ES2949372T3 - Confórmeros abiertos del CMH de clase Ia - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a confórmeros abiertos de MHC-Ia como agentes inmunomoduladores, particularmente en el tratamiento o prevención del cáncer. El confórmero abierto comprende o consta de un primer y un segundo monómero, y cada monómero comprende una cadena pesada de HLA de las moléculas de MHC-Ia. El confórmero abierto comprende además una secuencia polipeptídica estabilizadora de proteínas y opcionalmente un conector de aminoácidos. Otros aspectos de la invención proporcionan medicamentos combinados que comprenden los confórmeros abiertos del MHC-Ia e inhibidores de puntos de control inmunológico. Además, la invención se refiere al uso de confórmeros abiertos de MHC-Ia como inmunomoduladores, particularmente en enfermedades donde la interacción con diversos receptores inmunorreguladores tales como KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, LILRB2 y 10 PTPRJ modula una respuesta inmune. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Confórmenos abiertos del CMH de clase la

[0001] La presente invención se refiere a un confórmero abierto de fusión CMH-Ia que comprende una cadena pesada HLA seleccionada de C08, A25, B58, A30, B53 y C12 unida covalentemente a una secuencia polipeptídica Fc, particularmente para uso en la profilaxis o el tratamiento del cáncer, y para su uso como inmunomoduladores.

[0002] Los antígenos leucocitarios humanos (HLA) pertenecen a la familia clásica de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). El complejo HLA ayuda al sistema inmunitario a distinguir las proteínas propias del cuerpo de las proteínas producidas por invasores extraños, como virus y bacterias. Los seres humanos tienen moléculas CMH de clase I que comprenden las moléculas clásicas (CMH-Ia) HLA-A, HLA-B y HLA-C, y las no clásicas (CMH-Ib) HLA-E, HLA-F, HLA-G y HLA-H. Ambas categorías son similares en sus mecanismos de unión a péptidos, presentación y respuestas de células T inducidas. La característica más destacable de los CMH-la clásicos es su elevado polimorfismo, mientras que los CMH-Ib no clásicos suelen ser no polimórficos y tienden a mostrar un patrón de expresión más restringido que sus equivalentes CMH-la.

[0003] La nomenclatura HLA viene dada por el nombre particular del locus del gen (p. ej., HLA-A ) seguido del antígeno serológico de la familia de alelos (p. ej., HLA-A*02), y los subtipos de alelos asignados en números y en el orden en que el se han determinado las secuencias de ADN (por ejemplo, HLA-A*02:01). Los alelos que difieren solo por sustituciones de nucleótidos sinónimas (también denominadas sustituciones silenciosas o no codificantes) dentro de la secuencia codificante se distinguen por el uso del tercer conjunto de dígitos (p. ej., HLA-A*02:01:01). Los alelos que solo se diferencian por polimorfismos de secuencia en los intrones, o en las regiones no traducidas 5' o 3' que flanquean los exones e intrones, se distinguen por el uso del cuarto conjunto de dígitos (p. ej., HLA-A*02:01:01:02L) (Fig. 1).

[0004] En la Tabla 1 se proporciona una lista de alelos de CMH-Ia. Para obtener una lista completa de los subtipos de alelos, visite el enlace: http://hla.alleles.org/alleles/class1.html.

[0005] La función principal de las moléculas CMH-Ia clásicas es presentar péptidos como parte de la respuesta inmunitaria adaptativa. Las moléculas CMH-Ia son estructuras triméricas que comprenden una cadena pesada unida a la membrana con tres dominios extracelulares (α1, α2 y α3) que se asocia de forma no covalente con p2-microglobulina (p2m) y un pequeño péptido que se deriva de autoproteínas, virus o bacterias. Los dominios a l y a2 son muy polimórficos y forman una plataforma que da lugar al surco de unión al péptido. Yuxtapuesto al dominio a3 conservado hay un dominio transmembrana seguido de una cola citoplásmica intracelular.

[0006] Para iniciar una respuesta inmune, las moléculas CMH-Ia clásicas presentan péptidos específicos para ser reconocidos por TCR (receptor de células T) presente en los linfocitos T citotóxicos (^c T^l ) CD8+, mientras que los receptores de células NK presentes en las células asesinas naturales (NK) reconocen el péptido. motivos, en lugar de péptidos individuales. En condiciones fisiológicas normales, las moléculas CMH-Ia existen como complejos heterotriméricos encargados de presentar péptidos a las células T CD8+ y las células NK; sin embargo, las moléculas CMH-Ia también pueden estar presentes en las células como cadenas pesadas libres que carecen de p2-microglobulina y péptido, y se denominan conformadores abiertos HLA (Arosa et al., Trends in Immunology 2007 Mar; 28(3): 115-23) (Fig. 2). La interacción de los confórmeros abiertos HLA con los receptores de células T y los receptores de células NK es independiente del péptido y se desconoce su función.

[0007] Los confórmeros abiertos pueden expresarse en la superficie celular de las células y pueden detectarse con anticuerpos que reconocen epítopos lineales de moléculas HLA sin p2m y péptido (por ejemplo, LA45, L31, HCA2 y HC-10). Estos anticuerpos se han utilizado para detectar la presencia de confórmeros abiertos en diversos pacientes autoinmunes e individuos sanos (Raine et al., Rheumatology 2006;45:1338-1344). A pesar de su presencia en pacientes y líneas celulares, poco se sabe de su modo de acción. Los confórmeros abiertos se han evaluado principalmente en pacientes con espondilitis anquilosante (AS) HLA-B27, donde se ha planteado la hipótesis de que los confórmeros abiertos HLAB27 inducen la autoinmunidad, su función en otros pacientes autoinmunes aún no se ha abordado.

[0008] Ciprandi et al. (Allergy 2008, 63, 1335-1338) analizan la asociación de moléculas HLA solubles con la rinitis alérgica. Topalian et al. (Cancer Cell 27 (2015), 450-461) revisión del bloqueo de puntos de control en el tratamiento del cáncer. WO9958557 divulga dímeros HLA-B27 en el diagnóstico de espondiloartropatía.

[0009] En este documento, los inventores revelan por primera vez que la familia clásica de moléculas CMH-Ia (HLA-A, HLA-B y HLA-C) cuando están presentes como confórmeros abiertos (cadenas pesadas sin p2m) son terapias útiles para su Propiedades inmunomoduladoras y uso en el tratamiento del cáncer.

[0010] En general, modular la contextura inmunitaria de los tumores que favorecen la infiltración de macrófagos de tipo M1, células T CD8 citotóxicas y células Th1, y/o reducir la infiltración de MDSC y macrófagos de tipo M2 es una vía terapéutica prometedora para tratar el cáncer que se explora aquí con el uso de proteínas de conformación abierta HLA en diversas indicaciones de cáncer.

Términos y definiciones

[0011] Las secuencias de aminoácidos se dan desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo. Las letras mayúsculas para las posiciones de secuencia se refieren a L-aminoácidos en el código de una letra (Stryer, Biochemistry, 3a ed. p.

21).

[0012] El término confórmero abierto como se usa en la presente especificación se refiere a una molécula de cadena pesada de HLA aislada no asociada a p2-microglobulina como monómero o como dímero (homodímero o heterodímero). Ciertas formas de realización de los confórmeros abiertos descritos en el presente documento son monómeros o dímeros de proteínas de fusión, en los que la cadena pesada de HLA está unida covalentemente a una región polipeptídica estabilizadora, particularmente un dominio de inmunoglobulina de fragmento cristalizable.

[0013] En el contexto de la presente especificación, los términos identidad de secuencia y porcentaje de identidad de secuencia se refieren a los valores determinados comparando dos secuencias alineadas. Los métodos para la alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento de las secuencias para la comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988) o por implementaciones computarizadas de estos algoritmos, que incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL, GAP, B^e S^t FIT, B^lA^s T, FASTA y TFASTA. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente, por ejemplo, a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Un ejemplo de comparación de secuencias de aminoácidos es el algoritmo BLASTP que utiliza la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 3; Coincidencias máximas en un rango de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Costos de la Brecha: Existencia 11, Extensión 1; Ajustes de composición: ajuste de matriz de puntuación de composición condicional. Uno de esos ejemplos para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos es el algoritmo BLASTN que utiliza la configuración predeterminada: Umbral esperado: 10; Tamaño de palabra: 28; Coincidencias máximas en un rango de consulta: 0; Puntuaciones de coincidencia/desigualdad: 1.-2; Costos de la brecha: Lineal. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad de secuencia proporcionados en este documento se refieren al valor obtenido con el conjunto de programas BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)) utilizando los parámetros predeterminados identificados anteriormente para proteína y comparación de ácidos nucleicos, respectivamente.

