BR112021009544A2 - Métodos para identificar ligações dissulfeto embaralhadas em um medicamento de proteína e de produção de um medicamento de proteína, e, composição farmacêutica - Google Patents

Métodos para identificar ligações dissulfeto embaralhadas em um medicamento de proteína e de produção de um medicamento de proteína, e, composição farmacêutica Download PDF

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Abstract

métodos para identificar ligações dissulfeto embaralhadas em um medicamento de proteína e de produção de um medicamento de proteína, e, composição farmacêutica. são fornecidas composições e métodos para analisar ligações dissulfeto. um método exemplificativo inclui a preparação de padrões de peptídeos sem ligações dissulfeto, padrões de peptídeos de ligação dissulfeto embaralhada e padrões de peptídeos de ligação dissulfeto nativa de acordo com a sequência da região do medicamento de proteína que inclui a ligação dissulfeto, digestão de uma amostra de medicamento de proteína em peptídeos, separação dos peptídeos de medicamento de proteína, análise dos peptídeos de medicamento de proteína e os padrões de peptídeo, identificação dos peptídeos de ligação dissulfeto embaralhada e nativa por tempo de retenção e quantificação do nível de peptídeos de ligação dissulfeto embaralhada.

Description

1 / 25
MÉTODOS PARA IDENTIFICAR LIGAÇÕES DISSULFETO EMBARALHADAS EM UM MEDICAMENTO DE PROTEÍNA E DE PRODUÇÃO DE UM MEDICAMENTO DE PROTEÍNA, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[001] A invenção, em geral, se refere a sistemas e métodos de caracterização de anticorpos, em particular, ligações dissulfeto.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[002] Este pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. nº 62/792.994 depositado em 16 de janeiro de 2019, incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] Durante o desenvolvimento de anticorpos monoclonais (mAbs) a partir de fármaco candidato a produto comercializado podem ocorrer problemas de estabilidade, modificações pós-tradução ou outras alterações no anticorpo. Alterações na estrutura e função do anticorpo podem causar problemas como baixa vida útil ou mesmo imunogenicidade no paciente. Portanto, é importante caracterizar adequadamente a estrutura do anticorpo e monitorá-la ao longo da produção. O controle de qualidade e a garantia de qualidade do anticorpo são essenciais para a pureza e a segurança dos produtos de mAb.
[004] As ligações dissulfeto são importantes para a integridade estrutural, estabilidade e funções biológicas dos mAbs. As ligações dissulfeto não nativas podem causar alterações na estrutura e estabilidade dos mAbs. A afinidade de ligação dos mAbs aos antígenos pode ser afetada em até 50% se as ligações dissulfeto estiverem incompletas (Xiang, T., et al., Anal Chem, 81: 8101-8108 (2009)). A baixa energia de dissociação das ligações dissulfeto e a alta flexibilidade da região de dobradiça frequentemente levam a modificações e clivagens na região de dobradiça (Moritz, B., e Stracke, J.O.,
2 / 25 Electrophoresis, 36:769-785 (2017)). Além disso, a administração de estruturas ligadas por dissulfeto não nativas a humanos tem o potencial de desencadear respostas imunes indesejadas. A análise das ligações dissulfeto é, portanto, importante para a avaliação do controle de qualidade dos mAbs. Os métodos atuais de análise de ligações dissulfeto de mAb são demorados e trabalhosos.
[005] Portanto, é um objetivo da invenção fornecer sistemas e métodos para caracterizar anticorpos monoclonais, em particular ligações dissulfeto em anticorpos monoclonais.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[006] São fornecidas composições e métodos para caracterizar ligações dissulfeto. Uma modalidade fornece um método para identificar ligações dissulfeto embaralhadas em um medicamento de proteína e inclui as etapas de preparação de padrões de peptídeo com regiões do medicamento de proteína contendo uma ou mais ligações dissulfeto. Os padrões de peptídeo podem ser feitos para conter cada tipo diferente de ligação dissulfeto embaralhada. Por exemplo, um padrão pode incluir uma ligação dissulfeto cruzada e outro padrão pode incluir uma ligação dissulfeto intracadeia. A Figura 1A mostra formas exemplificativas de ligações dissulfeto que podem estar presentes no padrão de peptídeo. Em uma modalidade, o padrão de peptídeo contém uma ligação dissulfeto normal ou paralela. Cada padrão de peptídeo tem um tempo de retenção de cromatografia líquida conhecido diferente em comparação com os outros padrões de peptídeo. O método inclui digerir uma amostra de medicamento de proteína em peptídeos e analisar uma amostra contendo peptídeos de medicamento de proteína e os padrões de peptídeo usando um sistema de espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida (sistema LC-MS2). Os peptídeos detectados nos tempos de retenção dos diferentes padrões são indicativos da presença no medicamento de proteína do tipo de ligação dissulfeto no padrão de peptídeo
3 / 25 específico. Em uma modalidade, o medicamento de proteína é um anticorpo monoclonal. Em outras modalidades, o medicamento de proteína é uma proteína recombinante, uma proteína de fusão ou uma combinação das mesmas.
[007] Os padrões de peptídeo podem ser preparados usando técnicas convencionais. Por exemplo, uma reação de oxidação pode ser usada para gerar ligações dissulfeto nos padrões de peptídeo. Em uma modalidade, a reação de oxidação é realizada usando Cu2+.
[008] Outra modalidade fornece um método de produção de um medicamento de proteína incluindo as etapas de produzir o medicamento de proteína em uma cultura de células e identificar as ligações dissulfeto embaralhadas do medicamento de proteína usando o método descrito anteriormente. O método inclui modificar uma ou mais condições de cultura de células, purificação ou excipiente para reduzir a quantidade de ligações dissulfeto de dobradiça cruzadas do medicamento de proteína para menos de 1,0%. A uma ou mais condições podem incluir condições de cultura de células, como temperatura, pH, níveis de oxigênio, espécies reativas de oxigênio, tensoativos ou combinações dos mesmos.
[009] Outra modalidade fornece uma composição farmacêutica incluindo anticorpos monoclonais com menos de 30% de ligações dissulfeto embaralhadas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0010] A Figura 1A é uma ilustração esquemática que mostra a oxidação de um peptídeo de dobradiça reduzido que tem a sequência THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1). A Figura 1B é um cromatograma que mostra os peptídeos de dobradiça que foram oxidados durante a noite, resultando em peptídeos com duas ligações dissulfeto cruzadas e peptídeos de dobradiça com duas ligações dissulfeto paralelas. Os peptídeos têm a sequência THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1). A Figura 1C é um
4 / 25 cromatograma que mostra os peptídeos com uma ligação dissulfeto paralela (Pico 1 e 3) ou cruzada (Pico 2). O eixo X representa o tempo (minutos) e o eixo Y representa a abundância.
