MX2015003206A

MX2015003206A - Anticuerpos anti-cd3, moleculas de union a antigeno biespecificas que se unen a cd3 y cd20, y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2015003206A
Application number: MX2015003206A
Authority: MX
Inventors: Eric Smith; Nicholas J Papadopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2013-09-19
Publication date: 2015-07-14
Also published as: PT3778641T; SG11201501269XA; US20180215823A1; US11155621B2; AU2018232926B2; JP6923292B2; AU2013318059B2; JO3716B1; HUE063215T2; CA2885156A1; BR112015005380A2; JOP20200237A1; JP6865324B2; US9657102B2; CN104640881A; IL237301B; CN113980132A; HRP20230844T1; CN104640881B; LT2897981T

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a CD3 y métodos para el uso de los mismos. De acuerdo con ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a CD3 humano con alta afinidad e inducen la proliferación de células T humanas. La presente invención incluye anticuerpos que se unen a CD3 e inducen la muerte de células tumorales mediada por células T. De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20. En ciertas modalidades, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención son capaces de inhibir el crecimiento de tumores de células B que expresan CD20. Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos en los que una respuesta inmunitaria dirigida regulada hacia arriba o inducida es deseable y/o terapéuticamente beneficiosa. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer así como de otras enfermedades y trastornos relacionados con el CD20.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CD3, MOLÉCULAS DE UNIÓN A ANTÍGENO BIESPECÍFICAS QUE SE UNEN A CD3 Y CD20, Y USOS DE LOS MISMOS AMBITO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión de antígeno de los mismos, que son específicos para CD3, y los métodos para el uso de los mismos. La presente invención también se refiere a moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y a una molécula objetivo, tal como CD20, y métodos para el uso de las mismas.

ANTECEDENTES CD3 es un antígeno homodimérico o heterodimérico que se expresa en las células T en asociación con el complejo receptor de células T (TCR) y es necesario para la activación de las células T. El CD3 funcional se forma a partir de la asociación dimérica de dos de cuatro cadenas diferentes: épsilon, zeta, delta y gamma. Las configuraciones de CD3 dimérico incluyen gamma/épsilon, delta/épsilon y zeta/zeta. Se ha demostrado que los anticuerpos anti-CD3 se agrupan CD3 en las células T, provocando así la activación de las células T de una manera similar al acoplamiento de TCR por parte de las moleculas MHC cargadas con péptidos. Por lo tanto, se han propuesto anticuerpos anti-CD3 para propósitos terapéuticos que implican la activación de las células T. Además, se han propuesto anticuerpos biespecífíeos capaces de unión a CD3 y un antígeno objetivo para usos terapéuticos que implican dirigir respuestas inmunes de las células T a tejidos y células que expresan el antígeno objetivo.

CD20 es una fosfoproteína no glicosilada que se expresa en las membranas celulares de las células B maduras. CD20 se considera un antígeno asociado a tumores de células B, ya que se expresa en más del 95% de los linfomas no Hodgkin de células B (LNH) y otros tumores de células B malignos, pero está ausente en las células B precursoras, células dendríticas y células plasmáticas. Los métodos para el tratamiento del cáncer que apuntan a CD20 son conocidos en la téenica. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico rituximab se ha utilizado o sugerido para su uso en el tratamiento de cánceres tales como linfoma no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica (CLL) y linfoma linfocítico pequeño (SLL). Se cree que el CD20 mata las células tumorales que expresan CD20 por citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) y/o inducción de la apoptosis y sensibilización a la quimioterapia. Aunque las estrategias anti-CD20 que apuntan a los tumores han mostrado gran promesa en el ámbito clínico, no todos los pacientes responden a la terapia anti-CD20, y se ha demostrado que algunos pacientes desarrollan resistencia o muestran respuestas incompletas a la terapia anti-CD20 (por ejemplo, resistencia al rituximab).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen tanto a CD3 como a un antígeno objetivo (tal como CD20) serían útiles en ámbitos terapéuticos donde se desea una orientación específica y la muerte mediada por células T de las células que expresan el antígeno objetivo.

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCION En un primer aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano. Los anticuerpos de acuerdo con este aspecto de la invención son útiles, entre otras cosas, para dirigirse a las células T que expresan CD3, y para estimular la activación de células T, por ejemplo, en circunstancias donde la muerte mediada por células T es beneficiosa o deseable. Los anticuerpos anti-CD3 de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se pueden incluir como parte de un anticuerpo biespecífico que dirige la activación de células T mediada por CD3 a tipos de células específicas, tales como células tumorales o agentes infecciosos.

En las Tablas 1 y 2 en este documento se enumeran ejemplos de anticuerpos anti-CD3 de la presente invención. La Tabla 1 muestra los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (HCVR) y las regiones variables de cadena ligera (LCVR), así como las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3), y las regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1 LCDR2 y LCDR3) de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3. La Tabla 2 muestra los identificadores de secuencia de las moléculas de ácido nucleico que codifican las HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3.

La presente invención proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden una HCVR y un par de secuencias de aminoácidos LCVR (HCVR/LCVR) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR enumeradas en la Tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCVR enumeradas en la Tabla 1. De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR contenida dentro de cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 enumerados en la Tabla 1. En ciertas modalidades, el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 2/10 (por ejemplo, H1H2712N); 114/122 (por ejemplo, H2M2609N); 514/522 (por ejemplo, H2M3563N); 770/778 (por ejemplo, H1H5778P); 1050/1234 (por ejemplo, H1H7195B); y 1090/1234 (por ejemplo, H1H7208B).

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similares a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99 % de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una HCDR3 y un par de secuencias de aminoácidos LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCDR3 listadas en la Tabla 1. De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 contenidas dentro de cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 enumerados en la Tabla 1. En ciertas modalidades, el par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8/16 (por ejemplo, H1H2712N); 120/128 (por ejemplo, H2M2609N); 520/528 (por ejemplo, H2M3563N); 776/784 (por ejemplo, H1H5778P); 1056/1240 (por ejemplo, H1H7195B); y 1096/1240 (por ejemplo, H1H7208B).

La presente invención también proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas dentro de cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 enumerados en la Tabla 1. En ciertas modalidades, el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16 (por ejemplo, H1H2712N); 116-118-120-124-126-128 (por ejemplo, H2M2609N); 516-518-520-524-526-528 (por ejemplo, H2M3563N); 772-774-776- 780-782-784 (por ejemplo, H1H5778P); 1052-1054-1056-1236- 1238-1240 (por ejemplo, H1H7195B),- y 1092-1094-1096-1236-1238-1240 (por ejemplo, H1H7208B).

En una modalidad relacionada, la presente invención proporciona anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas dentro de un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR según se define por cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenidas dentro de un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10 (por ejemplo, H1H2712N); 114/122 (por ejemplo, H2M2609N); 514/522 (por ejemplo, H2M3563N); 770/778 (por ejemplo, H1H5778P); 1050/1234 (por ejemplo, H1H7195B); y 1090/1234 (por ejemplo, H1H7208B). Los metodos y téenicas para la identificación de las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos HCVR y/o LCVR aquí descritas. Los ejemplos de convenciones que se pueden utilizar para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de las secuencias, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones bucles estructurales, y la definición de AbM es un compromiso entre los enfoques de Kabat y Chothia. Ver, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, "National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al . , J. Mol . Biol . 273:927-948 (1997); and Martin et al . , Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 86. · 9268-9272 (1989). También hay bases de datos públicas disponibles para la identificación de secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-CD3 o porciones de los mismos. Por ejemplo, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos HCVR enumeradas en la Tabla 2, o un secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCVR enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia una sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos HCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos HCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos HCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos LCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos LCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos LCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1-HCDR2- HCDR3), donde el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define por cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 enumerados en la Tabla 1.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1-LCDR2- LCDR3), donde el conjunto de secuencias de aminoácidos LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define por cualquiera de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 enumerados en la Tabla 1.

La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR y una LCVR, donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR enumeradas en la Tabla 1, y donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCVR enumeradas en la Tabla 1. En ciertas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas, y una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con las mismas. En ciertas modalidades de acuerdo con este aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR y una LCVR, donde la HCVR y la LCVR se derivan del mismo anticuerpo anti-CD3 enumerado en la Tabla 1.

La presente invención también proporciona vectores de expresión recombinantes capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-CD3. Por ejemplo, la presente invención incluye vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias HCVR, LCVR y/o CDR como se enumera en la Tabla 1. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención las células huésped en las que se han introducido tales vectores, así como métodos para producir los anticuerpos o porciones de los mismos mediante el cultivo de células huésped bajo condiciones que permiten la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos así producidos.

La presente invención incluye anticuerpos anti-CD3 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas modalidades, la modificación para eliminar los sitios de glicosilación indeseables puede ser útil, o un anticuerpo que carece de un grupo fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, se puede modificar la galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o un fragmento del mismo que se une específicamente a CD3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-CD3 y un segundo agente terapéutico. En una modalidad, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combina ventajosamente con un anticuerpo anti-CD3. Los ejemplos de agentes que se pueden combinar ventajosamente con un anticuerpo anti-CD3 incluyen, sin limitación, otros agentes que se unen a y/o activan la señalización de CD3 (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, etc.) y/o agentes que no se unen directamente a CD3 pero no obstante activan o estimulan la activación de células inmunes. En otra parte en este documento se describen terapias de combinación adicionales y coformulaciones que implican los anticuerpos anti-CD3 de la presente invención.

En aún otro aspecto, la invención proporciona métodos terapéuticos para estimular la activación de células T usando un anticuerpo anti-CD3 o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, donde los métodos terapéuticos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención a un sujeto que lo necesite. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o condición que sea mejorada, aliviada, inhibida o impedida por la estimulación de actividad o señalización de CD3.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y a un antígeno objetivo. De acuerdo con ciertos ejemplos de modalidad, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas se unen a CD3 y CD20; en el presente documento, tales moléculas de unión a antígeno biespecíficas también se denominan "moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20". La porción anti-CD20 de la molécula biespecífica anti-CD3/anti-CD20 es útil para atacar a las células tumorales que expresan CD20 (por ejemplo, tumores de células B) y la porción anti-CD3 de la molécula biespecífica es útil para la activación de células T. La unión simultánea de CD20 en una célula tumoral y CD3 en una célula T facilita la eliminación dirigida (lisis celular) de la célula tumoral por parte de la célula T activada. Por lo tanto, las moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados con o causados por tumores que expresan CD20 (por ejemplo, linfomas).

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de acuerdo con este aspecto de la presente invención comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20. La presente invención incluye moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), donde cada dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) combinada con una región variable de cadena ligera (LCVR). En ciertos ejemplos de modalidad de la invención, el dominio de unión a antígeno anti-CD3 y el dominio de unión a antígeno anti-CD20 comprenden HCVR diferentes, junto con un LCVR común. Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 7 de este documento, se construyeron anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, donde el primer dominio de unión a antígeno comprende un par HCVR/LCVR derivado de un anticuerpo anti-CD3; y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20, donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende una HCVR derivada de un anticuerpo anti-CD20 combinado con una LCVR derivada de un anticuerpo anti-CD3 (por ejemplo, la misma LCVR que se incluye en el dominio de unión al antígeno anti- CD3). En otras palabras, en los ejemplos de moléculas descritos en este documento, el combinar una HCVR de un anticuerpo anti-CD20 con una LCVR de un anticuerpo anti-CD3 crea un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 (pero no se une a CD3). En tales modalidades, el primer y el segundo dominio de unión a antígeno comprenden HCVR anti-CD3 y anti-CD20 diferentes, pero comparten una LCVR anti-CD3 común.

La presente invención proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR indicadas en la Tabla 1 o la Tabla 18. El primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 también puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos LCVR indicadas en la Tabla 1 o la Tabla 19. De acuerdo con ciertas modalidades, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de los pares de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR indicados en la Tabla 1 o la Tabla 17. La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos CDR1- CDR2-CDR3 de cadena pesada indicadas en la Tabla 1 o la Tabla 18, y/o cualquiera de las secuencias de aminoácidos CDR1-CDR2-CDR3 de cadena ligera indicadas en la Tabla 1 o la Tabla 19.

De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1250, 1266, 1282, 1298, 1314 y 1329 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1250/1258, 1266/1274, 1282/1290, 1298/1306, 1314/1322, y 1329/1333.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1256, 1272, 1288, 1304, 1320 y 1332, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

En ciertas modalidades, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1256/1264, 1272/1280, 1288/1296, 1304/1312, 1320/1328 y 1332/1336.

La presente invención también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1252, 1268, 1284, 1300, 1316 y 1330, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1254, 1270, 1286, 1302, 1318 y 1331, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

Ciertos ejemplos no limitantes de moleculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 de la invención incluyen un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1252-1254-1256-1260-1262-1264 (por ejemplo, BS3/20-001); 1268-1270-1272-1276-1278-1280 (por ejemplo, BS3/20-002); 1284-1286-1288-1292-1294-1296 (por ejemplo, BS3/20-003); 1300-1302-1304-1308-1310-1312 (por ejemplo, BS3/20-004); 1316-1318-1320-1324-1326-1328 (por ejemplo, BS3-20-005); y 1330-1331-1332-1334-1335-1336 (por ejemplo, BS3/20-007).

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1242, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 y 1242/1333.

La presente invención también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1248, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

En ciertas modalidades, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1248/1264, 1248/1280, 1248/1296, 1248/1312, 1248/1328 y 1248/1336.

La presente invención también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1244, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1246, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, O una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia.

Ciertos ejemplos no limitantes de moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 de la invención incluyen un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 que comprende dominios HCDRl-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1244-1246-1248-1260-1262-1264 (por ejemplo, BS3/20-001); 1244-1246-1248-1276-1278-1280 (por ejemplo, BS3/20-002); 1244-1246-1248-1292-1294-1296 (por ejemplo, BS3/20-003); 1244-1246-1248-1308-1310-1312 (por ejemplo, BS3/20-004); 1244-1246-1248-1324-1326-1328 (por ejemplo, BS3-20-005); y 1244-1246-1248-1334-1335-1336 (por ejemplo, BS3/20-007).

En una modalidad relacionada, la invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 comprende dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos dentro de las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1242/1258, 1242/1274, 1242/1290, 1242/1306, 1242/1322 y 1242/1333.

En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias HCVR, LCVR o CDR de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 descritas en este documento, incluyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de polinucleótidos indicadas las Tablas 20 y 21 de este documento, así como moléculas de ácido nucleico que comprenden dos o más de las secuencias de polinucleótidos indicadas en las Tablas 20 y 21 en cualquier combinación o disposición funcional de las mismas. La invención también abarca los vectores de expresión recombinantes que transportan los ácidos nucleicos de la invención y las células huésped en las que se han introducido tales vectores, como así también los métodos para producir los anticuerpos mediante el cultivo de las células huésped bajo condiciones que permiten la producción de los anticuerpos, y la recuperación de los anticuerpos producidos. La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 en las cuales cualquiera de los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a CD3 mencionados anteriormente se combina, conecta o asocia de otro modo con cualquiera de los dominios de unión a antígeno que se unen específicamente a CD20 mencionados anteriormente para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une a CD3 y a CD20.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para eliminar los sitios de glicosilación indeseables puede ser útil, o un anticuerpo que carece de un grupo fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, se puede modificar la galactosilación con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20 como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20 y un segundo agente terapéutico. En una modalidad, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combina ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20. En otra parte en este documento se discuten en detalle ejemplos de agentes que se pueden combinar ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20.

En aún otro aspecto, la invención proporciona métodos terapéuticos para atacar/matar células tumorales que expresan CD20 usando una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20 de la invención, donde los métodos terapéuticos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti- CD3/anti-CD20 de la invención a un sujeto que lo necesite.

La presente invención también incluye el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20 de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con o causado por la expresión de CD20.

El estudio de la descripción detallada que sigue pondrá de manifiesto otras modalidades de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el volumen del tumor (en mm3) en función del tiempo en ratones NOD/SCID implantados por vía subcutánea con una mezcla de células tumorales Raji y PBMC después de la implantación y el tratamiento del tumor, comenzando el día de la implantación del tumor, ya sea con Fe humano (hFc, línea continua) o con anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007, línea de trazos).

La Figura 2 muestra el volumen del tumor (en mm3) en función del tiempo en ratones NOD/SCID implantados por vía subcutánea con una mezcla de células tumorales Raji y PBMC después de la implantación y el tratamiento del tumor, comenzando 7 días después de la implantación del tumor, ya sea con Fe humano (hFc, línea continua) o con anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007, línea de trazos).

La Figura 3 muestra una gráfica de la cantidad de células B (xl000/pL) en función del tiempo en muestras de sangre de monos cynomolgus tratados con tres dosis diferentes de anticuerpo biespecífico BS3/20-001 (0.01, 0.1 o 1.0 mg/kg); baja dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (Control V, 0.01 mg/kg); o alta dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (Control III (1.0 mg/kg).

La Figura 4 muestra una gráfica de la cantidad de células T (xl000/pL) en función del tiempo en muestras de sangre de monos cynomolgus tratados con tres dosis diferentes de anticuerpo biespecífico BS3/20-001 (0.01, 0.1 o 1.0 mg/kg); baja dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (Control V, 0.01 mg/kg); o alta dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (Control III (1.0 mg/kg).

