NO340778B1 - Antistoffer med høy affinitet for human IL-6-reseptor, isolert nukleinsyremolekyl, vektor, fremgangsmåte for fremstilling, farmasøytisk sammensetning samt anvendelse - Google Patents

Description

Antistoffer med høy affinitet for human IL-6-reseptor, isolert nukleinsyremolekyl, vektor, fremgangsmåte for fremstilling, farmasøytisk sammensetning samt anvendelse

Redegjørelse for fagfeltet

lnterleukin-6 (IL-6) er et pleiotropisk cytokin som produseres av immun og ikke-immune celler som spiller en viktig rolle i regulering av immunrespons, akutt-fasereaksjoner, og hematopoiesen. Den binder seg til løselige og cellemembranbundet IL-6R (a kjede) som danner et binært kompleks og dette kompleks er i stand til interagere med cellemembranbundet gpl30 (P kjede), og indusere dannelsen av signaleringskompleks som omfatter to av hver av IL-6, IL-6R, og gpl30.

Antistoffer mot WL-6R er beskrevet i US 5,670,373, 5,795,965, 5,817,790, 6,410,691, og EP 409 607B1. Terapeutiske fremgangsmåter er beskrevet i US 5,888,510 og 6,723,319.

FR 2694767 A beskriver IL-6R antistoff med en Kdfor IL-6 reseptoren på 600pM (Tabell 6). US 2005142635 Al omhandler et«reshaped» antistoff til humant IL-6R. EP 0409607 B beskriver antistoffer som spesifikt binder til en human IL-6 reseptor, og en metode for fremstilling av denne. Uchiyama Y. et al. Biol Pharm Bull. 2008, vol.31, no. 6, side 1159-1163 beskriver om tocilizumab, humanisert anti-interleukin-6 reseptor antistoff kan bedre hevelse i ledd ved artritt.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter antistoff eller antigen-bindende fragment av dette, som spesifikt binder human interleukin-6 reseptor (hIL-6R) med en KDpå 500 pM eller mindre, som målt ved overflateplasmonresonans, der de tungkjede CDRene og de lettkjede CDRene omfatter: (i) SEQ ID NO:21, 23 og 25 som hhv. tungkjede CDR1, CDR2 og CDR3 og

SEQ ID NO:29, 31 og 33 som hhv. lettkjede CDR1, CDR2 og CDR3; eller (ii) SEQ ID NO: 149, 151 og 153 som hhv. tungkjede CDR1, CDR2 og CDR3 og

SEQ ID NO:157, 159 og 161 som hhv. lettkjede CDR1, CDR2 og CDR3.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre isolert nukleinsyremolekyl som koder for et antistoff eller antigen-bindende fragment ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også vektor som omfatter nukleotidsekvensen ifølge krav 5.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse vertvektorsystem for produksjon av et antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff som spesifikt binder human IL-6 reseptor, som omfatter en vektor ifølge krav 6, i en passende vertscelle.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er fremgangsmåte for å produsere et anti-IL-6R antistoff eller antigen-bindende fragment av dette, som omfatter å dyrke celler i et vertvektorsystem ifølge krav 7 eller 8 under betingelser som tillater produksjon av antistoffet eller fragmenter av dette og å utvinne antistoffet eller fragmentet som blir produsert.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, ved fremstilling av et medikament for anvendelse for å svekke eller hemme en IL-6-mediert sykdom eller lidelse hos et menneske, der den IL-6-mediert sykdommen eller lidelsen er artritt, en inflammatorisk tarmsykdom eller systemisk lupus erytematose.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff eller et antigen-bindende fragment av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller hjelpestoff.

I et første aspekt så tilveiebringer oppfinnelsen humane antistoffer, helst rekombinante humane antistoffer, som spesifikt binder human interleukin-6 reseptor (hlL-6R). Disse antistoffer erkarakterisert vedbinding til hlL-6R med høy affinitet og langsom dissosiasjonskinetikk og ved evnen til å nøytralisere IL-6 aktivitet. Antistoffene kan være full-lengde (for eksempel, et IgGI eller lgG4 antistoff) eller de kan omfatte kun en antigen-bindende del (for eksempel, et Fab, F(ab')2eller scFv fragment), og kan være modifisert til å utøve funksjonalitet, f.eks. til å eliminere gjenværende effektor- funksjoner (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933). I en foretrukket utførelsesform så tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff eller antigen-bindende fragment av det, som binder human IL-6 reseptor (SEQ ID NO: 1) med en KDpå 500 pM eller mindre, som målt ved overflateplasmonresonans. I en mer spesifikk utførelsesform så har antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet en KDsom er 300 pM eller mindre. Den kan også være mindre enn 200 pM, eller enda mindre enn 100 pM. Antistoffet eller et antigen-bindende fragment av det kan blokkere hlL-6 aktivitet med en IC50som er 250 pM eller mindre, som målt ved luciferase bioanalyse. Antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet av det kan utvise en IC50pål 50 pM eller mindre.

I relaterte aspekter så binder antistoffet eller det antigen-bindende fragment i oppfinnelsen hlL- 6R med en affinitet som er minst to ganger høyere enn den binder ape IL-6R. Antistoffet eller det antigen-bindende fragment ML-6R protein (SEQ ID NO: 1) kan binde med en affinitet som er opptil ca. tre ganger høyere i forhold til dets binding til ape IL-6R (Macaca fascicularis ekstracellulær domene vist i SEQ ID NO:251).

Antistoffet eller den antigen-bindende delen av antistoffet kan omfatte en tungkjede variabel region (HCVR) valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:3, 227, 19, 231, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 239, 241, 163, 179, 235, 195 og 211, eller vesentlig lignende sekvens av dem. Videre kan det omfatte antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet av det en lettkjede variabel region (LCVR) valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 11, 229, 27, 233, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 237, 203 og 219, eller en vesentlig lignende sekvens av dem. Det kan også omfatte antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet av det HCVR/LCVR par valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:3/ll; 227/229; 19/27; 231/233; 35/43; 51/59; 67/75; 83/91; 99/107; 115/123; 131/139; 147/155; 239/155; 241/155; 163/171; 179/187; 235/237; 195/203; og 211/219, eller vesentlig lignende sekvenser av dem.

I et andre aspekt som tilveiebringer oppfinnelsen isolerte nukleinsyremolekyler som koder for et antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff i følge oppfinnelsen. Nukleinsyremolekylet kan kode for et antistoff eller fragment av det som omfatter en HCVR som beskrevet over. Nukleinsyremolekylet som koder for HCVR kan være valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:2, 226, 18, 230, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 238, 240, 162, 178, 234, 194 og 210, eller en vesentlig identisk sekvens av dem. I et relatert aspekt så tilveiebringer oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som koder for en LCVR som beskrevet over. Nukleinsyremolekylet som koder for LCVR en nukleotidsekvens kan være valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 10, 228, 26, 232, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 236, 202 og 218, eller en vesentlig identisk sekvens av dem.

