MX2014011898A - Anticuerpos anti-hla-b*27 y usos de estos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente a HLA-B*27 (también denominado HLA-B27). En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen a formas solubles y/o expresadas en la superficie celular de HLA-B*27. Los anticuerpos de la presente invención, en determinadas realizaciones, inhiben la activación de las células T mediada por HLA-B*27. Determinados anticuerpos ejemplares de la presente invención presentan una unión aumentada a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B (por ejemplo, HLA-B*07). La presente invención también proporciona anticuerpos anti-HLA-B*27 con características de unión dependiente del pH (por ejemplo, mayor afinidad de unión a pH neutro que a pH ácido). Los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la expresión de HLA-B*27, incluyendo espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías.

Description

ANTICUERPOS ANTI-HLA-B*27 Y USOS DE ESTOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, y a fragmentos de unión a antígeno de estos, que son específicos para HLA-B*27 humano y a métodos para usar estos.

ANTECEDENTES El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en los seres humanos se conoce como antígeno leucocitario humano (HLA). Las moléculas de HLA están implicadas de forma crítica en la presentación del antígeno y en las respuestas inmunes. HLA-B*27 es un alelo de HLA particular asociado con una alta incidencia de espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías seronegativas.

Las moléculas de HLA de clase I tales como HLA-B*27 consisten en dos cadenas: una cadena pesada unida a membrana que consiste en tres dominios Ig (alfa-1 , alfa-2 y alfa-3), y una cadena ligera común asociada no covalentemente conocida como beta-2-microglobulina (ß2??). Existen varios subtipos alélicos de HLA-B*27, incluyendo HLA-B*2701 hasta HLA-B*2728. Las diferencias de secuencia entre los alelos de HLA están confinadas en su mayor parte en el hueco de unión a péptido entre los dominios alfa-1 y alfa-2 de la cadena pesada. La presentación de los péptidos de origen intracelular (péptidos propios o virales) en el contexto de HLA-B*27 da lugar a la activación de clones de células T restringidos por HLA que expresan receptores de células T (TCR) específicos para el péptido particular.

Los anticuerpos frente a HLA-B*27 se conocen generalmente en la técnica, pero se describen principalmente para uso en aplicaciones de diagnóstico y/o detección. (Véase, por ejemplo, la Patente US No. 5.369.010, y Urban et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 911534-1538 (1994)). Así, existe una necesidad en la técnica de anticuerpos anti-HLA-B*27 nuevos, con alta afinidad de unión que sean adecuados para aplicaciones terapéuticas y otras utilidades.

COMPENDIO BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a HLA-B*27 humano. Los anticuerpos de la invención son útiles, ínter alia, para interferir con el reconocimiento de las células T de los antígenos presentados por HLA-B*27 y para tratar enfermedades y trastornos causados por o relacionados con la presentación de antígenos mediada por HLA-B*27. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse a un paciente para el tratamiento o alivio de espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo lgG1 o lgG4) o pueden comprender sólo una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para influir en la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, y 370, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 y 378, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia. La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de éste que comprende una pareja de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362 y 370/378. La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio de cadena pesada CDR3 (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 y 376, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia y un dominio de cadena ligera CDR3 (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo o parte de unión a antígeno de un anticuerpo comprende una pareja de secuencia de aminoácidos HCDR3/LCDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 376/384.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de este que comprende además un dominio de cadena pesada CDR1 (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, y 372, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de cadena pesada CDR2 (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 y 374, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio de cadena ligera CDR1 (LCDR1 ) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio de cadena ligera CDR2 (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente similar a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

Determinados anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos ejemplares no limitantes de la invención comprenden dominios HCDR1 -HCDR2-HCDR3-LCDR1 -LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16 (por ejemplo, H1 M2477N); 20-22-24-28-30-32 (por ejemplo, H1 M2490N); 36-38-40-44-46-48 (por ejemplo, H2M2482N); 52-54-56-60-62-64 (por ejemplo, H1 M2477N2); 68-70-72-76-78-80 (por ejemplo, H1 M2490N2); 84-86-88-92-94-96 (por ejemplo, H2M2482N2); 100-102-104-108-110-112 (por ejemplo, H1 M2480N); 116-118-120-124-126-128 (por ejemplo, H1 M2497N); 132-134-136-140-142-144 (por ejemplo, H2M2491N); 148-150-152-156-158- 60 (por ejemplo, H2M2499N); 164-166-168-172-174-176 (por ejemplo, H2M2718N); 180-182-184-188-190-192 (por ejemplo, H4H2524P); 196-198-200-204-206-208 (por ejemplo, H4H2526P); 212-214-216-220-222-224 (por ejemplo, H4H2528P); 228-230-232-236-238-240 (por ejemplo, H4H2530S); 244-246-248-252-254-256 (por ejemplo, H4H2532P); 260-262-264-268-270-272 (por ejemplo, H4H2534S); 276-278-280-284-286-288 (por ejemplo, H4H2538P); 292-294-296-300-302-304 (por ejemplo, H4H2542P); 308-310-312-316-318-320 (por ejemplo, H4H2555P); 324-326-328-332-334-336 (por ejemplo, H4H2559P); 340-342-344-348-350-352 (por ejemplo, H4H2560P); 356-358-360-364-366-368 (por ejemplo, H4H2562S); y 372-374-376-380-382-384 (por ejemplo, H4H2564S).

En una realización relacionada, la invención incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a HLA-B*27, en el que el anticuerpo o fragmento comprende los dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos en las secuencias de cadena pesada y ligera seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 1 14/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362 y 370/378. Los métodos y técnicas para identificar CDR en las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son muy conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar CDR en las secuencias de aminoácidos especificadas de HCVR y/o LCVR descritas en la presente memoria. Las convenciones ejemplares que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la localización de las regiones con bucle estructurales y la definición de AbM es un compromiso entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989).

También están disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR en un anticuerpo.

En una realización relacionada, la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que presenta una unión aumentada a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 que comprenden las SEQ ID NOs:52-54-56-60-62-64, respectivamente, con una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 33, una sustitución de histidina en el dominio HCDR2 en la posición del aminoácido 52, o una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 33 y una sustitución de histidina en HCDR2 en la posición del aminoácido 52.

En una realización relacionada, la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que presenta una unión aumentada a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno dominios HCDR1 -HCDR2-HCDR3-LCDR1 -LCDR2-LCDR3 que comprenden las SEQ ID NOs: 148-150-152-156-158-160, respectivamente, con una o más sustituciones de histidina: una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 32; una sustitución de histidina en el dominio HCDR2 en la posición del aminoácido 53; una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 32 y una sustitución de histidina en el dominio HCDR2 en la posición del aminoácido 53; una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 27, 30 y 32; una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 27, 28 y 32; una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 28, 30 y 32; una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 28, 30 y 31 ; una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 27, 28, 30 y 32; una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90, 92, 93 y 97; una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90, 92 y 97; una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 92, 93 y 97; una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90 y 93; una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 92 y 93; una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 100 y 106; una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 100 y 104; una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106; una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 100, 104 y 106; una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 104 y 106; una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106 y una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 28, 30 y 31 ; una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106 y una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90, 92 y 97; o una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106 y una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 92, 93 y 97.

En una realización relacionada, la invención incluye un anticuerpo aislado con sustitución de histidina o fragmento de unión a antígeno que se une a HLA-B*2705 a pH 6,0 con una CE50 que es al menos 1 ,5 veces mayor que la CE50 para la unión del anticuerpo a HLA-B*2705 a pH 7,2.

En otra realización, la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que se une a HLA-B*27 a pH 5,75 con una KD que es al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 12 veces o al menos 25 veces mayor que la KD para la unión del anticuerpo a HLA-B*27 a pH 7,2. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este que se une a HLA-B*27 a pH 5,75 con una KD que es mayor que la KD para la unión del anticuerpo a HLA-B*27 a pH 7,2 comprende una pareja de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 226/234, 258/266, 290/298, 338/346, y 370/378.

En una realización relacionada, la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que se une a HLA-B*2705 a pH 6,0 con una CE50 que es al menos 1 ,5 veces, al menos 10 veces, al menos 12 veces o al menos 25 veces mayor que la CE50 para la unión del anticuerpo a HLA-B*2705 a pH 7,2.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-HLA-B*27 o fragmentos de estos. Los vectores de expresión recombinantes que portan los ácidos nucleicos de la invención, y las células huésped en las que se han introducido dichos vectores, también están englobadas por la invención, así como los métodos para producir los anticuerpos mediante el cultivo de las células huésped en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos, y la recuperación de los anticuerpos producidos.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de este que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 , 17, 33, 49, 65, 81 , 97, 113, 129, 145, 161 , 177, 193, 209, 225, 241 , 257, 273, 289, 305, 321 , 337, 353, y 369, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de este que comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201 , 217, 233, 249, 265, 281 , 297, 313, 329, 345, 361, y 377, o una secuencia sustancialmente idéntica a esta que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71 , 87, 103, 119, 135, 151 , 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311 , 327, 343, 359, y 375, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, 31 , 47, 63, 79, 95, 111 , 127, 143, 159, 175, 191 , 207, 223, 239, 255, 271 , 287, 303, 319, 335, 351 , 367, y 383, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de este que comprende además un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51 , 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211 , 227, 243, 259, 275, 291 , 307, 323, 339, 355, y 371 , o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 21 , 37, 53, 69, 85, 101 , 117, 133, 149, 165, 181 , 197, 213, 229, 245, 261 , 277, 293, 309, 325, 341 , 357, y 373, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 , 27, 43, 59, 75, 91 , 107, 123, 139, 155, 171 , 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331 , 347, 363, y 379, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61 , 77, 93, 109, 125, 141 , 157, 173, 189, 205, 221 , 237, 253, 269, 285, 301 , 317, 333, 349, 365, y 381 , o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99% de homología con esta.

Según determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de este comprende las secuencias CDR de cadena pesada y ligera codificadas por las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y 9 (por ejemplo, H1 M2477N), 17 y 25 (por ejemplo, H1 M2490N), 33 y 41 (por ejemplo, H2M2482N), 49 y 57 (por ejemplo, H1 M2477N2), 65 y 73 (por ejemplo, H1M2490N2), 81 y 89 (por ejemplo, H2M2482N2), 97 y 105 (por ejemplo, H1 M2480N), 113 y 121 (por ejemplo, H1M2497N), 129 y 137 (por ejemplo, H2M2491N), 145 y 153 (por ejemplo, H2M2499N), 161 y 169 (por ejemplo, H2M2718N), 177 y 185 (por ejemplo, H4H2524P), 193 y 201 (por ejemplo, H4H2526P), 209 y 217 (por ejemplo, H4H2528P), 225 y 233 (por ejemplo, H4H2530S), 241 y 249 (por ejemplo, H4H2532P), 257 y 265 (por ejemplo, H4H2534S), 273 y 281 (por ejemplo, H4H2538P), 289 y 297 (por ejemplo, H4H2542P), 305 y 313 (por ejemplo, H4H2555P), 321 y 329 (por ejemplo, H4H2559P), 337 y 345 (por ejemplo, H4H2560P), 353 y 361 (por ejemplo, H4H2562S), y 369 y 377 (por ejemplo, H4H2564S).

