příklady použití vynálezu

Předkládaný vynález bude nyní vysvětlen podrobněji pomocí příkladů.

Příklad 1. Příprava experimentální myši

Savčí expresní vektor pCOSl, do kterého byl vložen gen kódující lidský tkáňový faktor (sekvence ID: 103), byl naštěpen restrikčním enzymem Prul a byl linearizován. Linearizovaný vektor byl poté elektroporací vnesen do lidské myelomové buněčné linie KPMM2 (FERMP-14 170).

pCOSl byl zkonstruován tak, že se z HEF-PMh-gyl pomocí restriktáz Eco RI a Smál vyštěpil gen pro protilátku a poté byl k němu přiligován adaptor Eco RI-Notl-BamHI (Takara Shuzo). Buňky nesoucí tento konstrukt byly kultivovány v RPMI 1 640 médiu (obsahující 20 % FCS, hIL-6: 4 ng/ml), obsahujícím 1 mg/ml G418. Exprese lidského tkáňového faktoru byla potvrzena průtokovou cytometrií pomocí protilátky proti lidskému tkáňovému faktoru (American Diagnostica). FACS sortování umožnilo vytřídit buněčnou linii KPMM2/TF226, která nesla gen pro lidský tkáňový faktor.

Rodičovský kmen (KPMM2/parent) před vnesením genu pro lidský tkáňový faktor a kmen KPMM2/TF226 s vneseným genem pro lidský tkáňový faktor byly kultivovány v RPMI 1 640 médiu obsahujícím 4 ng/ml lidského IL-6 a 20 % bovinního fetálního séra. Rostoucí KPMM2/TF226 a KPMM2/parent buňky byly separátně subkutánně implantovány v denzitě 1 x 10⁷ do hýždí SCID myší (od firmy CLEA Japan), 7-týdnů starých samečků s průměrnou tělesnou hmotností 22 g. Byly sledovány změny velikosti tumoru v čase, počty krevních destiček, plasmatická koncentrace lidského tkáňového faktoru, fibrinogenu, solubilních komplexů fibrin-monomerů (sFMC) a koncentrace komplexů thrombin-antithrombin ΙΠ (TAT).

Výsledky, uvedené na obr. 5 ukazují, že u všech myší došlo v čase k nárůstu tumorové hmoty. Jak je uvedeno na obr. 6, plasmatická koncentrace lidského tkáňového faktoru vzrůstala v čase u myší, kterým byly implantovány buňky nesoucí gen pro lidský tkáňový faktor, ale nevzrůstala u myší, kterým byly implantovány buňky bez genu pro lidský tkáňový faktor. Jak je uvedeno na obr. 7 a 8, u myší, kterým byly implantovány buňky nesoucí gen pro lidský tkáňový faktor, klesala hodnota krevních destiček a fibrinogenu, naznačující, že tyto koagulační komponenty krve byly konzumovány. Naopak, u myší, kterým byly

9 9999

9 :··. «, ; :

• · · 9 9 9 9 9 · · ♦ · ·· ·· 9 9 · · · <

implantovány buňky bez genu pro lidský tkáňový faktor, nebyla zaznamenána konzumpce těchto koagulačních faktorů krve.

Jak je uvedeno na obr. 9 a 10, u myší, kterým byly implantovány buňky nesoucí gen pro lidský tkáňový faktor, narůstala plasmatická koncentrace solubilních komplexů fibrinmonomerů (sFMC) a rovněž komplexů thrombin-antithrombin ΠΙ (TAT), což naznačuje, že hyperkoagulační stav je perzistentní. Naopak, u myší, kterým byly implantovány buňky bez genu pro lidský tkáňový faktor, nebyl zaznamenán žádný nárůst koncentrace výše uvedených koagulačních komponent krve.

Zvýše uvedených výsledků vyplývá, že u myší, kterým byly implantovány buňky nesoucí gen pro lidský tkáňový faktor, přetrvává hyperkoagulační stav. Toto zjištění potvrzuje, že zvíře předkládaného vynálezu je vhodné jako modelový organismus pro chronický hyperkoagulační stav.

Příklad 2.

Na modelu popsaném v Příkladě 1 byl zkoumán efekt humanizované protilátky proti lidskému TF, verze „i-b2“. Pět až šest týdnů po implantaci KPMM2/TF226 do SCID myší (od firmy CLEA Japan), 7-týdnů stalých samečků s průměrnou tělesnou hmotností 22 g, poklesla hodnota krevních destiček na poloviční ve srovnání s kontrolní skupinou, které nebyly implantovány nádorové buňky. Toto zjištění potvrzuje přetrvávání hyperkoagulačního stavu. Ode dne 45 po implantaci nádorových buněk byla jednou týdně intravenózně podávána humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“. Výsledkem bylo, že v den 3 po začátku podávání humanizované protilátky proti lidskému TF, verze „i-b2“ se hodnota počtu krevních destiček vrátila na hodnotu u kontrolní skupiny, které nebyly implantovány nádorové buňky, a tato hodnota krevních destiček se udržela po celou dobu trvání experimentu (3 týdny).

V den 6 po třetím podání humanizované protilátky proti lidskému TF, verze „i-b2“ byla určena plasmatická koncentrace solubilních komplexů fibrin-monomerů (sFMC) a komplexů thrombin-antithrombin ΠΙ (TAT). Bylo zjištěno, že podávání protilátky bránilo jejich nárůstu (obr. 12 a 13). Tyto výsledky naznačují, že humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ má u experimentálního modelu vyznačujícího se perzistentním hyperkoagulačním stavem při podávání jednou týdně efekt na udržování stabilních hodnot koagulace.

• 0 0 00 0

9

Příklad 3

LPS rozpuštěný ve fyziologickém roztoku byl kontinuálně infundován do žíly opice druhu Cynomolgus rychlostí 1 mg/kg/h (2 ml/kg/h) po dobu 6 hodin, při isofuranové anestézii. Zvířata byla importována z Chuang Primates Experimental Animal Research Center, Nanning, Čína, stejný počet samečků a samiček, průměrný věk 5 až 7 let, tělesná hmotnost 2,99 až 5,81 kg. Intravenózní podání humanizované protilátky proti lidskému TF, verze „i-b2“ v koncentraci 0,3 mg/kg (1 ml/kg) opicím testované skupiny a rozpouštědla (20 mM octan sodný, 150 mM chlorid sodný, pH 6,0) opicím kontrolní skupiny bylo učiněno 10 minut před začátkem kontinuálního podávání LPS.

Na konci kontinuálního podávání LPS byla normální a citrátovaná krev odebírána pomocí katétru zavedeného do femorální artérie a byl určen protrombinový čas, plasmatická koncentrace fibrinogenu a sérová koncentrace fibrin-degradačních produktů. Jak je uvedeno vTab. 4, injekce LPS způsobila prodloužení protrombinového času, pokles plasmatické koncentrace fibrinogenu a nárůst sérové koncentrace fibrin-degradačních produktů, tj. hyperkoagulační stav. U opic, kterým byla podána humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ byly tyto změny silně potlačeny. Tyto výsledky ukazují, že humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ potlačuje hyperkoagulační stav, vzniklý na podkladě infekce.

Tab.4

Efekt humanizované protilátky proti lidskému TF na hyperkoagulační stav způsobený injekcí LPS

	Kontrolní skupina n=4	Skupina, které byla podávána humanizovaná protilátka proti lidskému TF n=4
Před injekcí LPS	Po injekci LPS	Před injekcí LPS	Po injekci LPS
Protrombinový čas (vteřiny)	11,1 +-0,3	15,8 + -2,3	10,9 +- 0,3	11,7+-0,6
Plasmatická koncentrace fibrinogenu (mg/dl)	150+-20	90 +- 20	170+-10	160 +- 20

φφ φφ • φ φ · φ φ φ φφφ

Φ» φφφφ φ φ φ· .·· φ φ • φφφφ

Sérová koncentrace fibrin- degradačních produktů

0+-0

43 +- 14

0+-0

8+-4

* Průměr +- standardní chyba

Příklad 4

Efekt humanizované protilátky proti lidskému TF byl zkoumán na modelu venózní trombózy vzniklé na podkladě venostázy a poškození žilní stěny. Venostáza byla způsobená ligací krevní cévy. Poškození žilní stěny bylo indukováno pomocí „polidocanolu“ (terapeutická látka pro léčbu ezofageálních varixů, Kreussler).

Opice Cynomolgus s průměrným věkem 3 až 4 roky, s hmotností 2,97 až 3,99 (původem z Chuang Primates Experimental Animal Research Center, Nanning, Čína) byly použity jako modelová zvířata pro venózní trombózu. Opice byly anestezovány směsí isofluranu a oxidu dusného a byly uvolněny jugulámí žily bilaterálně. Segment jugulámí žíly byl zaligován suturou na straně proximální k srdci a reverzibilně zaligován další suturou směrem k hlavě tak, aby bylo možně tuto suturu později uvolnit. Do exponovaného segmentu jugulámí žíly byl mezi obě ligatury založen katétr, směrem od srdce k hlavě. Krev ze segmentu mezi oběmi ligaturami byla katétrem odstraněna a lumen žíly byl propláchnut fyziologickým roztokem. Katétrem byl do exponovaného segmentu instilován 0,5 % roztok polidocanolu. Katétr byl odstraněn a krevní céva byla okamžitě zaligována na místě bezprostředně proximálně od místa inzerce katétru.

Po 5 minutách byla reverzibilní ligatura na místě blíž k srdci uvolněna, aby byl odstraněn polidocanol. Reverzibilní ligatura na hlavové straně byla uvolněna a bylo odebráno malé množství krve. Poté byl segment exponované krevní cévy proximálně od místa inzerce katétru úplně uzavřen. Poté, co se segment naplnil krví, byla exponovaná jugulámí žíla na hlavové straně kompletně zaligovaná. Segment mezi oběmi kompletními ligaturami byl dlouhý 1,5 cm. Po 30 minutách byla změřena hmotnost vytvořené krevní sraženiny. Pro měření byly použita suma hmotností krevních sraženin z bilaterálních jugulámích žil. Humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ byla podána intravenózně v koncentraci 0,3 mg/kg a 1,5 mg/kg, 2 hodiny před začátkem tvorby žilního trombu.

·* «··· • ·

Výsledky jsou uvedeny v Tab. 5

Podávání humanizované protilátky proti lidskému TF vedlo k redukci hmotnosti tvořené krevní sraženiny. Tyto výsledky tudíž naznačují, že humanizovaná protilátka proti lidskému TF má profylaktický efekt na tvorbu žilních trombů na tomto modelu.

Tab. 5

Efekt humanizované protilátky proti lidskému TF na žilní trombózu u opic Cynomolgus

	Testovaná látka nebyla podána n=2	Humanizovaná protilátka proti lidskému TF 0,3 mg/kg i.v. n=2	Humanizovaná protilátka proti lidskému TF 1,5 mg/kg i.v. n=2
Suma vlhké hmotnosti	20,8	1,4	0,0
žilních krevních sraženin v levé a pravé jugulámí žíle (mg)	21,9	1,1	0,4
Průměr	21,4	1,3	0,2

Příklad 5

Efekt humanizované protilátky proti lidskému TF na arterielní trombózu byl zkoumán na modelu arterielní trombózy indukované angiostenózou a poškozením stěny artérie. Angiostenóza a poškození arterielní stěny byly způsobeny pevnou ligaturou krevní cévy pomocí 20G jehly se zakulacenou špičkou, která byla zapíchnuta do cévy a poté z cévy vytažena. Toto je model, který napodobuje angiostenózu způsobenou aterosklerózou a poškození cévní stěny na podkladě ruptury aterosklerotického plaku.

Opice Cynomolgus s průměrným věkem 3 až 4 roky, s hmotností 2,97 až 3,99 (původem z Chuang Primates Experimental Animal Research Center, Nanning, Čína) byly použity jako modelová zvířata pro arterielní trombózu. Opice byly anestezovány ketaminhydrochloridem (intramuskulámí podání) a butofanolem (intramuskulámí podání) a byla uvolněna pravá společná karotida. Sonda dopplerova průtokoměru byla přiložena ·· ···· ·· ·· ·· ·· • ♦ ♦ --··· · · · · ;··..: ; ·· • · · · · · · « ··· ·· ·· ·· ·· «· ···· k exponované krevní cévě a krevní tok byl monitorován po dobu 5 minut. Po zjištění, že průtok krve cévou je konstantní, byla vproximální části cévy indukována angiostenóza a poškození arterielní stěny.

Krevní proud byl pozorován dalších 15 minut a byl určen čas, kdy byla vytvořena cévní okluze v důsledku tvorby trombu. Po uvolnění ligatury na pravé společné karotidě byla opici z experimentální skupiny podána humanizovaná protilátka proti lidskému TF. V levé společné karotidě byl rovněž určen čas, kdy nastala okluze cévy v důsledku tvorby trombu. Humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ byla podána intravenózně v koncentraci 0,3 mg/kg a 1,5 mg/kg, 1 hodinu před začátkem tvorby trombu v levé společné karotidě.

Výsledky jsou uvedeny v Tab. 6.

Podání humanizované protilátky proti lidskému TF vedlo k redukci délky vaskulámí okluze. Tyto výsledky tudíž naznačují, že humanizovaná protilátka proti lidskému TF má profylaktický efekt na tvorbu arterielního trombu v tomto modelu.

Tab.6

Efekt humanizované protilátky proti lidskému TF na tvorbu arterielního trombu u opice Cynomolgus

	Testovaná látka nebyla podána n=2	Humanizovaná protilátka proti lidskému TF 0,3 mg/kg i.v. n=2	Humanizovaná protilátka proti lidskému TF 1,5 mg/kg i.v. n=2
Čas vaskulárm okluze po dobu 15 minutového pozorování po podání testované látky (min) (levá společná karotida)	12,2	7,2	3,5
Čas vaskulámí okluze po dobu 15 minutového	+0,9	-4,4	-6,2

444· ·· ·· ·· ·· • · * 4·· 4 ♦ · •444 444« ··· •· ·· 44 ·· «· ····

pozorování po podání testované látky (min) (levá společná karotida-pravá společná karotida)

* Uvedené hodnoty představují průměrné hodnoty skupiny

Příklad 6

Opice Cynomolgus (zakoupeny od firmy KEARI lne, opice vyrostly ve Vietnamu, odhadovaný věk 4 až 5 let) byly anestezovány 5 až 10 mg/kg ketalaru, i.m. a 15 až 20 mg/kg pentobarbitalu, i.v.. Krk byl naříznut a byla uvolněna karotida. Externí karotidou byl zaveden Fogartyho katétr (3 až 5 F) a balónek byl nafouknut tak, aby poškrábal vaskulámí intimu pětkrát. Po poškrábání byl katetr odstraněn a rána byla suturována. O jeden měsíc později byla zvířata euthanazována a byla vyjmuta karotida. Současně byla podobným způsobem vyjmuta kontralaterální karotida, která nebyla poškozena balónkem.

Humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ byla podána intravenózně v koncentraci 0,3 mg/kg a 1,5 mg/kg, 10 minut před poškozením cévní stěny. Extrahovaná artérie byla fixována ve formalinu. Byly připraveny histologické preparáty, které byly barveny HE, jejích elastica byla barvena vanGiesonem. Poté následovala obrazová analýza pro změření oblasti intimy. Výsledky ukazují (a jak je uvedeno na Obr. 7), že humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“ zabraňuje zúžení lumina cévy tím, že zabraňuje růstu cévní tkáně jako takové a tím efektivně zabraňuje restenóze.