[0014] En el contexto de la presente especificación, el término complejo principal de histocompatibilidad (CMH) se usa en su significado conocido en el campo de la biología celular y la inmunología; se refiere a una molécula de la superficie celular que muestra una fracción específica (péptido), también conocida como epítopo, de una proteína. Hay dos clases principales de moléculas CMH: clase I y clase II. Dentro del CMH de clase I se pueden distinguir dos grupos en función de su polimorfismo: a) el clásico (MHCla) con los correspondientes genes polimórficos HLA-A, HLA-B y h LA-C, y b) el no clásico (CMH-Ib) con los correspondientes genes HLA-E, HLA-F, HLA-G y HLA-H menos polimórficos.

[0015] Las moléculas de cadena pesada del CMH de clase I normalmente (es decir, cuando no están en forma de confórmero abierto) se presentan como una cadena alfa unida a una unidad de la molécula p2-microglobulina que no es del CMH. La cadena alfa comprende, en dirección del extremo N al extremo C, un péptido señal, tres dominios extracelulares (a1-3, con a1 en el extremo N), una región transmembrana y un dominio citoplásmico C-terminal. cola. El péptido que se muestra o presenta se mantiene en el surco de unión del péptido, en la región central de los dominios a 1/a2.

[0016] En el contexto de la presente especificación, el término dominio de p2-microglobulina se usa en su significado conocido en la técnica de la biología celular y la bioquímica; se refiere a una molécula que no es CMH que es parte de la molécula heterodimérica CMH clase I. En otras palabras, constituye la cadena p del heterodímero CMH de clase I.

[0017] En el contexto de la presente especificación, el término antígeno leucocitario humano (HLA) se usa en su significado conocido en el campo de la biología celular y la bioquímica; se refiere a loci de genes que codifican las proteínas CMH de clase I humanas. Los tres principales genes CMH-Ia clásicos son HLA-A, HLA-B y HLA-C, y todos estos genes tienen un número variable de alelos (Tabla 1). Los alelos estrechamente relacionados se combinan en subgrupos de un determinado alelo. Por ejemplo, el alelo HLA-B57 tiene más de 100 alelos estrechamente relacionados que varían en uno o más aminoácidos, según el Comité de Nomenclatura de la OMS para Factores del Sistema HLA, denominado HLA-B*57:01:01 a HLA-B *57:82. La secuencia completa o parcial de todos los genes HLA conocidos y sus respectivos alelos están disponibles para el experto en la materia en bases de datos especializadas como IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/).

[0018] En el contexto de la presente especificación, el término anticuerpo se usa en su significado conocido en el campo de la biología celular y la inmunología; se refiere a anticuerpos completos que incluyen, entre otros, inmunoglobulina tipo G (IgG), tipo A (IgA), tipo D (IgD), tipo E (IgE) o tipo M (IgM), cualquier fragmento de unión a antígeno o cadenas simples de los mismos y construcciones relacionadas o derivadas. Un anticuerpo completo es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como Vl) y una región constante de cadena ligera (Cl). La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, C^l. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente del sistema del complemento clásico.

[0019] El término molécula similar a un anticuerpo en el contexto de la presente especificación se refiere a una molécula capaz de unirse específicamente a otra molécula o diana con alta afinidad / un Kd ≤ 10E-8 mol/l. Una molécula similar a un anticuerpo se une a su objetivo de manera similar a la unión específica de un anticuerpo. El término molécula similar a un anticuerpo abarca una proteína repetida, como una proteína repetida de anquirina diseñada (Molecular Partners, Zürich), un polipéptido derivado de proteínas repetidas de armadillo, un polipéptido derivado de proteínas repetidas ricas en leucina y un polipéptido derivado de proteínas repetidas de tetratricopéptido.

[0020] En el contexto de la presente especificación, el término región de fragmento cristalizable (Fc) se usa en su significado conocido en el campo de la biología celular y la inmunología; se refiere a una fracción de un anticuerpo que comprende dos fragmentos de cadena pesada idénticos compuestos por un dominio C^h2 y C^h3, unidos covalentemente por enlaces disulfuro.

[0021] En el contexto de la presente especificación, el término dímero se refiere a una unidad que consta de dos subunidades.

[0022] En el contexto de la presente especificación, el término homodímero se refiere a un dímero compuesto por dos subunidades que son miembros idénticos o muy similares de la misma clase de subunidades. Un ejemplo de homodímero sería un dímero que consiste en dos subunidades seleccionadas independientemente de la lista de alelos HLA. En ciertas formas de realización, los homodímeros constan de dos alelos HLA idénticos.

[0023] En el contexto de la presente especificación, el término enlazador de aminoácidos se refiere a un polipéptido de longitud variable que se usa para conectar dos polipéptidos con el fin de generar un polipéptido de cadena sencilla. Formas de realización ejemplares de enlazadores útiles para practicar la invención especificada en este documento son cadenas de oligopéptidos que consisten en 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos. Un ejemplo no limitativo de un enlazador de aminoácidos es el polipéptido GGGGGGGGGS (SEQ ID No. 001) que enlaza un polipéptido de cadena pesada de HLA con un dominio Fc.

[0024] En el contexto de la presente especificación, el término agente inhibidor del punto de control o anticuerpo inhibidor del punto de control pretende abarcar un agente, particularmente un anticuerpo (no agonista) (o molécula similar a un anticuerpo) capaz de interrumpir la cascada de señales que conduce a la inhibición de células T después de la activación de células T como parte de lo que se conoce en la técnica como mecanismo de punto de control inmunitario. Los ejemplos no limitantes de un agente inhibidor de puntos de control o anticuerpo inhibidor de puntos de control incluyen anticuerpos contra CTLA-4 (Uniprot P16410), PD-1 (Uniprot Q15116), PD-L1 (Uniprot Q9NZQ7), B7H3 (CD276; Uniprot Q5ZPR3), Tim-3, Gal9, VISTA o Lag3.

[0025] En el contexto de la presente especificación, el término agente agonista de punto de control o anticuerpo agonista de punto de control pretende abarcar un agente, en particular, pero sin limitarse a, un anticuerpo (o molécula similar a un anticuerpo) capaz de participar en la cascada de señales que conduce a T activación celular como parte de lo que se conoce en la técnica como mecanismo de punto de control inmunitario. Los ejemplos no limitantes de receptores que se sabe que estimulan la activación de las células T incluyen CD122 y CD137 (4-lBB; Uniprot 007011). El término agente agonista de punto de control o anticuerpo agonista de punto de control abarca anticuerpos agonistas contra CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), CD357 (GITR), CD278 (ICOS), CD27, CD28.

[0026] En el contexto de la presente especificación, el término agente modulador de puntos de control (inmune) abarca agentes inhibidores de puntos de control, anticuerpos inhibidores de puntos de control, agentes agonistas de puntos de control y anticuerpos agonistas de puntos de control.

Descripción específica de la invención

[0027] La presente invención se refiere a un confórmero abierto CMH-Ia de fusión, en el que dicho confórmero abierto CMH-Ia de fusión comprende o consiste esencialmente en un primer monómero o un primer y un segundo monómero, en el que

a. dicho primer monómero, o cada uno de dicho primer y segundo monómero independientemente del otro monómero, comprende una cadena pesada de HLA seleccionada entre C08, A25, B58, A30, B53 y C12, y

b. en el que dicho primer monómero, o cada uno de dicho primer y segundo monómero están unidos covalentemente a una secuencia polipeptídica Fc,

en el que la cadena pesada de HLA consiste únicamente en los dominios HLA alfa 1, 2 y 3.

[0028] En ciertas formas de realización, el confórmero abierto de fusión CMH-Ia comprende un primer monómero o un primer y un segundo monómero, y cada monómero independientemente del otro monómero comprende una cadena pesada HLA.

[0029] Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un confórmero abierto de fusión CMH-Ia:

- para uso como medicamento,

- en particular para uso en el tratamiento o prevención del cáncer, o

- en particular para uso como agente inmunomodulador,

- particularmente en el tratamiento de una enfermedad infecciosa,

- más particularmente para su uso en la prevención, tratamiento o terapia del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis A, B, C (VHA, VHB, VHC, respectivamente), virus de la gripe, virus respiratorio sincitial (VSR), virus del sarampión, virus del herpes y/o virus de la fiebre amarilla.

[0030] En determinadas formas de realización del segundo aspecto de la invención o de cualquier alternativa mencionada anteriormente al segundo aspecto de la invención, el cáncer es cáncer de colon o cáncer de páncreas.

[0031] Un aspecto de la invención se refiere a un confórmero abierto de fusión CMH-Ia. El confórmero abierto de fusión CMH-Ia comprende, o consiste esencialmente en, un primer monómero de cadena pesada de HLA o un primer y un segundo monómero de cadena pesada de HLA. Cada uno de estos monómeros de cadena pesada de HLA, independientemente del otro, comprende o consiste esencialmente en una cadena pesada de HLA seleccionada entre C08, A25, B58, A30, B53 y C12. El confórmero abierto del CMH de fusión comprende adicionalmente una secuencia polipeptídica Fc. En determinadas formas de realización, la secuencia de monómero HLA está situada en el extremo N del confórmero abierto de fusión 6 CMH, y la construcción Fc está situada hacia el extremo C. En ciertas formas de realización, un enlazador de aminoácidos se une a la cadena pesada de HLA y al fragmento Fc.