La presente invención incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glicosilación no deseables o un anticuerpo que carezca de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para incrementar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase Shield et al. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse una modificación de la galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno de este que se une específicamente a HLA-B*27 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que comprende una combinación de un anticuerpo anti-HLA-B*27 y un segundo agente terapéutico. En una realización, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combina ventajosamente con un anticuerpo anti-HLA-B*27. Los agentes ejemplares que pueden combinarse ventajosamente con un anticuerpo ant¡-HLA-B*27 incluyen, sin limitación, otros agentes que inhiben la actividad de HLA-B*27 (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de estos, inhibidores peptídicos, pequeñas moléculas antagonistas, etc) y/o agentes que no se unen directamente a HLA-B*27 pero que sin embargo interfieren con, bloquean o atenúan la activación de las células T mediada por HLA-B*27.

En otro aspecto más, la invención proporciona métodos para inhibir la actividad mediada por HLA-B*27 usando un anticuerpo anti-HLA-B*27 o parte de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, en el que los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado, prevenido o mejorado puede ser cualquier enfermedad o afección que se mejora, alivia, inhibe o previene por la eliminación, inhibición o reducción de la actividad de HLA-B*27 (por ejemplo, la presentación de antígeno mediada por HLA-B*27). Los anticuerpos anti-HLA-B*27 o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden funcionar para interferir con la interacción de un complejo HLA-B*27/péptido con un receptor de células T, o para inhibir de otra manera la presentación de antígeno mediada por HLA-B*27 y/o la activación de las células T. Así, un aspecto de la invención son métodos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de HLA-B*27, comprendiendo el método administrar una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención a un paciente que padece o presenta riesgo de una enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de HLA-B*27. En algunas realizaciones de la invención, la enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de HLA-B*27 es espondiloartropatía, rechazo de trasplantes de órganos sólidos, o enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD). En algunas realizaciones de la invención, la espondiloartropatía que se trata, previene o mejora por los métodos de la invención son espondilitis anquilosante, artritis reactiva (Síndrome de Reiter), uveitis anterior aguda, initis, artritis psoriásica y/o colitis ulcerosa.

La presente invención también incluye el uso de un anticuerpo anti-HLA-B*27 o parte de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con o causado por la actividad de HLA-B*27.

Otras realizaciones serán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada subsiguiente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes de describir la presente invención, debe entenderse que esta invención no está limitada a los métodos y condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente memoria es sólo para el propósito de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitativa, ya que el alcance de la presente invención sólo estará limitado por las reivindicaciones adjuntas.

A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente," cuando se usa en referencia a un valor numérico recitado particular, significa que el valor puede variar del valor recitado no más de un 1%. Por ejemplo, tal y como se usa en la presente memoria, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque pueden usarse cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

Definiciones La expresión "HLA-B*27" (referido alternativamente como "HLA-B27") significa un complejo polipeptídico que comprende los dominios Ig alfa-1 , alfa-2 y alfa-3 de una cadena pesada alélica HLA-B*27, en asociación con un polipéptido beta-2-microglobulina. La expresión "HLA-B*27," tal y como se usa en la presente memoria, engloba todas las subvariantes alélicas de la familia HLA-B*27, incluyendo HLA-B*2701 hasta HLA-B*2728. Una subvariante alélica ejemplar de HLA-B*27 es HLA-B*2705 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:385. Otra subvariante alélica ejemplar de HLA-B*27 es HLA-B*2709 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:386. Las secuencias de aminoácidos de otras subvariantes alélicas de HLA-B*27 están disponibles en bases de datos públicas y serán muy conocidas para los expertos en la técnica. La expresión "HLA-B*27" incluye complejos de HLA-B*27 expresados en la superficie celular (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 4-6 en la presente memoria) así como proteínas de fusión solubles obtenidas artificialmente por ingeniería que comprenden los dominios Ig de HLA-B*27 alfa-1 , alfa-2 y alfa-3 fusionados con una proteína beta-2-microglobulina y opcionalmente un péptido restringido por HLA (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 en la presente memoria). Un ejemplo de una de dichas proteínas de fusión solubles HLA-B*27 es la construcción referida en la presente memoria como "scHLA-B27" que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:387.

El término "anticuerpo", tal y como se usa en la presente memoria, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, HLA-B*27). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas por puentes disulfuro, así como multímeros de estas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviado en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviado en la presente memoria como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (CL1 ). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, organizadas desde el extremo amino al extremo carboxi en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-HLA-B*27 (o parte de unión a antígeno de este) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana o pueden estar modificadas naturalmente o artificialmente. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse tomando como base un análisis paralelo de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", tal y como se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas completas de anticuerpo. Los términos "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y semejantes, tal y como se usan en la presente memoria, incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína natural, que se puede obtener enzimáticamente, sintético u obtenido por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, de moléculas completas de anticuerpo usando cualquier técnica estándar adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinantes que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica los dominios variables y opcionalmente constantes de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o está disponible fácilmente, por ejemplo, a partir de fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, bibliotecas de fago-anticuerpo), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante el uso de técnicas de biología molecular, por ejemplo, para organizar uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o delecionar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena única (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan a la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada tal como un péptido CDR3), o un péptido FR3-CDR3-FR4 constreñido. Otras molécula obtenidas por ingeniería, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos con dominio delecionado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, fragmentos divalentes, fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP), y dominios variables de tiburón IgNAR, también están englobados en la expresión "fragmento de unión a antígeno," tal y como se usa en la presente memoria.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos un dominio variable. El dominio variable puede tener cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprenderá generalmente al menos una CDR que está adyacente a o en marco con una o más secuencia marco. En los fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio VH asociado con un dominio VL, los dominios VH y VL pueden estar situados uno respecto al otro en cualquier organización adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Alternativamente, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio monomérico VH o VL.

En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente al menos a un dominio constante. Las configuraciones no limitativas, ejemplares de dominios variables y constantes que pueden encontrarse en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) VH-CH1 ; (¡i) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-Ch1-CH2-Ch3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1 ; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-Ch1-Ch2-CH3; (xüi) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ejemplares listadas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos por una región bisagra o conectora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos lo que resulta en una unión flexible o semi-flexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula de polipéptido. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homo-dímero o hetero-dímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante listadas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios monoméricos VH o VL (por ejemplo, por enlace (s) disulfuro(s)).

A igual que con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo comprenderá típicamente al menos dos dominios variables diferentes, en el que cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecíficos ejemplares descritos en la presente memoria, puede adaptarse para uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.

Los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar a través de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC). La "citotoxicidad dependiente de complemento " (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan el antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia de complemento. La "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo " (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcR) (por ejemplo, células Asesinas Naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula diana y de esta manera da lugar a la lisis de la célula diana. CDC y ADCC pueden medirse usando ensayos que son muy conocidos y están disponibles en la técnica. (Véanse, por ejemplo, las Patentes US Nos. 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998)). La reglón constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Así, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse tomando como base si es deseable que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

El término "anticuerpo humano", tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes obtenidas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", tal y como se usa en la presente memoria, no se pretende que incluya anticuerpos en los que las secuencias CDR obtenidas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

El término "anticuerpo humano recombinante", tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (descrito adicionalmente más adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos (descrito adicionalmente más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humanos (véase, por ejemplo, Taylor et al., Nucí. Acids Res. 20:6287-6295 (1992)) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humanos a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes obtenidas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se obtienen de y están relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio de línea germinal de anticuerpos humano in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas con la heterogeneidad de la bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos por un puente disulfuro intercadena en las cadenas pesadas. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante puentes disulfuro inter-cadena y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (mitad de anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.

La frecuencia de la aparición de la segunda forma en varios isotipos intactos de IgG se debe, pero no está limitada a, diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una única sustitución de aminoácidos en la región bisagra de la bisagra de lgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta niveles observados típicamente usando una bisagra de lgG1 humana. La presente invención engloba anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la bisagra, región CH2 o CH3 que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Un " anticuerpo aislado," tal y como se usa en la presente memoria, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en el que el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los propósitos de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ en una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido al menos a una etapa de purificación o aislamiento. Según determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede carecer sustancialmente de otros materiales celulares y/o compuestos químicos.

Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante", tal y como se usa en la presente memoria, se pretende que se refiera a un anticuerpo cuya unión a HLA-B*27 inhibe la interacción entre un complejo HLA-B*27/péptido y un receptor de células T. La inhibición causada por un anticuerpo neutralizante o bloqueante HLA-B*27 no necesita ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo apropiado. Los ensayos ejemplares para determinar si un anticuerpo bloquea la interacción entre HLA-B*27 y un receptor de células T se conocen en la técnica y se describen en otro lugar en la presente memoria. Los anticuerpos anti-HLA-B*27 descritos en la presente memoria pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de la cadena pesada y ligera comparado con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que se obtuvieron los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden averiguarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de anticuerpos. La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de estos, que se obtienen de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente memoria, en el que uno o más aminoácidos en una o más regiones marco y/o CDR están mutados al o a los residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo, o al o a los residuos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o a una sustitución de aminoácidos conservativa del o de los residuos de la línea germinal correspondiente (dichos cambios de secuencia se refieren en la presente memoria colectivamente como "mutaciones de la línea germinal "). Un experto en la técnica, empezando con las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera descritas en la presente memoria, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de estas. En determinadas realizaciones, todos los residuos marco y/o CDR en los dominios VH y/o VL están mutados de nuevo a los residuos encontrados en la secuencia de la línea germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otras realizaciones, sólo determinados residuos se mutan de nuevo a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, sólo los residuos mutados encontrados en los primeros 8 aminoácidos de FR1 o en los últimos 8 aminoácidos de FR4, o sólo los residuos mutados encontrados en CDR1 , CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más de los residuos marco y/o CDR están mutados al residuo(s) correspondiente(s) de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la que se obtuvo originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal en las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en el que determinados residuos individuales están mutados al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal particular mientras que otros determinados residuos que se diferencian de la secuencia de línea germinal original se mantienen o están mutados al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente para una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión incrementada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o aumentadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están englobados en la presente invención.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR descritas en la presente memoria que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR, por ejemplo, con 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones de aminoácidos conservativas respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR descritas en la presente memoria.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que comprenden variantes de los anticuerpos anti-HLA-B*27 con propiedades de unión dependientes del pH (es decir, unión reducida a pH bajo comparado con pH neutro), unión aumentada a subvariantes de HLA-ET27 (por ejemplo, afinidad de unión mayor para HLA-B*2705 y/o HLA-B*2709 comparado con HLA-B*07), y eficacia mejorada in vivo (por ejemplo, vida media en suero del anticuerpo mayor, inhibición prolongada de la activación de las células T, etc.). Dichas variantes incluyen variantes del anticuerpo anti-HLA-B*27 en las que las secuencias de CDR de un anticuerpo parental anti-HLA-B*27 se han alterado para reemplazar uno o más aminoácidos distintos de la histidina por un residuo de histidina. Los ejemplos de anticuerpos "parentales" anti-HLA-B*27 que pueden modificarse, mutarse u obtenerse de otra manera por ingeniería para poseer características de unión alteradas (por ejemplo, características de unión dependientes de pH aumentadas) incluyen anticuerpos anti-HLA_B*27 que comprenden cualquiera de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o dominios variables de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) como se describe en el Ejemplo 2, Tabla 1 , en la presente memoria. El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como un paratopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Así, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce yuxtaponiendo espacialmente aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

El término "identidad sustancial " o "sustancialmente idéntico," cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento de este, indica que, cuando se alinea de manera óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe una identidad en la secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 95%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% ó 99% de las bases nucleotídicas, según se mide por cualquier algoritmo muy conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se discute más adelante. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Según se aplica a los polipéptidos, el término "similitud sustancial " o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 95% de identidad de secuencia, incluso más preferiblemente al menos 98% ó 99% de identidad de secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas se diferencian por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos se diferencian entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son muy conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Métodos Mol. Biol. 24: 307-331 (1994). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina, y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos de aminoácidos preferidos para sustitución conservativa son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, y asparagina-glutamina. Alternativamente, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz PAM250 de logaritmo de probabilidades descrita en Gonnet et al. Science 256: 1443 45 (1992). Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz PAM250 de logaritmo de probabilidades.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se refiere como identidad de secuencia, se mide típicamente usando software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como GAP y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología o identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo salvaje y una muteína de esta. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre secuencias consultadas y buscadas (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 275:403-410 (1990) y Altschul er a/., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).