• 4 44

I 4 4 4 ♦ 4 4 4·· »4 44

..· 4 · • · 444

Tab.7

	Zvíře č.	Nepoškozená krevní céva Plocha médie v mm2	Poškozená krevní céva Plocha médie v mm2
Kontrolní skupina	1	1,06	2,15 (2,3 %)
	2	0,74	1,45 (196 %)
	3	0,82	1,78 (217 %)
Protilátka	4	0,75	1,15(153%)
proti lidskému TF	5	0,78	0,96 (123 %)
	6	0,86	0,98(114%)

(Procento vztažené k nepoškozené straně)

Příklad 7

V příkladu 1 byl zkoumán efekt humanizované protilátky proti lidskému TF „verze i-b2“ a nízkomolekulámího heparinu. 6 až 7 týdnů po implantaci KPMM2/TF226 buněk do SCID myší (CLEA Japonsko, samečkové, 7 týdnů věku, průměrná tělesná hmotnost 24 g) byl počet krevních destiček redukován na přibližně polovinu ve srovnání s kontrolní skupinou, které nebyly implantovány nádorové buňky, což potvrzuje perzistenci hyperkoagulačního stavu. Od 49 dne po implantaci byla intravenózně podávána humanizovaná protilátka proti lidskému TF, verze „i-b2“, v koncentraci 1 mg/kg. Alternativou bylo podávání nízkomolekulámího heparinu pomocí subkutánně zabudované osmotické pumpy, která dovoluje nepřerušované 24 hodinové podávání účinné látky, o koncentraci 601,5 IU/kg, 1 900,3 IU/kg a 6 487 IU/kg. Výsledkem bylo, že se v den 1 po podání humanizované protilátky proti lidskému TF, verze „i-b2“ vrátil stav krevních destiček do původního stavu a v den 3 byl počet krevních destiček vyšší než v kontrolní skupině, které nebyly implantovány nádorové buňky. Efekt třetího dne se udržel dokonce po dni 7. Naopak, u skupiny, které byl podáván nízkomolekulámí heparin o koncentraci 6 487 IU/kg, byl pozorován mírný návrat počtu krevních destiček k původní hodnotě v den 1 a 2 po podání, ale v den 3 tento efekt zmizel, ačkoliv existovala jistá tendence k návratu počtu krevních destiček do původního stavu. (Obr. 14).

·· »· • · · et ť»»· 99 <» t · « ..tet • · · ····· a · » ···· ···« ·»· ·· ·· te »· ·« ··*«

Referenční příklad 1

Metoda přípravy solubilního lidského TF Solubilní lidsktý TF byl připraven následujícím způsobem.

Gen kódující penetrační oblast lidského TF, ve kterém byly aminokyseliny na pozici 220 a dále nahrazeny FLAG peptidem M2, byl vložen do savčího expresního vektoru (obsahující gen pro rezistenci na neomycin a DHFR gen). Tento vektor byl transfekován do CHO buněk. cDNA sekvence lidského TF byla publikována v článku Morrissey, J.H, et al, Cell, 1987, 50: 129-135. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence tohoto solubilního lidského TF je uvedena v databáze sekvencí pod číslem 101 a 102. Po selekci sG418 byly vyselektovány buňky exprimující TF a exprese byla ještě zvýšena pomocí expozici methotrexátu. Byla ustanovena shTF exprimující buněčná linie.

Buňky byly kultivovány v bezsérovém médiu CHO-S-SFMII (GIBCO) a byl odebírán supematant, obsahující shTF. Supematant byl dvakrát naředěn stejným objemem 40 mM TrisHC1 pufrem (pH 8,5). Naředěný supematant byl nanesen na Q-Sepharose Fast Flow Column (od firmy Pharmacia Biotech) o objemu 100 ml, přičemž kolona byla před nanesením ekvilibrována 20 mM Tris-HCl pufrem (pH 8,5). Po propláchnutí stejným pufrem obsahujícím 0,1 M NaCl, byla koncentrace NaCl změněna na 0,3 M a shTF byl z kolony eluován.

K získané shTF frakci byl přidán sulfát amonný s výslednou koncentrací 2,5 M. Směs byla centrifugována (10 000 ot., 20 min) za precipitace kontaminujících proteinů. Supematant byl přidán k Butyl TOYOPEARL (30 ml, od firmy TOSOH) a poté byl propláchnut 50 mM TrisHCl pufrem (pH 6,8) obsahujícím 2,5 M sulfát amonný. V 50 mM Tris-HCl pufru (pH 6,8) se koncentrace sulfátu amonného lineárně snižovala od 2,5 M do 0 M, což umožnilo eluci shTF. Frakce, nejbohatší na shTF, byly zakoncentrovány pomocí Centri-Prep 10 (od firmy Amicon). Koncentrát byl nalit na TSKgel G3000SWG kolonu (21,5 x 600 mm, od firmy TOSOH), která byla předtím ekvilibrována pomocí 20 mM Tris-HCl pufru s pH 7,0, který obsahoval 150 mM NaCl. Nejbohatší shTF frakce byly sbírány. Frakce byly sterilizovány 0,22 pm filtrací a výsledný produkt představoval solubilní Udský TF (shTF). Byla vypočtena koncentrace vzorku: pro případ, že molámí extinkční koeficient vzorku je ε=40,130 a molová hmotnost je 43.210.

• * · ·· ··

• « >

·» • 44 • 4 ·«*<

Referenční příklad 2. Příprava protilátky proti lidskému TF

1. Purifikace lidského TF

TF z lidské placenty byl purifikován metodou podle Ito (Ito, T. et al., J.Biol.Chem., 114:691-696, 1993). Lidská placenta byla homogenizována vTrisem pufrovaném solném roztoku (TBS, pH 7,5), obsahujícím 1,0 mM benzamidinhydrochlorid, 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM diisopropylfluorofosfát a 0,02 % azid sodný, a poté byl precipitát zbaven tuků pomocí ledového acetonu. Získaný odtučněný prášek byl resuspendován ve výše uvedeném pufru obsahujícím 2 % Triton X-100, který solubilizoval TF. Supematant byl nanesen na afinitní chromatografickou kolonu (Concanavalin ASepharose 4B kolona od firmy Pharmacia) a Sepharose 4B kolonu s navázanou protilátkou proti TF (od firmy Pharmacia), čímž byl získán purifikovaný TF. Protein byl zakoncentrován pomocí ultrafiltrační membrány (PM-10, od firmy Amicon). Purifikovaný vzorek byl uložen při teplotě 4 °C.

Obsah TF v purifikovaném vzorku byl kvantifikován sendvičovou ELISA technikou, kombinovanou s komerčně dostupnou monoklonální a polyklonální protilátkou proti TF (od firmy American Diagnostica), s rekombinantním TF jako standardem.

Čistota purifikovaného vzorku byla konfirmována pomocí SDS-PAGE elektroforézy s 4 až 20 % hustotním gradientem, následovanou barvením stříbrem.

2. Imunizace a příprava hybridomu

Po smíchání purifikovaného lidského TF (70 pg/ml) se stejným objemem kompletního Freudova adjuvans (od firmy Difco), byla tato směs subkutánně injikováha do bříška 5 týdnů starých Balb/C samečků myší (od firmy Nipon Charles River) v koncentraci 10 pg TF/myš. V den 12, 18 a 25 byl TF smíchaný sFreudovým kompletním adjuvans v koncentraci 5 pg/myš znovu subkutánně myším injikován. Jako finální imunizace byl v den 32 myším podán roztok TF v PBS intraperitoneálně v koncentraci 5 pg/myš.

Tři dny po finální imunizaci byly získány slezinné myší buňky ze 4 myší a tyto byly zfuzovány s buňkami myší myelomové linie P3U1 v poměru 1:5 pomocí polyethylenglykolové metody. Fúzované buňky byly suspendovány v RPMI médiu (od firmy Lifetech Oriental), obsahujícím 10 % fetálního bovinního séra. Buňky byly vysety na 96-ti jamkovou destičku vdenzitě 400 buněk na jamku. V den 1, 2, 3 a 5 po fúzi byla polovina • 9 • · · · • · • · · * · média vyměněna za nové RPMI médium (dále pod názvem HAT médium), obsahující HAT (od firmy Dainippon Seiyaku) a H1 (od firmy Boehringer Mannheim GmbH), za HAT selekce hybridomů.

Hybridomy selektované na základě skrínovací metody popsané níže byly dvakrát klonovány za limitního ředění.

Pro limitní ředění bylo inokulováno 0,8 buněk do jedné jamky 96-ti jamkové destičky. V jamkách, kde se objevib mikroskopicky patrné kolonie, byly kolonie selektovány pomocí níže uvedeného měření vazebné aktivity k TF a neutralizační aktivity TF. Získané klony byly přeneseny z HAT média do RPMI média. Poté, co byl ověřen pokles tvorby protilátek v důsledku přenosu buněk do jiného média, bylo uskutečněno limitní ředění pro kompletní rozklonování. Pomocí výše uvedené procedury byly ustanoveny Unie hybridomů, které produkovaly 6 protilátek (ATR-2, 3, 4, 5, 7 a 8), silně mhibujících vazbu komplexu TF/faktor Vila a faktor X.

3. Tvorba ascitu a purifikace protilátky

Tvorba ascitu pomocí ustanovených hybridomových linií byla provedena pomocí standardní metody. 10^{4 * 6} hybridomových buněk, kultivovaných in vitro bylo intraperitoneálně implantováno do Balb/C samečka myši, kterému byl předtím dvakrát intravenózně podán minerální olej. Ascites byl odebírán myším, které měli nafouklé bříško, 1 až 2 týdny po implantaci.

Purifikace protilátky z ascitu byla provedena pomocí ConSepLIOO systému (od firmy MilUpore) a Protein A kolony (od firmy Nippon Gaishi).

4. ELISA test

Buňky lidského karcinomu močového měchýře J82 (Fair D.S. et al., J. Biol.Chem., 262:11 692-11 698, 1987), které exprimují TF ve velkém množství, byly získány zATTC banky tkáňových kultur a byly kultivovány v RPMI médiu při 37 °C, 5 % CO2 a 100 % vlhkosti.

Destičky pro ELISA test byly připraveny inokulaci J82 buněk na 96-ti jamkovou destičku vdenzitě 10⁵ buněk/jamku, kultivovány jeden den ve výše uvedených podmínkách. Poté jim bylo médium odstraněno, buňky byly dvakrát promyty PBS, byl přidán 4 % roztok paraformaldehydu (PFA) a buňky byly ponechány na ledu po dobu 10 minut, aby proběhla imobilizace. Poté, co byl odstraněn PF A, byla destička opláchnuta PBS, byl přidán Tris • · · · • φ • φ blokovací pufr obsahující 1 % BSA a 0,02 % azid sodný. Destička byla uložena při 4 °C do použití.

ELISA detekce byla provedena následujícím způsobem: Blokovací pufr byl odstraněn z výše uvedené připravené destičky, na kterou byl nanesen roztok protilátky proti TF anebo supernatant kultury hybridomu. Reakce probíhala při pokojové teplotě 1,5 hodiny. Po oplachu PBS s 0,05 % Tween 20, byla přidána kozí anti-myší IgG (H+L) protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatázou (od firmy Zymed). Reakce probíhala 1 hodinu. Po oplachu byl přidán 1 mg/ml p-nitrofenylfosfát disodný (od firmy Sigma) a za jednu hodinu byla měřena absorbance při 405/655 nm, detekující množství protilátky proti TF navázaného na J82 buňky.

5. Esej pro určení neutralizační aktivity proti TF, s faktorem Xa jako indexem

K 50 μΐ TBS, pH 7,6, s 5 mM CaCb a 0,1 % bovmním sérovým albuminem bylo přidáno 10 μΐ thromboplastinu z lidské placenty (roztok 5 mg/ml) (Thromborel Sod firmy Boehring) a 10 μΐ roztoku faktoru VHa (82,5 ng/ml, od firmy American Diagnostics). Reakce probíhala 1 hodinu při pokojové teplotě za vzniku komplexů TF a faktor Vila. Po přidání 10 μΐ naředěné protilátky proti TF anebo hybridomového supematantu a 10 μΐ roztoku faktoru X (3,245 mg/ml, od firmy Celsus Laboratories), probíhala reakce 45 minut. Poté byla reakce zastavena 10 μΐ 0,5 M EDTA. 50 μΐ 2 mM S-2 222 roztoku (od firmy Daiichi Kagaku Yakuhin) bylo přidáno k reakční směsi a po 30 minutách byly měřeny změny v absorbanci při 405/655 nm. Na základě měření absorbance byla stanovena faktor X produkující aktivita TF. Pomocí této metody lze stanovit aktivitu protilátky, která inhibuje vazbu komplexu TF/faktor Vila a faktor X.

6. Esej pro stanovení inhibiční aktivity proti plasmatické koagulaci μΐ vhodně naředěné protilátky proti TF bylo smícháno se 100 ml komerčně dostupného roztoku normální lidské plasmy (od firmy Kojin Bio). Reakce probíhala při teplotě 37 °C po dobu 3 minut. Poté bylo k reakci přidáno 50 μΐ thromboplastinu pocházejícího z lidské placenty (1,25 mg/ml) a byl měřen čas potřebný pro koagulaci plasmy. Měření bylo prováděno přístrojem na měření plasmatické koagulace (CR-A: Amelung).

• · · · • · « ·

Ί. Určení isotypu protilátky

Pro určení isotypu purifikované anebo hybridomové supematantové protilátky byl použit isotypovací kit pro myší monoklonální protilátky od firmy Amersham. Výsledky jsou uvedeny níže.

Tab. 5

Imunoglobulinový isotyp monoklonální protilátky proti TF

ATR-2

ATR-3

ATR-4

ATR-5

ATR-7

ATR-8

Referenční příklad 3 proti bdskému TF

IgGl, κ IgGl, κ IgGl, κ IgGl, κ IgG2a, κ IgG2a, κ

Klonování DNA kódující V oblast myší monoklonální protilátky

1. Příprava mRNA mRNA byla připravena z hybridomu ATR-5 (IgGl, κ), který je uveden v referenčním příkladě 2 za použití Quick-Prep mRNA purifikačního kitu (Pharmacia Biotech). Všechny hybridomové buňky byly kompletně homogenizovány v extrakčním pufru podle návodu uvedeného v kitu. Poté byla mRNA purifikována pomocí obgo (dT) - celulozové centrifugační kolonky, a precipitována ethanolem. mRNA precipitát byl rozpuštěn v elučním pufru.

2. Preparace a amplifikace cDNA genu kódujícího V oblast myší protilátky.

Klonování H řetězce V oblasti cDNA

Klonování genu kódujícího V oblast H řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému TF bylo provedeno pomocí 5' - RACE metody (Frohman, M.A., et al., Proč. Nati. Acad.Sci. USA, 85 : 8 998 - 9 002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Research, 17: 2 919 - 2 932, 1989). Pro 5-RACE metodu byl použit Marathon cDNA Amplification Kit (od firmy Clontech) a reakce byla provedena podle instrukcí uvedených v kitu.

• · • · · · φ · · · · · · · · · · · · ··· · · ϊ ϊ.ϊ’ίίϊϊ’ίϊ·' ·· ·· · · ·· ·< · · ι μg RNA, připravené jako bylo uvedeno výše, byl použit jako templát pro syntézu cDNA vlákna pomocí primeru vkitu. Reverzní transkripce probíhala 60 minut při teplotě 42 °C. K reakční směsi byla poté přidána DNA-polymeráza I, DNA ligáza a RNA-áza H při 16 °C po dobu 45 minut a bylo syntetizováno druhé vlákno cDNA. Dvouřetězcová cDNA byla extrahována fenolem a chloroformem a precipitována ethanolem.

K oběma koncům cDNA byly přes noc pomocí T4 DNA ligázy při teplotě 16 °C přiligovány adaptery. Reakční směs byla naředěna 50-krát pomocí 10 mM Tricin-KOH (pH 8,5) s 0,1 mM EDTA. Na tomto templátu byl pomocí PCR reakce amplifikován fragment kódující V oblast H řetězce. Adapterový primer 1 z kitu byl použit jako 5' primer a jako 3' primer byl použit MGC-G1 primer (sekvence č. 1) (S.T. Jones, et al., Biotechnology, 9:88-89, 1991).

PCR roztoky pro amplifikaci V oblasti H řetězce ATR-5 protilátky ve 100 μΐ obsahovaly 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH₄)₂ SO4, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), 30 až 50 pmol adapterového primeru 1, stejně jako MHC-G1 primeru a 1 až 5 μΐ cDNA ke které byl přiligován cDNA adapter.

