CN109562171A - MHC Ia类开放型构象异构体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为免疫调节剂、特别是在治疗或预防癌症中的免疫调节剂的MHC‑Ia开放型构象异构体。所述开放型构象异构体包含第一和第二单体或者由第一和第二单体组成，并且每个单体包含来自MHC‑Ia分子的HLA重链。所述开放型构象异构体还包含蛋白质稳定化多肽序列和可选的氨基酸连接物。本发明的其他方面提供了包含MHC‑Ia开放型构象异构体和免疫检查点抑制剂的组合药物。此外，本发明涉及MHC‑Ia开放型构象异构体作为免疫调节剂的应用，特别是在与多种免疫调节受体如KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB1、LILRB2和PTPRJ的相互作用调节免疫应答的疾病中，以及在以Treg的负向调节作为治疗策略的疾病(例如传染病)中作为免疫调节剂的应用。

Description

MHC Ia类开放型构象异构体
本发明涉及经典MHC Ia类(MHC-Ia)开放型构象异构体的应用，特别是用于预防或治疗癌症的应用以及作为免疫调节剂的应用。
人白细胞抗原(HLA)属于典型的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白家族。HLA复合体有助于免疫系统区分身体自身的蛋白质与由诸如病毒和细菌等外来入侵物产生的蛋白质。人类具有MHC I类分子，其包含经典(MHC-Ia)的HLA-A、HLA-B和HLA-C，以及非经典(MHC-Ib)的HLA-E、HLA-F、HLA-G和HLA-H分子。这两种类型在肽结合、呈递和诱导的T细胞应答方面的机制相似。经典MHC-Ia的最显著的特征是它们的高度多态性，而非经典MHC-Ib通常是非多态性的，并且倾向于显示出比其MHC-Ia对应物更受限制的表达模式。
HLA的命名由基因位点的特定名称(例如HLA-A)、随后的等位基因家族血清学抗原(例如HLA-A*02)以及按照DNA序列确定的顺序以数字指定的等位基因亚型(例如HLA-A*02:01)给出。仅在编码序列内的同义核苷酸取代(也称为沉默或非编码取代)方面有区别的等位基因通过使用第三组数字(例如HLA-A*02:01:01)来区分。仅在内含子中的序列多态性或在侧接外显子和内含子的5'或3'非翻译区域中的序列多态性方面有区别的等位基因通过使用第四组数字来区分(例如HLA-A*02:01:01:02L)(图1)。
表1中提供了MHC-Ia等位基因的列表。等位基因亚型的完整列表请访问链接：http://hla.alleles.org/alleles/class1.html。
经典的MHC-Ia分子的主要功能是作为适应性免疫应答的一部分来呈递肽。MHC-Ia分子是三聚体结构，其包含与β2微球蛋白(β2m)和源自自体蛋白、病毒或细菌的小肽非共价结合的具有三个细胞外结构域(α1、α2和α3)的膜结合重链。α1和α2结构域是高度多态性的，并形成产生肽结合沟的平台。与保守的α3结构域并置的是跨膜结构域，其后是细胞内的细胞质尾。
为了引发免疫应答，经典MHC-Ia分子呈递特异性肽以被CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上存在的TCR(T细胞受体)识别，而存在于自然杀伤细胞(NK)中的NK细胞受体则识别肽基序而不是单个的肽。在正常生理条件下，MHC-Ia分子作为异三聚体复合物存在，负责向CD8+T细胞和NK细胞呈递肽，然而，MHC-Ia分子还可以作为缺少β2微球蛋白和肽的游离重链存在于细胞中，并且可称为HLA开放型构象异构体(Arosa等,Trends in Immunology2007Mar；28(3):115-23)(图2)。HLA开放型构象异构体与T细胞受体和NK细胞受体的相互作用不依赖于肽，其功能是未知的。
开放型构象异构体可以在细胞的细胞表面表达，并且可以用识别不含β2m和肽的HLA分子的线性表位的抗体(例如LA45、L31、HCA2和HC-10)来检测。这些抗体已被用于检测多种自身免疫患者和健康个体中的开放型构象异构体的存在(Raine等，Rheumatology2006；45:1338-1344)。尽管它们存在于患者和细胞系中，但对它们的作用模式知之甚少。开放型构象异构体主要在强直性脊柱炎(AS)+HLA-B27患者中进行了评估，其中假设HLA-B27开放型构象异构体能够诱导自身免疫，其在其他自身免疫患者中的功能尚未得到探究。
在此本发明人首次公开，当作为开放型构象异构体(无β2m的重链)存在时，经典MHC-Ia(HLA-A、HLA-B和HLA-C)分子家族因其免疫调节性质是用于治疗癌症的有用的治疗剂。
癌症是以经历不受控的破坏性生长的身体异常细胞为特征的一组疾病。癌细胞可以遍布全身并转移而形成肿瘤；这种生长模式被称为恶性。癌症可以通过手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法和免疫疗法来治疗。疗法的选择取决于癌症的类型、癌症的阶段(已传播的程度)、年龄、健康状况和其他个人特征。不存在单一的癌症治疗方法，患者往往接受疗法和姑息护理(palliative care)的组合。
癌症免疫疗法是指被设计用来诱导患者自身的免疫系统对抗肿瘤的多种治疗策略，并且基于以下见解：免疫系统监视癌症的进展，其涉及多种突变的积累。免疫疗法或者刺激免疫系统的特定细胞组分的活动，或者抵消癌细胞产生的抑制免疫应答的信号(Mahoney等，Nat Rev Drug Discov.2015Aug；14(8):561-84)。
不同类型的免疫细胞参与针对癌症的免疫应答。在这个白细胞池(免疫环境(immune contexture))中，最著名的细胞是：T细胞(细胞毒性CD8+T细胞，辅助CD4+T细胞-Th1、Th2和Th17表型)，调节T细胞(Treg)，巨噬细胞(M1型-促炎性，和M2型-促肿瘤性)，髓系衍生的抑制细胞(MDSC)，自然杀伤细胞(NK细胞)，和树突状细胞(DC)。这些免疫细胞可以位于肿瘤的中心、侵入边缘或相邻的三级淋巴结构中(Fridman等，Nat.Rev.Cancer.2012,April:12,298-306)。
免疫微环境的密度和组成在不同的患者中和肿瘤中并不相同。现在已经充分确定，通常，肿瘤浸润M2表型巨噬细胞和髓系衍生的抑制细胞(MDSC)会促进肿瘤进展，而细胞毒性CD8+T细胞、Th1表型细胞和M1型巨噬细胞的浸润常常与良好的临床结果和对免疫疗法的良好响应相关。其他淋巴和骨髓细胞群的临床影响不太一致，似乎依赖于肿瘤类型和阶段。Th17和NK细胞的存在以及肿瘤浸润中Treg细胞的缺失/减少与某些癌症适应证的良好结果相关(Giraldo等，Current Opinion in Immunology 2014,27:8-15)。已综述了白细胞浸润与临床结果之间的平衡的总览(Becht等，Current Opinion in Immunology.2016,39:17-13)。
总体而言，调节有利于M1型巨噬细胞、细胞毒性CD8T细胞和Th1细胞的浸润、且/或减少MDSC和M2型巨噬细胞的浸润的肿瘤免疫环境是一种治疗癌症的有希望的治疗途径，在此通过使用HLA开放型构象异构体蛋白在多种癌症适应证中对其进行了探索。
术语和定义
氨基酸序列以氨基端到羧基端的顺序给出。序列位置的大写字母指单字母代码中的L-氨基酸(Stryer，Biochemistry，第3版，第21页)。
本说明书中使用的术语“开放型构象异构体”是指未与β2-微球蛋白结合的分离的HLA重链分子，无论是作为单体还是作为二聚体(同二聚体或异二聚体)。本文公开的开放型构象异构体的某些实施方式是融合蛋白单体或二聚体，其中HLA重链与稳定化多肽区、特别是可结晶片段免疫球蛋白结构域共价连接。
在本说明书的背景下，术语“序列同一性”和“序列同一性百分”比是指通过比较两个比对序列而确定的值。用于进行比较的序列比对方法是本领域公知的。用于进行比较的序列比对可通过以下方法进行：Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))、Needleman和Wunsch的全局比对算法(J.Mol.Biol.48：443(1970))、Pearson和Lipman的相似性检索法(Proc.Nat.Acad.Sci.85：2444(1988))或这些算法的计算机化实施形态而，其包括但不限于CLUSTAL、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。用于进行BLAST分析的软件是公众可得的，例如，通过美国国家生物技术信息中心(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。用于比较氨基酸序列的一个实例是使用默认设置的BLASTP算法：期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配：0；矩阵：BLOSUM62；空位代价：存在11，延伸1；组成调整：条件性组成评分矩阵调整。用于比较核酸序列的一个这样的实例是使用默认设置的BLASTN算法：期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/不匹配评分：1.-2；空位代价：线性。除非另有说明，本文提供的序列同一性值是指使用分别利用上述针对蛋白和核酸比较的默认参数的BLAST程序套件获得的值(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。
在本说明书的背景下，术语“主要组织相容性复合体(MHC)”以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用；它是指展示蛋白质的特定部分(肽)(也称作表位)的细胞表面分子。存在两个主要类别的MHC分子：I类和II类。在MHC I类中，可以基于它们的多态性区分出两组：a)经典(MHC-Ia)，具有相应的多态性HLA-A、HLA-B和HLA-C基因，和b)非经典(MHC-Ib)，具有相应的较少多态性的HLA-E、HLA-F、HLA-G和HLA-H基因。
MHC I类重链分子通常(即，当不是开放型构象异构体形式时)作为与非MHC分子β2-微球蛋白的单元相连的α链存在。α链在从N末端到C末端的方向上包含信号肽、三个细胞外结构域(α1-3，α1在N末端)、跨膜区和C末端胞质尾。被展示或呈递的肽在α1/α2结构域的中心区域被肽结合沟保持。
在本说明书的背景下，术语β2-微球蛋白结构域以其在细胞生物学和生物化学领域中已知的含义使用；它是指作为MHC I类异二聚体分子的一部分的非MHC分子。换句话说，它构成MHC I类异二聚体的β链。
在本说明书的背景下，术语人白细胞抗原(HLA)以其在细胞生物学和生物化学领域中已知的含义使用；它是指编码人MHC I类蛋白的基因座。三个主要的经典MHC-Ia基因是HLA-A、HLA-B和HLA-C，并且所有这些基因都具有不同数量的等位基因(表1)。紧密相关的等位基因合并在某个等位基因的亚组中。例如，等位基因HLA-B57具有超过100个在一个或多个氨基酸上有所不同的紧密相关的等位基因，根据针对HLA系统的因子的WHO命名委员会，这些等位基因被标记为HLA-B*57:01:01至HLAB*57:82。所有已知的HLA基因及其各等位基因的全长或部分序列是本领域技术人员可以在专业数据库中获得的，例如IMGT/HLA(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)。
在本说明书的背景下，术语“抗体”以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用；它是指：完整抗体，包括但不限于免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)；任何抗原结合片段或其单链；以及相关构建体或衍生构建体。完整抗体是包含通过二硫键相连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白。每个重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域组成。每个轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分在内的宿主组织或因子的结合。
在本说明书的上下文中，术语“抗体样分子”是指能够以高亲和力/Kd≤10E-8mol/l特异性地结合另一分子或靶标的分子。抗体样分子与其靶标结合，这类似于抗体的特异性结合。术语抗体样分子包括重复蛋白，例如设计的锚蛋白重复蛋白(Molecular Partners，Zürich)，衍生自犰狳(armadillo)重复蛋白的多肽，衍生自富含亮氨酸的重复蛋白的多肽，和衍生自34肽重复蛋白的多肽。
术语抗体样分子还包括：衍生自蛋白A结构域的多肽，衍生自纤连蛋白结构域FN3的多肽，衍生自共有纤连蛋白结构域的多肽，衍生自脂质运载蛋白的多肽，衍生自锌指的多肽，衍生自Src同源结构域2(SH2)的多肽，衍生自Src同源结构域3(SH3)的多肽，衍生自PDZ结构域的多肽，衍生自γ-晶状体蛋白的多肽，衍生自泛素的多肽，衍生自半胱氨酸结多肽的多肽，和衍生自结状蛋白(knottin)的多肽。
术语蛋白A结构域衍生的多肽是指作为蛋白A的衍生物并且能够特异性结合免疫球蛋白的Fc区和Fab区的分子。
术语犰狳重复蛋白是指包含至少一个犰狳重复的多肽，其中犰狳重复的特征在于形成发夹结构的一对α螺旋。
在本说明书的背景下，术语可结晶片段(Fc)区以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用；它是指包含通过二硫键共价连接的由CH2和CH3结构域组成的两个相同的重链片段的抗体部分。
在本说明书的背景下，术语二聚体是指由两个亚基组成的单元。