Antistoff eller antigen-bindende fragment, kan omfatte en

tungkjedekomplementaritetsbestemmende region 3 (CDR3) domene og et lettkjede CDR3 domene, hvor

det tunge kjedet CDR3 domene omfatter en aminosyresekvens med formelen X<1>- X<2>absentX^^-X^^-X^^-^-X^-^-X^-X^-X^-X^-X^-X17

- X<18>- X<19>(SEQ ID NO:247) hvor X<1>= Ala, X<2>= Lys, X<3>= Gly, X<4>= Arg, X8 = Asp, X<6>= Ser eller Ala, X7 = Phe, X<8>= Asp; X<9>= lie, X<10>= Pro eller fraværende, X<11>= Phe eller fraværende, X<12>= Val eller fraværende,X13=Tyr eller fraværende, X<14>= Tyr eller fraværende, X<15>= Tyr eller fraværende, X<16>=Gly eller fraværende,X17=Met eller fraværende, X<18>= Asp eller fraværende, og X<19>= Val eller fraværende; og

det lette kjedet CDR3 domene omfatter en aminosyresekvens med formelenX<1>-X2- X<3>- X<4>- X5 - X6- X<7>- X8 - X<9>(SEQ ID NO:250) hvor X<1>= Gin, X<2>= Gin eller His, X<3>= Ala, X4 = Asn eller Tyr, X<5>= Ser, X6 = Phe, X7 = Pro, X<8>= Pro, og X<9>= Thr.

Videre kan antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet omfatte et tungkjede CDR1 domene som omfatter en aminosyresekvens med formelenX<1>-X2- X<3>- X<4>-X5-X6-X<7>- X<8>(SEQ ID NO:245) hvor X<1>= Gly eller Arg, X<2>= Phe, X<3>= Thr, X<4>= Phe, X<5>= Asp, Xp = Asp, X<7>= Tyr, og X<8>= Ala;

et tungkjede CDR2 domene som omfatter en aminosyresekvens med formelen X<1>- X<2>

-X<3>-X<4>-X8-X6-X<7>- X<8>(SEQ ID NO:246) hvor X<1>= lie eller Val, X<2>= Ser, X<3>= Trp, X<4>=Asn, X8 = Ser, X6 = Gly, X<7>= Ser, og X<8>= lie;

et lettkjede CDR1 domene som omfatter en aminosyresekvens med formelen X<1>- X2 - X<3>-X<4>-X5 - X<6>- X7 - X<8>(SEQ ID NO:248), hvor X<1>= Gin, X<2>= Gly, X<3>= He, X<4>= Ser, X<5>= Ser, og X6 = Trp; og

et lettkjede CDR2 domene som omfatter en aminosyresekvens med formelen X<1>- X2 - X<3>(SEQ ID NO:249), hvor X<1>= Gly eller Ala, X<2>= Ala, og X<3>= Ser.

Videre kan antistoff eller antigen-bindende fragment av det som omfatter: et tungkjede CDR3 domene være valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 25, 153, 9, 185, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 169, 201 og 217; og et lettkjede CDR3 domene valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:33, 161, 17, 193,49, 65,81,97, 113, 129, 145, 177, 209 og 225.

Antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet kan videre være: et tungkjede CDR1 domene valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 21, 149, 5, 181, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 165, 197, og 213; et tung-kjede CDR2 domene valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 23, 151,7, 183,39,55,71,87, 103, 119, 135, 167, 199 og 215; et lettkjede CDR1 domene valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 29, 157, 13, 189, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 173, 205 og 221; og et lettkjede CDR2 domene valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 31, 159, 15, 191, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 175, 207 og 223.<*>;I spesifikke utførelsesformer så omfatter antigenet eller det antigen-bindende fragmentet tungkjede CDR sekvensene SEQ ID NO:21, 23, 25 og lettkjede CDR sekvensene SEQ ID NO:29, 31, 33; tungkjede CDR sekvenser SEQ ID NO: 149, 151, 153 og lettkjede CDR sekvensene SEQ ID NO: 157, 159, 161. ;Antigenet eller det antigen-bindende fragmentet kan også være tungkjede CDR sekvenser SEQ ID NO:5, 7, 9 og lettkjede SEQ ID NO: 13, 15, 17; og tungkjede CDR sekvenser SEQ ID NO: 181. 183, 185 og lettkjede CDR sekvensene SEQ ID NO:189, 191, 193. ;Isolerte nukleinsyremolekyler som koder for et antistoff eller et antigen-bindende fragment, hvor antistoffet eller fragmentet av det omfatter et tungkjede CDR3 domene kan koder for en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:24, 152, 8, 184, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 168, 200 og 216; og et lettkjede CDR3 domene som koder for en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:32, 160, 16, 192, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 176, 208 og 224; så vel som vesentlig identiske nukleinsyresekvenser av dem. ;Isolerte nukleinsyremolekyler kan tilveiebringes som koder for et antistoff eller et antigen-bindende fragment, hvor antistoffet eller fragment av det omfatter en tungt kjede CDR1 som koder for en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 20, 148, 4,180, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 164, 196 og 212; et tungkjede CDR2 domene som koder for en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 22, 150, 6, 182, 38, 54, 70, 86, 102,118,134,166,198 og 214; et lettkjede CDR1 domene som koder for en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:28, 156, 12, 188, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 172, 204 og 220; og et lettkjede CDR2 domene som koder for en nukleotidsekvens valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO:30, 158, 14, 190, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 174, 206 og 222; såvel som vesentlig identiske nukleinsyresekvenser av dem. ;Oppfinnelsen omfatter anti-hlL-6R antistoffer eller antigen-bindende fragmenter av dem som har et modifisert glykosileringsmønster. I noen applikasjoner så kan modifikasjon for å fjerne uønskede glykosyleringsseter være anvendbare, eller et antistoff som mangler en fukosedel på en oligosakkaridkjede, for eksempel, for å øke antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) (se Shield et al. (2002) JBC 277:26733). I andre applikasjoner så kan modifikasjon av en galaktosylering gjøres for å modifisere komplement-avhengig cytotoksisitet (CDC). ;I videre aspekter så tilveiebringer oppfinnelsen rekombinante ekspresjonsvektorer som bærer nukleinsyremolekylene i oppfinnelsen, og vertsceller hvor slike vektorer er blitt introdusert og også fremgangsmåter for å lage antistoffene eller de antigen-bindende fragmentene i oppfinnelsen skaffet tilveie ved å dyrke vertscellene i oppfinnelsen. Vertscellene kan være en prokaryot eller eukaryot celle, helst så er vertscellene en E. coli celle eller en pattedyrcelle, slik som en CHO celle. ;I et videre aspekt så vedrører oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning som omfatter et humant antistoff eller et antigen-bindende fragment av et antistoff som spesifikt binder ML-6R og en farmasøytisk akseptabel bærer. ;I videre aspekt så vedrører oppfinnelsen anvendelse for å hemme human IL-6 aktivitet ved å anvende et antistoff eller antigen-bindende del av dem i oppfinnelsen. Videre er det mulig å tilveiebringe en terapeutisk fremgangsmåte som omfatter å gi et antistoff fra oppfinnelsen, eller et fragment av det, til et menneske som har en lidelse som blir behandlet eller forbedret ved å hemme IL-6 aktivitet. Lidelsen kan for eksempel være artritt, som inkluderer kronisk rheumatoid artritt, inflammatorisk bowelsykdom, inkludert Crohn's sykdom og ulcerøs kolitt; systemisk lupus erythematose; og inflammatoriske sykdommer. ;I videre aspekter så tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen av et antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff som definert over i produksjonen av et medikament for anvendelse for å svekke eller å hemme en IL-6-mediert sykdom eller lidelse hos et menneske. I et relatert aspekt så tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff som definert over for anvendelse i svekkingen eller hemmingen av en IL-6-mediert sykdom eller lidelse hos et menneske. ;Andre temaer og fordeler vil være tydelige fra en oversikt i den påfølgende detaljerte beskrivelsen. ;DETALJERT BESKRIVELSE ;Før de foreliggende fremgangsmåter blir beskrevet, så må det forstås at denne oppfinnelse ikke er begrenset til bestemte fremgangsmåter eller eksperimentelle betingelser som er beskrevet, ettersom slike fremgangsmåter og betingelser kan variere. Det må også forstås at terminologien anvendt her kun er for formålet med å beskrive bestemte utførelsesformer, og er ikke ment å være begrensende, fordi omfanget av den foreliggende oppfinnelsen kun vil være begrenset ved de vedlagte kravene. ;Med mindre annet er definert så har alle tekniske og vitenskapelige uttrykk som er anvendt her den samme betydningen som vanligvis forstås av en fagperson som denne oppfinnelsen tilhører. Selv om enhver fremgangsmåte og materiale som ligner på eller ekvivalent til de som er beskrevet her kan anvendes i utføringen eller testingen av den foreliggende oppfinnelsen så bli nå de foretrukne fremgangsmåtene og materialene beskrevet. ;Uttrykket "human IL6R" (hll_-6R), som anvendt her, er ment å referere til en human cytokinreseptor som spesifikt binder interleukin-6 (IL-6). Det ekstracellulære domene til WL-6R er vist i SEQ ID NO: 1. ;Uttrykket "antistoff, som anvendt her, er ment å referere til immunoglobulinmolekyler som omfatter fire polypeptidkjeder, to tunge (H) kjeder og to lette (L) kjeder som er sammenbundet med disulfidbindinger. Hver tungkjede omfatter en tungkjede variabel region (forkortet her som HCVR eller VH) og en tungkjede konstantregion. Den tungkjede konstante regionen omfatter tre domener, CH1, CH2 og CH3. Hver lettkjede omfatter en lettkjede variabel region (forkortet her som LCVR eller VL) og en lettkjede konstant region. Den lettkjede konstante regionen er omfattet av et domene (CL1). VH og VL regionene kan være videre suboppdeles i regioner med hypervariabilitet, som kalles komplementaritetsbestemmende regioner (CDR), satt sammen med regioner som er mer konserverte, som kalles leserammeregioner (FR). Hver VH og VL er sammensatt av tre CDRer og fire FRer, arrangert fra amino-terminalene til karboksy-terminale enden i følgende rekkefølge: FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. ;Uttrykket "antigen-bindende del" av et antistoff (eller kun "antistoffdel" eller "antistoff-fragment"), som anvendt her, refererer til et eller flere fragmenter av et antistoff som bevarer evnen til spesifikt å binde et antigen (f. eks. ML-6R). Det har vært vist at den antigen-bindende funksjonen til et antistoff kan utføres av fragmenter fra et full-lengde antistoff. Eksempler på bindingsfragmenter som omfattet innenfor uttrykket "antigen-bindende del" av et antistoff inkluderer (i) et Fab fragment, et monovalent fragment som består av VL, VH, CL1 og CH1 domener; (ii) et F(ab')2 fragment, et bivalent fragment som omfatter to Fab fragmenter koplet med en disulfid bro ved hengselregionen; (iii) et Fd fragment som består av VH og CH1 domenene; (iv) et Fv fragment som består av VL og VH domenene til en enkel arm av et antistoff, (v) et dAb fragment (Ward et al. ;(1989) Nature 241 :544-546), som består av et VH domene; og (vi) en isolert komplementaritetsbestemmende region (CDR). Selv om de to domenene av Fv fragmentet, VL og VH, videre er kodet for av separate gener, så kan de koples ved å anvende rekombinante fremgangsmåter, ved hjelp av en syntetisk