JP2023502500A - 非水性エマルションを使用した持続放出製剤 - Google Patents

Abstract

ポリマー微粒子またはポリマーコーティング微粒子を製造するための非水性エマルション方法が提供される。１つの方法は、タンパク質粉末およびポリマーを炭化水素溶媒中に混合して、非水性の第１の溶液を生成することと、第１の溶液を第２の溶液に添加することとによって、持続放出微粒子組成物を製造し、第２の溶液は、フッ化炭素液およびフッ素系界面活性剤を含んで、フッ化炭素液中に複数のエマルション炭化水素液滴を含む非水性エマルションを形成する。それに続く微粒子硬化プロセスは、形成されたエマルション液滴から炭化水素溶媒を除去するステップを含み、これは、撹拌しながら周囲条件下で炭化水素を蒸発させることによって、または真空を介したもしくはフッ化炭素に共溶媒としてハイドロフルオロエステルを添加することを介した加速硬化によって、達成することができる。フッ化炭素液を除去し、追加のフッ化炭素液で洗浄して、持続放出微粒子を単離し、この持続放出微粒子は、タンパク質の１つ以上のコアおよびポリマーの被殻を含む。

Description

本発明の態様は、全般的には、薬剤マイクロスフェア製剤、および非水性エマルション系を使用してそれらを製造する方法に関する。

生物学的に関連する標的に向けた療法用タンパク質の延長放出送達は、がん、心血管疾患、血管状態、整形外科障害、歯科障害、創傷、自己免疫疾患、胃腸障害、および眼疾患などの医学的状態の治療のために望ましい。生体適合性および生体分解性ポリマー、ならびに薬物の制御および延長された送達のための他の埋め込み可能な送達デバイスは、数十年間使用されている。例えば、いくつかのポリマーベース送達デバイスでは、ポリマーが経時的に分解するにつれて、治療薬がゆっくりと放出される。

延長放出は、患者コンプライアンスのために望ましくなり得る。特に、注射の数を減少させることは、眼内治療薬の例などの、特に注射を行うために医師が必要とされる場合に有益であり得る。できるだけ少ない注射で経時的に薬物を効果的に送達するための延長放出製剤に対する満たされていない医学的ニーズがある。他の疾患、例えば、がんおよび炎症疾患の場合、安定した有効なタンパク質治療薬を含有する改良された埋め込み可能な延長放出製剤が必要とされている。

抗体および受容体Ｆｃ融合タンパク質などの治療用巨大分子は、分子を患者への投与に適したものにするだけでなく、保存中および投与部位でのそれらの安定性を維持する態様で製剤化されなければならない。例えば、水性溶液中の治療用タンパク質（例えば、抗体および融合タンパク質）は、溶液が適切に製剤化されないと、分解、凝集、および／または望ましくない化学的修飾を起こしやすい。液体製剤中のタンパク質治療薬の安定性は、製剤に使用される賦形剤の種類、およびそれらの賦形剤の互いに対する量および比率だけでなく、可溶性タンパク質の濃度にも依存する。治療用タンパク質製剤を調製する場合、安定性以外の考慮事項も考えに入れなければならない。かかる追加の考慮事項の例には、溶液の粘性および所与の製剤が収容できる治療用タンパク質の濃度が含まれる。延長放出のための治療用タンパク質を製剤化する場合、経時的にそして保存中および生理学的温度において安定であり続け、十分な抗体濃度を含有し、患者に簡便に投与することを可能にする他の特性を有する製剤に到達するように、細心の注意が払われなければならない。

いくつかの延長放出製剤は、内部相分離、界面重合、多重エマルションの形成、高分子電解質の層ごとの吸着、およびソフトテンプレート技法を含む様々な封入方法論を使用して製造される。水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）多重エマルションは、最も一般的なタイプの多重エマルションであり、水性／親水性コアを水性懸濁液中で直接的に封入することを可能にする。残念ながら、水性エマルション系は、生物活性剤を延長放出製剤に封入するために使用される場合に特定の問題を有する。例えば、タンパク質の沈殿が、それらの免疫反応性の付随的な低下を伴って、水性有機性界面で生じる（Ｒａｇｈｕｖａｎｓｈｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍ，Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ，３（２）：２６９－７６（１９９８）を参照されたい）。いくつかの水性エマルション系では、水が有機相に拡散して、タンパク質を加水分解し得る。加水分解後、タンパク質液滴は水性環境中へと溶け込んで逃れて、凝集または沈殿し始める。硬化後、タンパク質がかつて存在したが水性環境中へと逃げてしまった微粒子には空隙および水チャネルが現れる。

水の存在が望ましくない場合にはいつでも、非水性エマルションが通常の水性エマルションに代わることができる。しかしながら、非水性エマルションに関して、文献または先行技術における報告は数が少ない。２つのタイプの炭化水素ベースの非水性エマルション系が知られており、すなわち（１）ブロックコポリマーによって安定化される２つの不混和性有機溶媒（例えば、ヘキサン／ジメチルホルムアミド）、および（２）既存の界面活性剤を使用した、油と、水に置き代わる不混和極性溶媒（例えば、ホルムアミド、アセトニトリル）と、である。以前には、ペルフルオロ化油中水（Ｗ／Ｆ）エマルションが研究されており、単一細胞または単一分子生物学的アッセイのための液滴ベースのマイクロフルイディックスにおいて広く適用されてきた。これらの研究では、ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥが、フッ化炭素溶媒中の水滴を安定化するためのフッ素系界面活性剤（ＦＳ）として使用されている。

通常は一方が極性で他方が非極性である、多くの不混和性溶媒対が利用可能であるが、課題は、ポリマーマイクロスフェアの合成に好適である対を見つけることである。典型的な生体分解性ポリマー、例えば、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（オルトエステル）（ＰＯＥ）はほとんど、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチルなどの中度極性を有する溶媒に可溶性である。これにより、連続相の選択肢が限定される。加えて、プロセスとの適合性、毒性、安全性、および残留溶媒が、これらの有機溶媒を使用することの懸念事項であり、医薬品としての使用のためには検討を要する。

フッ化炭素は、以下の一般的な特性のため、非水性エマルション系における連続相として使用することができる。
１．フッ化炭素は、「疎水性」でも「親水性」でもなく、ほとんどの有機（炭化水素）溶媒と不混和性であり、そのことがフッ化炭素を炭化水素液滴エマルションの連続相として理想的なものとした。
２．フッ化炭素は、タンパク質および他の親水性分子、炭化水素系ポリマー、ならびに有機賦形剤にとって非溶媒であり、すなわち、これらのタイプの分子はフッ化炭素に可溶性ではない。
３．フッ化炭素は、低い粘性を有する。
４．フッ化炭素は、化学的に不活性であり、一般的に使用される炭化水素溶媒と比較して相対的に毒性または腐食性が低くなり得る。
５．フッ化炭素は、揮発性でリサイクル可能である。

以前の文献は、マイクロフルイディックス法を介して、フッ化炭素中水（Ｗ／Ｆ）、水中フッ化炭素中水（Ｗ／Ｆ／Ｗ）二重エマルション、水／フッ化炭素／油／水（Ｗ／Ｆ／Ｏ／Ｗ）三重エマルション、フッ化炭素／炭化水素／水（Ｆ／Ｈ／Ｗ）二重エマルション、および炭化水素／フッ化炭素／水（Ｈ／Ｆ／Ｗ）二重エマルションなど、フッ化炭素を含有する様々な種類のエマルション系が作製されてきたことを報告していた。これらのエマルションのいくつかは、ポリマーマイクロスフェアの合成に使用されている。しかしながら、それらはすべて、分散相または連続相として水を使用する水性ベースのエマルション系である。

したがって、本発明の目的は、薬剤製剤の製造のための非水性エマルション系およびそれらの使用方法を提供することである。

本発明の別の目的は、改善されたタンパク質安定性および安定した延長放出を有する延長放出製剤を提供することである。

ポリマー微粒子およびポリマーコーティング微粒子を製造するための非水性エマルション方法が提供される。一実施形態は、タンパク質粉末および生体分解性または生体侵食性ポリマーを炭化水素溶媒中に混合して非水性の第１の溶液を形成すること、および第１の溶液を第２の溶液に添加することによって、持続放出または制御放出微粒子組成物を製造するための方法を提供し、ここで第２の溶液は、フッ化炭素液およびフッ素系界面活性剤を含んで、フッ化炭素液中に複数のエマルション炭化水素液滴を含有する非水性エマルションを形成する。いくつかの実施形態において、エマルションは、バルクエマルションによって形成される。本方法は、炭化水素溶媒を除去し、フッ化炭素液を除去して、持続放出または制御放出微粒子を単離するステップをさらに含み、持続放出微粒子は、タンパク質粉末の１つ以上のコアおよび生体分解性または生体侵食性ポリマーの被殻を含有する。フッ化炭素液および炭化水素液は、非水性エマルションを撹拌しながら、フッ化炭素液および炭化水素液を周囲大気圧下または真空下で蒸発させながら除去することができる。いくつかの実施形態において、フッ化炭素液は、ハイドロフルオロエーテル（ＨＦＥ）を含有するか、または乳化後に、追加のＨＦＥが非水性エマルションに添加されて、炭化水素をフッ化炭素液中に素早く抽出し、マイクロスフェア硬化を加速させた。いくつかの実施形態において、タンパク質粉末は、微粒子化（micronized）タンパク質粉末である。いくつかの実施形態において、微粒子を洗浄して、微粒子上に残存する残留炭化水素溶媒、フッ化炭素液、フッ素系界面活性剤、またはそれらの組み合わせを除去する。例示的なフッ化炭素液には、ＦＣ－４０を含むがこれに限定されない、ペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物が含まれる。いくつかの実施形態において、フッ化炭素液は、ＨＦＥを含有する。例示的な炭化水素溶媒には、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的なフッ素系界面活性剤は、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥ）トリ－ブロックコポリマーである。例示的な生体侵食性ポリマーは、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、または組換えタンパク質である。一実施形態において、タンパク質は、噴霧乾燥ＶＥＧＦトラップタンパク質である。いくつかの実施形態において、微粒子は、１．０～１００μｍまたは１．０～２００μｍの直径を有する。一実施形態において、開示される非水性エマルション方法によって形成される微粒子は、流動性微粒子組成物である。開示される流動性微粒子組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、ｐＨ緩衝化生理食塩水中に懸濁され得、または中鎖トリグリセリドなどの油性ビヒクルに懸濁され得る。流動性微粒子組成物は、例えば、２７Ｇ針付きシリンジを使用して、非経口的に投与することができる。