在本说明书的背景下，术语同二聚体是指由相同的两个亚基或者由属于同一类亚基的高度相似成员的两个亚基组成的二聚体。同二聚体的一个实例是由独立选自HLA等位基因列表中的两个亚基组成的二聚体。在某些实施方式中，同二聚体由两个相同的HLA等位基因组成。
在本说明书的背景下，术语“氨基酸连接物”是指长度可变的多肽，其用于连接两个多肽以产生单链多肽。对实施本文指定的本发明有用的连接物的示例性实施方式是由1、2、3、4、5、10、20、30、40或50个氨基酸组成的寡肽链。氨基酸连接物的非限制性实例是连接HLA重链多肽与Fc结构域的多肽GGGGSGGGGS(SEQ ID No:001)。
在本说明书的上下文中，术语“检查点抑制剂”或“检查点抑制性抗体”意在涵盖能够破坏在T细胞活化后导致T细胞抑制的信号级联(本领域已知的免疫检查点机制的一部分)的试剂、特别是(非激动剂)抗体(或抗体样分子)。检查点抑制剂或检查点抑制性抗体的非限制性实例包括针对CTLA-4(Uniprot P16410)、PD-1(Uniprot Q15116)、PD-L1(UniprotQ9NZQ7)、B7H3(CD276；Uniprot Q5ZPR3)、Tim-3、Gal9、VISTA或Lag3的抗体。
在本说明书的上下文中，术语“检查点激动剂”或“检查点激动剂抗体”意在涵盖能够参与导致T细胞活化的信号级联(本领域已知的免疫检查点机制的一部分)的试剂、特别是但不限于抗体(或抗体样分子)。已知刺激T细胞活化的受体的非限制性实例包括CD122和CD137(4-1BB；Uniprot Q07011)。术语检查点激动剂或检查点激动剂抗体包括针对CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD357(GITR)、CD278(ICOS)、CD27、CD28的激动剂抗体。
在本说明书的上下文中，术语“(免疫)检查点调节剂”包括检查点抑制剂、检查点抑制性抗体、检查点激动剂和检查点激动剂抗体。
具体实施方式
本发明提供了MHC-Ia开放型构象异构体(HLA-开放型构象异构体)。MHC-Ia开放型构象异构体包括HLA-A、HLA-B和HLA-C开放型构象异构体。表1提供了已知MHC-Ia等位基因的列表。本发明不包括包含HLA-B27或HLA-B57等位基因的MHC-Ia开放型构象异构体。
根据本发明的第一方面，提供了分离的MHC-Ia开放型构象异构体，条件是所述分离的MHC-Ia开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体。
在某些实施方式中，分离的MHC-Ia开放型构象异构体包含第一单体或第一和第二单体，并且单体各自相互独立地包含HLA重链。
根据本发明第一方面的替代性方案，提供了分离的HLA-A开放型构象异构体。
根据本发明第一方面的另一个替代性方案，提供了分离的HLA-B开放型构象异构体，条件是所述分离的HLA-B开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体。
根据本发明第一方面的又一替代性方案，提供了一种分离的HLA-C开放型构象异构体。
根据本发明第一方面的又一替代性方案，提供了分离的HLA-A开放型构象异构体和HLA-C开放型构象异构体。
根据本发明的第二方面，提供了一种分离的MHC-Ia开放型构象异构体，条件是所述分离的MHC-Ia开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体，所述分离的MHC-Ia开放型构象异构体
-用作药物，
-特别是用于治疗或预防癌症，或
-特别是用作免疫调节剂，
-特别是用于治疗感染性疾病，
-更特别是用于预防、处理或治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲、乙、丙型肝炎病毒(分别为HAV、HBV、HCV)、流感病毒、呼吸合胞体病毒(RSV)、麻疹病毒、疱疹病毒和/或黄热病病毒。
根据本发明第二方面的替代性方案，提供了一种分离的HLA-A开放型构象异构体，其
-用作药物，
-特别是用于治疗或预防癌症，或
-特别是用作免疫调节剂，
-特别是用于治疗感染性疾病，
-更特别是用于预防、处理或治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲、乙、丙型肝炎病毒(分别为HAV、HBV、HCV)、流感病毒、呼吸合胞体病毒(RSV)、麻疹病毒、疱疹病毒和/或黄热病病毒。
根据本发明第二方面的另一替代性方案，提供了一种分离的HLA-B开放型构象异构体，条件是所述分离的HLA-B开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体，所述分离的HLA-B开放型构象异构体
-用作药物，
-特别是用于治疗或预防癌症，或
-特别是用作免疫调节剂，
-特别是用于治疗感染性疾病，
-更特别是用于预防、处理或治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲、乙、丙型肝炎病毒(分别为HAV、HBV、HCV)、流感病毒、呼吸合胞体病毒(RSV)、麻疹病毒、疱疹病毒和/或黄热病病毒。
根据本发明第二方面的又一替代性方案，提供了一种分离的HLA-C开放型构象异构体，其
-用作药物，
-特别是用于治疗或预防癌症，或
-特别是用作免疫调节剂，
-特别是用于治疗感染性疾病，
-更特别是用于预防、处理或治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲、乙、丙型肝炎病毒(分别为HAV、HBV、HCV)、流感病毒、呼吸合胞体病毒(RSV)、麻疹病毒、疱疹病毒和/或黄热病病毒。
作为免疫调节剂的功能对于治疗需要改变白细胞响应的疾病，例如传染病而言特别有用。可优选用本发明来治疗的传染病包括人免疫缺陷病毒(HIV)感染、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、呼吸合胞体病毒(RSV)感染、麻疹、疱疹和黄热病。
在本发明第二方面或本发明第二方面的任何上述替代性方案的某些实施方式中，癌症是结肠癌或胰腺癌。
本发明的第三方面涉及一种融合MHC-Ia开放型构象异构体，条件是所述融合MHC-Ia开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体。所述融合MHC-Ia开放型构象异构体包含第一HLA重链单体或第一和第二HLA重链单体，或基本上由其组成。这些HLA重链单体各自相互独立地包含HLA重链或基本上由HLA重链组成。所述融合MHC开放型构象异构体另外包含Fc多肽序列。在某些实施方式中，HLA单体序列位于所述融合MHC开放型构象异构体的N端，并且Fc构建体位于C端。在某些实施方式中，氨基酸连接物将HLA重链和Fc片段接合在一起。
所述融合MHC-Ia开放型构象异构体另外包含已知在体内使多肽在代谢上稳定化的多肽结构域。这种稳定化结构域的一个实例是免疫球蛋白的Fc(可结晶片段)结构域，特别是γ免疫球蛋白的Fc多肽结构域。可选地，HLA重链和该稳定化结构域可以通过氨基酸连接物接合在一起。下文中将包含HLA链和免疫球蛋白Fc片段的开放型构象异构体融合蛋白称为HLA-Fc开放型构象异构体或HLA2-Fc。
Fc结构域在该融合蛋白中的存在有利于增加溶解度、稳定性、亲合力、半衰期，并且从技术角度来看，在哺乳动物系统中有利于成本有效的生产和纯化(蛋白A或G纯化)。
根据本发明第三方面的替代性方案，提供了一种HLA-A开放型构象异构体，其中所述HLA-A开放型构象异构体包含第一单体或第一和第二单体，并且单体各自相互独立地包含HLA重链，所述HLA重链还包含Fc多肽序列和可选的氨基酸连接物，所述氨基酸连接物将HLA重链和Fc片段接合在一起。
根据本发明第三方面的另一替代性方案，提供了一种HLA-B开放型构象异构体，条件是所述HLA-B开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体，其中所述HLA-B开放型构象异构体包含第一单体或第一和第二单体，并且单体各自相互独立地包含HLA重链，所述HLA重链还包含Fc多肽序列和可选的氨基酸连接物，所述氨基酸连接物将HLA重链和Fc片段接合在一起。
根据本发明第三方面的又一替代性方案，提供了一种HLA-C开放型构象异构体，其中所述HLA-C开放型构象异构体包含第一单体或第一和第二单体，并且单体各自相互独立地包含HLA重链，所述HLA重链还包含Fc多肽序列和可选的氨基酸连接物，所述氨基酸连接物将HLA重链和Fc片段接合在一起。
根据本发明的替代方面，提供了用于治疗或预防癌症或用作免疫调节剂的MHC-Ia开放型构象异构体单体(即，未连接到第二HLA重链多肽并且未被β2-微球蛋白结合的HLA重链)，条件是所述MHC-Ia开放型构象异构体单体不是HLA-B27或HLA-B57开放型单体。在此方面的某些实施方式中，所述HMC-Ia单体还包含肽表位片段。
此方面可总结为以下各项：
第1项：一种源自MHC-Ia等位基因的分离的单HLA重链多肽单体，其基本上不含结合的β2-微球蛋白，其用作药物，特别是用于治疗或预防癌症，或用作免疫调节剂。
第2项：如第1项所述的源自MHC-Ia等位基因的分离的单HLA重链多肽单体，其用于治疗或预防癌症或用作免疫调节剂，其中，所述单体还包含肽表位片段。
第3项：如第1或2项所述的源自MHC-Ia等位基因的分离的单HLA重链多肽单体，其用于治疗或预防癌症或用作免疫调节剂，其中，所述HLA重链仅由HLAα1、α2和α3结构域组成。
第4项：如前述任一项所述的源自MHC-Ia等位基因的分离的单HLA重链多肽单体，其用于治疗或预防癌症或用作免疫调节剂，其中，所述HLA重链包含跨膜结构域并且不包含细胞内结构域(胞质尾)。
第5项：一种组合药物，其包含：
a.第1～4项中任一项所述的源自MHC-Ia等位基因的分离的单HLA重链多肽单体，和
b.检查点抑制剂，特别是检查点抑制性抗体，和/或检查点激动剂，特别是检查点激动剂抗体。
第6项：如第5项所述的组合药物，其中，所述检查点抑制剂选自CTLA4与CD80或CD86相互作用的抑制剂、以及PD-1与其配体PD-L1相互作用的抑制剂，特别是抗CTLA4、CD80、CD86、PD-1、PD-L1中的任一种的抗体，更特别是抗人CTLA4、PD-1或PD-L1的单克隆抗体；且/或其中，所述检查点激动剂选自针对4-1BB和/或4-1BBL(CD137L,Uniprot P41273)的激动剂抗体或配体。
在本发明上述替代方面的某些实施方式中，癌症是结肠癌或胰腺癌。
根据本发明的另一方面，提供一种MHC-Ia开放型构象异构体蛋白作为免疫调节剂，条件是所述MHC-Ia开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体。不希望受理论束缚，发明人认为，特别而言，其结合白细胞中存在的多种免疫调节受体和改变T细胞淋巴瘤细胞增殖的能力是特别有用的。此外，所述MHC-Ia开放型构象异构体作为调节性T细胞(Treg)的负调节剂的应用特别适合用于其中Treg损害保护性免疫的发展的人类疾病，例如癌症和传染病(von Boehmer等，同上)。
根据本发明该另一方面的替代性方案，提供了HLA-A开放型构象异构体作为免疫调节剂。
根据本发明该另一方面的另一替代性方案，提供了HLA-B开放型构象异构体作为免疫调节剂，条件是所述HLA-B开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体。
根据本发明该另一方面的又一替代性方案，提供了HLA-C开放型构象异构体作为免疫调节剂。
在所述本发明任一方面的某些实施方式中，HLA重链包含跨膜结构域并且不包含细胞内结构域(细胞质尾部)。
在本发明任一方面的某些实施方式中，分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体由两个独立地选自上述HLA等位基因的亚基组成。在某些实施方式中，同二聚体由两个相同的HLA等位基因组成。
在本发明任一方面的某些实施方式中，分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体包含两条相同的HLA多肽链。在某些实施方式中，分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体包含两条不同的HLA多肽链。
在本发明任一方面的某些实施方式中，分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体还包含肽表位片段。
在本发明任一方面的某些实施方式中，肽表位片段与HLA肽链的抗原呈递结构域内的多肽非共价连接。
在本发明任一方面的某些实施方式中，第一和/或第二单体还包含肽表位片段。
在本发明任一方面的某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体仅包含细胞外HLA-α1、HLA-α2和HLA-α3结构域。在这些实施方式中，在本发明的治疗用多肽中不包含HLA重链的跨膜结构域和细胞内结构域，从而允许其在重组细胞中的胞外表达。通过与注释的HLA序列进行逐对序列比对，本领域技术人员甚至可以在先前未知的HLA序列中容易地鉴定出相应的结构域。
在本发明任一方面的某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体包含Fc结构域。在某些具体的实施方式中，Fc结构域包含来自免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)的重链恒定区CH2和CH3。