linker som muliggjør at de lages som en enkel tilstøtende kjede hvorved VL og VH regionene parer og danner monovalente molekyler (kjent som enkeltkjede Fv (scFv); se f.eks. Bird et al. (1988) Science 242:423-426; og Huston et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Slike enkelkjede antistoffer er også ment å være omfattet innenfor uttrykket "antigen-bindende del" av et antistoff. Andre former av enkeltkjedeantistoffer, slik som diastoffer, er også omfattet (se f.eks. Holliger et al. (1993) Proe. Nati. Acad Sei. USA 90:6444-6448). ;Et "nøytraliserende" eller "blokkerende" antistoff, som anvendt her, er ment å referere ;til et antistoff hvis binding til hlL-6R resulterer i hemming av den biologiske aktiviteten av hlL-6. Denne hemming av den biologiske aktiviteten av hlL-6 kan bedømmes ved "å måle en eller flere indikatorer av hlL-6 biologisk aktivitet kjent i fagfeltet, slik som hlL-6-indusert cellulær aktivering og hlL-6 binding til hlL-6R (se eksempler under). ;En "CDR" eller komplementaritetsbestemmende region er en region med hypervariabilitet innfelt innen regioner som er mer konserverte, og kalles "leserammeregioner" (FR). I forskjellige utførelsesformer av anti-hlL-6R antistoffet eller fragmentet av det i oppfinnelsen, så kan FRene være identiske til de humane germlinesekvensene, eller de kan være naturlig eller artifisielt modifiserte. En gruppe CDRer kan defineres som en aminosyrekonsensussekvens; for eksempel i en utførelsesform så kan anti-hlL-6R antistoffet eller det antigen-bindende fragmentet i oppfinnelsen være beskrevet som å omfatte et tungkjede CDR3 domene som omfatter en aminosyresekvens med formelenX<1>-X2- X<3>-X4- X5 - X6-X<7>- X<8>-X<9>-X<10>-X11;- X1<2>- X13- X14 - X15 - Xlp -X17- X18 - X19 (SEQ ID NO:247) hvor X<1>= Ala, X<2>= Lys, X<3>= Gly, X<4>= Arg, X<5>= Asp, X<6>= Ser eller Ala, X<7>= Phe, X<8>= Asp; X<9>= He, X<10>= ;Pro eller fraværende, X<11>= Phe eller fraværende,X<12>= Val eller fraværende, X<13>= Tyr eller fraværende, X<14>= Tyr eller fraværende, X<15>= Tyr eller fraværende, X<16>= Gly eller fraværende, X<17>= Met eller fraværende,X<18>= Asp eller fraværende, og X<19>= Val eller fraværende; og et lettkjede CDR3 domene som omfatter en aminosyresekvens med formelen X<1>- X<2>- X<3>- X<4>- X<5>- X<6->X<7>- X<8>- X<9>(SEQ ID NO:250) hvor X<1>= Gin, X<2>= Gin eller His, X3 = Ala,X<4>=Asn eller Tyr, X<5>= Ser, X<6>= Phe, X<7>= Pro, X<8>= Pro, og X<9>= Thr. ;Uttrykket "overflateplasmonresonans", som anvendt her, refererer til et optisk fenomen som tillater analysen av virkelig tid interaksjoner ved å detektere forandringer i proteinkonsentrasjoner innen en biosensormatriks, for eksempel ved å anvende BIAcore™ systemet (Pharmacia Biosensor AB). ;Uttrykket "epitop" er en antigendeterminant som interagerer med et spesifikt antigenbindende sete i den variable regionen til et antistoffmolekyl kjent som en paratope. Et enkelt antigen kan ha flere enn et epitop. Epitoper kan være enten konformasjonelle eller lineære. Et konformasjonell epitop produseres ved rommelig sidestilte aminosyrer fra forskjellige segmenter fra den lineære polypeptidkjeden. Et lineær epitop er en som produseres ved tilstøtende aminosyreresiduer i en polypeptid-kjede. Under visse omstendigheter så kan et epitop inkludere deler med sakkarider, fosforgrupper eller sufonylgrupper avantigenet. ;Uttrykket "vesentlig identitet" eller "vesentlig identisk," når det refereres til en nukleinsyre eller fragment av det, indikerer at, når den optimalt oppstilles med passende nukleotidinnsettinger eller slettinger med en annen nukleinsyre (eller dets komplementære tråd), så er det en nukleotidsekvens som er minst ca. 95%, eller mer ønskelig minst ca. 96%, 97%, 98% eller 99% av nukleotidbasene, målt ved enhver velkjent algoritme for sekvensidentitet, slik som FASTA, BLAST eller Gap, som diskutert under. ;For polypeptider, så brukes uttrykket "vesentlig likhet" eller "vesentlig lik" at to peptidsekvenser, når de er optimalt oppstilt, slik som ved programmene GAP eller BESTFIT ved å anvende standard gap vekter, deler minst 95% sekvensidentitet, enda mer ønskelig minst 98% eller 99% sekvensidentitet. Helst så skiller residie posisjoner som ikke er identiske ved konservative aminosyresubstitusjoner. En "konservativ aminosyresubstitusjon" er en hvor et aminosyreresidie er substituert med et annet aminosyreresidie som har en sidekjede (R gruppe) med lignende kjemiske egenskaper (f.eks. ladning eller hydrofobisitet). Generelt så vil ikke en konservativ aminosyresubstitusjon vesentlig forandre de funksjonelle egenskapene til et protein. I tilfeller hvor to eller flere aminosyresekvenser skiller seg fra hverandre ved konservativ substitusjoner, så kan prosentsekvensidentiteten eller graden av likhet justeres oppover for å korrigere for den konservative naturen til substitusjonen. Måter for å gjøre denne justering er velkjent for fagfolk. Se f.eks. Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Eksempler på grupper med aminosyrer som har sidekjeder med lignende kjemiske egenskaper inkluderer 1) alifatiske sidekjeder: gly ein, alanin, valin, leucin og isoleucin; 2) alifatiske-hydroksylsidekjeder: serin og treonin; 3) amid-inneholdende sidekjeder: asparagin og glutamin; 4) aromatiske sidekjeder: fenylalanin, tyrosin og tryptofan; 5) basiske sidekjeder: ly sin, arginin og histidin; 6) sure sidekjeder: aspartat og glutamat og 7) svovel-inneholdende sidekjeder er cystein og metionin. Forerukne konservative aminosyresubstitusjonsgrupper er: valin-leucin-isoleucin, fenylalanin- tyrosin, lysin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat og asparagin-glutamin. Alternativt så er en konservativ erstatning enhver forandring som har en positiv verdi i PAM250 log-sannsynlighetsmatriks som er utgreid i Gorcnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. En "moderat konservativ" erstatning er enhver forandring som har en ikke-negativ verdi i PAM250 log-sannsynlighetsmatriksen. ;Sekvenslikhet for polypeptider som også refereres til som sekvensidentitet, måles vanligvis ved å anvende sekvensanalysesoftware. Proteinanalysesoftware treffer lignende sekvenser ved å anvende mål for likhet angitt for diverse substitusjoner, slettinger og andre modifikasjoner som inkluderer konservativ aminosyresubstitusjoner. For eksempel så inneholder GCG software programmer slik som Gap og Bestfit som kan anvendes med standardparametere for å bestemme sekvenshomologi eller sekvensidentitet mellom nær relaterte polypeptider, slik som homologe polypeptider fra forskjellige arter av organismer eller mellom et villtypeprotein og en mutant av dem. Se f.eks. GCG versjon 6.1. Polypeptidsekvenser kan også sammenlignes ved å anvende FASTA ved å anvende standard eller anbefalte parametere, et program i GCG versjon 6.1. FASTA (f.eks. FASTA2 og FASTA3) tilveiebringer oppstillinger og prosentsekvensidentitet av regionene i den beste overlappen mellom den forespurte sekvensen og søk sekvensene (Pearson (2000) supra). En annen foretrukket algoritme når man sammenligner en sekvens av oppfinnelsen med en database inneholdende et stort antall sekvenser fra forskjellige organismer er computerprogrammet BLAST, spesielt blastp eller tblastn, ved å anvende standardparametere. Se f.eks. Altschu et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 og Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402. ;Fremstilling av humane antistoffer ;Fremgangsmåter for å fremstille humane antistoffer inkluderer for eksempel Veloclmmune™ (Regeneron Pharmaceuticals), XenoMouse™ teknologi (Green et al. ;(1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix), "minilocus" tilnærmingsmåten og fagdisplay (og se for eksempel, US 5,545,807, US 6,787,637). Veloclmmune™ teknologien (US 6, 596,541) omfatter en fremgangsmåte for å fremstille et fullstendig humant antistoff med høy spesifisitet for å velge antigen. Denne teknologi involverer fremstilling av en transgen mus som har et genom som omfatter humane tunge og lette kjedevariable regioner som er operativt koplet til endogent musekonstante region loci slik at musen produserer et antistoff som omfatter en human variabel region og en mus konstant region som respons på antigenstimulering. DNA som koder for de variable regionene til de tunge og lette kjedene til antistoffet isoleres og operativt koplet til DNA som koder for de humane tunge og lette kjedekonstante regionene. DNA blir så uttrykt i en celle som er i stand til å uttrykke det fullstendige humane antistoffet. I spesifikke utførelsesformer så er cellen en CHO celle. ;Antistoffer kan være