Las Figuras 5A, 5B, 5C y 5D muestran los niveles anteriores y posteriores a las dosis (pg/mL) de IFN-gamma, IL-2, IL-6, y TNF-alfa, respectivamente, para monos cynomolgus tratados con una única dosis de BS3/20-001 (0.01, 0.1 o 1.0 mg/kg), baja dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (0.01 mg/kg Control V), o alta dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (1.0 mg/kg Control III).

La Figura 6 muestra el perfil de expresión de CD20 (expresado en términos de Log2 veces el cambio en la expresión) determinado a partir de muestras de sangre tomadas en diferentes puntos de tiempo de monos cynomolgus tratados con 0.01 mg/kg de Control V (anticuerpo anti-CD20); 1.0 mg/kg de Control III (anticuerpo anti-CD20); y 0.01 mg/kg, 0.1 mg/kg y 1.0 mg/kg de BS3/20-001 (anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD20).

La Figura 7 muestra la concentración total en suero (pg/ml) de anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-001) en función del tiempo en muestras de sangre de monos cynomolgus tratados con 1.0 mg/kg (triángulos), 0.1 mg/kg (cuadrados) o 0.01 mg/kg (rombos) de anticuerpo biespecífico CD3xCD20.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención, se debe comprender que esta invención no se limita a los métodos particulares y condiciones experimentales descritos, ya que tales métodos y condiciones pueden variar. También se debe comprender que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos téenicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. De acuerdo con el uso que se le da en la presente, el término "aproximadamente", cuando se utiliza con referencia a un valor numérico mencionado en particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor mencionado en no más del 1%. Por ejemplo, tal como se utiliza en este documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etc.).

Aunque en la práctica o la prueba de la presente invención se pueden utilizar cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, ahora se describirán los métodos y materiales preferidos.

DEFINICIONES Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "CD3" se refiere a un antígeno que se expresa en las células T como parte del receptor de células T multimolecular (TCR) y que consiste en un homodímero o heterodímero formado a partir de la asociación de dos de las cuatro cadenas del receptor: CD3-épsilon, CD3-delta, CD3-zeta, y CD3-gamma. El CD3-épsilon humano comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1370; el CD3-delta humano comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1371. En este documento, todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteínas pretenden referirse a la versión humana de la respectiva proteína, polipéptido o fragmento de proteína, a menos que se especifique expresamente que se trata de una especie no humana. Por lo tanto, la expresión "CD3 " significa CD3 humano, a menos que se especifique que se trata de una especie no humana, por ejemplo, "CD3 de ratón", "CD3 de mono", etc.

Tal como se utiliza en el presente documento, "un anticuerpo que se une a CD3 " o un "anticuerpo anti-CD3" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente una única subunidad de CD3 (por ejemplo, épsilon, delta, gamma o zeta), así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente un complejo dimérico de dos subunidades de CD3 (por ejemplo, dímeros CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon, y zeta/zeta). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se pueden unir a CD3 soluble y/o a CD3 expresado en la superficie celular. CD3 soluble incluye proteínas CD3 naturales así como variantes de proteínas CD3 recombinantes, tales como, por ejemplo, construcciones CD3 monoméricas y diméricas, que carecen de un dominio transmembrana o que no están asociadas de otro modo con una membrana celular.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "CD3 expresado en la superficie celular" significa una o más proteínas CD3 que se expresan en la superficie de una célula in vi tro o in vivo, de tal manera que al menos una porción de una proteína CD3 está expuesta al lado extracelular de la membrana celular y está accesible para una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. "CD3 expresado en la superficie celular" incluye las proteínas CD3 contenidas en el contexto de un receptor de células T funcionales en la membrana de una célula. La expresión "CD3 expresado en la superficie celular" incluye las proteínas CD3 expresadas como parte de un homodímero o heterodímero en la superficie de una célula (por ejemplo, dímeros CD3 gamma/épsilon, delta/épsilon, y zeta/zeta). La expresión "CD3 expresado en la superficie celular" también incluye una cadena de CD3 (por ejemplo, CD3-épsilon, CD3-delta o CD3-gamma) que se expresa por sí sola, sin otros tipos de cadenas de CD3, en la superficie de una célula. Un "CD3 expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína CD3 . Alternativamente, "CD3 expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa CD3 humano en su superficie pero que ha sido artificialmente modificada para expresar CD3 en su superficie.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo anti-CD3" incluye tanto los anticuerpos monovalentes con una única especificidad como los anticuerpos biespecífíeos que comprenden un primer brazo que se une a CD3 y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno (objetivo), donde el brazo anti-CD3 comprende cualquiera de las secuencias HCVR/LCVR o CDR indicadas en la Tabla 1 o las Tablas 18/19 de este documento. En otra parte de este documento se describen ejemplos de anticuerpos anti-CD3 biespecíficos. El término "molécula de unión a antígeno" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que se une específicamente a, o interactúa con, un antígeno particular (por ejemplo, CD3). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en este documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (en este documento abreviado como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, del inglés framework regions) . Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes modalidades de la invención, las FR del anticuerpo anti-CD3 (o porción de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden estar modificadas natural o artificialmente. Se puede definir una secuencia de aminoácidos de consenso sobre la base de un análisis lado a lado de dos o más CDR.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o diseñado mediante ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo se pueden derivar, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas utilizando cualquiera de las téenicas estándares adecuadas, tales como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de dominios variables y opcionalmente constantes de anticuerpos que codifican ADN. Tal ADN es conocido y/o se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, de fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos de fagos), o bien se pueden sintetizar. El ADN se puede secuenciar y manipular químicamente o mediante el uso de téenicas de biología molecular, por ejemplo, para organizar uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisterna, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb,-y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácido que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada tal como un péptido CDR3), o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas diseñadas mediante ingeniería genética, tales como los anticuerpos específicos para un dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos a los cuales se les ha eliminado un dominio, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), pequeños immunofármacos modulares (SMIP, del inglés small modular immunopharmaceutícals) , y dominios IgNAR variables de tiburón, también están comprendidos dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" tal como se usa en el presente documento.

Típicamente un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprende al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que es adyacente a, o que se encuentra en el marco con, una o más secuencias de marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio VH asociado con un dominio VL, los dominios VH y VL pueden estar situados uno con relación a otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros VH-VH, VH-VL o VL-VL. Alternativamente, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.

En ciertas modalidades, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a por lo menos un dominio constante. Los ejemplos de configuraciones de dominios variables y constantes que se pueden encontrar dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen las siguientes, aunque no se limitan a las mismas: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (V) VH-CHI_CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (X) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluso en cualquiera de los ejemplos de configuraciones enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar directamente unidos entre sí o bien pueden estar unidos por una región bisagra total o parcial o por una región de enlace. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula de polipéptido. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homo-dímero o hetero-dímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominios variables y constantes enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, mediante enlace(s) disulfuro).

Al igual que las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecífíeos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo raultiespecífico típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpos multiespecíficos, incluyendo los ejemplos de formatos de anticuerpos biespecífíeos descritos en este documento, se puede adaptar para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando téenicas de rutina disponibles en la técnica.

Los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de las células que expresan el antígeno por parte de un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fe (FcR) (por ejemplo, células NK, neutrófilos, y macrófagos) reconocen anticuerpo unido a una célula objetivo y por lo tanto llevan a la lisis de la célula objetivo. La CDC y la ADCC se pueden medir usando ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la téenica. (Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes et ai. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 95 : 652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo se puede seleccionar sobre la base de si es deseable que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos anti-CD3 de la invención (monoespecíficos o biespecíficos) son anticuerpos humanos. Tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo humano" pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis in vitro aleatoria o específica de un sitio o por mutación somática in vivo) , por ejemplo en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo humano" no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco humanas.

En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos humanos recombinantes. Tal como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo humano recombinante" pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos que se expresan usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (lo cual se describe más adelante), los anticuerpos que se aíslan de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes (lo cual se describe más adelante), los anticuerpos que se aíslan de un animal (por ejemplo, de un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucí. Acids Res.20:6287-6295) o los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. No obstante, en ciertas modalidades tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo ) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de, y están relacionadas con, las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vi vo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian con la heterogeneidad de la bisagra. En una de las formas, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen unidos mediante un enlace disulfuro de cadena pesada entre cadenas. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro entre cadenas y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y una pesada acopladas covalentemente (medio anticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe, pero no limita, a diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una única sustitución de aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) a niveles normalmente observados usando una bisagra de IgGl humana. La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra CH2 o CH3 que pueden ser deseables, por ejemplo, en producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos aislados. Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo aislado" significa un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado a partir de al menos un componente de un organismo, o a partir de un tejido o célula donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los propósitos de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que han sido sometidos al menos a una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con ciertas modalidades, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o productos químicos.

La presente invención también incluye anticuerpos de un brazo que se unen a CD3. Tal como se utiliza en este documento, un "anticuerpo de un brazo" significa una molécula de unión a antígeno que comprende una sola cadena pesada de anticuerpo y una sola cadena ligera de anticuerpo. Los anticuerpos de un brazo de la presente invención pueden comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR o CDR indicadas en la Tabla 1 o las Tablas 18/19 de este documento.

Los anticuerpos anti-CD3 descritos en este documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondiente a partir de la cual se derivaron los anticuerpos. Tales mutaciones se pueden determinar fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos aquí descritas con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, de bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente invención incluye anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en este documento, donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR se mutan al/a los residuo(s) correspondiente(s) de la secuencia de la línea germinal de la que se derivó el anticuerpo, o al/a los residuo(s) correspondiente(s) de otra secuencia de la línea germinal humana, o a una sustitución conservadora de aminoácidos del/de los residuo(s) correspondiente(s) de la línea germinal (en este documento, tales cambios de secuencia se denominan colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). A partir de las secuencias, de la región variable de cadena pesada y ligera, descritas en este documento, una persona versada en la téenica puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, todos los residuos de regiones marco y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL se mutan nuevamente a los residuos que se encuentran en la secuencia de la línea germinal original a partir de la cual se derivó el anticuerpo. En otras modalidades, solo ciertos residuos se mutan nuevamente a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, solo los residuos mutados que se encuentran dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o solo los residuos mutados que se encuentran dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras modalidades, uno o más residuos de las regiones marco y/o CDR se mutan al/a los residuo (s) correspondiente(s) de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal diferente de la secuencia de línea germinal a partir de la cual el anticuerpo se derivó originalmente). Además, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal en las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, donde ciertos residuos individuales se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal en particular, mientras que ciertos otros residuos que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal se pueden ensayar fácilmente para determinar si tienen una o más propiedades deseadas, tales como una mejor especificidad de unión, un aumento de la afinidad de unión, mejores o mayores propiedades biológicas antagonistas o agonistas (según corresponda), menor inmunogenicidad, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están comprendidos dentro de la presente invención.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR, y/o CDR descritas en este documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-CD3 que tienen secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR que tienen, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones conservadoras de aminoácidos en relación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR indicadas en la Tabla 1 del presente documento.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocido como un paratopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas de un antígeno y pueden tener efectos biológicos diferentes. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional es producido por aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal yuxtapuestos espacialmente. Un epítopo lineal es un epítopo producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir grupos funcionales de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

El término "identidad sustancial" o "sustancialmente idénticos", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o eliminaciones nucleotídicas apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia nucleotídica en al menos aproximadamente 95%, y más preferentemente en al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% de las bases nucleotídicas, medida utilizando cualquier algoritmo de identidad de secuencia conocido, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se discute a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en ciertos casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Cuando se aplica a los polipéptidos , el término "similitud sustancial" o "sustancialmente similares" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean óptimamente, como por ejemplo con los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 95% de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos 98% o 99% de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambia sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la téenica. Ver, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina . Alternativamente, una sustitución conservadora es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de log-probabilidades PAM250 descrita en Gonnet et al . (1992) Science 256: 1443-1445. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de log-probabilidades PAM250.

La similitud de secuencia para los polipéptidos, que también se conoce como identidad de secuencia, típicamente se mide usando software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas busca secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, entre ellas las sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que se pueden utilizar con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Ver, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También se pueden comparar secuencias polipeptídicas usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones que mejor se superponen entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferido para comparar una secuencia de la invención contra una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando los parámetros por defecto. Ver, por ejemplo, Altschul et al . (1990) J. Mol.

Biol . 215 : 403 -410 y Altschul et al . ( 1997 ) Nucleic Acids Res . 3389-402 .

Moléculas de unión a antigeno biespecificas Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecífíeos, biespecificos o multiespecíf icos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido objetivo o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido objetivos específicos para más de un polipéptido objetivo. Ver, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-CD3 de la presente invención pueden estar enlazados a, o co-expresarse con, otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido u otra proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede estar funcionalmente enlazado (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.

El uso de la expresión "anticuerpo anti-CD3" en este documento pretende incluir tanto los anticuerpos anti-CD3 monoespecífíeos como los anticuerpos biespecífíeos que comprenden un brazo de unión a CD3 y un segundo brazo que se une a un antígeno objetivo. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina se une a CD3 humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un antígeno objetivo. El antígeno objetivo al cual se une el otro brazo del anticuerpo CD3 biespecífico puede ser cualquier antígeno expresado en, o en la proximidad de, una célula, tejido, órgano, microorganismo o virus, contra el que se desea una respuesta inmunitaria específica. El brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR o CDR indicadas en la Tabla 1 o las Tablas 18/19 de este documento. En ciertas modalidades, el brazo de unión a CD3 se une a CD3 humano e induce la proliferación de células T humanas.

En el contexto de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención en los que un brazo del anticuerpo se une a CD3 y el otro brazo se une a un antígeno objetivo, el antígeno objetivo puede ser un antígeno asociado a un tumor. Los ejemplos no limitantes de antígenos asociados a tumores específicos, por ejemplo, AFP, ALK, proteínas BAGE, b-catenina, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, anhidrasa carbónica IX, caspasa-8, CCR5, CD19, CD20, CD30, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, cielina-Bl, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EpCAM, EphA2, Fra-1, F0LR1, proteínas GAGE (por ejemplo,GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, glipicano-3, GM3, gplOO, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, proteínas MAGE (por ejemplo,MAGE-1, -2, -3, -4, -6, y -12), MART-1, mesotelina, ML-IAP, Mucl, Muc2, Muc3, Muc4, Muc5, MUC16 (CA-125), MU 1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ES01, 0X40, pl5, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLACI, PRLR, PRAME, PSMA (FOLH1), proteínas RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, survivin, TAG-72, TGF-b, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, tirosinasa, y uroplakin-3.

En el contexto de los anticuerpos biespecíficos de la presente invención en los que un brazo del anticuerpo se une a CD3 y el otro brazo se une a un antígeno objetivo, el antígeno objetivo puede ser un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa. Los ejemplos no limitantes de antígenos asociados a una enfermedad infecciosa incluyen, por ejemplo, un antígeno que se expresa en la superficie de una partícula de virus, o que se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un virus, donde el virus se selecciona entre el grupo que consiste en V1H, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus de coxsackie, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis por arbovirus. Alternativamente, el antígeno objetivo puede ser un antígeno que se expresa en la superficie de una bacteria, o que se expresa preferentemente en una célula que está infectada con una bacteria, donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en clamidia, rickettsia, micobacterias , estafilococos, estreptococos, neumococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospira, y bacteria de la enfermedad de Lyme. En ciertas modalidades, el antígeno objetivo es un antígeno que se expresa en la superficie de un hongo, o que se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un hongo, donde el hongo se selecciona del grupo que consiste de Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Crytococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Mucorales (mucor, absidia, rhizopus, etc), Sporothrix schenckii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, e Histoplasma capsulatum. En ciertas modalidades, el antígeno objetivo es un antígeno que se expresa en la superficie de un parásito, o que se expresa preferentemente en una célula que está infectada con un parásito, donde el parásito se selecciona del grupo que consiste en Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambía, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis, Taenia crassiceps, y Brugia alayi. Los ejemplos no limitantes de antígenos asociados a patógenos específicos incluyen, por ejemplo, gpl20 del HIV, CD4 del V1H, glicoproteína L de la hepatitis B, glicoproteína M de la hepatitis B, glicoproteína S de la hepatitis B, El de la hepatitis C, E2 de la hepatitis C, proteína específica de hepatocitos, virus gB del herpes simplex, citomegalovirus gB, y proteína de la envoltura de HTLV.

De acuerdo con ciertos ejemplos de modalidad, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente CD3 y CD20. En el presente documento, a tales moléculas se puede referir como, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-CD20", o "anti-CD3xCD20" o "CD3xCD20", u otra terminología similar.

Tal como se utiliza en este documento, el término "CD20" se refiere a la proteína CD20 humana, a menos que se especifique que se trata de una especie no humana (por ejemplo, "CD20 de ratón", "CD20 de mono", etc.). La proteína CD20 humana tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 1369.

Tal como se utiliza en este documento, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende o que consiste en al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) que sola, o en combinación con una o más CDR y/o regiones marco (FR) adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En ciertas modalidades, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, tal como estos términos se definen en otra parte en este documento.

Tal como se utiliza en este documento, la expresión "molécula de unión a antígeno biespecífica" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. Cada dominio de unión al antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende al menos una CDR que sola, o en combinación con una o más CDR yo FR adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En el contexto de la presente invención, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno (por ejemplo, CD3), y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo antígeno diferente (por ejemplo, CD20).