Características Biológicas de los Anticuerpos La presente invención incluye anticuerpos que se unen específicamente a HLA-B*27. El término "se une específicamente," o semejantes, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede estar caracterizada por una KD de aproximadamente 1x10"7 M o menos a 25°C y pH neutro. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son muy conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y semejantes. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una subvariante alélica particular de HLA-B*27 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otras subvariantes alélicas de HLA-B*27. Así, los anticuerpos que "se unen específicamente a HLA-B*27" incluyen anticuerpos que se unen específicamente a todas o a un subconjunto de subvariantes alélicas de HLA-B*27. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a HLA-B*2705 y/o HLA-B*2709 se considera un anticuerpo que "se une específicamente a HLA-B*27." La presente invención incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que se unen a una proteína de fusión soluble HLA-B*27 (por ejemplo, scHLA-B27-mmH [SEQ ID NO:387]) con una KD de menos de aproximadamente 260 nM a 25°C y pH neutro (por ejemplo, aproximadamente pH 7,2). Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que se unen a scHLA-B27-mmH, según se ensaya por resonancia de plasmón superficial a 25°C y pH 7,2 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 en la presente memoria), con una KD de menos de aproximadamente 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 50 nM, 1 nM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pm, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, o menos.

La presente invención incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que presentan una unión dependiente de pH a HLA-B*27. En algunas realizaciones de la invención, la expresión "unión dependiente de pH", tal y como se usa en la presente memoria, significa que un anticuerpo presenta un valor de KD a pH ácido (por ejemplo, pH 5,75) que es al menos 5 veces mayor que su valor de KD a pH neutro (por ejemplo, pH 7,2), cuando se ensaya usando resonancia de plasmón superficial, en el que los valores de KD a pH ácido y neutro se miden bajo las mismas o sustancialmente las mismas condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura, orientación antígeno/anticuerpo, concentración de reactivos, velocidad de flujo, etc.). Por ejemplo, un anticuerpo anti-HLA-B*27 se considera que tiene "unión dependiente de pH" para los propósitos de la presente descripción si la relación de su valor de KD para la unión a HLA-B*27 a pH 5,75 respecto a su valor de KD para la unión a HLA-B*27 a pH 7,2 es al menos aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11 ,0, 11 ,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 15,0, 20,0, 25,0, o mayor (véase, por ejemplo, la Tabla 6 [Ejemplo 3] en la presente memoria). En algunas realizaciones de la invención, la expresión "unión dependiente de pH", tal y como se usa en la presente memoria, significa que un anticuerpo presenta un valor de CE50 (es decir, concentración eficaz mitad de la máxima) en un ensayo de unión (por ejemplo, un ensayo quimioluminiscente) a pH ácido (por ejemplo, pH 6,0) que es al menos 3 veces mayor que el valor de CE50 a pH neutro (por ejemplo, pH 7,2), en el que los valores de CE50 a pH ácido y neutro se miden en las mismas o sustancialmente las mismas condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura, orientación antígeno/anticuerpo, concentración de reactivos, velocidad de flujo, etc.). Por ejemplo, un anticuerpo anti-HLA-B*27 se considera que tiene una "unión dependiente del pH" para los propósitos de la presente descripción si la relación de su valor de CE50 para la unión a HLA-B*27 a pH 6,0 respecto a su valor de CE50 para la unión a HLA-B*27 a pH 7,2 es al menos aproximadamente 1 ,6, 1 ,7, 1 ,8, 1 ,9, 2,0, 2,1 , 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1 , 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1 , 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1 , 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1 , 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 , 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11 ,0, 11 ,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 15,0, 20,0, 25,0 o mayor (véanse, por ejemplo, las Tablas 21 y 22 [Ejemplo 11] en la presente memoria). En algunas realizaciones de la invención, la unión dependiente de pH puede medirse en términos de constantes de velocidad de unión asociativa {ka), constantes de velocidad de unión disociativa (/cd) o vidas medias disociativas (t /2).

La presente invención también incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que son capaces de bloquear o reducir la activación de las células T mediada por HLA-B*27 in vitro. Un ensayo ejemplar para determinar si un anticuerpo bloquea o reduce la activación de las células T mediada por HLA-B*27 in vitro se muestra en el Ejemplo 4 en la presente memoria. En este Ejemplo, se usan dos líneas celulares obtenidas por ingeniería. La primera línea celular es una que expresa una variante alélica de cadena pesada de HLA-B*27 junto con ß2?? humana y un péptido restringido por HLA en su superficie. La segunda línea celular es una línea celular informadora que expresa un receptor de células T que, cuando se activa, produce una señal de luciferasa detectable. Se añaden varias cantidades de anticuerpo anti-HLA-B*27 a la primera línea celular antes de mezclar con la línea celular informadora, y se calculan los valores de Cl50. La presente invención incluye anticuerpos que presentan una Cl50 de menos de aproximadamente 12,5 nM cuando se ensayan en un bioensayo bloqueante como se muestra en el Ejemplo 4, o un ensayo sustancialmente similar. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que presentan una Cl50 de menos de aproximadamente 12 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pm, 400 pM, o menos cuando se ensayan en un bioensayo bloqueante como se muestra en el Ejemplo 4, o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que presentan una unión aumentada a una variante alélica de HLA-B*27 (tal como, por ejemplo, HLA-B*2705 y/o HLA-B*2709) comparado con otras variantes alélicas (no B*27) de HLA-B (tal como, por ejemplo, HLA-B*07). Un formato de ensayo ejemplar para determinar si un anticuerpo presenta unión aumentada a una o más variantes alélicas de HLA-B*27 se muestra en el Ejemplo 8 en la presente memoria. En este Ejemplo, se determinó la unión relativa de cada anticuerpo a células que expresan bien HLA-B*07, HLA-B*2705 o HLA-B*2709, comparado con su unión a células parentales que no expresan HLA. Usando este tipo de formato de ensayo, un anticuerpo que presenta una unión al menos 50 veces mayor a las células que expresan una variante alélica de HLA-B*27 comparado con la unión a la línea celular parental (representado por [++] o [+++] en la Tabla 15), pero una unión menos de 10 veces mayor a las células que expresan la variante alélica distinta de HLA-B*27 (por ejemplo, HLA-B*07) comparado con la unión a las células parentales (representado [+] en la Tabla 15) se considera un anticuerpo que presenta una "unión aumentada" a HLA-B*27 comparado con otra(s) variante(s) alélica(s) de HLA-B. En determinados casos, se considera que un anticuerpo presenta una "unión aumentada" a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B si el anticuerpo, cuando se ensaya en el formato de ensayo del Ejemplo 8 en la presente memoria o un formato de ensayo sustancialmente similar, muestra una unión al menos 50 veces mayor a las células que expresan una variante alélica de HLA-B*27 comparado con la unión a las células parentales (representado por [++] o [+++] en la Tabla 15), pero una unión menos de 3 veces mayor a células que expresan la variante alélica distinta de HLA-B*27 (por ejemplo, HLA-B*07) comparado con la unión a las células parentales (representado por [-] en la Tabla 15).

Mapeo de Epítopos y Tecnologías Relacionadas La presente invención incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que interaccionan con uno o más aminoácidos encontrados en los dominios Ig alfa-1 , alfa-2, y/o alfa-3 de una cadena pesada de HLA-B*27. Para HLA-B*2705 (SEQ ID NO:385) y HLA-B*2709 (SEQ ID NO:386), el dominio Ig alfa-1 consiste en los aminoácidos 25-1 14, el dominio Ig alfa-2 consiste en los aminoácidos 115-206, y el dominio Ig alfa-3 consiste en los aminoácidos 207-298 de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la cadena pesada completa. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos localizada en uno o más dominios Ig de una cadena pesada de HLA-B*27. Alternativamente, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) localizados en uno o más dominios Ig de una cadena pesada de HLA-B*27. Los anticuerpos de la presente invención también pueden interaccionar con uno o más aminoácidos en la secuencia de ß2?t? (SEQ ID NO:388). Varias técnicas conocidas para los expertos en la técnica pueden usarse para determinar si un anticuerpo "interacciona con uno o más aminoácidos" en un polipéptido o proteína. Las técnicas ejemplares incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies. Harlow and Lañe (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional por escaneo de alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, Métodos Mol Biol 248:443-463 (2004)), y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, Protein Science 9:487-496 (2000)). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos en un polipéptido con los que interacciona un anticuerpo es intercambio hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el mareaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que ocurra el intercambio hidrógeno-deuterio en todos los residuos excepto en los residuos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión con proteasa y análisis por espectrometría de masas, revelando de esta manera los residuos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interacciona el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring, Analytical Biochemistry 267 '(2): 52-259 (1999); Engen y Smith, Anal. Chem. 73:256A-265A (2001 ).

La presente invención incluye además anticuerpos anti-HLA-B*27 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos específicos ejemplares descritos en la presente memoria (por ejemplo, H1 M2477N, H1 M2490N, H2M2482N, H1 M2477N2, H1 M2490N2, H2M2482N2, H1 M2480N, H1 M2497N, H2M2491 N, H2M2499N, H2M2718N, H4H2524P, H4H2526P, H4H2528P, H4H2530S, H4H2532P, H4H2534S, H4H2538P, H4H2542P, H4H2555P, H4H2559P, H4H2560P, H4H2562S, H4H2564S, etc.). Asimismo, la presente invención también incluye anticuerpos anti-HLA-B*27 que compiten para la unión a HLA-B*27 con cualquiera de los anticuerpos específicos ejemplares descritos en la presente memoria (por ejemplo, H1 M2477N, H1 M2490N, H2M2482N, H1 M2477N2, H1 M2490N2, H2M2482N2, H1 2480N, H1 M2497N, H2M2491 N, H2M2499N, H2M2718N, H4H2524P, H4H2526P, H4H2528P, H4H2530S, H4H2532P, H4H2534S, H4H2538P, H4H2542P, H4H2555P, H4H2559P, H4H2560P, H4H2562S, H4H2564S, etc.).

Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite para unión con, un anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a un complejo HLA-B*27 (por ejemplo, una proteína de fusión soluble HLA-B*27/péptido o un HLA-B*27 expresado en la superficie celular formando un complejo con un péptido restringido por HLA). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse al complejo HLA-B*27. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a HLA-B*27 después de la unión a saturación con el anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente que el anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia. Por otra parte, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse al complejo HLA-B*27 después de unión a saturación con el anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia de la invención. Puede llevarse a cabo experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia de unión observada del anticuerpo de ensayo se debe de hecho a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo esférico (u otro fenómeno) es el responsable de la ausencia de unión observada. Los experimentos de esta clase pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión cuantitativo o cualitativo de anticuerpo disponible en la técnica. Según determinadas realizaciones de la presente invención, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o superpuestos) si, por ejemplo, un exceso de 1 , 5, 10, 20 ó 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro al menos un 50% pero preferiblemente 75%, 90% o incluso 99% según se mide en un ensayo de unión competitivo (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos superpuestos" si sólo un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reduce o elimina la unión del otro.