[0032] El confórmero abierto de fusión CMH-Ia comprende además un dominio polipeptídico conocido por estabilizar metabólicamente un polipéptido in vivo. Un ejemplo de un dominio estabilizador de este tipo es un dominio Fc (fragmento cristalizable) de una inmunoglobulina, particularmente el dominio polipeptídico Fc de una inmunoglobulina gamma. La cadena pesada de HLA y el dominio estabilizador pueden unirse opcionalmente mediante un enlazador de aminoácidos. Una proteína de fusión de confórmero abierto que comprende la cadena HLA y un fragmento Fc de inmunoglobulina se denomina en adelante confórmero abierto HLA-Fc o HLA2-Fc en el presente documento.

[0033] La presencia del dominio Fc en la proteína de fusión facilita el aumento de la solubilidad, la estabilidad, la avidez, la vida media y, desde un punto de vista tecnológico, la producción y purificación rentables en sistemas de mamíferos (purificación de proteína A o G).

[0034] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el confórmero abierto CMH-Ia aislado o el confórmero abierto CMH-Ia de fusión consta de dos subunidades seleccionadas independientemente de los alelos HLA anteriores. En ciertas formas de realización, los homodímeros constan de dos alelos HLA idénticos.

[0035] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el confórmero abierto CMH-Ia aislado o el confórmero abierto CMH-Ia de fusión comprenden dos cadenas polipeptídicas HLA idénticas. En determinadas formas de realización, el confórmero abierto CMH-Ia aislado o el confórmero abierto CMH-la de fusión comprende dos cadenas polipeptídicas HLA diferentes.

[0036] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el confórmero abierto CMH-la aislado o el confórmero abierto CMH-Ia de fusión comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

[0037] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, un fragmento de epítopo peptídico se une de forma no covalente al polipéptido dentro del dominio presentador de antígeno de la cadena peptídica h La .

[0038] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, el primer y/o segundo monómero comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

[0039] El confórmero abierto de fusión CMH-la comprende sólo los dominios extracelulares HLA-alfa 1, HLA-alfa 2 y HLA-alfa 3. En estas formas de realización, los dominios transmembrana e intracelular de las cadenas pesadas de HLA no se incluyen en el polipéptido terapéutico de la invención para permitir su expresión extracelular en células recombinantes. El experto en la materia puede identificar fácilmente los dominios respectivos incluso en secuencias de HLA previamente desconocidas mediante el alineamiento de secuencias por pares con secuencias de HLA anotadas.

[0040] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, los confórmeros abiertos de fusión CMH-Ia comprenden un dominio Fc. En determinadas formas de realización particulares, el dominio Fc comprende regiones constantes de cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina tipo G (IgG), tipo A (IgA), tipo D (IgD), tipo E (IgE) o tipo M (IgM).

[0041] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, los confórmeros abiertos CMH-la de fusión comprenden un conector de aminoácidos que une un dominio estabilizador, particularmente un dominio Fc, al polipéptido HLA. En ciertas formas de realización particulares, el conector de aminoácidos comprende de 1 a 50 aminoácidos, particularmente de 5 a 40 aminoácidos, más particularmente de 10 a 30 aminoácidos, incluso más particularmente de 15 a 25 aminoácidos que unen la cadena pesada de HLA al dominio Fc como una sola cadena polipeptídica.

[0042] En ciertas formas de realización de cualquiera de los aspectos de la invención, los confórmeros abiertos CMH-Ia aislados o los confórmeros abiertos CMH-Ia de fusión se proporcionan como forma de dosificación parenteral, particularmente confitados para inyección. En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario o el agente agonista se proporciona como una forma de dosificación parenteral, particularmente confitada para inyección. En determinadas formas de realización, tanto los confórmeros abiertos del CMH-Ia como el agente inhibidor o agonista del punto de control inmunitario están presentes en la misma forma de administración.

[0043] En determinadas formas de realización del tercer aspecto de la invención, el conformador abierto de fusión CMH-Ia se utiliza como medicamento.

[0044] En ciertas formas de realización del tercer aspecto de la invención, el confórmero abierto CMH-Ia de fusión es para uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en particular para el cáncer de colon o el cáncer de páncreas.

[0045] En ciertas formas de realización del tercer aspecto de la invención, el confórmero abierto CMH-Ia de fusión es para uso como agente inmunomodulador, particularmente para uso como modulador negativo de células T reguladoras (Treg). En ciertas formas de realización, el confórmero abierto CMH-Ia de fusión es para uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas. En determinadas formas de realización, el confórmero abierto de fusión CMH-Ia se utiliza en el tratamiento de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), la hepatitis A, la hepatitis B, la hepatitis C, la gripe, la infección por el virus respiratorio sincitial (RSV), el sarampión, el herpes y la enfermedad amarilla.

[0046] Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un monómero de confórmero abierto Fc, según los aspectos anteriores de la invención, para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer o para su uso como agente inmunomodulador, particularmente en un tratamiento de una enfermedad infecciosa. La expresión del confórmero abierto in vivo a partir de la molécula de ácido nucleico conducirá, después de la dimerización, al polipéptido de proteína de fusión de la invención. El concepto de expresar polipéptidos farmacéuticamente activos a partir de ácidos nucleicos que los codifican en el cuerpo del paciente es bien conocido y puede conferir beneficios significativos al paciente.

[0047] En ciertas formas de realización del cuarto aspecto de la invención o cualquiera de sus alternativas mencionadas anteriormente, el cáncer es cáncer de colon o cáncer de páncreas.

[0048] En ciertas formas de realización, la molécula de ácido nucleico codifica monómeros de confórmeros abiertos CMH-Ia, particularmente 7 un monómero de confórmero abierto Fc que comprende un enlazador de aminoácidos y/o un dominio Fc (fragmento cristalizable), y se usa en el tratamiento o la terapia del cáncer, en particular cáncer de colon o pancreático.

[0049] Según un aspecto alternativo de la invención, se proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico según el cuarto aspecto de la invención (y sus aspectos alternativos) para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer, en particular del cáncer de colon. o cáncer de páncreas.

[0050] En ciertas formas de realización, el vector de expresión recombinante es un plásmido que comprende un promotor que es operativo en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana. El promotor está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico de la invención.

[0051] Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un virus que comprende la molécula de ácido nucleico según el cuarto aspecto de la invención (y sus aspectos alternativos) para su uso en el tratamiento o la terapia del cáncer, en particular de colon o de páncreas. cáncer, o para su uso como agente inmunomodulador, particularmente en el tratamiento de una enfermedad infecciosa. La molécula de ácido nucleico está bajo el control de una secuencia promotora operativa en una célula de mamífero, particularmente en una célula humana. En determinadas formas de realización, el virus es un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes o un lentivirus.

[0052] Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped modificada genéticamente in vitro que comprende la molécula de ácido nucleico según el cuarto aspecto de la invención (y sus aspectos alternativos).

[0053] Según un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un medicamento combinado, en el que el medicamento combinado comprende:

- confórmenos abiertos CMH-Ia aislados o confórmenos abiertos CMH-Ia de fusión, según cualquiera de los aspectos o formas de realización anteriores de la invención, y

- un agente modulador del punto de control inmunitario seleccionado entre

o un agente inhibidor del punto de control inmunitario (CPI) seleccionado entre:

• un inhibidor de la interacción de la proteína 4 asociada a los linfocitos T citotóxicos (CTLA4; también conocida como CD152) con B7-1 (CD80) y/o B7-2 (CD86), particularmente un polipéptido ligando a CTLA-4 o a cd80 o a cd86 tal como por ejemplo un anticuerpo,

• un inhibidor de la interacción de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1; también conocido como CD279) con su ligando PD-L1 (también conocido como CD274; UniProt ID: Q9NZQ7) y/o PD-L2 (también conocido como CD273; Uni Prot ID: Q9BQ51), particularmente un ligando polipeptídico para PD-1 o para PD-L1 o a PD-L2 como, por ejemplo, un anticuerpo y

• un ligando polipeptídico inhibidor, en particular un anticuerpo, de inmunoglobulina de células T y un dominio de mucina que contiene 3 (TIM-3), y

o un agente agonista de punto de control, en particular un agonista de punto de control anticuerpo seleccionado para unirse y activar el receptor del factor de necrosis tumoral 4-1BB (también conocido como CD137 o TNFRSF9).

[0054] En determinadas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de la interacción de CTLA4 con CD80 o CD86.

[0055] En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario es ipilimumab (Yervoy; CAS No. 477202-00-9).