PCR reakce byly provedeny za použití DNA Thermal Cycler 480 (od firmy Perkin-Elmer), ve 30 cyklech s tímto profilem: 94 °C, 30 vteřin, 55 °C, 30 vteřin, 74 °C 1 minuta.

ii. Klonování L řetězce V oblasti cDNA

Klonování genu kódujícího V oblast L řetězce myší monoklonální protilátky proti lidskému TF bylo provedeno pomocí 5' - RACE metody (Frohman, M.A., et al., Proč. Nati. Acad.Sci. USA 85 : 8 998 - 9 002, 1988; Belyavsky, A et al., Nucleic Acids Research, 17: 2 919 - 2 932, 1989). Pro 5-RACE metodu byl použit Marathon cDNA Amplification Kit (od firmy Clontech) a reakce byla provedena podle instrukcí uvedených v kitu.

pg RNA připravené jako bylo uvedeno výše, byl použit jako templát pro syntézu cDNA vlákna pomocí primeru vkitu. Reverzní transkripce probíhala 60 minut při teplotě 42 °C. K reakční směsi byla poté přidána DNA-polymeráza I, DNA bgáza a RNA-áza H při 16 °C po dobu 1,5 hodiny a T4 DNA ligáza při 16 °C po dobu 45 minut, a bylo syntetizováno druhé vlákno cDNA. Dvouřetězcová cDNA byla extrahována fenolem a chloroformem a precipitována ethanolem.

• · • · · ·

«(* «· • · · · • · · · · ·

K oběma koncům cDNA byly přes noc pomocí T4 DNA ligázy při teplotě 16 °C přiligovány adaptery. Reakční směs byla naředěna 5O-krát pomocí 10 mM Tricin-KOH (pH 8,5) s 0,1 mM EDTA. Na tomto templátu byl pomocí PCR reakce amplifikován fragment kódující V oblast L řetězce. Adapterový primer 1 z křtu byl použit jako 5' primer a jako 3' primer byl použit MKC primer (sekvence č. 2) (S.T. Jones, et al., Biotechnology, 9:88-89, 1991).

PCR roztoky pro amplifikaci V oblasti H řetězce ATR-5 protilátky ve 100 μΐ obsahovaly 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH₄)₂ SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mMMgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), 30 až 50 pmol adapterového primeru 1, stejně jako MKC primeru a 1 μΐ cDNA, ke které byl přiligován cDNA adapter.

PCR reakce byly provedeny za použití DNA Thermal Cycler 480 (od firmy Perkin-Elmer), ve 30 cyklech s tímto profilem: 94 °C, 30 vteřin, 55 °C, 30 vteřin, 74 °C 1 minuta.

3. Purifikace a fragmentace PCR produktů

Výše uvedená PCR reakční směs byla extrahována fenolem a chloroformem a amplifikované PCR fragmenty byly precipitovány ethanolem. DNA fragmenty byly štěpeny restriktázou Xmal (od firmy New England Biolabs) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Xmal štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 2 až 3 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky velikosti kolem 500 bp obsahující V oblast H řetězce a V oblast L řetězce byly z gelu vyříznuty. DNA byla zgelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny v 10 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) s 1 mM EDTA (zde nazývaný jako TE pufr).

Xmal štěpené DNA fragmenty obsahující V oblast H řetězce a V oblast L řetězce připravené jak bylo uvedeno výše byly zligovány s vektorem pUC16, který byl rovněž připraven štěpením restriktázou Xmal. Ligace byla provedena pomocí DNA ligačního kitu od firmy Takara Shuzo, při teplotě 16 °C po dobu 1 hodiny podle instrukcí uvedených v kitu. Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JM109 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny sLB médiem (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring • · • · · · « »

Harbor Laboratory Press, 1989), obsahující 100 pg/ml ampicilinu (z tohoto důvodu je zde médium nazýváno jako LBA) a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml anebo 4 ml LBA média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu, při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen), a konstrukty byly osekvenovány.

4. Určení nukleotidové sekvence genu kódujícího V oblast myší protilátky

Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti ve výše uvedených plasmidech byla určena pomocí Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy PerkinElmer) na přístroji DNA Sequencer 3 73A (od firmy Perkin-Elmer). Jako sekvenační primery byly použity M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 4). Korektnost sekvence byla potvrzena čtením nukleotidové sekvence z obou stran.

Plasmidy nesoucí gen kódující V oblast myšího H řetězce pocházející z hybridomu ATR-5 byly pojmenovány jako ATR-5Hv/pUC19 a plasmidy nesoucí gen kódující V oblast myšího L řetězce pocházející z hybridomu ATR-5 byly pojmenován jako ATR-5Lv/pUC19. Nukleotidové sekvence genů kódujících V oblasti H řetězců všech myších protilátek, které nese plasmid ATR-5Hv/pUC19 (společně s odpovídající aminokyselinovou sekvencí) jsou uvedeny pod čísly 5 a 99, a nukleotidové sekvence genů kódujících V oblasti L řetězců všech myších protilátek, které nese plasmid ATR-5Lv/pUC19 (společně s odpovídající aminokyselinovou sekvencí) jsou uvedeny pod čísly 6 a 100.

Referenční příklad 4. Konstrukce chimérické protilátky.

Byla připravena chimérická ATR-5 protilátka, kde V oblast myší ATR-5 protilátky byla ligována kC oblasti lidské protilátky. Byl připraven expresní vektor pro chimérickou protilátku, ve kterém V oblast myší ATR-5 protilátky byla ligována k C oblasti lidské protilátky.

1. Konstrukce V oblasti H řetězce chimérické protilátky

V oblast H řetězce ATR-5 protilátky byla PCR modifikována tak, aby bylo možné ji ligovat do expresního vektoru kódujícího C oblast H řetězce lidské protilátky. 5' primer ch5HS (sekvence č. 7) byl navržen tak, aby hybridizoval s 5' koncem DNA kódující V oblast.

• · ft · · · • »

Tento primer nese Kozákovu konsenzní sekvenci (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol, 196:947-950, 1987) a rozpoznávací sekvenci pro restriktázu Sáli. 3' primer ch5HA (sekvence č. 8) byl navržen tak, aby hybridizoval s 3' koncem DNA kódující J oblast. Tento primer rovněž nese rozpoznávací sekvenci pro restriktázu Nhel.

PCR roztoky ve 100 μΐ obsahovaly 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH4)₂ SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), pmol primeru ch5HS a ch5HA, stejně jako 1 μΐ plasmidu ATR5HV/pUC19, jako templátové DNA.

PCR reakce byly provedeny za použití DNA Thermal Cycler 480 (od firmy PerkinElmer), ve 30 cyklech s tímto profilem: 94 °C, 30 vteřin, 55 °C, 30 vteřin, 74 °C 1 minuta.

PCR reakční směs byla extrahována fenolem a chloroformem a amplifikované PCR fragmenty byly precipitovány ethanolem. DNA fragmenty byly štěpeny restriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny, a poté restriktázou Sáli při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny . Štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 3 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 450 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla zgelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny ve 20 μΐ TE pufru.

V případě klonovacího vektoru byl použit vektor s pozměněným promotorem (zde nazýván CVIDEC), do kterého byly vneseny rozpoznávací sekvence pro restriktázy Nhel, Sáli, SplI, a BglIL Fragment genu, připravený jak bylo uvedeno výše, kódující V oblast H řetězce myší protilátky, a CVIDEC vektor, připraven digescí Nhel a Sáli byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JM109 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny sLBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml LBA média při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

99 • · 9 « · *

Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti ve výše uvedených plasmidech byla určena pomocí Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy PerkinElmer) na přístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Jako sekvenační primery byly použity M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 4). Korektnost sekvence byla potvrzena čtením nukleotidové sekvence z obou stran.

Plasmid nesoucí gen kódující V oblast myšího H řetězce ATR-5 protilátky, Sáli rozpoznávací sekvenci a Kozákovu sekvenci na 5' konci a Nhe I rozpoznávací sekvenci na 3' konci byl pojmenován jako chATR5Hv/C VIDEC.

2. Konstrukce V oblasti L řetězce chimérické protilátky

V oblast L řetězce ATR-5 protilátky byla PCR modifikována tak, aby bylo možné ji ligovat do expresního vektoru kódujícího C oblast L řetězce lidské protilátky. 5' primer ch5LS (sekvence č. 9) byl navržen tak, aby hybridizoval s 5' koncem DNA kódující V oblast. Tento primer nese Kozákovu konsenzní sekvenci (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol, 196:947-950, 1987) a rozpoznávací sekvenci pro restriktázu BglII. 3' primer ch5LA (sekvence č. 10) byl navržen tak, aby hybridizoval s 3' koncem DNA kódující J oblast. Tento primer rovněž nese rozpoznávací sekvenci pro restriktázu SplI.

PCR roztoky ve 100 μΐ obsahovaly 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NHih SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), pmol primeru ch5HS a ch5HA, stejně jako 1 μΐ plasmidu ATR5LV/pUC19, jako templátové DNA.

PCR reakce byly provedeny za použití DNA Thermal Cycler 480 (od firmy PerkinElmer), ve 30 cyklech s tímto profilem: 94 °C, 30 vteřin, 55 °C, 30 vteřin, 74 °C 1 minuta.

PCR reakční směs byla extrahována fenolem a chloroformem a amplifikované PCR fragmenty byly precipitovány ethanolem. DNA fragmenty byly štěpeny restriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny, a poté restriktázou Sáli při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny . Štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 3 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 450 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla zgelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny ve 20 μΐ TE pufru.

·· ·· • · · *

Fragment genu, připravený jak bylo uvedeno výše, kódující V oblast L řetězce myší protilátky, a CVIDEC vektor, připraven digescí SplI a BglII, byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JMI09 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny s LBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml LBA média při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti ve výše uvedených plasmidech byla určena pomocí Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy Perkin-Elmer) na přístroji DNA Sequencer 3 73A (od firmy Perkin-Elmer). Jako sekvenační primery byly použity M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 4). Korektnost sekvence byla potvrzena čtením nukleotidové sekvence ž obou stran.

Plasmid nesoucí gen kódující V oblast myšího L řetězce ATR-5 protilátky, BglII rozpoznávací sekvenci a Kozákovu sekvenci na 5' konci a SplI rozpoznávací sekvenci na 3' konci byl pojmenován jako chATR5Lv/CVIDEC.

3. Konstrukce expresního vektoru pro chimérickou protilátku

Expresní vektor pro chimérickou protilátku byl zkonstrován pomocí expresního vektroru pro protilátku od firmy IDEC Pharmaceuticals. Jako vektory byly použity IgGl expresní vektor H5KG1 (V) a IgG4 expresní vektor N5KG4P. Expresní vektor pro chimérickou protilátku ATR-5 byl zkonstruován ligací genu kódujícího V oblast H řetězce ATR-5 do Sáli - Nhel místa bezprostředně před C oblastí lidského H řetězce v expresním vektoru N5KG1 (V) anebo N5KG4P, a ligací genu kódujícího V oblast L řetězce ATR-5 do BglII - SplI místa bezprostředně před C oblastí lidského L řetězce v expresním vektoru N5KG1 (V) anebo N5KG4P.

>* · . · · · · · » • · · · · · · · «· « ♦ · 4 · ·· ·*· · «·<· » · * · ··<

·· · * · 9 * · ··<

i. Vnesení V oblasti H řetězce

Plasmid chATR5Hv/CVIDEC byl štěpen restriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 3 hodin, a poté restriktázou Sáli při teplotě 37 °C po dobu 3 hodin. Štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 1,5 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 450 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla zgelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny ve 20 μΐ TE pufru.

Expresní vektory N5KG1 (V) a N5KG4P byly štěpeny restriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 3 hodin, a poté restriktázou Sáli při teplotě 37 °C po dobu 3 hodin. Štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 1,5 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 450 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla zgelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny ve 20 μΐ TE pufru.

Sáli - Nhel fragment připravený jak bylo uvedeno výše, obsahující gen kódující V oblast H řetězce, a N5KG1 (V) a N5KG4P štěpené restriktázami Sáli a Nhel, byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JM109 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu í hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny sLBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml LBA média při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Plasmidy nesoucí geny kódující H řetězce chimérické ATR-5 protilátky byly pojmenovány jako chATR5Hv/N5KGl (V) a chATR5Hv/N5KG4P.

ii. Vnesení V oblasti L řetězce

Plasmid chATR5Lv/CVIDEC byl štěpen restriktázou BgtH (od firmy Takara Shuzo) a restriktázou SplI (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1,5 hodiny. Štěpená směs • * · · 9 9 · ♦ · ♦ • 9 9 · 9 9 · · · · * byla fřakcionovaná pomocí 1,5 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 400 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla z gelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny ve 20 μΐ TE pufru.

Plasmidy chATR5Hv/N5KGl (V) a chATR5Hv/N5KG4P byly štěpeny restriktázou BglII a restriktázou SplI (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1,5 hodiny. Štěpená směs byla fřakcionovaná pomocí 1,5 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 9 400 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla z gelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny ve 20 μΐ TE pufru.

SplI - BglII DNA fragment připravený jak bylo uvedeno výše, obsahující gen kódující V oblast L řetězce, chATR5Hv/N5KGl (V) a chATR5Hv/N5KG4P štěpené restriktázami SplI a BglII, byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JMI09 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny s LBA médiem (koncentrace ampicilinu 100pg/ml) a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 1 1 2xYT média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu, při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Plasmidy nesoucí geny kódující chimérickou ATR-5 protilátku byly pojmenovány jako chATR5/N5KGl (V) a chATR5/N5KG4P.

4. Transfekce COS-7 buněk

Pro zjištění vazebné aktivity antigenu a neutralizující aktivity chimemí protilátky, byly výše uvedené expresní plasmidy transfekovány do COS-7 buněk a protilátka byla tranzientně eprimována.

Plasmidy chATR5/N5KGl (V) a chATR5/N5KG4P byly do COS-7 buněk vneseny elektroporací pomocí elektroporátoru Gene Pulser Instrument (od firmy BioRad). 50 μg

4 4 44 4 »·

4 4 • 4 4 4 • 4 ·

4 4

4· 4··4 plasmidu bylo přidáno k 0,78 ml buněčné suspenze COS-7 buněk v Dulbecco PBS (-) (zde pod názvem PBS). Buňky v koncentraci 1 x 10⁷ buněk/ml byly elektroporovány pulzy 1 500 V s kapacitou 25 gF.

Po 10 minutách vzpamatování se buněk při pokojové teplotě, byly elektroporované buňky resuspendovány v DMEM médiu obsahujícím 5 % Ultra low IgG fetálního bovinního séra (od firmy GIBCO) a kultivovány v 10 cm petriho miskách v 5 % CO₂ atmosféře v inkubátoru. Po 24 hodinové kultivaci byl supernatant z kultury odstraněn a bylo přidáno bezsérové médium HBCHO (od firmy Irvine Scientific). Po další kultivaci po dobu 72 hodin byl supernatant sklizen a zcentrifugován, aby se odstranily zbytky buněk.

5. Purifikace protilátky

Pomocí Sepharose Fast Flow (od firmy Pharmacia Biotech) s navázaným rekombinantním proteinem A byla ze supematantu COS-7 buněk purifikována chimérická protilátka níže uvedeným způsobem.

ml Sepharose Fast Flow s navázaným rekombinantním proteinem A byl nanesen na kolonku, která byla ekvilibrována 10 objemy TBS. Supernatant z COS-7 buněk byl nanesen na ekvilibrovanou kolonku, která byla poté propláchnuta 10 objemy IBS.

Adsorbovaná frakce protilátky byla poté eluována pomocí 13,5 ml 2,5 mM HC1 (pH

3,0) a eluát byl okamžité neutralizován pomocí 1,5 ml 1M Tris-HCl (pH 8,0).

Při dvounásobné ultrafiltraci pomocí Centriprepu 100 (od firmy Amicon) byla protilátka rozpuštěna v 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) s 150 mM NaCl (zde roztok nazýván TBS), a nakonec byla zahuštěna na objem 1,5 ml.

6. Ustanovení stabilní linie CHO

Pro ustanovení stabilní linie produkující chimérickou protilátku byl výše uvedený expresní plasmid vnesen do CHO buněk (DG44) aklimatizovaných na CHO-S-SFMII bezsérové médium (od firmy GIBCO).

Plasmidy chATR5/N5KGl (V) a chATR5/N5KG4P byly linearizovány restriktázou

SspI (od firmy Takara Shuzo) a po extrakci fenolem a chloroformem byla DNA precipitována ethanolem. Linearizovaný plasmid byl do DG44 buněk vnesen elektroporací pomocí elektroporátoru Gene Pulser Instrument (od firmy BioRad). 10 gg plasmidu bylo přidáno k0,78 ml buněčné suspenze DG44 buněk PBS. Buňky v koncentraci 1 x 10⁷ buněk/ml byly elektroporovány pulzy 1 500 V s kapacitou 25 gF.