Para determinar si un anticuerpo compite para la unión con un anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia, la metodología de unión descrita anteriormente se realiza en dos orientaciones: En una primera orientación, se deja que el anticuerpo de referencia se una a un complejo HLA-B*27 en condiciones saturantes seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo al complejo HLA-B*27. En una segunda orientación, se deja que el anticuerpo de ensayo se una a un complejo HLA-B*27 en condiciones saturantes seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia al complejo HLA-ET27. Si, en ambas orientaciones, sólo el primer anticuerpo (saturante) es capaz de unirse al complejo HLA-B*27, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten para unión a HLA-B*27. Como apreciará un experto en la técnica, un anticuerpo que compite para la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia por la unión a un epítopo superpuesto o adyacente.

Preparación de Anticuerpos Humanos Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales totalmente humanos se conocen en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en le contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unen específicamente a HLA-B*27 humano.

Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, se aislan inicialmente anticuerpos quiméricos con alta afinidad frente a HLA-B*27 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la sección experimental más adelante, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención, por ejemplo lgG1 o lgG4 de tipo salvaje o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

Bioequivalentes Los anticuerpos anti-HLA-B*27 y fragmentos de anticuerpo de la presente invención engloban proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos pero retienen la capacidad de unirse a HLA-B*27 humano. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se compara con la secuencia parental, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-HLA-B*27 de la presente invención engloban secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia descrita, pero codifican un anticuerpo anti-HLA-B*27 o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-HLA-B*27 o fragmento de anticuerpo de la invención. Los ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos y de ADN variantes se han discutido anteriormente.

Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran en la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, bien dosis únicas o dosis múltiples. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y todavía pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para lograr concentraciones de fármaco eficaces en el cuerpo, por ejemplo, en el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacéutico particular estudiado.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no existen diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un incrementado esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, comparado con la terapia continua sin dicho cambio.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos de acción comunes para la afección o afecciones de uso, hasta el grado de que se conozcan dichos mecanismos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que la concentración del anticuerpo o sus metabolitos se mide en sangre, plasma, suero u otro fluido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de los datos de biodisponibilidad en seres humanos in vivo; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) se mide como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-HLA-B*27 de la invención pueden construirse, por ejemplo, haciendo varias sustituciones de residuos o secuencias o delecionando residuos o secuencias terminales o internas que no son necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica pueden delecionarse o reemplazarse con otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos después de la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpos anti-HLA-B*27 que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glicosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o quitan la glicosilación.

Inmunoconjugados La invención engloba anticuerpos monoclonales anti-HLA-B*27 conjugados con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que es perjudicial para las células. Los ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados son conocidos en la técnica, (véase, por ejemplo, WO 05/103081 ).

Anticuerpos Multiespecíficos Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, bi-específicos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., J. Immunol. 747:60-69 (1991 ); Kufer et al., Trends Biotechnol. 22:238-244 (2004). Los anticuerpos anti-HLA-B*27 de la presente invención pueden unirse a o co-expresarse con otra molécula funcional por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de este puede unirse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otra) a una o más entidades moleculares adicionales, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo bi-específico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos b¡-específ¡cos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico para HLA-B*27 o un fragmento de este, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo agente terapéutico o se conjuga con un resto terapéutico.

Un formato de anticuerpo bi-específico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio de inmunoglobulina (Ig) CH3 y un segundo dominio Ig CH3, en el que el primer y segundo dominios Ig CH3 se diferencian entre sí por al menos un aminoácido, y en el que al menos la diferencia de un aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A comparado con un anticuerpo bi-específico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ig CH3 se une a la Proteína A y el segundo dominio Ig CH3 contiene una mutación que reduce o suprime la unión a la Proteína A tal como una modificación H95R (numeración de exones por IMGT; H435R por numeración EU). El segundo CH3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Las modificaciones adicionales que pueden encontrarse en el segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG1 ; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos lgG4. Las variaciones en el formato de anticuerpo bi-específico descritas anteriormente se contemplan en el alcance de la presente invención.

Otros formatos biespecíficos ejemplares que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o fragmentos divalentes, fusiones IgG-scFv, dominio dual variable (DVD)-lg, Cuadroma, "botón en ojal" (knobs-into-holes), cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal" (knobs-into-holes), etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, cremallera de leucina, Duobody, lgG1/lgG2, Fab de acción dual (DAF)-lgG y formatos biespecíficos Mab2 (véase, por ejemplo, Klein ef al. 2012, mAbs 4:6, 1-11 , y las referencias citadas en esta, para una revisión de los formatos anteriores). Los anticuerpos biespecíficos también pueden construirse usando conjugación péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en la que aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal se usan para generar conjugados específicos de sitio anticuerpo-oligonucleótido que se auto-ensamblan en complejos multiméricos con una composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: dic. 4, 2012]).

Formulación y Administración Terapéutica La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-HLA-B*27 o fragmentos de unión a antígeno de estos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una transferencia, administración, tolerancia y semejantes mejoradas. En la lista de productos conocida para todos los químicos farmacéuticos puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, cremas, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilen glicoles de varios pesos moleculares), geles semi-sólidos, y mezclas semi-sólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipiente for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y tamaño del paciente, enfermedad diana, afecciones, ruta de administración y semejantes. La dosis preferida se calcula típicamente según el peso corporal o el área de superficie corporal. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar una afección o enfermedad asociada con la actividad de HLA-B*27 en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar intravenosamente el anticuerpo de la presente invención normalmente a una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, puede ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones y esquemas eficaces para administrar anticuerpos anti-HLA-B*27 pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, el progreso del paciente puede monitorizarse por evaluación periódica y ajustarse la dosis consecuentemente. Además, puede realizarse el escalado interespecie de dosificaciones usando métodos muy conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., Pharmaceut. Res. 8:1351 (1991 )).

Se conocen varios sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)). Los métodos de introducción incluyen, pero no están limitados a, rutas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de los recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse subcutáneamente o intravenosamente con una aguja y jeringa estándar. Además, respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de administración en pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de administración en pluma puede ser reusable o desechable. Un dispositivo de administración en pluma reusable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y reemplazarse por un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración en pluma puede reusarse. En un dispositivo de administración en pluma desechable, no hay un cartucho de reemplazo. En lugar de esto, el dispositivo de administración en pluma desechable viene prellenado con la composición farmacéutica contenida en un reservorio en el dispositivo. Una vez que el reservorio se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo entero se desecha.

Numerosos dispositivos de administración en pluma y autoinyectores reusables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar sólo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración en pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no están limitados a la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y WIKPEN™ (Eli Lilly), el Autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousy Oaks, CA), la pluma PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.), y la HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar sólo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 ). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Reléase, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. En otra realización más, puede ponerse un sistema de liberación controlada cerca de la diana de la composición, requiriéndose de esta manera sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Reléase, supra, vol. 2, pp. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones en goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrito anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio graso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, disolución salina fisiológica, una disolución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilen glicol, polietilen glicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (polioxietileno (50 mol) aducto de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio graso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se utiliza preferiblemente para rellenar una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para ajustar una dosis de los ingredientes activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, pastillas, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad contenida del anticuerpo mencionado anteriormente es generalmente aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en la forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las demás formas de dosificación.

Usos Terapéuticos de los Anticuerpos Los anticuerpos de la invención (y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos) son útiles, inter alia, para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de HLA-B*27 o tratable mediante el bloqueo o atenuación de la presentación de antígeno mediada por HLA-B*27. Las enfermedades y trastornos ejemplares que pueden tratarse con los anticuerpos anti-HLA-B*27 de la presente invención incluyen espondiloartropatías, tales como, por ejemplo, espondilitis anquilosante, artritis reactiva (Síndrome de Reiter), uveitis anterior aguda, initis, artritis psoriásica, colitis ulcerosa, etc. Las enfermedades y trastornos adicionales que pueden prevenirse, tratarse y/o mejorarse con los anticuerpos anti-HLA-B*27 de la presente invención incluyen rechazo de trasplantes de órganos sólidos y enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD).

Regímenes de Administración Según determinadas realizaciones de la presente invención, pueden administrarse a un sujeto múltiples dosis de anticuerpo anti-HLA-B*27 durante un curso de tiempo definido. Los métodos según este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo anti-HLA-B*27. Tal y como se usa en la presente memoria, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de anticuerpo anti-HLA-B*27 se administra al sujeto en un punto de tiempo diferente, por ejemplo, en diferentes días separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una única dosis inicial de un anticuerpo anti-HLA-B*27, seguido de una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-HLA-B*27, y opcionalmente seguido de una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-HLA-B*27.

Los términos "dosis inicial," "dosis secundarias," y "dosis terciarias," se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo anti-HLA-B*27. Así, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al principio del régimen de tratamiento (también referida como la "dosis de la línea base"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo anti-HLA-B*27, pero generalmente pueden diferenciarse una de otra en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de anticuerpo anti-HLA-B*27 contenida en las dosis inicial, secundaria y/o terciaria varía una de otra (por ejemplo, se ajustan hacia arriba o hacia abajo según sea apropiado) durante el curso del tratamiento. En determinadas realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5) dosis al principio del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguido de dosis posteriores que se administran con menor frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

En una realización ejemplar de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra 1 a 26 (por ejemplo, 1 , 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11 , 11½, 12, 121/2, 13, 131/2, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 191/2, 20, 20½, 21 , 21 ½, 22, 221/2, 23, 2372, 24, 24½, 25, 25½, 26, 261/2 o más) semanas después de la dosis inmediatamente precedente. La expresión "la dosis inmediatamente precedente" tal y como se usa en la presente memoria, significa, en una secuencia de múltiples administraciones, la dosis de anticuerpo anti-HLA-B*27 que se administra a un paciente antes de la dosis justo siguiente en la secuencia sin dosis intermedias.

Los métodos según este aspecto de la invención pueden comprender administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo anti-HLA-B*27. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, sólo se administra una única dosis secundaria al paciente. En otras realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más) dosis secundarias al paciente. Asimismo, en determinadas realizaciones, sólo se administra una única dosis terciaria al paciente. En otras realizaciones, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o más) dosis terciarias al paciente.

En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse con la misma frecuencia que las demás dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente precedente. De manera similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse con la misma frecuencia que las demás dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente precedente. Alternativamente, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarse durante el curso de tratamiento por un médico dependiendo de las necesidades del paciente individual después del examen clínico.

Terapias de Combinación La presente invención incluye regímenes de administración terapéutica que comprenden administrar un anticuerpo anti-HLA-B*27 de la presente invención en combinación con al menos un componente terapéuticamente activo adicional. Los ejemplos no limitativos de dichos componentes terapéuticamente activos adicionales incluyen otro agentes bloqueantes de HLA-B*27 tales como, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-HLA-B*27. Otros agentes que pueden administrarse beneficiosamente en combinación con los anticuerpos anti-HLA-B*27 de la invención incluyen inhibidores de citoquinas (incluyendo moléculas pequeñas inhibidoras de citoquinas y anticuerpos que se unen a citoquinas tales como IL-1 , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, o a sus receptores respectivos), antivirales, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o NSAID.

El o los componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse antes de, simultáneamente con, o después de la administración de un anticuerpo anti-HLA-B*27 de la presente invención; (para los propósitos de la presente descripción, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-HLA-B*27 "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional).