[0011] As Figuras 2A-2B são cromatogramas que mostram a formação de ligações dissulfeto em peptídeos que foram incubados com Cu2+ durante a noite. Os peptídeos eram de ~0,1 µg/ml (Figura 2A) ou ~8 µg/ml (Figura 2B). Os peptídeos têm a sequência THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1). O eixo X representa o tempo (minutos) e o eixo Y representa a abundância relativa.
[0012] As Figuras 3A-3H são cromatogramas que mostram os resultados da análise do N-terminal do padrão de peptídeo de dobradiça paralelo. Os eixos X representam o tempo (minutos) e os eixos Y representam mV. A Figura 3I é uma ilustração esquemática dos vários peptídeos que podem ser detectados durante os ciclos de análise do N-terminal. As sequências de peptídeos são as seguintes: THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1), C-PTH (SEQ ID NO: 2) e PPCPAPELLG (SEQ ID NO: 3).
[0013] As Figuras 4A-4H são cromatogramas que mostram os resultados da análise do N-terminal do padrão de peptídeo de dobradiça cruzado. Os eixos X representam o tempo (minutos) e os eixos Y representam mV. A Figura 4I é uma ilustração esquemática dos vários peptídeos que podem ser detectados durante os vários ciclos de análise do N-terminal. As sequências de peptídeos são as seguintes: THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1), C-PTH (SEQ ID NO: 2) e PPCPAPELLG (SEQ ID NO: 3).
[0014] As Figuras 5A e 5B são cromatogramas que mostram os resultados da análise de LC-MS dos peptídeos restantes após quatro ciclos de degradação de Edman. A Figura 5A mostra os peptídeos com ligações dissulfeto cruzadas e a Figura 5B mostra os peptídeos com ligações dissulfeto paralelas. A Figura 5C-5F são cromatogramas dos peptídeos individuais da Figura 5A. As sequências de peptídeos são as seguintes: C-PTH (SEQ ID NO:
5 / 25 2) e PPCPAPELLG (SEQ ID NO: 3).
[0015] A Figura 6A é um cromatograma de um padrão de peptídeo de dobradiça paralelo para mAb1 de IgG1. A Figura 6B é um cromatograma de um padrão de peptídeo de dobradiça cruzado para mAb de IgG1. A Figura 6C é um cromatograma de peptídeos de mAb1 de IgG1. O eixo X representa o tempo (minutos) e o eixo Y representa a abundância relativa. Os peptídeos têm a sequência THTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 1).
[0016] A Figura 7A é um cromatograma de um padrão de peptídeo de dobradiça paralelo para mAb1 de IgG4. A Figura 7B é um cromatograma de um padrão de peptídeo de dobradiça cruzado para mAb1 de IgG4. A Figura 7C é um cromatograma de peptídeos de mAb1 de IgG4. O eixo X representa o tempo (minutos) e o eixo Y representa a abundância relativa. Os peptídeos têm a sequência YGPPCPPCPAPEFLG (SEQ ID NO: 4).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições
[0017] Deve ser apreciado que esta divulgação não está limitada às composições e métodos descritos neste documento, bem como às condições experimentais descritas, pois tais podem variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades específicas apenas, e não se pretende limitar o escopo da presente invenção, o qual será limitado somente pelas reivindicações anexas.
[0018] A menos que definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por um versado na técnica ao qual pertence esta divulgação. Embora quaisquer composições, métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publicações aqui mencionadas são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade.
[0019] O uso dos termos "um", "uma", "o/a" e referentes semelhantes
6 / 25 no contexto da descrição da invenção atualmente reivindicada (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser interpretados para cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto.
[0020] A repetições de faixas de valores neste documento é meramente destinado a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma neste documento, e cada valor separado está incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado neste documento.
[0021] O uso do termo "cerca de" se destina a descrever valores acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 10%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 5%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 2%; em outras modalidades, os valores podem variar em valor acima ou abaixo do valor declarado em uma faixa de aprox. +/- 1%. As faixas anteriores devem ser esclarecidas pelo contexto e nenhuma limitação adicional está implícita. Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") fornecido neste documento se destina meramente a esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.
[0022] “Proteína” se refere a uma molécula compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácidos ligados entre si por uma ligação peptídica. A
7 / 25 proteína inclui polipeptídeos e peptídeos e também pode incluir modificações como glicosilação, ligação lipídica, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, alquilação, hidroxilação e ADP-ribosilação. As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo fármacos à base de proteínas, e as proteínas incluem, entre outras coisas, enzimas, ligantes, receptores, anticorpos e proteínas quiméricas ou de fusão. As proteínas são produzidas por vários tipos de células recombinantes usando métodos conhecidos de cultura celular e, em geral, são introduzidas na célula por técnicas de engenharia genética (por exemplo, como uma sequência que codifica uma proteína quimérica ou uma sequência otimizada por códon, uma sequência sem íntrons, etc.) onde possa residir como um epissoma ou ser integrado ao genoma da célula.
[0023] "Anticorpo" se refere a uma molécula de imunoglobulina que consiste em quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada possui uma região variável da cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada contém três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve tem uma região variável da cadeia leve e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve consiste em um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo "anticorpo" inclui referência a imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse. O termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, como anticorpos isolados de uma célula hospedeira
8 / 25 transfectada para expressar o anticorpo. O termo anticorpo também inclui anticorpo biespecífico, que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Os anticorpos biespecíficos são, em geral, descritos na Patente U.S. n° 8.586.713, que está incorporada por referência neste pedido.
[0024] "Região de dobradiça" se refere ao trecho de aminoácido flexível na parte central das cadeias pesadas das classes de imunoglobulina IgG e IgA, que liga essas 2 cadeias por ligações dissulfeto. Nas imunoglobulinas IgG, a região de dobradiça está localizada entre os domínios constantes CH1 e CH3. A região de dobradiça proporciona flexibilidade ao anticorpo e permite uma ligação mais fácil ao antígeno.