φ φ φ φ φ φφφ φ* φφφφ

Ρο 10 minutách vzpamatování se buněk při pokojové teplotě, byly elektroporované buňky resuspendovány vCHO-S-SFMII médiu obsahujícím hypoxantin/thymidin (od firmy GIBCO) a kultivovány na dvou 96-ti jamkových destičkách (od firmy Falcon) v 5 % CO₂ atmosféře v inkubátoru. Po jednom dni kultivace bylo médium nahrazeno selekčním médiem CHO-S-SFMH obsahujícím hypoxantin/thymidin (od firmy GIBCO) a 500 gg/ml geneticinu (G418 sulfát, od firmy GIBCO), pro selekci buněk, do kterých byl vnesen gen pro protilátku. Po výměně selekčního média byly buňky za dva týdny prohlíženy pod mikroskopem. V případě, že byl pozorován dostatečný růst, bylo mmožství produkované protilátky měřeno pomocí ELISA techniky, popsané níže, a buňky se silnou expresí protilátky byly vyselektovány.

Referenční příklad 5. Konstrukce humanizované protilátky

1. Konstrukce H řetězce humanizované protilátky

i. Konstrukce H řetězce humanizované protilátky, verze „a“

H řetězec humanizované ATR-5 protilátky byl vytvořen vnesením CD3 oblasti pomocí

PCR. Pro přípravu H řetězce humanizované protilátky, verze „a“, která má FR oblasti původem z lidské protilátky L39 130 (DDBJ, Gao L et al., nepublikováno, 1995) bylo použito 7 PCR primerů. CDR příměry hR5HvlS (sekvence č. 11), hR5Hv2S (sekvence č. 12) a hR5Hv4S (sekvence č. 13) představují sense DNA sekvenci, zatímco hR5Hv3A (sekvence č. 14) a hR5Hv5A (sekvence č. 15) představují antisense DNA sekvence. Každý primer nesl 18 až 35 bp komplementární sekvence na jeho obou koncích.

hR5HvlS byl navržen tak, aby nesl Kozákovu sekvenci (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol.,

196 : 947-950, 1987) a Sáli rozpoznávací místo. hR5Hv5A byl navržen tak, aby nesl Nhel rozpoznávací místo. Exogenní primer hRSHvPrS (sekvence č. 16) nesl sekvence homologní kCDR primeru hR5HvlS. Primer hR5HvPrA (sekvence č. 17) nesl sekvence homologní k CDR primeru hR5Hv5 A.

CDR primery hR5HvlS, hR5Hv2S, hR511v3A, hR5Hv4S a hR5Hv5A a exogenní primery hR5HvPrS a hR5HvPrA byly syntetizovány a purifikovány firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakce byla provedena pomocí KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), přičemž PCR roztoky obsahovaly 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH^ SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl₂, 2,5 ·* 4444 *4 ♦· ·«? ·4

4 4.4 44 · 4 4 9>

4·*4 · · * · 444

4· 44 ·· 44 4 4 44 4 · jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) a 5 pmol každého CDR primeru hRSHvlS, hR5Hv2S, hR5Hv3A, hR5Hv4S a hR5Hv5A v reakčním objemu 98 μΐ.

PCR reakce byly provedeny s tímto profilem: 5 cyklů při 94 °C, 30 vteřin, 50 °C, 1 minuta a 72 °C, 1 minuta. Po přidání exogenního primeru hR5HvPrS a hR5HvPrA běžela PCR reakce dalších 25 cyklů ve 100 μΐ se stejným teplotním PCR profilem.

DNA fragmenty, amplifikovány pomocí PCR, byly frakcionovány pomocí 2 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 430 bp byly z gelu vyříznuty a ke každému byly přidány 3 objemy (ml/g) ΊΈ pufru. Poté byla DNA z gelových řízků extrahována fenolem, fenol/chloroformem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté byla jejich 1/3 rozpuštěna v 17 μΐ vody.

PCR fragmenty a CVIDEC vektor, které byly připraveny digescí Nhel a Sáli byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JMI09 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny s LBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml LBA média při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti ve výše uvedených plasmidech byla určena pomocí Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy PerkinElmer) na přístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Jako sekvenační primery byly použity M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 4). Korektnost sekvence byla potvrzena čtením nukleotidové sekvence z obou stran.

Protože se před a za Eco T221 rozpoznávacím místem vyskytovaly mutace a/nebo delece, každý fragment se správnou sekvencí byl ligován a poté opět subklonován do CVIDEC pro určení nukleotidové sekvence. Plasmid se správnou sekvencí byl nazván hATR5Hva/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence

4« 4444 44 4 4 44 44 , „ 44 4 444 · 4 « ·

444 44444 44 4

44444*4444 « 4. 4 · 4 · 4 4 4 4

44 4 4 44 44 4 4 · 4 humanizované verze „a“ H řetězce plasmidu hATR5Hva/CVIDEC je uvedena pod číslem 18. Aminokyselinová sekvence verze „a“ je rovněž uvedena pod číslem 19.

ii Konstrukce humanizovaného H řetězce, verze „b“ a „c“.

Verze „b“ a „c“ byly připraveny nahrazením FR3 verze „a“ pomocí FR3 derivovaného z jiné lidské protilátky metodou FR-shuffling. Pro nahrazení FR3 verze „b“ FR derivovaného z lidské protilátky Z34 963 (DDBJ, Borretzen, M. et al., Proč. Nat. Sci.USA, 91:12 917-12 921, 1994) byly navrženy 4 primery na oblast kódující FR3. FR-shuffling primery F3FRRS (sekvence č. 20) a F3RFFA (sekvence č. 21) představují sense DNA sekvenci, zatímco F3RFFA (sekvence č. 22) a F3RFBA (sekvence č. 23) představuje antisense DNA sekvenci.

F3RFFS a F3RFFA mají sekvence komplementární navzájem, a na obou koncích nesou rozpoznávací sekvence pro Balí a Xhol. Pro nahrazení FR3 oblasti verze „c“ jinou, derivovanou z lidské protilátky P01 825 (Swissprot, Poljak RJ, et al., Biochemistry, 16:3 4123 420, 1977) byly navrženy 4 DNA primery pro FR3 kódující oblast. FR-shuffling primery F3NMFS (sekvence č. 24) a F3NMBS (sekvence č. 25) představují sense DNA sekvenci, zatímco F3NMFA (sekvence č. 26) a F3NMBA (sekvence č. 27) představují antisense DNA sekvenci. F3RFBS a F3RFBA mají navzájem komplementární sekvence a nesou rozpoznávací místa pro restriktázy Xhol a Ncol po obou koncích.

Primeiy F3RFFS, F3RFBS, F3RFFA, F3RFBA, F3NMFS, F3NMBS, F3NMFA a F3NMBA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech. Prmery F3RFFS a F3RFFA a F3RFBS a F3RFBA byly anelovány a digerovány restriktázami Balí a Xhol a Ncol a Xhol. Poté byly vneseny do plasmidu hATR5Hva/CVIDEC (Balí / Ncol), který byl připraven digescí Balí a Ncol. Konstrukt byl osekvenován. Plasmid se správnou nukleotidovou sekvencí byl nazván hATR5hvb/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence jsou uvedeny pod číslem 28. Aminokyselinová sekvence verze „b“ je rovněž uvedena pod číslem 29.

F3NMFS a F3NMFA, a F3NMBS a F3NMBA byly anelovány a digerovány restriktázami Balí a Xhol a Ncol a Xhol. Poté byly vneseny do plasmidu hATR5Hva/CVIDEC (Balí / Ncol), který byl připraven digescí Balí a Ncol. Konstrukt byl osekvenován. Plasmid se správnou nukleotidovou sekvencí byl nazván hATR5hvc/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „c“, obsažena v plasmidu hATR5hvc/CVIDEC, je uvedena pod číslem 30. Aminokyselinová sekvence verze „c“ je rovněž uvedena pod číslem 31.

•0 0000 ♦ ·

0* 00 00

0 0 0 • * 0 * · 0 00 00 0

000» · · 0 · » 0 0 • 0 00 00 00 00 0000 iii. Konstrukce humanizovaného H řetězce, verze ,,ď‘ a „e“.

Verze „d“ a „e“ byly připraveny nahrazením FR3 verze „a“ pomocí FR3 derivovaného z jiné bdské protilátky metodou FR-shuffling. Pro nahrazení FR3 verze „d“ FR derivovaného z lidské protilátky M62 723 (DDBJ, Pascual V. et al., J. Clin. Invest., 86:1 320-1 328, 1990) byly navrženy 4 primery na oblast kódující FR3. FR-shuffling primer F3EPS (sekvence č. 32) představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3EPA (sekvence č. 33) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt.

Exogenní primery F3PrS (sekvence č. 34) a F3PrA (sekvence č. 35) mají homologií s FR-shuffling primery F3EPS a F3FPA. Tyto primery lze rovněž použít pro další shuffling v rámci FR3 oblasti. Pro nahrazení FR3 verze „e“ FR3 oblastí derivovanou z jiné lidské protilátky Z80 844 (DDBJ, Thomsett AR. et al., nepublikováno) byly připraveny dva primery pro FR3 kódující oblast.

FR-shuffling primer F3VHS (sekvence č. 36) představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3VHA (sekvence č. 37) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt.

Primery F3EPS, F3EPA, F3PrS, F3PrA, F3VHS a F3VHA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakce byla provedena pomocí KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pomocí pufrů obsažených v kitu a obsahovala 5 μΐ každého 1 μΜ FR-shuffling primerů F3EPS a F3EPA anebo F3VHS a F3VHA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčním objemu 100 μΐ.

PCR reakce byly provedeny s tímto profilem: 5 cyklů při 94 °C, 30 vteřin, 50 °C, 1 minuta a 74 °C, 1 minuta. Po přidání 100 pmol exogenního primerů F3PrS a F3PrA, běžela PCR reakce dalších 25 cyklů ve 100 μΐ se stejným teplotním PCR profilem.

DNA fragmenty, amplifikované pomocí PCR, byly frakcionovány pomocí 2 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 424 bp byly z gelu vyříznuty a ke každému byly přidány 3 objemy (ml/g) TE pufru. Poté byla DNA z gelových řízků extrahována fenolem, fenol/chloroformem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté byla jejich 1/3 rozpuštěna ve 14 μΐ vody.

PCR směs byla digerována restriktázami Balí a Xhol. Poté byla vnesena do plasmidu hATR5Hva/CVIDEC (Balí / Ncol), který byl připraven digescí Balí a Ncol. Konstrukt byl osekvenován.

Η 9··· • · 9 · 9 9 9 0 0 0

9 9 · 9 999 9 9 ·

9 999 99 999 9 9

9999 9 9 9 9 9 9 9

90 09 09 09 9999

Plasmid se správnou nukleotidovou sekvencí byl nazván hATR5hvd/CVIDEC a hATR5hve/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „d“, obsažena v plasmidu hATR5hvd/CVIDEC, je uvedena pod číslem 38. Aminokyselinová sekvence verze „d“ je rovněž uvedena pod číslem 39. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „e“, obsažena v plasmidu hATR5hve/CVBDEC, je uvedena pod číslem 40. Aminokyselinová sekvence verze „e“ je rovněž uvedena pod číslem 41.

iv. Konstrukce humanizovaného H řetězce, verze „f ‘ a „g“.

Verze „f ‘ a „g“ byly připraveny nahrazením FR3 verze „a“ pomocí FR3 derivovaného z jiné lidské protilátky metodou FR-shuffling. Pro nahrazení FR3 verze „f“ FR derivovaného z lidské protilátky L04 345 (DDBJ, Hillson JL. et al. J. Ep. Med., 178:331-336, 1993) a pro nahrazení FR3 verze „g“ FR derivovaného z lidské protilátky S78 322 (DDBJ, Bejcek BE. et al., Cancer Res., 55:2 346-2 351, 1995) byly navrženy 2 primery na oblast kódující FR3. FRshuffling primer F3SSS (sekvence č. 42) verze „f‘ představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3SSA (sekvence č. 43) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt. Primer F3CDS (sekvence č. 44) verze „g“ představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3CDA (sekvence č. 45) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt.

Primery F3SSS, F3SSA, F3CDS a F3CDA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakce byla provedena pomocí KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pomocí pufrů obsažených vkitu a obsahovala 5 μί každého 1 μΜ FR-shuffling primerů F3SSS a F3SSA anebo F3CDS a F3CDA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčním objemu 100 μί.

PCR reakce byly provedeny s tímto profilem: 5 cyklů při 94 °C, 30 vteřin, 50 °C, 1 minuta a 74 °C, 1 minuta. Po přidání 100 pmol exogenního primerů F3PrS a F3PrA, běžela PCR reakce dalších 25 cyklů ve 100 μί se stejným teplotním PCR profilem.

DNA fragmenty, amplifikované pomocí PCR, byly frakcionovány pomocí 2 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 424 bp byly z gelu vyříznuty a ke každému byly přidány 3 objemy (ml/g) TE pufru. Poté byla DNA z gelových řízků extrahována fenolem, φφ φ·· · φ φ ·♦ ·· ·· • Φ φ φ φ φ φφφφ :··..: ; .* • »· * · »· · · · · ·· ·· ·· ·. .· ·♦·· fenol/chloroformem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté byla jejich 1/3 rozpuštěna ve 14 μΐ vody.

PCR směs byla digerována restriktázami Balí a Ncol. Poté byla vnesena do plasmidu hATR5Hva/CVIDEC (Balí / Ncol), který byl připraven digescí Balí a Ncol. Konstrukt byl osekvenován.

Plasmid se správnou nukleotidovou sekvencí byl nazván hATR5hvř7CVIDEC a hATR5hvg/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „f‘, obsažena v plasmidu hATR5hvf/CVIDEC, je uvedena pod číslem 46. Aminokyselinová sekvence verze „f‘ je rovněž uvedena pod číslem 47 Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „g“, obsažena v plasmidu hATR5hvg/CVIDEC, je uvedena pod číslem 48. Aminokyselinová sekvence verze „g“ je rovněž uvedena pod číslem 49.

v. Konstrukce humanizovaného H řetězce, verze „h“.

Verze „h“ byla připravena nahrazením FR3 verze „a“ pomocí FR3 derivovaného z jiné lidské protilátky metodou FR-shuffling. Pro nahrazení FR3 verze „h“ FR derivovaného z lidské protilátky Z26 827 (DDBJ, van Der Stoep et al. J. Exp. Med., 177.99-107, 1993) byly navrženy 2 primery na oblast kódující FR3. FR-shuffling primer F3ADS (sekvence č. 50) verze „h“ představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3ADA (sekvence č. 51) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt.

Primery F3ADS a F3ADA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakce byla provedena pomocí KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pomocí pufrů obsažených v kitu a obsahovala 5 μΐ každého 1 μΜ FR-shuffling primerů F3ADS a F3ADA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčním objemu 100 μΐ.

PCR reakce byly provedeny s tímto profilem: 5 cyklů při 94 °C, 30 vteřin, 50 °C, 1 minuta a 74 °C, 1 minuta. Po přidání 100 pmol exogenního primerů F3PrS a F3PrA, běžela PCR reakce dalších 25 cyklů ve 100 μΐ se stejným teplotním PCR profilem.

DNA fragmenty, amplifikované pomocí PCR, byly frakcionovány pomocí 2 % NuSieve GTG agarozové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 424 bp byly z gelu vyříznuty a ke každému byly přidány 3 objemy (ml/g) TE pufru. Poté byla DNA z gelových řízků extrahována fenolem, • 4 44 4 · • 4 •4 4 44444 44

4 4 44 44 444 4 4

44 4 4 44 4 4 44 • 4 44 44 44 44 »4« fenol/chloroformem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté byla jejich 1/3 rozpuštěna ve 14 μΐ vody.

PCR směs byla digerována restriktázami Balí a Ncol. Poté byla vnesena do plasmidu hATR5Hva/CVIDEC (Balí / Ncol), který byl připraven digescí Balí a Ncol. Konstrukt byl osekvenován.

