ES2925563T3 - Anticuerpos anti-MUC16 (Mucina 16) - Google Patents

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Jessica R Kirshner
Sandra Coetzee
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Abstract

La mucina 16 (MUC16) se expresa en gran medida en el cáncer de ovario y se ha demostrado que la expresión en las células cancerosas protege a las células tumorales del sistema inmunitario. La presente invención proporciona nuevos anticuerpos IgG humanos de longitud completa que se unen a humanos y MUC16 (anticuerpos monoespecíficos). La presente invención también proporciona nuevos anticuerpos biespecíficos (bsAbs) que se unen tanto a MUC16 como a CD3 y activan las células T a través del complejo CD3 en presencia de tumores que expresan MUC16. De acuerdo con ciertas realizaciones, la presente invención proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humana y de mono, y una segunda molécula de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 humana y de mono. En ciertas realizaciones, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente invención son capaces de inhibir el crecimiento de tumores que expresan MUC16. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la invención son útiles para el tratamiento de enfermedades y trastornos en los que se desea y/o es terapéuticamente beneficiosa una respuesta inmunitaria dirigida a MUC16 regulada al alza o inducida. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos de la invención son útiles para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, incluido el cáncer de ovario. La presente invención también incluye conjugados de fármaco de anticuerpo anti-MUC16 que inhiben el crecimiento tumoral in vivo. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-MUC16 son útiles en métodos de diagnóstico para identificar la presencia de MUC16 en muestras de tejido y/o plasma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-MUC16 (Mucina 16)
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son específicos de la mucina 16 (MUC16), y a métodos de uso de los mismos.
Antecedentes
La mucina 16 (MUC16), también conocida como antígeno de cáncer 125, antígeno de carcinoma 125, antígeno carbohidrato 125 o CA-125, es una glucoproteína de membrana integral muy glucosilada de un solo dominio transmembrana que se expresa en gran medida en el cáncer de ovario. MUC16 consiste en tres dominios principales: un dominio N-terminal extracelular, un gran dominio repetido en tándem intercalado con esperma de erizo de mar, dominios enterocinasa y agrina (SEA), y un dominio carboxilo terminal que comprende un segmento de la región transmembrana y una cola citoplasmática corta. La escisión proteolítica produce el desprendimiento de gran parte de la parte extracelular de MUC16 en el torrente sanguíneo. La MUC16 se sobreexpresa en cánceres, incluido el cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma intrahepático de tipo formador de masa, adenocarcinoma del cuello uterino y adenocarcinoma del tubo gástrico, y en enfermedades y afecciones que incluyen la enfermedad inflamatoria intestinal, cirrosis hepática, insuficiencia cardíaca, infección peritoneal y cirugía abdominal. (Haridas, D. et al., 2014, FASEB J., 28:4183-4199). Se ha demostrado que la expresión en células cancerosas protege a las células tumorales del sistema inmunitario. (Felder, M. et al., 2014, Molecular Cáncer, 13:129) "Methods for treating ovarian cancer using antibodies to MUC16 have been investigated". Oregovomab y abgovomab son anticuerpos anti-MUC16 que han tenido un éxito limitado. (Felder, citado anteriormente, Das, S. y Batra, S. K. 2015, Cancer Res. 75:4660-4674.)
CD3 es un antígeno homodimérico o heterodimérico expresado en los linfocitos T en asociación con el complejo receptor de linfocitos T (TCR, T Cell Receptor) y es necesario para la activación de los linfocitos T. El CD3 funcional se forma a partir de la asociación dimérica de dos de cuatro cadenas diferentes: £, Z, 6 y Y. Las disposiciones diméricas de CD3 incluyen y/£, 6/e y Z/Z. Los anticuerpos contra CD3 han mostrado agrupar CD3 sobre los linfocitos T, produciendo, por tanto, la activación de los linfocitos T de una manera similar a la participación de los TCR por las moléculas MHC cargadas de péptidos. Por tanto, se han propuesto anticuerpos anti-CD3 con fines terapéuticos que implican la activación de linfocitos T. Adicionalmente, se han propuesto anticuerpos biespecíficos con capacidad de unión a CD3 y un antígeno diana para usos terapéuticos que implican el direccionamiento de las respuestas inmunitarias de los linfocitos T a tejidos y células que expresan el antígeno diana.
Las moléculas de unión a antígeno que se dirigen a MUC16, incluidos los conjugados de anticuerpo-fármaco, así como las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen tanto a MUC16 como a CD3, serían útiles en entornos terapéuticos en los que se desee un direccionamiento específico y la destrucción mediada por linfocitos T de células que expresan MUC16. En el documento WO2016/149368, se divulga un ejemplo de anticuerpos anti-MUC16.
Breve sumario de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas, y se refiere a anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a MUC16 humana. También se refiere a un método para detectar MUC16 en una muestra biológica mediante el anticuerpo de la invención.
Sumario de las enseñanzas técnicas
La información técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la presente divulgación en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la presente invención. Por ejemplo, la presente divulgación analiza diferentes anticuerpos biespecíficos. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de la invención reivindicada.
Los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos de la presente divulgación se enumeran en las tablas 1 y 2 del presente documento. La Tabla 1 expone los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (HCVR, Heavy Chain Variable Regions) y las regiones variables de cadena ligera (LCVR, Light Chain Variable Regions), así como regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3 [Heavy hain Complementarity Determining Regions]), y regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3 [Light chain Complementarity Determining Regions]) de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos. La Tabla 2 expone los identificadores de secuencia de las moléculas de ácido nucleico que codifican las HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 28, 30 y 32, respectivamente, como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR y LCDR (HCDR/LCDR) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR enumeradas en la Tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR enumeradas en la Tabla 1. De acuerdo con determinados ejemplos, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos enumerados en la Tabla 1. En determinados ejemplos, el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR es de SEQ ID NO: 18/26 (por ejemplo, H1H8767P).
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3 y LCDR3 (HCDR3/LCDR3) que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1 junto con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1. De acuerdo con determinados ejemplos, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 contenidas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos enumerados en la tabla 1. En determinados ejemplos, el par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 es de SEQ ID NO: 24/32 (por ejemplo, H1H8767P).
La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas en cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos enumerados en la tabla 1. En determinados ejemplos, el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32 (por ejemplo, H1H8767P).
En un ejemplo relacionado, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas dentro de un par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR como se define mediante cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos enumerados en la tabla 1. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprende el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenido dentro de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 18/26 (por ejemplo, H1H8767P). Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AcM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AcM es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-MUC16 o partes de los mismos. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma. Sin embargo, los ácidos nucleicos no forman parte de la invención reivindicada.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR1 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR2 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de HCDR3 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR1 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR2 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCDR3 enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, en donde la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos enumerados en la tabla 1.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, en donde la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3), en donde el conjunto de secuencias de aminoácidos de LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos enumerados en la tabla 1.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. En determinados ejemplos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma. En determinados ejemplos de acuerdo con este aspecto de la divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR y LCVR, en donde la HCVR y la LCVR proceden las dos del mismo anticuerpo anti-MUC16 enumerado en la tabla 1.
La presente divulgación también proporciona vectores de expresión recombinante capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-MUC16. Por ejemplo, la presente divulgación incluye vectores de expresión recombinante que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se exponen en la Tabla 1. Dentro del alcance de la presente divulgación también se incluyen células hospedadoras en donde se han introducido dichos vectores, así como métodos para producir los anticuerpos o partes de los mismos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo así producidos. Sin embargo, los vectores de expresión no forman parte de la invención reivindicada.
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-MUC16 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunos ejemplos, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación no deseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras solicitudes, se puede modificar la galactosilación para modificar la Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC).
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo que se une específicamente a MUC16 y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la divulgación presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-MUC16 y un segundo agente terapéutico. En un ejemplo, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine de forma ventajosa con un anticuerpo anti-MUC16. En cualquier parte del presente documento se describen terapias de combinación y coformulaciones adicionales que implican los anticuerpos anti-MUC16 de la presente divulgación.
En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos terapéuticos para atacar/eliminar células tumorales que expresan MUC16 mediante un anticuerpo anti-MUC16 de la divulgación, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-MUC16 de la divulgación a un sujeto que lo necesita. En algunos casos, los anticuerpos anti-MUC16 (o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos) se pueden utilizar para tratar el cáncer (por ejemplo, cáncer de ovario) o pueden modificarse para que sean más citotóxicos mediante métodos, que incluyen, pero sin limitación, dominios Fc modificados para aumentar la CCDA (véase, por ejemplo, Shield et al. (2002) JBC 277:26733), radioinmunoterapia, conjugados de anticuerpo-fármaco u otros métodos para aumentar la eficacia de la ablación tumoral. Sin embargo, los métodos terapéuticos no forman parte de la invención reivindicada.
La presente divulgación también incluye el uso de un anticuerpo anti-MUC16 de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno (por ejemplo, cáncer) relacionado o provocado por células que expresan MUC16. En un aspecto, la divulgación se refiere a un compuesto que comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno, o un anticuerpo biespecífico MUC16xCD3, como se divulga en el presente documento, para su uso en medicina. En un aspecto, la divulgación se refiere a un compuesto que comprende un conjugado de anticuerpo-fármaco (CAF) como se describe en el presente documento, para su uso en medicina.
En otro aspecto más, la divulgación proporciona anticuerpos anti-MUC16 monoespecíficos para aplicaciones de diagnóstico, tal como, por ejemplo, reactivos de formación de imágenes.
En otro aspecto más, la divulgación proporciona métodos terapéuticos para estimular la activación de linfocitos T mediante un anticuerpo anti-CD3 o una parte de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la mucina 16 (MUC16) humana con una constante de equilibrio de disociación de unión (Kd) inferior a aproximadamente 53 nM medida en un análisis de resonancia de plasmón superficial a 25 °C. En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a MUC16 humana con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 15 minutos, medida en un análisis de resonancia de plasmón superficial a 25 °C.
La divulgación proporciona además un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que compite por unirse a MUC16 humana con un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como las expuestas en la Tabla 1. En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que compite por la unión a MUC16 humana con un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10; 18/26; 34/42; 50/58, 66/74; 82/90; 98/106; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 178/186; 194/394; 202/210; 218/226, 234/242; 250/1936; 258/266; 274/1936; 282/290; 298/306; 314/322; 330/338; 346/354; 362/370; y 378/386. Sin embargo, solo un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
Por otra parte, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo en MUC16 humana que un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como las expuestas en la Tabla 1. En otro aspecto, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno se une al mismo epítopo de MUC16 humana que un anticuerpo de referencia que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10; 18/26; 34/42; 50/58, 66/74; 82/90; 98/106; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 178/186; 194/394; 202/210; 218/226, 234/242; 250/1936; 258/266; 274/1936; 282/290; 298/306; 314/322; 330/338; 346/354; 362/370; y 378/386. Sin embargo, solo un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
La divulgación proporciona además un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a MUC16 humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la Tabla 1; y las CDR de una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la Tabla 1. En otro aspecto, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende las CDR de cadena ligera y pesada de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en: 2/10; 18/26; 34/42; 50/58, 66/74; 82/90; 98/106; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 178/186; 194/394; 202/210; 218/226, 234/242; 250/1936; 258/266; 274/1936; 282/290; 298/306; 314/322; 330/338; 346/354; 362/370; y 378/386. En otro aspecto más, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende los dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54­ 56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 100-102-104-108-110-112; 116-118-120-124-126-128; 132-134­ 136-140-142-144; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 180-182-184-188-190-192; 196-198-200­ 396-398-400; 204-206-208-212-214-216; 220-222-224-228-230-232; 236-238-240-244-246-248; 252-254-256-1938­ 1940-1942; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-1938-1940-1942; 284-286-288-292-294-296; 300-302-304-308­ 310-312; 316-318-320-324-326-328; 332-334-336-340-342-344; 348-350-352-356-358-360; 364-366-368-372-374­ 376; y 380-382-384-388-390-392.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a MUC16 humana, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 202, 218, 234, 250, 258, 274, 282, 298, 314, 330, 346, 362 y 378; y (b) una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10; 26; 42; 58, 74; 90; 106; 122; 138; 154; 170; 186; 210; 226, 242; 266; 290; 306; 322; 338; 354; 370; 386; 1936 y 394. En un aspecto adicional, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2/10; 18/26; 34/42; 50/58, 66/74; 82/90; 98/106; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 178/186; 194/394; 202/210; 218/226, 234/242; 250/1936; 258/266; 274/1936; 282/290; 298/306; 314/322; 330/338; 346/354; 362/370; y 378/386. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 28, 30 y 32, como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
La divulgación proporciona además un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a MUC16 humana dentro de un epítopo que varía del resto 428 al resto 481 de SEQ ID NO: 1902. En algunos casos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno interactúa con los restos de aminoácidos 428-434, 429-434, 453-467, 459-467, 460-467 y/o 474-481 de SEQ ID NO: 1902. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno interactúa con los restos de aminoácidos 428-434, 429-434, 453-467, 459-467, 460-467 y 474-481 de SEQ ID NO: 1902. La divulgación proporciona además un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a MUC16 humana dentro de un epítopo que varía del resto 126 al resto 138 de SEQ ID NO: 1902. En algunos casos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno interactúa con los restos de aminoácidos 126-131, 127-131 y/o 132-138 de SEQ ID NO: 1902. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno interactúa con los restos de aminoácidos 126-131, 127-131 y 132-138 de SEQ ID NO: 1902. La divulgación proporciona además un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a MUC16 humana dentro de un epítopo que varía del resto 357 al resto 369 de SEQ ID NO: 1902. En algunos casos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno interactúa con los restos de aminoácidos 357-369, 358-366, 358­ 369 y/o 361-369 de SEQ ID NO: 1902. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno interactúa con los restos de aminoácidos 357-369, 358-366, 358-369 y 361-369 de SEQ ID NO: 1902. La divulgación proporciona además un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado que se une a MUC16 humana dentro de uno o más de los cinco dominios SEA próximos a la membrana de MUC 16 humana (SEQ ID NO: 1899). Los cinco dominios SEA próximos a la membrana corresponden a los restos 13791-14451 de SEQ ID NO: 1899. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une con una Kd inferior a aproximadamente 60 nM medida en un análisis de resonancia de plasmón superficial a 25 °C. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une dentro de los restos 14237 a 14290 de SEQ ID NO: 1899. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende CDR de un par de HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18/26. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une dentro de los restos 13935 a 13947 de SEQ ID NO: 1899. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende CDR de un par de HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 82/858. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une dentro de los restos 14165 a 14178 de SEQ ID NO: 1899. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende CDR de un par de HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 98/170. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado que se une dentro de los restos 14237 a 14290 de MUC 16 humana (SEQ ID NO: 1899) como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a uno o más de los dominios SeA de MUC16. En diferentes ejemplos, los anticuerpos anti-MUC16 o los fragmentos de unión a antígeno se unen a cualquiera o más de SEA1, SEA2, SEA3, SEA4, SEA5, SEA6, SEA7, SEA8, SEA9, SEA10, SEA11, SEA12, SEA13, SEA14, SEA15 o SEA16. En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA1 (restos 12074 a 12229 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA2 (restos 12230 a 12387 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA3 (restos 12388 a 12543 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA4 (restos 12544 a 12698 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA5 (restos 12699 a 12854 de SEQ iD NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA6 (restos 12855 a 13010 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA7 (restos 13011 a 13166 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA8 (restos 13167 a 13323 de SEQ ID n O: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA9 (restos 13324 a 13478 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA10 (restos 13479 a 13634 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA11 (restos 13635 a 13790 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA12 (restos 13791 a 13923 de SEQ ID n O: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA13 (restos 13924 a 14074 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA14 (restos 14075 a 14227 de SEQ ID NO: 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA15 (restos 14228 a 14320 de SEQ ID No : 1899). En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento se une dentro de SEA16 (restos 14321 a 14464 de SEQ ID NO: 1899). Solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado que se une dentro de uno o más de los cinco dominios SEA próximos a la membrana de MUC 16 humana (SEQ ID NO: 1899) como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
De acuerdo con otro aspecto, la presente divulgación proporciona conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un agente terapéutico (por ejemplo, un agente citotóxico). En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y el agente citotóxico se unen covalentemente a través de un enlazador, como se analiza en el presente documento. En diferentes ejemplos, el anticuerpo anti-MUC16 o el fragmento de unión a antígeno puede ser cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 o fragmentos descritos en el presente documento.
En algunos ejemplos, el agente citotóxico se selecciona entre una auristatina, un maitansinoide, una tubulisina, un derivado de tomaimicina o un derivado de dolastatina. En algunos casos, el agente citotóxico es una auristatina seleccionada entre MMAE o MMAF, o un maitansinoide seleccionado entre DM1 o DM4. En algunos ejemplos, el agente citotóxico es un maitansinoide que tiene la estructura de Fórmula (I) o Fórmula (II), como se analiza en el presente documento.
En algunos ejemplos, el agente citotóxico es un maitansinoide que tiene la estructura:
Figure imgf000008_0001
En algunos ejemplos, el agente citotóxico es un maitansinoide que tiene la estructura:
Figure imgf000008_0002
En algunos ejemplos, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento del mismo, y
Figure imgf000008_0003
en donde
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo.
En algunos ejemplos, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento del mismo, y
Figure imgf000009_0001
en donde
Figure imgf000009_0002
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo.
En algunos ejemplos, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento del mismo, y
Figure imgf000009_0003
en donde
Figure imgf000009_0004
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo.
En algunos ejemplos, el enlace entra en contacto con el anticuerpo o fragmento del mismo a través de un componente de azufre de un resto de cisteína.
En algunos ejemplos, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento del mismo, y
Figure imgf000009_0005
o
Figure imgf000010_0001
, o
una mezcla de los mismos,
en donde
Figure imgf000010_0002
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo.
En algunos ejemplos, el enlace entra en contacto con el anticuerpo o fragmento del mismo a través de un componente nitrogenado de un resto de lisina.
En cualquiera de los diferentes ejemplos de los conjugados de anticuerpo-fármaco analizados anteriormente o en el presente documento, el conjugado de anticuerpo-fármaco puede comprender de 1 a 4 agentes citotóxicos por anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo.
De acuerdo con un aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a MUC16 y CD3. En el presente documento, dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas también se denominan "moléculas biespecíficas anti-MUC16/anti-CD3", "moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16", o "Ac biespecíficos MUC16xCD3". La parte anti-MUC16 de la molécula biespecífica anti-MUC16/anti-CD3 es útil para dirigirse a células (por ejemplo, células tumorales) que expresen MUC16 (por ejemplo, tumores de ovario), y la parte anti-CD3 de la molécula biespecífica es útil para activar linfocitos T. La unión simultánea de MUC16 en una célula tumoral y CD3 en un linfocito T facilita la destrucción dirigida (lisis celular) de la célula tumoral diana por parte del linfocito T activado. Por tanto, las moléculas biespecíficas anti-MUC16/anti-CD3 de la divulgación son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento de enfermedades y trastornos relacionados o provocados por tumores que expresan MUC16 (por ejemplo, cánceres de ovario). Los anticuerpos biespecíficos son útiles, entre otras cosas, para dirigirse a linfocitos T que expresen CD3, y para estimular la activación celular, por ejemplo, en circunstancias en las que es beneficiosa o deseable la eliminación mediada por linfocitos T de las células que expresan MUC16. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede dirigir la activación de linfocitos T mediada por CD3 a células específicas que expresen MUC16, tales como las células del tumor de ovario.
Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16. La presente divulgación incluye moléculas biespecíficas anti-MUC16/anti-CD3 (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), en donde cada dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) emparejada con una región variable de cadena ligera (LCVR). En determinados ejemplos de la divulgación, el dominio de unión a antígeno anti-CD3 y el dominio de unión a antígeno anti-MUC16 comprenden cada uno diferentes HCVR distintas emparejadas con una LCVR común. Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 3 del presente documento, se construyeron anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3, en donde el primer dominio de unión a antígeno comprende una HCVR derivada de un anticuerpo anti-CD3 emparejado con una LCVR derivada de un anticuerpo anti-MUC16 (por ejemplo, la misma LCVR que está incluida en el dominio de unión a antígeno anti-MUC16); y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16, en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende un HCVR/LCVr derivado de un anticuerpo anti-MUC16. En otras palabras, en las moléculas ilustrativas divulgadas en el presente documento, el emparejamiento de una HCVR de un anticuerpo anti-CD3 con una LCVR de un anticuerpo anti-MUC16 crea un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 (pero no se une a MUC16). En dichos ejemplos, el primer y segundo dominio de unión a antígeno comprenden HCVR anti-CD3 y anti-MUC16 distintas, pero comparten una LCVR anti-MUC16 común. En otros ejemplos, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas comprenden distintas HCVR anti-CD3 y anti-MUC16, pero comparten una LCVR común. La secuencia de aminoácidos de esta LCVR se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 1890, y las secuencias de aminoácidos de las CDR correspondientes (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3) se muestran en SEQ ID NO: 1892, 1894 y 1896, respectivamente. Dichos ratones modificados genéticamente pueden usarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprendan dos cadenas pesadas diferentes que se asocien con una cadena ligera idéntica que comprenda un dominio variable procedente de uno de dos segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana diferentes. Como alternativa, las cadenas pesadas variables pueden emparejarse con una cadena ligera común y expresarse de forma recombinante en células hospedadoras. De este modo, los anticuerpos de la divulgación pueden comprender cadenas pesadas de inmunoglobulina asociadas a una única cadena ligera reordenada. En algunos ejemplos, la cadena ligera comprende un dominio variable derivado de un segmento del gen Vk1-39 humano o un segmento del gen Vk3-20. En otros ejemplos, la cadena ligera comprende un dominio variable derivado de un segmento del gen Vk1-39 humano reordenado con un segmento del gen Jk5 humano o Jk1 humano.
La presente divulgación proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVr , cualquiera de los pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena pesada, o cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena ligera como las expuestas en la publicación de EE. UU. 2014/0088295, publicada el 27 de marzo de 2014 y PCT/US2016/044732, presentada el 29 de julio de 2016.
Adicionalmente, la presente divulgación proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR como las expuestas en las Tablas 16, 18 y 22 del presente documento. El primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 también puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR como las expuestas en las Tablas 1, 16, 19 y 23 del presente documento. De acuerdo con determinados ejemplos, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de los pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como las expuestas en las Tablas 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento. La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena pesada como las expuestas en las Tablas 16, 18 y 22 del presente documento, y/o cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR1-CDR2-CDR3 de cadena ligera como las expuestas en las Tablas 1, 16, 19 y 23 del presente documento.
De acuerdo con determinados ejemplos, la presente divulgación proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las Tablas 16, 18 y 22 del presente documento o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las Tablas 1,6, 19 y 23 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) como las expuestas en las Tablas 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento.
La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las Tablas 16, 18 y 22 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las Tablas 1, 16, 19 y 23 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
En determinados ejemplos, el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 como las expuestas en las Tablas 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento.