En ciertos ejemplos de modalidad de la presente invención, la molécula de unión a antígeno biespecífica es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). En el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), las CDR del primer dominio de unión a antígeno se pueden designar con el prefijo "Al" y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno se pueden designar con el prefijo "A2". Por lo tanto, el presente documento se puede referir a las CDR del primer dominio de unión a antígeno como A1-HCDR1, Al- HCDR2, y A1-HCDR3, y el presente documento se puede referir a las CDR del segundo dominio de unión a antígeno como A2-HCDR1, A2-HCDR2, y A2-HCDR3.

El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente el uno al otro para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención. Alternativamente, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar cada uno conectado a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando así una molécula de unión a antígeno biespecífica. Tal como se utiliza en este documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido, o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma o similar estructura o constitución. Por ejemplo, un dominio de multimerización puede ser un polipéptido que comprende un dominio CH3 de inmunoglobulina. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una porción Fe de una inmunoglobulina (que comprende un dominio CH2-CH3), por ejemplo, un dominio Fe de una IgG seleccionada entre los isotipos IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo.

Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención típicamente comprenderán dos dominios de multimerización, por ejemplo, dos dominios Fe que son cada uno de ellos individualmente parte de una cadena pesada de un anticuerpo diferente. El primer y el segundo dominio de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG, tales como, por ejemplo, IgGl/lgGl, IgG2/lgG2, IgG4/lgG4. Alternativamente, el primer y el segundo dominio de multimerización pueden ser de isotipos de IgG diferentes, tales como, por ejemplo, IgGl/IgG2, IgGl/IgG4, IgG2/IgG4, etc.

En ciertas modalidades, el dominio de multimerización es un fragmento Fe o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un residuo de cisteína. En otras formas modalidades, el dominio de multimerización es un residuo de cisteína, o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o que consiste en una cremallera de leucina, un motivo hélice-bucle, o un motivo de bobina en espiral.

Para preparar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención se puede usar cualquier teenología o formato de anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno puede estar funcionalmente enlazado (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Los ejemplos específicos de formatos biespecíficos que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o diacuerpos, fusiones IgG-scFv, Ig de doble dominio variable (DVD), cuadroma, perillas-en-agujeros, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con perillas-en-agujeros, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, cremallera de leucina, Duobody, IgGl/IgG2, IgG de doble acción Fab (DAF), y formatos biespecífíeos Mab2 (ver, por ejemplo, Klein et al . 2012, mAbs 4:6, 1-11, y las referencias allí citadas para una revisión de los formatos mencionados).

En el contexto de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención, los dominios de multimerización, por ejemplo, los dominios Fe, pueden comprender uno o más cambios de aminoácidos (por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones) en comparación con la versión de origen natural y de tipo salvaje del dominio Fe. Por ejemplo, la invención incluye moleculas de unión a antígeno biespecíf icas que comprenden una o más modificaciones en el dominio Fe que se traduce en un dominio Fe modificado que tiene una interacción de unión modificada (por ejemplo, aumentada o disminuida) entre Fe y FcRn. En una modalidad, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una modificación en una región CH2 o a CH3, donde la modificación aumenta la afinidad del dominio Fe por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía desde aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.0. Los ejemplos no limitantes de tales modificaciones de Fe incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F),- 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En una modalidad, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio CH3 y un segundo dominio CH3 de Ig, donde el primer y el segundo dominio CH3 de Ig difieren el uno del otro en al menos un aminoácido, y donde al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una modalidad, el primer dominio CH3 de Ig se une la Proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o suprime la unió a la Proteína A tal como una modificación H95R (según la numeración de exones del IMGT; H435R según la numeración de la UE) . El segundo CH3 también puede comprender una modificación Y96F (según el IMGT; Y436F según la UE). Otras modificaciones que se pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, y V82I (según el IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, y V422I según la UE) en el caso de anticuerpos IgGl; N44S, K52N, y V82I (según el IMGT; N384S, K392N, y V422I según la UE) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, y V82I (según el IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, y V422I según la UE) en el caso de anticuerpos IgG4.

En ciertas modalidades, el dominio Fe puede ser quimérico, combinando secuencias de Fe derivadas de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fe quimérico puede comprender parte o la totalidad de una secuencia CH2 derivada de una región CH2 de una IgGl humana, IgG2 humana o IgG4 humana, y parte o la totalidad de una secuencia CH3 derivada de una IgGl humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fe quimérico también puede contener una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", derivada de una región bisagra de IgGl humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, combinada con una secuencia de "bisagra inferior", derivada de una una región bisagra de una IgGl humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana. Un ejemplo particular de un dominio Fe quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno aquí descritas comprende, del extremo N al extremo C: [CH1 de IgG4] - [bisagra superior de IgG4]-[bisagra inferior de IgG2] [CH2 de IgG4] - [CH3 de IgG4]. Otro ejemplo particular de un dominio Fe quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno aquí descritas comprende, del extremo N al extremo C: [CH1 de IgGl] - [bisagra superior de IgGl] - [bisagra inferior de IgG2] - [CH2 de IgG4] - [CH3 de IgGl]. Estos y otros ejemplos de dominios Fe quiméricos que se pueden incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se describen en la solicitud provisional estadounidense No. 61/759,578, presentada el 1ro de febrero de 2013. Los dominios Fe quiméricos que tienen estas disposiciones estructurales generales, y variantes de los mismos, pueden tener su unión al receptor Fe alterada, lo cual a su vez afecta la función efectora de Fe.

Variantes de las secuencias Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondiente a partir de la cual se derivaron los dominios de unión a antígeno individuales. Tales mutaciones se pueden determinar fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos aquí descritas con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, de bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención pueden comprender dominios de unión a antígeno que se derivan de cualquiera de los ejemplos de secuencias de aminoácidos descritas en este documento, donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR se mutan al/a los residuo(s) correspondiente(s) de la secuencia de la línea germinal de la que se derivó el anticuerpo, o al/a los residuo(s) correspondiente(s) de otra secuencia de la línea germinal humana, o a una sustitución conservadora de aminoácidos del/de los residuo(s) correspondiente(s) de la línea germinal (en este documento, tales cambios de secuencia se denominan colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). A partir de las secuencias, de la región variable de cadena pesada y ligera, descritas en este documento, una persona versada en la téenica puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, todos los residuos de regiones marco y/o CDR dentro de los dominios VH y/o VL se mutan nuevamente a los residuos que se encuentran en la secuencia de la línea germinal original a partir de la cual se derivó originalmente el dominio de unión a antígeno. En otras modalidades, solo ciertos residuos se mutan nuevamente a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, solo los residuos mutados que se encuentran dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o solo los residuos mutados que se encuentran dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras modalidades, uno o más residuos de las regiones marco y/o CDR se mutan al/a los residuo (s) correspondiente(s) de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal diferente de la secuencia de línea germinal a partir de la cual se derivó originalmente el dominio de unión a antígeno). Además, los dominios de unión a antígeno de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal en las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, donde ciertos residuos individuales se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal en particular, mientras que ciertos otros residuos que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o se mutan al residuo correspondiente de una secuencia de línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los dominios de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal se pueden ensayar fácilmente para determinar si tienen una o más propiedades deseadas, tales como una mejor especificidad de unión, un aumento de la afinidad de unión, mejores o mayores propiedades biológicas antagonistas o agonistas (según corresponda), una menor inmunogenicidad, etc. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas obtenidas de esta manera general están comprendidas dentro de la presente invención.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno en las cuales uno o ambos dominios de unión a antígeno comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR, y/o CDR descritas en este documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno que tiene secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR que tienen, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones conservadoras de aminoácidos en relación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR descritas en el presente documento. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambia sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina, e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre: cisterna y metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.

Alternativamente, una sustitución conservadora es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de log- probabilidades PAM250 descrita en Gonnet et al . (1992) Science 256: 1443-1445. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de log-probabilidades PAM250.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno con una secuencia de aminoácidos HCVR, LCVR, y/o CDR que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR, y/o CDR descritas en el presente documento. Cuando se aplica a secuencias de aminoácidos, el término "similitud sustancial" o "sustancialmente similares" significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean óptimamente, como por ejemplo con los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 95% de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos 98% o 99% de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la téenica. Ver, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol.24: 307-331.

La similitud de secuencia para los polipéptidos, que también se conoce como identidad de secuencia, típicamente se mide usando software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas busca secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, entre ellas las sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que se pueden utilizar con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Ver, por ejemplo, GCG Versión 6.1. También se pueden comparar secuencias polipeptídicas usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones que mejor se superponen entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra).

Otro algoritmo preferido para comparar una secuencia de la invención contra una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando los parámetros por defecto. Ver, por ejemplo, Altschul et al . (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al . (1997) Nucleic Acids Res. 3389-402.

Unión dependiente del pH La presente invención incluye anticuerpos anti-CD3, y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, con características de unión dependientes del pH. Por ejemplo, un anticuerpo an i-CD3 de la presente invención pueden presentar una unión a CD3 reducida a pH ácido en comparación con pH neutro. Alternativamente, los anticuerpos anti-CD3 de la invención pueden presentar una unión a CD3 mejorada a pH ácido en comparación con pH neutro. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH de menos de aproximadamente 6.2, por ejemplo, aproximadamente 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, o menos. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.4. La expresión "pH neutro pH" incluye valores de pH de aproximadamente 7 . 0 , 7. 05 , 7 . 1 , 7. 15 , 7.2 , 7.25 , 7 .3 , 7 .35 , y 7.4.

En ciertos casos, una "unión reducida... a pH ácido en comparación con pH neutro" se expresa en términos de una relación entre el valor KD del anticuerpo que se une a su antígeno a pH ácido y el valor KD del anticuerpo que se une a su antígeno a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, para los propósitos de la presente invención se puede considerar que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo exhibe "unión reducida a CD3 a pH ácido en comparación con pH neutro" si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo exhibe una relación KD ácido/neutro de aproximadamente 3.0 o mayor. En ciertos ejemplos de modalidad, la relación KD ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención puede ser de aproximadamente 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 o mayor.

Los anticuerpos con características de unión dependientes del pH se pueden obtener, por ejemplo, mediante la exploración de una población de anticuerpos en busca de anticuerpos con unión reducida (o mejorada) a un antígeno en particular a pH ácido en comparación con pH neutro. Además, las modificaciones del dominio de unión a antígeno a nivel de los aminoácidos pueden producir anticuerpos con características dependientes del pH. Por ejemplo, sustituyendo uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, dentro de una CDR) con un residuo de histidina, se puede obtener un anticuerpo con unión a antígeno reducida a pH ácido en comparación con pH neutro.

Anticuerpos que comprenden variantes de Fe De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-CD3, y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, que comprenden un dominio Fe que comprende una o más mutaciones que mejoran o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido, en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que comprenden una mutación en la región CH2 o una región CH3 del dominio Fe, donde la mutación aumenta la afinidad del dominio Fe por FcRn en un ambiente ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.0. Tales mutaciones pueden dar lugar a un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se lo administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de tales modificaciones de Fe incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En una modalidad, la modificación comprende una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433K (por ejemplo, H433K) y 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T, y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-CD3, y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, que comprenden un dominio Fe que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E),- 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las anteriores mutaciones en el dominio Fe, y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos descritos en este documento, están contempladas dentro del alcance de la presente invención.

Características biológicas de los anticuerpos y las moléculas de unión a antigeno biespecificas La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano e inducen la proliferación de células T. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-CD3 que inducen la proliferación de células T humanas con un valor de EC5o de menos de aproximadamente 0.33 pM, según se mide mediante un ensayo de proliferación de células T in vi tro, por ejemplo, usando el formato de ensayo definido en el Ejemplo 4 de este documento (por ejemplo, evaluando la proliferación de células Jurkat o PBMC humanas en presencia de anticuerpos anti-CD3), o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inducen la proliferación de células T humanas (por ejemplo, la proliferación de células Jurkat y/o la proliferación de PBMC) con un valor de EC50 de menos de aproximadamente 0.32 pM, menos de aproximadamente 0.31 pM, menos de aproximadamente 0.30 pM, menos de aproximadamente 0.28 pM, menos de aproximadamente 0.26 pM, menos de aproximadamente 0.24 pM, menos de aproximadamente 0.22 pM, o menos de aproximadamente 0.20 pM, según se mide mediante un ensayo de proliferación de células T in vi tro, por ejemplo, utilizando el formato de ensayo definido en el Ejemplo 4 de este documento, o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano e inducen la muerte de células tumorales mediada por células T. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-CD3 que inducen la muerte de células tumorales mediada por células T con un valor de EC50 de menos de aproximadamente 2.3 pM, según se mide mediante un ensayo de muerte de células tumorales mediada por células T in vi tro, por ejemplo, usando el formato de ensayo definido en el Ejemplo 6 de este documento (por ejemplo, evaluando el grado de muerte de células tumorales U937 por PBMC humanas en presencia de anticuerpos anti-CD3), o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inducen la muerte de células tumorales mediada por células T (por ejemplo, la muerte mediada por PBMC de células U937) con un valor de EC50 de menos de aproximadamente 2.3 pM, menos de aproximadamente 2.2 pM, menos de aproximadamente 2.1 pM, menos de aproximadamente 2.0 pM, menos de aproximadamente 1.8 pM, menos de aproximadamente 1.6 pM, menos de aproximadamente 1.4 pM, menos de aproximadamente 1.2 pM, menos de aproximadamente 1.0 pM, menos de aproximadamente 0.8 pM, menos de aproximadamente 0.6 pM, o menos de aproximadamente 0.5 pM, según se mide mediante un ensayo de muerte de células tumorales mediada por células T in vi tro, por ejemplo, utilizando el formato de ensayo definido en el Ejemplo 6 de este documento, o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con alta afinidad. La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con afinidad media o baja, dependiendo del contexto terapéutico y las propiedades de direccionamiento particulares que se deseen. Por ejemplo, en el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica en la cual un brazo se une a CD3 y otro brazo se une a un antígeno objetivo (por ejemplo, CD20), puede ser deseable que el brazo de unión al antígeno objetivo se una al antígeno objetivo con alta afinidad, mientras que el brazo anti-CD3 se une a CD3 con una afinidad apenas moderada o baja. De esta manera, el direccionamiento preferencial de la molécula de unión a antígeno hacia las células que expresan el antígeno objetivo se puede lograr evitando a la vez la unión general/no direccionada a CD3 y los consiguientes efectos secundarios adversos asociados con la misma.

De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a CD3 humano (por ejemplo, a 25°C) con una KD de menos de aproximadamente 15 nM, medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo definido en el Ejemplo 3 de este documento. En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen a CD3 con una KD de menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 800 pM, menos de aproximadamente 600 pM, menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 400 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 200 pM, menos de aproximadamente 180 pM, menos de aproximadamente 160 pM, menos de aproximadamente 140 pM, menos de aproximadamente 120 pM, menos de aproximadamente 100 pM, menos de aproximadamente 80 pM, menos de aproximadamente 60 pM, menos de aproximadamente 40 pM, menos de aproximadamente 20 pM, o menos de aproximadamente 10 pM, medida mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo definido en el Ejemplo 3 de este documento (por ejemplo, formato de captura de anticuerpo monoclonal o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 con una semivida disociativa (t½) de más de aproximadamente 10 minutos medida mediante resonancia de plasmón superficial a 25°C o 37°C, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo definido en el Ejemplo 3 en este documento, o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen a CD3 con una t¾ de más de aproximadamente 20 minutos, más de aproximadamente 30 minutos, más de aproximadamente 4 0 minutos, más de aproximadamente 50 minutos, más de aproximadamente 60 minutos, más de aproximadamente 70 minutos, más de aproximadamente 80 minutos, más de aproximadamente 90 minutos, más de aproximadamente 100 minutos, más de aproximadamente 200 minutos, más de aproximadamente 300 minutos, más de aproximadamente 400 minutos, más de aproximadamente 500 minutos, mayores de aproximadamente 600 minutos, más de aproximadamente 700 minutos, más de aproximadamente 800 minutos, más de aproximadamente 900 minutos, más de aproximadamente 1000 minutos, o más de aproximadamente 1200 minutos, medida mediante resonancia de plasmón superficial a 25°C o 37°C, por ejemplo, utilizando un formato de ensayo definido en el Ejemplo 3 de este documento (por ejemplo, formato de captura de anticuerpo monoclonal o captura de antígeno), o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecífíeos) que son capaces de unirse simultáneamente a CD3 humana y CD20 humana. De acuerdo con ciertas modalidades, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención interactúan específicamente con las células que expresan CD3 y/o CD20. La medida en que una molécula de unión a antígeno biespecífica se une a las células que expresan CD3 y/o CD20 se puede evaluar mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), tal como se ilustra en el Ejemplo 8 de este documento. Por ejemplo, la presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a líneas de células T humanas que expresan CD3 pero no CD20 (por ejemplo, Jurkat), líneas de células B humanas que expresan CD20 pero no CD3 (por ejemplo, Raji), y/o células T de primate (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica de cynomolgus [PBMC]). La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a cualquiera de las células y líneas celulares mencionadas anteriormente con un valor de EC50 de aproximadamente 9.0xl06 a aproximadamente 2.0xl09, o menos, determinada utilizando un ensayo de FACS como se indica en el Ejemplo 8 o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno bioespecíficas CD3/anti-CD20 que unen a las células T humanas que expresan CD3 (por ejemplo, Jurkat) con un valor EC50 de entre 1.0 Pm y 1000 nM. En ciertas modalidades, las moléculas de unión a antígeno bioespecíficas anti CD3/anti-CD20 se unen a las céluas T humanas que expresan CD3 con un valor EC50 de entre 1 Nm y 60 nM. Por ejemplo, la presente invención incluye las moléculas de unión a antígeno bioéspecifico anti-CD3/anti-CD20 que se une a las células T humanas que expresan CD3 (por ejemplo, Jurkat) con un valor EC50 de aproximadamente 1 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 20 nM, aproximadamente 40 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 60 nM, aproximadamente 70 nM, aproximadamente 80 nM, aproximadamente 90 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 1000 nM o más.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 que exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inducir la proliferación de PBMC in vitro (ver, por ejemplo, el Ejemplo 9 del presente documento); (b) activar células T, inducir la liberación de IFN-gamma y la regulación hacia arriba de CD25 en sangre humana entera (ver, por ejemplo, el Ejemplo 10 del presente documento); (c) inducir citotoxicidad mediada por células T en líneas celulares resistentes a anti-CD20 (ver, por ejemplo, el Ejemplo 11 del presente documento); (d) inducir citotoxicidad a células B humanas (por ejemplo, Raji; ver, por ejemplo, el Ejemplo 13 del presente documento); (e) disminuir las células B (por ejemplo, las células B CD19+) en ratones reconstituidos con células inmunes humanas (ver, por ejemplo, el Ejemplo 14 del presente documento); y (f) disminuir el volumen de los tumores de células B (por ejemplo, el volumen de los tumores Raji) en xenoinjertos de ratón (ver, por ejemplo, el Ejemplo 15) .