[0025] "Proteínas de fusão Fc" compreendem parte ou todas as duas ou mais proteínas, uma das quais é uma porção Fc de uma molécula de imunoglobulina, que não são encontradas juntas na natureza. A preparação de proteínas de fusão compreendendo certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Rath, T., et al., Crit Rev Biotech, 35(2): 235-254 (2015), Levin, D., et al., Trends Biotechnol, 33(1): 27-34 (2015)) "Proteínas de fusão Fc do receptor" compreendem um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc, que em algumas modalidades compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma imunoglobulina. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc compreende duas ou mais cadeias de receptor distintas que se ligam a um ou mais ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é um bloqueador, como por exemplo um bloqueador de IL-1 ou bloqueador de VEGF.
[0026] O termo "ligação dissulfeto" se refere à ligação formada pela oxidação de dois grupos SH, cada um ligado a uma cisteína. As ligações dissulfeto desempenham um papel importante no dobramento e estabilidade
9 / 25 de muitas proteínas. As IgGs incluem duas cadeias pesadas (HC) e duas cadeias leves (LC) covalentemente ligadas por um total de 16 ligações dissulfeto inter ou intramoleculares. Os mAbs de IgG contêm 32 resíduos de cisteína, 5 resíduos de cisteína em cada LC e 11 resíduos de cisteína em cada HC. Cada LC contém um domínio variável e um domínio constante com uma conexão de ligação dissulfeto. A 5 a cisteína na LC está ligada, quer à 3a ou 5a cisteína da HC para formar uma ligação dissulfeto intercadeias. As cadeias pesadas incluem um domínio variável N-terminal (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3) com uma região de dobradiça entre CH1 e a a CH2 (Vidarsson, G., et al., Front Immunol , 5: 520 ( 2014)). A 6 e 7 cisteína em cada HC estão ligadas formando a região de dobradiça. A região de dobradiça de uma imunoglobulina ajuda a formar a estrutura em forma de Y da molécula de imunoglobulina. A forma em Y possibilita a flexibilidade das moléculas de imunoglobulina necessárias para a ligação ao antígeno.
[0027] "Ligação dissulfeto intracadeia" se refere a ligações que são formadas entre duas cisteínas dentro da mesma cadeia de proteína.
[0028] "Ligação dissulfeto intercadeias" se refere a ligações que são formadas entre duas cisteínas de cadeias individuais da mesma proteína ou entre duas cisteínas de proteínas distintas.
[0029] "Ligação dissulfeto embaralhada" se refere a uma ligação dissulfeto na qual uma cisteína se liga a uma cisteína à qual normalmente não se liga. Por exemplo, a cisteína X se liga à cisteína Z em vez da cisteína Y. Ligações dissulfeto embaralhadas exemplificativas incluem, mas não se limitam a, ligações dissulfeto cruzadas e intracadeias.
[0030] Tal como usado neste documento, o termo "dobradiça cruzada" se refere a uma região de dobradiça de anticorpo na qual as ligações dissulfeto dentro da região de dobradiça do anticorpo estão em uma formação cruzada em vez de paralela, como visto no canto inferior direito da Figura 1A.
[0031] O termo "LC-MS" se refere a cromatografia líquida-
10 / 25 espectrometria de massa, que é uma técnica de química analítica que combina os recursos de separação física da cromatografia líquida (ou HPLC) com os recursos de análise de massa da espectrometria de massa (MS). II. Métodos de caracterização de ligações dissulfeto
[0032] As ligações dissulfeto são críticas para a estrutura terciária, estabilidade e função biológica de IgG. Os resíduos de cisteína estão envolvidos nas ligações dissulfeto. Cada subclasse de moléculas de IgG humana tem uma estrutura de dissulfeto homogênea bem definida; no entanto, há muitos casos relatados em que existe heterogeneidade da ligação dissulfeto. Quaisquer duas cisteínas próximas formarão uma ligação covalente, mesmo as cisteínas que não se emparelham naturalmente. A formação de ligações dissulfeto entre cisteínas emparelhadas não naturalmente é chamada de embaralhamento ou agregação. São divulgados neste documento diferentes métodos para identificar ligações dissulfeto. Também são divulgados neste documento métodos para a produção de medicamentos de proteína com menos de 30% de ligações dissulfeto embaralhadas A. Caracterização de ligações dissulfeto
[0033] A análise das ligações dissulfeto é importante para a avaliação do controle de qualidade dos mAbs. Em uma modalidade, as ligações dissulfeto estão na região de dobradiça. Os métodos tradicionais para a análise do padrão de ligação dissulfeto da região de dobradiça do mAb envolvem proteólise, fracionamento e análise de degradação de Edman, que é demorada e trabalhosa. Além disso, os métodos tradicionais, como as técnicas baseadas em MS2 , não conseguem distinguir entre peptídeos de dobradiça cruzados e paralelos. A identificação de ligações dissulfeto embaralhadas é difícil por causa do número muito baixo de ligações dissulfeto embaralhadas que ocorrem. Os anticorpos com ligações dissulfeto embaralhadas na região de dobradiça podem ser menos estáveis e têm um potencial para induzir
11 / 25 imunogenicidade se administrados a um sujeito. São divulgadas neste documento composições e métodos de uso das mesmas para caracterizar ligações dissulfeto em proteínas, por exemplo, anticorpos monoclonais. Padrões de peptídeo com padrões de ligação dissulfeto nativa e embaralhada são fornecidos neste documento. Esses padrões de peptídeo podem ser usados em análise de espectrometria de massa para focar a análise em peptídeos que eluem com os padrões de peptídeo. Métodos de aplicação dos padrões de peptídeo divulgados para caracterização da ligação dissulfeto da região de dobradiça também são fornecidos.