Plasmid se správnou nukleotidovou sekvencí byl nazván hATR5hvf/CVlDEC a hATR5hvh/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „h“, obsažena v plasmidu hATR5hvh/CVIDEC, je uvedena pod číslem 52. Aminokyselinová sekvence verze „h“ je rovněž uvedena pod číslem 53.

vi. Konstrukce humanizovaného H řetězce, verze „i“ a, j“.

Verze „i“ a ,j“ byly připraveny nahrazením FR3 verze „a“ pomocí FR3 derivovaného z jiné lidské protilátky metodou FR-shuffling. Pro nahrazení FR3 verze „f‘ FR derivovaného z lidské protilátky u95 239 (DDBJ, Manheimer-Lory AJ., nepublikováno) a pro nahrazení FR3 verze ,j“ FR derivovaného z lidské protilátky L03 147 (DDBJ, Collect TA., Proč. Nati. Sci. USA, 89:10 026-10 030, 1992) byly navrženy 2 primery na oblast kódující FR3. FR-shuffling primer F3MMS (sekvence č. 54) verze „i“ představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3MMA (sekvence č. 55) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt. Primer F3CDS (sekvence č. 44) verze „g“ představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3CDA (sekvence č. 45) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt.

Primer F3BMS (sekvence č. 56) verze ,j“ představuje sense DNA sekvenci, zatímco F3BMA (sekvence č. 57) představuje antisense DNA sekvenci. 3' konce primerů nesou komplementární sekvenci dlouhou 18 nt.

Primery F3MMS, F3MMA, F3BMS a F3BMA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakce byla provedena pomocí KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pomocí pufrů obsažených v kitu a obsahovala 5 pl každého 1 μΜ FR-shuffling primerů F3MMS a F3MMA anebo F3BMS a F3BMA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM MgCl₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčním objemu 100 μΐ.

PCR reakce byly provedeny s tímto profilem: 5 cyklů při 94 °C, 30 vteřin, 50 °C, 1 minuta a 74 °C, 1 minuta. Po přidání 100 pmol exogenního primerů F3PrS a F3PrA, běžela PCR reakce dalších 25 cyklů se stejným teplotním PCR profilem.

• 4

4 4-4 4 4 4

4 44444 44 4

4 444 44 4 · 4 4 4

4444 4444 444

44 44 44 44 4444

DNA fragmenty, amplifikované pomocí PCR, byly frakcionovány pomocí 2 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 424 bp byly z gelu vyříznuty a ke každému byly přidány 3 objemy (ml/g) TE pufru. Poté byla DNA z gelových řízků extrahována fenolem, fenol/chloroformem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté byla jejich 1/3 rozpuštěna ve 14 μΐ vody.

PCR směs byla digerována restriktázami Balí a Ncol. Poté byla vnesena do plasmidu hATR5Hva/CVIDEC (Balí / Ncol), který byl připraven digescí Balí a Ncol. Konstrukt byl osekvenován.

Plasmid se správnou nukleotidovou sekvencí byl nazván hATR5hvi/CVTDEC a hATR5hvj/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „i“, obsažena v plasmidu hATR5hvi/CVIDEC, je uvedena pod číslem 58. Aminokyselinová sekvence verze „i“ je rovněž uvedena pod číslem 59. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze ,j“, obsažena v plasmidu hATR5hvj/CVIDEC, je uvedena pod číslem 60. Aminokyselinová sekvence verze, j“ je rovněž uvedena pod číslem 6L vii. Konstrukce humanizovaného H řetězce, verze „bl“ a „dl“.

Verze „bl“ a „dl“ byly připraveny nahrazením FR2 verze „b“ a „d“ pomocí FR2 derivovaného z jiné lidské protilátky metodou FR-shuffling. Pro nahrazení FR2 FR derivovaným z lidské protilátky P01 742 (Swissprot, Cunningham BA.et al., Biochemistry,

9:3 161-3 170, 1970) byly navrženy 2 primery na oblast kódující FR2. FR-shufiQing primer F2MPS (sekvence č. 62) představuje sense DNA sekvenci, zatímco F2MPA (sekvence č. 63) představuje antisense DNA sekvenci. Konce primerů nesou navzájem komplementární sekvence a rozpozvávací sekvence pro restriktázy EcoT221 a Balí po obou koncích.

Primery F2MPS a F2MPA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech. F2MPS a F2MPA byly anelovány a digerovány pomocí restriktáz EcoT221 a Balí. Byly vneseny do plasmidu hATR5Hvb/CVIDEC (EcoT221/BalI) a hATR5Hvd/CVIDEC (EcoT221/BalI), připraveného digescí enzymy EcoT221 a Balí. Konstrukty byly osekvenóvány.

Plasmidy se správnou nukleotidovou sekvencí byly nazvány hATR5hvbl/CVIDEC a hATR5hvdl/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „bl“, obsažena v plasmidu hATR5hvbl/CVIDEC, je uvedena pod číslem 64. Aminokyselinová sekvence verze „bl“ je rovněž uvedena pod číslem 65. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H

0» 00 0 0 • 0 0 0 « 4 ·

4 0 000 0* 0

0000 0000 400

90 09 09 00 0009 řetězce verze „dl“, obsažena v plasmidu hATR5hvdl/CVIDEC, je uvedena pod číslem 66. Aminokyselinová sekvence verze „dl“ je rovněž uvedena pod číslem 67.

viii. Konstrukce humanizovaného H řetězce, verze „b3“ a „d3“.

Verze „b3“ a „d3“ byly připraveny nahrazením FR2 verze „b“ a „d“ pomocí FR2 derivovaného z jiné lidské protilátky metodou FR-shuffling. Pro nahrazení FR2 pomocí FR derivovaného z lidské protilátky Z80 0844 (Thomsett AR. et al., nepublikováno) byly navrženy 2 primery na oblast kódující FR2. FR-shuffling primer F2VHS (sekvence č. 68) představuje sense DNA sekvenci, zatímco F2VHA (sekvence č. 69) představuje antisense DNA sekvenci. Konce primerů nesou navzájem komplementární sekvence a rozpozvávací sekvence pro restriktázy EcoT221 a Balí po obou koncích.

Primery F2VHS a F2VHA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech. F2MPS a F2MPA byly anelovány a digerovány pomocí restriktáz EcoT221 a Balí. Byly vneseny do plasmidu hATR5Hvb/CVIDEC (EcoT221/BalI) a hAIR5Hvd/CVIDEC (EcoT221ZBalI), připraveného digescí enzymy EcoT221 a Balí. Konstrukty byly osekvenovány.

Plasmidy se správnou nukleotidovou sekvencí byly nazvány hATR5hvb3/CVIDEC a hAIR5hvd3/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „b3“, obsažena v plasmidu hATR5hvb3/CVIDEC, je uvedena pod číslem 70. Aminokyselinová sekvence verze „b3“ je rovněž uvedena pod číslem 71. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „d3“, obsažena v plasmidu hATR5hvd3/CVIDEC, je uvedena pod číslem 72. Aminokyselinová sekvence verze „d3“ je rovněž uvedena pod číslem 73.

2. Konstrukce V oblasti humanizovaného L řetězce protilátky

i. Verze „a“

V oblast L řetězce humanizované protilátky ATR-5 byla připravena PCR amplifikací CDR oblasti. Pro přípravu L řetězce humanizované verze protilátky, verze „a“, nesoucích FR oblast původem z lidské protilátky Z37 332 (DDBJ, Welschof M. et al., J. Immunol. Methods, 179:203-214, 1995) bylo navrženo 7 PCR primerů.

CDR primer h5LvlS (sekvence č. 74) a primer h5Lv4 (sekvence č. 75) představují sense DNA sekvence, zatímco h5Lv2A (sekvence č. 76), h5Lv3A (sekvence č. 77) a h5Lv5A (sekvence č. 78) představují antisense DNA sekvence. Každý primer nese komplementární sekvenci dlouhou 20 nt po jeho obou koncích.

·*»· »· <99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 99 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 99 99 99 99 9999

Exogenní primery h5LvS (sekvence č. 79) a h5LvA (sekvence č. 80) nesou oblasti homologie s CDR primery h5LvlS a h5Lv5A.

Primery h5LvlS, h5Lv4, h5Lv2A, h5Lv3A, h5Lv5A, h5LvS h5LvA byly syntetizovány firmou Pharmacia Biotech.

PCR roztoky ve 100 μΐ obsahovaly 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KC1, 6 mM (NH4)₂ SO4, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), mM MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), 50 pmol CDR primerů h5LvlS, h5Lv2A h5Lv3A, h5Lv4S a h5Lv5a.

PCR reakce byly provedeny za použití DNA Thermal Cycler 480 (od firmy Perkin-Elmer), s tímto profilem: 5 cyklů při 94 °C, 30 vteřin, 50 °C, 1 minuta a 72 °C, 1 minuta pro nasednutí CDR primerů. Po přidání 100 pmol exogenních primerů h5LvS a h5LvA běžela PCR ještě dalších 30 cyklů s tímto teplotním profilem: 94 °C, 30 vteřin, 52 °C, 1 minuta a 72 °C, 1 minuta, pro amplifikaci pospojovaných DNA fragmentů.

PCR reakční směs byla byla frakcionovaná pomocí 3 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 400 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla zgelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem. PCR fragmenty byly připraveny digescí SplI (od firmy Takara Shuzo) a BglII (od firmy Takara Shuzo) při 37 oC po dobu 4 hodin. Restrikční směs byla extrahována fenolem a chloroformem a po ethanolové precipitaci DNA fragmentů byly tyto rozpuštěny v 10 μΐ ΊΈ pufru. SplI - BglII fragment kódující V oblast L řetězce humanizované protilátky, připravený výše uvedeným způsobem a CVIDEC vektor, připravený digescí SplI a BglII byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JMI09 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny s LBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml LBA média při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

ftft *· ft · · ftft ···· ft* ftft • ft ftftftft • · ft · · ··· · ft ft ftftftft ftftftft ftftft •ft ·· ftft ft* ftft ·*»·

Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti ve výše uvedených plasmidech byla určena pomocí Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy PerkinElmer) na přístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Jako sekvenační primery byly použity M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 4). Korektnost sekvence byla potvrzena čtením nukleotidové sekvence z obou stran.

Plasmid nesoucí gen kódující V oblast humanizovaného L řetězce protilátky, nesoucí BglII rozpoznávací sekvenci a Kozákovu sekvenci na 5' konci a SplI rozpoznávací sekvenci na 3' konci byl pojmenován jako hATR5Lva/CVIDEC.

Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného L řetězce verze „b3“, obsažena v plasmidu hATR5hvb3/CVIDEC, je uvedena pod číslem 70. Aminokyselinová sekvence verze „b3“ je rovněž uvedena pod číslem 71. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného H řetězce verze „a“, je uvedena pod číslem 81. Aminokyselinová sekvence verze „a“ je rovněž uvedena pod číslem 82.

ii. Verze „b“ a „c“

Verze „b“ a „c“ byly připraveny nahrazením FR3 verze „a“ pomocí FR3 derivovaného z jiné lidské protilátky metodou FR-shuffling. Pro verzi „b“ byl použit FR3 derivovaný z lidské protilátky S68 699 (DDBJ, Hougs L. et al., Exp. Clin. Immunogen, 10:141-151, 1993)) a pro verzi „c“ byl použit FR3 derivovaný z lidské protilátky P01 607 (Swissprot, Epp O. et al., Biochemistry, 14:4 943-4 952).

Primer F3SS (sekvence Č. 83) a F3SA (sekvence č. 84), navrženy na kódující oblast FR3 verze „b“, a primery F3RS (sekvence č. 85) a F3RA (sekvence č. 86), navrženy na kódující oblast FR3 verze „c“, nesou sekvence komplementární k sobě navzájem a rovněž nesou rozpoznávací sekvence pro restriktázy KpnI a Pstl na obou koncích.

Primery F3SS, F3SA, F3RS a F3RA byly syntetizovány a purifikovány firmou Pharmacia Biotech.

100 pmol primeru F3SS a F3SA, F3RS a F3RA bylo anelováno tímto způsobem: 2 minuty při 96 °C a poté 2 minuty při 50 °C. Tato procedura připravila dvouřetězcové DNA fragmenty.

Tyto dvouřetězcové fragmenty byly digerovány restriktázami KpnI (od firmy Takara

Shuzo) při teplotě 37 °C 1 hodinu a poté restriktázou Pstl, při teplotě 37 °C 1 hodinu.

·· ·· • ·· • · • to «··· ·· ·· • · · · to · • to to · to ··· ·· ··· ·· ··· · · ···· ···· ··· ·· toto ·« to· ·· ····

Restrikční směs byla extrahována fenolem a chloroformem, poté precipitována ethanolem a rozpuštěna v TE pufru.

Plasmid hATR5Lva/CVIDEC byl štěpen restriktázou KpnI (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny, a poté restriktázou Pstl při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 1,5 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 3 000 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla z gelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny v TE pufru.

KpnI - Pstl DNA fragment oblast FR3 verze „b“ anebo „c“, připravený výše uvedeným způsobem a hATR5Lva/CVIDEC vektor, ze kterého byl digescí KpnI a Pstl odstraněn původní FR3 region, byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JMI09 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny s LBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml LBA média při teplotě 37 °C.

Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti ve výše uvedených plasmidech byla určena pomocí Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy PerkinElmer) na přístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Jako sekvenační primery byly použity M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 4). Korektnost sekvence byla potvrzena čtením nukleotidové sekvence z obou stran.

Plasmid, který nese gen kódující verzi „b“ anebo verzi „c“, ve kterých FR3 L řetězce humanizované protilátky verze „a“ byl nahrazen, byl nazván hATR5Lvb/CVIDEC a hATR5Lvc/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného L řetězce verze „b“, obsažena v plasmidů hATR5Lvb/CVIDEC je uvedena pod číslem 87. Aminokyselinová sekvence verze „b“ je rovněž uvedena pod číslem 88. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného L • · · · • · • · · · · · · · · ·

řetězce verze „c“, obsažena v plasmidu hATR5Lvc/CVIDEC, je uvedena pod číslem 89. Aminokyselinová sekvence verze „c“ je rovněž uvedena pod číslem 90.

iii. Verze „bl“ a „b2“

Verze „bl“ a „b2“ byly připraveny nahrazením FR2 verze „b“. Pro verzi „bl“ byl použit FR2 derivovaný z lidské protilátky S65 921 (DDBJ, Tonge DW., et al., Year Immunol., 7:56-62, 1993) a pro verzi „b2c“ byl použit FR2 derivovaný z lidské protilátky X93 625 (DDBJ, Cox JP et al., Eur. J. Immunol., 24:827-836, 1994).

Primer F2SS (sekvence č. 91) a F2SA (sekvence č. 92), navrženy na kódující oblast FR2 verze „bl“, a primery F2XS (sekvence č. 93) a F2XA (sekvence č. 94), navrženy na kódující oblast FR2 verze „b2“, nesou sekvence komplementární k sobě navzájem a rovněž nesou rozpoznávací sekvence pro restriktázy AfUI a Spěl na obou koncích.

Primery F2SS, F2SA, F2XS a F2XA byly syntetizovány a purifikovány firmou Pharmacia Biotech.

100 pmol primerů F2SS a F2SA, F2XS a F2XA bylo anelováno tímto způsobem: 2 minuty při 96 °C a poté 2 minuty při 50 °C. Tato procedura připravila dvouřetězcové DNA fragmenty.

Tyto dvouřetězcové fragmenty byly digerovány restriktázami Afin (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C 1 hodinu a poté restriktázou Spěl, při teplotě 37 °C 1 hodinu. Restrikční směs byla extrahována fenolem a chloroformem, poté precipitována ethanolem a rozpuštěna v TE pufru.

Plasmid hATR5Lvb/CVIDEC byl štěpen restriktázou AflH (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny, a poté restriktázou Spěl při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny. Štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 1,5 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 3 000 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla z gelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny v TE pufru.

AflII - Spěl DNA fragment kódující oblast FR3 verze „bl“ anebo „b2“, připravený výše uvedeným způsobem a hATR5Lvb/CVIDEC vektor, ze kterého byl digescí AflII a Spěl odstraněn původní FR2 region, byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JMI09 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

• ·

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny s LBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E. coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 3 ml LBA média při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti ve výše uvedených plasmidech byla určena pomocí Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy PerkinElmer) na přístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Jako sekvenační primery byly použity M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvence č. 4). Korektnost sekvence byla potvrzena čtením nukleotidové sekvence z obou stran.