在本发明任一方面的某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体包含将稳定化结构域(特别是Fc结构域)与HLA多肽接合在一起的氨基酸连接物。在某些具体的实施方式中，所述氨基酸连接物包含1～50个氨基酸，特别是5～40个氨基酸，更特别是10～30个氨基酸，甚至更特别是15～25个氨基酸，所述连接物将HLA重链与Fc结构域连接为一条单一多肽链。
在本发明任一方面的某些实施方式中，分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体作为肠胃外剂型提供，特别是用于注射的加糖剂型。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂或激动剂作为肠胃外剂型提供，特别是用于注射的加糖剂型。在某些实施方式中，MHC-Ia开放型构象异构体和免疫检查点抑制剂或激动剂以相同的施用形式存在。
在本发明第三方面的某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体用作药物。
在本发明第三方面的某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体用于治疗或预防癌症，特别是用于结肠癌或胰腺癌。
在本发明第三方面的某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体用作免疫调节剂，特别是用作调节性T细胞(Treg)的负调节剂。在某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体用于治疗传染病。在某些实施方式中，融合MHC-Ia开放型构象异构体用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、呼吸合胞体病毒(RSV)感染、麻疹、疱疹和黄热病。
根据本发明的第四方面，提供了用于治疗癌症或用于癌症疗法的或用作免疫调节剂(特别是在治疗传染病中)的编码本发明上述方面的MHC-Ia开放型构象异构体单体、特别是Fc开放型构象异构体单体的核酸分子。由所述核酸分子在体内表达所述开放型构象异构体，会在二聚化后产生本发明的融合蛋白多肽。在患者体内由编码药物活性多肽的核酸表达这些药物活性多肽的概念是众所周知的，并且可以赋予患者显著的益处。
根据本发明第四方面的替代性方案，提供了用于治疗癌症或用于癌症疗法的或用作免疫调节剂(特别是在治疗传染病中)的编码HLA-A开放型构象异构体单体的核酸分子。
根据本发明第四方面的另一替代性方案，提供了用于治疗癌症或用于癌症疗法的或用作免疫调节剂(特别是在治疗传染病中)的编码HLA-B开放型构象异构体单体的核酸分子，条件是所述HLA-B开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体。
根据本发明第四方面的又一替代性方案，提供了用于治疗癌症或用于癌症疗法的或用作免疫调节剂(特别是在治疗传染病中)的编码HLA-C开放型构象异构体单体的核酸分子。
在本发明第四方面或其上述任意替代性方案的某些实施方式中，癌症是结肠癌或胰腺癌。
在某些实施方式中，所述核酸分子编码包含肽表位片段的MHC-Ia开放型构象异构体单体、特别是Fc开放型构象异构体单体。在某些实施方式中，所述核酸分子编码仅包含细胞外HLA α1、α2和α3结构域的MHC-Ia开放型构象异构体单体、特别是Fc开放型构象异构体单体。在某些实施方式中，所述核酸分子编码仅包含细胞外HLA α1、α2和α3结构域和肽表位片段的HLA开放型构象异构体单体、特别是Fc开放型构象异构体单体。
在某些实施方式中，所述核酸分子编码包含氨基酸连接物和/或Fc(可结晶片段)结构域的MHC-Ia开放型构象异构体单体、特别是Fc开放型构象异构体单体，并且用于治疗癌症或用于癌症疗法中，特别是结肠癌或胰腺癌。
根据本发明的替代方面，提供了用于治疗癌症或用于癌症疗法中(特别是结肠癌或胰腺癌)的包含本发明第四方面(及其替代方面)的核酸分子的重组表达载体。
在某些实施方式中，所述重组表达载体是包含在哺乳动物细胞中(特别是在人细胞中)可操纵的启动子的质粒。启动子可操纵地连接到本发明的核酸分子。
根据本发明的第五方面，提供了用于治疗癌症或用于癌症疗法(特别是结肠癌或胰腺癌)或用作免疫调节剂(特别是用于治疗传染病)的包含本发明第四方面(及其替代方面)的核酸分子的病毒。核酸分子处在在哺乳动物细胞中(特别是在人细胞中)的可操纵的启动子序列的控制下。在某些实施方式中，病毒是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒。
根据本发明的第六方面，提供了包含本发明第四方面(及其替代方面)的核酸分子的经体外遗传修饰的宿主细胞。
本发明的另一方面提供了本发明第一和第二方面(及其替代性方案)的分离的MHC-Ia开放型构象异构体同二聚体或MHC-Ia开放型构象异构体同二聚体在制造用于治疗或预防癌症(特别是结肠癌或胰腺癌)的药物中的应用。
根据又一方面，本发明提供了一种治疗癌症(特别是结肠癌或胰腺癌)的方法，其包括对有需要的患者施用本发明第一和第二方面(及其替代方面)的MHC-Ia开放型构象异构体。
根据本发明的第七方面，提供了一种组合药物，其中，所述组合药物包含：
-本发明上述任一方面或实施方式所述的分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体，
和
-免疫检查点调节剂，其选自：
○免疫检查点抑制剂(CPI)，其选自：
●细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4；也称为CD152)与B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)相互作用的抑制剂，特别是CTLA-4或cd80或cd86的多肽配体，例如抗体，
●程序性细胞死亡蛋白1(PD-1；也称为CD279)与其配体PD-L1(也称为CD274；UniProt ID:Q9NZQ7)和/或PD-L2(也称作CD273；Uni Prot ID:Q9BQ51)相互作用的抑制剂，特别是PD-1或PD-L1或PD-L2的多肽配体，例如抗体，和
●T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子3(TIM-3)的抑制性多肽配体，特别是抗体，
和
○检查点激动剂，特别是检查点激动剂抗体，其被选择为结合并激活肿瘤坏死因子受体4-1BB(也称为CD137或TNFRSF9)。
根据本发明第七方面的替代性方案，包含在组合药物内的分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体选自HLA-A开放型构象异构体、HLA-B开放型构象异构体(条件是所述HLA-B开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体)或HLA-C开放型构象异构体。
在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是CTLA4与CD80或CD86相互作用的抑制剂。
在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是易普利姆单抗(ipilimumab)(Yervoy；CAS No.477202-00-9)。
在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)与其受体PD-L1相互作用的抑制剂。在某些实施方式中，免疫检查点抑制剂选自临床可用的抗体药物纳武单抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb；CAS No 946414-94-4)、派姆单抗(pembrolizumab)(Merck Inc.；CAS No.1374853-91-4)，匹迪丽珠单抗(pidilizumab)(CASNo.1036730-42-3)、阿特朱单抗(atezolizumab)(Roche AG；CAS No.1380723-44-3)和阿维鲁单抗(Avelumab)(Merck KGaA；CAS No.1537032-82-8)。
在某些实施方式中，免疫检查点激动剂是尤托米鲁单抗(utomilumab)(PF-05082566)，一种针对4-1BB的全人IgG2单克隆抗体，目前正在进行临床试验。
在某些实施方式中，检查点调节剂是选自抗体、抗体片段和抗体样分子的多肽，并且该多肽选择性地与检查点介体(mediator)反应。在某些实施方式中，检查点介体选自CTLA4、PD-1、CD80、CD86、PD-L1和PD-L2、TIM-3、4-1BB和4-1BBL。
在另一方面，本发明涉及产生重组HLA重链多肽的方法。该方法总结为以下各项：
项A：利用重组生物技术方法产生人HLA重链多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.表达步骤：在哺乳动物细胞(“生产细胞系”)中共表达：
i.至少编码HLA重链的α1链、α2链和α3链的HLA编码核酸序列，其处在在细胞(特别是真核细胞，更特别是哺乳动物细胞)中可操纵的启动子序列的控制下，和
ii.编码人HLA β2微球蛋白(UniProt P61769)的β2-微球蛋白编码核酸序列，其处在在所述细胞(与a.i中相同的细胞)中可操纵的启动子序列的控制下；
b.纯化步骤：从哺乳动物细胞(生产细胞系)中纯化所得的HLA重链/β2-微球蛋白复合体；
c.解离步骤：在合适的条件下解离所纯化的HLA重链/β2-微球蛋白复合体，并且将HLA重链多肽与β2-微球蛋白多肽分离；
d.重折叠步骤：在导致(在具有生理活性的HLA开放型构象异构体分子中见到的其天然三级蛋白结构的)重折叠的条件下，温育分离的HLA重链多肽。
项AA：项A，条件是所述人HLA重链多肽既不是B27重链也不是B57重链。
项B：如项A或项AA所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，所述HLA编码核酸序列从所编码的多肽的N末端到C末端包含α1链、α2链、α3链和稳定化序列。
项C：如项B所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，稳定化序列选自牛血清白蛋白和免疫球蛋白恒定片段(Fc)，特别是免疫球蛋白G恒定片段，更特别是IgG4 Fc。
项D：如前述任一项所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，所述HLA编码核酸序列和β2-微球蛋白编码核酸序列存在于相同的核酸载体分子(特别是DNA表达质粒)上。
项E：如前述A～C中任一项所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，所述HLA编码核酸序列和β2-微球蛋白编码核酸序列存在于不同的核酸载体分子(特别是不同的DNA表达质粒)上。
项F：如项E所述的方法，其中，相对于包含β2-微球蛋白编码核酸序列的核酸载体，包含HLA编码核酸序列的核酸载体以约1倍至5倍过量、特别是1.5倍至5倍过量、特别是约3倍过量而存在。
项G：如前述任一项所述的方法，其中，所述HLA编码核酸序列包含免疫球蛋白Fc片段作为稳定化序列，且纯化步骤通过将重组HLA重链多肽吸附到与蛋白A连接的表面上而实现。
项H：如前述任一项所述的方法，其中，解离步骤通过在酸性条件下、特别是在约pH2的条件下进行处理并在还原条件下进行透析而实现。
项I：如前述任一项所述的方法，其中，重折叠步骤通过在中性条件下进行处理而实现。
更具体地涉及本文所述的MHC-Ia开放型构象异构体时，所述方法可以总结为以下各项：
项A'：利用重组生物技术方法产生人HLA重链多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.表达步骤：在哺乳动物细胞(“生产细胞系”)中共表达：
i.至少编码HLA重链的α1链、α2链和α3链的HLA重链编码核酸序列，其处在在细胞(特别是真核细胞，更特别是哺乳动物细胞)中可操纵的启动子序列的控制下，和
ii.编码人HLA β2微球蛋白(UniProt P61769)的β2-微球蛋白编码核酸序列，其处在在所述细胞(与a.i中相同的细胞)中可操纵的启动子序列的控制下；
b.纯化步骤：从哺乳动物细胞(生产细胞系)中纯化所得的HLA重链/β2-微球蛋白复合体；
c.解离步骤：在合适的条件下解离所纯化的HLA重链/β2-微球蛋白复合体，并且将HLA重链多肽与β2-微球蛋白多肽分离；
d.重折叠步骤：在导致(在具有生理活性的HLA开放型构象异构体分子中见到的其天然三级蛋白结构的)重折叠的条件下，温育分离的HLA重链多肽。
项AA'：项A'，条件是所述人HLA重链多肽既不是B27重链也不是B57重链。
项B'：如项A'或项AA'所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，所述HLA编码核酸序列从所编码的多肽的N末端到C末端包含α1链、α2链、α3链和稳定化序列。
项C'：如项B'所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，稳定化序列选自牛血清白蛋白和免疫球蛋白恒定片段(Fc)，特别是免疫球蛋白G恒定片段，更特别是IgG4Fc。
项D'：如前述任一项所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，所述HLA编码核酸序列和β2-微球蛋白编码核酸序列存在于相同的核酸载体分子(特别是DNA表达质粒)上。
项E'：如前述A'～C'中任一项所述的产生人HLA重链多肽的方法，其中，所述HLA编码核酸序列和β2-微球蛋白编码核酸序列存在于不同的核酸载体分子(特别是不同的DNA表达质粒)上。