La presente divulgación también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene un aminoácido como el expuesto en las Tablas 16, 18 y 22 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene un aminoácido como el expuesto en las Tablas 16, 18 y 22, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene un aminoácido como el expuesto en las Tablas 16, 18 y 22, o una secuencia sustancialmente similar del mismo que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las Tablas 1, 16, 19 y 23 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las Tablas 1, 16, 19 y 23 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia, y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos como la expuesta en las Tablas 1, 16, 19 y 23 del presente documento, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 ilustrativas, no limitantes de la divulgación incluyen un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tiene las secuencias de aminoácidos que se exponen en las Tablas 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento.
La presente divulgación proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la Tabla 16, Tabla 18 o Tabla 22, y regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos como la expuesta en la Tabla 1, Tabla 16, Tabla 19 o Tabla 23.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) de una región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 y 1866", y regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
La divulgación proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), en donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 y 1868; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 y 1870; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 y 1872; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende las CDR de cadena pesada y ligera de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1730/26, 1762/26, 1778/26, 1786/26 y 1866/26
En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente al CD3 humano comprende tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), y en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 humana comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3); en donde A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 y 1868; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1734, 1766, 1782, 1790 y 1870; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 y 1872; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32; y en donde A2-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; A2-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; A2-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 no limitantes de la divulgación incluyen un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 que comprende una cadena pesada que comprende regiones marco de dominio variable que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada entre FR1 (SEQ ID NO: 1903), FR2 (SEQ ID NO: 1904), FR3 (SEQ ID NO: 1905) y FR4 (SEQ ID NO: 1906).
En más ejemplos, las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 ilustrativas de la divulgación incluyen una molécula de unión a antígeno biespecífica en donde el primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano comprende una HCVR que comprende HCDR1-HCDR2-HCDR3 que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1907-1908-1909.
La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 202, 218, 234, 250, 258, 274, 282, 298, 314, 330, 346, 362 y 378, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10; 26; 42; 58, 74; 90; 106; 122; 138; 154; 170; 186; 210; 226, 242; 266; 290; 306; 322; 338; 354; 370; 386; 1936; y 394, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR (HCVR/Lc Vr ) seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:18/26.
La presente divulgación también proporciona moléculas biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 208, 224, 240, 256, 264, 280, 288, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 216, 232, 248, 272, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 392, 400, y 1942, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
En determinados ejemplos, el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 24/32.
La presente divulgación también proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 204, 220, 236, 252, 260, 276, 284, 300, 316, 332, 348, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 206, 222, 238, 254, 262, 278, 286, 302, 318, 334, 350, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 208, 224, 240, 256, 264, 280, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 396, 212, 228, 244, 396, 268, 396, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 1938 y 388, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 398, 214, 230, 246, 398, 270, 398, 294, 310, 326, 342, 358, 374, 1940 y 390, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia; ; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 400, 216, 232, 248, 400, 272, 400, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 1942 y 392, o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia.
Determinadas moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 ilustrativas, no limitantes de la divulgación incluyen un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 que comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 20-22-24-28-30-32.
En un ejemplo relacionado, la divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 en donde el segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 comprende los dominios CDR de cadena pesada y ligera contenidos en secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18/26.
En un ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-MUC16, que comprende un brazo de unión anti-MUC16 que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1959 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1960, y un brazo de unión anti-CD3 que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1961 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1960. En otro ejemplo, la divulgación proporciona un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-MUC16, que comprende un brazo de unión anti-MUC16 que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1959 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1960, y un brazo de unión anti-CD3 que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1962 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1960.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 humano y un segundo dominio de unión a antígeno que se une a MUC16 humana, en donde el segundo dominio de unión a antígeno se deriva del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos anti-MUC16 de la divulgación. En un aspecto adicional, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 humana.
La divulgación proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une a células humanas que expresan CD3 humano y células de macaco cangrejero que expresan CD3 de macaco cangrejero. En otro aspecto, la molécula de unión a antígeno biespecífica se une a células humanas que expresan MUC16 humana.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que inhibe el crecimiento tumoral en ratones inmunodeprimidos portadores de xenoinjertos de cáncer de ovario humano. La divulgación proporciona además una molécula de unión a antígeno biespecífica que suprime el crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunodeprimidos portadores de xenoinjertos de cáncer de ovario humano.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende i) un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una célula efectora con un valor de CE50 superior a aproximadamente 4 nM y ii) un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a una célula de tumor de ovario humano diana con un valor de CE50 inferior a 3 nM, en donde dicho valor de unión CE50 se mide en un análisis de unión FACS in vitro.
En un ejemplo, la molécula de unión a antígeno biespecífica puede incluir un segundo dominio de unión a antígeno que se una específicamente a la célula tumoral de ovario diana con un valor de CE50 inferior a aproximadamente 2 nM. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a cada CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero con valor de CE50 superior a aproximadamente 40 nM, superior a aproximadamente 100 nM, superior a aproximadamente 200 nM, superior a aproximadamente 300 nM, superior a aproximadamente 400 nM, superior a aproximadamente 500 nM o superior a aproximadamente 1 pM. En algunos casos, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a cada CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero con una unión o afinidad de unión débil o no medible.
En algunos ejemplos, la molécula de unión a antígeno induce la muerte de células tumorales mediada por linfocitos T con un valor de CE50 inferior a aproximadamente 31 pM, medido en un ensayo de destrucción de células tumorales in vitro mediado por linfocitos T, por ejemplo, donde las células tumorales son células OVCAR3.
En algunas aplicaciones, el primer dominio de unión a antígeno se une al CD3 humano con un valor de Kd superior a aproximadamente 11 nM, medido en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro. En algunos ejemplos, el primer dominio de unión a antígeno se une a cada CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero con un valor de Kd superior a aproximadamente 15 nM, superior a aproximadamente 30 nM, superior a aproximadamente 60 nM, superior a aproximadamente 120 nM, superior a aproximadamente 300 nM o superior a aproximadamente 500 nM medido en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial in vitro.
En determinados ejemplos, los anticuerpos anti-CD3 de la divulgación, los fragmentos de unión a antígeno y los anticuerpos biespecíficos de los mismos se prepararon mediante el reemplazo de los restos de aminoácidos de un precursor de una manera escalonada basándose en las diferencias entre la secuencia de la estirpe germinal y la secuencia del anticuerpo precursor.
En algunos ejemplos, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por unirse a MUC16 humana con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A2-LCDR1, A2-LCDR2 y A2-LCDR3), en donde A2-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20; A2-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; A2-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; A2-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; A2-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A2-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En algunos ejemplos, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por la unión a MUC16 humana con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26.
En algunos ejemplos, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3) y tres regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (A1-LCDR1, A1-LCDR2 y A1-LCDR3), A1-HCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 1732, 1764, 1780, 1788 y 1868; A1-HCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ iD NO: 1734, 1766, 1782, 1790 y 1870; A1-HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1736, 1768, 1784, 1792 y 1872; A1-LCDR1 comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 28; A1-LCDR2 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y A1-LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. En algunos ejemplos, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 y 1866, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En algunos ejemplos, la divulgación proporciona una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 humano con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1730, 1762, 1778, 1786 y 1866, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por la unión a MUC16 humana con una proteína de unión a antígeno de referencia que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno anti-MUC16 o una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-MUC16/anti-CD3 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La divulgación proporciona además un método para tratar un cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno anti-MUC16 o una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-MUC16/anti-CD3 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres que incluyen cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma intrahepático de tipo formador de masa, adenocarcinoma del cuello uterino y adenocarcinoma del tubo gástrico. En algunos casos, el cáncer es cáncer de ovario. Sin embargo, los métodos de tratamiento no forman parte de la invención reivindicada.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR o CDR de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 divulgadas en el presente documento, incluyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de polinucleótidos expuestas en las Tablas 2, 17, 20, 21, 23 y 25 del presente documento, así como moléculas de ácido nucleico que comprenden dos o más de las secuencias de polinucleótidos expuestas en las Tablas 2, 17, 20, 21,23 y 25 en cualquier combinación o disposición funcional de las mismas. Los vectores de expresión recombinantes portadores de los ácidos nucleicos de la divulgación y las células hospedadoras en donde se han introducido dichos vectores, también están incluidos en la divulgación, así como los métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos. Sin embargo, los ácidos nucleicos, los vectores, las células hospedadoras y los métodos para producir anticuerpos no forman parte de la invención reivindicada.
La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde cualquiera de los dominios de unión a antígeno mencionados anteriormente que se unen específicamente a CD3 se combinan, conectan o asocian con cualquiera de los dominios de unión a antígeno mencionados anteriormente que se unen específicamente a MUC16 para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une a CD3 y MUC16.
La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación no deseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras solicitudes, se puede modificar la galactosilación para modificar la Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC).
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 como se divulga en el presente documento y un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la divulgación presenta una composición que es una combinación de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 y un segundo agente terapéutico. En un ejemplo, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16. Los agentes ilustrativos que pueden combinarse ventajosamente con una molécula de unión a antígeno biespecífico anti-CD3/anti-MUC16 se analizan en detalle en otras partes del presente documento.
En otro aspecto más, la divulgación proporciona métodos terapéuticos para dirigirse a/destruir células tumorales que expresan MUC16 usando una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 de la divulgación, en donde los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 de la divulgación a un sujeto que lo necesite. Los métodos terapéuticos no forman parte de la invención reivindicada.
La presente divulgación también incluye el uso de una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno relacionado con o provocado por células que expresan MUC16.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para detectar MUC16 en una muestra biológica, que comprende: obtener una muestra biológica de un sujeto y detectar si MUC16 está presente en la muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y detectar la unión entre MUC16 y el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento de unión a antígeno. En algunos casos, la muestra biológica es una muestra de tejido o fluido seleccionada entre plasma, suero, ascitis, ovario, útero, cuello uterino, hígado, vejiga, páncreas, estómago, intestino delgado o grueso, vesícula biliar, mama, pulmón, riñón, glándulas salivales y lagrimales, o cualquier neoplasia maligna epitelioide de los mismos. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a MUC16 humana dentro de uno o más de cinco dominios SEA próximos a la membrana de MUC16 humana correspondientes a los restos 13791-14451 de SEQ ID NO: 1899. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a MUC16 humana dentro de los restos 13810­ 14451 de SEQ ID NO: 1899. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une a cualquiera o más de SEA1, SEA2, SEA3, SEA4, SEA5, SEA6, SEA7, SEA8, SEA9, SEA10, SEA11, SEA12, SEA13, SEA14, SEA15 o SEA16 de MUC16 humana. Sin embargo, un método para detectar MUC16 en una muestra biológica de acuerdo con la invención utiliza un anticuerpo de la invención, como se define en las reivindicaciones.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para detectar MUC16 en un paciente, que comprende: obtener una muestra de tejido del paciente; y detectar si MUC16 está presente en la muestra de tejido poniendo en contacto la muestra de tejido con un anticuerpo anti-MUC16 y detectando la unión entre MUC16 y el anticuerpo anti-MUC16. En algunos casos, el método comprende además diagnosticar al paciente con un cáncer cuando se detecta la presencia de MUC16 en la muestra de tejido. En un ejemplo, la muestra de tejido es tejido ovárico. En algunos casos, el anticuerpo anti-MUC16 es específico de un epítopo dentro de los restos 12783-13467 de SEQ ID NO: 1899. En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 comprende CDR de un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 202/210. En algunos casos, el anticuerpo anti-MUC16 es específico de un epítopo dentro de los restos 13810-14451 de SEQ ID NO: 1899. En un ejemplo, el anticuerpo anti-MUC16 comprende CDR de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 250/1936, 258/266, 314/322 y 1944/1952. Los métodos que comprenden la obtención de una muestra de un paciente no forman parte de la invención reivindicada.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para detectar MUC16 en un paciente, que comprende: obtener una muestra de plasma del paciente; y detectar si MUC16 está presente en la muestra de plasma poniendo en contacto la muestra de plasma con un anticuerpo anti-MUC16 que comprende CDR de un par HCVR/LCVR que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 202/210, y detectar la unión entre MUC16 y el anticuerpo anti-MUC16. En algunos casos, el método comprende además diagnosticar al paciente con un cáncer cuando se detecta la presencia de MUC16 en la muestra de plasma. En algunos ejemplos, el método comprende además administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo biespecífico anti-CD3xMUC16 al paciente diagnosticado. En algunos ejemplos, el método comprende además administrar una cantidad eficaz de un CAF que comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento del mismo que se une al antígeno y un agente citotóxico al paciente diagnosticado. Los métodos que comprenden la administración a un paciente. no forman parte de la invención reivindicada.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a MUC16, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende las CDR de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en s Eq ID NO: 202/210, 250/1936, 258/266, 314/322, 82/858, 98/170 y 1944/1952. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 204-206-208-212-214-216; 252-254-256-1938-1940-1942; 260-262-264-268-270­ 272; 316-318-320-324-326-328; 84-86-88-1892-1894-1896; 100-102-104-172-174-176; y 1946-1948-1950-1954­ 1956-1958. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/lCv R seleccionadas del grupo que consiste en 202/210, 250/1936, 258/266, 314/322, 82/858, 98/170 y 1944/1952.
Otros ejemplos se harán evidentes al revisar la descripción detallada que figura a continuación.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1, 2 y 3 ilustran los perfiles farmacocinéticos de anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x CD3 en ratones de tipo silvestre (Fig. 1), ratones CD3 humanizados (Fig. 2) o ratones MUC16 x CD3 humanizados (Fig. 3) .
La Figura 4 muestra los resultados del estudio 1 del modelo OVCAR-3 (radiancia promedio [p/s/cm2/sr] en el Día 6). Todos los grupos tenían una carga tumoral similar según lo evaluado por BLI antes de que comenzara la dosificación. Los datos que se muestran son la carga tumoral evaluada por BLI el Día 6 después de la implantación del tumor. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Mann-Whitney no paramétricas para datos independientes. No hubo diferencias significativas en la carga tumoral entre los grupos.
La Figura 5 muestra los resultados del estudio 1 del modelo OVCAR-3 (radiancia promedio [p/s/cm22/sr] en el Día 20). BSMUC16/CD3-001 reduce significativamente la carga tumoral a 0,1 y 0,5 mg/kg. A los ratones NSG injertados con linfocitos T humanos se les implantaron células OVCAR-3/Luc humanas. El tratamiento comenzó 6 días después de la implantación del tumor. Los ratones se trataron los Días 6, 10, 13, 16 y 21 con 0,01, 0,1 o 0,5 mg/kg de BSMUC16/CD3-001 administrados i.p. o tratados con un control de unión a CD3 o un control sin unión (0,5 mg/kg i.p.). Los datos que se muestran son la carga tumoral evaluada por BLI el Día 20 después de la implantación del tumor. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Mann-Whitney no paramétricas para datos independientes. Se comparó el tratamiento con BSMUC16/CD3-001 con el control sin unión (** p<0,01 para 0,5 mg/kg, # p<0,05 para 0,1 mg/kg de BSMUC16/CD3-001).
La Figura 6 muestra los resultados del estudio 1 del modelo OVCAR-3 (factor de cambio en tumores evidentes según BLI entre los D6 y D20). BSMUC16/CD3-001 reduce significativamente el factor de cambio en la carga tumoral a 0,01, 0,1 y 0,5 mg/kg. A los ratones NSG injertados con linfocitos T humanos se les implantaron células OVCAR-3/Luc humanas. Los ratones se trataron los Días 6, 10, 13, 16 y 21 con 0,01, 0,1 o 0,5 mg/kg de BSMUC16/CD3-001 administrados i.p. o se trataron con un control de unión a CD3 o un control sin unión (0,5 mg/kg i.p.). Los datos que se muestran son el factor de cambio en la carga tumoral desde la primera medición (tomada antes de que comenzara el tratamiento) y el Día 20 al final del estudio. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Mann-Whitney no paramétricas para datos independientes. Se comparó el tratamiento con BSMUC16/CD3-001 con el control sin unión (** p<0,01 para 0,5 mg/kg, # p<0,05 para 0,1 mg/kg, $ p<0,05 para 0,01 mg/kg de BSMUC16/CD3-001).
La Figura 7 muestra los resultados del estudio 2 del modelo OVCAR-3 (radiancia promedio [p/s/cm2/sr] en el Día 4) . Todos los grupos tenían una carga tumoral similar según lo evaluado por BLI antes de que comenzara la dosificación. Los datos que se muestran son la carga tumoral evaluada por BLI el Día 4 después de la implantación del tumor. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Mann-Whitney no paramétricas para datos independientes. No hubo diferencia significativa en la carga tumoral en el Día 4 entre los grupos.
La Figura 8 muestra los resultados del estudio 2 del modelo OVCAR-3 (radiancia promedio [p/s/cm22/sr] en el Día 25). BSMUC16/CD3-005 reduce significativamente la carga tumoral a 0,5, 1 y 5 mg/kg. A los ratones NSG injertados con linfocitos T humanos se les implantaron células OVCAR-3/Luc humanas. El tratamiento comenzó 5 días después de la implantación del tumor. Los ratones se trataron los Días 5, 8, 12, 15, 19 y 22 con 0,1, 0,5, 1 o 5 mg/kg de REGN4019 administrados por vía i.v. o recibieron un control de unión a CD3 o un control sin unión (5 mg/kg i.v.). Los datos que se muestran son la carga tumoral evaluada por BLI el Día 25 después de la implantación del tumor. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Mann-Whitney no paramétricas para datos independientes. Se comparó el tratamiento con BSMUC16/CD3-005 con el control sin unión (** p<0,01 para 5 mg/kg, ## p<0,01 para 1 mg/kg, $$ p<0,01 para 0,5 mg/kg de BSMUC16/CD3-005).
La Figura 9 muestra los resultados del estudio 2 del modelo OVCAR-3 (factor de cambio en tumores evidentes según BLI entre los D4 y D25). BSMUC16/CD3-005 reduce significativamente el crecimiento tumoral a 0,5, 1 y 5 mg/kg. A los ratones NSG injertados con linfocitos T humanos se les implantaron células OVCAR-3/Luc humanas. Los ratones se trataron los Días 5, 8, 12, 15, 19 y 22 con 0,1, 0,5, 1 o 5 mg/kg de REGN4019 administrados por vía i.v. o se trataron con un control de unión a CD3 o un control sin unión (5 mg/kg i.v.). Los datos que se muestran son el factor de cambio en la carga tumoral desde la primera medición (tomada el día antes de que comenzara el tratamiento) y el Día 25, al final del estudio. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Mann-Whitney no paramétricas para datos independientes. Se comparó el tratamiento con BSMUC16/CD3-005 con el control sin unión (** p<0,01 para 5 mg/kg, ## p<0,01 para 1 mg/kg, $$ p<0,01 para 0,5 mg/kg de REGN4019). La Figura 10 muestra los resultados del modelo ID8-VEGF/huMUC16. Tamaño del tumor en el Día 47 después de la implantación BSMUC16/CD3-001 reduce significativamente el crecimiento del tumor en un modelo singénico cuando el tratamiento comienza el día de la implantación o 10 días después de la implantación del tumor. A los ratones que expresaban CD3 humano en lugar de CD3 de ratón y una molécula de MUC16 quimérica se les implantó la estirpe tumoral de ovario murino que expresaba una parte de MUC16 humana. A los ratones se les administró BSMUC16/CD3-001 (100 pg i.p.) el día de la implantación o 10 días después de la implantación, o se les administró el control de unión a CD3 (100 pg i.p.) el día de la implantación. Los ratones se trataron los Días 0, 4, 7, 10, 13, 17, 20 o 24 para los grupos de tratamiento inmediato y los Días 10, 13, 17, 20 y 24 para el grupo en el que la dosificación comenzó el D10. Los datos que se muestran son el volumen tumoral el Día 47 después de la implantación. La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Mann-Whitney no paramétricas para datos independientes. Se comparó el tratamiento con BSMUC16/CD3-001 con el control de unión a CD3 (** p<0,01 a partir de D0, * p<0,05 a partir de D10).
Las Figuras 11A-11C ilustran los resultados del análisis de citometría de flujo (o FACS) de la unión de anticuerpos biespecíficos seleccionados a PEO-1, OVCAR3-Luc, células Jurkat y linfocitos T de macaco cangrejero. El análisis de valoración se realizó analizando un intervalo de diluciones en serie de cada anticuerpo: bien anticuerpos biespecíficos MUC16xCD3 BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-002 o BSMUC16/CD3-003, o un primer o un segundo anticuerpo de control de isotipo (sin reactividad cruzada con CD3 o MUC16).
Las Figuras 12A y 12B muestran ejemplos de destrucción de células PEO-1 (Fig. 12A) u OVCAR3-Luc (Fig. 12B) en un ensayo de citotoxicidad de 48 horas después del tratamiento anti-MUC16xanti-CD3 en presencia de PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells, células mononucleares de sangre periférica) humanas.
Descripción detallada
La información técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la divulgación, que se define de manera exclusiva por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la presente divulgación en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la presente divulgación.
Antes de describir la presente divulgación, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a métodos ni condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en el presente documento es para los fines de describir aspectos particulares únicamente y no pretende ser limitante, dado que el alcance de la presente invención solo estará limitado por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. Como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101, y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
Definiciones
La expresión "CD3", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un antígeno que se expresa en linfocitos T como parte del receptor multimolecular de linfocitos T (TCR) y que consiste en un homodímero o heterodímero formado a partir de la asociación de dos de las cuatro cadenas receptoras: CD3-£, CD3-8, CD3-Z y CD3-y. CD3-£ humano comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1897; CD3-8 humano comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1898. Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectiva a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana. Por tanto, la expresión "CD3" significa CD3 humano a menos que se especifique que proviene de una especie no humana, por ejemplo, "CD3 de ratón", "CD3 de mono", etc.
Como se utiliza en el presente documento, "un anticuerpo que se une a CD3" o un "anticuerpo dirigido contra CD3" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente una subunidad CD3 única (por ejemplo, £, 8, y o Z), así como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente un complejo dimérico de dos subunidades CD3 (por ejemplo, dímeros CD3 y/£, 5/e y z/Z). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación pueden unirse a CD3 soluble y/o CD3 expresado en la superficie celular. CD3 soluble incluye proteínas CD3 naturales, así como variantes de proteínas CD3 recombinantes como, por ejemplo, construcciones CD3 monoméricas y diméricas, que carecen de un dominio transmembrana o que no están asociadas con una membrana celular.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "CD3 expresado en la superficie celular" significa una o más proteínas CD3 que se expresan en la superficie de una célula in vitro o in vivo, de modo que al menos una parte de una proteína c D3 está expuesta al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una parte de unión a antígeno de un anticuerpo. "CD3 expresado en la superficie celular" incluye proteínas CD3 contenidas dentro del contexto de un receptor de linfocitos T funcional en la membrana de una célula. La expresión "CD3 expresado en la superficie celular" incluye la proteína CD3 expresada como parte de un homodímero o heterodímero en la superficie de una célula (por ejemplo, dímeros CD3 y/£, 8/£ y Z/Z). La expresión, "CD3 expresado en la superficie celular" también incluye una cadena de CD3 (p.ej., CD3-£, CD3-8 o CD3-y) que se expresa por sí misma, sin otros tipos de cadenas de CD3, en la superficie de una célula. Un "CD3 expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente expresa la proteína CD3. Como alternativa, "CD3 expresada en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína CD3 expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa CD3 humana en su superficie, pero que se ha manipulado de manera artificial para expresar CD3 en su superficie.