別の実施形態は、炭化水素溶液中に懸濁された１．０～３０．０％ｗ／ｖの噴霧乾燥タンパク質を含む分散相（ここで炭化水素溶液は５．０～４０％ｗ／ｖのＰＯＥを含む）を連続相中に乳化して、分散相のエマルション液滴を形成することによって、ポリマーコーティングマイクロスフェアの集団を製造するための方法を提供し、ここで連続相は、０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤および任意でＨＦＥを含む。本方法は、エマルションを撹拌しながら炭化水素液を除去することによりエマルション液滴を硬化させて、ポリマーコーティング微粒子の集団を形成すること、および任意で微粒子を洗浄して、炭化水素溶液、フッ化炭素溶液、フッ素系界面活性剤、またはそれらの組み合わせを除去することをさらに含む。一実施形態において、炭化水素溶液およびフッ化炭素溶液は、周囲大気圧下または真空下での蒸発によって除去される。

さらに別の実施形態は、溶解されたポリマーを含有する炭化水素溶液を噴霧乾燥タンパク質粉末と混合して分散相を生成すること、および分散相を連続相と混合して、連続相中に分散相のエマルション液滴を生成することによって、ポリマーコーティング微粒子を製造するための方法を提供し、ここで連続相は、フッ化炭素液および０．２～５．０％ｗ／ｖのＦＳ、ならびに任意でＨＦＥを含む。本方法は、真空下でエマルションを撹拌することにより炭化水素溶液およびフッ化炭素溶液を除去して微粒子を硬化させ、次いでポリマーコーティング微粒子を収集することを含む。本方法はまた、収集した微粒子を洗浄する任意のステップを含む。

さらに別の実施形態は、炭化水素溶媒中にポリマーを含有する第１の溶液を、フッ化炭素溶媒およびフッ素系界面活性剤を含有する第２の溶液と混合すること、および混合された溶液を撹拌してエマルションを生成することによって、微粒子を製造するための方法を提供する。本方法は、混合された溶液を撹拌しながら真空下で炭化水素溶媒を除去して微粒子を硬化させるステップと、微粒子を収集するステップと、を含む。本方法は、任意で微粒子を洗浄し、微粒子を乾燥させることを含む。

別の実施形態は、本明細書に記載の非水性エマルション方法によって製造されるポリマーコーティング微粒子を提供する。いくつかの実施形態において、微粒子は、微粒子のポリマー表面または内部マトリックスに孔またはチャネルをほとんどまたはまったく有しない。

さらに別の実施形態は、本明細書に開示される非水性エマルション方法を使用して製造されるポリマーコーティング微粒子を含有する医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、微粒子のサイズは、配合組成およびプロセスパラメータを変化させることによって、所望の直径またはサイズに調整することができる。

図１Ａは、Ｈ／Ｆベースのバルクエマルションを介したブランクＰＯＥマイクロスフェア製造のプロセス－スキーム１を示す図である。図１Ｂは、ＦＣ－４０について化学構造を示す。図１Ｃは、ペルフルオロポリエーテル／ポリ（エチレングリコール）トリブロックコポリマーである、フッ素系界面活性剤ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥ（Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１）の化学構造を示す。Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１は、例えば、ＦＣ－４０中に５％（ｗ／ｗ）として市販されている。 図２Ａは、Ｈ／Ｆエマルションを介して形成されたブランクＰＯＥマイクロスフェアの顕微鏡写真である。図２Ｂは、低ＦＳ含有量で認められたＰＯＥ凝集を示す顕微鏡写真である。 図Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、低、中、および高の均質化速度によるＨ／Ｆエマルションを介して形成されたブランクＰＯＥマイクロスフェアの顕微鏡写真である。 （スキーム２）Ｓ／Ｈ／Ｆベースのバルクエマルションを介したＰＯＥマイクロスフェア内でのＳＤＰ封入のプロセスを示す図である。 （スキーム３）タンパク質ＳＤＰの封入のためのフッ化炭素中炭化水素エマルション系を示す図である。 図Ａおよび６Ｂは、ＦＣ－４０中に分散された、ＰＯＥおよび蛍光標識噴霧乾燥タンパク質（Ｆ－ＳＤＰ）を含有する酢酸エチル液滴の蛍光画像である。Ｆ－ＳＤＰは、液滴内で、その元のサイズおよび形態を保持したことに留意されたい。 図７Ａは、ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入マイクロスフェアの明視野顕微鏡写真である。図７Ｂは、ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入マイクロスフェアの蛍光画像である（バー＝２０μｍ）。図７Ｃは、ＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入マイクロスフェアの蛍光画像である（バー＝１０μｍ）。 図８Ａ～８Ｄは、水性環境中に配置されたＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入ＰＯＥマイクロスフェアの蛍光画像である。Ｆ－ＳＤＰは、液滴内で、元のサイズおよび形態を保持したことに留意されたい。 非水性エマルション方法においてジクロロメタン（ＤＣＭ）または酢酸エチル（ＥｔＡｃ）を使用して製造された微粒子についての体積密度（％）対サイズ（μｍ）の線グラフである。 図１０Ａおよび１０Ｂはそれぞれ１０％および３０％ｗ／ｗのＶＥＧＦトラップＳＤＰが積載された（loaded）微粒子の顕微鏡写真である。 図１１Ａおよび１１Ｂはそれぞれ１０％および３０％ｗ／ｗのＳＤＰが積載されたＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰ封入ＰＯＥマイクロスフェアの代表的な蛍光画像である。Ｆ－ＳＤＰは、液滴内で元のサイズおよび形態を保持したことに留意されたい。 図１２Ａ～１２Ｃは、５％、１０％、および３０％ｗ／ｗのＳＤＰが積載された微粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像であり、ＳＤＰ積載が増加すると微粒子の表面におけるタンパク質が増加することを示す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、２．１８μｍおよび５．６３μｍのＤｖ５０を有する噴霧乾燥タンパク質のＳＥＭ画像である。 図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、ＰＬＡマイクロスフェアに封入されたＶＥＧＦ－トラップＦ－ＳＤＰの明視野、蛍光、およびＳＥＭ画像である。 図１５Ａおよび１５Ｂは、ＰＬＧＡマイクロスフェアに封入されたＶＥＧＦ－トラップＦ－ＳＤＰの明視野および蛍光画像である。

Ｉ．定義
本開示は、本明細書に記載の組成物および方法、ならびに記載の実験条件に限定されず、従って変化し得ることを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することは意図されないことが理解されるべきである。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等である任意の組成物、方法、および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。言及されるすべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本願でクレームされる発明を記述する文脈において（特に、特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の指示物の使用は、本明細書で別段の指示がなされるか、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅するように解釈されるべきである。

本明細書において値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、単にその範囲内に含まれる各別個の値に個別に言及することの簡略法として機能することが意図され、各別個の値は、それが本明細書に個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。

「約」という用語の使用は、記載された値を、おおよそ＋／－１０％の範囲内で上回るか、または下回るいずれかの値を説明することが意図される。他の実施形態において、その値は、記載された値を、おおよそ＋／－５％の範囲内で上回るか、または下回るいずれかの値の範囲内であり得、他の実施形態において、その値は、記載された値を、おおよそ＋／－２％の範囲内で上回るか、または下回るいずれかの値の範囲内であり得、他の実施形態において、その値は、記載された値を、おおよそ＋／－１％の範囲内で上回るかまたは下回るいずれかの値の範囲内であり得る。前述の範囲は、文脈によって明確にされることが意図され、さらなる制限は意味されない。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。本明細書に提供されるあらゆるすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良く明らかにすることを意図しており、特に別段のクレームがない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、何らかの非クレーム要素を本発明の実施に不可欠なものとしてと示していると解釈されるべきではない。

「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質は、ポリペプチドおよびペプチドを含み、また、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰ－リボシル化などの修飾を含み得る。タンパク質は、タンパク質ベースの薬物を含め、科学的または商業的な関心対象となるものであり得、タンパク質には、とりわけ、酵素、リガンド、受容体、抗体、およびキメラまたは融合タンパク質が含まれる。タンパク質は、周知の細胞培養法を使用して様々なタイプの組換え細胞によって産生され、一般に、遺伝子操作技術（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンのない配列など）によって細胞に導入され、それはエピソームとして存在するか、または細胞のゲノムに組み込まれ得る。

「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である４つのポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に向けてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置される。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方に対する言及を含む。「抗体」という用語は、その抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体分子を含む。抗体という用語はまた、二重特異性抗体を含み、これには複数の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンが含まれる。二重特異性抗体は、米国特許第８，５８６，７１３号に一般的に記載されており、それは参照により本出願に組み込まれる。