项F'：如项E'所述的方法，其中，相对于包含β2-微球蛋白编码核酸序列的核酸载体，包含HLA编码核酸序列的核酸载体以约1倍至5倍过量、特别是1.5倍至5倍过量、特别是约3倍过量而存在。
项G'：如前述任一项所述的方法，其中，所述HLA编码核酸序列包含免疫球蛋白Fc片段作为稳定化序列，且纯化步骤通过将重组HLA重链多肽吸附到与蛋白A连接的表面上而实现。
项H'：如前述任一项所述的方法，其中，解离步骤通过在酸性条件下、特别是在约pH 2的条件下进行处理并在还原条件下进行透析而实现。
项I'：如前述任一项所述的方法，其中，重折叠步骤通过在中性条件下进行处理而实现。
在本文的任何位置将例如等位基因或编码序列等单个可分离特征的替代方式作为“实施方式”列出时，应当理解的是，这些替代方式可以自由组合，以形成本文公开的发明的离散实施方式。
本发明通过以下实施例和附图进一步说明，从中可以得出其他实施方式和优点。这些实施例意在说明本发明，但不限制本发明的范围。
附图说明
图1显示了MHC I类分子的命名。
图2显示了HLA异三聚体和HLA开放型构象异构体(游离重链)的示意图。两种形式都可以存在于抗原呈递细胞(APC细胞)的细胞表面。本发明人提出开放型构象异构体与免疫调节受体(KIR、LIL、PTPRJ等)的相互作用在亲和力方面是不同的，因此被修饰以诱导有利于抗肿瘤免疫力的免疫应答。
图3显示了HLA-Fc和β2m DNA盒的示意图，以及HLA-β2m-Fc分子在CHO细胞中的表达。A)插入人IgG4-Fc载体盒中的MHC-Ia重链(HLA重链)的α1、2和3结构域；和插入单独的载体盒中的人β2微球蛋白。B)中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的转染使用1:1比例的HLA-Fc载体+β2m载体进行，以用于细胞外产生HLA-β2m-Fc蛋白。收集上清液并使用标准抗体纯化方案纯化HLA-β2m-Fc。从HLA-β2m-Fc复合物中除去β2m，然后将HLA-Fc单体重折叠而形成HLA2-Fc同二聚体。
图4显示了从HLA-β2m-Fc复合物中分离出β2m并通过SEC对HLA2-Fc进行纯化和重折叠。A)尿素-Tris-BME变性缓冲液中的HLA-β2m-Fc分子的色谱图显示出使用SephacrylS-100HR柱通过SEC使HLA-Fc-游离重链与β2m解离。B)和C)：考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示出在SEC之前和之后β2m的存在。B)显示了在SEC中分离之前的HLA-B2m-Fc分子，C)显示了在SEC之后回收并重折叠的HLA2-Fc分子。
图5显示了通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测得的HLA2-Fc(A252-Fc、A302-Fc、B272-Fc、B532-Fc、B572-Fc、B582-Fc、C082-Fc和C122-Fc)与白细胞群的不同的免疫调节受体的相互作用。A)hu KIR3DL1、B)hu KIR3DL2和C)hu KIR3DL3在NK细胞和T细胞亚群中表达。D)LILRB1和E)LILRB2主要在骨髓细胞中表达，F)PirB(LILRB的鼠同源物)和G)PTPRJ(在白细胞上优先在MDSC细胞和活化的T细胞中表达)。
图6显示了HLA2-Fc分子(A252-Fc、A302-Fc、B272-Fc、B532-Fc、B572-Fc、B582-Fc、C082-Fc和C122-Fc)总是阻断小鼠CD4+T细胞转化为iTreg。HLA2-Fc以剂量依赖性方式与初始CD4+T细胞温育，阻断了向iTreg的转化。A-B)HLA2-Fc分子阻断FoxP3(Treg的分化标志物)在iTreg分化的最佳培养条件下的表达(10μg/mL)。对照HLA-β2m-Fc分子、同种型、补充有TGFβ和IL-2的培养基和不含补充剂的培养基证明了HLA2-Fc对iTreg转化的特异性影响。
图7显示了HLA2-Fc(A252-Fc、A302-Fc、B272-Fc、B532-Fc、B572-Fc、B582-Fc、C082-Fc和C122-Fc)抑制淋巴瘤T细胞。A-E)抑制测定以确定在HLA2-Fc分子或对照HLA-β2m-Fc分子存在下的细胞增殖。HLA2-Fc以剂量依赖性方式(μg/200μL)抑制人(Jurkat)和小鼠(EG.7)淋巴瘤细胞系，评估了其他细胞系，例如Daudi B细胞淋巴瘤、SK-N-AS神经母细胞瘤和L540人霍奇金淋巴瘤，但在最佳培养条件下未观察到来自HLA2-Fc分子的抑制作用。还测试了其他细胞系，例如L428人霍奇金淋巴瘤、L1236人霍奇金淋巴瘤、IMR-5神经母细胞瘤和M130428黑色素瘤，但没有观察到抑制。
图8显示出作为单一疗法或与PD-1抗体组合的HLA2-Fc(A302-Fc、B582-Fc和C082-Fc)能够减小C38鼠同基因(syngeneic)结肠癌模型中的肿瘤尺寸。A)结肠癌细胞(C38)的注射时间点和化合物注射的实验设计。B)A302-Fc治疗组的平均肿瘤体积mm3(n＝5)。C)B582-Fc治疗组的平均肿瘤体积mm3(n＝5)。D)C082-Fc治疗组的平均肿瘤体积mm3(n＝5)。细胞注射时间点和物质注射的实验设计如下：载剂PBS Q3Dx6，同种型(10mg/Kg)Q3Dx6；HLA2-Fc(10mg/Kg)Q3Dx6；PD-1biwk×2(200μg)；和HLA2-Fc+PD-1(分别为Q3D×6和biwk×2)。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析，*p<0.05，**p<0.01，n.s.＝不显著。Q＝注射之间的天数；Dx＝注射次数；biwk＝每周两次。
图9显示出HLA2-Fc(B272-Fc和B572-Fc)与CTLA4或PD-1抗体的组合减少了MC38-OVA或C38鼠同基因结肠癌模型中的肿瘤尺寸。A)B272-Fc治疗组的平均肿瘤体积mm3(n＝6)。B)B572-Fc治疗组的平均肿瘤体积mm3(n＝6)。细胞注射时间点和物质注射的实验设计如下：载剂PBS Q3Dx6，同种型(10mg/Kg)Q3Dx6；HLA2-Fc(10mg/Kg)Q3Dx6；CTLA-4Q3Dx2(d1＝100μg；d4＝50μg)，PD-1biwk×2(200μg)；HLA2-Fc+CTLA-4(分别为Q3Dx6和Q3Dx2)和HLA2-Fc+PD-1(分别为Q3Dx6和biwk×2)。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析，**p<0.01，***p<0.001，n.s.＝不显著。Q＝注射之间的天数；Dx＝注射次数；biwk＝每周两次。
图10显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对A252-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)A252-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；A252-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；A252-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和A252-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析，*p<0.05。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图11显示了用流式细胞术获得的具有用A252-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(immune contexture)(图10中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图12显示了用流式细胞术获得的具有用A252-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图10中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图13显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对A302-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)A302-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；A302-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；A302-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和A302-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图14显示了用流式细胞术获得的具有用A302-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(图13中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图15显示了用流式细胞术获得的具有用A302-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的经治疗的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图13中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图16显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对B272-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)B272-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；B272-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；B272-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和B272-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图17显示了用流式细胞术获得的具有用B272-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(图16中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图18显示了用流式细胞术获得的具有用B272-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的经治疗的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图16中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图19显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对B532-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)B532-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；B532-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；B532-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和B532-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图20显示了用流式细胞术获得的具有用B532-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(图19中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图21显示了用流式细胞术获得的具有用B532-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的经治疗的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图19中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图22显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对B572-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)B572-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；B572-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；B572-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和B572-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图23显示了用流式细胞术获得的具有用B572-