La expresión "MUC16", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la mucina 16. MUC16 es una glucoproteína de membrana integral muy glucosilada de un solo dominio transmembrana que se expresa a un nivel alto en el cáncer de ovario. La secuencia de aminoácidos de MUC16 humana se establece en SEQ iD NO:1899.
Como se utiliza en el presente documento, "un anticuerpo que se une a MUC16" o un "anticuerpo anti-MUC16" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen específicamente a MUC16.
La expresión "molécula de unión a antígeno" incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, incluidos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interacciona con un antígeno particular (por ejemplo, MUC16 o CD3). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, Framework Regions). Cada Vh y Vl comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes ejemplos de la divulgación, las FR del anticuerpo anti-MUC16 o anticuerpo anti-CD3 (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la estirpe germinal humana o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se utiliza en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas, mediante cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica los dominios variables y, opcionalmente, los constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bancos de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o delecionar aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo
(por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido
FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio delecionado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios
IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", tal como se utiliza en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que esté adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinados ejemplos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Configuraciones no limitantes, ilustrativas, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-C (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluida cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que producen una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Asimismo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante enlace/s disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos que se divulgan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación mediante técnicas habituales disponibles en la técnica.
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la divulgación en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (CCDA) se refiere a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la CCDA pueden medirse usando ensayos que se conocen bien y están disponibles en la técnica. (Véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 95:652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.
En determinados casos ilustrativos de la divulgación, los anticuerpos monoespecíficos anti-MUC16 o los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 de la divulgación son anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de estirpe germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de estirpe germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de c Dr procedentes de la estirpe germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Los anticuerpos de la divulgación pueden, en algunos ejemplos, ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un recombinante, biblioteca de anticuerpo humano combinatorio (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor etal. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de estirpe germinal humana. En determinados ejemplos, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes están sujetos a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de Vh y Vl de la estirpe germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la estirpe germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150­ 160 kDa en donde los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa que comprende una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de la purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diferentes isotipos de IgG inalterada se debe, pero sin limitación, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) hasta los niveles normalmente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente divulgación abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, la región Ch2 o Ch3, que puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Los anticuerpos de la divulgación pueden ser anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente divulgación. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinados ejemplos, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos. Solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado, como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de un anticuerpo de la invención reivindicada.
La presente divulgación también incluye anticuerpos de un brazo que se unen a MUC16. Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo de un brazo" significa una molécula de unión a antígeno que comprende una única cadena pesada de anticuerpo y una única cadena ligera de anticuerpo. Los anticuerpos de un brazo de la presente divulgación pueden comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se expone en la Tabla 1. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDr 3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 28, 30 y 32, respectivamente, como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
Los anticuerpos anti-MUC16 o anti-MUC16/anti-CD3 divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la estirpe germinal correspondientes de las que derivan los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento con secuencias de la estirpe germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la estirpe germinal de la que deriva el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la estirpe germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la estirpe germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la estirpe germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la estirpe germinal o combinaciones de las mismas. En determinados ejemplos, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl se retromutan a los restos encontrados en la secuencia de la estirpe germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros ejemplos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de estirpe germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros ejemplos, uno o más de entre el resto o los restos de la región marco conservada y/o de la CDR están mutados al resto o los restos correspondientes de una secuencia de la estirpe germinal diferente (es decir, una secuencia de la estirpe germinal diferente que es diferente de la secuencia de la estirpe germinal de la que derivó originariamente el anticuerpo). Por otra parte, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la estirpe germinal dentro de las regiones marco conservadas y/o las CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de estirpe germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la estirpe germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, aumento de la unión (por ejemplo, medido por valoración de unión celular o unión FACS) o afinidad de unión (por ejemplo, Kd), propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente divulgación. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 28, 30 y 32, respectivamente, como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-MUC16 o anti-MUC16/anti-CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las VHCR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-MUC16 o anti-MUC16/anti-CD3 que tienen HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR expuestas en la Tabla 1 del presente documento o como se describe en las Tablas 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 95 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados ejemplos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, incorporada en el presente documento por referencia. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, incorporada en el presente documento por referencia. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit, que pueden utilizarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402, cada uno incorporado por referencia en el presente documento.
Mutaciones de la estirpe germinal
Los anticuerpos anti-CD3 divulgados en el presente documento comprenden una o más sustituciones de aminoácidos, inserciones y/o deleciones en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada en comparación con las correspondientes secuencias de estirpe germinal de las que se derivaron los anticuerpos.
La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la estirpe germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la estirpe germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la estirpe germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la estirpe germinal") y tienen una unión débil o no detectable a un antígeno CD3. Varios de estos anticuerpos ilustrativos que reconocen c D3 se describen en las Tablas 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se define en las reivindicaciones y que se une a MUC 16 humana (SEQ ID NO: 1899) está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
Por otra parte, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la estirpe germinal dentro de las regiones marco conservadas y/o las CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de estirpe germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la estirpe germinal pueden probarse con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, unión o afinidad de unión débil o reducida, propiedades farmacocinéticas mejoradas o potenciadas, inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general dada la orientación de la presente divulgación están incluidos dentro de la presente divulgación.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-CD3 que comprenden variantes de cualquiera de las HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-CD3 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR expuestas en las Tablas 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento. Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación comprenden una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la estirpe germinal correspondientes de las que se derivaron los dominios de unión a antígeno individuales, mientras se mantiene o mejora la unión deseada débil a no detectable al antígeno CD3. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará de manera sustancial las propiedades funcionales de una proteína, es decir, la sustitución de aminoácidos mantiene o mejora la unión débil o no detectable deseada o la afinidad de unión en el caso de las moléculas de unión anti-CD3. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanintirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La presente divulgación también se refiere a moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno con una secuencia de aminoácidos de HCVR y/o CDR que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento, mientras se mantiene o mejora la afinidad débil deseada por el antígeno CD3. La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit, que pueden utilizarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
Una vez obtenidos, se probaron dominios de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la estirpe germinal para determinar la unión o afinidad de unión disminuida utilizando una o más ensayos in vitro. Aunque los anticuerpos que reconocen un antígeno particular normalmente se examinan para su fin probando una alta (es decir, fuerte) unión o afinidad de unión a antígeno, los anticuerpos de la presente divulgación presentan una unión débil o no detectable. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno obtenidos de esta manera general también se incluyen dentro de la presente divulgación, y se encontró que son ventajosas como terapias tumorales impulsadas por la avidez.
Los métodos descritos en el presente documento pueden aportar beneficios inesperados, por ejemplo, mejores propiedades farmacocinéticas y una baja toxicidad para el paciente.
Propiedades de unión de los anticuerpos
Como se utiliza en el presente documento, el término "unión" en el contexto de la unión de un anticuerpo, inmunoglobulina, fragmento de unión a anticuerpo, o proteína que contiene Fc a cualquiera, por ejemplo, un antígeno predeterminado, tal como una proteína de la superficie celular o un fragmento de la misma, se refiere normalmente a una interacción o asociación entre un mínimo de dos entidades o estructuras moleculares, tal como una interacción de anticuerpo y antígeno.
Por ejemplo, la afinidad de unión corresponde normalmente a un valor Kd de aproximadamente 10'7 M o menor, tal como aproximadamente 10'8 M o menor, tal como aproximadamente 10'9 M o menor cuando se determina mediante, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance) en un instrumento BIAcore 3000 que utiliza el antígeno como ligando y el anticuerpo, Ig, fragmento de unión a anticuerpo o proteína que contiene Fc como analito (o antiligando). Las estrategias de unión basadas en células, tales como los análisis de unión de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, Fluorescent-Activated Cell Sorting), también se utilizan de forma rutinaria, y los datos de FACs se correlacionan bien con otros métodos, tales como la unión por competición de radioligandos y la SPR (Benedict, CA, J Immunol Methods. 1997, 201(2):223-31; Geuijen, CA, et al. J Immunol Methods. 2005, 302(1-2):68-77).
Por consiguiente, el anticuerpo o la proteína de unión a antígeno de la divulgación se une al antígeno predeterminado o molécula de la superficie celular (receptor) que tiene una afinidad correspondiente a un valor de Kd que es al menos diez veces inferior a su afinidad por unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína). De acuerdo con la presente divulgación, la afinidad de un anticuerpo correspondiente a un varlor de Kd que es igual o inferior a diez veces menor que un antígeno no específico puede considerarse unión no detectable, sin embargo, dicho anticuerpo puede emparejarse con un segundo brazo de unión a antígeno para la producción de un anticuerpo biespecífico de la divulgación.
El término "Kd"(M) se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de equilibrio de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo que se une a un antígeno. Existe una relación inversa entre la Kd y la afinidad de unión, por lo que cuanto menor es el valor de Kd, más alto, es decir, más fuerte, será la afinidad. Por tanto, las expresiones "afinidad mayor" o "afinidad más fuerte" se refieren a una mayor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor de Kd menor y, por el contrario, las expresiones "afinidad menor" o "afinidad más débil" se refieren a una menor capacidad para formar una interacción y, por lo tanto, un valor de Kd mayor. En algunas circunstancias, una mayor afinidad de unión (o Kd) de una molécula particular (por ejemplo, anticuerpo) a su molécula asociada interactiva (por ejemplo, antígeno X) en comparación con la afinidad de unión de la molécula (por ejemplo, anticuerpo) a otra molécula asociada interactiva (por ejemplo, antígeno Y) puede expresarse como una relación de unión determinada mediante la división del valor de Kd más elevado (afinidad menor, o más débil) entre el valor de Kd más bajo (afinidad mayor, o más fuerte), por ejemplo, expresada como afinidad de unión 5 veces o 10 veces superior, según sea el caso.
El término "kd"(s-1 o 1/s) se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de velocidad de disociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo. Dicho valor también se conoce como valor koff.
El término "ka" (M-1 * s-1 o 1/M) se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de velocidad de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo.
El término "Ka"(M-1 o 1/M) se refiere a la constante de equilibrio de asociación de una interacción de anticuerpo y antígeno particular, o la constante de equilibrio de asociación de un anticuerpo o fragmento de unión de anticuerpo. La constante de equilibrio de asociación se obtiene dividiendo la ka entre la kd.
El término "CE50" o "CE50" se refiere a la concentración eficaz semimáxima, que incluye la concentración de un anticuerpo que induce una respuesta a medio camino entre el valor inicial y el máximo después de un tiempo de exposición específico. La CE50 representa esencialmente la concentración de un anticuerpo donde se observa el 50 % de su efecto máximo. En determinados ejemplos, el valor de CE50 es igual a la concentración de un anticuerpo de la divulgación que proporciona una unión semimáxima a las células que expresan CD3 o antígeno asociado a tumores, según se determina mediante, por ejemplo, un análisis de unión de FACS. Por tanto, se observa una unión reducida o más débil con un aumento de la CE50, o valor de concentración eficaz semimáxima.
En un ejemplo, la unión disminuida puede definirse como un aumento de la concentración de anticuerpos CE50 que permite la unión a la cantidad semimáxima de células diana.
En otro ejemplo, el valor de CE50 representa la concentración de un anticuerpo de la divulgación que provoca el agotamiento semimáximo de las células diana mediante la actividad citotóxica de los linfocitos T. Por tanto, se observa un aumento de la actividad citotóxica (por ejemplo, destrucción de células tumorales mediada por linfocitos T) con una disminución de la CE50, o el valor de concentración eficaz semimáxima.
Moléculas de unión a antígeno biespecíficas
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos monoespecíficos anti-MUC16 o los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 de la presente divulgación pueden unirse o expresarse junto con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión o especificidad de unión adicional.
El uso de la expresión "anticuerpo anti-CD3" o "anticuerpo anti-MUC16" en el presente documento pretende incluir tanto anticuerpos monoespecíficos anti-CD3 o anti-MUC16 como anticuerpos biespecíficos que comprenden un brazo de unión a c D3 y un brazo de unión a MUC16. Por tanto, la presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina se une a CD3 humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico de la MUC16 humana. El brazo de unión a CD3 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR que se exponen en las Tablas 1, 16, 18, 19, 22 y 23 del presente documento.
En determinados ejemplos, el brazo de unión a CD3 se une a CD3 humano e induce la activación de linfocitos T humanos. En determinados ejemplos, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil al CD3 humano e induce la activación de los linfocitos T humanos. En otros ejemplos, el brazo de unión a CD3 se une de forma débil a CD3 humano e induce la destrucción de células que expresan antígenos asociados a tumores en el contexto de un anticuerpo biespecífico o multiespecífico. En otros ejemplos, el brazo de unión a CD3 se une o se asocia de forma débil con CD3 humano y de macaco cangrejero (mono), sin embargo, la interacción de unión no es detectable mediante ensayos in vitro conocidos en la materia. El brazo de unión a MUC16 puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como la expuesta en la Tabla 1 en el presente documento.
De acuerdo con determinados casos ilustrativos, la presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen específicamente a CD3 y MUC16. En el presente documento dichas moléculas pueden denominarse, por ejemplo, moléculas biespecíficas "anti-CD3/anti-MUC16", o moléculas biespecíficas "anti-CD3xMUC16" o "CD3xMUC16", u otra terminología similar (por ejemplo, anti-MUC16/anti-CD3). La divulgación proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas construidas con un primer brazo de unión a antígeno que se une a MUC16 y un segundo brazo de unión a antígeno que se une a CD3. En algunos ejemplos, el brazo anti-CD3 comprende una cadena pesada derivada de IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01. En otros ejemplos, la molécula de unión a antígeno biespecífica activa las células PBMC humanas y/o induce actividad citotóxica en estirpes celulares que expresan antígenos tumorales.
El término "MUC16", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la proteína MUC16 humana, a menos que se especifique que proviene de una especie no humana (por ejemplo, "MUC16 de ratón", "MUC16 de mono", etc.). La proteína MUC16 humana tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1899.
Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas mencionadas anteriormente que se unen específicamente a CD3 y MUC16 pueden comprender una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que se une a CD3 con una afinidad de unión débil, tal como la que presenta una Kd superior a aproximadamente 40 nM, medida mediante un ensayo de unión por afinidad in vitro. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas mencionadas anteriormente pueden comprender una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que se une a CD3 y muestra una CE50 superior a aproximadamente 100 nM, medida mediante un análisis de valoración FACS. Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas mencionadas anteriormente pueden comprender una molécula de unión a antígeno anti-CD3 que no muestra una unión medible u observable a CD3, medida mediante un análisis de unión por afinidad o un análisis de valoración FACS in vitro, que aún conserva la capacidad de activar células PBMC humanas y/o inducir actividad citotóxica en estirpes celulares que expresan antígenos tumorales.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende o consiste en al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que sola, o junto con una o más CDR y/o regiones marco (FR) adicionales, se une de manera específica a un determinado antígeno. En determinados ejemplos, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, como se definen esos términos en otras partes en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno biespecífica" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno. Cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende al menos una CDR que sola, o junto con una o más CDR y/o FR adicionales, se une de manera específica a un determinado antígeno. En el contexto de la presente divulgación, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno (p.ej., CD3), y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo, antígeno distinto (p.ej., MUC16).
En determinados ejemplos de la presente divulgación, la molécula de unión a antígeno biespecífica es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). En el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica que comprende un primer y un segundo dominio de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A1" y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno pueden designarse con el prefijo "A2". Por tanto, en el presente documento las CDR del primer dominio de unión a antígeno pueden denominarse A1-HCDR1, A1-HCDR2 y A1-HCDR3; y las CDR del segundo dominio de unión a antígeno en el presente documento pueden denominarse A2-HCDR1, A2-HCDR2 y A2-HCDR3.
El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación. Como alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar unidos a un dominio de multimerización separado. La asociación de un dominio de multimerización con otro dominio de multimerización facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando así una molécula de unión a antígeno biespecífica. Como se utiliza en el presente documento, un "dominio de multimerización" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio de multimerización de la misma estructura o constitución o similar. Por ejemplo, un dominio multimerizante puede ser un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina Ch3. Un ejemplo no limitante de un componente de multimerización es una parte Fc de una inmunoglobulina (que comprende un dominio Ch2-Ch3), por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipo.
Las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación comprenderán normalmente dos dominios de multimerización, por ejemplo, dos dominios Fc que son cada uno de manera individual parte de una cadena pesada de anticuerpo separada. El primer y segundo dominio de multimerización pueden ser del mismo isotipo de IgG tal como, por ejemplo, IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. Como alternativa, el primer y segundo dominio de multimerización pueden ser de diferentes isotipos de IgG tales como, por ejemplo, IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4, etc.
En determinados ejemplos, el dominio multimerizante es un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un resto de cisteína. En otros ejemplos, el dominio de multimerización es un resto de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios de multimerización incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de bucle de hélice o un motivo de hélice superenrrollada.
Puede utilizarse cualquier formato o tecnología de anticuerpo biespecífico para preparar las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno puede unirse funcionalmente (p.ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica. Otros formatos biespecíficos ilustrativos específicos que se pueden utilizar en el contexto de la presente divulgación incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, botón en ojal, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con botón en ojal, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Klein et al., 2012, "mAbs" 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores).
En el contexto de moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación, los dominios de multimerización, por ejemplo, dominios Fc, pueden comprender uno o más cambios de aminoácidos (por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones) en comparación con la versión que se produce de manera natural, de tipo silvestre, del dominio Fc. Por ejemplo, la divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden una o más modificaciones en el dominio Fc produciendo un dominio Fc modificado que tiene una interacción de unión modificada (por ejemplo, mejorada o disminuida) entre Fc y FcRn. En un ejemplo, la molécula de unión a antígeno biespecífica comprende una modificación en una región Ch2 o Ch3, en donde la modificación aumenta la afinidad del dominio Fc a FcRn en un entorno ácido (p.ej., en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, l/r /S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un ejemplo, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).
La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio Ch3 y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En un ejemplo, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.586.713. Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4.
En determinados ejemplos, el dominio Fc puede ser quimérico, que combina secuencias de Fc procedentes de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio Fc quimérico puede comprender parte o toda una secuencia Ch2 derivada de una región Ch2 de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, y parte o toda una secuencia Ch3 derivada de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un dominio Fc quimérico también puede contener una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de "bisagra superior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, junto con una secuencia de "bisagra inferior", derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Un ejemplo particular de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [Ch1 de IgG4] - [Bisagra superior de IgG4] -[Bisagra inferior de IgG2] - [Ch2 de IgG4] - [Ch3 de IgG4]. Otro ejemplo de un dominio Fc quimérico que se puede incluir en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno establecidas en el presente documento comprende, desde el extremo N al extremo C: [Ch1 de IgG1] -[Bisagra superior de IgG1] -[Bisagra inferior de IgG2] -[Ch2 de IgG4] -[Ch3 de IgG1]. Estos y otros ejemplos de dominios Fc quiméricos que pueden incluirse en cualquiera de las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación se describen en la publicación US 2014/0243504, publicado el 28 de agosto de 2014, que se incorpora en el presente documento en su totalidad. Los dominios Fc quiméricos que tienen estas disposiciones estructurales generales y variantes de los mismos, pueden tener alterada la unión al receptor de Fc, que a su vez afecta la función efectora de Fc.
En determinados ejemplos, la divulgación proporciona una cadena pesada de anticuerpo en donde la región de la región constante de cadena pesada (CH) comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos un 99 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO: 1911, SEQ ID NO: 1912, SEQ ID NO: 1913, SEQ ID NO: 1914, SEQ ID NO: 1915, SEQ ID NO: 1916, SEQ ID NO: 1917, SEQ ID NO: 1918, SEQ ID NO: 1919 o SEQ ID NO: 1920. En algunos ejemplos, la región de la región constante de cadena pesada (CH) comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1911, SEQ ID NO: 1912, SEQ ID NO: 1913, SEQ ID NO: 1914, SEQ ID NO: 1915, SEQ ID NO: 1916, SEQ ID NO: 1917, SEQ ID NO: 1918, SEQ ID NO: 1919 y SEQ ID NO: 1920.
En otros ejemplos, la divulgación proporciona una cadena pesada de anticuerpo en donde el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos un 99 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO: 1921, SEQ ID NO: 1922, SEQ ID NO: 1923, SEQ ID NO: 1924, SEQ ID NO: 1925, SEQ ID NO: 1926, SEQ ID NO: 1927, SEQ ID NO: 1928, SEQ ID NO: 1929 o SEQ ID NO: 1930. En algunos ejemplos, el dominio Fc comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1921, SEQ ID NO: 1922, SEQ ID NO: 1923, SEQ ID NO: 1924, SEQ ID NO: 1925, SEQ ID NO: 1926, SEQ ID NO: 1927, SEQ ID NO: 1928, SEQ ID NO: 1929 y SEQ ID NO: 1930. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 28, 30 y 32, respectivamente, como se define en las reivindicaciones, está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
Variantes de secuencia
Los anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácido en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la estirpe germinal correspondientes de las que se derivaron los dominios de unión a antígeno individuales. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento con secuencias de la estirpe germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. Las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación pueden comprender dominios de unión a antígeno que se derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos ilustrativas divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la estirpe germinal de la que deriva el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la estirpe germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la estirpe germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la estirpe germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la estirpe germinal o combinaciones de las mismas. En determinados ejemplos, todos los restos de marco y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl se vuelven a mutar a los restos encontrados en la secuencia original de la estirpe germinal de la cual se derivó originalmente el dominio de unión a antígeno. En otros ejemplos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de estirpe germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros ejemplos, uno o más del resto(s) del marco y/o CDR están mutados a los restos correspondientes de una secuencia de estirpe germinal diferente (es decir, una secuencia de la estirpe germinal que es diferente de la secuencia de la estirpe germinal de la cual se derivaba originalmente el dominio de unión a antígeno). Por otra parte, los dominios de unión a antígeno pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de estirpe germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de estirpe germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal distinta. Una vez obtenidos, los dominios de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de estirpe germinal pueden analizarse fácilmente para una o más propiedades deseadas como, especificidad de unión mejorada, aumento de la unión o afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), inmunogenicidad reducida, etc. En la presente divulgación se incluyen moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden uno o más dominios de unión a antígeno obtenidos de esta manera general.
La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno en las que uno o ambos dominios de unión a antígeno comprenden variantes de cualquiera de las HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno que tiene HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxiloalifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445, incorporada en el presente documento por referencia. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión a antígeno con una secuencia de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que es sustancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento. La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se hace referencia a una secuencia de aminoácidos significa que dos secuencias de aminoácidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331, incorporada en el presente documento por referencia.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit, que pueden utilizarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) supra). Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402, cada uno incorporado por referencia en el presente documento.