terapeutisk anvendbare for å blokkere en ligand-reseptor interaksjon eller å hemme reseptorkomponentinteraksjon, i stedet for å drepe cellene gjennom fiksering av komplement (komplement-avhengig cytotoksisitet) (CDC) og deltakelse i antistoff-avhengig celle-mediert cytotoksisitet (ADCC). Den konstante regionen til et antistoff er viktig for evnen et antistoff har til å fiksere komplement og styre celleavhengig cytotoksisitet. Isotypen til et antistoff kan dermed selekteres på basis av om det er ønskelig for antistoffet å styre cytotoksisitet. ;Humane immunoglobuliner kan eksistere i to former som er assosiert med hengselheterogenitet. I en form så omfatter et immunoglobulinmolekyl en stabil fire kjedekonstruksjon på ca. 150-160 kDa hvor dimerene holdes sammen med en interkjede tungkjede disulfidbinding. I en andre form så er dimerene ikke koplet via interkjededisulfidbindinger og et molekyl på ca. 75-80 kDa dannes som er sammensatt av en kovalent kopling lett og tung kjede (halv-antistoff). Disse former har vært ekstremt vanskelige å separere selv etter affinitetsrensing. Frekvensen av tilstedeværelsen av den andre formen i diverse intakte IgG isotyper er på grunn av, men ikke begrenset til, strukturelle forskjeller som er assosiert med hengselregionisotypen til antistoffet. Faktisk så kan en enkel aminosyresubstitusjon i hengselregionen til humane lgG4 hengselen signifikant redusere tilstedeværelsen av den andre formen (Angal et al. ;(1993) Molecular Immunology 30:105) til nivåer som vanligvis observeres ved å anvende en human IgGI hengsel. Antistoffer som har en eller flere mutasjoner i hengselen, CH2 eller CH3 regioner er mulige som kan være ønskelig for eksempel i produksjon, for å forbedre utbytte av den ønskede antistofformen. ;Antistoffer i oppfinnelsen lages helst med anvendelsen av Veloclmmune™ teknologi. En transgen mus hvor de endogene immunoglobulin tunge- og lettkjedevariable regionene er erstattet med de korresponderende humane variable regionene utfordres med antigenet av interesse, og lymfatiske celler (slik som B-celler) gjenvinnes fra musene som uttrykker antistoffene. De lymfatiske cellene kan fuseres med en myelomacellelinje for å lage udødelige hybridomacellelinjer, og slike hybridomacellelinjer screenes og selekteres for å identifisere hybridomacellelinjer som produserer antistoffer som er spesifikke for antigenet av interesse. DNA som koder for de variable regionene til den tunge kjeden og den lette kjeden kan isoleres og koples til ønskelige isotype konstante regioner på den tungekjeden og den lettekjeden. Et slikt antistoffprotein kan produseres i en celle slik som en CHO celle. Alternativt så kan DNA som koder for de antigenspesifikke kimære antistoffene eller de variable domenene til de lette og de tunge kjedene isoleres direkte fra antigenspesifikke lymfocytter. ;den transgene musen kan omfatte opptil 18 funksjonelle humane variable tungkjede gener og 12 funksjonelle humane variable kappa lettkjede gener. Videre kan den den transgene musen omfatte opptil 39 humane variable tungekjede gener og 30 humane variable kappa lettkjede gener. Den transgene musen kan også omfatte opptil 80 humane variable tungkjede gener og 40 humane variable kappa lettkjede gener. ;Generelt så innehar antistoffene i den foreliggende oppfinnelsen høye affiniteter, vanligvis så har de KpS fra ca. 10<9>til ca. 10~<12>molar målt ved binding til antigen enten immobilisert på fast fase eller i løsningsfase. ;Initialt så blir kimære antistoffer med høy affinitet isolert og har en human variabel region og en mus konstant region. Som beskrevet over så blir antistoffenekarakterisertog valgt for de ønskede karakteristikaene, som inkluderer bindingsaffinitet til hlL-6R, evnen til å blokkere hlL-6, og/eller selektivitet for det humane proteinet. De musekonstante regionene erstattes med en ønsket human konstant region for å generere det fullstendige humane antistoffet i oppfinnelsen, for eksempel villtype eller modifisert lgG4 eller IgGI (for eksempel SEQ ID NO:242, 243, 244). Mens den konstante regionen som er valgt kan variere i henhold til spesifikk anvendelse, så er høy affinitet antigenbinding og målspesifisitetskarakteristika i den variable regionen. ;Epitop kartlegging og relaterte teknologier ;For å screene antistoffer som binder seg til et bestemt epitop, så kan en rutine kryssblokkeringsanalyse slik som den som er beskrevet i Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane, eds., utføres. Andre fremgangsmåter inkluderer alanin scanning av mutantet, peptidblot (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), eller peptid kløyvningsanalyse som beskrevet i eksemplene under. I tillegg så kan fremgangsmåter slik som epitopfjerning, epitop ekstraksjon og kjemisk modifikasjon av antigener benyttes (Tomer (2000) ;Protein Science: 9: 487-496). ;Modifikasjon-assistert profilering (MAP), også kjent som antigen struktur-basert antistoff profilering (ASAP) er en fremgangsmåte som kategoriserer et stort antall monoklonale antistoffer (mAber) direkte mot samme antigenet i henhold til likhetene til bindingsprofilen til hvert antistoff til kjemiske eller enzymatisk modifiserte antigenoverflater (US patentsøknad publikasjon nr. 2004/0101920). Hver kategori kan reflektere en unik epitop enten distinkt forskjellig fra eller delvis overlappende med en epitop representert ved en annen kategori. Denne teknologi tillater rask filtrering av genetisk identiske antistoffer slik at karakterisering kan fokuseres på genetisk distinkte antistoffer. Når den brukes til hybridomascreening, så kan MAP fasilitetere identifisering av sjeldne hybridomakloner med ønskede karakteristika. MAP kan anvendes for å sortere hlL-6R antistoffene i oppfinnelsen i grupper med antistoffer som binder forskjellige epitoper. ;Antigener som er anvendbare for å forandre strukturen til det immobiliserte antigenet er enzymer slik som for eksempel proteolytiske enzymer og kjemiske midler. Antigenproteinet kan immobiliseres på enten biosensor chipoverflater eller polystyrenkuler. Det sistnevnte kan prosseseres med for eksempel en analyse slik som en multiplex Luminex™ deteksjonsanalyse (Luminex Corp., TX). På grunn av kapasiteten Luminex™ har til å håndtere multipleksanalyse med opptil 100 forskjellige typer med kuler, så tilveiebringer Luminex™ nesten ubegrensede antigenoverflater med diverse modifikasjoner, og resulterer i forbedret resolusjon i antistoffepitopprofilering i forhold til en biosensoranalyse. ;Terapeutisk administrering og formuleringer ;Administreringen av terapeutiske deler vil kunne administreres med passende bærere, hjelpestoffer og andre midler som er inkorporert inn i formuleringen for å tilveiebringe forbedret overføring, levering, toleranse og lignende. Flere passende formuleringer kan finnes i formularet som er kjent for alle farmasøytiske kjemikere: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1975), spesielt kapittel 87 av Blaug, Seymour, deri. Disse formuleringer inkluderer for eksempel pulvere, pastaer, salver, geleer, vokser, oljer, lipider, lipid (kationiske eller anioniske) inneholdende vesikler (slik som Lipofectin™), DNA konjugater, anhydrerte absorpsjonspastaer, olje-i-vann og vann-i-oljeemulsjoner, emulsjonskarbovoks (polyetylenglykoler av diverse molekylvekter), halvfaste geler og halvfaste blandinger som inneholder karbovoks. Enhver av de foregående blandingene kan være passende i behandlinger og terapier, forutsatt at den aktive ingrediensen i formuleringen ikke er inaktivert ved formuleringen og formuleringen er fysiologisk kompatibel og tolererbar med administreringsmåten. Se også Powell et al. PDA (1998) J Pharm Sei Technol. 