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 que son capaces de mermar las células B en un sujeto (ver, por ejemplo, el Ejemplo 16). Por ejemplo, de acuerdo con ciertas modalidades, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20, donde una sola administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica a un sujeto (por ejemplo, en una dosis de aproximadamente 0.1 mg/kg, aproximadamente 0.08 mg/kg, aproximadamente 0.06 mg/kg aproximadamente 0.04 mg/kg, aproximadamente 0.04 mg/kg, aproximadamente 0.02 mg/kg, aproximadamente 0.01 mg/kg, o menos) provoca una reducción del número de células B en el sujeto (por ejemplo, en una muestra de sangre tomada del sujeto) por debajo de los niveles detectables. En ciertas modalidades, una única administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20 en una dosis de aproximadamente 0.1 mg/kg provoca una reducción del número de células B en el sujeto por debajo de los niveles detectables aproximadamente 7 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 2 días, o aproximadamente 1 días después de administrar la molécula de unión a antígeno bispecifica al sujeto. De acuerdo con ciertas modalidades, una única administración de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20 de la invención, en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg, hace que el número de células B permanezca por debajo de los niveles detectables hasta al menos 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días o más, después de la administración. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "por debajo de los niveles detectables" significa que no se pueden detectar células B directa o indirectamente en una muestra de sangre extraída de un sujeto usando ensayos estándares de detección de células B, por ejemplo, un ensayo de FACS para marcadores de células B, como se indica en el Ejemplo 16 de este documento.

En modalidades relacionadas, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20, donde el número de células B por microlitro de sangre extraída de un sujeto desde aproximadamente el primer día hasta aproximadamente el día 28 después de administrar al sujeto una dosis única de aproximadamente 0.01 mg/kg de la molécula de unión a antígeno es menor que el 25% del número de células B por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración. En ciertas otras modalidades, se proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20, donde el número de células B por microlitro de sangre extraída de un sujeto aproximadamente el primer día hasta aproximadamente el día 56 después de administrar al sujeto una dosis única de aproximadamente 0.01 mg/kg de la molécula de unión a antígeno es menor que el 50% del número de células B por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración.

La presente invención también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 que, al ser administradas a un sujeto, no provocan más que una disminución transitoria de las células T. Por ejemplo, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 que, al ser administradas a un sujeto en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg hacen que el número de células T disminuya el día 1 después de la administración, pero donde el número de células T por microlitro de sangre rebota en puntos de tiempo posteriores (por ejemplo, aproximadamente el día 2, el día 7, el día 14, el día 28, el día 42, el día 56 o más tarde después de la administración).

Por ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20, donde el número de células T por microlitro de sangre extraída del sujeto entre aproximadamente el día 14 y aproximadamente el día 56 después de administrar al sujeto la molécula de unión a antígeno en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg es mayor o igual que el número de células T por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de administrar la molécula de unión a antígeno biespecífica.

Mapeo de epítopos y teenologías relacionadas El epítopo de CD3 al que se unen las moléculas de unión a antígeno de la presente invención puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína CD3. Alternativamente, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) de CD3 no contiguos. Los anticuerpos de la invención pueden interactuar con aminoácidos contenidos en una única cadena de CD3 (por ejemplo, CD3-épsilon, CD3-delta o CD3-gamma), o pueden interactuar con aminoácidos en dos o más cadenas de CD3 diferentes. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocido como un paratopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas de un antígeno y pueden tener efectos biológicos diferentes. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional es producido por aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal yuxtapuestos espacialmente. Un epítopo lineal es un epítopo producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir grupos funcionales de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

Se pueden utilizar diferentes téenicas conocidas por los expertos en la técnica para determinar si un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o una proteína Los ejemplos de estas técnicas incluyen, por ejemplo, un ensayo de bloqueo cruzado de rutina como el que se describe en Antibodies, Harlow y Lañe (Coid Spring Harbor Press, Coid Spring Harb., NY), análisis mutacional de escaneo de alanina, análisis de blot de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), y análisis de escisión de péptidos. Además, se pueden emplear métodos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de los antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que se puede utilizar para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el cual interactúa un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica marcar con deuterio la proteína deseada, seguido por la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua para permitir que se produzca el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los residuos excepto en los residuos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína objetivo se somete a escisión de la proteasa y a un análisis por espectrometría de masas, revelando así los residuos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Ver, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal . Chem . 73 : 256A-265A. Para mapear los epítopos también se puede utilizar cristalografía de rayos X del complejo antígeno/anticuerpo.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-CD3 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los ejemplos de anticuerpos específicos descritos en este documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla 1 de este documento) . Además, la presente invención también incluye anticuerpos anti-CD3 que compiten por unirse a CD3 con cualquiera de los ejemplos de anticuerpos específicos descritos en este documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos indicadas en la Tabla 1 de este documento).

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano, donde el primer dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD3 que cualquiera de los ejemplos específicos de dominios de unión a antígeno específicos para CD3 descritos en este documento, y/o donde el segundo dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD20 que cualquiera de los ejemplos específicos de dominios de unión a antígeno específicos para CD20 descritos en este documento.

La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano, donde el primer dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD3 que cualquiera de los ejemplos de dominios de unión a antígeno específicos para CD3 descritos en este documento, y/o donde el segundo dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD20 que cualquiera de los ejemplos de dominios de unión a antígeno específicos para CD20 descritos en este documento.

Se puede determinar fácilmente si una molécula de unión a antígeno particular (por ejemplo, un anticuerpo) o un dominio de unión a antígeno de la misma se une al mismo epítopo que, o compite por unirse a, una molécula de unión a antígeno de referencia de la presente invención utilizando métodos de rutina conocidos en la téenica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo en CD3 (o CD20) que una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención, primero se permite que la molécula biespecífica de referencia se una a una proteína CD3 (o CD20). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula de CD3 (o CD20). Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a CD3 (o CD20) luego de su unión hasta la saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, se puede concluir que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo de CD3 (o CD20) diferente que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la molécula de CD3 (o CD20) luego de su unión hasta la saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, entonces puede que el anticuerpo de ensayo se una al mismo epítopo de CD3 (o CD20) que el epítopo al cual se une la molécula de unión a antígeno biespecífica de la invención de referencia. Luego se pueden realizar experimentos de rutina adicionales (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión del anticuerpo de ensayo observada realmente se debe a la unión al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia o si la falta de unión observada se debe a un bloqueo estérico (o a otro fenómeno). Se pueden realizar experimentos de este tipo utilizando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la téenica. De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo (o a epítopos superpuestos) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de una proteína de unión a antígeno inhibe la unión del otro por lo menos un 50%, pero preferentemente un 75%, un 90% o incluso un 99%, medida en un ensayo de unión competitiva (ver, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, se considera que dos dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reducen o eliminan la unión de la otra. Se considera que dos proteínas de unión a antígeno tienen "epítopos superpuestos" si solamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reducen o eliminan la unión de la otra.

Para determinar si un anticuerpo o un dominio de unión a antígeno del mismo compite por la unión con una molécula de unión a antígeno de referencia, la metodología de unión anteriormente descrita se lleva a cabo en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que la molécula de unión a antígeno de referencia se una a una proteína CD3 (o CD20) en condiciones saturantes y luego se evalúa la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de CD3 (o CD20). En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de CD3 (o CD20) en condiciones saturantes y luego se evalúa la unión de la molécula de unión a antígeno de referencia a la molécula de CD3 (o CD20). Si en ambas orientaciones solo la primera molécula de unión a antígeno (saturante) es capaz de unirse a la molécula de CD3 (o CD20), se concluye que el anticuerpo de ensayo y la molécula de unión a antígeno de referencia compiten por la unión a CD3 (o CD20). Como podrán apreciar los expertos en la téenica, un anticuerpo que compite por la unión con una molécula de unión a antígeno de referencia puede no necesariamente unirse al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear esféricamente la unión del anticuerpo de referencia al unir un epítopo superpuesto o adyacente.

Preparación de dominios de unión a antigeno y construcción de moléculas biespecificas Se pueden preparar dominios de unión a antígeno específicos para antígenos particulares usando cualquier teenología de generación de anticuerpos conocido en la técnica Una vez obtenidos, dos dominios de unión a antígeno diferentes, específicos para dos antígenos diferentes (por ejemplo, CD3 y CD20), se pueden disponer adecuadamente uno con relación al otro de manera de producir una molécula de unión a antígeno biespecifica de la presente invención usando métodos de rutina. (En otra parte de este documento se proporciona una discusión de ejemplos de formatos de anticuerpos biespecificos que se pueden utilizar para construir las moléculas de unión a antígeno biespecificas de la presente invención). En ciertas modalidades, uno o más de los componentes individuales (por ejemplo, las cadenas pesadas y ligeras) de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la invención se derivan a partir de anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Los métodos para preparar tales anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras de las moléculas de unión a antígeno biespecificas de la presente invención se pueden preparar usando la teenología VELOCIMMUNE™. Usando la tecnología de VELOCIMMUNE™ (o cualquier otra tecnología para la generación de anticuerpos humanos), inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de elevada afinidad por un antígeno particular (por ejemplo, CD3 o CD20) que tiene una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan según sus características deseables, incluyendo su afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se sustituyen por una región constante humana deseada para generar cadenas pesadas y/o ligeras totalmente humanas que se puedan incorporar en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención.

Los animales genéticamente modificados se pueden usar para hacer moléculas de unión a antígeno biespecíficas humanas. Por ejemplo, se puede utilizar un ratón modificado genéticamente que es incapaz de reordenar y expresar una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina de ratón endógena, donde el ratón expresa solo uno o dos dominios variables de cadena ligera humana codificados por secuencias de inmunoglobulina humana unidos de manera operativa al gen constante kappa de ratón en el locus kappa de ratón endógeno. Tales ratones modificados genéticamente se pueden utilizar para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprenden dos cadenas pesadas diferentes que se asocian con una cadena ligera idéntica que comprende un dominio variable derivado de uno de dos segmentos de gen de región variable de cadena ligera humana diferentes. (Ver, por ejemplo, US 2011/0195454 para una discusión detallada de estos ratones modificados genéticamente y el uso de los mismos para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas).

Bioequivalentes La presente invención abarca moléculas de unión a antígeno que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto de las de los ejemplos de moléculas descritos en este documento pero que mantienen la capacidad de unirse a CD3 y/o CD20. Tales moléculas variantes pueden comprender una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia madre, pero exhiben una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de las moléculas de unión antígeno biespecíficas descritas.

La presente invención incluye moléculas de unión a antígeno que son bioequivalentes a cualquiera de los ejemplos de moléculas de unión a antígeno descritas en este documento. Dos proteínas, o anticuerpos, de unión a antígeno se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran en la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en dosis únicas o en dosis múltiples. Algunas proteínas de unión a antígeno se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en cuanto a su absorción aunque no en cuanto a su tasa de absorción; tales proteínas pueden ser consideradas bioequivalentes debido a que dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionales y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para lograr concentraciones eficaces del fármaco en el cuerpo, por ejemplo, con un uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el fármaco particular estudiado.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en cuanto a su seguridad, pureza, y potencia.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, entre ellos un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o una eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin tales cambios.

En una modalidad, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por uno o más mecanismos de acción comunes para la condición o condiciones de uso, en la medida en que se conocen tales mecanismos.

La bioequivalencia se puede demostrar mediante métodos in vivo e in vi tro . Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, donde se mida la concentración del anticuerpo o de sus metabolitos en la sangre, el plasma, el suero u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) un ensayo in vi tro que se haya correlacionado y que sea razonablemente predictivo de los datos de biodisponibilidad in vivo en humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos donde se mida el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su objetivo) en función del tiempo, y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establezca la seguridad, eficacia, biodisponibilidad o bioequivalencia de una proteína de unión a antígeno.

Las variantes bioequivalentes de los ejemplos de moléculas de unión antígeno biespecíficas de la invención se pueden construir, por ejemplo, realizando diferentes sustituciones de residuos o secuencias o eliminando residuos o secuencias terminales o internos que no son necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica se pueden eliminar o reemplazar por otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos durante la renaturalización. En otros contextos, las proteínas de unión a antígeno bioequivalentes pueden incluir variantes de los ejemplos de moléculas de unión a antígeno biespecíficas aquí descritas que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glicosilación de las moléculas, por ejemplo, mutaciones que eliminan la glicosilación.

Selectividad de especies y reactividad cruzada entre diferentes especies Alfiero De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano pero no a CD3 de otras especies. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD20 humano pero no a CD20 de otras especies. La presente invención también incluye moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y a CD3 de una o más especies no humanas, y/o moléculas de unión a antígeno que se unen a CD20 humano y a CD20 de una o más especies no humanas.

De acuerdo con ciertos ejemplos de modalidad de la invención, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y/o a CD20 humano y que pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más CD3 y/o CD20 de ratón, rata, cobayo, hámster, gerbillo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, cynomolgus, tití, mono Rhesus o chimpancé. Por ejemplo, en un ejemplo de modalidad particular de la presente invención se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 humano y a CD3 de cynomolgus, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano.

Inmunoconjugados La presente invención abarca moléculas de unión a antígeno conjugadas con un grupo terapéutico ("inmunoconjugado "), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos adecuados para la formación de inmunoconjugados son conocidos en la téenica ver, por ejemplo, WO 05/103081).

Formulación y administración terapéutica La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno de la presente invención. Las composiciones f rmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes, y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, suministro, tolerancia, y similares. En el vademécum conocido por todos los químicos farmacéuticos se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicas o aniónicas) (tales como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos, y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Ver también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations " PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

La dosis de molécula de unión a antígeno administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y del tamaño del paciente, de la enfermedad objetivo, de las condiciones, de la vía de administración, y similares. La dosis preferida típicamente se calcula de acuerdo con el peso corporal o el área de superficie corporal. Cuando se utiliza una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención para fines terapéuticos en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa la molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente invención normalmente a una dosis única de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la condición, se pueden ajustar la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosis eficaces y programas de administración de una molécula de unión a antígeno biespecífica se pueden determinar empíricamente; por ejemplo, se puede monitorear el progreso del paciente mediante evaluaciones periódicas y la dosis se puede ajustar en consecuencia. Por otra parte, se pueden proyectar las dosis de una especie a otra utilizando métodos bien conocidos en la téenica (por ejemplo, Mordenti et al . , 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

Se conocen diferentes sistemas de entrega que se pueden usar para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (ver, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición se puede administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y se puede administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención se puede suministrar por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa estándares. Además, con respecto a la administración subcutánea, para suministrar una composición farmacéutica de la presente invención se puede utilizar fácilmente un dispositivo de administración tipo bolígrafo. Tal dispositivo de administración tipo bolígrafo puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración tipo bolígrafo reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que toda la composición farmacéutica contenida en el cartucho ha sido administrada y el cartucho está vacío, el cartucho vacío se puede desechar fácilmente y sustituir por un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración tipo bolígrafo puede entonces ser reutilizado. En un dispositivo de administración tipo bolígrafo desechable no hay ningún cartucho reemplazable, sino que el dispositivo de administración tipo bolígrafo desechable viene previamente llenado con la composición farmacéutica en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de composición farmacéutica, todo el dispositivo se desecha.