Unión dependiente del pH
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-MUC16 y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, con características de unión dependientes del pH. Por ejemplo, un anticuerpo anti-MUC16 de la presente divulgación puede presentar una unión reducida a MUC16 a pH ácido en comparación con un pH neutro. Como alternativa, los anticuerpos anti-MUC16 de la divulgación pueden presentar una unión mejorada a MUC16 a pH ácido en comparación con un pH neutro. La expresión "pH ácido" incluye valores de pH inferiores a aproximadamente 6,2, por ejemplo, aproximadamente 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 o menor. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "pH neutro" significa un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,4. La expresión "pH neutro" incluye valores de pH de aproximadamente 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 y 7,4.
En determinados ejemplos, "unión reducida... a pH ácido en comparación con un pH neutro" se expresa en términos de una relación del valor de Kd del anticuerpo que se une a su antígeno a pH ácido respecto al valor de Kd del anticuerpo que se une a su antígeno a pH neutro (o viceversa). Por ejemplo, puede considerarse que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta "unión reducida a MUC16 a pH ácido en comparación con pH neutro" para fines de la presente divulgación si el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una proporción de Kd ácido/neutro de aproximadamente 3,0 o mayor. En determinados casos ilustrativos, la proporción de Kd ácido/neutro para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación puede ser aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0. 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 o superior.
Se pueden obtener anticuerpos con características de unión dependientes del pH, por ejemplo, rastreando una población de anticuerpos para la unión reducida (o potenciada) a un antígeno particular a pH ácido en comparación con pH neutro. Adicionalmente, las modificaciones del dominio de unión a antígeno a nivel de aminoácidos pueden producir anticuerpos con características dependientes del pH. Por ejemplo, mediante la sustitución de uno o más aminoácidos de un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, dentro de una CDR) con un resto de histidina, puede obtenerse un anticuerpo con unión a antígeno reducida a pH ácido en relación con el pH neutro.
Anticuerpos que comprenden variantes Fc
De acuerdo con determinados ejemplos de la presente divulgación, se proporcionan anticuerpos anti-MUC16 y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos que comprenden una mutación en la región Ch2 o Ch3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/r /s /P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un ejemplo, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428l ) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).
Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-MUC16 y moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos divulgados en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.
Características biológicas de los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas
La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a MUC16 humana con alta afinidad (por ejemplo, valores de Kd subnanomolares).
De acuerdo con determinados ejemplos, la presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a MUC16 humana (por ejemplo, a 25 °C) con una Kd inferior a aproximadamente 60 nM medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento. En determinados ejemplos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a MUC16 con una Kd inferior a aproximadamente 60 nM, inferior a aproximadamente 40 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 8 nM, inferior a aproximadamente 7 nM, inferior a aproximadamente 6 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 4 nM, inferior a aproximadamente 3 nM, inferior a aproximadamente 2 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 800 pM, inferior a aproximadamente 700 pM, inferior a aproximadamente 500 pM, inferior a aproximadamente 400 pM o inferior a aproximadamente 300 pM, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de AcM o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar. La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos que se unen a MUC16 con una Kd inferior a aproximadamente 7 nM, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de AcM o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar.
La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a MUC16 con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 10 minutos o superior a aproximadamente 125 minutos, medida por resonancia de plasmones superficiales a 25 °C, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. En determinados ejemplos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a MUC16 con una t1^ superior a aproximadamente 10 minutos, superior a aproximadamente 20 minutos, superior a aproximadamente 30 minutos, superior a aproximadamente 40 minutos, superior a aproximadamente 50 minutos, superior a aproximadamente 60 minutos, superior a aproximadamente 70 minutos, superior a aproximadamente 80 minutos, superior a aproximadamente 90 minutos, superior a aproximadamente 100 minutos, superior a aproximadamente 110 minutos o superior a aproximadamente 120 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento (por ejemplo, formato de captura de AcM o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar. La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos que se unen a MUC16 con una duración superior a aproximadamente 10 minutos o superior a aproximadamente 20 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a estirpes celulares humanas que expresan MUC16 endógena (por ejemplo, OVCAR-3), como se determina mediante un análisis de detección basado en electroquimioluminiscencia como se expone en el Ejemplo 2 o un ensayo sustancialmente similar.
La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 que presentan una o más características seleccionadas del grupo que consiste en: (a) inhibición del crecimiento tumoral en ratones inmunodeprimidos portadores de xenoinjertos de cáncer de próstata humano; y (b); supresión del crecimiento tumoral de tumores establecidos en ratones inmunodeprimidos portadores de xenoinjertos de cáncer de ovario humano (véase, por ejemplo, Ejemplo 8).
La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con alta afinidad. La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano con afinidad media o baja, dependiendo del contexto terapéutico y las propiedades de direccionamiento particulares que se deseen. En algunos casos, la baja afinidad incluye anticuerpos que se unen a CD3 con una Kd o CE50 (por ejemplo, medida en un ensayo de resonancia de plasmón superficial) superior a 300 nM, superior a 500 nM o superior a 1 pM. La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a CD3 humano sin afinidad medible. Por ejemplo, en el contexto de una molécula de unión a antígeno biespecífica, en donde un brazo se une a CD3 y otro brazo se une a un antígeno diana (por ejemplo, MUC16), puede ser deseable que el brazo de unión a antígeno diana se una al antígeno diana con alta afinidad mientras que el brazo anti-CD3 se una a CD3 solo con afinidad moderada o baja o sin afinidad. De esta manera, puede conseguirse la orientación preferente de la molécula de unión a antígeno a células que expresan el antígeno diana mientras se evita la unión de CD3 general/no dirigida y los consiguientes efectos secundarios adversos asociados con ella.
La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) que pueden unirse simultáneamente a CD3 humano y a MUC16 humana. El brazo de unión que interactúa con las células que expresan CD3 puede tener una unión débil a no detectable según se mide en un ensayo de unión in vitro. El grado en que una molécula de unión a antígeno biespecífica se une a células que expresan CD3 y/o MUC16 puede evaluarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), como se ilustra en el Ejemplo 5 en el presente documento.
Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen específicamente a estirpes de linfocitos T humanos que expresan CD3 pero no expresan MUC16 (por ejemplo, Jurkat), linfocitos T de primates (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica [PBMC] de macaco cangrejero), y/o células que expresan MUC16.
La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 humano con una unión o afinidad de unión débil (es decir, baja) o incluso no detectable.
La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 de mono (es decir, macaco cangrejero) con una unión o afinidad de unión débil (es decir, baja) o incluso no detectable.
La presente divulgación incluye anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos de los mismos que se unen a CD3 humano e inducen la activación de linfocitos T.
La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 que son capaces de agotar las células que expresan antígenos tumorales en un sujeto (véase, por ejemplo, Ejemplo 8, en un ensayo de imágenes bioluminiscentes, o un ensayo sustancialmente similar). Por ejemplo, de acuerdo con determinados ejemplos, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16, en donde una sola administración de 10 |jg de la molécula de unión a antígeno biespecífica a un sujeto provoca una reducción en el número de células que expresan MUC16 en el sujeto (por ejemplo, se suprime o inhibe el crecimiento tumoral en el sujeto). Salvo que se indique lo contrario, la radiación bioluminiscente se refiere a [p/s/cm22/sr].
La presente divulgación también incluye conjugados de fármacos de anticuerpos anti-MUC16 que inhiben el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de cáncer de ovario que expresan MUC16 in vivo (véase, por ejemplo, Ejemplo de referencia 2, en un ensayo de imágenes bioluminiscentes, o un ensayo sustancialmente similar). En determinados ejemplos, se proporcionan conjugados de anticuerpo anti-MUC16 y fármaco con el Compuesto 7, en donde cuatro dosis una vez a la semana administradas a una dosis de 85 jg/kg inhiben el crecimiento intraperitoneal del tumor OVCAR3/luc in vivo. En determinados ejemplos, se proporcionan conjugados de anticuerpo anti-MUC16 y fármaco con el Compuesto 7, en donde cuatro dosis una vez a la semana administradas a una dosis de 85 jg/kg inhiben el crecimiento subcutáneo del tumor OVCAR3/luc in vivo. En determinados ejemplos, se proporcionan conjugados de anticuerpo anti-MUC16 y fármaco con el Compuesto 10, en donde una dosis única a una dosis de 85 jg/kg, 170 jg/kg o 340 jg/kg inhiben el crecimiento intraperitoneal del tumor OVCAR3/luc in vivo. Salvo que se indique lo contrario, la radiación bioluminiscente se refiere a [p/s/cm22/sr].
La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 que presentan perfiles farmacocinéticos en ratones MUC16 x CD3 humanizados (ratones homocigotos para la expresión de MUC16 y CD3 humanos, MUC16 hu/hu x CD3 hu/hu), ratones CD3 humanizados (ratones homocigotos para la expresión de CD3 humano, CD3hu/hu) y ratones de tipo silvestre (TS) emparejados por cepas (75 % de C57BL, 25 % de 129Sv), como se describe en el Ejemplo 7 y se muestra en las Figuras 1, 2 y 3.
Cartografía epitópica y tecnologías relacionadas
El epítopo en CD3 y/o MUC16 al que se unen las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína CD3 o MUC16. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) de CD3 o MUC16. Los anticuerpos de la divulgación pueden interactuar con aminoácidos contenidos dentro de una sola cadena CD3 (p.ej., CD3-£, Cd3-8 o CD3-y), o pueden interactuar con aminoácidos en dos o más cadenas de CD3 diferentes. El término "epítopo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
Para determinar si un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína se pueden utilizar diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) y análisis de escisión de péptidos. Adicionalmente, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. Seguidamente, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos, excepto en los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana es sometida a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem.
73:256A-265A. Para fines de mapeo de epítopos también puede usarse cristalografía de rayos X del complejo antígeno/anticuerpo.
La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-MUC16 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como la expuesta en la tabla 1 en el presente documento). Del mismo modo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-MUC16 que compiten por unirse a MUC16 con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como la expuesta en la Tabla 1 en el presente documento). Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano y/o CD3 de macaco cangrejero con afinidad de unión o unión baja o no detectable, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 humana, en donde el primer dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en CD3 que cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos descritos en el presente documento, y/o en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo en MUC16 que cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de MUC16 ilustrativos descritos en el presente documento.
Del mismo modo, la presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 humana, en donde el primer dominio de unión a antígeno compite por unirse a CD3 con cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de CD3 ilustrativos descritos en el presente documento, y/o en donde el segundo dominio de unión a antígeno compite por unirse a MUC16 con cualquiera de los dominios de unión a antígeno específicos de MUC16 ilustrativos descritos en el presente documento.
Se puede determinar fácilmente si una molécula de unión a antígeno particular (por ejemplo, un anticuerpo) o un dominio de unión a antígeno de la misma se une al mismo epítopo que, o si compite por unirse a, una molécula de unión a antígeno de referencia de la presente divulgación usando métodos de rutina conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo en MUC16 (o CD3) como una molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia de la presente divulgación, primero se permite la unión de una molécula biespecífica de referencia a una proteína MUC16 (o proteína CD3). Seguidamente, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula MUC16 (o CD3). Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a MUC16 (o CD3) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente de MUC16 (o CD3) que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula MUC16 (o CD3) después de unión de saturación con la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo de MUC16 (o CD3) que el epítopo unido por la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia de la divulgación. Después puede realizarse una experimentación de rutina adicional (p.ej., análisis de mutación de péptidos y unión peptídica) para confirmar si la falta observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe realmente a la unión al mismo epítopo que la molécula de unión a antígeno biespecífica de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. De acuerdo con determinados ejemplos de la presente divulgación, dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo (o superpuesto) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de una proteína de unión a antígeno inhibe la unión de la otra en al menos el 50 %, pero preferentemente el 75 %, el 90 % o incluso el 99 %, medido en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res. 1990:50:1495-1502). Como alternativa, se considera que dos proteínas de unión a antígeno se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reducen o eliminan la unión de la otra. Se considera que dos proteínas de unión a antígeno tienen "epítopos superpuestos" si solo un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de una proteína de unión a antígeno reduce o elimina la unión de la otra.
Para determinar si un anticuerpo o dominio de unión a antígeno del mismo compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que la molécula de unión a antígeno de referencia se una a una proteína MUC16 (o proteína CD3) en condiciones de saturación, seguido de evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula MUC16 (o CD3). En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula MUC16 (o CD3) en condiciones de saturación seguido de una evaluación de la unión de la molécula de unión a antígeno de referencia a la molécula MUC16 (o CD3). Si, en ambas orientaciones, solo la primera molécula de unión a antígeno (saturante) es capaz de unirse a la molécula MUC16 (o CD3), entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y la molécula de unión a antígeno de referencia compiten por unirse al MUC16 (o c D3). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por unirse con una molécula de unión a antígeno de referencia no necesariamente se une al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Preparación de dominios de unión a antígeno y construcción de moléculas biespecíficas
Los dominios de unión a antígeno específicos para antígenos particulares pueden prepararse mediante cualquier tecnología generadora de anticuerpos conocida en la técnica. Una vez obtenidos, dos dominios de unión a antígeno diferentes, específicos para dos antígenos diferentes (p.ej., CD3 y MUC16), pueden disponerse apropiadamente uno con respecto al otro para producir una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación usando métodos de rutina. (En otras partes del presente documento, se proporciona un análisis de formatos de anticuerpos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse para construir las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación). En determinados ejemplos, uno o más de los componentes individuales (por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras) de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la divulgación se derivan de anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Los métodos para fabricar tales anticuerpos se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, una o más de las cadenas pesadas y/o ligeras de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación se pueden preparar utilizando la tecnología VELOCIMMUNE™. Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (o cualquier otra tecnología de generación de anticuerpos humanos), los anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra un antígeno particular (p.ej., CD3 o MUC16) se aíslan inicialmente con una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizan y seleccionan por características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar cadenas pesadas y/o ligeras completamente humanas que pueden incorporarse en las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la presente divulgación.
Los animales genéticamente modificados pueden usarse para hacer moléculas de unión a antígeno biespecíficas humanas. Por ejemplo, puede usarse un ratón genéticamente modificado que es incapaz de reorganizar y expresar una secuencia variable de cadena ligera de inmunoglobulina endógena de ratón, en donde el ratón expresa solo uno o dos dominios variables de cadena ligera humana codificados por secuencias de inmunoglobulina humana unidas operativamente al gen constante k de ratón en el locus k de ratón endógeno. Dichos ratones genéticamente modificados pueden usarse para producir moléculas de unión a antígeno biespecíficas completamente humanas que comprendan dos cadenas pesadas diferentes que se asocien con una cadena ligera idéntica que comprenda un dominio variable procedente de uno de dos segmentos génicos de región variable de cadena ligera humana diferentes. (Véase, por ejemplo, documento US 2011/0195454). Completamente humano se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno o dominio de inmunoglobulina del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN derivado de una secuencia humana en toda la longitud de cada polipéptido del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o dominio de inmunoglobulina del mismo. En algunos ejemplos, la secuencia totalmente humana se deriva de una proteína endógena a un ser humano. En otros ejemplos, la proteína o secuencia de proteína totalmente humana comprende una secuencia quimérica en donde cada secuencia constituyente se deriva de una secuencia humana. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, las proteínas o secuencias quiméricas generalmente están diseñadas para minimizar la creación de epítopos inmunogénicos en las uniones de las secuencias constituyentes, por ejemplo, en comparación con cualquier región o dominio de inmunoglobulina humana de tipo silvestre.
Bioequivalentes
La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de las moléculas ilustrativas divulgadas en el presente documento, pero que conservan la capacidad de unirse a CD3 y/o a MUC16. Dichas moléculas variantes pueden comprender una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas.
La presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno que son bioequivalentes a cualquiera de las moléculas de unión a antígeno ilustrativas expuestas en el presente documento. Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes o alternativas farmacéuticos cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una única dosis o en múltiples dosis. Algunas proteínas de unión a antígeno se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su velocidad de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la velocidad de absorción son intencionales y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente irrelevantes para el fármaco estudiado en concreto. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
En un ejemplo, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.
En un ejemplo, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En un ejemplo, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) una prueba in vivo en seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia, biodisponibilidad o bioequivalencia de una proteína de unión a antígeno.
Las variantes bioequivalentes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento pueden construirse mediante, por ejemplo, la generación de diferentes sustituciones de restos o secuencias o la deleción de secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse por otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, las proteínas de unión a antígeno bioequivalentes pueden incluir variantes de las moléculas de unión a antígeno biespecíficas ilustrativas expuestas en el presente documento que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de las moléculas, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
De acuerdo con determinados ejemplos de la divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen al CD3 humano, pero no al CD3 de otras especies. También se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a MUC16 humana. La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y a CD3 de una o más especies no humanas; y/o moléculas de unión a antígeno que se unen a MUC16 humana.
De acuerdo con determinados casos ilustrativos de la divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno que se unen a CD3 humano y/o a MUC16 humana y que pueden unirse o no unirse, según sea el caso, a uno o más de CD3 y/o MUC16 de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gatos, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, rhesus o chimpancé. Por ejemplo, en un caso ilustrativo particular de la presente divulgación, se proporcionan moléculas de unión a antígeno biespecíficas que comprenden un primer dominio de unión a antígeno que se une a CD3 humano y a CD3 de macaco cangrejero, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a MUC16 humana.
Conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF)
La presente divulgación proporciona conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) que comprenden un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un resto terapéutico tal como un agente citotóxico, un fármaco quimioterápico, un inmunodepresor o un radioisótopo. En términos generales, los CAF comprenden: A-[L-P]y, en donde A es una molécula de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-MUC16, o un fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento que comprende al menos una HCDR3 seleccionada de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1), L es un enlazador, P es la carga activa o el resto terapéutico (por ejemplo, agente citotóxico) e y es un número entero de 1 a 30. En diferentes ejemplos, el CAF comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende las CDR de una HCVR y una LCVR que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y 10) expuestas en la Tabla 1, o pares específicos de HCVR/LCVR (por ejemplo, SEQ ID NO: 2/10). En algunos casos, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento comprende CDR con las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO (por ejemplo, SEQ ID NO: 4-6-8-12-14-16) expuestas en la Tabla 1. En algunos casos, el anticuerpo anti-MUC16 o fragmento comprende una HCVR y una LCVR que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y 10) expuestas en la Tabla 1, o pares de secuencias de aminoácidos específicos (por ejemplo, SEQ ID NO: 2/10). En algunos casos, el anticuerpo anti-MUC16 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a MUC16 humana dentro de uno o más de los cinco dominios SEA próximos a la membrana de MUC16 humana correspondientes a los restos 13791-14451 de SEQ ID NO: 1899. En algunos casos, el anticuerpo anti-MUC16 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a MUC16 humana dentro de los restos 13810-14451 de SEQ ID NO: 1899. En algunos casos, el anticuerpo anti-MUC16 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a una cualquiera o más de SEA1, SEA2, SEA3, SEA4, SEA5, SEA6, SEA7, SEA8, SEA9, SEA10, SEA11, SEA12, SEA13, SEA14, SEA15 o SEA16 de MUC16 humana. Sin embargo, solo un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones está dentro del alcance de los anticuerpos de la invención reivindicada.
Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para el crecimiento, la viabilidad o la propagación de las células. Las moléculas de unión a antígeno o los anticuerpos de la divulgación liberan estos agentes citotóxicos, denominados en el presente documento "cargas activas", a las células diana. Los ejemplos de agentes citotóxicos y quimioterápicos adecuados para formar CAF son conocidos en la técnica.
Los ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterápicos adecuados que pueden conjugarse con anticuerpos anti-MUC16 de acuerdo con este aspecto de la divulgación incluyen, por ejemplo, 1-(2cloroetil)-1,2-dimetanosulfonilhidrazida, 1,8-dihidroxi-biciclo[7.3.1]trideca-4,9-dieno-2,6-diino-13-ona, 1-deshidrotestosterona, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 9-amino-camptotecina, actinomicina D, amanitina, aminopterina, anguidina, antraciclina, antramicina (AMC), auristatinas (monometil-auristatina E o monometil-auristatina F), bleomicina, busulfano, ácido butírico, caliqueamicinas, camptotecina, carminomicinas, carmustina, cemadotinas, cisplatino, colchicina, combretastatinas, ciclofosfamida, citarabina, citocalasina B, dactinomicina, daunorrubicina, decarbazina, diacetoxipentildoxorrubicina, dibromomanitol, dihidroxiantracindiona, disorazoles, dolastatina, doxorrubicina, duocarmicina, equinomicinas, eleuterobinas, emetina, epotilonas, esperamicina, estramustinas, bromuro de etidio, etopósido, fluorouracilos, geldanamicinas, gramicidina D, glucocorticoides, irinotecanos, leptomicinas, leurosinas, lidocaína, lomustina (CCNU), maitansinoides, mecloretamina, melfalán, mercaptopurinas, metopterinas, metotrexato, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, N8-acetil-espermidina, podofilotoxinas, procaína, propranolol, pteridinas, puromicina, rizoxinas, estreptozotocina, talisomicinas, taxol, tenopósido, tetracaína, tioepa clorambucilo, tomaimicinas, topotecanos, tubulisina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbinas y derivados de cualquiera de los anteriores.
De acuerdo con determinados ejemplos, el agente citotóxico que se conjuga con un anticuerpo anti-MUC16 es una auristatina tal como monometil-auristatina E (MMAE) o monometil-auristatina F (MMAF), una tubulisina tal como TUB-OH o TUB-OMOM, un derivado de tomamicina, un derivado de dolastatina o un maitansinoide tal como DM1 o DM4. En algunos ejemplos, el agente citotóxico es un maitansinoide que tiene la estructura de Fórmula (I), incluyendo estereoisómeros de los compuestos de Fórmula (I):
Figure imgf000036_0001
en donde A es arileno o heteroarileno.
En algunos ejemplos, A es un radical divalente de benceno, de piridina, de naftaleno o de quinolona, que están opcionalmente sustituidos.
En algunos ejemplos, A es arileno.
En algunos ejemplos, A es:
Figure imgf000036_0002
en donde:
R1 es, independientemente en cada caso, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, alcarilo, aralquilo, halo, heteroarilo, heterocicloalquilo, hidroxilo, ciano, nitro,
Figure imgf000036_0003
, o azido, en donde RA es alquilo o heteroalquilo;
n es un número entero de 0 a 4;
m es y número entero de 0 a 3;
p es un número entero de 0 a 6; y
q es un número entero de 0 a 5.
En algunos ejemplos, el compuesto de Fórmula (I) se selecciona Del grupo que consiste en:
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001

Figure imgf000039_0001

Figure imgf000040_0001
En un ejemplo, el compuesto de Fórmula (I) es:
Figure imgf000040_0002
En algunos ejemplos, el maitansinoide de Fórmula (I) se conjuga con un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo a través de un enlazador, como se muestra en la Fórmula (IA), a continuación:
Figure imgf000040_0003
en donde:
A es arileno o heteroarileno, como se ha analizado anteriormente en relación con la Fórmula (I);
L es un enlazador;
BA es un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y
k es un número entero de 1 a 30.
En diferentes ejemplos, L es:
Figure imgf000040_0004
en donde:
SP es un espaciador;
Figure imgf000041_0001
es uno o más enlaces al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo;
AA1 es un aminoácido; y
AA2 es un aminoácido.