52:238-311 og siteringer deri for tilleggsinformasjon relatert til hjelpestoffer og bærere som er velkjent for farmasøytiske kjemikere. ;EKSEMPLER ;De følgende eksemplene er satt frem for å tilveiebringe for fagfolk en fullstendig utgreiing og beskrivelse om hvordan man lager og anvender fremgangsmåtene og sammensetningene i oppfinnelsen.. Arbeid har vært gjort for å sikre nøyaktighet med hensyn til tall som anvendes (f.eks. mengder, temperaturer osv.) men noen eksperimentelle feil og avvik bør man regne med. Med mindre annet er indikert så er deler er deler ved vekt, molekylvekt er gjennomsnittlig molekylvekt, temperatur er i grader celsius, og trykk er ved eller nær atmosfæretrykk. ;Eksempel 1. Generering av humane antistoffer for human IL-6 reseptor. ;Immunisering av gnagere kan gjøres ved enhver fremgangsmåte som er kjent i fagfeltet (se for eksempel, Harlow and Lane (1988) supra; Malik and Lillehoj, Antibodies techniques: Academic Press, 1994, CA). I en foretrukket utførelsesform så blir hlL-6R antigen administrert direkte til mus som omfatter DNA loci som koder for både human lg tungkjede variabel region og kappa lettkjede variabel region (Veloclmmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; US 6,596,541), med en adjuvant for å stimulere immunresponsen. En slik adjuvant inkluderer fullstendig og ufullstendig Freund's adjuvant, MPL+TDM adjuvantsystem (Sigma), eller RIBI (muramyl dipeptider) (se 0'Hagan, Vaccine Adjuvant, av Human Press, 2000, NJ). Et slikt adjuvant kan forhindre rask fordeling av polypeptid ved å avsondre antigenet i et lokalt depot, og kan inneholde faktorer som kan stimulere vertsimmunrespons. I en utførelsesform så blir hIL-6R administrert indirekte som DNA plasmid som inneholder hlL-6R gen og uttrykker hlL-6R ved å anvende vertens cellulære proteinuttrykksmaskineri for å produsere antigenpolypeptid in vivo. I begge tilnærmingsmåtene så krever immuniseringsskjemaet flere administreringer med mellomrom på noen få uker. Antistoffimmunresponsen måles ved hjelp standard antigen-spesifikk immunoanalyse. Når dyrene når deres maksimale immunrespons, så ble antistoff uttrykkende B celler høstet og fusert med musemyelomaceller for å konservere deres viabilitet, og dannet hybridomaceller. For å velge funksjonelle ønskelige monoklonale antistoffer, så ble kondisjonert medium fra hybridomacellene eller de transfekterte cellene screenet for spesifisitet, antigen-bindende affinitet og potens i å blokkere hlL-6 binding til hlL-6R (beskrevet under). ;Eksempel 2. Anti-hlL6R antistoffer generert via direkte isolering av splenocytter ;DNA som koder for VH og VL domener kan isoleres direkte fra en enkel antigen positiv B celle. I korthet så ble hlL-6Ra immuniserte transgene mus avlivet og splenocytter ble høstet. Røde blodceller ble fjernet ved ly sis etterfulgt av pelletering av de høstede splenocyttene. Resuspenderte splenocytter ble først inkubert med en cocktail bestående av humant IgG, FITC-anti-mFc og biotin-IL6Ra i 1 time. De fargede cellene ble vasket to ganger med PBS, deretter farget med en cocktail bestående av humant og rotte IgG, APC-anti-mlgM, og S A-PE i 1 time. De fargede cellene ble vasket en gang med PBS og ble analysert med flowcytometri på en MoFIo (Cytomation). Hver IgG positiv, IgM negativ, og antigen positive B celle ble sortert og platet i en separat brønn på en 96-brønners plate. RT-PCR av antistoffgener fra disse B celler ble utført i henhold til en fremgangsmåte beskrevet av Wang et al. (2000) (J Immunol Methods 244:217-225). I korthet så ble cDNA for hver enkelt B celle syntetisert ved hjelp av RT-PCR. Hvert resulterende RT produkt ble så splittet og overført til to korresponderende brønner på to 96-brønners plater. Et sett med de resulterende RT produktene ble først amplifisert ved hjelp av PCR ved å anvende en 5' degenerert primer som er spesifikk for human IgG tungkjede variabel region ledersekvens og en 3' primer spesifikk for muse tungkjede konstant region og dannet et amplicon. Ampliconet ble så omformet igjen ved PCR ved å anvende en 5' degenerert primersett som er spesifikk for leseramme 1 i human IgG tungkjede variabel regionsekvens og en nestet 3' primer som er spesifikk for muse tungkjede konstant region. Det andre settet med de resulterende RT produktene ble først omformert ved hjelp av PCR ved å anvende en 5' degenerert primer spesifikk for human kappa lettkjede variabel region ledersekvens og en 3" primer spesifikk for musekappa lettkjede konstant region for å danne et amplicon. Ampliconet ble så omformert igjen ved hjelp av PCR ved å anvende et 5' degenerert primersett spesifikk for leseramme 1 i human kappa lettkjede variabel regionsekvens og en nestet 3' primer spesifikk for musekappa lettkjede konstant region. De tungkjede og lettkjede PCR produktene ble klonet inn i Sap 1-linearisert antistoffvektorer inneholdende hhv. IgGI tungkjede konstant region og kappa lettkjede konstant region. Det tungkjedede plasmidet har et Iox2272 sete og et Iox511 sete som flankerer tungkjede uttrykskassettene. I tillegg så er det rett nedstrøms for Iox2272 i tungkjede plasmidet et hygromycin-resistens gen som mangler en promoter og et initierings ATG Hygromycin-resistensgenet er også transkripsjonelt koplet til et nedstrøms eGFP gen via en IRES sekvens. Lettkjede plasmidet har et loxP sete og Iox2272 sete som flankerer lettkjede uttrykkskassetten. I tillegg så har lettkjede plasmidet en SV40 promoter rett før et ATG ved Iox2272 sete, slik at ved integrering inn i en passende vertscelle så blir Iox2272-proksimal SV40 promoteren og initierings ATG fra det lettkjede plasmidet brakt tilstøtende til hygromycin-resistensgenet i tunge kjedet plasmidet i en passende leseramme slik at transkripsjon tillates og translasjon av det hygromycin-resistente og av eGFP genene. Rensede rekombinante plasmider som har en tungkjede variabel regionsekvens og plasmider som har en lettkjede variabel regionsekvens fra den samme B cellen ble så kombinert og transfektert sammen med et plasmid som uttrykker Cre rekombinasen, inn i en modifisert CHO vertscellelinje. Den modifiserte CHO vertscellelinjen inneholder, fra 5' til 3", et loxP sete, en eCFP, et Iox2272 sete, DsRed, og et Iox511 sete ved et transkripsjonelt aktivt locus. Som en konsekvens av dette så kan verts CHO cellen isoleres ved hjelp av flowcytometri som en blå-positiv, rød-positiv og grønn-negativ celle. Når rekombinante plasmider som uttrykker tungkjede og lettkjede gener transfekteres sammen med et plasmid som uttrykker Cre rekombinasen, så resulterer sete-spesifikk rekombinasjon styrt av Cre rekombinasen i integreringen av antistoffplasmidene på det kromosomale locuset som inneholder lox setene og erstatning av eCFP og DsRed genene. Rekombinanter kan så isoleres som blå-negative, rød-negative og grønn-positive celler ved hjelp av flowcytometri. Følgelig så ble CHO celler transfektert med rekombinante plasmider som har en tungkjede variabel regionsekvens og plasmider som har en lettkjede variabel regionsekvens fra den samme B cellen sortert ved hjelp av flowcytometri, og passende rekombinanter som viser den blå-negative, rød-negative, og grønn-positive fenotypen ble isolert, og stabile rekombinante antistoff som uttrykker CHO cellelinjer ble etablert fra isolerte kloner. ;Eksempel 3. Antigen bindingsaffinitetsbestemmelse ;KDfor antigenbindingen til de valgte antistoffene beskrevet over ble bestemt ved overflatekinetikk på en virkelig tid biosensor overflateplasmonresonansanalyse (BIAcore™). Mer spesifikt ble affiniteten antistoffene har for human IL-6R målt ved å anvende en BIAcore® 2000 eller BIAcore® 3000. Antistoffet ble fanget på en anti-mus IgG overflate og eksponert for forskjellige konsentrasjoner av rekombinant hlL-6R protein enten i monomer eller dimer form. Kinetisk analyse som anvender BlAevaluerings™ software ble utført for å skaffe tilveie assosiasjons- og dissosiasjonshastighetskonstantene. ;Bindingsaffiniteter av antistoffene til hlL-6R ble også målt for enten hybridom-kondisjonert medium eller rensede proteiner ved platebasert konkurranseimmunoanalyse. Antistoffproteinene ble renset ved å anvende Protein G affinitets kromatografi fra hybridomacelle kondisjonert medium som var redusert for bovin IgG-(Invitrogen). For konkurranse ELISA, så ble i korthet, konstante mengder av antistoff ved forskjellige nivåer forhåndsblandet med seriefortynninger av antigen protein, hlL-6R-hFc, i området fra 0 til 10 ug/ml, og inkubert i to timer ved romtemperatur for å nå pseudo-bindingslikevekt mellom antistoffet og antigenet. Disse løsninger ble så overført til 96-brønners hlL-6R-hFc forhåndsovertrukne plater for å tillate at det frie antistoffet i blandingen skulle binde seg til plateovertrukket hlL-6R-hFc. Platene ble vanligvis overtrukket med 1 til 2 ug/ml hlL-6R-hFc protein i PBS løsning over natt ved 4°C etterfulgt av BSA ikke-spesifikk blokkering. Etter vasking av overskuddsantistoff i løsning, så ble platebundne antistoffer detektert med et HRP-konjugert geit anti-mus IgG eller IgA polyklonalt antistoff reagens og utviklet ved å anvende enten farge eller kjemiluminessenssubstrater. Avhengigheten til signalene av konsentrasjonene av antigen i løsning ble analysert med en 4-parameter tilpasningsanalyse ved å anvende Prisme™ software (Graph Pad) og rapportert som IC50. Konkurranseimmunanalyse ble også utført ved å anvende steady state løsning fase Kinexa™ instrument (Sapidyne Inc.). ;Resultater er vist i tabell 1 (kontroll: humanisert monoklonalt antistoff mot