JP2022523360A - Metに結合する抗met抗体および二特異性抗原結合分子を使用した眼癌の治療方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書において、METに結合する抗体または二特異性抗原結合分子、または当該抗体もしくは二特異性抗原結合分子を含む抗体-薬剤結合体(ADC)を使用して、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌を治療する方法が提供される。二特異性抗原結合分子は、第一および第二の抗原結合ドメインを含み、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、ヒトMETの細胞外ドメインの二つの異なるエピトープに結合する。ADCは、細胞障害剤、放射性核種、または他の部分に連結された、本明細書に提供される抗体または二特異性抗原結合分子を含む。抗体および二特異性抗原結合分子は、ヒトMETおよびそのリガンドのHGFとの間の相互作用を遮断することができる。眼癌を有する対象、例えば、c-Metを発現するブドウ膜メラノーマを有する対象を、抗体、二特異性抗原結合分子、またはそのADCを当該対象に投与することにより治療することができる。【選択図】なし
Description
本発明は、肝細胞増殖因子受容体(c-MetまたはMET)に特異的に結合し、METシグナル伝達を調節して、ブドウ膜メラノーマを含む眼癌を治療する抗体、二特異性抗体、およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体の抗体-薬剤結合体に関するものである。
配列表
配列表の公的な写しは、ASCIIフォーマットの配列表としてEFS-Webを介して電子的に本明細書と同時に提出され、当該写しのファイル名は「10548WO01_SEQ_LIST_ST25.TXT」であり、2020年2月20日が作成日であり、サイズは約140キロバイトである。このASCIIフォーマット書面に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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ブドウ膜メラノーマは、成人において最も普遍的な眼内原発性悪性腫瘍であり、眼メラノーマの79~81%を占める。米国における発症率は100万人当たり5人と推定され、一方でヨーロッパにおける発症率は緯度に依存し、北から南へと向かうにつれて発症率は減少して100万人当たり2~8人と推定されている。ブドウ膜メラノーマは転移傾向が高く、長期予後は不良で、50%を超える症例で死亡する。
肝細胞増殖因子(HGF)(別名、散乱因子[SF:scatter factor])はヘテロ二量体のパラクライン増殖因子であり、HGF受容体(HGFR)と相互作用することによってその活性を発揮する。HGFRは、c-Met癌遺伝子の産物であり、METとしても知られている。METは、ジスルフィド架橋を介して細胞外アルファ鎖に連結された膜貫通ベータ鎖からなる受容体チロシンキナーゼである。HGFがMETに結合すると、METのキナーゼ触媒活性が活性化され、ベータ鎖のTyr 1234およびTyr 1235のリン酸化と、それに続く下流シグナル伝達経路の活性化が生じる。
MET遺伝子が増幅した腫瘍細胞株は、増殖および生存をMETに高度に依存している。様々な一価のMET遮断抗体が、様々な癌の治療に臨床開発されている(米国特許第5,686,292号、第5,646,036号、第6,099,841号、第7,476,724号、第9,260,531号、および第9,328,173号、ならびに米国特許出願公開2014/0349310および2005/0233960を参照)。そうした抗体としては、オナルツズマブ(MetMab:onartuzumab)やエミベツズマブ(emibetuzumab)が挙げられる(Xiang et al.,Clin.Cancer Res.19(18):5068-78,2013、およびRosen et al.,Clin.Cancer Res.,Published October 10,2016,doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-1418)。これら抗体の一部は、リガンド依存性のMETシグナル伝達を遮断するが、リガンド非依存性のMET活性化の遮断にはあまり有効ではない。
ブドウ膜メラノーマ腫瘍は、G-タンパク質の変異(GNAQおよびGNA11)とc-Metの高発現を特徴とする。ブドウ膜メラノーマのc-Metの標的化は、細胞の浸潤と転移を阻害するが、腫瘍の増殖は抑制されない。局所的な腫瘍制御率や世界的な救命率は徐々に改善されているが、生存率は比較的未変化のままである。抗体-薬剤結合体(ADC:antibody-drug conjugate)は過去数年で進歩しており、そのうちのいくつかはFDAにより使用が承認されているが、ブドウ膜メラノーマに対して開発されたものはこれまでのところない。リガンド依存性とリガンド非依存性の両方のMETシグナル伝達を強力に遮断する、ブドウ膜メラノーマを含む眼癌の治療に使用するための抗癌剤の改善に対する重大なアンメットメディカルニーズが未だ存在している。
ブドウ膜メラノーマ腫瘍は、G-タンパク質の変異(GNAQおよびGNA11)とc-Metの高発現を特徴とする。ブドウ膜メラノーマのc-Metの標的化は、細胞の浸潤と転移を阻害するが、腫瘍の増殖は抑制されない。局所的な腫瘍制御率や世界的な救命率は徐々に改善されているが、生存率は比較的未変化のままである。抗体-薬剤結合体(ADC:antibody-drug conjugate)は過去数年で進歩しており、そのうちのいくつかはFDAにより使用が承認されているが、ブドウ膜メラノーマに対して開発されたものはこれまでのところない。リガンド依存性とリガンド非依存性の両方のMETシグナル伝達を強力に遮断する、ブドウ膜メラノーマを含む眼癌の治療に使用するための抗癌剤の改善に対する重大なアンメットメディカルニーズが未だ存在している。
Xiang et al.,Clin.Cancer Res.19(18):5068-78,2013
Rosen et al.,Clin.Cancer Res.,Published October 10,2016,doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-1418
本明細書において、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌を治療する方法が提供される。当該方法は、抗体、抗体の抗原結合断片、二価一特異性抗体の組み合わせ、またはヒトc-Met受容体タンパク質に結合する二特異性抗体(MET×MET)を用いた治療を含む。抗MET抗体およびその抗原結合部分は、非改変の形態で単独で使用されてもよく、または抗体-薬剤結合体(ADC)の一部として、もしくは二特異性抗体の一部として含まれてもよい。抗体およびADCは特に、METを発現する腫瘍細胞の標的化に有用であり、したがって本明細書に開示される眼癌の治療方法において有用である。
他の実施形態は、後に続く詳細な説明の検討を行うことから明白となるであろう。
他の実施形態は、後に続く詳細な説明の検討を行うことから明白となるであろう。
図16Bは、対照抗体、10mg/kgの抗MET一価抗体、および10mg/kgのMET×MET二特異性抗体を用いた処置後に、マウス異種移植片モデルから採取されたSNU5腫瘍から抽出されたpMET、MET、およびチューブリン(ローディング対照)のイムノブロットである。
本発明を説明する前に、本開示は、記述される特定の方法および実験条件に限定されず、そうした方法および条件は変化し得ることを理解されたい。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるため、本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的でのみ使用されており、限定することは意図されないことも理解されたい。
別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本教示の属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙される数値に関して使用される場合、当該値が、列挙される値から1%以下まで変動し得ることを意味する。例えば本明細書で使用される場合、「約100」という表現には、99および101、ならびにその間のすべての値(例えば、99.1、99.2、99.3、99.4など)が含まれる。
本明細書に記載したものと類似または均等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから記述する。本明細書において言及される全ての特許、特許出願、および非特許公開文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
METタンパク質
「MET」、「c-Met」などの表現は、本明細書で使用される場合、(1)配列番号145に記載されるアミノ酸配列、および/もしくはアイソフォーム「a」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すNCBIアクセッション番号NM_001127500.2に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、(2)配列番号146に記載されるアミノ酸配列、および/もしくはアイソフォーム「b」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すNCBIアクセッション番号NM_000236.2に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、(3)配列番号147に記載されるアミノ酸配列、および/もしくはアイソフォーム「c」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すNCBIアクセッション番号NM_001311330.1に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、ならびに/または(3)三つのアイソフォームすべてに共通する細胞質アルファサブユニット(配列番号148)、および膜貫通ベータサブユニット(アイソフォームa、bおよびcに対しそれぞれ配列番号149、150または151)、を含む成熟タンパク質、を含むヒト膜貫通受容体チロシンキナーゼを指す。「MET」という表現には、単量体および多量体のMET分子の両方が含まれる。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトMET」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有していない、または保有していない、および別のMET分子への直接的な物理的接続を伴わずに単一のMET分子として通常の条件下に存在する、METタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体MET分子は、本明細書において、配列番号152のアミノ酸配列を含む「hMET.mmh」と呼称される分子である(例えば本明細書の実施例3を参照)。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトMET」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Fcドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のMET分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体MET分子は、本明細書において、配列番号153のアミノ酸配列を含む「hMET.mFc」と呼称される分子である(例えば本明細書の実施例3を参照)。
「MET」、「c-Met」などの表現は、本明細書で使用される場合、(1)配列番号145に記載されるアミノ酸配列、および/もしくはアイソフォーム「a」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すNCBIアクセッション番号NM_001127500.2に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、(2)配列番号146に記載されるアミノ酸配列、および/もしくはアイソフォーム「b」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すNCBIアクセッション番号NM_000236.2に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、(3)配列番号147に記載されるアミノ酸配列、および/もしくはアイソフォーム「c」の非プロセッシングプレプロタンパク質を表すNCBIアクセッション番号NM_001311330.1に記載されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列、ならびに/または(3)三つのアイソフォームすべてに共通する細胞質アルファサブユニット(配列番号148)、および膜貫通ベータサブユニット(アイソフォームa、bおよびcに対しそれぞれ配列番号149、150または151)、を含む成熟タンパク質、を含むヒト膜貫通受容体チロシンキナーゼを指す。「MET」という表現には、単量体および多量体のMET分子の両方が含まれる。本明細書において使用される場合、「単量体ヒトMET」という表現は、任意の多量体形成ドメインを含有していない、または保有していない、および別のMET分子への直接的な物理的接続を伴わずに単一のMET分子として通常の条件下に存在する、METタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体MET分子は、本明細書において、配列番号152のアミノ酸配列を含む「hMET.mmh」と呼称される分子である(例えば本明細書の実施例3を参照)。本明細書で使用される場合、「二量体ヒトMET」という表現は、リンカー、共有結合、非共有結合を介して、または抗体Fcドメインなどの多量体形成ドメインを介して、互いに接続された二個のMET分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体MET分子は、本明細書において、配列番号153のアミノ酸配列を含む「hMET.mFc」と呼称される分子である(例えば本明細書の実施例3を参照)。
本明細書における、タンパク質、ポリペプチド、およびタンパク質断片への全ての参照は、非ヒト種からと明示的に指定されていない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質断片のヒトバージョンを指すことが意図されている。したがって、「MET」という表現は、例えば「マウスMET」、「サルMET」など、非ヒト種由来であると特定されていない限り、ヒトMETを意味する。
本明細書において使用される場合、「細胞表面発現MET」という表現は、METタンパク質の少なくとも一部が、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分にアクセス可能であるように、インビトロまたはインビボにおいて細胞表面上に発現される、一つ以上のMETタンパク質、またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面発現MET」は、METタンパク質を通常に発現する細胞の表面上に発現されるMETタンパク質を含んでもよく、またはそれからなってもよい。あるいは、「細胞表面発現MET」は、通常はその表面上にヒトMETを発現しないが、人為的にその表面上にMETを発現するように操作された細胞の表面上で発現されるMETタンパク質を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
眼癌の治療方法
本明細書において、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌を治療する方法が提供される。一部の態様では、方法は、その必要のある対象に、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子(例えば、本明細書の表1に記載されるHCVR/LCVRまたはCDRの配列のいずれかを含む抗MET、または本明細書の表5に記載されるD1構成要素およびD2構成要素のいずれかを含むMET X MET二特異性抗原結合分子、またはオナルツズマブ(onartuzumab)、エミベツズマブ(emibetuzumab)、テリソツズマブ(telisotuzumab)、SAIT301、ARGX-111、Sym015、HuMax-cMet、およびCE-355621からなる群から選択される抗MET抗体)を含む治療用組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子は、以下に詳述されるように、例えばメイタンシノイドなどの細胞障害性化合物に結合される。治療用組成物は、細胞障害剤に結合された抗MET ADCまたはMET X MET二特異性抗原結合分子を含む、本明細書に記載される抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。
本明細書において、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌を治療する方法が提供される。一部の態様では、方法は、その必要のある対象に、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子(例えば、本明細書の表1に記載されるHCVR/LCVRまたはCDRの配列のいずれかを含む抗MET、または本明細書の表5に記載されるD1構成要素およびD2構成要素のいずれかを含むMET X MET二特異性抗原結合分子、またはオナルツズマブ(onartuzumab)、エミベツズマブ(emibetuzumab)、テリソツズマブ(telisotuzumab)、SAIT301、ARGX-111、Sym015、HuMax-cMet、およびCE-355621からなる群から選択される抗MET抗体)を含む治療用組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子は、以下に詳述されるように、例えばメイタンシノイドなどの細胞障害性化合物に結合される。治療用組成物は、細胞障害剤に結合された抗MET ADCまたはMET X MET二特異性抗原結合分子を含む、本明細書に記載される抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。
ブドウ膜メラノーマは、成人において最も普遍的な悪性原発性の眼内腫瘍である。これらの腫瘍は、脈絡膜、虹彩および毛様体に発生する可能性があり、虹彩または毛様体のメラノーマと呼ばれる場合もある。ブドウ膜メラノーマは高度に転移性である。他の眼癌としては、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫が挙げられ、後者は毛様体およびブドウ膜で発生する可能性がある。本明細書に開示される方法は、例えば眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用であることが予期される。一部の態様では、治療には、原発腫瘍からの浸潤および/もしくは転移を阻害または軽減することが含まれる。
抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合分子、ならびにその薬剤結合体は特に、METの発現、シグナル伝達もしくは活性に関連する、または介在される、またはMETとHGFの間の相互作用の遮断により治療可能である、ならびに/または別手段によりMETの活性および/もしくはシグナル伝達を阻害することにより治療可能である、ならびに/または受容体内在化を促進することにより治療可能である、ならびに/または細胞表面受容体の数を減少させることにより治療可能である、任意の疾患もしくは障害の治療、予防および/または改善に有用である。特に抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合分子、ならびにその薬剤結合体は、ブドウ膜メラノーマの治療に有用である。治療には、対象においてブドウ膜メラノーマの腫瘍増殖を低下させること、および/またはブドウ膜メラノーマの退縮をもたらすことが含まれる。さらに治療には、ブドウ膜メラノーマ細胞の浸潤を阻害もしくは軽減すること、または原発腫瘍からのブドウ膜メラノーマの転移を阻害もしくは軽減することが含まれる。
例えば本開示の抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子は、METを発現する(または過剰発現する)ブドウ膜メラノーマ腫瘍の治療に有用である。例えば、抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子は、眼に生じる原発性および/または転移性の腫瘍を治療するために使用されてもよい。
したがって本明細書は、対象において、眼癌を治療する方法、眼癌の増殖を低下させる方法、眼癌の浸潤および/もしくは転移を阻害または軽減する方法、ならびに/または眼癌の退縮をもたらす方法を提供する。例えば本明細書は、対象において、ブドウ膜メラノーマを治療する方法、ブドウ膜メラノーマ腫瘍の増殖を低下させる方法、ブドウ膜メラノーマの浸潤および/もしくは転移を阻害または軽減する方法、ならびに/またはブドウ膜メラノーマの退縮をもたらす方法を提供する。一部の態様では、例えばブドウ膜メラノーマなどの眼癌は、METを発現する。一部の態様では、方法は、その必要のある対象に、二特異性抗原結合分子とサイトトキシンを含む抗体-薬剤結合体(ADC)を投与することを含み、この場合において当該二特異性抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメイン(D1)および第二の抗原結合ドメイン(D2)を含み、D1はヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、D2はヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する。
さらに本明細書において、ブドウ膜メラノーマ細胞の増殖を阻害する方法、浸潤を阻害する方法、アポトーシスを誘導する方法、および/または生存率を減少させる方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、細胞と、二特異性抗原結合分子とサイトトキシンを含む抗体-薬剤結合体(ADC)とを接触させることを含む。一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメイン(D1)と第二の抗原結合ドメイン(D2)を含み、この場合においてD1は、ヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、D2は、ヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する。
さらに本明細書において、ブドウ膜メラノーマ細胞の有糸分裂停止を誘導する方法が提供される。一部の実施形態において、方法は、細胞と、二特異性抗原結合分子とサイトトキシンを含む抗体-薬剤結合体(ADC)とを接触させることを含み、この場合において当該二特異性抗原結合分子は、第一の抗原結合ドメイン(D1)と第二の抗原結合ドメイン(D2)を含み、D1はヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、D2はヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する。
また本明細書において、c-Met発現腫瘍に罹患する対象において、眼癌を治療する方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、当該対象に、二特異性抗原結合分子を投与することを含み、当該分子は、第一の抗原結合ドメイン(D1)と第二の抗原結合ドメイン(D2)を含み、この場合においてD1は、ヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、D2は、ヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する。一部の態様では、二特異性抗原結合分子は、サイトトキシンと結合されて、抗体-薬剤結合体(ADC)を形成する。一部の態様では、サイトトキシンは、メイタンシノイドである。
二特異性抗原結合分子の様々な態様、およびサイトトキシンの様々な態様が、以下の段落に提供されているが、本明細書の別段においてより詳細に記述される。
一部の態様では、D1とD2は、ヒトMETへの結合に関し、互いに競合しない。一部の態様では、ヒトMETの第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含む。一部の態様では、ヒトMETの第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む。一部の態様では、ヒトMETの第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含み、ヒトMETの第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む。
一部の実施形態では、D1は、配列番号58または配列番号18のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号138のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1,LCDR2およびLCDR3)とを含む。一部の実施形態では、D2は、配列番号82のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号138のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1,LCDR2およびLCDR3)とを含む。
一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列内のCDR、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列内のCDRを含む。一部の実施形態では、二特異性抗原結合分子は、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列内のCDR、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列内のCDRを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のD1は、配列番号58のアミノ酸配列または当該配列少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、および配列番号138のアミノ酸配列または当該配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む。
一部の態様では、D1のHCDR1は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号140のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、そしてLCDR3は、配列番号144のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のD1は、配列番号58のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むLCVRを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のD1は、配列番号58のアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列を含むLCVRを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のD2は、配列番号82のアミノ酸配列または当該配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、および配列番号138のアミノ酸配列または当該配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のD2のHCDR1は、配列番号84のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号86のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号88のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号140のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、LCDR3は、配列番号144のアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のD2は、配列番号82のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列、または当該配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むLCVRを含む。
一部の態様では、二特異性抗原結合分子のD2は、配列番号82のアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列を含むLCVRを含む。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、サイトトキシンは、バイオトキシン、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される。例えばサイトトキシンは、メイタンシノイド(maytansinoid)、オーリスタチン(auristatin)、トメイマイシン(tomaymycin)、デュオカルマイシン(duocarmycin)、225Ac、227Th、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択されてもよい。一部の態様では、サイトトキシンは、リンカーを介して二特異性抗原結合分子に結合される。
サイトトキシンの例は、以下である:
式中、
は、リンカーへの結合である。一部の態様では、リンカーは、以下である:
式中、
で記される結合は、二特異性抗原結合分子への結合を表し、
で記される結合は、サイトトキシンへの結合を表す。
さらなるサイトトキシンの例は、以下である:
式中、
は、リンカーへの結合である。一部の態様では、リンカーは、以下である:
式中、
で記される結合は、二特異性抗原結合分子への結合を表し、
で記される結合は、サイトトキシンへの結合を表す。
本明細書に提供される方法は、眼癌または目の癌の治療に有用である。一部の実施形態では、眼癌は、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫からなる群から選択される。
本明細書に記載される治療方法において、抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合分子、ならびにその薬剤結合体は、単剤療法として(すなわち、唯一つの治療剤として)投与されてもよく、または一つ以上の追加的治療剤(その例は本明細書において別に記載されている)と組み合わされて投与されてもよい。
抗MET抗体およびその抗原結合断片
さらなる詳細において、および一つの態様によれば、本明細書に提供される方法に従い有用な抗MET抗体は、本明細書の表1および表2に列挙される。表1には、例示的な抗MET抗体の重鎖可変領域(HCVR)、軽鎖可変領域(LCVR)、重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、および軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)のアミノ酸配列の識別子が記載されており、そこから本明細書に開示される二特異性抗原結合分子(本明細書において二特異性抗原結合タンパク質と相互交換可能に使用される)が誘導され得る。表2には、例示的な抗MET抗体のHCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3の核酸配列の識別子が記載されている。
さらなる詳細において、および一つの態様によれば、本明細書に提供される方法に従い有用な抗MET抗体は、本明細書の表1および表2に列挙される。表1には、例示的な抗MET抗体の重鎖可変領域(HCVR)、軽鎖可変領域(LCVR)、重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、および軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)のアミノ酸配列の識別子が記載されており、そこから本明細書に開示される二特異性抗原結合分子(本明細書において二特異性抗原結合タンパク質と相互交換可能に使用される)が誘導され得る。表2には、例示的な抗MET抗体のHCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2およびLCDR3の核酸配列の識別子が記載されている。
また本明細書に提供される方法に従って、オナルツズマブ、エミベツズマブ、テリソツズマブ、SAIT301、ARGX-111、Sym015、HuMax-cMet、およびCE-355621からなる群から選択される抗MET抗体も有用である。
また本明細書に提供される方法に従って、METに特異的に結合し、細胞中のMETのシグナル伝達経路をアゴナイズ(例えば活性化)する抗体またはその抗原結合断片も有益であり、ならびにMETシグナル伝達の活性化が有益である、または治療上有用である治療状況下における当該抗体の使用も有用である。そのようなアゴニスト性抗MET抗体の非限定的な例としては、本明細書において「H4H14636D」と呼称される抗体、ならびに重鎖CDRおよび軽鎖CDR(配列番号28、30、32、140、142、144)ならびに/またはその重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン(配列番号26/138)を含む抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。
本明細書において、表1に列挙されるHCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むHCVR、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する、実質的に類似した配列を含むHCVRを含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が有用である。
本明細書において、表1に列挙されるLCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むLCVR、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する、実質的に類似した配列を含むLCVRを含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が有用である。
本明細書において、表1に列挙されるLCVRアミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表1に列挙されるHCVRアミノ酸配列のいずれかを含むHCVRとLCVRとのアミノ酸配列ペア(HCVR/LCVR)を含む、METに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片が有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、HCVR/LCVRアミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される:配列番号2/138、10/138、18/138、26/138、34/138、42/138、50/138、58/138、66/138、74/138、82/138、90/138、98/138、106/138、114/138、122/138および130/138。
また、表1に列挙されるHCDR1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖CDR1(HCDR1)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表1に列挙されるHCDR2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖CDR2(HCDR2)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表1に列挙されるHCDR3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖CDR3(HCDR3)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表1に列挙されるLCDR1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖CDR1(LCDR1)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表1に列挙されるLCDR1アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表1に列挙されるHCDR1アミノ酸配列のいずれかを含むHCDR1とLCDR1とのアミノ酸配列ペア(HCDR1/LCDR1)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、HCDR1/LCDR1アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される:配列番号4/140、12/140、20/140、28/140、36/140、44/140、52/140、60/140、68/140、76/140、84/140、92/140、100/140、108/140、116/140、124/140および132/140。
また、表1に列挙されるLCDR2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖CDR2(LCDR2)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表1に列挙されるLCDR2アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表1に列挙されるHCDR2アミノ酸配列のいずれかを含むHCDR2とLCDR2とのアミノ酸配列ペア(HCDR2/LCDR2)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有されるHCDR2/LCDR2アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、HCDR2/LCDR2アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される:配列番号6/142、14/142、22/142、30/142、38/142、46/142、54/142、62/142、70/142、78/142、86/142、94/142、102/142、110/142、118/142、126/142および134/142。
また、表1に列挙されるLCDR3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖CDR3(LCDR3)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。
また、表1に列挙されるLCDR3アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表1に列挙されるHCDR3アミノ酸配列のいずれかを含むHCDR3とLCDR3とのアミノ酸配列ペア(HCDR3/LCDR3)を含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態によれば、抗体またはその抗原結合断片は、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列ペアを含む。ある実施形態では、HCDR3/LCDR3アミノ酸配列ペアは、以下からなる群から選択される:配列番号8/144、16/144、24/144、32/144、40/144、48/144、56/144、64/144、72/144、80/144、88/144、96/144、104/144、112/144、120/144、128/144および136/144。
本明細書において、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有される六個のCDR(すなわちHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)のセットを含む、METに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片も有用である。ある実施形態では、HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3のアミノ酸配列セットは、以下からなる群から選択される:配列番号4-6-8-140-142-144、12-14-16-140-142-144、20-22-24-140-142-144、28-30-32-140-142-144、36-38-40-140-142-144、44-44-48-140-142-144、52-54-56-140-142-144、60-62-64-140-142-144、68-70-72-140-142-144、76-78-80-140-142-144、84-86-88-140-142-144、92-94-96-140-142-144、100-102-104-140-142-144、108-110-112-140-142-144、116-118-120-140-142-144、124-126-128-140-142-144、および132-134-136-140-142-144。