[0056] En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de la interacción de la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) con su receptor PD-L1. En ciertas formas de realización, el agente inhibidor del punto de control inmunitario se selecciona de los fármacos de anticuerpos clínicamente disponibles nivolumab (Bristol-Myers Squibb; CAS No. 946414-94-4), pembrolizumab (Merck Inc.; CAS No. 1374853-91-4), pidilizumab (N.° CAS 1036730-42-3), atezolizumab (Roche AG; N.° CAS 1380723-44-3) y Avelumab (Merck KGaA; N.° CAS 1537032-82-8).

[0057] En ciertas formas de realización, el agente agonista del punto de control inmunitario es utomilumab (PF-05082566), un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano contra 4-1BB que actualmente se encuentra en ensayos clínicos.

[0058] En ciertas formas de realización, el agente modulador de puntos de control es un polipéptido seleccionado de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una molécula similar a un anticuerpo, y el polipéptido reacciona selectivamente a un mediador de puntos de control. En ciertas formas de realización, el mediador del punto de control se selecciona de CTLA4, PD-1, CD80, CD86, PD-L1 y PD-L2, TIM-3, 4-1BB y 4-1BBL.

Breve descripción de las figuras

[0059]

La Fig. 1 muestra la nomenclatura de las moléculas del CMH de clase I.

La Fig.2 muestra la representación esquemática de heterotrímeros HLA y conformadores abiertos HLA (cadenas pesadas libres). Ambas formas pueden existir en la superficie celular de las células presentadoras de antígenos (células APC). Los inventores proponen que la interacción de los confórmeros abiertos con los receptores inmunorreguladores (KIR's, LIL's, PTPRJ, etc.) es de afinidad diferente y, por lo tanto, se modifica para inducir respuestas inmunitarias que favorecen la inmunidad antitumoral.

La Fig. 3 muestra la representación esquemática de casetes de ADN HLA-Fc y p2m y la expresión de moléculas HLA-p2m-Fc de células CHO. A) los dominios alfa 1,2 y 3 de cadenas pesadas de CMH-1a (cadena pesada de HLA) se insertan en un casete de vector IgG4-Fc humano; y la microglobulina p2 humana insertada en un casete de vector separado. B) Las transfecciones en células de ovario de hámster chino (CHO) se realizan utilizando tanto el vector HLA-Fc el vector p2m en una proporción de 1:1 para la producción extracelular de la proteína HLA-p2m-Fc. Se recogieron los sobrenadantes y se purificaron HLA-p2m-Fc usando protocolos estándar de purificación de anticuerpos. p2m se elimina del complejo HLA-p2m-Fc y los siguientes monómeros HLA-Fc se repliegan para formar homodímeros HLA2-Fc.

La Fig. 4 muestra la separación de p2m del complejo HLA-p2m-Fc y la purificación y replegamiento de HLA2-Fc por SEC. A) El gráfico de histograma de cromatografía de moléculas HLA-p2m-Fc en tampón desnaturalizante Urea-Tris-BME muestra la disociación de cadenas pesadas libres de HLA-Fc de p2m usando columnas Sephacryl S-100 HR por SEC. B) y C) Los geles SDS-page teñidos con azul de Coomassie muestran la presencia de p2m antes y después de la SEC. B) muestra moléculas HLA-B2m-Fc antes de ser separadas en SEC, y C) muestra moléculas HLA2-Fc recuperadas y replegadas después de SEC.

La Fig. 5 muestra la interacción HLA2-Fc (A252-Fc, A302-Fc, B272-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-Fc y C122-Fc) con diferentes receptores inmunorreguladores de poblaciones de leucocitos. por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). A) hu KIR3DL1, B) hu KIR3DL2 y C) hu KIR3DL3 se expresan en células NK y subpoblaciones de células T. D) LILRB1, y E) LILRB2 expresado principalmente en células mieloides, F) PirB (homólogo murino de LILRB) y G) PTPRJ (en leucocitos se expresa preferentemente en células MDSC y células T activadas).

La Fig. 6 muestra que las moléculas HLA2-Fc (A252-Fc, A302-Fc, B272-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-Fc y C122-Fc) invariablemente bloquean la conversión de células T CD4+ de ratón en iTreg. La incubación de HLA2-Fc de forma dependiente de la dosis con células T CD4+ vírgenes bloquea la conversión a iTregs. A-B) Moléculas HLA2-Fc bloquea la expresión de FoxP3 (marcador de diferenciación de Tregs) en condiciones de cultivo óptimas para la diferenciación de iTreg (10mg/mL) Moléculas HLA-p2m-Fc de control, isotipo, medios suplementados con TGFp e IL-2 y los medios sin suplementación demuestran la influencia específica de HLA2-Fc en la conversión de iTreg.

La Fig. 7 muestra que HLA2-Fc (A252-Fc, A302-Fc, B272-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-Fc y C122-Fc) suprime las células T del linfoma. A-E) ensayos de supresión para determinar la proliferación de células en presencia de moléculas HLA2-Fc o moléculas de control HLA-p2m-Fc. HLA2-Fc suprime las líneas celulares de linfoma humano (Jurkat) y de ratón (EG.7) de manera dependiente de la dosis (mg/200 ml), otras líneas celulares como Daudi, linfoma de células B; SK-N-AS, neuroblastoma; y L540, linfoma de Hodgkin humano, pero no se observó supresión de moléculas HLA2-Fc en condiciones óptimas de cultivo. Otras líneas celulares como L428, linfoma de Hodgkin humano; L1236, linfoma de Hodgkin humano; IMR-5, neuroblastoma; y M130428, Melanoma también se probaron pero no se observó supresión.

La Fig. 8 muestra que HLA2-Fc (A302-Fc, B582-Fc y C082-Fc) como monoterapia o en combinación con anticuerpos PD-1 puede reducir el tamaño de los tumores en el modelo de carcinoma de colon singénico murino C38. A) Diseño experimental de puntos de tiempo de inyección de células de carcinoma de colon (C38) e inyección de compuestos. B) Volumen tumoral medio medio mm3 de los grupos tratados con A302-Fc (n=5). C) Volumen tumoral medio medio mm3 de los grupos tratados con B582-Fc (n=5). D) Volumen tumoral medio medio mm3 de los grupos tratados con C082-Fc (n=5). El diseño experimental de puntos de tiempo de inyección de células e inyección de sustancias fue el siguiente: vehículo PBS Q3Dx6, isotipo (10 mg/Kg) Q3Dx6; HLA2-Fc (10 mg/Kg) Q3Dx6; PD-1 dos semanas x 2 (200 |jg); y HLA2-Fc PD-1 (Q3Dx6 y dos semanas x 2, respectivamente). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni, *p<0,05, **p<0,01, ns= no significativo. Q= días entre inyecciones; Dx= número de inyecciones; dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 9 muestra que HLA2-Fc (B272-Fc y B572-Fc) en combinación con anticuerpos CTLA4 o PD-1 reducen el tamaño de los tumores en el modelo de carcinoma de colon singénico murino MC38-OVA o C38. A) Volumen tumoral medio medio mm3 de los grupos tratados con B272-Fc (n=6). B) Volumen tumoral medio medio mm3 de los grupos tratados con B572-Fc (n=6). El diseño experimental de puntos de tiempo de inyección de células e inyección de sustancias fue el siguiente: vehículo PBS Q3Dx6, isotipo (10 mg/Kg) Q3Dx6; HLA2-Fc (10 mg/Kg) Q3Dx6; CTLA-4 Q3Dx2 (d1= 100 jg ; d4 = 50 jg), PD-1 dos semanas x 2 (200 jg); HLA2-Fc CTLA-4 (Q3Dx6 y Q3Dx2, respectivamente) y HLA2-Fc PD-1 (Q3Dx6 y dos semanas x 2, respectivamente). Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis posthoc de Bonferroni, **p<0,01, ***p<0,001, ns= no significativo. Q= días entre inyecciones; Dx= número de inyecciones; dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 10 muestra el estudio in vivo de A252-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con A252-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; A252-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; A252-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y A252-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni *p<0,05. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral A T/ A C, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 11 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con A252-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 10). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

La Fig. 12 muestra la contextura inmune del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con A252-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 10). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

