KR20210114926A - 단백질 내에서 유리 티올을 식별하는 방법 - Google Patents

단백질 내에서 유리 티올을 식별하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210114926A
KR20210114926A KR1020217016160A KR20217016160A KR20210114926A KR 20210114926 A KR20210114926 A KR 20210114926A KR 1020217016160 A KR1020217016160 A KR 1020217016160A KR 20217016160 A KR20217016160 A KR 20217016160A KR 20210114926 A KR20210114926 A KR 20210114926A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
reporter
sample
antibody
igg molecule
protein drug
Prior art date
Application number
KR1020217016160A
Other languages
English (en)
Inventor
숙 옌 이
데이비드 브람홀
하이보 츄
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Publication of KR20210114926A publication Critical patent/KR20210114926A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G01N33/6812—Assays for specific amino acids
    • G01N33/6815—Assays for specific amino acids containing sulfur, e.g. cysteine, cystine, methionine, homocysteine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

단백질에서 유리 티올을 식별하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 유리 티올을 식별하기 위한 태그 및 천연 이황화 결합을 식별하기 위한 태그로 펩티드를 표지하고 표적화된 MS2를 사용하여 상기 태그를 분석하는 예시적인 방법. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.

Description

단백질 내에서 유리 티올을 식별하는 방법
본 발명은 일반적으로 단백질 내에서, 특히 항체 내에서 유리 티올기를 특징 짓는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 1월 16일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/792,994호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
약물 후보부터 시판되는 제품까지 단일 클론 항체(mAb)를 개발하는 동안, 안정성, 번역 후 변형, 또는 기타 상기 항체 변경 문제가 발생할 수 있다. 항체 구조 및 기능의 변화는 좋지 않은 보관 수명이나 심지어 환자 내에서 면역원성과 같은 문제를 일으킬 수 있다. 따라서 항체 구조를 적절하게 특징 짓고 생산 전반에 걸쳐 이를 모니터링하는 것이 중요하다. 항체 품질 관리 및 품질 보증은 mAb 생성물의 순도와 안전성에 매우 중요하다.
이황화 결합은 mAb의 구조적 무결성, 안정성, 및 생물학적 기능에 중요하다. 비천연 이황화 결합은 mAb의 구조와 안정성에 변화를 일으킬 수 있다. 이황화 결합이 불완전한 경우 항원에 대한 mAb의 결합 친화력은 최대 50%까지 영향을 받을 수 있다(Xiang, T., et al., Anal Chem, 81:8101-8108 (2009)). 이황화 결합의 낮은 해리 에너지와 힌지 영역의 높은 유연성은 종종 힌지 영역에서 변형 및 분열을 초래한다(Moritz, B., and Stracke, J.O., Electrophoresis, 36:769-785 (2017)). 또한, 인간에게 비천연 이황화 결합 구조를 투여하면 원치 않는 면역 반응을 유발할 가능성을 가지고 있다. 따라서 이황화 결합 분석은 mAb의 품질 관리 평가에 중요하다. mAb 이황화 결합을 분석하는 현재 방법은 시간 소모적 및 노동 집약적이다.
따라서, 본 발명의 목적은 항체, 특히 단일 클론 항체 내의 이황화 결합을 특징 짓기 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
다른 실시예는 단백질 약물 생성물 내의 이황화 이질성을 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단백질 내에서 유리 티올을 식별하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
유리 티올(유리 술프하이드릴이라고도 함)을 식별하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 유리 티올은 단백질 내에서, 예를 들어 mAb 내에서 불완전한 이황화 결합 형성 또는 이황화 결합 파괴의 결과로 존재할 수 있다. 유리 티올의 존재는 mAb 생성물의 열안정성을 낮추고 이의 구조적 무결성, 안정성 및 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 mAb 생산에서 유리 티올을 특징 짓는 것은 중요하다. 본원에는 단백질 약물 생성물 내에서 부위특이적 유리 티올을 식별하는 방법이 개시되어 있다. 예시 방법은 유리 티올을 식별하기 위한 태그 및 천연 이황화 결합을 식별하기 위한 태그로 펩티드를 표지하고 표적화된 MS2를 사용하여 상기 태그를 분석하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
한 실시예는 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 단편 내에서 유리 티올의 존재를 식별하는 방법을 제공한다. 단백질 약물 생성물 내에서 유리 티올을 식별하는 예시적인 방법은 상기 단백질 약물 생성물을 함유하는 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 함유하는 제1 라벨로 표지하는 단계를 포함한다. 과량의 라벨을 제거할 수 있고 상기 샘플을 변성 및 환원시킨다. 그 다음, 상기 샘플은 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 가지는 제2 라벨로 표지된다. 상기 방법은 상기 샘플을 효소적으로 분해하고 상기 샘플을 질량 분석법, 예를 들어 대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 초 고성능 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분석 시스템(UPLC-MS2 시스템)을 사용하여 분석하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 방법은 상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있다. 한 실시예에서 상기 제1 MS/MS 리포터는 128의 질량을 가지고 상기 제2 MS/MS 리포터는 131의 질량을 가진다. 상기 단백질 약물 생성물은 전형적으로 항체, 예를 들어 단일 클론 또는 키메라 항체이다. 유리 티올의 존재는 불완전한 이황화 결합 형성 또는 이황화 결합 분해의 결과일 가능성이 높다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
다른 실시예는 단백질 약물 생성물을 함유하는 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 함유하는 제1 라벨로 표지하는 단계를 포함하는 상기 단백질 약물 생성물 내에서 이황화 이질성을 식별하는 방법을 제공한다. 과량의 라벨을 제거할 수 있고 상기 샘플을 변성 및 환원시킨다. 그 다음, 상기 샘플은 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 가지는 제2 라벨로 표지된다. 상기 방법은 상기 샘플을 효소적으로 분해하고 상기 샘플을 질량 분석법, 예를 들어 대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 초 고성능 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분석 시스템(UPLC-MS2 시스템)을 사용하여 분석하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 방법은 상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있다. 상기 분석이 상기 단백질 약물 생성물 내에서 유리 티올을 검출하면, 상기 단백질 약물 생성물은 이황화 이질성을 가진다. 상기 유리 티올의 존재는 불완전한 이황화 결합 형성 또는 이황화 결합 분해의 결과일 가능성이 높다. 한 실시예에서 상기 제1 MS/MS 리포터는 128의 질량을 가지고 상기 제2 MS/MS 리포터는 131의 질량을 가진다. 상기 단백질 약물 생성물은 전형적으로 항체, 예를 들어 단일 클론, 키메라 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