Plasmid, který nese gen kódující verzi „bl“ anebo verzi „b2“, ve kterých FR2 L řetězce humanizované protilátky verze „b“ byl nahrazen, byl nazván hATR5Lvbl/CVIDEC a hATR5Lvb2/CVIDEC. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného L řetězce verze „bl“, obsažena vplasmidu hATR5Lvbl/CVIDEC je uvedena pod číslem 95. Aminokyselinová sekvence verze „bl“ je rovněž uvedena pod číslem 96. Nukleotidová sekvence a korespondující aminokyselinová sekvence humanizovaného L řetězce verze „b2“, obsažena v plasmidu hATR5Lvb2/CVIDEC, je uvedena pod číslem 97. Aminokyselinová sekvence verze „b2“ je rovněž uvedena pod číslem 98.

3. Konstrukce expresního vektoru humanizované protilátky

i. Kombinace humanizovaného H řetězce a chimérického L řetězce

Plasmid hATR5Hva/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chATR5/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chATR5/N5KG4P je expresní vektor pro chATR-5 protilátku. Takto vytvořený plasmid byl nazván hHva-chLv/N5KG4P.

Plasmid hATR5Hvb/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chATR5/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chATR5/N5KG4P je expresní vektor pro chATR-5 protilátku. Takto vytvořený plasmid byl nazván hHvb-chLv/N5KG4P.

······«· ·· «· «· ·· * ··· ···· i i ·. · í j ;··. . : : .·

Plasmidy hATR5Hvc/CVIDEC, hATRSHvd/CVIDEC a hATR5Hve/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chATR5/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chATR5/N5KG4P je expresní vektor pro chATR-5 protilátku. Takto vytvořený plasmid byl nazván hHvc-chLv/N5KG4P, hHvd-chLv/N5KG4P a hHve-chLv/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvf/CVIDEC a hATR5Hvh/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chATR5/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chATR5/N5KG4P je expresní vektor pro chATR-5 protilátku. Takto vytvořený plasmid byl nazván hHvf-chLv/N5KG4P a hHvh-chLv/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvi/CVIDEC a hATR5Hvj/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chATR5/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chATR5/N5KG4P je expresní vektor pro chATR-5 protilátku. Takto vytvořený plasmid byl nazván hHvi-chLv/N5KG4P a hHvj-chLv/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvdl/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chATR5/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chATR5/N5KG4P je expresní vektor pro chATR-5 protilátku. Takto vytvořený plasmid byl nazván hHvbl-chLv/N5KG4P a hHvdlchLv/N5KG4P.

ii. Kombinace L řetězce humanizované protilátky s H řetězcem chimérické protilátky

Pomocí expresního vektoru N5KG4P pro protilátku byla provedena kombinace L řetězce humanizované protilátky s H řetězcem chimérické protilátky.

Plasmidy hATR5Lva/CVIDEC, hATR5Lvb/CVIDEC, hATRSLvc/CVEDEC, hATR5I.vbl/CVIDEC a hATR5Lvb2/C VIDEC byly štěpeny restriktázou BglII (od firmy Takara Shuzo) a restriktázou SplI (od firmy Takara Shuzo) při teplotě 37 °C po dobu 2 až 3 hodin.

Štěpená směs byla frakcionovaná pomocí 1,5 anebo 2 % NuSieve GTG agarózové gelové elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Proužky obsahující DNA o velikosti kolem 400 bp byly z gelu vyříznuty. DNA byla zgelových řízků extrahována fenolem a chloroformem, DNA fragmenty byly precipitovány ethanolem a poté rozpuštěny v TE pufru.

SplI - BglII DNA fragment obsahující gen pro V region L řetězce humanizované protilátky každé z verzí a hATR5Hv/N5KG4P vektor, upravený digescí SplI a BglII, byly ligovány pomocí DNA ligačního kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) při teptlotě 16 °C po dobu 1 hodiny, podle instrukcí obsažených v kitu.

Ligační směs byla přidána ke 100 μΐ JMI09 kompetentních buněk E.coli (od firmy Nippogene) a byla inkubována po dobu 30 minut na ledu a 1 minutu při 42 °C.

Poté bylo k bakteriím přidáno 300 μΐ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a směs byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byly E.coli naneseny na agarové plotny s LBA médiem a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Za tuto dobu na plotně narostly kolonie transformovaných E.coli.

Transformanty byly pěstovány přes noc ve 250 anebo 500 ml LBA média při teplotě 37 °C. Z buněčných extraktů byla poté izolována plasmidová DNA pomocí QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Plasmidy, do kterých byl vnesen gen pro chimérický H řetězec a humanizovaný L řetězec byly pojmenovány chHv-hLvb/N5KG4P, chHv-hLvc/N5KG4P,chHv-hLvbl/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P.

iii. Kombinace humanizovaného H řetězce s humanizovaným L řetězcem

Plasmid hATR5Hva/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do hLva/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHv-hLva/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chHv-hLva/N5KG4P nese cDNA sekvenci L řetězce humanizované ATR-5 protilátky, verze „a“. Takto vytvořený plasmid byl nazván hHva-hLva/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvb/CVIDEC a hATR5Hvc/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byly digerovány enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do hLva/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHvhLva/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chHv-hLva/N5KG4P nese cDNA sekvenci L řetězce humanizované ATR-5 protilátky, verze „a“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány hHvbhLva/N5KG4P a hHvc-hLva/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvb/CVIDEC, hATR5Hvd/CVIDEC a hATR5Hve/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byly digerovány enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce • · · · humanizované protilátky byl vnesen do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHv-hLva/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chHv-hLvb/N5KG4P nese cDNA sekvenci L řetězce humanizované ATR-5 protilátky, verze „b“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány hHvb-hLvb/N5KG4P, hHvd-hLvb/N5KG4P a hHve-hLvb/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvf/CVlDEC, hATR5Hvg/CVIDEC a hATR5Hvh/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byly digerovány enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHv-hLvb/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chHv-hLvb/N5KG4P nese cDNA sekvenci L řetězce humanizované ATR-5 protilátky, verze „b“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány hHvf-hLvb/N5KG4P, hHvg-hLvb/N5KG4P a hHvh-hLvb/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvi/CVIDEC a hATR5Hvj/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byly digerovány enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do bLvb/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHvhLvb/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chHv-hLvb/N5KG4P nese cDNA sekvenci L řetězce humanizované ATR-5 protilátky, verze „b“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány hHvihLvb/N5KG4P a hHvj-hLvb/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvdl/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byly digerovány enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHvhLvb/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chHv-hLvb/N5KG4P nese cDNA sekvenci L řetězce humanizované ATR-5 protilátky, verze „b“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány hHvbbLvbl/N5KG4P a bHvdl-bLvb/N5KG4P.

Plasmidy hATR5Hvb3/CVIDEC a hATR5Hvd3/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byly digerovány enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHvhLvb/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. chHv-hLvb/N5KG4P nese cDNA sekvenci L řetězce humanizované ATR-5 protilátky, verze „b“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány hHvbhLvb3/N5KG4P a hHvd3-hLvb/N5KG4P.

Plasmid hATR5Hvb/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do hLvbl/N5KG4P (Sall/Nhel) a hLvb2/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHvhLvbl/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. Tyto plasmidy nesou cDNA sekvence L řetězců humanizované ATR-5 protilátky, verze „bl“ a „b2“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány bHvb-hLvbl/N5KG4P a hHvb-hLvb2/N5KG4P,

99 9 9 9 tt 99 99 • 9 9 9 9 9 9 9

Plasmid hATR5Hvi/CVIDEC nesoucí V oblast H řetězce byl digerován enzymy Nhel a Sáli a cDNA fragment V oblasti H řetězce humanizované protilátky byl vnesen do hLvbl/N5KG4P (Sall/Nhel) a hLvb2/N5KG4P (Sall/Nhel), připraveného digescí chHvhLvbl/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P enzymy Nhel a Sáli. Tyto plasmidy nesou cDNA sekvence L řetězců humanizované ATR-5 protilátky, verze „bl“ a „b2“. Takto vytvořené plasmidy byly nazvány hHvi-hLvbl/N5KG4P a hHvi-hLvb2/N5KG4P.

4. Transfekce COS-7 buněk

Pro zjištění vazebné aktivity antigenů a neutralizující aktivity humanizované protilátky, byly výše uvedené expresní plasmidy transfekovány do COS-7 buněk a protilátka byla tranzientně eprimována.

Expresní plasmidy byly do COS-7 buněk vneseny elektroporací pomocí elektroporátoru Gene Pulser Instrument (od firmy BioRad). 20 anebo 50 pg plasmidu bylo přidáno k0,78 ml buněčné suspenze COS-7 buněk v PBS. Buňky v koncentraci 1 x 10⁷ buněk/ml byly elektroporovány pulzy 1 500 V s kapacitou 25 pF.

Po 10 minutách vzpamatování se buněk při pokojové teplotě, byly elektroporované buňky resuspendovány v DMEM médiu obsahujícím 5 % Ultra low IgG fetálního bovinního séra (od firmy GIBCO) a kultivovány v 10 anebo 15 cm petriho miskách v 5 % CO₂ atmosféře v inkubátoru. Po 24 hodinové kultivaci byl supematant z kultury odstraněn a bylo přidáno bezsérové médium HBCHO (od firmy Irvine Scientific). Po další kultivaci po dobu 72 hodin byl supematant sklizen a zcentrifugován, aby se odstranily zbytky buněk.

5. Purifíkace protilátky

Ze supematantu COS-7 buněk byla pomocí Affigel Protein A MAPSII kitu (od firmy Bio Rad) anebo Sepharose Fast Flow (od firmy Pharmacia Biotech) s navázaným rekombinantním proteinem A purifíkována chimérická protilátka. Purifíkace pomočí Affigel Protein MAPSII kitu byla provedena podle instrukcí uvedených v kitu. Purifíkace pomocí Sepharose Fast Flow s navázaným rekombinantním proteinem A byla provedena následujícím způsobem:

ml Sepharose Fast Flow s navázaným rekombinantním proteinem A byl nanesen na kolonku, která byla ekvilibrována 10 objemy TBS. Supematant z COS-7 buněk byl nanesen na ekvilibrovanou kolonku, která byla poté propláchnuta 10 objemy TBS.

Adsorbovaná frakce protilátky byla poté eluována pomocí 13,5 ml 2,5 mM HC1 (pH 3,0) a eluát byl okamžité neutralizován pomocí 1,5 ml 1M Tris-HCI (pH 8,0).

• · · ·

Při dvou - anebo trojnásobné ultrafiltraci pomocí Centriprepu 30 anebo 100 (od firmy Amicon) byla protilátka v TBS a nakonec byla zahuštěna na objem 1,5 ml.

Referenční příklad 6. Kvantifikace protilátky a měření její aktivity

1. Měření koncentrace protilátky metodou ELISA

ELISA destičky pro měření koncentrace protilátky byly připraveny následujícím způsobem: Na každou jamku 96-ti jamkové destičky (Maxisorp, NUNC) bylo imobilizováno 100 μΐ kozí protilátky proti lidskému IgGy (od firmy BIO SOURCE), naředěné na koncentraci 1 pg/ml v imobilazačním pufru (0,1 M NaHCO3, 0,02 % NaN₃, pH 9,6 , pufr nazýván CB). Po blokování pomocí 200 μΐ dilučního pufru (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 M NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN3, 1 % bovinní sérový albumin (BSA), pH 8,1, pufr nazýván DB) byl buněčný supematant z COS-7 buněk, které exprimovaly protilátku sériově naředěn pomocí DB pufru a poté nakapán do každé jamky.

Po 1 hodinové inkubaci při pokojové teplotě a po oplachování PBS s 0,05 % Tween 20 (pufr nazýván RB), bylo k reakci přidáno 100 μΐ kozí anti-lidské IgGy protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), která byla naředěna 1 OOO-krát pomocí DB pufru. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny, následované oplachem pufrem RB, byl přidán Sigma 104 (p-nitrofenylfosfát, od firmy SIGMA), který byl rozpuštěn v substrátovém pufru (50 mM NaHCO3, 10 mM MgCf, pH 9,8) na koncentraci 1 mg/ml. Poté byla pomocí Microplate Reader (od firmy Bio Rad) měřena absorbance při vlnové délce 405/655 nm. Jako standard pro měření koncentrace byla použita protilátka IgG4x (od firmy Binding Site).

2. Měření antigen-vazebné aktivity

Destičky pro ELISA test měření antigen-vazebné aktivity byly připraveny následujícím způsobem: Použité buňky byly buňky lidského karcinomu močového měchýře J82 (ATTC HTB-1). Na 60 jamek 96-ti jamkové destičky byly vysety buňky v denzitě 1 x 10⁵ buněk/jamku. Buňky byly jeden den kultivovány vRPMI 1 640 médiu s 10 % fetálním bovinním sérem (od firmy GIBCO), v termostatu s CO₂ do té doby, až si buňky sedly. Po odstranění supematantu byla každá jamka 2x propláchnuta 300 μΐ PBS. 100 μΐ PBS obsahující 4 % paraformaldehyd (zde nazýván jako PFA/PBS) byl přidán do každé jamky a destička byla na 10 minut umístěna na led, pro dostatečnou imobilizaci.

··*· ·· 99 ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 ' 9 9 9 999 9 9 9

PFA/PBS byl odstraněn a každá jamka byla dvakrát propláchnuta 300 μΐ PBS. Poté byly jamky blokovány 250 μΐ pufru DB. Supernatant z kultury byl sériově naředěn pomocí pufru DB, 100 μΐ na každou jamku. Po dvouhodinové inkubaci při pokojové teplotě, následoval oplach pufrem RB. Poté bylo přidáno 100 μΐ kozí anti-lidské IgGy protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), která byla naředěna 1 OOO-krát pomocí DB pufru. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny, následované oplachem pufrem RB, byl přidán roztok substrátu. Poté byla pomocí Microplate Reader (od firmy Bio Rad) měřena absorbance při vlnové délce 405/655 nm.

3. Měření neutralizující aktivity

Neutralizační aktivita myší protilátky, chimérické protilátky a humanizované protilátky byla měřena pomocí inhibiční aktivity na produkci faktoru Xa, s tkáňovým tromboplastinem derivovaným z lidské placenty (Thromborel S, od firmy Boehringer, AG) jako standardem. 60 μΐ pufru (TMS obsahující 5 mM CaC12, a 0,1 % BSA) bylo přidáno k 10 μΐ Thromborelu S v koncentraci 1,25 mg/ml a 10 ml vhodně naředěné protilátky. Reakce probíhala na 96- ti jamkové destičce po dobu 1 hodiny. K reakci bylo přidáno 10 μΐ 3,245 pg/ml lidského faktoru X (od firmy Celsus Laboratories) a 82,5 ng /ml lidského faktoru Vila (od firmy Enzyme Research). Následovala inkubace při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Pro zastavení reakce bylo přidáno 10 μΐ 0,5 M EDTA. Poté bylo k reakci přidáno 50 μΐ chromogenního substrátu a pomocí Microplate Reader (od firmy Bio Rad) byla měřena absorbance při vlnové délce 405/655 nm. Po inkubaci 1 hodinu při pokojové teplotě byla absorbance při 405/655 nm měřena znovu. Neutralizační aktivita byla určena jako procento reziduální aktivity při každé změně absorbance v průběhu hodinovébo měření, přičemž 100 % aktivita byla přisouzena vzorečku, kde nebyla přidána protilátka.

Roztok chromogenního substrátu byl připraven ředěním Testzyme chromogenního substrátu S-2 000 (Chromogenix) podle návodu udaného výrobcem, a to tak, že byl 2-krát naředěn destilovanou vodou a smíchán s roztokem polybrenu (0,6 mg/ml hexadimethylenbromid, od firmy SIGMA) v poměru 1:1.

4. Měření aktivity

i. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „a“ a chimérického L řetězce

Byla připravena protilátka (a - ch), která obsahuje humanizovaný H řetězec verze „a“, kombinovaný s chimérickým L řetězcem. Tato protilátka byla testována na svojí vazebnou ♦ ·0

aktivitu k antigenu pomocí ELISA techniky. Množství navázané na antigen se se zvyšující se koncentrací snižovalo. Neutralizační aktivita pro antigen inhibicí produkce FXa byla slabá ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou představovala chimérická protilátka (ch -ch). Bylo tudíž rozhodnuto, že se pomocí metody FR-shuffling připraví zlepšená verze humanizovaného H řetězce. Chimérická protilátka použitá zde byla exprimována v COS-7 buňkách, purifikována a měřená.

ii. Kombinace humanizovaného L řetězce verze „a“ a chimérického H řetězce.