「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部または全部を含み、そのうちの１つは免疫グロブリン分子のＦｃ部分であり、それらは自然界では一緒に見出されない。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０、およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４における”Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ページ１０．１９．１－１０．１９．１１，１９９２によって報告されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分にカップリングされた受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含み、これは、いくつかの実施形態において、免疫グロブリンのヒンジ領域とそれに続くＣＨ２およびＣＨ３ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンドに結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質はトラップであり、例えば、ＩＬ－１トラップまたはＶＥＧＦトラップなどである。

「微粒子化タンパク質粒子」または「タンパク質粒子」は、低いか、非常に低いか、またはゼロに近い量の水（例えば、重量で＜３％の水）を有する、複数のタンパク質分子を含有する粒子を意味する。本明細書で使用される場合、微粒子化タンパク質粒子は、概して形状が球形であり、２ミクロン～約３５ミクロンの範囲のＥＣＤを有する。微粒子化タンパク質粒子は、特定のタンパク質実体に限定されず、治療用タンパク質の調製および送達に適している。一般的な治療用タンパク質には、とりわけ、抗原結合タンパク質が含まれ、例えば、可溶性受容体断片、抗体（ＩｇＧを含む）および抗体の誘導体または断片、Ｆｃ融合タンパク質を含む他のＦｃ含有タンパク質、ならびにＶＥＧＦトラップなどのトラップ型タンパク質（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６９２－９９（２００９））を含む受容体Ｆｃ融合タンパク質などが挙げられる。

ＩＩ．炭化水素－フッ化炭素エマルションを使用したマイクロスフェア製剤の製造
無水エマルション系を使用した医薬組成物を製剤化するためのシステムおよび方法が提供される。開示される無水エマルション方法は、既存の水性エマルション系のいくつかの問題を克服する。例えば、本明細書に提供される、開示される無水エマルション系と既存の水性エマルション系との間の比較試験は、水性エマルション系を使用して製造される製剤が、製造中に、エマルション液滴から水性連続相へと薬物（例えばタンパク質薬物）を漏出させることを示す。このエマルション液滴からの薬物の漏出は、低い封入有効性をもたらす。本明細書に記載の開示される非水性ベースのエマルション方法は、タンパク質などの親水性薬物を含むがこれらに限定されない薬物分子を、水性エマルション系と比較して増加した封入有効性で封入し、元のタンパク質粒子構造を維持し、またはそれらの組み合わせである。開示される無水エマルション系および方法は、バルク法（すなわち、撹拌（agitation）、均質化（homogenization）、超音波処理）および他の従来の方法によって封入薬物製剤を製造することができる。当該系および方法はまた、広範囲のポリマー材料、固体状態ペイロード、および乳化法に適用することができる。表１は、異なるエマルションの比較結果を示し、非水性エマルション系が、水性エマルション系と比較して微粒子封入における有意な改善であることを実証する。

Ａ．フッ化炭素中炭化水素中固体（Ｓ／Ｈ／Ｆ）エマルション
例示的な非水性Ｓ／Ｈ／Ｆエマルション方法は、乾燥タンパク質粉末ならびに生体分解性および／または生体侵食性ポリマーを炭化水素溶媒中に混合して、非水性の第１の溶液を形成するステップと、フッ化炭素液およびフッ素系界面活性剤から構成された第２の溶液に第１の溶液を添加するステップと、を含む。第１および第２の溶液の混合は、例えば、撹拌、超音波処理、キャビテーション、均質化、またはボルテックス撹拌によって、フッ化炭素液中に複数のエマルション炭化水素液滴を含有する非水性エマルションを形成する様式で行われる。本方法は、炭化水素溶媒を除去するステップと、フッ化炭素液を除去して、微粒子化タンパク質の１つ以上のコアおよび生体分解性ポリマーの被殻を有する微粒子を単離するステップと、を含む。一実施形態において、エマルションを撹拌して、炭化水素液およびフッ化炭素液を真空下で蒸発させる。得られる微粒子は、任意で洗浄して、炭化水素溶媒、フッ化炭素液、フッ素系界面活性剤、またはそれらの組み合わせを除去することができる。エマルションは、バルクエマルション技術を使用して形成することができる。

一実施形態は、タンパク質粉末および生体分解性または生体侵食性ポリマーを炭化水素溶媒中に混合して非水性の第１の溶液を形成することと、フッ化炭素液、フッ素系界面活性剤、および任意でＨＦＥを含有する第２の溶液に、第１の溶液を添加して、フッ化炭素液中に、タンパク質粉末を含有する複数のエマルション炭化水素液滴を含有する非水性エマルションを形成することと、によって持続放出微粒子組成物を製造する方法を提供する。エマルションは、均質化、ボルテックス撹拌、超音波処理、キャビテーション、撹拌、またはそれらの組み合わせを使用して形成することができる。本方法は、エマルションを撹拌しながら、炭化水素溶媒およびフッ化炭素液を除去するステップをさらに含む。炭化水素およびフッ化炭素液は、任意で真空下において、蒸発によって除去することができる。他の実施形態において、微粒子は、濾過によって収集することができる。炭化水素液およびフッ化炭素液を除去することは微粒子を硬化させ、続いてこれが収集され得る。いくつかの実施形態において、より速い硬化プロセスのために、ＨＦＥをフッ素炭素に添加して、炭化水素を分散相からフッ素炭素連続相へと抽出することを促進することができる。ＨＦＥは、フッ化炭素および炭化水素の両方と混和性であり、したがって、フッ化炭素相中の炭化水素の溶解性を高める共溶媒として作用することができる。非水性エマルション方法によって製造された持続放出微粒子は、生体分解性または生体侵食性ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含有する。いくつかの実施形態において、微粒子は、単一コア－シェル構造を有する。他の実施形態において、微粒子は、ポリマー内に分散された複数のコアを有する。さらに他の実施形態において、微粒子の集団は、ポリマー被殻によって封入された単一コア構造を有する微粒子と、ポリマー被殻内に複数のコア構造を有する微粒子と、を含む。フッ化炭素液は、ＦＣ－４０を含むがこれに限定されないペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物であることができ、炭化水素溶液は、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、およびジクロロメタン、またはそれらの組み合わせの群から選択される。一実施形態において、フッ素系界面活性剤は、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１として市販されている、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルである。いくつかの実施形態において、生体侵食性ポリマーは、ＰＯＥである。他の実施形態において、ポリマーは、ポリ乳酸およびポリ（乳酸－コ－グリコール酸）からなる群から選択される。一般に、タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの断片もしくは切詰型（truncated version）である。典型的には、タンパク質は、例えば、噴霧乾燥、エレクトロスプレー乾燥、可逆的沈殿、噴霧凍結、マイクロテンプレート法、またはそれらの組み合わせによって微粒子化される。一実施形態において、タンパク質は、ＶＥＧＦトラップタンパク質またはその切詰形態（truncated form）である。開示される方法で使用することができる他のタンパク質が、以下に記載される。開示される方法によって製造される微粒子は、孔またはチャネルを欠いているポリマー被殻を有する。ポリマー被殻は、孔化されない。いくつかの実施形態において、微粒子は、１～２００μｍの直径を有する。

別の実施形態は、（１）炭化水素溶液に懸濁された１．０～３０．０％ｗ／ｖの噴霧乾燥タンパク質を有する分散相であって、炭化水素溶液が、５．０～３０％ｗ／ｖのＰＯＥを含む、分散相を、（２）連続相中に混合して、分散相のエマルション液滴を形成することによって、ポリマー被覆マイクロスフェアを製造するための方法を提供し、ここで連続相は、０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を含むフッ化炭素溶液を含む。本方法は、炭化水素溶液を除去することによってエマルション液滴を硬化させて、硬化ポリマー被覆マイクロスフェアを形成することを含む。一実施形態において、フッ化炭素溶液は、ＦＣ－４０を含むがこれに限定されないペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物であることができ、炭化水素溶液は、酢酸エチル、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、およびジクロロメタン、またはそれらの組み合わせの群から選択される。一実施形態において、フッ素系界面活性剤は、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１として市販されている、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルである。本方法は、真空下でエマルションを撹拌して、炭化水素溶液およびフッ化炭素溶液を除去するステップを含む。

さらに別の実施形態は、溶解されたポリマーを含有する炭化水素溶液および噴霧乾燥タンパク質粉末を混合して分散相を生成することによって、ポリマーコーティング微粒子を製造するための方法を提供する。本方法は、分散相を連続相と混合して、連続相中に分散相のエマルション液滴を生成すること（ここで連続相は、フッ化炭素液および０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を含有する）と、ポリマーコーティング微粒子を収集することと、を含む。炭化水素溶液は、酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、またはそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。一実施形態において、フッ化炭素溶液は、ＦＣ－４０を含有し、界面活性剤は、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１として市販されているペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルである。

１．炭化水素溶媒
いくつかの実施形態において、炭化水素溶媒（炭化水素液とも称される）は、ポリマー材料、例えば、生体分解性または生体侵食性ポリマーが、該炭化水素に可溶であるように選択される。いくつかの実施形態において、炭化水素溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、炭化水素溶媒は、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトン、エタノール、メタノール、ペンタン、プロパノール、ヘキサン、またはそれらの組み合わせを含有することができる。