Existen numerosos dispositivos de administración tipo bolígrafo y autoinyectores reutilizables que se pueden utilizar en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los bolígrafos AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), HUMALOG MIX 75/25™, HUMALOG™, HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración tipo bolígrafo desechables que se pueden usar en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los bolígrafos SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), y KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA) , el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dcy, L.P.), y el HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En ciertas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede utilizar una bomba (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201). En otra modalidad, se pueden utilizar materiales poliméricos; ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres, Boca Ratón, Florida. En aún otra modalidad, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad de la objetivo de la composición, con lo cual se requiere apenas una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp.115-138). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para administración intravenosa, subcutánea, intracutánea e intramuscular, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables se pueden preparar por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables se pueden preparar, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descritos anteriormente en un medio acuoso estéril o en un medio oleoso convencionalmente utilizado para preparar inyectables. Como medio acuoso para las inyecciones existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que se pueden utilizar en combinación con un agente solubilizante adecuado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensoactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 moles) de aceite de ricino hidrogenado], etc. Como medio oleoso se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que se pueden utilizar en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se llena preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada en la que quepa una dosis de los ingredientes activos. Tales formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo antes mencionado que contienen es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; se prefiere especialmente que las inyecciones contengan de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg del anticuerpo antes mencionado y que las demás formas de dosificación contengan de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg.

Usos terapéuticos de las moléculas de unión a antigeno La presente invención incluye métodos que comprenden administrar a un sujeto que la necesite una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-CD3 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD3 y a un antígeno objetivo (por ejemplo, CD20). La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas tal como se describen en el presente documento y un vehículo o diluyente f rmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "un sujeto que lo necesite" significa un animal humano o no humano que exhibe uno o más síntomas o signos de cáncer (por ejemplo, un sujeto que expresa un tumor o que sufre de cualquiera de los cánceres mencionados a continuación en este documento), o que de otra manera se beneficiaría de una inhibición o reducción de la actividad de CD20 o un agotamiento de las células B CD20+.

Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención (y las composiciones terapéuticas que los comprenden) son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno en el que la estimulación, activación y/u orientación de una respuesta inmunitaria sería beneficioso. En particular, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-CD20 de la presente invención se pueden usar para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con o mediado por la expresión o actividad de CD20 o la proliferación de células B CD20 +. El mecanismo de acción por el que se logran los métodos terapéuticos de la invención incluyen la muerte de las células que expresan CD20 en presencia de células efectoras, por ejemplo, por CDC, apoptosis, ADCC, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos. Las células que expresan CD20 que se pueden inhibir o matar usando las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención incluyen, por ejemplo, las células B tumorigénicas.

Las moléculas de unión a antígeno de la presente invención se pueden usar para tratar, por ejemplo, tumores primarios y/o metastásicos que surgen en el cerebro y las meninges, la orofaringe, los pulmones y el árbol bronquial, el tracto gastrointestinal, el tracto reproductivo masculino y femenino, los músculos, los huesos, la piel y los apéndices, el tejido conectivo, el bazo, el sistema inmunitario, las células que forman la sangre y la médula ósea, el hígado y el tracto urinario, y órganos especiales de los sentidos tales como el ojo. En ciertas modalidades, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención se utilizan para tratar uno o más de los siguientes tipos de cáncer: carcinoma de células renales, carcinoma de páncreas, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, cáncer gástrico (por ejemplo, cáncer gástrico con amplificación MET), mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides, o melanoma. De acuerdo con ciertos ejemplos de modalidad, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención se utilizan para tratar un cáncer de células B (por ejemplo, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin [NHL], leucemia/linforna linfoblástico de células B precursoras, neoplasmas de células B maduras, leucemia linfocítica crónica de células B/ linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células de manto, linfoma folicular, linfoma cutáneo del centro folicular, linfoma de células B de zona marginal, leucemia de células peludas, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, plasmocitoma , mieloma de células plasmáticas, trastorno linfoproliferativo postrasplante, macroglobulinemia de Waldenstrom, y linfoma anaplásico de células grandes).

De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, las moléculas de unión a antígeno son útiles para el tratamiento de un paciente que padece de un linfoma de células B (por ejemplo, linfoma no hodgkin) que es resistente, o que responde de forma incompleta, a la terapia anti-CD20 por sí sola (por ejemplo, resistente a la terapia con rituximab). De acuerdo con otras modalidades relacionads de la invención, los métodos son proporcionados comprendiendo la administración de una molécula de unión a antígeno bioespecífica anti-CD3/anti-CD20 como se divulga en la presente a un paciente quien sufre de linfoma de la célula B (por ejemplo: NHL) que es refractoria a la terapia anti-CD20 (por ejemplo: un paciente con un tumor refractario a la terapia CD20 (por ejemplo, un paciente con un tumor refractario al rituximab o con linfoma de célula B refractario o reincidido). Los métodos analítico/diagnósitico conocidos en la téenica, tales como el escaneo del tumor, etc., puede ser utilizado para determinar si un paciente alberga como tumor que es resistente a, incompletamente sensible a, o refractario solo a la terapia anti-CD20.

La presente invención también incluye métodos para el tratamiento de cáncer residual en un sujeto. Tal como se utiliza en este documento, el término "cáncer residual" significa la existencia o la persistencia de una o más células cancerosas en un sujeto después de su tratamiento con una terapia anticáncer.

De acuerdo con ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión de CD20 (por ejemplo, linfoma de células B) que comprende la administración de una o más de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas en otra parte en este documento a un sujeto después de que el sujeto ha recibido una monoterapia anti-CD20 (por ejemplo, después de la administración de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-CD20 tal como rituximab). Por ejemplo, la presente invención incluye métodos para el tratamiento de linfoma de células B que comprende administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-CD20 a un paciente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 1 año, o más después de que el sujeto ha recibido una monoterapia anti-CD20 (por ejemplo, tratamiento con rituximab o un tratamiento equivalente). En otros aspectos, una molécula de unión a antígeno biespecífico de la invención (una molécula de unión a antígeno biespecífico anti-CD3/anti-CD20) que comprende un dominio Fe de IgG4 se administra inicialmente a un sujeto en uno o más puntos de tiempo (por ejemplo, para proporcionar agotamiento robusto inicial de células B), seguido de la administración de una molécula de unión a antígeno del biespecífico equivalente que comprende un dominio diferente IgG, tal como un dominio Fe de la IgGl, en puntos de tiempo posteriores.

Terapias de combinación y formulaciones La presente invención proporciona métodos que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ejemplos de anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas aquí descritos en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales que se pueden combinar con o administrar en combinación con una molécula de unión a antígeno de la presente invención incluyen, por ejemplo, un antagonista de EGFR (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia de EGFR tales como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ErbB2, anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o un inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvIII (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvIII), un antagonista de cMET (por ejemplo, un anticuerpo anti-cMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGFIR), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de PDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-b (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-b), un antagonista de VEGF (por ejemplo, un VEGF-Trap, ver, por ejemplo, US 7,087,411 (en este documento también denominado "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor quinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib), un antagonista de DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 divulgado en US 2009/0142354 tal como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 divulgado en US 2011/0027286 tal como H1H685P), un antagonista de a FOLH1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-FOLHl), un antagonista de PRLR (por ejemplo, un anticuerpo anti-PRLR), un antagonista de STEAP1 o STEAP2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-STEAPl o un anticuerpo anti-STEAP2), un antagonista de TMPRSS2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-TMPRSS2) , un antagonista de MSLN (por ejemplo, un anticuerpo anti-MSLN), un antagonista de CA9 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CA9), un antagonista de uroplakin (por ejemplo, un anticuerpo anti-uroplakin), un antagonista de CD20 monovalente (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD20 monovalente tal como rituxi ab), etc. Otros agentes que se pueden administrar beneficiosamente en combinación con las moléculas de unión a antígeno de la invención incluyen los inhibidores de citocinas, incluyendo los inhibidores de citocinas de molécula pequeña y los anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, o a sus respectivos receptores. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula biespecífica de unión a antígeno anti-CD3/anti-CD20, como se describe en el presente documento) también pueden administrarse como parte de un régimen terapéutico que comprende una o más combinaciones terapéuticas seleccionadas de "ICE": ifosfamida (por ejemplo, Ifex®), carboplatino (por ejemplo, Paraplatin®), etopósido (por ejemplo, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": dexametasona (por ejemplo, Decadron®) , citarabina (por ejemplo, Cytosar-U®, citarabina, ara-C), cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ); y "ESHAP": etopósido (por ejemplo, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednisolona (por ejemplo, Medrol®), altas dosis de citarabina, cisplatino (por ejemplo, Platinol®-AQ).

La presente invención también incluye combinaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno mencionadas en este documento y un inhibidor de una o más entre VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-b, F0LH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplakin, o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, donde el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, un ribozima, un ARNsi, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento scFv, fragmento dAb, u otras moléculas de ingeniería, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Las moléculas de unión a antígeno de la invención también se pueden administrar y/o coformular en combinación con antivirales, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o antinflamatorios no esteroideos (AINE). Las moléculas de unión a antígeno de la invención también se pueden administrar como parte de un régimen de tratamiento que también incluye tratamiento de radiación y/o quimioterapia convencional.

El o los componentes terapéuticamente activos adicionales se pueden administrar justo antes de, simultáneamente con, o poco después de la administración de una molécula de unión a antígeno de la presente invención (para los propósitos de este documento, dichos regímenes de administración se consideran la administración de una molécula de unión a antígeno "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional).

La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que una molécula de unión a antígeno de la presente invención se coformula con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales tal como se describe en otra parte en este documento.

Regímenes de administración De acuerdo con ciertas modalidades de la presente invención, se pueden administrar a un sujeto múltiples dosis de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD20 y CD3) durante un período de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden la administración secuencial a un sujeto de múltiples dosis de una molécula de unión a antígeno de la invención. Tal como se utiliza en este documento, administración secuencial" significa que cada dosis de una molécula de unión a antígeno se administra al sujeto en un punto de tiempo diferente, por ejemplo, en diferentes días separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden la administración secuencial al paciente de una dosis única inicial de una molécula de unión a antígeno, seguida de una o más dosis secundarias de la molécula de unión a antígeno y, opcionalmente, seguida de una o más dosis terciarias de la molécula de unión a antígeno.

Los términos "dosis inicial", "dosis "secundarias" y "dosis terciarias" se refieren a la secuencia temporal de administración de la molécula de unión a antígeno de la invención. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al comienzo del régimen de tratamiento (también conocida como "dosis de referencia"), las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundarias y terciarias y pueden contener todas la misma cantidad de molécula de unión a antígeno, pero por lo general pueden diferir unas de otras en términos de la frecuencia de administración. Sin embargo, en ciertas modalidades la cantidad de molécula de unión a antígeno contenida en las dosis inicial, secundarias y/o terciarias difieren unas de otras (por ejemplo, ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el curso del tratamiento. En ciertas modalidades, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga", seguidas de dosis posteriores que se administran con menor frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

En un ejemplo de modalidad de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo,, 1, 1¾, 2, 2½, 3, 3¾, 4, 4½, 5, 5¾, 6, 6¾, 7, 7¾, 8, 8¾, 9, 9¾, 10, 10¾, 11, 11½, 12, 12¾, 13, 13¾, 14, 14½, 15, 15¾, 16, 16¾, 17, 17¾, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20¾, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½, o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Tal como se utiliza en este documento, la frase "la dosis inmediatamente anterior" significa, en una secuencia de múltiples administraciones, la dosis de molécula de unión a antígeno que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis de la secuencia, sin ninguna dosis intermedia.

Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención pueden comprender administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD20 y CD3). Por ejemplo, en ciertas modalidades, solo se administra una única dosis secundaria al paciente. En otras modalidades, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. Del mismo modo, en ciertas modalidades, solo se administra una única dosis terciaria al paciente. En otras modalidades, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.

En las modalidades que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria se puede administrar con la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria se puede administrar al paciente de 1 a 2 emanas después de la dosis inmediatamente anterior. Del mismo modo, en las modalidades que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria se puede administrar con la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria se puede administrar al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Alternativamente, la frecuencia con la que las dosis secundarias y/o terciarias se administran a un paciente puede variar en el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ser ajustada por un médico durante el curso del tratamiento dependiendo de las necesidades del paciente individual luego de un examen clínico.

Usos de los anticuerpos con fines de diagnóstico Los anticuerpos anti-CD3 de la presente invención también se pueden usar para detectar y/o medir CD3, o células que expresan CD3 en una muestra, por ejemplo, para fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento del la mismo, se puede utilizar para diagnosticar una condición o enfermedad que se caracteriza por la expresión aberrante (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, falta de expresión, etc.) de CD3. Los ejemplos de ensayos de diagnóstico para CD3 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-CD3 de la invención, donde el anticuerpo anti-CD3 se etiqueta con un marcador detectable o una molécula reportera. Alternativamente, se puede utilizar un anticuerpo anti-CD3 no etiquetado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está etiquetado con un marcador detectable. El marcador detectable o molécula reportera puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, o 125I; un grupo fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína, o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano, o luciferasa. Los ejemplos de ensayos específicos que se pueden utilizar para detectar o medir CD3 en una muestra incluyen el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).

Las muestras que se pueden utilizar en los ensayos de diagnóstico de CD3 de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier muestra de tejido o fluido obtenible de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína CD3, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de CD3 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente que no padece una enfermedad o condición asociada con niveles o actividad de CD3 anormales) para establecer inicialmente un nivel de línea de base, o nivel de referencia, de CD3. Luego este nivel de referencia de CD3 se puede comparar con los niveles de CD3 medidos en muestras obtenidas de individuos que se sospecha padecen una enfermedad o condición relacionada con CD3.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos en la téenica una exposición y descripción completas de cómo realizar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, las cantidades, las temperaturas, etc.), no obstante lo cual deben tenerse en cuenta algunas desviaciones y errores experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura se expresa en grados Celsius, y la presión es la presión atmosférica o está próxima a la misma.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos anti-CD3 Se obtuvieron anticuerpos anti-CD3 mediante la inmunización de un ratón VELOCIMMUNE (es decir, un ratón genéticamente modificado que comprende regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de ADN que codifica inmunoglobulina humana) con células que expresan CD3 o con ADN que codifica CD3. La respuesta inmunitaria de los anticuerpos se monitoreó mediante un inmunoensayo específico para CD3. Cuando se logró una respuesta inmunitaria deseada se recogieron esplendocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad y formar las líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se analizan y se seleccionan para identificar líneas celulares que producen anticuerpos específicos para CD3. Usando esta téenica se obtuvieron varios anticuerpos anti-CD3 quiméricos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón). Además, se aislaron varios anticuerpos anti-CD3 completamente humanos directamente a partir de células B positivas para antígeno sin fusión de células de mieloma, como se describe en US 2007/0280945A1.

Ciertas propiedades biológicas de los ejemplos de anticuerpos anti-CD3 generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen detalladamente en los Ejemplos que se exponen a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de regiones variables de cadena pesada y ligera y ácido nucleico La Tabla 1 muestra los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de anticuerpos anti-CD3 de la invención seleccionados. En la Tabla 2 se muestran los correspondientes identificadores de secuencia de ácido nucleico.

Tabla 1: Identificadores de secuencia de aminoácidos Tabla 2: Identificadores de secuencia de ácido nucleico En el presente documento, para referirse a los anticuerpos típicamente se utiliza la siguiente nomenclatura: prefijo Fe (por ejemplo, "H1H, " "H1M, " "H2M, " etc.), seguido por un identificador numérico (por ejemplo, "2712," "2692," etc., como se muestra en la Tabla 1), seguido por un sufijo "P "N, " o "B". Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, en este documento un anticuerpo puede ser denominado, por ejemplo, "H1H2712N, " "H1M2692N, " "H2M2689N, " etc. Los prefijos H1H, H1M y H2M de las denominaciones de los anticuerpos utilizadas en este documento indican el isotipo de la región Fe particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1H" tiene un Fe de IgGl humana, un anticuerpo "H1M" tiene un Fe de IgGl de ratón, y un anticuerpo "H2M" tiene un Fe de IgG2 de ratón (todas las regiones variables son completamente humanas como lo indica la primera 'H' en la denominación de los anticuerpos). Como podrán apreciar los expertos en la téenica, un anticuerpo que tiene un isotipo Fe particular se puede convertir en un anticuerpo con un isotipo Fe diferente (por ejemplo, un anticuerpo con un Fe de IgGl de ratón se puede convertir a un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero, en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR) - que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en la Tabla 1 -seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fe.

Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos En los siguientes experimentos se incluyeron varias construcciones de control (anticuerpos anti-CD3)con fines comparativos: "OKT-3,11 un anticuerpo monoclonal de ratón contra antígenos de superficie de células T humanas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) bajo el número de catálogo CRL-8001; y "SP34,11 un anticuerpo monoclonal de ratón disponible comercialmente que se obtuvo de Biolegend, San Diego, CA (Cat. No. 302914), reactivo contra la cadena épsilon del complejo T3 en las células de linfocitos T humanas.

Ejemplo 3. Afinidades de unión y constantes cinéticas de los anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos derivadas mediante resonancia de plasmón superficial Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial a 25°C utilizando ya sea un formato de captura de anticuerpos (Tablas 3, 5 y 7) o un formato de captura de antígeno (Tablas 4, 6 y 8). Las mediciones se realizaron en un instrumento Biacore T200.