단백질 약물 생성물이 함유된 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 함유하는 제1 라벨로 표지하는 단계를 포함하는 상기 단백질 약물 생성물을 선택하는 방법. 과량의 라벨을 제거할 수 있고 상기 샘플을 변성 및 환원시킨다. 그 다음, 상기 샘플은 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 가지는 제2 라벨로 표지된다. 상기 방법은 상기 샘플을 효소적으로 분해하고 상기 샘플을 대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 초 고성능 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분석 시스템(UPLC-MS2 시스템)을 사용하여 분석하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 방법은 상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있다. 유리 티올이 검출되면, 상기 단백질 약물 생성물은 이황화 이질성을 가진다. 상기 방법은 이황화 이질성을 나타내지 않는 상기 단백질 약물 생성물을 선택하는 것을 포함한다. 한 실시예에서 상기 제1 MS/MS 리포터는 128의 질량을 가지고 상기 제2 MS/MS 리포터는 131의 질량을 가진다. 상기 단백질 약물 생성물은 전형적으로 항체, 예를 들어 단일 클론, 키메라 항체, 또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 실시예는 상기 기술된 방법을 사용하여 선택된 상기 단백질 약물 생성물을 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
도 1a는 4개의 IodoTMTsixplex 시약의 개략도이다. 도 1b는 iodoTMT 라벨로 펩티드를 표지하기 위한 예시 워크 플로우의 개략도이다.
도 2는 표적화된 MS2를 사용하여 iodoTMT 표지된 펩티드를 분석하기 위한 예시 워크 플로우의 개략도이다.
도 3a 내지 3b는 데이터 종속적 실행(도 3a) 또는 포함 목록이 있는 표적화된 MS2(도 3b)로 실행된 iodoTMT 표지된 펩티드의 MS2 분석에서 얻은 크로마토그램의 결과이다. X 축은 시간을 나타내고 Y 축은 상대적 존재비를 나타낸다.
도 4a 내지 4b는 iodoTMT 표지된 펩티드의 MS2 분석에 대한 크로마토그램의 결과이며, 특히 TMT-태그 128/131을 살펴보았다. 도 4a는 완전한 크로마토그램이고 도 4b는 상기 TMT-태그 128/131을 확대한 것이다. X 축은 시간을 나타내고 Y 축은 상대적 존재비를 나타낸다.
도 5a 내지 5g는 항체의 다른 로트에서 나온 iodoTMT 표지된 펩티드의 MS2 분석에서 얻은 크로마토그램의 결과이다. X 축은 시간을 나타내고 Y 축은 상대적 존재비를 나타낸다.
도 6은 단백질 샘플 1의 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 0.1%가 단백질 샘플 2에 스파이킹된 스파이크-인 연구에서 얻은 다양한 시스테인 잔여물의 상대적 존재비를 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 생산 공정 A의 항체 로트 1-3 및 생산 공정 B의 항체 로트 4-6 내에서 다양한 시스테인 이황화 결합 쌍의 상대적 존재비를 보여주는 막대 그래프이다. 이황화 결합 쌍은 상기 두 시스테인을 연결하는 곡선으로 표시된다.
I. 정의
본원은 본원에 기술된 상기 조성물 및 상기 방법 뿐만 아니라 상기 기술된 실험 조건에 한정되지 않으며, 그 자체로 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적이고, 제한하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 조성물, 방법 "G 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 공보는 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
현재 청구된 발명을 설명하는 것과 관련하여(특히 청구항들과 관련하여) 용어 "한(a)", "한(an)", "그(the)", 그리고 유사한 지시어(referent)의 사용은, 본 명세서에 달리 지시되지 않거나 문맥 내에서 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 커버하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서의 값들의 범위들의 열거는, 본 명세서에 달리 지시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 약기 방법(shorthand method)으로서 역할하도록 의도되며, 각각의 별개의 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
용어 "약"의 사용은 대략 +/- 10% 범위 내에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값을 설명하기 위한 것이며; 다른 실시예에서는 상기 값은 대략 +/- 5% 범위 내에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값에 이를 수 있으며; 다른 실시예에서는 상기 값은 대략 +/- 2% 범위 내에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값에 이를 수 있으며; 다른 실시예에서는 상기 값은 대략 +/- 1% 범위 내에서 언급된 값의 위 또는 아래의 값에 이를 수 있다. 선행하는 범위들은 문맥 상 명확해지게 하기 위한 것이며, 어떠한 추가 제한도 함축되지 않는다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 표시되지 않거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공되는 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "같은")의 사용은, 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위한 것이고, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 한정을 제시하지 않는다. 본 명세서 내의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 임의의 미-청구 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
"단백질"은 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산 잔여물을 포함하는 분자를 지칭한다. 단백질은 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하고, 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔여물의 감마-카르복실화, 알킬화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 단백질은 단백질 기반 약물을 포함하여 과학적 또는 상업적 관심의 대상이 될 수 있으며, 단백질은 특히 효소, 리간드, 수용체, 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 공지된 세포 배양 방법을 사용하여 다양한 유형의 재조합 세포에 의해 생성되고, 일반적으로 유전자 공학 기술(예를 들어, 키메라 단백질을 코딩하는 서열 또는 코돈-최적화 서열, 무인트론(intronless) 서열 등과 같은)에 의해 상기 세포 내로 도입되며, 에피솜으로 존재하거나 상기 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
"항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄인 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성되는 면역글로불린 분자를 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 가진다. 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 세 도메인을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 가진다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역은 프레임 워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초 가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 하위 부류의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린 모두에 대한 언급을 포함한다. 상기 용어 "항체"는 상기 항체를 발현하도록 형질 감염된 숙주 세포로부터 분리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체 분자를 포함한다. 상기 용어 항체는 또한 이중특이적 항체를 포함하며, 이는 1개 초과의 상이한 항원결정기에 결합될 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 미국 특허 제8,586,713호에 기술되어 있으며, 이 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.