1. Padrões de peptídeo para análise de padrão de ligação dissulfeto de mAb
[0034] Em uma modalidade, o padrão de peptídeo é formado por dois peptídeos covalentemente ligados entre si por uma ou mais ligações dissulfeto. As ligações dissulfeto embaralhadas ocorrem quando uma ligação dissulfeto se forma entre dois aminoácidos que não são diretamente opostos um ao outro. A Figura 7A mostra a ligação dissulfeto paralela natural. A Figura 7B mostra uma ligação dissulfeto cruzada exemplificativa também referida como uma ligação dissulfeto embaralhada. A Figura 1A mostra ligações dissulfeto paralelas, cruzadas e intracadeia. Em uma modalidade, os padrões de peptídeo podem ser usados para identificar a presença de ligações dissulfeto paralelas, cruzadas ou intracadeias em uma amostra de proteína, por exemplo ligações dissulfeto embaralhadas ou ligações dissulfeto nativas em um anticorpo, por exemplo, um anticorpo monoclonal. Em outra modalidade, os padrões de peptídeo podem detectar ligações dissulfeto intracadeia em uma proteína ou peptídeo. Detalhes adicionais para preparar e usar os peptídeos de ligação dissulfeto divulgados são fornecidos a seguir. i. Síntese
[0035] Uma modalidade fornece um método para sintetizar padrões de peptídeos de ligação dissulfeto. Os padrões de peptídeos podem ser
12 / 25 sintetizados usando técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, síntese em fase líquida, síntese de peptídeos em fase sólida e tecnologia recombinante (Stawikowski, M., and Fields, G.B., Current Protoc Protein Sci, Capítulo: Unidade 18.1 (2002)).
[0036] Os padrões de peptídeo podem incluir fragmentos da proteína contendo as ligações dissulfeto a serem analisadas. A proteína pode ser fragmentada ou seções da proteína contendo as ligações dissulfeto a serem analisadas podem ser sintetizadas e usadas para produzir padrões de peptídeos de ligação dissulfeto. Em algumas modalidades, a sequência de padrão de peptídeo tem 100% de identidade de sequência com a região da proteína ou medicamento de proteína de interesse que inclui a ligação dissulfeto. Em outras modalidades, a sequência de padrão de peptídeo tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a região da proteína ou medicamento de proteína de interesse que inclui a ligação dissulfeto. A sequência de padrão do peptídeo pode ter 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a região da proteína ou medicamento de proteína de interesse que inclui a ligação dissulfeto. Em outras modalidades, a sequência de padrão de peptídeo representa apenas uma porção da região que inclui a ligação dissulfeto. Os padrões de peptídeos têm tipicamente 5 a 20 aminoácidos de comprimento.
[0037] A formação de ligações dissulfeto nos padrões de peptídeo pode ser induzida através da oxidação de resíduos de cisteína no padrão de peptídeo. Os métodos de formação de ligações dissulfeto na cisteína incluem, mas não estão limitados a, oxidação ao ar, oxidação química e exposição do peptídeo a cobre (Cu2+) ou zinco. A oxidação no ar ocorre pela mistura de peptídeos contendo tiol e cisteína em tampão aberto ao ar. Em outra modalidade, a formação de dissulfetos em um peptídeo pode ser realizada por troca de dissulfeto, por exemplo, usando 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoato) (DTNB ou Reagente de Ellman). Em uma modalidade, outros produtos químicos
13 / 25 comuns para induzir a oxidação de resíduos de cisteína são reagentes ativados, incluindo, mas não se limitando a, iodo, haletos de sulfenila, iodoacetamidas, maleimidas, haletos benzílicos e bromometilcetonas. Em outra modalidade, as ligações dissulfeto podem ser formadas expondo o peptídeo a cobre ou zinco. Isso pode ser alcançado usando um eletrodo de platina inerte ou um eletrodo sacrificial (cobre ou zinco) ou gerando íons metálicos em espectrometria de massa de ionização por eletroaspersão (ESI- MS). Em uma modalidade, a razão molar de peptídeo:Cu2+ necessária para induzir a formação de ligações dissulfeto é 5:1. A concentração de peptídeo mais alta pode induzir preferencialmente a formação de dímeros de dobradiça sobre a formação de ligações dissulfeto intracadeia.
[0038] Os padrões de peptídeo podem ser expostos a Cu2+ para induzir ligações dissulfeto paralelas ou cruzadas simples. Em uma modalidade, os padrões de peptídeo são oxidados por cerca de 1 hora a cerca de 6 horas. Em uma modalidade preferida, os padrões de peptídeos são oxidados por 2 horas. Em outra modalidade, os padrões de peptídeo podem ser oxidados por até 24 horas a fim de induzir duas ou mais ligações dissulfeto paralelas ou cruzadas. ii. Autenticação
[0039] Em uma modalidade, as características dos padrões de peptídeos sintetizados são determinadas. As características incluem o tempo de retenção e m/z de cada padrão de peptídeo. Os padrões de peptídeos sintetizados podem ser separados ou fracionados usando vários métodos de cromatografia. Os padrões de peptídeos contendo ligações dissulfeto paralelas são distinguíveis dos padrões de peptídeos contendo ligações dissulfeto cruzadas ou intracadeias.
[0040] Em uma modalidade, a análise da sequência N-terminal pode ser usada para confirmar a identidade dos padrões de peptídeo. A análise da sequência N-terminal envolve uma série de reações químicas que derivatizam e removem um aminoácido de cada vez do N-terminal de peptídeos
14 / 25 purificados ou proteínas intactas. A análise do N-terminal pode detectar ligações dissulfeto porque a reação para remover um aminoácido de cada vez do N-terminal não rompe as ligações entre os resíduos de cisteína na ligação dissulfeto.
[0041] Em outra modalidade, a degradação de Edman pode ser utilizada para sequenciar os padrões de peptídeo de ligação dissulfeto. A degradação de Edman é semelhante à análise N-terminal em que esta detecta a sequência de uma proteína ou peptídeo pela remoção de um aminoácido de cada vez do N-terminal da proteína ou peptídeo. No entanto, a primeira rodada de degradação de Edman é frequentemente contaminada por impurezas e, portanto, não fornece uma determinação precisa do aminoácido N-terminal. A degradação de Edman pode detectar ligações dissulfeto porque a reação para remover um aminoácido de cada vez do N-terminal não rompe as ligações entre os resíduos de cisteína na ligação dissulfeto. Em uma modalidade, a análise do N-terminal pode ser combinada com a degradação de Edman para dar uma sequência ordenada completa dos padrões de peptídeo de ligação dissulfeto sintetizados.
[0042] Outros métodos de sequenciamento de peptídeos são considerados. Estes incluem, mas não estão limitados a, análise de C-terminal e espectrometria de massa.