En el formato de captura de anticuerpos, la superficie del sensor Biacore se derivatizó con un Fe anti-ratón de conejo para la captura de hibridoma (anticuerpos de prefijo H1M o H2M) o una superficie de Fe anti-humano de ratón para anticuerpos con el formato de la IgG humana (anticuerpos de prefijo H1H). Se inyectó proteína CD3 heterodomerica soluble (hCD3-épsilon/hCD3-delta; SEQ ID NO:1370/1371) ya sea con una etiqueta Fe humana (hFcAAdp/hFc; SEQ ID NO:1372/1373) o una etiqueta Fe de ratón (mFcAAdp/mFc; SEQ ID NO:1374/1375) sobre la superficie capturada por el anticuerpo y se registró la respuesta de unión. La proteína CD3 heterodimérica se purificó usando el método descrito en Davis et al . (US 2010/0331527).

En el formato de captura de antígeno, se capturó proteína CD3 heterodimérica usando un Fe anti-ratón de conejo o un Fe anti-humano de ratón y los respectivos anticuerpos se inyectaron sobre el antígeno capturado.

Los anticuerpos se analizaron en su formato divalente convencional (Tablas 3 a 6) o en una configuración monovalente de un brazo (Tablas 7 y 8) donde se retiró el segundo Fab del anticuerpo y solo se expresó la porción Fe (CH2-CH3).

Se determinaron las constantes de asociación (ka) y disociación (kd) cinética procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa para ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constante de equilibrio de disociación de la unión (KD) y las semividas disociativas (11/2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética de la siguiente manera: KD (M) = / ka>- Y ti/2 (min) = (ln2/(60*k<a). NT = no ensayado; NB = no se observó unión.

Tabla 3 : Afinidades de unión Biacore de anticuerpos monoclonales de hibridoma (H1M y H2M) Tabla 4 : Afinidades de unión Biacore de anticuerpos monoclonales de hibridoma (H1M y H2M) Tabla 5: Afinidades de unión Biacore de anticuerpos monoclonales de Fe humano (H1M) Tabla 6 : Afinidades de unión Biacore de anticuerpos monoclonales de Fe humano (HlM) Tabla 7 : Afinidades de unión Biacore de anticuerpos monoclonales monovalentes de un brazo Tabla 8 Afinidades de unión Blacore de anticuerpos monoclonales monovalentes de un brazo Como se muestra en las Tablas 3-8, varios anticuerpos anti-CD3 de la presente invención se unen a CD3, ya sea en el formato de captura de anticuerpos o de captura de antígeno, con alta afinidad.

Ejemplo 4. Anticuerpos anti-CD3 se unen a células T humanas e inducen la proliferación de las mismas Se ensayaron anticuerpos anti-CD3 de la presente invención para determinar su capacidad de unirse a las células T humanas e inducir su proliferación. La unión se evaluó utilizando células Jurkat (una línea de células T CD3+ humanas), mientras que la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se evaluó utilizando cuantificación catalizada con ATP (CellTiter Glo ®). El anticuerpo anti-CD3 0KT3 actuó como un control positivo y los anticuerpos de isotipo irrelevantes sirvieron como controles negativos.

Los datos de la FACS se adquirieron aplicando el siguiente protocolo: Se incubaron 2xl05 células por pocilio con diluciones seriadas de anticuerpos durante 30 minutos en hielo. Luego de la incubación, las células se lavaron, se añadió anticuerpo secundario y se incubó durante 30 minutos adicionales. Después de la incubación, las células se lavaron, se suspendieron nuevamente en PBS frío que contenía 1% de BSA y se analizaron por citometría de flujo con células Jurkat viables encerradas por dispersiones laterales y hacia adelante. Los valores de EC50 para la titulación de la unión celular se determinaron usando software de Prism con valores calculados utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.

Los datos de la proliferación se adquirieron aplicando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC humanas (5xl04 / por pocilio) con una dilución seriada 3 veces de anticuerpo anti-CD3 y una concentración fija de un anticuerpo anti-CD28 comercial (200ng/ml) en placas de 96 pocilios durante 72 horas a 37°C. Luego de la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia usando un lector de placas de múltiples etiquetas VICTOR X5 (PerkinElmer). La EC5o de la viabilidad celular (cuantificación catalizada con ATP) se calculó usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.

Los resultados de los experimentos de unión y proliferación se resumen en las Tablas 9-11.

Tabla 9: Anticuerpos monoclonales anti-CD3 de hibridoma se unen a células T humanas e inducen la proliferación de las mismas NB: No hay unión; NT: No ensayado.

Tabla 10: Anticuerpos monoclonales anti-CD3 de Fe humano se unen a celulas T humanas e inducen la proliferación de las mismas NB: No hay unión; NT: No ensayado Tabla 11: Anticuerpos monoclonales anti-CD3 monovalentes de un brazo se unen a células T humanas e inducen la proliferación de las mismas NB: No hay unión; NT: No ensayado Como se muestra en las Tablas 7-9, la gran mayoría de los anticuerpos anti-CD3 de la invención se unieron a las células T humanas e indujeron la proliferación de las mismas.

Ejemplo 5. Anticuerpos anti-CD3 se unen a células T de mono e inducen la proliferación de las mismas Se ensayó un subconjunto de anticuerpos anti-CD3 de la invención para determinar su capacidad de unirse a células T de mono e inducir la proliferación de las mismas.

Los datos de la FACS se adquirieron aplicando el siguiente protocolo: Se incubaron 2xl05 células por pocilio con diluciones seriadas de anticuerpos durante 30 minutos en hielo. Luego de la incubación, las células se lavaron, se añadieron anticuerpos secundarios y se incubó durante 30 minutos adicionales. Después de la incubación, las células se lavaron, se suspendieron nuevamente en PBS frío que contenía 1% de BSA y se analizaron por citometría de flujo. Las células T CD4+ de mono estaban encerradas por dispersiones laterales y hacia adelante, y en la población de CD2+CD4+CD20-. La EC50 la para la titulación de la unión celular se calculó usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism.

Los datos de la proliferación se adquirieron aplicando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC derivadas de cynomolgus recién aisladas (5xl04 / por pocilio) con una dilución seriada 3 veces de anticuerpo anti-CD3 y una concentración fija de un anticuerpo anti-CD28 comercial (500 ng/ml) en placas de 96 pocilios durante 72 horas a 37°C. Luego de la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia usando un lector de placas de múltiples etiquetas VICTOR X5 (PerkinElmer). La EC50 de la viabilidad celular (cuantificación catalizada con ATP) se calculó usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros.

Los resultados de los experimentos de unión y proliferación se resumen en las Tablas 12 y 13.

Tabla 12: Anticuerpos monoclonales anti-CD3 se unen a PBMC de mono e inducen la proliferación de las mismas NB: No hay unión; NT: No ensayado Tabla 13: Anticuerpos monoclonales anti-CD3 monovalentes de un brazo se unen a PBMC de mono e inducen la proliferación de las mismas NB: No hay unión; NT: No ensayado Como se muestra en las Tablas 12 y 13, varios anticuerpos anti-CD3 de la invención se unieron a células T CD2+CD4+ de mono e indujeron su proliferación. El 0KT3 no promovió la proliferación de las PBMC de mono, mientras que el SP34 fue activo contra las PBMC de mono.

Ejemplo 6. Anticuerpos monoclonales anti-CCD3 soportan la muerte de células tumorales mediada por células T Se estudió la capacidad de los anticuerpos anti-CD3 para redirigir la muerte mediada por células T a través de interacciones Fc/FcR usando un ensayo de muerte de células U937 basado en calceína. Brevemente, se aislaron PBMC humanas sobre Ficoll-Paque y se activaron durante un transcurso de varios días con un medio que contenía IL-2 humana (30 U/ml) y perlas de activación de células T (anti-CD3/CD28). Se marcaron células U937 con calceína, y luego se incubaron con las células T activadas con una relación efector: objetivo de 10:1 utilizando diluciones seriadas 3 veces de anticuerpos durante el transcurso de 3 horas a 37°C. Después de la incubación, las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a una placa negra translúcida de fondo transparente para un análisis de fluorescencia. Los valores de EC50, que se define como la concentración molar de anticuerpo CD3 que induce 50% de citotoxicidad, se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism. Los resultados utilizando anticuerpos de hibridoma, anticuerpos de Fe humano y anticuerpos monovalentes de un solo brazo se muestran en las Tablas 14, 15 y 16, respectivamente.

Tabla 14: Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 de hibridoma redirigen la muerte de células T a las células U937 NT: No ensayado Tabla 15: Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 de Fe humano formateados redirigen la muerte de células T a las células U937 NT: No ensayado Tabla 16: Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 monovalentes de un brazo redirigen la muerte de células T a las células U937 NT: No ensayado Como se muestra en las Tablas 14-16, en este sistema de ensayo la mayoría de los anticuerpos anti-CD3, así como el 0KT3, soportaron el redireccionamiento de la muerte mediada por células T. La muerte observada, que se cree depende del compromiso del Fe del anticuerpo con el receptor de Fe en las células U937 que lleva a la agrupación de CD3 en las células T adyacentes, se suprimió mediante la adición de la IgG humana no específica (datos no mostrados).

Ejemplo 7. Generación de anticuerpos biespecificos que se unen a CD3 y CD20 Se construyeron anticuerpos biespecificos que comprenden un dominio de unión específico anti-CD3 y un dominio de unión específico anti-CD20 utilizando metodologías estándares donde una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 se combinaron con una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD20. Los anticuerpos anti-CD3 utilizados para construir los anticuerpos biespecificos de este ejemplo se obtuvieron mediante la inmunización de un ratón Veloclmmune® con células que expresan CD3 o con ADN que codifica CD3, o, en el caso del BS3/20-007 y -009, de un anticuerpo anti-CD3 conocido (es decir, el anticuerpo anti-CD3 "L2K" descrito en W02004/106380). Los anticuerpos anti-CD20 utilizados para construir los anticuerpos biespecificos de este ejemplo se describen en US 7.879.984.

Los anticuerpos biespecíficos creados de acuerdo con el presente Ejemplo comprenden dos dominios de unión a antígeno diferentes (es decir, brazos de unión). El primer dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada derivada de un anticuerpo anti-CD20 ("CD20-VH"), combinado con una región variable de cadena ligera derivada de un anticuerpo anti-CD3 ("CD3-VL"). La combinación CD20-VH/CD3-VL crea un dominio de unión a antígeno que reconoce específicamente CD20. El segundo dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada derivada de un anticuerpo anti-CD3 ("CD3-VH"), combinado con una región variable de cadena ligera derivada de un anticuerpo anti-CD3 ("CD3-VL"). La combinación CD3-VH/CD3-VL crea un dominio de unión a antígeno que reconoce específicamente CD3. En todos los anticuerpos biespecíficos creados en este ejemplo se utilizó el mismo CD20-VH, al que que se denomina "CD20-VH-A" (a excepción de BS3/20-009, que utilizó un CD20-VH diferente llamado "CD20-VH-B"). Sin embargo, en los diferentes anticuerpos biespecíficos de los siguientes Ejemplos se utilizaron varios componentes CD3-VH y CD3-VL diferentes (llamados "CD3-VH-A, CD3-VH-B, etc. y CD3-VL-A, CD3-VL-B, etc.) derivados de diferentes anticuerpos anti-CD3 En la Tabla 17 se muestra un resumen de las partes componentes de los dominios de unión a antígeno de los diversos anticuerpos biespecíficos fabricados de acuerdo con este Ejemplo.

Tabla 17: Las regiones variables de cadena pesada y ligera de CD3- VH-F y CD3-VL-F se obtuvieron a partir del anticuerpo anti-CD3 designado como "L2K" como se describe en W02004/106380.

* El brazo anti-CD20 del BS3/20-009, el cual comprende la combinación CD20-VH-B/CD3-VL-F, no es funcional, es decir, no se une a CD20. Sin embargo, el brazo anti-CD3 (el cual comprende la combinación CD3-VH-F/CD3-VL-F) se une específicamente a CD3. Por lo tanto, el BS3/20-009 conserva la misma estructura general "biespecífica" de las otras moléculas biespecíficas generadas en este ejemplo, pero sólo se une a CD3.

Las Tablas 18 y 19 muestran los identificadores de secuencia de aminoácidos de las diferentes regiones variables de cadena pesada (Tabla 18) y las regiones variables de cadena ligera (Tabla 19), y sus correspondientes CDR, de los anticuerpos biespecífíeos de este Ejemplo.

Tabla 18 (Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada) Tabla 19 (Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera) Además, las Tablas 20 y 21 muestran los identificadores para las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada (Tabla 20) y las regiones variables de cadena ligera (Tabla 21), y sus correspondientes CDR, de los anticuerpos biespecífíeos de este Ejemplo.

Tabla 20 (Secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de regiones variables de cadena pesada) Tabla 21 (Secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de regiones variables de cadena ligera) Además de los anticuerpos biespecífíeos descritos anteriormente, en algunos de los experimentos descritos en los Ejemplos que siguen también se utilizaron los siguientes anticuerpos de control: Control I: Anticuerpo monoclonal "OKT-3" contra antígenos de superficie de células T humanas como se describe en US 4.361.549 y disponible del hibridoma CRL-8001 (American Type Culture Collection, Manassas, VA).

Control II: Anticuerpo "SP34" reactivo contra la cadena épsilon del complejo T3 en las células de linfocitos T humanas, disponible de BD Pharmagen, Cat # 55052.

Control III: anticuerpo anti-CD20 terapéutico, con secuencias de cadena pesada y ligera de Rituxan (Rituximab) como se describe en US 5.736.137.

Control IV: Anticuerpo monoclonal anti-CD20 denominado "3B9-10" como se describe en US 7.879.984, e incluido en este documento como un anticuerpo que comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 1242/1346 y las secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 de las SEQ ID NO: 1244-1246-1248-1348-1350-1352.

Control V: Anticuerpo monoclonal anti-CD20 denominado "10F2-13" como se describe en US 7.879.984, e incluido en este documento como un anticuerpo que comprende el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 1354/1362 y las secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 de las SEQ ID NO: 1356-1358-1360-1364-1366-1368.

Ejemplo 8. Anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 se unen selectivamente a células Jurkat, Ra i y células T de mono Se analizaron anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 y construcciones de control, tal como se indica en el Ejemplo 1, mediante FACS para determinar su capacidad para unirse a células Jurkat (CD3+, línea de células T CD20 - humanas), Raji (CD3-, línea de células B CD20+ humanas) o PBMC de cynomolgus ("células mkT").

Los datos de la FACS se adquirieron aplicando el siguiente protocolo: Se incubaron 2xl05 células por pocilio con diluciones seriadas de anticuerpos durante 30 minutos en hielo. Después de la incubación, las células se lavaron y se añadió un anticuerpo (células Jurkat, Raji) o un cóctel de anticuerpos secundarios apropiado (para PBMC de cynomolgus) y se incubó durante 30 minutos adicionales. Después de la incubación, las células se lavaron, se suspendieron nuevamente en PBS frío que contenía 1% de BSA y se analizaron por citometría de flujo sobre una BD FACS Canto II. Las células Jurkat y Raji estaban encerradas por dispersiones laterales y hacia adelante, mientras que las células T de cynomolgus también estaban encerradas en una población de CD2+CD4+. Los valores de EC50 para la titulación de la unión celular se determinaron usando software de Prism con valores calculados utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros. Los resultados se muestran en la Tabla 22.

Tabla 22. Valores de unión EC50 (Molar) para anticuerpos biespecificos CD3xCD20 (+) No se determinaron valores de EC50, pero se observó unión; NB No hay unión; NT No ensayado Como se muestra en la Tabla 22, el panel de anticuerpos ensayados mostró una gama de afinidades de unión en las diferentes líneas de células, dependiendo de sus especificidades. Los anticuerpos biespecificos (BS3/20-001, - 002, -003, -004 y -005) mostraron la capacidad de unirse a ambas líneas objetivo humanas. Un subconjunto de anticuerpos también mostró la capacidad de unirse a las células cynomolgus (Control II, BS3/20-001 y BS3/20-003). El Control I anti-CD3 (OKT3), el Control II anti-CD3 (SP34) y el Control IV anti-CD20 se unieron a células Jurkat, células T de cynomolgus y células RAJI, respectivamente.

Ejemplo 9. Anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 inducen proliferación de PBMC in vitro Se evaluó la capacidad de anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 seleccionados y construcciones de control para estimular células mononucleares de sangre periférica (PBMC) e inducir su proliferación mediante cuantificación catalizada con ATP (CellTiter Glo®). La activación de PBMC da por resultado la liberación de citocinas, las cuales promueven la proliferación celular.

Los datos de la proliferación se adquirieron aplicando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC humanas o derivadas de mono cynomolgus (5x105 / por pocilio) con una dilución seriada 3 veces de anticuerpo anti-CD3xCD20 o anticuerpo de control en placas de 96 pocilios durante 72 horas a 37°C. Luego de la incubación, se añadió CellTiter Glo® y se midió la luminiscencia usando un lector de placas de múltiples etiquetas VICTOR X5 (PerkinElmer). La EC50 de la viabilidad celular (cuantificación catalizada con ATP) se determinó usando software de Prism. Los valores se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros y se muestran en la Tabla 23.

