SK4442002A3

SK4442002A3 - Prevention and treatment of diseases associated with blood coagulation

Info

Publication number: SK4442002A3
Application number: SK444-2002A
Authority: SK
Inventors: Hiroyuki Saito; Takehisa Kitazawa; Kazutaka Yoshihashi; Kunihiro Hattori
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2003-04-01
Also published as: KR20030008205A; JP3859512B2; PL354961A1; EP1222854B1; IL148980A0; AU7450600A; CA2388408A1; DK1222854T3; US8062638B1; BR0014667A; NO20021410D0; WO2001024626A1; EP1222854A1; NO20021410L; ATE498305T1; EP1222854A4; CZ20021035A3; DE60045638D1; HUP0203486A2; MXPA02003278A

Description

Profylaktická alebo terapeutická látka na liečbu ochorení súvisiacich s poruchami krvného zrážania

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka spôsobu prípravy zvieracieho modelu, ktorý sa vyznačuje pretrvávajúcim hyperkoagulačným stavom; preventívnych alebo liečebných prípravkov na liečbu ochorení, vyznačujúcich sa hyperkoagulačným stavom, preventívnych alebo liečebných prípravkov nä liečbu hyperkoagulačných stavov vzniknutých na podklade infekcie; preventívnych alebo liečebných prípravkov určených na liečbu žilových alebo tepnových trombóz; a preventívnych alebo liečebných prípravkov na liečbu ochorení vzniknutých na podklade hypertrofie média ciev.

Doterajší stav techniky

Zrážanie krvi je reakcia, kde dochádza k postupnej aktivácii prekurzorov serínových proteáz pomocou aktivovaných proteáz, a v konečnom kroku dochádza k tvorbe trombinu, ktorý vedie k tvorbe fibrínu. Trombóza vzniká ako následok prehnanej koagulačnej reakcie, spôsobenej zmenou v plazmatickej koagulácii a fibrinolytickom systéme, vo funkcii krvných doštičiek, leukocytov a cievnych endoteliálnych buniek, ktoré súvisia s progresiou daného ochorenia. Počiatočným faktorom krvnej koagulácie je tkanivový faktor. V prípade akútnych koronárnych syndrómov, ako napríklad infarkt myokardu alebo nestabilná angína, dochádza k iniciácii krvného zrážania potom, čo sa z rozpadnutých aterosklerotických piakov, prítomných v cievach postihnutých aterosklerózou, uvoľní do krvi nahromadený tkanivový faktor.

Pri syndróme disseminovanej intravaskulárnej koagulácie, ktorý je spojený so sepsou a malignými nádormi, exprimujú aktivované monocyty a makrofágy alebo nádorové bunky tkanivový faktor, čo vedie k zvýšenej krvnej koagulácii. Akonáhle sa tkanivový faktor dostane do kontaktu s krvou, rýchlo dochádza ku koagulačnej reakcii a k tvorbe krvných zrazenín. Tiež na prevenciu tvorby trombov je nevyhnutné blokovať reakcie krvného zrážania, ktoré môžu byť iniciované v akomkoľvek čase alebo sa rovnako môžu vyskytovať permanentne. Z týchto dôvodov je pre vývoj efektívnych antitrombotických látok nevyhnutný experimentálny model, ktorý sa vyznačuje konštantným hyperkoagulačným stavom. Všetky doterajšie modely trombotického stavu sa vyznačujú tým, že je trombus vytvorený za veľmi krátky čas.

Podľa jedného z hľadiska predkladaného vynálezu, je nárokovaný experimentálny model unikátny tým, že sa vyznačuje pretrvávajúcim hyperkoagulačným stavom, založeným na trvalom kontakte ľudského tkanivového faktora s krvou.

Zrážanie krvi je reakcia, kde dochádza k postupnej aktivácii prekurzorov serínových proteáz pomocou aktivovaných proteáz, a v konečnom kroku dochádza k tvorbe trombínu, ktorý vedie k tvorbe fibrínu. Trombóza vzniká ako následok prehnanej koagulačnej reakcie, spôsobenej zmenou v plazmatickej koagulácii a fibrinolytickom systéme, vo funkcii krvných doštičiek, leukocytov a cievnych endoteliálnych buniek, ktoré súvisia s progresiou daného ochorenia. Počiatočným faktorom krvnej koagulácie je tkanivový faktor (TF).

V akútnych koronárnych syndrómoch, akými sú akútny infarkt myokardu a nestabilná angína, je proces koagulácie vyvolaný uvoľnením TF z rozpadajúcich sa plakov, ktoré sa tvoria progresiou aterosklerózy a obsahujú veľké množstvo tkanivového faktora.

Pri syndróme disseminovanej intravaskulárnej koagulácie, ktorý je spojený so sepsou a malignými nádormi, exprimujú aktivované monocyty a makrofágy alebo nádorové bunky tkanivový faktor, čo vedie k zvýšenej krvnej koagulácii. Akonáhle sa TF dostane do kontaktu s krvou, rýchlo dochádza ku koagulačnej reakcii a k tvorbe krvných zrazenín. Teda na prevenciu tvorby trombov je nevyhnutné blokovať reakcie krvného zrážania, ktoré môžu byť iniciované v akýkoľkek čas alebo sa rovnako môžu vyskytovať permanentne. Preto je potrebné pripraviť efektívne antitrombotické liečivo, ktoré je schopné blokovať trvalý hyperkoagulačný stav.

Vzhľadom k druhému hľadisku predkladaného vynálezu, je navrhnutá nová preventívna alebo liečebná účinná látka, vhodná na liečbu ochorení, vyznačujúcich sa pretrvávajúcim hyperkoagulačným stavom.

Ťažké infekcie sú často spojené s hyperkoagulačným stavom, ktorý môže spôsobiť multiorgánové zlyhanie alebo disseminovanú intravaskulárnu koaguláciu, a sú faktorom, ktorý významne zhoršuje prognózu pacienta. V prípade ťažkých infekcií a systémových infekcií, akými sú napríklad sepsa, bolo zistené, že vyvolávajúcim momentom orgánového zlyhania sú lézie cievnych endoteliálnych buniek. V prípade sepsí, spôsobených gram-negatívnymi baktériami, hraje dôležitú úlohu bunkový

I komponent bakteriálnej steny, lipopolysacharid (LPS).

LPS uvoľnený do krvného obehu nielen že aktivuje monocyty, čim dochádza k tvorbe tkanivového faktora (TF), vedúcemu k hyperkoagulačnému stavu, ale rovnako vyvoláva uvoľňovanie cytokínov, ako napríklad TNF, ΙΙ_-1β, a IL-8. Tieto cytokíny aktivujú neutrofily a vaskulárne endoteliálne bunky. Aktivované neutrofily adherujú na vaskulárne endoteliálne bunky a uvoľňujú toxické substancie, akými sú aktívne enzýmy a elastázy, ktoré poškodzujú endoteliálne bunky. Vo vaskulárnych endoteliálnych bunkách, aktivovaných cytokínmi alebo poškodených neutrofilmi, dochádza k zvýšenej tvorbe TF, ktorý ďalej zhoršuje hyperkoagulačný stav. Výsledkom je, že sa systémovo objavujú mikrotromby, ktoré spôsobujú zlyhanie mikrocirkulácie, čo vedie k multiorgánovému zlyhaniu.

Teda je veľmi potrebný vývoj preventívnej alebo liečebne účinnej látky, vhodnej na liečbu koagulačných stavov spôsobených infekciami.

Vzhľadom k tretiemu hľadisku predkladaného vynálezu, je navrhnutá nová preventívna alebo liečebná účinná látka vhodná na ovplyvnenie koagulačných stavov spôsobených infekciami.

Dôležitú úlohu vo vývoji žilnej trombózy hrá spomalenie žilovej cirkulácie, poškodenie cievnej steny a zvýšená tendencia ku krvnej zrážanlivosti. Konkrétne, invazívne chirurgické výkony, pôrod a trauma spôsobujú fyzikálne poškodenie cievnej steny a abnormality y koagulačnom a fibrinolytickom systéme. Dekubity po chirurgických zákrokoch spôsobujú spomalenie krvnej cirkulácie. Nielen, že v cievach vznikajúce krvné zrazeniny spôsobujú zlyhanie cirkulácie v končatinách, ale krvné zrazeniny samotné sa uvoľňujú do krvného obehu a dostávajú sa do pľúcnej tepny, čím dochádza k smrteľnej pľúcnej embolizácii. Taktiež prevencia embolizmu je považovaná za mimoriadne dôležitú. Z toho plynie, že je potrebné pripraviť účinné látky, ktoré sú schopné účinne brániť alebo liečiť trombózu žíl.

Vzhľadom k štvrtému hľadisku predkladaného vynálezu je navrhnutá nová preventívna alebo liečebná účinná látka vhodná na liečbu trombózy žíl.

V prípade trombózy tepien sa krvné zrazeniny vyskytujú v krvných cievach postihnutých rozsiahlou aterosklerózou. Prepuknutie trombózy tepien v dôležitých orgánoch, akými sú mozog alebo srdce vo väčšine prípadov končí fatálne. Konkrétne, akútne koronárne syndrómy, ako napríklad nestabilná angína alebo akútny infarkt myokardu, sú považované za nebezpečné stavy, ktoré sú často príčinou syndrómu náhlej smrti. Celkom nedávno bolo zistené, že rozpad aterosklerotických plátov a nastupujúci trombus sú dôležitými faktormi v mechanizme vzniku ochorenia.

Rovnako bolo zistené, že sa tkanivový faktor (TF), ktorý je spúšťacím faktorom tvorby trombu, nachádza na povrchu a v interstíciu aterosklerotických plátov. Predpokladá sa, že expozícia tkanivového faktora (TF) z rozpadajúcecho sa plátu krvného obehu je hlavnou príčinou arteriálnej trombózy.

Z toho vyplýva, že je potrebné pripraviť novú účinnú látku, ktorá je schopná účinne brániť alebo liečiť arteriálnu trombózu.

Vzhľadom k piatemu hľadisku predkladaného vynálezu je navrhnutá nová preventívna alebo liečebná účinná látka vhodná na liečbu arteriálnej trombózy.

Perkutánna transluminálna koronárna angioplastika (PTCA) zaujíma popredné miesto v liečbe koronárnych ochorení. Avšak restenózy, ktoré sa vyskytujú niekoľko mesiacov po operácii, znižujú efektivitu tejto liečebnej metódy a sú teda značným problémom. Za príčinu restenózy je považovaný trombus, ktorý je tvorený v akútnej a subakútnej fáze poškodenia endoteliálnych buniek. Kontakt krvi s tkanivovým faktorom, produkovaným poškodenými endoteliálnymi bunkami, bunkami hladkej svaloviny ciev a fibroblasty v subendoteliálnej látke, je považovaný za príčinu tvorby trombu. Bunky cievnej steny rastú a snažia sa prekryť trombus, čo má za následok zužovanie priesvitu cievy. Rast látky cievnej steny per se a zúženie priemeru cievy rovnako prispievajú k zužovaniu priesvitu cievy, čím predstavujú priamy faktor restenózy.

Z toho vyplýva, že je potrebné pripraviť novú účinnú látku, ktorá je schopná účinne brániť alebo liečiť restenózy.

Vzhľadom k piatemu hľadisku predkladaného vynálezu je navrhnutá nová preventívna alebo liečebná účinná látka vhodná na liečbu ochorení spôsobených hypertrofiou média krvných ciev.

Podstata vynálezu

Po intenzívnom a náročnom výskume zameranom na vyriešenie vyššie predloženého problému bolo zistené, že experimentálne zviera, ktorému bol implantovaný štep buniek geneticky upravených vnesením génu pre ľudský tkanivový faktor (TF) a schopných konštantné produkovať vysokú hladinu ľudského tkanivového faktora (TF), je charakteristické pretrvávajúcim hyperkoagulačným stavom, teda celkom spĺňa nároky predkladaného vynálezu. Podľa prvého z hľadísk predkladaného vynálezu, uvádza predkladaný vynález experimentálne zviera, ktorému bol implantovaný štep geneticky upravených buniek tak, že im bol vložený gén pre ľudský tkanivový faktor (TF) alebo pre jeho časť. Gén pre ľudský tkanivový faktor je exprimovaný. Uvedený zvierací model sa vyznačuje pretrvávajúcim hyperkoagulačným stavom.

Časť vyššie uvedeného ľudského tkanivového faktora je napríklad časť molekuly, ktorá nemá intracelulárnu časť. Vyššie uvedené bunky štepu sú s výhodou cicavčie bunky, s výhodou bunky ľudského myelómu. Vyššie uvedené experimentálne zviera je s výhodou myš. Hyperkoagulačný stav je definovaný aspoň jedným z uvedených fenoménov: zvýšenie plazmatickej koncentrácie ľudského tkanivového faktora, zníženie počtu krvných doštičiek, zníženie hladiny fibrinogénu, zvýšenie koncentrácie solubilných komplexov fibrín-monomérov a zvýšenie koncentrácie komplexov trombín-antitrombín III.

Predkladaný vynález taktiež opisuje spôsob prípravy vyššie uvedeného zvieraťa, do ktorého sú implantované bunky, geneticky upravené tak, že nesú gén pre ľudský tkanivový faktor, alebo jeho časť, a tento gén je exprimovaný. Takto upravené bunky sú vložené ako štep do zvieraťa, ktoré sa následne vyznačuje trvalým hyperkoagulačným stavom.

Predkladaný vynález rovnako predstavuje spôsob hľadania antitrombotických látok pomocou uvedeného experimentálneho zvieracieho modelu.

Na základe intenzívneho a náročného výskumu zameraného na vyriešenie vyššie uvedeného problému bolo zistené, že protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru (anti-human TF antibody), je schopná zabrániť pretrvávaniu hyperkoagulačného stavu.

Vzhľadom k druhému hľadisku predkladaného vynálezu, predkladaný vynález predstavuje preventívnu alebo liečebnú účinnú látku, ktorou je protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru.

Vyššie uvedená protilátka je napríklad polyklonálna protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je monoklonálna protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je rekombinantná protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je modifikovaná protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je chimerna alebo humanizovaná protilátka. Vyššie uvedená humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verzie b-b, i-b alebo i-b2. Vyššie uvedená protilátka je napríklad modifikovaná protilátka. Vyššie uvedená modifikácia protilátky zahrňuje napríklad fragment protilátky Fab, F(ab')2, Fv alebo jeden reťazec Fv (scFv).

Na základe intenzívneho a náročného výskumu zameraného na vyriešenie vyššie uvedeného tretieho problému bolo zistené, že protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru (anti-human TF antibody) je schopná zabrániť alebo liečiť hyperkoagulačný stav, ktorý je následkom infekcie.

Taktiež, podľa štvrtého hľadiska predkladaného vynálezu, predkladaný vynález predstavuje preventívnu alebo liečebnú účinnú látku na liečbu trombózy žíl. Spomínanou liečebnou látkou je protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru.

Vyššie uvedená protilátka je napríklad polyklonálna protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je monoklonálna protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je rekombinantná protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je modifikovaná protilátka. S výhodou vyššie uvedená protilátka je chimerna alebo humanizovaná protilátka. Vyššie uvedená humanizovaná protilátka je humanizovaná protilátka verzie b-b, i-b alebo i-b2.Vyššie uvedená protilátka je napríklad modifikovaná protilátka. Vyššie uvedená modifikácia protilátky zahrňuje napríklad fragment protilátky Fab, F(ab')₂, Fv alebo jeden reťazec Fv (scFv).

Na základe intenzívneho a náročného výskumu zameraného na vyriešenie vyššie uvedeného piateho problému bolo zistené, že protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru (anti-human TF antibody) je schopná zabrániť alebo liečiť arteriálnu trombózu.

Taktiež, podľa piateho hľadiska predkladaného vynálezu, predkladaný vynález predstavuje preventívnu alebo liečebnú účinnú látku na liečbu arteriálnej trombózy. Spomínanou liečebnou látkou je protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru.

Na základe intenzívneho a náročného výskumu zameraného na vyriešenie vyššie uvedeného šiesteho problému bolo zistené, že protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru (anti-human TF antibody) je schopná zabrániť alebo liečiť ochorenia spôsobené hypertrofiou cievneho média.

Teda, podľa šiesteho hľadiska predkladaného vynálezu, predkladaný vynález predstavuje preventívnu alebo liečebnú účinnú látku na liečbu hypertrofie cievneho média. Spomínanou liečebnou látkou je protilátka proti ľudskému tkanivovému faktoru.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje graf, ktorý porovnáva antigén-väzbovú aktivitu chimerickej protilátky zloženej z H reťazca a L reťazca; protilátky zloženej z b humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; a protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b2 humanizovanej verzie L reťazca.

Obrázok 2 znázorňuje graf, ktorý porovnáva aktivitu protilátok inaktivujúcich ľudský TF (aktivita TF potrebná na inhibiciu tvorby faktora Xa), skladajúcich sa z chimerickej protilátky zloženej z H reťazca a L reťazca; protilátky zloženej z b humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; a

I ,1 protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b2 humanizovanej verzie L reťazca.

Obrázok 3 znázorňuje graf, ktorý porovnáva aktivitu protilátok inaktivujúcich ľudský TF (aktivita TF potrebná na inhibiciu tvorby faktora X), skladajúcich sa z chimerickej protilátky zloženej z H reťazca a L reťazca; protilátky zloženej z b humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; a protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b2 humanizovanej verzie L reťazca.

Obrázok 4 znázorňuje graf, ktorý porovnáva aktivitu protilátok inaktivujúcich ľudský TF (aktivita TF potrebná na inhibiciu plazmatickej koagulácie), skladajúcich sa z chimerickej protilátky zloženej z H reťazca a L reťazca; protilátky zloženej z b humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b humanizovanej verzie L reťazca; a protilátky zloženej z i humanizovanej verzie H reťazca a b2 humanizovanej verzie L reťazca.

Obrázok 5 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien veľkosti nádoru po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor (bodkovaná čiara), a po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých uvedený gén nebol vnesený (plná čiara).

Obrázok 6 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien plazmatickej koncentrácie ľudského tkanivového faktora po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor (bodkovaná čiara), a po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých uvedený gén nebol vnesený (plná čiara).

Obrázok 7 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien počtu krvných doštičiek po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor (bodkovaná čiara), a po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých uvedený gén nebol vnesený (plná čiara).

Obrázok 8 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien plazmatickej koncentrácie fibrinogénu po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor (bodkovaná čiara), a po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých uvedený gén nebol vnesený (plná čiara). Uvedené hodnoty sú relatívne, závislé od hodnoty fibrinogénu v kontrolnej myši (normál), ktorá nebola zasiahnutá nádorovými bunkami, a kde hodnota fibrinogénu je 100 %.

Obrázok 9 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien plazmatickej koncentrácie solubilných komplexov fibrín - monomérov (sFMC) po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor (bodkovaná čiara), a po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých uvedený gén nebol vnesený (plná čiara).

Obrázok 10 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien plazmatickej koncentrácie komplexu trombín-antitrombín III (TAT) po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor (bodkovaná čiara), a po zasiahnutí myši nádorovými bunkami, do ktorých uvedený gén nebol vnesený (plná čiara).

Obrázok 11 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien počtu krvných doštičiek u myši po podaní protilátky proti ľudskému TF v koncentrácii 1 mg/kg jeden krát týždenne počas 3 týždňov odo dňa 45 po zasiahnutí bunkami, ktorým bol vnesený gén pre ľudský TF.

Obrázok 12 znázorňuje graf, ktorý predstavuje plazmatickú koncentráciu solubilných komplexov fibrín-monomérov (sFMC) v deň 6 po poslednom podaní protilátky proti ľudskému TF u myši po podávaní protilátky proti ľudskému TF v koncentrácii 1 mg/kg jeden krát týždenne po čas 3 týždňov do dňa 45 po zasiahnutí bunkami, ktorým bol vnesený gén pre ľudský TF.

Obrázok 13 znázorňuje graf, ktorý predstavuje plazmatickú koncentrácii komplexov trombín-antitrombín III (TÁT) v deň 6 po poslednom podaní protilátky proti ľudskému TF u myši po podávaní protilátky proti ľudskému TF v koncentrácii 1 mg/kg jeden krát týždenne po čas 3 týždňov odo dňa 45 po zasiahnutí bunkami, ktorým bol vnesený gén pre ľudský TF.

Obrázok 14 znázorňuje graf, ktorý predstavuje časový priebeh zmien počtu krvných doštičiek u myši, nesúcich bunky s vloženým génom pre ľudský TF, ktorým bola protilátka proti ľudskému TF podaná v koncentrácii 1 mg/kg v deň 49 a alebo ktorým bol kontinuálne počas 24 hodín osmotickou pumpou podávaný nízkomolekulárny heparín v koncentrácii 601,5 IU/kg, 1900,3 lU/kg alebo 6487,3

IU/kg.

Gén pre ľudský tkanivový faktor (TF) na použitie v prvom aspekte predkladaného vynálezu bol už klonovaný a nukleotidová a aminokyselinová sekvencia je známa (H. Morrissey et al., Celí, 1987, 50: 129-135). Plnodfžková nukleotidová a aminokyselinová sekvencia génu pre ľudský tkanivový faktor je prístupná v SEQ databáze pod prístupovým kódom 103 a 104. Vzhľadom k predkladanému vynálezu, je možné použiť gén kódujúci ľudský TF, ktorý bol upravený tak, že z neho bola odstránená sekvencia kódujúca intracytoplazmatickú časť, a/alebo je možné použiť časť génu kódujúceho ľudský TF tak, že jeho produkt si zachováva schopnosť inicializácie kaskády krvného zrážania.

Čo sa týka vektora na vnesenie génu do cicavčích buniek a pre následnú expresiu klonovaného génu, je možné použiť akýkoľvek cicavčí expresný vektor, akými sú napríklad pCOS1, pSV2-neo, pMAM-neo a pSG5. V súlade s predkladaným vynálezom, dochádza k expresii konštruktu zloženého z promótora, génu pre ľudský tkanivový faktor a poly-A signál, umiestený 3' od génu. Čo sa týka promótora/enhancéra, sú vhodné vírusové promótory, ako napríklad skorý promótor/enhancér vírusu ľudskej cytomegalovej infekcie, adenovírusový promótor a promótor z SV40 vírusu a promótory/enhancéry odvodené od cicavčích buniek, ako napríklad ľudský elongačný faktor 1a (HEF 1a). Čo sa týka začiatku replikácie expresných vektorov, je možné použiť začiatky replikácie odvodenej od SV40 vírusu, polyomu vírusu, adenovírusu a podobných. Ďalej, expresné vektory obsahujú selektovateľné markery, ako napríklad gén pre fosfotransferázu APH (3') II alebo I (neo), gén pre tymidínkinázu, gén pre dihydrofolátreduktázu (DHFR) a podobne.

Čo sa týka metódy vnášania génu do bunky, je možné použiť elektroporáciu, kalcium-fosfátovú metódu, lipofekciu a podobne. Čo sa týka buniek, do ktorých je vnášaný vektor, je možné použiť akékoľvek bunky, ktoré majú schopnosť usídliť sa v cicavčom organizme. Na tieto ciele je možné použiť rôzne tkanivové kultúry, zahrňujúce rôzne cicavčie bunky a ľudské bunky, bunky pochádzajúce z myši, krysy, škrečka a opice, pričom nádorové bunky sú najvýhodnejšie. Špecifickými príkladmi sú ľudské myelómové línie KPMM2 a ARH-77, myšia leukemická línia P815, P388 a

L1210.

Experimentálnymi zvieratmi vhodnými na použitie v predkladanom vynáleze sú cicavce s výnimkou človeka, a s výhodou sú to malé laboratórne zvieratá, ako napríklad myši, krysy a škrečkovia, pričom myš je najvýhodnejšia.

V súlade s druhým aspektom predkladaného vynálezu, hyperkoagulačný stav znamená fyzikálny stav navodený ľudským TF, ktorý sa manifestuje zníženým počtom krvných doštičiek a zníženou hladinou fibrinogénu, zvýšenou hladinou solubilných komplexov fibrín-monomérov (sFMC) a komplexu trombín-antitrombín lll (TAT).