"힌지 영역"은 상기 IgG 및 IgA 면역글로불린 부류의 중쇄의 중앙 부분 내에 있는 상기 유연한 아미노산 스트레치를 말하며, 이는 두 사슬을 이황화 결합에 의해 연결한다. IgG 면역글로불린 내에서 상기 힌지 영역은 상기 CH1 및 CH3 불변 도메인 사이에 있다. 상기 힌지 영역은 상기 항체에 유연성을 제공하고 상기 항원에 더 쉽게 결합할 수 있게 한다.
"Fc 융합 단백질"은 둘 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하며, 이 중 하나는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이고, 이는 달리 자연 내에서 함께 발견되지 않는다. 항체-유래 폴리펩티드(상기 Fc 도메인 포함)의 다양한 부분에 융합된 특정 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예를 들어 Rath, T., et al., Crit Rev Biotech, 35 (2): 235-254 (2015), Levin, D., et al, Trends Biotechnol, 33(1): 27-34 (2015)에 의해 설명되었다. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 결합된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하며, 일부 실시예에서 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인이 뒤따르는 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 둘 이상의 별개의 수용체 쇄를 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 트랩, 예를 들어 IL-1 트랩 또는 VEGF 트랩이다.
용어 "이황화 결합"은 시스테인에 각각 부착된 2개의 SH기의 산화에 의해 형성된 연결을 의미한다. 이황화 결합은 많은 단백질의 접힘과 안정성에 중요한 역할을 한다. IgG는 총 16개의 분자 간 또는 분자 내 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결된 2개의 중쇄(HC) 및 2개의 경쇄(LC)를 포함한다. IgG mAb는 32개의 시스테인 잔여물, 각 LC에 5개의 시스테인 잔여물 및 각 HC에 11개의 시스테인 잔여물을 함유한다. 각 LC는 이황화 결합 연결이 있는 하나의 가변 도메인 및 하나의 불변 도메인을 함유한다. 상기 LC의 제5 시스테인은 쇄 간 이황화 결합을 형성하는 상기 HC의 제3 또는 제5 시스테인과 연결된다. 상기 중쇄는 CH1과 CH2 사이에 힌지 영역이 있는 N-말단 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 포함한다(Vidarsson, G., et al., Front Immunol, 5:520 (2014)). 각 HC의 제6 및 제7 시스테인은 결합되어 상기 힌지 영역을 형성한다. 면역글로불린의 상기 힌지 영역은 상기 면역글로불린 분자의 Y형 구조를 형성하는 데 도움이 된다. 상기 Y 모양은 항원 결합에 필요한 상기 면역글로불린 분자의 유연성을 가능하게 한다.
용어 "LC-MS"는 액체 크로마토그래피(또는 HPLC)의 물리적 분리 기능을 질량 분석 (MS)의 질량 분석 기능과 결합한 분석 화학 기술인 액체 크로마토그래피-질량 분석을 의미한다. MS/MS 또는 MS2라는 용어는 직렬 질량 분석법을 나타낸다.
용어 "유리 티올" 및 "유리 술프하이드릴"은 혼용하여 사용된다.
II. 유리 티올을 식별하는 방법
항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 단백질 내에서 유리 티올을 식별하는 방법이 제공된다. 티올 또는 술프하이드릴은 일반적으로 -SH기를 함유하는 유기 화합물을 의미한다. 단백질 내에서 매우 근접한 두 개의 시스테인은 심지어 자연적으로 함께 짝을 이루지 않는 시스테인도 공유 결합을 형성한다. 두 시스테인 사이의 상기 공유 결합을 이황화 결합이라고 한다. 이황화 결합은 IgG의 제3의 구조체, 안정성 및 생물학적 기능에 중요하다. 유리 티올 또는 유리 술프하이드릴은 이황화 결합의 일부가 아닌 단백질 내의 시스테인을 말하며, 단백질 약물 효능, 반감기, 안정성 상의 부작용을 일으킬 수 있는 상기 단백질의 부적절한 구조를 나타낼 수 있으며 또는, 상기 단백질 약물이 효과적이지 않을 수 있다. 유리 술프하이드릴(유리 티올이라고도 함)은 불완전한 이황화 결합 형성 또는 이황화 결합 분해의 결과로도 발생할 수 있다. 유리 술프하이드릴의 증가는 열안정성을 낮추고 항원에 대한 항체의 결합 친화도에 최대 50%까지 영향을 미칠 수 있다. 본원에는 유리 술프하이드릴 또는 유리 티올을 식별하는 방법이 개시되어 있다.
A. 부위특이적 유리 티올을 식별하는 방법
유리 티올은 불완전한 이황화 결합 형성 또는 이황화 결합 파손의 결과로 mAb 내에서 존재할 수 있다. 유리 티올의 존재는 mAb 생성물의 열안정성을 낮추고 이의 구조적 무결성, 안정성 및 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 mAb 생산에서 유리 티올을 특징 짓는 것은 중요하다. 본원에는 단백질 약물 생성물 내에서 부위특이적 유리 티올을 식별하는 방법이 개시되어 있다. 예시 방법은 유리 티올을 식별하기 위한 태그 및 천연 이황화 결합을 식별하기 위한 태그로 펩티드를 표지하고 표적화된 MS2를 사용하여 상기 태그를 분석하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
한 실시예는 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 단편 내에서 유리 티올의 존재를 식별하는 방법을 제공한다. 단백질 약물 생성물 내에서 유리 티올을 식별하는 예시적인 방법은 상기 단백질 약물 생성물을 함유하는 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 함유하는 제1 라벨로 표지하는 단계를 포함한다. 과량의 라벨을 제거할 수 있고 상기 샘플을 변성 및 환원시킨다. 그 다음, 상기 샘플은 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 가지는 제2 라벨로 표지된다. 상기 방법은 상기 샘플을 효소적으로 분해하고 상기 샘플을 질량 분석법, 예를 들어 대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 초 고성능 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분석 시스템(UPLC-MS2 시스템)을 사용하여 분석하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 방법은 상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있다. 한 실시예에서 상기 제1 MS/MS 리포터는 128의 질량을 가지고 상기 제2 MS/MS 리포터는 131의 질량을 가진다. 상기 단백질 약물 생성물은 전형적으로 항체, 예를 들어 단일 클론 또는 키메라 항체이다. 유리 티올의 존재는 불완전한 이황화 결합 형성 또는 이황화 결합 분해의 결과일 가능성이 높다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
다른 실시예는 단백질 약물 생성물을 함유하는 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 함유하는 제1 라벨로 표지하는 단계를 포함하는 상기 단백질 약물 생성물 내에서 이황화 이질성을 식별하는 방법을 제공한다. 과량의 라벨을 제거할 수 있고 상기 샘플을 변성 및 환원시킨다. 그 다음, 상기 샘플은 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 가지는 제2 라벨로 표지된다. 상기 방법은 상기 샘플을 효소적으로 분해하고 상기 샘플을 질량 분석법, 예를 들어 대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 초 고성능 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분석 시스템(UPLC-MS2 시스템)을 사용하여 분석하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 방법은 상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있다. 상기 분석이 상기 단백질 약물 생성물 내에서 유리 티올을 검출하면, 상기 단백질 약물 생성물은 이황화 이질성을 가진다. 상기 유리 티올의 존재는 불완전한 이황화 결합 형성 또는 이황화 결합 분해의 결과일 가능성이 높다. 한 실시예에서 상기 제1 MS/MS 리포터는 128의 질량을 가지고 상기 제2 MS/MS 리포터는 131의 질량을 가진다. 상기 단백질 약물 생성물은 전형적으로 항체, 예를 들어 단일 클론, 키메라 항체, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