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(图22中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图24显示了用流式细胞术获得的具有用B572-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的经治疗的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图22中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图25显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对B582-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)B582-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；B582-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；B582-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和B582-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图26显示了用流式细胞术获得的具有用B582-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(图25中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图27显示了用流式细胞术获得的具有用B582-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的经治疗的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图25中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图28显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对C082-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)C082-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；C082-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；C082-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和C082-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图29显示了用流式细胞术获得的具有用C082-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(图28中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图30显示了用流式细胞术获得的具有用C082-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的经治疗的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图28中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图31显示了在胰腺Pan02同基因小鼠模型的大肿瘤中对C122-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体组合的体内研究。A)C122-Fc治疗的动物的平均肿瘤体积(mm3)(n＝6)。B)与对照相比，经治疗的小鼠组的％Δ肿瘤抑制率。物质注射时间点的实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；C122-Fc(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB抗体(1mg/Kg)biwk×2注射；C122-Fc+4-1BB(分别为5mg/Kg和1mg/Kg)biwk×2；PD-1抗体(5mg/Kg)biwk×2；和C122-Fc+PD-1(各5mg/Kg)biwk×2。肿瘤体积表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA分析，然后进行Bonferroni事后分析。Δ肿瘤抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长之比来计算，其表示与同种型相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％。biwk＝每周两次。
图32显示了用流式细胞术获得的具有用C122-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的Pan02胰腺癌小鼠的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分析的免疫布局(图31中的实验的继续)。浸润肿瘤的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)粒细胞，巨噬细胞，巨噬细胞M1型，巨噬细胞M2型，和髓源性抑制细胞(MDSC)。C)M1/M2巨噬细胞比，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
图33显示了用流式细胞术获得的具有用C122-Fc、4-1BB和PD-1治疗的大肿瘤的经治疗的Pan02胰腺癌小鼠的血液白细胞分析的免疫布局(图31中的实验的继续)。存在于血液中的所分析的相关白细胞：A)CD3+ T细胞，CD4+ T细胞，调节性T细胞(Treg)，CD8+ T细胞，和CD8+/Treg比。B)Th1细胞(CD4+ T细胞IFNγ+)，自然杀伤细胞(NK)，和自然杀伤T细胞(NKT)。C)单核细胞，粒样髓源性抑制细胞(G-MDSC)，和单核样髓源性抑制细胞(M-MDSC)。将白细胞％表示为显示样品最大值和最小值的箱形图，并且每组用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnet事后分析，*p<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
实施例
本发明人惊奇地发现，MHC-Ia开放型构象异构体与存在于NK细胞、NKT细胞、T细胞、巨噬细胞和MDSC细胞中的多种免疫调节细胞表面受体相互作用，并且具有独特的结合或与其对照MHC-Ia异三聚体相比更强的亲和力。HLA I-a类开放型构象异构体可用作靶向其中血液白细胞损害保护性免疫的发展的疾病的治疗剂，如在癌症和传染病的情况中那样。
另外，发明人发现了作为单一疗法的HLA2-Fc注射或HLA2-Fc注射与使用检查点调节剂的组合方法的新的体内作用模式。单一或组合疗法中的HLA2-Fc疗法可以调节多种白细胞群向肿瘤中的浸润，这通过巨噬细胞M1/M2比的浸润增加、增加的NK细胞、NKT细胞、CD3+ T细胞和CD8+ T细胞以及减少的MDSC来确定。
此外，发明人观察到，通过系统性血液分析，HLA2-Fc疗法增加NKT细胞和在一些情况下Th1细胞的扩增，表明存在可用于在临床前和临床环境中实现治疗功效的生物标志物。令人感兴趣的是，发明人还观察到4-1BB单一疗法系统性地增加了动物血液中的CD3+、CD4+、CD8+ T细胞和Treg的扩增，表明免疫系统被4-1BB过度激活的潜在副作用。HLA2-Fc+4-1BB的多种组合显著减少了血液CD3+、CD4+、Treg和CD8+ T细胞的存在，表明在用激动性抗体治疗的患者的血液上有不想要的淋巴细胞扩增的情况下的正面组合方法。
总体而言，MHC-Ia开放型构象异构体(特别是在作为包含Fc免疫球蛋白片段的融合蛋白存在时)的作用模式，不论是单独存在还是与拮抗性/激动性抗体组合，无疑是与作为免疫调节剂相关的，并且可用于其在癌症治疗中的转化。
HLA开放型构象异构体可用作靶向以免疫调节作为治疗方法的疾病的治疗剂，如在癌症和传染病的情况中那样。
体外测试
MHC-Ia开放型构象异构体与在多种类型的白细胞中表达的免疫调节受体结合，具有独特的结合或不同于其HLA-β2m-Fc对照对应物的亲和力。
发明人通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定了MHC-Ia开放型构象异构体是否与特定的免疫调节受体相互作用。结果表明，MHC-Ia开放型构象异构体与KIR3DL2和PTPRJ(HLA-C-β2m-Fc除外)独特地相互作用，并且其表现出的对KIR3DL1、KIR3DL3、LILRB1、LILRB2和Pirb免疫调节受体的亲和力与其HLA-β2m-Fc对照对应物不同(图5A-G)。该数据首次显示MHC经典等位基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)(MHC-Ia)当作为开放型构象异构体存在时具有相似的免疫调节受体结合模式。
MHC-Ia开放型构象异构体阻断鼠CD4+T细胞向iTreg的转化
用10μg/mL的HLA2-Fc(A252-Fc，A302-Fc，B272-Fc，B532-Fc，B572-Fc，B582-Fc，C082-Fc和C122-Fc)、HLA-β2m对照(A25-β2m-Fc，A30-β2m-Fc，B27-β2m-Fc，B53-β2m-Fc，B57-β2m-Fc，B58-β2m-Fc，C08-β2m-Fc和C12-β2m-Fc)、同种型和PBS在iTreg转化的最佳培养条件下与初始CD4+T细胞一起温育，由此分析了MHC-Ia分子对初始CD4+T细胞在iTreg转化方面的影响。证明了MHC-Ia开放型构象异构体总是下调FoxP3的诱导(图6)，并因此下调初始CD4+T细胞向iTreg的转化。
MHC-Ia开放型构象异构体破坏了白血病T细胞的增殖。
发明人确定了MHC-Ia开放型构象异构体(A252-Fc，A302-Fc，B272-Fc，B532-Fc，B572-Fc，B582-Fc，C082-Fc和C122-Fc)在不同的肿瘤细胞系中阻断增殖的效果。结果证明，当与其对照对应物HLA-β2m-Fc(图7)或同种型IgG4(未提供数据)相比时，MHC-Ia开放型构象异构体总是调节淋巴瘤T细胞系的增殖，表明其作为靶向疗法治疗淋巴瘤的潜在应用。
体内试验
使用经验证的临床前同基因鼠C38和MC38-OVA结肠癌模型(图8和9)以及胰腺(Pan02)癌小鼠模型(图10、13、16、19、22、25、28和31)展示了MHC-Ia开放型构象异构体作为用于癌症疗法中的免疫调节治疗分子这一概念的体内证据。
在CHO细胞中产生作为人Fc融合蛋白的MHC-Ia开放型构象异构体
从治疗的角度来说，有效的策略是以稳定的形式(Fc融合)产生MHC-Ia开放型构象异构体分子，以增加溶解性、稳定性、亲合力、半衰期，并且从技术角度来说，在哺乳动物系统中进行成本有效的生产和纯化。与HLA-β2m-Fc蛋白的细胞外产生所必需的人β2m载体一起，将HLA-A25、HLA-A30、HLA-B27、HLA-B53、HLA-B57、HLA-B58、HLA-C08和HLA-C12的α1、α2和α3结构域插入到人IgG4-Fc载体盒(图3A)中，成功地产生了HLA-β2m-Fc复合体(图3A，B)。以1:1的比例使用HLA-Fc-载体+β2m载体在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行转染。收集上清液，并且使用标准抗体纯化方案(Recombinant Protein Purification Handbook,principles and methods.2009.GE Healthcare,18-1142-75)纯化HLA-β2m-Fc。通过SEC(图4A)或透析(数据未示出)使用变性条件进行β2m与HLA-Fc游离重链的分离。在重折叠缓冲液中使用稀释法评估HLA2-Fc的重折叠，并通过SDS PAGE(图4B，C)或蛋白质印迹(数据未示出)进行分析。
在鼠同基因结肠癌模型中对HLA2-Fc与CTLA4抗体和PD-1抗体进行临床前联合疗法试验
在C38和MC38-OVA鼠结肠癌模型中展示了使用HLA2-Fc(A302-Fc，B272-Fc，B572-Fc，B582-Fc和C082-Fc)作为单一疗法或与鼠CTLA4或鼠PD-1抗体组合时的免疫调节治疗分子的概念研究的体内证据。
按照已建立的方案，将C38或MC38-OVA片段肿瘤皮下注射到同基因小鼠的胁腹中。一旦肿瘤达到60mm3(肿瘤移植后1-2周)，根据其肿瘤体积对小鼠进行分配。腹膜内注射A302-Fc、B272-Fc、B572-Fc、B582-Fc和C082-Fc，每3天六次(Q3Dx6)；CTLA4注射两次(Q3Dx2)；PD-1注射4次，每周2次(biwk×2)(图8A)。
选定的HLA2-Fc作为单一疗法(C082-Fc)(图8D)或与检查点抗体组合(例如PD-1+A302-Fc(图8B)，B582-Fc(图8C)，B572-Fc(图9B)和CTLA4+B272-Fc(图9A))，能够在同基因C38和MC38-OVA结肠癌小鼠模型中协同并增强抗肿瘤响应(图8和9)。
在鼠同基因胰腺癌模型的大肿瘤中对HLA2-Fc与PD-1抗体和4-1BB抗体进行临床前联合疗法试验