Aj keď protilátka použitá v predkladanom vynáleze je buď polyklonálna alebo monoklonálna, s preventívnym alebo terapeutickým efektom na perzistenciu hyperkoagulácie spôsobenú ľudským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonálna. Je možné taktiež použiť chimerické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmente a iné monoklonálne protilátky, ale preferovaným typom protilátky je humanizovaná protilátka.

Aj keď protilátka použitá v treťom hľadisku predkladaného vynálezu je buď polyklonálna a alebo monoklonálna, s preventívnym a/alebo terapeutickým efektom na perzistenciu hyperkoagulácie spôsobenú ľudským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonálna. Je možné rovnako použiť chimerické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmente a iné monoklonálne protilátky, ale preferovaným typom protilátky je humanizovaná protilátka.

Aj keď protilátka použitá v štvrtom hľadisku predkladaného vynálezu je buď polyklonálna a/alebo monoklonálna, s preventívnym a alebo terapeutickým efektom na perzistenciu hyperkoagulácie spôsobenú ľudským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonálna. Je možné rovnako použiť chimerické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmente a iné monoklonálne protilátky, ale preferovaným typom protilátky je humanizovaná protilátka.

Aj keď protilátka použitá v piatom hľadisku predkladaného vynálezu je buď polyklonálna a/alebo monoklonálna, s preventívnym a alebo terapeutickým efektom na perzistenciu hyperkoagulácie spôsobenú ľudským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonálna. Je možné rovnako použiť chimerické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmente a iné monoklonálne protilátky, ale preferovaným typom protilátky je humanizovaná protilátka.

Aj keď protilátka použitá v šiestom hľadisku predkladaného vynálezu je buď polyklonálna a/alebo monoklonálna, s preventívnym a alebo terapeutickým efektom na perzistenciu hyperkoagulácie spôsobenú ľudským TF, s výhodou použitá protilátka je monoklonálna. Je možné rovnako použiť chimerické protilátky, humanizované protilátky, protilátky založené na Fv fragmente a iné monoklonálne protilátky, ale preferovaným typom protilátky je humanizovaná protilátka.

1. Protilátka proti ľudskému TF

Protilátka proti ľudskému TF môže byť akéhokoľvek pôvodu, druhu (monoklonálna, polyklonálna), akéhokoľvek tvaru. Musí mať ale schopnosť brániť trvalý stav hyperkoagulácie spôsobený ľudským TF.

Protilátky proti ľudskému TF na použitie v predkladanom vynáleze sú monoklonálne alebo polyklonálne a sú pripravené niektorou zo známych metód.

V predkladanom vynáleze sú s výhodou použité monoklonálne protilátky proti ľudskému TF, s výhodou cicavčieho pôvodu. Monoklonálne protilátky cicavčieho pôvodu zahrňujú tie, ktoré sú pripravené pomocou hybridómov, a tie, ktoré sú pripravené pomocou hostiteľa, ktorý bol transformovaný expresným vektorom, nesúcim gén pre protilátku. Táto protilátka inhibuje tvorbu trombu tým, že viaže ľudský TF.

2. Hybridómy produkujúce protilátky

Hybridom, produkujúci monoklonálnu protilátku je pripravený pomocou známej metódy, opísanej nižšie. Ľudský TF alebo jeho fragment je použitý ako senzitizujúci antigén a je použitý na imunizáciu pomocou známej metódy imunizácie. Získané imúnne bunky sú potom fúzované so známymi rodičovskými bunkami pomocou bežného fúzovacieho procesu. Potom sú monoklonálne protilátky produkujúce hybridómy testované bežnou testovacou metódou a je vybraný hybridom, najlepšie produkujúci protilátku. Špecifickejšie, monoklonálna protilátka je pripravená týmto spôsobom:

TF, ako senzitizujúci antigén na prípravu protilátky, je pripravený expresiou ľudského TF génu (Aminokyselinová sekvencia publikována (J.H. Morrissey et al., Celí, 1987, 50: 129-135). Potom, čo je gén pre ľudský TF vložený do expresného vektora, a je transformovaný do vhodnej hostiteľskej bunky, ľudský TF je purifikovaný z hostiteľských buniek a/alebo supernatantu pomocou jednej zo známych metód.

Táto metóda je opísaná v citácii č. 1 predkladaného vynálezu.

Ďalej, ľudský TF použiteľný ako antigén je získaný a purifikovaný z biologického materiálu obsahujúceho TF, akým je napríklad ľudská placenta. Postup je opísaný v citácii č. 2. Potom je purifikovaný ľudský TF použitý ako senzitizujúci antigén. Alternatívne, solubilný TF, s deliacou transmembránovou doménou na jeho C-konci, pripravený rekombinantnou DNA technológiou, je použiteľný ako senzitizujúci antigén. Aj keď zvieratá, ktoré sú imunizované senzitizujúcim antigénom nie sú špecificky limitované, sú s výhodou vyberané tak, že sú kompatibilné s rodičovskou bunkou, použitou v bunkovej fúzii. Všeobecne, vhodnými zvieratmi sú hlodavci, ako napríklad myši, krysy a škrečkovia, alebo králiky a opice.

Imunizácia zvierat senzitizujúcim antigénom sa vykonáva známou metódou. Všeobecná metóda napríklad zahrňuje intraperitoneálne alebo subkutánne podanie senzitizujúceho antigénu zvieraťu. Konkrétne, senzitizujúci antigén, riedený vo vhodnom množstve fosfátového pufru (PBS) alebo fyziologického roztoku je zmiešaný s vhodným množstvom bežného adjuvans, akým je napríklad Freundovo kompletné adjuvans. Po emulzifikácii je prípravok podávaný zvieratám niekoľkokrát, každých 4 až 21 dní. Prípadne, pri imunizácii senzitizujúcim antigénom, je možné použiť vhodný nosič.

Po imunizácii zvieraťa uvedeným spôsobom a potvrdení dostatočne vysokej hladiny protilátky v sére, sú imúnne bunky vybraté z pokusného zvieraťa a sú podrobené bunkovej fúzii. S výhodou použité bunky zahrňujú bunky sleziny.

Cicavčie myelómové bunky sú použité ako ďalšie rodičovské bunky, ktoré sú fúzované s vyššie uvedenými imúnnymi bunkami. Myelómové bunky s výhodou zahrňujú rôzne známe bunkové línie, ako napríklad P3 (P3X63Ag8.653) (Kearney, J.F. et al., J. Immunol., 1979, 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Yelton, D. E. et al, Current Topics in Microbiology and Immunology, 1978, 81:1-7), NS-1 (Kohler, G, and Milstein, C, Eur. J. Immunol, 1976, 6:511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al. Celí, 1976, 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al. Náture, 1978, 276: 269-270), FO (de St. Grot, S.F. et al, J. Immunol, Metods, 1980, 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I. S, J. Exp. Med, 1978, 148:313-323), R210 (Galfre, G. etal, Náture, 1979,277:131-133).

Bunková fúzia medzi vyššie uvedenými imúnnymi bunkami a myelómovými bunkami sa uskutočňuje pomocou známej metódy, ako napríklad metódy, opísanej v

Milstein et al., (Kohler, G. andMilstein, C., Metods Enzymol., 1981, 73:3-46).

Špecifickejšie, vyššie uvedená bunková fúzia sa uskutočňuje v bežnom výživnom médiu v prítomnosti akcelerátora bunkovej fúzie. Ako akcelerátor bunkovej fúzie je možné použiť napríklad polyetylénglykol (PEG), Sendai vírus (HVJ) a pod. Ako adjuvans je možné použiť napríklad dimetylsulfoxid. Tieto prísady sa pridávajú na zvýšenie účinnosti fúzie.

S výhodou použitý pomer imúnnych buniek k bunkám myelómu je stanovený empiricky a je napríklad 1 až 10 : 1. Príklady vhodných médií použiteľných pre vyššie uvedené bunkové fúzie sú RPMI 1640, MEM médium, a iné bežné média vhodné na kultiváciu týchto typov bunkových línií, a rovnako vhodné pre rast buniek myelómovej línie. Do média môže byť pridané fetálne teľacie sérum (FCS).

Pre bunkovú fúziu sa v kultivačnom médiu dôkladne zmieša určené množstvo imúnnych buniek a myelómových buniek. Do média sa pridá PEG, zahriaty na 37 °C, ktorý má priemernú molekulovú hmotnosť 1000 až 6000. PEG bol pridaný na koncentráciu 30 až 60 % hmotn. za vzniku fúznych buniek (hybridómov). Potom boli odstránené všetky látky, ktoré sú nežiadúce pre rast buniek a to tak, že bolo opakovane bunkám vymieňané médium, bunky boli centrifugované a bolo pridané nové médium.

Získané hybridómy boli následne kultivované v selekčnom médiu, ako napríklad HAT kultivačné médium, obsahujúce hypoxantín, aminopterín a tymidín. Kultivácia v uvedenom médiu po dostatočne dlhý čas (niekoľko dní až týždňov) umožňuje selekciu hybridómových buniek tým, že nehybridómové bunky (nefúzované bunky) zahynú. Bežná dilučná metóda odhalí hybridómy, ktoré produkujú očakávanú protilátku a jednotlivé klony sú rozpestované.

Okrem získania hybridómov imunizáciou zvieraťa iného ako človek antigénom, je rovnako možné získať protilátku s väzbovou aktivitou proti ľudskému TF tým, že sa ľudské lymfocyty in vitro senzitizujú ľudským TF a vzniknuté senzitizované ľudské lymfocyty sú fúzované s ľudskými myelómovými bunkami, ako napríklad myelómovou líniou U266 schopnou permanentného delenia, (viď Japanese Examined Patent Publication, No. 1-59 878). Ďalej, protilátku proti ľudskému TF je možné získať pomocou transgénneho zvieraťa, ktorému je ako antigén podaný ľudský TF, pričom zviera exprimuje celý repertoár ľudských imunoglobulinov a/alebo jeho časť. Bunky, produkujúce protilátku proti ľudskému TF sú potom imortalizované (viď International Unexamined Patent Application No. WO 94/25 585, WO 93/12 227,

WO 92/03 918, WO 94/02 602, WO 96/34 096 a WO 96/33 735).

Pripravené hybridómy, produkujúce monoklonálnu protilátku, sú kultivované v bežnom kultivačnom médiu, a/alebo sú dlhodobo uskladnené v tekutom dusíku.

Z hybridómov sa protilátky získavajú tak, že sa hybridom kultivuje v bežnom kultivačnom médiu bežným spôsobom, a protilátka je získavaná zo supernatantu, alebo je hybridom implantovaný laboratórnemu zvieraťu kompatibilnému s bunkami hybridómov a protilátka je získavaná z ascitu. Prvá metóda je vhodná na získanie vysoko čistej protilátky, zatiaľ čo druhá metóda je vhodná na produkciu protilátky vo veľkom množstve.

Príklad prípravy monoklonálnej protilátky je opísaný v citácii č. 2. V tomto príklade bolo pripravených 6 monoklonálnych protilátok nazvaných ATR-2, 3, 4, 5, 7 a 8. Všetky sú použité v predkladanom vynáleze, ale najvýhodnejšia je ATR-5.

3. Rekombinantná protilátka

Rekombinantná protilátka, pripravená rekombinantnou DNA technológiou tak, že gén kódujúci protilátku bol klonovaný a integrovaný do vhodného vektora a vnesený do hostiteľa, je rovnako použiteľná v predkladanom vynáleze ako monoklonálna protilátka, (viď napríklad Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem, 1990, 192:767-775).

Špecifickejšie, mRNA kódujúca variabilnú oblasť (V) protilátky proti ľudskému TF je izolovaná z hybridómu, produkujúceho protilátku proti ľudskému TF. mRNA je izolovaná spoločne s celkovou RNA pomocou známej metódy, akou je napríklad guanidínová ultracentrifugačná metóda (Ghirgwin, J. M. et al., Biochemistry, 1979, 18:5 294-5 299), a alebo AGPC metóda (Chomczynski, P. et al., Anál. Biochem., 1987, 162:156-159). mRNA bola potom z celkovej RNA purifikovaná pomocou mRNA purifikačného kitu (od firmy Pharmacia). Navyše, mRNA je pripravená priamo pomocou Quick Prep mRNA Purification Kit (od firmy Pharmacia).

cDNA variabilnej oblasti protilátky je syntetizovaná z mRNA pomocou reverznej transkriptázy. Na syntézu cDNA je možné použiť AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Syntesis Kit (od firmy Seikagaku Čo.). Naviac, pre syntézu a amplifikáciu cDNA je možné použiť 5-Ampli FINDER RAČE Kit (od firmy

Clontech) a 5' - RAČE metódu (Frohman, M. A. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 8 998-9 002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17: 2 919- 2 932). Metódy sú založené na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR).

Získaný PCR produkt je purifikovaný a ligovaný do vektora. Ligačná zmes je transformovaná do buniek E. coli, z ktorých sú vybrané kolónie obsahujúce rekombinantný vektor. Sekvencia klonovanej DNA sa overí pomocou dideoxyterminačnej sekvenčnej metódy.

Keď boli získaná DNA kódujúca V región protilátky proti ľudskému TF, je možné ju vložiť do vektora nesúceho konštantnú oblasť (C) protilátky.

Na prípravu protilátky proti ľudskému TF na použitie v predkladanom vynáleze gén pre protilátku je vložený do expresného vektora tak, že gén je pod kontrolou regulačných oblastí, akými sú enhancér a/alebo promótor. V ďalšom kroku je vektor transformovaný do hostiteľskej bunky, v ktorej je protilátka exprimovaná.

Na expresiu génu pre protilátku, sú DNA kódujúce ťažký (H) a ľahký (L) reťazec protilátky separátne vložené do expresných vektorov a hostiteľská bunka je transformovaná simultánne. Inou možnosťou je, že DNA pre ťažký i ľahký reťazec sú klonované do rovnakého expresného vektora a hostiteľská bunka je transformovaná týmto konštruktom (viď International Patent Publication, WO 94/11 523).

Ďalej, okrem vyššie uvedených hostiteľských buniek, je možné pripraviť protilátku použitím transgénneho zvieraťa. Napríklad, gén pre protilátku je pripravený ako fúzny tým, že je vložený do génu pre proteín, ktorý je prirodzene produkovaný mliekom. DNA fragment, obsahujúci fúzny gén pre protilátku, je injekovaný do kozieho embrya a toto embryo je vložené do kozy. Očakávaná protilátka je získavaná z mlieka transgénnej kozy, ktorá vyrastie z transgénneho embrya a z jej potomkov. Aby bolo možné zvýšiť množstvo mlieka obsahujúceho očakávanú protilátku, produkovanú transgénnou kozou, sú koze podávané hormóny (Ebert, K. M. et al., BioTechnology, 1994, 12: 699-702). Príklad metódy na prípravu rekombinantnej protilátky je konkrétne opísaný v citácii č. 3.

4. Pozmenená protilátka

V súlade s predkladaným vynálezom, spoločne s vyššie uvedenými protilátkami, je možné použiť umelo pozmenenú protilátku, ako napríklad chimérnu protilátku a humanizovanú protilátku, na zníženie heterológnej antigénicity voči človeku. Pozmenená protilátka, užitočná v predkladanom vynáleze, sa pripraví jednou z bežných metód.

Chimerická protilátka sa pripraví (ako bolo uvedené vyššie) ligáciou DNA kódujúcej V oblasť protilátky s DNA kódujúcej C oblasť ľudskej protilátky, ktoré sú potom vložené do expresného vektora a integrované do hostiteľa za účelom produkcie protilátky. Použitím tejto známej metódy je možné získať chimerickú protilátku užitočnú na použitie v predkladanom vynáleze.

Humanizovaná protilátka, nazývaná taktiež pozmenená ľudská protilátka, bola pripravená prenesením komplementaritu určujúcej oblasti (CDR) protilátky pochádzajúcej z cicavca iného ako človek, napríklad myšej protilátky, do CDR oblasti ľudskej protilátky. Rekombinantná DNA technológia na prípravu takýchto protilátok je taktiež známa (viď European Patent Application EP 125 023 a WO 92/02 576).

Špecifickejšie, DNA sekvencia, ktorá bola určená na ligáciu CDR z myšej protilátky s kostrovou oblasťou (FR) ľudskej protilátky je pripravená pomocou PCR metódy. Početné primery boli navrhnuté tak, že obsahujú sekvencie, ktorými sa prekrývajú terminálne oblasti CDR a FR (viď metóda opísaná v publikácii WO 98/13 388).

Oblasť CDR, ktorá predstavuje dostatočné väzbové miesto pre antigén, je vybraná z FR oblasti ľudskej protilátky, spoločne s CDR. Aminokyseliny FR variabilnej oblasti protilátky je možné podľa potreby nahradiť tak, aby CDR oblasť modifikovanej ľudskej protilátky tvorila vhodné väzbové miesto pre antigén (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993), 53, 851-856).

Pre C oblasť H reťazca chimerickej protilátky a humanizovanej protilátky je použitá oblasť Cy1, Cy2, Cy3 a Cy4, zatiaľ čo pre L reťazec sú použité Ck a CA. Navyše, C oblasť ľudskej protilátky je možné modifikovať, čím sa zvýši stabilita protilátky alebo jej produkcia.

Chimerická protilátka sa skladá z variabilnej oblasti protilátky pochádzajúcej z cicavca iného ako človek; a konštantnej časti ľudskej protilátky. Na druhej strane, humanizovaná protilátka sa skladá z CDR pochádzajúceho z cicavca, iného než človek; a FR a C oblastí ľudskej protilátky. Pretože má humanizovaná protilátka v ľudskom tele nižšiu aktivitu, je užitočná ako efektívna súčasť terapeutickej látky predkladaného vynálezu.

Spôsob prípravy chimerickej protilátky je špecificky opísaný v citácii č. 4.

Navyše, metóda prípravy humanizovanej protilátky je špecificky opísaná v citácii č. 5. V tejto citácii, verzie a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, b1, d1, b3 a d3, ktoré majú aminokyselinové sekvencie uvedené v Tab. 1 a 2, boli použité ako humanizovaná variabilná (V) oblasť ťažkého (H) reťazca.

Tab.1

Aminokyselinové sekvencie variabilnej (V) oblasti ťažkého (H) reťazca

FR1 ODRI FR2 CDR2

L3S13O(í)

Z34963(b)

M30885U)

M62723(d>

280844(e)

L04345W

S78322(8>

Z26827(h)

U95239<1>

103147())

P01?42(bl)

P01742(dl)

Z80844(b3)

Z80844(d3)

3 4 5 6

1234567890)2345678901234567690 12345 67890123456789 012A3456789012345 QVOLLESGAVLARPCrSVKlSCKASCFHÍK OľVMH ftVKORFCQCLEtflC CMPANCHSMYDPKFQG

R-A-------H

R-A~—-M

R-A........

Tab. 2

Aminokyselinové sekvencie variabilnej (V) oblasti ťažkého (H) reťazca (pokračovanie Tab. 1)

P83 CDJ13 PR4

L39130W

Z34963W

M30885íc)

M62723(d)

Z8QS44(fi) tO4346(f)

S78322(g)

Z26827(h)

095239( i)

L03147O)

P01?42(bl)

PO1742Cdl)

280844(63)

Z80844(d3)

8 S 10 11

G7890123456789012ABC3456789012á4 56789012 34567890123 RAKLTAATSAS1AYLEFSSLTNEDSAVYVCAR DSGYAMDY WQGTLVTVSS

-VTH-D-TNT-4Í-L—RS—7-1......-.................

-VTtóLYD-KRQPS-RL-Y-AA-T.........................-VTk-DJ-T-T-K-1.—RS—P..............-.......

-VSI--DE-TK—M-Lfl—R9--T—P........-..........— .VT1--0T-T-T--IHR--RSD-T......-..........-.......K-T—DE'S-T—NQl—RS------S......................

-VTH5-DX-S-A'—W-XAS-7-1-F...............-......

-VTl—D—T-TVPM-L—R 5—T..........................

-VTP--D—NT-tó*LR—R$A~T..........................

-VTJ-Ď-TNT-M-L—RS—T-J...............-........

- VT) -Μ-Τ-Τ-Μ— 88......F.......................

-VT1-D—TNT—M-L—-RS—T-I*-.....-.......-........

-VT I -DB-T-T-M-L—R5------p.........-............

Navyše, verzie a, b, c, b1 a b2, ktorých aminokyselinová sekvencia je uvedená v Tab. 3, boli použité ako humanizovaná variabilná (V) oblasť ľahkého (L) reťazca.

Tab. 3

Aminokyselinová sekvencia variabilnej (V) oblasti ľahkého (L) reťazca

FR1 CDR1 FR2 CDR2

3 4 5

12345678901234567890123 45678901234 567800123456789 0123456 237332(a) 03QHTQSPSSLSASVGDKVTJTC KASQDIKSFU IflWPGXAPKLlIY YATSLAD

S68699(b) ....................... .................................

P01607(c) ..................-.......—.............—.........

S85921(bl) ................—-................P-.....S--T..........

X93625(b2) .................-......----------------.......

FR3 CDR3 PM

7 8 9 10

78901234567890123458789012345878 901234567 B901234567 237332(a) GVPSRPSGSGSGTDnXTlSSLQPBDFA'TYYC LQRGESPYT PGGCTKVBÍX

88B699(b) --------------Y...................-...............

P01607(c) --------------Y------...................

$65921(bl) ..............y.......................— ---------X93625(b2>......-.......Y...............................—

Meraním antigén väzbovej aktivity a TF neutralizačnej aktivity protilátok vzniknutých rôznymi kombináciami vyššie uvedených V oblastí H reťazcov a V oblastí L reťazcov (opísané v citáciách č.6 a 7 ako verzia H reťazec V oblasť a verzia L reťazec V oblasť) bolo zistené, že obzvlášť vysokú aktivitu mali kombinácie b-b, i-b a i-b2. Ďalej, schopnosť týchto humanizovaných protilátok viazať antigén je znázornená na Obr. 1. Aktivita protilátky pri neutralizácii ľudského TF (aktivita inhibujúca produkciu faktora Xa závislá od TF) je znázornená na Obr. 2.

Aktivita protilátky pri neutralizácii ľudského TF (aktivita protilátky v inhibícii väzby faktora X) je znázornená na Obr. 3. Aktivita protilátky pri neutralizácii ľudského TF (aktivita protilátky v inhibícii plazmatickej koagulácie na podklade TF) je znázornená na Obr. 4.

5. Modifikované protilátky

Protilátkou použitou v predkladanom vynáleze je buď fragment protilátky alebo modifikovaná protilátka za predpokladu, že sa viaže na ľudský TF a inhibuje aktivitu ľudského TF. Príklady fragmentov protilátok zahrňujú jeden reťazec Fv (scFv), v ktorom sú fragmenty Fab, F(abj₂, FvH reťazca a/alebo L reťazca spojené s vhodným linkerom.

Špecifickejšie, protilátka je opracovaná enzýmom, ako napríklad papaín a alebo pepsín, za vzniku fragmentov protilátky. Iným spôsobom je, že sa pripravia gény, ktoré kódujú tieto fragmenty, inzerujú sa do expresných vektorov a exprimujú sa vo vhodnom hostiteľskom organizme (viď napr. Co, M.S. et al., J. Immunol, 1994, 152, 2 968 - 2 976, Better, M. et Horowitz, A.H., Metods in Enzymology, 1989, 178, 497-515, Lamoyi, E., Metods in Enzymology, 1986, 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Metods in Enzymology, 1986, 121, 663-669, a Bird, R.E., et al., TIBTECH, 1991, 9, 132-137).

scFv sa získa spojením V oblasti H reťazca s V oblasťou L reťazca. V tomto prípade sú V oblasť H reťazca a V oblasť L reťazca spojené pomocou linkera, s výhodou pomocou peptidového linkera (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 5 879-5 883). V oblasť H reťazca a V oblasť L reťazca pochádzajú z akejkoľvek protilátky opísanej v predkladanom vynáleze. Pre peptidový linker, ktorý spája V oblasti, sa použije jednoreťazcový peptid, skladajúci sa napríklad z 12 až 19 aminokyselinových zvyškov.