関連の実施形態では、METに特異的に結合し、本明細書に開示される方法において有用な抗体またはその抗原結合断片は、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかにより規定されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアの中に含有される六個のCDR(すなわちHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む。例えばMETに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、以下からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアの中に含有されるHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列セットを含む:配列番号4-6-8-140-142-144、12-14-16-140-142-144、20-22-24-140-142-144、28-30-32-140-142-144、36-38-40-140-142-144、44-44-48-140-142-144、52-54-56-140-142-144、60-62-64-140-142-144、68-70-72-140-142-144、76-78-80-140-142-144、84-86-88-140-142-144、92-94-96-140-142-144、100-102-104-140-142-144、108-110-112-140-142-144、116-118-120-140-142-144、124-126-128-140-142-144、および132-134-136-140-142-144。
HCVRおよびLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定するための方法および技法は当該技術分野で既知であり、本明細書に開示の特定のHCVRおよび/またはLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定するために使用することができる。CDRの境界を同定するために使用することができる例示的な慣習としては、例えば、Kabat定義、Chothia定義、およびAbM定義が挙げられる。一般的な条件では、Kabat定義は配列変動性に基づき、Chothia定義は構造ループ領域の位置に基づき、AbM定義はKabatとChothia手法との間の折衷物である。例えば、Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)、Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)、およびMartin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)を参照されたい。パブリックデータベースもまた、抗体内のCDR配列を同定するために利用可能である。
本明細書に提供される方法に従い、改変グリコシル化パターンを有する抗MET抗体も有用である。いくつかの実施形態では、例えば、抗体依存性細胞傷害(ADCC)機能を増大させるために、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾、または抗体がオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損していることが有用であり得る(Shield et al.(2002)JBC 277:26733を参照されたい)。他の応用において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害(CDC)を修飾するために行うことができる。
MET X MET二特異性抗原結合分子
本発明者らは、METへのHGF結合を遮断する特定の一特異性抗MET抗原結合分子が、METシグナル伝達を強力に活性化する傾向があること(治療用分子にとって望ましくない結果)を観察した。しかしながら本発明者らは驚くべきことに、METタンパク質の細胞外ドメイン上の二つの異なるエピトープに同時に結合する二特異性抗原結合分子は、METへのリガンド結合を遮断しながら、METシグナル伝達のアゴニズムをほとんど引き起こさないことを発見した。さらに本発明者らは驚くべきことに、当該二特異性抗原結合分子は、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌の治療、および/または転移の阻害もしくは軽減に非常に適していることも発見した。
本発明者らは、METへのHGF結合を遮断する特定の一特異性抗MET抗原結合分子が、METシグナル伝達を強力に活性化する傾向があること(治療用分子にとって望ましくない結果)を観察した。しかしながら本発明者らは驚くべきことに、METタンパク質の細胞外ドメイン上の二つの異なるエピトープに同時に結合する二特異性抗原結合分子は、METへのリガンド結合を遮断しながら、METシグナル伝達のアゴニズムをほとんど引き起こさないことを発見した。さらに本発明者らは驚くべきことに、当該二特異性抗原結合分子は、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫などの眼癌の治療、および/または転移の阻害もしくは軽減に非常に適していることも発見した。
したがって本明細書に記載される方法に従い、第一の抗原結合ドメイン(本発明において「D1」とも称される)および第二の抗原結合ドメイン(本明細書において「D2」とも称される)を含む、二特異性抗原結合分子が有用である。当該二特異性抗原結合分子による二つの異なるMETエピトープの同時結合は、METシグナル伝達の活性化を最小限にしながら効果的にリガンド遮断を生じさせる。
ヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合する第一の抗原結合ドメイン(D1)と、ヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する第二の抗原結合ドメイン(D2)とを含む二特異性抗原結合分子は、本明細書において、「MET x MET二特異性抗体」、「MET x MET」、または他の関連する用語として呼称され得る。一部の実施形態では、ヒトMETの第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含む。一部の実施形態では、ヒトMETの第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む。一部の実施形態では、ヒトMETの第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含み、ヒトMETの第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む。
ある実施形態では、MET×MET二特異性抗体のD1ドメインおよびD2ドメインは、互いに非競合的である。METへの結合に対して、D1とD2の間の非競合とは、D1およびD2が誘導されたそれぞれの一特異性抗原結合タンパク質が、ヒトMETへの結合に対して互いに競合しないことを意味する。抗原結合タンパク質の競合アッセイの例は当分野で既知であり、その非限定的な例は本明細書の別段に記載される。
ある実施形態では、D1およびD2は、本明細書において別段に記載されるように、MET上の異なるエピトープ(例えば、MET上の非重複エピトープまたは部分重複エピトープ)に結合する。
MET x MET二特異性抗原結合分子は、二つの異なる一特異性抗MET抗体の抗原結合ドメインを使用して構築されてもよい。例えば、モノクローナル性の一特異性抗MET抗体のコレクションを、当分野に公知の標準的な方法を使用して作製してもよい。そのように作製された個々の抗体を、METタンパク質に対する交差競合に関して、互いに対して一対で試験してもよい。二つの異なる抗MET抗体が同時にMETに結合することができる場合(すなわち、互いに競合しない場合)、当該第一の抗MET抗体由来の抗原結合ドメインと、当該第二の非競合抗MET抗体由来の抗原結合ドメインを、本開示に従う一つのMET×MET二特異性抗体へと操作してもよい。
本発明によれば、二特異性抗原結合分子は、一つの多機能性ポリペプチドであってもよく、または互いに共有結合的にまたは非共有結合的に関連付けられた二つ以上のポリペプチドの多量体性の複合体であってもよい。本開示によって明らかとなるように、METの二つの異なる同一ではないエピトープに同時に結合する能力を有する抗原結合構築物はすべて、二特異性抗原結合分子と見なされる。本発明に開示される二特異性抗原結合分子またはそのバリアントはいずれも、当業者に公知であるように、標準的な分子生物学的手法(例えば、組み換えDNA法およびタンパク質発現技術)を使用して構築されてもよい。
抗原結合領域
本明細書に開示される方法において有用な二特異性抗原結合分子は、二つの異なる抗原結合ドメイン(D1およびD2)を含む。本明細書において使用される場合、「抗原結合ドメイン」という表現は、対象の特定抗原(例えばヒトMET)に特異的に結合することができる、あらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸分子、足場型(scaffold-type)分子、ペプチドディスプレイ分子(peptide display molecule)、またはポリペプチド含有構築物を意味する。「特異的に結合する」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合領域が、500pM以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる特定の抗原と複合体を形成し、一般的な試験条件下においてその他の無関係な抗原を結合しないことを意味する。「関連性のない抗原」とは、互いに95%未満のアミノ酸相同性を有する、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。
本明細書に開示される方法において有用な二特異性抗原結合分子は、二つの異なる抗原結合ドメイン(D1およびD2)を含む。本明細書において使用される場合、「抗原結合ドメイン」という表現は、対象の特定抗原(例えばヒトMET)に特異的に結合することができる、あらゆるペプチド、ポリペプチド、核酸分子、足場型(scaffold-type)分子、ペプチドディスプレイ分子(peptide display molecule)、またはポリペプチド含有構築物を意味する。「特異的に結合する」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原結合領域が、500pM以下の解離定数(KD)によって特徴付けられる特定の抗原と複合体を形成し、一般的な試験条件下においてその他の無関係な抗原を結合しないことを意味する。「関連性のない抗原」とは、互いに95%未満のアミノ酸相同性を有する、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。
本開示と関連して使用され得る抗原結合ドメインの例示的な分類には、抗体、抗体の抗原結合部分、特定の抗原と特異的に相互作用するペプチド(例えば、ペプチボディ)、特定の抗原と特異的に相互作用する受容体分子、特定の抗原に特異的に結合する受容体のリガンド結合部分を含むタンパク質、抗原結合足場(例えば、DARPins、HEAT反復タンパク質、ARM反復タンパク質、テトラトリコペプチド反復タンパク質、および天然の反復タンパク質に基づく他の足場など[例えば、Boersma and Pluckthun,2011,Curr.Opin.Biotechnol.22:849-857、および当該文献内に引用される参考文献を参照されたい])、ならびにそれらのアプタマーまたは部分が含まれる。
二個の分子が互いに特異的に結合するかどうかを判定するための方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴法、および同様の方法が挙げられる。例えば、本開示に関連して使用される場合、抗原結合領域には、表面プラズモン共鳴アッセイにて測定さした場合、約500pM未満、約400pM未満、約300pM未満、約200pM未満、約100pM未満、約90pM未満、約80pM未満、約70pM未満、約60pM未満、約50pM未満、約40pM未満、約30pM未満、約20pM未満、約10pM未満、約5pM未満、約4pM未満、約2pM未満、約1pM未満、約0.5pM未満、約0.2pM未満、約0.1pM未満、または約0.05pM未満のKDを有する、特定の抗原(例えば、標的分子[T]もしくは内部移行エフェクタータンパク質[E])またはその一部を結合するポリペプチドが含まれる。
「表面プラズモン共鳴法」という用語は、本明細書において使用される場合、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を、例えばBIAcore(登録商標)システム(GE Healthcare社内Biacoreライフサイエンス部門、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて検出することにより、リアルタイムの相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
「KD」という用語は、本明細書において使用される場合、特定のタンパク質-タンパク質相互作用(例えば、抗体-抗原相互作用)の平衡解離定数を意味する。本発明にて開示されるKD値は、表面プラズモン共鳴アッセイによって25℃で測定されたKD値を指す。
上記に示されるように、「抗原結合ドメイン」(D1および/またはD2)は、抗体または抗体の抗原結合断片を含んでもよいか、またはこれらからなってもよい。「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗原(例えば、ヒトMET)と特異的に結合する、または相互作用する少なくとも一つの相補性決定領域(CDR)を含む、あらゆる抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語には、四つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続した二つの重(H)鎖および二つの軽(L)鎖、ならびにそれらの多量体(例えば、IgM)を含む、免疫グロブリン分子が包含される。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVRまたはVHと省略される)と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3の三つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVRまたはVLと省略される)と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメイン(CL1)を含む。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域へとさらに細分され得る。各VHおよびVLは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのCDRと四つのFRから構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。異なる実施形態では、本明細書に提供される抗体のFR(またはその抗原結合部分)は、ヒトの生殖系列配列と同一であってもよく、または自然にもしくは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、二つ以上のCDRの並列分析に基づいて定義され得る。
本明細書に提供される二特異性抗原結合分子のD1構成要素および/またはD2構成要素は、完全抗体分子(full antibody molecules)の抗原結合断片を含んでいても、これらからなっていてもよい。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成するいずれか天然の、酵素処理により取得可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えばタンパク質消化、または抗体の可変ドメイン、および任意で定常ドメインをコードするDNAの操作と発現を含む遺伝子組み換え操作法などの任意の適切な標準的技術を使用して完全抗体分子から誘導されてもよい。そのようなDNAは既知であり、かつ/または例えば、市販の供給源、DNAライブラリ(例えば、ファージ抗体ライブラリを含む)から容易に入手可能であるか、もしくは合成され得る。DNAは化学的に、または分子生物学的技術を使用することにより配列解析され、および操作されてもよく、例えば、一つ以上の可変ドメインおよび/または定常ドメインを適切な構成へと配置させてもよく、またはコドンを導入してもよく、システイン残基を生成してもよく、修飾してもよく、アミノ酸を付加もしくは欠失させてもよい。
抗原結合断片の非限定例としては、(i)Fab断片、(ii)F(ab’)2断片、(iii)Fd断片、(iv)Fv 断片、(v)一本鎖Fv(scFv)分子、(vi)dAb断片、および(vii)抗体の超可変領域(例えば、CDR3ペプチドなどの単離された相補性決定領域(CDR))を模倣するアミノ酸残基、または拘束FR3‐CDR3‐FR4ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。例えばドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ(例えば一価ナノボディ、二価ナノボディなど)、小型モジュール式免疫薬剤(SMIP:small modular immunopharmaceutical)、およびサメ可変IgNARドメインなどの他の操作型分子も、本明細書において使用される場合、「抗原結合断片」という表現の内に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的に、少なくとも一つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、一般的に、一つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または一つ以上のフレームワークとともにフレーム内にある、少なくとも一つのCDRを含むであろう。VLドメインと結合したVHドメインを有する抗原結合断片において、VHドメインおよびVLドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であってもよく、VH-VH、VH-VLまたはVL-VL二量体を含有してもよい。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のVHまたはVLドメインを含有してもよい。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも一つの定常ドメインに共有結合された少なくとも一つの可変ドメインを含有してもよい。本開示の抗体の抗原結合断片内で見られ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な構成には、(i)VH-CH1、(ii)VH-CH2、(iii)VH-CH3、(iv)VH-CH1-CH2、(v)VH-CH1-CH2-CH3、(vi)VH-CH2-CH3、(vii)VH-CL、(viii)VL-CH1、(ix)VL-CH2、(x)VL-CH3、(xi)VL-CH1-CH2、(xii)VL-CH1-CH2-CH3、(xiii)VL-CH2-CH3、および(xiv)VL-CLが挙げられる。上記の構成例のいずれかを含む、可変ドメインと定常ドメインの任意の構成において、可変ドメインと定常ドメインは互いに直接結合されてもよく、または完全もしくは部分的なヒンジまたはリンカー領域により結合されてもよい。ヒンジ領域は、単一ポリペプチド分子における隣接する可変ドメインおよび/または定常ドメイン間の可動性または半可動性連鎖をもたらす、少なくとも2個(例えば、5、10、15、20、40、60個以上)のアミノ酸からなってもよい。さらに、抗原結合断片は、上記に列挙された可変領域および定常領域の構成のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体(またはその他の多量体)を、互いに非共有結合で、および/または一つ以上の単量体VHもしくはVLドメインとの非共有結合で(例えば、ジスルフィド結合により)、含んでいてもよい。
本明細書に提供される方法において有用な二特異性抗原結合分子は、ヒト抗体および/もしくは遺伝子組み換えヒト抗体、またはその断片を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する抗体を含む。しかしヒト抗体は、例えばCDRにおいて、および特定のCDR3において、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコード化されていないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的な突然変異誘導により導入された変異、またはインビボでの体細胞突然変異により導入された変異)を含んでもよい。しかしながら「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むようには意図されていない。
本明細書に提供される方法において有用な二特異性抗原結合分子は、組み換えヒト抗体またはその抗原結合断片を含んでもよく、またはそれからなるものであってもよい。「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段によって、調製される、発現される、生成される、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞(以下で詳述する)にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリ(以下で詳述する)から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体(例えば、Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295を参照されたい)、または他のDNA配列へヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含むあらゆるその他の手段によって調製される、発現される、生成される、または単離される抗体などを含むことが意図される。その様な遺伝子組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する。ある特定の実施形態では、しかしながら、その様な遺伝子組換えヒト抗体はインビトロでの突然変異誘発(または、ヒトIg配列にトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボでの体細胞の突然変異誘発)に供されるため、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列に由来し、関連する配列である一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー中には自然に存在し得ない。
二特異性抗体を作製する方法は当分野に公知であり、当該方法を使用して、本明細書に開示される二特異性抗原結合分子を構築してもよい。本開示に関して使用することのできる例示的な二特異性のフォーマットとしては、限定されないが例えば、scFvベースまたはダイアボディ二特異性のフォーマット(diabody bispecific format)、IgG-scFv融合体、二重可変ドメイン(DVD)-Ig、クアドローマ(Quadroma)、ノブ・イントゥ・ホール(knobs-into-holes)、共通軽鎖(例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など)、CrossMab、CrossFab、(SEED)ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ(Duobody)、IgG1/IgG2、二重作用Fab(DAF)-IgG、およびMab2二特異性フォーマット(前述のフォーマットのレビューに関しては、例えばKlein et al.2012、mAbs 4:6、1~11、および当該文献内に引用される参考文献を参照のこと)が挙げられる。
本明細書に提供されるMET X MET二特異性抗原結合分子に含まれ得る抗原結合ドメイン(D1およびD2)の例としては、本明細書に開示される抗MET抗体のいずれかに由来する抗原結合ドメインが挙げられる。例えば、表1に列挙されるHCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むHCVR、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含むHCVRを含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子が、本明細書に記載されるブドウ膜メラノーマの治療方法に有用である。
また、表1に列挙されるLCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むLCVR、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含むLCVRを含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子が、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表1に列挙されるLCVRアミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表1に列挙されるHCVRアミノ酸配列のいずれかを含むHCVRとLCVRとのアミノ酸配列ペア(HCVR/LCVR)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子が、本明細書に提供される方法により有用である。ある実施形態によれば、有用なMET X MET二特異性抗原結合分子は、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含むD1またはD2抗原結合ドメインを含む。
また、表1に列挙されるHCDR1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖CDR1(HCDR1)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表1に列挙されるHCDR2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖CDR2(HCDR2)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表1に列挙されるHCDR3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖CDR3(HCDR3)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表1に列挙されるLCDR1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖CDR1(LCDR1)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表1に列挙されるLCDR2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖CDR2(LCDR2)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表1に列挙されるLCDR3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれらアミノ酸配列に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖CDR3(LCDR3)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。
また、表1に列挙されるLCDR3アミノ酸配列のいずれかとペア形成される、表1に列挙されるHCDR3アミノ酸配列のいずれかを含むHCDR3とLCDR3とのアミノ酸配列ペア(HCDR3/LCDR3)を含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含むMET X MET二特異性抗原結合分子も、本明細書に提供される方法により有用である。ある実施形態によれば、本開示は、表1に列挙された例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
また、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかの中に含有される六個のCDR(すなわちHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)のセットを含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含む、MET X MET二特異性抗原結合分子も有用である。
また、表1に列挙される例示的な抗MET抗体のいずれかにより規定されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアの中に含有される六個のCDR(すなわちHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)のセットを含む、D1またはD2抗原結合ドメインを含む、MET X MET二特異性抗原結合分子も有用である。
本明細書に提供される方法において有用なMET x MET二特異性抗原結合分子は、表1の抗MET抗体のいずれかに由来するD1抗原結合ドメイン、および表1の任意の他の抗MET抗体に由来するD2抗原結合ドメインを含んでもよい。MET x MET二特異性抗体の非限定的な例を、図1に示す。図1は、272個の例示的なMET x MET二特異性抗体の構成要素を示すマトリクスである。マトリクスの番号付けされた各セル(1~272までの番号)は、“D1”抗原結合ドメインと“D2”抗原結合ドメインを含む固有の二特異性抗体を確認するものであり、この場合において当該D1抗原結合ドメインは、Y軸に沿って列記される対応する抗MET抗体の免疫グロブリン可変ドメイン(HCVR/LCVRアミノ酸配列ペア)またはCDRを含み、当該D2抗原結合ドメインは、X軸に沿って列記される対応する抗MET抗体の免疫グロブリン可変ドメイン(HCVR/LCVRアミノ酸配列)またはCDRを含む。したがって例えば、当該マトリクスに示されるMET x MET二特異性抗原結合分子の「番号10」は、例示的な抗MET抗体のH4H13290P2に由来するHCVR/LCVRペアまたは6-CDRセットを含むD1抗原結合ドメインと、例示的な抗MET抗体のH4H13321P2に由来するHCVR/LCVRペアまたは6-CDRセットを含むD2抗原結合ドメインとを含む。本明細書に提供されるMET x MET二特異性抗体の追加的な例を、本明細書の実施例4に記載する。
本明細書に提供される方法により有用なMET X MET二特異性抗原結合分子の例は、D1抗原結合ドメインとD2抗原結合ドメインとを含み、この場合において当該D1抗原結合ドメインは、配列番号58/138のHCVR/LCVRアミノ酸配列ペア、または配列番号60-62-64-140-142-144を含む重鎖および軽鎖のCDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)のセットを含み、およびこの場合において当該D2抗原結合ドメインは、配列番号82/138のHCVR/LCVRアミノ酸配列ペア、または配列番号 84-86-88-140-142-144を含む重鎖および軽鎖のCDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)のセットを含む。これらの配列の特徴を有する例示的なMET X MET二特異性抗体は、二特異性抗体の番号122とも呼称される、H4H14639Dと指定される二特異性抗体であり、H4H13306P2に由来するD1と、H4H13312P2に由来するD2とを含む(本明細書の実施例4および表5を参照のこと)。
さらなる非限定的な例示として、本明細書において有用なMET X MET二特異性抗原結合分子は、D1抗原結合ドメインとD2抗原結合ドメインとを含み、この場合において当該D1抗原結合ドメインは、配列番号18/138のHCVR/LCVRアミノ酸配列ペア、または配列番号20-22-24-140-142-144を含む重鎖および軽鎖のCDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)のセットを含み、およびこの場合において当該D2抗原結合ドメインは、配列番号82/138のHCVR/LCVRアミノ酸配列ペア、または配列番号 84-86-88-140-142-144を含む重鎖および軽鎖のCDR(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)のセットを含む。これらの配列の特徴を有する例示的なMET X MET二特異性抗体は、二特異性抗体の番号42とも呼称される、H4H14635Dと指定される二特異性抗体であり、H4H13295P2に由来するD1と、H4H13312P2に由来するD2とを含む(本明細書の実施例4および表5を参照のこと)。
多量体形成成分
本発明に提供される方法に従い有用な二特異性抗原結合分子は、ある実施形態において、一つ以上の多量体形成構成要素を含んでもよい。多量体形成構成要素は、抗原結合ドメイン(D1およびD2)間の会合を維持するように機能することができる。本明細書において使用される場合、「多量体形成構成要素」とは、同一のもしくは類似の構造または構成の第二の多量体形成構成要素と会合する能力を有する、任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成構成要素は、イムノグロブリンCH3ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成構成要素の非限定的な例として、イムノグロブリンのFc部分(例えば、以下のアイソタイプ、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、ならびに各アイソタイプ群における任意のアロタイプから選択されるアイソタイプのFcドメイン)が挙げられる。特定の実施形態において、多量体形成構成要素は、Fc断片であり、または少なくとも一つのシステイン残基を含有する1~約200のアミノ酸の長さのアミノ酸配列である。その他の実施形態において、多量体形成構成要素はシステイン残基であるか、または短システイン含有ペプチドである。その他の多量体形成ドメインとして、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・モチーフ、またはコイルドコイル・モチーフを含むか、もしくはこれらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
本発明に提供される方法に従い有用な二特異性抗原結合分子は、ある実施形態において、一つ以上の多量体形成構成要素を含んでもよい。多量体形成構成要素は、抗原結合ドメイン(D1およびD2)間の会合を維持するように機能することができる。本明細書において使用される場合、「多量体形成構成要素」とは、同一のもしくは類似の構造または構成の第二の多量体形成構成要素と会合する能力を有する、任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。例えば、多量体形成構成要素は、イムノグロブリンCH3ドメインを含むポリペプチドであってもよい。多量体形成構成要素の非限定的な例として、イムノグロブリンのFc部分(例えば、以下のアイソタイプ、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、ならびに各アイソタイプ群における任意のアロタイプから選択されるアイソタイプのFcドメイン)が挙げられる。特定の実施形態において、多量体形成構成要素は、Fc断片であり、または少なくとも一つのシステイン残基を含有する1~約200のアミノ酸の長さのアミノ酸配列である。その他の実施形態において、多量体形成構成要素はシステイン残基であるか、または短システイン含有ペプチドである。その他の多量体形成ドメインとして、ロイシンジッパー、ヘリックス・ループ・モチーフ、またはコイルドコイル・モチーフを含むか、もしくはこれらからなるペプチドまたはポリペプチドが挙げられる。
ある実施形態において、二特異性抗原結合分子は、二つの多量体形成ドメインのM1とM2を含み、この場合においてD1はM1に結合され、D2はM2に結合され、M1およびM2の会合は、一つの二特異性抗原結合分子において、D1とD2の互いの物理的連結を促進する。特定の実施形態において、M1およびM2は互いに同一である。例えば、M1は特定のアミノ酸配列を有するFcドメインであってもよく、M2はM1と同一のアミノ酸配列を有するFcドメインである。あるいは、M1およびM2は一つ以上のアミノ酸位置において互いに異なっていてもよい。例えば、M1は、第一のイムノグロブリン(Ig)CH3ドメインを含んでいてもよく、M2は第二のIg CH3ドメインを含んでもよく、この場合において当該第一および第二のIg CH3ドメインは少なくとも一つのアミノ酸が互いに異なっており、この場合において少なくとも一つのアミノ酸の差異は、同一のM1およびM2配列を有する参照構築物と比べて、プロテインAに対する標的化構築物の結合を減少させる。一実施形態において、M1のIg CH3ドメインはプロテインAと結合し、M2のIg CH3ドメインは、例えばH95R修飾(IMGTエクソンナンバリングによる;EUナンバリングではH435R)など、プロテインA結合を減少させるか、または消滅させる変異を含有する。M2のCH3はさらに、Y96F修飾(IMGTによる;Y436FはEUによる)を含んでいてもよい。M2のCH3にて見出され得るさらなる修飾として、以下を挙げることができる:D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、およびV82I(IMGTによる;IgG1 Fcドメインの場合においては、D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、およびV422IはEUによる);IgG2 Fcドメインの場合においては、N44S、K52N、およびV82I(IMGT;N384S、K392N、およびV422IはEUによる);ならびに、IgG4 Fcドメインの場合においては、Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、およびV82I(IMGTによる;Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、およびV422IはEUによる)。
本明細書に提供される方法に従い有用な二特異性抗原結合分子は、「単離」されていてもよい。本明細書において使用される場合、「単離された二特異性抗原結合分子」とは、その天然環境の少なくとも一つの構成要素から特定され、および分離され、および/または回収された二特異性抗原結合分子を意味する。例えば、生物体の少なくとも一つの構成要素から、または当該抗体が生成された組織もしくは細胞から分離された、または取り出された二特異性抗体は、本開示に目的に対し、「単離された二特異性抗体」である。単離された二特異性抗原結合分子には、組み換え細胞内での原位置での分子も含む。単離された二特異性抗原結合分子は、少なくとも一つの精製工程または単離工程を受けた分子である。ある実施形態によれば、単離された二特異性抗原結合分子は、他の細胞物質および/または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書に提供される方法に従い有用な二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン(D1および/またはD2)は、当該抗原結合タンパク質または抗原結合ドメインが誘導された対応する生殖細胞系列配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域ならびに/またはCDR領域において、一つ以上のアミノ酸の置換、挿入および/または欠失を含んでもよい。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認され得る。二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン(D1および/またはD2)は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来し、この場合において一つ以上のフレームワーク領域および/またはCDR領域内の一つ以上のアミノ酸は、当該抗体が由来する生殖細胞系列の配列の対応する残基に、または別のヒト生殖細胞系列の配列の対応する残基に、または対応する生殖細胞系列の残基の保存的アミノ酸置換に、変異を受けている(そのような配列変化を本明細書において集合的に「生殖細胞系列変異」と呼称する)。