La Fig. 13 muestra el estudio in vivo de A302-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con A302-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; A302-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; Anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; A302-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y A302-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 14 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con A302-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la figura 13). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 15 muestra la contextura inmunitaria del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 tratados con tumores grandes tratados con A302-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 13). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T C^d 4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales 10 (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 16 muestra el estudio in vivo de B272-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con B272-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; B272-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; Anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; B272-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y B272-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 17 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con B272-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 16). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 18 muestra la contextura inmunitaria del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 tratados con tumores grandes tratados con B272-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 16). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T C^d 4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 19 muestra el estudio in vivo de B532-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con B532-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; B532-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; Anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; B532-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y B532-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 20 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con B532-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la figura 19). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 21 muestra la contextura inmunitaria del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 tratados con tumores grandes tratados con B532-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 19). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T C^d 4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales 11 (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 22 muestra el estudio in vivo de B572-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con B572-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; B572-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; Anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; B572-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y B572-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 23 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con B572-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 22). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 24 muestra la contextura inmunitaria del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 tratados con tumores grandes tratados con B572-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 22). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T C^d 4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 25 muestra el estudio in vivo de B582-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con B582-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; B582-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; Anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; B582-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y B582-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 26 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con B582-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 25). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 27 muestra la contextura inmunitaria del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 tratados con tumores grandes tratados con B582-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 25). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T C^d 4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales 12 (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 28 muestra el estudio in vivo de C082-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con C082-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; C082-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; Anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; C082-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y C082-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 29 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con C082-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 28). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 30 muestra la contextura inmunitaria del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 tratados con tumores grandes tratados con C082-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 28). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T C^d 4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 31 muestra el estudio in vivo de C122-Fc en combinación con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes del modelo de ratón singénico Pan02 pancreático. A) Volumen tumoral medio medio en mm3 de animales tratados con C122-Fc (n=6). B) % de inhibición tumoral A de los grupos de ratones tratados en comparación con el control. El diseño experimental de los tiempos de inyección de las sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; C122-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; Anticuerpo 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2 inyecciones; C122-Fc 4-1BB (5 mg/Kg y 1 mg/Kg, respectivamente) dos semanas x 2; anticuerpo PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; y C122-Fc PD-1 (5 mg/kg cada uno) dos semanas x 2. Los volúmenes tumorales se expresan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA de dos vías seguido de análisis post-hoc de Bonferroni. La inhibición tumoral A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (p. ej., 300 mm3) hasta el volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación al isotipo. dos semanas= dos veces por semana.

La Fig. 32 muestra la contextura inmunitaria del análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) de ratones con cáncer de páncreas Pan02 con tumores grandes tratados con C122-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la figura 31). Leucocitos relevantes analizados infiltrados en el tumor: A) Células T CD3+, Células T CD4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+, y la relación CD8+/Treg. ^b ) Granulocitos, macrófagos, macrófagos de tipo M1, macrófagos de tipo M2 y células supresoras derivadas de mieloides (MDSC). C) Proporción de macrófagos M1/M2, monocitos, células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales (NKT). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis posthoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

La Fig. 33 muestra la contextura inmunitaria del análisis de leucocitos en sangre de ratones con cáncer de páncreas Pan02 tratados con tumores grandes tratados con C122-Fc, 4-1BB y PD-1 mediante citometría de flujo (continuación del experimento en la Fig. 31). Leucocitos relevantes analizados presentes en la sangre: A) Células T CD3+, Células T C^d 4+, Células T reguladoras (Treg), Células T CD8+ y relación CD8+/Treg. B) Células Th1 (células T CD4+ IFNy+), células asesinas naturales (NK) y células T asesinas naturales 13 (NKT). C) Monocitos, células supresoras derivadas de granulocitos mieloides (G-MDSC) y células supresoras derivadas de mieloides monocíticos (M-MDSC). El % de leucocitos se expresa como diagramas de caja que muestran máximos y mínimos de muestra, y cada grupo se analiza mediante ANOVA de una vía seguido de análisis post-hoc de Dunnet *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; ****p<0,0001.

Ejemplos

[0060] Sorprendentemente, los inventores encontraron que los confórmeros abiertos CMH-Ia interactúan con diversos receptores de superficie celular inmunorreguladores presentes en células NK, células NKT, células T, macrófagos y células MDSC con unión única o afinidad más fuerte que sus heterotrímeros CMH-Ia de control. Los confórmeros abiertos HLA clase la se pueden utilizar como terapia para atacar enfermedades en las que los glóbulos blancos impiden el desarrollo de la inmunidad protectora, como es el caso del cáncer y las enfermedades infecciosas.

[0061] Además, descubrieron un nuevo modo de acción in vivo con inyecciones de HLA2-Fc como monoterapia o enfoques combinatorios que utilizan agentes moduladores de puntos de control. La terapia HLA2-Fc sola o en terapias combinadas puede modular la infiltración de diversos conjuntos de leucocitos en los tumores según lo determinado por el aumento de la infiltración de la relación M1/M2 de macrófagos, el aumento de las células NK, las células NKT, las células T CD3+ y las células T CD8+. y reducción de MDSC.

[0062] Además, observaron que sistémicamente mediante análisis de sangre la terapia HLA2-Fc aumenta la expansión de las células NKT y en algunos casos las células Th1, lo que indica la presencia de un biomarcador que puede usarse para la eficacia de la terapia en entornos preclínicos y clínicos. Curiosamente, también observaron que la monoterapia con 4-1BB aumenta sistémicamente la expansión de células T CD3+, CD4+, CD8+ y Tregs en la sangre de los animales, lo que indica un posible efecto secundario de hiperactivación del sistema inmunitario por 4-1BB. Diversas combinaciones de HLA2-Fc 4-1BB redujeron significativamente la presencia de células T CD3+, CD4+, Treg y CD8+ en sangre, lo que indica un enfoque combinatorio positivo en caso de expansión no deseada de linfocitos en la sangre de pacientes tratados con anticuerpos agonistas.

[0063] En general, el modo de acción de los confórmeros abiertos CMH-Ia, particularmente cuando están presentes como proteínas de fusión que comprenden un fragmento de inmunoglobulina Fc, solos o en un enfoque combinatorio con anticuerpos antagonistas/agonistas es de indudable relevancia como agentes inmunomoduladores, y puede ser útil por su traducción en el tratamiento del cáncer.

[0064] Los confórmeros abiertos de HLA se pueden usar como un agente terapéutico para combatir enfermedades en las que la inmunomodulación es un enfoque terapéutico, como es el caso del cáncer y las enfermedades infecciosas.

Pruebas in vitro

[0065] Los confórmeros abiertos de CMH-Ia se unen a los receptores inmunorreguladores expresados en diversos tipos de glóbulos blancos con una unión única o una afinidad diferente que sus contrapartes de control HLA-p2m-Fc

[0066] Los inventores determinaron si confórmeros abiertos a CMH-Ia interactúan con receptores inmunomoduladores específicos mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los resultados demostraron que los confórmeros abiertos CMH-la interactúan únicamente con KIR3DL2 y PTPRJ (a excepción de HLA-C-p2m-Fc) y muestran diferentes afinidades con los receptores inmunorreguladores KIR3DL1, KIR3DL3, LILRB1, LILRB2 y Pirb que sus contrapartes de control de HLA-p2m-Fc (Fig. 5 AG). Estos datos muestran por primera vez que los alelos clásicos del CMH (HLA-A, HLA-B y HLA-C) (CMH-Ia) tienen un patrón de unión similar a los receptores inmunorreguladores cuando están presentes como confórmeros abiertos. Los confórmeros abiertos CMH-la bloquean la conversión de células T CD4+ murinas en iTregs

[0067] La influencia de las moléculas CMH-Ia en células T CD4+ vírgenes para la conversión de iTreg se analizó con 10 μg/ml de HLA2-Fc (A252-Fc, A302-Fc, B272-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-Fc y C122-Fc), controles HLA-p2m (A25-p2m-Fc, A30-p2m-Fc, B27-p2m-Fc, B53-p2m-Fc, B57-p2m-Fc, B58-p2m-Fc, C08-p2m-Fc y C12-p2m-Fc), isotipo y PBS, incubados con T CD4+ ingenuo células en condiciones de cultivo óptimas para la conversión de iTreg. Se demostró que los confórmeros abiertos CMH-la invariablemente modulan a la baja la inducción de FoxP3 (Fig. 6) y, por lo tanto, la conversión de células T CD4+ vírgenes en iTregs.

[0068] Los confórmeros abiertos CMH-la perjudican la proliferación de células T de leucemia.

[0069] Los inventores determinaron el efecto de los confórmeros abiertos CMH-la (A252-Fc, A302-Fc, B272-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-Fc y C122-Fc) con el bloqueo de proliferación en diferentes líneas celulares tumorales. Los resultados demostraron que los confórmeros abiertos CMH-la modulan invariablemente la proliferación de líneas de células T de linfoma, en comparación con sus contrapartes de control HLA-p2m-Fc (Fig. 7) o el isotipo IgG4 (datos no proporcionados), lo que indica su aplicación potencial para el tratamiento del linfoma como terapia dirigida.

Pruebas in vivo

[0070] La prueba de concepto in vivo de los confórmeros abiertos CMH-la como moléculas terapéuticas inmunomoduladoras para la terapia contra el cáncer se demostró usando un estudio preclínico validado. modelos de carcinoma de colon murino C38 y MC38-OVA singénicos (Figuras 8 y 9), y en el modelo de ratón con cáncer de páncreas (Pan02) (Figuras 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28 y 31).