Tabla 23. Valores de EC50 para la proliferación de PBMC humanas y de cynomolgus inducida por anticuerpos biespecificos anti-CD20 x CD3 (*) Los datos son valores medios de 3 o más ensayos independientes. Los datos sin un (*) son valores representativos / promedio de 1 o 2 ensayos independientes. NA = Sin actividad; NT= No ensayado Como se muestra en la Tabla 23, todos los anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 de la invención fueron activadoras de PBMC humanas o de cynomolgus. En general, los anticuerpos anti-CD3 parenterales bivalentes monoespecíficos (Contros I y II) fueron 2-10 veces más potente que sus homólogos biespecificos. El Control I (0KT3) no promovió la proliferación de las PBMC de mono, mientras que el Control II (SP34) fue activo contra las PBMC de mono.

Ejemplo 10. Anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 activan las células T e inducen la liberación de IFN -gamma y la regulación hacia arriba de CD25 en sangre humana entera Se ensayaron anticuerpos biespecíf icos CD20 x CD3 seleccionadas para determinar su capacidad para activar células T en sangre humana entera. La medida de la activación de células T se determinó midiendo la secreción de interferón-gamma (IFNy) y la regulación hacia arriba de CD25 en células T CD8+.

La secreción de interferón-gamma (IFNy) se cuantificó combinando sangre entera heparinizada con diluciones seriadas 5 veces de anticuerpos biespecíf icos en placas de 96 pocilios. Después de 20 horas, las placas se centrifugaron durante 5 minutos y se separó el plasma para un análisis ELISA para determinar los niveles de IFNy. Se graficaron las concentraciones de IFNy extrapoladas en función de la concentración de anticuerpo, y se calcularon los valores de EC5otnediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando software de Prism.

Para el análisis de la expresión de CD25 en las células T CD8+, después de la incubación con anticuerpos y la eliminación del plasma, se transfirieron 150 ml de sangre a una placa de pocilios profundos y se U saron durante 15 minutos con 1.5 mi de tampón de lisis RBC. Las células se lavaron dos veces, se bloquearon durante 10 minutos a temperatura ambiente con reactivo de bloqueo hFcR, y luego se incubaron durante 30 minutos a 4°C con anticuerpos conjugados directamente a CD2, CD19, CD4, CD8, y CD25. A continuación, las células se lavaron dos veces antes del análisis con un citómetro de FACSCanto y el software FlowJo.

Se gráfico el porcentaje de células T CD2+CD8+ que expresaron el marcador de activación CD25 en función de la concentración de anticuerpo, y los valores de EC50 se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando software de Prism. Los resultados se muestran en la Tabla 24.

Tabla 24: Valores de EC50 de la regulación hacia arriba de CD25 mediada por anticuerpos biespecificos y producción de IFNy en sangre entera Valores medios de al menos 3 experimentos independientes (con excepción de la expresión de IFN-gamma del BS3/20-003, donde n = 2) Como se muestra en la Tabla 24, los anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 mediaron la regulación hacia arriba de CD25 en células T CD8+ en sangre entera con valores de EC50 comprendidos entre 130 y 290 pM, siendo los correspondientes valores de EC50 para IFNy ligeramente más altos, comprendidos entre 390 pM y 2 nM. El BS3/20-004 fue levemente menos potente que el BS3/20-001 y el BS3/20-003 para mediar la regulación hacia arriba de CD25 y la producción de IFNy de acuerdo con los valores de EC50 determinados; sin embargo, el BS3/20-004 pudo inducir mayores niveles de IFNy en cultivos de sangre completa.

Ejemplo 11. Anticuerpos blerspecificos CD20 x CD3 inducen citotoxicidad mediada por células T en lineas celulares resistentes al rituximab Se evaluó la capacidad de anticuerpos biespecífíeos CD20 x CD3 seleccionados y construcciones de control para mediar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad mediada por células T usando células Raji parentales y líneas Raji SCID. Estas últimas (las líneas Raji SCID) se derivaron a partir de tumores individuales resistentes a terapia anti-CD20 aislados de ratones inmunodeficientes inyectados por vía subcutánea con células Raji después del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-CD20 rituximab. En este ejemplo se utilizaron cuatro líneas celulares (Raji SCID 1-4).

La expresión de CD20 y las moléculas inhibidoras del complemento CD55 y CD59 en las líneas de células Raji se determinó mediante FACS. Brevemente, se incubaron lxlO6 células en tubos individuales durante 30 minutos con anticuerpos conjugados directamente con CD20, CD55 y CD59. Las células se lavaron dos veces antes de la adquisición de FACS mediante un citómetro de FACSCanto y análisis con el software FlowJo.

Para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-CD20 y anti-CD3xCD20 para mediar la muerte dirigida por células T de las líneas de células Raji, se incubaron células Raji marcadas con calceína durante 2 horas a 37°C con células T previamente activadas (PBMC humanas aisladas por Ficoll activadas con rhIL-2 (30U/mL) y perlas de activación anti-CD3/CD28) y diluciones seriadas 3 veces de anticuerpos a partir de 2 nM. Después de la incubación, las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a una placa negra translúcida de fondo transparente para una detección de fluorescencia de 530nm a una emisión de 485 nm. El porcentaje de citotoxicidad se determinó sobre la base de valores espontáneos (células objetivo solas) y de liberación máxima (células objetivo lisadas con detergente). Los valores de EC50 se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando software de Prism.

Para determinar la actividad de los anticuerpos para mediar CDC, se incubaron líneas de células Raji con 5% de complemento de suero humano normal y diluciones seriadas 3 veces de anticuerpos a partir de 100 nM. Después de incubar durante 4.5 horas a 37°C, la muerte celular se determinó utilizando CellTiter Glo ®. El porcentaje de citotoxicidad se determinó sobre la base de valores espontáneos (células objetivo solas) y de liberación máxima (células objetivo lisadas con detergente). Los valores de EC50 se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando software de Prism.

Los resultados se muestran en la Tabla 25.

Tabla 25. Valores de EC50 para CDC mediada por anticuerpos y citotoxicidad mediada por células T En comparación con las células Raji parentales, 2 de 4 líneas Raji SCID mostraron una reducción de la expresión de CD20 (Tabla 25; líneas Raji SCID 1 y 3), con un porcentaje significativamente mayor de células expresando las moléculas inhibidoras del complemento CD55 y CD59. La sensibilidad de las células Raji SCID a la CDC mediada por los anticuerpos anti-CD20 o anti-CD20 x CD3 dependió del porcentaje de células que expresaban CD55/CD59, pero no de los niveles de CD20, de tal manera que el aumento de expresión de CD55/CD59 en las células objetivo inhibió la CDC.

Los anticuerpos anti-CD20 (Control IV y Control III [ Rituximab]) fueron más potentes que el anticuerpo anti-CD20 x CD3 (BS3/20-007) en la mediación de CDC, ya que el biespecífico es monovalente para CD20. Sin embargo, en contraste con la CDC, la citotoxicidad mediada por células T no dependió de los niveles de CD20 o CD55/CD59, ya que todas las líneas celulares fueron igualmente susceptibles a la muerte celular por células T activadas en presencia de anticuerpo biespecífico anti-CD20 x CD3. Además, en el ensayo de CDC el anticuerpo biespecífico fue de 100 a 1000 veces más potente en la mediación de la muerte dependiente de células T de las células Raji que el anticuerpo anti-CD20.

Ejemplo 12. La regulación hacia arriba de CD25 en células T CD8+ depende de la concentración de CD20 ante la presencia de anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 Para evaluar si una mayor concentración de células objetivo (CD20 + linfomas) daría lugar a un aumento de la potencia de los anticuerpos biespecificos CD20 x CD3, se co cultivaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en presencia de una línea celular derivada de linfoma de Burkitt, es decir, células Raji.

La regulación hacia arriba de CD25 en las células T CD8+ se determinó aplicando el siguiente protocolo: Se incubaron PBMC humanas (5xl05/mL), aisladas por centrifugado de sangre obtenida por leukaferesis enriquecida con células mononucleares sobre Ficoll, en presencia (lxl05/mL) o ausencia de células Raji, a 37°C en placas de 96 pocilios de fondo plano con diluciones seriadas 5 veces de los anticuerpos biespecífíeos. Después de 48 horas, las células se lavaron dos veces, se bloquearon durante 10 minutos a temperatura ambiente con reactivo de bloqueo hFcR, y luego se incubaron durante 30 minutos a 4°C con anticuerpos conjugados directamente a CD2, CD19, CD4, CD8, y CD25. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces antes de la adquisición de FACS mediante un citómetro de FACSCanto y análisis con el software FlowJo. Se gráfico el porcentaje de células T CD2+CD8+ activadas que expresaron CD25 en función de la concentración de anticuerpo, y los valores de EC50 se calcularon mediante un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros usando software de Prism. Los resultados se muestran en la Tabla 26.

Tabla 26. Regulación hacia arriba de CD25 en células T CD8+ luego de la incubación de PBMC humanas con anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 más o menos células Raji Como se muestra en la Tabla 26, al ser cultivadas en presencia de células Raji (objetivo), las células T activadas mostraron una regulación hacia arriba de CD25, y una disminución posterior de 100 veces en sus valores de EC50.

Ejemplo 13. Los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 inducen citotoxicidad a las células Raji en presencia de células T activadas Se evaluó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD20 x CD3 para redirigir la muerte mediada por células T a las células Raji que expresan CD20 en un ensayo de citotoxicidad in vitro . Además, también se estudió la capacidad tanto de los anticuerpos biespecíficos como de los anticuerpos anti-CD3 parenterales para matar las células U937 mediante interacciones Fc/FcR.

Se realizaron ensayos de muerte basados en calceína aplicando el siguiente protocolo: Se aislaron PBMC humanas y de cynomolgus sobre Ficoll-Plaque o mediante medio de separación de células Lympholyte Mammal, respectivamente. Las PBMC aisladas se activaron durante un transcurso de varios días con medio que contenía IL-2 recombinante humana (30U/ml) y perlas de activación de células T (anti-CD3/CD28 para las PBMC humanas, anti-CD2/CD3/CD28 para las PBMC de cynomolgus).

Se marcaron células objetivo (Raji para muerte mediada por CD20 y U937 para muerte mediada por FcR) con calceína, y se incubaron con células T activadas con una relación efector:objetivo de 10:1 utilizando diluciones seriadas 3 veces de anticuerpos durante el transcurso de 3 horas a 37°C. Después de la incubación, las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a una placa negra translúcida de fondo transparente para un análisis de fluorescencia. Los valores de EC50, que se define como la concentración molar de anticuerpo biespecífico que induce 50% de citotoxicidad, se determinaron usando Prism. Los valores se calcularon usando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros. Los resultados se resumen en la Tabla 27.

Tabla 27. Valores de EC50 para citotoxicidad inducida por CD20 x CD3 a células Raji y U937 (*) Los datos son valores medios de 3 o mas ensayos ndependientes. Los datos sin un (*) son valores representativos / promedio de 1 o 2 ensayos independientes. NA = Sin actividad; NT= No ensayado.

Como se muestra en la Tabla 27, los anticuerpos biespecífíeos CD20 x CD3 que contenían brazos anti-CD3 específicos para humano o con reactividad cruzada para humano/cynomolgus pudieron redirigir específicamente la citotoxicidad a las células Raji en presencia de las células T humanas activadas. En presencia de células T de cynomolgus activadas, las células Raji murieron al ser incubadas con BS3/20-001 o BS3/20-003, anticuerpos biespecíficos que tienen brazos anti-CD3 que activan las células T de mono. Todos los anticuerpos biespecíficos así como el Control I, un anticuerpo monoclonal anti-CD3, mostraron actividad en el ensayo de muerte de U937 dependiente de Fc/FcR. Esta actividad pudo ser bloqueada agregando IgG humana no específica de bloqueo a la reacción (datos no presentados).

Ejemplo 14. Anticuerpos biespecíficos CD3 x CD20 pueden agotar las células B CD19+ en ratones reconstituidos con células inmunes humanas Para determinar la potencia in vivo de la administración de los anticuerpos biespecíficos CD3xCD20, se estudiaron los cambios en los niveles de células B CD19+ y células T CD2+ mediante FACS después de la administración de 10 mg o 0.1 pg de anticuerpo biespecífico anti- CD3xCD20 en ratones, que se reconstituyeron con células inmunes humanas.

Brevemente, se irradiaron ratones BALB /Rag2nul1/gahu11 recién nacidos con 2 x 150 Rads y se reconstituyeron con 4xl05 células progenitoras hematopoyéticas CD34+ humanas mediante inyección intrahepática. Después de 12 semanas, se determinó la composición del sistema inmunitario humano reconstituido en la sangre periférica por citometría de flujo. Típicamente, tres meses después de la reconstitución, entre el 10% y el 60% por ciento de los leucocitos de la sangre periférica son CD45+ humanas de las cuales del 40% al 70% son células B, del 15% al 40% son células T y las restantes son pequeñas poblaciones de células NK y células dendríticas.

Cinco meses después de la reconstitución, los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con 10 mg o 0.1 pg del anticuerpo biespecífico anti- CD3xCD20 BS3/20-007, 10 pg de anticuerpo anti-CD3 monovalente de un brazo (BS3/20-009, ver Tabla 1) o 10 pg de un control de un isotipo de hlgG irrelevante. Uno, ocho y veinticinco días después de la inyección, los ratones fueron sangrados retro-orbitalmente y las poblaciones de células inmunes en la sangre periférica se determinaron por citometría de flujo (FACS).

Para el análisis FACS; se incubaron 100 ml de sangre con 1.5 mi de tampón de lisis RBC en tubos Eppendorf durante tres minutos. Las células se centrifugaron durante cinco minutos a 0.4xg, se lavaron 2x con lavado para FACS (PBS+3% de FBS), y se bloquearon durante 10 minutos a temperatura ambiente con reactivo de bloqueo de Fe de ratón. Las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C con anticuerpos conjugados directamente a CD2, CD3, CD19, CD4, CD8, hCD45, hHLA-DR, y mCD45. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces antes de la adquisición de FACS mediante un citómetro de FACSCanto y análisis con el software FlowJo. Los resultados se muestran en la Tabla 28.

Tabla 28: Porcentaje de células positivas para CD45, CD19 y CD2 circulantes en ratones reconstituidos con células inmunes humanas Como se muestra en la Tabla 28, una dosis única de 10 pg del anticuerpo biespecífico anti-CD3xCD20 BS3/20-007 dio como resultado una desaparición de las células hCD45+ en circulación en 2 de 2 ratones tratados que no se recuperaron durante el transcurso del experimento. Una única dosis de 0.1 pg de BS3/20-007 redujo las células hCD45+ en circulación, incluso las células B CD19+ y las células T CD2+ 24 horas después de la inyección en 2 de 3 ratones tratados. Una vez agotado, el porcentaje de células hCD45+ no se recuperó de manera significativa en los ratones tratados con 0.1 mg de BS3/20-007 que respondieron. Sin embargo, las células que permanecieron en estos ratones eran predominantemente células T hCD2+, y no había células B CD19+ presentes en los ratones que respondieron incluso 25 días después del tratamiento. Una única dosis de 10 pg de un anticuerpo anti-CD3 monovalente de un brazo (BS3/20-009) también produjo una reducción persistente pero modesta de las células CD45+, en particular de las células T CD2+, en 2 de 2 ratones tratados. Una única dosis de 10 pg de un control de hlgGl irrelevante no tuvo ningún efecto significativo sobre el porcentaje de células hCD45+, hCD19+ o hCD2+ en circulación.

Ejemplo 15. Tratamiento con anticuerpo biespecífico CD20 x CD3 reduce el volumen de los tumores Raji en ratones NOD/SCID Para evaluar la eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-CD3xCD20 seleccionados en la reducción del crecimiento de tumores Raji, se implantaron ratones NOD/SCID (Taconic) por vía subcutánea con una mezcla de 2xl06 células tumorales Raji y 8x10s PBMC humanas. Los ratones se trataron tres veces por semana, comenzando el día de la implantación del tumor, ya sea con Fe humano (hFc) o con anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007) en una dosis de 1 mg por ratón (N = 20 ratones por grupo de tratamiento). Los reactivos se suministraron por inyección intraperitoneal (i.p.). El tamaño del tumor se midió tres veces por semana usando calibres, y el volumen del tumor calculó como Volumen = (largo x ancho2)/2. Los resultados se muestran en la Figura 1.

En un segundo experimento, se implantaron ratones NOD/SCID por vía subcutánea con una mezcla de 2xl06 células tumorales Raji y 4x10s PBMC humanas. El tratamiento con anticuerpo biespecífico CD3xCD20 (BS3/20-007) o reactivo de control (hFc) comenzó 7 días después de la implantación del tumor para permitir que los tumores se volvieran palpables. Los ratones se trataron dos veces por semana con una dosis de 1 pg por ratón (N = 6 ratones por grupo de tratamiento). Los reactivos se inyectan por vía subcutánea, lejos del sitio de implantación del tumor. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana usando calibres, y el volumen del tumor calculó como Volumen = (largo x ancho2)/2. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Este ejemplo demuestra que el tratamiento con el anticuerpo biespecífico CD3xCD20 BS3/20-007 fue eficaz para inhibir el crecimiento tumoral tanto en el momento de la implantación del tumor como una vez que los tumores se establecieron. El volumen del tumor en los ratones se redujo 25 días después de la implantación en ambos estudios, en relación con el control.