当業者であれば、本明細書に開示される重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から開始して、一つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多くの二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン(D1および/またはD2)を容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、VHおよび/またはVLドメイン内のフレームワークおよび/またはCDR残基のすべてが、抗体が由来する元の生殖系列配列に存在する残基へと戻し変異する。他の実施形態では、ある残基のみ、例えばFR1の最初の8個のアミノ酸、もしくはFR4の最後の8個のアミノ酸の中に存在する変異残基のみ、またはCDR1、CDR2、もしくはCDR3の中に存在する変異残基のみが、元の生殖系列配列に戻し変異する。他の実施形態では、フレームワークおよび/またはCDR残基のうちの一つ以上が、異なる生殖系列配列(すなわち抗体が元々由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列)の対応する残基に変異する。
さらに本明細書において有用な二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン(D1および/またはD2)は、フレームワーク領域および/またはCDR領域の中に二つ以上の生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば特定の個々の残基は、特定の生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異され、一方で元の生殖細胞系列配列とは異なる特定の他の残基は維持され、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基へと変異される。取得された時点で、一つ以上の生殖細胞系列変異を含有する二特異性抗原結合分子、またはその抗原結合ドメイン(D1および/またはD2)は、一つ以上の所望の特性に関して容易に検証されることができる。所望の特性としては例えば結合特異性の改善、結合アフィニティの増加、アンタゴニスト性もしくはアゴニスト性の生物学的特性の改善または強化(場合によっては)、免疫原性の低下などが挙げられる。この一般的な様式で取得された二特異性抗原結合分子またはその抗原結合ドメイン(D1および/またはD2)は、本明細書で有用であることが予期される。
バリアント
また、本明細書に開示されるHCVR、LCVR、および/またはCDRのアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗MET抗体および二特異性抗原結合分子も本明細書において有用である。当該態様に含まれる例示的なバリアントとしては、一つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるHCVR、LCVR、及び/またはCDRアミノ酸配列のいずれかのバリアントが挙げられる。例えば本開示は、本明細書において表1に記載されるHCVRアミノ酸配列、LCVRアミノ酸配列、および/またはCDRアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、10個以下、8個以下、6個以下、または4個以下等の保存的アミノ酸置換を有するHCVRアミノ酸配列、LCVRアミノ酸配列、および/またはCDRアミノ酸配列を有する、抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子を含む。
また、本明細書に開示されるHCVR、LCVR、および/またはCDRのアミノ酸配列のいずれかのバリアントを含む抗MET抗体および二特異性抗原結合分子も本明細書において有用である。当該態様に含まれる例示的なバリアントとしては、一つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるHCVR、LCVR、及び/またはCDRアミノ酸配列のいずれかのバリアントが挙げられる。例えば本開示は、本明細書において表1に記載されるHCVRアミノ酸配列、LCVRアミノ酸配列、および/またはCDRアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、10個以下、8個以下、6個以下、または4個以下等の保存的アミノ酸置換を有するHCVRアミノ酸配列、LCVRアミノ酸配列、および/またはCDRアミノ酸配列を有する、抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子を含む。
例示的なバリアントとしては、本明細書に開示されるHCVR、LCVR、及び/またはCDRアミノ酸配列のいずれかとの実質的な配列同一性を有するバリアントが挙げられる。アミノ酸配列の場合において本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、二つのアミノ酸配列が、例えばデフォルトのギャップ重み付けを使用したプログラムのGAPまたはBESTFITなどによって最適に整列したとき、少なくとも95%、98%または99%の配列同一性を共有することを意味する。特定の実施形態では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なっている。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学特性(例えば、電荷または疎水性)を伴う側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基により置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能性特性を実質的に変化させない。二つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、配列同一性の百分率または相同性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に既知である。例えば、Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331(参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、(1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、(2)脂肪族-ヒドロキシル側鎖:セリンおよびトレオニン、(3)アミド含有側鎖:アスパラギンおよびグルタミン、(4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(5)塩基性側鎖:リジン、アルギニン、およびヒスチジン、(6)酸性側鎖:アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに(7)含硫側鎖はシステインおよびメチオニンである、が挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸およびアスパラギン-グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、Gonnet et al.(1992)Science 256:1443-1445に開示されるPAM250対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する任意の変化である。当該文献は参照により本明細書に援用される。「中程度に保存的な」置換は、PAM250対数尤度マトリクスにおいて、負ではない値を有する任意の変化である。
二つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。配列解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似性の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、GCGソフトウェアは、GAPおよびBESTFITなどのプログラムを含有しており、これらプログラムをデフォルトのパラメータで使用して、異なる生物種に由来する相同ポリペプチド、または野生型タンパク質とその変異体との間の相同ポリペプチドなどの非常に近縁なポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、GCGバージョン6.1を参照のこと。ポリペプチド配列は、GCG第6.1版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたFASTAを使用して比較することもできる。FASTA(例えば、FASTA2およびFASTA3)は、クエリと検索配列の間の最良重複の領域のアラインメントおよび配列同一性の百分率を提供する(Pearson(2000)、上記)。本明細書に提供される配列を、異なる生物体からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータープログラムのBLASTであり、特にデフォルトパラメータを使用したBLASTPまたはTBLASTNである。例えば、Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410、およびAltschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402を参照のこと。各文献は、本明細書において参照により援用される。
FCバリアントを含む抗MET抗体、およびMET X MET二特異性抗原結合分子
本明細書に提供される特定の実施形態によると、本明細書において有用な抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合タンパク質は、例えば中性pHと比較して酸性pHで、FcRn受容体への抗体結合を強化する、または減少させる一つ以上の変異を含むFcドメインを含む。例えば、そのようなバリアントには、FcドメインのCH2またはCH3領域に変異を含む抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合タンパク質が含まれ、この場合において当該変異は、酸性環境において(例えば、pHが約5.5~約6.0の範囲のエンドソームにおいて)FcRnに対するFcドメインのアフィニティを増加させる。そのような変異によって、動物に投与されたときの抗体の血清半減期が延長され得る。そのようなFc修飾の非限定的な例としては、例えば、250位(例えば、EまたはQ);250位および428位(例えば、LまたはF);252位(例えば、L/Y/F/WまたはT)、254位(例えば、SまたはT)、および256位(例えば、S/R/Q/E/DまたはT)の修飾、または428位および/または433位(例えば、H/L/R/S/P/QまたはK)および/もしくは434位(例えば、H/FまたはY)の修飾、または250位および/もしくは428位の修飾、または307位もしくは308位(例えば、308F、V308F)と434位の修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、428L(例えば、M428L)および434S(例えば、N434S)修飾、428L、259I(例えば、V259I)、および308F(例えば、V308F)修飾、433K(例えば、H433K)および434(例えば、434Y)修飾、252、254、および256(例えば、252Y、254T、および256E)修飾、250Qおよび428L修飾(例えば、T250QおよびM428L)、ならびに307および/または308修飾(例えば、308Fおよび/または308P)を含む。
本明細書に提供される特定の実施形態によると、本明細書において有用な抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合タンパク質は、例えば中性pHと比較して酸性pHで、FcRn受容体への抗体結合を強化する、または減少させる一つ以上の変異を含むFcドメインを含む。例えば、そのようなバリアントには、FcドメインのCH2またはCH3領域に変異を含む抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合タンパク質が含まれ、この場合において当該変異は、酸性環境において(例えば、pHが約5.5~約6.0の範囲のエンドソームにおいて)FcRnに対するFcドメインのアフィニティを増加させる。そのような変異によって、動物に投与されたときの抗体の血清半減期が延長され得る。そのようなFc修飾の非限定的な例としては、例えば、250位(例えば、EまたはQ);250位および428位(例えば、LまたはF);252位(例えば、L/Y/F/WまたはT)、254位(例えば、SまたはT)、および256位(例えば、S/R/Q/E/DまたはT)の修飾、または428位および/または433位(例えば、H/L/R/S/P/QまたはK)および/もしくは434位(例えば、H/FまたはY)の修飾、または250位および/もしくは428位の修飾、または307位もしくは308位(例えば、308F、V308F)と434位の修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、428L(例えば、M428L)および434S(例えば、N434S)修飾、428L、259I(例えば、V259I)、および308F(例えば、V308F)修飾、433K(例えば、H433K)および434(例えば、434Y)修飾、252、254、および256(例えば、252Y、254T、および256E)修飾、250Qおよび428L修飾(例えば、T250QおよびM428L)、ならびに307および/または308修飾(例えば、308Fおよび/または308P)を含む。
したがって、以下からなる群から選択される変異の一つ以上のペアまたは群を含むFcドメインを含む、抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合タンパク質が本明細書において有用である。250Qおよび248L(例えば、T250QおよびM248L);252Y、254Tおよび256E(例えば、M252Y、S254TおよびT256E);428Lおよび434S(例えば、M428LおよびN434S);ならびに433Kおよび434F(例えば、H433KおよびN434F)。前述のFcドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のあらゆる可能性のある組み合わせが、本開示の範囲内に予期される。
本明細書において有用な抗原結合分子の生物学的特徴
本明細書に提供される方法によれば、ブドウ膜メラノーマ細胞の増殖を阻害し、浸潤を阻害し、アポトーシスを引き起こし、および/または生存率を低下させる抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体および抗原結合断片を含むADCが有用である。
本明細書に提供される方法によれば、ブドウ膜メラノーマ細胞の増殖を阻害し、浸潤を阻害し、アポトーシスを引き起こし、および/または生存率を低下させる抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体および抗原結合断片を含むADCが有用である。
また本明細書に提供される方法によれば、ブドウ膜メラノーマ細胞の細胞サイクルに影響を及ぼす抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体およびその抗原結合断片を含むADCも有用である。一部の態様では、細胞は有糸分裂停止を受ける。一部の態様では、細胞はSubG1期に留まり、これは細胞がアポトーシスを受けていることを示す。
また本明細書に提供される方法によれば、ブドウ膜メラノーマ細胞にアポトーシスを引き起こす抗体およびその抗原結合断片、ならびに当該抗体およびその抗原結合断片を含むADCも有用である。一部の態様では、ブドウ膜メラノーマ細胞は、PARP切断を示す。一部の態様では、ブドウ膜メラノーマ細胞は、ヒストンH3のリン酸化を示す。
また本明細書に提供される方法によれば、高アフィニティで単量体ヒトMETに結合する抗体およびその抗原結合断片も有用である。例えば本発明は、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用するなど、25℃または37℃での表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約230nM未満のKDで、単量体型ヒトMET(例えば、hMET.mmh)に結合する抗MET抗体を含む。ある実施形態によると、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約230nM未満、約200nM未満、約150nM未満、約100nM未満、約50nM未満、約25nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約8nM未満、約6nM未満、約5nM未満、約4 nM未満、または約3nM未満のKDで、37℃で単量体ヒトMETに結合する抗MET抗体が提供される。
そのような抗体およびその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、25℃または37℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約1分を超える解離半減期(t1/2)で単量体ヒトMET(例えば、hMET.mmh)に結合する。そのような抗MET抗体は、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約1分を超える、約2分を超える、約4分を超える、約6分を超える、約8分を超える、約10分を超える、約12分を超える、約14分を超える、約16分を超える、約18分を超える、または約20分以上のt1/2で、37℃で単量体ヒトMETに結合する。
そのような抗体およびその抗原結合断片は、高いアフィニティで二量体ヒトMET(例えば、hMET.mFc)に結合する。例えば抗MET抗体は、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、25℃または37℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約3nM未満のKDで二量体ヒトMETに結合する。ある実施形態によると、抗MET抗体は、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約3nM未満、約2nM未満、約1nM未満、約0.9nM未満、約0.8nM未満、約0.7nM未満、約0.6nM未満、約0.5nM未満、約0.4nM未満、約0.3nM未満、または約0.25nM未満のKDで、37℃で二量体ヒトMETに結合する。
そのような抗体およびその抗原結合断片は、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、25℃または37℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約4分を超える解離半減期(t1/2)で二量体ヒトMET(例えば、hMET.mFc)に結合してもよい。ある実施形態によると、抗MET抗体は、例えば本明細書の実施例3に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約4分を超える、約5分を超える、約10分を超える、約20分を超える、約30分を超える、約40分を超える、約50分を超える、約60分を超える、約70分を超える、約80分を超える、約90分を超える、約100分を超える、または約105分以上のt1/2で、37℃で二量体ヒトMETに結合してもよい。
本明細書に提供される方法によると、例えば本明細書の実施例5に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似したアッセイを使用するなど、25℃または37℃の表面プラズモン共鳴により測定されたときに、約10分を超える解離半減期(t1/2)で二量体ヒトMET(例えば、hMET.mFc)に結合するMET X MET二特異性抗原結合タンパク質も有用である。ある実施形態によると、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質は、例えば本明細書の実施例5に規定されるアッセイフォーマットまたは非常に類似したアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定したときに、約10分を超える、約20分を超える、約30分を超える、約40分を超える、約50分を超える、約60分を超える、約70分を超える、約80分を超える、約90分を超える、約100分を超える、約200分を超える、約300分を超える、約400分を超える、約500分を超える、約600分を超える、約700分を超える、約800分を超える、約900分を超える、約1000分を超える、または約1100分以上のt1/2で、37℃で二量体ヒトMETに結合する。
または本明細書に提供される方法によると、抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合タンパク質は、例えばインビトロのリガンド結合アッセイにおいて、HGFとMETの間の相互作用を遮断する。本明細書に提供されるある実施形態によると、MET x MET二特異性抗原結合タンパク質は、ヒトMETを発現する細胞へのHGF結合を遮断し、HGFシグナル伝達の非存在下で、MET活性化を最小限に誘導し、または全く誘導しない。例えば、MET x MET二特異性抗原結合タンパク質は、細胞系MET活性レポーターアッセイにおいて、D1またはD2を単独で含有する一特異性抗体を使用した同等の活性レポーターアッセイにおいて観察されるMETアゴニスト活性の50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、3%未満、2%未満、または1%未満のMETアゴニスト活性の程度を呈する。
本開示に従い有用な抗体および抗原結合タンパク質は、前述の生物学的特徴のうちの一つ以上、またはその任意の組み合わせを保有してもよい。抗体の生物学的特徴の前述のリストは、包括的であることは意図されない。本明細書に提供される抗体のその他の生物学的特徴は、本明細書の実施例を含む本開示の検討から当業者に明らかであろう。
抗体-薬剤結合体(ADC)
本明細書に提供される方法によれば、例えば細胞障害剤、化学療法薬、または放射性同位体などの治療部分と結合された抗MET抗体、またはMET×MET二特異性抗原結合タンパク質を含む抗体-薬剤結合体(ADC)が有用である。
本明細書に提供される方法によれば、例えば細胞障害剤、化学療法薬、または放射性同位体などの治療部分と結合された抗MET抗体、またはMET×MET二特異性抗原結合タンパク質を含む抗体-薬剤結合体(ADC)が有用である。
細胞傷害剤としては、細胞の成長、生存率、または増殖に対して有害な任意の剤が挙げられ、限定ではないが、チューブリン相互作用剤およびDNA損傷剤が挙げられる。本開示の当該態様に従い抗MET抗体に結合され得る適切な細胞障害剤および化学療法剤の例としては、例えば、1-(2クロロエチル)-1,2-ジメタンスルホニルヒドラジド、1,8-ジヒドロキシ-ビシクロ[7.3.1]トリデカ-4,9-ジエン-2,6-ジイン-13-オン、1-デヒドロテストステロン、5-フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、9-アミノカンプトテシン、アクチノマイシンD、アマニチン、アミノプテリン、アングイジン、アントラサイクリン、アントラマイシン(AMC)、オーリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カリケアミシン(例えば、カリケアミシンγ1)、カンプトテシン、カルミノマイシン、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルヒチン、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンB、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオンン、ジソラゾール、ドラスタチン(例えば、ドラスタチン10)、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エキノマイシン、エリュテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチジウムブロマイド、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンD、グルココルチコイド、イリノテカン、キネシンスピンドルタンパク質(KSP)阻害剤、レプトマイシン、ロイロシン、リドカイン、ロムスチン(CCNU)、メイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトプテリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、N8-アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン(PBDs)、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タリソマイシン(tallysomycins)、タキソール、テノポシド、テトラカイン、チオエパクロラムブシル、トマイマイシン、トポテカン、チューブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびそれらのいずれかの誘導体が挙げられる。ある実施形態によると、抗MET抗体に結合される細胞障害剤は、例えばDM1またはDM4などのメイタンシノイド、トマイマイシン誘導体、またはドラスタチン誘導体である。ある実施形態によると、抗MET抗体に結合される細胞障害剤は、例えばMMAE、MMAF、またはその誘導体などのオーリスタチンである。当分野に公知の他の細胞障害剤も本開示の範囲内にあることが予期され、例えばリシン、C.ディフィシル毒素、シュードモナス外毒素、リシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ブリオジン(bryodin)、サポニン、ヤマゴボウ毒素(すなわち、フィトラッカトキシンおよびフィトラッキゲニン)などのタンパク質毒素、および例えばSapra et al.,Pharmacol.& Therapeutics,2013,138:452-469に記載されるものなどの他の毒素が挙げられる。
ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイド、例えばメイタンシンの誘導体である。好適なメイタンシノイドとしては、DM1、DM4、またはその誘導体、立体異性体、もしくはアイソトポログが挙げられる。好適なメイタンシノイドとしてはさらに限定されないが、WO2014/145090A1、WO2015/031396A1、US2016/0375147A1、およびUS2017/0209591A1に開示されるものが挙げられる。当該文献はその全体で参照により本明細書に援用される。
また、本明細書に提供される方法によると、一つ以上の放射性核種に結合された抗MET抗体を含む抗体-放射性核種結合体(ARC)も有用である。本開示の態様の場合において使用され得る放射性核種の例としては限定されないが、例えば、225Ac、212Bi、213Bi、131I、186Re、227Th、222Rn、223Ra、224Ra、および90Yが挙げられる。
ある実施形態では、ADCは、リンカー分子を介して細胞障害剤(例えば上記に開示される細胞障害剤のいずれか)と結合された抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合タンパク質を含む。リンカーは、本明細書に記載される抗体または抗原結合タンパク質を、例えば細胞障害剤などの治療部分と連結、接続、または結合させる任意の群または部分である。好適なリンカーは、例えば、Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins;Phillips,G.L.,Ed.;Springer Verlag:New York,2013;Antibody-Drug Conjugates;Ducry,L.,Ed.;Humana Press,2013;Antibody-Drug Conjugates;Wang,J.,Shen,W.-C.,and Zaro,J.L.,Eds.;Springer International Publishing,2015に見出される。これら文献の内容は、参照によりその全体で本明細書に援用される。概して、本明細書に記載の抗体結合体に適した結合手段のリンカーは、抗体の循環半減期を活用するのに充分に安定的であると同時に、当該結合体の抗原介在性の内在化の後に搭載物を放出することができるリンカーである。リンカーは、切断可能であっても、切断不可能であってもよい。切断可能なリンカーとしては、内在化後に例えば加水分解、還元または酵素反応を介した切断などの細胞内代謝により切断されるリンカーが挙げられる。切断不可能なリンカーとしては、内在化後の抗体のリソソーム分解を介して、付加された搭載物を放出するリンカーが挙げられる。好適なリンカーとしては限定されないが、酸不安定性リンカー、加水分解不安定性リンカー、酵素切断可能なリンカー、還元不安定性リンカー、自己犠牲(self-immolative)リンカー、および切断不可能なリンカーが挙げられる。適切なリンカーとしてはさらに限定されないが、ペプチド、グルクロニド、スクシンイミド-チオエーテル、ポリエチレングリコール(PEG)単位、ヒドラゾン、マル-カプロイル(mal-caproyl)単位、ジペプチド単位、バリン-シトルリン単位、およびパラ-アミノベンジル(PAB)単位であるか、またはそれらを含むリンカーが挙げられる。
当分野で公知の任意のリンカー分子またはリンカー技術を使用して、本開示により有用なADCを作製または構築することができる。ある実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。他の実施形態によれば、リンカーは切断不可能なリンカーである。本開示の状況下で使用され得る例示的なリンカーとしては、例えば、MC(6-マレイミドカプロイル)、MP(マレイミドプロパノイル)、val-cit(バリン-シトルリン)、val-ala(バリン-アラニン)、プロテアーゼ切断リンカー中のジペプチド部位、ala-phe(アラニン-フェニルアラニン)、プロテアーゼ切断リンカー中のジペプチド部位、PAB(p-アミノベンジルオキシカルボニル)、SPP(N-スクシンイミジル4-(2-ピリジルチオ)ペンタン酸塩)、SMCC(N-スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1 カルボン酸塩)、SIAB(N-スクシンイミジル(4-ヨード-アセチル)アミノ安息香酸塩)、ならびにそれらのバリアントおよび組み合わせを含む、またはそれらからなるリンカーが挙げられる。本開示の状況下で使用され得る追加の例示的リンカーは、例えば、US7,754,681、およびDucry,Bioconjugate Chem.,2010,21:5-13、ならびにそれらに引用される参照文献中に提示されるものであり、それら文献の内容は、その全体で参照により本明細書に援用される。
ある実施形態では、リンカーは、生理学的条件下で安定である。ある実施形態では、リンカーは切断可能であり、例えば、酵素の存在下、または特定のpH範囲もしくはpH値で、少なくとも搭載物部分を放出することができる。一部の実施形態では、リンカーは、酵素切断可能な部分を含む。例示的な酵素切断可能な部分としては限定されないが、ペプチド結合、エステル結合、ヒドラゾン、およびジスルフィド結合が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、カテプシン切断可能なリンカーを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、切断不可能な部分を含む。
好適なリンカーとしてはさらに限定されないが、例えば抗体など一つの結合物質の二つのシステイン残基に化学的に結合されるリンカーが挙げられる。そのようなリンカーは、結合プロセスの結果として破壊される抗体のジスルフィド結合を模倣する役目を果たすことができる。
一部の実施形態では、リンカーは、一つ以上のアミノ酸を含む。好適なアミノ酸として、天然、非天然、標準、非標準、タンパク質を構成する、タンパク質を構成しない、およびL-またはD-α-アミノ酸が挙げられる。一部の実施形態では、リンカーは、アラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、もしくはシトルリン、その誘導体、またはそれらの組み合わせを含む。ある実施形態では、一つ以上のアミノ酸側鎖が、以下に記載される側鎖群に連結される。一部の実施形態では、リンカーは、バリンおよびシトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リシン、バリン、およびシトルリンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、リシン、バリン、およびアラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、バリンおよびアラニンを含む。
一部の実施形態では、リンカーは、自己犠牲基を含む。自己犠牲基は、当業者に公知の任意のそのような基であり得る。特定の実施形態では、自己犠牲基は、p-アミノベンジル(PAB)、またはその誘導体である。有用な誘導体としては、p-アミノベンジルオキシカルボニル(PABC)が挙げられる。当業者であれば、自己犠牲基が、搭載物からリンカーの残存原子を放出する化学反応を実行する能力を有することを認識するであろう。
一部の実施形態では、リンカーは、以下である:
式中、
は、抗体または抗原結合タンパク質への(例えばリシン残基を介した)結合であり、
は、細胞障害剤(例えば、DM1)への結合である。一部の実施形態では、リンカーは、以下である:
式中、
は、抗体または抗原結合タンパク質への(例えばリシン残基を介した)結合であり、
は、細胞障害剤(例えば、DM1)への結合である。ある実施形態では、リンカーは、以下である。
本開示の方法により有用な分子は、ADCを含み、ADCにおいて、リンカーが抗MET抗体またはMET×MET二特異性抗原結合タンパク質を、当該抗体または抗原結合分子内の特定のアミノ酸での付加を介して薬剤またはサイトトキシンへと接続させる。当該態様の状況下で使用され得るアミノ酸付加の例は、例えば、リシン(例えば、US5,208,020;US2010/0129314;Hollander et al.,Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361;WO2005/089808;US5,714,586;US2013/0101546;およびUS2012/0585592を参照のこと)、システイン(例えば、US2007/0258987;WO2013/055993;WO2013/055990;WO2013/053873;WO2013/053872;WO2011/130598;US2013/0101546;およびUS7,750,116を参照のこと)、セレノシステイン(例えば、WO2008/122039;およびHofer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456を参照のこと)、ホルミルグリシン(例えば、Carrico et al.,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322;Agarwal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51、およびRabuka et al.,Nat.Protocols,2012,10:1052-1067を参照のこと)、非天然アミノ酸(例えば、WO 2013/068874およびWO 2012/166559を参照のこと)、および酸性アミノ酸(例えば、WO2012/05982を参照のこと)である。またリンカーは、炭水化物(例えば、US2008/0305497、WO 2014/065661、およびRyan et al.,Food & Agriculture Immunol.,2001,13:127-130を参照のこと)およびジスルフィドリンカー(例えば、WO 2013/085925、WO 2010/010324、WO 2011/018611、およびShaunak et al.,Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313を参照のこと)への付加を介して抗原結合タンパク質に結合されてもよい。部位特異的な結合技術を採用して、抗体または抗原結合タンパク質の特定の残基へ直接結合させてもよい(例えば、Schumacher et al.J Clin Immunol(2016)36(Suppl 1):100を参照のこと)。部位特異的な結合技術としては限定されないが、トランスグルタミナーゼを介したグルタミン結合が挙げられる(例えば、Schibli,Angew Chemie Inter Ed.2010,49,9995を参照のこと)。
ある実施形態によると、本明細書に提供される方法により有用なADCは、国際特許出願公開WO2014/145090に記載されるリンカー-薬剤組成物へ結合された抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合タンパク質を含む(例えば、「化合物7」は、本明細書において「M0026」とも呼称され、以下に記載される)。当該文献は、その全体で参照により本明細書に援用される。
本明細書に提供される方法により、一特異性の抗MET抗体、およびMET x MET二特異性抗体を含む抗体-薬剤結合体も有用であり、ここで当該抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗体は、細胞障害剤に結合される。ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドである。ある実施形態では、メイタンシノイドは、以下の式を有する化合物である:
式中、nは1~12の整数であり、R1はアルキルである。ある実施形態では、メイタンシノイドは、以下である:
。
ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドであり、当該メイタンシノイドは、切断不可能なリンカーを介して抗体に共有結合される。ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドであり、当該メイタンシノイドは、切断可能なリンカーを介して抗体に共有結合される。
ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドであり、当該メイタンシノイドは、切断不可能なリンカーを介して抗体に共有結合される。ある実施形態では、細胞障害剤は、メイタンシノイドであり、当該メイタンシノイドは、切断可能なリンカーを介して抗体に共有結合される。
一つの実施形態では、抗体は、以下の構造を有する化合物のジアステレオマーに結合される:
当該ジアステレオマーは、(300MHz,CDCl3)δ6.85(d,1H,J=4Hz),6.72(m,1H),6.65(d,1H,J=4Hz),6.44(dd,1H,J=15Hz,11Hz),6.25(s,1H),5.67(dd,1H,J=16Hz,9Hz),5.41(m,1H),4.79(d,1H,J=11Hz),4.30(t,1H,J=11Hz),3.72(m,2H),3.51(d,1H,J=9Hz),3.37(m,4H),3.27(m,1H),3.23(s,3H),3.16 -2.99(m,4H),2.85(m,7H),2.62(m,3H),2.39(ddd,1H,J=19Hz,12Hz,4Hz),2.18(br m,2H),1.77(br m,3H),1.66(s,3H),1.60-1.47(m,4H),1.31(m,6H),1.05(m,2H)、および0.82(s,3H)のデルタシフトにより特徴付けられる1H NMRを特徴とする。
一つの実施形態では、抗体は、以下の構造を有する化合物に結合される:
(I);
以下を接触させる工程を含むプロセスにより調製される:
(i)式IIIの化合物:
III;
(ii)式IVの化合物:
IV
(iii)シリカゲル、および
(iv)有機溶媒と水を含む希釈剤。
以下を接触させる工程を含むプロセスにより調製される:
(i)式IIIの化合物:
(ii)式IVの化合物:
(iii)シリカゲル、および
(iv)有機溶媒と水を含む希釈剤。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、本明細書に記載される抗MET抗体、またはMET x MET二特異性抗原結合タンパク質であり、
Lは、リンカーであり、
Payは、細胞障害剤であり、
nは、1~10の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、本明細書に記載される抗MET抗体、またはMET x MET二特異性抗原結合タンパク質であり、
Lは、リンカーであり、
Payは、細胞障害剤であり、
nは、1~10の整数である。
一部の実施形態では、Abは、配列番号82/138のHCVR/LCVRアミノ酸配列ペア内のCDRを含む抗MET抗体である。一部の実施形態では、Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