2. Métodos para caracterizar ligações dissulfeto na região de dobradiça
[0043] Uma modalidade fornece métodos para identificar e caracterizar ligações dissulfeto em um medicamento de proteína. Em outra modalidade, os métodos identificam e caracterizam ligações dissulfeto especificamente na região de dobradiça de um anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de IgG. Um método exemplificativo inclui a preparação de padrões de peptídeo de ligação dissulfeto embaralhada e padrões de peptídeo de ligação dissulfeto nativa de acordo com a sequência
15 / 25 do medicamento de proteína, clivagem de uma amostra de medicamento de proteína em peptídeos, análise de padrões de peptídeo e os peptídeos de medicamento de proteína, identificação de produtos embaralhados e ligações dissulfeto nativas em peptídeos comparando o tempo de retenção e quantificando o nível de peptídeos de ligação dissulfeto embaralhada. A detecção de peptídeos com o mesmo tempo de retenção ou m/z que o padrão de peptídeo indica que o tipo de ligação dissulfeto no padrão de peptídeo está presente no medicamento de proteína. i. Preparação da amostra de proteína
[0044] A proteína ou medicamento de proteína de interesse pode ser obtido, por exemplo, a partir de um biorreator contendo células geneticamente modificadas para produzir anticorpos monoclonais.
[0045] Em uma modalidade, a proteína ou medicamento de proteína de interesse é digerido nos peptídeos. Os métodos de digestão de proteínas são conhecidos na técnica. As proteínas podem ser digeridas por digestão enzimática com enzimas proteolíticas ou por digestão não enzimática com produtos químicos. Enzimas proteolíticas exemplificativas para digerir proteínas incluem, mas não estão limitadas a, tripsina, pepsina, quimotripsina, termolisina, papaína, pronase, Arg-C, Asp-N, Glu-C, Lys-C e Lys-N. Combinações de enzimas proteolíticas podem ser usadas para garantir a digestão completa. Produtos químicos exemplificativos para digerir proteínas incluem, mas não estão limitados a, ácido fórmico, ácido clorídrico, ácido acético, brometo de cianogênio, 2-nitro-5-tiocianobenzoato e hidroxialamina.
[0046] Em uma modalidade, o medicamento de proteína pode ser submetido a dupla digestão. Nesta modalidade, a primeira digestão pode ser realizada usando uma protease de ampla especificidade, tal como, mas não se limitando a, proteinase K, termolisina, substilisina, papaína, quimiotripsina ou elastase. A segunda digestão pode ser realizada com tripsina. Em uma modalidade, a enzima FabRICATOR® é usada para digerir a proteína ou
16 / 25 medicamento de proteína. A enzima FabRICATOR® digere anticorpos em um local específico abaixo da dobradiça, gerando, portanto, fragmentos F(ab')2 e Fc/2. A digestão por FabRICATOR® pode ser combinada com a digestão tríptica. ii. Análise do padrão de ligação dissulfeto da região da dobradiça
[0047] A mistura de peptídeos digeridos da proteína ou medicamento de proteína pode ser analisada por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS ou LC-MS2) para determinar a massa dos peptídeos digeridos. Em uma modalidade, a mistura de peptídeos digeridos é separada por cromatografia líquida, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho.
[0048] A mistura de peptídeos pode então ser analisada usando espectrometria de massa. Os métodos de realização de espectrometria de massa são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo (Aeberssold, M., and Mann, M., Nature, 422:198-207 (2003)) Os tipos comumente utilizados de espectrometria de massa incluem, mas não estão limitados a espectrometria de massa em tandem (MS/MS), espectrometria de massa de ionização por eletroaspersão, cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) e dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI). Em outra modalidade, o monitoramento da reação selecionada (SRM) é realizado na mistura de peptídeos. No SRM, um íon de uma massa específica é selecionado no primeiro estágio de um espectrômetro de massa em tandem e um produto de fragmentação do íon precursor é selecionado no segundo espectrômetro de massa para detecção.
[0049] Em uma modalidade, os padrões de peptídeo de dobradiça também são analisados. Os padrões são usados para caracterizar a região de dobradiça do medicamento de proteína de interesse. Em uma modalidade, o tempo de retenção dos padrões de peptídeos de dobradiça conhecidos são comparados ao tempo de retenção da mistura de peptídeos do medicamento
17 / 25 de proteína de interesse. A detecção de peptídeos com o mesmo tempo de retenção ou m/z que o padrão de peptídeo indica que o tipo de ligação dissulfeto no padrão de peptídeo está presente no medicamento de proteína. B. Proteínas de interesse
[0050] Em uma modalidade, a proteína de interesse é um medicamento de proteína ou é uma proteína de interesse adequada para expressão em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, a proteína pode ser um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um ScFv ou fragmento do mesmo, uma proteína de fusão Fc ou fragmento da mesma, um fator de crescimento ou um fragmento do mesmo, uma citocina ou um fragmento da mesma, ou um domínio extracelular de um receptor de superfície celular ou um fragmento do mesmo. As proteínas nos complexos podem ser polipeptídeos simples consistindo em uma única subunidade, ou proteínas complexas com múltiplas subunidades compreendendo duas ou mais subunidades. A proteína de interesse pode ser um produto biofarmacêutico, aditivo ou conservante alimentar, ou qualquer produto proteico sujeito a purificação e padrões de qualidade
[0051] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é um anticorpo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, triacorpo ou tetracorpo, uma molécula de imunoglobulina G tetravalente específica dupla, denominada imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-IG), um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgG, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 ou um anticorpo IgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2. Em uma modalidade, o anticorpo é um
18 / 25 anticorpo IgG4. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região de dobradiça quimérica. Ainda em outras modalidades, o anticorpo compreende um Fc quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2/IgG4 quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2/IgG1 quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2/IgG1/IgG4 quimérico.