단백질 약물 생성물이 함유된 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 함유하는 제1 라벨로 표지하는 단계를 포함하는 상기 단백질 약물 생성물을 선택하는 방법. 과량의 라벨을 제거할 수 있고 상기 샘플을 변성 및 환원시킨다. 그 다음, 상기 샘플은 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 가지는 제2 라벨로 표지된다. 상기 방법은 상기 샘플을 효소적으로 분해하고 상기 샘플을 대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 초 고성능 액체 크로마토그래피 직렬 질량 분석 시스템(UPLC-MS2 시스템)을 사용하여 분석하는 것을 포함한다. 다음으로, 상기 방법은 상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있다. 유리 티올이 검출되면, 상기 단백질 약물 생성물은 이황화 이질성을 가진다. 상기 방법은 이황화 이질성을 나타내지 않는 상기 단백질 약물 생성물을 선택하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 선택된 단백질 약물 생성물은 5개 미만의 유리 티올, 4개 미만의 유리 티올, 3개 미만의 유리 티올, 2개 미만의 유리 티올을 함유하는 IgG이다. 일부 실시예에서 상기 유리 티올은 상기 IgG 분자의 경쇄 내에 있다. 일부 실시예에서, 상기 유리 티올은 상기 IgG 분자의 중쇄 내에 있다. 일부 실시예에서, 상기 IgG 분자의 경쇄 내에 적어도 하나의 유리 티올 및 중쇄 내에 적어도 하나의 유리 티올이 있다. 한 실시예에서 상기 제1 MS/MS 리포터는 128의 질량을 가지고 상기 제2 MS/MS 리포터는 131의 질량을 가진다. 상기 단백질 약물 생성물은 전형적으로 항체, 예를 들어 단일 클론, 키메라 항체, 또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 실시예는 상기 기술된 방법을 사용하여 선택된 상기 단백질 약물 생성물을 함유하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버한다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버한다.
1. 요오도아세틸 태그
한 실시예에서, 펩티드는 천연 이황화 결합 및 유리 티올 잔여물을 식별하기 위해 태그로 표지될 수 있다. 상기 태그는 시스테인 함유 펩티드를 표지하는 요오도아세틸 태그일 수 있다. 예시적인 태그는 Thermo Scientific™ Iodoacetyl 직렬 질량 태그™ (iodoTMT™)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 요오도아세틸 태그는 시스테인 잔여물에 유리 술프하이드릴기을 비가역적으로 표지한다. 상기 태그에는 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, 질량 정규화 암, 및 MS/MS 리포터가 포함된다. 13C 및 15N의 조합으로 만들어진 총 5개의 동위 원소 원자가 각 시약 내의 상기 질량 정규화 암과 상기 MS/MS 리포터 영역에 통합되지만 도 1a에서 별표로 표시된 다른 위치에 분포되어 있다. 결과적으로 각 시약은 동일한 명목상 부모 질량을 갖지만 MS/MS 스펙트럼 상의 구별할 수 있는 MS/MS 리포터 영역에 대해 다음과 같은 고유 질량을 가진다: 127 Da, 128 Da, 130 Da 및 131 Da. 한 실시예에서, 유리 티올은 126, 127, 128, 129, 130, 또는 131 Da의 질량을 가지는 라벨로 태그된다. 또 다른 실시예에서, 천연 이황화 결합은 상기 유리 티올을 검출하기 위해 사용된 상기 질량을 가지는 라벨과 다른 질량을 가지는 표지로 태그된다. 비제한적인 예시는 127 Da의 질량을 가지는 라벨로 태깅된 유리 티올, 및 130 Da의 질량을 가지는 라벨로 태깅된 천연 이황화 결합을 포함한다.
예시적인 워크 플로우는 도 1b에 제공된다. 한 실시예에서, 상기 펩티드 샘플의 앨리쿼트는 상기 제1 태그와 혼합되고 배양된다. 상기 샘플에서 과량의 시약을 제거할 수 있고 상기 샘플을 변성 및 환원시킬 수 있다. 한 실시예에서, 상기 제2 질량 태그는 상기 샘플을 변성시킨 후 상기 샘플에 첨가된다. 상기 제2 태그를 첨가한 후 상기 샘플을 효소로 분해할 수 있다. 효소 분해를 위한 예시적인 방법은 위에서 논의되었다. 다른 실시예에서, 상기 두 샘플은 추가 분석 전에 함께 첨가될 수 있다. 일부 실시예에서, 최대 3쌍의 태그가 단일 실행으로 분석될 수 있다.
2. MS/MS
한 실시예에서, 상기 요오도아세틸 태그 표지된 펩티드는 질량 분석법, 예를 들어 초 고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)-MS/MS를 사용하여 분석된다. 한 실시예에서, 상기 UPLC는 에틸렌 브릿지 하이브리드(BEH) 컬럼 또는 대전 표면 하이브리드(CSH) 컬럼에서 수행된다. 상기 버퍼는 트리플루오로아세트산(TFA) 버퍼 또는 포름산(FA) 버퍼일 수 있다. 상기 액체 크로마토그래피는 약 90분 내지 약 150분 동안 실행될 수 있다. 버퍼 및 실행 시간은 분석되는 특정 샘플에 대해 최적화할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시예에서, 상기 실행은 약 40분의 재평형화 단계를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 UPLC는 40분의 재평형화 단계와 함께 150분 동안 FA 버퍼를 사용하여 150mm CSH 컬럼에서 실행된다.
UPLC를 사용하여 상기 펩티드를 분리한 후, 이를 질량 분광법을 사용하여 분석할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 표적화된 MS2 분광법이 사용된다. 상기 질량 분석기는 예를 들어 Thermo Scientific Q Exactive hybrid quadrupole Orbitrap® 질량 분석기일 수 있다. 표적화된 MS2에 대한 예시 워크 플로우가 도 10에 나와 있다. 상기 펩티드는 상기 질량 분석기에 도입되고 병렬 반응 모니터링을 사용하여 분석될 수 있다. 한 실시예에서, 전구체 질량 필터링은 Q1에서 수행되고 이어서 상기 HCD 셀에서 단편화되고 상기 Orbitrap® 질량 분석기에서 고분해/고질량 정확도(HR/HA) 단편 이온 검출이 수행된다. 일부 실시예에서, 상기 펩티드는 상기 정확한 질량에서 상기 정확한 펩티드를 확인하기 위해 MS1 내에서 포획된다. 상기 리포터 라벨은 상기 MS2의 Orbitrap® 내의 펩티드에서 분리된 다음 상기 Orbitrap에서 정량화된다. 상기 검출된 질량 태그에 해당하는 각 시스테인의 상대적 존재비를 계산할 수 있다.
한 실시예에서, 포함 질량은 상기 MS2 스캔에 포함된다. 예를 들어, 관심이 있거나 우려되는 특정 시스테인의 질량을 포함 목록으로 프로그래밍할 수 있다. 한 실시예에서, 포함 목록의 사용은 상기 관심 잔여물을 보다 강도 높게 정량화할 수 있다. 다른 실시예에서, 배제 질량은 상기 MS2 스캔에서 제외된다. 예를 들어, 안정적이거나 스크램블 결합을 거의 형성하지 않는 것으로 알려진 특정 시스테인의 질량은 상기 스캔에서 제외될 수 있다.
C. 관심 단백질
한 실시예에서 상기 관심 단백질은 단백질 약물 생성물이거나 원핵 또는 진핵 세포 내에서 발현에 적합한 관심 단백질이다. 예를 들어, 상기 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편, ScFv 또는 이의 단편, Fc-융합 단백질 또는 이의 단편, 성장 인자 또는 이의 단편, 사이토 카인 또는 이의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편일 수 있다. 상기 복합체 내의 단백질은 단일 서브 유닛으로 구성되는 단순 폴리 펩티드, 또는 둘 이상의 서브 유닛을 포함하는 복합 다중 서브 유닛 단백질일 수 있다. 상기 관심 단백질은 바이오 의약품, 식품 첨가물 또는 방부제, 또는 정제 및 품질 표준을 따르는 단백질 생성물 중 어느 하나일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 관심 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 클론 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일쇄 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-IG)이라 명명되는 이중특이적 4가 면역글로불린 G-유사 분자, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체이다. 한 실시예에서, 상기 항체는 IgG1 항체이다. 