对于胰腺(Pan02)癌小鼠模型，按照已建立的方案，分别将Pan02细胞以1x105注射到同基因小鼠的右胁腹中。一旦肿瘤达到300mm3(注射细胞后约3周)，根据其肿瘤体积对小鼠进行统计学分配。注意大肿瘤比较小肿瘤更难治疗，但可用于进一步分析肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，大肿瘤更接近其中在患者的大尺寸肿瘤中进行免疫调节剂干预的临床环境。
在胰腺(Pan02)中，数据证明HLA2-Fc与PD-1抗体的组合在组合A252-Fc(图10A-B)、B272-Fc(图16A-B)、C082-Fc(图28A-B)和C122-Fc(图31A-B)时能够显著减小大Pan02肿瘤，而PD-1单一疗法未显示出治疗效果。其他的HLA2-Fc与PD-1的组合未显示出统计学显著性，但是在组合B572-Fc中观察到％Δ肿瘤抑制(图22)。另外，与同种型相比，证明了HLA2-Fc与4-1BB抗体的组合疗法或几种HLA2-Fc组合疗法(A302-Fc和C082-Fc除外)显著减小了肿瘤尺寸。在用B532-Fc(图19A-B)、B572-Fc(图22A-B)和B582-Fc(图25A-B)时观察到最显著的肿瘤减小(p<0.01)。与同种型对照相比，4-1BB单一疗法没有显著差异。与同种型相比，C082-Fc单一疗法(图28A-B)显示出显著的肿瘤减小(p<0.01)。
胰腺(Pan02)小鼠的肿瘤免疫布局证实了HLA2-Fc疗法对多种肿瘤浸润性白细胞的影响，如用巨噬细胞M1/M2比、增加的NK细胞、NKT细胞、CD3+ T细胞和CD8+T细胞以及减少的MDSC的浸润所观察到的，且每种HLA2-Fc的情况有所不同，如在A252-Fc(图11A-C)、A302-Fc(14A-C)、B272-Fc(17A-C)、B532-Fc(20A-C)、B572-Fc(23A-C)、B582-Fc(26A-C)、C082-Fc(29A-C)和C122-Fc(32A-C)中观察到的。与NKT细胞中和一些情况下的Th1细胞中的其对照单一疗法对应物相比，对血液白细胞的系统性分析仅显示出很少的变化，见A252-Fc(图12A-C)、A302-Fc(15A-C)、B272-Fc(18A-C)、B532-Fc(21A-C)、B572-Fc(24A-C)、B582-Fc(27A-C)、C082-Fc(30A-C)和C122-Fc(33A-C)。
结论
本发明首次证明了，当作为没有β2m的重链(HLA-A、HLA-B和HLA-C开放型构象异构体及其相应的HLA2-Fc融合蛋白)产生时，经典MHC-Ia分子家族具有与它们的对照HLA-β2m对应物不同的免疫调节性质。使用多组HLA等位基因作为非限制性实例，本发明人提供的数据表明，当作为开放型构象异构体存在时，MHC-Ia分子是总是具有独特性质的免疫调节剂，这由对存在于肿瘤微环境和血液中的白细胞的调节作用证明。此外，其用途不仅限于调节剂，而且还用作治疗癌症的治疗剂，如作为单一疗法或与检查点抑制剂抗体(例如CTLA4和PD-1)和检查点激动性抗体(例如4-1BB)的联合疗法在结肠癌和胰腺癌的临床前癌症小鼠模型中所证明的。
HLA2-Fc与分布在多种白细胞(例如NK、NKT、CD4+ T细胞、巨噬细胞和MDSC)中的多种免疫调节受体(KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB1、LILRB2、PTPRJ和Pirb)的相互作用表明，这些分子的多重任务特性开辟了用HLA开放型构象异构体调节免疫系统的新途径。
另外，HLA2-Fc分子经证明能够在体外阻断初始CD4+ T细胞向iTreg的转化，这指明了一种作用模式，其中HLA2-Fc充当影响iTreg的分化和功能的免疫调节分子。靶向iTreg是针对多种治疗适应证(例如传染病和癌症)的策略。
总体而言，HLA2-Fc作为与拮抗/激动剂抗体的组合方法的作用模式无疑在癌症治疗中是相关的，并且与癌症免疫疗法中当前的临床需求相关。
HLA2-Fc分子作为一类新的免疫调节药物而出现。体外和体内数据指向如下机制：其中HLA2-Fc分子充当激活抗肿瘤免疫力的开通机制。不希望受理论束缚，发明人假设HLA2-Fc开放型构象异构体与在NK细胞、T细胞、巨噬细胞和MDSC中存在的多种免疫调节受体的相互作用以及Treg的功能调节协同地参与并加剧免疫应答。
材料和方法
细胞系
使用C38和MC38-OVA结肠癌小鼠细胞系进行体内实验。
所使用的体外实验细胞系为：EL4，小鼠T细胞淋巴瘤；EG.7，小鼠T细胞淋巴瘤；Jurkat，人T细胞淋巴瘤；L428，人霍奇金淋巴瘤；L540，人霍奇金淋巴瘤；L1236，人霍奇金淋巴瘤；Daudi，B细胞淋巴瘤；IMR-5，神经母细胞瘤；SK-N-AS，神经母细胞瘤；和M130428，黑色素瘤。
抗体
将用于iTreg转化实验的淋巴细胞群用以下染色：CD4(FITC-BD Bioscience)，FoxP3+(efluor 450-eBioscience)，CD3(PE-Cy7-eBioscience)，CD45(PerCP-eBioscience)。
用以下抗体分析肿瘤浸润淋巴细胞：CD45(Biolegend，克隆30-F11)；CD3(BDBioscience，克隆145-2C11)；CD4(Biolegend，克隆GK1.5)；CD8(BD Bioscience，克隆53-6.7)；CD25(Biolegend，克隆PC61)；FoxP3(eBioscience，克隆FJK-16s)；CD335(Biolegend，克隆29A1.4)；F4/80(Biolegend，克隆BM8)；CD11b(Biolegend，克隆M1/70)；Gr-1(BDBioscience，克隆RB6-8C5)；MHCIII-A/I-E(BD Bioscience，克隆2G9)；CD206(Biolegend，克隆C068C2)和L/D染色剂(eBioscience)。
用以下抗体分析血液白细胞：CD45(Biolegend，克隆30-F11)；CD3(BDBioscience，克隆145-2C11)；CD4(Biolegend，克隆GK1.5)；CD8(BD Bioscience，克隆53-6.7)；FoxP3(eBioscience，克隆FJK-16s)；T-Bet(BD Bioscience，克隆4B10)；CD335(Biolegend，克隆29A1.4)；F4/80(Biolegend，克隆BM8)；CD115(Biolegend，克隆AFS98)；CD11b(Biolegend，克隆M1/70)；Ly6G(Biolegend，克隆1A8)；Ly6C(Biolegend，克隆HK1.4)和L/D染色剂(eBioscience)。
检查点抑制剂抗体CTLA4克隆9H10、PD-1克隆RMP1-14和激动剂抗体4-1BB克隆3H3获自Bio X Cell Co.。
与MHC-Ia等位基因的无β2m重链结合的HC10mAb(IgG2a)由Hidde Ploegh博士(MIT，MA)馈赠。
HLA2-Fc的产生、纯化和重折叠
通过将HLA的α1、α2和α3结构域插入人IgG4-Fc载体(InvivoGen)中，并利用单独的载体中的人β2-微球蛋白(β2m)，实现了HLA-β2m-Fc(A25-β2m-Fc、A30-β2m-Fc、B2705-β2m-Fc、B53-β2m-Fc、B57-β2m-Fc、B58-β2m-Fc、C08-β2m-Fc和C12-β2m-Fc)的重组产生。通过将HLA-Fc载体和β2m载体共转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中来进行重组HLA-β2m-Fc的产生。HLA-β2m-Fc的产生外包给Evitria AG。
使用常规的抗体纯化方案进行HLA-β2m-Fc构建体的纯化。添加变性步骤从HLA-β2m-Fc复合体中除去β2m，来进行HLA2-Fc的产生。
简言之，在使上清液流过(5mL/min)蛋白G柱(Amersham Pharmacia)后，进行HLA-β2m-Fc蛋白的捕获步骤。通过使用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸，pH2.0)从蛋白G柱中洗脱出选定的HLA-β2m-Fc，并在8M尿素、100mM Tris-HCl pH 8.0中回收级分，进行中间纯化步骤。第一精制步骤：通过使用具有系统(GE Lifescience)的superdex 200制备级或Sephacryl S-100HR(GE Lifescience)尺寸排阻色谱(SEC)，或者通过用50KDa孔径的膜(Millipore)进行透析，将HLA-Fc单体级分与β2m分离。对HLA-Fc单体进行间隔8小时的3次脉冲，每次在100倍体积的重折叠缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.5、500mM L-精氨酸、1mMEDTA、0.15mM NaCl、1％蔗糖、0.01％Tween-80)中进行，之后，通过稀释法使从两种方案回收的HLA-Fc单体重折叠。通过SEC进行第二精制步骤以进一步除去杂质，并将新回收的HLA2-Fc蛋白级分的缓冲液交换成稀释缓冲液(PBS、1％蔗糖、0.01％Tween-20)。使用0.2μm膜(Millipore)对纯化的HLA2-Fc蛋白(A252-Fc、A252-Fc、B27052-Fc、B532-Fc、B572-Fc、B582-Fc、C082-F、C122-Fc)的溶液进行过滤灭菌。
通过梯度为4-20％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和使用HC10(对HLA游离重链有特异性)抗体的蛋白质印迹来分析HLA-β2m-Fc复合体和HLA2-Fc的级分。使用和不使用变性条件(10mM DTT)进行β2m的蛋白质印迹(数据未示出)。
ELISA测定
使用涂布有10μg/mL购自Creative Biomart的选定重组白细胞受体(人KIR3DL1、人KIR3DL2、人KIR3DL3、人LILRB1、人LILRB2、人PTPRJ和小鼠Pirb)的Maxisorp(Nunc，Switzerland)96孔板进行竞争ELISA测定。将受体在4℃温育过夜，用5％乳粉-TBS封闭2小时。以10μg/mL添加HLA2-Fc选定构建体(A252-Fc、A302-Fc、B27052-Fc、B532-Fc、B572-Fc、B582-Fc、C082-F和C122-Fc)及其对照(A25-β2m-Fc、A30-β2m-Fc、B2705-β2m-Fc、B53-β2m-Fc、B57-β2m-Fc、B58-β2m-Fc、C08-β2m-Fc和C12-β2m-Fc)以及同种型IgG4，室温下保持2小时。将针对人Fc的HRP缀合抗体用作检测剂。
白细胞的流式细胞术分析
使用FACS canto II(BD Bioscience)进行流式细胞术分析，并使用FlowJo 7.6.4版来分析数据。
Treg的产生
为了在鼠CD4+T细胞中诱导Foxp3的表达，我们从C57BL/6脾细胞中收获脾脏细胞，并进行纯化(小鼠初始CD4+T细胞分离试剂盒-Easy Sep)以获得CD4+初始T细胞。然后，在涂布有5μg/mL抗CD3mAb(eBioscience)、可溶性2μg/mL抗CD28mAb(Biolegend)、10μg/mL TGF-β1(R&D systems)和100IU/mL IL-2(R&D systems)的96孔板中，以105个细胞/200μL/孔培养细胞96小时。
HLA2-Fc存在下的iTreg转化
在剂量浓度(5μg/200μL)的HLA2-Fc(A252-Fc、A302-Fc、B27052-Fc、B532-Fc、B572-Fc、B582-Fc、C082-F和C122-Fc)、对照(A25-β2m-Fc、A30-β2m-Fc、B2705-β2m-Fc、B53-β2m-Fc、B57-β2m-Fc、B58-β2m-Fc、C08-β2m-Fc和C12-β2m-Fc)、同种型IgG4、无分化因子的培养基和PBS的存在下，在用于iTreg转化的最佳培养条件下温育鼠初始CD4+T细胞72小时。通过流式细胞术测量iTreg转化。
增殖测定
在加入不同浓度(25、10和5μg/孔)的药物1天后，将细胞以5×105个细胞/孔的密度平板接种在圆形96孔板中。根据手册说明书(细胞增殖试剂盒II，Roche)进行XTT增殖测定。使用微孔板读数器以孔在450nm下的吸光度获取结果。
体内治疗
在第6周，将C38或MC38-OVA肿瘤片段皮下注射到同基因雌性C57BL/6小鼠的右侧肋腹中。在第6周，将Pan02细胞系以1×105注射到同基因C57BL/6小鼠的右侧胁腹中。根据动物各自的肿瘤体积大小分配动物，并将其分成其间不显示统计学差异的各组。对于C38和MC38-OVA，当肿瘤达到±60mm3时开始进行实验治疗。对于胰腺Pan02，在±300mm3的大肿瘤中开始进行实验治疗。根据它们各自的肿瘤体积大小分配动物并分组，它们之间没有显示出统计学差异。使用卡尺测量肿瘤直径，根据公式D/2×d2计算体积，其中D和d分别是以毫米为单位的肿瘤的最长直径和最短直径。
针对结肠(C38和MC38)的物质注射实验设计如下建立：载剂(PBS 200μL)Q3Dx6；同种型(10mg/Kg)Q3Dx6；HLA2-Fc(10mg/Kg)Q3Dx6；抗CTLA4Q3Dx2(第1次注射100μg，第2次注射50μg)；PD-1biwkx2(200μg)；HLA2-Fc+CTLA-4(分别为Q3Dx6和Q3Dx2)；HLA2-Fc+PD-1(分别为Q3Dx6和biwk×2)。针对胰腺(Pan02)的注射物质实验设计如下：同种型(5mg/Kg)biwk×2；HLA2-Fc(5mg/Kg)biwk×2；PD-1(5mg/Kg)biwk×2；4-1BB(1mg/Kg)biwkx2；HLA2-Fc+PD-1biwk x 2；和HLA2-Fc+4-1BB biwk x 2。