[0052] Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-morte celular programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD1 como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. n° US2015/0203579A1), um ligante de anti-morte celular programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1 como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. n° US2015/0203580A1), um anticorpo anti-Dll4, um anticorpo anti-Angiopoetina-2 (por exemplo, um anticorpo anti- ANG2 como descrito na Patente U.S. nº 9.402.898), um anticorpo 3 como anti-Angiopoetina (por exemplo, um anticorpo anti-AngPtl3 como descrito na Patente U.S. nº 9.018.356), um anticorpo receptor do fator de crescimento derivado de anti-plaquetas (por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR como descrito na Patente U.S. n° 9.265.827), um anticorpo anti-Erb3, um anticorpo receptor de anti-prolactina (por exemplo, anticorpo anti-PRLR como descrito na Patente U.S. n° 9.302.015), um anticorpo anti-Complemento 5 (por exemplo, um anticorpo anti-C5 como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. nº US2015/0313194A1), um anticorpo anti-TNF, um anticorpo receptor do fator de crescimento anti-epidérmico (por exemplo, um anticorpo anti-EGFR como descrito na Patente U.S. nº 9.132.192 ou um anticorpo anti- EGFRvIII como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. nº US2015/0259423A1), um anticorpo anti-Proproteína Convertase Subtilisina Kexin-9 (por exemplo, um anticorpo anti-PCSK9 como descrito na Patente U.S. nº 8.062.640 ou Patente U.S. nº 9.540.449), um anticorpo do fator de Anti-crescimento e Diferenciação 8 (por exemplo, um anticorpo anti-GDF8,
19 / 25 também conhecido como anticorpo anti-miostatina, conforme descrito nas patentes U.S. 8.871.209 ou 9.260.515), um receptor anti-glucagon (por exemplo anticorpo anti-GCGR conforme descrito na Publicação do Pedido de Patentes nº US2015/0337045A1 ou US2016/0075778A1), um anticorpo anti- VEGF, um anticorpo anti-IL1R, um anticorpo receptor de interleucina 4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL4R como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. nº US2014/0271681A1 ou Patentes U.S. nº 8.735.095 ou
8.945.559), um anticorpo do receptor de anti-interleucina 6 (por exemplo, um anticorpo anti-IL6R como descrito nas Patentes U.S. nº 7.582.298, 8.043.617 ou 9.173.880), um anticorpo anti-IL1, um anticorpo anti-IL2, um anticorpo anti-IL3, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL5, um anticorpo anti- IL6, um anticorpo anti-IL7, um anti-interleucina 33 (por exemplo, anticorpo anti-IL33 como descrito nas Patentes nº 9.453.072 ou 9.637.535), um anticorpo do anti-vírus sincicial Respiratório (por exemplo, anticorpo anti- RSV como descrito. na Publicação do Pedido de Patente U.S nº 9.447.173), um anti-Agrupamento de diferenciação 3 (por exemplo, um anticorpo anti- CD3, conforme descrito nas Patentes U.S. nº 9.447.173 e 9.447.173, e no Pedido U.S. nº 62/222.605), um anti-agrupamento de diferenciação 20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 como descrito nas Patentes U.S. nº
9.657.102 e US20150266966A1, e na Patente U.S. nº 7.879.984), um anticorpo anti-CD19, um anticorpo anti-CD28, um anti-agrupamento de diferenciação 48 (por exemplo, anticorpo anti-CD48 como descrito na Patente U.S. nº 9.228.014), um anticorpo anti-Fel d1 (por exemplo, como descrito na Patente U.S. nº 9.079.948), um anti-vírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (por exemplo, um anticorpo anti-MERS como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. nº US2015/0337029A1), um anticorpo anti-vírus Ebola (por exemplo, conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. nº US2016/0215040), um anticorpo anti-vírus da Zika, um anticorpo anti-Gene de Ativação de Linfócito 3 (por exemplo, um anticorpo
20 / 25 anti-LAG3, ou um anticorpo anti-CD223), um anticorpo anti-Fator de Crescimento Nervoso (por exemplo, um anticorpo anti-NGF conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. nº US2016/0017029 e Patente U.S. 8.309.088 e 9.353.176) e um anticorpo anti-Proteína Y. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 (conforme descrito na Publicação do Pedido de Patentes U.S. nº US2014/0088295A1 e US20150266966A1), um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Mucina 16 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Muc16) e um anticorpo biespecífico de antígeno de membrana específico da anti-CD3 x anti-próstata (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti- PSMA). Em algumas modalidades, a proteína de interesse é selecionada a partir do grupo que consiste em abciximabe, adalimumabe, adalimumabe-atto, ado-trastuzumabe, alemtuzumabe, alirocumabe, atezolizumabe, avelumabe, basiliximabe, belimumabe, benralizumabe, bevacizumabe, bezlotoxumabe, blinatumomabe, brentuximabe vedotina, brodalumabe, canaquinumabe, capromabe pendetida, certolizumabe pegol, cemiplimabe, cetuximabe, denosumabe, dinutuximabe, dupilumabe, durvalumabe, eculizumabe, elotuzumabe, emicizumabe-kxwh, emtansinealirocumabe, evinacumabe, evolocumabe, fasinumabe, golimumabe, guselcumabe, ibritumomabe tiuxetano, idarucizumabe, infliximabe, infliximabe-abda, infliximabe-dyyb, ipilimumabe, ixequizumabe, mepolizumabe, necitumumabe, nesvacumabe, nivolumabe, obiltoxaximabe, obinutuzumabe, ocrelizumabe, ofatumumabe, olaratumabe, omalizumabe, panitumumabe, pembrolizumabe, pertuzumabe, ramucirumabe, ranibizumabe, raxibacumabe, reslizumabe, rinucumabe, rituximabe, sarilumabe, secuquinumabe, siltuximabe, tocilizumabe, tocilizumabe, trastuzumabe, trevogrumabe, ustequinumabe e vedolizumabe.
[0053] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína recombinante que contém uma fração Fc e um outro domínio (por
21 / 25 exemplo, uma proteína de fusão Fc). Em algumas modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão Fc de receptor, que contém um ou mais domínios extracelulares de um receptor acoplado a uma fração Fc. Em algumas modalidades, a fração Fc compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma IgG. Em algumas modalidades, a proteína de fusão Fc do receptor contém duas ou mais cadeias de receptor distintas que se ligam a um único ligante ou a vários ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma proteína TRAP, tal como, por exemplo, uma IL-1 TRAP (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação do ligante IL-1RAcP fundida à região extracelular Il-1R1 fundida a Fc de hIgG1; consultar Patente U.S. nº 6.927.004, que está incorporada neste documento por referência na sua totalidade), ou um bloqueador de VEGF (por exemplo, aflibercept ou ziv-aflibercept, que compreende o domínio Ig 2 do receptor VEGF Flt1 fundido ao domínio Ig 3 do receptor VEGF Flk1 fundido a Fc de hIgG1; consultar Patente U.S. nº 7.087.411 e 7.279.159). Em outras modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão ScFv-Fc, que contém um ou mais de um ou mais domínios de ligação ao antígeno, como um fragmento de cadeia pesada variável e um fragmento de cadeia leve variável, de um anticorpo acoplado a uma fração Fc. C. Produção de mAb com padrão de ligação dissulfeto nativa
[0054] Uma modalidade fornece métodos de produção de um medicamento de proteína contendo menos de 30% de ligações dissulfeto embaralhadas. Um método exemplificativo inclui a cultura de células que produzem o anticorpo em uma cultura de células sob condições adequadas para produzir o anticorpo, purificação do anticorpo sob condições adequadas para extrair o anticorpo, mistura do anticorpo com excipientes sob condições adequadas para estabilizar o anticorpo, obtenção de uma amostra do anticorpo da cultura de células, após a purificação do anticorpo da cultura de células, ou após a adição de excipientes ao anticorpo purificado, caracterização das
22 / 25 ligações dissulfeto do anticorpo de acordo com os métodos divulgados e modificação de uma ou mais condições de culturas de células, purificação ou excipiente para reduzir a quantidade de ligações dissulfeto de dobradiça cruzada do anticorpo.