２．フルオロ液
例示的なフルオロ液は、フッ化炭素液であり、Ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ－４０（平均ＭＷ＝６５０ｇ／ｍｏｌ）１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミン（図１Ｂ）、Ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ－７０（平均ＭＷ＝８２１ｇ／ｍｏｌ）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、フッ化炭素液は、ハイドロフルオロエーテル（ＨＦＥ）であるか、またはそれを含有する。例示的なＨＦＥには、ＮＯＶＥＣ（商標）７０００（１－メトキシヘプタフルオロプロパン）、ＮＯＶＥＣ（商標）７１００（メトキシ－ノナフルオロブタン）、ＮＯＶＥＣ（商標）７２００（エトキシ－ノナフルオロブタン）、ＮＯＶＥＣ（商標）７５００（２－（トリフルオロメチル）－３－エトキシドデカフルオロヘキサン）が含まれるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態において、フッ化炭素液は、ＦＣ－４０、ＦＣ－７０、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００、Ｎｏｖｅｃ（商標）７１００、Ｎｏｖｅｃ（商標）７０００、またはそれらの組み合わせを含有する。特定の実施形態において、第２の溶液は、フルオロ液に加えてフッ素系界面活性剤（ＦＳ）を含有する。例示的なＦＳは、Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１として市販されているペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテル（ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥ）トリブロックコポリマーである。一実施形態において、フッ化炭素液または第２の溶液は、ＦＣ－４０およびＰｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１を含有する。

いくつかの実施形態において、ＦＳは、

であって、式中、ｎ＝約３７、ｘ＋ｚ＝約６．０、ｙ＝約１２．５であるか、またはｎ＝３．７、ｘ＋ｚ＝約３．６、ｙ＝約９．０である（Ｌｅｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｃｈｉｐ．，７：１４（３）：５０９－１３（２０１４））。

一実施形態において、ＨＦＥは、以下の化学構造を有する。

該プロセスでの使用に適した他のＨＦＥは、フッ素置換を有しない炭素にすべての水素原子が存在し、エーテル酸素によってフッ素化炭素から分離されている分子のクラス、すなわちＲｆＯＲｈである。ＨＦＥは、直鎖状、分岐状、環状、またはそれらの組み合わせ（例えば、アルキルシクロ脂肪族）であることができる分子構造を有し、好ましくは、エチレン系不飽和を含まず、合計で約４～約２０個の炭素原子を有する。かかるＨＦＥは既知であり、本質的に純粋な化合物または混合物のいずれかとして容易に入手可能である。ＨＦＥの親油性および親フルオロ性のため、それらはフッ化炭素および炭化水素の両方と混和性である。炭化水素／フッ化炭素エマルションに添加される場合、それらは共溶媒として作用して、炭化水素をフッ化炭素相に抽出し、硬化プロセスを加速することができる。

いくつかの実施形態において、炭化水素溶媒、フッ素炭素、またはそれらの両方は、エマルションを撹拌しながら、任意で真空下において、蒸発によって除去される。いくつかの実施形態において、微粒子は、濾過、任意で真空下での濾過によって、収集される。

フッ化炭素相中のＨＦＥの割合は、０～２０％ｖ／ｖであることができるが、ＨＦＥの割合を増加させると、炭化水素抽出率が増加する。しかしながら、マイクロスフェアのサイズおよび形態を制御することがより難しくなり得るため、ＨＦＥの割合を高くし過ぎることはできない。

３．侵食性または生体分解性ポリマー
一実施形態において、ポリマーは、生体分解性または生体侵食性のポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、分岐状または直線状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ－ｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡ－エチレンオキシドフマレート、ポリエチレングリコール１０００にエステル化されたＰＬＧＡ－アルファ－トコフェリルスクシネート（ＰＬＧＡ－ＴＧＰＳ）、ポリ無水ポリ［１，６－ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン］（ｐＣＰＨ）、ポリ（ヒドロキシ酪酸－コヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢ－ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール－ポリ（乳酸）コポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＡ）、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ－アルキル－シアノ－アクリレート（ＰＡＣ）、ポリ（エチル）シアノアクリレート（ＰＥＣ）、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ））、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ－β－Ｒ－リンゴ酸、リン脂質－コレステロールポリマー、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン／ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＣ／ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）／コレステロール、ポリサッカライド、セルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、アルギネート、デキストランおよびデキストランヒドロゲルポリマー、アミロース、イヌリン、ペクチンおよびグアーガム、キトサン、キチン、ヘパリン、ヒアルロン酸、シクロデキストリン（ＣＤ）ベースのポリロタキサンおよびポリシュードロタキサン、ポリアスパラテート、ポリグルタメート、ポリルシン、ロイシン－グルタミン酸コポリマー、ポリブチレンスクシネート、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、フィブロイン、ポリオルトエステル、ポリオルトエステル－ポリアミジンコポリマー、ポリオルトエステル－ジアミンコポリマー、潜在酸を組み込んだポリオルトエステル、ポリ（エチレングリコール）／ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマー、ならびにそれらの組み合わせおよびコポリマーからなる群から選択される。一実施形態において、ポリマーは、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）またはその誘導体もしくはコポリマーである。一実施形態において、ポリマーは、ＰＬＧＡまたはその誘導体もしくはコポリマーである。一実施形態において、ポリマーは、エチルセルロースまたはその誘導体もしくはコポリマーである。一実施形態において、ポリマーは、ポリオルトエステルまたはその誘導体もしくはコポリマーである。一実施形態において、ポリマーは、ポリエステルアミドである。

本明細書で使用される場合、「ポリマー」という用語は、共有化学結合によって連結された反復モノマーを含む巨大分子を指す。ポリマーは、生体適合性および生体分解性浸食性である。生体適合性および生体分解性ポリマーは、天然または合成であることができる。天然ポリマーには、ポリヌクレオチド、ポリペプチドである天然に存在するタンパク質、組換えタンパク質、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、フィブロイン、ポリアスパラギン酸塩、ポリグルタミン酸塩、ポリリジン、ロイシン－グルタミン酸塩コポリマーなど、ならびにポリサッカライドであるアルギン酸セルロース、デキストランおよびデキストランヒドロゲルポリマー、アミロース、イヌリン、ペクチンおよびグアーガム、キトサン、キチン、ヘパリン、およびヒアルロン酸などが含まれる。合成の生体適合性または生体分解性ポリマーには、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ－ｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡ－エチレンオキシドフマレート、ポリエチレングリコール１０００にエステル化されたＰＬＧＡ－アルファコ－コフェリルスクシネート（ＰＬＧＡ－ＴＧＰＳ）、ポリ無水物ポリ［１，６－ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）ヘキサン］（ｐＣＰＨ）、ポリ（ヒドロキシ酪酸－コヒドロキシ吉草酸）（ＰＨＢ－ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール－ポリ（乳酸）コポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＡ）、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ－アルキル－シアノ－アクリレート（ＰＡＣ）、ポリ（エチル）シアノアクリレート（ＰＥＣ）、ポリイソブチルシアノアクリレート、ポリ－Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ポリ（ＨＰＭＡ））、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ－β－Ｒ－ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ－β－Ｒ－リンゴ酸、リン脂質－コレステロールポリマー、２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン／ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＣ／ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）／コレステロール、エチルセルロース、シクロデキストリン（ＣＤ）ベースのポリロタキサンおよびポリシュードロタキサン、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）、ポリオルトエステル、ポリオルトエステル－ポリアミジンコポリマー、ポリオルトエステル－ジアミンコポリマー、分解速度を制御する潜在酸を組み込んだポリオルトエステル、ならびに、とりわけポリ（エチレングリコール）／ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリマーが含まれる。

エチルセルロース（ＥＣ）は、薬学および食品科学で使用される良く知られた容易に入手可能な生体材料である。それは、グルコースヒドロキシル基のいくつかがエチルエーテルで置換されたセルロース誘導体である。Ｍａｒｔｉｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，２２（５）：５４９－５６１（２００５）およびその参考文献を参照し、そこにはマイクロスフェアの製造において生体適合性ポリマーとしてエチルセルロースを使用する方法が記載されている。エチルセルロースの詳細な説明およびエチルセルロースの誘導体を作製する方法について、ＵＳ４，２１０，５２９（１９８０）およびその参照文献も参照されたい。

ポリ－ｄ，ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ）もまた、組織工学および医薬品送達系で使用される、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認のよく知られた生体適合性および生体分解性ポリマーである。ＰＬＧＡは、グリコール酸および乳酸モノマーを含むポリエステルである。ＰＬＧＡの合成およびＰＬＧＡナノ粒子の製造の説明について、Ａｓｔｅｔｅ ａｎｄ Ｓａｂｌｉｏｖ，Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．，１７（３）：２４７－８９（２００６）およびその参考文献を参照されたい。

ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）は、薬物送達デバイスとしてヒトにおける使用のためにＦＤＡによって承認された、別の生体適合性および生体分解性ポリマーである。ＰＣＬは、ε－カプロラクトンのポリエステルであり、体内で急速に加水分解して、非毒性または低毒性のヒドロキシカルボン酸を形成する。ＰＣＬの製造方法の説明について、Ｌａｂｅｔ ａｎｄ Ｔｈｉｅｌｅｍａｎｓ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３８：３４８４－３５０４（２００９）およびその参考文献を参照されたい。送達システムとしてのＰＣＬベースのマイクロスフェアおよびナノスフェアの製造および使用の説明について、Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，２７８（１）：１－２３（２００４）およびその参考文献を参照されたい。