En algunos ejemplos, AA1-AA2 es: valina-citrulina, citrulina-valina, lisina-fenilalanina, fenilalanina-lisina, valinaasparagina, asparagina-valina, treonina-asparagina, asparagina-treonina, serina-asparagina, asparagina-serina, fenilalanina-asparagina, asparagina-fenilalanina, leucina-asparagina, asparagina-leucina, isoleucina-asparagina, asparagina-isoleucina, glicina-asparagina, asparagina-glicina, ácido glutámico-asparagina, asparagina-ácido glutámico, citrulina-asparagina, asparagina-citrulina, alanina-asparagina o asparagina-alanina.
En algunos ejemplos, SP es:
Figure imgf000041_0002
en donde:
Figure imgf000041_0003
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o a un fragmento del mismo; y b es un número entero de 2 a 8.
En otros ejemplos, L es:
Figure imgf000041_0004
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o a un fragmento del mismo; y b es un número entero de 2 a 8.
En un ejemplo, el compuesto de Fórmula (IA), incluyendo el enlazador, que se une al anticuerpo anti-MUC16 o al fragmento de unión a antígeno del mismo es:
Figure imgf000042_0001
en donde
Figure imgf000042_0002
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo. En algunos ejemplos, este resto se denomina "Compuesto 10".
En un ejemplo, el compuesto de Fórmula (IA), incluyendo el enlazador, que se une al anticuerpo anti-MUC16 o al fragmento de unión a antígeno del mismo es:
Figure imgf000042_0003
en donde
Figure imgf000042_0004
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo. En algunos ejemplos, este resto se denomina "Compuesto 60".
En algunos ejemplos, el agente citotóxico es un maitansinoide que tiene la estructura de Fórmula (II), incluyendo estereoisómeros de los compuestos de Fórmula (II):
Figure imgf000042_0005
en donde:
A3a es un aminoácido, un péptido que tiene 2-20 aminoácidos, un alquilo, un alquinilo, un alquenilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, -CR5 R6-, -O-, -C(=O)-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-O-, -C(=O)-(CHx)p1-,-C(=O)-O-(CHx)p1-, -(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O-, -(O-(CH2)p2-)p3-,-((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR4-,-N(R4)-C(=O)-N(R3)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-C(=O)-, -C(=O)-N(R4)-, -C(=O)-N(R4)-C(=O)- o -O-C(=O)-NR4-, en donde el alquilo, alquinilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo están opcionalmente sustituidos; y
p1, p2 y p3 son cada uno independientemente 0, o un número entero de 1 a 100;
x es 0, 1 o 2;
R4 , R5 , R6 y R8 son cada uno independientemente H, o uno de los siguientes sustituido o no sustituido: alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo; y
R4a es uno de los siguientes sustituido o no sustituido: alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo. En algunos ejemplos, el compuesto de Fórmula II se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000043_0001
En un ejemplo, el compuesto de Fórmula (II) es:
Figure imgf000043_0002
En algunos ejemplos, el maitansinoide de Fórmula (II) se conjuga con un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo a través de un enlazador, como se muestra en la Fórmula (IIA), a continuación:
Figure imgf000044_0001
en donde:
BA es un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
a es un número entero de 1 a 30;
Z2 está representado por la siguiente fórmula estructural: -Z2A-Z2B-Z2C-Z2D, en donde Z2A, Z2B, Z2C y Z2D están cada uno independientemente ausentes, un aminoácido, un péptido que tiene 2-20 aminoácidos, un alquilo, un alquinilo, un alquenilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, -CR5R6-, -O-, -C(=O)-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-,-O-C(=O)-O-, -C(=O)-(CHx)p1, -C(=O)-O-(CHx)p1, -(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O-, -(O-(CH2)p2-)p3-.-((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR4-, -N(R4)-C(=O)-N(R3)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-C(=O)-, -C(=O)-N(R4)-, -C(=O)-N(R4)-C(=O)-, -O-C(=O)-N(R4), -O-C(=S)-N(R4)-, -C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=O,
Figure imgf000044_0002
A es un aminoácido natural o no natural, o un péptido que comprende 2-20 aminoácidos;
W es -O-, -S-, -CR5R6- o -NR4-;
X es arilo, heteroarilo, cicloalquilo o heterociclilo, en donde arilo, heteroarilo, cicloalquilo y heterociclilo están opcionalmente sustituidos;
en donde A1 , A3 y R1 son cada uno independientemente un aminoácido, un péptido que tiene 2-20 aminoácidos, un alquilo, un alquinilo, un alquenilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, -CR5R6-, -O-, -C(=O)-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-O-, -C(=O)-(CHx)p1-, -C(=O)-O-(CHx)p1-, -(CHx)p1-C(=O)-, -(CHx)p1-C(=O)-O-, -(O-(CH2)p2-)p3-, -((CH2)p2-O-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -S-C(=S)-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SO2-, -NR4-, -N(R4)-C(=O)-N(R3)-, -N(R4)-C(=O)O-, -N(R4)-C(=O)-, -C(=O)-N(R4)-, -C(=O)-N(R4)-C(=O)- o -O-C(=O)-NR4-, en donde el alquilo, alquinilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo están opcionalmente sustituidos; R17 se selecciona del grupo que consiste en O, S, NR18 y CR5R6 ;
R18 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo, alquinilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo y acilo, en donde el alquilo, alquinilo, alquenilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo y acilo están opcionalmente sustituidos;
R4 , R5 , R6 y R8 son cada uno independientemente H, o uno de los siguientes sustituido o no sustituido: alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo;
R4a es uno de los siguientes sustituido o no sustituido: alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo; p1, p2 y p3 son cada uno independientemente 0, o un número entero de 1 a 100; y
x es 0, 1 o 2.
En algunos ejemplos de Fórmula (II A), A es un péptido seleccionado del grupo que consiste en valina-citrulina, citrulinavalina, lisina-fenilalanina, fenilalanina-lisina, valina-asparagina, asparagina-valina, treonina-asparagina, asparagina-treonina, serina-asparagina, asparagina-serina, fenilalanina-asparagina, asparagina-fenilalanina, leucinaasparagina, asparagina-leucina, isoleucina-asparagina, asparagina-isoleucina, glicina-asparagina, asparagina-glicina, ácido glutámico-asparagina, asparagina-ácido glutámico, citrulina-asparagina, asparagina-citrulina, alaninaasparagina y asparagina-alanina.
En un ejemplo, el compuesto de Fórmula (IIA) que se une al anticuerpo anti-MUC16 o al fragmento de unión a antígeno del mismo es:
Figure imgf000045_0001
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo. En algunos ejemplos, este resto se denomina "Compuesto 7".
En algunos ejemplos, el agente citotóxico que se conjuga con un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento del mismo es un diastereómero puro, o sustancialmente puro, de DM1:
Figure imgf000045_0002
e y es un número entero de 1 a 0.
En otro ejemplo, el CAF comprende una estructura "A-[L-P]y" en la que A es un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y [L-P] es:
Figure imgf000045_0003
o
Figure imgf000046_0001
o
una mezcla de los mismos, y
en donde y es un número entero de 1 a 30, y
Figure imgf000046_0002
es un enlace al anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo.
Otros derivados de maitansinoides se analizan en los documentos WO 2014/145090, WO2016/160615 y WO 2015/031396, cada uno de los cuales se incorpora por referencia en su totalidad).
En algunos ejemplos, el agente citotóxico que se conjuga con un anticuerpo anti-MUC16 o fragmento del mismo es MMAE o MMAF.
Dentro del alcance de la presente divulgación, se contemplan otros agentes citotóxicos conocidos en la técnica, incluidos, por ejemplo, toxinas proteicas tales como ricina, toxina de C. difficile, exotoxina de Pseudomonas, toxina diftérica, toxina botulínica, briodina, saporina, toxinas de hierba carmín (es decir, fitolacatoxina y fitolaccigenina), y otras como las expuestas en Sapra et al., Pharmacol. & Therapeutics, 2013, 138:452-469.
Los agentes citotóxicos ("cargas activas") se pueden unir a una molécula de unión a antígeno o anticuerpo anti-MUC16 de la divulgación a través de un enlazador químico que una covalentemente el compuesto de carga activa a la molécula de proteína (es decir, al anticuerpo). Los casos ilustrativos de enlazadores específicos se han analizado anteriormente. Más generalmente, y como se utiliza en el presente documento, el término "enlazador" se refiere a cualquier grupo divalente o resto que enlaza, conecta o une un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo) con un compuesto de carga activa expuesto en el presente documento. Generalmente, los enlazadores de agentes de unión adecuados para los conjugados de anticuerpos descritos en el presente documento son aquellos que son lo suficientemente estables para aprovechar la semivida circulante del anticuerpo y, al mismo tiempo, capaces de liberar su carga activa tras la interiorización del conjugado mediada por antígeno. Los enlazadores pueden ser escindibles o no escindibles. Los enlazadores escindibles son enlazadores que se escinden mediante metabolismo intracelular tras la interiorización, por ejemplo, escisión por hidrólisis, reducción o reacción enzimática. Los enlazadores no escindibles son enlazadores que liberan una carga activa adjunta a través de la degradación lisosomal del anticuerpo tras la interiorización. Los enlazadores adecuados incluyen, pero sin limitación, enlazadores lábiles al ácido, enlazadores lábiles a la hidrólisis, enlazadores escindibles enzimáticamente, enlazadores lábiles a la reducción, enlazadores autoinmolables y enlazadores no escindibles. Los enlazadores adecuados también incluyen, pero sin limitación, los que son o comprenden péptidos, glucurónidos, succinimida-tioéteres, unidades de polietilenglicol (PEG), hidrazonas, unidades de mal-caproílo, unidades de dipéptidos, unidades de valina-citrulina y unidades de para-aminobencilo (PAB). En algunos casos, el enlazador es capaz de unirse al anticuerpo o al fragmento de unión a antígeno a través de un resto de lisina o un resto de cisteína (por ejemplo, mediante la escisión de un grupo disulfuro del anticuerpo o fragmento, o mediante un resto de cisteína genomodificado en el anticuerpo o fragmento). En algunos casos, el enlazador es capaz de unirse al anticuerpo o fragmento a través de un resto de glutamina, incluyendo los derivados a través de la conjugación mediada por transglutaminasa.
Los enlazadores ilustrativos que se pueden utilizar en el contexto de la presente divulgación incluyen enlazadores que comprenden o consisten en, por ejemplo, MC (6-maleimidocaproílo), m Cc (maleimidometil-ciclohexano-1-carboxilato), MP (maleimidopropanoílo), val-cit (valina-citrulina), val-ala (valina-alanina), ala-phe (alanina-fenilalanina), phe-lys (fenilalaninalisina), sitio dipeptídico en el enlazador escindible por proteasa, PAB (p-aminobenciloxicarbonilo), SPP (4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo), SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo), SIAB ((4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo), y variantes y combinaciones de los mismos. Algunos ejemplos adicionales de enlazadores que se pueden utilizar en el contexto de la presente divulgación se divulgan en, por ejemplo, Patente de EE. UU. N.° 7.754.681 y en Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21:5-13, y las referencias citadas en los mismos, cuyo contenido se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad. En algunos casos, el enlazador es o contiene un espaciador autoinmolable, tal como se ha analizado en Jin, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012, 20:3465-3469 y Wu, et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2016, 24:2697-2706.
Las cargas activas se pueden enlazar al anticuerpo anti-MUC16 o al fragmento de unión a antígeno a través de un enlace en un aminoácido particular dentro del anticuerpo o la molécula de unión a antígeno. Las uniones de aminoácidos ilustrativas que se pueden utilizar en el contexto de este aspecto de la divulgación incluyen, por ejemplo, lisina (véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.208.020; US 2010/0129314; Hollander et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; la patente de EE. UU. n.° 5.714.586; el documento US 2013/0101546; y el documento US 2012/0585592), cisteína (véanse, por ejemplo, el documento US 2007/0258987; el documento w O 2013/055993; el documento WO 2013/055990; el documento WO 2013/053873; el documento WO 2013/053872; el documento WO 2011/130598; el documento US 2013/0101546; y la patente de EE. UU. n.° 7.750.116), selenocisteína (véanse, por ejemplo, el documento WO 2008/122039; y Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 2008, 105:12451-12456), formil-glicina (véanse, por ejemplo, Carrico et al., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 2013, 110:46-51 y Rabuka et al., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067), aminoácidos no naturales (véase, por ejemplo, los documentos Wo 2013/068874 y WO 2012/166559) y aminoácidos ácidos (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/05982). Los enlazadores también se pueden conjugar con una proteína de unión a antígeno mediante la unión a carbohidratos (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0305497 y Ryan et al., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13:127-130) y enlaces disulfuro (véase, por ejemplo, los documentos WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611 y Shaunak et al., Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313).
La proporción del fármaco con respecto al anticuerpo (PFA) es el promedio de fármacos conjugados con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que tiene un efecto importante en la eficacia, potencia y farmacocinética del CAF. En diferentes ejemplos, la PFA es de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 moléculas de fármaco por anticuerpo. En algunos ejemplos, la PFA es de 1 a 4. En determinados ejemplos, la PFA es de 2 a 4. En algunos casos, la PFA es de 2 a 3. En determinados casos, la PFA es de 3 a 4. En algunos ejemplos, la PFA es de 1 a 10, 1 a 20 o 1 a 30 (es decir, de 1 a 30 moléculas de fármaco por anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo).
Formulación terapéutica y administración
La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se formulan con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Se puede encontrar una multitud de formulaciones adecuadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, Pa . Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LlPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de la molécula de unión a antígeno administrada a un paciente puede variar según la edad y la talla del paciente, la enfermedad diana, afecciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida normalmente se calcula de acuerdo con el peso o la superficie corporales. Cuando una molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación se usa con fines terapéuticos en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa la molécula de unión a antígeno biespecífica de la presente divulgación normalmente a una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosis eficaces y los programas para administrar una molécula de unión a antígeno biespecífica pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede controlarse el progreso del paciente mediante evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Asimismo, pueden realizarse aumentos graduales de las dosis entre especies utilizando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
Se conocen diferentes sistemas de suministro y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la divulgación, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y vías orales. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente divulgación puede administrarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y jeringa estándar. Adicionalmente, con respecto al suministro subcutáneo, un dispositivo inyector de pluma tiene aplicaciones fácilmente en el suministro de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.
Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente divulgación. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofiaventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en el suministro subcutáneo de una composición farmacéutica de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi­ aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. En un ejemplo, puede utilizarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otro ejemplo, pueden utilizarse materiales poliméricos; véase, "Medical Applications of Controlled Release", Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. En otro ejemplo más, puede colocarse en las proximidades de la diana de la composición un sistema de liberación controlada, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutánea, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos por el público en general. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, mediante disolución, suspensión o emulsión del anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede utilizarse junto con un agente de solubilización apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., los cuales pueden utilizarse junto con un agente de solubilización tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferentemente en una ampolla apropiada.
De manera ventajosa, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en pautas posológicas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas pautas posológicas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, pastillas, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de las moléculas de unión a antígeno
La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-MUC16 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a CD3 y MUC16. La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos o moléculas de unión a antígeno biespecíficas divulgadas en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "un sujeto que lo necesita" se refiere a un ser humano o animal no humano que presenta uno o más síntomas o indicios de cáncer (por ejemplo, un sujeto que expresa un tumor o padece cualquiera de los cánceres mencionados a continuación) o que, de otro modo, se beneficiarían de una inhibición o reducción de la actividad de MUC16 o de un agotamiento de las células MUC16+ (por ejemplo, células de cáncer de ovario). Sin embargo, los métodos de tratamiento terapéutico no forman parte del método reivindicado.
Los anticuerpos y las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación (y composiciones terapéuticas que los comprenden) son útiles, entre otras cosas, para tratar cualquier enfermedad o trastorno en donde la estimulación, activación y/u orientación de una respuesta inmunitaria sería beneficiosa. En particular, los anticuerpos anti-MUC16 o las moléculas de unión a antígeno biespecíficas anti-CD3/anti-MUC16 de la presente divulgación pueden utilizarse para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por expresión o actividad de MUC16 o proliferación de linfocitos B MUC16+. El mecanismo de acción mediante el cual se logran los métodos terapéuticos de la divulgación incluyen destrucción de células que expresan MUC16 en presencia de células efectoras, por ejemplo, mediante CDC, apoptosis, CCDA, fagocitosis, o por una combinación de dos o más de estos mecanismos. Las células que expresan MUC16 que pueden inhibirse o destruirse usando las moléculas de unión a antígeno biespecíficas de la divulgación incluyen, por ejemplo, células de cáncer de ovario.
Las moléculas de unión a antígeno de la presente divulgación pueden usarse para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión de MUC16, que incluye, por ejemplo, un cáncer, incluido el cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma intrahepático de tipo formador de masa, adenocarcinoma del cuello uterino y adenocarcinoma del tubo gástrico. De acuerdo con determinados ejemplos de la presente divulgación, los anticuerpos anti-MUC16 o los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 son útiles para tratar a un paciente afectado por cáncer de ovario. De acuerdo con otros ejemplos relacionados de la divulgación, se proporcionan métodos que comprenden administrar un anticuerpo anti-MUC16 o una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 como se describe en el presente documento a un paciente que padece cáncer de ovario. Pueden usarse métodos analíticos/diagnósticos conocidos en la técnica, como exploración tumoral, etc., puede utilizarse para determinar si una paciente tiene un tumor de ovario.
La presente divulgación también incluye métodos para tratar el cáncer residual en un sujeto. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cáncer residual" significa la existencia o persistencia de una o más células cancerosas en un sujeto después de tratamiento con una terapia anticáncer.
De acuerdo con determinados aspectos, la presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión de MUC16 (por ejemplo, cáncer de ovario) que comprende administrar una o más de las moléculas de unión a antígeno o biespecíficas anti-MUC16 descritas en otra parte del presente documento a un sujeto después de que se haya determinado que el sujeto tiene cáncer de próstata. Por ejemplo, la presente divulgación incluye métodos para tratar el cáncer de ovario que comprenden la administración de un anticuerpo anti-MUC16 o una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MUC16 a un paciente 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas, 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 1 año o más después de que el sujeto haya recibido terapia hormonal (por ejemplo, terapia antiandrogénica).
Terapias y formulaciones de combinación
La presente divulgación proporciona métodos que comprenden administrar una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los ejemplos de anticuerpos y moléculas de unión a antígeno biespecíficas descritas en el presente documento junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los ejemplos de agentes terapéuticos adicionales que pueden combinarse o administrarse junto con una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, un antagonista de EGFR (por ejemplo, un anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anticuerpo anti-ErbB2, anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvIII (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvIII), un antagonista de cMET (por ejemplo, un anticuerpo anti-cMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R), un inhibidor de B-raf (por ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de PDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-p), un antagonista de VEGF (por ejemplo, una trampa de VEGF, véase, por ejemplo, el documento US 7087411 (también denominado en el presente documento "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib)), un antagonista de DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 divulgado en el documento US 2009/0142354 como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 divulgado en el documento US 2011/0027286 como H1H685P), un antagonista de FOLH1 (PSMA), un antagonista de PRLR (por ejemplo, un anticuerpo anti-PRLR), un antagonista de STEAP1 o STEAP2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-STEAP1 o un anticuerpo anti-STEAP2), un antagonista de TMPRSS2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-TMPRSS2), un antagonista de MSLN (por ejemplo, un anticuerpo anti-MSLN), un antagonista de CA9 (p.ej., un anticuerpo anti-CA9), un antagonista de uroplaquina (p.ej., un anticuerpo antiuroplaquina), etc. Otros agentes que pueden administrarse beneficiosamente junto con las moléculas de unión a antígeno de la divulgación incluyen inhibidores de citocinas, incluyendo inhibidores de citocina de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus receptores respectivos. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación (por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de unión a antígeno biespecífica anti-CD3/anti-MuC16 como se desvela en el presente documento) también pueden administrarse como parte de una pauta terapéutica que comprende una o más combinaciones terapéuticas seleccionadas entre "ICE ": ifosfamida (p.ej., Ifex®), carboplatino (por ejemplo, Paraplatin®), etopósido (por ejemplo, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); "DHAP": dexametasona (por ejemplo, Decadron®), citarabina (por ejemplo, Cytosar-U®, arabinósido de citosina, ara-C), cisplatino (p.ej., Platinol®-AQ); y "ESHAP": etopósido (p.ej., Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), metilprednisolona (p.ej., Medrol®), dosis altas de citarabina, cisplatino (p.ej., Platinol®-AQ).
La presente divulgación también incluye combinaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de las moléculas de unión a antígeno mencionadas en el presente documento y un inhibidor de uno o más de VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIlI, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-p, FOLH1 (PSMA), PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, uroplaquina o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, en donde el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')2 ; fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; u otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Las moléculas de unión a antígeno de la divulgación también pueden administrarse y/o formularse junto con agentes antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticosteroides y/o AlNE. Las moléculas de unión a antígeno de la divulgación también pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento que también incluye tratamiento con radiación y/o quimioterapia convencional.
El/los componente/s terapéuticamente activo/s adicional/es puede/n administrarse justo antes, de manera simultánea o poco después de la administración de una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación; (para los fines de la presente divulgación, dichas pautas de administración se consideran la administración de una molécula de unión a antígeno "junto con" un componente terapéuticamente activo adicional).
La presente divulgación incluye composiciones farmacéuticas en donde una molécula de unión a antígeno de la presente divulgación se formula junto con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.
Regímenes de administración
De acuerdo con determinados ejemplos de la presente divulgación, pueden administrarse dosis múltiples de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti-MUC16 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a MUC16 y CD3) a un sujeto durante un periodo de tiempo definido. Los métodos según este aspecto de la divulgación comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de una molécula de unión a antígeno de la divulgación. Como se utiliza en el presente documento, "administrar de manera secuencial" significa que cada dosis de una molécula de unión a antígeno se administra al sujeto en un momento diferente, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar de manera secuencial al paciente una dosis inicial única de una molécula de unión a antígeno, seguido de una o más dosis secundarias de la molécula de unión a antígeno, y opcionalmente seguido de una o más dosis terciarias de la molécula de unión a antígeno.
Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de la molécula de unión a antígeno de la divulgación. Por tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta de tratamiento (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener la misma cantidad de la molécula de unión a antígeno, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinados ejemplos, sin embargo, la cantidad de una molécula de unión a antígeno contenida en las dosis inicial, secundaria y/o terciaria varían entre sí (p.ej., ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el curso del tratamiento. En determinados ejemplos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis al comienzo de la pauta de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").
En un ejemplo de la presente divulgación, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 31/ 2, 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 141/ 2, 15, 151/ 2, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21,21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se utiliza en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de la molécula de unión a antígeno que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.
Los métodos de acuerdo con este aspecto de la divulgación pueden comprender la administración a un paciente de cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de una molécula de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo anti-MuC16 o una molécula de unión a antígeno biespecífica que se une específicamente a MUC16 y CD3). Por ejemplo, en determinados ejemplos, solo se administra una dosis secundaria única al paciente. En otros ejemplos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias se administran al paciente. Del mismo modo, en determinados ejemplos, solo se administra una dosis terciaria única al paciente. En otros ejemplos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.