Byla připravena protilátka (a - ch), která obsahuje humanizovaný H řetězec verze „a“, kombinovaný s chimérickým L řetězcem. Vazebná aktivita této protilátky k antigenu byla testována pomocí ELISA techniky. Bylo zjištěno, že má vazebnou aktivitu stejnou anebo vyšší než je aktivita chimérické protilátky. Na druhou stranu, neutrahzující aktivita proti antigenu byla ve srovnání s kontrolní chimérickou protilátkou nízká. Bylo tudíž rozhodnuto, že se pomocí metody FR-shuffling připraví zlepšená verze humanizovaného L řetězce. Chimérická protilátka použitá zde byla exprimována v COS-7 buňkách, purifikovaná a měřená.

iii. Kombinace humanizované verze „a“ H řetězce a humanizované verze „a“ L řetězce.

Byla připravena protilátka (a - a), která obsahuje humanizovaný H řetězec verze „a“, kombinovaný s humanizovaným L řetězcem verze „a“. Vazebná aktivita této protilátky k antigenu byla testována pomocí ELISA techniky. Bylo zjištěno, že množství navázané na antigen se se zvyšující se koncentrací snižovalo. Neutralizační aktivita pro antigen inhibicí produkce FXa byla slabá ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou představovala chimérická protilátka. Bylo tudíž rozhodnuto, že se pomocí metody FR-shuffling připraví zlepšená verze humanizovaného H a L řetězce. Chimérická protilátka použitá zde byla exprimována v COS-7 buňkách, purifikovaná a měřená.

iv. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „b“, „c“ a „d“ a chimérického L řetězce.

Metodou FR-shuffling byly připraveny zlepšené verze protilátek („b-ch“, „c-ch“ a „dch“), nesoucí humanizovaný H řetězec a chimérický L řetězec. Vazebná aktivita těchto protilátek k antigenu byla testována pomocí ELISA techniky. Bylo zjištěno, že „d-ch“ měla vazebnou aktivitu stejnou jako chimérická protilátka, a „b-ch“ a „c-ch“ měly mírně nižší aktivity. Na druhou stranu, neutralizační aktivita proti antigenu ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou představovala chimérická protilátka, byla přibližně stejná v případě „b-ch“ a mírně slabší v případě „d-ch“. Aktivita verze „c-ch“ byla signifikantně nižší než aktivita chimérické protilátky. Tudíž, bylo zjištěno, že humanizované H řetězce verzí „b“ a „d“ mají vysoké aktivity.

v. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „b“ a humanizovaného L řetězce verze „a“.

Metodou FR-shuffling byla připravena zlepšená verze protilátky, nesoucí humanizovaný H řetězec verze „b“ a chimérický L řetězec verze „a“. Vazebná aktivita těchto protilátek k antigenu byla testována pomocí ELISA techniky. Bylo zjištěno, množství protilátky navázané na antigen se snižovalo se zvyšující se koncentrací. Na druhou stranu, neutralizační aktivita proti antigenu ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou představovala chimérická protilátka, byla signifikantně slabší. Tudíž, bylo zjištěno, že verze „b-a“ a „a-a“ mají vysoké aktivity. Chimérická protilátka použitá zde byla exprimována v COS-7 buňkách, purifikovaná a měřená.

vi. Kombinace humanizovaného L řetězce verze „b“ a „c“ chimérického H řetězce.

Byla připravena protilátka („ch-b“ a „ch-c“), která obsahuje humanizovaný L řetězec verze „b“ a „c“, kombinovaný s chimérickým H řetězcem. Bylo zjištěno, že obč verze mají vazebnou aktivitu k antigenu a neutralizaující aktivitu proti antigenu stejnou jako chimérická protilátka. Na základě tohoto zjištění byly verze „b“ a „c“ vybrány jako kandidátní pro přípravu L řetězce humanizované protilátky. Verze „b“ odvozená od myší protilátky, která je o jednu aminokyselinu kratší, je ohledně antigenicity pokládána za nejlepší. Chimérická protilátka použitá zde byla exprimována v CHO buňkách DG44, purifikována a změřena. Ve všech dalších měřeních byla tato protilátka použita jako pozitivní kontrola.

vii. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „b“ a humanizovaného L řetězce verze „b“a„c“.

Byly připraveny protilátky („b-b“ a „b-c“), které nesou humanizovaný H řetězec verze „b“ a humanizovaný L řetězec verze „b“ a „c“. Tyto protilátky byly testovány na antigen vazebnou aktivitu a antigen-neutralizační aktivitu. Obě se vyznačovaly mírně sníženou aktivitou než chimérická protilátka, a to v obou testovaných aktivitách.

viii. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „b“ a „d“ a humanizovaného L řetězce verze „b“.

Metodou FR-shuffling byly připraveny zlepšené verze protilátek („b-b“ a „d-b“), nesoucí humanizovaný H řetězec a humanizovaný L řetězec verze „b“. Vazebná aktivita

9 9·· * ·· ·· 99 99 • 9 9 9 9 9 9 • 9 999 99 9

99 9 9 0 9 9 •• 9 9 9 9 9 ·· ·9 99 999» těchto protilátek k antigenů byla testována pomocí ELISA techniky. Bylo zjištěno, že „d-b“ měla vazebnou aktivitu stejnou jako chimérická protilátka, a „b-b“ měla mírně nižší aktivitu.

Na druhou stranu, neutralizační aktivita proti antigenů ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou představovala chimérická protilátka, byla mírně slabší v případě „b-b“ a signifikantně nižší v případě „d-b“. Tudíž, bylo zjištěno, že verze „b-b“ představuje protilátku s vysokou antigen neutralizující aktivitou, zatímco verze „d-b“ představuje protilátku s vysokou vazebnou aktivitou k antigenů.

ix. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „e“ a chimérického L řetězce a humanizovaného L řetězce verze „b“

Byly připraveny protilátky („e-ch“ a „e-b“), které obsahovaly humanizovaný H řetězec verze „e“, kombinovaný s chimérickým L řetězcem a humanizovaným L řetězcem verze „b“ Verze „e-ch“ se vyznačovala stejnou vazebnou aktivitou k antigenů, jakou se vyznačovala chimérická protilátka, ale exprese „e-b“ protilátky byla příliš slabá a většina vazebné aktivity se stratila. Antigen neutralizující aktivita verze „e-ch“ byla signifikantně nižší než aktivita chimérické protilátky. Bylo tudíž uzavřeno, že kombinace H řetězce verze „e“ a L řetězce verze „b“ není šťastná a protilátka není funkční.

x. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „f“, „g“ a „h“ a humanizovaného L řetězce verze „b“.

Byly připraveny protilátky („f-b“, „g-b“ a „h-b“), které obsahovaly humanizovaný H řetězce verze „f ‘, „g“ a „h“, kombinovaný s humanizovaným L řetězcem verze „b“. V případě verze „f-b“ a „h-b“ bylo množství exprimované protilátky velmi malé. Byly připraveny protilátky verze „f“ a „h“, kombinované s chimérickým L řetězcem, nicméně nedocházelo k jejích expresi. Verze „g-b“ dosáhla saturace pří nízkých koncentracích, a vyznačovala se nižší vazebnou aktivitou, než chimérická protilátka. Antigen neutralizační aktivita verze „g-b“ byla signifikantně slabší než aktivita chimérické protilátky.

xi. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „bl“ a „dl“ a humanizovaného L řetězce verze „b“

Byly připraveny protilátky („bl-b“ a „dl-b“), které nesly humanizovaný H řetězec verze „bl“ a „dl“, kombinovaný s humanizovaným L řetězcem verze „b“. Tyto protilátky byly sice připraveny, ale nebyly exprimovány.

44 > 4· <

4

444 * ·999 • * 4 : :

4 4 4

4 9 9 xii. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „b3“ a „d3“ a humanizovanéh L řetězce verze „b“.

Byly připraveny protilátky („b3-b“ a „d3-b“), které nesly humanizovaný H řetězec verze „b3“ a „d3“, kombinovaný s humanizovaným L řetězcem verze „b“ Antigen vazebná aktivita verze „d3-b“ byla mírně nižší než aktivita chimérické protilátky. Antigen vazebná aktivita verze „b3-b“ byla ještě mnohem nižší. Antigen neutrabzující aktivita verze „b3-b“ byla vyšší než aktivita verze „b-b“, ale byla nižší než aktivita chimérické protilátky a verze „d3-b“ a „b-b“ měly aktivitu stejnou.

xiii. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „i“ a ,j“ a chimérického L řetězce a humanizovaného L řetězce verze „b“.

Byly připraveny protilátky („i-ch“ a ,j-ch“'), které nesly humanizovaný H řetězec verze „i“ a ,j“, kombinovaný s chimérickým L řetězcem a protilátky („i-b“ a ,j-b“), kombinované s humanizovaným L řetězcem verze „b“ Protilátky byly testovány na antigen vazebnou aktivitu a antigen neutrabzující aktivitu. Antigen vazebná aktivita všech protilátek byla přibbžně stejná jako aktivita chimérické protilátky. Verze „i-ch“ měla antigen neutralizující aktivitu vyšší než chimérická protilátka. Verze „i-b“ měla antigen neutralizující aktivitu stejnou jako chimérická protilátka a verze ,j-b“ měla signifikantně nižší antigen neutrabzující aktivitu než chimérická protilátka.

xiv. Humanizovaný L řetězec verze „bl“ a „b2“.

Když byly připraveny protilátky („ch-bl“ a „ch-b2“), které nesly humanizovaný L řetězec verze „bl“ a „b2“, kombinovaný s chimérickým H řetězcem, bylo zjištěno, že obě protilátky měly antigen vazebnou aktivitu stejnou jako chimemí protilátka. V případe antigen neutralizační aktivity, verze „ch-bl“ měla aktivitu stejnou jako chimérická protilátka, zatímco „ch-b2“ měla aktivitu mírně vyšší než chimérická protilátka o vysoké koncentraci. Verze „bl“ a „b2“ jsou kandidáty pro humanizovaný L řetězec, nicméně verze „b2“ je absolutně nejlepší, protože má velmi silnou aktivitu.

xv. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „b“ a humanizovaného L řetězce verze „b2“.

Byla připravena protilátka („b-b2“), která nesla humanizovaný H řetězec verze „b“, kombinovaný s humanizovaným L řetězcem verze „b2“ Protilátka byla testována na její ·* 0000 ·· 00 90 *·. 0 «00 «000 :·*,.: ; .·

0 0 9 9 00 9 0 00 • · ·· · · ·· 0· 0000 antigen vazebnou aktivitu a antigen neutralizující aktivitu. Antigen vazebná aktivita byla mírně nižší než aktivita chimérické protilátky. Antigen neutralizující aktivita, ačkoli mírně vyšší než aktivita verze „b-b“, byla nižší než aktivita verze „i-b“ xvi. Kombinace humanizovaného H řetězce verze „i“ a humanizovaného L řetězce verze „bl“ anebo „b2“.

Byly připraveny protilátky („i-bl“ a „i-b2“), které nesly humanizovaný H řetězec verze „i“, kobminovaný s humanizovaným L řetězcem verze „bl“ anebo „b2“. Protilátky byly testovány na antigen vazebnou aktivitu a antigen neutralizující aktivitu. Antigen vazebná aktivita verze „i-b2“ byla téměř stejná jako aktivita chimérické protilátky. Antigen vazebná aktivita verze „i-bl“ byla mírně nižší než aktivita chimérické protilátky. Antigen neutralizující aktivita verze „i-bl“ a „i-b2“ byla vyšší než aktivita chimérické protilátky a verze „i-b“ - „ib2“ -) „i-bl“.

Referenční příklad 7. Příprava CHO buňek produkujících humanizovanou protilátku a určení její aktivity.

1. Ustanovení stabilní CHO buněčné linie

Pro ustanovení stabilní linie, která stabilně produkuje humanizovanou protilátku (b-b, i-b a i-b2) byl do CHO (DG44) buněk vnesen expresní vektor pro protilátku.

Plasmidy hHvb-hLvb/N5KG4P, hHvi-hLvb/N5KG4P a hHvi-hLvb2/N5KG4P byly linearizovány restriktázou SspI (od firmy Takara Shuzo) a po extrakci fenolem a chloroformem byla DNA precipitována ethanolem. Linearizovaný plasmid byl do DG44 buněk vnesen elektroporací pomocí elektroporátoru Gene Pulser Instrument (od firmy BioRad). 10 anebo 50 pg plasmidu bylo přidáno k 0,8 ml buněčné suspenze DG44 buněk PBS. Buňky v koncentraci 1 x 10^{1 * * * * * 7} buněk/ml byly elektroporovány pulzy 1 500 V s kapacitou 25 pF.

Po 10 minutách vzpamatování se buněk při pokojové teplotě, byly elektroporované buňky resuspendovány vCHO-S-SFMII médiu obsahujícím hypoxantin/thymidin (HT, od firmy GIBCO) a kultivovány ve 100 pl/jamku na dvou 96-ti jamkových destičkách (od firmy Falcon) v CO₂ atmosféře v inkubátoru. 8 až 9 hodin po začátku kultivace bylo médium nahrazeno 100 pl/jamku selekčního média CHO-S-SFMII, obsahujícího HT (od firmy GIBCO) a 500 pg/ml geneticinu (G418 sulfát, od firmy GIBCO), pro selekci buněk, do ·* ··♦· ftft <9 ·· • · · · ♦ · · ft « « :··.. j : .· ftftftft ft · ft * ··· • ft ·· ftft ftft ftft ftft·· kterých byl vnesen gen pro protilátku. Polovina objemu média byla vyměňována jednou za 3 až 4 dny. Po dvoutýdenní kultivaci v selekčním médiu byl odebrán alikvot supematantu z jamky, kde byl patrný zjevný růst buněk. V případě, že byl pozorován dostatečný růst, bylo mmožství produkované protilátky měřeno pomocí ELISA techniky, popsané výše, a buňky se silnou expresí protilátky byly vyselektovány.

2. Velkoobjemová purifikace humanizované protilátky

Poté, co byly DG44 buňky vyselektovány a produkovaly humanizovanou protilátku („b-b“, „i-b“ a „i-b2“), byla kultura několik dnů pěstována v 500 ml kultivační láhvi v CHO-SSFMH médiu. Do 21 kulaté láhve (od firmy CORNIG) bylo sklizeno kultivační médium a buňkám bylo opět přidáno 500 ml CHO-S-SFMII média. Kultivační médium bylo centrifugováno, aby se odstranily zbytky buněk a filtrováno přes 0,22 anebo 0,45 pm filtr. Opakováním tohoto postupu byly získány 2 1 supematantu z buněčných kultur. Ze získaného supematantu byla purifikována protilátka, a to pomocí ConSep LC100 systému (od firmy Millipore), spojeným s afinitní kolonou s proteinem A (od firmy Poros),

3. Měření koncentrace protilátky metodou ELISA

ELISA destičky pro měření koncentrace protilátky byly připraveny následujícím způsobem: Na každou jamku 96-ti jamkové destičky (Maxisorp, NUNC) bylo mobilizováno 100 μΐ kozí protilátky proti lidskému IgGy (od firmy BIO SOURCE), naředěné na koncentraci 1 pg/ml v imobilazačním pufru CB. Po blokování pomocí 200 μΐ dilučního DB byl buněčný supematant z CHO buněk, které exprimovaly protilátku sériově naředěn pomocí DB pufru, a poté nakapán do každé jamky.

Po 1 hodinové inkubaci při pokojové teplotě a po oplachu RB pufrem, bylo k reakci přidáno 100 μΐ kozí anti-lidské IgGy protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), která byla naředěna 1 OOO-krát pomocí DB pufru. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny, následované oplachem pufrem RB, byl přidán roztok substrátu.

Poté byla pomocí Microplate Reader (od firmy Bio Rad) měřena absorbance při vlnové délce 405/655 nm. Jako standard pro měření koncentrace byla použita protilátka IgG4x (od firmy Binding Site).

44

4 4

7i : : ·.