Usos de Diagnóstico de los Anticuerpos Los anticuerpos anti-HLA-B*27 de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir células que expresan HLA-B*27, o HLA-B*27 en una muestra, por ejemplo, para propósitos de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-HLA-B*27, o fragmento de este, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la presencia de una subvariante alélica de HLA-B*27 (por ejemplo, HLA-B*2705 o HLA-B*2709). Los ensayos de diagnóstico ejemplares para HLA-B*27 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-HLA-B*27 de la invención, en el que el anticuerpo anti-HLA-B*27 está marcado con un marcador detectable o molécula informadora. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo anti-HLA-B*27 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que en sí mismo está marcado de manera detectable. El marcador detectable o molécula informadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125l; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano o luciferasa. Los ensayos ejemplares específicos que pueden usarse para detectar o medir HLA-B*27 en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y separación de células activada por fluorescencia (FACS).

Las muestras que pueden usarse en los ensayos de diagnóstico de HLA-B*27 según la presente invención incluyen cualquier muestra de tejido o fluido que se puede obtener de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína HLA-B*27, o fragmentos de esta, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles de HLA-B*27 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente que no padece una enfermedad o afección asociada con HLA-B*27 o un alelo particular de HLA-B*27) se medirán para establecer inicialmente un nivel de línea base, o estándar, de HLA-B*27. Este nivel de línea base de HLA-B*27 puede compararse frente a los niveles de HLA-B*27 medidos en muestras obtenidas de individuos que se sospecha que tienen una enfermedad o afección relacionada con HLA-B*27.

EJEMPLOS Los ejemplos siguientes se muestran para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A no ser que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura está en grados Centígrados, y la presión es o está cerca de la atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de Anticuerpos Humanos frente a HLA-B*27 Humano Para generar anticuerpos anti-HLA-B*27, se inmunizó un ratón VELOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, la Patente US No. 6.596.541) según métodos estándar con una proteína de fusión soluble HLA-B*27 (que comprende el dominio extracelular de cadena pesada de HLA-B*2705 fusionado con un péptido restringido por HLA y la secuencia de ß2p?), o con tejidos/células que expresan HLA-B*27, así como combinaciones de estas. La respuesta inmune de anticuerpo se monitorizó por un inmunoensayo específico de HLA-B*27. Cuando se consiguió una respuesta inmune deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar las líneas celulares que producen anticuerpos específicos de HLA-B*27. Usado esta técnica se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-HLA-B*27 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos ejemplares generados de esta manera se designaron como sigue: 2477N, 2490N, 2482N, 2477N2, 2490N2, 2482N2, 2480N, 2497N, 2491 N, 2499N, y 2718N.

Los anticuerpos anti-HLA-B*27 también se aislaron directamente de células B positivas para antígeno sin fusión con células de mieloma, como se describe en US 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos totalmente humanos anti-HLA-B*27 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ejemplares generados de esta manera se designaron como sigue: 2524P, 2526P, 2528P, 2530S, 2532P, 2534S, 2538P, 2542P, 2555P, 2559P, 2560P, 2562S y 2564S.

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-HLA-B*27 ejemplares generados según los métodos de este Ejemplo se describen con detalle en los Ejemplos mostrados a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de Aminoácidos de la Región Variable de la Cadena Pesada y Ligera La Tabla 1 muestra los identificadores de secuencias de aminoácidos (SEQ ID NOs) para las regiones variables de la cadena pesada y ligera (HCVR y LCVR) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de anticuerpos anti-HLA-B*27 seleccionados.

Tabla 1 Los anticuerpos se refieren típicamente en la presente memoria según la nomenclatura siguiente: prefijo Fe (por ejemplo, "H4H", "H1 M", "H2M"), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "2477" o "2524" como se muestra en la Tabla 1 ), seguido de un sufijo "P", "N" o "S". Así, según esta nomenclatura, un anticuerpo puede referirse en la presente memoria como, por ejemplo, "H1 M2477N" o "H4H2524P". Los prefijos H4H, H1 M y H2M en las designaciones de los anticuerpos usadas en la presente memoria indican la región Fe particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1 M" tiene una lgG1 Fe de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una lgG4 Fe humana. Como apreciará un experto en la técnica, un anticuerpo H1 o H2M puede convertirse en un anticuerpo H4H, y vice versa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR) - que se indican por los identificadores numéricos mostrados en la Tabla 1 -permanecerán iguales.

Ejemplo 3. Afinidades de Unión y Constantes Cinéticas Derivadas de Resonancia de Plasmón Superficial de Anticuerpos Monoclonales Humanos anti-HLA-B*27 Las constantes de velocidad de unión asociativa y disociativa (ka y kd, respectivamente) y las constantes de disociación en equilibrio y las midas vidas disociativas {KD y t1/2, respectivamente) calculadas para la unión del antígeno a anticuerpos anti-HLA-B*27 purificados se determinaron usando un ensayo con biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T200, 3000, o T100-2). Los anticuerpos se ensayaron para unión a una proteína de fusión preparada por ingeniería en línea HLA-B*27 ectodominio ("scHLA-B27-mmH", SEQ ID NO:387) que consiste en los componentes siguientes: una secuencia peptídica restringida por HLA N-terminal (SRYWAIRTR, aminoácidos 1-9 de SEQ ID NO:387); seguida de una primera secuencia conectora (aminoácidos 10-19 de SEQ ID NO:387); seguida de la secuencia de beta-2 microglobulina humana (ß2?t?) (aminoácidos 20-118 de SEQ ID NO:387); seguida de una segunda secuencia conectora (aminoácidos 119-133 de SEQ ID NO:387); seguida de la región extracelular de la cadena pesada de HLA-B*2705 (aminoácidos 134-409 de SEQ ID NO:387); y terminando con una etiqueta de extremo C de mye-mye-hexahistidina (aminoácidos 410-437 de SEQ ID NO:387).

Los anticuerpos anti-HLA-B*27 se capturaron en una superficie con un anticuerpo específico policlonal de cabra anti-Fc-gamma humano (Jackson Lab, # 109-005-098) o un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fc humano (GE Healthcare, # BR-1008-39) creada a través del acoplamiento directo de amina a un chip sensor Biacore CM5. Se inyectaron diferentes concentraciones de scHLA-B27-mmH sobre la superficie con anticuerpo monoclonal capturado durante 4 minutos para determinar la velocidad de asociación, y la disociación se monitorizó durante 8 minutos. La unión dependiente de la temperatura (Tablas 4 y 5) se determinó a 25°C y 37°C a una velocidad de flujo de 50 µ?/min usando tampón HBST (0,01 M HEPES pH7,4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05% v/v tensioactivo P20). La unión dependiente de pH (Tablas 2 y 3) se determinó a la misma velocidad de flujo en tampón PBS que contenía 0,05% v/v tensioactivo P20.

Las constantes de velocidad cinética de asociación (ka) y disociación (/¾) se determinaron procesando y ajusfando los datos a un modelo de unión 1 :1 usando el software de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes de la disociación de la unión en equilibrio ( D) y las vidas medias disociativas (t1 2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: KD (M) = / d / ka y t½ (min) = [ln2/(60*/ d)]. Los resultados se muestran en las Tablas 2-5 (IC=no concluyente; NB = sin unión).

Tabla 2: Cinéticas de la Unión de scHLA-B27-mmH a Diferentes Anticuerpos Monoclonales Tabla 3: Cinéticas de la Unión de scHLA-B27-mmH a Diferentes Anticuerpos Monoclonales Tabla 4: Cinéticas de la Unión de scHLA-B27-mmH a Diferentes Anticuerpos Monoclonales Tabla 5: Cinéticas de la Unión de scHLA-B27-mmH a Diferentes Anticuerpos Monoclonales A 25°C en PBS a pH 7,2, 20 de 21 anticuerpos anti-HLA-B*27 se unieron a scHLA-B27- mmH con valores de KD que varían de 370 pM a 239 nM como se muestra en la Tabla 2. Un anticuerpo, H4H2499N, produjo una señal baja de unión con datos cinéticos que no pudieron ajustarse a modelos estándar (IC).

A 25°C en PBS a pH 5,75, 20 de 21 anticuerpos anti-HLA-B*27 se unieron a scHLA-B27- mmH con valores de KD que varían de 641 pM a 488 nM como se muestra en la Tabla 3. Un anticuerpo, H4H2499N produjo una señal baja de unión con datos cinéticos que no pudieron ajustarse a modelos estándar (IC).

A 25°C en HBST a pH 7,4, 23 de 24 anticuerpos anti-HLA-B*27 ensayados se unieron a scHLA-B27-mmH con valores de K0 que varían de 452 pM a 259 n como se muestra en la Tabla 4. Un anticuerpo, H4H2477N, no se unió a scHLA-B27-mmH en estas condiciones (NB).

Cuando se ensayó a 37°C en HBST a pH 7,4, 20 de los 21 anticuerpos anti-HLA-B*27 ensayados se unieron a scHLA-B27-mmH con valores de KD que varían de 837 pM a 430 nM como se muestra en la Tabla 5. Un anticuerpo, H4H2480N, no se unió a scHLA-B27- mmH en estas condiciones.

Se calculó la relación de valores de KD a pH 5,75 respecto a los valores de KD a pH 7,2 para cada uno de los anticuerpos ensayados para evaluar las propiedades de unión dependiente de pH de los anticuerpos anti-HLA-B*27 (Tabla 6). Tal y como se usa en la presente memoria, un anticuerpo anti-HLA-B*27 presenta una "unión dependiente de pH" si el anticuerpo presenta un alto nivel de unión (por ejemplo, un valor de KD menor) a un valor incrementado de pH comparado con la unión que presenta a un valor de pH menor; esto puede representarse como una relación de unión (por ejemplo, en la que la unión dependiente de pH se demuestra por un valor de KD a pH 5,75 que es al menos 5 veces mayor que su valor de KD a pH 7,2 (como en la Tabla 6 siguiente).

Tabla 6: Unión Dependiente de pH Como se muestra en la Tabla 6, los anticuerpos anti-HLA-B*27 de la presente invención que presentaron una unión dependiente de pH según la definición mencionada anteriormente son: H4H2530S, H4H2534S, H4H2542P, H4H2560P y H4H2564S.

Ejemplo 4. Anticuerpos anti-HLA-B*27 Bloquean la Activación de Células T Inducida por HLA-B*27 In Vitro Se desarrolló un bioensayo para medir la activación de las células T inducida por la interacción entre el complejo HLA-B*27-péptido y un receptor de células T (TCR) correspondiente utilizando un cultivo mixto obtenido de dos líneas celulares de mamífero: C1 R-neo (ATCC, # CRL-2369), una línea linfoblastoide B que se ha mostrado previamente que expresa niveles endógenos bajos o ninguno de moléculas HLA-A y HLA- B; y Jurkat, una línea de células T CD4+ humanas.