En ejemplos que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en ejemplos que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar en el transcurso de la pauta de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico en el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual después del examen clínico.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-MUC16 de la presente divulgación también pueden usarse para detectar y/o medir MUC16, o células que expresan MUC16 en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpos anti-MUC16, o fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de MUC16. Los análisis de diagnóstico ilustrativos para MUC16 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-MUC16 de la divulgación, en donde el anticuerpo anti-MUC16 está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-MUC16 no marcado en aplicaciones de diagnóstico junto con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Otro uso diagnóstico ilustrativo de los anticuerpos anti-MUC16 de la divulgación incluye el anticuerpo marcado con 89Zr, como el marcado con 89Zr-desferrioxamina, con el fin de identificar y rastrear de forma no invasiva las células tumorales en un sujeto (por ejemplo, imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET, Positrón Emission Tomography)). (Véase, por ejemplo, Tavare, R. et al. Cáncer Res. 1 de enero de 2016;76(1):73-82; y Azad, BB. et al. Oncotarget. 15 de marzo de 2016;7(11):12344-58.) Los análisis ilustrativos específicos que pueden usarse para detectar o medir MUC16 en una muestra incluyen el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), RadioInmunoAnálisis (RIA) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, Fluorescence-Activated Cell Sorting).
Las muestras que pueden utilizarse en los análisis de diagnóstico de MUC16 de acuerdo con la presente divulgación incluyen cualquier muestra de tejido o fluido que se pueda obtener de un paciente que contenga cantidades detectables de la proteína MUC16, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles de MUC16 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad anormal de MUC16) se medirán para establecer inicialmente un nivel inicial, o patrón, de MUC16. Este nivel inicial de MUC16 se puede comparar entonces con los niveles de MUC16 medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen una enfermedad o afección relacionada con MUC16 (por ejemplo, un tumor que contiene células que expresan MUC16).
Los ejemplos de muestras de tejidos o fluidos incluyen, pero sin limitación, plasma, suero, ascitis, ovario, útero, cuello uterino, hígado, vejiga, páncreas, estómago, intestino delgado o grueso, vesícula biliar, mama, pulmón, riñón, glándulas salivales y lagrimales, o cualquier neoplasia maligna epitelioide de los mismos. Algunos ejemplos adicionales de muestras de tejidos o fluidos incluyen, pero sin limitación, carcinoma seroso papilar del cuello uterino, adenocarcinoma del endometrio, adenocarcinoma de células claras de la vejiga, carcinoma de vesículas seminales, carcinoma gástrico, adenocarcinoma colorrectal y mesotelioma epitelioide. Se prevé que cualquier muestra de líquido o tejido que contenga cantidades detectables de proteína MUC16, o fragmentos de la misma, puede someterse a los métodos de detección descritos en el presente documento. Los métodos descritos se pueden utilizar para controlar el desarrollo y la progresión de enfermedades malignas, o para distinguir entre estados normales y patologías. De este modo, los métodos descritos se pueden utilizar para detectar o controlar cánceres, tales como el cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón no microcítico, colangiocarcinoma intrahepático de tipo formador de masa, adenocarcinoma del cuello uterino y adenocarcinoma del tubo gástrico.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos enseñan al experto en la materia cómo preparar y utilizar los métodos y las composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones. Salvo que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
Ejemplo 1: generación de anticuerpos anti-MUC16
Los anticuerpos anti-MUC16 se obtuvieron mediante la inmunización de un ratón genomodificado con un antígeno MUC16 humano o mediante la inmunización de un ratón genomodificado que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera k y pesada de inmunoglobulina humana con un antígeno MUC16 humano.
Se inmunizaron ratones genomodificados con hMUC16.nub (un formato truncado que abarca los últimos cinco dominios SEA de la Mucina-16 (SEQ ID: 1902)) o se inmunizaron con una estirpe celular que expresaba hMUC16, tal como las células OVCAR-3. s Eq ID NO: 1902 contiene los restos 13810-14451 de SEQ ID NO: 1899, así como marcadores C-terminales. Después de la inmunización, se extrajeron esplenocitos de cada ratón y (1) se fusionaron con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad y formar células de hibridoma, y se analizaron para determinar la especificidad de MUC16, o (2) se clasificaron los linfocitos B (como se describe en el documento US 2007/0280945A1) mediante un fragmento de MUC16 humana como reactivo de clasificación que se une e identifica anticuerpos reactivos (linfocitos B con antígeno).
Inicialmente se aislaron anticuerpos quiméricos contra MUC16 que tenían una región variable humana y una región constante de ratón. Los anticuerpos se caracterizaron y seleccionaron en cuanto a características deseables, que incluyen afinidad, selectividad, etc. Cuando fue necesario, las regiones constantes de ratón se reemplazaron por una región constante humana deseada, por ejemplo, una región constante de IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada, para generar un anticuerpo anti-MUC16 completamente humano. Aunque la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. Las designaciones de los nombres de los anticuerpos, tales como H1H8755P y H1M7129N, indican anticuerpos completamente humanos "H1H" o anticuerpos quiméricos de región variable humana/constante de ratón "H1M". Los anticuerpos identificados mediante el método de hibridoma se indican con números de identificación de anticuerpos que terminan en "N" o "N2". Los anticuerpos identificados mediante el método de clasificación de linfocitos B se indican con números de identificación de anticuerpos que terminan en "P" o "P2".
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.
Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-MUC16
La Tabla 1 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-MUC16 seleccionados de la divulgación. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se exponen en la tabla 2.
Tabla 1: identificadores de secuencias de aminoácidos
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continuación
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Tabla 2: identificadores de secuencias de ácido nucleico
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Ejemplo 2: los anticuerpos anti-MUC16 se unen específicamente a hMUC16 expresada endógenamente en la estirpe celular OVCAR-3
La capacidad de los anticuerpos anti-MUC16 para unirse específicamente a la expresión endógena de MUC16 en la estirpe de células de carcinoma de ovario humano (OVCAR-3) se evaluó mediante un análisis de detección basado en electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, Maryland). En síntesis, OVCAR-3 y una estirpe de células de adenocarcinoma de ovario de control, SK-OV-3, que no tiene expresión detectable de hMUC16, se enjuagaron en PBS x1 complementado con Ca2+/Mg2+ (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) seguido de la incubación en tampón de disociación de células libres de enzima (Millipore, Billerica, MA) durante 10 min a 37 °C. A continuación, se lavaron las células separadas una vez en PBS x1 complementado con Ca2+/Mg2+ y se contaron (contador de células Cellometer Auto T4, Nexcelom Bioscience, Lorenzo, MA). Se sembraron aproximadamente 1,0 x 104 células en placas de electrodos de carbono (MSD) de 96 pocillos MULTI-ARRAY y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. A continuación, se bloquearon los sitios de unión no específicos con BSA al 2 % (p/v) en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Seguidamente, se añadieron diluciones en serie de anti-MUC16 o anticuerpos de control (0,85 pM-50 nM) y controles de tampón sin anticuerpo a las células unidas a la placa y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente (TA). A continuación, se lavaron las placas para retirar los anticuerpos no unidos utilizando un lavador de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un anticuerpo anti-cadena ligera k humana conjugado con SULFO-TAG™ (Regeneron) o un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con SULFO-TAG™ (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante 1 h a TA. Después del lavado, se revelaron las placas con tampón de lectura (MSD) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se registraron las señales luminiscentes con un instrumento SECTOR Imager 6000 (MSD).
Se registró la intensidad de luminiscencia, medida en unidades relativas de luz (URL), para las dos estirpes celulares para indicar la intensidad de unión de cada anticuerpo. Se notificó la relación de la señal detectada con la unión del anticuerpo anti-MUC16 1,9 nM o 16,7 nM a OVCAR-3 frente a SK-OV-3 como una indicación de la especificidad y la potencia de la unión (Tabla 3).
Tabla 3: proporciones de unión celular de anticuerpos anti-Muc16 para expresar endógenamente OVCAR-3 hMUC16 frente a estir es celulares SK- V-3 sin hMUC16
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Como muestran los resultados en la Tabla 3, la mayoría de los anticuerpos anti-MUC16 de esta divulgación se unieron específicamente a OVCAR-3 a concentraciones de anticuerpo altas (16,7 nM) y bajas (1,9 nM). Los anticuerpos de control de isotipo mlgG1, mlgG2a y hIgG1 no mostraron unión específica con OVCAR-3 ni con la estirpe celular SK-OV-3. Adicionalmente, existen pruebas de que el método es sensible, ya que varios anticuerpos que no mostraron unión a la proteína MUC16 humana monomérica soluble en un ensayo de unión por resonancia de plasmón superficial (véase el Ejemplo 4 a continuación) mostraron unión específica a MUC16 humana endógena expresada en células OVCAR-3 en este análisis de unión a base de células.
Ejemplo 3: generación de anticuerpos biespecíficos que se unen a células específicas de ovario (MUC16) y CD3
La presente divulgación proporciona moléculas de unión a antígeno biespecíficas que se unen a CD3 y MUC16; dichas moléculas de unión a antígeno biespecíficas también se denominan en el presente documento "moléculas biespecíficas anti-MUC16/anti-CD3 o anti-MUC16xCD3". La parte anti-MUC16 de la molécula biespecífica anti-MUC16/anti-CD3 es útil para dirigirse a las células tumorales que expresan MUC16 (también conocida como CA-125), y la parte anti-CD3 de la molécula biespecífica es útil para activar los linfocitos T. La unión simultánea de MUC16 en una célula tumoral y CD3 en un linfocito T facilita la destrucción dirigida (lisis celular) de la célula tumoral diana por parte del linfocito T activado.
Se construyeron anticuerpos biespecíficos que comprenden un dominio de unión específico anti-MUC16 y un dominio de unión específico anti-CD3 mediante metodologías convencionales, en donde el dominio de unión a antígeno anti-MUC16 y el dominio de unión a antígeno anti-CD3 comprenden cada uno diferentes HCVR distintas emparejadas con una LCVR común. En los anticuerpos biespecíficos ilustrados, las moléculas se construyeron mediante una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3, una cadena pesada de un anticuerpo anti-MUC16 y una cadena ligera común del anticuerpo anti-MUC16. En otros ejemplos, los anticuerpos biespecíficos pueden construirse mediante una cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3, una cadena pesada de un anticuerpo anti-MUC16 y una cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 o una cadena ligera de anticuerpo conocida por ser promiscua o emparejarse eficazmente con una variedad de brazos de cadena pesada.
Los anticuerpos biespecíficos descritos en los siguientes ejemplos consisten en brazos de unión anti-CD3 que tienen afinidades de unión variables hacia la proteína hCD3£/8 heterodimérica soluble humana (como se describe en el Ejemplo de referencia 7 del presente documento); y MUC16 humana (véanse los Ejemplos 1-2 anteriores). Los anticuerpos biespecíficos ilustrados se fabricaron con un dominio Fc de IgG1 (BSMUC16/CD3-001, -002, -003 y -004) o un dominio Fc de IgG4 modificado (quimérico) (BSMUC16/CD3-005) como se expone en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° US20140243504A1, publicada el 28 de agosto de 2014.
En la Tabla 4, se muestra un sumario de las partes constituyentes de los dominios de unión a antígeno de los diferentes anticuerpos biespecíficos anti-MUC16xCD3 construidos.
T l 4: m ri l r n i n n i r i ífi n i-M 1 x D l i n
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Las cadenas ligeras enumeradas en la Tabla 4 eran comunes a los brazos dirigidos a CD3 y MUC16 de los anticuerpos biespecíficos. Las Tablas 1 y 2 establecen los identificadores de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos, respectivamente, para las diferentes regiones variables de cadena pesada y sus correspondientes CDR, de los brazos anti-MUC16 de los anticuerpos biespecíficos de este Ejemplo. Las Tablas 22 y 23 establecen los identificadores de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos, respectivamente, para las diferentes regiones variables de cadena pesada y sus correspondientes CDR, de los brazos anti-CD3 de los anticuerpos biespecíficos de este Ejemplo.
Ejemplo 4: afinidades de unión derivadas de resonancia de plasmón superficial y constantes cinéticas de anticuerpos monoclonales humanos monoespecíficos anti-MUC16 y biespecíficos anti-MUC16xCD3
Las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos anti-MUC16 humanos se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial en tiempo real (SPR; Biacore 4000 o Biacore T-200, GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) a 25 °C. Los anticuerpos anti-MUC16 analizados en este ejemplo eran agentes de unión monoespecíficos bivalentes de MUC16 (expresados con una región constante hIgG1 (H1H), mIgG1 (H1M), mIgG2 (H2M) o mIgG3 (H3M)) o anticuerpos biespecíficos que comprendían un dominio de unión anti-MUC16 y un dominio de unión anti-CD3. Los anticuerpos se capturaron en una superficie de sensor Biacore CM4 o CM5 (GE Healthcare Life Sciences) derivatizada mediante acoplamiento de amina con un anticuerpo monoclonal anti-Fc humano (GE, n.° BR-1008-39) o un anticuerpo monoclonal anti-Fc de ratón (GE, n.° BR-1008-38). Se inyectaron diferentes concentraciones de MUC16 humana monomérica soluble, en un formato truncado que abarca los últimos cinco dominios SEA de la Mucina-16 (hMUC16.mmh, o MUC16 "nub", SEQ ID: 1902) sobre la superficie capturada del anticuerpo anti-MUC16 a un caudal de 50 pl/minuto (Biacore T-200) o 30 pl/minuto (Biacore 4000). Se controló la asociación de anticuerpo-reactivo durante 4 min y la disociación durante 6-10 min. Todos los estudios de unión se realizaron en tampón HBS-ET (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v.
Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron ajustando los sensogramas en tiempo real a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes de disociación en equilibrio de unión (Kd) y las semividas disociativas ( t / ) se calcularon a partir de las constantes cinéticas como:
kd(M) = kdka y t / (min) = ln(2)60*kd
En las siguientes Tablas 5A y 5B, se muestran los parámetros cinéticos de unión para los anticuerpos anti-MUC16 monoespecíficos a un fragmento de proteína MUC16 humana monomérica. Los parámetros cinéticos de unión para los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 contra la proteína MUC16 humana monomérica se muestran a continuación en la Tabla 6.
Tabla 5A: afinidades de unión de Biacore de anticuerpos anti-MUC16 de hibridoma (H1M, H2M y H3M) al fra mento hMUC16 a 25 ° C
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Tabla 5B: afinidades de unión de Biacore de anticuerpos anti-MUC16 Fc humanos (H1H) al fragmento hMUC16 a 25 °C
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Tabla 6: afinidades de unión de Biacore de anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 al fragmento hMUC16 a 25 °C
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Como muestran los resultados, la mayoría de los anticuerpos anti-MUC16 de esta divulgación se unieron a la proteína MUC16 humana soluble, mostrando algunos afinidad subnanomolar. Varios anticuerpos (H1M9519N, H1M9521N, H3M9524N, H3M9525N, H1M9528N, H3M9529N) no mostraron unión al formato truncado que abarca los últimos cinco dominios SEA a través de resonancia de plasmón superficial; sin embargo, mostraron unión específica a MUC16 humana endógena expresada en células OVCAR-3 en un ensayo de unión a base de células. Los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16xCD3 de esta divulgación también se unieron a la proteína MUC16 humana truncada soluble que presenta afinidad nanomolar en este análisis.
Ejemplo 5: propiedades de unión adicional, activación de linfocitos T y citotoxicidad de anticuerpos biespecíficos ilustrativos
En este ejemplo, se determinó la capacidad de los anticuerpos biespecíficos MUC16xCD3 para unirse a estirpes celulares humanas que expresan CD3 (linfocitos T humanos), en comparación con la unión a estirpes celulares específicas de diana (específicas de MUC16), a través de FACS. Adicionalmente, también se comparó la capacidad de estos anticuerpos biespecíficos para activar estirpes celulares específicas de la diana (específicas de MUC16) ten un análisis similar.
Valoración de unión de anticuerpos biespecíficos ilustrativos medidos mediante análisis FACS
A. En síntesis, se utilizó un análisis de citometría de flujo (es decir, clasificación de células activadas por fluorescencia o FACS) para determinar la unión de anticuerpos biespecíficos a células Jurkat o células que expresan MUC16 humana, seguido de la detección con un anticuerpo IgG antihumano marcado con ficoeritrina (PE) o marcado con APC. En síntesis, se incubaron 2 x 105 células/pocillo durante 30 minutos a 4 °C con una dilución en serie que varió de 1,33E-07 M a 8,03E-12 M de cada anticuerpo de prueba o control de isotipo (anticuerpo del mismo isotipo que se une a un antígeno diferente sin reactividad cruzada con MUC16 o CD3). Después de la incubación, se lavaron las células dos veces con PBS frío que contenía FBS filtrado al 1 % y se añadió a las células un anticuerpo secundario antihumano conjugado con PE o conjugado con APC, y se incubaron durante 30 minutos más. También se utilizaron como controles pocillos que no contenían anticuerpos o que solo contenían anticuerpos secundarios. Después de la incubación, las células se lavaron, se volvieron a suspender en 200 pl de PBS frío que contenía FBS filtrado al 1 % y se analizaron mediante citometría de flujo en un BD FACS Canto II. Véase la Tabla 7A.
B. En experimentos separados con condiciones análogas a las descritas anteriormente, se utilizó el análisis de citometría de flujo (o FACS) para determinar la unión de anticuerpos biespecíficos seleccionados a células Jurkat, PEO-1, OVCAR3-Luc y linfocitos T de macaco cangrejero. Para el análisis de valoración, la dilución en serie de anticuerpos biespecíficos MUC16xCD3 seleccionados, un primer anticuerpo de control de isotipo (un anticuerpo IgG4 quimérico humano que se une a un antígeno humano irrelevante sin reactividad cruzada con el CD3 humano o de macaco cangrejero) y un segundo anticuerpo de control de isotipo (un anticuerpo IgG4 quimérico humano que se une a un antígeno humano irrelevante sin reactividad cruzada hacia MUC16 humana), variando de 66,6 nM a 0,001 nM. Véase la Tabla 7B y las Figs. 11A-11C.
Para el análisis FACS, las células se clasificaron según la altura de dispersión frontal frente al área de dispersión frontal para la selección de eventos individuales, seguido de dispersiones laterales y frontales. La CE50 para la valoración de la unión celular se determinó utilizando el programa informático PRISM™ (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Los valores se calcularon utilizando un análisis de regresión no lineal de 4 parámetros. (Liu, J., et al. 2005, Biotechnol Letters 27:1821-1827). El valor de CE50 representa la concentración del anticuerpo analizado donde se observa el 50 % de su unión máxima.
Tabla 7A: unión de FACS en estir es celulares es ecíficas de CD3 MUC16
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Tabla 7B: unión de FACS en estir es celulares es ecíficas de CD3 MUC16
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Como se muestra en las Tablas 7A y 7B, los brazos de unión a CD3 de cada anticuerpo biespecífico MUC16 mostraron un intervalo de unión celular a linfocitos T que expresan CD3 humanos y de mono (por ejemplo, de CE50 3,2 nM a unión muy débil). El anticuerpo biespecífico BSMUC16/CD3-001 mostró una alta medición de unión a células que expresan CD3 (es decir, <7 nM), mientras que el anticuerpo biespecífico BSMUC16/CD3-002 mostró una unión débil o nula a células con expresión de CD3 humano y de mono. La unión no medible, en el análisis FACS o análisis equivalente se refiere a una interacción de unión entre el anticuerpo y su antígeno diana que está más allá del límite de detección del ensayo (por ejemplo, igual o superior a 1 pM). Los anticuerpos biespecíficos probados mostraron una unión celular similar en estirpes celulares con expresión de MUC16, lo que confirma que el emparejamiento biespecífico con brazos individuales de CD3 que presentan interacciones altas o débiles (o no medibles) con CD3 no afectó ni disminuyó la unión específica de diana del tumor (la unión específica de MUC16 fue inferior o igual a 3 nM (unión alta) en estos ejemplos. El primer anticuerpo de control no se unió a las células CD3+ y el segundo anticuerpo de control no se unió a las células MUC16+. Véase también las Figs. 11A-11C.
Los anticuerpos que presentan una unión débil o no detectable a CD3 humano todavía se consideran ventajosos para el emparejamiento biespecífico impulsado por la avidez, y se probaron más para determinar la citotoxicidad en análisis in vitro (véase abajo) e in vivo (Ejemplo 8).
Activación de linfocitos T y citotoxicidad específica del tumor presentadas por anticuerpos biespecíficos medidas in vitro
A. La destrucción específica de células diana tumorales que expresan MUC16 en presencia de anticuerpos biespecíficos a base de CD3 se controló mediante citometría de flujo. Como se ha informado anteriormente, los anticuerpos biespecíficos mostraron capacidades de unión diferenciales con la proteína CD3 y las estirpes celulares que expresan CD3 (es decir, unión muy débil o fuerte). Se probó la capacidad de estos mismos anticuerpos biespecíficos para inducir a las linfocitos T humanos indiferenciados a redirigir la destrucción hacia las células que expresan la diana.
En síntesis, las estirpes celulares que expresan MUC16 (OVCAR3) se marcaron con 1 pM del colorante de seguimiento fluorescente Violet Cell Tracker. Después del marcaje, las células se sembraron en placas durante la noche a 37 °C. Por separado, las PBMC humanas se sembraron en placas en medio RPMI complementado a 1 * 106 células/ml y se incubaron durante la noche a 37 °C para enriquecer los linfocitos mediante el agotamiento de macrófagos adherentes, células dendríticas y algunos monocitos. Al día siguiente, las células diana se incubaron junto con PBMC sin estimular agotadas en células adherentes (proporción de célula efectora/célula diana 4:1) y una dilución en serie de anticuerpos biespecíficos en cuestión o control de isotipo (intervalo de concentraciones: 66,7 nM a 0,25 pM) durante 48 horas a 37 °C. Las células se eliminaron de las placas de cultivo celular utilizando un tampón de disociación celular sin enzimas y se analizaron mediante FACS. Véase los resultados representados en la Tabla 8A.
B. En estudios análogos, se marcaron estirpes celulares que expresan MUC16 (PEO-1 u OVCAR3-Luc), se sembraron en placas y se incubaron durante la noche como se describe. Se incubaron conjuntamente diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos MUC16xCD3 o control de isotipo. Véase los resultados representados en las Tablas 8B y 8C y las Figuras 12A-12B.
Para el análisis FACS, las células se tiñeron con un rastreador de glóbulos rojos muertos/vivos (Invitrogen). Se añadieron 5 * 105 perlas de recuento a cada pocillo inmediatamente antes del análisis FACS. Se recogieron 1 * 104 perlas para cada muestra. Para la evaluación de la especificidad de destrucción, las células se seleccionaron en poblaciones vivas marcadas con violeta. Se registró el porcentaje de población viva y se utilizó para el cálculo de la supervivencia normalizada.
La activación de los linfocitos T se evaluó incubando células con anticuerpos directamente conjugados contra CD2, CD69 y/o CD25, e informando el porcentaje de linfocitos T activados precozmente (CD69+) y/o linfocitos T activados tardíamente (CD25+) del total de linfocitos T (CD2+).