• · · · • 4 ··

5. Měření antigen vazebné aktivity

Destičky pro ELISA test měření antigen-vazebné aktivity byly připraveny následujícím způsobem: Použité buňky byly buňky lidského karcinomu močového měchýře J82 (ATTC HTB-1). Na 60 jamek 96-ti jamkové destičky byly vysety buňky v denzitě 1 x 10⁵ buněk/jamku. Buňky byly jeden den kultivovány v RPMI 1 640 médiu s 10 % fetálním bovinním sérem (od firmy GIBCO), v termostatu s CO2 do té doby, až si buňky sedly. Po odstranění supernatantu byla každá jamka 2x propláchnuta 300 μΐ PBS. 100 μΐ PBS obsahující % paraformaldehyd (zde nazýván jako PFA/PBS) byl přidán do každé jamky a destička byla na 10 minut umístěna na led, pro dostatečnou imobilizaci.

PFA/PBS byl odstraněn a každá jamka byla dvakrát propláchnuta 300 μΐ PBS. Poté byly jamky blokovány 250 μΐ pufru DB. Supematant z kultury byl sériově naředěn v dvojkovém ředění pomocí pufru DB, s počátečním ředěním 10 pg/ml, 100 μΐ na každou jamku. Po dvouhodinové inkubaci při pokojové teplotě, následoval oplach pufrem RB. Poté bylo přidáno 100 μΐ kozí anti-lidské IgGy protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), která byla naředěna 1 OOO-krát pomocí DB pufru. Po inkubaci při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny, následované oplachem pufrem RB, bylo přidáno 100 μΐ roztoku substrátu. Poté byla pomocí Microplate Reader (od firmy Bio Rad) měřena absorbance při vlnové délce 405/655 nm.

6. Měření neutralizující aktivity proti TF (faktor inhibující produkci FXa)

Neutralizační aktivita humanizované protilátky zaměřená proti produkci FXa byla měřena pomocí inhibiční aktivity na produkci faktoru Xa, s tkáňovým tromboplastinem derivovaným z lidské placenty (Thromborel S, od firmy Boehringer, AG) jako standardem. 60 μΐ pufru (TBS obsahující 5 mM CaC12, a 0,1 % BSA) bylo přidáno k 10 μΐ Thromborelu v koncentraci 5 mg/ml a 10 μΐ vhodně naředěné protilátky. Reakce probíhala na 96- ti jamkové destičce po dobu 1 hodiny. Protilátka byla sériově naředěna v pětkovém ředění s počáteční koncentrací 200 pg/ml.

K reakci bylo přidáno 10 μΐ 3,245 pg/ml lidského faktoru X (od firmy Celsus Laboratories) a 82,5 ng /ml lidského faktoru Vila (od firmy Enzyme Research). Následovala inkubace při pokojové teplotě po dobu 45 minut. Pro zastavení reakce bylo přidáno 10 μΐ 0,5 M EDTA. Poté bylo k reakci přidáno 50 μΐ chromogenního substrátu a pomocí Microplate Reader (od firmy Bio Rad) byla měřena absorbance při vlnové délce 405/655 nm. Po inkubaci 30 minut při pokojové teplotě byla absorbance při 405/655 nm měřena znovu. Neutralizační • · · · ···· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 · · 9 9 9 9 aktivita byla určena jako procento reziduální aktivity při každé změně absorbance v průběhu hodinového měření, přičemž 100 % aktivita byla přisouzena vzorečku, kde nebyla přidána protilátka.

Roztok chromogenního substrátu byl připraven ředěním Testzyme chromogenního substrátu S-2 222 (Chromogenix) podle návodu udaného výrobcem, a to tak, že byl 2-krát naředěn destilovanou vodou a smíchán s roztokem polybrenu (0,6 mg/ml hexadimethylenbromid, od firmy SIGMA) v poměru 1:1.

6. Měření TF neutralizační aktivity (aktivita inhibující vazbu FX)

Inhibiční aktivita zaměřená proti vazbě FX s humanizoavnou protilátkou byla měřena za použití tkáňového tromboplastinu derivovaného z lidské placenty (Thromborel S, od firmy Boehringer, AG), ve kterém se vytvořil komplex TF a faktoru Vila. Inhibiční aktivita na FX vazbu byla měřena produkcí faktoru Xa na podkladě komplexu TF-FVHa jako standardu.

μΐ pufru (TBS obsahující 5 mM CaC12, a 0,1 % BSA) bylo přidáno k 10 μΐ Thromborelu S v koncentraci 5 mg/ml a 10 μΐ vhodně naředěné protilátky. Reakce probíhala na 96- ti jamkové destičce po dobu 1 hodiny.

K reakci bylo přidáno 10 μΐ 3,245 pg/ml lidského faktoru X (od firmy Celsus Laboratories) a 82,5 ng /ml lidského faktoru Víla (od firmy Enzyme Research). Následovala inkubace při pokojové teplotě po dobu 45 minut. Pro zastavení reakce bylo přidáno 10 μΐ 0,5 M EDTA. Poté bylo k reakci přidáno 50 μΐ chromogenního substrátu a pomocí Microplate Reader (od firmy Bio Rad) byla měřena absorbance při vlnové délce 405/655 nm. Po inkubaci 30 minut při pokojové teplotě byla absorbance při 405/655 nm měřena znovu. Neutralizační aktivita byla určena jako procento reziduální aktivity při každé změně absorbance v průběhu hodinového měření, přičemž 100 % aktivita byla přisouzena vzorečku, kde nebyla přidána protilátka.

oztok chromogenního substrátu byl připraven ředěním Testzyme chromogenního substrátu S-2 222 (Chromogenix) podle návodu udaného výrobcem, a to tak, že byl 2-krát naředěn destilovanou vodou a smíchán s roztokem polybrenu (0,6 mg/ml hexadimethylenbromid, od firmy SIGMA) v poměru 1:1.

7. Měření neutralizační aktivity zaměřené proti inhibiční aktivitě píasmatické koagulace

Neutralizační aktivita humanizované protilátky zaměřená proti TF (inhibiční aktivita na plasmatickou koagulaci) byla měřena pomocí prothrombinového času jako indexu.

•to ···· *··· · · · · ··· • to ·· ·· ·» ·· ·»

Protrombinový čas byl stanoven na základě thromboplastinu derivovaného z lidské placenty, Thromborel S (od firmy Boehringer AG). 100 μΐ lidské plasmy (od firmy Cosmo Bio) bylo přidáno ke vzorečku, ke kterému bylo rovněž přidáno 50 μΐ protilátky v různých koncentracích. Vzoreček byl 3 minuty zahříván na teplotu 37 °C. 50 μΐ Thromborelu S s koncentrací 1,25 mg/ml, který byl předehřát na teplotu 37 °C bylo přidáno k reakční směsi, čímž se spustila plasmatická koagulace. Koagulační čas byl měřen přístrojem Amelung KC10A, spojeném s Amelung CR-A (oba přístroje od firmy M.C.Medical).

Protilátka byla sériově naředěna v dvojkovém ředění pomocí IBS s 0,1 % BSA (TBS/BSA). Počáteční koncentrace byla 80 pg/ml. Koagulační čas při nepřítomnosti protilátky byl stanoven jako 100 % TF plasmatické koagulační aktivity. Reziduální TF aktivita byla počítána z koagulačního času ve chvíli přidání protilátky, založeného na standardní křivce získané vynesením závislosti koncentrace Thromborelu S a koagůlačního času.

Standardní křivka byla zkonstruována z různých koncentrací Thromborelu S a naměřeného koagulačního času. 50 μΐ BSA-TBS bylo přidáno d 50 μΐ vhodně neředěného Thromborelu S, který byl předehřát na teplotu 37 °C po dobu 3 minut. Ktéto směsi bylo přidáno 100 μΐ bdské plasmy předehřáté na 37 °C, čímž se nastartovala koagulace. Koagulační čas byl měřen. Thromborel Sbyl sériově naředěn vHankově pufru (od firmy GIBCO), obsahujícím 25 mM CaCh. Počáteční koncentrace ve dvojkovém ředění byla 6,25 mg/ml. Koncentrace Thromborelu S byla vynesena na úsečku a koagulační čas na logaritmický papír a byla zkonstruována standardní křivka.

8. Určení aktivity

Všechny humanizované protilátky „b-b“, „i-b“ a „i-b2“ měly aktivitu stejnou anebo vyšší než byla aktivita chimérické protilátky (Obr. 1). V případě inhibiční aktivity na tvorbu FXa, FX vazbu a plasmatickou koagulaci, měly humanizované protilátky „b-b“, „i-b“ a „i-b2“ stejnou anebo větší aktivitu než chimérická protilátka, přičemž aktivita humanizovaných protilátek klesala v tomto pořadí: „i-b2“ --) „i-b“--) „b-b“ (Obr. 2 až 4).

Claims (53)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Experimentální zvíře, vyznačující se tím, že mu byly implantovány zvířecí buňky, do kterých byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor TF anebo jeho část, a které jsou schopny exprimovat uvedený gen, přičemž uvedené zvíře není Člověk a dlouhodobně u něj přetrvává hyperkoagulační stav.
2. 2. Zvíře podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené části lidského tkáňového faktoru chybí intracelulámí oblast.
3. 3. Zvíře podle nároků 1 a 2 vyznačující se tím, že uvedená zvířecí buňka je savčí buňka.
4. 4. Zvíře podle nároku 3 vyznačující se tím, že uvedená savčí buňka je buňka lidského myelomu.
5. 5. Zvíře podle nároků laž4 vyznačující se tím, že uvedené zvíře je myš.
6. 6. Zvíře podle nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že hyperkoagulační stav je naznačen alespoň jedním fenoménem zahrnujícím nárůst plasmatické koncentrace lidského tkáňového faktoru, pokles počtu krevních destiček, pokles fibrinogenu, nárůst solubilních komplexů fibrin - monomerů a nárůst koncentrace komplexů thrombin-antithrombin ΙΠ.
7. 7. Způsob přípravy zvířete podle nároků laž 6, vyznačující se tím, že savčí buňka, do které byl vnesen gen pro lidský tkáňový faktor anebo jeho část, je schopna exprimovat uvedený gen, přičemž tato buňka je implantována do zvířete jiného než člověk, které se vyznačuje přetrvávajícím hyperkoagulačním stavem a toto zvíře je selektováno.
8. 8. Způsob testování antitrombotické látky, vyznačující se tím, že zahrnuje zvíře podle nároků 1 až 6.
9. 9. Preventivní anebo terapeutická látka vyznačující se tím, že se použije v případě nemoci charakterizované hyperkoagulačním stavem, přičemž uvedená látka zahrnuje protilátku proti lidskému tkáňovému faktoru (TF).
10. 10. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 9, vyznačující se tím, že protilátka je polyklonální protilátka.
11. 11. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 9, vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
12. 12. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 9 anebo 11,vyznačující setím, že protilátka je rekombinantní protilátka.
13. 13. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 9 al2,vyznačující se tím, že protilátka je pozměněná protilátka.

    *4 ··«· • · 4 • · 4 • · · ·

    9 9 9 9

    9 · ·· * 9 9

    9 9 999 • ·9 9 9

    9 9 9 9 ·« ·· ·· 99

    9 9 9 9

    9 9 9

    9 9 9

    9 9 9

    99 9999
14. 14. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 9, 12 a 13, vyznačující se tím, že protilátka je chimérická protilátka anebo humanizovaná protilátka.
15. 15. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 14,vyznačující se tím, že humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2.
16. 16. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 9, 12ažl5,vyznačující se tím, že protilátka je modifikovaná protilátka.
17. 17. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 16,vyznačující se tím, že modifikovaná protilátka představuje fragmenty protilátky Fab, F(ab')₂ anebo Fv anebo jednořetězcový fragment Fv (scFv).
18. 18. Preventivní anebo terapeutická látka, vyznačující se tím, že se použije pro léčení hyperkoagulačního stavu vzniklého na podkladě infekcí, přičemž uvedená látka zahrnuje protilátku proti lidskému tkáňovému faktoru (TF).
19. 19. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 18,vyznačující se tím, že protilátka je polyklonální protilátka.
20. 20. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 18,vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
21. 21. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 18a 20,vyznačující se tím, že protilátka je rekombinantní protilátka.
22. 22. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 18a21,vyznačující se tím, že protilátka je pozměněná protilátka.
23. 23. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 18, 21 a 22, vyznačující se tím, že protilátka je chimérická protilátka anebo humanizovaná protilátka.
24. 24. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 23,vyznačující se tím, že humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2.
25. 25. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 18, 21 až 24, vyznačující se tím, že protilátka je modifikovaná protilátka.
26. 26. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 25,vyznačující se tím, že modifikovaná protilátka představuje fragmenty protilátky Fab, F(ab')₂ anebo Fv anebo jednořetězcový fragment Fv (scFv).
27. 27. Preventivní anebo terapeutická látka, vyznačující se tím, že se použije pro léčení žilní trombózy, přičemž uvedená látka zahrnuje protilátku proti lidskému tkáňovému faktoru (TF).
28. 28. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 27,vyznačující se tím, že protilátka je polyklonální protilátka.

    • 4 ** 9··· * · t • · ·

    4 » 9 9 • · · 4 ** ·· • 4 • ··· t · • 9 • 4 Λ· «* *· ft < · · • · 4

    9 9 9 • 44 *· ····
29. 29. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 27,vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
30. 30. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 27 a 29,vyznačující se t í m, že protilátka je rekombinantní protilátka.
31. 31. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 27 a 30,vyznačující se tím, že protilátka je pozměněná protilátka.
32. 32. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 27, 30 a 31, vyznačující se tím, že protilátka je chimérická protilátka anebo humanizovaná protilátka.
33. 33. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 32,vyznačující se tím, že humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2.
34. 34. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 27, 30 až 33,vyznačující se tím, že protilátka je modifikovaná protilátka.
35. 35. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 34,vyznačující se tím, že modifikovaná protilátka představuje fragmenty protilátky Fab, F(ab')2 anebo Fv anebo jednořetězcový fragment Fv (scFv).
36. 36. Preventivní anebo terapeutická látka, vyznačující se tím, že se použije pro léčení arterielní trombózy, přičemž uvedená látka zahrnuje protilátku proti lidskému tkáňovému faktoru (TF).
37. 37. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 36,vyznačující se tím, že protilátka je polyklonální protilátka.
38. 38. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 36,vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
39. 39. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 36 a 38,vyznačující se tím, že protilátka je rekombinantní protilátka.
40. 40. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 36 a 39,vyznačující se tím, že protilátka je pozměněná protilátka.
41. 41. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 36, 39 a 40, vy zn ač u j i c i se t í m, že protilátka je chimérická protilátka anebo humanizovaná protilátka.
42. 42. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 41,vyznačující se tím, že humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2.
43. 43. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 36, 39 až 42,vyznačující se tím, že protilátka je modifikovaná protilátka.

    ·· ···· · · ·· ·· · · • · · ··· ···«

    9 · · · · · · · · 9 9
44. 44. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 43,vyznačující se tím, že modifikovaná protilátka představuje fragmenty protilátky Fab, F(ab')2 anebo Fv anebo jednořetězcový fragment Fv (scFv).
45. 45. Preventivní anebo terapeutická látka, vyznačující se tím, že se použije pro nemocí vznikajících na podkladě ztluštění médie cév, přičemž uvedená látka zahrnuje protilátku proti lidskému tkáňovému faktoru (TF).
46. 46. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 45,vyznačující se tím, že protilátka je polyklonálni protilátka.
47. 47. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 45,vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
48. 48. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 45 a 47,vyznačující se tím, že protilátka je rekombinantní protilátka.
49. 49. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 45 a 48, vyznačující se tím, že protilátka je pozměněná protilátka.
50. 50. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 45, 48 a 49, vyznačující se tím, že protilátka je chimérická protilátka anebo humanizovaná protilátka.
51. 51. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 50,vyznačující se tím, že humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verze b-b, i-b anebo i-b2.
52. 52. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároků 43, 48 až51,vyznačující se tím, že protilátka je modifikovaná protilátka.
53. 53. Preventivní anebo terapeutická látka podle nároku 52,vyznačující se tím, že modifikovaná protilátka představuje fragmenty protilátky Fab, F(ab')₂ anebo Fv anebo jednořetězcový fragment Fv (scFv).