Para el primer componente del bioensayo, la línea celular C1 R-neo se transfectó de manera estable para sobreexpresar la cadena pesada de la subvariante alélica HLA- B*2705 (aminoácidos 25-362 de SEQ ID NO:385) y la beta 2 microglobulina humana (P2m¡ aminoácidos 21-119 de SEQ ID NO:388) junto con NP383-391 , un péptido de nueve aminoácidos restringido por HLA-B*27 (SRYWAIRTR [SEQ ID NO:389]) obtenido de la nucleoproteína del virus de la influenza A. Las células positivas para NP383-391 se separaron por FACS y se aisló una línea celular estable (C1 R-neo/HLA- ?*2705/ß2p?/??383-391), que se mantuvo en medio Iscove (Irvine Scientific, Cat. No. # 9032) suplementado con 10% suero fetal bovino y penicilina/estreptomicina/L-glutamina. Para el segundo componente del bioensayo, se modificó por ingeniería una línea celular informadora, Jurkat/NFAT-Luc (que presenta un elemento de respuesta IL-2 acoplado con expresión de luciferasa [NFAT-luciferasa]) para expresar: (1 ) GRb, un TCR que consiste en dos subunidades, alfa (SEQ ID NO:390) y beta (SEQ ID NO:391 ), que se clonaron de un individuo HLA-B*27+ (el receptor intacto, GRbAB, se une específicamente al péptido NP383-391 en un complejo con HLA-B*2705); y (2) el co-receptor CD8, que consiste en dos subunidades, alfa (SEQ ID NO:392) y beta (SEQ ID NO:393), que se requieren para la activación de TCR restringido por clase I (expresado normalmente en células T CD8+). La línea celular estable resultante (Jurkat/NFAT-Luc/CD8AB/GRbAB) se aisló y mantuvo en RPMI (Irvine Scientific, # 9160) suplementado con 10% suero fetal bovino y penicilina/estreptomicina/L-glutamina.

Para el bioensayo, las células C1 R-neo/HLA-B*2705^2m/NP383-391 se sembraron en placas de ensayo de 96 pocilios a 10.000 células/pocilio. Para determinar los valores de Cl50, se añadieron a las células diluciones senadas 1 :3 de los anticuerpos anti-HLA-B*27 empezando desde 100 nM hasta 0,1 nM (más un control sin anticuerpo) y se incubó durante 1 hora a 37°C en 5% C02. Para estimular la interacción HLA-TCR, se añadieron 100.000 células Jurkat/NFAT-Luc/CD8AB/GRbAB a cada pocilio y se incubó durante 5 horas a 37°C en 5% C02. La actividad luciferasa se detectó añadiendo reactivo de sustrato OneGlo (Promega, # E6051 ). Los resultados se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7: Bloqueo por el Anticuerpo anti-HLA-B*27 de la estimulación dependiente de células C1 R-neo/HLA-B*2705/p2m/NP383-391 de células Jurkat/NFAT- Luc/CD8AB/GrbAB Como se muestra en la Tabla 7, trece de los 21 anticuerpos anti-HLA ensayados en el bioensayo de cultivo mixto bloquearon la estimulación dependiente de células C1R-Neo/HLA-B*2705/ 2m/NP383-391 de células Jurkat/NFAT-Luc/CD8AB/GrbAB con valores de Cl50 que varían de 85,6pM a 18,1nM. Además, 6 de los 21 anticuerpos también bloquearon en el ensayo, pero no de una manera sigmoidea. Un anticuerpo ensayado, H4H2477N2, presentó una activación fuerte en el bioensayo de cultivo mixto, pero no de una manera sigmoidea.

Ejemplo 5. Análisis por Citometría de Flujo para Confirmar la Unión de Anticuerpos Anti-HLA-B*27 a Células que Expresan HLA-B*27 Se utilizó análisis por citometría de flujo para confirmar la unión de anticuerpos anti-HLA- B*27 a células HLA-B*27+. Las células ensayadas incluyeron: (a) la línea celular C1 R-neo-B*2705; (b) esplenocitos de ratones transgénicos HLA-B*27; y (c) células primarias mononucleadas de sangre periférica (PBMC) humana de individuos HLA-B*27+. La línea celular C1 R-neo-B*2705 es un derivado de la línea celular parental C1 R-neo transfectada de manera estable para sobreexpresar la cadena pesada del alelo HLA-B*2705 y beta 2 microglobulina humana (véase el Ejemplo 4). Las células parentales C1R-neo no transfectadas se usaron como un control negativo. Se generó una cepa de ratón transgénico por la expresión heterocigota transgénica de la cadena pesada de HLA-B*2705 y 2microglobulina humana [C57BL/6J-Tg(HLA-B27) 30-4Trg cepa de ratón; stock # 003440 de The Jackson Laboratory]. Los esplenocitos de miembros de una carnada de tipo salvaje se usaron como un control negativo para los esplenocitos heterocigotos HLA-B*27+. Las PBMC primarias humanas se genotiparon como positivas para HLA-B*27, y la expresión del alelo HLA-B*27 se confirmó tiñendo con un anticuerpo comercial anti-HLA-B*27 (HLA ABC Ab; Millipore # MAB1285F). Las PBMC de donantes HLA-B*27" se usaron como un control negativo.

Para los experimentos con esplenocitos de ratón, los ratones se sacrificaron y los bazos se extrajeron y homogeneizaron mecánicamente. La suspensión celular se filtró y las células mononucleadas se purificaron en una columna de gradiente Histopaque. Las PBMC humanas se purificaron del concentrado de células blancas (Leukopak; New York Blood Bank, NY, # E3752V00) en una columna de gradiente Histopaque.

Para los análisis por citometría de flujo, 100.000 células se lavaron en tampón de tinción (eBioscience, # 00-4222) y se incubaron con IgG humana completa (10 pg/ml) (Jackson ImmunoResearch, # 009-000-003) durante 15 minutos a 4°C para bloquear los receptores Fe en las células. A continuación, los anticuerpos anti-HLA-B*27 se añadieron a las concentraciones indicadas (0,1 ó 1 Mg/ml) y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron una vez y se incubaron con un anticuerpo secundario anti-Fc humano (dilución 1:2.000) (Jackson ImmunoResearch, # 709-116-149) durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces y se adquirieron medidas de fluorescencia usando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, MD) y se analizaron mediante software FlowJo. El bloqueo con IgG humana completa sola no generó una señal de unión por encima del fondo cuando se detectó con un anticuerpo secundario anti-hFc. Los resultados se resumen en la Tabla 8 (WT = ratón de tipo salvaje; TG = ratón transgénico HLA-B27/hp2m).

Tabla 8: Unión por FACS de anticuerpos anti-HLA a células con diferentes patrones de expresión de HLA Intensidad Media de Fluorescencia ( FI) Como se muestra en la Tabla 8, todos los anticuerpos anti-HLA-B*27 ensayados se unieron a esplenocitos transgénicos HLA-B*27+, mientras que no se detectó unión por encima del nivel de fondo en los esplenocitos de ratones de tipo salvaje. De manera similar, todos los anticuerpos se unieron a células C1 R-neo-B*2705. En las células parentales C1 R-neo, no se detectó unión por encima del nivel de fondo para H4H2499N, H4H2542P y H4H2562P, mientras que todos los demás anticuerpos mostraron varios niveles de unión por encima del nivel de fondo, pero menores que a células C1 R-neo- B*2705. En PBMC humanas, todos los anticuerpos tiñeron las células aisladas de la sangre de un individuo que se confirmó que expresaba el alelo HLA-B*27 por genotipado ("B27(pos)"). Cuando se compara con la unión a PBMC de un donante negativo para HLA-B*27 ("B27(neg)") las relaciones de unión variaron de 1 ,1 a 5,6, presentando H4H2499N la mayor especificidad para PBMC HLA-B*27+.

Ejemplo 6. Unión de Anticuerpos HLA-B*27 a Células Mononucleadas de Sangre Periférica (PBMC) Se llevaron a cabo experimentos adicionales de citometría de flujo usando PBMC que se había mostrado que expresaban alelos distintos de HLA-B*27. Se recogió sangre humana de 4 donantes en tubos con anti-coagulante K2-EDTA (BD, #366643). El ADN genómico se purificó según las especificaciones del fabricante a partir de muestras de sangre completa usando un minikit de ADN de sangre QlAamp (Qiagen, #51304). Las muestras de ADN genómico se amplificaron y se llevó a cabo la reacción de secuenciación específica del locus HLA subsiguiente usando un kit SeCore (Invitrogen, locus A #5300925, locus B #5311925D, locus C # 5320925). La secuencia de ADN se determinó usando un Analizador de ADN ABI 3730xL, y el tipo HLA se determinó usando software de secuenciación uType SBT HLA (Invitrogen, #53999-1 ).

Las PB C humanas se aislaron de la sangre de los mismos donantes por centrifugación en Ficoll. Las PBMC se bloquearon con IgG Humana ChromPure (Jackson Immunoresearch, # 009-000-003), se tiñeron con 1ug/ml de anticuerpos anti-HLA durante 30 minutos a 4°C seguido de lavado con tampón de tinción (BD Biosciences, # 554657) e incubación con una dilución 1 :500 de anticuerpo secundario anti-lgG humana marcado con APC (Jackson Immunoresearch, #109-136-098) durante 20 minutos a 4°C. Las PBMC se lavaron, se resuspendieron en fijador estabilizante (BD Biosciences, #338036) y se separaron en un equipo FACS Canto. Los datos se analizaron usando software FlowJo.

Los alelos HLA de Clase I determinados a partir de los donantes HD1 , HD2, HD3 y HD4 se muestran en la Tabla 9. Se determinó que ninguno de los 4 donantes ensayados era positivo para HLA-B*27.

Tabla 9: Tipado de HLA Clase I para 4 muestras de sangre completa de donantes La unión de anticuerpos anti-HLA a PBMC de los donantes con tipado de HLA, según se determina por citometría de flujo, se muestra en la Tabla 10.

Tabla 10: Unión por FACS de anticuerpos anti-HLA a PBMC de 4 donantes Como se muestra en la Tabla 10, todos los anticuerpos anti-HLA se unieron a las PBMC de todos los donantes en algún grado, excepto los anticuerpos H4H2534S, H4H2538P, H4H2542P y H4H2555P, que no se unieron a las PBMC del donante HD2. Los anticuerpos H4H2499N y H4H2718N (las dos últimas filas de la Tabla 10) muestran la menor cantidad de unión a las PBMC de donantes no B*27.

Ejemplo 7. Unión de Anticuerpos HLA-B*27 a HLA*B de Superficie El análisis por citometría de flujo se utilizó adicionalmente para determinar la especificidad de la unión de anticuerpos anti-HLA a líneas celulares modificadas por ingeniería para sobreexpresar diferentes alelos de HLA*B. Para generar líneas celulares que expresan diferentes alelos de HLA, las células parentales K562 (leucemia mielógena humana inmortalizada) se electroporaron con plásmidos de ADN para estimular la integración estable de 23 alelos diferentes de HLA (mostrado en la Tabla 11 ) así como un gen de resistencia a antibiótico frente a neomicina o higromicina. Las líneas celulares electroporadas se pusieron en selección de antibiótico durante 2,5 a 5 semanas para seleccionar las células que expresan los alelos de HLA específicos. Las líneas celulares K562/HLA resultantes se separaron por FACS para poblaciones con los niveles más altos de HLA superficial (el 10% más alto de los que expresan) usando un anticuerpo multiespecífico HLA-A, B, C (clon W6/32) conjugado con ficoeritrina (Biolegend, #311406).

Tabla 11: Alelos de HLA-B usados en la generación de líneas celulares K562 que expresan HLA-B Para realizar el análisis por citometría de flujo, se lavaron, ~2 x 10 células/pocilio en 200 uL de Tampón de Tinción (BSA) (BD Pharmingen, #554657) y se bloquearon con 1 ug/mL de IgG humana purificada (Jackson ImmunoResearch, # 009-000-003) durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron anticuerpos anti-HLA a 1 g/mL y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces con Tampón de Tinción y se incubaron con un reactivo secundario policlonal de cabra F(ab')2 conjugado con aloficocianina que es específico para el fragmento Fe gamma de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, # 109-136-098) a una dilución 1 :500 durante 20 minutos a 4°C. Las células se lavaron dos veces con 200 uL y las medidas de fluorescencia se adquirieron usando un instrumento FACSCanto II (BD Biosciences, MD) y se analizaron usando software FlowJo (Tree Star).