Como muestran los resultados de las Tablas 8A-8C, se observó el agotamiento de las células con expresión de MUC16 con anticuerpos biespecíficos anti-MUC16xCD3. Todos los anticuerpos biespecíficos probados activaron y dirigieron los linfocitos T para agotar las células diana con unas CE50 de intervalo picomolar. Adicionalmente, la lisis (agotamiento) de la célula diana observada se asoció con una regulación al alza de CD69 (o CD25) en los linfocitos T CD2+, también con CE50 picomolares (pM).
Notablemente, los resultados de este ejemplo también demuestran que un anticuerpo biespecífico construido con un brazo de unión a CD3 que mostró una unión débil o no medible a la proteína CD3 o a las células con expresión de CD3 (es decir, CD3-VH-G5) siguió conservando la capacidad de activar linfocitos T y mostró una potente citotoxicidad de las células que expresan antígenos tumorales.
Tabla 8A: propiedades de citotoxicidad y activación de linfocitos T de anticuerpos biespecíficos MUC16xCD3 seleccionados
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Tabla 8B: propiedades de citotoxicidad y activación de linfocitos T de anticuerpos biespecíficos MUC16xCD3 seleccionados
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Tabla 8C: propiedades de citotoxicidad y activación de linfocitos T de anticuerpos biespecíficos MUC16xCD3 seleccionados
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Ejemplo 6: cartografía de epítopos basada en intercambio de hidrógeno/deuterio (HID) de anticuerpos anti-Muc16 H4sH8767P, H1H8794P2 y H1H8799P2 que se unen a una parte del dominio C-terminal de hMUC16
Se realizaron experimentos para determinar los restos de aminoácidos de MUC16 dentro de los cinco dominios SEA C-terminales (SEQ ID NO: 1902, denominado en lo sucesivo hMUC16.nub), con el que los anticuerpos anti-MUC16 H4sH8767P, H1H8794P2 y H1H8799P2 interactúan. Con este fin, se utilizó la cartografía de epítopos de intercambio de hidrógeno/deuterio (H/D) con espectrometría de masas (HDX-MS). Una descripción general del método de intercambio H/D se establece en Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; y Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
Los experimentos de HDX-MS se realizaron en una plataforma integrada Waters HDX/MS, que consiste en un sistema Leaptec HDX PAL para el marcaje de deuterio, un Waters Acquity M-Class (administrador auxiliar de disolventes) para la digestión y carga de muestras, un Waters Acquity M-Class (administrador de disolventes pBinary) para el gradiente de columna analítica y un espectrómetro de masas Synapt G2-Si para la medición péctica de masas peptídicas.
La solución de marcaje se preparó en tampón PBS 10 mM en D2O en pD 7,0. Para el marcaje de deuterio, 3,8 pl de hMUC16.nub (12 pmol/pl) o hMUC16.nub premezclados con el anticuerpo anti-MUC16 H4sH8767P, H1H8794P2 o H1H8799P2 en una proporción molar de 2:1 se incubaron con 56,2 pl. Solución de marcaje de D2O para diferentes puntos de tiempo (por ejemplo: control no deuterado = 0 s; marcaje con deuterio: 1 min y 20 min). La deuteración se inactivó transfiriendo 50 pl de muestra a 50 pl de tampón de inactivación preenfriado (TCEP 0,2 M, cloruro de guanidina 6 M en tampón de fosfato 100 mM, pH 2,5) y la muestra mezclada se incubó a 1,0 °C durante dos minutos. A continuación, la muestra inactivada se inyectó en un administrador Waters HDX para la digestión en estirpe con pepsina/proteasa XIII. Los péptidos digeridos se atraparon en una precolumna VanGuard de 2,1 x 5 mm ACQUITY UPLC BEH C18 de 1,7 pm, a 0 °C y se eluyeron a una columna analítica ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 pm, 1,0 x 50 mm para una separación en gradiente de 9 minutos del 5 %-40 % de B (fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua, fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo). El espectrómetro de masas utilizó una tensión del cono de 37 V, un tiempo de exploración de 0,5 s e intervalo de masa/carga de 50-1700 Th.
Para la identificación de los restos peptídicos de hMUC16.nub con los que interactúan H4sH8767P, H1H8794P2 y H1H8799P2, se procesaron los datos de LC-MSE de la muestra no deuterada y se buscaron en una base de datos que incluía secuencias para hMUC16.nub, pepsina y una secuencia aleatoria utilizando el programa informático Waters ProteinLynx Global Server (PLGS). Los péptidos identificados se importaron al programa informático DynamX y se filtraron por dos criterios: 1) productos mínimos por aminoácido: 0,25 y 2) umbral del archivo de replicación: 2. A continuación, el programa informático DynamX determinó automáticamente la captación de deuterio de cada péptido basada en el tiempo de retención y la alta precisión de masa (<10 ppm) en múltiples puntos de tiempo con 3 repeticiones en cada tiempo.
Utilizando la columna en línea de pepsina/proteasa XIII junto con adquisición de datos de MSE, se identificó un total de 109 péptidos de hMUC16.nub en ausencia o presencia de H4sH8767P, lo que representa una cobertura de secuencia del 64 %. Seis péptidos tenían una captación de deuteración significativamente reducida (valores 8 del centroide >0,5 Da desde al menos un punto temporal con valores p <0,05) cuando se unían a H4sH8767P, y se ilustran en la Tabla 9A. La masa peptídica registrada corresponde al valor promedio de la masa de MH+ del centroide de tres repeticiones. Estos péptidos, correspondientes a los aminoácidos 428-434, 453-467 y 474-481 de hMuc16.nub, tenía tasas de deuteración más lentas cuando se unían a H4sH8767P. Estos restos identificados también corresponden a los restos 14237-14243, 14262-14276 y 14283-14290 de hMUC16 según lo definido por la entrada de Uniprot Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ ID NO: 1899.
Tabla 9A. Pé tidos hMUC16.nub con tasas de deuteración alteradas al unirse a H4sH8767P
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Utilizando la columna en línea de pepsina/proteasa XIII junto con adquisición de datos de MSE, se identificó un total de 109 péptidos de hMUC16.nub en ausencia o presencia de H1H8794P2, lo que representa una cobertura de secuencia del 64 %. Tres péptidos tenían una captación de deuteración significativamente reducida (valores 8 del centroide >0,5 Da desde al menos un punto temporal con valores p <0,05) cuando se unían a H1H8794P2, y se ilustran en la Tabla 9B. La masa peptídica registrada corresponde al valor promedio de la masa de MH+ del centroide de tres repeticiones. Estos péptidos, correspondientes a los aminoácidos 126-131, 127-131 y 132-138 de hMuc16.nub, tenían tasas de deuteración más lentas cuando se unían a H1H8794P2. Estos restos identificados también corresponden a los restos 13935-13940, 13936-13940 y 13941-13947 de hMUC16 según lo definido por la entrada de Uniprot Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ ID NO: 1899.
Tabla 9B. Pé tidos hMUC16.nub con tasas de deuteración alteradas al unirse a H1H8794P2
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Utilizando la columna en línea de pepsina/proteasa XIII junto con adquisición de datos de MSE, se identificó un total de 109 péptidos de hMUC16.nub en ausencia o presencia de H1H8799P2, lo que representa una cobertura de secuencia del 64 %. Cuatro péptidos tenían una captación de deuteración significativamente reducida (valores 8 del centroide >0,5 Da desde al menos un punto temporal con valores p <0,05) cuando se unían a H1H8799P2, y se ilustran en la Tabla 9C. La masa peptídica registrada corresponde al valor promedio de la masa de MH+ del centroide de tres repeticiones. Estos péptidos, correspondientes a los aminoácidos 357-369, 358-366, 358-369 y 361-369 de hMuc16.nub, tenían tasas de deuteración más lentas cuando se unían a H1H8799P2. Estos restos identificados también corresponden a los restos 14165-14178, 14166-14176, 14166-14178 y 14170-14178 de hMUC16 según lo definido por la entrada Uniprot Q8WXI7 (MUC16_HUMAN), SEQ ID NO: 1899.
Tabla 9C. Péptidos hMUC16.nub con tasas de deuteración alteradas al unirse a H1H8799P2
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Ejemplo 7: evaluación farmacocinética de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x CD3
La evaluación de la farmacocinética de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16xCD3 BSMUC16/CD3-001 y BSMUC16/CD3-005 y un control de isotipo se llevaron a cabo en ratones MUC16xCD3 humanizados (ratones homocigotos para la expresión de MUC16 y CD3 humano, MUC16 hu/hu x CD3 hu/hu), ratones humanizados CD3 (ratones homocigotos para la expresión de CD3 humano, CD3hu/hu) y ratones de tipo silvestre (TS) emparejados por cepas (75 % C57BL, 25 % 129Sv). Las cohortes contenían de 4 a 5 ratones por anticuerpo probado y por cepa de ratón. Todos los ratones recibieron una sola dosis intraperitoneal (i.p.) de 0,4 mg/kg. Se recogieron muestras de sangre a las 3 y 6 horas, 1,3, 7, 14 y 28 días después de la dosis. La sangre se procesó en suero y se congeló a -80 °C hasta que se analizó.
Las concentraciones de anticuerpos circulantes se determinaron mediante el análisis de anticuerpos IgG humanos totales utilizando el GyroLab xPlore™ (Gyros, Uppsala, Suecia). En síntesis, un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana biotinilado (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se capturó en perlas recubiertas de estreptavidina en un Gyrolab Bioaffy 200 CD (Gyros) para capturar la IgG humana presente en los sueros. Después de la captura en la columna de afinidad, el anticuerpo IgG humano unido en las muestras se detectó con anti-IgG humana de cabra marcado con Alexa-647 (Jackson ImmunoResearch). La señal fluorescente en la columna permitió la detección de la IgG unida y el instrumento leyó las unidades de respuesta (UR). Las concentraciones de las muestras se determinaron mediante la interpolación a partir de una curva convencional que se ajustó utilizando un ajuste de curva logística de 5 parámetros utilizando el programa informático Gyrolab Evaluator. Los parámetros FC se determinaron mediante análisis no compartimental (NCA, Non-Compartmental Analysis) utilizando el programa informático Phoenix®WinNonlin® versión 6.3 (Certara, L.P., Princeton, NJ) y un modelo de dosificación extravascular. Con los respectivos valores de concentración media para cada anticuerpo, todos los parámetros FC, incluida la concentración máxima observada en suero (Cmáx), la semivida estimada observada (t1/2) y el área bajo la curva de concentración frente al tiempo hasta la última concentración medible (ABCúltima) se determinaron mediante una regla trapezoidal lineal con interpolación lineal y ponderación uniforme.
Después de la administración i.p. de los anticuerpos en ratones de TS, los perfiles de concentración de IgG-tiempo totales de BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 y del control de isotipo fueron todos similares, caracterizados primero por una breve distribución del fármaco seguida de una única fase de eliminación del fármaco durante el resto del estudio. Las concentraciones séricas máximas (Cmáx) y la exposición calculada al fármaco (ABCúltima) de los tres anticuerpos fueron comparables (con una diferencia de 1,3 veces entre sí).
Después de la administración i.p. de los anticuerpos en ratones CD3hu/hu, BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 y el control de isotipo tenían concentraciones Cmáx comparables (4,6, 3,6 y 4,1 pg/ml, respectivamente). BSMUC16/CD3-005 y el control de isotipo presentaron curvas de eliminación del fármaco similares, mientras que BSMUC16/CD3-001 presento una eliminación del fármaco más pronunciada que ambos, lo que sugiere que la unión a la diana de CD3 humano impulsa la eliminación. La concentración terminal de anticuerpos para BSMUC16/CD3-001 fue de 0,03 pg/ml, que es aproximadamente 28 veces inferior a las concentraciones de anticuerpos terminales determinadas para el control de isotipo (0,85 pg/ml) y 22 veces inferior a las concentraciones séricas de BSMUC16/CD3-005 (0,66 pg/ml).
En ratones doble humanizados MUC16hu/hu x CD3hu/hu, los anticuerpos de control de isotipo y biespecíficos Muc16 x CD3 tenían concentraciones Cmáx comparables (Intervalo de Cmáx: 4,5 a 6,9 pg/ml). Ambos anticuerpos biespecíficos presentaron una eliminación del fármaco más pronunciada que el control de isotipo, lo que sugiere un efecto mediado por la diana. Las concentraciones terminales de anticuerpos para BSMUC16/CD3-001 y BSMUC16/CD3-005 fueron aproximadamente 29 veces y 2,9 veces inferiores, respectivamente, a las concentraciones terminales de anticuerpos determinadas para el control de isotipo (0 , 8 6 pg/ml).
En la tabla 10, se resumen los datos de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x CD3 totales y las concentraciones de anticuerpos de control de isotipo. Los parámetros FC medios se describen en las tablas 11A y 11B. Las concentraciones medias de anticuerpos totales frente al tiempo se muestran en las Figuras 1, 2 y 3. En conclusión, los anticuerpos biespecíficos MUC16 * CD3 presentaron Cmáx y curvas de eliminación de fármacos en ratones de TS similares, pero BSMUC16/CD3-001 mostró velocidades de eliminación más pronunciadas que BSMUC16/CD3-005 y el control de isotipo en ratones CD3 humanizados simples y ratones humanizados dobles MUC16/CD3. Dado que los anticuerpos biespecíficos administrados en este estudio Fe están compuestos por el mismo brazo de unión anti-MUC16, los resultados sugieren que la fuerza de unión del brazo de dirección c D3 puede desempeñar un papel en los niveles de exposición al fármaco (ABCúltima) y en las velocidades de eliminación de fármacos. Ni BSMUC16/CD3-001 ni BSMUC16/CD3-005 se unen a MUC16 de ratón o CD3 de ratón.
Tabla 10: concentraciones medias de IgG total en suero después de una única inyección intraperitoneal de 0,4 mg/kg de BSMUC16/CD3-001, BSMUC16/CD3-005 y anticuerpos de control de isotipo en ratones de TS, ratones CD3 humanizados ratones MUC16 x CD3 humanizados
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T l 11A: m ri l r m r f rm in i : r n h m niz D h h
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T l 11B: m ri l r m r f rm in i : r n h m niz M 1 h h x D h h l
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Ejemplo 8: los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 muestran una potente eficacia antitumoral in vivo
Para determinar la eficacia in vivo de anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 ilustrativos identificados como de unión débil o no detectable a CD3 humano y de macaco cangrejero, se realizaron estudios en ratones inmunodeprimidos que portaban xenoinjertos de cáncer de próstata humana. La eficacia de los anticuerpos biespecíficos seleccionados se probó tanto en modelos de dosificación de tratamiento inmediato como de tratamiento terapéutico.
Eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 en modelos de xenoinjerto de tumores humanos
Para evaluar la eficacia in vivo de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 en estudios de xenoinjerto de tumores humanos, se implantaron previamente en ratones NOD scid y (NSG) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC; ReachBio LLC., Seattle, WA) y después se les administraron células de ascitis de la estirpe celular de cáncer de ovario humano OVCAR-3 (American Type Tissue Culture, Manassas, VA) transducidas con luciferasa (OVCAR-3/Luc). Las células OVCAR-3 expresan de forma endógena MUC-16.
En síntesis, se inyectaron ratones NSG por vía intraperitoneal (i.p.) con 5,0 x 106 PBMC humanas. 8 d más tarde, 1,5 x 10 6 células de ascitis de la estirpe celular OVCAR-3/Luc, previamente pasadas in vivo, se administraron i.p. a los ratones NSG injertados con PBMC. En el grupo de tratamiento inmediato, los ratones se trataron i.p. el día de la implantación de las células OVCAR-3/Luc con anticuerpos biespecíficos MUC16/CD3 BSMUC16/CD3-001 o BSMUC16/CD3-005, o un control de isotipo, a una dosis de 10 pg/ratón (N = 5 ratones/grupo de tratamiento). En el modelo de dosis terapéutica, los ratones se trataron i.p. 7 d después de la implantación del tumor con los anticuerpos de control o biespecíficos MUC16/CD3 descritos anteriormente, a una dosis de 10 pg/ratón (N = 5/grupo de tratamiento).
En todos los estudios, el crecimiento tumoral se controló mediante imágenes bioluminiscentes (BLI, "BioLuminescent Imaging"). A los ratones se les inyectó i.p. el sustrato de luciferasa D-luciferina suspendido en PBS (150 mg/kg) y se obtuvieron imágenes bajo anestesia con isoflurano después de 10 min. Se realizó BLI utilizando el sistema Xenogen IVIS (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) y las señales BLI se extrajeron utilizando el programa informático Living Image (Xenogen/Perkin Elmer). Las regiones de interés se dibujaron alrededor de cada masa celular y las intensidades de los fotones se registraron como fotones (p)/segundo (s)/cm2/estereorradián (sr). Para el grupo de tratamiento inmediato, los datos se muestran como niveles de BLI 26 d después de la implantación del tumor (Tabla 12A). Para el grupo de tratamiento terapéutico, los datos se muestran como factor de cambio en BLI entre el día 6 (1 d antes del tratamiento) y en el momento final del estudio (26 d después de la implantación del tumor; Tabla 12B).
Como muestran los resultados, tanto BSMUC16/CD3-001 como BSMUC16/CD3-005 mostraron una eficacia similar en la supresión del crecimiento tumoral en comparación con el control de isotipo cuando se midieron las BLI el día 26 en el modelo de dosificación inmediata. Ambos anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 también suprimieron el crecimiento de tumores establecidos cuando se administraron 7 d después de la implantación del tumor, en comparación con el control. Resumiendo, los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 de esta divulgación muestran una potente eficacia antitumoral en varios modelos.
Tabla 12A: eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16/anti-CD3 en el modelo de xenoinjerto inmunode rimido: dosificación inmediata
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Tabla 12B: eficacia de los anticuerpos biespecíficos anti-Muc16/anti-CD3 en el modelo de xenoinjerto inmunode rimido: tratamiento tera éutico
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En experimentos adicionales, se evaluó la eficacia in vivo de un anticuerpo biespecífico anti-MUC16/anti-CD3 en modelos tumorales xenogénicos y singénicos. Para el primer modelo xenogénico, a los ratones NSG se les inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) células OVCAR-3/Luc pasadas previamente in vivo (Día 0) once días después del injerto con PBMC humanas. Los ratones se trataron i.p. con 0,01, 0,1 o 0,5 mg/kg de BSMUC16/CD3-001, o recibieron 0,5 mg/kg de control sin unión o control con unión a CD3 los Días 6, 10, 13, 16 y 21. La carga tumoral se evaluó mediante BLI en los Días 6, 14 y 20 posteriores a la implantación del tumor. El tratamiento con 0,1 o 0,5 mg/kg de BSMUC16/CD3-001 produjo en una eficacia antitumoral significativa según lo determinado por las mediciones de BLI el Día 20, como se muestra en las Tablas 13A-C y en las Figuras 4-6. Para el segundo modelo xenogénico, a los ratones NSG se les inyectaron células OVCAR-3/Luc previamente pasadas in vivo (Día 0) trece días después del injerto con PBMC humanas y se transfirió un segundo lote de PBMC el Día 4. Los ratones se trataron por vía intravenosa (I.V.) con 0,1, 0,5, 1 o 5 mg/kg de BSMUC16/CD3-005 o recibieron 5 mg/kg de control sin unión o control con unión a CD3 los Días 5, 8, 12, 15, 19 y 22. La carga tumoral se evaluó mediante BLI los Días 4, 11, 18 y 25. El tratamiento con 0,5, 1 o 5 mg/kg de BSMUC16/CD3-005 produjo una eficacia antitumoral significativa, según lo mostrado por las mediciones de BLI y los factores de cambio (Tablas 13D-F y Figuras 7-9). Para examinar la eficacia en un modelo inmunocompetente, se reemplazó el gen CD3 murino por CD3 humano, y una parte del gen MUC16 de ratón se reemplazó por la secuencia humana. Los reemplazos produjeron un ratón cuyos linfocitos T expresaban CD3 humano y que expresaban una molécula MUC16 quimérica que contenía una parte de MUC16 humana donde se une el anticuerpo biespecífico BSMUC16/CD3-001. Para el modelo tumoral singénico, se utilizaron estirpes de células ID8-VEGF genomodificadas para que expresaran la parte de MUC16 humana. Se implantaron ratones con células ID8-VEGF/huMUC16 por vía subcutánea y se trataron con 100 |jg de BSMUC16/CD3-001 el día de la implantación o diez días después de la implantación cuando se establecieron los tumores. El tratamiento con 100 jg de BSMUC16/CD3-001 produjo una eficacia antitumoral significativa, como se muestra en la Tabla 13G y la Figura 10.
Implantación y medición de tumores xenoinjertados: se administraron i.p. células de ascitis de la estirpe de células oVCAR-3/Luc, previamente pasadas in vivo a los ratones NSG previamente injertados con PBMC humanas. La midió la BLI como una lectura del crecimiento tumoral varios días después de la implantación de OVCAR-3/Luc y en múltiples momentos durante el estudio. Después de la medición inicial de BLI para la cohorte, los ratones se dividieron en grupos de 4-6 animales cada uno y se les administró anticuerpos de control o biespecíficos MUC16xCD3 dos veces a la semana durante todo el estudio.
Cálculo del crecimiento y de la inhibición de tumores xenoinjertados: se utilizaron imágenes de bioluminiscencia para medir la carga tumoral. Se inyectaron a los ratones i.p. 150 mg/kg (según lo determinado por los pesos corporales al comienzo del experimento) del sustrato de luciferasa D-luciferina suspendido en PBS. Diez minutos después de la dosificación, se tomaron imágenes BLI de los ratones bajo anestesia con isoflurano mediante el sistema Xenogen IVIS. La adquisición de imágenes se llevó a cabo con el campo de visión en D, altura del sujeto de 1,5 cm y nivel de binning medio para un tiempo de exposición de 0,5 min. Las señales de las BLI se extrajeron utilizando el programa informático Living Image. Se dibujaron regiones de interés alrededor de cada masa tumoral y se registraron las intensidades de los fotones como p/s/cm2/sr. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa informático GraphPad Prism (Versión 6). La significación estadística para los resultados de BLI se determinó mediante una prueba de la t de Mann-Whitney no paramétrica para datos independientes. Los factores de cambio se calcularon mediante la Fórmula: (Día 20-Día 6)/Día 6 para el estudio 1 y (Día 25-Día 4)/Día 4 para el estudio 2.
Implantación y medición de tumores singénicos: se implantaron 10e6 células ID8-VEGF/huMUC16 por vía subcutánea (s.c.) en los ratones que expresaban CD3 humano y una quimera humana-murina de MUC16 en los locus de ratón correspondientes. A los ratones se les administró BSMUC16/CD3-001 o un control de unión a CD3 i.p., dos veces a la semana durante todo el estudio. El tratamiento comenzó el Día 0 o el Día 10 después de la implantación. El crecimiento tumoral se midió con calibradores dos veces a la semana. Los ratones se sacrificaron 47 días después de la implantación del tumor.