ポリオルトエステル（ＰＯＥ）は、薬物送達のために設計された生体侵食性ポリマーである。それは一般に、ケテンアセタール、好ましくは環状ジケテンアセタール（例えば、３，９－ジメチレン－２，４，８，１０－テトラオキサスピロ［５．５］－ウンデカンなど）のポリマーであり、グリコール縮合を介して重合化されて、オルトエステル結合を形成する。ポリオルトエステル合成および種々のタイプの説明は、例えば、ＵＳ４，３０４，７６７に認めることができる。ポリオルトエステルは、例えば、ヘキサネトリオールをデカネトリオールで置き換えることなどのように、種々の疎水性ジオールおよびポリオールを組み入れたり除いたりすることによって、ならびに、例えば、グリコリド、オクタン二酸などの潜在酸を骨格に添加してｐＨ感受性を増加させることによって、それらの薬物放出プロファイルおよび分解速度を制御するように修飾することができる。ＰＯＥのカスタム形態は、質量損失および薬物放出を調整するために、グリコール酸をＰＯＥ骨格に含むことができる。ポリオルトエステルに対する他の修飾には、官能性を高めるためにアミンを組み込むことが含まれる。ポリオルトエステルの形成、説明、および使用は、ＵＳ５，９６８，５４３、ＵＳ４，７６４，３６４、Ｈｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，５（５）：１６２５－３２（２００４）、およびＨｅｌｌｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５７：２０５３－６２（２００５）に記載されている。

４．タンパク質薬物
いくつかの実施形態において、開示される無水エマルション方法および系によって製造される微粒子製剤は、薬物（drug）を含む。例示的な薬物には、タンパク質、融合タンパク質およびその断片、抗体およびその抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、タンパク質は、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号、第７，２７９，１５９号、および第８１４４８４０号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＶＥＧＦトラップタンパク質（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有する、Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）である。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦトラップタンパク質は、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第７，３９６，６６４号に記載されるようなＶＥＧＦトラップの切詰形態である。

いくつかの実施形態において、微粒子製剤中のタンパク質は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、もしくはテトラボディ、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－ＩＧ）と称される二重特異性四価免疫グロブリンＧ様分子、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。別の実施形態において、抗体は、キメラヒンジを含む。さらに他の実施形態において、抗体は、キメラＦｃを含む。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。

いくつかの実施形態において、抗体には、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許第９，９８７，５００号に記載のような抗ＰＤ１抗体、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許第９，９３８，３４５号に記載のような抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載のような抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載のような抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載のような抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載のような抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許第９，７９５，１２１号に記載のような抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗表皮増殖因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載のような抗ＥＧＦＲ抗体または米国特許第９，４７５，８７５号に記載のような抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロプロテイン転換酵素サブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許第９，５４０，４４９号に記載のような抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗成長および分化因子－８抗体（例えば、抗ＧＤＦ８抗体、抗ミオスタチン抗体としても知られており、米国特許第８，８７１，２０９号または第９，２６０，５１５号に記載されている）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許第９，５８７，０２９号または第９，６５７，０９９号に記載のような抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１号（放棄された）または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは第８，９４５，５５９号に記載のような抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、第８，０４３，６１７号、または第９，１７３，８８０号に記載のような抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号または第９，６３７，５３５号に記載のような抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号および第１０，１２５，１８８号、ならびに米国特許出願公開第２０１９／００３１７４１Ａ１号に記載のような抗ＲＳＶ抗体）、抗分化抗原群３（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号に記載のような抗ＣＤ３抗体）、抗分化抗原群２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号およびＵＳ２０１５／０２６６９６６Ａ１、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載のような抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化抗原群４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載のような抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許第９，７１８，８７２号に記載のような抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許第９，７７１，４１４号に記載のような抗エボラ）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号（放棄された）、ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および第９，３５３，１７６号に記載のような抗ＮＧＦ抗体）、ならびに抗プロテインＹ抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許第９，６５７，１０２号およびＵＳ２０１５／０２６６９６６Ａ１に記載）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、および抗ＣＤ３×抗前立腺特異性膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、関心対象のタンパク質は、アブシキシマブ、、アダリムマブ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、ａｄｏ－トラスツズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、セルトリズマブペゴル、セミプリマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、エムタンシネアリロクマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、ファシヌマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ａｂｄａ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トレボグルマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、複合体中のタンパク質は、Ｆｃ部分および別のドメインを含む組換えタンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、受容体Ｆｃ融合タンパク質であり、Ｆｃ部分にカップリングされた受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧのヒンジ領域に続くＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、トラップタンパク質であり、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含むリロナセプト、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２７，００４号を参照されたい）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１０のＦｃに融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されたＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプトまたはｚｉｖ－アフリベルセプト）などが挙げられる。他の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、ＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質であり、これはＦｃ部分にカップリングされた抗体の可変重鎖断片および可変軽鎖断片などの１つ以上の抗原結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態において、初期状態のタンパク質は、乾燥粉末、例えば、微粒子化された乾燥粉末の形態である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、噴霧乾燥粉末（ＳＤＰ）である。タンパク質の溶液に代わる噴霧乾燥タンパク質の使用は、微粒子におけるより高いタンパク質積載量、および封入プロセスの際のより優れたタンパク質安定性という利点を有する。いくつかの実施形態において、乾燥タンパク質分子は、封入の全プロセスおよび保存状態の期間中、固体状態に維持され、安定化物質に囲まれたままである。いくつかの実施形態において、封入噴霧乾燥タンパク質は、高い回収および低い凝集体を示し、これはわずかな割合の表面タンパク質のみが界面に曝露されることによって表面相互作用が最小限になることに起因する可能性がある。いくつかの実施形態において、タンパク質は、封入前に微粒子化される。

Ｂ．微粒子（Microparticles）
一実施形態は、開示される非水性エマルション系を使用して製造される医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ポリマー被殻および微粒子化タンパク質コアを有する微粒子を含有する。いくつかの実施形態において、微粒子は、形状がほぼ球形である。いくつかの微粒子およびタンパク質コアは真球に近づくであろうが、他は形状がより不規則であろう。したがって、本明細書で使用される場合、「直径」という用語は、マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって決定される、または静的光散乱（ＳＬＳ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、もしくはレーザー回折分析などの光散乱法による体積平均直径もしくは数平均直径として決定される、（ａ）微粒子またはタンパク質コアを画定する球体の直径、（ｂ）微粒子またはタンパク質コアの境界内に収まる最も大きい球体の直径、（ｃ）（ａ）の画定された球体と（ｂ）の境界内の球体との間の任意の測定値（その２つの間の平均値を含む）、（ｄ）微粒子またはタンパク質コアの最長軸の長さ、（ｅ）微粒子またはタンパク質コアの最短軸の長さ、（ｆ）長軸の長さ（ｄ）と短軸の長さ（ｅ）との間の任意の測定値（その２つの間の平均値を含む）、および／あるいは（ｇ）円相当直径（「ＥＣＤ」）の、各々およびいずれかを意味する。直径は、一般に、マイクロメートル（μｍまたはミクロン）で表される。直径は、光学的測定または走査型電子顕微鏡測定によって決定することができる。

開示される非水性エマルション方法によって製造される微粒子は、低いか、非常に低いか、またはゼロに近い量の水（例えば、重量で＜３％の水）を伴って、タンパク質の複数の分子を含有する。本明細書で使用される場合、微粒子化タンパク質粒子は、２ミクロン～約３５ミクロン、もしくは２．０～５０μｍ、もしくは５．０～１５．０μｍの範囲、または約１０μｍのＥＣＤを有する。微粒子化タンパク質粒子は、特定のタンパク質実体に限定されず、上記のタンパク質を含む治療用タンパク質の調製および送達に適している。

例えば、タンパク質粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥およびミリング、ジェットミリング、非溶媒中の可逆的沈殿、造粒、漸進的沈殿（ＵＳ７，９９８，４７７（２０１１））、超臨界流体沈殿（ＵＳ６，０６３，９１０（２０００））、または高圧二酸化炭素誘導粒子形成（Ｂｕｓｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．１７：１３６０－６６（２０００））によって微粒子化され得る。本明細書で使用される場合、「噴霧乾燥」という語句は、噴霧乾燥機を使用することによって、スラリーまたは懸濁液からミクロンサイズの粒子を含む乾燥粉末を製造する方法を意味する。噴霧乾燥機は、噴霧器または噴霧ノズルを使用して、懸濁液もしくはスラリーを制御された液滴サイズ噴霧に分散させる。１０～５００μｍの液滴サイズを、噴霧乾燥によって生じることができる。溶媒（水または有機溶媒）が乾燥すると、タンパク質物質は乾燥してミクロンサイズになり、粉末様物質を形成するか、またはタンパク質－ポリマー懸濁液の場合には、乾燥の際に、タンパク質積載物の周りのポリマー硬化シェルを形成する。

いくつかの実施形態において、微粒子化タンパク質は、ＶＥＧＦトラップタンパク質である。微粒子化ＶＥＧＦトラップタンパク質粒子の形成のための医薬製剤は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦトラップタンパク質、約１．０～約５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約９５ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬのＶＥＧＦトラップタンパク質を含有し得る。

いくつかの実施形態において、開示される非水性エマルション系を使用して製造される微粒子は、ポリマー被殻内にタンパク質粒子コアを含有し、約２μｍ～約７０μｍ、約５μｍ～約６５μｍ、約１０μｍ～約６０μｍ、約１５μｍ～約５５μｍ、約１０μｍ～約５０μｍ、約１．０～１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、または約３０μｍの範囲の直径を有する。サイズの変動は、大部分がポリマー被殻の厚さを反映するが、タンパク質コアの直径もある程度サイズの変動に寄与し得る。

一実施形態において、開示される非水性エマルション方法によって形成される微粒子は、流動性微粒子組成物である。開示される流動性微粒子組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、ｐＨ緩衝化生理食塩水に懸濁され得る。流動性微粒子組成物は、非経口的に、例えば、２７Ｇ針付きシリンジなどのシリンジを使用して投与することができる。