Producción de confórmeros abiertos CMH-la como proteína de fusión Fc humana en células CHO

[0071] Una estrategia válida, desde un punto de vista terapéutico, es producir moléculas de confórmeros abiertos CMH-la en formato estable (fusión Fc), para aumentar la solubilidad, estabilidad, avidez, vida media y, desde un punto de vista tecnológico, producción y purificación rentables en sistemas de mamíferos. El complejo HLA-p2m-Fc se produjo con éxito mediante la inserción de los dominios alfa 1,2 y 3 de HLA-A25, HLA-A30, HLA-B27, HLA-B53, HLA-B57, HLA-B58, HLA-C08 y HLA-C12 en un casete de vector IgG4-Fc humano (Fig. 3A), junto con un vector humano-p2m, necesario para la producción extracelular de la proteína HLA-p2m-Fc (Fig. 3A, B). Las transfecciones en células de ovario de hámster chino (CHO) se realizaron utilizando tanto el vector HLA-Fc como el vector p2m en una proporción de 1:1. Se recogieron los sobrenadantes y se purificaron HLA-p2m-Fc utilizando protocolos de purificación de anticuerpos estándar (Manual de purificación de proteínas recombinantes, principios y métodos. 2009. ^g E Healthcare, 18-1142-75). La separación de p2m de las cadenas pesadas libres de HLA-Fc se realizó usando condiciones desnaturalizantes por SEC (Fig. 4A), o diálisis (datos no mostrados). El replegamiento de HLA2-Fc se evaluó utilizando el método de dilución en tampón de replegamiento y se analizó la página SDS (Fig. 4B, C) o mediante transferencia Western (datos no mostrados).

Pruebas de terapia de combinación preclínica de HLA2-Fc con CTLA4 y anticuerpos PD-1 en modelos de cáncer de colon singénico murino

[0072] El estudio de prueba de concepto in vivo usando HLA2-Fc (A302-Fc, B272-Fc, B572-Fc, B582-Fc y C082-Fc) como moléculas terapéuticas inmunomoduladoras se demostró en los modelos de cáncer de carcinoma de colon murino C38 y MC38-OVA como monoterapia o en combinación con un anticuerpo murino CTLA4 o murino PD-1.

[0073] Siguiendo los protocolos establecidos, los tumores del fragmento C38 o MC38-OVA se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones singénicos. Una vez que el tumor alcanzó los 60 mm3 (entre 1 y 2 semanas después del trasplante de los tumores), los ratones se distribuyeron según su volumen tumoral. A302-Fc, B272-Fc, B572-Fc, B582-Fc y C082-Fc se inyectaron i.p. seis veces cada 3 días (Q3Dx6), CTLA4 se inyectó dos veces (Q3Dx2) y PD-1 se inyectó 4 veces dos veces a la semana (dos semanas x 2) (Fig. 8A).

[0074] HLA2-Fc seleccionado puede generar sinergia y mejorar las respuestas antitumorales en modelos de ratón de cáncer de colon C38 y MC38-OVA singénicos (Fig. 8 y 9) ya sea como monoterapia (C082-Fc) (Fig. 8D) o en combinación con anticuerpos de punto de control, como PD-1 A302-Fc (Fig. 8B), B582-Fc (Fig. 8C), B572-Fc (Fig. 9B) y CTLA4 B272-Fc (Fig. 9A).

Ensayos de terapia de combinación preclínica de HLA2-FC con anticuerpos PD-1 y 4-1BB en tumores grandes de un modelo de cáncer de páncreas singénico murino

[0075] Para el modelo de ratón con cáncer de páncreas (Pan02), siguiendo los protocolos establecidos, se inyectaron células Pan02 en 1x105 en el flanco derecho de ratones singénicos respectivamente. Una vez que los tumores alcanzaron los 300 mm3 (aproximadamente 3 semanas después de la inyección de células), los ratones se distribuyeron estadísticamente según su volumen tumoral. Tenga en cuenta que los tumores grandes son más difíciles de tratar que los tumores más pequeños, pero son útiles para un análisis más detallado de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Además, los tumores grandes están más cerca de un entorno clínico donde las intervenciones con inmunomoduladores se realizan en tumores de pacientes de gran tamaño.

[0076] En el páncreas (Pan02), los datos demostraron que la combinación de HLA2-Fc con el anticuerpo PD-1 puede reducir significativamente los tumores Pan02 grandes en combinación con A252-Fc (Fig. 10A-B), B272-Fc (Fig. 16A-B), C082-Fc (Fig. 28A-B) y C122-Fc (Fig. 31A-B), mientras que la monoterapia con PD-1 no mostró ningún efecto terapéutico. Otras combinaciones de HLA2-Fc con PD-1 no demostraron significación estadística, sin embargo, se observó un % de inhibición tumoral A en la combinación B572-Fc (Fig. 22). Además, se demostró que la terapia combinada de HLA2-Fc con el anticuerpo 4-1BB reduce significativamente el tamaño del tumor o varias terapias combinadas de HLA2-Fc (a excepción de A302-Fc y C082-Fc) en comparación con el isotipo. Las reducciones tumorales más sorprendentes (p<0,01) se observaron con B532-Fc (Fig. 19A-B), B572-Fc (Fig. 22A-B) y B582-Fc (Fig. 25A-B). La monoterapia con 4-1BB no fue significativamente diferente en comparación con el control de isotipo. La monoterapia con C082-Fc (Fig. 28A-B) mostró una reducción significativa del tumor (p<0,01) en comparación con el isotipo.

[0077] La contextura inmune tumoral de ratones pancreáticos (Pan02) demostró la influencia de la terapia HLA2-Fc hacia diversos conjuntos de leucocitos infiltrantes tumorales como se observó con la infiltración de la relación M1/M2 de macrófagos, aumento de células NK, células NKT, células T CD3+, y células T CD8+, y reducción de MDSC, con variaciones para cada HLA2-Fc como se observa en A252-Fc (Fig. 11A-C), A302-Fc (14A-C), B272-Fc (17A-C), B532-Fc (20A-C), B572-Fc (23A-C), B582-Fc (26A-C), C082-Fc (29A-C) y C122-Fc (32A-C). El análisis sistémico de los leucocitos de la sangre demostró solo unos pocos cambios en comparación con sus contrapartes de monoterapia de control en células NKT y células Th1 para algunos casos, A252-Fc (Fig. 12A-C), A302-Fc (15A-C), B272- Fc (18A-C), B532-Fc (21A-C), B572-Fc (24A-C), B582-Fc (27A-C), C082-Fc (30A-C) y C122-Fc (33A- C).

Conclusión

[0078] La presente invención demuestra por primera vez que la familia de moléculas CMH-la clásicas cuando se producen como cadenas pesadas sin p2m (confórmeros abiertos HLA-A, HLA-B y HLA-C y sus correspondientes proteínas de fusión HLA2-Fc) tienen propiedades inmunomoduladoras que difieren de sus homólogos de control HLA-p2m. Usando como ejemplos no limitantes diversos conjuntos de alelos HLA, los inventores proporcionan datos que demuestran que invariablemente las moléculas CMH-la, cuando están presentes como confórmeros abiertos, son agentes inmunomoduladores con propiedades únicas, como lo demuestra la modulación de los leucocitos presentes en el microambiente tumoral y en la sangre. Además, su uso no solo se limita a agentes moduladores, sino también para su uso como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer, como se demostró en modelos preclínicos de cáncer de colon y cáncer de páncreas en ratones con cáncer, ya sea como monoterapia o en terapia combinada con anticuerpos inhibidores de puntos de control (por ejemplo, CTLA4 y PD-1) y anticuerpos agonistas de puntos de control (por ejemplo, 4-1BB).

[0079] La interacción de HLA2-Fc con diversos receptores inmunorreguladores (KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRB1, LILRB2, PTPRJ y Pirb) distribuidos en diversos glóbulos blancos (por ejemplo, NK, NKT, células T CD4+, macrófagos y MDSC) demuestra que la naturaleza multitarea de las moléculas allana una nueva forma de modular el sistema inmunológico con confórmeros abiertos HLA.

[0080] Además, se demostró que las moléculas HLA2-Fc bloquean la conversión de células T CD4+ ingenuas en iTregs in vitro, lo que indica un modo de acción en el que HLA2-Fc actúa como una molécula inmunomoduladora que afecta la diferenciación y la función de iTregs. Apuntar a iTregs es una estrategia para diversas indicaciones terapéuticas, como enfermedades infecciosas y cáncer.

[0081] En general, el modo de acción de HLA2-Fc como enfoques combinatorios con anticuerpos antagonistas/agonistas tiene una relevancia indudable en el tratamiento del cáncer y se correlaciona con la necesidad clínica actual en inmunoterapia contra el cáncer.

[0082] Las moléculas HLA2-Fc emergen como una nueva clase de fármacos inmunomoduladores. Los datos in vitro e in vivo apuntan a un mecanismo en el que las moléculas HLA2-Fc actúan como un mecanismo de encendido para la activación de la inmunidad antitumoral. Sin desear limitarse a la teoría, los inventores plantean la hipótesis de que la interacción de los confórmeros abiertos HLA2-Fc con diversos receptores inmunomoduladores presentes en NK, células T, macrófagos y MDSC, y la modulación funcional de Tregs participan sinérgicamente y exacerban la respuesta inmunitaria.