한 실시예에서, 상기 항체는 IgG2 항체이다. 한 실시예에서, 상기 항체는 IgG4 항체이다. 다른 실시예에서, 상기 항체는 키메라 힌지를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 항체는 키메라 Fc를 포함한다. 한 실시예에서, 상기 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 한 실시예에서, 상기 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 한 실시예에서, 상기 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 실시예에서, 상기 항체는 항-프로그래밍된 세포사 1 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2015/0203579A1호에 기술된 바와 같은 항-PD1 항체), 항-프로그래밍된 세포사 리간드-1 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0203580A1호에 기술된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포에틴-2 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,402,898호에서 기술된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항-안지오포에틴-유사 3 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,018,356호에서 기술된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,265,827호에서 기술된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프롤락틴 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,302,015호에서 기술된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0313194A1호에서 기술된 바와 같은 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,132,192호에서 기술된 바와 같은 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공개 제US2015/0259423A1호에서 기술된 바와 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-전구단백질 전환효소 섭틸리신 켁신-9 항체 (예를 들어, 미국 특허 제8,062,640호 또는 미국 특허 제9,540,449호에서 기술된 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체 (예를 들어, 항-미오스타틴 항체로도 알려진, 미국 특허 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에서 기술된 바와 같은 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0337045A1호 또는 제US2016/0075778A1호에 기술된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터루킨 4 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271681A1호 또는 미국 특허 제8,735,095호 또는 제8,945,559호에서 기술된 바와 같은 항-IL4R 항체), 항-인터루킨 6 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기술된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터루킨 33 (예를 들어, 미국 특허 제9,453,072호 또는 제9,637,535호에 기술된 바와 같은 항- IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제9,447,173호에 기술된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3 (예를 들어, 미국 특허 제9,447,173호 및 제9,447,173호, 및 미국 특허 출원 제62/222,605호에서 기술된 바와 같은 항-CD3 항체), 항- 분화 클러스터 20 (예를 들어, 미국 특허 제9,657,102호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 특허 제7,879,984호에서 기술된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항- 분화 클러스터-48 (예를 들어, 미국 특허 제9,228,014호에서 기술된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체 (예를 들어, 미국 특허 제9,079,948호에서 기술된 바와 같은), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0337029A1호에서 기술된 바와 같은 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2016/0215040호에서 기술된 바와 같은), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체 (예를 들어, 항-LAG3 항체, 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2016/0017029호 및 미국 특허 제8,309,088호 및 제9,353,176호에서 기술된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-단백질 Y 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 상기 이중특이적 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체 (미국 특허 출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호에서 기술된 바와 같은), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이적 항체 (예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc16 이중특이적 항체), 및 항-CD3 x 항- 전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체 (예를 들어 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 관심 단백질은 압식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아달리무맙-아토(adalimumab-atto), 아도-트라스트주맙(ado-trastuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 바실릭시맙(basiliximab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베즐로톡주맙(bezlotoxumab), 블리나투모맙(blinatumomab), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 브로달루맙(brodalumab), 카나키누맙(canakinumab), 캅프로맙 펜데티드(capromab pendetide), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 세미플리맙(cemiplimab), 세툭시맙(cetuximab), 데노수맙(denosumab), 디누툭시맙(dinutuximab), 두필루맙(dupilumab), 더발루맙(durvalumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 엘로투주맙(elotuzumab), 에미시주맙-kxwh(emicizumab-kxwh), 엠탄신알리로쿠맙(emtansinealirocumab), 에비나쿠맙(evinacumab), 에볼로쿠맙(evolocumab), 파시누맙(fasinumab), 골리무맙(golimumab), 구셀쿠맙(guselkumab), 이브리투모맙 타이욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 이다루시주맙(idarucizumab), 인플릭시맙(infliximab), 인플릭시맙-abda(infliximab-abda), 인플릭시맙-dyyb(infliximab-dyyb), 이필리무맙(ipilimumab), 익세키주맙(ixekizumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 네시투무맙(necitumumab), 네스바쿠맙(nesvacumab), 니볼루맙(nivolumab), 오빌톡삭시맙(obiltoxaximab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 올라라투맙(olaratumab), 오말리주맙(omalizumab), 파니투무맙(panitumumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab), 락시바쿠맙(raxibacumab), 레스리주맙(reslizumab), 리누쿠맙(rinucumab), 리툭시맙(rituximab), 사리루맙(sarilumab), 세쿠키누맙(secukinumab), 실툭시맙(siltuximab), 토실리주맙(tocilizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 트레보그루맙(trevogrumab), 우스테키누맙(ustekinumab) 및 베돌리주맙(vedolizumab)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 상기 관심 단백질은 Fc 모이어티 및 다른 도메인을 함유하는 재조합 단백질이다(예를 들어 Fc-융합 단백질). 