Los resultados para los 20 anticuerpos anti-HLA que se unen a las líneas celulares K562 que expresan diferentes alelos de HLA-B mostrados como relación de la señal MFI respecto a la de las líneas celulares parentales K562 se muestran en las Tablas 12, 13 y 14, a continuación. De los 20 anticuerpos ensayados, H4H2499N presentó el grado más alto de especificidad.

Tabla 12: Unión por FACS de anticuerpos anti-HLA a células K562 que expresan siete alelos diferentes de HLA-B Tabla 13: Unión por FACS de anticuerpos anti-HLA a células K562 que expresan seis alelos diferentes de HLA-B Tabla 14: Unión por FACS de anticuerpos anti-HLA a células K562 que expresan diez alelos diferentes de HLA-B Relación de MFI respecto a parental Ejemplo 8. Unión Preferente de los Anticuerpos a Subvariantes Alélicas de HLA-B*27 Se midió la capacidad de anticuerpos anti-HLA-B*27 de unirse a subvariantes alélicas de HLA-B*27 humano en la superficie celular (es decir, HLA-B*2705 y HLA-B*2709), comparado con su capacidad de unirse a la variante alélica HLA-B*07, usando tecnología de detección por electroquimioluminiscencia. Para estos estudios, se usaron células C1 R-neo transfectadas de manera estable para expresar bien la cadena pesada de HLA- B*07 (CR1-B7, ATCC #CRL-2371 ), la cadena pesada de HLA-B*2705 (aminoácidos 25-362 de SEQ ID NO:385), o la cadena pesada de HLA-B*2709 (aminoácidos 25-362 de SEQ ID NO:386). Cada una de las líneas celulares que expresan HLA-B* también expresaba beta 2 microglobulina humana ( 2m¡ aminoácidos 21-119 de SEQ ID NO:388) que forma un complejo no covalente con la cadena pesada de HLA.

Las células se recogieron y contaron usando un contador celular Cellometer™ Auto T4 (Nexcelom Bioscience). Se sembraron aproximadamente 20.000 células por pocilio en PBS en placas con electrodo de carbono (Meso Scale Discovery, # L15-XB-3/L11XB-3) y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de bloquear con PBS + 2% (p/v) BSA durante 1 hora a 25°C, se transfirieron bien 1 nM ó 1 ,1 nM de anticuerpos anti-HLA-B*27 a las células unidas a las placas y se incubaron durante 1 hora a 25°C. Los anticuerpos no unidos se eliminaron por lavado usando un lavador de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Los anticuerpos anti-HLA-B*27 unidos a las células se detectaron bien con anticuerpos anti-mFc (Jackson ImmunoResearch, #115-005-164) o anti-hFc (Meso Scale Discovery, #R32AJ-1) conjugados con SULFO-TAG™. Para la medida de la unión a células, se añadió Tampón de Lectura MSD (Meso Scale Discovery, #R92TD-2) a la mezcla célula-anticuerpo y después se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la estimulación electroquímica. La luminiscencia se detectó usando un lector SECTOR Imager 6000 (MSD) usando un filtro para una longitud de onda de 620 nm. La intensidad de luminiscencia se correlaciona con la cantidad de anticuerpos unidos a las células. Las relaciones de especificidad de los anticuerpos anti-HLA-B*27 que se unen bien a células C1 R-B*07, C1 R-neo B*2705 o C1 R-neo B*2709, respecto a células parentales C1 R-neo, se muestran en la Tabla 15. (-) indica relaciones de 1 a 3 veces por encima de la unión a células C1 R-neo; (+) indica relaciones de 3 a 10 veces por encima de la unión a células C1 R-neo; (++) indica relaciones de 10 a 50 veces por encima de la unión a células C1 R-neo; y (+++) indica relaciones mayores de 50 veces por encima de la unión a células C1 R-neo.

Tabla 15: Relaciones Relativas de Unión de Anticuerpos a Células que Expresan Como se muestra en la Tabla 15, sólo H2aM2482N presentó una unión significativa a células que expresan el alelo HLA-B*07 (con una relación de especificidad de 10 a 50 veces por encima de la unión a células C1 R-neo). Los anticuerpos H1 M2477N, H1 M2480N, H2aM2482N, H1 M2490N, H2aM2499N, H4H2524P, H4H2526P, H4H2528P, H4H2532P, H4H2538P, H4H2555P, H4H2559P, y H4H2562S presentaron una unión aproximadamente equivalente a células que expresan la variante alélica HLA-B*2705 que a células que expresan la variante alélica HLA-B*2709. Por otra parte, determinados anticuerpos ejemplares presentaron una unión relativamente más fuerte a células que expresan el alelo HLA-B*2705 comparado con células que expresan el alelo HLA-B*2709 (por ejemplo, H1M2497N, H2bM2718N, H4H2530S, H4H2534S, H4H2542P, y H4H2560P).

Todos los anticuerpos ensayados, excepto H2bM2491 N y H4H2564S, presentaron una unión aumentada a células que expresan las subvariantes alélicas HLA-B*2705 y/o HLA-B*2709 comparado con células que expresan la variante alélica HLA-B*07. El anticuerpo H2aM2499N, por ejemplo, mostró una unión al menos 50 veces mayor a células que expresan las subvariantes alélicas HLA-B*2705 y HLA-B*2709 por encima de la unión a células C1 R-neo (representado por [+++] en la Tabla 15), y una unión menor de 3 veces mayor a células que expresan la variante alélica HLA-B*07 por encima de la unión a células C1 R-neo (representado por [-] en la Tabla 15). De manera similar, pero menos pronunciada, se observaron características de unión aumentada con varios otros anticuerpos anti-HLA-B*27 ejemplares ensayados en este Ejemplo, como se muestra en la Tabla 15.

Ejemplo 9. Actividad de los Anticuerpos anti-HLA-B*27 Evaluada In Vivo Se investigó la actividad de los anticuerpos anti-HLA-B*27 in vivo. HLA-B*27 (aminoácidos 25-362 de UniProt número de registro P03989) y beta 2 microglobulina humana (ß2??; aminoácidos 21-119 de GenBank número de registro NP_004039) se sobreexpresaron en el hígado de ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT) obtenidos de Jackson Laboratory por administración hidrodinámica de ADN (HDD). Para el experimento de HDD, los ratones WT se dividieron en grupos de 2-5 ratones por cohorte, y se inyectó a cada ratón 50 µg de plásmido que expresa HLA-B*27 más 50 µg de plásmido que expresa ß2?t? ó 50 µg de un plásmido control vacío. En los días 3 y 10 posteriores a la inyección HDD, se inyectó a los ratones en cada una de las cuatro cohortes intra-peritonealmente 30mg/kg de anticuerpos anti-HLA H4H2542P, H4H2499N o H4H2482P, o un anticuerpo con isotipo control. Los ratones se sacrificaron en el día 14 posterior a HDD, y las células que se infiltraban en el hígado se aislaron por tratamiento con colagenasa y centrifugación en percoll. Las células sanguíneas rojas del hígado se lisaron usando tampón de lisis ACK (Gibco, #A1492-01 ). Las células inmunes infiltrantes se tiñeron con un agente de tinción de célula viva/muerta (Invitrogen, #L34957) así como un anticuerpo anti-CD45 (eBioscience, #12-0451-82) para detectar leucocitos infiltrantes y anticuerpos anti-CD3 (BD Biosciences, #552774), anti-CD4 (Biolegend, #100414) y anti-CD8 (Biolegend, #100734) para identificar diferentes poblaciones de células T. Se realizó citometría de flujo en un FACS Canto y los datos se analizaron usando software FlowJo. Los niveles de infiltración de las células inmunes en general, y de células CD8+ y CD4+ en particular, en los hígados de los animales sacrificados se midieron en términos de frecuencia, es decir, el porcentaje de células intactas/vivas de los hígados aislados por tratamiento con colagenasa y centrifugación en percoll que eran linfocitos, células CD8\ o células CD4+ (a diferencia, por ejemplo, de hepatocitos).

La frecuencia de células vivas en la entrada linfocito (Tabla 16) así como las frecuencias de células T CD8+ (Tabla 17) y CD4+ (Tabla 18) infiltrantes en el hígado se analizaron por citometría de flujo. Los ratones a los que se inyectó plásmidos control mostraron una frecuencia de aproximadamente 10% células inmunes y 1% de células T CD8+ y CD4+ infiltrantes en el hígado, independientemente del tratamiento con anticuerpo. Por el contrario, la sobreexpresión de HLA-B*27 y ß2?? dio lugar a un incremento en la frecuencia de infiltrados de células inmunes (media = 27%) incluyendo un incremento en las células T CD8+ y CD4+ (6,1% y 3,3%, respectivamente) en los ratones tratados con anticuerpo con isotipo control. El tratamiento de ratones que expresan ???-?*27/ß2?? con los anticuerpos anti-HLA, H4H25422P y H4H2499N, dio lugar a una reducción significativa de las células inmunes infiltrantes en el hígado. Esto fue más destacado en ratones tratados con H4H2499N, que también resultó en una disminución significativa del porcentaje de células T CD8+ y CD4+. Por el contrario, el anticuerpo anti-HLA H4H2482P y el control de isotipo no tuvieron una reducción significativa en la infiltración de células inmunes en el hígado. Por lo tanto, el anticuerpo anti-HLA H4H2499N es capaz de bloquear la infiltración de células inflamatorias en el hígado de ratones que sobreexpresan HLA-B*27 y ß2?? por HDD.

Tabla 16: Frecuencia de células inmunes infiltrantes en el hígado Tabla 17: Frecuencia de células T CD8+ totales en el hígado Ejemplo 10. Construcción de Anticuerpos anti-HLA-B*27 Variantes con Sustitución de Histidina En un intento de generar variantes de los anticuerpos anti-HLA-B*27 con propiedades de unión dependiente de pH (es decir, unión reducida a pH bajo comparado con pH neutro) y eficacia mejorada in vivo (por ejemplo, vida media en suero del anticuerpo más larga, inhibición prolongada de la activación de las células T, etc.), se construyó una serie de anticuerpos variantes. En particular, se construyeron versiones mutantes de los anticuerpos parentales H4H2477N2 y H4H2499N en las que cada aminoácido (distinto de histidina) en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cada anticuerpo se mutó individualmente a histidina. Como se muestra en la Tabla 1, la región variable de la cadena pesada (HCVR) del anticuerpo parental H4H2477N2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y la región variable de la cadena ligera (LCVR) del anticuerpo parental H4H2477N2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO;58, la región variable de la cadena pesada (HCVR) del anticuerpo parental H4H2499N comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y la región variable de la cadena ligera (LCVR) del anticuerpo parental H4H2499N comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:154; Las secuencias de CDR de los anticuerpos parentales H4H2477N2 y H4H2499N se representan en las Tablas 19A y 19B, respectivamente.