Materiales y métodos

Líneas celulares

[0083] Se realizaron experimentos in vivo usando líneas celulares de ratón de carcinoma de colon C38 y MC38-OVA.

[0084] Las líneas celulares experimentales in vitro utilizadas fueron: EL4, linfoma de células T de ratón; EG.7, linfoma de células T de ratón; Jurkat, linfoma de células T humano; L428, linfoma de Hodgkin humano; L540, linfoma de Hodgkin humano; L1236, linfoma de Hodgkin humano; Daudi, linfoma de células B; IMR-5, neuroblastoma; SK-N-AS, neuroblastoma; y M130428, Melanoma.

Anticuerpos

[0085] Las poblaciones de linfocitos para los experimentos de conversión de iTreg se tiñeron con: CD4 (FITC-BD Bioscience), FoxP3+ (efluor 450-eBioscience), CD3 (PE-Cy7-eBioscience), CD45 (PerCP-eBioscience).

[0086] El análisis de los linfocitos que se infiltran en el tumor se realizó con los siguientes anticuerpos: CD45 (Biolegend, clon 30-F11); CD3 (BD Bioscience, clon 145-2011); CD4 (Biolegend, clon GK1.5), CD8 (BD Bioscience, clon 53-6.7), CD25 (Biolegend, clon PC61), FoxP3 (eBioscience, clon FJK-16s), CD335 (Biolegend, clon 29A1.4), F4 /80 (Biolegend, clon ^b M8), CD11b (Biolegend, clon M1/70), Gr-1 (BD Bioscience, clon RB6-8C5), MHClI INIE (BD Bioscience, clon 2G9), CD206 (Biolegend, clon C068C2) y tinción LID (eBioscience).

[0087] El análisis de leucocitos en sangre se realizó con los siguientes anticuerpos: CD45 (Biolegend, clon 30-F11); CD3 (BD Bioscience, clon 145-2011), CD4 (Biolegend, clon GK1.5), CD8 (BD Bioscience, clon 53-6.7), FoxP3 (eBioscience, clon FJK-16s), T-Bet (BD Bioscience, clon 4B10), CD335 (Biolegend, clon 29A1.4), F4/80 (Biolegend, clon B^m 8), CD115 (Biolegend, clon AFS98), CD11b (Biolegend, clon M1/70), Ly6G (Biolegend, clon 1A8), Ly6C (Biolegend, clon HK1.4) y tinción LID (eBioscience).

[0088] Los anticuerpos inhibidores de puntos de control CTLA4 clon 9H10, PD-1 clon RMP1-14 y el anticuerpo agonista 4-1BB clon 3H3 se obtuvieron de Bio X Cell Co.

[0089] HCl0 mAb (IgG2a) que se une a cadenas pesadas libres de p2m de los alelos CMH-la fue un regalo del Dr. Hidde Ploegh (MIT, MA).

Producción, purificación y replegamiento de HLA2-FC

[0090] Producción recombinante de HLA-p2m-Fc (A25-p2m-Fc, A30-p2m-Fc, B2705-p2m-Fc, B53-p2m-Fc, B57-p2m-Fc, B58-p2m-Fc, C08-p2m-Fc y C12-p2m-Fc) se logró insertando los dominios alfa 1, 2 y 3 de HLA en un vector IgG4-Fc humano (InvivoGen), y la microglobulina p2 humana (p2m) en un vector separado. La producción de HLA-p2m-Fc recombinante se realizó mediante cotransfección del vector HLA-Fc y el vector p2m en células de ovario de hámster chino (CHO). La producción de HLA-p2m-Fc se subcontrató a Evitria AG.

[0091] La purificación de construcciones HLA-p2m-Fc se realizó utilizando protocolos convencionales para la purificación de anticuerpos. La producción de HLA2-Fc se realizó con la adición de un paso de desnaturalización para eliminar p2m del complejo HLA-p2m-Fc.

[0092] Brevemente, el paso de captura de las proteínas HLA-p2m-Fc se realizó después de pasar los sobrenadantes (5 ml/min) a través de columnas de proteína G (Amersham Pharmacia). Los pasos intermedios de purificación se realizaron eluyendo el HLA-p2m-Fc seleccionado de las columnas de proteína G usando tampón de elución (glicina 100 mM, pH 2,0) y recuperando fracciones en urea 8 M, Tris-HCl 100 mM pH 8,0. El primer paso de pulido fue separar las fracciones de monómeros HLA-Fc de p2m mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) con superdex 200 prep grade o Sephacryl S-100 HR (GE Lifescience) con un sistema AKTA (GE Lifescience) o mediante diálisis. con membranas de 50 KDa de tamaño de poro (Millipore). Los monómeros HLA-Fc recuperados de ambos protocolos se replegaron mediante el método de dilución después de pulsar los monómeros HLA-Fc 3 veces con intervalos de 8 horas cada uno en 100 veces el volumen de tampón de replegamiento (Tris-HCl 50 mM pH 8,5, 500 L-arginina mM, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 mM, sacarosa al 1 %, Tween-20 al 0,01 %). El segundo paso de pulido por SEC se realizó para eliminar más impurezas y para cambiar las fracciones recién recuperadas de proteínas HLA2-FC en tampón de dilución (PBS, sacarosa al 1 % y Tween-20 al 0,01 %). Las soluciones purificadas de proteínas HLA2-Fc (A252-Fc, A252-Fc, B27052-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-F, C122-Fc) se esterilizaron por filtración utilizando membranas de 0,2 mm (Millipore).

[0093] Las fracciones de complejos HLA-p2m-Fc y HLA2-Fc se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 4-20 % en gradiente (SDS-PAGE) y transferencia Western usando anticuerpos HCl0 (específicos para cadenas pesadas libres de HLA). Se realizaron transferencias Western de p2m con y sin condiciones desnaturalizantes (DTT 10 mM) (datos no mostrados).

Ensayos ELISA

[0094] Los ensayos ELISA de competición se realizaron utilizando placas de 96 pocillos Maxisorp (Nunc, Suiza) recubiertas con 10 μg/ml de receptores de leucocitos seleccionados (KIR3DL1 humano, KIR3DL2 humano, KIR3DL3 humano, LILRB1 humano, LILRB2 humano, PTPRJ humano y Pirb de ratón) comprado en Creative Biomart. Los receptores se incubaron durante ON a 4 °C, se bloquearon con leche en polvo al 5 %-TBS durante 2 horas. Construcciones seleccionadas de HLA2-Fc (A252-Fc, A302-Fc, B27052-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-F y C122-Fc) y sus controles (A25-p2m-Fc, A30-p2m-Fc, B2705-p2m-Fc, B53-p2m-Fc, B57-p2mFc, B58-p2m-Fc, C08-p2m-Fc y C12-p2m-Fc) e isotipo Se añadió IgG4 a 10 μg/ml durante 2 horas a temperatura ambiente. Se usaron como detectores anticuerpos conjugados con HRP contra Fc humana.

Citometría de flujo de leucocitos

[0095] El análisis de citometría de flujo se realizó usando un FACS canto II (BD Bioscience) y los datos se analizaron usando FlowJo versión 7.6.4.

Generación de Tregs

[0096] Para inducir la expresión de Foxp3 en células T CD4+ murinas, recolectamos células de bazo de esplenocitos C57BL/6 y las purificamos (Kit de aislamiento de células T CD4+ ingenuas de ratón - Easy Sep) para obtener células T ingenuas CD4+. A continuación, las células se cultivaron durante 96 h a 105 células/200 μL/pocillo en placas de 96 pocillos con 5 μg/ml de mAb anti-CD3 recubierto (eBioscience), 2 μg/ml de mAb anti-CD28 soluble (Biolegend), 10 μg/ml de TGF-p1 (R&D systems) y 100 UI/mL de IL-2 (R&D systems).

Conversión de iTreg en presencia de HLA2-Fc

[0097] Células T CD4+ ingenuas murinas en condiciones de cultivo óptimas para la conversión de iTreg se incubaron en presencia de concentraciones de dosis (5 μg/200 μL) de HLA2-Fc (A252-Fc, A302-Fc, B27052-Fc, B532-Fc, B572-Fc, B582-Fc, C082-F y C122-Fc), controles (A25-p2m-Fc, A30-p2m-Fc, B2705-p2m-Fc, B53-p2m-Fc, B57-p2m-Fc, B58-p2m-Fc, C08-p2mFc y C12-p2m-Fc) Isotipo IgG4, medios sin factores de diferenciación y PBS durante 72 h. La conversión de iTreg se midió por citometría de flujo.

Ensayo de proliferación

[0098] Las células se sembraron en placas redondas de 96 pocillos a una densidad de 5 x 105 células/pocillo tras la adición de fármacos a diferentes concentraciones (25, 10 y 5 μg/pocillo) durante 1 día. El ensayo de proliferación XTT se realizó de acuerdo con las instrucciones del manual (kit de proliferación celular II, Roche). Los resultados se obtuvieron con la absorbancia de los pocillos a 450 nm utilizando un lector de placas de microvaloración.

Tratamientos in vivo

[0099] Se inyectaron subcutáneamente fragmentos de tumor C38 o MC38-OVA en el flanco derecho de ratones C57BL/6 hembra singénicos en la semana 6. Se inyectaron líneas celulares Pan02 a 1x105 en el flanco derecho de ratones C57BL/6 singénicos en la semana 6. Los animales se distribuyeron de acuerdo con el tamaño del volumen de su tumor individual y se dividieron en grupos que no mostraron diferencias estadísticas entre ellos. Para C38 y MC38-OVA el tratamiento experimental comenzó cuando los tumores alcanzaron los ±60 mm3. Para el páncreas, el tratamiento experimental Pan02 comenzó en tumores grandes de 300 mm3. Los diámetros de los tumores se midieron usando un calibrador y el volumen se calculó de acuerdo con la fórmula D/2xd2 donde D y d son el diámetro más largo y más corto del tumor en mm, respectivamente.

[0100] El diseño experimental de inyección de sustancias se estableció de la siguiente manera para colon (C38 y MC38): vehículo (PBS 200 μL) Q3Dx6; isotipo (10mg/Kg) Q3Dx6; HLA2-Fc (10 mg/Kg) Q3Dx6; anti-CTLA4 Q3Dx2 (1a inyección 100 μg y 2a inyección 50 μg); PD-1 dos semanas x 2 (200 μg); H^lA2-F^c + CTLA-4 (Q3Dx6 y Q3Dx2, respectivamente); HLA2-Fc PD-1 (Q3Dx6 y dos semanas x 2, respectivamente). Para el páncreas (Pan02) el diseño experimental de inyección de sustancias fue el siguiente: isotipo (5 mg/Kg) dos semanas x 2; HLA2-Fc (5 mg/Kg) dos semanas x 2; PD-1 (5 mg/Kg) dos semanas x 2; 4-1BB (1 mg/Kg) dos semanas x 2; HLA2-Fc PD-1 dos semanas x 2; y HLA2-Fc 4-1BB dos semanas x 2.

[0101] El % de inhibición A se calcula a partir de la relación de crecimiento tumoral AT/AC, que representa el crecimiento del tumor en % desde el comienzo del tratamiento (por ejemplo, 300 mm3), al volumen final del tratamiento (p. ej., 1000 mm3) en comparación con el control utilizando la siguiente fórmula: % medio de lnhibición = (media(C)-media(C0))-(media(T)-media(T0)) / (media(C)-media(C0)) * 100%. Donde T = valor del grupo tratado, T0 - valor inicial del grupo tratado; C - valor del grupo de control, C0 - valor inicial del grupo de control.

[0102] Para el análisis de los linfocitos que se infiltran en el tumor, se usaron las siguientes estrategias de selección: CD45+ para leucocitos totales; CD45+ CD3+ para células T totales; CD45+ CD3+ CD4+ para células T auxiliares CD4; CD45+ CD3+ CD8+ para células T citotóxicas CD8; CD45+ CD3+ CD4+ FoxP3+ CD25+ para células Treg; CD45+ CD3-CD11+ Gr-1+ para MDSC; CD45+ CD3- CD11+ F4/80+ para macrófagos; CD45+ CD3- CD11+ F4/80+ MHClI+ para macrófagos tipo M1; CD45+ CD3-CD11+ F4/80+ CD206+ para macrófagos tipo M2; CD45+ Gr-1- F4/80- CD335+ para células NK; y CD45+ Gr-1- F4/80- CD335+ CD3+ para células NKT.

[0103] Para el análisis de leucocitos en sangre se usaron las siguientes estrategias de sincronización: CD45+ para leucocitos totales; CD45+ CD3+ para células T totales; CD45+ CD3+ CD4+ para células T auxiliares CD4; CD45+ CD3+ CD8+ para células T citotóxicas CD8; CD45+ CD3+ CD4+ FoxP3+ para células Treg; CD45+ CD3+ CD4+ T-Bet+ para células Th1; CD45+ CD3- CD11+ Ly6C+ Ly6G+ para G-MDSC y M-MDSC; CD45+ Ly6C- Ly6G- CD335+ para células NK; y CD45+ Ly6C- Ly6G- CD335+ CD3+ para células NKT.

[0104] La preparación de muestras de tumor y sangre para citometría de flujo se realizó utilizando protocolos descritos por eBioscience (https://www.ebioscience.com/media/pdf/best-protocols/cell-preparation-for-flow-cytometry.pdf, consultado el 21 de febrero de 2017).

Tabla 1: Lista de alelos CMH-la

Tabla 2: Alelos CMH-la seleccionados

(Continuación)

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un confórmero abierto CMH-Ia de fusión, en el que dicho confórmero abierto CMH-Ia de fusión comprende o consiste esencialmente en un primer monómero o un primer y un segundo monómero, en el que

a. dicho primer monómero, o cada uno de dicho primer y segundo monómero independientemente del otro monómero, comprende una cadena pesada de HLA seleccionada entre C08, A25, B58, A30, B53 y C12, y b. en el que dicho primer monómero, o cada uno de dicho primer y segundo monómero están unidos covalentemente a una secuencia polipeptídica Fc,

en el que la cadena pesada de HLA consiste únicamente en los dominios HLA alfa 1,2 y 3.

2. El confórmero abierto de fusión CMH-Ia según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada de HLA es C08.

3. El confórmero abierto de fusión CMH-Ia según la reivindicación 1 o 2, en el que un conector de aminoácidos se une a la cadena pesada de HLA y la secuencia del polipéptido Fc.

4. El confórmero abierto de fusión CMH-Ia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el primer y el segundo monómero son iguales.

5. El confórmero abierto CMH-Ia de fusión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el confórmero abierto CMH-Ia de fusión comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico, particularmente en el que el primer y/o segundo monómero comprende adicionalmente un fragmento de epítopo peptídico.

6. El confórmero abierto de fusión CMH-Ia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dominio Fc comprende regiones constantes de cadena pesada Ch2 y Ch3 seleccionadas de cualquiera de inmunoglobulina tipo G (IgG), tipo A (IgA), tipo D (IgD), tipo E (IgE) o tipo M (IgM).

7. El confórmero abierto de fusión CMH-Ia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el conector de aminoácidos comprende de 1 a 50, particularmente de 5 a 40, más particularmente de 10 a 30, incluso más particularmente de 15 a 25 aminoácidos, que unen la cadena pesada de HLA al dominio Fc como una única cadena polipeptídica.

8. El confórmero abierto de fusión CMH-Ia según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso como medicamento.

9. El confórmero abierto CMH-Ia de fusión según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 9 para uso

a. en el tratamiento o prevención del cáncer, o

b. como agente inmunomodulador, particularmente en el tratamiento de una enfermedad infecciosa, más particularmente en el tratamiento de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, influenza, infección por el virus respiratorio sincitial (RSV), sarampión, herpes y fiebre amarilla.

10. Una molécula de ácido nucleico, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica un monómero de confórmero abierto CMH-la de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Un virus que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10 bajo el control de una secuencia promotora operable en una célula de mamífero, en particular en una célula humana, en particular un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus del herpes o un lentivirus.

12. Una célula huésped modificada genéticamente in vitro que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10.

13. Un medicamento combinado que comprende

a. un confórmero abierto de fusión CMH-Ia como se especifica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y b. un agente modulador de punto de control seleccionado de

i. un agente inhibidor de puntos de control (CPI), particularmente en el que dicho CPI se selecciona de:

- un inhibidor de la interacción de CTLA4 con B7-1 (cd80) y/o B7-2 (cd86), más particularmente un ligando polipeptídico para CTLA- 4 oa cd80 oa cd86;

- un inhibidor de la interacción de PD-1 con PD-L1 y/o PD-L2, más particularmente un ligando polipeptídico de PD-1 o de PD-L1 o de PD-L2; y

- un ligando polipeptídico inhibidor, particularmente un anticuerpo, de inmunoglobulina de células T y dominio de mucina que contiene 3 (TIM-3); y

ii. un agente agonista de punto de control, particularmente un anticuerpo agonista de punto de control seleccionado para unirse y activar el receptor del factor de necrosis tumoral 4-1BB, particularmente un anticuerpo monoclonal contra 4-1BB.

particularmente donde dicho agente modulador de puntos de control es un polipéptido seleccionado de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo y una molécula similar a un anticuerpo, y el polipéptido es selectivamente reactivo a un mediador de puntos de control seleccionado de CTLA4, PD-1, CD80, CD86, PD-L1, PD-L2, TIM-3, 4-1BB y 4-1BBL.