％Δ抑制率由ΔT/ΔC肿瘤生长比计算，其表示与对照相比，从治疗开始(例如300mm3)到治疗结束体积(例如1000mm3)的肿瘤生长％，其使用下式计算：平均％Δ抑制率＝(平均值(C)-平均值(C0))-(平均值(T)-平均值(T0))/(平均值(C)-平均值(C0))*100％。其中T＝治疗组值，T0为治疗组初始值；C为对照组值，C0为对照组初始值。
对于肿瘤浸润淋巴细胞分析，使用以下门控策略：CD45+用于总白细胞；CD45+ CD3+用于总T细胞；CD45+ CD3+ CD4+用于CD4辅助T细胞；CD45+ CD3+ CD8+用于CD8细胞毒性T细胞；CD45+ CD3+ CD4+ FoxP3+ CD25+用于Treg细胞；CD45+ CD3- CD11+ Gr-1+用于MDSC；CD45+ CD3- CD11+ F4/80+用于巨噬细胞；CD45+ CD3- CD11+ F4/80+ MHCII+用于M1型巨噬细胞；CD45+ CD3- CD11+ F4/80+ CD206+用于M2型巨噬细胞；CD45+ Gr-1- F4/80-CD335+用于NK细胞；CD45+ Gr-1- F4/80- CD335+ CD3+用于NKT细胞。
对于血液白细胞的分析，使用以下门控策略：CD45+用于总白细胞；CD45+ CD3+用于总T细胞；CD45+ CD3+ CD4+用于CD4辅助T细胞；CD45+ CD3+ CD8+用于CD8细胞毒性T细胞；CD45+ CD3+ CD4+ FoxP3+用于Treg细胞；CD45+ CD3+ CD4+ T-Bet+用于Th1细胞；CD45+CD3- CD11+ Ly6C+ Ly6G+用于G-MDSC和M-MDSC；CD45+ Ly6C- Ly6G- CD335+用于NK细胞；CD45+ Ly6C- Ly6G- CD335+ CD3+用于NKT细胞。
用于流式细胞术的肿瘤样品和血液样品使用eBioscience描述的方案(https:// www.ebioscience.com/media/pdf/best-protocols/cell-preparation-for-flow- cytometry.pdf，于2017年2月21日访问)制备。
表1：MHC-Ia等位基因列表
表2：选定的MHC-Ia等位基因
序列表
<110> 苏黎世大学
<120> MHC Ia类开放型构象异构体
<130> uz286wo
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 氨基酸连接物(amino acid linker)
<400> 1
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Tyr Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala
50 55 60
Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Asn Thr Arg Asn Val Lys Ala His Ser Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Glu Ser Leu Arg Ile Ala Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Asp Gly Ser His Thr Ile Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly
115 120 125
Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Gln Gln Asp Ala Tyr Asp Gly
130 135 140
Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Thr Ala His Glu
165 170 175
Ala Glu Gln Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Arg Cys Val Glu Trp Leu
180 185 190
Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala
195 200 205
Pro Lys Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr
210 215 220
Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr
225 230 235 240
Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu
245 250 255
Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val
260 265 270
Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu
275 280 285
Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro
290 295 300
Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala
305 310 315 320
Val Ile Ala Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser
325 330 335
Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser
340 345 350
Ala Gln Gly Ser Asp Met Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val
355 360 365
<210> 3
<211> 365
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Ala Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Gln Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Ser Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala
50 55 60
Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Arg
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr Arg Asn Val Lys Ala Gln Ser Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Gly Ser His Thr Ile Gln Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly
115 120 125
Ser Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Glu Gln His Ala Tyr Asp Gly
130 135 140
Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Trp
165 170 175
Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu
180 185 190
Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro
195 200 205
Pro Lys Thr His Met Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr
210 215 220
Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr
225 230 235 240
Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu
245 250 255
Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val
260 265 270
Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu
275 280 285
Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Leu Ser Ser Gln Pro
290 295 300
Thr Ile Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala
305 310 315 320
Val Ile Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser
325 330 335
Ser Asp Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Thr Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser
340 345 350
Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val
355 360 365
<210> 4
<211> 362
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Leu Leu Leu Leu Trp Gly Ala
1 5 10 15
Val Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
His Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Thr
35 40 45
Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Leu Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala
50 55 60
Ala Ser Pro Arg Glu Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Asp Arg Glu Thr Gln Ile Cys Lys Ala Lys Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Glu Asp Leu Arg Thr Leu Leu Arg Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Asn Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly
115 120 125
Pro Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr His Gln Asp Ala Tyr Asp Gly
130 135 140
Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu Asp Leu Ser Ser Trp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Asp Thr Ala Ala Gln Ile Thr Gln Arg Lys Trp Glu Ala Ala Arg Val
165 170 175
Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Cys Val Glu Trp Leu
180 185 190
Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro
195 200 205
Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr
210 215 220
Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr
225 230 235 240
Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu
245 250 255
Thr Arg Pro Ala Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val
260 265 270
Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu
275 280 285
Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Ser
290 295 300
Thr Val Pro Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val
305 310 315 320
Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Cys Arg Arg Lys Ser