DNA, ktorá kóduje scFv sa získa tak, že sa ako templát použije oblasť DNA kódujúca H reťazec a/alebo V oblasť H reťazca, a DNA kódujúca L reťazec a/alebo V oblasť L reťazca vyššie uvedenej protilátky, a predstavuje jej kompletnú a/alebo čiastočnú aminokyselinovú sekvenciu. Táto sekvencia je amplifikovaná pomocou PCR techniky a to tak, že sa použije dvojica primerov, ohraničujúca obidva jej konce. Taktiež je amplifikovaný linker, a to tak, že sa pripraví pomocou dvojice primerov, pomocou ktorých je potom linker napojený na reťazec H a L.

Akonáhle je pripravená DNA kódujúca scFv, je pripravený expresný vektor, ktorý nesie túto sekvenciu. V súlade s rutinne používanými metódami je expresný vektor transformovaný do hostiteľa, pomocou ktorého sa získa scFv. Tieto fragmenty protilátok sú tvorené hostiteľom tak, že exprimuje získaný gén. Termín „protilátka, ako je používaný v predkladanom vynáleze zahrňuje tieto fragmenty protilátok.

Ako pozmenená protilátka sa rovnako použije protilátka proti ľudskému TF, ktorá je konjugovaná s rôznymi molekulami, ako napríklad polyetylénglykol. Tieto modifikované protilátky rovnako spadajú pod termín „protilátka, ako je používaný v predkladanom vynáleze. Tieto modifikované protilátky sa získajú tak, že sa protilátka rôzne chemicky modifikuje. Postupy pre modifikáciu protilátok sú už známe.

6. Expresia a príprava rekombinantnej protilátky a/alebo pozmenenej protilátky.

Gén na produkciu protilátky je získaný vyššie uvedeným postupom a je exprimovaný pomocou jedného zo známych postupov. V prípade cicavčích buniek je protilátka exprimovaná z konštruktu zloženého z bežne používaného promótora, génu pre protilátku, ktorý má byť exprimovaný a poly A sekvencie na 3' konci. Príkladom promótora/enhancéra je okamžitý skorý promótor/enhancér z ľudského cytomegalovírusu.

Iné príklady promótora/enhancéra, pomocou ktorých je exprimovaná protilátka predkladaného vynálezu, zahrňujú vírusové promótory/enhancéry, ako napríklad pôvodom z retrovírusov, poliovírusov, adenovírusu a SV40 vírusu, ako i promótorové/enhancérové sekvencie pochádzajúce z cicavčích buniek, ako napríklad ľudský elongačný faktor 1 a (HEF1 a).

Gén pre protilátku je ľahko exprimovaný pomocou metódy podľa Mulligana et al. (Náture, 1979, 277,108-114) v prípade, že sa použije promótor/enhancér z SV40. V prípade, že sa použije promótor/enhancér z HEF1 a, je gén pre protilátku exprimovaný pomocou metódy podľa Mizushima et al. (Nucleic Acid Research, 1990, 18, 5322).

V prípade E. coli sa vyššie uvedený gén exprimuje z konštruktu nesúceho promótor, signálnu sekvenciu pre sekréciu protilátky a gén pre protilátku, ktorý bude exprimovaný. Príklady promótorov zahrňujú LacZ a araB promótor. Gén je exprimovaný pomocou metódy podľa Ward et al., (Náture, 1989, 341, 544-546;

FASEB J., 1992, 6, 2422-2427) v prípade, že sa použije LacZ promótor. V prípade, že sa použije ara B promótor, je gén exprimovaný pomocou metódy podľa Better et al, (Science, 1988, 240, 1041-1043).

V prípade, že sa protilátka produkuje do periplazmatického priestoru E. coli, je ako signálna sekvencia použitý pelB (Lei, S.P.et al., J. Bacteriol., 1987, 169, 43794383). Po izolácii protilátky produkovanej do periplazmatického priestoru baktérie je táto použitá po vhodnom opätovnom zbalení do vhodnej štruktúry protilátky.

Začiatky replikácie môžu pochádzať z rôznych zdrojov, napríklad SV40, poliovírusu, adenovírusu a/alebo bovinného papilomavírusu (BPV) atd. Expresný vektor môže obsahovať selekčný marker, ako napríklad gén pre aminoglykozyltransferázu (APH), gén pre tymidín-kinázu (TK), E. coli xantinguaninfosforibozyltransferázu (Ecogpt) a/alebo gén pre dihydrofolátreduktázu (dhfr).

Na produkciu protilátky v predkladanom vynáleze je možné použiť buď eukaryontný a/alebo prokaryontný expresný systém. Príklady eukaryontných buniek zahrňujú stabilné cicavčie línie, bunky hmyzu a bunky húb, ako napríklad bunky plesní a kvasiniek. Príklady prokaryontných buniek zahrňujú bakteriálne bunky, ako napríklad E.coli.

Protilátka použitá v predkladanom vynáleze je s výhodou exprimovaná v cicavčej bunke, ako napríklad CHO, COS, myelómových bunkách, BHK, Vero a alebo HeLa bunkách.

Transformované hostiteľské bunky sú potom inkubované in vitro a alebo in vivo za vzniku cieľovej protilátky. Hostiteľské bunky sú pestované podľa známych metód. Ako kultivačné médium je možné použiť DMEM, MEM, RPMI 1640 a/alebo IMDM. Médiá sú doplňované sérom. S vyššie uvedenými médiami je možné použiť fetálne teľacie sérum (FCS).

7. Izolácia a purifikácia protilátok

Protilátka exprimovaná a produkovaná ako bolo opísané vyššie je izolovaná z buniek a/alebo z hostiteľského zvieraťa a purifikovaná do homogenity. Izolácia a purifikácia protilátky použitej v predkladanom vynáleze sa vykoná pomocou afinitnej kolónky. Príklady kolóniek využívajúcich proteín A zahrňujú Hyper D, POROS a Sepharose F.F. (Pharmacia). Ďalej sú použité metódy izolácie a purifikácie pre bežné proteíny a nie je žiadne obmedzenie vo výbere metód. Napríklad, spoločne s vyššie uvedenou afinitnou purifikáciou je možné purifikáciu protilátky kombinovať s purifikáciou pomocou chromatografickej kolóny, filtráciou, ultrafiltráciou, odsoľovaním a/alebo dialýzou atď. (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and Dávid Lane,

Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). ,

8/1. Meranie inhibičného efektu na perzistenciu hyperkoagulačného stavu

Pre štúdium účinnosti predkladaného vynálezu v prevencii a liečbe ochorení spojených s hyperkoagulačným stavom, je potrebné pripraviť nový zvierací model. Detaily metód, použitých na overenie vyššie uvedených parametrov sú opísané v špecifikácii patentovej prihlášky s názvom „Zvierací model s chronickým hyperkoagulačným stavom a metóda prípravy tohto modelu, ktorú podáva rovnaký prihlasovateľ. Špecifické príklady overovacích metód sú opísané ako Príklad 1 v tejto špecifikácii.

Výsledok experimentu, v ktorom bola použitá vyššie uvedená humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 je znázornený v Príklade 2 a obrázkoch 11 až 13. Podľa tohoto experimentu bolo zvieraciemu myšiemu modelu z Príkladu 1, ktorému boli implantované bunky nádoru nesúceho gén pre ľudský TF, potom, čo počet jeho krvných doštičiek poklesol približne na polovicu hodnoty bežnej u myši, ktorej tumorové bunky nesúce gén pre ľudský TF neboli implantované (5 až 6 týždňov po implantácii), bola opakovane intravenózne podávaná humanizovaná protilátka proti ľudskému TF (verzia „i-b2) v koncentrácii 1 mg/kg. Výsledkom bolo, že počet krvných doštičiek bol až do konca experimentu rovnaký ako u myši, ktorej neboli implantované bunky nádoru. Experiment trval 3 týždne od začiatku podávania protilátky.

Podávanie humanizovanej protilátky proti ľudskému TF predkladaného vynálezu potlačuje nárast koncentrácie solubilných komplexov fibrín-monomérov (sFMC) a komplexu trombín-antitrombín III (TAT). Výsledky potvrdili, že podávanie protilátky proti ľudskému TF predkladaného vynálezu zabraňuje perzistenciu hyperkoagulačného stavu a udržuje normálny stav.

8/2. Potvrdenie terapeutického efektu na hyperkoagulačný stav spôsobený infekciou

Ako hyperkoagulačný stav sú označované predĺženie protrombínového času, pokles plazmatickej koncentrácie fibrinogénu, nárast sérovej koncentrácie fibríndegradačných produktov apod. Podávanie protilátky proti ľudskému TF predkladaného vynálezu zabraňuje predĺženie protrombínového času, poklesu plazmatickej koncentrácie fibrinogénu a nárastu sérovej koncentrácie fibríndegradačných produktov indukovaných kontinuálnou infúznou LPS. Tento výsledok demonštruje, že protilátka proti ľudskému TF predkladaného vynálezu má preventívny a/alebo terapeutický efekt na hyperkoagulačný stav, vzniknutý na podklade infekcie. Tento efekt je detailne opísaný v Príklade 3.

8/3. Potvrdenie preventívneho a/alebo terapeutického efektu na venóznu trombózu.

V Príklade 4 je detailne uvedené, že protilátka proti ľudskému TF predkladaného vynálezu má preventívny a/alebo terapeutický efekt na venóznu trombózu.

8/4. Potvrdenie preventívneho a/alebo terapeutického efektu na arteriálnu trombózu.

V Príklade 5 je detailne uvedené, že protilátka proti ľudskému TF predkladaného vynálezu má preventívny a/alebo terapeutický efekt na arteriálnu trombózu.

8/5. Potvrdenie preventívneho a/alebo terapeutického efektu na ochorenia vznikajúce na podklade zhrubnutia média krvných ciev.

V Príklade 6 je detailne uvedené, že protilátka proti ľudskému TF predkladaného vynálezu má preventívny a/alebo terapeutický efekt na ochorenia vznikajúce na podklade zhrubnutia média krvných ciev.

9. Metóda podávania a dávkové formy

Terapeutická látka predkladaného vynálezu je použitá na prevenciu, liečbu alebo zlepšenie ochorení spojených s hyperkoagulačným stavom, hyperkoagulačným stavom vzniknutým na podklade infekcie, venóznou trombózou, arteriálnou trombózou a ochorením vznikajúcich na podklade hypertrofie vaskulárneho média.

Efektívna dávka pre jedno podanie je v rozsahu od 0,001 do 1000 mg/kg telesnej hmotnosti. Alternatívne, dávka je v rozsahu od 0,01 do 100 mg/kg, s výhodou od 0,1 do 10 mg/kg. Terapeutická látka obsahujúca protilátku proti ľudskému TF predkladaného vynálezu nie je na vyššie uvedenom dávkovači rozmedzí limitovaná.

Metóda podávania je s výhodou intravenóznou injekciou, intravenóznou infúziou a im podobným, metóda nieje limitovaná len na vyššie uvedené.

Terapeutická látka predkladaného vynálezu obsahujúca ako účinnú látku protilátku proti ľudskému TF môže byť pripravená do liekovej formy pomocou štandardnej metódy (Remington's Pharmaceutical Science, posledné vydanie, Mark Publishing Company, Easton, USA), a môže obsahovať farmakologicky prijateľný nosič a/alebo aditíva.

Príklady takýchto nosičov a aditív sú voda, farmakologicky prijateľné organické rozpúšťadlo, kolagén, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón, karboxyvinylpolymér, karboxymetylcelulóza sodná, polyakryl sodný, alginát sodný, vo vode rozpustný dextrán, karboxymetylškrob sodný, pektín, metylcelulóza, etylcelulóza, xantánová živica, arabská guma, kazeín, agar, polyetylénglykol, diglycerín, glycerín, propylénglykol, vazelína, parafín, stearylalkohol, kyselina steárová, ľudský sérový albumín (HSA), manitol, sorbitol, laktóza, farmakologicky prijateľná povrchovo aktívna látka apod.

Aditíva sú vybrané (ale nie sú limitované len na uvedené) zo skupiny uvedenej vyššie a môžu byť vhodne ich kombináciami, podľa očakávanej dávkovej formy terapeutickej látky predkladaného vynálezu.

Napríklad, pri použití ako injekcie, je purifikovaná protilátka proti ľudskému TF rozpustená v rozpúšťadle, ako napríklad fyziologický roztok, pufer a roztok glukózy, ku ktorým sa pridá anti-adsorbent, ako napríklad Tween 80, Tween 20, želatína alebo ľudský sérový albumín. Alternatívne sú aditíva lyofilizované a je potrebné ich pred použitím rozpustiť a rekonštituovať do dávkovej formy. Ako excipient pre lyofilizáciu sa používajú cukrové alkoholy a cukry, ako napríklad manitol a glukóza.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predkladaný vynález bude teraz vysvetlený podrobnejšie pomocou príkladov.

Príklad 1. Príprava experimentálnej myši

Cicavčí expresný vektor pCOS1, do ktorého bol vložený gén kódujúci ľudský tkanivový faktor (šekvencia ID: 103), bol naštiepený reštrikčným enzýmom Prul a bol linearizovaný. Linearizovaný vektor bol potom elektroporáciou vnesený do ľudskej myelómovej bunkovej línie KPMM2 (FERM P-14 170).

pCOS1 bol skonštruovaný tak, že sa z HEF-PMh-gy1 pomocou reštriktáz Eco Rl a Smal vyštiepil gén pre protilátku a potom bol k nemu priligovaný adaptor Eco RlNotl-BamHI (Takara Shuzo). Bunky nesúce tento konštrukt boli kultivované v RPMI I 640 médiu (obsahujúce 20 % FCS, hlL-6: 4 ng/ml), obsahujúcim 1 mg/ml G418. Expresia ľudského tkanivového faktora bola potvrdená prietokovou cytometriou pomocou protilátky proti ľudskému tkanivovému faktoru (American Diagnostica). FACS sortovanie umožnilo vytriediť bunkovú líniu KPMM2/TF226, ktorá niesla gén pre ľudský tkanivový faktor.

Rodičovský kmeň (KPMM2/parent) pred vnesením génu pre ľudský tkanivový faktor a kmeň KPMM2/TF226 s vneseným génom pre ľudský tkanivový faktor boli kultivované v RPMI 1 640 médiu obsahujúcom 4 ng/ml ľudského IL-6 a 20 % bovinného fetálneho séra. Rastúce KPMM2/TF226 a KPMM2/parent bunky boli separátne subkutánne implantované v denzite 1 x 10⁷ do slabín SCID myší (od firmy CLEA Japan), 7-týždňov starých samčekov s priemernou telesnou hmotnosťou 22 g. Boli sledované zmeny veľkosti tumoru v čase, počty krvných doštičiek, plazmatická koncentrácia ľudského tkanivového faktora, fibrinogénu, solubilných komplexov fibrín-monomérov (sFMC) a koncentrácia komplexov trombín-antitrombín lll (TAT).

Výsledky uvedené na obr. 5 ukazujú, že u všetkých myší došlo v čase k nárastu tumorovej hmoty. Ako je uvedené na obr. 6, plazmatická koncentrácia ľudského tkanivového faktora vzrastala v čase u myší, ktorým boli implantované bunky nesúce gén pre ľudský tkanivový faktor, ale nevzrastala u myší, ktorým boli implantované bunky bez génu pre ľudský tkanivový faktor. Ako je uvedené na obr. 7 a 8, u myší, ktorým boli implantované bunky nesúce gén pre ľudský tkanivový faktor, klesala hodnota krvných doštičiek a fibrinogénu, naznačujúc, že tieto koagulačné komponenty krvi boli konzumované. Naopak, u myší, ktorým boli implantované bunky bez génu pre ľudský tkanivový faktor, nebola zaznamenaná konzumácia týchto koagulačných faktorov krvi.

Ako je uvedené na obr. 9 a 10, u myší, ktorým boli implantované bunky nesúce gén pre ľudský tkanivový faktor, narastala plazmatická koncentrácia solubilných komplexov fibrín-monomérov (sFMC) a rovnako komplexov trombínantitrombín III (TAT), čo naznačuje, že hyperkoagulačný stav je perzistentný. Naopak, u myší, ktorým boli implantované bunky bez génu pre ľudský tkanivový faktor, nebol zaznamenaný žiadny nárast koncentrácie vyššie uvedených koagulačných komponentov krvi.

Z vyššie uvedených výsledkov vyplýva, že u myší, ktorým boli implantované bunky nesúce gén pre ľudský tkanivový faktor, pretrváva hyperkoagulačný stav. Toto zistenie potvrdzuje, že zviera predkladaného vynálezu je vhodné ako modelový organizmus pre chronický hyperkoagulačný stav.

Príklad 2

Na modeli opísanom v príklade 1 bol skúmaný efekt humanizovanej protilátky proti ľudskému TF, verzie „i-b2. Päť až šesť týždňov po implantácii KPMM2/TF226 do SCID myší (od firmy CLEA Japan), 7-týždňov starých samčekov s priemernou telesnou hmotnosťou 22 g, poklesla hodnota krvných doštičiek na polovicu v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorej neboli implantované nádorové bunky. Toto zistenie potvrdzuje pretrvávanie hyperkoágulačného stavu. Odo dňa 45 po implantácii nádorových buniek bola jedenkrát týždenne intravenózne podávaná humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2. Výsledkom bolo, že v deň 3 od začiatku podávania humanizovanej protilátky proti ľudskému TF, verzie „i-b2 sa hodnota počtu krvných doštičiek vrátila na hodnotu v kontrolnej skupine, ktorej neboli implantované nádorové bunky, a táto hodnota krvných doštičiek sa udržala po celý čas trvania experimentu (3 týždne).

V deň 6 po treťom podaní humanizovanej protilátky proti ľudskému TF, verzie „i-b2 bola určená plazmatická koncentrácia solubilných komplexov fibrín-monomérov (sFMC) a komplexov trombín-antitrombín lll (TAT). Bolo zistené, že podávanie protilátky bránilo ich nárastu (obr. 12 a 13). Tieto výsledky naznačujú, že humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzie „i-b2 má v experimentálnom modeli vyznačujúcom sa perzistentným hyperkoagulačným stavom pri podávaní jedenkrát týždenne efekt na udržiavanie stabilných hodnôt koagulácie.

Príklad 3

LPS rozpustený vo fyziologickom roztoku bol kontinuálne infuzovaný do žily opice druhu Cynomolgus rýchlosťou 1 mg/kg/h (2 ml/kg/h) počas 6 hodín, pri izofuránovej anestézii. Zvieratá boli importované z Chuang Primates Experimental Animal Research Center, Nanning, Čína, rovnaký počet samčekov a samičiek, priemerný vek 5 až 7 rokov, telesná hmotnosť 2,99 až 5,81 kg. Intravenózne podanie humanizovanej protilátky proti ľudskému TF, verzie „i-b2 v koncentrácii 0,3 mg/kg (1 ml/kg) opiciam testovanej skupiny a rozpúšťadla (20 mM octan sodný, 150 mM chlorid sodný, pH 6,0) opiciam kontrolnej skupiny bolo vykonané 10 minút pred začiatkom kontinuálneho podávania LPS.

Na konci kontinuálneho podávania LPS bola normálna a citrátovaná krv odoberaná pomocou katétru zavedeného do femorálnej artérie a bol určený protrombínový čas, plazmatická koncentrácia fibrinogénu a sérová koncentrácia fibrín-degradačných produktov. Ako je uvedené v Tab. 4, injekcia LPS spôsobila predĺženie protrombínového času, pokles plazmatickej koncentrácie fibrinogénu a nárast sérovej koncentrácie fibrín-degradačných produktov, tj: hyperkoagulačný stav. U opíc, ktorým bola podaná humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 boli tieto zmeny silne potlačené. Tieto výsledky ukazujú, že humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 potlačuje hyperkoagulačný stav, vzniknutý na podklade infekcie.

Tab. 4

Efekt humanizovanej protilátky proti ľudskému TF na hyperkoagulačný stav spôsobený injekciou

LPS

	Kontrolná skupina n=4	Skupina, ktorej bola podávaná humanizovaná protilátka proti ľudskému TF n=4
Pred injekciou LPS	Po injekcii LPS	Pred injekciou LPS	Po injekcii LPS
Protrombínový čas (sekundy)	11,1 ±0,3	15,8 ±2,3	10,9 ±0,3	11,7 ±0,6
Plazmatická koncentrácia fibrinogénu (mg/dl)	150 ±20	90 ±20	170 ±10	160 ±20
Sérová koncetrácia fibrín— degradačných produktov	0±0	43 ±14	0±0	8 ±4

* Priemer ± štandardná chyba

Príklad 4

Efekt humanizovanej protilátky proti ľudskému TF bol skúmaný na modeli venóznej trombózy vzniknutej na podklade venostázy a poškodenia steny žily. Venostáza bola spôsobená ligáciou krvnej cievy. Poškodenie steny žily bolo indukované pomocou „polidocanolu (terapeutická látka na liečbu ezofageálnych varixov, Kreussler).

Opice Cynomolgus s priemerným vekom 3 až 4 roky, s hmotnosťou 2,97 až 3,99 (pôvodom z Chuang Primates Experimental Animal Research Center, Nanning, Čína) boli použité ako modelové zvieratá pre venóznu trombózu. Opice boli anestezované zmesou izofluránu a oxidu dusného a boli uvoľnené jugulárne žily bilaterálne. Segment jugulárnych žíl bol zaligovaný stehom na strane proximálnej k srdcu a reverzibilne zaligovaný ďalším stehom smerom k hlave tak, aby bolo možné tento steh neskôr uvoľniť. Do exponovaného segmentu jugulárnej žily bol medzi obe ligatúry založený katéter, smerom od srdca k hlave. Krv zo segmentu medzi obidvomi ligatúrami bola katétrom odstránená a lumen žily bol prepláchnutý fyziologickým roztokom. Katétrom bol do exponovaného segmentu instilovaný 0,5 % roztok polidocanolu. Katéter bol odstránený a krvné cievy boli okamžite zaligované na mieste bezprostredne proximálne od miesta inzercie katétru.

Po 5 minútach bola reverzibilná ligatúra na mieste bližšie k srdcu uvoľnená,

I aby bol odstránený polidocanol. Reverzibilná ligatúra na hlavovej strane bola uvoľnená a bolo odobraté malé množstvo krvi. Potom bol segment exponovanej krvnej cievy proximálne od miesta inzercie katétru úplne uzavretý. Potom, čo sa segment naplnil krvou, bola exponovaná jugulárna žila na hlavovej strane kompletne zaligovaná. Segment medzi obidvoma kompletnými ligatúrami bol dlhý 1,5 cm. Po 30 minútach bola zmerená hmotnosť vytvorenej krvnej zrazeniny. Na meranie bola použitá suma hmotnosti krvných zrazenín z bilaterálnych jugulárnych žíl. Humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 bola podaná intravenózne v koncentrácii 0,3 mg/kg a 1,5 mg/kg, 2 hodiny pred začiatkom tvorby žilového trombu. Výsledky sú uvedené v Tab. 5

Podávanie humanizovanej protilátky proti ľudskému TF viedlo k redukcii hmotnosti tvorenej krvnej zrazeniny. Tieto výsledky teda naznačujú, že humanizovaná protilátka proti ľudskému TF má profylaktický efekt na tvorbu žilových trombov na tomto modeli.

Tab. 5

Efekt humanizovanej protilátky proti ľudskému TF na trombózu žíl u opíc Cynomolgus

	Testovaná látka nebola podaná n=2	Humanizovaná protilátka proti ľudskému TF	Humanizovaná protilátka proti ľudskému TF
		0,3 mg/kg i.v. n=2	1,5mg/kg i.v. n=2
Suma vlhkej hmotnosti	20,8	1,4	0,0
žilových krvných zrazenín v ľavej a pravej jugulárnej žile	21,9	1,1	0,4
(mg)
Priemer	21,4	1,3	0,2

Príklad 5

Efekt humanizovanej protilátky proti ľudskému TF na arteriálnu trombózu bol skúmaný na modeli arteriálnej trombózy indukovanej angiostenózou a poškodením steny artérie. Angiostenóza a poškodenie arteriálnej steny boli spôsobené pevnou ligatúrou krvnej cievy pomocou 20G ihly so zaguľatenou špičkou, ktorá bola zapichnutá do cievy a potom z cievy vytiahnutá. Toto je model, ktorý napodobuje angiostenózu spôsobenú aterosklerózou a poškodením cievnej steny na podklade ruptúry aterosklerotického plaku.