一部の実施形態では、Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列内のCDR、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列内のCDRを含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号138のLCVRアミノ酸配列内のCDRを含む。一部の実施形態では、Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列内のCDR、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列内のCDRを含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。一部の態様では、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質はさらに、配列番号138のLCVRアミノ酸配列内のCDRを含む。一部の実施形態では、Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
一部の実施形態では、Lは、切断可能なリンカーである。一部の実施形態では、Lは、切断不可能なリンカーである。一部の実施形態では、Lは、ジペプチドを含む。一部の実施形態では、Lは、PAB部分を含む。
一部の実施形態では、Payは、メイタンシノイドである。
一部の実施形態では、nは、2~5の整数である。
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗体への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗体への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗体への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗体への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号82のHCVRアミノ酸配列と、配列番号138のLCVRアミノ酸配列を含む抗MET抗体である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
一部の実施形態では、結合体は、以下の構造を有する:
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
式中、
は、抗原結合タンパク質への結合であり、nは、2~5の整数である。
Ab-[L-Pay]n
式中:
Abは、配列番号18のD1-HCVRアミノ酸配列、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列を含む、MET X MET二特異性抗原結合タンパク質である。
L-Payは、以下である:
本明細書に有用な抗体薬剤結合体は、当分野の当業者に公知の結合条件を使用して調製することができる(例えば、Doronina et al.Nature Biotechnology 2003,21,7,778を参照のこと。当該文献はその全体で参照により本明細書に援用される)。一部の実施形態では、抗MET抗体、またはMET X MET二特異性抗原結合タンパク質の抗体薬剤結合体は、本明細書に記載される抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合タンパク質を、所望のリンカーおよび細胞障害剤を含む化合物と接触させることにより調製され、この場合において当該リンカーは、例えば当該抗体または抗原結合タンパク質の所望の残基で、当該抗体または抗原結合タンパク質と反応性である部分を保有する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法により有用な抗体薬剤結合体の調製のためのプロセスは、本明細書に記載される抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合タンパク質を、以下の式A1を有する化合物、および水性希釈剤を接触させることを含む:
A1
一部の実施形態では、式A1の化合物は、化学量論上、過剰に存在する。一部の実施形態では、式A1の化合物は、化学量論上、5~6倍過剰に存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤は、HEPESを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤は、DMAを含む。
一部の実施形態では、式A2またはA3の化合物は、立体的に純粋である。一部の実施形態では、式A1の化合物は、式A2またはA3の化合物を含み、この場合においてA2またはA3の化合物は、50%を超えるジアステレオマー過剰の状態で存在する。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、70%を超える。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、90%を超える。ある実施形態では、ジアステレオマーの過剰は、95%を超える。
「ジアステレオマーの過剰」という用語は、組成物中の残りのジアステレオマーと比較した、所望の単一ジアステレオマーのモル割合間の差異を指す。ジアステレオマーの過剰は、以下のように計算される:(単一ジアステレオマーの量)-(他のジアステレオマーの量)/1。例えば、90%の1、および10%の2、3、4またはそれらの混合物を含有する組成物は、80%のジアステレオマーの過剰を有する[(90-10)/1]。95%の1、および5%の2、3、4またはそれらの混合物を含有する組成物は、90%のジアステレオマーの過剰を有する[(95-5)/1]。99%の1、および1%の2、3、4またはそれらの混合物を含有する組成物は、98%のジアステレオマーの過剰を有する[(99-1)/1]。ジアステレオマーの過剰は、1、2、3、または4のうちのいずれか一つについて同様に計算することができる。
一部の実施形態では、式A1の化合物は、以下の式(a)の化合物:
(a)
を、以下の式(b)の化合物:
(b)
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させることにより調製される。一部の実施形態では、希釈剤は、有機溶媒と水を含有する。
を、以下の式(b)の化合物:
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させることにより調製される。一部の実施形態では、希釈剤は、有機溶媒と水を含有する。
また本明細書において、以下のプロセスによって調製される生成物が提供される:
(i)式(a)の化合物:
(a)
を、以下の式(b)の化合物:
(b)
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させ、中間体を合成させること、および
(ii)本明細書に記載される抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合タンパク質を、当該中間体、および水性希釈剤と接触させること。
(i)式(a)の化合物:
を、以下の式(b)の化合物:
と、シリカゲルおよび希釈剤の存在下で接触させ、中間体を合成させること、および
(ii)本明細書に記載される抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合タンパク質を、当該中間体、および水性希釈剤と接触させること。
一部の実施形態では、本明細書において、本明細書に記載される抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合タンパク質を、以下の式Bを有する化合物、および水性希釈剤と接触させることを含む、抗体-薬剤結合剤を調製するプロセスが提供される:
B
式中、LGは、脱離基である。
式中、LGは、脱離基である。
一部の実施形態では、式Bの化合物は、化学量論上、過剰に存在する。一部の実施形態では、式Bの化合物は、化学量論上、5~6倍過剰に存在する。一部の実施形態では、水性希釈剤は、HEPESを含む。一部の実施形態では、水性希釈剤は、DMAを含む。一部の実施形態では、-C(O)-LGは、例えばNHSまたはトリフルオロフェニルエステルなどのエステルである。
一部の実施形態では、式B1の化合物は、以下の式Cの化合物:
C
と、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ペプチドカップリング試薬、および有機希釈剤を接触させることにより調製される。好適なペプチドカップリング試薬としては、カルボン酸部分を活性化させる、すなわち反応性を与えて、求核試薬と反応させる試薬が挙げられる。ある実施形態では、ペプチドカップリング試薬は、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)である。一部の実施形態では、有機溶媒は、ジクロロメタンである。
と、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ペプチドカップリング試薬、および有機希釈剤を接触させることにより調製される。好適なペプチドカップリング試薬としては、カルボン酸部分を活性化させる、すなわち反応性を与えて、求核試薬と反応させる試薬が挙げられる。ある実施形態では、ペプチドカップリング試薬は、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)である。一部の実施形態では、有機溶媒は、ジクロロメタンである。
一部の実施形態では、式Cの化合物は、以下の式Dの化合物:
D
と、アジピン酸、ペプチドカップリング剤、および有機溶媒を接触させることにより調製される。ある実施形態では、ペプチドカップリング剤は、2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)である。ある実施形態では、有機溶媒は、ジクロロメタンを含む。化合物Dは、WO2014/145090に記載されるように調製することができる。
と、アジピン酸、ペプチドカップリング剤、および有機溶媒を接触させることにより調製される。ある実施形態では、ペプチドカップリング剤は、2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)である。ある実施形態では、有機溶媒は、ジクロロメタンを含む。化合物Dは、WO2014/145090に記載されるように調製することができる。
エピトープマッピングおよびその関連技術
抗体または抗原結合ドメインが結合するエピトープは、METタンパク質の3個以上(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個以上)のアミノ酸の単一連続配列からなる場合もある。あるいはその関連エピトープは、METの複数の非連続的アミノ酸(またはアミノ酸配列)からなる場合もある。一部の実施形態では、エピトープは、METのリガンド結合ドメイン上に位置し、またはその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、METのリガンド結合ドメインの外側に位置し、例えば抗体が当該エピトープに結合したときに、METへのHGF結合に干渉しないMET表面上の位置にある。
抗体または抗原結合ドメインが結合するエピトープは、METタンパク質の3個以上(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個以上)のアミノ酸の単一連続配列からなる場合もある。あるいはその関連エピトープは、METの複数の非連続的アミノ酸(またはアミノ酸配列)からなる場合もある。一部の実施形態では、エピトープは、METのリガンド結合ドメイン上に位置し、またはその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、METのリガンド結合ドメインの外側に位置し、例えば抗体が当該エピトープに結合したときに、METへのHGF結合に干渉しないMET表面上の位置にある。
本明細書において別段に記載されるように、MET x MET二特異性抗原結合分子の個々の抗原結合ドメイン(D1およびD2)は互いに対して、別個の、または重複しない、または部分的に重複するエピトープに結合する場合がある。本明細書において使用される場合、「部分的に重複するエピトープ」とは、当分野で公知の任意のエピトープマッピング方法(例えば、X線結晶法、アラニンスキャン突然変異誘導法、水素/重水素交換法[HDX]、ドメインスワッピング法など)により決定された場合、第一のエピトープと第二のエピトープが、5未満、4未満、3未満、またはたった一つの共通アミノ酸を共有することを意味する。D1ドメインおよびD2ドメインは、互いに非競合的であってもよい。例えばある実施形態では、特定のMET x MET二特異性抗原結合分子のD1ドメインの、MET上のそのエピトープへの結合は、当該MET x MET二特異性抗原結合分子のD2ドメインの、MET上のそのエピトープへの結合を阻害しない(または最小限にのみ阻害する)。D1構成要素とD2構成要素の各エピトープが、非重複(または最大でも部分的重複)であることによって、MET X MET二特異性抗原結合分子は、細胞表面上の一つのMET分子に結合することができる。
当業者に公知の様々な技術を使用して、本明細書に有用な抗体および抗原結合ドメインが相互作用するMET上のエピトープを決定することができる。特定の抗体または抗原結合ドメインのエピトープまたは結合ドメインを決定するために使用できる例示的な技術には、例えば、点変異突然誘導法(例えば、アラニンスキャニング突然変異誘導法、アルギニンスキャニング突然変異誘導法など)、ペプチドブロット分析(Reineke、2004、Methods Mol Biol 248:443~463)、プロテアーゼ保護、およびペプチド切断分析が挙げられる。さらに、抗原のエピトープ切り出し、エピトープ抽出、および化学修飾などの方法を用いることができる(Tomer,2000,Protein Science 9:487-496)。抗体と相互作用するポリペプチド内のアミノ酸の特定に使用され得るもう一つの方法は、質量分析法により検出される水素/重水素交換法である。総称的な用語として、水素/重水素交換法は、対象タンパク質を重水素標識すること、次いで抗体を当該重水素標識タンパク質に結合させることを含む。次にタンパク質/抗体複合体を水に移し、抗体により保護された残基(重水素標識の状態を維持する)を除くすべての残基で水素-重水素交換を発生させる。抗体を解離させた後、標的タンパク質にプロテアーゼ切断と質量分析を行い、それにより重水素標識残基が明らかとなり、当該重水素標識残基が抗体が相互作用する特定のアミノ酸に相当する。例えば、Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259;Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265Aを参照のこと。X線結晶構造解析を使用して、抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定することもできる。
本明細書に提供される方法により、本明細書に記載される特定の例示的な抗体または抗原結合ドメイン(例えば、本明細書の表1に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体)のいずれかと同じエピトープに結合する抗MET抗体(二特異性抗体を含む)が有用である。同様に本明細書において、本明細書に記載される特定の例示的な抗体(例えば、本明細書の表1に記載されるアミノ酸配列のいずれかを含む抗体)のいずれかと、METへの結合に関して競合する抗MET抗体も提供される。一部の実施形態では、抗MET抗体が結合するヒトMETエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204、アミノ酸305~315、および/またはアミノ酸421~455を含む。一部の実施形態では、ヒトMETの第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含み、ヒトMETの第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む。
当分野に公知であり、本明細書において例証される日常的な方法を使用することにより、抗体が、参照抗MET抗体と同じエピトープに結合するか、または参照抗MET抗体と結合に関して競合するかを容易に決定することができる。例えば被験抗体が、本発明に提供される参照抗MET抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体を、METタンパク質に結合させる。次に、MET分子に結合する被験抗体の能力が評価される。参照抗MET抗体との飽和結合後に被験抗体がMETに結合することができた場合、当該被験抗体は参照抗MET抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、参照抗MET抗体との飽和結合後に被験抗体がMET分子に結合できない場合、当該被験抗体は、参照抗MET抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。追加の日常的な実験(例えば、ペプチド突然変異および結合分析)を実施して、観察された被験抗体の結合の欠落が実際に、参照抗体と同じエピトープに結合することが原因であるのか、または立体遮断(または別の現象)が、観察された結合の欠落の原因であるのかを確認することができる。この種の実験は、ELISA、RIA、Biacore、フローサイトメトリー、または当分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的な抗原結合アッセイを使用して実施することができる。ある実施形態によると、競合結合アッセイにおいて測定したとき、例えば1倍、5倍、10倍、20倍、または100倍余剰のある抗体が、他の抗体の結合を少なくとも50%、しかし好ましくは75%、90%、またはさらには99%まで阻害する場合、二つの抗体は同じ(または重複する)エピトープに結合する(例えば、Junghans et al.,Cancer Res.1990:50:1495-1502を参照のこと)。別の方法として、一個の抗体の結合を減少または除去する抗原中の本質的に全てのアミノ酸突然変異が、他方の抗体の結合を減少または除去する場合、二個の抗体は同一エピトープに結合するとみなされる。一個の抗体の結合を減少または消去するアミノ酸変異のサブセットのみが、他の抗体の結合を減少または消去する場合、二個の抗体は「重複エピトープ」を有すると見なされる。
抗体が、参照抗MET抗体と結合に関して競合する(または結合に関して交差競合する)かどうかを決定するために、以下の二つの方向性で上述の結合技法が実施される:第一の方向性では、参照抗体は、飽和条件下でMET分子に結合され、その後、MET分子への被験抗体の結合が評価される。第二の方向性では、被験抗体が、飽和条件下でMET分子に結合され、その後、MET分子への参照抗体の結合が評価される。両方の方向性で、第一の(飽和)抗体のみがMET分子に結合することができた場合、被験抗体と参照抗体は、METへの結合に関して競合すると結論付けられる。当分野の当業者によって理解されるように、参照抗体への結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同じエピトープに結合しなくてよく、重複したエピトープまたは隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断する場合もある。
ヒト抗体の調製
本明細書に提供される方法により有用な抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗体は、完全ヒト抗体であってもよい。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の作製方法は、当分野に公知である。ヒトMETに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の状況下で任意のそうした公知の方法が使用され得る。
本明細書に提供される方法により有用な抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗体は、完全ヒト抗体であってもよい。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体の作製方法は、当分野に公知である。ヒトMETに特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本開示の状況下で任意のそうした公知の方法が使用され得る。
例えばVELOCIMMUNE(商標)法、または任意の他の類似した公知の方法を使用して完全ヒトモノクローナル抗体を作製するために、ヒト可変領域とマウス定常領域を有する、ヒトMETに対する高アフィニティキメラ抗体が最初に単離される。以下の実験セクションと同様に、抗体を、アフィニティ、リガンド遮断活性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付け、選択する。必要であれば、マウス定常領域と、所望のヒト定常領域、例えば野生型もしくは改変型のIgG1またはIgG4を置換して、完全ヒト抗MET抗体が作製される。選択された定常領域は、特定の用途に応じて変化する場合がある一方で、高アフィニティの抗原結合性および標的特異性の特徴は、可変領域中に存在する。ある例において、完全ヒト抗MET抗体は、抗原陽性B細胞から直接単離される。
生物学的均等物
本明細書に提供される方法により有用な抗MET抗体および抗体断片は、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるが、ヒトMETに結合する能力を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較して一つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体の生物学的活性と本質的に均等である生物学的活性を呈する。同様に、本開示の抗MET抗体をコードするDNA配列は、開示される配列と比較して一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本開示の抗MET抗体または抗体断片と本質的に生物学的に均等である抗MET抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。そうしたバリアントなアミノ酸配列およびDNA配列の例は、上記に検討される。
本明細書に提供される方法により有用な抗MET抗体および抗体断片は、記載される抗体のアミノ酸配列とは異なるが、ヒトMETに結合する能力を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較して一つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体の生物学的活性と本質的に均等である生物学的活性を呈する。同様に、本開示の抗MET抗体をコードするDNA配列は、開示される配列と比較して一つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本開示の抗MET抗体または抗体断片と本質的に生物学的に均等である抗MET抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。そうしたバリアントなアミノ酸配列およびDNA配列の例は、上記に検討される。
二つの抗原結合タンパク質または抗体が、薬学的な均等物または薬学的な代替物であり、類似した実験条件下で、単回投与または複数回投与のいずれかで同モル投与量で投与されたときに、その吸収の速度および範囲が有意な差を示さない場合、それら二つの抗原結合タンパク質または抗体は生物学的に均等とみなされる。いくつかの抗体で、吸収の範囲は同等であるが、吸収の速度は同等ではなく、しかし吸収速度における当該差異が意図的であり、ラベリングに反映されており、例えば慢性的使用での有効身体薬物濃度の獲得に必須ではなく、試験された特定の医薬品にとって医学的に重要ではないとみなされるために、それら抗体が生物学的に均等であるとみなされ得る場合、それら抗体は均等物、または薬学的代替物とみなされる。
一つの実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、その安全性、純度および有効性において臨床的に意義のある差異が無ければ、生物学的に均等である。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、参照製品と生物学的製品の間での一回以上の切り替えを行わない持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害作用のリスクの予想される上昇または有効性の減退が生じずに、患者がそのような切り替えを行うことができる場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、二つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、一つのまたは複数の使用条件について、一つのまたは複数の共通の作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的に均等であることは、インビボおよびインビトロの方法により実証されてもよい。生物学的に均等であることの測定方法としては例えば、(a)時間の関数として血液、血漿、血清または他の体液中で抗体またはその代謝物の濃度が測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、(b)ヒトのインビボ生体利用効率データに相関し、その合理的な指標であるインビトロ検査、(c)抗体(またはその標的)の適切な急性薬理学的作用が時間関数として計測される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、および(d)抗体の安全性、有効性または生体利用効率もしくは生物学的均等性を立証する、適切に管理された臨床試験が挙げられる。
本発明に提供される抗MET抗体の生物学的に均等なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うこと、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基または配列を欠失させることによって構築されてもよい。例えば、生物活性に必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要な、または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失されてもよく、または他のアミノ酸で置換されてもよい。他の状況では、生物学的に均等の抗体には、抗体のグリコシル化特性を改変するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消滅または除去する変異を含む、抗MET抗体バリアントを含んでもよい。
種選択性および種交差反応性
本開示は特定の実施形態によると、ヒトMETに結合するが、他の種に由来するMETには結合せず、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用な抗MET抗体(および抗MET抗原結合ドメインを含む抗原結合分子)を提供する。本開示はさらに、ヒトMET、および一種以上の非ヒト種に由来するMETに結合し、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用な抗MET抗体(および抗MET抗原結合ドメインを含む抗原結合分子)も含む。例えば抗MET抗体および抗原結合分子は、ヒトMETに結合してもよく、そして場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのMETのうちの一つ以上に結合してもよく、または結合しなくてもよい。ある例示的実施形態によると、ヒトMETとカニクイザル(例えば、Macaca fascicularis)のMETに特異的に結合する抗MET抗体および抗原結合分子が提供される。他の抗MET抗体および抗原結合分子は、ヒトMETに結合するが、カニクイザルMETには結合しないか、または弱く結合するのみである。
本開示は特定の実施形態によると、ヒトMETに結合するが、他の種に由来するMETには結合せず、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用な抗MET抗体(および抗MET抗原結合ドメインを含む抗原結合分子)を提供する。本開示はさらに、ヒトMET、および一種以上の非ヒト種に由来するMETに結合し、例えばブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫および髄様上皮腫などの眼癌の治療に有用な抗MET抗体(および抗MET抗原結合ドメインを含む抗原結合分子)も含む。例えば抗MET抗体および抗原結合分子は、ヒトMETに結合してもよく、そして場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのMETのうちの一つ以上に結合してもよく、または結合しなくてもよい。ある例示的実施形態によると、ヒトMETとカニクイザル(例えば、Macaca fascicularis)のMETに特異的に結合する抗MET抗体および抗原結合分子が提供される。他の抗MET抗体および抗原結合分子は、ヒトMETに結合するが、カニクイザルMETには結合しないか、または弱く結合するのみである。
多特異性抗体
本明細書において別段に記載されるように、本開示によると、二つの異なる抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子が有用であり、この場合において第一の抗原結合ドメイン(D1)は、MET上の第一のエピトープに結合し、第二の抗原結合ドメイン(D2)は、MET上の第二のエピトープに結合する。ある実施形態では、D1ドメインおよびD2ドメインが結合するMET上の第一および第二のエピトープは別個のものであり、または重複せず、または部分的に重複している。当該態様によれば、D1ドメインは、本明細書の表1に記載されるHCVR/LCVRまたはCDRのアミノ酸配列のいずれかを含んでもよく、およびD2ドメインは、本明細書の表1に記載されるHCVR/LCVRまたはCDRのアミノ酸配列のいずれか他の配列を含んでもよい(D1ドメインの結合特異性が、D2ドメインの結合特異性とは異なっており、および/またはD1が取得された抗原結合タンパク質が、D2が取得された抗原結合タンパク質と、METへの結合に関して競合しない限りにおいて)。一部の実施形態では、抗MET抗体が結合するヒトMETエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204、アミノ酸305~315、および/またはアミノ酸421~455を含む。一部の実施形態では、ヒトMETの第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含み、ヒトMETの第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む。
本明細書において別段に記載されるように、本開示によると、二つの異なる抗原結合ドメインを含む二特異性抗原結合分子が有用であり、この場合において第一の抗原結合ドメイン(D1)は、MET上の第一のエピトープに結合し、第二の抗原結合ドメイン(D2)は、MET上の第二のエピトープに結合する。ある実施形態では、D1ドメインおよびD2ドメインが結合するMET上の第一および第二のエピトープは別個のものであり、または重複せず、または部分的に重複している。当該態様によれば、D1ドメインは、本明細書の表1に記載されるHCVR/LCVRまたはCDRのアミノ酸配列のいずれかを含んでもよく、およびD2ドメインは、本明細書の表1に記載されるHCVR/LCVRまたはCDRのアミノ酸配列のいずれか他の配列を含んでもよい(D1ドメインの結合特異性が、D2ドメインの結合特異性とは異なっており、および/またはD1が取得された抗原結合タンパク質が、D2が取得された抗原結合タンパク質と、METへの結合に関して競合しない限りにおいて)。一部の実施形態では、抗MET抗体が結合するヒトMETエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204、アミノ酸305~315、および/またはアミノ酸421~455を含む。一部の実施形態では、ヒトMETの第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含み、ヒトMETの第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む。
別の態様によれば、従来的な二特異性抗体も、本明細書に有用な抗体として提供される。この場合において当該二特異性抗体の一方のアームは、ヒトMET上のエピトープに結合し、当該二特異性抗体の他方のアームは、MET以外の第二の抗原に結合する。MET結合アームは、本明細書の表1に記載されるHCVR/LCVRまたはCDRのアミノ酸配列のいずれかを含んでもよい。ある実施形態では、MET結合アームは、ヒトMETに結合し、METへのHGF結合を遮断する。他の実施形態では、MET結合アームは、ヒトMETに結合するが、METへのHGF結合は遮断しない。
本開示の状況下で使用され得る例示的な二特異性抗体のフォーマットは、第一の免疫グロブリン(Ig)CH3ドメインと第二のIg CH3ドメインの使用を含み、この場合において当該第一および第二のIg CH3ドメインは、少なくとも一つのアミノ酸によって互いに異なり、そしてこの場合において、少なくとも一つのアミノ酸の差異は、アミノ酸の差異を欠く二特異性抗体と比較して、二特異性抗体のプロテインAへの結合を低下させる。一つの実施形態では、第一のIg CH3ドメインはプロテインAに結合し、第二のIg CH3ドメインは、例えばH95R(IMGTエクソンナンバリングによる;EUナンバリングではH435R)修飾などのプロテインA結合を減少または消失させる変異を含有する。第二のCH3は、Y96F修飾(IMGTによる;EUではY436F)をさらに含んでもよい。第二のCH3内に存在し得るさらなる修飾としては以下が挙げられる:IgG1抗体の場合には、D16E、L18M、N44S、K52N、V57M、およびV82I(IMGTによる;EUではD356E、L358M、N384S、K392N、V397M、およびV422I);IgG2抗体の場合には、N44S、K52N、およびV82I(IMGT;EUではN384S、K392N、およびV422I);ならびにIgG4抗体の場合には、Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、およびV82I(IMGTによる;EUではQ355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、およびV422I)。上述の二特異性抗体のフォーマットの変形も、本開示の範囲内に予期される。
本開示の状況下で使用され得る他の例示的な二特異性のフォーマットとしては限定されないが、例えば、scFvベースまたはダイアボディの二特異性フォーマット(diabody bispecific format)、IgG-scFv融合体、二重可変ドメイン(DVD)-Ig、クアドローマ(Quadroma)、ノブ・イントゥ・ホール(knobs-into-holes)、共通軽鎖(例えば、ノブ・イントゥ・ホールを有する共通軽鎖など)、CrossMab、CrossFab、(SEED)ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ(Duobody)、IgG1/IgG2、二重作用Fab(DAF)-IgG、およびMab2二特異性フォーマット(前述のフォーマットのレビューに関しては、例えばKlein et al.2012、mAbs 4:6、1~11、および当該文献内に引用される参考文献を参照のこと)が挙げられる。二特異性抗体はさらに、ペプチド/核酸結合を使用して構築されてもよい。例えば直交的な化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体-オリゴヌクレオチド結合体を作製し、次いでこれを規定の組成、結合価および構造を有する多量体性複合体へと自己アセンブリさせる。(例えば、Kazane et al.,J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012]を参照されたい)。
治療用製剤および投与
本明細書において、本明細書に記載される方法により有用な抗MET抗体、またはMET X MET二特異性抗原結合分子を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、適切な担体、賦形剤とともに、および輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の剤とともに製剤化されてもよい。
本明細書において、本明細書に記載される方法により有用な抗MET抗体、またはMET X MET二特異性抗原結合分子を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、適切な担体、賦形剤とともに、および輸送、送達、忍容性などの改善をもたらす他の剤とともに製剤化されてもよい。
一部の態様では、抗MET抗体またはMET×MET二特異性抗原結合分子を含む医薬組成物は、例えば、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、または髄様上皮腫などの眼癌を治療するための眼投与用に製剤化される。
本明細書において、患者に投与される抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合分子が、医薬製剤内に含有される方法が提供される。医薬製剤は、抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合分子を、例えば、薬学的に許容可能な担体などの少なくとも一つの不活性成分と共に含有し得る。他の剤を医薬組成物内に組み込んで、輸送、送達、忍容性などの改善を提供し得る。「薬学的に許容可能」という用語は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されるか、または米国薬局方に列記されるか、または動物で、より具体的にはヒトにおける使用に関して他の一般的に認識されている薬局方に列記されることを意味する。「担体」という用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指し、これとともに抗体が投与される。数多くの適切な製剤が、すべての薬剤師に公知の以下の処方集に見出され得る:Remington’s Pharmaceutical Sciences(第15版、Mack Publishing Company、ペンシルバニア州イーストン、1975)の中の特にBlaug、Seymourによるチャプター87。これらの製剤としては例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質(カチオン性またはアニオン性)含有小胞(例えば、LIPOFECTIN(商標))、DNA結合体、無水吸収ペースト、水中油および油中水の乳剤、乳剤カーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固形ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固形混合物が挙げられる。前述の混合物のいずれも、本開示の方法の場合において適切であり得るが、ただし抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子が、当該製剤により不活化されないものとし、および当該製剤は、投与経路に関して生理学的に適合性があり、忍容性であるものとする。またPowell et al.PDA(1998)J Pharm Sci Technol.52:238-311、および薬剤師に公知の賦形剤および担体に関連する追加情報について、当該文献中の引用文献も参照のこと。
本開示の場合において、注射による投与に有用な医薬製剤は、抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合分子を、従来から注射用に使用される滅菌水性媒体または油性媒体中で溶解、懸濁、または乳化することにより調製されてもよい。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコースと他の補助剤を含有する等張液などがあり、それらを例えばアルコール(例えば、エタノール)、ポリアルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤[例えば、ポリソルベート80、HCO-50(水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン(50モル)付加物)]などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが採用されてもよく、それらを例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このようにして調製された注射液は、望ましい場合には適切なアンプル中に充填され得る。
投与様式
抗MET抗体およびMET×MET二特異性抗原結合分子(または抗MET抗体およびMET×MET二特異性抗原結合分子を含む医薬製剤)は、任意の公知の送達システムおよび/または投与方法により患者に投与されてもよい。ある実施形態では、抗MET抗体およびMET×MET二特異性抗原結合分子は、眼注射、眼内注射、硝子体内注射、または結膜下注射により患者に投与される。他の実施形態では、抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子は、例えば、抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子を含有し、眼に直接適用することができる点眼剤または他の液体、ゲル、軟膏もしくは流体を介した局所投与により患者に投与することができる。他の可能性のある投与経路としては、例えば、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられる。