325 330 335
Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Cys Ser Asp Ser
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Val Val Ile Gly Ala Val Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser
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Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser
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Ser Ala Gln Gly Ser Asp Glu Ser Leu Ile Ala Cys Lys Ala
355 360 365

Claims (19)

1.用作药物的分离的MHC-Ia开放型构象异构体，条件是所述分离的MHC-Ia开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体。
2.如权利要求1所述的用作药物的分离的MHC-Ia开放型构象异构体，其中，所述分离的MHC-Ia开放型构象异构体包含第一单体或第一和第二单体，并且单体各自相互独立地是HLA重链或包含HLA重链，条件是所述HLA重链不是HLA-B27或HLA-B57重链。
3.如权利要求1或2所述的分离的MHC-Ia开放型构象异构体，其用于治疗或预防癌症。
4.如权利要求1或2所述的分离的MHC-Ia开放型构象异构体，其用作免疫调节剂，特别是用于治疗传染病，更特别是用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、呼吸合胞体病毒(RSV)感染、麻疹、疱疹和黄热病。
5.如权利要求1至4中任一项所述的用作药物的分离的MHC-Ia开放型构象异构体，其特别用于治疗或预防癌症或用作免疫调节剂，其中，所述开放型构象异构体包含一条或两条HLA重链或基本上由一条或两条HLA重链组成，所述HLA重链选自A25、B58、C08、A30、B53和C12。
6.一种融合MHC-Ia开放型构象异构体，条件是所述融合MHC-Ia开放型构象异构体不是HLA-B27或HLA-B57开放型构象异构体，其中，所述融合MHC-Ia开放型构象异构体包含第一单体或第一和第二单体，或者基本上由其组成，其中
a.所述第一单体包含HLA重链，或所述第一和第二单体各自相互独立地包含HLA重链，和
b.其中，所述第一单体或所述第一和第二单体中的每一个与Fc多肽序列共价连接。
7.如权利要求6所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，氨基酸连接物将所述HLA重链和所述Fc多肽序列接合在一起。
8.如权利要求6或7所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，所述第一和第二单体是相同的。
9.如权利要求6至8中任一项所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，所述融合MHC-Ia开放型构象异构体另外包含肽表位片段，特别是其中所述第一和/或第二单体另外包含肽表位片段。
10.如权利要求6至9中任一项所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，所述HLA重链仅由HLAα1、2和3结构域组成。
11.如权利要求6至10中任一项所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，所述HLA重链包含跨膜结构域并且不包含细胞内结构域。
12.如权利要求6至11中任一项所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，所述HLA重链选自A25、B58、C08、A30、B53和C12。
13.如权利要求6至12中任一项所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，Fc结构域包含选自免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)中任一种的重链恒定区CH2和CH3。
14.如权利要求6至13中任一项所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其中，所述氨基酸连接物包含1～50个氨基酸，特别是5～40个氨基酸，更特别是10～30个氨基酸，甚至更特别是15～25个氨基酸，并将所述HLA重链与所述Fc结构域连接成一条单一多肽链。
15.如权利要求6至14中任一项所述的融合MHC-Ia开放型构象异构体，其用作药物，特别是
a.用于治疗或预防癌症，或
b.用作为免疫调节剂，特别是用于治疗传染病，更特别是用于治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、呼吸合胞体病毒(RSV)感染、麻疹、疱疹和黄热病。
16.一种核酸分子，其用于治疗或预防癌症或用作免疫调节剂，特别是用于治疗传染病，其中，所述核酸分子编码权利要求1至14中任一项所述的分离的MHC-Ia开放型构象异构体单体或融合MHC-Ia开放型构象异构体单体。
17.一种包含权利要求16所述的核酸分子的病毒，所述核酸分子处于在哺乳动物细胞中、特别是在人细胞中可操纵的启动子序列的控制下，所述病毒特别是腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或慢病毒，其用于治疗或预防癌症或用作免疫调节剂，特别是用于治疗传染病。
18.一种经体外遗传修饰的宿主细胞，其包含权利要求16所述的核酸分子。
19.一种组合药物，其包含：
a.权利要求1至14中任一项所述的分离的MHC-Ia开放型构象异构体或融合MHC-Ia开放型构象异构体，和
b.检查点调节剂，其选自：
i.检查点抑制剂(CPI)，特别是其中所述CPI选自：
-CTLA4与B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)相互作用的抑制剂，更特别是CTLA-4的多肽配体或者CD 80或CD 86的多肽配体，
-PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的抑制剂，更特别是PD-1的多肽配体或者PD-L1或PD-L2的多肽配体，和
-T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域分子3(TIM-3)的抑制性多肽配体，特别是抗体；
和
ii检查点激动剂，特别是被选择为结合并激活肿瘤坏死因子受体4-1BB的检查点激动剂抗体，特别是针对4-1BB的单克隆抗体，
特别地，其中所述检查点调节剂是选自抗体、抗体片段和抗体样分子的多肽，并且所述多肽选择性地与选自CTLA4、PD-1、CD80、CD86、PD-L1、PD-L2、TIM-3、4-1BB和4-1BBL的检查点介体反应。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4380605A1 (en) 2021-08-05 2024-06-12 ImmunOs Therapeutics AG Combination medicaments comprising hla fusion proteins
EP4130029A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-08 ImmunOs Therapeutics AG Pharmaceutical compositions comprising hla fusion proteins
WO2023012348A1 (en) 2021-08-05 2023-02-09 Immunos Therapeutics Ag A modified hla-b57 with increased expression levels

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999058557A2 (en) * 1998-05-11 1999-11-18 Isis Innovation Limited Dimers of the hla-b27 heavy chain extracellular domain and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7521202B2 (en) 1999-12-17 2009-04-21 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Method and apparatus for the production of soluble MHC antigens and uses thereof
AU2003283963A1 (en) 2002-09-27 2004-04-19 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-c2 antigenic peptides and uses thereof
US7601801B2 (en) 2003-07-11 2009-10-13 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. HLA-A24 binding cancer antigen peptide derived from livin
US7807392B1 (en) 2003-09-15 2010-10-05 Celera Corporation Lung disease targets and uses thereof
US7842466B1 (en) 2005-09-16 2010-11-30 Celera Corporation Colon disease targets and uses thereof
US8168586B1 (en) 2007-11-21 2012-05-01 Celera Corporation Cancer targets and uses thereof
GB0821806D0 (en) 2008-11-28 2009-01-07 Circassia Ltd Compositions with reduced dimer formation
PT2519543T (pt) 2009-12-29 2016-10-07 Emergent Product Dev Seattle Proteínas de ligação de heterodímero e suas utilizações
TWI619729B (zh) 2012-04-02 2018-04-01 再生元醫藥公司 抗－ｈｌａ－ｂ*２７抗體及其用途
WO2015022669A2 (en) 2013-08-15 2015-02-19 Centre Hospitalier Universitarie Vaudois Methods for typing hla alleles
WO2015153969A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ligand discovery for t cell receptors
JP6792559B2 (ja) 2015-02-04 2020-11-25 ウニヴェルズィテート チューリッヒ 癌治療のためのｈｌａホモ二量体の使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999058557A2 (en) * 1998-05-11 1999-11-18 Isis Innovation Limited Dimers of the hla-b27 heavy chain extracellular domain and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDO A.AROSA 等: "Open conformers: the hidden face of MHC-I molecules", 《TRENDS IN IMMUNOLOGY》 *
G CIPRANDI 等: "Soluble HLA-G and HLA-A,-B,-C serum levels in patients with allergic rhinitis", 《ALLERGY》 *
MANNI LUTHRA-GUPTASARMA 等: "HLA-B27 lacking associated beta2-microglobulin rearranges to auto-display or cross-display residues 169-181: a novel molecular mechanism for spondyloarthropathies", 《FEBS LETT》 *
SUZANNE L TOPALIAN 等: "Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy", 《CANCER CELL》 *

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GR01 Patent grant
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