일부 실시예에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 결합된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 함유하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시예에서, 상기 Fc 모이어티는 IgG의 CH2 및 CH3 도메인이 뒤따르는 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다중 리간드에 결합하는 둘 이상의 별개의 수용체 쇄를 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 예를 들어, IL-1 트랩 (예를 들어, 릴로나셉트이며, hIgG1의 Fc에 융합된 상기 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 상기 Il-1RAcP 리간드 결합 영역을 포함한다; 미국 특허 제6,927,004호 참조, 그 전체가 참고로서 본원에 인용됨), 또는 VEGF 트랩 (예를 들어, 애플리버셉트 또는 ziv-애플리버셉트이며, hIgG1의 Fc에 융합된 상기 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 상기 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함한다; 미국 특허 제7,087,411호 및 제7,279,159호 참조)과 같은 TRAP 단백질이다. 다른 실시예에서, Fc-융합 단백질은 ScFv-Fc-융합 단백질이며, Fc 모이어티에 결합된 항체의 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편과 같은 하나 이상의 항원-결합 도메인(들) 중 하나 이상을 함유한다.
D. 이황화 이질성이 거의 또는 전혀 없는 mAb 생산
한 실시예는 유리 티올을 거의 또는 전혀 함유하지 않는 단백질 약물 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 상기 항체를 생산하기 위한 적합한 조건 하에서 세포 배양 내에서 상기 항체를 생산하는 세포를 배양하는 것, 상기 항체를 추출하기에 적합한 조건 하에서 상기 항체를 정제하는 것, 상기 항체를 안정화시키기 위한 적합한 조건 하에서 상기 항체를 부형제와 혼합하는 것, 상기 세포 배양으로부터 상기 항체를 정제하는 것, 또는 상기 정제된 항체에 부형제를 첨가하는 것에 이어서 상기 세포 배양으로부터 상기 항체의 샘플을 얻는 것, 및 상기 개시된 방법에 따라 상기 항체의 이황화 결합을 특짓 짓는 것, 및 상기 항체의 교차 힌지 이황화 결합의 양을 감소시키기 위해 하나 이상의 세포 배양, 정제, 또는 부형제 조건을 변형하는 것을 포함한다.
상기 항체 내에서 유리 티올의 양을 감소시키기 위해 변경되는 하나 이상의 상기 세포 배양, 정제 또는 부형제 조건은 온도, pH, 산소 수준, 반응성 산소 종, 계면 활성제 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 한 실시예에서, 세포 배양의 무 아미노산 전략은 이황화 결합 형성에 영향을 미칠 수 있다.
한 실시예에서, 상기 항체를 생산하는 상기 세포는 중국 햄스터 난소 세포이다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 하이브리도마 세포이다. 한 실시예에서, 상기 단백질 약물 생성물은 IgG 단일 클론 항체 및 이의 단편이다.
한 실시예에서, 상기 단백질 약물 생성물은 유리 티올을 함유하지 않는다. 다른 실시예에서, 상기 단백질 약물 생성물은 IgG 분자에 5개 미만의 유리 티올, 4개 미만의 유리 티올, 3개 미만의 유리 티올, 2개 미만의 유리 티올을 함유한다. 다른 실시예에서 상기 유리 티올은 IgG 분자의 경쇄 내에 있다. 다른 실시예에서, 상기 유리 티올은 IgG 분자의 중쇄 내에 있다. 다른 실시예에서, IgG 분자의 경쇄 내에 적어도 하나의 유리 티올 및 중쇄 내에 적어도 하나의 유리 티올이 있다.
실시예
실시예 1: 부위특이적 유리 티올 분석
방법
시스테인 표지
그림 1b의 워크 플로우를 따랐다. 간단히 말하자면, 대조군 샘플 및 항체 샘플은 iodo-TMT 시약으로 표지되었다 (도 1a). 상기 과량의 시약을 제거하고 상기 샘플을 변성시키고 0.5M TCEP를 사용하여 환원시키고 1시간 동안 배양하였다. 변성 및 환원 후, 제2 라벨이 샘플에 첨가되었다. 그런 다음 상기 샘플을 결합하고, 효소로 분해하고, UPLC-MS/MS를 사용하여 분석했다. UPLC 조건은 다음과 같다: 샘플은 40분 재평형화 단계를 포함하여 150분 실행 동안 150mm CSH 컬럼에서 실행되었다. FA 버퍼가 사용되었다.
스파이크 인 연구
상기 스파이크 인 연구를 위해 동일한 단백질의 두 가지 다른 샘플의 앨리쿼트를 준비했다. GuanHCl을 사용하여 상기 단백질을 변성시키고 환원시켰다. 상기 샘플은 두 개의 다른 IodoTMT 태그로 표지되었다. 다음으로 스파이크 인 농도 기울기가 준비되었다. 단백질 샘플 1의 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 0.1%를 단백질 샘플 2의 앨리쿼트에 첨가하였다. 그런 다음 상기 샘플을 효소로 분해하고 UPLC/MS-MS를 사용하여 분석했다 (도 2).
결과:
표 1은 부위특이적 유리 티올을 식별하기 위해 iodo-TMT 태그로 표지된 Regeneron 항체의 표적화된 MS2 분석 결과를 보여준다. 상기 표에서 볼 수 있듯이 16개의 시스테인 잔여물이 모두 식별되었다.
도 3a 내지 3b는 상기 동일한 샘플에 대한 데이터 의존 MS2 실행과 표적화된 MS2 실행(포함 목록 포함)의 비교를 보여준다. 상기 도에서 볼 수 있듯이, 특정 시스테인의 포함 목록과 함께 실행되는 표적화된 MS2는 특정 시스테인 잔여물을 보다 격렬하게 정량화하는 데 도움이 될 수 있다. 또한, 표적화된 MS2 와 결합된 iodo-TMT 태그를 사용하면 표지된 시스테인을 더 잘 분리할 수 있다. 도 4a 내지 4b는 128 Da 표지된 시스테인 및 131 Da 표지된 시스테인의 명확한 분리를 보여준다. 상기 개시된 방법은 표지된 IAA 방법과 같은 현재 방법에서 볼 수 있는 동위 원소 패턴이 오버랩될 염려없이 매우 명확한 분리를 가진다.
상기 개시된 방법의 유용성을 추가로 보여주기 위해, 상기 동일한 항체 생성물의 상이한 로트를 비교하였다. 도 5a 내지 5g는 상기 동일한 항체의 상이한 로트 내에서 유리 티올 및 이황화 결합 시스테인의 상대적 존재비를 보여준다.
스파이크 인 연구를 사용하여 상기 방법의 추가 검증을 수행했다. 다양한 백분율의 표지된 단백질 샘플 1이 표지된 단백질 샘플 2에 첨가되었다. 도 6은 상기 스파이크 인 연구의 결과를 보여준다. 상기 시스테인의 대부분은 단백질 샘플 2에 스파이킹된 단백질 샘플 1의 양에 의해 예측될 유리 티올의 예상되는 양을 보여주었으며, 이는 상기 방법이 유리 티올의 상대적 존재비를 예측하는 데 효과적임을 나타낸다.
Figure pct00001
표 2는 Regeneron 항체 생성물에 대한 유리 티올 및 이황화 결합 존재비의 결과를 요약한다. 각 시스테인 부위에 대해 부위특이적 유리 티올 백분율을 계산하였다. 16개의 시스테인이 모두 식별되고 정량화되었다. 5-6% 유리 티올의 임계값이 설정되었으며, 상기 임계값 미만은 이황화 결합 파손의 가능성을 나타내지 않았다. 도 7은 Regeneron 항체 생성물의 다른 로트 내에서 이황화 결합쌍의 상대적 존재비를 나타낸다.
개시된 방법 및 결과는 부위특이적 총 유리 티올 정량화 및 이황화 스크램블링 위치의 잠재적 지표로서 사용될 수 있다. 또한 반 분자 또는 응집으로 이어지는 사슬 내 이황화를 식별하는 데 사용할 수 있다.
Figure pct00002
전술한 명세서에서 본 발명을 이의 특정 실시예에 관하여 설명하였으며, 많은 세부 사항이 예시를 위해 제시되었지만, 본 발명이 추가적인 실시예에 영향을 받기 쉬우며 본원에서 설명된 소정의 세부사항들이 본 발명의 기본 원칙을 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 인용된다. 본 발명은 사상 또는 이의 필수 속성으로부터 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있으며, 본 발명의 범위를 나타내는 것으로서, 전술한 명세서보다는, 첨부된 청구범위를 참조하여야 한다.