Opice Cynomolgus s priemerným vekom 3 až 4 roky, s hmotnosťou 2,97 až 3,99 (pôvodom z Chuang Primates Experimental Animal Research Center, Nanning, Čína) boli použité ako modelové zvieratá pre arteriálnu trombózu. Opice boli anestezované ketamínhydrochloridom (intramuskulárne podanie) a butofanolom (intramuskulárne podanie) a bola uvoľnená pravá spoločná karotída. Sonda dopplerovho prietokomeru bola priložená k exponovanej krvnej cieve a krvný tok bol monitorovaný počas 5 minút. Po zistení, že prietok krvi cievou je konštantný, bola v proximálnej časti cievy indukovaná angiostenóza a poškodenie arteriálnej steny.

Krvný prúd bol pozorovaný ďalších 15 minút a bol určený čas, kedy bola vytvorená cievna oklúzia v dôsledku tvorby trombu. Po uvoľnení ligatúry na pravej spoločnej karotíde bola opiciam z experimentálnej skupiny podaná humanizovaná protilátka proti ľudskému TF. V ľavej spoločnej karotíde bol taktiež určený čas, kedy nastala oklúzia cievy v dôsledku tvorby trombu. Humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 bola podaná intravenózne v koncentrácii 0,3 mg/kg a 1,5 mg/kg, 1 hodinu pred začiatkom tvorby trombu v ľavej spoločnej karotíde. Výsledky sú uvedené v Tab. 6.

Podanie humanizovanej protilátky proti ľudskému TF viedlo k redukcii dĺžky vaskulárnej oklúzie. Tieto výsledky teda naznačujú, že humanizovaná protilátka proti ľudskému TF má profylaktický efekt na tvorbu arteriálneho trombu v tomto modeli.

Tab. 6

Efekt humanizovanej protilátky proti ľudskému TF na tvorbu arteriálneho trombu u opice Cynomolgus

	Testovaná látka nebola podaná n=2	Humanizovaná protilátka proti ľudskému TF 0,3 mg/kg i.v. n=2	Humanizovaná protilátka proti ľudskému TF 1,5 mg/kg i.v. a=2
Čas vaskulárnej oklúzie počas 15 min. pozorovania po podaní testovanej látky (min.) (ľavá spoločná karotída)	12,2	7,2	3,5
Čas vaskulárnej oklúzie počas 15 min. pozorovania po podaní testovanej látky (min.) (ľavá spoločná karotídapravá spoločná karotída)	+ 0,9	-4,4	-6,2

* Uvedené hodnoty predstavujú priemerné hodnoty skupiny

Príklad 6

Opice Cynomolgus (zakúpené od firmy KEARI Inc, opice vyrástli vo Vietname, odhadovaný vek 4 až 5 rokov) boli anestezované 5 až 10 mg/kg ketalaru, i.m. a 15 až mg/kg pentobarbitalu, i.v.. Krk bol prerezaný a bola uvoľnená karotída. Externou karotídou bol zavedený Fogartyho katéter (3 až 5 F) a balón bol nafúknutý tak, aby poškriabal vaskulárnu intimu päťkrát. Po poškrabaní bol katéter odstránený a rana bola zošitá. O jeden mesiac neskôr boli zvieratá eutanázované a bola im vybratá karotída. Súčasne bola podobným spôsobom vybratá kontralaterálna karotída, ktorá nebola poškodená balónom.

Humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 bola podaná intravenózne v koncentrácii 0,3 mg/kg a 1,5 mg/kg, 10 minút pred poškodením cievnej steny. Extrahovaná artéria bola fixovaná vo formalíne. Boli pripravené histologické preparáty, ktoré boli farbené HE, ich elastica bola farbená vanGiesonom. Potom nasledovala obrazová analýza na zmeranie oblasti intimy. Výsledky ukazujú (a ako je uvedené na obr. 7), že humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 zabraňuje zúženiu lumina cievy tým, že zabraňuje rastu cievneho tkaniva a tým efektívne zabraňuje restenóze.

Tab.7

	Zviera č.	Nepoškodená krvná cieva	Poškodená krvná cieva Plocha médie v mm²
Plocha mm²	médie v
Kontrolná skupina	1		1,06	2,15(2,3%)
	2 3		0,74	1,45(196%)
			0,82	1,78(217%)
Protilátka proti	4		0,75	1,15(153%)
ľudskému TF	5		0,78	0,96(123%)
	6		0,86	0,98(114%)

(Percento vztiahnuté k nepoškodenej strane)

Príklad 7

V príklade 1 bol skúmaný efekt humanizovanej protilátky proti ľudskému TF „verzia i-b2 a nízkomolekulárneho heparínu. 6 až 7 týždňov po implantácii

KPMM2/TF226 buniek do SCID myši (CLEA Japonsko, samčekovia, 7 týždňov veku, priemerná telesná hmotnosť 24 g) bol počet krvných doštičiek redukovaný na približne polovicu v porovnaní s kontrolnou skupinou, ktorej neboli implantované nádorové bunky, čo potvrdzuje perzistenciu hyperkoagulačného stavu. Od 49. dňa po implantácii bola intravenózne podávaná humanizovaná protilátka proti ľudskému TF, verzia „i-b2 v koncentrácii 1 mg/kg. Alternatívou bolo podávanie nízkomolekulárneho heparínu pomocou subkutánne zabudovanej osmotickej pumpy, ktorá dovoľuje neprerušované 24 hodinové podávanie účinnej látky, o koncentrácii 601,5 lU/kg, 1 900,3 lU/kg a 6 487 lU/kg. Výsledkom bolo, že sa v deň 1 po podaní humanizovanej protilátky proti ľudskému TF, verzie „i-b2 vrátil stav krvných doštičiek do pôvodného stavu a v deň 3 bol počet krvných doštičiek vyšší než v kontrolnej skupine, ktorej neboli implantované nádorové bunky. Efekt tretieho dňa sa udržal dokonca po 7. dni. Naopak, v skupine, ktorej bol podávaný nízkomolekulárny heparín o koncentrácii 6 487 lU/kg, bol pozorovaný mierny návrat počtu krvných doštičiek k pôvodnej hodnote v deň 1 a 2 po podaní, ale v deň 3 tento efekt zmizol, aj keď existovala istá tendencia k návratu počtu krvných doštičiek do pôvodného stavu. (Obr. 14).

Referenčný príklad 1

Spôsob prípravy solubilného ľudského TF

Solubilný ľudský TF bol pripravený nasledujúcim spôsobom.

Gén kódujúci penetračnú oblasť ľudského TF, v ktorom boli aminokyseliny na pozícii 220 a ďalej nahradené FLAG peptidom M2, bol vložený do cicavčieho expresného vektora (obsahujúci gén pre rezistenciu na neomycín a DHFR gén). Tento vektor bol transfekovaný do CHO buniek. cDNA sekvencia ľudského TF bola publikovaná v článku Morrissey, J.H, et al, Celí, 1987, 50: 129-135. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia tohoto solubilného ľudského TF je uvedená v databáze sekvencií pod číslom 101 a 102. Po selekcii s G418 boli vyselektované bunky exprimujúce TF a expresia bola ešte zvýšená pomocou expozície metotrexátu. Bola ustanovená shTF exprimujúca bunková línia.

Bunky boli kultivované v bezsérovom médiu CHO-S-SFMII (GIBCO) a bol odobratý supernatant, obsahujúci shTF. Supernatant bol dvakrát nariedený rovnakým objemom 40 mM Tris-HCl pufrom (pH 8,5). Nariedený supernatant bol nanesený na

Q-Sepharose Fast Flow Column (od firmy Pharmacia Biotech) o objeme 100 ml, pričom kolóna bola pred nanesením ekvilibrovaná 20 mM Tris-HCI pufrom (pH 8,5). Po prepláchnutí rovnakým pufrom obsahujúcim 0,1 M NaCI, bola koncentrácia NaCI zmenená na 0,3 M a shTF bol z kolóny eluovaný. K získanej shTF frakcii bol pridaný sulfát amonný s výslednou koncentráciou 2,5 M. Zmes bola centrifugovaná (10 000 ot., 20 min) za precipitácie kontaminujúcich proteínov. Supernatant bol pridaný k Butyl TOYOPEARL (30 ml, od firmy TOSOH) a potom bol prepláchnutý 50 mM TrisHCI pufrom (pH 6,8) obsahujúcim 2,5 M sulfát amonný. V 50 mM Tris-HCI pufri (pH 6,8) sa koncentrácia sulfátu amonného lineárne znižovala od 2,5 M do O M, čo umožnilo elúciu shTF. Frakcia, najbohatšia na shTF, bola koncentrovaná pomocou Centri-Prep 10 (od firmy Amicon). Koncentrát bol naliaty na TSKgel G3000SWG kolóny (21,5 x 600 mm, od firmy TOSOH), ktorá bola predtým ekvilibrovaná pomocou 20 mM Tris-HCI pufra s pH 7,0, ktorý obsahoval 150 mM NaCI. Najbohatšie shTF frakcie boli zbierané. Frakcie boli sterilizované 0,22 pm filtráciou a výsledný produkt predstavoval solubilný ľudský TF (shTF). Bola vypočítaná koncentrácia vzorky: pre prípad, že molárny extinkčný koeficient vzorky je ε=40,130 a mólová hmotnosť je 43,210.

Referenčný príklad 2

Príprava protilátky proti ľudskému TF

1. Purifikácia ľudského TF

TF z ľudskej placenty bol purifikovaný metódou podľa Ito (Ito, T. et al., J. Biol. Chem., 114:691-696, 1993). Ľudská placenta bola homogenizovaná v Trisom pufrovanom soľnom roztoku (TBS, pH 7,5), obsahujúcom 1,0 mM benzamidínhydrochlorid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM diizopropylfluorofosfát a 0,02 % azid sodný, a potom bol precipitát zbavený tukov pomocou ľadového acetónu. Získaný odtučnený prášok bol resuspendovaný vo vyššie uvedenom pufri obsahujúcom 2 % Triton X-100, ktorý solubilizoval TF. Supernatant bol nanesený na afinitnú chromatografickú kolónu (Concanavalin A-Sepharose 4B kolóna od firmy Pharmacia) a Sepharose 4B kolónu s naviazanou protilátkou proti TF (od firmy Pharmacia), čím bol získaný purifikovaný TF. Proteín bol koncentrovaný pomocou ultrafiltračnej membrány (PM-10, od firmy Amicon). Purifikovaná vzorka bol uložená pri teplote 4 °C.

Obsah TF v purifikovanej vzorke bol kvantifikovaný sendvičovou ELISA technikou, kombinovanou s komerčne dostupnou monoklonálnou a polyklonálnou protilátkou proti TF (od firmy American Diagnostica), s rekombinantným TF ako štandardom.

Čistota purifikovanej vzorky bola konfirmovaná pomocou SDS-PAGE elektroforézy s 4 až 20 % hustotným gradientom, nasledovaná farbením striebrom.

2. Imunizácia a príprava hybridómu

Po zmiešaní purifikovaného ľudského TF (70 pg/ml) s rovnakým objemom kompletného Freudovho adjuvans (od firmy Difco), bola táto zmes subkutánne injekovaná do bruška 5 týždňov starých Balb/C samčekov myší (od firmy Nipon Charles River) v koncentrácii 10 pg TF/myš. V deň 12, 18 a 25 bol TF zmiešaný s Freudovým kompletným adjuvans v koncentrácii 5 pg/myš a znovu subkutánne myšiam injekovaný. Ako finálna imunizácia bol v deň 32 myšiam podaný roztok TF v PBS intraperitoneálne v koncentrácii 5 pg/myš.

Tri dni po finálnej imunizácii boli získané slezinné myšie bunky zo 4 myší a tieto boli fúzované s bunkami myšej myelómovej línie P3U1 v pomere 1:5 pomocou polyetylénglykolovej metódy. Fúzované bunky boli suspendované vRPMI médiu (od firmy Lifetech Oriental), obsahujúcom 10 % fetálneho bovinného séra. Bunky boli vysiate na 96 jamkovú doštičku v hustote 400 buniek na jamku. V deň 1, 2, 3 a 5 po fúzii boli polovica média vymenená za nové RPMI médium (ďalej pod názvom HAT médium), obsahujúce HAT (od firmy Dainippon Seiyaku) a Hl (od firmy Boehringer Mannheim GmbH), za HAT selekciu hybridómov.

Hybridómy selektované na základe skrinovacej metódy opísanej nižšie boli dvakrát klonované za limitného riedenia.

Pre limitné riedenie bolo inokulovaných 0,8 buniek do jednej jamky 96 jamkovej doštičky. V jamkách, kde sa objavili mikroskopicky viditeľné kolónie, boli kolónie selektované pomocou nižšie uvedeného merenia väzbovej aktivity k TF a neutralizačnej aktivity TF. Získané klony boli prenesené z HAT média do RPMI média. Potom, čo bol overený pokles tvorby protilátok v dôsledku prenosu buniek do iného média, bolo uskutečnené limitné riedenie pre kompletné rozklonovanie. Pomocou vyššie uvedenej procedúry boli ustanovené línie hybridómov, ktoré produkovali 6 protilátok (ATR-2, 3, 4, 5, 7 a 8), silne inhibujúcich väzbu komplexu

TF/faktor Vila a faktor X.

3. Tvorba ascitu a purifikácia protilátky

Tvorba ascitu pomocou ustanovených hybridómových línií bola uskutočnená pomocou štandardnej metódy. 10⁶ hybridómových buniek, kultivovaných in vitro, bolo intraperitoneálne implantovaných do Balb/C samčeka myši, ktorému bol predtým dvakrát intravenózne podaný minerálny olej. Ascitus bol odobratý myšiam, ktoré mali nafúknuté bruško, 1 až 2 týždne po implantácii.

Purifikácia protilátky z ascitu bola uskutočnená pomocou ConSepLIOO systému (od firmy Millipore) a Proteín A kolóny (od firmy Nippon Gaishi).

4. ELISA test

Bunky ľudského karcinómu močového mechúra J82 (Fair D.S. et al., J. Biol. Chem., 262:11 692-11 698, 1987), ktoré exprimujú TF vo veľkom množstve, boli získané z ATTC banky tkanivových kultúr a boli kultivované v RPMI médiu pri 37 °C, % CO2 a 100 % vlhkosti.

Doštičky pre ELISA test boli pripravené inokuláciou J82 buniek na 96-jamkovú doštičku v hustote 10⁵ buniek/jamku, kultivované jeden deň vo vyššie uvedených podmienkach. Potom im bolo médium odstránené, bunky boli dvakrát premyté PBS, bol pridaný 4 % roztok paraformaldehydu (PFA) a bunky boli ponechané na ľade počas 10 minút, aby sa vykonala imobilizácia. Potom, čo bol odstránený PFA, bola doštička opláchnutá PBS, bol pridaný Tris blokovací pufer obsahujúci 1 % BSA a 0,02 % azid sodný. Doštička bola uložená pri 4 °C do ďalšieho použitia.

ELISA detekcia bola uskutočnená nasledujúcim spôsobom: Blokovací pufer bol odstránený z vyššie uvedenej pripravenej doštičky, na ktorú bol nanesený roztok protilátky proti TF alebo supernatant kultúry hybridómu. Reakcia bola uskutočnená pri izbovej teplote 1,5 hodiny. Po opláchnutí PBS s 0,05 % Tween 20, bola pridaná kozia anti-myšia IgG (H+L) protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatázou (od firmy Zymed). Reakcia sa vykonávala 1 hodinu. Po opláchnutí bol pridaný 1 mg/ml pnitrofenylfosfát disodný (od firmy Sigma) a po hodine bola merená absorbancia pri 405/655 nm, detekujúca množstvo protilátky proti TF naviazaného na J82 bunky.

5. Štúdia na určenie neutralizačnej aktivity proti TF, s faktorom Xa ako indexom

K 50 μΙ TBS, pH 7,6, s 5 mM CaCb a 0,1 % bovinného sérového albumínu bolo pridaných 10 μΙ tromboplastínu z ľudskej placenty (roztok 5 mg/ml) (Tromborel S od firmy Boehring) a 10 μΙ roztoku faktoru Vila (82,5 ng/ml, od firmy American Diagnostics). Reakcia bola uskutočňovaná hodinu pri izbovej teplote,za vzniku komplexov TF a faktor Vila. Po pridaní 10 μΙ nariedenej protilátky proti TF alebo hybridómového supernatantu a 10 μΙ roztoku faktora X (3,245 mg/ml, od firmy Celsus Laboratories), uskutočňovala sa reakcia 45 minút. Potom bola reakcia zastavená 10 μΙ 0,5 M EDTA. 50 μΙ 2 mM S-2 222 roztoku (od firmy Daiichi Kagaku Yakuhin) bolo pridané k reakčnej zmesi a po 30 minútach boli merané zmeny v absorbancii pri 405/655 nm. Na základe meraní absorbancie bol stanovený faktor X produkujúci aktivitu TF. Pomocou tejto metódy je možné stanoviť aktivitu protilátky, ktorá inhibuje väzbu komplexu TF/faktor Vila a faktor X.

6. Štúdia na stanovenie inhibičnej aktivity proti plazmatickej koagulácii μΙ vhodne nariedenej protilátky proti TF bolo zmiešané so 100 ml komerčne dostupného roztoku normálnej ľudskej plazmy (od firmy Kojin Bio). Reakcia sa uskutočnila pri teplote 37 °C počas 3 minút. Potom bolo k reakci pridané 50 μΙ tromboplastínu pochádzajúceho z ľudskej placenty (1,25 mg/ml) a bol meraný čas potrebný na koaguláciu plazmy. Meranie bolo vykonávané prístrojom na meranie plazmatickej koagulácie (CR-A: Amelung).

7. Určenie izotypu protilátky

Na určenie izotypu purifikovanej alebo hybridómovej supernatantovej protilátky bol použitý izotypovací kit pre myšie monoklonálne protilátky od firmy Amersham.

Výsledky sú uvedené nižšie.

Tab. 5

Imunoglobulínový izotyp monoklonálnej protilátky proti TF ATR-2 lgG1,K lgG1,K

ATR-3

ATR-4 lgG1,K

ATR-5 lgG1,K

ATR-7 lgG2a, κ

ATR-8 lgG2a, κ

Referenčný príklad 3

Klonovanie DNA kódujúcej V oblasť myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF

1. Príprava mRNA mRNA boli pripravené z hybridómu ATR-5 (lgG1, k), ktorý je uvedený v referenčnom príklade 2 za použitia Quick-Prep mRNA purifikačného kitu (Pharmacia Biotech). Všetky hybridómové bunky boli kompletne homogenizované vextrakčným pufrom podľa návodu uvedeného v kitu. Potom boli mRNA purifikované pomocou oligo (dT) - celulózové centrifugačné kolónky, a precipitované etanolom. mRNA precipitát bol rozpustený v elučnom pufri.

2. Preparáčia a amplifikácia cDNA génu kódujúceho V oblasť myšej protilátky.

Klonovanie H reťazca V oblasti cDNA

Klonovanie génu kódujúceho V oblasť H reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF bolo uskutočnené pomocou 5'- RAČE metódy (Frohman, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 8 998 - 9 002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Research, 17: 2 919 - 2 932, 1989). Pre 5-RACE metódu bol použitý Maratón cDNA Amplification Kit (od firmy Clontech) a reakcia bola uskutočnená podľa inštrukcií uvedených v kitu.

pg RNA, pripravenej ako bolo uvedené vyššie, bol použitý ako templát na syntézu cDNA vlákna pomocou priméru v kite. Reverzná transkripcia sa vykonala 60 minút pri teplote 42 °C. K reakčnej zmesi bola potom pridaná DNA-polymeráza I, DNA ligáza a RNA-áza H pri 16 °C počas 45 minút a bolo syntetizované druhé vlákno cDNA. Dvojreťazová cDNA bola extrahovaná fenolom a chloroformom a precipitovaná etanolom.

K obidvom koncom cDNA boli cez noc pomocou T4 DNA ligázy pri teplote 16°C priligované adaptéry. Reakčná zmes bola nariedená 50-krát pomocou 10 mM Tricin-KOH (pH 8,5) s 0,1 mM EDTA. Na tomto templáte bol pomocou PCR reakcie amplifikovaný fragment kódujúci V oblasť H reťazca. Adaptérový primér 1 z kitu bol použitý ako 5' primér a ako 3' primér bol použitý MGC-G1 primér (sekvencia č. 1) (S.T. Jones, et al., Biotechnology, 9:88-89, 1991).

PCR roztoky pre amplifikáciu V oblasti H reťazca ATR-5 protilátky v 100 μΙ obsahovali 120 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM KCI, 6 mM (NH₄)₂ SO₄, 0,1 % Triton X100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCI₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), 30 až 50 pmol adaptérového priméru 1, rovnako ako MHC-G1 priméru a 1 až 5 μΙ cDNA, ku ktorej bol priligovaný cDNA adaptér. PCR reakcia bola uskutočnená použitím DNA Termal Cycler 480 (od firmy Perkin-Elmer), v 30 cykloch s týmto profilom: 94 °C, 30 sekúnd, 55 °C, 30 sekúnd, 74 °C 1 minúta.

ii. Klonovanie L reťazca V oblasti cDNA

Klonovanie génu kódujúceho V oblasť L reťazca myšej monoklonálnej protilátky proti ľudskému TF bolo uskutočnené pomocou 5'- RAČE metódy (Frohman, M.A., et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 85 : 8 998 - 9 002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Research, 17: 2 919-2 932, 1989). Pre 5-RACE metódu bol použitý Maratón cDNA Amplification Kit (od firmy Clontech) a reakcia bola uskutočnená podľa inštrukcií uvedených v kitu.

pg RNA, pripravenej ako bolo uvedené vyššie, bol použitý ako templát na syntézu cDNA vlákna pomocou priméru v kite. Reverzná transkripcia sa vykonala 60 minút pri teplote 42 °C. K reakčnej zmesi bola potom pridaná DNA-polymeráza I, DNA ligáza a RNA-áza H pri 16 °C počas 1,5 hodiny a T4 DNA ligáza pri 16 °C počas 45 minút, a bolo syntetizované druhé vlákno cDNA. Dvojreťazová cDNA bola extrahovaná fenolom a chloroformom a precipitovaná etanolom.

K obidvom koncom cDNA boli cez noc pomocou T4 DNA ligázy pri teplote 16°C priligované adaptéry. Reakčná zmes bola nariedená 50-krát pomocou 10 mM Tricin-KOH (pH 8,5) s 0,1 mM EDTA. Na tomto templáte bol pomocou PCR reakcie amplifikovaný fragment kódujúci V oblasť L reťazca. Adaptérový primér 1 z kitu bol použitý ako 5' primér a ako 3' primér bol použitý MKC primér (sekvencia č. 2) (S.T.

Jones, etal., Biotechnology, 9:88-89, 1991).

PCR roztoky pre amplifikáciu V oblasti H reťazca ATR-5 protilátky v 100 μΙ obsahovali 120 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM KCI, 6 mM (NH₄)₂ SO₄, 0,1 % Triton X100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCI₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), 30 až 50 pmol adaptéŕového primeru 1, rovnako ako MKC primeru a 1 μΐ cDNA, ku ktorej bol priligovaný cDNA adaptér.

PCR reakcia bola uskutočnená použitím DNA Termal Cycler 480 (od firmy Perkin-Elmer), v 30 cykloch s týmto profilom: 94 °C, 30 sekúnd, 55 °C, 30 sekúnd, 74°C 1 minúta.

3. Purifikácia a fragmentácia PCR produktov

Vyššie uvedená PCR reakčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a amplifikované PCR fragmenty boli precipitované etanolom. DNA fragmenty boli štiepené reštriktázou Xmal (od firmy New England Biolabs) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Xmal štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 2 až 3 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky veľkosti okolo 500 bp obsahujúce V oblasť H reťazca a V oblasť L reťazca boli z gélu vyrezané. DNA boli z gélových rezov extrahované fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v 10 μ110 mM Tris-HCI (pH 8,0) s 1 mM EDTA (tu nazývaný ako TE pufer).

Xmal štiepené DNA fragmenty obsahujúce V oblasť H reťazca a V oblasť L reťazca pripravené ako bolo uvedené vyššie boli zligované s vektorom pUC16, ktorý bol rovnako pripravený štiepením reštriktázou Xmal. Ligácia bola uskutočnená pomocou DNA ligačného kitu od firmy Takara Shuzo, pri teplote 16 °C počas 1 hodiny podľa inštrukcií uvedených v kite. Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΙ JM109 kompetentných buniek E. coli (od firmy Nippogene) a boli inkubované počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo k baktériám pridané 300 μΙ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agarové platne s LB médiom (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), obsahujúce 100 pg/ml ampicilínu (z tohoto dôvodu je tu médium nazývané ako LBA) a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platni narástli kolónie transformovaných E. coli.

Transformanty boli pestované cez noc v 3 ml alebo 4 ml LBA média obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu, pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov boli potom izolované plazmidové DNA pomocou QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen), a konštrukty boli osekvenované.

4. Určenie nukleotidovej sekvencie génu kódujúceho V oblasť myšej protilátky

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca oblasti vo vyššie uvedených plazmidoch bola určená pomocou Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy Perkin-Elmer) na prístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Ako sekvenčné priméry boli použité M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 4). Korektnosť sekvencií bola potvrdená čítaním nukleotidovej sekvencie z obidvoch strán.

Plazmidy nesúce gén kódujúce V oblasť myšieho H reťazca pochádzajúceho z hybridómu ATR-5 boli pomenované ako ATR-5Hv/pUC19 a plazmidy nesúce gén kódujúcej V oblasť myšieho L reťazca pochádzajúce z hybridómu ATR-5 boli pomenované ako ATR-5Lv/pUC19. Nukleotidové sekvencie génov kódujúcich V oblasti H reťazcov všetkých myších protilátok, ktoré nesie plazmid ATR-5Hv/pUC19 (spoločne so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) sú uvedené pod číslami 5 a 99, a nukleotidové sekvencie génov kódujúcich V oblasti L reťazcov všetkých myších protilátok, ktoré nesie plazmid ATR-5Lv/pUC19 (spoločne so zodpovedajúcou aminokyselinovou sekvenciou) sú uvedené pod číslami 6 a 100.

Referenčný príklad 4

Konštrukcia chimerickej protilátky

Bola pripravená chimerická ATR-5 protilátka, kde V oblasť myšej ATR-5 protilátky bola ligovaná k C oblasti ľudskej protilátky. Bol pripravený expresný vektor pre chimerickú protilátku, v ktorom V oblasť myšej ATR-5 protilátky bola ligovaná k C oblasti ľudskej protilátky.

1.

Konštrukcia V oblasti H reťazca chimerickej protilátky

V oblasť H reťazca ATR-5 protilátky bola PCR modifikovaná tak, aby bolo možné ju ligovať do expresného vektora kódujúceho C oblasť H reťazca ľudskej protilátky. 5' prímer ch5HS (sekvencia č. 7) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 5' koncom DNA kódujúcej V oblasť. Tento prímer nesie Kozákovú konsenznú sekvenciu (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol, 196:947-950, 1987) a rozpoznávaciu sekvenciu pre reštriktázu Sali. 3' primer ch5HA (sekvencia č. 8) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 3' koncom DNA kódujúcej J oblasť. Tento primer rovnako nesie rozpoznávaciu sekvenciu pre reštriktázu Nhel.

PCR roztoky v 100 μΙ obsahovali 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KCI, 6 mM (NH₄)₂ SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), pmol primeru ch5HS a ch5HA, rovnako ako 1 μΙ plazmidu ATR5HV/pUC19, ako templátovej DNA.

PCR reakčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a amplifikované PCR fragmenty boli precipitované etanolom. DNA fragmenty boli štiepené reštriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny, a potom reštriktázou Sa11 pri teplote 37 °C počas 1 hodiny . Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 3 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 450 bp boli z gélu vyrezané. DNA boli z gólových výrezkov extrahované fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v 20 μΙ TE pufru.

V prípade klonovacieho vektora bol použitý vektor s pozmeneným promótorom (tu nazývaný CVIDEC), do ktorého boli vnesené rozpoznávacie sekvencie pre reštriktázy Nhel, Sa11, Sp11, a BglII. Fragment génu, pripravený ako bolo uvedené vyššie, kódujúci V oblasť H reťazca myšej protilátky, a CVIDEC vektor, pripravený digesciou Nhel a Sa11 boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 16 °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite. Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΙ JM109 kompetentných buniek E. coli (od firmy Nippogene) a boli inkubované počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C.

Potom bolo k baktériám pridané 300 μΙ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agárové platne s LBA médiom a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platni narástli kolónie transformovaných E. coli.

Transformanty boli pestované cez noc v 3 ml LBÄ média pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov boli potom izolované plazmidové DNA pomocou QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen). Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca oblasti vo vyššie uvedených plazmidoch bola určená pomocou Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy Perkin-Elmer) na prístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Ako sekvenčné primery boli použité M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 4). Korektnosť sekvencie bola potvrdená čítaním nukleotidovej sekvencie z obidvoch strán.

Plazmid nesúci gén kódujúci V oblasť myšieho H reťazca ATR-5 protilátky, Sali rozpoznávaciu sekvenciu a Kozákovu sekvenciu na 5' konci a Nhe I rozpoznávaciu sekvenciu na 3' konci bol pomenovaný ako chATR5Hv/CVIDEC.

2. Konštrukcia V oblasti L reťazca chimerickej protilátky

V oblasť L reťazca ATR-5 protilátky bola PCR modifikovaná tak, aby bolo možné ju ligovať do expresného vektora kódujúceho C oblasť L reťazca ľudskej protilátky. 5' primer ch5LS (sekvencia č. 9) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 5' koncom DNA kódujúcej V oblasť. Tento primer nesie Kozákovú konsenznú sekvenciu (Kozák, M. et al., J. Mol. Biol, 196:947-950, 1987) a rozpoznávaciu sekvenciu pre reštriktázu Bglll. 3' primer ch5LA (sekvencia č. 10) bol navrhnutý tak, aby hybridizoval s 3' koncom DNA kódujúcej J oblasť. Tento primer rovnako nesie rozpoznávaciu sekvenciu pre reštriktázu Sp11.

PCR roztoky v 100 μΙ obsahovali 120 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM KCI, 6 mM (NH₄)₂ SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), pmol primeru ch5HS a ch5HA, rovnako ako 1 μΙ plazmidu ATR5LV/pUC19, ako templátovej DNA.

PCR reakcia bola uskutočnená použitím DNA Termal Cycler 480 (od firmy Perkin-Elmer), v 30 cykloch s týmto profilom: 94 °C, 30 sekúnd, 55 °C, 30 sekúnd,

74°C 1 minúta.

PCR reakčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a amplifikované PCR fragmenty boli precipitované etanolom. DNA fragmenty boli štiepené reštriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny, a potom reštriktázou Sali pri teplote 37 °C počas 1 hodiny . Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 3 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 450 bp boli z gélu vyrezané. DNA boli z gélových výrezkov extrahované fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v 20 μΙ TE pufru.

Fragment génu, pripravený ako bolo uvedené vyššie, kódujúci V oblasť L reťazca myšej protilátky, a CVIDEC vektor, pripravený digesciou Sp11 a BglII, boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 16°C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΙ JM109 kompetentných buniek E. coli (od firmy Nippogene) a boli inkubované počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C.

Potom bolo k baktériám pridané 300 μΙ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agarové platne s LBA médiom a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platniach narástli kolónie transformovaných E. coli.

Transformanty boli pestované cez noc v 3 ml LBA média pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov boli potom izolované plazmidové DNA pomocou QiaPrep Spin Plasmid Kit (Qiagen).

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca oblasti vo vyššie uvedených plazmidoch bola určená pomocou Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy Perkin-Elmer) na prístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Ako sekvenčné primery boli použité M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 4). Korektnosť sekvencie bola potvrdená čítaním nukleotidovej sekvencie z obidvoch strán.

Plazmid nesúci gén kódujúci V oblasť myšieho L reťazca ATR-5 protilátky, BglII rozpoznávaciu sekvenciu a Kozákovú sekvenciu na 5' konci a Spil rozpoznávaciu sekvenciu na 3' konci bol pomenovaný ako chATR5Lv/C VIDEC.

3. Konštrukcia expresného vektora pre chimerickú protilátku

Expresný vektor pre chimerickú protilátku bol z konštruovaný pomocou expresného vektrora pre protilátku od firmy IDEC Pharmaceuticals. Ako vektory boli použité lgG1 expresný vektor H5KG1 (V) a lgG4 expresný vektor N5KG4P. Expresný vektor pre chimerickú protilátku ATR-5 bol z konštruovaný ligáciou génu kódujúceho V oblasť H reťazca ATR-5 do Sa11 - Nhel miesta bezprostredne pred C oblasťou ľudského H reťazca v expresnom vektore N5KG1 (V) alebo N5KG4P, a ligáciou génu kódujúceho V oblasť L reťazca ATR-5 do Bg1 II - Sp11 miesta bezprostredne pred C oblasťou ľudského L reťazca v expresnom vektore N5KG1 (V) alebo N5KG4P.

i. Vnesenie V oblasti H reťazca

Plazmid chATR5Hv/CVIDEC bol štiepený reštriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 3 hodín, a potom reštriktázou Sa11 pri teplote 37 °C počas 3 hodín. Štepená zmes bola frakcionovaná pomocou 1,5 % NuSieve GTG agarózovej gólovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 450 bp boli z gélu vyrezané. DNA bola z gólových výrezkov extrahovaná fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v 20 μΙ TE pufru.

Expresné vektory N5KG1 (V) a N5KG4P boli štiepené reštriktázou Nhel (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 3 hodín, a potom reštriktázou Sa11 pri teplote 37 °C počas 3 hodín. Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 1,5 % NuSieve GTG agarózovej gólovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 450 bp boli z gélu vyrezané. DNA boli z gólových výrezkov extrahované fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v 20 pl TE pufru.

Sa11 - Nhel fragment pripravený ako bolo uvedené vyššie, obsahujúci gén kódujúci V oblasť H reťazca, a N5KG1 (V) a N5KG4P štiepený reštriktázami Sa11 a Nhel, boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 16 °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 pl JM109 kompetentných buniek E. coli (od firmy Nippogene) a boli inkubované počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo k baktériám pridané 300 pl Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agárové platne s LBA médiom a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platniach narástli kolónie transformovaných E. coli.

Transformanty boli pestované cez noc v 3 ml LBA médií pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov boli potom izolované plazmidové DNA pomocou QiaPrep Spin Plazmid Kit (Qiagen).

Plazmidy nesúce gény kódujúce H reťazec chimerickej ATR-5 protilátky boli pomenované ako chATR5Hv/N5KGI (V) a chATR5Hv/N5KG4P.

ii. Vnesenie V oblasti L reťazca

Plazmid chATR5Lv/CVIDEC bol štiepený reštriktázou Bg1 II (od firmy Takara Shuzo) a reštriktázou Spil (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1,5 hodiny. Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 1,5 % NuSieve GTG agarózovej gólovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 400 bp boli z gélu vyrezané. DNA bola z gólových výrezkov extrahovaná fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v 20 μΙ TE pufru.

Plazmidy chATR5Hv/N5KGI (V) a chATR5Hv/N5KG4P boli štiepené reštriktázou Bglll a reštriktázou Spil (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1,5 hodiny. Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 1,5 % NuSieve GTG agarózovej gólovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 9 400 bp boli z gélu vyrezané. DNA boli z gólových výrezkov extrahované fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v 20 μΙ TE pufru.

Sp11 - Bglll DNA fragment pripravený ako bolo uvedené vyššie, obsahujúci gén kódujúci V oblasť L reťazca, chATR5Hv/N5KGI (V) a chATR5Hv/N5KG4P štiepené reštriktázami Sp11 a Bglll, boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 16 °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΙ JM109 kompetentných buniek E. coli (od firmy Nippogene) a boli inkubované počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo k baktériám pridané 300 μΙ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agárové platne s LBA médiom (koncentrácie ampicilínu 100pg/ml) a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platniach narástli kolónie transformovaných E.

coli.

Transformanty boli pestované cez noc v 1 I 2xYT média, obsahujúceho 50 pg/ml ampicilínu, pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov boli potom izolované plazmidové DNA pomocou QiaPrep Spin Plazmid Kit (Qiagen).

Plazmidy nesúce gény kódujúce chimerickú ATR-5 protilátku boli pomenované ako chATR5/N5KGI (V) a chATR5/N5KG4P.

4. Transfekcia COS-7 buniek

Na zistenie väzbovej aktivity antigénu a neutralizujúcej aktivity chimernej protilátky boli vyššie uvedené expresné plazmidy transfekované do COS-7 buniek a protilátka bola tranzientne exprimovaná.

Plazmidy chATR5/N5KGI (V) a chATR5/N5KG4P boli do COS-7 buniek vnesené elektroporáciou pomocou elektroporátora Gene Pulser Inštrument (od firmy BioRad). 50 pg plazmidu bolo pridané k 0,78 ml bunkovej suspenzii COS-7 buniek v Dulbecco PBS (-) (tu pod názvom PBS). Bunky v koncentrácii 1 x 10⁷ buniek/ml boli elektroporované pulzmi 1 500 V s kapacitou 25 pF.

Po 10 minútach spamätania sa buniek pri izbovej teplote, boli elektroporované bunky resuspendované v DMEM médiu obsahujúcom 5 % Ultra low IgG fetálneho bovinného séra (od firmy GIBCO) a kultivované v 10 cm Petriho miskách v 5 % CO2 atmosfére v inkubátore. Po 24 hodinovej kultivácii bol supernatant z kultúry odstránený a bolo pridané bezsérové médium HBCHO (od firmy Irvine Scientific). Po ďalšej kultivácii počas 72 hodín bol supernatant uložený a scentrifugovaný, aby sa odstránili zvyšky buniek.

5. Purifikácia protilátky

Pomocou Sepharose Fast Flow (od firmy Pharmacia Biotech) s naviazaným rekombinantným proteínom A bola zo supernatantu COS-7 buniek purifikovaná chimerická protilátka nižšie uvedeným spôsobom.

ml Sepharose Fast Flow s naviazaným rekombinantným proteínom A bol nanesený na kolónku, ktorá bola ekvilibrovaná 10 objemami TBS. Supernatant z

COS-7 buniek bol nanesený na ekvilibrovanú kolónku, ktorá bola potom prepláchnutá objemami TBS.

Adsorbovaná frakcia protilátky bola potom eluovaná pomocou 13,5 ml 2,5 mM HCI (pH 3,0) a eluát bol okamžite neutralizovaný pomocou 1,5 ml 1M Tris-HCI (pH 8,0). Pri dvojnásobnej ultrafiltrácii pomocou Centriprepu 100 (od firmy Amicon) bola protilátka rozpustená v 50 mM Tris-HCI (pH 7,6) s 150 mM NaCl (tu roztok nazývaný TBS), a nakoniec bola zahustená na objem 1,5 ml.

6. Ustanovenie stabilnej línie CHO

Na ustanovenie stabilnej línie produkujúcej chimerickú protilátku bol vyššie uvedený expresný plazmid vnesený do CHO buniek (DG44) aklimatizovaných na CHO-S-SFMII bezsérové médium (od firmy GIBCO).

Plazmidy chATR5/N5KGI (V) a chATR5/N5KG4P boli linearizované reštriktázou Sspl (od firmy Takará Shuzo) a po extrakcii fenolom a chloroformom boli DNA precipitované etanolom. Linearizovaný plazmid bol do DG44 buniek vnesený elektroporáciou pomocou elektroporátora Gene Pulser Inštrument (od firmy BioRad). 10 pg plazmidu bolo pridané k 0,78 ml bunkovej suspenzie DG44 buniek PBS. Bunky v koncentrácii 1 x 10⁷ buniek/ml boli elektroporované pulzmi 1 500 V s kapacitou 25 PFPo 10 minútach spamätovania sa buniek pri izbovej teplote boli elektroporované bunky resuspendované v CHO-S-SFMII médiu obsahujúcom hypoxantín/tymidín (od firmy GIBCO) a kultivované na dvoch 96-jamkových doštičkách (od firmy Falcon) v 5 % CO2 atmosfére v inkubátore. Po jednom dni kultivácie bolo médium nahradené selekčným médiom CHO-S-SFMII obsahujúcom hypoxantín/tymidín (od firmy GIBCO) a 500 pg/ml geneticinu (G418 sulfát, od firmy GIBCO) na selekciu buniek, do ktorých bol vnesený gén pre protilátku. Po výmene selekčného média boli bunky za dva týždne prehliadané pod mikroskopom. V prípade, že bol pozorovaný dostatočný rast, bolo mmožstvo produkovanej protilátky merané pomocou ELISA techniky, opísanej nižšie, a bunky so silnou expresiou protilátky boli vyselektované.

Referenčný príklad 5

Konštrukcia humanizovanej protilátky

I. Konštrukcia H reťazca humanizovanej protilátky

i. Konštrukcia H reťazca humanizovanej protilátky, verzia „a

H reťazec humanizovanej ATR-5 protilátky bol vytvorený vnesením CD3 oblasti pomocou PCR. Na prípravu H reťazca humanizovanej protilátky, verzie „a, ktorá má FR oblasti pôvodom z ľudskej protilátky L39 130 (DDBJ, Gao L et al., nepublikované, 1995) bolo použitých 7 PCR primerov. CDR primery hR5Hv1S (sekvencia č. 11), hR5Hv2S (sekvencia č. 12) a hR5Hv4S (sekvencia č. 13) predstavujú sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo hR5Hv3A (sekvencia Č. 14) a hR5Hv5A (sekvencia č. 15) predstavujú antisense DNA sekvenciu. Každý primer niesol 18 až 35 bp komplementárnej sekvencie na jeho obidvoch koncoch.

hR5Hv1S bol navrhnutý tak, aby niesol Kozákovu sekvenciu (Kozák, M. et al.,

I

J. Mol. Biol., 196 : 947-950, 1987) a Sali rozpoznávacie miesto. hR5Hv5A bol navrhnutý tak, aby niesol Nhel rozpoznávaciu miesto. Exogénny primer hR5HvPrS (sekvencia č. 16) niesol sekvenciu homológnu k CDR primemu hR5Hv1S. Primer hR5HvPrA (sekvencia č. 17) niesol sekvenciu homológnu k CDR primemu hR5Hv5A. CDR primery hR5Hv1S, hR5Hv2S, hR5Hv3A, hR5Hv4S a hR5Hv5A a exogénne primery hR5HvPrS a hR5HvPrA boli syntetizované a purifikované firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pričom PCR roztoky obsahovali 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM KCI, 6 mM (NtLOi SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) a 5 pmol každého CDR primeru hR5Hv1S, hR5Hv2S, hR5Hv5A, hR5Hv4S a hR5Hv5A v reakčnom objeme 98 μΙ. PCR reakcia bola uskutočnená s týmto profilom: 5 cyklov pri 94 °C, 30 sekúnd, 50 °C, 1 minúta a 72 °C, 1 minúta. Po pridaní exogénneho primeru hR5HvPrS a hR5HvPrA sa uskutočňovala PCR reakcia ďalších 25 cyklov v 100 μΙ s rovnakým teplotným PCR profilom.

DNA fragmenty, amplifikované pomocou PCR, boli frakcionované pomocou 2 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 430 bp boli z gélu vyrezané a ku každému boli pridané 3 objemy (ml/g) TE pufru. Potom boli DNA z gólových výrezkov extrahované fenolom, fenol/chloroformom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom bola ich 1/3 rozpustená v 17 pl vody.

PCR fragmenty a CVIDEC vektor, ktoré boli pripravené digesciou Nhel a Sa11 boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Transformanty boli pestované cez noc v 3 ml LBA médiu pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov boli potom izolované plazmidové DNA pomocou QiaPrep Spin Plazmid Kit (Qiagen).

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca oblasti vo vyššie uvedených plazmidoch bola určená pomocou Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy Perkin-Elmer) na prístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Ako sekvenčné primery boli použité M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 4). Korektnosť sekvencií bola potvrdená čítaním nukleotidovej sekvencie z obidvoch strán.

Pretože sa pred a za Eco T221 rozpoznávacím miestom vyskytovali mutácie a/alebo delécie, každý fragment so správnou sekvenciou bol ligovaný a potom opäť subklonovaný do CVIDEC na určenie nukleotidovej sekvencie. Plazmid so správnou sekvenciou bol nazvaný hATR5Hva/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca amínokyselinová sekvencia humanizovanej verzie „a H reťazca plazmidu hATR5Hva/CVTDEC je uvedená pod číslom 18. Amínokyselinová sekvencia verzie „a je rovnako uvedená pod číslom 19.

ii Konštrukcia humanizovaného H reťazca, verzie „b a „c.

Verzie „b a „c boli pripravené nahradením FR3 verzie „a pomocou FR3 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Pre nahradenie FR3 verzie „b FR derivovaného z ľudskej protilátky Z34 963 (DDBJ, Borretzen, M. et al., Proc. Nat. Sci.USA, 91:12 917-12 921, 1994) boli navrhnuté 4 primery na oblasť kódujúcu FR3. FR-shuffling primery F3FRRS (sekvencia č. 20) a F3RFFA (sekvencia

č. 21) predstavujú sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3RFFA (sekvencia č. 22) a

F3RFBA (sekvencia č. 23) predstavuje antisense DNA sekvenciu.

F3RFFS a F3RFFA majú sekvenciu komplementárnu navzájom, a na obidvoch koncoch nesú rozpoznávaciu sekvenciu pre Ba11 a Xhol. Pre nahradenie FR3 oblasti verzie „c inou, derivovanou z ľudskej protilátky P01 825 (Swissprot, Poljak RJ, et al., Biochemistry, 16:3 412-3 420, 1977) boli navrhnuté 4 DNA primery pre FR3 kódujúcu oblasť. FR-shuffling primery F3NMFS (sekvencia č. 24) a F3NMBS (sekvencia č. 25) predstavujú sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3NMFA (sekvencia č. 26) a F3NMBA (sekvencia č. 27) predstavujú antisense DNA sekvenciu. F3RFBS a F3RFBA majú navzájom komplementárnu sekvenciu a nesú rozpoznávacie miesta pre reštriktázy Xhol a Ncol po obidvoch koncoch.

Primery F3RFFS, F3RFBS, F3RFFA, F3RFBA, F3NMFS, F3NMBS, F3NMFA a F3NMBA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech. Prmery F3RFFS a F3RFFA a F3RFBS a F3RFBA boli anelované a digerované reštriktázami Ba11 a Xhol a Ncol,a Xhol. Potom boli vnesené do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ba1l / Ncol), ktorý bol pripravený digesciou Ba11 a Ncol. Konštrukt bol osekvenovaný. Piazmid so správnou nukleotidovou sekvenciou bol nazvaný hATR5hvb/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia sú uvedené pod číslom 28. Aminokyselinová sekvencia verzie „b je rovnako uvedená pod číslom 29.

F3NMFS a F3NMFA, a F3NMBS a F3NMBA boli anelované a digerované reštriktázami Ba1l a Xhol a Ncol a Xhol. Potom boli vnesené do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ba1l/Ncol), ktorý bol pripravený digesciou Ba1l a Ncol. Konštrukt bol osekvenovaný. Piazmid so správnou nukleotidovou sekvenciou bol nazvaný hATR5hvc/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „c, obsiahnutá v plazmide hATR5hvc/CVIDEC, je uvedená pod číslom 30. Aminokyselinová sekvencia verzie „c je rovnako uvedená pod číslom 31.

iii. Konštrukcia humanizovaného H reťazca, verzie „d a „e.

Verzie „d a „e boli pripravené nahradením FR3 verzie „a pomocou FR3 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Pre nahradenie FR3 verzie „d FR derivovaného z ľudskej protilátky M62 723 (DDBJ, Pascual V. et al., J. Clin. Invest., 86:1 320-1 328, 1990) boli navrhnuté 4 primery na oblasť kódujúcu FR3. FR-shuffling primer F3EPS (sekvencia č. 32) predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3EPA (sekvencia č. 33) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primerov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt.

Exogénne primery F3PrS (sekvencia č. 34) a F3PrA (sekvencia č. 35) majú homológiu s FR-shuffling primérmi F3EPS a F3FPA. Tieto primery je možné rovnako použiť pre ďalší shuffling v rámci FR3 oblasti. Na nahradenie FR3 verzie „e FR3 oblasti derivovanej z inej ľudskej protilátky Z80 844 (DDBJ, Tomsett AR. et al., nepublikované) boli pripravené dva primery pre FR3 kódujúcu oblasť.

FR-shuffling primer F3VHS (sekvencia č. 36) predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3VHA (sekvencia č. 37) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primerov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt.

Primery F3EPS, F3EPA, F3PrS, F3PrA, F3VHS a F3VHA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pomocou pufrov obsiahnutých v kité a obsahovala 5 pl každého 1 uM FRshuffling primerov F3EPS a F3EPA alebo F3VHS a F3VHA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčnom objeme 100 μΙ.

PCR reakcia bola uskutočnená s týmto profilom: 5 cyklov pri 94 °C, 30 sekúnd, 50 °C, 1 minúta a 74 °C, 1 minúta. Po pridaní 100 pmol exogénneho primeru F3PrS a F3PrA, sa uskutočňovala PCR reakcia ďalších 25 cyklov v 100 μΙ s rovnakým teplotným PCR profilom.

DNA fragmenty, amplifikované pomocou PCR, boli frakcionované pomocou 2 % NuSieve GTG agarózovej gélovej eiektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 424 bp boli z gélu vyrezané a ku každému boli pridané 3 objemy (ml/g) TE pufru. Potom boli DNA z gélových výrezkov extrahované fenolom, fenol/chloroformom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom bola ich 1/3 rozpustená v 14 μΙ vody.

PCR zmes bola digerovaná reštriktázami Ba11 a Xhol. Potom bola vnesená do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ba1l/Ncol), ktorý bol pripravený digesciou Ba1l a Ncol. Konštrukt bol osekvenovaný.

Plazmid so správnou nukleotidovou sekvenciou bol nazvaný hATR5hvd/CVIDEC a hATR5hve/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „d, obsiahnutá v plazmide hATR5hvd/CVIDEC, je uvedená pod číslom 38. Aminokyselinová sekvencia verzie „d je rovnako uvedená pod číslom 39. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „e, obsiahnutá v plazmide hATR5hve/CVIDEC, je uvedená pod číslom 40. Aminokyselinová sekvencia verzie „e je rovnako uvedená pod číslom 41.

iv. Konštrukcia humanizovaného H reťazca, verzie „f a „g.

Verzie „f a „g boli pripravené nahradením FR3 verzie „a pomocou FR3 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Pre nahradenie FR3 verzie „f“ FR derivovaného z ľudskej protilátky L04 345 (DDBJ, Hillson J L. et al. J. Exp. Med., 178:331-336, 1993) a na nahradenie FR3 verzie „g FR derivovaného z ľudskej protilátky S78 322 (DDBJ, Bejcek BE. et al., Cancer Res., 55:2 346-2 351, 1995) boli navrhnuté 2 primery na oblasť kódujúcu FR3. FR-shuffling primer F3SSS (sekvencia č. 42) verzie „f predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3SSA (sekvencia č. 43) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primerov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt. Primer F3CDS (sekvencia č. 44) verzie „g predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3CDA (sekvencia č. 45) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primerov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt.

Primery F3SSS, F3SSA, F3CDS a F3CDA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pomocou pufrov· obsiahnutých v kite a obsahovala 5 μΙ každého 1 uM FRshuffling primeru F3SSS a F3SSA alebo F3CDS a F3CDA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčnom objeme 100 μΙ.

DNA fragmenty, amplifikované pomocou PCR, boli frakcionované pomocou 2 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC

BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 424 bp boli z gélu vyrezané a ku každému boli pridané 3 objemy (mi/g) TE pufru. Potom boli DNA z gólových výrezkov extrahované fenolom, fenol/chloroformom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom bola ich 1/3 rozpustená v 14 pl vody.

PCR zmes bola digerovaná reštriktázami Ba11 a Ncol. Potom bola vnesená do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ba1l / Ncol), ktorý bol pripravený digesciou Ba1l a Ncol. Konštrukt bol osekvenovaný.

Plazmid so správnou nukleotidovou sekvenciou bol nazvaný hATR5hvf/CVTDEC a hATR5hvg/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca amínokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „ľ, obsiahnutá v plazmide hATR5hvf/CVIDEC, je uvedená pod číslom 46. Amínokyselinová sekvencia verzie „f‘ je rovnako uvedená pod číslom 47 Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca amínokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „g, obsiahnutá v plazmide hATR5hvg/CVIDEC, je uvedená pod číslom 48. Amínokyselinová sekvencia verzie „g je rovnako uvedená pód číslom 49.

v. konštrukcia humanizovaného H reťazca, verzia „h.

Verzia „h bola pripravená nahradením FR3 verzie „a pomocou FR3 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Pre nahradenie FR3 verzie „h FR derivovaného z ľudskej protilátky Z26 827 (DDBJ, van Der Stoep et al. J. Exp. Med., 177.99-107, 1993) boli navrhnuté 2 primery na oblasť kódujúcu FR3. FR-shuffling primer F3ADS (sekvencia č. 50) verzie „h predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3ADA (sekvencia č. 51) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primérov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt.

Primery F3 AD S a F3 ADA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo Boseki), pomocou pufrov obsiahnutých v kite a obsahovala 5 μΙ každého 1 uM FRshuffling priméru F3ADS a F3ADA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM MgCI₂, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčnom objeme 100 μΙ.

PCR reakcia bola uskutočnená s týmto profilom: 5 cyklov pri 94 °C, 30 sekúnd, 50 °C, 1 minúta a 74 °C, 1 minúta. Po pridaní 100 pmol exogénneho priméru F3PrS a F3PrA, sa uskutočňovala PCR reakcia ďalších 25 cyklov v 100 μΙ s rovnakým teplotným PCR profilom.

DNA fragmenty, amplifikované pomocou PCR, boli frakcionované pomocou 2 % NuSieve GTG agarózovej gólovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 424 bp boli z gélu vyrezané a ku každému boli pridané 3 objemy (ml/g) TE pufru. Potom bola DNA z gólových výrezkov extrahovaná fenolom, fenol/chloroformom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom bola ich 1/3 rozpustená v 14 pl vody.

PCR zmes bola digerovaná reštriktázami Ba11 a Ncol. Potom bola vnesená do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ba1l/Ncol), ktorý bol pripravený digesciou Ba1l a Ncol. Konštrukt bol osekvenovaný.

Plazmid so správnou nukleotidovou sekvenciou bol nazvaný hATR5hvf7CVIDEC a hATR5hvh/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „h, obsiahnutá v plazmide hATRShvh/CVIDEC, je uvedená pod číslom 52. Aminokyselinová sekvencia verzie „h je rovnako uvedená pod číslom 53.

vi. Konštrukcia humanizovaného H reťazca, verzie „i a j.

Verzie „i a ,j boli pripravené nahradením FR3 verzie „a pomocou FR3 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Pre nahradenie FR3 verzie „f FR derivovaného z ľudskej protilátky u95 239 (DDBJ, Manheimer-Lory AJ., nepublikované) a na nahradenie FR3 verzie „j FR derivovaného z ľudskej protilátky L03 147 (DDBJ, Collect TA., Proc. Natl. Sci. USA, 89:10 026-10 030, 1992) boli navrhnuté 2 primery na oblasť kódujúcu FR3. FR-shuffling primer F3MMS (sekvencia č. 54) verzia „i predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3MMA (sekvencia č. 55) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primérov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt. Primer F3CDS (sekvencia č. 44) verzia „g predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3CDA (sekvencia č. 45) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primérov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt.

Primer F3BMS (sekvencia č. 56) verzia „j predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F3BMA (sekvencia č. 57) predstavuje antisense DNA sekvenciu. 3' konce primérov nesú komplementárnu sekvenciu dlhú 18 nt.

Primery F3MMS, F3MMA, F3BMS a F3BMA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech.

PCR reakcia bola uskutočnená pomocou KOD DNA polymerázy (Toyo

Boseki), pomocou pufrov obsiahnutých v kite a obsahovala 5 μΙ každého 1 uM FRshuffling primérov F3MMS a F3MMA alebo F3BMS a F3BMA, 0,2 mM dNTPs, 1 mM

MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki) v reakčnom objeme 100 μΙ.

PCR reakcia bola uskutočnená s týmto profilom: 5 cyklov pri 94 °C, 30 sekúnd, 50 °C, 1 minúta a 74 °C, 1 minúta. Po pridaní 100 pmol exogénneho priméru F3PrS a F3PrA, sa uskutočňovala PCR reakcia ďalších 25 cyklov s rovnakým teplotným PCR profilom.

DNA fragmenty, amplifikované pomocou PCR, boli frakcionované pomocou 2 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 424 bp boli z gélu vyrezané a ku každému boli pridané 3 objemy (ml/g) TE pufru. Potom bola DNA z gólových výrezkov extrahovaná fenolom, fenol/chloroformom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom bola ich 1/3 rozpustená v 14 μΐ vody.

PCR zmes bola digerovaná reštriktázami Ba11 a Ncol. Potom bola vnesená do plazmidu hATR5Hva/CVIDEC (Ba11 / Ncol), ktorý bol pripravený digesciou Ba1l a Ncol. Konštrukt bol osekvenovaný.

Plazmid so správnou nukleotidovou sekvenciou bol nazvaný hATR5hvi/CVTDEC a hATR5hvj/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzia „i, obsiahnutá v plazmide hATR5hvi/CVIDEC, je uvedená pod číslom 58. Aminokyselinová sekvencia verzia „i je rovnako uvedená pod číslom 59. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzia „j, obsiahnutá v plazmide hATR5hvj/CVTDEC, je uvedená pod číslom 60. Aminokyselinová sekvencia verzie „j je rovnako uvedená pod číslom 61;

vii. Konštrukcia humanizovaného H reťazca, verzie „b1 a „d1“.

Verzie „bľ‘ a „d1“ boli pripravené nahradením FR2 verzie „b a „d pomocou FR2 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Pre nahradenie FR2 FR derivovaným z ľudskej protilátky P01 742 (Swissprot, Cunningham BA.et al., Biochemistry, 9:3 161-3 170, 1970) boli navrhnuté 2 priméry na oblasť kódujúcu FR2. FR-shuffling primer F2MPS (sekvencia č. 62) predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F2MPA (sekvencia č. 63) predstavuje antisense DNA sekvenciu. Konce primerov nesú navzájom komplementárnu sekvenciu a rozpoznávaciu sekvenciu pre reštriktázy EcoT221 a Ba11 po obidvoch koncoch.

Primery F2MPS a F2MPA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech. F2MPS a F2MPA boli anelované a digerované pomocou reštriktáz EcoT221 a Ba1l. Boli vnesené do plazmidu hATR5Hvb/CVIDEC (EcoT221/Ball) a hATR5Hvd/CVIDEC (EcoT221/Ball), pripraveného digesciou enzýmu EcoT221 a Ba11. Konštrukty boli osekvenované.

Plazmidy so správnou nukleotidovou sekvenciou boli nazvané hATR5hvb1/CVIDEC a hATR5hvd1/CVTDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „b1“, obsiahnutá v plazmide hATR5hvb1/CVIDEC, je uvedená pod číslom 64. Aminokyselinová sekvencia verzie „b1“ je rovnako uvedená pod číslom 65. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzia „d1“, obsiahnutá v plazmide hATR5hvd1/CVIDEC, je uvedená pod číslom 66. Aminokyselinová sekvencia verzie „d1“ je rovnako uvedená pod číslom 67.

viii. Konštrukcia humanizovaného H reťazca, verzie „b3 a „d3.

Verzie „b3 a „d3 boli pripravené nahradením FR2 verzie „b a „d pomocou FR2 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Na nahradenie FR2 pomocou FR derivovaného z ľudskej protilátky Z80 0844 (Tomsett AR. et al., nepublikované) boli navrhnuté 2 primery na oblasť kódujúcu FR2. FR-shuffling primer F2VHS (sekvencia č. 68) predstavuje sense DNA sekvenciu, zatiaľ čo F2VHA (sekvencia č. 69) predstavuje antisense DNA sekvenciu. Konce primerov nesú navzájom komplementárnu sekvenciu a rozpoznávaciu sekvenciu pre reštriktázy EcoT221 a Ba11 po obidvoch koncoch.

Primery F2VHS a F2VHA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech. F2MPS a F2MPA boli anelované a digerované pomocou reštriktáz EcoT221 a Ba11. Boli vnesené do plazmidu hATR5Hvb/CVIDEC (EcoT221/Ball) a hATR5Hvd/CVIDEC (EcoT221/Ball), pripravenýého digesciou enzymy EcoT221 a Ba1l. Konštrukty boli osekvenované.

Plazmidy so správnou nukleotidovou sekvenciou boli nazvané hATR5hvb3/CVIDEC a hATR5hvd3/CVTDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzia „b3, obsiahnutá v plazmide hATR5hvb3/CVIDEC, je uvedená pod číslom 70. Aminokyselinová sekvencia verzia „b3 je rovnako uvedená pod číslom 71. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „d3, obsiahnutá v plazmide hATR5hvd3/CVIDEC, je uvedená pod číslom 72. Aminokyselinová sekvencia verzie „d3 je rovnako uvedená pod číslom 73.

2. Konštrukcia V oblasti humanizovaného L reťazca protilátky

i. Verzia „a

V oblasť L reťazca humanizovanej protilátky ATR-5 bola pripravená PCR amplifikáciou CDR oblasti. Na prípravu L reťazca humanizovanej verzie protilátky, verzie „a, nesúcich FR oblasť pôvodom z ľudskej protilátky Z37 332 (DDBJ, Welschof M. et al., J. Immunol. Metods, 179:203-214, 1995) bolo navrhnutých 7 PCR primerov.

CDR primer h5Lv1S (sekvencia č. 74) a primer h5Lv4 (sekvencia č. 75) predstavujú sense DNA sekvencia, zatiaľ čo h5Lv2A (sekvencia č. 76), h5Lv3A (sekvencia č. 77) a h5Lv5A (sekvencia č. 78) predstavujú antisense DNA sekvencia. Každý primer nesie komplementárnu sekvenciu dlhú 20 nt po jeho obidvoch koncoch. Exogénne primery h5LvS (sekvencia č. 79) a hSLvA (sekvencia č. 80) nesú oblasti homológie s CDR primermi h5Lv1S a h5Lv5A.

Primery h5Lv1S, h5Lv4, h5Lv2A, h5Lv3A, h5Lv5A, h5LvS h5LvA boli syntetizované firmou Pharmacia Biotech.

PCR roztoky v 100 μΙ obsahovali 120 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mM KCI, 6 mM (NH₄)₂ SO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCb, 2,5 jednotky KOD DNA polymerázy (od firmy Toyo Boseki), 50 pmol CDR primerov h5Lv1S, h5Lv2A, h5Lv3A, h5Lv4S a h5Lv5a.

PCR reakcia bola uskutočnená použitím DNA Termal Cycler 480 (od firmy Perkin-Elmer), s týmto profilom: 5 cyklov pri 94 °C, 30 sekúnd, 50 °C, 1 minúta a 72 °C, 1 minúta pre nasadenie CDR primerov. Po pridaní 100 pmol exogénnych primerov h5LvS a h5LvA, sa uskutočňovala PCR ešte ďalších 30 cyklov s týmto teplotným profilom: 94 °C, 30 sekúnd, 52 °C, 1 minúta a 72 °C, 1 minúta, pre amplifikáciu pospojovaných DNA fragmentov.

PCR reakčná zmes bola frakcionovaná pomocou 3 % NuSieve GTG agarózovej gólovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 400 bp boli z gélu vyrezané. DNA bola z gólových výrezkov extrahovaná fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom. PCR fragmenty boli pripravené digesciou Sp11 (od firmy Takara Shuzo) a BglII (od firmy Takara Shuzo) pri 37 °C počas 4 hodín. Reštrikčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom a po etanolovej precipitácii DNA fragmentov boli tieto rozpustené v 10 μΙ TE pufru. Sp11 - BglII fragment kódujúci V oblasť L reťazca humanizovanej protilátky, pripravený vyššie uvedeným spôsobom a CVTDEC vektor, pripravený digesciou Spil a BglII boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teptlote 16 °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΙ JM109 kompetentných buniek E. coli (od firmy Nippogene) a boli inkubované počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo k baktériám pridané 300 μΙ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agárové platne s LBA médiom a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platniach narástli kolónie transformovaných E. coli.

Plazmid nesúci gén kódujúci V oblasť humanizovaného L reťazca protilátky, nesúci BglII rozpoznávaciu sekvenciu a Kozákovú sekvenciu na 5' konci a Spil rozpoznávaciu sekvenciu na 3' konci bol pomenovaný ako hATR5Lva/CVIDEC.

Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného L reťazca verzie „b3, obsiahnutá v plazmide hATR5hvb3/CVIDEC, je uvedená pod číslom 70. Aminokyselinová sekvencia verzie „b3 je rovnako uvedená pod číslom 71. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného H reťazca verzie „a, je uvedená pod číslom 81.

Aminokyselinová sekvencia verzie „a je rovnako uvedená pod číslom 82.

ii. Verzie „b a „c

Verzie „b a „c boli pripravené nahradením FR3 verzie „a pomocou FR3 derivovaného z inej ľudskej protilátky metódou FR-shuffling. Pre verziu „b bol použitý FR3 derivovaný z ľudskej protilátky S68 699 (DDBJ, Hougs L. et al., Exp. Clin. Immunogen, 10:141-151, 1993)) a pre verziu „c bol použitý FR3 derivovaný z ľudskej protilátky P01 607 (Swissprót, Epp O. etal., Biochemistry, 14:4 943-4 952).

Primér F3SS (sekvencia č. 83) a F3SA (sekvencia č. 84), navrhnuté na kódujúcu oblasť FR3 verzie „b, a primery F3RS (sekvencia č. 85) a F3RA (sekvencia č. 86), navrhnuté na kódujúcu oblasť FR3 verzie „c, nesú sekvenciu komplementárnu k sebe navzájom a rovnako nesú rozpoznávaciu sekvenciu pre reštriktázy KpnI a PstI na obidvoch koncoch.

Primery F3SS, F3SA, F3RS a F3RA boli syntetizované a purifikované firmou Pharmacia Biotech.

100 pmol primerov F3SS a F3SA, F3RS a F3RA bolo anelované týmto spôsobom: 2 minúty pri 96 °C a potom 2 minúty pri 50 °C. Táto procedúra pripravila dvojreťazové DNA fragmenty.

Tieto dvojreťazové fragmenty boli digerované reštriktázami KpnI (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C 1 hodinu a potom reštriktázou PstI, pri teplote 37 °C 1 hodinu.

Reštrikčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom, potom precipitované etanolom a rozpustená v TE pufru.

Plazmid hATR5Lva/CVIDEC bol štiepený reštriktázou KpnI (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny, a potom reštriktázou PstI pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 1,5 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 3 000 bp boli z gélu vyrezané. DNA boli z gélových výrezkov extrahované fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v TE pufru.

KpnI - Pstl DNA fragment oblasť FR3 verzie „b alebo „c, pripravený vyššie uvedeným spôsobom a hATR5Lva/CVIDEC vektor, z ktorého bol digesciou KpnI a Pstl odstránený pôvodný FR3 región, boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teptlote 16 °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Transformanty boli pestované cez noc v 3 ml LBA média pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov boli potom izolované plazmidové DNA pomocou QiaPrep Spin Plazmid Kit (Qiagen).

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca oblasti vo vyššie uvedených plazmidoch bola určená pomocou Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy Perkin-Elmer) na prístroji DNA Sequencer 373A (od firmy Perkin-Elmer). Ako sekvenčné primery boli použité M13 primér M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 3) a M13 primér RV (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 4). Korektnosť sekvencie bola potvrdená čítaním nukleotidovej sekvencie z obidvoch strán.

Plazmid, ktorý nesie gén kódujúci verziu „b alebo verziu „c, v ktorých FR3 L reťazca humanizovanej protilátky verzie „a bol nahradený, bol nazvaný hATR5Lvb/CVTDEC a hATR5Lvc/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného L reťazca verzie „b, obsiahnutá v plazmide hATR5Lvb/CVIDEC je uvedená pod číslom 87. Aminokyselinová sekvencia verzie „b je rovnako uvedená pod číslom 88. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného L reťazca verzie „c, obsiahnutá v plazmide hATR5Lvc/CVIDEC, je uvedená pod číslom 89. Aminokyselinová sekvencia verzie „c je rovnako uvedená pod číslom 90.

iii. Verzie „bi“ a „b2

Verzie „b1“ a „b2 boli pripravené nahradením FR2 verzie „b. Pre verziu „b1“ bol použitý FR2 derivovaný z ľudskej protilátky S65 921 (DDBJ, Tonge DW., et al.,

Year Immunol., 7:56-62, 1993) a pre verziu „b2c bol použitý FR2 derivovaný z ľudskej protilátky X93 625 (DDBJ, Cox JP et al., Eur. J. Immunol., 24:827-836, 1994).

Primer F2SS (sekvencia č. 91) a F2SA (sekvencia č. 92), navrhnuté na kódujúcu oblasť FR2 verzie „b1“, a primery F2XS (sekvencia č. 93) a F2XA (sekvencia č. 94), navrhnuté na kódujúcu oblasť FR2 verzie „b2, nesú sekvenciu komplementárnu k sebe navzájom a rovnako nesú rozpoznávaciu sekvencia pre reštriktázy Aflll a Spel na obidvoch koncoch.

Primery F2SS, F2SA, F2XS a F2XA boli syntetizované a purifikované firmou Pharmacia Biotech.

100 pmol primerov F2SS a F2SA, F2XS a F2XA bolo anelovaných týmto spôsobom: 2 minúty pri 96 °C a potom 2 minúty pri 50 °C. Táto procedúra pripravila dvojreťazové DNA fragmenty.

Tieto dvojreťazové fragmenty boli digerované reštriktázami Aflll (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C 1 hodinu a potom reštriktázou Spel, pri teplote 37 °C 1 hodinu. Reštrikčná zmes bola extrahovaná fenolom a chloroformom, potom precipitovaná etanolom a rozpustená v TE pufru.

Plazmid hATR5l_vb/CVBDEC bol štiepený reštriktázou Aflll (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 1 hodiny, a potom reštriktázou Spel pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 1,5 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 3 000 bp boli z gélu vyrezané. DNA boli z gólových výrezkov extrahované fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v TE pufru.

Aflll-Spel DNA fragment kódujúci oblasť FR3 verziu „b1“ alebo „b2, pripravený vyššie uvedeným spôsobom a hATR5l_vb/CVIDEC vektor, z ktorého bol digesciou Aflll a Spel odstránený pôvodný FR2 región, boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 16 °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Potom bolo k baktériám pridané 300 pl Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agárové platne sLBA médiom a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platniach narástli kolónie transformovaných E. coli.

Nukleotidová sekvencia cDNA kódujúca oblasti vo vyššie uvedených plazmidoch bola určená pomocou Dye Terminátor Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kitu (od firmy Perkin-Elmer) na prístroji DNA Sequencer 3 73A (od firmy Perkin-Elmer). Ako sekvenčné primery boli použité M13 primer M4 (od firmy Takara Shuzo, sekvencia Č. 3) a M13 primer RV (od firmy Takara Shuzo, sekvencia č. 4). Korektnosť sekvencie bola potvrdená čítaním nukleotidovej sekvencie z obidvoch strán.

Plazmid, ktorý nesie gén kódujúci verziu „b1“ alebo verziu „b2, v ktorých FR2 L reťazca humanizovanej protilátky verzie „b bol nahrazený, bol nazvaný hATR5Lvb1/CVIDEC a hATR5Lvb2/CVIDEC. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného L reťazca verzie „bľ‘, obsiahnutá v plazmide hATR5Lvb1/CVIDEC je uvedená pod číslom 95. Aminokyselinová sekvencia verzie „b1“ je rovnako uvedená pod číslom 96. Nukleotidová sekvencia a korešpondujúca aminokyselinová sekvencia humanizovaného L reťazca verzie „b2, obsiahnutá v plazmide hATR5Lvb2/CVTDEC, je uvedená pod číslom 97. Aminokyselinová sekvencia verzie „b2 je rovnako uvedená pod číslom 98.

3. Konštrukcia expresného vektora humanizovanej protilátky

i. Kombinácia humanizovaného H reťazca a chimerického L reťazca

Plazmid hATR5Hva/CVIDEC nesúci V oblasť H reťazca bol digerovaný enzýmami Nhel a Sali a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chATR5/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chATR5/N5KG4P je expresný vektor pre chATR-5 protilátku. Takto vytvorený plazmid bol nazvaný hHva-chLv/N5KG4P.

Plazmid hATR5Hvb/CVIDEC nesúci V oblasť H reťazca bol digerovaný enzýmami Nhel a Sali a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chATR5/N5KG4P enzýmami Nhel a Sa11. chATR5/N5KG4P je expresný vektor pre chATR-5 protilátku. Takto vytvorený plazmid bol nazvaný hHvb-chLv/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvc/CVIDEC, hATR5Hvd/CVIDEC a hATR5Hve/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sal1/Nhel), pripraveného digesciou chATR5/N5KG4P enzýmami Nhel a Sa11. chATR5/N5KG4P je expresný vektor pre chATR-5 protilátku. Takto vytvorený plazmid bol nazvaný hHvc-chl_v/N5KG4P, hHvd-chl_v/N5KG4P a hHvechLv/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvf/CVIDEC a hATR5Hvh/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chATR5/N5KG4P enzýmami Nhel a Sa11. chATR5/N5KG4P je expresný vektor pre chATR-5 protilátku. Takto vytvorený plazmid bol nazvaný hHvfchLv/N5KG4P a hHvh-chl_v/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvi/CVIDEC a hATR5Hvj/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa1l a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chATR5/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chATR5/N5KG4P je expresný vektor pre chATR-5 protilátku. Takto vytvorený plazmid bol nazvaný hHvichl_v/N5KG4P a hHvj-chLv/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvdl/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do chATR5/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chATR5/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chATR5/N5KG4P je expresný vektor pre chATR-5 protilátku. Takto vytvorený plazmid bol nazvaný hHvblchLv/N5KG4P a hHvdl-chl_v/N5KG4P.

ii. Kombinácia L reťazca humanizovanej protilátky s H reťazcom chimerickej protilátky

Pomocou expresného vektora N5KG4P pre protilátku boli uskutočnená kombinácia L reťazca humanizovanej protilátky s H reťazcom chimerickej protilátky.

Plazmidy hATR5Lva/CVIDEC, hATR5Lvb/CVIDEC, hATR5Lvc/CVIDEC, hATR5Lvb1/CVIDEC a hATR5Lvb2/CVIDEC boli štiepené reštriktázou Bglll (od firmy Takara Shuzo) a reštriktázou Sp11 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 37 °C počas 2 až 3 hodín.

Štiepená zmes bola frakcionovaná pomocou 1,5 alebo 2 % NuSieve GTG agarózovej gélovej elektroforézy (agaróza od firmy FMC BioProducts). Prúžky obsahujúce DNA o veľkosti okolo 400 bp boli z gélu vyrezané. DNA bola z gólových výrezkov extrahovaná fenolom a chloroformom, DNA fragmenty boli precipitované etanolom a potom rozpustené v TE pufru.

Spil - Bglll DNA fragment obsahujúce gén pre V región L reťazca humanizovanej protilátky každej z verzií a hATR5Hv/N5KG4P vektor, upravený digesciou Sp11 a Bglll, boli ligované pomocou DNA ligačného kitu ver. 2 (od firmy Takara Shuzo) pri teplote 16 °C počas 1 hodiny, podľa inštrukcií obsiahnutých v kite.

Ligačná zmes bola pridaná k 100 μΙ JM109 kompetentných buniek E. coli (od firmy Nippogene) a boli inkubované počas 30 minút na ľade a 1 minútu pri 42 °C. Potom bolo k baktériám pridané 300 μΙ Hi-Competence média (od firmy Nippogene) a zmes bola inkubovaná pri 37 °C počas 1 hodiny. Potom boli E. coli nanesené na agarové platne s LBA médiom a inkubované cez noc pri teplote 37 °C. Za tento čas na platniach narástli kolónie transformovaných E. coli.

Transformanty boli pestované cez noc v 250 alebo 500 ml LBA média pri teplote 37 °C. Z bunkových extraktov bola potom izolovaná plazmidová DNA pomocou QiaPrep Spin Plazmid Kit (Qiagen).

Plazmidy, do ktorých bol vnesený gén pre chimerický H reťazec a humanizovaný L reťazec boli pomenované chHv-hLvb/N5KG4P, chHvhLvc/N5KG4P,chHv-hLvbl/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P.

iii. Kombinácia humanizovaného H reťazca s humanizovaným L reťazcom

Plazmid hATR5Hva/CVIDEC nesúci V oblasť H reťazca bol digerovaný enzýmami Nhel a Sali a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hLva/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chHv67 hLva/N5KG4P enzýmami Nhel a Sa11. chHv-hLva/N5KG4P nesie cDNA sekvenciu L reťazca humanizovanej ATR-5 protilátky, verzie „a. Takto vytvorený plazmid bol nazvaný hHva-hLva/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvb/CVIDEC a hATR5Hvc/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hl_va/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chHv-hLva/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chHv-hl_va/N5KG4P nesie cDNA sekvenciu L reťazca humanizovanej ATR-5 protilátky, verzie „a. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvb-hl_va/N5KG4P a hHvc-hl_va/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvb/CVIDEC, hATR5Hvd/CVIDEC a hATR5Hve/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment

V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hl_vb/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chHv-hLva/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chHv-hLvb/N5KG4P nesie cDNA sekvenciu L reťazca humanizovanej ATR-5 protilátky, verzie „b. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvb-hl_vb/N5KG4P, hHvd-hl_vb/N5KG4P a hHve-hl_vb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvf/CVIDEC, hATR5Hvg/CVIDEC a hATR5Hvh/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sali a cDNA fragment

V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hl_vb/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chHv-hLvb/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chHv-hLvb/N5KG4P nesie cDNA sekvenciu L reťazca humanizovanej ATR-5 protilátky, verzie „b. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvf-hl_vb/N5KG4P, hHvg-hl_vb/N5KG4P a hHvh-hl_vb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvi/CVIDEC a hATR5Hvj/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hl_vb/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chHv-hLvb/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chHv-hLvb/N5KG4P nesie cDNA sekvenciu L reťazca humanizovanej ATR-5 protilátky, verzie „b. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvi-hl_vb/N5KG4P a hHvj-hl_vb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvbl/CVIDEC a hATR5Hvdl/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hLvb/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chHv-hLvb/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chHv-hLvb/N5KG4P nesie cDNA sekvenciu L reťazca humanizovanej ATR-5 protilátky, verzie „b. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvb-hLvb1/N5KG4P a hHvd1-hl_vb/N5KG4P.

Plazmidy hATR5Hvb3/CVIDEC a hATR5Hvd3/CVIDEC nesúce V oblasť H reťazca boli digerované enzýmami Nhel a Sa11 a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hl_vb/N5KG4P (Sall/Nhel), pripraveného digesciou chHv-hLvb/N5KG4P enzýmami Nhel a Sali. chHv-hLvb/N5KG4P nesie cDNA sekvenciu L reťazca humanizovanej ATR-5 protilátky, verzie „b. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvb-hLvb3/N5KG4P a hHvd3-hl_vb/N5KG4P.

Plazmid hATRSHvb/CVIDEC nesúci V oblasť H reťazca bol digerovaný enzýmami Nhel a Sali a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hl_vb1/N5KG4P (Sall/Nhel) a hl_vb2/N5KG4P (Sall/Nhel), pripravených digesciou chHv-hLvb1/N5KG4P a chHv-hl_vb2/N5KG4P enzýmami Nhel a Sa11. Tieto plazmidy nesú cDNA sekvenciu L reťazcov humanizovanej ATR-5 protilátky, verziu „b1“ a „b2. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvbhl_vb1/N5KG4P a hHvb-hl_vb2/N5KG4P.

Plazmid hATR5Hvi/CVIDEC nesúci V oblasť H reťazca bol digerovaný enzýmami Nhel a Sali a cDNA fragment V oblasti H reťazca humanizovanej protilátky bol vnesený do hl_vb1/N5KG4P (Sall/Nhel) a hl_vb2/N5KG4P (Sall/Nhel), pripravených digesciou chHv-hLvb1/N5KG4P a chHv-hLvb2/N5KG4P enzýmami Nhel a Sa11. Tieto plazmidy nesú cDNA sekvenciu L reťazcov humanizovanej ATR-5 protilátky, verziu „bľ‘ a „b2. Takto vytvorené plazmidy boli nazvané hHvihLvb1/N5KG4P a hHvi-hl_vb2/N5KG4P.

4. Transfekcia COS-7 buniek

Na zistenie väzbovej aktivity antigénu a neutralizujúcu aktivitu humanizovanej protilátky, boli vyššie uvedené expresné plazmidy transfekované do COS-7 buniek a protilátka boli tranzientne exprimované.

Expresné plazmidy boli do COS-7 buniek vnesené elektroporáciou pomocou elektroporátora Gene Pulser Inštrument (od firmy BioRad). 20 alebo 50 pg plazmidu bolo pridané k 0,78 ml bunkovej suspenzii COS-7 buniek v PBS. Bunky v koncentrácii 1 x 10⁷ buniek/ml boli elektroporované pulzmi 1 500 V s kapacitou 25 mf.

Po 10 minútach spamätania sa buniek pri izbovej teplote, boli elektroporované bunky resuspendované v DMEM médiu obsahujúcom 5 % Ultra low IgG fetálneho bovinního séra (od firmy GffiCO) a kultivované v 10 alebo 15 cm Petriho miskách v 5 % CO₂ atmosfére v inkubátore. Po 24 hodinovej kultivácii bol supernatant z kultúry odstránený a bolo pridané bezsérové médium HBCHO (od firmy Irvine Scientific). Po ďalšej kultivácii počas 72 hodín bol supernatant odobratý a scentrifugovaný, aby sa odstránili zvyšky buniek.

5. Purifikácia protilátky

Zo supernatantu COS-7 buniek bola pomocou Affigel Protein A MAPSII kitu (od firmy Bio Rad) alebo Sepharose Fast Flow (od firmy Pharmacia Biotech) s naviazaným rekombinantným proteínom A purifikovaná chimerická protilátka. Purifikácia pomocou Affigel Protein MAPSII kitu bola uskutočnená podľa inštrukcií uvedených v kite. Purifikácia pomocou Sepharose Fast Flow s naviazaným rekombinantným proteínom A bola uskutočnená nasledujúcim spôsobom:

ml Sepharose Fast Flow s naviazaným rekombinantným proteínom A bol nanesený na kolónku, ktorá bola ekvilibrovaná 10 objemami TBS. Supernatant z COS-7 buniek bol nanesený na ekvilibrovanú kolónku, ktorá bola potom prepláchnutá 10 objemami TBS. Adsorbovaná frakcia protilátky bola potom eluovaná pomocou 13,5 ml 2,5 mM HCI (pH 3,0) a eluát bol okamžite neutralizovaný pomocou 1,5 ml 1M Tris-HCl (pH 8,0).

Pri dvoj- alebo trojnásobnej ultrafiltrácii pomocou Centriprepu 30 alebo 100 (od firmy Amicon) bola protilátka v TBS a nakoniec bola zahustená na objem 1,5 ml.

Referenčný príklad 6

Kvantifikácia protilátky a meranie jej aktivity

1. Merenie koncentrácie protilátky metódou ELIS A

ELISA doštičky na meranie koncentrácie protilátky boli pripravené nasledujúcim spôsobom: Na každú jamku 96-jamkovej doštičky (Maxisorp, NUNC) bolo imobilizovaných 100 μΙ kozej protilátky proti ľudskému IgGy (od firmy BIO

SOURCE), nariedenej na koncentráciu 1 pg/ml v imobilazačnom pufri (0,1 M

NaHCO₃, 0,02 % NaN₃, pH 9,6 , pufer nazývaný CB). Po blokovaní pomocou 200 μΙ dilučného pufru (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCb, 0,1 M NaCl, 0,05 % Tween 20, 0,02 % NaN₃, 1 % bovinného sérového albumínu (BSA), pH 8,1, pufer nazývaný DB) bol bunkový supernatant z COS-7 buniek, ktoré exprimovaly protilátku sériovo nariedený pomocou DB pufra a potom nakvapkaný do každej jamky.

Po 1 hodinovej inkubácii pri izbovej teplote a po oplachovaní PBS s 0,05 % Tween 20 (pufer nazývaný RB), bolo k reakcii pridané 100 μΙ kozej anti-ľudskej IgGy protilátky konjugovanej s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), ktorá bola nariedená 1 OOO-krát pomocou DB pufru. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny, nasledovanej opláchnutím pufrom RB, bol pridaný Sigma 104 (pnitrofenylfosfát, od firmy SIGMA), ktorý bol rozpustený v substrátovom pufri (50 mM NaHCO₃, 10 mM MgCb, pH 9,8) na koncentráciu 1 mg/ml. Potom bola pomocou Microplate Reader (od firmy Bio Rad) meraná absorbancia pri vlnovej dĺžke 405/655 nm. Ako štandard na meranie koncentrácie bola použitá protilátka lgG4« (od firmy Binding Site).

2. Meranie antigén-väzbovej aktivity

Doštičky pre ELISA test merania antigén-väzbovej aktivity boli pripravené nasledujúcim spôsobom: Použité bunky boli bunky ľudského karcinómu močového mechúra J82 (ATTC HTB-1). Na 60 jamiek 96-jamkovej doštičky boli vysiate bunky v hustote 1 x 10⁵ buniek/jamku. Bunky boli jeden deň kultivované v RPMI 1 640 médiu s 10 % fetálnym bovinným sérom (od firmy GIBCO), v termostate s CO₂ dovtedy, kým bunky sadli. Po odstránení supernatantu bola každá jamka 2x prepláchnutá 300 μΙ PBS. 100 μΙ PBS obsahujúceho 4 % paraformaldehydu (tu nazývaný ako PFA/PBS) bolo pridané do každej jamky a doštička bola na 10 minút umiestnená na ľad, pre dostatočnú imobilizáciu.

PFA/PBS bol odstránený a každá jamka bola dvakrát prepláchnutá 300 μΙ PBS. Potom boli jamky blokované 250 μΙ pufru DB. Supernatant z kultúry bol sériovo nariedený pomocou pufru DB, 100 μΙ na každú jamku. Po dvojhodinovej inkubácii pri izbovej teplote nasledovalo opláchnutie pufrom RB. Potom bolo pridané 100 μΙ kozej anti-ľudskej IgGy protilátky konjugovanej s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), ktorá bola nariedená 1 OOO-krát pomocou DB pufru. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny, nasledovanej opláchnutím pufrom RB, bol pridaný roztok substrátu. Potom bola pomocou Microplate Reader (od firmy Bio Rad) meraná absorbancia pri vlnovej dĺžke 405/655 nm.

3. Merenie neutralizujúcej aktivity

Neutralizačná aktivita myšej protilátky, chimerickej protilátky a humanižovanej protilátky boli merané pomocou inhibičnej aktivity na produkciu faktora Xa, s tkanivovým tromboplastínom derivovaným z ľudskej placenty (Tromborel S, od firmy Boehringer, AG) ako štandardom. 60 pl pufru (TMS obsahujúce 5 mM CaCb, a 0,1 % BSA) bolo pridané k 10 μΙ Tromborelu S v koncentrácii 1,25 mg/ml a 10 ml vhodne nariedenej protilátky. Reakcia sa vykonala na 96-jamkovej doštičke počas 1 hodiny. K reakci bolo pridané 10 μΙ 3,245 μg/ml ľudského faktora X (od firmy Celsus Laboratories) a 82,5 ng/ml ľudského faktora Vila (od firmy Enzýme Research). Nasledovala inkubácia pri izbovej teplote počas 1 hodiny. Pre zastavenie reakcie bolo pridané 10 μΙ 0,5 M EDTA. Potom bolo k reakcii pridané 50 μΐ chromogénneho substrátu a pomocou Microplate Reader (od firmy Bio Rad) bola meraná absorbancia pri vlnovej dĺžke 405/655 nm. Po inkubácii 1 hodinu pri izbovej teplote bola absorbancia pri 405/655 nm meraná znova. Neutralizačná aktivita bola určená ako percento reziduálnej aktivity pri každej zmene absorbancie počas hodinového merania, pričom 100 % aktivita bola prisúdená vzorke, kde nebola pridaná protilátka. Roztok chromogénneho substrátu bol pripravený riedením Testzyme chromogénneho substrátu S-2 000 (Chromogenix) podľa návodu udaného výrobcom, a to tak, že bol 2-krát nariedený destilovanou vodou a zmiešaný s roztokom polybrenu (0,6 mg/ml hexadimetylénbromid, od firmy SIGMA) v pomere 1:1.

4. Meranie aktivity

i. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „a a chimerického L reťazca

Bola pripravená protilátka (a - ch), ktorá obsahuje humanizovaný H reťazec verzie „a, kombinovaný s chimerickým L reťazcom. Táto protilátka bola testovaná na svoju väzbovú aktivitu k antigénu pomocou ELISA techniky. Množstvo naviazané na antigén sa so zvyšujúcou sa koncentráciou znižovalo. Neutralizačná aktivita pre antigén inhibíciu produkcie FXa bola slabá v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ktorú predstavovala chimerická protilátka (ch -ch). Bylo teda rozhodnuté, že sa pomocou metódy FR-shuffling pripraví zlepšená verzia humanizovaného H reťazca.

Chimerická protilátka tu použitá bola exprimovaná v COS-7 bunkách, purifikovaná a meraná.

ii. Kombinácia humanizovaného L reťazca verzie „a a chimerického H reťazca

Bola pripravená protilátka (a - ch), ktorá obsahuje humanizovaný H reťazec verzie „a, kombinovaný s chimerickým L reťazcom. Väzbová aktivita tejto protilátky k antigénu bola testovaná pomocou ELISA techniky. Bolo zistené, že má väzbovú aktivitu rovnakú alebo vyššiu ako je aktivita chimerickej protilátky. Na druhej strane, neutralizujúca aktivita proti antigénu bola v porovnaní s kontrolnou chimerickou protilátkou nízka. Bolo teda rozhodnuté, že sa pomocou metódy FR-shuffling pripraví zlepšená verzia humanizovaného L reťazca. Chimerická protilátka tu použitá bola exprimovaná v COS-7 bunkách, purifikovaná a meraná.

iii. Kombinácia humanizovanej verzie „a H reťazca a humanizovanej verzie „a L reťazca

Bola pripravená protilátka (a - a), ktorá obsahuje humanizovaný H reťazec verzie „a, kombinovaný s humanizovaným L reťazcom verzie „a. Väzbová aktivita tejto protilátky k antigénu bola testovaná pomocou ELISA techniky. Bolo zistené, že množstvo naviazané na antigén sa so zvyšujúcou sa koncentráciou znižovalo. Neutralizačná aktivita pre antigén inhibiciu produkcie FXa bola slabá v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ktorú predstavovala chimerická protilátka. Bolo teda rozhodnuté, že sa pomocou metódy FR-shuffling pripraví zlepšená verzia humanizovaného H a L reťazca. Chimerická protilátka tu použitá bola exprimovaná v COS-7 bunkách, purifikovaná a meraná.

iv. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „b, „c a „d a chimerického L reťazca

Metódou FR-shuffling boli pripravené zlepšené verzie protilátok („b-ch, „c-ch a „d-ch), nesúce humanizovaný H reťazec a chimerický L reťazec. Väzbová aktivita týchto protilátok k antigénu bola testovaná pomocou ELISA techniky. Bolo zistené, že „d-ch mala väzbovú aktivitu rovnakú ako chimerická protilátka, a „b-ch a „c-ch mali mierne nižšiu aktivitu. Na druhej strane, neutralizačná aktivita proti antigénu v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ktorú predstavovala chimerická protilátka, bola

Ί3 približne rovnaká v prípade „b-ch a mierne slabšia v prípade „d-ch. Aktivita verzia „c-ch bola signifikantne nižšia ako aktivita chimerickej protilátky. Taktiež bolo zistené, že humanizované H reťazce verzií „b a „d majú vysoké aktivity.

v. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „b a humanizovaného L reťazca verzie „a

Metódou FR-shuffling boli pripravená zlepšená verzia protilátky, nesúca humanizovaný H reťazec verzie „b a chimerický Ľ reťazec verzie „a. Väzbová aktivita týchto protilátok k antigénu bola testovaná pomocou ELISA techniky. Bolo zistené, množstvo protilátky naviazanej na antigén sa znižovalo so zvyšujúcou sa koncentráciou. Na druhej strane, neutralizačná aktivita proti antigénu v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ktorú predstavovala chimerická protilátka, bola signifikantne slabšia. Taktiež bolo zistené, že verzie „b-a a „a-a majú vysoké aktivity. Chimerická protilátka tu použitá bola exprimovaná v COS-7 bunkách, purifikovaná a meraná.

vi. Kombinácia humanizovaného L reťazca verzie „b a „c chimerického H reťazca

Bola pripravená protilátka („ch-b a „ch-c), ktorá obsahuje humanizovaný L reťazec verzie „b a „c, kombinovaný s chimerickým H reťazcom. Bolo zistené, že obidve verzie majú väzbovú aktivitu k antigénu a neutralizujúcu aktivitu proti antigénu rovnakú ako chimerická protilátka. Na základe tohoto zistenia boli verzie „b a „c vybrané ako kandidáti na prípravu L reťazca humanizovanej protilátky. Verzia „b odvodená od myšej protilátky, ktorá je o jednu aminokyselinu kratšia, je ohľadom antigénicity považovaná za najlepšiu. Chimerická protilátka tu použitá bola exprimovaná v CHO bunkách DG44, purifikovaná a zmeraná. Vo všetkých ďalších meraniach bola táto protilátka použitá ako pozitívna kontrola.

vii. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „b a humanizovaného L reťazca verzie „ba„c

Boli pripravené protilátky („b-b a „b-c), ktoré nesú humanizovaný H reťazec verzie „b a humanizovaný L reťazec verzie „b a „c. Tieto protilátky boli testované na antigén väzbovú aktivitu a antigén-neutralizačnú aktivitu. Obidve sa vyznačovali mierne zníženou aktivitou ako chimerická protilátka, a to v obidvoch testovaných aktivitách.

viii. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „b a „d a humanizovaného L reťazca verzie „b

Metódou FR-shuffling boli pripravené zlepšené verzie protilátok („b-b a „d-b), nesúce humanizovaný H reťazec a humanizovaný L reťazec verzie „b. Väzbová aktivita týchto protilátok k antigénu bola testována pomocou ELISA techniky. Bolo zistené, že „d-b mala väzbovú aktivitu rovnakú ako chimerická protilátka, a „b-b mala mierne nižšiu aktivitu. Na druhej strane, neutralizačná aktivita proti antigénu v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ktorú predstavovala chimerická protilátka, bola mierne slabšia v prípade „b-b a signifikantne nižšia v prípade „d-b. Taktiež bolo zistené, že verzia „b-b predstavuje protilátku s vysokou antigén neutralizujúcou aktivitou, zatiaľ čo verzia „d-b predstavuje protilátku s vysokou väzbovou aktivitou k antigénu.

ix. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „e a chimerického L reťazca a humanizovaného L reťazca verzie „b

Boli pripravené protilátky („e-ch a „e-b), ktoré obsahovali humanizovaný H reťazec verzie „e, kombinovaný s chimerickým L reťazcom a humanizovaným L reťazcom verzie „b. Verzia „e-ch sa vyznačovala rovnakou väzbovou aktivitou k antigénu, akou sa vyznačovala chimerická protilátka, ale expresia „e-b protilátky bola príliš slabá a väčšina väzbovej aktivity sa stratila. Antigén neutralizujúca aktivita verzie „e-ch bola signifikantne nižšia ako aktivita chimerickej protilátky. Bolo teda konštatované, že kombinácia H reťazca verzie „e a L reťazca verzie „b nie je šťastná a protilátka nie je funkčná.

x. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „f, „g a „h a humanizovaného

L reťazca verzie „b

Boli pripravené protilátky („f-b, „g-b a „h-b), ktoré obsahovali humanizované

H reťazce verzie „f, „g a „h, kombinované s humanizovaným L reťazcom verzie „b.