Ejemplo 16. Anticuerpos biespecificos CD20 x CD3 agotan las poblaciones de células B en monos cynomolgus y tienen un perfil farmacocinético típico de los anticuerpos monoclonales Se realizó un estudio piloto de toxicología y farmacología no GLP en monos cynomolgus ( Macaca fascicularis) para determinar la capacidad de los anticuerpos biespecificos CD3xCD20 para agotar lasa poblaciones de células B en estos animales. Se organizaron animales macho en tres cohortes. La Cohorte 1 recibió anticuerpo biespecífico BS3/20-001 e incluyó tres grupos de dosificación diferentes (0.01, 0.10 y 1.00 mg/kg) con 3-4 animales por cada grupo de dosificación.

La Cohorte 2 era una cohorte formada por dos animales que recibieron una baja dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (Control V; 0.01 mg/kg). La Cohorte 3 era una cohorte formada por cuatro animales que recibieron una alta dosis de anticuerpo anti-CD20 de control (Control III; 1.0 mg/kg). Se extrajo sangre el día -7 e inmediatamente antes de la dosificación con el fin de establecer los niveles de referencia para las células B y T en estos animales. Se administraron dosis de fármaco de 0.01, 0.10, o 1.00 mg/kg mediante infusión intravenosa y se extrajo sangre 5 minutos, 5 horas, y 1, 4, 7, y 14 días después de la dosificación.

Después del día 14 después de la dosificación, se extrajo sangre cada dos semanas hasta la conclusión del estudio. Las muestras de sangre se analizaron por FACS para determinar los marcadores de células B y T y se determinó el número absoluto de estos tipos de células. Se analizaron muestras de suero para determinar los niveles de citocinas (IFNy, IL-2, IL-6 y TNFa) utilizando métodos analíticos estándares. Los resultados se muestran en la Figura 3 (células B), la Figura 4 (células T) y las Figuras 5A-5D (citocinas).

Como se muestra en este ejemplo, la administración del anticuerpo biespecífico CD3xCD20 redujo las células B en circulación a los niveles de referencia el primer punto de tiempo medido día 1). Esta reducción no se observó en la cohorte de animales de control. La reducción de las células B en la cohorte que recibió anticuerpo biespecífico se mantuvo hasta dos semanas después de la dosificación y en los mg/kg cohortes que recibieron dosis de 0.01 y 0.10 fue seguida por una recuperación gradual de los niveles de células B hasta que el experimento se concluyó aproximadamente 11 semanas después de la dosificación. Sin embargo, en la cohorte que recibió 1.0 mg/kg no se observó recuperación de los niveles de células B mientras duró el experimento (11 semanas). En este experimento también se monitorearon los niveles de células T. Se observó una pérdida transitoria de células T en circulación el día 1 posterior a la dosificación en las cohortes con anticuerpo biespecífico. En estas cohortes los niveles de células T volvieron a los niveles de referencia a los 4 días y se mantuvieron en estos niveles de referencia hasta el final del experimento. Además, los niveles de citocina en suero para BS3/20-001 a las 5 horas exhibieron una respuesta dependiente de la dosis y del tiempo que es consistente con la activación de células T (ver Figuras 5A-5D).

Durante este experimento también se analizaron los niveles de expresión de genes en la sangre periférica. Se obtuvieron muestras de sangre de animales en dos puntos de tiempo antes de la dosificación (día 7 antes de la dosificación e inmediatamente antes de la dosificación) y a las 5, 24, 72, 96 y 168 horas posteriores a la dosificación. Se aisló ARN a partir de estas muestras y se analizó por micromatrices. En comparación con los niveles antes de la dosificación y los niveles de expresión de genes del grupo de control, se observó una disminución notable de la expresión de genes de marcadores de células B en los animales tratados con el anticuerpo biespecífico; este efecto fue similar al efecto observado en las muestras obtenidas a partir de animales tratados con 1.0 mg/kg de Control III (anticuerpo anti-CD20 correspondiente a rituximab). El cambio observado en la expresión del marcador de células B corresponde a la pérdida de células B detectada en la sangre de los animales tratados. La expresión de genes marcadores de células T en muestras de animales tratados con el anticuerpo biespecífico CD3xCD20 mostró una disminución inicial seguida de un retorno a los niveles normales a las 24 horas. Además, los genes asociados con una respuesta inflamatoria mostraron una regulación al alza inicial en los animales de la cohorte con anticuerpo biespecífico pero volvieron a niveles menores o iguales que los normales después de 24 horas. Finalmente, un análisis de la intensidad en bruto de la señal de expresión del gen CD20 sugiere que se obtiene una mayor reducción de las células B tratando a los animales con el anticuerpo biespecífico CD3xCD20 que tratándolos con los anticuerpos anti-CD20 de control. (Ver Figura 6 y Tabla 29).

Tabla 29. Niveles de expresión del gen CD20 el día 7 Como se muestra en la Tabla 29, a los siete días posteriores a la dosificación la intensidad en bruto de la señal de CD20 se mantuvo en niveles de fondo en todos menos uno de los animales con CD3xCD20, mientras que 3 de los 4 animales tratados con 1 mg/kg de Control III mostraron niveles de señal de CD20 ya sea marginales o detectables.

En el mismo experimento, se evaluó el perfil farmacocinético del anticuerpo biespecífico (Figura 7) obteniendo muestras de sangre antes de la dosificación y luego de 0.083, 5, 24, 48, 72, 168, 336, 504 y 840 horas. Las muestras de suero resultantes se analizaron mediante un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para determinar la concentración de anticuerpo biespecífico total. Se analizaron los datos de concentración total de biespecífico (BS3/20-001) en suero mediante análisis no compartimental (Phoenix WinNonLin) para determinar los parámetros farmacocinéticos. Los resultados se muestran en la Tabla 30 (AUC = área debajo la curva en función del tiempo; Cmax = concentración máxima del compuesto observado en la matriz de interés).

Tabla 30: Parámetros farmacocinéticos de BS3/20-001 en mono cynomolgus Después de una única dosis intravenosa de 0.01, 0.10 o 1.0 mg/kg de BS3/20-001 en monos cynomolgus, se observaron concentraciones pico medias (Cmax) de 0.261, 2.32 y 33.4 pg/mL, respectivamente, en el primer punto de tiempo donde se tomaron muestras (0.083 hr). Se observaron valores de AUCan de 4.42, 289 y 4940 pg*hr/mL para dosis de 0.01, 0.1 y 1.0 mg/kg. Los valores de AUC normalizados para considerar la dosis (AUCaii/Dosis) de 442, 2890 y 4940 pg*hr/mL por mg/kg indican que la exposición del plasma (AUCan) aumenta de forma no lineal a medida que aumenta la dosis. Se observó un aumento mayor que el proporcional de la exposición al fármaco en plasma al aumentar la dosis de anticuerpo, lo que sugiere que el BS3/20-001 puede estar experimentando una cierta eliminación mediada por la objetivo. El perfil farmacocinético global del BS3/20-001 es típico de los anticuerpos monoclonales dosificados en mono cynomolgus.

La presente invención no está limitada en su alcance por las modalidades específicas descritas en este documento. En efecto, diversas modificaciones de la invención adicionales a las descritas en este documento serán evidentes para los expertos en la téenica a partir de la descripción anterior y las figuras que se acompañan. Tales modificaciones están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD3 humano e induce la proliferación de células T humanas in vitro con una EC50 de menos de aproximadamente 0.33 pM.

2. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD3 humano e induce la muerte mediada por células T de células tumorales in vi tro con una EC50 de menos de aproximadamente 2.3 pM.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo induce la muerte mediada por células T de células tumorales in vi tro con una EC50 de menos de aproximadamente 1 pM.

4. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD3 humano con una constante de equilibrio de disociación de la unión (KD) de menos de aproximadamente 1 nM según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25°C.

5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 4, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a CD3 humano con una KD de menos de aproximadamente 500 pM según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25°C.

6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a CD3 humano con una KD de menos de aproximadamente 100 pM según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25°C.

7. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD3 humano con una semivida disociativa (t¾) de más de aproximadamente 10 minutos según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25°C.

8. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a CD3 humano con una t½ de más de aproximadamente 100 minutos según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25°C.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo compite por la unión a CD3 con un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR como se indica en la Tabla 1.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 9, donde el anticuerpo de referencia comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10; 114/122; 514/522; 770/778; 1050/1234; y 1090/1234.

11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo en CD3 que un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR como se indica en la Tabla 1.

12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 11, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo en CD3 que un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10; 114/122; 514/522; 770/778; 1050/1234; y 1090/1234.

13. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD3 humano, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como se indica en la Tabla 1; y (b) las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene un secuencia de aminoácidos como se indica en la Tabla 1.

14. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 13, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende las CDR de cadena pesada y ligera de un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2/10; 114/122; 514/522; 770/778; 1050/1234; y 1090/1234.

15. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 14, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16; 116-118- 120-124-126-128; 516-518-520-524-526-528; 772-774-776-780- 782-784; 1052-1054-1056-1236-1238-1240; y 1092-1094-1096- 1236-1238-1240.

16. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a CD3 humano, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2; 114; 514; 770; 1050; y 1090; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10; 122; 522; 778; 1234; y 1234.

17. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 16, donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2/10; 114/122; 514/522; 770/778; 1050/1234; y 1090/1234.

18. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 humano y un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno objetivo, donde el primer dominio de unión a antígeno se deriva a partir del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o el anticuerpo biespecífico de la reivindicación 18, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

20. Un método para modular hacia arriba una respuesta inmunitaria en un sujeto, donde el método comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de la reivindicación 19.

21. Un método para el tratamiento de un tumor en un sujeto, donde el método comprende administrar la composición farmacéutica de la reivindicación 19 a un sujeto que la necesite.

22. Una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20.

23. La molécula de unión a antígeno biespecífico de la reivindicación 22, en donde la molécula de unión a antígeno se une a CD3-expresión de las células T humanas con un valor de EC50 de entre lxlO12 M y lxlO6 M.

24. La molécula de unión a antígeno biespecífico de la reivindicación 22, en donde la molécula de unión a antígeno se une a CD3-expresión de las células T humanas con un valor de EC50 de entre lxlO9M y lxlO8 M.

25. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde la molécula de unión a antígeno se une a células humanas que expresan CD3 humano y a células de mono cynomolgus que expresan CD3 de cynomolgus .

26. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde la molécula de unión a antígeno induce la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas y de cynomolgus ín vitro.

27. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde la molécula de unión a antígeno induce la liberación de IFN-gamma y la regulación hacia arriba de CD25 en sangre humana entera.

28. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde la molécula de unión a antígeno induce citotoxicidad mediada por células T en células B humanas.

29. La molécula de unión a antígeno biespecífica de la reivindicación 28, donde la molécula de unión a antígeno induce citotoxicidad mediada por células T en células B humanas que son resistentes o refractorias a la citotoxicidad mediada por anti-CD20.

30. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, donde una única administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica a un sujeto en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg provoca una reducción del número de células B en el sujeto por debajo de los niveles detectables aproximadamente 1 día después de la administración de la molécula de unión a antígenos biespecífica al sujeto.

31. La molécula de unión a antígeno biespecífico de la reivindicación 30, donde el número de células B permanece por debajo de los niveles detectables hasta al menos aproximadamente 14 días después de la administración de una única dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg de la molécula de unión a antígenos biespecífica al sujeto.

32. La molécula de unión a antígeno biespecífica de las reivindicaciones 30 o 31, donde el número de células B por microlitro de sangre extraída del sujeto desde aproximadamente el día 1 hasta aproximadamente el día 28 después de la administración de una dosis única de aproximadamente 0.01 mg/kg de la molécula de unión a antígeno al sujeto es menor que el 25% del número de células B por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica.

33. La molécula de unión a antígeno biespecífica de las reivindicaciones 30 o 31, donde el número de células B por microlitro de sangre extraída del sujeto desde aproximadamente el día 1 hasta aproximadamente el día 56 después de la administración de una dosis única de aproximadamente 0.01 mg/kg de la molécula de unión a antígeno al sujeto es menor que el 50% del número de células B por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica.

34. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, donde el número de células T por microlitro de sangre extraída del sujeto entre aproximadamente el día 14 y aproximadamente el día 56 después de la administración de la molécula de unión a antígeno al sujeto es mayor o igual que el número de células T por microlitro de sangre extraída del sujeto antes de la administración de la molécula de unión a antígeno biespecífica.

35. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (Al-HCDRl, A1-HCDR2 y Al-HCDR3) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1250, 1266, 1282, 1298, 1314 y 1329, y las regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333.

36. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano comprende las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 and HCDR3) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la SEQ ID NO: 1242, y las regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333.

37. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, Al-HCDR2 y Al-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), donde Al-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1252, 1268, 1284, 1300, 1316 y 1330; donde A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1254, 1270, 1286, 1302, 1318 y 1331; donde A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1256, 1272, 1288, 1304, 1320 y 1332, donde A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, donde Al-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, y donde A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336.

38. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3), donde A2- HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1244, donde A2-HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1246, donde A2-HCDR3 comprende la SEQ ID NO:1248, donde A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, donde A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, y donde A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336.

39. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, Al-HCDR2 y Al-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), y donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3); donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1252, 1268, 1284, 1300, 1316 y 1330; donde A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1254, 1270, 1286, 1302, 1318 y 1331; donde A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1256, 1272, 1288, 1304, 1320 y 1332, donde A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, donde A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, y donde Al-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336; y donde A2-HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1244, donde A2-HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1246, donde A2-HCDR3 comprende la SEQ ID NO:1248, donde A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, donde A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, y donde A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336.

40. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el primer dominio de unión a antígeno compite por la unión a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende tres regiones determinantes de la co plementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1252, 1268, 1284, 1300, 1316 y 1330; donde A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1254, 1270, 1286, 1302, 1318 y 1331; donde Al-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1256, 1272, 1288, 1304, 1320 y 1332, donde A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, donde A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, y donde A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336.

41. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el primer dominio de unión al antígeno compite por la unión a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1250, 1266, 1282, 1298, 1314 y 1329, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333.

42. La molécula de unión a antígeno biespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por la unión a CD20 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3), donde A2-HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1244, donde A2-HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1246, donde A2-HCDR3 comprende la SEQ ID NO: 1248, donde A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1260, 1276, 1292, 1308, 1324 y 1334, donde A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1262, 1278, 1294, 1310, 1326 y 1335, y donde A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1264, 1280, 1296, 1312, 1328 y 1336.

43. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por la unión a CD20 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1242, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333.

44. La molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 34, donde el primer dominio de unión al antígeno compite por la unión a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1250, 1266, 1282, 1298, 1314 y 1329, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333; y donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por la unión a CD20 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1242, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1258, 1274, 1290, 1306, 1322 y 1333.

45. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 44 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

46. Un método para tratar un cáncer de células B en un sujeto, donde el método comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de la reivindicación 45.

47. El método de la reivindicación 46, donde el cáncer de células B se selecciona del grupo que consiste en: linfoma folicular, leucemia linfocítica crónica de células B, linfoma linfoblástico de células B, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de zona marginal, linfoma de células de manto, leucemia de células peludas y linfoma de Burkitt.

48. El método de las reivindicaciones 46 o 47, donde el sujeto padece de un tumor que es resistente, o que responde de forma incompleta, a la terapia anti-CD20 monoespecífica por sí sola.

49. El método de la reivindicación 48, donde el sujeto padece de un tumor que es resistente, o que responde de forma incompleta, a la monoterapia con rituximab.

50. El método de cualquiera de las reivindicaciones 46 a 49, donde el sujeto ha recibido una terapia con anticuerpo monoespecífico anti-CD20 al menos 1 día a 1 año antes de la administración de la composición farmacéutica.

51. El método de la reivindicación 50, donde la terapia con anticuerpo monoespecífico anti-CD20 comprende o consiste en un anticuerpo monoespecífico anti-CD20.

52. El método de la reivindicación 51, donde el anticuerpo monoespecífico anti-CD20 es rituximab.

53. Un método para tratar un cáncer de células B en un sujeto, donde el método comprende: (a) seleccionar un sujeto que padece de un tumor que es resistente, o que responde de forma incompleta, a la terapia monoespecífica anti-CD20 por sí sola, y (b) administrar al sujeto la composición farmacéutica de la reivindicación 45.

54. El método de la reivindicación 53, donde el sujeto se selecciona por tener un tumor que es resistente a, refractaria, o que responde de forma incompleta, a la monoterapia con rituximab. RESUMEN La presente invención proporciona anticuerpos que se unen a CD3 y métodos para el uso de los mismos. De acuerdo con ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a CD3 humano con alta afinidad e inducen la proliferación de células T humanas. La presente invención incluye anticuerpos que se unen a CD3 e inducen la muerte de células tumorales mediada por células T. De acuerdo con ciertas modalidades, la presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD20. En ciertas modalidades, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención son capaces de inhibir el crecimiento de tumores de células B que expresan CD20. Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos en los que una respuesta in unitaria dirigida regulada hacia arriba o inducida es deseable y/o terapéuticamente beneficiosa. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención son útiles para el tratamiento de diferentes tipos de cáncer así como de otras enfermedades y trastornos relacionados con el CD20.