微粒子は、タンパク質治療薬の期間放出または持続放出において有用である。いくつかの実施形態において、微粒子製剤は、硝子体内に、脈絡膜に、または皮下に注入される。例えばＶＥＧＦトラップ微粒子は、例えば血管性眼障害の治療のための硝子体におけるＶＥＧＦトラップ治療用タンパク質の延長放出において、または他の障害を治療するＶＥＧＦトラップの延長放出のための皮下埋め込みにおいて有用であることが想定される。

本発明の微粒子は、約３７℃の生理学的水性環境において、少なくとも６０日、９０日、１２０日、または１５０日までの延長期間にわたって、比較的一定した速度でタンパク質を放出する。

一実施形態は、本明細書に開示される非水性エマルション方法を使用して製造されるマイクロスフェアの組成物を提供し、該組成物は、＞１００ｍｇの噴霧乾燥タンパク質を含有する。一実施形態において、非水性エマルション方法は、＞９０％の収率を有し、＞９９％の純度で、５０～１００μＬの注入体積において＞１０％ｗ／ｗの積載量および＜１０％のバーストを有する微粒子を製造する。

実施例１：Ｈ／Ｆベースのバルクエマルションを介したブランクマイクロスフェア合成。
材料および方法
油および水性ベースのエマルション系は、ポリマーのマイクロ粒子またはナノ粒子の合成のために頻繁に使用され、その場合、疎水性ポリマー材料が有機相に溶解され、水性連続相に分散される。しかしながら、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ならびに水の存在下で容易に加水分解する、ポリ無水物、ポリ乳酸のような短い中間ブロックを有する脂肪族ポリエステル、およびポリ（グルタミン酸）のような特定のポリ（アミノ酸）を含むポリマーについては、従来の水性ベースのエマルション系は理想的ではない。以下の実施例は、上記の水溶性または水分解性ポリマー微粒子を製造するための開示されたＨ／Ｆエマルション系の有用性を実証する。いくつかの実施形態において、これらのポリマーは、最初に、極性溶媒（例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン）、およびより低極性の溶媒（例えば、ＤＣＭ、クロロホルム）を含む、炭化水素溶媒中に溶解される。次いで、このポリマー溶液を、ＦＳ（例えばＰｉｃｏｓｕｒｆ１）を伴うフッ化炭素液（例えばＦＣ－４０）である連続相に加える。撹拌、ボルテックス撹拌、または他の乳化方法を通じてエマルションが作製される。エマルション液滴は、炭化水素溶媒を蒸発させるかまたは抽出することによって、最終的に硬化されてポリマー球体になる。

特定の実施形態において、スキーム１（図１Ａ）に示すように、Ｈ／Ｆバルクエマルションを介したブランクＰＯＥマイクロスフェア合成のために、ＤＣＭ中約１０％、２０％、３０％、および４０％ｗ／ｖのＰＯＥを２００μＬ、０．５％ｗ／ｗ ＦＳ Ｐｉｃｏ－Ｓｕｒｆ（商標）１（Sphere Fluidics社）を含有する２ｍＬのＦＣ－４０に添加した。ボルテックス撹拌によって乳化が達成された。エマルション液滴は、ＦＣ－４０よりも軽く、溶液の上部に浮遊した。アリコートを採取し、顕微鏡撮像のためにスライドガラス上に滴下した。真空下で３時間撹拌しながらマイクロスフェアを硬化させた。ＦＣ－４０中の硬化ポリマー球体を、最初に０．２２ミクロンのＰＥＳ膜に通して真空濾過した。ＦＣ－４０はフィルターを通過し、マイクロスフェアは保持された。次いで、マイクロスフェアを追加のＦＣ－４０で洗浄し、真空下で完全に乾燥させた。同じプロセスによる別の実施例では、ＤＣＭ中の約３０％ｗ／ｖ ＰＯＥを炭化水素相において使用し、ＦＣ４０中の約０．０１％、０．１％、および０．５％ＦＳをフッ化炭素相で使用してＦＳ濃度の影響を評価した。

結果
ＦＳの存在下で、炭化水素およびフッ化炭素混合物は、Ｈ／Ｆエマルションを形成することができた。一例では、Ｈ／ＦエマルションとしてＤＣＭをＦＣ－４０中に分散させ（図１ＢにおけるＦＣ－４０の構造を参照されたい）、ＰＦＰＥ－ＰＥＧ－ＰＦＰＥをＦＳとして使用した（図１ＣにおけるＦＳの構造を参照されたい）。ＦＳの濃度を増加させていってＦＣ－４０フッ化炭素相に添加した。試験は、ＤＣＭ液滴の癒着を防止するために０．１～５％ｗ／ｗのＦＳを必要としたことを示した（図２Ａ）。０．１％ｗ／ｗ未満のＳＦを添加した場合、より広いサイズ分布が観察された。ＳＦを使用しない場合、ＤＣＭ液滴は安定しなかった。分散したＤＣＭ液滴はすぐに一緒にマージし、２つの相がすばやく分離する。結果は、安定したＨ／Ｆエマルションを生成するために十分な量のＦＳを使用すること、およびポリマーマイクロスフェアを成功裏に製造するために硬化プロセス中に連続的に撹拌することの必要性を示した。（図２Ｂ）。

ＤＣＭにＰＯＥを添加し、ＦＣ－４０中でボルテックス撹拌したことが、ＰＯＥ含有液滴の形成をもたらした。開放容器中における周囲条件、または真空下でのＤＣＭの蒸発は、液滴が硬化してＰＯＥマイクロスフェアとなることをもたらした（図２Ａおよび２Ｂ）。マイクロスフェアのサイズは、有機相中の液滴サイズおよびＰＯＥ含有量に関連した。ＰＯＥ濃度が高いほど、大きいマイクロスフェアサイズをもたらす（表１）。

実施例２：均質化速度の効果。
材料および方法
ＤＣＭ中３０％または４０％ｗ／ｖのＰＯＥの１ｍＬを、０．５％（ｗ／ｗ）ＦＳ ＦＣ－４０を含む９ｍＬのＦＣ－４０に添加し、ＶＷＲ ７ｍｍ×９５ｍｍ鋸歯型発生器プローブを備えたＶＷＲハンドヘルドホモジナイザー２００を用いて、３つの均質化速度である低（全出力の約５０％）、中（全出力の約６０％）、および高（全出力の約７０％）のうちの１つで乳化した。形成したエマルションを真空下で撹拌した。形成されたマイクロスフェアを洗浄し、真空下で乾燥させた。

結果
図３に示されるように、３０％ＰＯＥでは、低均質化速度は、より大きなマイクロスフェアサイズをもたらし、高均質化速度は、より小さいサイズをもたらした（表２）。４０％ＰＯＥは、同じ傾向を示した。これらの結果は、均質化速度を調整することによってマイクロスフェアサイズを制御することができることを示す。

実施例３：Ｓ／Ｈ／Ｆベースのバルクエマルション方法を介したＰＯＥマイクロスフェアにおけるタンパク質ＳＤＰ封入の一般的手順。
材料および方法
図４に示されるように、バルクエマルション合成は、配合、乳化、硬化の３つのステップに分けることができる。製造物の特性は、これら３つのステップで使用される異なるパラメータによって異なってくる。一般的な手順は次のとおりである。

配合することでは、全固体重量１０％～３０％ｗ／ｗのＶＥＧＦトラップＳＤＰ（または蛍光撮像のためには蛍光標識ＳＤＰ（Ｆ－ＳＤＰ））を、１０～３５％ｗ／ｖのＰＯＥを含有する５００μＬの酢酸エチル中に、ボルテックス撹拌およびその後の５分間の超音波処理によって分散させた。次いで、これらの懸濁液を、０．１～０．５％ｗ／ｗのＦＳを添加した９．５ｍＬのＦＣ－４０に加えた。乳化は、撹拌、ボルテックス撹拌、またはベンチトップホモジナイザーを使用する均質化によって達成することができる。エマルションの構造が図５に示される。乳化直後にプロセス中のアリコートを採取し、顕微鏡撮像のためにスライドガラス上に滴下した。周囲条件下で蒸発を通して液滴をスライド上に硬化させた。マイクロスフェアを硬化させるために、（ａ）溶液を、開放容器中で一晩、周囲条件下で撹拌して、酢酸エチルを蒸発させること、（ｂ）溶液を、より速い溶媒蒸発のために真空下で少なくとも２時間撹拌すること、（ｃ）ＮＯＶＥＣ７５００、またはＦＣ－４０およびＮＯＶＥＣ７５００の混合物を、撹拌下でエマルションに添加すること、の３つの方法のうちの１つを適用した。ＨＦＥは、炭化水素相からフッ化炭素相への酢酸エチルの抽出を促進して、迅速な硬化プロセス（典型的には数分以内）を可能にする共溶媒として作用する。

最後に、ＦＣ－４０中の硬化ポリマー球体は、最初に０．２２μｍ ＰＥＳ膜に通して真空濾過した。ＦＣ－４０はフィルターを通過し、マイクロスフェアは保持された。次いで、マイクロスフェアを追加のＦＣ－４０で洗浄し、真空下で完全に乾燥させた。

マイクロスフェアのサイズは、製造物粉末を０．０１％ｗ／ｖのＰＶＡ溶液中に分散させることによる液体サンプリングを用いて、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ３０００を使用したレーザー回折分析によって測定した。製造物の形態を、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して測定した。

マイクロスフェアのタンパク質含有量を測定するために、所定量のマイクロスフェアを、最初に２００μＬの酢酸エチルに溶解し、次いで１回純水で抽出し、水相を収集し、遠心分離して濁った懸濁物を除去した。タンパク質の純度および濃度は、ＳＥＣ－ＵＰＬＣによって測定した。

バースト放出を測定するために、所定量のマイクロスフェアを、１ｍＬのＰＢＳ中３７℃で１時間インキュベートした。混合物を遠心分離し、上清をタンパク質濃度のためにＳＥＣ－ＵＰＬＣに供した。

結果
上記の結果は、十分なＳＦの存在による安定したＨ／Ｆエマルションの形成を示した。この非水性エマルションは、ブランクＰＯＥ球体を成功裏に製造することができる。この無水法を再び使用して、ＳＤＰをＰＯＥマイクロスフェアに組み込んだ。一例において、全固体重量１０％（ｗ／ｗ）のＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰを、懸濁物として酢酸エチル（２０％ｗ／ｖ ＰＯＥを含む）中に導入し、ＦＣ－４０（０．５％ｗ／ｗ ＦＳを含有）中のこの懸濁液を、撹拌およびボルテックス撹拌によって乳化した。乳化直後に、小分けを顕微鏡撮像のためにスライドガラス上に移した。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、酢酸エチルがＦＣ－４０中に分散して液滴になり、ＳＤＰ粒子が酢酸エチル液滴内に明らかに閉じ込められた。Ｓ／Ｏ／Ｗ系とは対照的に（データは示していない）、タンパク質がフッ素炭素連続相に漏出する兆候はなかった。このＨ／Ｆ系において重要なことには、液滴中のＳＤＰ粒子は、それらの最初の粉末状態における窪んだ形状を保持した。Ｈ／Ｆ系にはＳＤＰを再構成する水が存在しなかったため、ＳＤＰは最初の固体微粒子形状を維持した。硬化後、単一または複数のＳＤＰ粒子を含有するＰＯＥ微粒子は、明視野および蛍光顕微鏡画像を通して明確に観察することができる（図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃ）。スライドガラス上の炭化水素およびフッ化炭素溶媒の蒸発後、水を添加してバースト放出および封入の質を試験した。図８Ａ～Ｄに示されるように、マイクロスフェア製造物を水中に配置した後、ＳＤＰ封入ＰＯＥマイクロスフェアは、それらの完全性（integrity）を保持した。タンパク質の即時放出は観察されず、ＳＤＰ粒子の形状は同じに維持され、これはＳＤＰ粒子がポリマーマトリックスによって十分に保護され、水性環境から遮蔽されていることを示した。これらの結果は、Ｈ／Ｆエマルションが、タンパク質その他の親水性薬物をポリマーマトリックス中に封入するための有効な解決手段であり、バースト放出を最小限に抑えながら高い封入効率、高い収率を達成する可能性を有することを示唆しており、これらはすべて水性ベースのＷ／Ｏ／Ｗ法またはＳ／Ｏ／Ｗ法を使用する場合には大きな課題となっていることである。

本明細書に開示される手順は、ＰＯＥマイクロスフェア中のタンパク質ＳＤＰ封入のためにＳ／Ｈ／Ｆ非水性ベースのバルクエマルション法を使用する例である。本方法は、再現性があり、スケール変更可能であり、調整可能である。配合およびプロセスのパラメータを変化させることによって、製造物特性を調整および制御することができる。これらのパラメータのいくつかの効果が、実施例４に開示される。

実施例４：炭化水素溶媒の効果
材料および方法
微粒子を実施例２に記載されるように製造し、炭化水素としてはジクロロメタンまたは酢酸エチルを使用した。ＤＣＭ中の３５％ｗ／ｖ ＰＯＥ、および酢酸エチル中の３５％ｗ／ｖ ＰＯＥを調製した。全固体重量１０％ｗ／ｗのタンパク質粉末を、ＤＣＭ中または酢酸エチル中の０．５ｍＬのＰＯＥ溶液に懸濁させた。これらの懸濁液を、２０ｍＬシンチレーションバイアル中、０．５％ｗ／ｗ ＦＳを含有する９．５ｍＬのＦＣ－４０に移した。これらの混合物を均質化してエマルションを生成し、ハウス真空下で１．５時間撹拌した。形成された微粒子を、濾過によって単離し、ＦＣ－４０で洗浄し、真空下で乾燥させた。

結果
図９は、炭化水素溶媒の種類をジクロロメタンまたは酢酸エチルのいずれかにした以外は、同じ配合およびプロセス条件を使用して製造された微粒子のサイズ分布を示す。どちらの炭化水素を使用して製造された微粒子も、噴霧乾燥タンパク質の封入を示す。ジクロロメタンを使用すると、より大きな微粒子を生じる。以下の表２を参照されたい。結果は、同じ配合およびプロセス条件下で、異なる炭化水素溶媒を使用することが、異なるサイズのマイクロスフェアをもたらすことを示唆した。ＤＣＭは、酢酸エチルよりも大きいマイクロスフェアサイズを生じた。したがって、炭化水素溶媒を意図的に選択して、マイクロスフェアサイズを制御することができる。

実施例５：タンパク質積載量の効果
材料および方法
微粒子を実施例２に記載されるよう製造し、タンパク質積載量のみを変化させた。ＤＣＭ中の３５％ｗ／ｖ ＰＯＥを調製した。５％、１０％、および３０％ｗ／ｗの全固体重量のタンパク質粉末を、ＤＣＭ中０．５ｍＬのＰＯＥ溶液に懸濁させた。これらの懸濁液を、２０ｍＬシンチレーションバイアル中の０．５％ｗ／ｗ ＦＳを含有する９．５ｍＬのＦＣ－４０に移した。これらの混合物を約１分間均質化してエマルションを生成し、次いで１分以内にＮｏｖｅｃ７５００およびＦＣ－４０の１：１ ｖ：ｖ混合物の６ｍＬをエマルションに添加した。次いで、さらに１分間撹拌した後、形成されたマイクロスフェアを濾過によって単離し、ＦＣ－４０で洗浄し、真空下で乾燥させた。

結果
表３に示すように、製剤中のタンパク質粉末の量を増加させることで、レーザー回折分析によって測定される、より大きなＰＯＥ微粒子サイズが得られ、また、タンパク質抽出実験、明視野および共焦点蛍光顕微鏡法を介して観察される、最終ＰＯＥマイクロスフェア製造物中の増加したタンパク質積載を得た。３０％ｗ／ｗタンパク質粉末積載における明視野画像は、１０％ｗ／ｗタンパク質粉末よりも暗く透明度が低いマイクロスフェアを示し、より多くの薬物がマイクロスフェア製造物に封入されたことを示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。代表的な共焦点画像によって、ＳＤＰがＰＯＥマトリックス中にその最初の形状で封入されていることが、マイクロスフェアの断面像から確証された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。より多くのＳＤＰ粒子が、３０％ｗ／ｗ積載マイクロスフェアで観察された。ここでも、封入されたＳＤＰは、それらの元の窪んだ形状を維持し、それらが全製造プロセス期間のあいだ無傷だったことを示した。さらに、ＳＥＭ画像は、タンパク質粉末積載を増加させると、より多くのタンパク質粒子がＰＯＥ微粒子の表面に吸着したことを示した（図１２Ａ～１２Ｃ）。したがって、結果は、３０％ｗ／ｗに及ぶタンパク質粉末をマイクロスフェア内に効率的に封入することができることを示した。＞３０％ｗ／ｗのタンパク質粉末積載では、この配合のマイクロスフェア内には物理的空間が欠如する可能性があることから、タンパク質粒子はマイクロスフェアの表面に吸着されるようになり得る。表面吸着したタンパク質は、かかる効果が治療効能のために望まれる場合には、水との接触で薬物のバースト放出を生じることができる。水性ベースのエマルション系で予想されるような、タンパク質が連続相に失われることはない。

実施例６：Ｈ／Ｆバルク乳化を使用したＰＯＥマイクロスフェアへの封入ＳＤＰについての実験計画法（ＤＯＥ）。
材料および方法
ＤＯＥ研究を実施して、最終製造物の特性に対する、設計した空間での合成の重要な因子の影響を評価した。設計した実験における１０回の実行を、実施例２に記載される一般的な手順に従って実施した。タンパク質粉末積載、タンパク質粉末粒子径（Ｄｖ（５０）サイズは２．２ｕｍおよび５．６ｕｍ、図１３のＳＥＭ画像を参照されたい）、ポリマー濃度、およびＨＦＥ濃度を変化させ、一方、例えば炭化水素およびフッ化炭素相の体積、均質化速度、ＦＳ濃度等の、配合およびプロセス条件は一定に維持した（表４）。マイクロスフェアサイズ（Ｄｖ５０、レーザー回折によるスパン）、封入効率、３７℃で１時間でのバースト放出、ＳＥＭ画像を含む測定された応答。

結果
ＤＯＥの結果を、表５に要約する。

マイクロスフェアサイズについてのカスタム設計されたＤＯＥのフィッティング（Ｒ^２＝０．７６）は、タンパク質粉末積載量およびＰＯＥ濃度の主要な影響を明らかにした（ｐ値＜０．０５、表６の相関結果を参照されたい）。加えて、バースト放出についてのフィッティング（Ｒ^２＝０．９２）は、タンパク質粉末積載量のみがバースト放出に有意に影響することを示している（ｐ値＜０．０５、表７の相関結果を参照されたい）。結果は、製剤中のタンパク質粉末量を増加させると、最終製造物中のペイロードが増加するが、バースト放出率も増加することが示唆される。バースト放出は、表面に吸着されたタンパク質粒子によって引き起こされる可能性が高い。ポリマーマイクロスフェアに内在化されるタンパク質粉末の最大量は、所与のマイクロスフェアサイズについての物理的空間によって決定される。配合懸濁液中のタンパク質粉末濃度を単に増加させても、特定の閾値（この実施例では約３０％ｗ／ｗだった）を超えて薬物封入が増加することはない。

実施例７．異なるタンパク質へのＳ／Ｈ／Ｆエマルションベースの封入方法の適用。
開示されるＨ／Ｆベースのエマルション系およびプロセスは、異なるポリマーおよび治療用タンパク質に適用可能なプラットフォーム技術となり得る。本発明の特定の例では、組換えＩｇＧ４（ＭＷ＝約１４５ｋＤａ）のタンパク質粉末、組換えＩｇＧ１（ＭＷ＝約１４６ｋＤａ）のタンパク質粉末、または組換え融合タンパク質（ＭＷ＝約６４ｋＤａ）のタンパク質粉末を、実施例２と同じプロセスによって、それぞれＰＯＥマイクロスフェアに封入した。結果を、表７に要約する。マイクロスフェア製造物中の封入タンパク質粉末の量を、抽出アッセイによって決定し、目標値と一致した。タンパク質純度は、封入プロセス後に、組換え融合タンパク質、ＩｇＧ１については維持され、ＩｇＧ４についてはわずかに低下し（２％未満）、良好なプロセス適合性を示す。

他の生体分解性ポリマー、例えば、ＰＬＧＡおよびＰＬＡも、Ｈ／Ｆベースのエマルションで使用される。本発明の特定の例では、実施例２に開示される同様のプロセスを通じて、蛍光標識されたＶＥＧＦトラップＦ－ＳＤＰを、ＰＬＧＡ（ラクチド：グリコリド＝５０：５０、Ｍｗ４２～６５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＰＬＡ（アルキルエーテル末端化、Ｍｗ１８，０００～２８，０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）マイクロスフェアにそれぞれ封入した。明視野および蛍光顕微鏡画像は、タンパク質粉末がポリマーマイクロスフェアの内部に成功裏に封入されたことを示した（ＰＬＡについて図１４Ａ～Ｃ、およびＰＬＧＡについて図１５Ａ～Ｂ）。

上述の明細書において、本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されており、多くの詳細は、例示の目的のために提示されているが、本発明は、追加の実施形態が可能であり、本明細書に記載の詳細のいくつかは、本発明の基本原則から逸脱することなく、かなり変化することができることは、当業者には明らかであろう。

本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得、したがって、本発明の範囲を示すものとしては、前述の明細書ではなく添付の特許請求の範囲を参照する必要がある。

Claims (52)

1. ポリマー微粒子またはポリマーコーティング微粒子を製造する方法であって、
   タンパク質粉末およびポリマーを炭化水素溶媒中に混合して、非水性の第１の溶液を形成する工程と、
   前記第１の溶液を第２の溶液に添加し、前記第２の溶液が、フッ化炭素液およびフッ素系界面活性剤を含む、工程と、
   混合された前記溶液を撹拌して、前記フッ化炭素液中に複数のエマルション炭化水素液滴を含む非水性エマルションを形成する工程と、
   前記炭化水素溶媒を除去する工程と、
   前記フッ化炭素液を除去して前記微粒子を単離する工程であって、前記微粒子が、ポリマーのマトリックス内に封入されたタンパク質を含む、工程
   を含む、方法。
2. 前記微粒子が、単一コア－シェル構造を含む、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１つの前記微粒子が、前記ポリマー内に分散した複数のコアを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記微粒子が、ポリマーによって封入された単一コア構造と、ポリマーによって封入された複数コア構造を含む微粒子との組合せを含む微粒子を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記フッ化炭素液が、ペルフルオロＣ５～Ｃ１８化合物を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記炭化水素溶液が、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記フッ化炭素溶液が、Ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ（商標）ＦＣ－４０（平均ＭＷ＝６５０ｇ／ｍｏｌ）１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロ－Ｎ，Ｎ－ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）ブタン－１－アミンを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記炭化水素溶媒が、ジクロロメタン、酢酸エチル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記フッ化炭素溶液が、ハイドロフルオロエーテルを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記フッ素系界面活性剤が、ペルフルオロポリエーテル－ｂ－ポリエチレングリコール－ｂ－ペルフルオロポリエーテルを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ポリマーが、ポリオルトエステル（ＰＯＥ）を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ポリマーが、ポリ乳酸およびポリ（乳酸－コ－グリコール酸）からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記タンパク質が、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの断片もしくは切詰型である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記タンパク質が、ＶＥＧＦトラップタンパク質である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記タンパク質が、ＶＥＧＦトラップタンパク質の切詰形態である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記微粒子が、１～２００μｍの直径を有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記タンパク質粉末が、０．５～２０μｍの微粒子化タンパク質の直径を含む粒子を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. タンパク質粉末が、噴霧乾燥、エレクトロスプレー乾燥、可逆的沈殿、噴霧凍結、マイクロテンプレート法、またはそれらの組み合わせによって微粒子化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記エマルションが、均質化、ボルテックス撹拌、超音波処理、キャビテーション、撹拌、またはそれらの組み合わせを使用して形成される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 混合された前記溶液を撹拌しながら、前記炭化水素溶媒を除去する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記炭化水素溶媒が、真空下で除去されて、前記微粒子を硬化させる、請求項２０に記載の方法。
22. 前記炭化水素溶媒が、蒸発によって除去される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記フッ化炭素液が、任意で真空下で、濾過によって除去される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. ハイドロフルオロエーテルが、前記炭化水素を抽出するための共溶媒として使用される、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法によって製造される微粒子であって、持続放出微粒子である、微粒子。
26. 請求項２５に記載の微粒子を含む、持続放出組成物。
27. 前記微粒子が、ポリマー被殻にほとんどもしくはまったく孔またはチャネルを有しない、請求項１～２６のいずれか一項に記載の微粒子。
28. ポリマーマイクロスフェアまたはポリマーコーティングマイクロスフェアを製造するための方法であって、
    （１）炭化水素溶液中に懸濁された１．０～３０．０％ｗ／ｗの全固体噴霧乾燥タンパク質を含む分散相であって、前記炭化水素溶液が、５．０～３５％ｗ／ｖのＰＯＥを含む、分散相を、
    （２）連続相中に混合させて、前記分散相のエマルション液滴を形成し、前記連続相が、０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を含むフッ化炭素溶液を含む、工程と、
    前記エマルション液滴を、炭化水素液を除去することによって硬化させて、硬化されたポリマーマイクロスフェアまたはポリマーコーティングマイクロスフェアを形成する工程と
    を含む方法。
29. 前記非水性エマルションが撹拌され、前記炭化水素溶液が、撹拌中に周囲大気圧下で、または真空下で、蒸発によって除去される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記硬化されたポリマーマイクロスフェアまたはポリマーコーティングマイクロスフェアが、真空濾過によって収集される、請求項２９に記載の方法。
31. ポリマー微粒子またはポリマーコーティング微粒子を製造するための方法であって、
    溶解されたポリマーを含む炭化水素溶液と、噴霧乾燥タンパク質粉末とを混合して、分散相を生成する工程と、
    前記分散相を連続相と混合して、前記連続相中に前記分散相のエマルション液滴を生成する工程であって、前記連続相が、フッ化炭素液および０．１～５．０％ｗ／ｖのフッ素系界面活性剤を含む、工程と、
    前記ポリマーコーティング微粒子を収集する工程と
    を含む、方法。
32. 前記噴霧乾燥タンパク質が、抗体、組換えタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの断片である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記タンパク質が、ＶＥＧＦトラップタンパク質または切詰ＶＥＧＦトラップタンパク質である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記炭化水素溶液が、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
35. 前記フッ化炭素液が、トリフルオロメチル）ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）アミンを含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記微粒子が、蒸発によってまたは真空下で撹拌しながら前記炭化水素溶液を除去することによって硬化される、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記硬化された微粒子を収集することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
38. 請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法によって製造される、微粒子。
39. 請求項３８に記載の微粒子を含む、医薬組成物。
40. １つ以上の賦形剤をさらに含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
41. 前記医薬組成物が、持続放出組成物である、請求項４０に記載の医薬組成物。
42. 前記医薬組成物が、非経口投与のために製剤化されている、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
43. 前記医薬組成物が、１００ｍｇ超の噴霧乾燥タンパク質を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記ハイドロフルオロエーテルが、４－エトキシ－１，１，１，２，２，３，３，４，５，６，６，６－ジデカフルオロ－５－（トリフルオロメチル）ヘキサンを含む、請求項９に記載の方法。
45. 微粒子を製造するための方法であって、
    炭化水素溶媒中にポリマーを含む第１の溶液を、フッ化炭素溶媒およびフッ素系界面活性剤を含む第２の溶液と混合することと、
    前記混合された溶液を撹拌して、エマルションを生成することと、
    前記混合された溶液を撹拌しながら真空下で前記炭化水素溶媒を除去して、前記微粒子を硬化させることと、
    前記微粒子を収集することと、
    任意で、前記微粒子を洗浄することと、
    前記微粒子を乾燥させることと
    を含む、方法。
46. 前記炭化水素溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
47. 前記フッ化炭素溶媒が、トリフルオロメチル）ビス（１，１，２，２，３，３，４，４，４－ノナフルオロブチル）アミンを含む、請求項４５または４６に記載の方法。
48. 前記ポリマーが、ＰＯＥ、ポリ乳酸、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記微粒子が、ポリマー被殻および中空コアを含む、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
50. 前記微粒子が、前記ポリマー被殻にほとんどもしくはまったく孔またはチャネルを有しない、請求項４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記微粒子の直径が、前記炭化水素溶媒、撹拌速度、ポリマー濃度、またはそれらの組み合わせを変化させることによって所望の直径に調整される、請求項５０または５１に記載の方法。
52. 請求項４５～５１のいずれか一項に記載の、微粒子。
    

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