抗MET抗体およびMET×MET二特異性抗原結合分子(または抗MET抗体およびMET×MET二特異性抗原結合分子を含む医薬製剤)は、任意の公知の送達システムおよび/または投与方法により患者に投与されてもよい。ある実施形態では、抗MET抗体およびMET×MET二特異性抗原結合分子は、眼注射、眼内注射、硝子体内注射、または結膜下注射により患者に投与される。他の実施形態では、抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子は、例えば、抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子を含有し、眼に直接適用することができる点眼剤または他の液体、ゲル、軟膏もしくは流体を介した局所投与により患者に投与することができる。他の可能性のある投与経路としては、例えば、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が挙げられる。
併用療法および製剤
本明細書において、一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わされた、本明細書に記載される抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合分子のいずれかを含む組成物および治療用製剤が提供され、および当該組成物を、その必要のある対象に投与することを含む治療方法が提供される。
本明細書において、一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わされた、本明細書に記載される抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合分子のいずれかを含む組成物および治療用製剤が提供され、および当該組成物を、その必要のある対象に投与することを含む治療方法が提供される。
抗MET抗体およびMET X MET二特異性抗原結合分子は、以下からなる群から選択される一つ以上の追加の治療活性成分と組み合わされて共に製剤化されてもよく、および/または投与されてもよい:METアンタゴニスト(例えば、抗MET抗体[例えば、オナルツズマブ、エミベツズマブ、テリソツズマブ、SAIT301、ARGX-111、Sym015、HuMax-cMet、CE-355621、およびH4H14639D]、またはMETの低分子阻害剤)、EGFRアンタゴニスト(例えば、抗EGFR抗体[例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ]またはEGFRの低分子阻害剤[例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ])、例えばHer2/ErbB2、ErbB3またはErbB4などの別のEGFRファミリーの一員のアンタゴニスト(例えば、抗ErbB2[例えば、トラスツズマブ、またはT-DM1{KADCYLA(登録商標)}]、抗ErbB3抗体もしくは抗ErbB4抗体、またはErbB2、ErbB3もしくはErbB4の活性に対する低分子阻害剤)、EGFRvIIIのアンタゴニスト(例えば、抗EGFRvIII抗体)、IGF1Rアンタゴニスト(例えば、抗IGF1R抗体)、B-raf阻害剤(例えば、ヴェムラフェニブ、ソラフェニブ、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α阻害剤(例えば、抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β阻害剤(例えば、抗PDGFR-β抗体、または例えばメシル酸イマチニブもしくはリンゴ酸スニチニブなどの低分子キナーゼ阻害剤)、PDGFリガンド阻害剤(例えば、抗PDGF-A、-B、-C、または-Dの抗体、アプタマー、siRNAなど)、VEGFアンタゴニスト(例えば、アフリベルセプトなどのVEGF-Trap、例えば、US 7,087,411を参照のこと(本明細書において「VEGF-阻害融合タンパク質」とも呼称される)、抗VEGF抗体(例えば、ベバシズマブ)、VEGF受容体の低分子キナーゼ阻害剤(例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ)、DLL4アンタゴニスト(例えば、REGN421など、US2009/0142354に開示されている抗DLL4抗体など)、Ang2アンタゴニスト(例えば、H1H685Pなど、US 2011/0027286に開示されている抗Ang2抗体など)、FOLH1アンタゴニスト(例えば、抗FOLH1抗体)、STEAP1またはSTEAP2のアンタゴニスト(例えば、抗STEAP1抗体または抗STEAP2抗体)、TMPRSS2アンタゴニスト(例えば、抗TMPRSS2抗体)、MSLNアンタゴニスト(例えば、抗MSLN抗体)、CA9アンタゴニスト(例えば、抗CA9抗体)、ウロプラキンアンタゴニスト(例えば、抗ウロプラキン[例えば、抗UPK3A]抗体)、MUC16アンタゴニスト(例えば、抗MUC16抗体)、Tn抗原アンタゴニスト(例えば、抗Tn抗体)、CLEC12Aアンタゴニスト(例えば、抗CLEC12A抗体)、TNFRSF17アンタゴニスト(例えば、抗TNFRSF17抗体)、LGR5アンタゴニスト(例えば、抗LGR5抗体)、一価CD20アンタゴニスト(例えば、リツキシマブなどの一価抗CD20抗体)、CD20 x CD3 二特異性抗体、PD-1ブロッキング剤(例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブなどの抗PD-1抗体)など。本明細書に提供される抗体と組み合わせて有益に投与され得る他の剤としては例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤およびサイトカイン阻害剤が挙げられ、例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18等のサイトカイン、またはそれらの各受容体に結合する低分子サイトカイン阻害剤および抗体が挙げられる。
例としては、例えば抗PD-1抗体などのPD-1阻害剤を、本明細書に記載される抗MET抗体-薬剤結合体と組み合わせてもよい。標的患者集団には特に、c-Met変異を過剰発現する腫瘍を有する患者、例えばc-Met発現ブドウ膜メラノーマまたはc-Met発現非小細胞肺癌を有する患者が含まれる。
本明細書において、本明細書に記載される抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子のいずれかと、一つ以上の化学療法剤の組み合わせを含む組成物および治療用製剤が提供される。化学療法剤の例示としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド(Cytoxan(商標));スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン;アジリジン、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)およびウレドーパ(uredopa);アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン;ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン(novembichin)、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン;抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート;プリンアナログ、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン;ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤(anti-adrenal)、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補液(folic acid replenisher)、例えば、フォリン酸;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド(aldophosphamide glycoside);アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル(bestrabucil);ビスアントレン;エダトラキサート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エルホルニチン(elfornithine);酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(商標);ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2”-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(Ara-C);シクロホスファミド;チオテパ;タキサン、例えば、パクリタキセル(Taxol(商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology社、ニュージャージー州プリンストン)およびドセタキセル(Taxotere(商標)、Aventis社、フランス、アントニー);クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT-11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン;および上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモンの作用を制御する、または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(Fareston)をはじめとする抗エストロゲン;例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン;ならびに上述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。
抗MET抗体およびMET x MET二特異性抗原結合分子はさらに、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、COX阻害剤、心臓保護剤、金属キレート剤、IFN-ガンマ、および/またはNSAIDと組み合わせて投与されてもよく、および/または一緒に製剤化されてもよい。
例えば上記に列記される剤またはその誘導体のいずれかなどの追加の治療活性成分は、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の投与の直前に、投与と同時に、または投与の後すぐに投与されてもよい(本開示の目的に対し、そうした投与レジメンは、追加の治療活性成分と「併用された」抗体の投与とみなされる)。本開示は、抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合分子が、本明細書の別段に記載される追加の治療活性成分のうちの一つ以上と一緒に製剤化される医薬組成物を含む。
投与レジメン
ある実施形態によると、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子(または、抗MET抗体もしくはMET X MET二特異性抗原結合分子と、本明細書に言及される追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物)の複数投与量を、規定の時間経過で対象に投与してもよい。当該態様による方法は、本明細書に提供される抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合分子の複数投与量を対象に順次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「順次投与する」とは、抗体の各投与量が、例えば所定の間隔(例えば、時間、日、週または月)をあけた異なる日など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本開示は、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の一つの初回投与量、次いで当該抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の一つ以上の第二の投与量、および任意で次いで当該抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の一つ以上の第三の投与量を、患者に順次投与することを含む方法を含む。
ある実施形態によると、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子(または、抗MET抗体もしくはMET X MET二特異性抗原結合分子と、本明細書に言及される追加の治療活性剤のいずれかの組み合わせを含む医薬組成物)の複数投与量を、規定の時間経過で対象に投与してもよい。当該態様による方法は、本明細書に提供される抗MET抗体またはMET x MET二特異性抗原結合分子の複数投与量を対象に順次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「順次投与する」とは、抗体の各投与量が、例えば所定の間隔(例えば、時間、日、週または月)をあけた異なる日など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本開示は、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の一つの初回投与量、次いで当該抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の一つ以上の第二の投与量、および任意で次いで当該抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の一つ以上の第三の投与量を、患者に順次投与することを含む方法を含む。
「初回投与量」、「第二の投与量」、および「第三の投与量」という用語は、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子の投与に関する時間的な順序を指す。したがって、「初回投与量」は、治療レジメンの開始時に投与される投与量である(また「基準投与量」とも呼称される)、「第二の投与量」は、初回投与量の後に投与される投与量であり、「第三の投与量」は、第二の投与量の後に投与される投与量である。初回投与量、第二の投与量、および第三の投与量はすべて、同じ量の抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子を含有してもよいが、一般的に、投与頻度に関しては概して互いに異なり得る。しかしながらある実施形態では、初回投与量、第二の投与量、および/または第三の投与量に含有される抗体の量は、治療経過の間に(例えば適宜調整されて加減され)、互いに異なっている。ある実施形態では、二つ以上(例えば、2、3、4、または5)の投与量が、治療レジメンの開始時に負荷投与量」として投与され、その後に続く投与量は、より低い頻度ベースで投与される(例えば、「維持投与量」)。
抗体の診断用途
本開示の抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子を使用して、例えば診断目的のためにサンプル中のMETもしくはMET発現細胞を検出および/または測定してもよい。例えば、抗MET抗体またはその断片を使用して、METの異常発現(例えば過剰発現、過小発現、発現の欠如など)を特徴とする状態または疾患を診断してもよい。METに対する例示的な診断アッセイは、例えば患者から取得されたサンプルを、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子と接触させることを含み、この場合において、当該抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識される。あるいは、標識されていない抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子を、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、診断アプリケーションに使用することもできる。検出可能な標識またはレポーター分子は、例えば3H、14C、32P、35S、または125Iなどの放射性同位体、例えばフルオレセインもしくはローダミンなどの蛍光または化学発光部分、または例えばアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であってもよい。サンプル中のMETを検出または測定するために使用され得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、およびイムノ-PET(例えば、89Zr、64Cuなど)、および蛍光活性化細胞ソーティング法(FACS)が挙げられる。
本開示の抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子を使用して、例えば診断目的のためにサンプル中のMETもしくはMET発現細胞を検出および/または測定してもよい。例えば、抗MET抗体またはその断片を使用して、METの異常発現(例えば過剰発現、過小発現、発現の欠如など)を特徴とする状態または疾患を診断してもよい。METに対する例示的な診断アッセイは、例えば患者から取得されたサンプルを、抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子と接触させることを含み、この場合において、当該抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識される。あるいは、標識されていない抗MET抗体またはMET X MET二特異性抗原結合分子を、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて、診断アプリケーションに使用することもできる。検出可能な標識またはレポーター分子は、例えば3H、14C、32P、35S、または125Iなどの放射性同位体、例えばフルオレセインもしくはローダミンなどの蛍光または化学発光部分、または例えばアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であってもよい。サンプル中のMETを検出または測定するために使用され得る具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、およびイムノ-PET(例えば、89Zr、64Cuなど)、および蛍光活性化細胞ソーティング法(FACS)が挙げられる。
本開示に従うMET診断アッセイに使用され得るサンプルとしては、患者から取得可能な任意の組織サンプルまたは液体サンプル、特に眼または眼の空洞部分にある組織または液体が挙げられる。一般的に、健常な患者(例えば異常なMETのレベルまたは活性と関連した疾患または状態に罹患していない患者)から取得された特定のサンプル中のMETレベルを測定して、最初に基準または標準的なMETレベルを確立する。次いでMETの基準レベルを、MET関連の疾患または状態を有すると疑われる個体から得られたサンプルにおいて測定されたMETレベルと比較することができる。
以下の実施例は、当業者に、本明細書に提供される方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示と説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明であるとみなす範囲を限定することは意図されていない。使用した数字(例えば、量、温度など)に対する正確性を確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮に入れるべきである。別段の示唆が無い限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧であるか、または大気圧に近い。
実施例1.抗MET抗体の作製
抗MET抗体は、ヒトFcに融合された組換えヒトMET細胞外ドメインを含む免疫原を用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む遺伝子操作されたマウスを免疫化することにより取得された(R&D Systems社、カタログ番号358-MT、ミネソタ州ミネアポリス)。免疫化に使用されたマウスは、「ユニバーサル軽鎖」を発現する。すなわち、当該マウスで生成された抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、本質的に同一の軽鎖可変ドメインを有している。
抗MET抗体は、ヒトFcに融合された組換えヒトMET細胞外ドメインを含む免疫原を用いて、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む遺伝子操作されたマウスを免疫化することにより取得された(R&D Systems社、カタログ番号358-MT、ミネソタ州ミネアポリス)。免疫化に使用されたマウスは、「ユニバーサル軽鎖」を発現する。すなわち、当該マウスで生成された抗体は、異なる重鎖可変領域を有するが、本質的に同一の軽鎖可変ドメインを有している。
抗体の免疫反応は、MET特異的な免疫アッセイによりモニタリングされた。所望の免疫応答が得られたときに、脾細胞を採取し、マウスミエローマ細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、MET特異的抗体を産生する細胞株を特定した。この技術を使用して、数種の抗METキメラ抗体(すなわちヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを保有する抗体)を得た。さらに、US 2007/0280945A1号に記載されるように、いくつかの完全ヒト抗MET抗体を、ミエローマ細胞との融合をおこなわずに直接、抗原陽性B細胞から単離した。
本実施例の方法にしたがって作製された例示的な抗MET抗体、および当該抗体から構築された二特異性抗体の特定の生物学的特性を、以下に記載される実施例において詳細に説明する。
実施例2.重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
表1は、本明細書に記載される選択された抗MET抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、およびCDRのアミノ酸配列識別子を記載する。(上述のように、実施例1で生成された全ての抗体は、同じ軽鎖可変領域を保有しており、それに伴い同じ軽鎖CDR配列を保有している)。対応する核酸配列の識別子は、表2に記載される。
表1は、本明細書に記載される選択された抗MET抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域、およびCDRのアミノ酸配列識別子を記載する。(上述のように、実施例1で生成された全ての抗体は、同じ軽鎖可変領域を保有しており、それに伴い同じ軽鎖CDR配列を保有している)。対応する核酸配列の識別子は、表2に記載される。
抗体は典型的には、以下の命名法にしたがって本明細書において言及される:表1および2に示されるように、Fc接頭辞(例えば、「H4H」)、その後に数値識別子(例えば、「13290」、「13291」、「13295」など)、その後に「P2」接尾辞が続く。したがってこの命名法によると、抗体は本明細書において例えば「H4H13290P2」、「H4H13291P2」、「H4H13295P2」などと呼称される場合もある。本明細書で使用される抗体の名称に対する接頭辞は、抗体の特定のFc領域のアイソタイプを示す。特に「H4H」抗体は、ヒトIgG4のFcを有する(抗体の名称において最初に「H」で示される場合、全ての可変領域が完全にヒトである)。当業者によって理解されるように、特定のFcアイソタイプを有する抗体は、異なるFcアイソタイプを有する抗体に変換することができる(例えば、マウスIgG4 Fcを有する抗体は、ヒトIgG1を有する抗体に変換することができる、など)。しかしいずれの場合でも、可変ドメイン(CDRを含む)-これは、表1および2に示される数値識別子によって示されている-は変わらず同じであり、結合特性はFcドメインの性質に関わらず同一または実質的に類似していると予想される。
実施例3.ヒトモノクローナル抗MET(一特異性)抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合アフィニティおよび速度定数
ヒト抗MET抗体の結合アフィニティおよび速度定数を、37℃での表面プラズモン共鳴(Biacore 4000またはT-200)により決定した。本実施例で検証された抗MET抗体は、二価の一特異性MET結合物質であった。ヒトIgG4として発現された抗体(「H4H」と指定)は、モノクローナルマウス抗ヒトFc抗体とのアミンカップリングを介して誘導体化されたCM4またはCM5 Biacoreセンサー表面に捕捉された(GE社、BR-1008-39)。 様々な濃度の可溶性の単量体(ヒト(h)Met.mmh;配列番号152、カニクイザル(macaca fascicularis)(mf)Met.mmh;配列番号154)または二量体(hMet.mFc;配列番号153)のMETタンパク質を、30または50μL/分の流速で抗MET抗体捕捉表面に注入した。捕捉モノクローナル抗体と、hMET.mmhまたはhMET.mFcの結合は4または5分間モニタリングされ、HBS-ET(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)またはPBS-P(0.01M リン酸ナトリウム pH 7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)のランニング緩衝液中、hMET.mmhまたはhMET.mFcの解離が10分間モニタリングされた。
ヒト抗MET抗体の結合アフィニティおよび速度定数を、37℃での表面プラズモン共鳴(Biacore 4000またはT-200)により決定した。本実施例で検証された抗MET抗体は、二価の一特異性MET結合物質であった。ヒトIgG4として発現された抗体(「H4H」と指定)は、モノクローナルマウス抗ヒトFc抗体とのアミンカップリングを介して誘導体化されたCM4またはCM5 Biacoreセンサー表面に捕捉された(GE社、BR-1008-39)。 様々な濃度の可溶性の単量体(ヒト(h)Met.mmh;配列番号152、カニクイザル(macaca fascicularis)(mf)Met.mmh;配列番号154)または二量体(hMet.mFc;配列番号153)のMETタンパク質を、30または50μL/分の流速で抗MET抗体捕捉表面に注入した。捕捉モノクローナル抗体と、hMET.mmhまたはhMET.mFcの結合は4または5分間モニタリングされ、HBS-ET(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)またはPBS-P(0.01M リン酸ナトリウム pH 7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)のランニング緩衝液中、hMET.mmhまたはhMET.mFcの解離が10分間モニタリングされた。
Scrubber2.0c曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサグラムを1:1結合モデルに適合させることによって、結合速度(ka)および解離速度(kd)定数を決定した。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を以下のように速度定数から計算した:
表3に示されるように、いくつかの抗体は、ヒトおよびサルのMETタンパク質に対し、高いアフィニティの結合を呈した。
実施例4.抗Met抗体は、Met受容体上の異なるエピトープに結合する
二つの抗Met抗体が、MET上のそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるかを評価するために、OCTET(登録商標)HTXバイオセンサー(ForteBio Corp.,カリフォルニア州メンロパーク)上でリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉法(BLI)を使用して結合競合アッセイを実施した。
二つの抗Met抗体が、MET上のそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるかを評価するために、OCTET(登録商標)HTXバイオセンサー(ForteBio Corp.,カリフォルニア州メンロパーク)上でリアルタイムの無標識バイオレイヤー干渉法(BLI)を使用して結合競合アッセイを実施した。
簡潔に述べると、C末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグとともに発現された約0.25nMのヒトMET細胞外ドメイン(hMet.mmh)は、20μg/mLのhMET.mmh溶液を含有するウェル内にバイオセンサーを5分間沈めることによって、抗ペンタHis抗体被覆OCTET(登録商標)バイオセンサー(ForteBio Corp.、#18-5079)上に最初に捕捉された。次に、抗原を捕獲したバイオセンサーを、50μg/mLのmAb-1溶液を含有するウェル内に5分間沈めることによって、第一の抗METモノクローナル抗体(以後、mAb-1と呼称される)で飽和させた。次に、バイオセンサーを、50μg/mLの第二の抗METモノクローナル抗体(以後、mAb-2と呼称される)溶液を含有するウェル内に3分間沈めた。すべてのバイオセンサーを、実験の各工程の間にOCTET(登録商標)HEPES-緩衝生理食塩水-EDTAポリソルベート20(HBS-EP)緩衝液中で洗浄した。実験の経過中、リアルタイムの結合反応をモニタリングし、各工程の最後での結合反応を記録した。mAb-1と予め複合体化された抗METに対するmAb-2結合の反応を比較し、様々な抗METモノクローナル抗体の競合/非競合の挙動を、50%阻害閾値を使用して判定した。表4は、結合の順序とは関係なく両方向で競合する抗体の関係性を明示的に規定する。
実施例5.METの異なるエピトープに特異的な二つの異なる抗原結合ドメインを有する二特異性抗体の構築
本実施例は、二つの異なる抗原結合ドメイン(D1およびD2)を含む二特異性抗体の構築を記述する。D1およびD2は、異なる抗MET抗体に由来し、その結果、MET細胞外ドメイン上の異なるエピトープに結合する。
本実施例は、二つの異なる抗原結合ドメイン(D1およびD2)を含む二特異性抗体の構築を記述する。D1およびD2は、異なる抗MET抗体に由来し、その結果、MET細胞外ドメイン上の異なるエピトープに結合する。
本実施例の二特異性抗体を構築するために使用された個々の抗MET抗原結合ドメインは、本明細書の実施例1~3に記載される様々な二価の一特異性抗MET抗体から誘導された。本明細書に記載されるすべての抗MET抗体は、同一(共通の)軽鎖(配列番号138の軽鎖可変領域[LCVR]のアミノ酸配列、および配列番号140、142および144の軽鎖CDR[LCDR1、LCDR2、およびLCDR3]のアミノ酸配列を含む)を含む。さらに、本実施例に例証される全ての二特異性抗体は、例示的な抗MET抗体であるH4H13312P2に由来する「D2」アームを含有する。したがって、本実施例に記載される全ての二特異性抗体の抗原結合ドメイン(D1およびD2)は両方とも、この共通軽鎖可変領域を含み、そして全てのD2結合アームは、H4H13312P2由来の重鎖可変領域を含む。しかし、それら二特異性抗体は、そのD1重鎖可変領域(HCVR)および重鎖CDR(HCDR)に関しては互いに異なっている。本実施例の二特異性抗体の構成要素を、表5に要約する。
実施例6.MET X METヒト二特異性モノクローナル抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合アフィニティおよび速度定数
本明細書の実施例4に従って構築されたMET x MET二特異性抗体の結合アフィニティおよび速度定数を、37℃での表面プラズモン共鳴(Biacore 4000または T-200)により決定した。ヒトIgG4として発現された二特異性抗体(「H4H」と指定)を、モノクローナルマウス抗ヒトFc抗体とのアミンカップリングを介して誘導体化されたCM4またはCM5 Biacoreセンサー表面に捕捉した(GE社、BR-1008-39)。様々な濃度の可溶性の単量体METタンパク質(hMet.mmh、配列番号152)を、抗MET×MET二特異性抗体が捕捉された表面上に、30または50μL/分の速度で注入した。捕捉二特異性抗体と分析物の結合は、4または5分間モニタリングされ、HBS-ET(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)またはPBS-P(0.01M リン酸ナトリウム pH7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)のランニング緩衝液中、分析物の解離が10分間モニタリングされた。
本明細書の実施例4に従って構築されたMET x MET二特異性抗体の結合アフィニティおよび速度定数を、37℃での表面プラズモン共鳴(Biacore 4000または T-200)により決定した。ヒトIgG4として発現された二特異性抗体(「H4H」と指定)を、モノクローナルマウス抗ヒトFc抗体とのアミンカップリングを介して誘導体化されたCM4またはCM5 Biacoreセンサー表面に捕捉した(GE社、BR-1008-39)。様々な濃度の可溶性の単量体METタンパク質(hMet.mmh、配列番号152)を、抗MET×MET二特異性抗体が捕捉された表面上に、30または50μL/分の速度で注入した。捕捉二特異性抗体と分析物の結合は、4または5分間モニタリングされ、HBS-ET(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)またはPBS-P(0.01M リン酸ナトリウム pH7.4、0.15M NaCl、0.05% v/v Surfactant P20)のランニング緩衝液中、分析物の解離が10分間モニタリングされた。
結合速度(ka)および解離速度(kd)定数を実施例3に記載されるように決定した。
表6に示されるように、本明細書に記載の二特異性「MET x MET」抗体は、最大1155分を超えるT1/2値を示した。
実施例7:抗Met抗体は、SRE-ルシフェラーゼレポーターバイオアッセイにおいて、HGF介在性のMet活性化を遮断する
肝細胞増殖因子(HGF)介在性のMET活性化を遮断する抗MET抗体の能力を、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイで検証した。増殖因子のHGFは、その受容体のc-Met(MET)の細胞外ドメインに結合し、急速なホモ二量体化を誘発して、いくつかの下流シグナル伝達カスケードを活性化する。本実施例で検証された抗MET抗体は、METの二価一特異性結合物質、または抗MET「二特異性」物質であり、二特異性抗体の各アームは、MET上の異なる別個のエピトープに結合した。
肝細胞増殖因子(HGF)介在性のMET活性化を遮断する抗MET抗体の能力を、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイで検証した。増殖因子のHGFは、その受容体のc-Met(MET)の細胞外ドメインに結合し、急速なホモ二量体化を誘発して、いくつかの下流シグナル伝達カスケードを活性化する。本実施例で検証された抗MET抗体は、METの二価一特異性結合物質、または抗MET「二特異性」物質であり、二特異性抗体の各アームは、MET上の異なる別個のエピトープに結合した。
操作された細胞系ルシフェラーゼレポーターアッセイ(図2)を使用して、METシグナル伝達を活性化する抗MET抗体の能力(図3、パネルA;表8、列3および4)、およびMETのリガンド介在性活性化を遮断する抗MET抗体の能力(図3、パネルB;表8、列1および2)を決定した。簡潔に述べると、CIGNAL(商標)Lenti SRE Reporter(luc)キット(SABiosciences社、ドイツ、ヒルデン)を使用して、HEK293/SRE-Luc細胞を作製した。HEK293(ヒト胚性腎)細胞は、c-Metを内因性に発現するために選択された。HEK293/SRE-Luc細胞は、血清応答因子(SRE)依存性ルシフェラーゼ(Luc)レポーターを安定的に組み込まれた(Dinter et al.,PLoS ONE 10(2):e0117774,2015を参照)。HEK293/SRE-Luc細胞は、10%のウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、および1μg/mlのピューロマイシンを補充したDMEM中で培養された。
次に、2.0 x 105 HEK293/SRE-Luc細胞を、96ウェルプレートにおいて、ルシフェラーゼアッセイ培地中に播種し、5% CO2中、37℃で一晩インキュベートした。肝細胞増殖因子(HGF)の用量反応曲線は、連続希釈されたHGF(0.01pM~1.0nM)を細胞に添加し、抗体の非存在下、37℃で4~6時間インキュベーションした後のルシフェラーゼシグナルを記録することによって生成された。抗体阻害曲線を生成するために、連続希釈された抗ヒトMET抗体(1.1pM~200nM)を用いて、37℃で1時間、細胞を予めインキュベートした。次いで、73pMまたは100pMの濃度のHGFをさらに4~6時間添加して、その後にシグナルを記録した。それとは別に、リガンドの非存在下でc-Metを活性化する抗体の能力も評価した。
ルシフェラーゼ活性は、ONE-Glo(商標)ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega社、ウィスコンシン州マディソン)を使用して検出し、放射光を、VictorまたはEnvisionのルミノメーター(Perkin Elmer社、米国コネチカット州シェルトン)上で測定し、相対光度単位(RLU)として表現した。EC50/IC50値は、12点の応答曲線にわたる4パラメータロジスティック方程式からGRAPHPAD PRISM(登録商標)を使用して決定した。HGF遮断のパーセント、およびMET活性化の倍率(mAb単独)は、最大抗体用量に対して報告された。結果を表8に示す。
NT=未試験、ND=EC50/IC50は非シグモイド曲線であるため、または不完全遮断のために判定されず。
表8に要約されるように、抗体の大部分はSREレポーターの活性化を阻害し、IC50値は<2.0pM~約1.0nMの範囲であった。例えば、H4H13306P2およびH4H13309P2などのいくつかの例示的な一特異性二価抗MET抗体は、SRE-luc活性化の強力な阻害物質であり、それぞれ阻害割合は67%と77%であった。抗MET二特異性抗体(MET x MET)は、全体的に高いSRE-luc活性化の阻害を示した。例えば、MET x MET二特異性抗体のH4H14639Dは、95%の阻害を示した。さらに、いくつかの遮断抗体は、リガンドの非存在下では弱く活性化し、活性化応答の倍率は基準レベルより0.8~14.4の範囲であった。
また図3に示されるように、二価単一特異性抗体のH41413306P2およびH4H13312P2はそれぞれ、HGFリガンドの非存在下でMet経路を活性化し(パネルA)、またMetのHGF活性化も遮断した(パネルB)。
HGF依存性およびHGF非依存性のMET活性化に対する二特異性MET x MET抗体(例えば、H4H14639D の効果も、HEK293/SRE-Lucシステムを使用して評価した。SRE誘導型ルシフェラーゼ活性を、様々な濃度のMET抗体H4H14639D(MET×MET二特異性抗体)、一価抗MET抗体、およびH4H14639D親抗体のH4H13312P2で処理されたHEK293T細胞において測定し、HGF非依存性のMETアゴニズムのレベルを確認した。親抗MET一特異性二価抗体は、METアゴニスト活性を示したが、一価抗体もMET x MET二特異性抗体もMETアゴニスト活性を示さなかった(図4、パネルA)。
SRE誘導型ルシフェラーゼ活性を、様々な濃度のMET抗体H4H14639D(MET×MET二特異性抗体)、一価抗MET抗体、およびH4H14639D親抗体のH4H13312P2で処理されたHEK293T細胞において測定し、HGF依存性のMETアゴニズムの阻害または遮断のレベルを確認した。親抗MET一特異性二価抗体は、いくらかのHGF遮断活性を示したが、一価抗体とMET x MET二特異性抗体の両方とも高いHGF遮断を示した(図4、パネルB)。
MET x MET二特異性抗体は、HGFシグナル伝達を遮断し、低いMETアゴニスト活性を呈する。
実施例8:抗Met抗体は、Met増幅細胞の増殖を阻害する。
次に、選択された抗Met抗体を、MET増幅SNU5細胞の増殖を阻害する能力について試験した。簡潔に述べると、2.5×103個のヒト胃癌(SNU5)細胞を、1.5pM~100nMの範囲の濃度の抗MET抗体の存在下で、完全増殖培地中に播種した。SNU5完全増殖培地は、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium、10% FBS、およびペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンを含有した。細胞を5日間インキュベートし、CELLTITER-GLO(登録商標)Luminescent Cell Viability Assayキット(Promega社、ウィスコンシン州マディソン)を使用して、メーカーの説明書に従い、生細胞数を決定した。