Tabla 19 A: Secuencias de CDR de mAb H4H2477N2 Tabla 19B: Secuencias de CDR de mAb H4H2499N Se hicieron cuarenta y ocho variantes con sustitución de histidina de H4H2477N2 (31 mutantes de cadena pesada de CDR y 17 mutantes de de cadena ligera de CDR); y se hicieron 43 variantes con sustitución de histidina individual de H4H2499N (25 mutantes de cadena pesada de CDR y 18 mutantes de cadena ligera de CDR). Los anticuerpos variantes obtenidos del medio de cultivo (sobrenadante) después de la expresión transitoria en células de ovario de hámster chino (CHO) se cribaron para unión dependiente de pH, es decir, unión reducida a las células que expresan HLA-B*27 a pH ácido comparado con pH neutro. Tomando como base el cribado inicial del sobrenadante, se seleccionaron varios anticuerpos variantes que comprenden sustituciones de histidina únicas y múltiples en las CDR para estudios adicionales, como se resume en la Tabla 20. Las designaciones de la sustitución de His mostradas en la Tabla 20 (por ejemplo, "Y33H", "N52H", etc. para H4H2477N2; y "Y32H", "T53H", etc. para H4H2499N) se refieren a las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) de H4H2477N2 (es decir, SEQ ID NOs: 50/58) y H4H2499N (es decir, SEQ ID NOs:146/154). Una celda vacía en la Tabla 20 indica la secuencia parental.

Tabla 20: Sustituciones de Histidina Seleccionadas para Estudio Adicional Ejemplo 11. Unión selectiva de pH de Anticuerpos anti-HLA-B*27 Variantes con Sustitución de Histidina a Células que Expresan HLA-B*27 Se hicieron sustituciones de histidina en un único sitio y en múltiples sitios para el o los aminoácidos parentales en las regiones CDR de dos anticuerpos anti-HLA, H4H2477N2 y H4H2499N, para incrementar la unión selectiva de pH (véase el Ejemplo 10). Estas variantes de histidina y sus anticuerpos parentales se ensayaron para unión a HLA-B27 humano en la superficie celular expresado en células C1 R-neo HLA-B*2705 tanto a pH 7,2 como a pH 6,0, usando también tecnología de detección por electroquimiolumlniscencia. Las células se recogieron, se contaron y se sembraron en placas con electrodo de carbono de 96 pocilios y también se bloquearon como se ha descrito previamente (véase el Ejemplo 8). Para la evaluación de la unión a pH 6,0, las células unidas a las placas se lavaron con tampón pH 6,0 [50mM MES, 0.0025M KCI, 0,137M NaCI, 0,0005M MgCI2x6H20, 0.0009M CaCI2, 0,5% (p/v) BSA; ajustado a pH 6,0 por la adición de 5M NaOH] antes de la adición del anticuerpo. Los anticuerpos anti-HLA se diluyeron a través de diluciones seriadas de 12 puntos, de 3 veces empezando a 50nM bien en tampón con pH neutro [PBS + 0,5% (p/v) BSA; a pH 7,2] para la evaluación de la unión a pH 7,2 o en tampón con pH 6,0 para la evaluación de la unión a pH 6,0, se transfirieron a las células unidas a las placas y se incubaron durante 1 hora a 25°C. Los anticuerpos no unidos se eliminaron por lavado usando un lavador de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Los anticuerpos anti-HLA unidos a las células se detectaron usando un anticuerpo específico anti-CH1 humano (generado en instalaciones propias) conjugado con SULFO-TAG™. La adición de Tampón de Lectura MSD, estimulación electroquímica y detección de la luminiscencia también se realizaron como se ha descrito anteriormente. La intensidad de la luminiscencia (expresada como RLU) se correlaciona con la cantidad de anticuerpos unidos a las células. Los valores de CE50 para la unión de las variantes de histidina de los anticuerpos anti-HLA H4H2499N y H4H2477N2 a las células C1 R-neo B*2705 se calcularon usando Software Prism y se muestran en las Tablas 21 y 22, respectivamente.

Tabla 21 : Comparación de los valores de CE50 y señal de unión RLU máxima para H4H2499N y sus variantes de histidina a células C1R-neo B*2705 a pH 7,2 y pH 6,0 *Realizado en un día separado de un primer experimento IC=no concluyente Tabla 22: Comparación de los valores de CE50 y señal de unión RLU máxima para H4H2477N2 y la unión de sus variantes de histidina a células C1R-neo B*2705 a pH 7,2 y pH 6,0 Los experimentos de unión para el anticuerpo parental H4H2499N y sus variantes de histidina se realizaron en dos días separados. Algunos de los anticuerpos se incluyeron en ambos experimentos, y los datos de ambos experimentos se muestran en la Tabla 21. Varias de las variantes de histidina (H4H2499N3, H4H2499N4, H4H2499N11 , H4H2499N17, H4H2499N20, H4H2499N21 , y H4H2499N22) presentaron una disminución más de 3 veces en el valor de CE50 a pH 6,0 comparado con su valor de CE50 a pH 7,2, mientras que el anticuerpo parental, en dos experimentos, presentó una disminución de 1 ,6 veces y de 2,6 vedes en el valor de CE50 a pH 6,0 comparado con su valor de CE50 a pH 7,2. Los valores de CE50 para dos de las variantes de histidina, H4H2499N16 y H4H2499N19, no pudieron asignarse a pH 6,0 y pH 7,2 debido a la ausencia de una curva sigmoidea completa a las concentraciones de anticuerpo ensayadas.

Como se muestra en la Tabla 22, dos de las variantes de histidina del anticuerpo parental H4H2477N2 (H4H2477N3 y H4H2477N4) ensayadas para unión a células C1 R-neo B*2705 presentaron disminuciones de 7,7 veces y 21 ,8 veces, respectivamente, en los valores de CE50 a pH 6,0 comparado con sus valores de CE50 a pH 7,2, mientras que el anticuerpo parental H4H2477N2 no presentó una disminución mensurable en el valor de CE50 a pH 6,0 comparado con su valor de CE50 a pH 7,2. Para la variante de histidina H4H2477N5, los valores de CE50 no pudieron asignarse a pH 7,2 y pH 6,0 debido a la ausencia de una curva sigmoidea completa a las concentraciones de anticuerpo ensayadas.

La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas en la presente memoria. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las descritas en la presente memoria serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Dichas modificaciones se pretende que se encuentren en al alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que presenta una unión aumentada a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 , en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este presenta una unión aumentada a HLA-B*2705 o HLA-B*2709 comparado con HLA-B*07.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, y 370; y (b) las CDR de una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, y 378.

4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende las CDR de la cadena pesada y ligera de una pareja de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, y 370/378.

5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1 -LCDR2-LCDR3, respectivamente, seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 100-102-104-108-110-112; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 180-182-184-188-190-192; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 228-230-232-236-238-240; 244-246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288; 292-294-296-300-302-304; 308-310-312-316-318-320; 324-326-328-332-334-336; 340-342-344-348-350-352; 356-358-360-364-366-368; y 372-374-376-380-382-384.

6. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno de este, que se une específicamente a HLA-B*27, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, y 370; y (b) una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, y 378.

7. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una pareja de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, y 370/378.

8. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que se une al mismo epítopo en HLA-B*27 que un anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una pareja de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, y 370/378.

9. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que compite con un anticuerpo anti-HLA-B*27 de referencia para la unión a HLA-B*27, en el que el anticuerpo de referencia comprende una pareja de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, y 370/378.

10. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que presenta una unión aumentada a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 que comprenden las SEQ ID NOs:52-54-56-60-62-64, respectivamente, con una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 33, una sustitución de histidina en el dominio HCDR2 en la posición del aminoácido 52, o una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 33 y una sustitución de histidina en HCDR2 en la posición del aminoácido 52.

11. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que presenta una unión aumentada a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1 -LCDR2-LCDR3 que comprenden las SEQ ID NOs:148-150-152-156-158-160, respectivamente, con una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 32; (b) una sustitución de histidina en el dominio HCDR2 en la posición del aminoácido 53; (c) una sustitución de histidina en el dominio HCDR1 en la posición del aminoácido 32 y una sustitución de histidina en el dominio HCDR2 en la posición del aminoácido 53; (d) una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 27, 30 y 32; (e) una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 27, 28 y 32; (f) una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 28, 30 y 32; (g) una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 28, 30 y 31 ; (h) una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 27, 28, 30 y 32; (i) una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90, 92, 93 y 97; (j) una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90, 92 y 97; (k) una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 92, 93 y 97; (I) una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90 y 93; (m) una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 92 y 93; (n) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 100 y 106; (o) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 100 y 104; (p) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106; (q) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 100, 104 y 106; (r) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 98, 104 y 106; (s) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106 y una sustitución de histidina en el dominio LCDR1 en las posiciones de los aminoácidos 28, 30 y 31 ; (t) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106 y una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 90, 92 y 97; y (u) una sustitución de histidina en el dominio HCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 100, 104 y 106 y una sustitución de histidina en el dominio LCDR3 en las posiciones de los aminoácidos 92, 93 y 97.

12. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que se une a HLA-B*27 a pH 5,75 con una KD que es al menos 5 veces mayor que la KD para la unión del anticuerpo a HLA-B*27 a pH 7,2.

13. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este se une a HLA-B*27 a pH 5,75 con una KD que es al menos 10 veces mayor que la KD para la unión del anticuerpo a HLA-B*27 a pH 7,2.

14. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 13, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este se une a HLA-B*27 a pH 5,75 con una KD que es al menos 25 veces mayor que la KD para la unión del anticuerpo a HLA-B*27 a pH 7,2.

15. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 14, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este comprende una pareja de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 226/234, 258/266, 290/298, 338/346, y 370/378.

16. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de este que se une a HLA-B*2705 a pH 6,0 con una CE50 que es al menos 1 ,5 veces mayor que la CE50 para la unión del anticuerpo a HLA-B*2705 a pH 7,2.

17. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 16, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este se une a HLA-B*2705 a pH 6,0 con una CE50 que es al menos 10 veces mayor que la CE50 para la unión del anticuerpo a HLA-B*2705 a pH 7,2.

18. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este se une a HLA-B*2705 a pH 6,0 con una CE50 que es al menos 25 veces mayor que la CE50 para la unión del anticuerpo a HLA-B*2705 a pH 7,2..

19. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este se une a HLA-B*2705 a pH 6,0 con una CE50 que es al menos 1 ,5 veces mayor que la CE50 para la unión del anticuerpo a HLA-B*2705 a pH 7,2.

20. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1 1 , en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de este se une a HLA-B*2705 a pH 6,0 con una CE50 que es al menos 1 ,5 veces mayor que la CE50 para la unión del anticuerpo a HLA-B*2705 a pH 7,2.

21. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 , 10, 11 , 12 ó 16 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

22. Un método para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de HLA-B*27, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica de la reivindicación 21 a un paciente que padece o presenta riesgo de una enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de HLA-B*27.

23. El método de la reivindicación 22, en el que la enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la actividad de HLA-B*27 se selecciona del grupo que consiste en una espondiloartropatía, rechazo de trasplantes de órganos sólidos y enfermedad de injerto frente a huésped (GVHD).

24. El método de la reivindicación 23, en el que la espondiloartropatía se selecciona del grupo que consiste en espondilitis anquilosante, artritis reactiva (Síndrome de Reiter), uveitis anterior aguda, initis, artritis psoriásica y colitis ulcerosa. RESUMEN La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente a HLA-B*27 (también denominado HLA-B27). En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen a formas solubles y/o expresadas en la superficie celular de HLA-B*27. Los anticuerpos de la presente invención, en determinadas realizaciones, inhiben la activación de las células T mediada por HLA-B*27. Determinados anticuerpos ejemplares de la presente invención presentan una unión aumentada a HLA-B*27 comparado con otras variantes alélicas de HLA-B (por ejemplo, HLA-B*07). La presente invención también proporciona anticuerpos anti-HLA-B*27 con características de unión dependiente del pH (por ejemplo, mayor afinidad de unión a pH neutro que a pH ácido). Los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la expresión de HLA-B*27, incluyendo espondilitis anquilosante y otras espondiloartropatías.