[0055] Uma ou mais condições de cultura de células, purificação ou excipiente que são alteradas para reduzir a quantidade de ligações dissulfeto embaralhadas no anticorpo incluem, mas não estão limitadas a, temperatura, pH, níveis de oxigênio, espécies reativas de oxigênio, tensoativos ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, uma estratégia livre de aminoácidos de cultura de células pode afetar a formação da ligação dissulfeto.
[0056] Em uma modalidade, as células que produzem o anticorpo são células de ovário de hamster chinês. Em outra modalidade, as células são células de hibridoma.
[0057] Em uma modalidade, o medicamento de proteína pode ter menos de 30% de ligações dissulfeto embaralhadas na região de dobradiça. O medicamento de proteína pode ter menos de 30%, 25%, 20%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 1%, 0,5% ou 0,1% de ligações dissulfeto embaralhadas na região de dobradiça.
[0058] Em outra modalidade, o medicamento de proteína pode ter menos de 10% de ligações dissulfeto embaralhadas em geral. O medicamento de proteína pode ter menos de 10%, 9,5%, 9%, 8,5%, 8%, 7,5%, 7%, 6,5%, 6%, 5,5%, 5%, 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,5% ou 0,1% de ligações dissulfeto embaralhadas.
EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese de peptídeos de dobradiça paralela e cruzada Métodos : Reticulação
[0059] Os peptídeos contendo cisteína foram adquiridos de um
23 / 25 fornecedor comercial. Os peptídeos foram reticulados por incubação com Cu2+ 1 mM como oxidante na presença de ar. A razão molar de peptídeo para Cu2+ foi de 5:1. Análise de N-terminal/Degradação de Edman
[0060] Os peptídeos reticulados foram suspensos em água e colocados em um sequenciador de proteínas. Os peptídeos foram expostos a isotiocianato de fenila (PITC). O PITC se acopla ao resíduo de N-terminal para formar um polipeptídeo PTC. Ácido trifluoroacético foi adicionado à reação e o resíduo de N-terminal do PTC sofreu clivagem ácida, resultando na liberação de um ATZ-aminoácido instável. O ATZ-aminoácido foi separado da solução de peptídeo em um frasco de conversão contendo acetato de etila. O ATZ-aminoácido foi convertido em um PTH-aminoácido estável com 25% de TFA, v/v em água. A solução de PTH-aminoácido foi injetada em um HPLC. Cada aminoácido do peptídeo é identificado por HPLC. Resultados
[0061] Foi relatado que Cu2+ induz a formação de ligações dissulfeto por meio da produção de radicais (Prudent, M. e Girault, H.H., Metallomics, 1:157-165 (2009)). Os peptídeos expostos a Cu2+ a uma razão molar de peptídeo/Cu2+ de 5/1 formaram ligações dissulfeto, conforme ilustrado na Figura 1A. A primeira oxidação formou uma única ligação não seletiva que foi de natureza paralela ou cruzada (Figuras 1A e 1C). Durante a formação da segunda ligação dissulfeto, a conectividade paralela foi considerada a conexão preferida (Figura 1B). A concentração do peptídeo afetou o tipo de ligação dissulfeto que se formou. Uma concentração mais elevada de peptídeo, 8 µg/ml, induziu a formação de mais dímeros de dobradiça paralelos do que uma concentração de 0,1 µg/ml (Figuras 2A-2B). Concentrações mais altas de peptídeos favorecem as pontes intermoleculares.
[0062] A identidade dos peptídeos foi confirmada usando análise de N-terminal e degradação de Edman (Figuras 3A-3I, Figuras 4A-4I e Figuras
24 / 25 5A-5B). Exemplo 2: Uma análise da região de dobradiça de dois mAbs Métodos Caracterização DSB da dobradiça
[0063] Os anticorpos foram primeiro digeridos em peptídeos. Os anticorpos IgG1 foram submetidos à digestão enzimática dupla usando proteinase K seguida de tripsina. Os anticorpos IgG4 foram submetidos à digestão por FabRICATOR seguido por tripsina. Os padrões de peptídeo de dobradiça foram preparados como anteriormente, usando a sequência da região de dobradiça dos anticorpos IgG1 e IgG4 para preparar os peptídeos. As misturas de peptídeos digeridas foram submetidas à análise LC-MS. Os padrões de peptídeo de dobradiça também foram submetidos à análise de LC- MA. A análise do tempo de retenção foi realizada para comparar o tempo de retenção dos peptídeos de anticorpo com o tempo de retenção dos padrões de peptídeo de dobradiça. Resultados
[0064] O mAb1 de IgG1 foi submetido a digestão em peptídeos e os peptídeos resultantes foram submetidos a análise de LC/MS. Os padrões de peptídeo de dobradiça descritos anteriormente também foram submetidos à análise de LC/MS. Como mostrado nas Figuras 6A-6C, o mAb1 de IgG1 tem cerca de 0,9% de ligações dissulfeto de dobradiça cruzadas.
[0065] Um segundo anticorpo, IgG4 mAb1, também foi analisado usando os métodos divulgados e padrões de peptídeo de ligação dissulfeto de dobradiça. Como mostrado nas Figuras 7A-7C, o mAb1 de IgG4 tinha cerca de 0,6% de ligações dissulfeto de dobradiça cruzadas.
[0066] Embora no relatório descritivo anterior esta invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades do mesmo, e muitos detalhes tenham sido apresentados para fins de ilustração, será evidente para os versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e
25 / 25 que alguns dos detalhes descritos neste documento podem ser consideravelmente variados sem se afastar dos princípios básicos da invenção.