V prípade verzie „f-b a „h-b bolo množstvo exprimovanej protilátky veľmi malé. Boli pripravené protilátky verzie „f“ a „h, kombinované s chimerickým L reťazcom, avšak nedochádzalo k ich expresii. Verzia „g-b dosiahla saturáciu pri nízkych koncentráciách a vyznačovala sa nižšou väzbovou aktivitou ako chimerická protilátka. Antigén neutralizačná aktivita verzie „g-b bola signifikantne slabšia ako aktivita chimerickej protilátky.

xi. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „b1“ a „di“ a humanizovaného L reťazca verzie „b

Boli pripravené protilátky („b1-b a „dl-b), ktoré niesli humanizovaný H reťazec verzie „bľ‘ a „d1“, kombinovaný s humanizovaným L reťazcom verzie „b. Tieto protilátky boli síce pripravené, ale neboli exprimované.

xii. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „b3 a „d3 a humanizovaného L reťazca verzie „b

Boli pripravené protilátky („b3-b a „d3-b), ktoré niesli humanizovaný H reťazec verzie „b3 a „d3, kombinovaný s humanizovaným L reťazcom verzie „b. Antigén väzbová aktivita verzie „d3-b bola mierne nižšia ako aktivita chimerickej protilátky. Antigén väzbová aktivita verzie „b3-b bola ešte oveľa nižšia. Antigén neutralizujúca aktivita verzie „b3-b bola vyššia ako aktivita verzie „b-b, ale bola nižšia ako aktivita chimerickej protilátky a verzie „d3-b a „b-b mali aktivitu rovnakú.

xiii. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „i a ,j a chimerického L reťazca a humanizovaného L reťazca verzie „b

Boli pripravené protilátky („i-ch a „j-ch“), ktoré niesli humanizovaný H reťazec verzie „i a „j, kombinovaný s chimerickým L reťazcom a protilátky („i-b a „j-b), kombinované s humanizovaným L reťazcom verzie „b. Protilátky boli testované na antigén väzbovú aktivitu a antigén neutralizujúcu aktivitu. Antigén väzbová aktivita všetkých protilátok bola približne rovnaká ako aktivita chimerickej protilátky. Verzia „ich mela antigén neutralizující aktivitu vyšší než chimerická protilátka. Verzie „i-b mala antigén neutralizujúcu aktivitu rovnakú ako chimerická protilátka a verzia „j-b mala signifikantne nižšiu antigén neutralizujúcu aktivitu ako chimerická protilátka.

xiv. Humanizovaný L reťazec verzie „b1“ a „b2

Keď boli pripravené protilátky („ch-b1 a „ch-b2), ktoré niesli humanizovaný L reťazec verzie „bľ* a „b2, kombinovaný s chimerickým H reťazcom, bolo zistené, že obidve protilátky mali antigén väzbovú aktivitu rovnakú ako chimérna protilátka. V prípade antigén neutralizačnej aktivity, verzia „ch-b1 mala aktivitu rovnakú ako chimerická protilátka, zatiaľ čo „ch-b2 mala aktivitu mierne vyššiu ako chimerická protilátka o vysokej koncentrácii. Verzie „b1“ a „b2 sú kandidátmi pre humanizovaný

L reťazec, avšak verzia „b2 je absolútne najlepšia, pretože má veľmi silnú aktivitu.

xv. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „b a humanizovaného L reťazca verzie „b2

Bola pripravená protilátka („b-b2'j, ktorá niesla humanizovaný H reťazec verzie „b, kombinovaný s humanizovaným L reťazcom verzie „b2. Protilátka bola testovaná na jej antigén väzbovú aktivitu a antigén neutralizujúcu aktivitu. Antigén väzbová aktivita bola mierne nižšia ako aktivita chimerickej protilátky. Antigén neutralizujúca aktivita, hoci mierne vyššia ako aktivita verzie „b-b, bola nižšia ako aktivita verzie „i-b.

xvi. Kombinácia humanizovaného H reťazca verzie „i a humanizovaného L reťazca verzie „b1“ alebo „b2

Boli pripravené protilátky („i-b1 a „i-b2), ktoré niesli humanizovaný H reťazec verzie „i, kombinovaný s humanizovaným L reťazcom verzie „b1“ alebo „b2. Protilátky boli testované na antigén väzbovú aktivitu a antigén neutralizujúcu aktivitu. Antigén väzbová aktivita verzie „i-b2 bola takmer rovnaká ako aktivita chimerickej protilátky. Antigén väzbová aktivita verzie „i-b1 bola mierne nižšia ako aktivita chimerickej protilátky. Antigén neutralizujúca aktivita verzie ,,i-b1 a „i-b2 bola vyššia ako aktivita chimerickej protilátky a verzie „i-b - „i-b2 --) „i-b1.

Referenčný príklad 7

Príprava CHO buniek produkujúcich humanizovanú protilátku a určenie jej aktivity

1. Stanovenie stabilnej CHO bunkovej línie

Na stanovenie stabilnej línie, ktorá stabilne produkuje humanizovanú protilátku (b-b, i-b a i-b2) bol do CHO (DG44) buniek vnesený expresný vektor pre protilátku. Plazmidy hHvb-hl_vb/N5KG4P, hHvi-hl_vb/N5KG4P a hHvi-hl_vb2/N5KG4P boli linearizované reštriktázou Sspl (od firmy Takara Shuzo) a po extrakcii fenolom a chloroformom bola DNA precipitované etanolom. Linearizovaný plazmid bol do DG44 buniek vnesený elektroporáciou pomocou elektroporátora Gene Pulser Inštrument (od firmy BioRad). 10 alebo 50 pg plazmidu bolo pridané k 0,8 ml bunkovej suspenzie DG44 buniek PBS. Bunky v koncentrácii 1 x 10⁷ buniek/ml boli elektropórované pulzmi 1 500 V s kapacitou 25 pF.

Po 10 minútach spamätania sa buniek pri izbovej teplote, boli elektroporované bunky resuspendované v CHO-S-SFMII médiu obsahujúcom hypoxantín/tymidín (HT, od firmy GIBCO) a kultivované v 100 μΙ/jamku na dvoch 96-jamkových doštičkách (od firmy Falcon) v CO₂ atmosfére v inkubátore. 8 až 9 hodín od začiatku kultivácie bolo médium nahradené 100 μΙ/jamku selekčného média CHO-S-SFMII, obsahujúceho HT (od firmy GIBCO) a 500 pg/ml geneticínu (G418 sulfát, od firmy GIBCO), pre selekciu buniek, do ktorých bol vnesený gén pre protilátku. Polovica objemu média bola menená jedenkrát za 3 až 4 dni. Po dvojtýždennej kultivácii v selekčnom médiu bol odobraný alikvot supernatantu z jamky, kde bol viditeľný zjavný rast buniek. V prípade, že bol pozorovaný dostatočný rast, bolo mmožstvo produkovanej protilátky merané pomocou ELISA techniky opísanej vyššie, a bunky so silnou expresiou protilátky boli vyselektované.

2. Veľkoobjemová purifikácia humanizovanej protilátky

Potom, čo boli DG44 bunky vyselektované a produkovali humanizovanú protilátku („b-b, „i-b a „i-b2), bola kultúra niekoľko dní pestovaná v 500 ml kultivačnej fľaši v CHO-S-SFMII médiu. Ďo 2I guľatej fľaše (od firmy CORMG) bolo odobraté kultivačné médium a bunkám bolo znova pridané 500 ml CHO-S-SFMII média. Kultivačné médium bolo centrifugované, aby sa odstránili zvyšky buniek a filtrované cez 0,22 alebo 0,45 pm filter. Opakovaním tohoto postupu boli získané 2 I supernatantu z bunkových kultúr. Zo získaného supernatantu bola purifikovaná protilátka, a to.pomocou ConSep LC100 systému (od firmy Millipore), spojeným s afinitnou kolónou s proteínem A (od firmy Poros).

3. Meranie koncentrácie protilátky metódou ELISA

SOURCE), nariedenej na koncentráciu 1 pg/ml v imobilazačnom pufri CB. Po blokovaní pomocou 200 μΙ dilučného DB bol bunkový supernatant z CHO buniek, ktoré exprimovali protilátku sériovo nariedený pomocou DB pufru, a potom nakvapkaný do každej jamky.

Po 1 hodinovej inkubácii pri izbovej teplote a po opláchnutí RB pufrom, bolo k reakcii pridané 100 μΙ kozej anti-ľudskej IgGy protilátky konjugovanej s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), ktorá bola nariedená 1 OOO-krát pomocou DB pufru. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny, nasledovanej opláchnutím pufrom RB, bol pridaný roztok substrátu. Potom bola pomocou Microplate Reader (od firmy Bio Rad) meraná absorbancia pri vlnovej dĺžke 405/655 nm. Ako štandard pre meranie koncentrácie bola použitá protilátka lgG4« (od firmy Binding Site).

5. Meranie antigén väzbovej aktivity

Doštičky pre ELISA test merenia antigén-väzbovej aktivity boli pripravené nasledujúcim spôsobom: Použité bunky boli bunky ľudského karcinómu močového mechúra J82 (ATTC HTB-1). Na 60 jamiek 96-jamkovej doštičky boli vysiate bunky v hustote 1 x 10⁵ buniek/jamku. Bunky boli jeden deň kultivované v RPMI 1 640 médiu s 10 % fetálnym bovinným sérom (od firmy GIBCO), v termostate s CO₂ dovtedy, až bunky sadli. Po odstránení supernatantu bola každá jamka 2x prepláchnutá 300 μΙ PBS. 100 μΙ PBS obsahujúce 4 % paraformaldehydu (tu nazývaný ako PFA/PBS) bol pridaný, do každé jamky a doštička bola na 10 minút umiestnená na ľad, pre dostatečnú imobilizáciu.

PFA/PBS bol odstránený a každá jamka bola dvakrát prepláchnutá 300 μΙ PBS. Potom boli jamky blokované 250 μΙ pufru DB. Supernatant z kultúry bol sériovo nariedený v dvojitom riedení pomocou pufru DB, s počiatočným riedením 10 pg/ml, 100 μΙ na každú jamku. Po dvojhodinovej inkubácii pri izbovej teplote nasledovalo opláchnutie pufrom RB. Potom bolo pridané 100 μΙ kozej anti-ľudskej IgGy protilátky konjugovanej s alkalickou fosfatázou (od firmy BIO SOURCE), ktorá bola nariedená 10OO-krát pomocou DB pufru. Po inkubácii pri izbovej teplote počas 1 hodiny, nasledovanej opláchnutím pufrom RB, bolo pridané 100 μΙ roztoku substrátu. Potom bola pomocou Microplate Reader (od firmy Bio Rad) meraná absorbancia pri vlnovej dĺžke 405/655 nm.

6. Meranie neutralizujúcej aktivity proti TF (faktor inhibující produkciu FXa)

Neutralizačná aktivita humanizovanej protilátky zamerená proti produkcii FXa bola meraná pomocou inhibičnej aktivity na produkciu faktora Xa, s pletivovým tromboplastínom derivovaným z ľudskej placenty (Tromborel S, od firmy Boehringer, AG) ako štandardom. 60 μΙ pufru (TBS obsahujúce 5 mM CaCb, a 0,1 % BSA) bolo pridané k 10 μΙ Tromborelu S v koncentrácii 5 mg/ml a 10 μΙ vhodne nariedenej protilátky. Reakcia sa vykonala na 96-jamkovej doštičke počas 1 hodiny. Protilátka bola sériovo nariedená v päťnásobnom riedení s počiatočnou koncentráciou 200 pg/ml.

K reakci bolo pridané 10 μΙ 3,245 pg/ml ľudského faktora X (od firmy Celsus Laboratories) a 82,5 ng /ml ľudského faktora Vila (od firmy Enzýme Research). Nasledovala inkubácia pri izbovej teplote počas 45 minút. Pre zastavenie reakcie bolo pridané 10 μΙ 0,5 M EDTA. Potom bolo k reakcii pridané 50 μΙ chromogénneho substrátu a pomocou Microplate Reader (od firmy Bio Rad) bola meraná absorbancia pri vlnovej dĺžke 405/655 nm. Po inkubácii 30 minút pri izbovej teplote bola absorbancia pri 405/655 nm meraná znovu. Neutralizačná aktivita bola určená ako percento reziduálnej aktivity pri každej zmene absorbancie počas hodinového merania, pričom 100 % aktivita bola prisúdená vzorke, kde nebola pridaná protilátka.

Roztok chromogénneho substrátu bol pripravený riedením Testzyme chromogénneho substrátu S-2 222 (Chromogenix) podľa návodu udaného výrobcom, a to tak, že bol 2-krát nariedený destilovanou vodou a zmiešaný s roztokom polybrénu (0,6 mg/ml hexadimetylénbromid, od firmy SIGMA) v pomere 1:1.

6. Meranie TF neutralizačnej aktivity (aktivita inhibujúca väzbu FX)

Inhibičná aktivita zameraná proti väzbe FX s humanizovanou protilátkou bola meraná použitím tkanivového tromboplastínu derivovaného z ľudskej placenty (Tromborel S, od firmy Boehringer, AG), v ktorom sa vytvoril komplex TF a faktora Vila. Inhibičná aktivita na FX väzbu bola meraná produkciou faktora Xa na podklade komplexu TF-FVila ako štandardu.

μΙ pufru (TBS obsahujúce 5 mM CaCI_2l a 0,1 % BSA) bolo pridané k 10 μΙ

Tromborelu S v koncentrácii 5 mg/ml a 10 μΙ vhodne nariedenej protilátky. Reakcia sa vykonala na 96-jamkovej doštičke počas 1 hodiny.

K reakcii bolo pridané 10 μΙ 3,245 μg/ml ľudského faktora X (od firmy Celsus

Laboratories) a 82,5 ng /ml ľudského faktora Vila (od firmy Enzýme Research). Nasledovala inkubácia pri izbovej teplote počas 45 minút. Pre zastavenie reakcie bolo pridané 10 pl 0,5 M EDTA. Potom bolo k reakcii pridané 50 μΙ chromogénneho substrátu a pomocou Microplate Reader (od firmy Bio Rad) bola meraná absorbancia pri vlnovej dĺžke 405/655 nm. Po inkubácii 30 minút pri izbovej teplote bola absorbancia pri 405/655 nm meraná znova. Neutralizačná aktivita bola určená ako percento reziduálnej aktivity pri každej zmene absorbancie počas hodinového merania, pričom 100 % aktivita bola prisúdená vzorke, kde nebola pridaná protilátka.

7. Meranie neutralizačnej aktivity zameranej proti inhibičnej aktivite plazmatickej koagulácie

Neutralizačná aktivita humanizovanej protilátky zameraná proti TF (inhibičná aktivita na plazmatickú koaguláciu) bola meraná pomocou protrombínového času ako indexu. Protrombínový čas bol stanovený na základe tromboplastínu derivovaného z ľudskej placenty, Tromborel S (od firmy Boehringer AG). 100 μΙ ľudskej plazmy (od firmy Cosmo Bio) bolo pridané k vzorke, ku ktorej bolo rovnako pridané 50 μΙ protilátky v rôznych koncentráciách. Vzorka bola 3 minúty zahrievaná na teplotu 37 °C. 50 μΙ Tromborelu S s koncentráciou 1,25 mg/ml, ktorý bol predohriaty na teplotu 37 °C bolo pridané k reakčnej zmesi, čím sa spustila plazmatická koagulácia. Koagulačný čas bol meraný prístrojem Amelung KC-10A, spojeným s Amelung CR-A (obidva prístroje od firmy M.C.Medical).

Protilátka bola sériovo nariedená v dvojkovom riedení pomocou TBS s 0,1 % BSA (TBS/BSA). Počiatočná koncentrácia bola 80 pg/ml. Koagulačný čas pri neprítomnosti protilátky bol stanovený ako 100 % TF plazmatickej koagulačnej aktivity. Reziduálna TF aktivita bola počítaná z koagulačného času vo chvíli pridania protilátky, založeného na štandardnej krivke získanej vynesením závislosti koncentrácie Tromborelu S a koagulačného času.

Štandardná krivka bola skonštruovaná z rôznych koncentrícií Tromborelu S a nameraného koagulačného času. 50 μΙ BSA-TBS bolo pridané do 50 μΙ vhodne nariedeného Tromborelu S, ktorý bol predohriaty na teplotu 37 °C počas 3 minút. K tejto zmesi bolo pridané 100 μΙ ľudskej plazmy predohriatej na 37 °C, čím sa naštartovala koagulácia. Koagulačný čas bol meraný. Tromborel S bol sériovo nariedený v Hankovome pufri (od firmy GIBCO), obsahujúcom 25 mM CaCb. Počiatočná koncentrácia v dvojkovom riedení bola 6,25 mg/ml. Koncentrácia Tromborelu S bola vynesená na úsečku a koagulačný čas na logaritmický papier a bola skonštruovaná štandardná krivka.

8. Stanovenie aktivity

Všetky humanizované protilátky „b-b, „i-b a „i-b2 mali aktivitu rovnakú alebo vyššiu ako bola aktivita chimerickej protilátky (Obr. 1). V prípade inhibičnej aktivity na tvorbu FXa, FX väzbu a plazmatickú koaguláciu, mali humanizované protilátky „b-b, „i-b a „i-b2 rovnakú alebo vvyššiu aktivitu ako chimerická protilátka, pričom aktivita humanizovaných protilátok klesala v tomto poradí: „i-b2 --) „i-b--) „b-b (Obr. 2 až 4).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Experimentálne zviera, vyznačujúce sa tým, že mu boli implantované bunky zvierat, do ktorých bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor TF alebo jeho časť, a ktoré sú schopné exprimovať uvedený gén, pričom uvedené zviera nie je človek a dlhodobo u neho pretrváva hyperkoagulačný stav.
2. Zviera podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že uvedeným častiam ľudského tkanivového faktora chýba intracelulárna oblasť.
3. Zviera podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúce sa tým, že uvedenou bunkou zvierat je cicavčie bunka.
4. Zviera podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že uvedená cicavčie bunka je bunka ľudského myelómu.
5. Zviera podľa nárokov 1 až 4, vyznačujúce sa tým, že zvieraťom je myš.
6. Zviera podľa nárokov 1 až 5, vyznačujúce sa tým, že hyperkoagulačný stav je naznačený aspoň jedným fenoménom zahŕňajúcim nárast plazmatickej koncentrácie ľudského tkanivového faktora, pokles počtu krvných doštičiek, pokles fibrinogénu, nárast solubilných komplexov fibrín - monomérov a nárast koncentrácie komplexov trombín-antitrombín III.
7. Spôsob prípravy zvieraťa podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že cicavčie bunka, do ktorej bol vnesený gén pre ľudský tkanivový faktor alebo jeho časť, je schopná exprimovať uvedený gén, pričom táto bunka je implantovaná do zvieraťa iného ako človek, ktoré má pretrvávajúci hyperkoagulačný stav a toto zviera je selektované.
8. Spôsob testovania antitrombotickej látky, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa zviera podľa nárokov 1 až 6.
9. Preventívna alebo terapeutická látka, vyznačujúca sa tým, že sa použije v prípade ochorenia charakterizovaného hyperkoagulačným stavom, pričom uvedená látka zahŕňa protilátku proti ľudskému tkanivovému faktoru (TF).
10. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je polyklonálna protilátka.
11. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je monoklonálna protilátka.
12. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 9 alebo 11, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je rekombinantná protilátka.
13. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 9 až 12, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je pozmenená protilátka.
14. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 9, 12 a 13, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je chimerická protilátka alebo humanizovaná protilátka.
15. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 14, vyznačujúca sa tým, že humanizovanou protilátkou je humanizovaná protilátka verzie b-b, i-b alebo i-b2.
16. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 9, 12 až 15, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je modifikovaná protilátka.
17. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že modifikovanou protilátkou sú fragmenty protilátky Fab, F(ab')2 alebo Fv alebo jednoreťazcový fragment Fv (scFv).
18. Preventívna alebo terapeutická látka, vyznačujúca sa tým, že sa použije ria liečenie hyperkoagulačného stavu vzniknutého na podklade infekcií, pričom uvedená látka zahŕňa protilátku proti ľudskému tkanivovému faktoru (TF).
19. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je polyklonálna protilátka.
20. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 18, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je monoklonálna protilátka.
21. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 18 a 20, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je rekombinantná protilátka.
22. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 18 a 21, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je pozmenená protilátka. .
23. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 18, 21 a 22, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je chimerická protilátka alebo humanizovaná protilátka.
24. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 23, vyznačujúca sa tým, že humanizovanou protilátkou je humanizovaná protilátka verzie b-b, i-b alebo i-b2.
25. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 18, 21 až 24, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je modifikovaná protilátka.
26. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 25, vyznačujúca sa tým, že modifikovanou protilátkou sú fragmenty protilátky Fab, F(ab')2 alebo Fv alebo jednoreťazcový fragment Fv (scFv).
27. Preventívna alebo terapeutická látka, vyznačujúca sa tým, že sa použije na liečenie trombózy žíl, pričom uvedená látka zahŕňa protilátku proti ľudskému tkanivovému faktoru (TF).
28. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je polyklonálna protilátka.
29. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 27, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je monoklonálna protilátka.
30. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 27 a 29, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je rekombinantné protilátka.
31. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 27 a 30, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je pozmenená protilátka.
32. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 27, 30 a 31, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je chimerická protilátka alebo humanizovaná protilátka.
33. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že humanizovanou protilátkou je humanizovaná protilátka verzie b-b, i-b alebo i-b2.
34. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 27, 30 až 33, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je modifikovaná protilátka.
35. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 34, vyznačujúca sa tým, že modifikovanou protilátkou sú fragmenty protilátky Fab, F(ab')a alebo Fv alebo jednoreťazcový fragment Fv (scFv).
36. Preventívna alebo terapeutická látka, vyznačujúca sa tým, že sa použije na liečenie arteriálnej trombózy, pričom uvedená látka zahŕňa protilátku proti ľudskému tkanivovému faktoru (TF).
37. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 36, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je polyklonálna protilátka.
38. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 36, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je monoklonálna protilátka.
39. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 36 a 38, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je rekombinantné protilátka.
40. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 36 a 39, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je pozmenená protilátka.
41. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 36, 39 a 40, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je chimerická protilátka alebo humanizovaná protilátka.
42. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 41, vyznačujúca sa tým, že humanizovanou protilátkou je humanizovaná protilátka verzie b-b, i-b alebo i-b2.
43. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 36, 39 až 42, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je modifikovaná protilátka.
44. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 43, vyznačujúca sa tým, že modifikovanou protilátkou sú fragmenty protilátky Fab, F(ab')2 alebo Fv alebo jednoreťazcový fragment Fv (scFv).
45. Preventívna alebo terapeutická látka, vyznačujúca sa tým, že sa použije na liečenie ochorení vznikajících na podklade zhrubnutia médie ciev, pričom uvedená látka zahŕňa protilátku proti ľudskému tkanivovému faktoru (TF).
46. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 45, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je polyklonálna protilátka.
47. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 45, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je monoklonálna protilátka.
48. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 45 a 47, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je rekombinantné protilátka.
49. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 45 a 48, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je pozmenená protilátka.
50. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 45, 48 a 49, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je chimerická protilátka alebo humanizovaná protilátka.
51. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 50, vyznačujúca sa tým, že humanizovanou protilátkou je humanizovaná protilátka verzie b-b, i-b alebo i-b2.
52. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nárokov 43, 48 až 51, vyznačujúca sa tým, že protilátkou je modifikovaná protilátka.
53. Preventívna alebo terapeutická látka podľa nároku 52, vyznačujúca sa tým, že modifikovanou protilátkou sú fragmenty protilátky Fab, F(ab')2 alebo Fv alebo jednoreťazcový fragment Fv (scFv).