次に、選択された抗Met抗体を、MET増幅SNU5細胞の増殖を阻害する能力について試験した。簡潔に述べると、2.5×103個のヒト胃癌(SNU5)細胞を、1.5pM~100nMの範囲の濃度の抗MET抗体の存在下で、完全増殖培地中に播種した。SNU5完全増殖培地は、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium、10% FBS、およびペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミンを含有した。細胞を5日間インキュベートし、CELLTITER-GLO(登録商標)Luminescent Cell Viability Assayキット(Promega社、ウィスコンシン州マディソン)を使用して、メーカーの説明書に従い、生細胞数を決定した。
表9に要約されるように、例えばH4H13312P2およびH4H13325P2などのいくつかの抗MET抗体は、50%を超えてSNU5の増殖を妨害し、全体的なIC50は、44pM~780pMの範囲であった。
図5は、様々な抗MET二価一特異性抗体(すなわち従来的な抗体)を用いて処理されたSNU5細胞の相対的な細胞増殖を示す。従来的なMET抗体のサブセットは、SNU5のMET増幅胃癌細胞の増殖を阻害する(図5)。96ウェルプレート中のSNU5細胞を、10μg/mlの各抗体で処理し、細胞の増殖は、ALAMARBLUE(登録商標)試薬(Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム)の減少により5日後に判定した。一価MET抗体(列2、図5)は、米国特許第7,892,550 B2号に記載される、MetMabの重鎖可変配列および軽鎖可変配列を使用して生成された。当該特許は、その全体で参照により本明細書に援用される。従来的な抗体である8は、H4H13306P2であり、従来的な抗体である11は、H4H13312P2であり、これらを使用して、MET×MET二特異性抗体のH4H14639Dが構築された。
別個の増殖アッセイにおいて、MET x MET二特異性抗体(すなわちH4H14639D)の遮断活性を、SNU5、および非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株のEBC-1の両方で評価した。EBC-1も、Met遺伝子の増幅を停止、METを過剰発現する(Lutterbach et al.,Cancer Res.67(5):2081-2088,2007)。EBC-1細胞の完全増殖培地は、MEM Earle’s Salts、10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン、およびMEM用の非必須アミノ酸を含有した。H4H14369Dは、SRE-ルシフェラーゼの読み取り値によると、MET活性において最大阻害割合を示した。現行の実験では、3.0×103個のSNU5細胞またはEBC-1細胞を、15pM~100nMの範囲の濃度のH4H14639Dの存在下で、完全増殖培地中に播種した。細胞を、5%CO2中、37℃で3日間インキュベートした。次いで細胞を4%ホルムアルデヒド中で固定し、3μg/mlのHoechst 33342で染色し、核を標識した。IMAGEXPRESS(登録商標)Micro XL(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)上で画像を取得し、METAXPRESS(登録商標)画像解析ソフトウェア(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)により核の数を決定した。40nMのジギトニンで処理された細胞のバックグラウンドの核数を、全てのウェルから引き算し、生存率は未処理対照のパーセンテージ(生存率%)として表した。IC50値は、10点の応答曲線にわたる4パラメータロジスティック方程式から決定された(GRAPHPAD PRISM(登録商標))。IC50値、および細胞殺傷率を表9に示す。
ND=IC50は非シグモイド曲線であるため、または不完全妨害のために判定されず。
以下の表10に要約されるように、MET x MET二特異性抗体のH4H14639Dは、EBC-1細胞およびSNU5細胞の増殖を、それぞれ37%および40%阻害し、IC50は、0.82nMおよび0.3nMであった。
96ウェルプレート中のSNU5細胞(胃)を、対照抗体、一価MET抗体、またはMET×MET二特異性抗体を用いて、0.1μg/mL、1μg/mL、または10μg/mLで処理した。ALAMARBLUE(登録商標)試薬(Thermo Fisher Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム)の減少により、細胞の増殖を5日後に判定した。MET x MET二特異性抗体は、対照抗体および一価抗体と比較して、SNU5細胞の相対的な細胞増殖を有意に減少させた(図6、パネルA)。
同様に、EBC-1細胞の増殖に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。2,500個のEBC-1細胞を96ウェルプレートに播種し、10%のFBSを補充したダルベッコ培地中で培養した。細胞を、対照抗体またはMET×MET二特異性抗体を用いて、0.1μg/mLまたは1μg/mLで処理した。続いて5% CO2で、37℃でインキュベートした。5日後、相対的な細胞増殖は、指標色素のALAMARBLUE(登録商標)を、SPECTRAMAX(登録商標)M3プレートリーダー(Molecular Devices,LLC、カリフォルニア州サニーベール)において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。結果を表11および図6、パネルBに示す。MET x MET二特異性抗体(H4H14639D)は、対照抗体と比較して、EBC-1細胞の相対的細胞増殖を有意に減少させた(図6、パネルB)。
実施例9.MET x MET二特異性抗体は、NCI-H596 NSCLC細胞において、中程度で一過性のMET経路活性を誘導する
ヒト肺腺扁平上皮癌細胞における、MET経路に対するMET×MET二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。
ヒト肺腺扁平上皮癌細胞における、MET経路に対するMET×MET二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。
250,000個のNCI-H596細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FBSを補充されたRPMI培地中で培養した。細胞を、50ng/mlの肝細胞増殖因子(HGF)で、または10μg/mlのMET×MET二特異性抗体 H4H14639Dで処理し、実験を二重に繰り返した。次いで細胞を37℃で5% CO2中でインキュベートした。 0、2、6、または18時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。METリン酸化およびERKリン酸化を、ImageJ画像処理プログラム(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)を用いて定量した。チューブリンのローディング対照に対してリン酸化レベルを正規化し、対照処理に対する倍数変化として表した。結果を表12に要約する。
NCI-H596細胞をHGFで処理することにより、METとERKに強力な活性化を誘導し、2時間でピークに達して、18時間持続した。中程度のMETおよびERKのリン酸化は、H4H14636D二特異性抗体の処理で検出され、それぞれ18時間または6時間までに基準レベルに戻った。
実施例10.MET x MET二特異性抗体は、Hs746T胃癌細胞において、一特異性抗体よりも強力にMET分解を誘導し、経路の活性を阻害する
ヒト胃癌細胞のMET経路に対するMET×MET二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。250,000個のHs746Tヒト胃癌細胞(H.Smith,J.Nat’l.Cancer Inst.62(2):225-230,1979)を12ウェルプレートに播種し、10%のFBSを補充した改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞を、(1)5μg/mlのhFc対照分子、(2)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13306P2、(3)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13312P2、(4)2.5μg/mLのH4H13306P2と2.5μg/mLのH4H13312P2の組み合わせ、または(5)5μg/mlのMET X MET二特異性抗体のH4H14639D、を用いて処理した。次いで細胞を37℃、5% CO2でインキュベートした。 18時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。MET発現、METリン酸化、およびERKリン酸化を、ImageJ画像処理プログラム(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)を用いて定量した。結果を表13および図7のパネルAに要約する。当該図において、イムノブロットの生データを示す。図7のパネルBは、10μg/mlのMET X MET二特異性抗体を用いて、0、2、または6時間、処理された細胞中のMETタンパク質発現を示す。Hs747T細胞における総METレベルは、MET×MET二特異性抗体を用いた処理により経時的に低下した。MET増幅ヒト乳頭腺がんのNCI-H820細胞株(Bean et al.,“MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to getfitnib or erlotinib,” Proc.Natl.Acad.Sci.2007 Dec 26,104(52):20932-20937)に対しても同様の結果が得られた。
ヒト胃癌細胞のMET経路に対するMET×MET二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。250,000個のHs746Tヒト胃癌細胞(H.Smith,J.Nat’l.Cancer Inst.62(2):225-230,1979)を12ウェルプレートに播種し、10%のFBSを補充した改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞を、(1)5μg/mlのhFc対照分子、(2)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13306P2、(3)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13312P2、(4)2.5μg/mLのH4H13306P2と2.5μg/mLのH4H13312P2の組み合わせ、または(5)5μg/mlのMET X MET二特異性抗体のH4H14639D、を用いて処理した。次いで細胞を37℃、5% CO2でインキュベートした。 18時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。MET発現、METリン酸化、およびERKリン酸化を、ImageJ画像処理プログラム(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)を用いて定量した。結果を表13および図7のパネルAに要約する。当該図において、イムノブロットの生データを示す。図7のパネルBは、10μg/mlのMET X MET二特異性抗体を用いて、0、2、または6時間、処理された細胞中のMETタンパク質発現を示す。Hs747T細胞における総METレベルは、MET×MET二特異性抗体を用いた処理により経時的に低下した。MET増幅ヒト乳頭腺がんのNCI-H820細胞株(Bean et al.,“MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to getfitnib or erlotinib,” Proc.Natl.Acad.Sci.2007 Dec 26,104(52):20932-20937)に対しても同様の結果が得られた。
二特異性抗体であるH4H14639Dは、その親の従来抗体よりも強力にMET分解を誘導した。METリン酸化とERKリン酸化は両方とも、親抗体、または親抗体の組み合わせよりも、H4H14636Dを用いた処理によって効果的に阻害された。
Hs746T胃癌細胞を、対照抗体、MET×MET二特異性抗体のH4H14639D、抗MET親抗体のH4H13306P2、抗MET親抗体のH4H13312P2、および親抗体1と2の組み合わせを用いて処理した。各抗体は10μg/mlで、または親抗体の組み合わせはそれぞれ5μg/mlで18時間処理した。MET発現(MET)、および経路活性化(pMETおよびpErk)を、指定抗体を用いた免疫ブロッティングにより判定した(図8)。MET x MET二特異性抗体は、Hs746T胃癌細胞において、その親抗体よりも効果的にMET経路の活性化を阻害する。
実施例11.MET x MET二特異性抗体は、NCI-H596肺癌細胞において、一特異性抗体よりも強力にMET分解を誘導する
ヒト肺腺扁平上皮癌細胞上の肝細胞増殖因子受容体(HGFRまたはMET)の発現レベルに対する、MET x MET二特異性抗体と、親二価一特異性抗MET抗体の効果を評価した。250,000個のNCI-H596ヒト肺腺扁平上皮癌細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FBSを補充されたRPMI培地中で培養した。細胞を、(1)5μg/mlのhFc対照分子、(2)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13306P2、(3)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13312P2、(4)2.5μg/mLのH4H13306P2と2.5μg/mLのH4H13312P2の組み合わせ、または(5)5μg/mlのMET X MET二特異性抗体のH4H14639D、を用いて処理した。次いで細胞を37℃、5% CO2でインキュベートした。 18時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。MET発現を、ImageJ画像処理プログラム(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)を用いて定量した。結果を表14に要約する。
ヒト肺腺扁平上皮癌細胞上の肝細胞増殖因子受容体(HGFRまたはMET)の発現レベルに対する、MET x MET二特異性抗体と、親二価一特異性抗MET抗体の効果を評価した。250,000個のNCI-H596ヒト肺腺扁平上皮癌細胞を12ウェルプレートに播種し、10% FBSを補充されたRPMI培地中で培養した。細胞を、(1)5μg/mlのhFc対照分子、(2)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13306P2、(3)5μg/mlの親二価一特異性抗MET抗体のH4H13312P2、(4)2.5μg/mLのH4H13306P2と2.5μg/mLのH4H13312P2の組み合わせ、または(5)5μg/mlのMET X MET二特異性抗体のH4H14639D、を用いて処理した。次いで細胞を37℃、5% CO2でインキュベートした。 18時間後、細胞溶解物を調製し、タンパク質含有量を正規化し、イムノブロット分析を実施した。MET発現を、ImageJ画像処理プログラム(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)を用いて定量した。結果を表14に要約する。
さらにNCI-H596(METのエクソン14スキップ変異)肺癌細胞を、10μg/mlの対照抗体またはMET×MET二特異性抗体で2、6、または18時間、処理した。MET発現は、イムノブロット法により判定された(図9)。当該図から、処理時間が増すにつれ、METxMET二特異性抗体誘導性にMETが分解されることが示される。
二特異性抗体のH4H14636Dは、NCI-H596肺癌細胞において、その親の従来抗体よりも強力にMET分解を誘発する。
実施例12.MET x MET二特異性抗体は、SNU5胃癌細胞において、一特異性抗体よりも強力にMET分解を誘導し、経路の活性を阻害する
胃癌細胞上の肝細胞増殖因子受容体(HGFRまたはMET)の発現レベルに対する、二価一特異性抗MET抗体、およびいくつかのMET x MET二特異性抗体の効果を評価した。ヒト胃癌SNU5細胞を、20% FBSと、ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを含有するIscove’s培地中に播種した。播種から24時間後、細胞を、対照hFc、抗MET親二価一特異性抗体のH4H13312P2、またはMET X MET二特異性抗体(H4H14634D、H4H14635D、H4H14636D、H4H14637D、H4H14638D、H4H14639D、H4H14640D、H4H14641D)を用いて18時間処理した。次いで細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロッティングにより分析した。イムノブロットを、METおよびチューブリンに対してプローブした。METタンパク質の発現レベルを定量し、チューブリンローディング対照に対して正規化した。結果を表15および図10、パネルBに示す。
胃癌細胞上の肝細胞増殖因子受容体(HGFRまたはMET)の発現レベルに対する、二価一特異性抗MET抗体、およびいくつかのMET x MET二特異性抗体の効果を評価した。ヒト胃癌SNU5細胞を、20% FBSと、ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミンを含有するIscove’s培地中に播種した。播種から24時間後、細胞を、対照hFc、抗MET親二価一特異性抗体のH4H13312P2、またはMET X MET二特異性抗体(H4H14634D、H4H14635D、H4H14636D、H4H14637D、H4H14638D、H4H14639D、H4H14640D、H4H14641D)を用いて18時間処理した。次いで細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロッティングにより分析した。イムノブロットを、METおよびチューブリンに対してプローブした。METタンパク質の発現レベルを定量し、チューブリンローディング対照に対して正規化した。結果を表15および図10、パネルBに示す。
SNU5癌細胞を、10μg/mlの対照抗体またはMET×MET二特異性抗体または一価MET抗体を用いて18時間、上述のように処理した。MET発現(図10、パネルAおよびB)、および経路活性化(すなわちpMETおよびpErk、パネルA)を、指定抗体を用いた免疫ブロッティングにより判定した。イムノブロットを図10に示す。
MET×MET二特異性抗体を用いたSNU5細胞の処理によって、二価一特異性抗MET抗体(H4H13312P2)(図10、パネルB)、一価MET抗体、または対照hFcを用いた処理よりも強力なMETの分解を誘導した。MET x MET二特異性抗体を用いたSNU5細胞の処理によって、MET経路の下流エフェクターが阻害された。MET増幅非小細胞肺癌腺癌細胞株のNCI-H1993(Kubo et al.,“MET gene amplification or EGFR mutation activate MET in lung cancers untreated with EGFR tyrosine kinase inhibitors,” Int.J.Cancer 2009 Apr 15;124(8):1778-1784)についても同様の結果が得られた。
実施例13.MET x MET二特異性抗体は、EBC-1細胞において、一特異性抗体よりも強力にMET分解を誘導し、経路の活性を阻害し、そして腫瘍増殖を阻害する
MET増幅ヒト肺扁平上皮細胞癌のEBC-1細胞(Lutterbach et al.,“Lung cancer cell lines harboring MET gene amplification are dependent on Met for growth and survival,” Cancer Res.2007 Mar 1;67(5):2081-8)を、対照抗体、または10μg/mlのMET X MET二特異性抗体を用いて18時間、上述のように処理した。MET発現とMET経路の活性化は、pMETおよびpErkにより確定され、指定抗体を用いた免疫ブロッティングにより判定された。イムノブロットを図11に示す。
MET増幅ヒト肺扁平上皮細胞癌のEBC-1細胞(Lutterbach et al.,“Lung cancer cell lines harboring MET gene amplification are dependent on Met for growth and survival,” Cancer Res.2007 Mar 1;67(5):2081-8)を、対照抗体、または10μg/mlのMET X MET二特異性抗体を用いて18時間、上述のように処理した。MET発現とMET経路の活性化は、pMETおよびpErkにより確定され、指定抗体を用いた免疫ブロッティングにより判定された。イムノブロットを図11に示す。
MET遺伝子の増幅を担持するEBC-1細胞をMET×MET二特異性抗体で処理することにより、対照抗体を用いた処理よりも強力なMETの分解を誘導した。MET x MET二特異性抗体を用いたEBC-1細胞の処理によって、MET経路の下流エフェクターが阻害された。
別の実験において、500万個のEBC-1細胞を、C.B.-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約150mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、25mg/kgの対照抗体、または25mg/kgのMET x MET二特異性抗体のH4H14639Dを用いて週に2回処理した。腫瘍増殖は、移植後30日間モニタリングされ、各実験群について腫瘍体積(mm3)が経時的に測定された。結果を表16および図12に示す。この結果から、MET x MET二特異性抗体が、EBC-1腫瘍の増殖を有意に阻害することが示される。
実施例14.MET x MET二特異性抗体は、Hs746T胃癌細胞のインビトロ増殖を、一特異性抗体よりも強力に阻害する
ヒト胃癌細胞の増殖に対するMET×MET二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。2,500個のHs746Tヒト胃癌細胞(H.Smith,J.Nat’l.Cancer Inst.62(2):225-230,1979)を96ウェルプレートに播種し、10%のFBSを補充した改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞は、(1)5μg/mlの個々の二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2またはH4H13312P2)、(2)それぞれ2.5μg/mlの二つの二価一特異性抗MET親抗体(H4H13306P2とH4H13312P2)の組み合わせ、または(3)5μg/mlの、H4H13306P2由来の一方の結合アームと、H4H13312P2由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体(H4H14639D)、を用いて処理された。次いで細胞を、5% CO2、37℃でインキュベートした。 5日後、相対的な細胞増殖は、指標色素のALAMAR BLUE(登録商標)(ThermoFischer Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム)を、Spectramax(登録商標)M3プレートリーダー(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表17は、対照(処理なし)Hs746T細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なHs746T細胞の増殖を示す。二特異性抗体のH4H14639Dは、その親一特異性抗体の個々の、または組み合わせよりも強力にHs746T細胞の増殖を阻害する。
ヒト胃癌細胞の増殖に対するMET×MET二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。2,500個のHs746Tヒト胃癌細胞(H.Smith,J.Nat’l.Cancer Inst.62(2):225-230,1979)を96ウェルプレートに播種し、10%のFBSを補充した改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞は、(1)5μg/mlの個々の二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2またはH4H13312P2)、(2)それぞれ2.5μg/mlの二つの二価一特異性抗MET親抗体(H4H13306P2とH4H13312P2)の組み合わせ、または(3)5μg/mlの、H4H13306P2由来の一方の結合アームと、H4H13312P2由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体(H4H14639D)、を用いて処理された。次いで細胞を、5% CO2、37℃でインキュベートした。 5日後、相対的な細胞増殖は、指標色素のALAMAR BLUE(登録商標)(ThermoFischer Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム)を、Spectramax(登録商標)M3プレートリーダー(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表17は、対照(処理なし)Hs746T細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なHs746T細胞の増殖を示す。二特異性抗体のH4H14639Dは、その親一特異性抗体の個々の、または組み合わせよりも強力にHs746T細胞の増殖を阻害する。
Hs746T胃癌細胞を、対照抗体、MET×MET二特異性抗体のH4H14639D、抗MET親抗体のH4H13306P2、抗MET親抗体のH4H13312P2、および親抗体1と2の組み合わせを用いて処理した。各抗体は2μg/mlであった。ALAMAR BLUE(登録商標)試薬の減少により、細胞の増殖を5日後に判定した(図13、パネルA)。MET x MET二特異性抗体は、親抗体の単独または組み合わせよりも細胞増殖を阻害し、Hs746T胃癌細胞において、その親抗体よりも効果的にMET経路の活性化を阻害した。
96ウェルプレート中のHs746T胃癌細胞を、25μg/mLの対照抗体、1μg/mL、10μg/mL、もしくは25μg/mLの一価MET抗体、または1μg/mL、10μg/mL、もしくは25μg/mLMET×MET二特異性抗体を用いて処理した。Hs746T胃癌細胞の増殖は、ALAMARBLUE(登録商標)試薬の減少により5日後に判定した(図13、パネルB)。MET x MET二特異性抗体は、MET増幅細胞の増殖を強力に阻害する。
実施例15.MET x MET二特異性抗体は、インビトロでNCI-H596肺癌細胞の増殖を誘導しない
ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞(NCI-H596)の増殖に対するMET×MET二特異性抗体の効果をインビトロで評価した。10,000個のNCI-H596 肺腺扁平上皮癌細胞(Nair et al.,J.Nat’l.Cancer Inst.86(5):378-383,1994)を、1%ウシ胎児血清(FBS)を補充した培地中、0.66%アガーの層上で、96ウェルプレートに播種した。細胞を、0.3%アガロースを含む、1% FBSを補充されたRPMI1640培地中で培養した。細胞は、(1)5μg/mlの個々の親二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2またはH4H13312P2)、(2)それぞれ2.5μg/mlの二つの親二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2とH4H13312P2)の組み合わせ、(3)5μg/mlの、H4H13306P2由来の一方の結合アームと、H4H13312P2由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体(H4H14639D)、または(4)100ng/mLの肝細胞増殖因子(HGF)を用いて処理された。次いで細胞を、5% CO2、37℃でインキュベートした。 2週間後、相対的な細胞増殖は、指標色素のALAMAR BLUE(登録商標)(ThermoFischer Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム)を、SPECTRAMAX(登録商標)M3プレートリーダー(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表18および図14は、対照(処理なし)のNCI-H596細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なNCI-H596細胞の増殖を示す。NCI-H596肺癌細胞をHGFで処理することにより、軟アガー中での増殖が強力に誘導された。MET x MET(図14のMM)二特異性抗体のH4H14639Dは、対照処理細胞と比較して増殖を有意に変化させなかった。それぞれの親二価一特異性抗体のH4H13306P2(M1)またはH4H13312P2(M2)の個別で、または組み合わせ(H4H13306P2とH4H13312P2)(M1M2)で、中程度の細胞増殖が観察された。
実施例16.MET x MET二特異性抗体は、SNU5胃癌細胞のインビトロ増殖を、一特異性抗体よりも強力に阻害する
ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)細胞(NCI-H596)の増殖に対するMET×MET二特異性抗体の効果をインビトロで評価した。10,000個のNCI-H596 肺腺扁平上皮癌細胞(Nair et al.,J.Nat’l.Cancer Inst.86(5):378-383,1994)を、1%ウシ胎児血清(FBS)を補充した培地中、0.66%アガーの層上で、96ウェルプレートに播種した。細胞を、0.3%アガロースを含む、1% FBSを補充されたRPMI1640培地中で培養した。細胞は、(1)5μg/mlの個々の親二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2またはH4H13312P2)、(2)それぞれ2.5μg/mlの二つの親二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2とH4H13312P2)の組み合わせ、(3)5μg/mlの、H4H13306P2由来の一方の結合アームと、H4H13312P2由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体(H4H14639D)、または(4)100ng/mLの肝細胞増殖因子(HGF)を用いて処理された。次いで細胞を、5% CO2、37℃でインキュベートした。 2週間後、相対的な細胞増殖は、指標色素のALAMAR BLUE(登録商標)(ThermoFischer Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム)を、SPECTRAMAX(登録商標)M3プレートリーダー(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表18および図14は、対照(処理なし)のNCI-H596細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なNCI-H596細胞の増殖を示す。NCI-H596肺癌細胞をHGFで処理することにより、軟アガー中での増殖が強力に誘導された。MET x MET(図14のMM)二特異性抗体のH4H14639Dは、対照処理細胞と比較して増殖を有意に変化させなかった。それぞれの親二価一特異性抗体のH4H13306P2(M1)またはH4H13312P2(M2)の個別で、または組み合わせ(H4H13306P2とH4H13312P2)(M1M2)で、中程度の細胞増殖が観察された。
ヒト胃癌細胞の増殖に対するMET×MET二特異性抗体の効果を、インビトロで評価した。2,500個のSNU5ヒト胃癌細胞(Ku and Park,Cancer Res.Treat.37(1):1-19,2005)を、96ウェルプレートに播種し、20%のFBSを補充したIscove’s改変ダルベッコ培地中で培養した。細胞は、(1)5μg/mlの個々の二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2またはH4H13312P2)、(2)それぞれ2.5μg/mlの二つの二価一特異性抗MET抗体(H4H13306P2とH4H13312P2)の組み合わせ、または(3)5μg/mlの、H4H13306P2由来の一方の結合アームと、H4H13312P2由来の他方の結合アームを含有する二特異性抗体(H4H14639D)、を用いて処理された。次いで細胞を、5% CO2、37℃でインキュベートした。 5日後、相対的な細胞増殖は、指標色素のALAMAR BLUE(登録商標)(ThermoFischer Scientific社、マサチューセッツ州ウォルサム)を、SPECTRAMAX(登録商標)M3プレートリーダー(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)において、その高度に蛍光性の形態への減少を測定することにより判定した。蛍光の増加は、細胞増殖と相関する。表19は、対照(処理なし)SNU5細胞の増殖に対して正規化された各抗体処理の相対的なSNU5細胞の増殖を示す。二特異性抗体のH4H14639Dは、その親一特異性抗体よりも強力にSNU5細胞の増殖を阻害する。
実施例17.MET x MET二特異性抗体は、Hs746T腫瘍異種移植片の退縮を誘導する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒト胃癌腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。300万個のHs746Tヒト胃癌細胞を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した(Bancroft et al.,J.Immunol.137(1):4-9,1986)。腫瘍体積が約200mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、25mg/kgの対照抗体、または25mg/kgのMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて週に2回治療した。対照群に関して、移植から16日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖をモニタリングした。H4H14639治療群に関して、移植から30日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスモデルにおける、ヒト胃癌腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。300万個のHs746Tヒト胃癌細胞を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した(Bancroft et al.,J.Immunol.137(1):4-9,1986)。腫瘍体積が約200mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、25mg/kgの対照抗体、または25mg/kgのMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて週に2回治療した。対照群に関して、移植から16日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖をモニタリングした。H4H14639治療群に関して、移植から30日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
MET x MET二特異性抗体を用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して21日間にわたり、腫瘍サイズの退縮を誘導した。対照治療された腫瘍は、16日間にわたり増殖し、約12倍の平均体積の増加を示した(表20)。経時的な腫瘍体積は、MET×MET二特異性抗体によるHs746T腫瘍退縮を示しており、これは図15に示される。
実施例18.MET x MET二特異性抗体は、SNU5腫瘍異種移植片の退縮を誘導する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒト胃癌腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。1,000万個のSNU5ヒト胃癌細胞を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約500mm3に達した時点で、マウスを5群に無作為化し、10mg/kgの対照抗体、または1mg/kgもしくは10mg/kgいずれかのMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて週に2回治療した。移植後81日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖がモニタリングされた。
免疫不全マウスモデルにおける、ヒト胃癌腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。1,000万個のSNU5ヒト胃癌細胞を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約500mm3に達した時点で、マウスを5群に無作為化し、10mg/kgの対照抗体、または1mg/kgもしくは10mg/kgいずれかのMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて週に2回治療した。移植後81日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖がモニタリングされた。
1mg/kgまたは10mg/kgのMET×MET抗体で治療されたマウスの腫瘍は、それぞれ約95%または98%の平均サイズ減少を示した。対照治療群の腫瘍は、治療開始から約12倍の平均体積の増加を示した(表21)。
皮下移植されたSNU5腫瘍を、対照抗体、1mg/kgもしくは10mg/kg一価MET抗体、または1mg/kgもしくは10mg/kgのMET x MET二特異性抗体で週に2回治療した。MET×MET二特異性抗体で治療されたマウスにおいて、MET増幅SNU5腫瘍の強力で持続的な退縮(すなわち腫瘍体積の減少)が経時的に観察された(図16、パネルA)。試験終了時に腫瘍からタンパク質を抽出し、MET発現と、METリン酸化(pMET発現)により示される経路活性化をイムノブロット法により判定した。MET x MET治療マウス(腫瘍)は、対照と比較してMETおよびpMETの発現の減少を示した(図16、パネルB)。MET x MET二特異性抗体は、MET増幅を担持する腫瘍の強力な阻害物質である。
実施例19.MET x MET二特異性抗体は、U87-MG腫瘍異種移植片の退縮を誘導する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒトグリア芽腫腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。500万個のU87-MGヒトグリア芽腫細胞(Vordermark and Brown,Int.J.Radiation Biol.56(4):1184-1193,2003)を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。U87-MGグリア芽腫異種移植片モデルは、オートクラインのHGFシグナル伝達により誘導される。腫瘍体積が約100mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体またはMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて治療した。各マウスには、週に二回、25mg/kgの抗体(対照またはMET X MET)が投与sれた。移植後29日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖がモニタリングされた。
免疫不全マウスモデルにおける、ヒトグリア芽腫腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。500万個のU87-MGヒトグリア芽腫細胞(Vordermark and Brown,Int.J.Radiation Biol.56(4):1184-1193,2003)を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。U87-MGグリア芽腫異種移植片モデルは、オートクラインのHGFシグナル伝達により誘導される。腫瘍体積が約100mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体またはMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて治療した。各マウスには、週に二回、25mg/kgの抗体(対照またはMET X MET)が投与sれた。移植後29日間、対照治療腫瘍がプロトコールのサイズ限界に達するときまで腫瘍増殖がモニタリングされた。