human IL-6R (U.S. Patent nr. 5,817,790 SEQ ID NO:69 og 71). Antistoff (HCVR og LCVR aminosyresekvens): VQ8A9-6 (3, 11); VQ8F11-21 (19, 27); W7G4-1 (35, 43); W7G4-10 (51, 59) W6C10-1 (67, 75); W6C10-3 (83, 91); W6C10-4 (99, 107); W6F12-11 (115, 123); W9A6-11 (131, 139); W6A9-5 (147, 155), W3D8-4 (163, 171); W1G4-7 (179, 187); 248982-13-1 -E5 (195, 203); 248982-13-2-A9 (211, 219). Monomer og dimer KDbestemt ved hjelp av BIAcore™; ;Løsning KDved Kinexa™; IC50ved ELISA analyser (n.d. = ikke bestemt). ; hlL-6 blokkeringsaktiviteter av anti-hlL-6R antistoffene i oppfinnelsen ble screenet ved hlL-6 blokkeringsimmunoanalyser, in vitro hlL-6 avhengige cellevektbioanalyser og overflateplasmonresonans (BIAcore™). Iimmunoanalysen ble anvendt for å screen evnen det testede antistoffet har til å blokkere hlL-6 binding til ML-6R, og in vitro bioanalysen ble anvendt for å bestemme potensen antistoffene har til å nøytralisere hlL-6R-styrt cellulær signaltransduksjon. For immunoanalysen så ble hlL-6 rekombinant protein overtrukket på en 96-brønners plate i PBS buffer over natt ved 4°C. Denne plate ble anvendt for å fange fri hlL-6R-hFc fra antistoffprøveløsninger og mengden av fanget hH_-6R-hFc ble kvantifisert i henhold til standardkurven. Prøveløsningene var sammensatt av en konstant mengde av hlL-6R-hFc rekombinant protein (100 pM) og forskjellige mengder antistoff, enten i rått hybridoma kondisjonert medium eller som renset antistoffprotein i området fra 0 til ca. 50 nM i seriefortynninger. Antistoffantigenblandingene ble inkubert ved romtemperatur i~2 timer for å tillate antistoff-antigenbinding å nå likevekt. De ekvilibrerte prøveløsningene ble så overført til de hlL-6 overtrukne platene for måling av fri hlL-6R-hFc. Etter 1 times binding så ble platen vasket og bundet hlL-6R-hFc ble detektert ved å anvende HRP-konjugert geite anti-hFc polyklonale antistoffer (Jackson lmmuno Research), og utviklet ved å anvende TMB substrat (BD Pharmigen). ICsoer ble bestemt som mengden antistoff som er nødvendig for å redusere 50% av IL-6R-hFc detekterbar til platebundet hlL-6 ligand. Resultater er vist i den første kolonnen av tabell 2. ;I tillegg så ble evnen til testantistoffet til å blokkere hlL-6 binding til hlL-6R reseptoren bestemt ved å anvende overflateplasmonresonans. Rensede antigen hlL-6R-hFc molekyler ble fanget ved hjelp av geite anti-human IgG polyklonale antistoffer immobilisert på CM-5 overflate gjennom aminkopling til en tetthet på 250 RU. hlL-6 løsning (0.25ml, 50 nM) ble injisert over reseptoroverflaten og bundet hlL-6 nedtegnet (første injeksjon av IL-6). Bundet hlL-6 ble så fjernet med en puls av 3 M MgCb etterfulgt av kondisjoneringsbuffer. Anti-hlL6R antistoff i hybridoma kondisjonert medium ble injisert over den fangede reseptoroverflaten etterfulgt av annen injeksjon av hlL-6. Prosentreduksjonen i hL-6 binding som et resultat av forhåndsdannet antistoff og reseptorkompleks ble anvendt som en skår for å definere hlL-6 blokkere fra ikke-blokkere (andre kolonne, Tabell 2). ; Evnen hlL-6R antistoffene har til å blokkere hlL-6 aktivitet in vitro ble målt i den hlL-6-avhengige myelomalinjen XG-1. XG-1 celler opprettholdt i hlL-6-inneholdende medium ble vasket to ganger med hlL-6-frit media og dyrket i tilnærmet 24 timer i hlL-6-fritt medium for å redusere gjenværende hlL-6. De sultede cellene ble så spunnet ned og resuspendert i mediet ved 4 x IO<5>celler pr. ml og platet ut i 20,000 celler pr. brønn i en 96-brønners vevskulturplate. De rensede antistoffproteinene ble seriefortynnet i medium og tilsatt til de utplatede cellene ved konsentrasjoner i området fra 0 til 50 nM. Deretter ble rekombinant hlL-6 tilsatt til brønnene ved en sluttkonsentrasjon på 8 pM. Cellene fikk gro i tilnærmet~72 timer ved 37°C i en humidifisert 5% CO2 inkubator. På slutten av vekstperioden så ble levende celler målt ved å anvende CCK-8 kit (Dojindo, Japan). IC50ble bestemt som beskrevet over, og rapportert i den tredje kolonnen i tabell 2. ;Evnen hlL-6R antistoffene har til å blokkere hlL-6 aktivitet ble også målt in vitro i den hlL-6-responsive humane hepatomacellelinje, HepG2. HepG2 celler blir transfektert med et reporterplasmid inneholdende et STAT3 (Signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3) responselement koplet til et luciferasegen. De transfekterte cellene ble trypsinisert, spunnet ned og re-suspendert i mediet ved ca. 2.5 x 10<5>celler pr. ml og platet ut til 20,000 celler pr. brønn i en 96-brønners vevkulturplate. De rensede antistoffproteinene ble seriefortynnet i medium og tilsatt til de utplatede cellene ved konsentrasjoner i området fra 0 til 100 nM. Deretter ble rekombinant hlL-6 tilsatt til brønnene til en sluttkonsentrasjon på 50 pM. Responsen ble målt etter inkubering av cellene i 6 timer ved 37°C i en humidifisert 5% CO2 inkubator. Luciferaseaktivitet ble målt med Steady-Glo™ luciferaseanalysesystemet (Promega). IC50ble bestemt som beskrevet over og rapportert i den fjerde kolonnen av tabell 2. ;Eksempel 5. Bindingsepitopdiversitet ;En antistoffbinding konkurranseimmunoanalyse ble utført ved å anvende som en kontroll, humanisert antistoff mot human JX-6R. I korthet så ble en 96-brønners immunosorbent plate overtrukket med 20 ng pr. brønn hlL-6R rekombinant protein over natt ved 4°C. Etter blokkering av ikke-spesifikk binding med BSA, så ble hlL-6R bindingssetene på den ene halvdelen av platen mettet med binding av kontrollantistoffet ved å tilsette 500 ng av kontrollen pr. brønn, og den andre halvdelen av platen ble tilsatt kun binding sbuffer. Etter tre timer med binding ved romtemperatur så ble de rensede antistoffene tilsatt ved en sluttkonsentrasjon på 50 ng/ml med eller uten det allerede eksisterende kontrollantistoffet i brønnen. Etter en time med tilleggsbinding så ble det frie antistoffet vasket bort og det platebundne antistoffet ble detektert med HRP-konjugert geite anti-mus IgG eller IgA, polyklonalt antistoff og platene ble utviklet ved å anvende kromatiske HRP substrater og absorbans ved 450 nm ble nedtegnet. Prosent fradrag av bindingen av anti-hll_6R antistoffene ved tilstedeværelsen av kontrollantistoffet er opplistet i tabell 3 under. Et lignende eksperiment ble utført ved å anvende overflateplasmonresonansteknologi (Tabell 3). Begge fremgangsmåter genererte overensstemmende resultater. Antistoffer VQ8F11, W3D8, W6A9, W6C10-1 bandt epitoper som overlappet med kontrollantistoffet mens antistoffer VQ8A9, Wl G4, W6F12, W7G4, W9A6 og W6C10-3 synes å binde distinkte epitoper ettersom antigenbinding ikke ble blokkert ved kontrollantistoff. Delvis konkurranse kan være et resultat fra sterisk hindring fra det første antistoffet som ble bundet selv om epitoper ikke trenger å være overlappende. ; Eksempel 6. Kryssarter bindingsegenskaper ;Fire antistoffer ble testet for kryss-reaktivitet til ape IL-6R rekombinant protein ved å anvende BIAcore™ teknologi. I korthet så ble en biosensor chip som geite anti-mus Fc polyklonalt antistoff var immobilisert på anvendt for å presentere anti-hlL-6R monoklonale antistoffer til en tetthet på ca. 75 RU. Rekombinant humant eller ape monomert IL-6R protein (Macaca fasciculahs, ekstracellulært domene; SEQ ID NO:251), ved et konsentrasjonsområde mellom 1.25 -40 nM, ble injisert over antistoffoverflaten. Bindingen av reseptoren til antistoffet og dissosieringen av det bundne komplekset ble målt i virkelig tid. Både assosiasjonshastighetskonstant (ka) og dissosiasjonshastighetskonstant (kd) ble skaffet tilveie og KDberegnet (Tabell 4). Blant de fire testede antistoffer så reagerte VQ8F11, W6A9 og VQ8A9 sterkt på apereseptor med Ko verdier skilte seg med opptil ca. hhv. 1.5- til ca. tre ganger fra human reseptorbinding. W1G4 som ikke ble blokkert av kontrollantistoffet (Tabell 3), viste ingen binding til apereseptor til tross for sterk binding til den humane reseptoren med KD på 241 pM. ;Eksempel 7. Effekt av konstant region på bindingsaffinitet ;Bindingsaffiniteten for monomer hlL-6R til fire antistoffer som har muse IgG, human IgGI eller humant lgG4 (vill-type og modifisert) ble bestemt ved å anvende BIAcore™ som beskrevet over unntatt at en geite anti-humant Fc polyklonalt antistoff overflate ble anvendt for å fange hlgG antistoffer. Monomer hlL-6R ble injisert ved konsentrasjoner på 12,5, 6,25, 3,12, og 1,56 nM. Evnen antistoffene har til å nøytralisere hlL-6-avhengig HepG2/STAT3 signaltransduksjon ble også bestemt i en luciferaseanalyse (IC50). IC50for forskjellige IgG isotyper var lignende, noe som tyder på at det ikke var noen effekt av isotype på antistoff affinitet for antigen. *