Cálculo del crecimiento y la inhibición de tumores singénicos: para determinar el volumen tumoral con un calibrador externo, se determinó el mayor diámetro longitudinal (longitud) y el mayor diámetro transversal (anchura). El volumen tumoral basado en las medidas del calibrador se calculó mediante la Fórmula: Volumen = (longitud x anchura2)/2. La significación estadística se determinó utilizando una prueba de la t de Mann-Whitney no paramétrica para datos independientes.
La eficacia antitumoral del anticuerpo biespecífico BSMUC16/CD3-001 en los modelos tumorales xenogénicos y singénicos in vivo se muestra en las Tablas 13A-D, a continuación.
Tabla 13A: estudio 1 del modelo OVCAR-3. Nivel de bioluminiscencia en el Día 6 después de la implantación del tumor
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Tabla 13B: estudio 1 del modelo OVCAR-3. Nivel de bioluminiscencia en el Día 20 después de la implantación del tumor
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Tabla 13C: estudio 1 del modelo OVCAR-3. Factor de cambio en BLI entre el Día 6 y el Día 20 después de la im l n i n l m r
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Tabla 13D: estudio 2 del modelo OVCAR-3. Nivel de bioluminiscencia en el Día 4 después de la implantación del tumor
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Tabla 13E: estudio 2 del modelo OVCAR-3. Nivel de bioluminiscencia en el Día 25 después de la implantación del tumor
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Tabla 13F: estudio 2 del modelo OVCAR-3. Factor de cambio en BLI entre el Día 4 y el Día 25 después de la im l n i n l m r
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Tabla 13G: modelo ID8-VEGF/huMUC16. Tamaño del tumor mm3 en el Día 47
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Ejemplo de referencia 1: preparación y caracterización de conjugados
Todos los anticuerpos monoclonales se expresaron en células CHO y se purificaron con Proteína A. También se preparó un control de isotipo de manera similar. El anticuerpo de control de isotipo sin unión se derivó de un antígeno inmunológico que no tenía relación con la oncología.
El anticuerpo (10 mg/ml) en HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5, se trató con ditiotreitol 1 mM a 37 °C durante 30 min. Después de la filtración en gel (G-25, acetato de sodio a pH 4,5), se añadió uno de los derivados de la carga activa del enlazador de maleimido, el Compuesto 7 o el Compuesto 10 (véase la Tabla 14) (1,2 equivalentes/grupo SH) en DMSO (10 mg/ml) al anticuerpo reducido, y se ajustó la mezcla a pH 7,0 con HEPES 1 M ( pH 7,4). El Compuesto 7 y el Compuesto 10, y los métodos para fabricación de los compuestos, se describen en la publicación PCT n.° WO2014/145090, publicada el 18 de septiembre de 2014, y la publicación PCT n.° WO2016/160615, publicada el 6 de octubre de 2016, respectivamente, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Después de 1 h, se inactivó la reacción con un exceso de N-etil-maleimida. Los conjugados se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se filtraron en condiciones estériles. Las concentraciones de carga activa de proteína y enlazador se determinaron mediante análisis espectral UV. La HPLC de exclusión por tamaño estableció que todos los conjugados utilizados eran >95 % monoméricos. Los rendimientos se notifican en la Tabla 14 basándose en las determinaciones de proteínas. Todos los anticuerpos conjugados se analizaron mediante UV para determinar los valores de carga activa del enlazador según Hamblett et al., Cáncer Res 2004 107063. Los resultados se resumen en la Tabla 14.
Un conjugado que comprende el Compuesto 60 se puede preparar mediante un método similar. El Compuesto 60 y los métodos de fabricación del compuesto, se describen en la publicación PCT n.° WO2016/160615 (Ejemplo 20), publicada el 6 de octubre de 2016, que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad. El Compuesto 60 es Maitansin-N-metil-L-alanina-(3-metoxi-4-amino)benzamido-Cit-Val-Cap-Mal.
Tabla 14: sumario de la carga activa (fármaco quim iotóxico) y los parámetros del conjugado de anticuerpofármaco
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Ejemplo de referencia 2: los conjugados de fármaco con anticuerpo anti-MUC16 son potentes inhibidores del crecim iento tumoral en modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata con expresión de MUC16 in vivo
Para determinar la eficacia in vivo de los anticuerpos anti-MUC16 conjugados con el Compuesto 7 y el Compuesto 10, se realizaron estudios en ratones inmunodeprimidos portadores de xenoinjertos de cáncer de ovario con expresión de MUC16.
Para estos estudios, se implantaron en ratones hembra SCID (Taconic, Hudson NY) células OVCAR3 [NIH:OVCAR-3 (OVCAR3, ATCC HTB-161)] transfectadas con luciferasa (OvCAR3/luc) que expresan endógenamente MUC16. Para los tumores intraperitoneales (i.p.), los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y recibieron anticuerpos anti-MUC16 conjugados con fármaco (véase el Ejemplo de referencia 1), un anticuerpo conjugado sin unión o vehículo después de la detección de la señal luminiscente del tumor. Para los xenoinjertos subcutáneos (s.c.), una vez que los tumores habían alcanzado un volumen medio de 200 mm3 (-Día 16), los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento y recibieron anticuerpos anti-MUC16 conjugados con fármaco, un anticuerpo conjugado sin unión o vehículo. En estos estudios in vivo, se administraron los anticuerpos y luego se controlaron los tumores hasta que se desarrolló ascitis o hasta que se alcanzó un tamaño tumoral promedio de aproximadamente 1200 mm3 en la cohorte a la que solo se administró vehículo. En este punto, se calculó la inhibición del crecimiento tumoral.
En un estudio intraperitoneal (i.p.) inicial, se examinó la eficacia de anticuerpos anti-MUC16 ilustrativos conjugados con el Compuesto 7 en la reducción de la señal luminiscente de OVCAR3/luc. Los ratones recibieron cuatro dosis una vez a la semana de CAF anti-MUC16 y de control a 85 pg/kg de equivalente farmacológico en función de las proporciones de fármaco:anticuerpo de los CAF. Como se resume en la Tabla 15A, H1H9519N-Compuesto 7 y HlH9521N-Compuesto 7 inhibieron potentemente el crecimiento del tumor con ascitis. Estos CAF anti-MUCl6 redujeron eficazmente el tamaño de los tumores, con una reducción del 100 por cien en la luminiscencia del tumor en relación con el control del vehículo. El CAF de control no medió en ninguna inhibición del crecimiento de células tumorales con ascitis OVCAR/luc.
En la Tabla 15B se resume un estudio adicional que evalúa la eficacia de los CAF anti-MUC16 contra el tumor subcutáneo (s.c.) OVCAR3/luc. Los ratones recibieron cuatro dosis una vez a la semana de CAF anti-MUC16 y de control a 85 pg/kg de equivalente farmacológico en función de las proporciones de fármaco:anticuerpo de los CAF. Al conjugarse al Compuesto 7, los CAF MUC16 H1H9519N-Compuesto 7 y H1H9521N-Compuesto 7 produjeron nuevamente un efecto antitumoral significativo; esta vez contra los tumores OVCAR3/luc subcutáneos. Por consiguiente, estos CAF mediaron una inhibición del 100 % y del 109 % del crecimiento tumoral, respectivamente. El CAF de control no medió ninguna inhibición del crecimiento del tumor OVCAR/luc subcutáneo.
En un tercer estudio, se evaluó la eficacia del anticuerpo anti-MUC16 H1H9521N conjugado con el fármaco enlazador Compuesto 10 en el modelo de tumor OVCAR3/luc i.p. Los ratones recibieron dosis únicas de CAF anti-MUC16 y de control a 85 pg/kg, 170 pg/kg y 340 pg/kg de equivalente farmacológico en función de las proporciones de fármaco:anticuerpo del CAF. Como se resume en la Tabla 15C, H1H9519N-10 inhibió potentemente el crecimiento de los tumores con ascitis. Las dosis de H1H9519N-Compuesto 10 produjeron una inhibición del 99-100 % de la luminiscencia tumoral en relación con el control del vehículo. Se observó cierta inhibición con el CAF de control mediante el Compuesto 10 aunque esta fue más moderada que la observada después de anti-MUC16 H1H9519N-Compuesto 10.
Tabla 15A: inhibición del crecimiento de tumor OVCAR3/luc i.p. en el Día 49 en ratones SCID tratados con n i r n i-M 1 n n l m 7
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Tabla 15B: inhibición del crecimiento de tumor OVCAR3/luc s.c. en el Día 37 en ratones SCID tratados con n i r n i-M 1 n n l m 7
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Tabla 15C: inhibición del crecimiento de tumor OVCAR3/luc i.p. en el Día 49 en ratones SCID tratados con n i r n i-M 1 n n l m 1
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Ejemplo de referencia 3: generación de anticuerpos anti-CD3
Los anticuerpos anti-CD3 se obtuvieron mediante la inmunización de un ratón genomodificado que comprendía ADN codificante de regiones variables de cadena ligera k y pesada de inmunoglobulina humana con células que expresaban CD3 o con ADN codificante de CD3. La respuesta inmunitaria de los anticuerpos se controló mediante un inmunoanálisis específico de CD3. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar estirpes celulares que producían anticuerpos específicos de CD3. Mediante esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-CD3 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón). Adicionalmente, se aislaron varios anticuerpos anti-CD3 totalmente humanos directamente de linfocitos B que expresaban el antígeno sin fusión con células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos del presente documento.
Ejemplo de referencia 4: secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico de la región variable de las cadenas pesada y ligera
La Tabla 16 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 seleccionados de la divulgación. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se exponen en la tabla 17. Los métodos para producir los anticuerpos anti-CD3 divulgados en el presente documento también se pueden encontrar en la publicación de EE. UU. 2014/0088295.
Tabla 16: identificadores de secuencias de aminoácidos
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Tabla 17: identificadores de secuencias de ácido nucleico
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Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: Prefijo Fc (por ejemplo, "H1H", "H1M", "H2M", etc.), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "2712", "2692", etc., como se muestra en la Tabla 1), seguido de un sufijo "P", "N", o "B". Por tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H1H2712N", "H1M2692N", "H2M2689N", etc. Los prefijos H1H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo utilizadas en el presente documento indican el isotipo de la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H1H" tiene una Fc de IgG1 humana, un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, y un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón, (todas las regiones variables son completamente humanas, como se indica con la primera "H" en la denominación del anticuerpo). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular se puede convertir en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con una Fc de IgG1 de ratón se puede convertir en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en la Tabla 1, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.
Las Tablas 18 y 19 establecen los identificadores de secuencias de aminoácidos para regiones variables de cadena pesada (Tabla 18) y regiones variables de cadena ligera (Tabla 19) y sus correspondientes CDR, de HCVR y LCVR anti-CD3 adicionales útiles en los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x anti-CD3 de la divulgación.
T l 1 n i min i l r i n v ri l n
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Tabla 19 secuencias de aminoácidos de la re ión variable de cadena li era
Figure imgf000077_0003
Las regiones variables de cadena ligera y pesada de CD3-VH-F y CD3-VL-F se derivaron del anticuerpo anti-CD3 denominado "L2K" como se expone en el documento WO2004/106380.
Adicionalmente, las Tablas 20 y 21 establecen los identificadores de secuencia para las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada (Tabla 20) y las regiones variables de cadena ligera (Tabla 21) y sus correspondientes CDR, de HCVR y LCVr anti-CD3 adicionales útiles en los anticuerpos biespecíficos anti-MUC16 x anti-CD3 de la divulgación.
)
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Tabla 21 secuencias de nucleótidos ue codifican secuencias de la re ión variable de cadena ligera)
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Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos
Se incluyeron diferentes construcciones de control (anticuerpos anti-CD3) en los siguientes experimentos con fines comparativos: "OKT-3", un anticuerpo monoclonal de ratón contra antígenos de superficie de linfocitos T humanos disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el n.° de catálogo CRL-8001; y "SP34", un anticuerpo monoclonal de ratón disponible en el mercado, obtenido, por ejemplo, de Biolegend, San Diego, CA (Cat. n.° 302914) o BD Pharmagen, Cat. 55052, reactivo contra la cadena £ del complejo T3 en linfocitos T humanos.
Ejemplo de referencia 5: generación de anticuerpos anti-CD3 adicionales
Los siguientes procedimientos tenían como objetivo identificar anticuerpos que reconocían de manera específica CD3 (correceptor de linfocitos T) como un antígeno.
Una combinación de anticuerpos anti-CD3 se derivó de un ratón modificado genéticamente. En síntesis, se inmunizaron ratones con un antígeno CD3 y generaron linfocitos B que comprendían una diversidad de reordenamientos de VH humana para expresar un repertorio diverso de anticuerpos específicos de antígeno de afinidad elevada. Los anticuerpos descritos en las Tablas 22-25 tienen la misma secuencia de cadena ligera de VK1-39JK5 (LCVR expuesta en SEQ ID NO: 1890).
Se probó la unión de los anticuerpos generados al antígeno CD3 humano y de macaco cangrejero en un ensayo de unión in vitro y, por ejemplo, se identificó un anticuerpo CD3: designado CD3-VH-P (HCVR establecida en s Eq ID NO: 1882), entre algunos otros, que resultaron unirse a CD3 humanos y de macaco cangrejero que tenían una CE50 de entre 1 y 40 nM de unión (o valoración de unión celular), según se determina en una valoración de FACS de células Jurkat y linfocitos T de macaco, respectivamente. Véase también, por ejemplo, los experimentos de unión de FACS esbozados en el Ejemplo de referencia 7 y en el documento PCT/US2016/044732 presentado el 29 de julio de 2016.
Posteriormente se identificaron los restos de aminoácidos de la estirpe germinal de CD3-VH-P (el reordenamiento de V-D-J para CD3-VH-P es IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01) y se genomodificó un anticuerpo denominado "CD3-VH-G" para contener solo marcos de la estirpe germinal. Se genomodificaron otros derivados de anticuerpos mediante técnicas de clonación molecular muy conocidas para reemplazar restos de aminoácidos de manera escalonada basándose en las diferencias entre la secuencia de la estirpe germinal y la secuencia de CD3-VH-P. A cada derivado de anticuerpo se le asigna un número de denominación "CD3-VH-G". Véase la Tabla 18.
Mientras que CD3-VH-G y algunos otros anticuerpos genomodificados conservaron su unión como se vio en los análisis FACS, varios anticuerpos anti-CD3 se unieron al CD3 humano o de macaco cangrejero in vitro con una unión débil o no medible, tal como CE50 de 40 nM. Posteriormente, se investigaron las afinidades de unión, la cinética de unión y otras propiedades biológicas para dilucidar la toxicidad y los perfiles farmacocinéticos (pK) de los anticuerpos biespecíficos que comprendían los anticuerpos anti-CD3 ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo, descritos en detalle en los ejemplos del presente documento.
Ejemplo de referencia 6: regiones variables de cadena pesada y ligera (Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de las CDR)
La Tabla 22 establece los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y las CDR de anticuerpos anti-CD3 seleccionados de la divulgación. Los identificadores de secuencias de ácido nucleico correspondientes se exponen en la Tabla 23.
Se determinaron las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos para cada secuencia de cadena pesada de anticuerpo. A cada cadena pesada de anticuerpo derivada de la secuencia de la estirpe germinal (SEQ ID NO: 1910), se le asignó una designación de número "G" para una nomenclatura coherente. La Tabla 22 muestra los identificadores de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y las CDR de los anticuerpos anti-CD3 genomodificados de la divulgación. Los identificadores de secuencias de ácido nucleico correspondientes se exponen en la Tabla 23. Los identificadores de secuencia de aminoácidos y ácidos nucleicos de la región variable de la cadena ligera y las CDR también se identifican a continuación en las Tablas 24 y 25, respectivamente.
Tabla 22: identificadores de secuencia de aminoácidos de cadena esada
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T l 2: i nifi r n i ^ i n l i n
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continuación
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Tabla 24: identificadores de secuencia de aminoácidos de cadena li era
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Tabla 25: identificadores de secuencia de ácidos nucleicos de cadena li era
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El anticuerpo de control 1 denominado "CD3-L2K" se construyó basándose en un anticuerpo anti-CD3 conocido (es decir, el anticuerpo anti-CD3 "L2K" como se expone en el documento WO2004/106380).
El anticuerpo de control de isotipo, mencionado en los ejemplos del presente documento, es un anticuerpo de isotipo coincidente (IgG4 modificado) que interactúa con un antígeno irrelevante, es decir, antígeno FeID1.
Ejemplo de referencia 7: estudios in vitro e in vivo de anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos
Los estudios in vivo e in vitro de los anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos se realizaron como se describe en la publicación de EE. UU. 2014/0088295, publicada el 27 de marzo de 2014, y en el documento PCT/US2016/044732, presentado el 29 de julio de 2016, que se incorporan en el presente documento a modo de referencia.
Algunos anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos de la presente divulgación se unen a la proteína CD3 heterodimérica soluble, en formatos de captura de anticuerpos o de captura de antígenos, con alta afinidad. La proteína CD3 heterodimérica soluble (hCD3-£/hCD3-8; SEQ ID NO: 1900/1901) se preparó con un marcador Fc humano (hFcAAdp/hFc; SEQ ID NO: 1931/1932) o un marcador Fc de ratón (mFcAAdp/mFc; SEQ ID NO: 1933/1934). La proteína CD3 heterodimérica se purificó mediante el método descrito en Davis et al. (documento US2010/0331527).
Algunos anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos de la divulgación se unieron a los linfocitos T humanos e indujeron la proliferación de linfocitos T. Algunos anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos de la divulgación se unieron a los linfocitos T de mono CD2+CD4+ e indujeron su proliferación. Algunos anticuerpos anti-CD3 monoclonales humanos apoyaron la destrucción mediada por linfocitos T redirigida a través de la interacción de Fc/FcR en un análisis de destrucción deU937 a base de calceína. La destrucción observada, que se cree que depende de la unión de Fc del anticuerpo con el receptor Fc en las células U937, lo que conduce a la agrupación de CD3 en los linfocitos T adyacentes, se suprimió mediante la adición de IgG humana no específica (datos no mostrados). Una amplia selección de anticuerpos biespecíficos construidos con variantes del brazo anti-CD3 descritas en el presente documento (particularmente brazos anti-CD3 basados en la cadena pesada CD3-VH-P derivada de IGHV3-9*01, IGHJ6*02, IGHD5-12*01) activan las células PBMC humanas y PBMC de mono, y muestran actividad citotóxica en estirpes celulares que expresan antígenos tumorales.
Ejemplo de referencia 8: detección e identificación de anticuerpos anti-MUC16 monoclonales adecuados para inmunohistoquímica (IHQ) en muestras incluidas en parafina fijada en formalina (FFPE, Formalin Fixed Paraffin Embedded).
Se identificaron estirpes celulares tumorales humanas con niveles conocidos de expresión de MUC16, se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % y se incluyeron en parafina. Estas estirpes se utilizaron para cribar diferentes anticuerpos anti-MUC16 a fin de identificar candidatos para los estudios de IHQ.
Las estirpes celulares incluyeron las siguientes estirpes celulares sin expresión de MUC16:
HT29 (colon) y PC3/ATCC parental (próstata); estirpes de células pancreáticas con niveles bajos o nulos de MUC16: Capan1 (adenocarcinoma de páncreas), HPAC (adenocarcinoma de páncreas).
Las estirpes celulares que expresan endógenamente MUC16 incluyen: OVCAR3 (ovario) y PEO-1 (carcinoma seroso de ovario).
Las estirpes celulares transfectadas se genomodificaron de la siguiente manera: se transfectaron células PC3/ATCC (estirpe de cáncer de próstata parental) para generar estirpes celulares PC3/MUC16 "cortas" y PC3/MUC16 "altas". Ambas construcciones incluyen el dominio C-terminal de MUC16 de los aminoácidos 13.810-14.507 (de SEQ ID NO: 1899), y esto incluye parte del dominio SEA12, SEA13, SEA14, SEA15, SEA16, la región C-terminal no SEA, la región transmembrana y el dominio citoplasmático. Adicionalmente, las células PC3/MUC altas tienen aminoácidos N-terminales adicionales 12783-13467 (de SEQ ID NO: 1899) que incluyen de SEA5 (parcial) a SEA9 y un enlazador corto entre el dominio SEA9 y el inicio de la construcción corta de MUC16. Esto permite la diferenciación entre los anticuerpos anti-MUC16 que se unen en la región repetida y los que se unen a la parte "nub" de MUC16 adyacente a la membrana después de la escisión enzimática y la liberación de las regiones repetidas (análogas a la parte CA125 de MUC16).
Toda la tinción se realizó en el sistema de tinción automática Ventana Discovery XT mediante protocolos convencionales. Los sedimentos celulares se desparafinizaron, se optimizó la recuperación de epítopos inducida por calor, se bloqueó la biotina endógena y se realizó el bloqueo de proteínas. Los anticuerpos se aplicaron manualmente a una concentración inicial de 10 pg/ml y también se valoraron para garantizar la especificidad de la señal. Se realizó una comparación con un anticuerpo anti-MUC16 disponible en el mercado (OC-125), que es específico de las regiones repetidas de CA-125 (Roche, Ventana n.° de catálogo 760-2610), y un control negativo (ausencia de anticuerpo primario). La detección se realizó con biotina de burro anti-ratón seguida de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. La conversión del sustrato, di-amino-bencidina (DAB), se observó como una tinción marrón. Las muestras se contrastaron con hematoxilina para visualizar los núcleos. Los resultados de los experimentos de tinción se presentan en la Tabla 26, a continuación.
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Cuatro de los anticuerpos probados (H1M7130N, H2aM7128N, H2aM7131N y H2aM7138N) mostraron una unión positiva a las células que expresaban la parte "nub" de MUC16 sin las regiones repetidas (PC3/MUC16 corta). Estos anticuerpos se identifican como "con unión a nub". Uno de los anticuerpos probados (H1M9519N) mostró una unión positiva a las células que expresaban las regiones repetidas de MUC16 (PC3/MUC16 altas), pero una unión negativa a las células que solo expresaban la parte "nub" de MUC16 (PC3/MUC16 cortas). Este anticuerpo se identifica como un "con unión a repetición", similar al anticuerpo OC-125 disponible en el mercado. Se espera que los anticuerpos probados se unan a tejidos o células de diferente origen que tengan las proteínas y/o los fragmentos de proteínas expresados como se describe en el presente documento.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado que se une a MUC 16 humana dentro de los restos 14237 a 14290 de SEQ ID NO: 1899, y que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 20, 22, 24, 28, 30 y 32, respectivamente.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
3. Un método para detectar MUC16 en una muestra biológica que se ha obtenido de un sujeto, que comprende: detectar si MUC16 está presente en la muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, y detectar la unión entre MUC16 y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.
4. El método de la reivindicación 3, en donde la muestra biológica es una muestra de tejido o de fluido seleccionada entre plasma, suero, ascitis, ovario, útero, cuello uterino, hígado, vejiga, páncreas, estómago, intestino delgado o grueso, vesícula biliar, mama, pulmón, riñón, glándulas salivales y lagrimales, o cualquier neoplasia maligna epitelioide de los mismos.
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