[0067] Todas as referências citadas neste documento estão incorporadas por referência em sua totalidade. A presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem fugir do espírito ou seus atributos essenciais e, consequentemente, deve-se fazer referência às reivindicações anexas, em vez de à especificação anterior, como indicando o escopo da invenção.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para identificar ligações dissulfeto embaralhadas em um medicamento de proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: preparar padrões de peptídeo compreendendo regiões do medicamento de proteína contendo uma ou mais ligações dissulfeto, em que um primeiro padrão de peptídeo compreende uma primeira ligação dissulfeto embaralhada e um segundo padrão compreende uma segunda e diferente ligação dissulfeto embaralhada, e em que o primeiro e o segundo padrões de peptídeo têm diferentes tempos de retenção de cromatografia líquida conhecidos; digerir uma amostra de medicamento de proteína em peptídeos, analisar uma amostra contendo os peptídeos de medicamento de proteína e os padrões de peptídeo usando um sistema LC-MS2, em que os peptídeos detectados no tempo de retenção do primeiro padrão indicam que a presença de ligação dissulfeto embaralhada do primeiro padrão de peptídeo está presente no medicamento de proteína, e os peptídeos detectados no tempo de retenção do segundo peptídeo padrão, o tempo de retenção indica que as ligações dissulfeto embaralhadas do segundo peptídeo padrão estão presentes no medicamento de proteína.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ligações dissulfeto embaralhadas são selecionadas do grupo que consiste em ligações dissulfeto cruzadas, ligações dissulfeto cruzadas e ligações dissulfeto intracadeia.
3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o método inclui padrão de peptídeo contendo uma ligação dissulfeto paralela.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a indução da reação de oxidação compreende oxidação com Cu2+.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a razão molar de peptídeo:Cu2+ para a formação de ligações dissulfeto é 5:1.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a digestão da amostra compreende digestão tríptica ou digestão de enzima dupla.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento de proteína compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma proteína recombinante, uma proteína de fusão ou uma combinação dos mesmos.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a ligação dissulfeto está na região de dobradiça de um anticorpo.
9. Método de produção de um medicamento de proteína, caracterizado pelo fato de que compreende: produzir o medicamento de proteína em uma cultura de células; identificar ligações dissulfeto embaralhadas do medicamento de proteína de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e modificar uma ou mais condições de cultura de células, purificação ou excipiente para reduzir a quantidade de ligações dissulfeto de dobradiça cruzada do medicamento de proteína para menos de 1,0%.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que uma ou mais condições de cultura de células, purificação ou excipiente que são modificadas são selecionadas do grupo que consiste em temperatura, pH, níveis de oxigênio, espécies reativas de oxigênio, surfactantes ou combinações dos mesmos.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, caracterizado pelo fato de que o medicamento de proteína é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína de fusão, proteína recombinante ou uma combinação dos mesmos.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpos monoclonais com menos de 30% de ligações dissulfeto embaralhadas.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que as ligações dissulfeto estão na região de dobradiça do anticorpo.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020150491A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds
JP2024503996A (ja) * 2020-12-20 2024-01-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 生体分子中のスクランブルジスルフィドを同定するための方法
US20240060988A1 (en) * 2021-02-25 2024-02-22 Dr. Reddy’S Laboratories Limited Thiol variants and analytical methods thereof
CN113189254B (zh) * 2021-05-08 2021-11-16 北京工商大学 一种基于白酒中挥发性硫醇化合物的测定方法

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
JP3727317B2 (ja) 2002-03-08 2005-12-14 エイエスエムエル ネザランドズ ベスローテン フエンノートシャップ リソグラフィに使用するためのマスク、マスクを作成する方法、リソグラフィ装置、およびデバイス製造方法
MY159787A (en) 2006-06-02 2017-01-31 Regeneron Pharma High affinity antibodies to human il-6 receptor
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
ES2527297T3 (es) 2007-07-31 2015-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanos para CD20 humano y método para utilizar los mismos
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
EP2579897A1 (en) * 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JOP20190250A1 (ar) 2010-07-14 2017-06-16 Regeneron Pharma صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب
AR083044A1 (es) 2010-09-27 2013-01-30 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos
SG189220A1 (en) 2010-10-06 2013-05-31 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (il-4r) antibodies
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
US20130259806A1 (en) * 2010-12-09 2013-10-03 David Light Dimeric molecular complexes with free cysteine residues and conjugates thereof
JO3412B1 (ar) 2011-06-17 2019-10-20 Regeneron Pharma أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها
US8871209B2 (en) 2011-11-14 2014-10-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing GDF8 and or Activin A
AU2013212587B2 (en) 2012-01-23 2017-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-Ang2 antibodies
MY171729A (en) 2012-03-27 2019-10-25 Genentech Inc Improved harvest operations for recombinant proteins
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
US9835629B2 (en) 2012-05-18 2017-12-05 Pierce Biotechnology, Inc. Methods and reagents for biomolecule labeling, enrichment and gentle elution
TWI641619B (zh) 2012-06-25 2018-11-21 美商再生元醫藥公司 抗-egfr抗體及其用途
MX363213B (es) 2012-08-13 2019-03-15 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-pcsk9 con características de unión dependientes del ph.
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒f蛋白質的人類抗體及其使用方法
MX364591B (es) 2013-03-15 2019-05-02 Regeneron Pharma Antagonistas de il-33 y usos de estos.
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗-prlr抗體及其用途
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對pd-1的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗pd-l1之人類抗體
CN106459199B (zh) 2014-03-11 2021-01-01 瑞泽恩制药公司 抗-egfrviii抗体及其用途
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
MX2016014504A (es) 2014-05-05 2017-05-23 Regeneron Pharma Animales c5 y c3 humanizados.
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
US10690676B2 (en) 2014-07-29 2020-06-23 Mayo Roundation for Medical Education and Research Quantifying monoclonal antibody therapeutics by LC-MS/MS
AU2015317899A1 (en) 2014-09-16 2017-04-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glucagon antibodies and uses thereof
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
CN108627647B (zh) * 2017-03-24 2020-06-19 四川大学 一种翻译后修饰蛋白质组学的检测和定量方法
CN109142561A (zh) * 2018-07-17 2019-01-04 上海师范大学 同时定量蛋白质丰度与半胱氨酸氧化水平的方法及其应用
WO2020150491A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing disulfide bonds

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