Claims (13)

1. Antistoff eller antigen-bindende fragment av dette, som spesifikt binder human interleukin-6 reseptor (hIL-6R) med en Kd på 500 pM eller mindre, som målt ved overflateplasmonresonans, der de tungkjede CDRene og de lettkjede CDRene omfatter: (i) SEQ ID NO:21, 23 og 25 som hhv. tungkjede CDR1, CDR2 og CDR3 og SEQ ID NO:29, 31 og 33 som hhv. lettkjede CDR1, CDR2 og CDR3; eller (ii) SEQ ID NO: 149, 151 og 153 som hhv. tungkjede CDR1, CDR2 og CDR3 og SEQ ID NO:157, 159 og 161 som hhv. lettkjede CDR1, CDR2 og CDR3.
2. 2. Antistoff eller antigen-bindende fragment ifølge krav 1, som omfatter HCVR/LCVR-par valgt fra SEQ ID NO: 19/27 eller 147/155.
3. 3. Antistoff eller antigen-bindende fragment ifølge krav 1 eller 2, som spesifikt binder hIL-6R med en KD på 300 pM eller mindre, som målt ved overflateplasmonresonans.
4. 4. Antistoff eller antigen-bindende fragment ifølge krav 1, 2 eller 3, som binder ML-6R med en affinitet som er minst to ganger høyere i forhold til dets binding til ape IL-6R.
5. 5. Isolert nukleinsyremolekyl som koder for et antistoff eller antigen-bindende fragment ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene.
6. 6. Vektor som omfatter nukleotidsekvensen ifølge krav 5.
7. 7. Vertvektorsystem for produksjonen av et antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff som spesifikt binder human IL-6 reseptor, som omfatter en vektor ifølge krav 6, i en passende vertscelle.
8. 8. Vertvektorsystem ifølge krav 7, der vertscellen er en prokaryotisk eller eukaryotisk celle valgt fra én av en E. coli- eller en CHO-celle.
9. 9. Fremgangsmåte for å produsere et anti-IL-6R antistoff eller antigen-bindende fragment av dette, som omfatter å dyrke celler i et vertvektorsystem ifølge krav 7 eller 8 under betingelser som tillater produksjon av antistoffet eller fragmenter av dette og å utvinne antistoffet eller fragmentet som blir produsert.
10. 10. Anvendelse av et antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, ved fremstilling av et medikament for anvendelse for å svekke eller hemme en IL-6-mediert sykdom eller lidelse hos et menneske, der den IL-6-mediert sykdommen eller lidelsen er artritt, en inflammatorisk tarmsykdom eller systemisk lupus erytematose.
11. 11. Antistoff eller antigen-bindende fragment av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, for anvendelse for å svekke eller hemme en IL-6-mediert sykdom eller lidelse hos et menneske, der den IL-6-mediert sykdommen eller lidelsen er artritt, en inflammatorisk tarmsykdom eller systemisk lupus erytematose.
12. 12. Farmasøytisk sammensetning som omfatter et antistoff eller et antigen-bindende fragment av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller hjelpestoff.
13. 13. Anvendelse ifølge krav 10 eller et antistoff eller fragment ifølge krav 11, der nevnte artritt er kronisk reumatoid artritt, eller nevnte inflammatoriske tarmsykdom er Crohr<i>s sykdom eller ulcerøs kolitt.