Claims (20)

  1. 단백질 약물 생성물에서의 유리 티올의 식별 방법으로서,
    단백질 약물 생성물을 포함하는 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 포함하는 제1 라벨로 표지하는 단계;
    과량의 제1 라벨을 제거하는 단계;
    상기 샘플을 변성 및 환원시키는 단계;
    술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 포함하는 제2 라벨로 상기 샘플을 표지하는 단계;
    상기 샘플을 효소적으로 분해하는 단계;
    대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 UPLC-MS2 시스템을 사용하여 상기 샘플을 분석하는 단계; 및
    상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 MS/MS 리포터는 128의 질량을 가지고 상기 제2 MS/MS 리포터는 131의 질량을 가지는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 라벨은
    Figure pct00003

    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5-6% 유리 티올의 임계값이 설정되고, 상기 임계값 미만의 결과가 이황화 결합 파손의 가능성을 나타내지 않는, 방법.
  9. 단백질 약물 생성물에서의 이황화 이질성의 식별 방법으로서,
    단백질 약물 생성물을 포함하는 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 포함하는 제1 라벨로 표지하는 단계;
    과량의 제1 라벨을 제거하는 단계;
    상기 샘플을 변성 및 환원시키는 단계;
    술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 포함하는 제2 라벨로 상기 샘플을 표지하는 단계;
    상기 샘플을 효소적으로 분해하는 단계;
    대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 UPLC-MS2 시스템을 사용하여 상기 샘플을 분석하는 단계; 및
    상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계를 포함하며, 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있으며, 유리 티올의 검출은 상기 단백질 약물 생성물이 이황화 이질성을 가진다는 것을 나타내는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 라벨은
    Figure pct00004

    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 모든 32개의 시스테인 잔여물의 완전한 커버리지를 제공하는 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자 내의 상기 중쇄 및 경쇄 상의 상기 16개의 시스테인 잔여물을 커버하는 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 경쇄 상의 상기 5개의 시스테인 잔여물을 커버하는 것인 방법.
  14. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 IgG 분자의 각 중쇄 상의 상기 11개의 시스테인 잔여물을 커버하는 것인 방법.
  15. 단백질 약물 생성물의 선택 방법으로서,
    단백질 약물 생성물을 포함하는 샘플을 술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제1 MS/MS 리포터를 포함하는 제1 라벨로 표지하는 단계;
    과량의 제1 라벨을 제거하는 단계;
    상기 샘플을 변성 및 환원시키는 단계;
    술프하이드릴 반응성 요오도아세틸기, MS-중성 스페이서 암, 및 고유한 리포터 이온 질량을 가지는 제2 MS/MS 리포터를 포함하는 제2 라벨로 상기 샘플을 표지하는 단계;
    상기 샘플을 효소적으로 분해하는 단계;
    대전 표면 하이브리드 컬럼 및 포름산 버퍼 이동상을 포함하는 UPLC-MS2 시스템을 사용하여 상기 샘플을 분석하는 단계;
    상기 제1 MS/MS 리포터 및 상기 제2 MS/MS 리포터를 정량화하는 단계 - 여기서 상기 제1 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 유리 티올의 양과 관련이 있으며 상기 제2 MS/MS 리포터의 양은 상기 단백질 약물 생성물 내의 결합된 티올의 양과 관련이 있음-; 및
    유리 티올이 거의 또는 전혀 없는 경우 상기 단백질 생성물을 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 선택된 단백질 약물 생성물은 IgG 분자에 5개 미만의 유리 티올, 4개 미만의 유리 티올, 3개 미만의 유리 티올, 또는 2개 미만의 유리 티올을 함유하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유리 티올은 IgG 분자의 경쇄 내에 있는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 유리 티올은 IgG 분자의 중쇄 내에 있는, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 유리 티올이 IgG 분자의 중쇄 내에 있고 적어도 하나의 유리 티올이 경쇄 내에 있는, 방법.
  20. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 선택된 상기 단백질 생성물을 포함하는 약제학적 조성물.
KR1020217016160A 2019-01-16 2020-01-16 단백질 내에서 유리 티올을 식별하는 방법 KR20210114926A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962792994P 2019-01-16 2019-01-16
US62/792,994 2019-01-16
PCT/US2020/013910 WO2020150492A1 (en) 2019-01-16 2020-01-16 Methods for identifying free thiols in proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210114926A true KR20210114926A (ko) 2021-09-24

Family

ID=69570836

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217016167A KR20210114927A (ko) 2019-01-16 2020-01-16 이황화 결합을 특징 짓는 방법
KR1020217016160A KR20210114926A (ko) 2019-01-16 2020-01-16 단백질 내에서 유리 티올을 식별하는 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217016167A KR20210114927A (ko) 2019-01-16 2020-01-16 이황화 결합을 특징 짓는 방법

Country Status (19)