MET x MET抗体で治療されたマウスの腫瘍は、約38%の平均サイズ減少を示したが、対照抗体で治療された腫瘍は、29日間にわたり増殖し、約19倍の平均体積の増加を示した(表22)。経時的な腫瘍体積は、MET×MET二特異性抗体によるU87-MG腫瘍退縮を示しており、これは図17に示される。
実施例20.MET x MET二特異性抗体は、U118-MG腫瘍異種移植片の増殖を阻害する
免疫不全マウスモデルにおける、ヒトグリア芽腫腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。U118-MGグリア芽腫異種移植片モデルは、オートクラインのHGFシグナル伝達により誘導される。500万個のU118-MGヒトグリア芽腫細胞(Olopade et al.,Cancer Research 52:2523-2529,1992)を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約100mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体またはMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて治療した。各マウスには、週に二回、25mg/kgの抗体(対照またはMET X MET)が投与sれた。移植後72日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスモデルにおける、ヒトグリア芽腫腫瘍に対するMET×MET二特異性抗体の効果を評価した。U118-MGグリア芽腫異種移植片モデルは、オートクラインのHGFシグナル伝達により誘導される。500万個のU118-MGヒトグリア芽腫細胞(Olopade et al.,Cancer Research 52:2523-2529,1992)を、CB-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約100mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体またはMET x MET二特異性抗体(H4H14639D)を用いて治療した。各マウスには、週に二回、25mg/kgの抗体(対照またはMET X MET)が投与sれた。移植後72日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
別の実験では、マウスに皮下移植されたU118-MGグリア芽腫腫瘍を、25mg/kgの対照抗体、一価MET抗体、またはMET×MET二特異性抗体を用いて週に2回治療した。各実験群について、経時的に腫瘍体積(mm3)を測定した。結果を図18に示す。この結果から、MET x MET二特異性抗体が、U118-MG腫瘍の増殖を阻害することが示される。
実施例21:メイタンシノイドの合成
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-アジポイル-コハク酸塩(図20の化合物1)を、化合物2(図19)から以下に記載されるように合成した。
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-アジポイル-コハク酸塩(図20の化合物1)を、化合物2(図19)から以下に記載されるように合成した。
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-Fmoc-N-Me-ベータ-アラニン(化合物3、図19)。デス-アセチル-メイタンシン(化合物2、図19、0.433g、0.666mmol)、Fmoc-N-Me-ベータ-Ala(0.434g、1.33mmol)、およびHATU(0.757g、1.99mmol)を乾燥したフラスコに計り取り、無水DMF(9mL)に溶解させ、4-メチルモルホリン(0.300mL、2.73mmol)で処理した。フラスコをゴム隔膜で密封し、アルゴンでパージして、反応物を周囲温度で攪拌した。3日後、混合物を蒸発させて油状物を得て、アセトニトリルおよび水に溶解させ、275gのC18シリカカラム上のフラッシュクロマトグラフィー(20分間で30~90%のアセトニトリル水溶液、両方の相で0.05%酢酸)により精製した。生成画分の凍結乾燥により、白色固形物として表題化合物を得た。粗生成物を、80gのシリカゲルカラム(17分かけてEtOAc-5:5:1のEtOAc:DCM:MeOH)で精製した。純粋な画分を一つにまとめ、蒸発させ、真空中で一晩乾燥させて、白色固形物として表題化合物を得た(0.424g、66%)。MS(ESI、pos.):C51H61ClN4O12の計算値956.4;実測値956.9(M+H)、979.0(M+Na),939.0(M-H2O+H)。
N-tert-ブトキシカルボニル-N-メチル-ベータ-アラニンコハク酸エステル(化合物4、図19)。表題化合物を、当分野で公知の方法(Widdison et al.,J.Med.Chem.,2006,49(14),4401を参照)により、市販のBoc-N-Me-ベータ-Ala-OHから調製した。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.62(bm,2H),2.88(m,9H),1.47(s,9H)。
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-Boc-N-Me-ベータ-アラニン(化合物5、図19)。方法A:上述の工程の生成物(化合物4、図19、0.453g、1.51mmol)およびデス-アセチル-メイタンシン(化合物2、図19、0.304g、0.468mmol)を、3:1のアセトニトリル:水(8mL)に溶解し、1MのNaHCO3水溶液(0.5mL)で処理し、18時間、周囲温度で攪拌した。TLCにより判定して反応が完了したら、その後ブラインで10分間攪拌し、酢酸エチル(EtOAc)で三回抽出した。次いで一つにまとめた有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮して真空中で乾燥させて金色のシロップを得て、20gのシリカゲルカートリッジでのフラッシュカラムクロマトグラフィー(EtOAc中、15分かけて0~10% MeOH)により精製し、白色固形物として表題化合物を得た(0.084g、43%)。MS(ESI、pos.):C41H59ClN4O12の計算値834.4;実測値835.2(M+H)、857.2(M+Na),817.4(M-H2O+H)。
方法B:Boc-N-Me-ベータ-Ala-OH(0.294g、1.45mmol)を無水DMF(5mL)中に溶解し、ペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィン酸塩(FDPP、0.555g、1.44mmol)で処理し、反応物を周囲温度で30分間攪拌した。次いで混合物を、デス-アセチル-メイタンシン(化合物2、図19、0.462g、0.711mmol)とジイソプロピルエチルアミン(DIEA、0.250mL、1.44mmol)の無水DNF(7mL)溶液を含有する大きなフラスコへと移し、ゴム隔膜でフラスコを密閉して、アルゴンでパージし、反応物を周囲温度で再び攪拌した。24時間後、反応物を真空中で濃縮して油状物を得て、酢酸エチル(EtOAc、2mL)中に溶解し、40gのシリカゲルカートリッジ(15分かけてEtOAc-5:5:1のEtOAc/DCM/MeOH)上で精製して、淡黄色固形物として表題化合物を得た(0.468g、79%)。MS(ESI、pos.):C41H59ClN4O12の計算値834.4;実測値857.2(M+Na),817.2(M-H2O+H)。
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン(化合物6、図19)。方法A:メイタンシン-N-Me-L-Ala-Boc-N-Me-ベータ-Ala(化合物5、図19、0.464g、0.555mmol)を、アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸の3:1:1混合液(7mL)中に溶解し、フラスコをゴム隔膜で密封し、アルゴンでパージした。反応物を周囲温度で24時間攪拌して、その後に蓋をして-20℃で3日間保存した。粗反応混合物を周囲温度まで2時間加温し、真空中で短時間濃縮し、100gの C18 RediSep Goldカラム(25分かけて、20%~80%のアセトニトリル水溶液、両溶媒中、0.1%TFA)で精製し、一つにまとめた純画分を周囲温度で部分的に蒸発させ、ドライアイス浴中で凍結し、凍結乾燥させて、淡黄色固形物として表題化合物を得た(0.295g、63%)。MS(ESI、pos.):C36H51ClN4O10の計算値734.3;実測値735.7(M+H),1471.3(2M+H)。
方法B:メイタンシン-N-Me-L-Ala-Fmoc-ベータ-Ala(化合物3、図19、0.422g、0.441mmol)5%ピペリジンのDMF溶液中に溶解し(6.00mL、3.04mmol)、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。3時間後、反応をLCMSにより完了させ、真空中で濃縮し、密封して、-20℃で一晩保存した。粗生成物を周囲温度まで加温し、アセトニトリルおよび10%酢酸水溶液(3mLずつ)で処理し、275gのC18シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー(20分かけて10~90%のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に0.05% 酢酸)により精製した。生成画分の凍結乾燥により、白色固形物として表題化合物を得た。固形物を無水ジエチルエーテルで三回粉末化し、濾過して、DCMを用いて固形物からフリットを洗い流し、濾液を蒸発させ、真空中で乾燥させて、白色固形物として表題化合物を得た(0.311g、89%)。MS(ESI、pos.):C36H51ClN4O10の計算値734.3;実測値735.0(M+H)。
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-Fmoc(化合物7、図20)。工程1:上述の工程の生成物(化合物6、図19、0.310g、0.390mmol)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAT、0.164g、1.20mmol)、重炭酸ナトリウム(0.138g、1.64mmol)、およびFmoc-バリン-シトルリン-(p-アミノ)ベンジル-(p-ニトロフェニル)炭酸塩(0.595g、0.776mmol、当分野に公知の方法により調製された。Gangwarらの米国特許第7,714,016 B2号を参照のこと)を、無水DMF(10mL)に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。24時間後、反応物を真空中でおよそ2~3mLまで部分的に蒸発させ、10%の酢酸水溶液および水(それぞれ約1mL)で処理し、アセトニトリル(約6mL)に溶解し、275gのC18シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー(20分かけて、30~90%のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に0.05%酢酸)により精製した。部分蒸発、凍結、および凍結乾燥により、白色固形物として表題化合物を得た(0.362g、68%)。MS(ESI、pos.):C70H88ClN9O17の計算値 1361.6;実測値 1362.1(M+H),1384.1(M+Na),1344.1(M-H2O+H)。
工程2:上述の工程の生成物(0.360g、0.264mmol)を5% ピペリジンのDMF(7mL)溶液に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。3時間後、反応物を真空中で蒸発させ、残留物を10%の酢酸水溶液(2mL)で処理し、アセトニトリル(4mL)に溶解し、275gのC18シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー(20分かけて、10~70%のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に0.05%酢酸)により精製した。純画分を一つにまとめ、-20℃で一晩保存し、真空中、25~30℃で部分的に蒸発させてドライアイス上で凍結させ、6日間凍結乾燥させて淡黄色固形物として表題化合物を得た(0.303g、95%)。MS(ESI、pos.):C15H78ClN9O15の計算値1139.5;実測値1140.1(M+H),1162.0(M+Na)。
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-アジピン酸(化合物8、図20)。上述の工程の生成物(化合物7、図20、0.205g、0.171mmol)、アジピン酸(0.258g、1.77mmol)、および2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ、0.215g、0.869mmol)を無水DCM(10mL)および無水メタノール(5mL)に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。21時間後、反応物を真空中で蒸発させ、残留物を数ミリリットルのアセトニトリル/水に溶解し、150gのC18シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー(17分かけて、20~80%のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に0.05%酢酸)により精製した。純画分を18時間、部分蒸発、凍結、および凍結乾燥することにより、白色固形物として表題化合物を得た(0.140g、65%)。MS(ESI、pos.):C61H86ClN9O18の計算値1267.6;実測値1268.9(M+H),1290.9(M+Na)。
メイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-アジポイル-コハク酸塩(化合物1、図20)。上述の工程の生成物(化合物8、図20、0.061g、0.048mmol)、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.063g、0.55mmol)、およびN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC-HCl、0.071g、0.37mmol)を無水DCM(7mL)中に溶解し、反応フラスコをゴム隔膜で密封してアルゴンでパージし、混合物を周囲温度で攪拌した。5日後、反応物を真空中で蒸発させ、残留物を数ミリリットルのアセトニトリル/水に溶解し、100gのC18シリカカラムでのフラッシュクロマトグラフィー(15分かけて、30~90%のアセトニトリル水溶液、両方の溶媒中に0.05%酢酸)により精製した。最も清浄化された生成物画分を18時間、部分蒸発、凍結、および凍結乾燥することにより、白色固形物として表題化合物を得た(0.044g、67%)。MS(ESI、pos.):C65H89ClN10O20の計算値1364.6;実測値1365.7(M+H),1387.7(M+Na),1347.7(M-H2O+H)。1H-NMR(500MHz;CDCl3):δ7.56(d,J=8.3Hz,2H),7.20(d,J=8.7Hz,1H),6.80(s,1H),6.71(m,1H),6.62(d,J=10.0Hz,1H),6.39(dd,J=15.1,11.3Hz,1H),5.68(dd,J=15.3,9.1Hz,1H),5.38-5.32(m,1H),5.03(t,J=15.1Hz,1H),4.88(d,J=12.3Hz,1H),4.73(d,J=11.3Hz,1H),4.61(dd,J=9.1,3.6Hz,1H),4.26(d,J=7.0Hz,1H),4.17(t,J=7.1Hz,1H),3.95(s,3H),3.61(d,J=11.7Hz,1H),3.57(d,J=12.4Hz,1H),3.46(d,J=9.1Hz,2H),3.33(s,3H),3.27(t,J=6.9Hz,1H),3.17-3.07(m,5H),2.97(dd,J=16.6,9.9Hz,1H),2.88(d,J=11.7Hz,3H),2.84(s,4H),2.77(s,2H),2.66(s,2H),2.62(t,J=4.8Hz,2H),2.56(d,J=13.1Hz,1H),2.32(t,J=6.6Hz,2H),2.15(d,J=14.0Hz,1H),2.10(q,J=6.8Hz,1H),1.92(s,4H),1.75(m,5H),1.61(s,3H),1.52(s,3H),1.27(d,J=6.3Hz,3H),1.22(dt,J=12.7,6.3Hz,6H),0.95(t,J=5.9Hz,7H),0.78(s,3H)。
DM1は、WO2015/031396(例えば、実施例2の段落[0106])に記載される手順に基づいて、単一のジアステレオマーとして合成された。当該文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
実施例22.抗体結合体および結合体の特徴解析
抗体結合体
抗体結合体
50mM HEPES、150mM NaCl、pH8.0、および10-15%(v/v)DMA中、抗体(H4H14639D、H4H13312P、H4H14635D、およびアイソタイプ対照;10~20mg/ml)を、実施例21に記載されるように調製されたSMCC-DM1ジアステレオマーの5~6倍過剰量(メイタンシノイドA)、またはメイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-アジポイル-コハク酸塩(化合物1、図20)(メイタンシノイドB)の5~6倍過剰量と、周囲温度で2時間結合させた。結合体は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは広域限外濾過により精製し、滅菌濾過した。タンパク質濃度は、UVスペクトル分析によって決定された。使用された全ての結合体が90%を超える単量体であったサイズ排除HPLCが確立され、そして非結合リンカー搭載物が1%未満となったRP-HPLCが確立された。すべての結合抗体は、Hamblett et al.(American Association for Cancer Research.2004 Oct 15;10(20):7063-70)に従い、リンカー搭載物の担持量に関してUVにより、および/または質量差により、結合と非結合を比較して分析された。搭載物と抗体の比率は、表24に報告する。
液体クロマトグラフィー-質量分析法による結合体の特徴解析
抗体上のリンカー-搭載物の担持量を判定するために、結合体を脱グリコシル化し、LC-MSにより分析した。
抗体上のリンカー-搭載物の担持量を判定するために、結合体を脱グリコシル化し、LC-MSにより分析した。
このアッセイについて、50μgの結合体をミリQ水で希釈し、1mg/mLの最終濃度とした。10μLのPNGase F溶液[PNGase F溶液は、150μLのPNGase Fストック(New England Biolabs社、カタログ番号P0704L)および850μLのミリQ水を加えて、よく混合することにより調製された]を希釈結合体溶液に加え、次いで37℃で一晩インキュベートした。各サンプルの5μLをLC-MS(Waters Synat G2-Si)上に注入し、25分かけて0.1mL/分の勾配移動相 20~40%で溶出させた(移動相A:H2O中、0.1% v/v、移動相B:アセトニトリル中、0.1% v/v FA)。LC分離は、Waters Acquity BEH C4カラム(1.0 X 50mM、1.7μM)で80℃で実施された。
質量分析スペクトルは、Masslynxソフトウェアを使用してデコンボリューションされ、薬剤と抗体の比率(DAR)は、以下の方程式を使用して計算された:
1.分布ピーク強度(PI)による薬剤(Dn)の相対割合(%):
Dn%=PIn/Σ(PI0+PI1+PI2…….+PIi)×100
(n=0,1,2,3,…,i)
2.平均DARの計算:
DAR=Σ(1×D1%+2×D2%+3×D3%+……+i×Di%)
1.分布ピーク強度(PI)による薬剤(Dn)の相対割合(%):
Dn%=PIn/Σ(PI0+PI1+PI2…….+PIi)×100
(n=0,1,2,3,…,i)
2.平均DARの計算:
DAR=Σ(1×D1%+2×D2%+3×D3%+……+i×Di%)
実施例23.ヒトモノクローナル抗MET(一特異性および二特異性)抗体の表面プラズモン共鳴から導かれた結合アフィニティおよび速度定数
MCC-DM1ジアステレオマー(メイタンシノイドA)、またはメイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-アジポイル-コハク酸塩(化合物1、図20)(メイタンシノイドB)のいずれかと結合された抗MET抗体へのMET結合に対する平衡解離定数(KD値)は、Biacore 2000装置でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定された。Biacoreセンサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトFc抗体(GE Healthcare社、# BR-1008-39)とのアミンカップリングを行うことにより誘導体化して、ヒト定常領域を含み発現される抗MET ADCと親非改変抗体を捕捉した。Biacore結合実験は、HEPES緩衝生理食塩水(HBS)-EPランニング緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)中で実施された。C末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグを発現するヒトMET(hMET-mmh)が社内で調製された。HBS-EPランニング緩衝液中で調製された、様々な濃度(3倍希釈)のhMET-mmh(30nM~1.1nMの範囲)を、抗MET ADCまたは抗体捕捉表面上に40μL/分の流量で注入した。hMET-mmhと、捕捉ADCおよびモノクローナル抗体の各々への結合は、4分間モニタリングされた。続いて、HBS-EPランニング緩衝液中で6分間、hMET-mmhの解離がモニタリングされた。抗ヒトFc表面は20mM H3PO4の短時間注入により再生された。すべての結合動態実験は、25℃で実施された。
MCC-DM1ジアステレオマー(メイタンシノイドA)、またはメイタンシン-3-N-メチル-L-アラニン-N-Me-ベータ-アラニン-カルバミル-(p-アミノ)ベンジル-シトルリン-バリン-アジポイル-コハク酸塩(化合物1、図20)(メイタンシノイドB)のいずれかと結合された抗MET抗体へのMET結合に対する平衡解離定数(KD値)は、Biacore 2000装置でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定された。Biacoreセンサー表面を、モノクローナルマウス抗ヒトFc抗体(GE Healthcare社、# BR-1008-39)とのアミンカップリングを行うことにより誘導体化して、ヒト定常領域を含み発現される抗MET ADCと親非改変抗体を捕捉した。Biacore結合実験は、HEPES緩衝生理食塩水(HBS)-EPランニング緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v Surfactant P20)中で実施された。C末端myc-myc-ヘキサヒスチジンタグを発現するヒトMET(hMET-mmh)が社内で調製された。HBS-EPランニング緩衝液中で調製された、様々な濃度(3倍希釈)のhMET-mmh(30nM~1.1nMの範囲)を、抗MET ADCまたは抗体捕捉表面上に40μL/分の流量で注入した。hMET-mmhと、捕捉ADCおよびモノクローナル抗体の各々への結合は、4分間モニタリングされた。続いて、HBS-EPランニング緩衝液中で6分間、hMET-mmhの解離がモニタリングされた。抗ヒトFc表面は20mM H3PO4の短時間注入により再生された。すべての結合動態実験は、25℃で実施された。
Scrubber2.0c曲線適合ソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサグラムを1:1結合モデルに適合させることによって、結合速度(ka)および解離速度(kd)定数を決定した。すべてのセンサグラムは、対応する分析物のセンサグラムから緩衝液注入センサグラムのシグナルを差し引くことにより二重参照され、これにより捕捉表面から抗体が解離することにより生じるアーチファクトが除去される。結合解離平衡定数(KD)および解離半減期(t1/2)を、反応速度定数から以下のように計算した:
実施例24:抗MET抗体薬剤結合体(ADC)のインビトロでの有効性
本明細書に記載される抗MET抗体薬剤結合体(ADC)の相対的な細胞殺傷の有効性を判定するために、様々なレベルの内因性METを発現する複数の細胞株に対し、細胞殺傷アッセイを実施した。EBC-1(Riken Cell Bank;#RBRC-RCB1965)細胞株、MKN-45(JCRB;#JCRB0254)細胞株、NCI-H1993(ATCC;#CRL-5909)細胞株、およびJ.RT3(ATCC;#TIB-153)細胞株は、RPMI+10% FBS+1X ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(P/S/G)中で維持された。SNU-5(ATCC;#CRL-5973)細胞株は、Iscove’s + 10% FBS+1X P/S/G中で維持された。Hs746t(ATCC;#HTB-135)細胞株とHEK293(ATCC;# 003041)細胞株は、DME+10% FBS+1X P/S/G中で維持された。MDA-MB-231(ATCC;#HTB-26)細胞株は、Liebowitz’s L-15+10% FBS+1X P/S/G+1X 非必須アミノ酸(NEAA)中でCO2を用いずに維持された。U87MG(ATCC;# HTB-14)細胞株は、MEM Earle’s Salts+15% FBS+1X P/S/G+1X NEAA中で維持された。T47D(ATCC;#HTB-133)細胞株は、RPM1 1640 + 10% FBS + 1X P/S/G+10mM HEPES+1mM ピルビン酸ナトリウム + 10 ug/ml ウシインスリン中で維持された。A549(ATCC;# CCL-185)細胞株は、Kaighn’s Nutrient Mixture F-12(HAM’s F-12K)+10% FBS+1X P/S/G中で維持された。
本明細書に記載される抗MET抗体薬剤結合体(ADC)の相対的な細胞殺傷の有効性を判定するために、様々なレベルの内因性METを発現する複数の細胞株に対し、細胞殺傷アッセイを実施した。EBC-1(Riken Cell Bank;#RBRC-RCB1965)細胞株、MKN-45(JCRB;#JCRB0254)細胞株、NCI-H1993(ATCC;#CRL-5909)細胞株、およびJ.RT3(ATCC;#TIB-153)細胞株は、RPMI+10% FBS+1X ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(P/S/G)中で維持された。SNU-5(ATCC;#CRL-5973)細胞株は、Iscove’s + 10% FBS+1X P/S/G中で維持された。Hs746t(ATCC;#HTB-135)細胞株とHEK293(ATCC;# 003041)細胞株は、DME+10% FBS+1X P/S/G中で維持された。MDA-MB-231(ATCC;#HTB-26)細胞株は、Liebowitz’s L-15+10% FBS+1X P/S/G+1X 非必須アミノ酸(NEAA)中でCO2を用いずに維持された。U87MG(ATCC;# HTB-14)細胞株は、MEM Earle’s Salts+15% FBS+1X P/S/G+1X NEAA中で維持された。T47D(ATCC;#HTB-133)細胞株は、RPM1 1640 + 10% FBS + 1X P/S/G+10mM HEPES+1mM ピルビン酸ナトリウム + 10 ug/ml ウシインスリン中で維持された。A549(ATCC;# CCL-185)細胞株は、Kaighn’s Nutrient Mixture F-12(HAM’s F-12K)+10% FBS+1X P/S/G中で維持された。
最初に、フローサイトメトリーにより細胞株パネルの全体にわたる、相対的な抗MET抗体の結合を、非結合のH4H14635D抗体、H4H14639D抗体、およびH4H13312P2抗体を用いて評価した。簡潔に述べると、1×106個の細胞を、PBS+2% FBS(FACS緩衝液)中、氷上で30分間、10μg/mlのH4H14635D、H4H14639D、H4H13312P2、またはアイソタイプ対照抗体(REGN1945)とともにインキュベートした。FACS緩衝液で1回洗浄した後、細胞を、氷上で30分間、10μg/mLのAlexa647結合抗ヒト二次抗体(Jackson ImmunoResearch社、#109-606-170)とともにインキュベートした。FACS緩衝液でさらに1回洗浄した後、サンプルを、Cytofix(BD Biosciences社、#554655)を用いて固定し、FACS緩衝液でろ過して、iQueフローサイトメーター(Intelicyte社)でフローサイトメトリーを実施した。平均蛍光強度(MFI)データは、FlowJoソフトウェア(FlowJo LLC)を使用して決定した。FACS結合は、アイソタイプ対照のレベルを超えるMFI結合の倍率として表され、結果を表26に要約する。三種の抗Met抗体の相対的結合は各細胞株に対して同等であり、アイソタイプ対照の447倍~7倍の範囲であった。T47D細胞、HEK293細胞、またはJ.RT3細胞に対しては、試験された3種の抗MET抗体のいずれの結合も検出されなかった。
抗MET ADCのインビトロでの細胞傷害性を測定するために、ADCを用いた3日間または6日間の処置後の核数を評価した。簡潔に述べると、細胞を、96ウェルのコラーゲン被覆プレート(Greiner社、VWR、#82050-812)に、750~3000細胞/ウェルで、完全増殖培地中に播種し、37℃、5%CO2で一晩増殖させた。細胞生存率曲線については、連続希釈されたADC、非結合抗体、または遊離搭載物を、100nM~0.01nMの範囲の最終濃度(毒素濃度に基づく)で細胞に添加し、37℃、5%CO2で3日間または6日間インキュベートした。続いて細胞を、4%ホルムアルデヒドで固定しながら、3μg/mlのHoechst 33342核染色(Invitrogen社、#H3570)で処理した。ImageXpress micro XL(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)上で画像を取得し、MetaXpress画像解析ソフトウェア(Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール)により核数を決定した。40nMのジギトニンで処理された細胞のバックグラウンドの核数を、全てのウェルから引き算し、生存率は未処理対照のパーセンテージ(生存率%)として表した。IC50値は、10点の応答曲線にわたる4パラメータロジスティック方程式から決定された(GraphPad Prism)。各用量応答性曲線に対する未処置条件も分析に含まれており、最小用量として表されている。IC50値および細胞殺傷割合%を表27および表28に示す。
表27に要約されるように、抗MET抗体-薬剤結合体のH4H14639D-メイタンシノイドAは、Met増幅されたEBC-1、SNU-5、MKN-45、NCI-H1993、およびHs746t細胞の状況下で、0.35nM~0.96nMの範囲のIC50値で細胞生存率を特異的に減少させた。殺傷細胞の割合(最大殺傷の割合%)は、73%~100%の範囲であった。H4H14639D-メイタンシノイドAはさらに、A549細胞の84%を特異的に殺傷し、IC50値は13.91nMであった。低発現細胞株(MDA-MB-231、およびU87MG)、および非発現細胞株(T47D、HEK293、およびJ.RT3)において、H4H14639D-メイタンシノイドAのIC50値は、37nMよりも高かった。類似の結合型アイソタイプ対照抗体は、すべての細胞株を殺傷し、IC50値は35nMよりも高かった。DM1(MeS-DM1)のメチルジスルフィド型は、全ての検証された細胞株を殺傷し、IC50値は、0.07nM~2.86nMの範囲であった。
別の実験では、三種の抗Met抗体(H4H14639D、H4H14635D、およびH4H13312P2)をメイタンシノイドA搭載物またはメイタンシノイドB搭載物に結合させ、6日間の処理後にEBC-1、Hs746t、A549、T47D細胞においてインビトロでの細胞傷害性を評価した。表28に要約されるように、すべての抗Met抗体-薬剤結合体は、Met陽性細胞において強力かつ特異的に細胞生存率を低下させ、EBC-1細胞でのIC50値は10pM、Hs746t細胞では0.82nM、A549細胞では3.5nMもの低さであった。殺傷された細胞の割合は、EBC-1細胞では95%よりも高く、Hs746t細胞では86%よりも高く、そしてA549細胞では72%よりも高かった。T47D細胞(Met陰性)は、抗Met ADCによって特異的に殺傷されなかった。類似の結合型アイソタイプ対照抗体は、検証された全ての細胞株において細胞生存率を低下させ、IC50値は、EBC-1細胞では5nMよりも高く、Hs746t細胞では33nMよりも高く、A549細胞とT47D細胞では90nMよりも高かった。非結合型のH4H14639Dは、EBC-1細胞、Hs746t細胞、およびA549細胞において細胞生存率を低下させたが、結合抗体よりも低い割合であった。非結合型のH4H14635DおよびH4H13312P2は、検証された細胞株のいずれにおいても生存率にほとんど影響を与えず、または全く影響を与えなかった。DM1(MeS-DM1)のメチルジスルフィド型は、全ての検証された細胞株を殺傷し、IC50値は、0.12nM~1.39nMの範囲であった。対照的に、M24(メイタンシノイドBから放出される搭載物)は、100nMよりも高いIC50で細胞を殺傷した。
実施例25 胃癌細胞に対するインビボ有効性
300万個のHs746T胃癌細胞を、C.B.-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約150mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドB、10mg/kgのREGN1945-メイタンシノイドA、または3もしくは10mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドAまたはH4H14639D-メイタンシノイドBで治療した。すべての抗体を、週に1回の頻度で3回投与した。移植後37日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
300万個のHs746T胃癌細胞を、C.B.-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約150mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドB、10mg/kgのREGN1945-メイタンシノイドA、または3もしくは10mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドAまたはH4H14639D-メイタンシノイドBで治療した。すべての抗体を、週に1回の頻度で3回投与した。移植後37日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスにおいて、ヒト腫瘍異種移植片の増殖に対するH4H14639D-メイタンシノイドAまたはH4H14639D-メイタンシノイドBの効果を評価し、その結果を表29に示す。対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドBまたはREGN1945-メイタンシノイドAで治療された腫瘍は、20日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した。H4H14639D-メイタンシノイドAを3mg/kgで治療された腫瘍は、27日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した。実験期間中、3mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドBで治療された腫瘍の増殖は阻害された。10mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドA、またはH4H14639D-メイタンシノイドBを用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して腫瘍サイズの退縮を誘導した。
実施例26:肺癌細胞に対するインビボ有効性
500万個のEBC1肺癌細胞を、C.B.-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約170mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドBを15mg/kg、またはH4H14639D-メイタンシノイドBを2.5、5、10、もしくは15mg/kgで用いて治療した。抗体は、週に1回の頻度で2回投与した。移植後73日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
500万個のEBC1肺癌細胞を、C.B.-17 SCIDマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約170mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドBを15mg/kg、またはH4H14639D-メイタンシノイドBを2.5、5、10、もしくは15mg/kgで用いて治療した。抗体は、週に1回の頻度で2回投与した。移植後73日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍異種移植片の増殖に対するH4H14639Dの効果を評価した。対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドBで治療された腫瘍は、24日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した(IACUCプロトコールは、直径2cmを超え、およそ1500mm3の腫瘍を担持する動物の犠牲を要求する)。2.5、5、10、または15mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドBを用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して腫瘍サイズの退縮を誘導した。結果を表30に示す。
実施例27:患者由来のNSCLC腫瘍に対するインビボ有効性
Met発現NSCLC CTG-0165の患者由来腫瘍を、nu/nu Nudeマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約150mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドB、10mg/kgのREGN1945-メイタンシノイドA、または3もしくは10mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドAまたはH4H14639D-メイタンシノイドBで治療した。すべての抗体を、週に1回の頻度で3回投与した。移植後61日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
Met発現NSCLC CTG-0165の患者由来腫瘍を、nu/nu Nudeマウスの側腹に皮下移植した。腫瘍体積が約150mm3に達した時点で、マウスを6群に無作為化し、対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドB、10mg/kgのREGN1945-メイタンシノイドA、または3もしくは10mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドAまたはH4H14639D-メイタンシノイドBで治療した。すべての抗体を、週に1回の頻度で3回投与した。移植後61日間、腫瘍増殖をモニタリングした。
免疫不全マウスにおいて、ヒト腫瘍異種移植片の増殖に対するH4H14639D-メイタンシノイドAまたはH4H14639D-メイタンシノイドBの効果を評価した。対照抗体のREGN1945-メイタンシノイドAまたはREGN1945-メイタンシノイドBで治療された腫瘍は、27日以内にプロトコールのサイズ限界に達するまで増殖した。3mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドAまたはH4H14639D-メイタンシノイドBで治療された腫瘍の増殖は、27日間、阻害された。10mg/kgのH4H14639D-メイタンシノイドA、またはH4H14639D-メイタンシノイドBを用いた腫瘍の治療は、治療開始時と比較して腫瘍サイズの退縮を誘導した。データを表31に提示する。
実施例28:水素/重水素(H/D)交換に基づいたエピトープマッピング。ヒトMETに結合する抗MET抗体のH4H13312P2、H4H13306P2、およびH4H14639Dのエピトープマッピング
ヒト肝細胞増殖因子受容体外部ドメイン(配列番号155:myc-myc-ヘキサヒスチジン(.mmh)タグとともに発現されるヒトMetアイソフォーム1(Uniprot ID:P08581。以下、hMetと呼称される)の、抗MET抗体のH4H13312P2、H4H13306P2、およびH4H14639Dが相互作用する特異的領域を決定するための実験を実施した。H4H13312P2およびH4H13306P2は二価-一特異性抗MET抗体であり、H4H14639Dは、二つの重鎖とユニバーサル軽鎖を含む二特異性抗体であり、当該二つの重鎖はそれぞれH4H13312P2とH4H13306P2に由来するMET上の異なるエピトープに結合する。(実施例5を参照)。
ヒト肝細胞増殖因子受容体外部ドメイン(配列番号155:myc-myc-ヘキサヒスチジン(.mmh)タグとともに発現されるヒトMetアイソフォーム1(Uniprot ID:P08581。以下、hMetと呼称される)の、抗MET抗体のH4H13312P2、H4H13306P2、およびH4H14639Dが相互作用する特異的領域を決定するための実験を実施した。H4H13312P2およびH4H13306P2は二価-一特異性抗MET抗体であり、H4H14639Dは、二つの重鎖とユニバーサル軽鎖を含む二特異性抗体であり、当該二つの重鎖はそれぞれH4H13312P2とH4H13306P2に由来するMET上の異なるエピトープに結合する。(実施例5を参照)。
質量分析法(HDX-MS)を用いた水素/重水素(H/D)交換エピトープマッピングを利用して、上述の抗体の結合エピトープを決定した。HDXの概要説明は、例えば、Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259;およびEngen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A~265Aに記載されている。
実験手順
HDXを介して、抗Met抗体のH4H13312P2、H4H13306P2、およびH4H14639DのhMET上の結合エピトープをマッピングするために、個々の抗体を、NHS活性化されたSepharose 4 Fast Flowビーズ(GE Healthcare社、ペンシルバニア州ピッツバーグ)に別々に共有結合させた。以下に記載されるように、「オン-抗原」および「オン-複合体」の二つの方法を利用して、抗MET抗体の結合エピトープを確認した。
HDXを介して、抗Met抗体のH4H13312P2、H4H13306P2、およびH4H14639DのhMET上の結合エピトープをマッピングするために、個々の抗体を、NHS活性化されたSepharose 4 Fast Flowビーズ(GE Healthcare社、ペンシルバニア州ピッツバーグ)に別々に共有結合させた。以下に記載されるように、「オン-抗原」および「オン-複合体」の二つの方法を利用して、抗MET抗体の結合エピトープを確認した。
「オン-抗原」実験の条件下では、hMETは、D2Oを用いて調製されたPBS中、5.0分間または10.0分間の重水素化を受けた。重水素化抗原を、短時間のインキュベーションでH4H13312P2抗体またはH4H13306P2抗体に結合させ、次いで氷冷した低pHのクエンチ緩衝液を用いてビーズから溶出させた。溶出したサンプルを、統合オンラインペプチド消化、トラップ、9.0分間の液体クロマトグラフィー(LC)分離、およびSynapt G2-Si MSデータ取得からなるWaters H/DX-MSシステムに手動でローディングした。
「オン-複合体」実験の条件下では、hMETは、最初にH4H13312P2ビーズまたはH4H13306P2ビーズに結合され、その後、D2Oを用いて調製されたPBS中でのインキュベーションを介して5.0分間または10.0分間の重水素化を受けた。重水素化されたhMETを溶出し、上述のようにWaters H/DX-MSシステムによって分析した。
hMETからのペプシン消化ペプチドを特定するために、非重水素化サンプルからのLC-MSEデータを処理して、Waters ProteinLynx Global Server(PLGS)ソフトウェアを使用してヒトMETに対して探索した。特定されたペプチドをDynamX 3.0ソフトウェアにインポートし、以下の二つの基準によりフィルタリングした:1)1アミノ酸当たりの最小生成物が0.3である、2)複製ファイル閾値が3.0である。続いてDynamX 3.0ソフトウェアは、特定されたペプチドの重水素取り込みに関して、5分および10分の両方の重水素時点での「オン-抗原」ならびに「オン-複合体」の間の差異を自動的に計算した。重水素取り込み計算の精度を確保するために、質量中心値の計算のためのDynamXソフトウェアによりピックアップされた各ペプチドの個々の同位体ピークも手動で検証した。
概して、0.2を超える重水素化のデルタ値を、特異的結合エピトープ決定のカットオフ点として使用した。
結果
9.0分間のLC-MSEデータ取得と併せて、Waters Enzymate(商標)BEH Pepsin Column(2.1 x 30 mm、5μm)を介したオンラインのペプシン消化を使用して、ヒトMETから合計で162個のペプシン消化ペプチドを再現性良く特定した。H4H13312P2抗体ビーズを使用したときに、「オン-抗原」と「オン-複合体」の両方の実験に対し、追跡可能な重水素取り込みがあった。これらのペプチドは、55.7%の配列カバー率を表している。これらすべてのペプチドのうち、5個のペプチドのみが、抗原単独の重水素化(オン-抗原)と比較して、H4H13312P2の結合時(オン-複合体)に、重水素化取り込みが有意に減少した。両実験条件下でのこれら五つのペプチドの質量中心値を、表32に図示した。これらの五つのペプチドによってカバーされる192~204残基に対応する領域を、HDXデータに基づいて、H4H13312P2抗体の結合エピトープとして規定した。
9.0分間のLC-MSEデータ取得と併せて、Waters Enzymate(商標)BEH Pepsin Column(2.1 x 30 mm、5μm)を介したオンラインのペプシン消化を使用して、ヒトMETから合計で162個のペプシン消化ペプチドを再現性良く特定した。H4H13312P2抗体ビーズを使用したときに、「オン-抗原」と「オン-複合体」の両方の実験に対し、追跡可能な重水素取り込みがあった。これらのペプチドは、55.7%の配列カバー率を表している。これらすべてのペプチドのうち、5個のペプチドのみが、抗原単独の重水素化(オン-抗原)と比較して、H4H13312P2の結合時(オン-複合体)に、重水素化取り込みが有意に減少した。両実験条件下でのこれら五つのペプチドの質量中心値を、表32に図示した。これらの五つのペプチドによってカバーされる192~204残基に対応する領域を、HDXデータに基づいて、H4H13312P2抗体の結合エピトープとして規定した。
H4H13306P2抗体ビーズを使用して実施されたHDX実験については、hMETに由来する合計で98個のペプシン消化ペプチドが再現性良く特定され、「オン-抗原」と「オン-複合体」の両方の実験中に追跡可能な重水素取り込みがあった。これらの98個のペプチドは、52.1%の配列カバー率を表している。これらすべてのペプチドのうち、12個のペプチドが、抗原単独の重水素化(オン-抗原)と比較して、H4H13306P2の結合時(オン-複合体)に、重水素化取り込みが有意に減少したことが観察された。両実験条件下でのこれら12個のペプチドの質量中心値を、表33に図示した。これらのペプチドによってカバーされる305-315残基および421-455残基に対応する領域を、HDXデータに基づいて、H4H13306P2抗体の結合エピトープとして規定した。
二特異性抗Met抗体のH4H14639Dの結合エピトープを決定するために、上記で概説した方法と同じ方法を使用した。この方法により決定されたhMET上のH4H14639Dの結合エピトープは、親抗体で決定されたエピトープに対応する。
抗Met抗体H4H13312P2の結合エピトープ:AA 192-204:配列番号155のVRRLKETKDGFMF(配列番号156)。
抗Met抗体H4H13306P2の結合エピトープ:AA 305-315:配列番号155のLARQIGASLND(配列番号157)、およびAA 421-455:配列番号155のFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNF(配列番号158)。
実施例29:ブドウ膜メラノーマ細胞株における、MET X MET二特異性抗体ADCCによる細胞増殖の阻害と細胞生存率
二つのメイタンシノイド搭載物のうちの一つに結合された二特異性c-Met抗体のH4H14639Dは、H4H14639D-メイタンシノイドAとH4H14639D-メイタンシノイドBと指定された。これらをブドウ膜メラノーマ細胞株において試験し、当該細胞株のc-Met発現と比較した細胞増殖と細胞生存率に対する効果を判定した。
二つのメイタンシノイド搭載物のうちの一つに結合された二特異性c-Met抗体のH4H14639Dは、H4H14639D-メイタンシノイドAとH4H14639D-メイタンシノイドBと指定された。これらをブドウ膜メラノーマ細胞株において試験し、当該細胞株のc-Met発現と比較した細胞増殖と細胞生存率に対する効果を判定した。
第一の実験では、c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるOMM1.3、Mel202、Mel270、およびMP65を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり1,000細胞で96ウェルプレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。細胞を、0.01nM~100nMでREGN1945、REGN1945-メイタンシノイドA、REGN1945-メイタンシノイドB、H4H14639D、H4H14639D-メイタンシノイドA、およびH4H14639D-メイタンシノイドBの用量を増加させながら7日間処理した。7日後、Emax Plus Microplate Reader(Molecular Devices社)を使用した比色分析アッセイのDojindo Cell Counting Kit 8における、WST-8の低下を測定することにより、相対的な細胞生存率を決定した。
第二の実験では、c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるOMM1.3細胞、ならびにc-Met陰性のOCM3細胞を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり1,000細胞で96ウェルプレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。細胞を、0.3125nM~10nMで、REGN1945、REGN1945-メイタンシノイドB、H4H14639D、およびH4H14639D-メイタンシノイドBの用量を増加させながら処理した。7日後、Emax Plus Microplate Reader(Molecular Devices社)を使用した比色分析アッセイのDojindo Cell Counting Kit 8における、WST-8の低下を測定することにより、相対的な細胞生存率を決定した。
表34~38ならびに図21および図22において、メイタンシノイド搭載物に結合された二特異性c-Met抗体のH4H14639D-メイタンシノイドBが、対照処理と比較して、c-Metタンパク質を発現するブドウ膜メラノーマ細胞の生存率を低下させたことが示される。H4H14639D-メイタンシノイドBは、c-Met陰性細胞株の生存率には影響を及ぼさなかった。図21は、より低いADC濃度での細胞の生存率への影響を対数尺度で示す。H4H14639D-メイタンシノイドAのデータも、図21に示す。非結合型のH4H14639D抗体は、c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞の生存率を有意には低下させなかった。このことから、これら細胞は、生存にためにMetシグナル伝達に依存していないことが示唆される。13種の細胞株を、REGN1945、REGN1945-メイタンシノイドB、H4H14639DおよびH4H14639D-メイタンシノイドBの用量を増加させながら用いて3日にわたり処理した第三の実験のデータを図33に示す。H4H14639D-メイタンシノイドBは、用量依存性にMET発現ブドウ膜メラノーマ細胞株の生存率を低下させ、IC50は1nM未満であった。
実施例30:ブドウ膜メラノーマ細胞において、MET X MET二特異性抗体ADCはアポトーシスを誘導する。
c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株であるOMM1.3およびMel202、ならびにc-Met陰性のOCM3細胞を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり800,000細胞で60mm3プレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。細胞を、1.25nM、2.5nM、または10nMのREGN1945(アイソタイプ対照抗体)、REGN1945-メイタンシノイドA、H4H14639D、またはH4H14639D-メイタンシノイドBで48時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で30分間固定し、4℃で一晩DAPIで染色した。 細胞を顕微鏡スライド上に置き、Cytoseal 40で密封した。アポトーシス細胞を、DAPI蛍光を励起するためのUV光を伴う顕微鏡下で定量した。
c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株であるOMM1.3およびMel202、ならびにc-Met陰性のOCM3細胞を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり800,000細胞で60mm3プレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。細胞を、1.25nM、2.5nM、または10nMのREGN1945(アイソタイプ対照抗体)、REGN1945-メイタンシノイドA、H4H14639D、またはH4H14639D-メイタンシノイドBで48時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で30分間固定し、4℃で一晩DAPIで染色した。 細胞を顕微鏡スライド上に置き、Cytoseal 40で密封した。アポトーシス細胞を、DAPI蛍光を励起するためのUV光を伴う顕微鏡下で定量した。
メイタンシノイド搭載物に結合された二特異性c-Met抗体であるH4H14639D-メイタンシノイドBは、対照処理およびc-Met陰性細胞株(表41を参照)と比較して、用量依存性にc-Metタンパク質を発現するブドウ膜メラノーマ細胞のアポトーシスを有意に誘導した(表39および40を参照)。図23および24も参照のこと。別の実験では、10nMのMETxMET-ADCで48時間処理したとき、c-Met発現細胞株のOMM1.3およびMel202において最大40%までアポトーシスが誘導されたが、OCM3では誘導されなかった(データは示さず)。細胞障害性化合物とc-Met特異的抗体を結合させることにより、ブドウ膜メラノーマを選択的にアポトーシスの標的とすることができる。
実施例31:ブドウ膜メラノーマ細胞において、MET X MET二特異性抗体ADCは細胞サイクルを変化させる
c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株であるOMM1.3およびMel202、ならびにc-Met陰性のOCM3細胞を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり800,000細胞で60mm3プレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。細胞は、未処理で、または10nMのH4H14639D-メイタンシノイドBで1、3、6、24、および48時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、PBSで洗浄し、-20℃で一晩、冷却70%エタノールで固定した。Millipore抗MPM2抗体で2時間インキュベートし、PBSで洗浄して、Alexa Fluor 488(Invitrogen社)と結合されたInvitrogen社の抗マウスIgG中でインキュベートし、再度PBSで洗浄した。次いで細胞を500μg/mlのヨウ化プロピジウムで染色し、4℃で一晩インキュベートした。次いで細胞をセルストレーナーに通し、その後、BD Bioscience LSR IIフローサイトメーターを通過させた。データは、FCS Express 6を使用し、De Novoソフトウェアによって分析された。
c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株であるOMM1.3およびMel202、ならびにc-Met陰性のOCM3細胞を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり800,000細胞で60mm3プレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。細胞は、未処理で、または10nMのH4H14639D-メイタンシノイドBで1、3、6、24、および48時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、PBSで洗浄し、-20℃で一晩、冷却70%エタノールで固定した。Millipore抗MPM2抗体で2時間インキュベートし、PBSで洗浄して、Alexa Fluor 488(Invitrogen社)と結合されたInvitrogen社の抗マウスIgG中でインキュベートし、再度PBSで洗浄した。次いで細胞を500μg/mlのヨウ化プロピジウムで染色し、4℃で一晩インキュベートした。次いで細胞をセルストレーナーに通し、その後、BD Bioscience LSR IIフローサイトメーターを通過させた。データは、FCS Express 6を使用し、De Novoソフトウェアによって分析された。
メイタンシノイド搭載物に結合された二特異性c-Met抗体のH4H14639D-メイタンシノイドBは、6~24時間の処理後、OMM1.3細胞およびMel202細胞(それぞれ図25および26)において有意に有糸分裂停止を誘導したが、OCM3細胞では有糸分裂停止を誘導しなかった(図27)。H4H14639D-メイタンシノイドBで処理されたc-Met発現細胞において、24~48時間の間にSubG1集団の増加があった。このことから、アポトーシスの誘導が示唆されるが、c-Met陰性細胞においてはSubG1集団の増加は見られなかった。表42~44を参照のこと。細胞サイクル解析により、メイタンシノイド搭載物の導入により、c-Met発現細胞株であるOMM1.3とMel202においてのみ有糸分裂停止とその結果としてのアポトーシスが誘導され、c-Met陰性のOCM3細胞株では誘導されなかったことが確認された。
実施例32:ブドウ膜メラノーマ細胞株におけるc-Met発現
ウェスタンブロッティング解析を実施して、いくつかのブドウ膜メラノーマ細胞株ならびに胃癌細胞株および肺癌細胞株においてc-Metタンパク質発現レベルの差異を評価した。
ウェスタンブロッティング解析を実施して、いくつかのブドウ膜メラノーマ細胞株ならびに胃癌細胞株および肺癌細胞株においてc-Metタンパク質発現レベルの差異を評価した。
胃癌細胞株のSNU-5、肺癌細胞株のA549、ならびにブドウ膜メラノーマ細胞株のMel290、92.1、OMM1.3、OMM1、Mel285、Mel202、Mel270、OCM1A、OCM3、MP41、MP65、MP46、およびUM004を含む、様々なレベルのc-Met発現を有する細胞株を、10%FBSを含むRPMI中、1プレート当たり1,000,000細胞で、60mm3プレートに播種し、24時間、37℃、5%CO2でインキュベートした。次いで細胞をトリプシンで収集し、PBSで洗浄し、RIPA緩衝液で溶解した。タンパク質溶解物を、20ウェルのNovex midi gel 4-12%(Invitrogen社)上に流し、次いでPBDF膜にトランスファーした。その後、膜を5%ノンファット粉乳中でブロッキングし、4℃の振とう機上で一晩、c-Met(Cell Signaling社)およびチューブリン(Cell Signaling社)に対する一次抗体でインキュベートし、TBSTで洗浄し、HRPと結合された適切な二次抗体(GE Healthcare社)でインキュベートし、TBSTで洗浄した。ECL HRP基質を膜上に添加し、蛍光画像をFujifilm XA-2 カメラを使用して撮影した。
結果
ブドウ膜メラノーマ細胞株は、例えばGNAQまたはGNA11など、Gタンパク質の変異が一般的に認識されているが、それらはさらに様々なc-Met発現も呈する。図28に示されるように、ブドウ膜メラノーマ細胞株の各々は、OCM1A細胞株およびOCM3細胞株を除き、ある程度のレベルでc-Met受容体を発現するが、これらはBRAFV600E変異細胞である。SNU-5は、c-Metを高度に発現することが知られている陽性対照の胃癌細胞株であり、一方でA549は、c-Metも発現する肺癌細胞株である。
ブドウ膜メラノーマ細胞株は、例えばGNAQまたはGNA11など、Gタンパク質の変異が一般的に認識されているが、それらはさらに様々なc-Met発現も呈する。図28に示されるように、ブドウ膜メラノーマ細胞株の各々は、OCM1A細胞株およびOCM3細胞株を除き、ある程度のレベルでc-Met受容体を発現するが、これらはBRAFV600E変異細胞である。SNU-5は、c-Metを高度に発現することが知られている陽性対照の胃癌細胞株であり、一方でA549は、c-Metも発現する肺癌細胞株である。
実施例33:MET x MET二特異性抗体ADCは、PARP切断およびヒストンH3のリン酸化を誘導する
ウェスタンブロット解析を実施して、H4H14639D-メイタンシノイドBを用いた処理後のいくつかのブドウ膜メラノーマ細胞株における、c-Metタンパク質レベル、PARP切断およびヒストンH3のリン酸化を評価した。
ウェスタンブロット解析を実施して、H4H14639D-メイタンシノイドBを用いた処理後のいくつかのブドウ膜メラノーマ細胞株における、c-Metタンパク質レベル、PARP切断およびヒストンH3のリン酸化を評価した。
c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるOMM1.3細胞およびMel202細胞、ならびにc-Met陰性のOCM3細胞を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり800,000細胞で60mm3プレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。細胞を、未処理で、または0.5nM~10nMで、REGN1945-メイタンシノイドB、H4H14639D、およびH4H14639D-メイタンシノイドBの用量を増加させながら24時間処理した。次いで細胞をトリプシンで収集し、PBSで洗浄し、RIPA緩衝液で溶解した。タンパク質溶解物を、20ウェルのNovex midi gel 4-12%(Invitrogen社)上に流し、次いでPBDF膜にトランスファーした。その後、膜を5%ノンファット粉乳中でブロッキングし、4℃の振とう機上で一晩、PARP(Cell Signaling社)、リン酸化ヒストン-H3(Cell Signaling社)、およびチューブリン(Cell Signaling社)に対する一次抗体でインキュベートし、TBSTで洗浄し、HRPと結合された適切な二次抗体(GE Healthcare社)でインキュベートし、TBSTで洗浄した。ECL HRP基質を膜上に添加し、蛍光画像をFujifilm XA-2 カメラを使用して撮影した。
別の実験では、c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるOMM1.3細胞、ならびにc-Met陰性のOCM3細胞株を、10%FBSを含むRPMI中、1ウェル当たり800,000細胞で60mm3プレートに一晩播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。しかしながらこの実験では、細胞は、未処理で、または10nMのREGN1945-メイタンシノイドB、H4H14639D、およびH4H14639D-メイタンシノイドBを用いて、より長時間の24時間、48時間および72時間で処理された。次いで細胞をトリプシンで収集し、PBSで洗浄し、RIPA緩衝液で溶解した。タンパク質溶解物を、20ウェルのNovex midi gel 4-12%(Invitrogen社)上に流し、次いでPBDF膜にトランスファーした。その後、膜を5%ノンファット粉乳中でブロッキングし、4℃の振とう機上で一晩、c-Met(Cell Signaling社)、PARP(Cell Signaling社)、リン酸化ヒストン-H3(Cell Signaling社)、およびチューブリン(Cell Signaling社)に対する一次抗体でインキュベートし、TBSTで洗浄し、HRPと結合された適切な二次抗体(GE Healthcare社)でインキュベートし、TBSTで洗浄した。ECL HRP基質を膜上に添加し、蛍光画像をFujifilm XA-2 カメラを使用して撮影した。
結果
図29は、H4H14639D-メイタンシノイドBが、処置から24時間後にOMM1.3細胞およびMel202細胞においてPARP切断(アポトーシスのマーカー)を誘導することを示すウェスタンブロットの画像である。REGN1945-メイタンシノイドBとH4H14639DのいずれもPARP切断を誘導しなかった。c-Met陽性細胞株とは異なり、OCM3細胞は、H4H14639D-メイタンシノイドB処理後でもPARP切断を呈さなかった。図29はさらに、H4H14639D-メイタンシノイドBで処理されたOMM1.3細胞およびMel202細胞におけるヒストンH3リン酸化の有意な増加を、REGN1945-メイタンシノイドBおよびH4H14639Dと比較して示しているが、OCM3細胞では増加はなかった。ヒストンH3のリン酸化は有糸分裂中に誘導されるものであり、細胞におけるメイタンシノイド誘導性の有糸分裂停止の証拠である。図29では、ヒストンH3のリン酸化は、c-Met発現細胞(OMM1.3およびMel202)にのみ見られ、OCM3では見られなかった。これは、c-Met抗体により細胞内にメイタンシノイドが輸送された証拠である。このデータは、c-Met ADCの特異性と有効性をさらに実証する。
図29は、H4H14639D-メイタンシノイドBが、処置から24時間後にOMM1.3細胞およびMel202細胞においてPARP切断(アポトーシスのマーカー)を誘導することを示すウェスタンブロットの画像である。REGN1945-メイタンシノイドBとH4H14639DのいずれもPARP切断を誘導しなかった。c-Met陽性細胞株とは異なり、OCM3細胞は、H4H14639D-メイタンシノイドB処理後でもPARP切断を呈さなかった。図29はさらに、H4H14639D-メイタンシノイドBで処理されたOMM1.3細胞およびMel202細胞におけるヒストンH3リン酸化の有意な増加を、REGN1945-メイタンシノイドBおよびH4H14639Dと比較して示しているが、OCM3細胞では増加はなかった。ヒストンH3のリン酸化は有糸分裂中に誘導されるものであり、細胞におけるメイタンシノイド誘導性の有糸分裂停止の証拠である。図29では、ヒストンH3のリン酸化は、c-Met発現細胞(OMM1.3およびMel202)にのみ見られ、OCM3では見られなかった。これは、c-Met抗体により細胞内にメイタンシノイドが輸送された証拠である。このデータは、c-Met ADCの特異性と有効性をさらに実証する。
図30は、H4H14639D-メイタンシノイドBで処理されたOMM1.3細胞では、時間依存性のPARP切断の誘導があるが、REGN1945-メイタンシノイドBまたはH4H14639Dで処理されたOMM1.3細胞では誘導がなかったことを示す、ウェスタンブロットの画像である。PARPタンパク質は、OCM3細胞において、H4H14639D-メイタンシノイドB処理で影響を受けなかった。さらに、H4H14639D、およびH4H14639D-M114で処置された場合、未処理およびREGN1945-M114と比較して、Metタンパク質の総発現量が減少しており、このことから、抗体またはADCで処理した後の受容体の内在化が示唆される。最後に、H4H14639D-メイタンシノイドBで処理されたOMM1.3細胞において、(REGN1945-メイタンシノイドBで処理された場合、またはH4H14639Dで処理された場合と比較して)、ヒストンH3リン酸化の有意な増加があったが、やはりOCM3細胞では増加は観察されなかった。
結論として、例示的な二特異性抗c-Met抗体であるH4H14639D抗体は、当該受容体を発現する細胞において、c-Metを特異的に標的とする。この抗体をメイタンシノイドと結合させることにより(H4H14639D-メイタンシノイドB)、c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞株においてアポトーシスを特異的かつ強力に誘導することができる。
実施例34:MET x MET二特異性抗体ADCは、c-Met発現ブドウ膜メラノーマ細胞の浸潤を阻害する
c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるOMM1.3を、以下の処理を伴い、0.1%FBS含有RPMI中、1インサート当たり120,000個の細胞で、24ウェルプレートに配置されたマトリゲルインサートに一晩播種した:未処置対照、125pM、250pMおよび500pMのR1945、R1945-メイタンシノイドB、H4H14639DならびにH4H14639D-メイタンシノイドB。10%FBSと50ng/mlのヒトHGFを含有するRPMIを、化学的誘引物質としてウェル内に入れた。約24時間後、マトリゲルの挿入側から非遊走性細胞で除去した。遊走細胞をメタノールで2分間固定し、1%のトルイジンで2分間染色した。次いでddH2Oで2回洗浄した。その後、乾燥したマトリゲルを顕微鏡スライド上に置き、Cytoseal 60で密封した。Nikon社のTE-2000-U顕微鏡を使用して画像を取得した。
c-Metを発現するブドウ膜メラノーマ細胞であるOMM1.3を、以下の処理を伴い、0.1%FBS含有RPMI中、1インサート当たり120,000個の細胞で、24ウェルプレートに配置されたマトリゲルインサートに一晩播種した:未処置対照、125pM、250pMおよび500pMのR1945、R1945-メイタンシノイドB、H4H14639DならびにH4H14639D-メイタンシノイドB。10%FBSと50ng/mlのヒトHGFを含有するRPMIを、化学的誘引物質としてウェル内に入れた。約24時間後、マトリゲルの挿入側から非遊走性細胞で除去した。遊走細胞をメタノールで2分間固定し、1%のトルイジンで2分間染色した。次いでddH2Oで2回洗浄した。その後、乾燥したマトリゲルを顕微鏡スライド上に置き、Cytoseal 60で密封した。Nikon社のTE-2000-U顕微鏡を使用して画像を取得した。
結果
二特異性c-Met抗体のH4H14639D-メイタンシノイドBは、対照処理(R1945およびR1945-メイタンシノイドB)と比較して、c-Metタンパク質を発現するOMM1.3ブドウ膜メラノーマ細胞の浸潤を250pMから阻害した。また、H4H14639Dで処理された細胞においても、250pMから細胞浸潤の有意な阻害が認められた。しかしながら細胞生存率は、この用量でのH4H14639D-メイタンシノイドBの結合型メイタンシノイド搭載物では影響を受けなかった。図32を参照のこと。
二特異性c-Met抗体のH4H14639D-メイタンシノイドBは、対照処理(R1945およびR1945-メイタンシノイドB)と比較して、c-Metタンパク質を発現するOMM1.3ブドウ膜メラノーマ細胞の浸潤を250pMから阻害した。また、H4H14639Dで処理された細胞においても、250pMから細胞浸潤の有意な阻害が認められた。しかしながら細胞生存率は、この用量でのH4H14639D-メイタンシノイドBの結合型メイタンシノイド搭載物では影響を受けなかった。図32を参照のこと。
本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本発明の様々な改変が、本明細書に記載されるものに加えて、上記の記述および付随する図から、当業者に明らかとなるであろう。そのような改変も、添付される特許請求の範囲内にあることが意図される。
Claims (41)
- 対象において、ブドウ膜メラノーマを治療する方法、ブドウ膜メラノーマの腫瘍増殖を低下させる方法、および/またはブドウ膜メラノーマの退縮を生じさせる方法であって、前記方法は、その必要のある対象に、二特異性抗原結合分子およびサイトトキシンを含む抗体-薬剤結合体(ADC)を投与することを含み、前記二特異性抗原結合分子は、
第一の抗原結合ドメイン(D1)、および
第二の抗原結合ドメイン(D2)を含み、
D1は、ヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、および
D2は、ヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。 - 前記ブドウ膜メラノーマが、METを発現する、請求項1に記載の方法。
- D1は、配列番号58のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、ならびに配列番号138のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む、請求項1に記載の方法。
- D2は、配列番号82のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、ならびに配列番号138のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号58のD1-HCVRアミノ酸配列内のCDR、および配列番号82のD2-HCVRアミノ酸配列内のCDRを含む、請求項1に記載の方法。
- ヒトMETの前記第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含む、請求項1に記載の方法。
- ヒトMETの前記第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む、請求項1に記載の方法。
- ヒトMETの前記第一のエピトープは、配列番号155のアミノ酸192~204を含み、ヒトMETの前記第二のエピトープは、配列番号155のアミノ酸305~315および421~455を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サイトトキシンは、バイオトキシン、化学療法剤、および放射性同位体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記サイトトキシンは、メイタンシノイド、オーリスタチン、トメイマイシン、デュオカルマイシン、225Ac、227Th、およびそれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- ブドウ膜メラノーマ細胞の増殖を阻害する方法、浸潤を阻害する方法、アポトーシスを生じさせる方法、および/または生存率を低下させる方法であって、前記細胞と、二特異性抗原結合分子およびサイトトキシンを含む抗体-薬剤結合体(ADC)とを接触させることを含み、前記二特異性抗原結合分子は、
第一の抗原結合ドメイン(D1)、および
第二の抗原結合ドメイン(D2)を含み、
D1は、ヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、および
D2は、ヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。 - D1は、配列番号58のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号138のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを含む、請求項15に記載の方法。
- D2は、配列番号82のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号138のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを含む、請求項15に記載の方法。
- ブドウ膜メラノーマ細胞の有糸分裂停止を誘導する方法であって、前記細胞と、二特異性抗原結合分子およびサイトトキシンを含む抗体-薬剤結合体(ADC)とをインビボで接触させることを含み、前記二特異性抗原結合分子は、
第一の抗原結合ドメイン(D1)、および
第二の抗原結合ドメイン(D2)を含み、
D1は、ヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、および
D2は、ヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。 - D1は、配列番号58のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号138のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを含む、請求項22に記載の方法。
- D2は、配列番号82のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)と、配列番号138のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを含む、請求項22に記載の方法。
- c-Met発現腫瘍に罹患する対象において、眼癌を治療する方法または転移を阻害する方法であって、前記対象に、
第一の抗原結合ドメイン(D1)、および
第二の抗原結合ドメイン(D2)とを含む二特異性抗原結合分子を投与することを含み、
D1は、ヒトMETの第一のエピトープに特異的に結合し、および
D2は、ヒトMETの第二のエピトープに特異的に結合する、方法。 - 前記眼癌は、ブドウ膜メラノーマ、眼窩リンパ腫、網膜芽細胞腫、および髄様上皮腫からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記対象に、第二の抗癌治療剤を投与することをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- D1とD2は、ヒトMETへの結合に関し、互いに競合しない、請求項29に記載の方法。
- D1は、配列番号58のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、および配列番号138のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを宇組む、請求項29に記載の方法。
- HCDR1は、配列番号60のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号62のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号64のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号140のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、そしてLCDR3は、配列番号144のアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号58のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むLCVR、とを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号58のアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列を含むLCVR、とを含む、請求項35に記載の方法。
- D2は、配列番号82のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域(HCVR)内に三つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、および配列番号138のアミノ酸配列または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域(LCVR)内に三つの軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)とを宇組む、請求項36に記載の方法。
- HCDR1は、配列番号84のアミノ酸配列を含み、HCDR2は、配列番号86のアミノ酸配列を含み、HCDR3は、配列番号88のアミノ酸配列を含み、LCDR1は、配列番号140のアミノ酸配列を含み、LCDR2は、配列番号142のアミノ酸配列を含み、そしてLCDR3は、配列番号144のアミノ酸配列を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号82のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列、または前記配列に対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含むLCVR、とを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記二特異性抗原結合分子は、配列番号82のアミノ酸配列を含むHCVR、および配列番号138のアミノ酸配列を含むLCVR、とを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記二特異性抗原結合分子は、サイトトキシンと結合されて、抗体-薬剤結合体(ADC)を形成し、前記サイトトキシンは、メイタンシノイドである、請求項29に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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