Country Link
US (4) US11579150B2 (ko)
EP (3) EP3857237B1 (ko)
JP (2) JP2022517720A (ko)
KR (2) KR20210114927A (ko)
CN (3) CN117110492A (ko)
AU (2) AU2020208396A1 (ko)
BR (2) BR112021009544A2 (ko)
CA (2) CA3116735A1 (ko)
DK (1) DK3857237T3 (ko)
EA (2) EA202191841A1 (ko)
ES (1) ES2942024T3 (ko)
FI (1) FI3857237T3 (ko)
HU (1) HUE061783T2 (ko)
IL (2) IL284471B1 (ko)
MX (2) MX2021008589A (ko)
PL (1) PL3857237T3 (ko)
SG (2) SG11202104103XA (ko)
WO (2) WO2020150492A1 (ko)
ZA (2) ZA202102546B (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020208396A1 (en) 2019-01-16 2021-05-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying free thiols in proteins
CA3202429A1 (en) * 2020-12-20 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identification of scrambled disulfides in biomolecules
US20240060988A1 (en) * 2021-02-25 2024-02-22 Dr. Reddy’S Laboratories Limited Thiol variants and analytical methods thereof
CN113189254B (zh) * 2021-05-08 2021-11-16 北京工商大学 一种基于白酒中挥发性硫醇化合物的测定方法

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
JP3727317B2 (ja) 2002-03-08 2005-12-14 エイエスエムエル ネザランドズ ベスローテン フエンノートシャップ リソグラフィに使用するためのマスク、マスクを作成する方法、リソグラフィ装置、およびデバイス製造方法
RS52176B (en) 2006-06-02 2012-08-31 Regeneron Pharmaceuticals Inc. HIGH AFINITY ANTIBODIES TO THE HUMAN IL-6 RECEPTOR
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
ES2527297T3 (es) 2007-07-31 2015-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanos para CD20 humano y método para utilizar los mismos
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
DK2975051T3 (da) 2009-06-26 2021-04-26 Regeneron Pharma Let-at-isolere bispecifikke antistoffer med nativt immunoglobulinformat
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
CA3220104A1 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JOP20190250A1 (ar) 2010-07-14 2017-06-16 Regeneron Pharma صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب
AR083044A1 (es) 2010-09-27 2013-01-30 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos
PT2624865T (pt) 2010-10-06 2018-11-05 Regeneron Pharma Formulações estabilizadas que contêm anticorpos anti-recetor de interleucina-4 (il-4r)
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
WO2012078761A2 (en) * 2010-12-09 2012-06-14 Bayer Healthcare Llc Dimeric molecular complexes with free cysteine residues and conjugates thereof
JO3412B1 (ar) 2011-06-17 2019-10-20 Regeneron Pharma أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها
US8871209B2 (en) 2011-11-14 2014-10-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing GDF8 and or Activin A
SG11201403792TA (en) 2012-01-23 2014-10-30 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-ang2 antibodies
CN109880867A (zh) 2012-03-27 2019-06-14 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于重组蛋白质的改进的收获操作
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
US9835629B2 (en) 2012-05-18 2017-12-05 Pierce Biotechnology, Inc. Methods and reagents for biomolecule labeling, enrichment and gentle elution
TWI641619B (zh) 2012-06-25 2018-11-21 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
MX363213B (es) 2012-08-13 2019-03-15 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-pcsk9 con características de unión dependientes del ph.
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法
EA034834B1 (ru) 2013-03-15 2020-03-26 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антагонисты il-33 и их применение
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
EA035809B1 (ru) 2014-03-11 2020-08-14 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
WO2015171523A1 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized c5 and c3 animals
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
WO2016018978A1 (en) * 2014-07-29 2016-02-04 Mayo Foundation For Medical Education And Research Quantifying monoclonal antibody therapeutics by lc-ms/ms
WO2016044337A1 (en) 2014-09-16 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glucagon antibodies and uses thereof
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
CN108627647B (zh) * 2017-03-24 2020-06-19 四川大学 一种翻译后修饰蛋白质组学的检测和定量方法
CN109142561A (zh) * 2018-07-17 2019-01-04 上海师范大学 同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其应用
AU2020208396A1 (en) 2019-01-16 2021-05-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying free thiols in proteins

Also Published As

Publication number Publication date
EP4220173A3 (en) 2023-10-18
CN113272651B (zh) 2023-06-16
JP2022517720A (ja) 2022-03-10
CN117110492A (zh) 2023-11-24
CA3116735A1 (en) 2020-07-23
US20200225243A1 (en) 2020-07-16
WO2020150492A8 (en) 2021-05-06
EP3857236A1 (en) 2021-08-04
EP4220173A2 (en) 2023-08-02
SG11202104237YA (en) 2021-05-28
DK3857237T3 (da) 2023-05-01
EP3857237A1 (en) 2021-08-04
HUE061783T2 (hu) 2023-08-28
WO2020150492A1 (en) 2020-07-23
US11579150B2 (en) 2023-02-14
CN113272651A (zh) 2021-08-17
AU2020208395A1 (en) 2021-05-20
ZA202102547B (en) 2023-10-25
US20230273216A1 (en) 2023-08-31
JP2022517721A (ja) 2022-03-10
US20230280354A1 (en) 2023-09-07
MX2021008589A (es) 2021-08-11
ES2942024T3 (es) 2023-05-29
CN113272650A (zh) 2021-08-17
AU2020208396A1 (en) 2021-05-20
EP3857237B1 (en) 2023-03-01
ZA202102546B (en) 2023-10-25
IL284473A (en) 2021-08-31
US20200225245A1 (en) 2020-07-16
BR112021009544A2 (pt) 2021-10-26
EA202191841A1 (ru) 2021-10-07
CA3116732A1 (en) 2020-07-23
IL284471A (en) 2021-08-31
IL284471B1 (en) 2024-09-01
US12000839B2 (en) 2024-06-04
KR20210114927A (ko) 2021-09-24
US11674968B2 (en) 2023-06-13
EA202191699A1 (ru) 2021-10-11
SG11202104103XA (en) 2021-05-28
BR112021009543A2 (pt) 2021-08-17
PL3857237T3 (pl) 2023-07-10
MX2021008590A (es) 2021-08-11
JP7560456B2 (ja) 2024-10-02
FI3857237T3 (fi) 2023-05-03
WO2020150491A1 (en) 2020-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11674968B2 (en) Methods for identifying free thiols in proteins
AU2019215125B2 (en) System and method for characterizing protein dimerization
US20210382067A1 (en) High-throughput and mass-spectrometry-based method for quantitating antibodies
US20220169704A1 (en) System and method for characterizing drug product impurities
KR102711151B1 (ko) 약물 제품 불순물 특성화를 위한 시스템 및 방법
EA047402B1 (ru) Способы для идентификации свободных тиолов в белках
KR20240144486A (ko) 약물 제품 불순물 특성화를 위한 시스템 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal