EA045943B1 - Биспецифичные антитела анти-psma x анти-cd28 и их применения - Google Patents
Биспецифичные антитела анти-psma x анти-cd28 и их применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA045943B1 EA045943B1 EA202190089 EA045943B1 EA 045943 B1 EA045943 B1 EA 045943B1 EA 202190089 EA202190089 EA 202190089 EA 045943 B1 EA045943 B1 EA 045943B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- psma
- antibody
- bispecific
- amino acid
- Prior art date
Links
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 title claims description 102
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 456
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 388
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 387
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 387
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 303
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 264
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 264
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 226
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 225
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 202
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 126
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 102
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 53
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 claims description 52
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 46
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 44
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 39
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 39
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 33
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 31
- 101100166600 Homo sapiens CD28 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 23
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 210000000428 immunological synapse Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 12
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 11
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 8
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 8
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 claims description 8
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 claims description 8
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 claims description 7
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 7
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 5
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims description 3
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 claims description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011523 CAR-T cell immunotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 claims description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 claims description 2
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 claims description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims description 2
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 229940121420 cemiplimab Drugs 0.000 claims 2
- 239000012275 CTLA-4 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000012270 PD-1 inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 239000012668 PD-1-inhibitor Substances 0.000 claims 1
- 229960003852 atezolizumab Drugs 0.000 claims 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 claims 1
- 229940121655 pd-1 inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 73
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 67
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 67
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 65
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 56
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 56
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 47
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 44
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 43
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 41
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 41
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 40
- 102000010910 CD28 Antigens Human genes 0.000 description 38
- 108010062433 CD28 Antigens Proteins 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 34
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 34
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 33
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 33
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 description 31
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 31
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 30
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 29
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 28
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 21
- -1 phosphoryl groups Chemical group 0.000 description 21
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 19
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 18
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 18
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 17
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 17
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 17
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 17
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 16
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 16
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 16
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 15
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 15
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 15
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 15
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 13
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 13
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 12
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 11
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 10
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 10
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 10
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 10
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 10
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 10
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 10
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 9
- 101000834898 Homo sapiens Alpha-synuclein Proteins 0.000 description 9
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 9
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 9
- 101000652359 Homo sapiens Spermatogenesis-associated protein 2 Proteins 0.000 description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 9
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 9
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 9
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 9
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 8
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 8
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 8
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 8
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 8
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 7
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 7
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 6
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 5
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 5
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 5
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 5
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 5
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 5
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 5
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 4
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 4
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000369 Glutamate Carboxypeptidase II Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 description 4
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 4
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 4
- 102100033504 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 4
- 108010018242 Transcription Factor AP-1 Proteins 0.000 description 4
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 4
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N ifosfamide Chemical compound ClCCNP1(=O)OCCCN1CCCl HOMGKSMUEGBAAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 4
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 3
- 208000028564 B-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 description 3
- 101100495232 Homo sapiens MS4A1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 3
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 3
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000010782 T cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 3
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 3
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 229960001101 ifosfamide Drugs 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 102220238658 rs1468529365 Human genes 0.000 description 3
- 102220268018 rs201210997 Human genes 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 6alpha-methylprednisolone Chemical compound C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)CO)CC[C@H]21 VHRSUDSXCMQTMA-PJHHCJLFSA-N 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 238000012815 AlphaLISA Methods 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 description 2
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 description 2
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229950009579 axicabtagene ciloleucel Drugs 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 2
- 229960003008 blinatumomab Drugs 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 2
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 2
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 2
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 2
- 229960000752 etoposide phosphate Drugs 0.000 description 2
- LIQODXNTTZAGID-OCBXBXKTSA-N etoposide phosphate Chemical compound COC1=C(OP(O)(O)=O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 LIQODXNTTZAGID-OCBXBXKTSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N gallium nitrate Chemical compound [Ga+3].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O CHPZKNULDCNCBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 2
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- ORMNNUPLFAPCFD-DVLYDCSHSA-M phenethicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)C(C)OC1=CC=CC=C1 ORMNNUPLFAPCFD-DVLYDCSHSA-M 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229940063179 platinol Drugs 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 201000005825 prostate adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960004622 raloxifene Drugs 0.000 description 2
- GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N raloxifene Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(C(=O)C=2C=CC(OCCN3CCCCC3)=CC=2)C2=CC=C(O)C=C2S1 GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 102200148758 rs116840795 Human genes 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000011524 similarity measure Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- PVYJZLYGTZKPJE-UHFFFAOYSA-N streptonigrin Chemical compound C=1C=C2C(=O)C(OC)=C(N)C(=O)C2=NC=1C(C=1N)=NC(C(O)=O)=C(C)C=1C1=CC=C(OC)C(OC)=C1O PVYJZLYGTZKPJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 2
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 229940035307 toposar Drugs 0.000 description 2
- 231100000583 toxicological profile Toxicity 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- FLWWDYNPWOSLEO-HQVZTVAUSA-N (2s)-2-[[4-[1-(2-amino-4-oxo-1h-pteridin-6-yl)ethyl-methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1C(C)N(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FLWWDYNPWOSLEO-HQVZTVAUSA-N 0.000 description 1
- CGMTUJFWROPELF-YPAAEMCBSA-N (3E,5S)-5-[(2S)-butan-2-yl]-3-(1-hydroxyethylidene)pyrrolidine-2,4-dione Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]1NC(=O)\C(=C(/C)O)C1=O CGMTUJFWROPELF-YPAAEMCBSA-N 0.000 description 1
- XRBSKUSTLXISAB-XVVDYKMHSA-N (5r,6r,7r,8r)-8-hydroxy-7-(hydroxymethyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5,6,7,8-tetrahydrobenzo[f][1,3]benzodioxole-6-carboxylic acid Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H](CO)[C@@H]2C(O)=O)=C1 XRBSKUSTLXISAB-XVVDYKMHSA-N 0.000 description 1
- AESVUZLWRXEGEX-DKCAWCKPSA-N (7S,9R)-7-[(2S,4R,5R,6R)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-4-methoxy-8,10-dihydro-7H-tetracene-5,12-dione iron(3+) Chemical compound [Fe+3].COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4C[C@@](O)(C[C@H](O[C@@H]5C[C@@H](N)[C@@H](O)[C@@H](C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO AESVUZLWRXEGEX-DKCAWCKPSA-N 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N (8S)-3-(2-deoxy-beta-D-erythro-pentofuranosyl)-3,6,7,8-tetrahydroimidazo[4,5-d][1,3]diazepin-8-ol Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NCC2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEXUMDBQLIVNHZ-YOUGDJEHSA-N (8s,11r,13r,14s,17s)-11-[4-(dimethylamino)phenyl]-17-hydroxy-17-(3-hydroxypropyl)-13-methyl-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-one Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(O)CCCO)[C@@]2(C)C1 IEXUMDBQLIVNHZ-YOUGDJEHSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LKJPYSCBVHEWIU-KRWDZBQOSA-N (R)-bicalutamide Chemical compound C([C@@](O)(C)C(=O)NC=1C=C(C(C#N)=CC=1)C(F)(F)F)S(=O)(=O)C1=CC=C(F)C=C1 LKJPYSCBVHEWIU-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N (e)-1-[(2s)-2-amino-2-carboxyethoxy]-2-diazonioethenolate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CO\C([O-])=C\[N+]#N AGNGYMCLFWQVGX-AGFFZDDWSA-N 0.000 description 1
- KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 1-n-(4-chlorophenyl)-6-methyl-5-n-[3-(7h-purin-6-yl)pyridin-2-yl]isoquinoline-1,5-diamine Chemical compound N=1C=CC2=C(NC=3C(=CC=CN=3)C=3C=4N=CNC=4N=CN=3)C(C)=CC=C2C=1NC1=CC=C(Cl)C=C1 KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTOTXLJHDSNXMW-POYBYMJQSA-N 2,3-dideoxyuridine Chemical compound O1[C@H](CO)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 BTOTXLJHDSNXMW-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- BOMZMNZEXMAQQW-UHFFFAOYSA-N 2,5,11-trimethyl-6h-pyrido[4,3-b]carbazol-2-ium-9-ol;acetate Chemical compound CC([O-])=O.C[N+]1=CC=C2C(C)=C(NC=3C4=CC(O)=CC=3)C4=C(C)C2=C1 BOMZMNZEXMAQQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCXJFISCRQIYID-IAEPZHFASA-N 2-amino-1-n-[(3s,6s,7r,10s,16s)-3-[(2s)-butan-2-yl]-7,11,14-trimethyl-2,5,9,12,15-pentaoxo-10-propan-2-yl-8-oxa-1,4,11,14-tetrazabicyclo[14.3.0]nonadecan-6-yl]-4,6-dimethyl-3-oxo-9-n-[(3s,6s,7r,10s,16s)-7,11,14-trimethyl-2,5,9,12,15-pentaoxo-3,10-di(propa Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N=C2C(C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@H](C(N4CCC[C@H]4C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]3C)=O)[C@@H](C)CC)=C(N)C(=O)C(C)=C2O2)C2=C(C)C=C1 QCXJFISCRQIYID-IAEPZHFASA-N 0.000 description 1
- CTRPRMNBTVRDFH-UHFFFAOYSA-N 2-n-methyl-1,3,5-triazine-2,4,6-triamine Chemical class CNC1=NC(N)=NC(N)=N1 CTRPRMNBTVRDFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWMYMKOUNYTVQN-UHFFFAOYSA-N 3-(8,8-diethyl-2-aza-8-germaspiro[4.5]decan-2-yl)-n,n-dimethylpropan-1-amine Chemical compound C1C[Ge](CC)(CC)CCC11CN(CCCN(C)C)CC1 PWMYMKOUNYTVQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 1
- DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 4-[(z)-1-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]phenyl]-1-phenylbut-1-en-2-yl]phenol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- IDPUKCWIGUEADI-UHFFFAOYSA-N 5-[bis(2-chloroethyl)amino]uracil Chemical compound ClCCN(CCCl)C1=CNC(=O)NC1=O IDPUKCWIGUEADI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 6-azauridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=N1 WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 1
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 9beta-Ribofuranosyl-7-deazaadenin Natural products C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- CEIZFXOZIQNICU-UHFFFAOYSA-N Alternaria alternata Crofton-weed toxin Natural products CCC(C)C1NC(=O)C(C(C)=O)=C1O CEIZFXOZIQNICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034608 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 229940122815 Aromatase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 1
- SHHKQEUPHAENFK-UHFFFAOYSA-N Carboquone Chemical compound O=C1C(C)=C(N2CC2)C(=O)C(C(COC(N)=O)OC)=C1N1CC1 SHHKQEUPHAENFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOCCBINRVIKJHY-UHFFFAOYSA-N Carmofur Chemical compound CCCCCCNC(=O)N1C=C(F)C(=O)NC1=O AOCCBINRVIKJHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- JWBOIMRXGHLCPP-UHFFFAOYSA-N Chloditan Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C(C(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 JWBOIMRXGHLCPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033553 Delta-like protein 4 Human genes 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000000279 Emilia sonchifolia Species 0.000 description 1
- 235000002139 Emilia sonchifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBMLHUPNRURLOK-XGRAFVIBSA-N Epitiostanol Chemical compound C1[C@@H]2S[C@@H]2C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 OBMLHUPNRURLOK-XGRAFVIBSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003958 Glutamate Carboxypeptidase II Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N Goserelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](COC(C)(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NNC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N 0.000 description 1
- 108010069236 Goserelin Proteins 0.000 description 1
- 101150003775 HNF1A gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000924533 Homo sapiens Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100273713 Homo sapiens CD2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000872077 Homo sapiens Delta-like protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001019455 Homo sapiens ICOS ligand Proteins 0.000 description 1
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 1
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 1
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 1
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 1
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101001055145 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000576802 Homo sapiens Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 101000628547 Homo sapiens Metalloreductase STEAP1 Proteins 0.000 description 1
- 101000628535 Homo sapiens Metalloreductase STEAP2 Proteins 0.000 description 1
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001123448 Homo sapiens Prolactin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000736929 Homo sapiens Proteasome subunit alpha type-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N Hydroxyurea Chemical compound NC(=O)NO VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 description 1
- MPBVHIBUJCELCL-UHFFFAOYSA-N Ibandronate Chemical compound CCCCCN(C)CCC(O)(P(O)(O)=O)P(O)(O)=O MPBVHIBUJCELCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102100022964 Immunoglobulin kappa variable 3-20 Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 239000002136 L01XE07 - Lapatinib Substances 0.000 description 1
- JLERVPBPJHKRBJ-UHFFFAOYSA-N LY 117018 Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(C(=O)C=2C=CC(OCCN3CCCC3)=CC=2)C2=CC=C(O)C=C2S1 JLERVPBPJHKRBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- 108010000817 Leuprolide Proteins 0.000 description 1
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 102100024573 Macrophage-capping protein Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- VJRAUFKOOPNFIQ-UHFFFAOYSA-N Marcellomycin Natural products C12=C(O)C=3C(=O)C4=C(O)C=CC(O)=C4C(=O)C=3C=C2C(C(=O)OC)C(CC)(O)CC1OC(OC1C)CC(N(C)C)C1OC(OC1C)CC(O)C1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 VJRAUFKOOPNFIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025096 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 102100026712 Metalloreductase STEAP1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026711 Metalloreductase STEAP2 Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N Mitobronitol Chemical compound BrC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CBr VFKZTMPDYBFSTM-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100381978 Mus musculus Braf gene Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N N-debenzoyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-10-deacetyltaxol Chemical compound O([C@H]1[C@H]2[C@@](C([C@H](O)C3=C(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C=4C=CC=CC=4)C[C@]1(O)C3(C)C)=O)(C)[C@@H](O)C[C@H]1OC[C@]12OC(=O)C)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZDZOTLJHXYCWBA-VCVYQWHSSA-N 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- SYNHCENRCUAUNM-UHFFFAOYSA-N Nitrogen mustard N-oxide hydrochloride Chemical compound Cl.ClCC[N+]([O-])(C)CCCl SYNHCENRCUAUNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- KGTDRFCXGRULNK-UHFFFAOYSA-N Nogalamycin Natural products COC1C(OC)(C)C(OC)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=C4C5(C)OC(C(C(C5O)N(C)C)O)OC4=C3C3=O)=C3C=C2C(C(=O)OC)C(C)(O)C1 KGTDRFCXGRULNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000017954 Nuclear factor of activated T cells (NFAT) Human genes 0.000 description 1
- 108050007058 Nuclear factor of activated T cells (NFAT) Proteins 0.000 description 1
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 229930187135 Olivomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010057150 Peplomycin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- KMSKQZKKOZQFFG-HSUXVGOQSA-N Pirarubicin Chemical compound O([C@H]1[C@@H](N)C[C@@H](O[C@H]1C)O[C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1CCCCO1 KMSKQZKKOZQFFG-HSUXVGOQSA-N 0.000 description 1
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 1
- HFVNWDWLWUCIHC-GUPDPFMOSA-N Prednimustine Chemical compound O=C([C@@]1(O)CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)[C@@H](O)C[C@@]21C)COC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 HFVNWDWLWUCIHC-GUPDPFMOSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010015499 Protein Kinase C-theta Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 102100021566 Protein kinase C theta type Human genes 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- AHHFEZNOXOZZQA-ZEBDFXRSSA-N Ranimustine Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CNC(=O)N(CCCl)N=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AHHFEZNOXOZZQA-ZEBDFXRSSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091008035 T cell costimulatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 1
- CGMTUJFWROPELF-UHFFFAOYSA-N Tenuazonic acid Natural products CCC(C)C1NC(=O)C(=C(C)/O)C1=O CGMTUJFWROPELF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IWEQQRMGNVVKQW-OQKDUQJOSA-N Toremifene citrate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C1=CC(OCCN(C)C)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(\CCCl)C1=CC=CC=C1 IWEQQRMGNVVKQW-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 description 1
- UMILHIMHKXVDGH-UHFFFAOYSA-N Triethylene glycol diglycidyl ether Chemical compound C1OC1COCCOCCOCCOCC1CO1 UMILHIMHKXVDGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYAMXEPQQLNQDM-UHFFFAOYSA-N Tris(1-aziridinyl)phosphine oxide Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=O)N1CC1 FYAMXEPQQLNQDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 1
- 108010061861 Uroplakins Proteins 0.000 description 1
- 102000012349 Uroplakins Human genes 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- ZYVSOIYQKUDENJ-ASUJBHBQSA-N [(2R,3R,4R,6R)-6-[[(6S,7S)-6-[(2S,4R,5R,6R)-4-[(2R,4R,5R,6R)-4-[(2S,4S,5S,6S)-5-acetyloxy-4-hydroxy-4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-7-[(3S,4R)-3,4-dihydroxy-1-methoxy-2-oxopentyl]-4,10-dihydroxy-3-methyl-5-oxo-7,8-dihydro-6H-anthracen-2-yl]oxy]-4-[(2R,4R,5R,6R)-4-hydroxy-5-methoxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-2-methyloxan-3-yl] acetate Chemical class COC([C@@H]1Cc2cc3cc(O[C@@H]4C[C@@H](O[C@@H]5C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O5)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](C)O4)c(C)c(O)c3c(O)c2C(=O)[C@H]1O[C@H]1C[C@@H](O[C@@H]2C[C@@H](O[C@H]3C[C@](C)(O)[C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)O3)[C@H](O)[C@@H](C)O2)[C@H](O)[C@@H](C)O1)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O ZYVSOIYQKUDENJ-ASUJBHBQSA-N 0.000 description 1
- SPJCRMJCFSJKDE-ZWBUGVOYSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] 2-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]acetate Chemical compound O([C@@H]1CC2=CC[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)C(=O)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SPJCRMJCFSJKDE-ZWBUGVOYSA-N 0.000 description 1
- IFJUINDAXYAPTO-UUBSBJJBSA-N [(8r,9s,13s,14s,17s)-17-[2-[4-[4-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]butanoyloxy]acetyl]oxy-13-methyl-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-yl] benzoate Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](C2=CC=3)CC[C@]4([C@H]1CC[C@@H]4OC(=O)COC(=O)CCCC=1C=CC(=CC=1)N(CCCl)CCCl)C)CC2=CC=3OC(=O)C1=CC=CC=C1 IFJUINDAXYAPTO-UUBSBJJBSA-N 0.000 description 1
- IHGLINDYFMDHJG-UHFFFAOYSA-N [2-(4-methoxyphenyl)-3,4-dihydronaphthalen-1-yl]-[4-(2-pyrrolidin-1-ylethoxy)phenyl]methanone Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(CCC1=CC=CC=C11)=C1C(=O)C(C=C1)=CC=C1OCCN1CCCC1 IHGLINDYFMDHJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZSRRNFBEIOBDA-CFNBKWCHSA-N [2-[(2s,4s)-4-[(2r,4s,5s,6s)-4-amino-5-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-2,5,12-trihydroxy-7-methoxy-6,11-dioxo-3,4-dihydro-1h-tetracen-2-yl]-2-oxoethyl] 2,2-diethoxyacetate Chemical compound O([C@H]1C[C@](CC2=C(O)C=3C(=O)C4=CC=CC(OC)=C4C(=O)C=3C(O)=C21)(O)C(=O)COC(=O)C(OCC)OCC)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 XZSRRNFBEIOBDA-CFNBKWCHSA-N 0.000 description 1
- USDJGQLNFPZEON-UHFFFAOYSA-N [[4,6-bis(hydroxymethylamino)-1,3,5-triazin-2-yl]amino]methanol Chemical compound OCNC1=NC(NCO)=NC(NCO)=N1 USDJGQLNFPZEON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- ZOZKYEHVNDEUCO-XUTVFYLZSA-N aceglatone Chemical compound O1C(=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]2OC(=O)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H]21 ZOZKYEHVNDEUCO-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 1
- 229950002684 aceglatone Drugs 0.000 description 1
- 229930188522 aclacinomycin Natural products 0.000 description 1
- LJZPVWKMAYDYAS-QKKPTTNWSA-N aclacinomycin T Chemical class O([C@H]1C[C@]([C@@H](C2=CC=3C(=O)C4=CC=CC(O)=C4C(=O)C=3C(O)=C21)C(=O)OC)(O)CC)[C@H]1C[C@H](N(C)C)[C@H](O)[C@H](C)O1 LJZPVWKMAYDYAS-QKKPTTNWSA-N 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 229940045714 alkyl sulfonate alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000008052 alkyl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000473 altretamine Drugs 0.000 description 1
- 229960003437 aminoglutethimide Drugs 0.000 description 1
- ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N aminoglutethimide Chemical compound C=1C=C(N)C=CC=1C1(CC)CCC(=O)NC1=O ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 229960001220 amsacrine Drugs 0.000 description 1
- XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N amsacrine Chemical compound COC1=CC(NS(C)(=O)=O)=CC=C1NC1=C(C=CC=C2)C2=NC2=CC=CC=C12 XCPGHVQEEXUHNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 1
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 239000013059 antihormonal agent Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 229940045687 antimetabolites folic acid analogs Drugs 0.000 description 1
- 229940045719 antineoplastic alkylating agent nitrosoureas Drugs 0.000 description 1
- 229940045713 antineoplastic alkylating drug ethylene imines Drugs 0.000 description 1
- 229940045688 antineoplastic antimetabolites pyrimidine analogues Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 150000008209 arabinosides Chemical class 0.000 description 1
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 150000001541 aziridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002903 benzyl benzoate Drugs 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000997 bicalutamide Drugs 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229950008548 bisantrene Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical class N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 1
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 1
- 229960000455 brentuximab vedotin Drugs 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102220349284 c.287A>T Human genes 0.000 description 1
- 108700002839 cactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 229950009908 cactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229930195731 calicheamicin Natural products 0.000 description 1
- HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N calicheamicin Chemical compound C1[C@H](OC)[C@@H](NCC)CO[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C\3=C(NC(=O)OC)C(=O)C[C@](C/3=C/CSSSC)(O)C#C\C=C/C#C2)O[C@H](C)[C@@H](NO[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](SC(=O)C=3C(=C(OC)C(O[C@H]4[C@@H]([C@H](OC)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)=C(I)C=3C)OC)[C@@H](O)C2)[C@@H]1O HXCHCVDVKSCDHU-LULTVBGHSA-N 0.000 description 1
- IVFYLRMMHVYGJH-PVPPCFLZSA-N calusterone Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@](O)(C)CC[C@H]2[C@@H]2[C@@H](C)CC3=CC(=O)CC[C@]3(C)[C@H]21 IVFYLRMMHVYGJH-PVPPCFLZSA-N 0.000 description 1
- 229950009823 calusterone Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002115 carboquone Drugs 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229930188550 carminomycin Natural products 0.000 description 1
- XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N carminomycin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-CSKJXFQVSA-N 0.000 description 1
- XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N carminomycin I Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XREUEWVEMYWFFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003261 carmofur Drugs 0.000 description 1
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229950001725 carubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000419 catumaxomab Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000011340 continuous therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011254 conventional chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960002204 daratumumab Drugs 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 229940026692 decadron Drugs 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 229960005052 demecolcine Drugs 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229950003913 detorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [K+].[K+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003668 docetaxel Drugs 0.000 description 1
- ZWAOHEXOSAUJHY-ZIYNGMLESA-N doxifluridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ZWAOHEXOSAUJHY-ZIYNGMLESA-N 0.000 description 1
- 229950005454 doxifluridine Drugs 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- NOTIQUSPUUHHEH-UXOVVSIBSA-N dromostanolone propionate Chemical compound C([C@@H]1CC2)C(=O)[C@H](C)C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](OC(=O)CC)[C@@]2(C)CC1 NOTIQUSPUUHHEH-UXOVVSIBSA-N 0.000 description 1
- 229950004683 drostanolone propionate Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N eflornithine Chemical compound NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950000549 elliptinium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940015979 epipen Drugs 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229950002973 epitiostanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960001842 estramustine Drugs 0.000 description 1
- FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N estramustine Chemical compound ClCCN(CCCl)C(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940043168 fareston Drugs 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 229960000961 floxuridine Drugs 0.000 description 1
- ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N floxuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 ODKNJVUHOIMIIZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 1
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002074 flutamide Drugs 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004783 fotemustine Drugs 0.000 description 1
- YAKWPXVTIGTRJH-UHFFFAOYSA-N fotemustine Chemical compound CCOP(=O)(OCC)C(C)NC(=O)N(CCCl)N=O YAKWPXVTIGTRJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940044658 gallium nitrate Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 229960002913 goserelin Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- UUVWYPNAQBNQJQ-UHFFFAOYSA-N hexamethylmelamine Chemical compound CN(C)C1=NC(N(C)C)=NC(N(C)C)=N1 UUVWYPNAQBNQJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 description 1
- 229940038661 humalog Drugs 0.000 description 1
- 229940062714 humalog mix Drugs 0.000 description 1
- 102000045113 human PSMA1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001330 hydroxycarbamide Drugs 0.000 description 1
- 229940015872 ibandronate Drugs 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 229940090411 ifex Drugs 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- DBIGHPPNXATHOF-UHFFFAOYSA-N improsulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCNCCCOS(C)(=O)=O DBIGHPPNXATHOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950008097 improsulfan Drugs 0.000 description 1
- 230000005918 in vitro anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 230000022023 interleukin-5 production Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004891 lapatinib Drugs 0.000 description 1
- BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N lapatinib Chemical compound O1C(CNCCS(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=C(N=CN=C2NC=3C=C(Cl)C(OCC=4C=C(F)C=CC=4)=CC=3)C2=C1 BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N leuprolide Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 GFIJNRVAKGFPGQ-LIJARHBVSA-N 0.000 description 1
- 229960004338 leuprorelin Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 1
- 229960003538 lonidamine Drugs 0.000 description 1
- WDRYRZXSPDWGEB-UHFFFAOYSA-N lonidamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(C(=O)O)=NN1CC1=CC=C(Cl)C=C1Cl WDRYRZXSPDWGEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000002794 lymphocyte assay Methods 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- MQXVYODZCMMZEM-ZYUZMQFOSA-N mannomustine Chemical compound ClCCNC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CNCCCl MQXVYODZCMMZEM-ZYUZMQFOSA-N 0.000 description 1
- 229950008612 mannomustine Drugs 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940064748 medrol Drugs 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- VJRAUFKOOPNFIQ-TVEKBUMESA-N methyl (1r,2r,4s)-4-[(2r,4s,5s,6s)-5-[(2s,4s,5s,6s)-5-[(2s,4s,5s,6s)-4,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4-(dimethylamino)-6-methyloxan-2-yl]oxy-2-ethyl-2,5,7,10-tetrahydroxy-6,11-dioxo-3,4-dihydro-1h-tetracene-1-carboxylat Chemical compound O([C@H]1[C@@H](O)C[C@@H](O[C@H]1C)O[C@H]1[C@H](C[C@@H](O[C@H]1C)O[C@H]1C[C@]([C@@H](C2=CC=3C(=O)C4=C(O)C=CC(O)=C4C(=O)C=3C(O)=C21)C(=O)OC)(O)CC)N(C)C)[C@H]1C[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O1 VJRAUFKOOPNFIQ-TVEKBUMESA-N 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 229960005485 mitobronitol Drugs 0.000 description 1
- 229960003539 mitoguazone Drugs 0.000 description 1
- MXWHMTNPTTVWDM-NXOFHUPFSA-N mitoguazone Chemical compound NC(N)=N\N=C(/C)\C=N\N=C(N)N MXWHMTNPTTVWDM-NXOFHUPFSA-N 0.000 description 1
- VFKZTMPDYBFSTM-GUCUJZIJSA-N mitolactol Chemical compound BrC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CBr VFKZTMPDYBFSTM-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 1
- 229950010913 mitolactol Drugs 0.000 description 1
- 229960000350 mitotane Drugs 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229950009794 mosunetuzumab Drugs 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- NJSMWLQOCQIOPE-OCHFTUDZSA-N n-[(e)-[10-[(e)-(4,5-dihydro-1h-imidazol-2-ylhydrazinylidene)methyl]anthracen-9-yl]methylideneamino]-4,5-dihydro-1h-imidazol-2-amine Chemical compound N1CCN=C1N\N=C\C(C1=CC=CC=C11)=C(C=CC=C2)C2=C1\C=N\NC1=NCCN1 NJSMWLQOCQIOPE-OCHFTUDZSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940086322 navelbine Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 238000010984 neurological examination Methods 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- XWXYUMMDTVBTOU-UHFFFAOYSA-N nilutamide Chemical compound O=C1C(C)(C)NC(=O)N1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 XWXYUMMDTVBTOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002653 nilutamide Drugs 0.000 description 1
- 229960001420 nimustine Drugs 0.000 description 1
- VFEDRRNHLBGPNN-UHFFFAOYSA-N nimustine Chemical compound CC1=NC=C(CNC(=O)N(CCCl)N=O)C(N)=N1 VFEDRRNHLBGPNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMVWGSQGCWCDGW-UHFFFAOYSA-N nitracrine Chemical compound C1=CC([N+]([O-])=O)=C2C(NCCCN(C)C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 YMVWGSQGCWCDGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950008607 nitracrine Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000062 no-observed-adverse-effect level Toxicity 0.000 description 1
- 229950009266 nogalamycin Drugs 0.000 description 1
- KGTDRFCXGRULNK-JYOBTZKQSA-N nogalamycin Chemical compound CO[C@@H]1[C@@](OC)(C)[C@@H](OC)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=C(O)C=C4[C@@]5(C)O[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]5O)N(C)C)O)OC4=C3C3=O)=C3C=C2[C@@H](C(=O)OC)[C@@](C)(O)C1 KGTDRFCXGRULNK-JYOBTZKQSA-N 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 229960003347 obinutuzumab Drugs 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- CZDBNBLGZNWKMC-MWQNXGTOSA-N olivomycin Chemical class O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1)O[C@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@H](O)[C@H](OC)[C@H](C)O1 CZDBNBLGZNWKMC-MWQNXGTOSA-N 0.000 description 1
- 229950011093 onapristone Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- KLAKIAVEMQMVBT-UHFFFAOYSA-N p-hydroxy-phenacyl alcohol Natural products OCC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 KLAKIAVEMQMVBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000007427 paired t-test Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229960002340 pentostatin Drugs 0.000 description 1
- FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N pentostatin Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC[C@H]2O)=C2N=C1 FPVKHBSQESCIEP-JQCXWYLXSA-N 0.000 description 1
- QIMGFXOHTOXMQP-GFAGFCTOSA-N peplomycin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCN[C@@H](C)C=1C=CC=CC=1)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1NC=NC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QIMGFXOHTOXMQP-GFAGFCTOSA-N 0.000 description 1
- 229950003180 peplomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- NUKCGLDCWQXYOQ-UHFFFAOYSA-N piposulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCC(=O)N1CCN(C(=O)CCOS(C)(=O)=O)CC1 NUKCGLDCWQXYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001100 piposulfan Drugs 0.000 description 1
- 229960001221 pirarubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 150000003057 platinum Chemical class 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229960004694 prednimustine Drugs 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011809 primate model Methods 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- WOLQREOUPKZMEX-UHFFFAOYSA-N pteroyltriglutamic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(=O)NC(CCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)=O)C=C1 WOLQREOUPKZMEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002106 pulse oximetry Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229960002185 ranimustine Drugs 0.000 description 1
- BMKDZUISNHGIBY-UHFFFAOYSA-N razoxane Chemical compound C1C(=O)NC(=O)CN1C(C)CN1CC(=O)NC(=O)C1 BMKDZUISNHGIBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000460 razoxane Drugs 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036387 respiratory rate Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 102220210869 rs1057524586 Human genes 0.000 description 1
- 102220220520 rs1060503090 Human genes 0.000 description 1
- 102220325921 rs1555376589 Human genes 0.000 description 1
- 102220142694 rs192332456 Human genes 0.000 description 1
- 102200164344 rs63751661 Human genes 0.000 description 1
- VHXNKPBCCMUMSW-FQEVSTJZSA-N rubitecan Chemical compound C1=CC([N+]([O-])=O)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VHXNKPBCCMUMSW-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 229950006315 spirogermanium Drugs 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 1
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 1
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229960005353 testolactone Drugs 0.000 description 1
- BPEWUONYVDABNZ-DZBHQSCQSA-N testolactone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(OC(=O)CC4)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 BPEWUONYVDABNZ-DZBHQSCQSA-N 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- YFTWHEBLORWGNI-UHFFFAOYSA-N tiamiprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC(N)=NC2=C1NC=N2 YFTWHEBLORWGNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950007137 tisagenlecleucel Drugs 0.000 description 1
- 108010078373 tisagenlecleucel Proteins 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- XFCLJVABOIYOMF-QPLCGJKRSA-N toremifene Chemical compound C1=CC(OCCN(C)C)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(\CCCl)C1=CC=CC=C1 XFCLJVABOIYOMF-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 1
- 229960005026 toremifene Drugs 0.000 description 1
- 231100000607 toxicokinetics Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229960001612 trastuzumab emtansine Drugs 0.000 description 1
- IUCJMVBFZDHPDX-UHFFFAOYSA-N tretamine Chemical compound C1CN1C1=NC(N2CC2)=NC(N2CC2)=N1 IUCJMVBFZDHPDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950001353 tretamine Drugs 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 229960004560 triaziquone Drugs 0.000 description 1
- PXSOHRWMIRDKMP-UHFFFAOYSA-N triaziquone Chemical compound O=C1C(N2CC2)=C(N2CC2)C(=O)C=C1N1CC1 PXSOHRWMIRDKMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 229960001670 trilostane Drugs 0.000 description 1
- KVJXBPDAXMEYOA-CXANFOAXSA-N trilostane Chemical compound OC1=C(C#N)C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@@]32O[C@@H]31 KVJXBPDAXMEYOA-CXANFOAXSA-N 0.000 description 1
- NOYPYLRCIDNJJB-UHFFFAOYSA-N trimetrexate Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(NCC=2C(=C3C(N)=NC(N)=NC3=CC=2)C)=C1 NOYPYLRCIDNJJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001099 trimetrexate Drugs 0.000 description 1
- 229950000212 trioxifene Drugs 0.000 description 1
- 229960000875 trofosfamide Drugs 0.000 description 1
- UMKFEPPTGMDVMI-UHFFFAOYSA-N trofosfamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)OCCCN1CCCl UMKFEPPTGMDVMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-LITAXDCLSA-N tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-LITAXDCLSA-N 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011870 unpaired t-test Methods 0.000 description 1
- 229960001055 uracil mustard Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 1
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-IELIFDKJSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-IELIFDKJSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- CILBMBUYJCWATM-PYGJLNRPSA-N vinorelbine ditartrate Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC CILBMBUYJCWATM-PYGJLNRPSA-N 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 229940053867 xeloda Drugs 0.000 description 1
- 229940045208 yescarta Drugs 0.000 description 1
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 description 1
- 229960000641 zorubicin Drugs 0.000 description 1
- FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N zorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(\C)=N\NC(=O)C=1C=CC=CC=1)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N 0.000 description 1
Description
Родственные заявки
Данная заявка связана с предварительной заявкой на патент США № 62/688227, поданной 21 июня 2018 г., предварительной заявкой на патент США № 62/781930, поданной 19 декабря 2018 г., предварительной заявкой на патент США № 62/781980, поданной 19 декабря 2018 г., и предварительной заявкой на патент США № 62/815878, поданной 8 марта 2019 г, и испрашивает приоритет на их основании. Полное содержание вышеупомянутых заявок в явном виде включено в настоящий документ посредством ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 20 июня 2019 г., названа 10367WO01_118003-45220_SL.TXT и имеет размер 48690 байт.
Область техники
Настоящее изобретение относится к биспецифичным антигенсвязывающим молекулам, которые связывают CD28 и молекулу-мишень, такую как PSMA, и способам их применения.
Уровень техники
CD28 представляет собой трансмембранный белок I типа, экспрессируемый на поверхности Тклеток, который имеет единственный внеклеточный Ig-подобный домен V-типа, собранный в виде гомодимера. CD28 является рецептором для белков CD80 (В7.1) и CD86 (В7.2) и активируется CD80 или CD86, экспрессируемыми на АПК. Связывание CD28 с CD80 или CD86 обеспечивает костимулирующие сигналы, важные для активации и выживания Т-клеток. Стимуляция Т-клеток посредством CD28 в дополнение к Т-клеточному рецептору (TCR) обеспечивает мощный сигнал для продукции различных интерлейкинов. CD28 усиливает клеточные сигналы, такие как сигнальные пути, контролируемые фактором транскрипции NFkB, после активации TCR. Сопутствующий сигнал CD28 важен для эффективной активации Т-клеток, такой как дифференцировка, пролиферация, высвобождение цитокинов и уничтожение клеток Т-клетками.
Антитела к CD28 были предложены для применения в терапевтических целях, включая активацию Т-клеток. Одно конкретное антитело к CD28, TGN1412 (суперагонист к CD28), было использовано в клиническом исследовании. TGN1412 вызвало цитокиновый шторм, который не был предсказан токсикологическими исследованиями или исследованиями ex vivo с МНПК человека. В 2006 году шести здоровым добровольцам внутривенно ввели TGN1412 (суперагонист к CD28) в дозе 0,1 мг/кг. В течение 2 ч у всех шести пациентов наблюдались выраженные воспалительные реакции (цитокиновый шторм). В течение 16 ч у всех пациентов наблюдалась полиорганная недостаточность. Субъектам вводили кортикостероиды, и уровни цитокинов вернулись к нормальным уровням по прошествии 2-3 дней. Начальная доза 0,1 мг/кг в исследовании фазы 1 (связанном с CRS (синдром высвобождения цитокинов)) была основана на 500-кратно большем уровне, при котором не наблюдается неблагоприятного воздействия NOAEL, составившем 50 мг/кг у яванских макаков (Suntharalingam, et al., Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412, NEJM 355:1018-1028 (2006)).
Токсикологическое исследование на яванских макаках не позволило спрогнозировать цитокиновый ответ, который наблюдали у людей.
PSMA (простатоспецифичный мембранный анτиген)/FOLH1 является хорошо охарактеризованной опухолевой мишенью. PSMA представляет собой трансмембранный гликопротеин II типа, сверхэкспрессируемый при раке предстательной железы. Он также известен как глутаматкарбоксипептидаза II (GPC). В нормальной предстательной железе человека PSMA связан с цитоплазмой и апикальной стороной эпителия, окружающего протоки предстательной железы. Диспластическая и/или неопластическая трансформация ткани предстательной железы приводит к переносу PSMA с апикальной мембраны на просветную поверхность протоков. PSMA подвергается конститутивному эндоцитозу и не слущивается. PSMA является мишенью в различных клинических исследованиях ADC (конъюгата антителолекарственное средство) и методах визуализации. PSMA в высокой степени экспрессируется в аденокарциноме предстательной железы человека и соответствует метастазам (лимфатические узлы). В опухолях предстательной железы уровни экспрессии PSMA увеличиваются в зависимости от стадии и степени. Переход в андроген-независимую форму рака предстательной железы в конечном итоге приводит к увеличению экспрессии. Интересно, что экспрессия PSMA также была обнаружена в новообразованных сосудах некоторых солидных опухолей (включая рак ободочной кишки, легкого, молочной железы, почки и подтипы рака мочевого пузыря).
PSMA также экспрессируется в здоровых тканях. Самая сильная экспрессия встречается в эпителиальных клетках предстательной железы, двенадцатиперстной кишке, клетках почечных канальцев, слюнных железах и астроцитах. PSMA в низкой степени экспрессируется в фаллопиевых трубах, молочной железе и редко экспрессируется в эндотелии шейки матки.
Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, которые связывают как CD28, так и антигенмишень (такой как PSMA), были бы эффективны в терапевтических ситуациях, где требуется специфичное нацеливание и опосредованное Т-клетками уничтожение клеток, экспрессирующих указанный антиген-мишень. Также существует потребность в антителе к CD28, безопасном для применения в составе
- 1 045943 фармацевтической композиции.
Краткое описание изобретения
В первом аспекте настоящего изобретения предложены биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, которые связывают CD28 и антиген-мишень. Согласно отдельным иллюстративным вариантам осуществления биспецифичные антигенсвязывающие молекулы связывают CD28 и PSMA; такие биспецифичные антигенсвязывающие молекулы также называются в настоящем документе биспецифичными молекулами анти-CD28/анти-PSMA. Анти-PSMA часть биспецифичной молекулы αнти-CD28/антиPSMA эффективна для нацеливания на опухолевые клетки, экспрессирующие PSMA (например, опухолевые клетки предстательной железы), а анти-CD28 часть биспецифичной молекулы эффективна для активации Т-клеток. Одновременное связывание PSMA на опухолевой клетке и CD28 на Т-клетке способствует направленному уничтожению (клеточному лизису) опухолевой клетки-мишени активированной Т-клеткой. Следовательно, биспецифичные молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению эффективны, среди прочего, для лечения заболеваний и расстройств, связанных с опухолями, экспрессирующими PSMA (например, раком предстательной железы), или вызываемых ими.
Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно этому аспекту настоящего изобретения содержат первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28 человека, и второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA. Настоящее изобретение включает биспецифичные молекулы αнти-CD28/αнти-PSMA (например, биспецифичные антитела), где каждый антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) в паре с вариабельной областью легкой цепи (LCVR). В отдельных иллюстративных вариантах осуществления изобретения каждый из антигенсвязывающего домена к CD28 и антигенсвязывающего домена к PSMA содержит разные, отдельные HCVR в паре с общей LCVR.
Настоящее изобретение относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/aнти-PSMA, где первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит любую из аминокислотных последовательностей HCVR, представленных в табл. 1. Первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, также может содержать любую из аминокислотных последовательностей LCVR, представленных в табл. 1. Согласно отдельным вариантам осуществления первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит любую из пар аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, представленных в табл. 1. Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит любую из аминокислотных последовательностей CDR1CDR2-CDR3 тяжелой цепи, представленных в табл. 1, и/или любую из аминокислотных последовательностей CDR1-CDR2-CDR3 легкой цепи, представленных в табл. 1.
Согласно отдельным вариантам осуществления настоящее изобретение относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 26 и 58, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 42 и 66, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10/18, 26/42 и 58/66.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит домен CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 32 и 64, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен CDR3 легкой цепи (LCDR3), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 48 и 72, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
В отдельных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16/24, 32/48 и 64/72.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным антигенсвязывающим молекулам анти
- 2 045943
CD28/aHTu-PSMA, где первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержит домен CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 28 и 60, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 30 и 62, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен CDR1 легкой цепи (LCDR1), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 44 и 68, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен CDR2 легкой цепи (LCDR2), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 46 и 70, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
Некоторые неограничивающие иллюстративные биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению включают первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28, содержащий домены HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, соответственно, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 12-14-16-20-22-24; 28-30-32-44-46-48; и 60-62-64-68-70-72.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 34 и 50, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18, 42 и 66, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержит пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/18, 34/42 и 50/66.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным молекулам анти-CD28/анти-PSMA, где второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержит домен CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8, 40 и 56, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен CDR3 легкой цепи (LCDR3), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 24, 48 и 72, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
В отдельных вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержит пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8/24, 40/48 и 56/72.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным антигенсвязывающим молекулам антиCD28/анти-PSMA, где второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержит домен CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 36 и 52, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 38 и 54, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; домен CDR1 легкой цепи (LCDR1), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 44 и 68, или по существу схожую с ними последовательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности; и домен CDR2 легкой цепи (LCDR2), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22, 46 и 70, или по существу схожую с ними последо
- 3 045943 вательность, обладающую по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности.
Некоторые неограничивающие иллюстративные биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению включают второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержащий домены HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, соответственно, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 4-6-8-20-22-24; 36-38-40-44-46-48; и 52-54-56-68-70-72.
В связанном варианте осуществления изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/анти-PSMA, где второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA, содержит домены CDR тяжелой и легкой цепей, содержащиеся в последовательностях вариабельной области тяжелой и легкой цепей (HCVR/LCVR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2/18, 34/42 и 50/66.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие любую из последовательностей HCVR, LCVR или CDR биспецифичных антигенсвязывающих молекул анти-CD28/анти-PSMA, раскрытых в настоящем документе, включая молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие полинуклеотидные последовательности, представленные в табл. 1 в настоящем документе, а также молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие две или более полинуклеотидных последовательностей, представленных в табл. 1, в любой их функциональной комбинации или расположении. Рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты согласно изобретению, и клетки-хозяева, в которые такие векторы были введены, также охватываются изобретением, как и способы получения антител путем культивирования указанных клеток-хозяев в условиях, позволяющих получать антитела и выделять полученные антитела.
Настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/антиPSMA, где любой из вышеупомянутых антигенсвязывающих доменов, которые специфично связывают CD28, объединен, связан или иным образом ассоциирован с любым из вышеупомянутых антигенсвязывающих доменов, которые специфично связывают PSMA, с образованием биспецифичной антигенсвязывающей молекулы, связывающей CD28 и PSMA.
Настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/антиPSMA, имеющие модифицированный профиль гликозилирования. Для некоторых областей применения может быть полезной модификация для удаления нежелательных сайтов гликозилирования, или антитело, в котором отсутствует фукозный фрагмент, присутствующий на олигосахаридной цепи, например, для усиления функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Для других областей применения может быть осуществлена модификация галактозилирования, чтобы модифицировать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).
В еще одном аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая биспецифичную антигенсвязывающую молекулу анти-CD28/анти-PSMA, как раскрыто в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В связанном аспекте изобретения представлена композиция, представляющая собой комбинацию биспецифичной антигенсвязывающей молекулы антиCD28/анти-PSMA и второго терапевтического агента. В одном из вариантов осуществления второй терапевтический агент представляет собой любой агент, который может с пользой применяться в комбинации с биспецифичной антигенсвязывающей молекулой анти-CD28/анти-PSMA. Примеры агентов, которые могут с пользой применяться в комбинации с биспецифичной антигенсвязывающей молекулой антиCD28/анти-PSMA, подробно обсуждаются в других местах в настоящем документе.
В еще одном аспекте изобретения предложены терапевтические способы нацеливания на/уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих PSMA, с использованием биспецифичной антигенсвязывающей молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению, где указанные терапевтические способы включают введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащий биспецифичную антигенсвязывающую молекулу анти-CD28/анти-PSMA согласно настоящему изобретению, нуждающемуся в этом субъекту.
Настоящее изобретение также включает применение биспецифичной антигенсвязывающей молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, связанного с экспрессией PSMA или вызываемого ею.
В еще одном аспекте изобретения предложены терапевтические способы нацеливания на/уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих PSMA, с использованием биспецифичной антигенсвязывающей молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению, где указанную биспецифичную антигенсвязывающую молекулу анти-CD28/анти-PSMA применяют в комбинации с другими противоопухолевыми биспецифичными антигенсвязывающими молекулами, которые связываются с CD3 (например, анти-CD28/анти-PSMA в комбинации с антителами анти-CD3/анmи-PSMA).
В еще одном аспекте изобретения предложены терапевтические способы нацеливания на/уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих PSMA, с использованием биспецифичной антигенсвязывающей молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению, где указанную биспецифичную антигенсвязывающую молекулу анти-CD28/анти-PSMA применяют в комбинации с ингибитором
- 4 045943 контрольной точки, нацеленным на PD-1 или CTLA-4 (например, aHTu-CD28/aHTu-PSMA в комбинации с антителами к PD-1).
В еще одном аспекте изобретения предложены терапевтические способы нацеливания на/уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих PSMA, с использованием биспецифичной антигенсвязывающей молекулы анти-CD28/анти-PSMA согласно изобретению, где указанную биспецифичную антигенсвязывающую молекулу анти-CD28/анти-PSMA применяют в комбинации с другими противоопухолевыми биспецифичными антигенсвязывающими молекулами, которые связываются с CD3 (например, анти-CD28/анти-PSMA в комбинации с биспецифичными антителами анти-CD3/анти-PSMA), и ингибитором контрольной точки, нацеленным на PD-1 или CTLA-4 (например, анти-CD28/анти-PSMA в комбинации с антителами к PD-1).
Другие варианты осуществления будут очевидны из обзора следующего подробного описания изобретения.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 схематически показана структура иллюстративного биспецифичного антитела к CD28/PSMA.
Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий ингибирование роста опухоли в генетически модифицированных линиях клеток с введенной экспрессией костимулирующего лиганда. Три линии опухолевых клеток, B16F10.9, EL4 и МС 38, были генетически модифицированы для экспрессии костимулирующего лиганда или GFP в качестве контроля. Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий процент (%) выживаемости. Мышей умерщвляли, когда опухоли вырастали до размера, превышающего 2000 мм3.
Фиг. 3 схематически показан исходный и генетически модифицированный биоанализ для исследования биспецифичных антител к PSMAxCD28.
На фиг. 4А и 4В показано, что активация CD4+ Т-клеток и генетически модифицированных клеток JRT3.T3/ 1G4/hCD28 усиливалась под воздействием анти-hPSMAxhCD28 в условиях первичной стимуляции (REGN2281) и PSMA, экспрессируемого на клетках HEK293/hCD20.
На фиг. 5А-Н показано, что в генетически модифицированных линиях клеток с введенным PSMA биспецифичные антитела к PSMAxCD28 усиливают активацию Т-клеток в условиях стимуляции TCR биспецифичными антителами к CD20xCD3.
На фиг. 5А схематически показан механизм действия биспецифичных антител.
Фиг. 5В представляет собой график, демонстрирующий количественную оценку отношения флуоресценции CD28 внутри иммунологического синапса и за его пределами. Генетически модифицированные PSMA клетки-мишени (HEK293) и Т-клетки человека Jurkat культивировали совместно с флуоресцентно мечеными биспецифичными антителами (анти-PSMAxCD28, uhtu-CD20xCD3) в течение 1 ч при 37°C, осторожно фиксировали и окрашивали антителом к CD28. Количество проанализированных клеток в каждой группе указано на гистограмме.
На фиг. 5С и 5D показана пролиферация Т-клеток человека, культивированных с генетически модифицированными PSMA клетками-мишенями. Показанные данные представляют собой среднее значение ±SEM (стандартная ошибка среднего). Данные относятся к по меньшей мере двум (2) экспериментам.
На фиг. 5С представлен график, демонстрирующий титрование дозы CD20xCD3 в присутствии 0,5 нМ изотипического контроля hIgG4s или PSMAxCD28.
На фиг. 5D представлен график, демонстрирующий титрование дозы PSMAxCD28 или указанных контролей в присутствии 5 пМ изотипического контроля hIgG4s или CD20xCD3.
Фиг. 5E-G представляют собой графики, демонстрирующие пролиферацию и высвобождение цитокинов Т-клетками человека, культивированными с генетически модифицированными ТАА (PSMA или CD20) клетками-мишенями, как указано в верхней части панели, в присутствии 5 пМ изотипического контроля hIgG4s (нижняя панель каждой фигуры) или CD20xCD3 (верхняя панель каждой фигуры). Данные представляют собой среднее значение ± SEM. Данные относятся к по меньшей мере трем (3) экспериментам.
Фиг. 5Е представляет собой график, демонстрирующий пролиферацию.
Фиг. 5F представляет собой график, демонстрирующий высвобождение IL-2.
Фиг. 5G представляет собой график, демонстрирующий высвобождение ZFNy.
Фиг. 5Н представляет собой график, демонстрирующий, что биспецифичные антитела к PSMAxCD28 и к PSMAxCD3 могут одновременно связываться с клетками, экспрессирующими PSMA. Клетки 22RV1 предварительно инкубировали в течение 30 мин при 4°C в буфере для проточной цитометрии (PBS+1%FBS) с 20 мг/мл PSMAxCD3 или 20 мг/мл антитела к PSMA, несущего плечо к PSMA, аналогичное содержащемуся в биспецифичном PSMAxCD28. После инкубации клетки промывали буфером для проточной цитометрии и инкубировали в течение 20 мин при 4°C с 5 мг/мл PSMAxCD28, напрямую меченого Alexa647. После инкубации клетки промывали, повторно суспендировали в буфере для проточной цитометрии и анализировали методом проточной цитометрии.
На фиг. 6А и 6В показано, что анти-PSMAxCD28 усиливало цитотоксическую активность анти
- 5 045943
PSMAxCD3 в присутствии клеток карциномы предстательной железы и Т-клеток человека или яванского макака.
На фиг. 7А-Н представлены графики, демонстрирующие, что в линиях раковых клеток с эндогенным PSMA биспецифичные антитела к PSMAxCD28 усиливают активацию Т-клеток в условиях стимуляции TCR биспецифичными антителами к PSMAxCD3. На фиг. 7A-D Т-клетки человека культивировали с раковыми клетками-мишенями с эндогенной экспрессией PSMA (линия рака предстательной железы С4-2) и указанными биспецифичными антителами в течение 96 ч.
Фиг. 7А представляет собой график, демонстрирующий уничтожение опухолевых клеток. Показанные данные представляют собой процент жизнеспособных клеток.
Фиг. 7В представляет собой график, демонстрирующий высвобождение ZFNy.
На фиг. 7С представлены графики, демонстрирующие количество CD4 Т-клеток и частоту встречаемости CD25' клеток в виде процента от CD4 Т-клеток.
На фиг. 7D представлены графики, демонстрирующие количество CD8 Т-клеток и частоту встречаемости CD25+ клеток в виде процента от CD8 Т-клеток.
На фиг. 7E-G Т-клетки яванского макака культивировали с раковыми клетками с эндогенной экспрессией PSMA (линия рака предстательной железы С4-2) и указанными биспецифичными антителами в течение 96 ч.
Фиг. 7Е представляет собой график, демонстрирующий уничтожение опухолевых клеток. Показанные данные представляют собой процент жизнеспособных клеток.
На фиг. 7F представлены графики, демонстрирующие количество CD4 Т-клеток и частоту встречаемости CD25+ клеток в виде процента от CD4 Т-клеток.
На фиг. 7G представлены графики, демонстрирующие количество CD8 Т-клеток и частоту встречаемости CD25+ клеток в виде процента от CD8 Т-клеток.
На фиг. 7Н представлен график, демонстрирующий связывание антител с клеточными мишенями, измеренное с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 8 показано сравнение свойств суперагониста TGN и антитела к CD28 согласно изобретению.
На фиг. 9А и 9В представлены графики и точечные диаграммы, демонстрирующие, что биспецифичное антитело к PSMAxCD28 усиливает противоопухолевый иммунитет посредством PSMAxCD3 и индуцированной активации Т-клеток. Опухолевые клетки MC38/hPSMA подкожно имплантировали гуманизированным мышам hCD3/hCD28/hPSMA. Мышам вводили указанные биспецифичные антитела в дозе 5 мг/кг в 0, 3 и 7 день.
На фиг. 9А показана динамика объемов опухолей. Значения представляют собой среднее значение ± SEM и относятся к трем (3) экспериментам с 3-7 мышами на группу. Значения Р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. (*, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001 и ****, р<0,0001).
На фиг. 9В представлены графики, демонстрирующие процент клеток в каждом кластере из каждой группы лечения (верхняя панель); наложение указанного кластера на график viSNE (нижняя панель).
На фиг. 9С и 9D представлены гистограммы, демонстрирующие, что биспецифичное антитело к PSMAxCD28 усиливает высвобождение цитокинов, индуцированное PSMAxCD3. У мышей брали кровь на сывороточные уровни цитокинов через 4 ч после введения дозы в 0 день. Статистическую значимость рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа по сравнению с изотипом **р<0,01 и ***р<0,0001. n=7 мышей на группу. Данные относятся к 3 экспериментам.
На фиг. 9Е представлен график и точечная диаграмма, демонстрирующие, что биспецифичное антитело к PSMAxCD28 усиливает активацию Т-клеток, индуцированную PSMAxCD3.
На фиг. 10 показано, что биспецифичные антитела к PSMAxCD28 или родительские двухвалентные антитела к CD28 не индуцируют продукцию цитокинов в сыворотке у гуманизированных мышей CD3/CD28/PSMA.
На фиг. 11 показано, что лечение суперагонистом к CD28 вызывало цитокиновый ответ через 4 ч у мышей NSG с привитыми МНПК, в отличие от антитела к CD28 mAb14226P2.
На фиг. 12 показан потенциально более безопасный токсикологический профиль костимулирующих биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно данному изобретению. Ahtu-CD28 x антиPSMA не вызывало цитокинового ответа, в отличие от анти-CD3 x анти-PSMA.
На фиг. 13А и 13В показано, что PSMAxCD28 не демонстрировало продукцию цитокинов или маргинации Т-клеток по сравнению с PSMAxCD3 и суперагонистом к CD28. LLOQ: нижний предел количественного определения.
На фиг. 14 и 17 показано, что TSAxCD28 и блокада PD-1 активируют TCR/CD3 и CD28 на Тклетках в месте опухоли. На фиг. 15, 16 и 18 показано, что биспецифик TSAxCD28 и блокада PD-1 синергетически способствуют активации Т-клеток in vitro. На фиг. 14-18 Т-клетка (Jurkat/PD-1) и клеткамишень (Raji WT) конъюгируются в присутствии неблокирующего mAb к PD-1 (NB mAb к PD-1) или блокатора (mAb к PD-1) и биспецифика CD20xCD3.
На фиг. 14 представлены гистограммы, демонстрирующие количественную оценку локализации PD-1 и CD28 в иммунологическом синапсе. Статистическую значимость рассчитывали с помощью не
- 6 045943 парного t-критерия (незначимо, ns). Для количественной оценки локализации PD-1 и CD28 в иммунологическом синапсе получали изображения конъюгатов Т-клеток (Jurkat/PD-1) и клеток-мишеней (Raji WT) в присутствии неблокирующего mAb к PD-1 (NB mAb к PD-1) или блокатора (mAb к PD-1) и биспецифичного антитела к CD20xCD3. MAb к PD-1 напрямую метили Alexa647, биспецифичное антитело к CD20xCD3 напрямую метили Alexa488, mAb к CD28 напрямую метили РЕ, а ядра окрашивали Hoechst 33342 (изображения не показаны).
На фиг. 15 представлены гистограммы, демонстрирующие количественную оценку локализации PD-1 и CD28 в иммунологическом синапсе. Статистическую значимость рассчитывали с помощью непарного t-критерия (р<0,0001, ****). Для количественной оценки локализации PD-1 и CD28 в иммунологическом синапсе получали изображения конъюгатов Т-клеток (Jurkat/PD-1) и клеток-мишеней (Raji/PDL1) в присутствии неблокирующего mAb к PD-1 (NB mAb к PD-1) или блокатора (mAb к PD-1) и биспецифичного антитела к CD20xCD3. MAb к PD-1 напрямую метили Alexa647 (показано красным), CD20xCD3 напрямую метили Alexa488 (показано зеленым), mAb к CD28 напрямую метили РЕ (показано синим), а ядра окрашивали Hoechst 33342 (показано серым). Пунктирные линии представляют собой контуры клеток, нарисованные на основе светлопольного изображения.
На фиг. 16 показан процент (%) жизнеспособности клеток 22RV1-PDL1 через 96 ч.
Фиг. 17 представляет собой график, демонстрирующий уровни IFNy в супернатанте через 96 ч.
Фиг. 18 представляет собой график, демонстрирующий высвобождение IL-2 через 96 ч.
На фиг. 19A-D показано, что экспрессия лиганда CD28 (CD86) на опухолевых клетках действует синергетически с лечением молекулой к PD1 в отношении индукции опосредованного CD8 противоопухолевого иммунитета. Опухолевые клетки МС38 трансдуцировали лигандом CD28, CD86 (MC38/CD86) или пустым векторным контролем (MC38/EV). Мышам WT C57BL6 первоначально имплантировали 1х 106 опухолевых клеток на мышь и вводили mAb к PD-1 или крысиный изотипический контроль в дозе 5 мг/кг в 0, 3, 7, 10 и14 день после имплантации опухоли.
На фиг. 19А показана динамика среднего объема опухоли. Планки погрешностей представляют собой ±SEM. Статистическую значимость определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критериев множественного сравнения Тьюки.
На фиг. 19В показана динамика выживаемости (процент мышей с опухолями <2000 мм3). Статистическую значимость на 60-й день после имплантации определяли с помощью лорангового критерия (Кокса-Мантеля).
На фиг. 19С мышам вводили антитело, истощающее популяцию CD8 (истощение CD8), или изотипический контроль (без истощения). Показана динамика среднего объема опухоли при истощении CD8 (пунктирные линии) и в отсутствие истощения (сплошные линии) ±SEM. Статистическую значимость определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критериев множественного сравнения Тьюки.
На фиг. 19D показаны повторные имплантаты опухолей (повторная провокация опухолевыми клетками) у мышей без опухолей, которым имплантировали MC38/CD86 и проводили лечение mAb к PD1.
На фиг. 19A-D показаны данные из 1 эксперимента с 10 мышами на группу. Данные относятся к по меньшей мере 4 отдельным экспериментам. Указана статистическая значимость (*р<0,05, **р<0,01, ***р<0,001 и ****р<0,0001).
На фиг. 20, 21А, 22, 24 и 25 показано, что PSMAxCD28 действует синергетически с лечением mAb к PD1 в отношении индукции противоопухолевого иммунитета. Опухолевые клетки МС38 /hPSMA подкожно имплантировали мышам hCD3/hCD28/hPSMA. Биспецифичное антитело к PSMAxCD28, mAb к PD-1 или крысиный изотипический контроль IgG2a вводили в качестве монотерапии или в комбинации путем внутрибрюшинной инъекции по 5 мг/кг каждого. На фиг. 21В и 21С показано, что комбинация PSMAxCD28 и mAb к PD-1 увеличивает частоту встречаемости опухолеспецифичных Т-клеток. На фиг. 23А и 23В показано, что PSMAxCD28 действует синергетически с лечением антителом к PD1 в отношении индукции внутриопухолевых, но не селезеночных или системных цитокинов.
На фиг. 20А-Е показано, что немедленное лечение антителом анти-PSMA х анти-СО28 усиливает иммунитет в месте опухоли и действует синергетически с антителами к PD-1, способствуя отторжению опухоли. На фиг. 20А показана динамика среднего объема опухоли. Планки погрешностей представляют собой ±SEM. Статистическую значимость определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критериев множественного сравнения Тьюки (***, р<0,001 и ****, р<0,0001). На фиг. 20В показана динамика выживаемости (мышей с опухолями >2000 мм3 умерщвляли). Статистическую значимость определяли с помощью лорангового критерия (Кокса-Мантеля) (**, р<0,01). На фиг. 20С показан средний объем опухоли на 21 день после имплантации. Планки погрешностей представляют собой ±SEM. Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Холма-Сидака (****, р<0,0001). На фиг. 20D приведена таблица с объемами опухолей (мм3) на 21 день после имплантации. На фиг. 20Е приведена таблица с количеством мышей без опухолей на группу, относящаяся к 6 отдельным экспериментам.
На фиг. 21А показана повторная провокация опухолевыми клетками у мышей без опухолей, ранее
- 7 045943 получавших комбинацию PSMAxCD28 и mAb к PD1. Планки погрешностей представляют собой ±SEM. Данные относятся к 4 экспериментам.
На фиг. 21В показаны опухолевые клетки MC38/PSMA, имплантированные гуманизированным мышам CD3/CD28/PSMA, которым вводили изотипический контроль, PSMAxCD28, mAb к PD1 или комбинацию в дозе 5 мг/кг на 10 и 14 день после имплантации. Селезенки собирали на 17 день. Спленоциты культивировали в течение ночи в Т-клеточной среде с 10 мг/мл пептида (р15Е или OVA) и 2 мг/мл антитела к CD28. После инкубации в течение ночи проводили внутриклеточное окрашивание цитокинов в соответствии со стандартными процедурами.
На фиг. 21С показано, что мыши без опухолей, получавшие лечение αнти-CD28 х PSMA и антителом к PD1, но не aнти-CD28 х PSMA и анти-CD3 х PSMA, отторгли повторные опухоли.
На фиг. 22A-D, 24 и 25 показана схема отсроченного/терапевтического лечения (дозирование обозначено стрелками; фиг. 22А и 22В на 9, 16 и 22 день; фиг. 24 и 25 на 7, 11 и 14 день.
На фиг. 22А показана динамика среднего объема опухоли. Планки погрешностей представляют собой ±SEM. Статистическую значимость определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критериев множественного сравнения Тьюки. Данные относятся к 3 экспериментам.
На фиг. 22В показаны селезеночные и внутриопухолевые цитокины ex vivo. Точки представляют собой данные от отдельных мышей. Планка представляет собой среднее значение ±SEM.
На фиг. 22С показан средний размер опухоли на 20 день.
На фиг. 22D показана выживаемость мышей, получавших разные виды лечения.
На фиг. 23А и 23В показано, что PSMAxCD28 действует синергетически с лечением антителом к PD1 в отношении индукции внутриопухолевых, но не селезеночных или системных цитокинов.
Данные на фиг. 23А аналогичны фиг. 22В. Селезеночные и внутриопухолевые цитокины ex vivo. Точки представляют собой данные от отдельных мышей. Планка представляет собой среднее значение ±SEM.
На фиг. 23В трижды гуманизированным мышам CD3/CD28/PSMA имплантировали MC38/hPSMA и вводили указанное антитело в дозе 5 мг/кг в 0 день. У мышей брали кровь и собирали сыворотку через 4 ч после введения дозы. На фиг. 23А и 23В статистическую значимость рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критериев множественного сравнения Тьюки. *р<0,05, **р<0,01, ****р<0,0001.
На фиг. 24 показана экспрессия PD1 на субпопуляциях Т-клеток из дренирующего лимфатического узла (dLN), селезенки (Sp) и опухоли (Tu). Точки представляют собой данные от отдельных мышей. Планка представляет собой среднее значение ±SEM.
На фиг. 25 показана частота встречаемости CD8 Т-клеток в С1 и С2 из указанных групп лечения.
Данные на каждой из фиг. 22В, 24 и 25 относятся к 1 эксперименту. Фиг. 22В и 24: n=4-6 мышей на группу. Фиг. 25: n=10 мышей на группу.
На фиг. 26А-С и 27 показано, что TAAxCD28 по отдельности или в комбинации с терапией PD1 не индуцирует системную активацию Т-клеток по сравнению с суперагонистом к CD28 у яванских макаков. Яванским макакам вводили разовую дозу биспецификов в указанной дозе (1 или 10 мг/кг, как указано). Время относится к периоду после введения дозы (ч).
На фиг. 26А показаны сывороточные цитокины.
На фиг. 26В показано относительные количества Т-клеток в периферической крови.
На фиг. 26С показана частота встречаемости Ki67+ и ICOS+ Т-клеток (% от CD3).
На фиг. 26А-С значения представляют собой среднее значение ±SEM. N=3 животных на группу.
На фиг. 27 показано, что трижды гуманизированным мышам CD3/CD28/PSMA вводили разовую дозу антитела (0,25 или 2,5 мг/кг, как указано). У мышей брали кровь и собирали сыворотку через 4 ч (0 день) после введения дозы. Статистическую значимость рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Холма-Сидака. *р<0,05, **р<0,01, ****р<0,0001.
На фиг. 28 показано, что PSMAxCD28 ±PD1 не повышали сывороточные уровни цитокинов у мышей с опухолями.
На фиг. 29А и 29В показано, что PSMAxCD28 по отдельности или в комбинации с mAb к PD1 демонстрируют безопасный цитокиновый профиль in vivo у мышей без опухолей. Данные аналогичны представленным на фиг. 27. Трижды гуманизированным мышам CD3/CD28/PSMA вводили разовую дозу антитела (0,25 или 2,5 мг/кг, как указано). У мышей брали кровь и собирали сыворотку через 4 ч (0 день) и 72 ч (3 день) после введения дозы. Статистическую значимость рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Холма-Сидака. *р<0,05, **р<0,01, ****р<0,0001.
Подробное описание изобретения
Перед прочтением описания настоящего изобретения следует понимать, что данное изобретение не ограничивается определенными описанными методами и экспериментальными условиями, поскольку
- 8 045943 такие методы и условия могут варьироваться. Также следует понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания частных вариантов осуществления и не имеет ограничительного характера, поскольку объем данного изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. В контексте настоящего документа термин приблизительно применительно к конкретному приведенному числовому значению означает, что указанное значение может отличаться от приведенного значения не более чем на 1%. Например, в контексте настоящего документа выражение приблизительно 100 включает 99 и 101, и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).
Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, могут использоваться при практическом осуществлении или испытании данного изобретения, предпочтительные методы и материалы описаны далее. Все патенты, заявки и непатентные публикации, упомянутые в данном описании, включены в настоящее описание посредством ссылки во всей полноте.
Определения
Выражение CD28 в контексте настоящего документа относится к антигену, экспрессируемому на Т-клетках в качестве костимулирующего рецептора. CD28 человека содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74, и/или имеет аминокислотную последовательность, соответствующую регистрационному номеру NP_006130.1. Все ссылки на белки, полипептиды и фрагменты белков в настоящем документе подразумевают ссылки на человеческую версию соответствующего белка, полипептида или фрагмента белка, если явно не указано, что они принадлежат виду, отличному от человека. Таким образом, выражение CD28 означает CD28 человека, если не указано, что он принадлежит к виду, отличному от человека, например, мышиный CD28, обезьяний CD28 и т.д.
В контексте настоящего документа термин антитело, связывающее CD28 или антитело к CD28 включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают мономерный CD28, а также антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично распознают димерный CD28. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению могут связывать растворимый CD28 и/или CD28, экспрессируемый на клеточной поверхности. Растворимый CD28 включает природные белки CD28, а также рекомбинантные варианты белков CD28, такие как, например, мономерные и димерные конструкции CD28, в которых отсутствует трансмембранный домен или которые иным образом не связаны с клеточной мембраной.
В контексте настоящего документе выражение CD28, экспрессируемый на клеточной поверхности означает один или более белков CD28, которые экспрессируются на клеточной поверхности in vitro или in vivo, так что по меньшей мере часть белка CD28 находится снаружи внеклеточной стороны клеточной мембраны и доступна для антигенсвязывающей части антитела. CD28, экспрессируемый на клеточной поверхности включает белки CD28, содержащиеся в контексте функционального Т-клеточного костимулирующего рецептора в мембране клетки. Выражение CD28, экспрессируемый на поверхности клетки включает белок CD28, экспрессируемый как часть гомодимера на поверхности клетки. CD28, экспрессируемый на клеточной поверхности может содержать или состоять из белка CD28, экспрессируемого на поверхности клетки, которая обычно экспрессирует белок CD28. В качестве альтернативы, CD28, экспрессируемый на клеточной поверхности может содержать или состоять из белка CD28, экспрессируемого на поверхности клетки, которая обычно не экспрессирует CD28 человека на своей поверхности, но была искусственно генетически модифицирована для экспрессии CD28 на своей поверхности.
В контексте настоящего документа выражение антитело к CD28 включает как моновалентные антитела с одной специфичностью, так и биспецифичные антитела, содержащие первое плечо, которое связывает CD28, и второе плечо, которое связывает второй антиген (мишень), при этом плечо к CD28 содержит любую из последовательностей HCVR/LCVR или CDR, приведенных в табл. 1 в настоящем документе. Примеры биспецифичных антител к CD28 описаны в других местах в настоящем документе. Термин антигенсвязывающая молекула включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, включая, например, биспецифичные антитела.
Термин антитело в контексте настоящего документа означает любую антигенсвязывающую молекулу или молекулярный комплекс, содержащий по меньшей мере одну определяющую комплементарность область (CDR), которая специфично связывается или взаимодействует с определенным антигеном (например, CD28). Термин антитело включает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидных цепи - две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи - соединенные дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем документе как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем документе как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с
- 9 045943 более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В различных вариантах осуществления изобретения FR антитела к CD28 (или его антигенсвязывающей части) могут быть идентичны последовательностям зародышевой линии человека, или могут быть модифицированы естественным или искусственным образом. Консенсусная аминокислотная последовательность может быть определена на основе сравнительного анализа двух или более CDR.
Термин антитело в контексте настоящего документа также включает антигенсвязывающие фрагменты полноразмерных молекул антител. Термины антигенсвязывающая часть антитела, антигенсвязывающий фрагмент антитела и т.п. в контексте настоящего документа включают любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или генетически модифицированный полипептид или гликопротеин, который специфично связывает антиген с образованием комплекса. Антигенсвязывающие фрагменты антитела могут быть получены, например, из полноразмерных молекул антител с использованием любых подходящей стандартной методики, такой как протеолитическое расщепление или рекомбинантные методы генной инженерии, включающие обработку и экспрессию ДНК, кодирующей вариабельные и, необязательно, константные домены антител. Такая ДНК известна и/или легко доступна из, например, коммерческих источников, библиотек ДНК (включая, например, фаговые библиотеки антител), или может быть синтезирована. ДНК может быть секвенирована и обработана химически или с помощью методов молекулярной биологии, например, для размещения одного или нескольких вариабельных и/или константных доменов в подходящей конфигурации или для введения кодонов, создания цистеиновых остатков, модификации, добавления или удаления аминокислот и т.д.
Неограничивающие примеры антигенсвязывающих фрагментов включают: (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab')2; (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные рекогниционные единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область антитела (например, выделенную определяющую комплементарность область (CDR), например, пептид CDR3), или пептид с ограниченной конформационной свободой FR3-CDR3-FR4. Другие генетически модифицированные молекулы, такие как доменспецифичные антитела, однодоменные антитела, антитела с удаленным доменом, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела (например, моновалентные нанотела, двухвалентные нанотела и т.д.), иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (SMIP) и вариабельные домены акул IgNAR также охватываются выражением антигенсвязывающий фрагмент в контексте настоящего документа.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела в типичном случае содержит по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотный состав и, как правило, содержит по меньшей мере одну CDR, которая прилегает к одной или более каркасным последовательностям или находится в рамке считывания с ними. В антигенсвязывающих фрагментах, имеющих домен VH, ассоциированный с доменом VL, домены VH и VL могут быть расположены друг относительно друга в любом подходящем порядке. Например, вариабельная область может быть димерной и содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. В качестве альтернативы, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать мономерный домен VH или VL.
В отдельных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен, ковалентно связанный с по меньшей мере одним константным доменом. Неограничивающие иллюстративные конфигурации вариабельных и константных доменов, которые могут содержаться в антигенсвязывающем фрагменте антитела согласно настоящему изобретению, включают: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; и (xiv) VL-CL. В любой конфигурации вариабельных и константных доменов, в том числе любой из иллюстративных конфигураций, перечисленных выше, вариабельные и константные домены могут быть или непосредственно связаны друг с другом, или могут быть связаны полной или частичной шарнирной или линкерной областью. Шарнирная область может состоять по меньшей мере из 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, что приводит к гибкой или полугибкой связи между соседними вариабельными и/или константными доменами в одной молекуле полипептида. Кроме того, антигенсвязывающий фрагмент антитела может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) в любой из конфигураций вариабельного и константного доменов, перечисленных выше, в нековалентной ассоциации друг с другом и/или с одним или более мономерными доменами VH или VL (например, с помощью дисульфидной(ых) связи(ей)).
Как и в случае с полноразмерными молекулами антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными (например, биспецифичными). Мультиспецифичный антигенсвязывающий фрагмент антитела в типичном случае содержит по меньшей мере два разных вариабельных домена, при этом каждый из них способен специфично связываться со своим антигеном или с другим эпитопом на том же самом антигене. Любой формат мультиспецифичного антитела, включая иллюстративные форматы биспецифичных антител, раскрытые в настоящем документе, может быть
- 10 045943 адаптирован для применения в контексте антигенсвязывающего фрагмента антитела согласно настоящему изобретению с использованием стандартных методов, доступных в данной области техники.
Антитела согласно настоящему изобретению могут выполнять свою функцию посредством комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ) или антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ).
Комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ) относится к лизису антиген-экспрессирующих клеток посредством антитела согласно изобретению в присутствии комплемента. Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ) относится к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифичные цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, естественные киллеры (NK-клетки), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клеткемишени и тем самым приводят к ее лизису. КЗЦ и АЗКЦ могут быть измерены с использованием анализов, которые хорошо известны и доступны в данной области техники. (См., например, патенты США № 5500362 и 5821337, и Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652- 656). Константная область антитела важна для способности антитела фиксировать комплемент и опосредовать клеточнозависимую цитотоксичность. Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основании того, желательно ли для данного антитела опосредовать цитотоксичность.
В отдельных вариантах осуществления изобретения антитела к CD28 согласно изобретению (моноспецифичные или биспецифичные) представляют собой антитела человека. Подразумевается, что термин антитело человека в контексте настоящего документа включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфичного мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Однако термин антитело человека в контексте настоящего документа не подразумевает включение антител, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты на каркасные последовательности человека.
Антитела согласно изобретению могут, в некоторых вариантах осуществления, представлять собой рекомбинантные антитела человека. Подразумевается, что термин рекомбинантное антитело человека в контексте настоящего документа включает все антитела человека, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (дополнительно описаны ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека (дополнительно описаны ниже), антитела, выделенные у животного (например, мыши), трансгенного по генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:62876295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает в себя сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека с получением других последовательностей ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в отдельных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, в случае использования трансгенного по последовательностям Ig человека животного, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и родственны им, в естественных условиях не могут существовать в репертуаре зародышевой линии антитела человека in vivo.
Антитела человека могут существовать в двух формах, которые связаны с различиями шарнира. В одной форме молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию массой приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе межцепочечной дисульфидной связью между тяжелыми цепями. Во второй форме димеры не связаны межцепочечными дисульфидными связями, и образуется молекула массой приблизительно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно связанных легкой и тяжелой цепей (полуантитело). Эти формы чрезвычайно трудно разделить, даже после аффинной очистки.
Частота появления второй формы в различных интактных изотипах IgG обусловлена, не ограничиваясь перечисленным, структурными различиями, связанными с изотипом шарнирной области антитела. Одна аминокислотная замена в шарнирной области шарнира Ig человека G4 может значительно уменьшить частоту появления второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) до уровней, обычно наблюдаемых при использовании шарнира Ig человека G1. Данное изобретение охватывает антитела, имеющие одну или более мутаций в областях шарнира, СН2 или СН3, которые могут быть желательны, например, при производстве, для улучшения выхода желаемой формы антитела.
Антитела согласно изобретению могут представлять собой выделенные антитела. Выделенное антитело в контексте настоящего документа означает антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или извлечено из по меньшей мере одного компонента его естественной среды. Например, анти
- 11 045943 тело, которое было отделено или извлечено из по меньшей мере одного компонента организма, или из ткани или клетки, в которой антитело существует в природе или продуцируется естественным путем, является выделенным антителом в контексте настоящего изобретения. Выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела представляют собой антитела, которые были подвергнуты по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. Согласно отдельным вариантам осуществления выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного материала и/или химических веществ.
Настоящее изобретение также включает антитела с одним плечом, связывающие CD28. В контексте настоящего документа термин антитело с одним плечом означает антигенсвязывающую молекулу, содержащую одну тяжелую цепь антитела и одну легкую цепь антитела. Антитела с одним плечом согласно настоящему изобретению могут содержать любую из аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR или CDR, представленных в табл. 2.
Антитела к CD28 в настоящем документе или их антигенсвязывающие домены могут содержать одну или более аминокислотных замен, инсерций и/или делеций в каркасных областях и/или областях CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены антигенсвязывающие белки или антигенсвязывающие домены. Такие мутации могут быть легко установлены путем сравнения раскрытых в настоящем документе аминокислотных последовательностей с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие домены, полученные из любой из аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, в которых одна или более аминокислот в одной или более каркасных областях и/или областях CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело, или в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии человека, или в консервативную аминокислотную замену соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности в совокупности называются в настоящем документе мутациями зародышевой линии). Специалист в данной области техники, начиная с раскрытых в настоящем документе последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, может легко получить множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, содержащих одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В отдельных вариантах осуществления все каркасные остатки и/или остатки CDR в доменах VH и/или VL мутированы обратно в остатки, содержащиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело. В других вариантах осуществления только некоторые остатки мутированы обратно в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутированные остатки, содержащиеся в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутированные остатки, содержащиеся в CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или более каркасных остатков и/или остатков CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой было первоначально получено антитело). Кроме того, антитела или их антигенсвязывающие домены согласно настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию двух или более мутаций зародышевой линии в пределах каркасных областей и/или областей CDR, например, при которых некоторые отдельные остатки мутированы в соответствующий остаток определенной последовательности зародышевой линии, тогда как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохранены или мутированы в соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. После получения антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более мутаций зародышевой линии, могут быть легко проверены на наличие одного или нескольких желаемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в соответствующих случаях), сниженная иммуногенность и т.д. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, полученные таким общим образом, охватываются настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также включает антитела к CD28 и антигенсвязывающие молекулы, содержащие варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе. Иллюстративные варианты, включенные в данный аспект изобретения, включают варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе, имеющие одну или более консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает антитела и антигенсвязывающие молекулы к CD28, имеющие аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR с, например, 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативными аминокислотными заменами относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, представленных в табл. 1 в настоящем документе.
Термин эпитоп относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует с определенным антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связываться с
- 12 045943 различными областями на антигене и могут оказывать различные биологические действия. Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образован сближенными в пространстве аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образованный смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В определенных обстоятельствах эпитоп может включать фрагменты сахаридов, фосфорильных групп или сульфонильных групп на антигене.
Термин по существу идентичность или по существу идентичный применительно к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту означает, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными инсерциями или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) имеет место идентичность нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, составляющая по меньшей мере приблизительно 95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 96%, 97%, 98% или 99%, при измерении с помощью любого хорошо известного алгоритма определения идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или GAP, как обсуждается ниже. Молекула нуклеиновой кислоты, по существу идентичная референсной молекуле нуклеиновой кислоты, в определенных случаях может кодировать полипептид, имеющий такую же или по существу аналогичную аминокислотную последовательность, что и полипептид, кодируемый указанной референсной молекулой нуклеиновой кислоты.
Применительно к полипептидам термин по существу сходство или по существу схожий означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием штрафов за открытие гэпа по умолчанию, обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу R) со схожими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом консервативная аминокислотная замена по существу не приводит к изменению функциональных свойств белка. В случаях, когда две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности или степень сходства последовательностей могут быть скорректированы в большую сторону, чтобы внести поправку на консервативный характер замены. Средства для осуществления этой корректировки хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со схожими химическими свойствами, включают: (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; (3) амидосодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат, и (7) серосодержащие боковые цепи -цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В качестве альтернативы, консервативной заменой является любое изменение, имеющее положительное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Умеренно консервативной заменой является любое изменение, имеющее неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.
Сходство последовательностей для полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков подбирает схожие последовательности, применяя меры сходства, присвоенные различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG содержит такие программы, как Gap и Bestfit, которые могут быть использованы с параметрами по умолчанию для определения гомологии или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды от разных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с помощью FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами - программы в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивания и процент идентичности последовательностей областей наилучшего перекрытия между заданной и найденной последовательностями (см. Pearson (2000) выше). Еще одним предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности согласно изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей от разных организмов, является компьютерная программа BLAST, в особенности BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть моноспецифичными, биспецифичными
- 13 045943 или мультиспецифичными. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными к разным эпитопам одного полипептида-мишени или могут содержать антигенсвязывающие домены, специфичные к более чем одному полипептиду-мишени. См., например, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Антитела к CD28 согласно настоящему изобретению могут быть связаны или совместно экспрессированы с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одним или более другими молекулярными структурами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, в целях получения биспецифичного или мультиспецифичного антитела со второй специфичностью связывания.
Подразумевается, что использование выражения антитело к CD28 в настоящем документе включает как моноспецифичные антитела к CD28, так и биспецифичные антитела, содержащие CD28связывающее плечо и второе плечо, связывающее антиген-мишень. Таким образом, настоящее изобретение включает биспецифичные антитела, в которых одно плечо иммуноглобулина связывает CD28 человека, а другое плечо иммуноглобулина является специфичным к антигену-мишени. Антиген-мишень, с которым связывается другое плечо биспецифичного антитела к CD28, может представлять собой любой антиген, экспрессируемый на или вблизи клетки, ткани, органа, микроорганизма или вируса, против которых необходимо вызвать направленный иммунный ответ. CD28-связывαющее плечо может содержать любую из аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR или CDR, представленных в табл. 1 в настоящем документе. В отдельных вариантах осуществления CD28-связывaющее плечо связывает CD28 человека и индуцирует пролиферацию Т-клеток человека.
В контексте биспецифичных антител согласно настоящему изобретению, где одно плечо антитела связывает CD28, а другое плечо связывает антиген-мишень, указанный антиген-мишень может представлять собой опухолеассоциированный антиген, такой как PSMA.
Согласно отдельным иллюстративным вариантам осуществления настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, которые специфично связывают CD28 и PSMA. Такие молекулы могут называться в настоящем документе, например, биспецифичными молекулами антиCD28/анти-PSMA, или анти-CD28xPSMA, или CD28xPSMA, или анти-PSMA/анти-CD28, или анtu-PSMAxCD28, или PSMAxCD28, или с использованием другой подобной терминологии.
Термин PSMA в контексте настоящего документа относится к белку PSMA человека, если не указано, что он принадлежит к отличным от человеку видам (например, мышиный PSMA, обезьяний PSMA и т.д.). Белок PSMA человека имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 73, и/или имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую регистрационному номеру в NCBINP_004467.1.
Согласно отдельным иллюстративным вариантам осуществления, показанным на фиг. 1, биспецифичные антигенсвязывающие молекулы (например, биспецифичные антитела) могут иметь эффекторное плечо и нацеливающее плечо. Эффекторное плечо может представлять собой первый антигенсвязывающий домен (например, антитело к CD28), который связывается с антигенами на эффекторных клетках (например, Т-клетках). Нацеливающее плечо может представлять собой второй антигенсвязывающий домен (например, антитело к PSMA), который связывается с антигенами на клетках-мишенях (например, опухолевых клетках). Согласно отдельным иллюстративным вариантам осуществления эффекторное плечо связывается с CD28, а нацеливающее плечо связывается с PSMA. Биспецифичная молекула к CD28/PSMA может передавать костимулирующий сигнал эффекторным клеткам (например, Т-клеткам). Эффекторное плечо неспособно стимулировать Т-клетки в отсутствие кластеризации. При кластеризации эффекторное плечо само по себе незначительно стимулирует Т-клетки. В комбинации с нацеливающим плечом эффекторное плечо стимулирует Т-клетки. Плечо, нацеленное на опухоль, может иметь несовершенную специфичность к опухоли. Антиген, который является мишенью для нацеливающего плеча (например, PSMA), может экспрессироваться на части опухолевых клеток. Специфичность плеча, нацеленного на опухоль, может быть увеличена путем перекрытия комбинацией с биспецифичными антигенсвязывающими молекулами к CD3 (например, биспецифичным антителом к CD3/PSMA).
В контексте настоящего документа выражение антигенсвязывающая молекула означает белок, полипептид или молекулярный комплекс, содержащий или состоящий по меньшей мере из одной определяющей комплементарность области (CDR), которая по отдельности или в комбинации с одной или более дополнительными CDR и/или каркасными областями (FR) специфично связывается с определенным антигеном. В отдельных вариантах осуществления антигенсвязывающая молекула представляет собой антитело или фрагмент антитела в соответствии с определениями этих терминов в других местах в настоящем документе.
В контексте настоящего документа документе выражение биспецифичная антигенсвязывающая молекула означает белок, полипептид или молекулярный комплекс, содержащий по меньшей мере первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен. Каждый антигенсвязывающий домен в биспецифичной антигенсвязывающей молекуле содержит по меньшей мере одну CDR, которая сама по себе или в комбинации с одной или более дополнительными CDR и/или FR специфично связы
- 14 045943 вается с определенным антигеном. В контексте настоящего изобретения первый антигенсвязывающий домен специфично связывает первый антиген (например, CD28), а второй антигенсвязывающий домен специфично связывает второй, другой антиген (например, PSMA).
В отдельных иллюстративных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифичная антигенсвязывающая молекула представляет собой биспецифичное антитело. Каждый антигенсвязывающий домен биспецифичного антитела содержит вариабельный домен тяжелой цепи (HCVR) и вариабельный домен легкой цепи (LCVR). В контексте биспецифичной антигенсвязывающей молекулы, содержащей первый и второй антигенсвязывающий домены (например, биспецифичного антитела), CDR первого антигенсвязывающего домена могут быть обозначены префиксом D1, a CDR второго антигенсвязывающего домена могут быть обозначены префиксом D2. Таким образом, CDR первого антигенсвязывающего домена могут называться в настоящем документе D1-HCDR1, D1-HCDR2 и D1-HCDR3; a CDR второго антигенсвязывающего домена могут называться в настоящем документе D2-HCDR1, D2HCDR2 и D2-HCDR3.
Первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен могут быть непосредственно или опосредованно связаны друг с другом с образованием биспецифичной антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению. В качестве альтернативы, каждый из первого антигенсвязывающего домена и второго антигенсвязывающего домена может быть соединен с отдельным мультимеризирующим доменом. Ассоциация одного мультимеризующего домена с другим мультимеризующим доменом облегчает ассоциацию между двумя антигенсвязывающими доменами, тем самым обеспечивая образование биспецифичной антигенсвязывающей молекулы. В контексте настоящего документа термин мультимеризующий домен означает любую макромолекулу, белок, полипептид, пептид или аминокислоту, обладающие способностью ассоциировать со вторым мультимеризующим доменом такой же или подобной структуры или состава. Например, мультимеризующий домен может представлять собой полипептид, содержащий домен СН3 иммуноглобулина. Неограничивающим примером мультимеризующего компонента является Fc-часть иммуноглобулина (содержащая домен СН2-СН3), например, Fc-домен IgG, выбранного из изотипов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, a также любого аллотипа в группе каждого изотипа.
Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению в типичном случае содержат два мультимеризующих домена, например, два Fc-домена, каждый из которых в отдельности является частью отдельной тяжелой цепи антитела. Первый и второй мультимеризующие домены могут относиться к одному и тому же изотипу IgG, например, к IgG1/IgG1, IgG2/IgG2, IgG4/IgG4. В качестве альтернативы, первый и второй мультимеризующие домены могут относиться к разным изотипам IgG, например, к IgG1/IgG2, IgG1/IgG4, IgG2/IgG4 и т.д.
В отдельных вариантах осуществления мультимеризующий домен представляет собой Fc-фрагмент или аминокислотную последовательность длиной от 1 до приблизительно 200 аминокислот, содержащую по меньшей мере один цистеиновый остаток. В других вариантах осуществления мультимеризующий домен представляет собой цистеиновый остаток или короткий цистеинсодержащий пептид. Другие мультимеризующие домены включают пептиды или полипептиды, содержащие или состоящие из лейциновой молнии, мотива спираль-петля или мотива суперспирали.
Для получения биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению может быть использован любой формат биспецифичных антител или технология. Например, антитело или его фрагмент, имеющие первую антигенсвязывающую специфичность, могут быть функционально связаны (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одной или более другими молекулярными структурами, такими как другое антитело или фрагмент антитела, имеющими вторую антигенсвязывающую специфичность, в целях получения биспецифичной антигенсвязывающей молекулы. Конкретные иллюстративные биспецифичные форматы, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают, не ограничиваясь перечисленным, например, биспецифичные форматы на основе scFv или диател, слияния IgG-scFv, двойной вариабельный домен (OVO)-Ig, квадрогибридому, выступы во впадины, общую легкую цепь (например, общую легкую цепь с взаимодействием по типу выступы во впадины и т.д.), CrossMab, CrossFab, (SEEO)body, лейциновую молнию, Duobody, IgG1/IgG2, Fab (OAF)-IgG двойного действия и биспецифичные форматы Mab2 (обзор вышеуказанных форматов см., например, в Klein et a/. 2012, mAbs 4:6, 111, и цитируемых в нем источниках).
В контексте биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению мультимеризующие домены, например, Fc-домены, могут содержать одно или более изменений аминокислот (например, инсерции, делеции или замены) по сравнению со встречающейся в природе версией Fc-домена дикого типа. Например, изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие одну или более модификаций в Fc-домене, приводящих к модифицированному Fcдомену, имеющему модифицированное связывающее взаимодействие (например, повышенное или пониженное) между Fc и FcRn. В одном из вариантов осуществления биспецифичная антигенсвязывающая молекула содержит модификацию в области CH2 или СН3, причем указанная модификация увеличивает аффинность домена Fc к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где рН составляет от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, на
- 15 045943 пример, модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, LN/FIW или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/EID или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, UR/S/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или V); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В одном из вариантов осуществления модификация включает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 2591 (например, V2591) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).
Настоящее изобретение также включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие первый домен СН3 и второй домен СН3 Ig, причем первый и второй домены СН3 Ig отличаются друг от друга по меньшей мере одной аминокислотой, и причем отличие по меньшей мере в одной аминокислоте снижает связывание биспецифичного антитела с белком А по сравнению с биспецифичным антителом, не имеющим отличия в аминокислоте. В одном из вариантов осуществления первый домен СН3 Ig связывает белок А, а второй домен СН3 Ig содержит мутацию, которая снижает или устраняет связывание белка А, такую как модификация H95R (согласно нумерации экзонов IMGT; H435R согласно нумерации EU). Второй СН3 может дополнительно содержать модификацию Y96F (согласно IMGT; согласно Y436F EU). Другие модификации, которые могут содержаться во втором СН3, включают: D16E, L 18M, N44S, K52N, V57M и V821 (согласно IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M и V4221 согласно EU) в случае антител IgG1; N44S, K52N и V821 (IMGT; N384S, K392N и V4221 согласно EU) в случае антител IgG2; и Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q и V821 (согласно IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q и V4221 согласно EU) в случае антител IgG4.
В отдельных вариантах осуществления Fc-домен может быть химерным и содержать комбинацию последовательностей Fc, полученных от более чем одного изотипа иммуноглобулина. Например, химерный Fc-домен может содержать часть или всю последовательность СН2, полученную из области СН2 Ig человека G1, Ig человека G2 или Ig человека G4, и часть или всю последовательность СН3, полученную из Ig человека G1, Ig человека G2 или Ig человека G4. Химерный Fc-домен может также содержать химерную шарнирную область. Например, химерный шарнир может содержать верхнюю шарнирную последовательность, полученную из шарнирной области Ig человека G1, Ig человека G2 или Ig человека G4, в комбинации с нижней шарнирной последовательностью, полученной из шарнирной области Ig человека G1, Ig человека G2 или Ig человека G4. Конкретный пример химерного Fc-домена, который может быть включен в любую из антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, содержит, от N- к С-концу: [IgG4 СН1] - [верхний шарнир IgG4] - [нижний шарнир IgG2] - [IgG4 CH2] - [IgG4 CH3]. Еще один пример химерного Fc-домена, который может быть включен в любую из антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, содержит, от N- к С-концу: [IgG1 СН1] [верхний шарнир IgG1] -[нижний шарнир IgG2] - [IgG4 СН2] - [IgG1 СН3]. Эти и другие примеры химерных Fc-доменов, которые могут быть включены в любую из антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению, описаны в заявке WO 2014/022540 А1. Химерные Fc-домены, имеющие такое общее строение, и их варианты могут обладать измененным связыванием с Fc-рецептором, которое, в свою очередь, влияет на эффекторную функцию Fc.
Варианты последовательностей.
Антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать одну или более аминокислотных замен, инсерций и/или делеций в каркасных областях и/или областях CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых были получены отдельные антигенсвязывающие домены. Такие мутации могут быть легко установлены путем сравнения раскрытых в настоящем документе аминокислотных последовательностей с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, из общедоступных баз данных последовательностей антител. Антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать антигенсвязывающие фрагменты, полученные из любой из иллюстративных аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем документе, в которых одна или более аминокислот в одной или более каркасных областях и/или областях CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) последовательности зародышевой линии, из которой было получено антитело, или в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии человека, или в консервативную аминокислотную замену соответствующего остатка(ов) зародышевой линии (такие изменения последовательности в совокупности называются в настоящем документе мутациями зародышевой линии). Специалист в данной области техники, начиная с раскрытых в настоящем документе последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, может легко получить множество антител и антигенсвязывающих фрагментов, содержащих одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинации. В отдельных вариантах осуществления все каркасные остатки и/или остатки CDR в доменах VH и/или VL мутированы обратно в остатки, содержащиеся в исходной последовательности зародышевой линии, из которой был первоначально получен антигенсвязывающий домен. В других вариантах осуществления только некоторые остатки мутированы обратно
- 16 045943 в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутированные остатки, содержащиеся в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутированные остатки, содержащиеся в CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или более каркасных остатков и/или остатков CDR мутированы в соответствующий остаток (остатки) другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, которая отличается от последовательности зародышевой линии, из которой был первоначально получен антигенсвязывающий домен). Кроме того, антигенсвязывающие домены могут содержать любую комбинацию двух или более мутаций зародышевой линии в пределах каркасных областей и/или областей CDR, например, при которых некоторые отдельные остатки мутированы в соответствующий остаток определенной последовательности зародышевой линии, тогда как некоторые другие остатки, которые отличаются от исходной последовательности зародышевой линии, сохранены или мутированы в соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии.
После получения антигенсвязывающие домены, содержащие одну или более мутаций зародышевой линии, могут быть легко проверены на наличие одного или нескольких желаемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или усиленные антагонистические или агонистические биологические свойства (в соответствующих случаях), сниженная иммуногенность и т.д. Биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие один или более антигенсвязывающих доменов, полученных по этому общему принципу, охватываются настоящим изобретением.
Настоящее изобретение также включает антигенсвязывающие молекулы, где один или оба антигенсвязывающих домена содержат варианты любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе, имеющие одну или более консервативных замен. Например, настоящее изобретение включает антигенсвязывающие молекулы, содержащие антигенсвязывающий домен, имеющий аминокислотные последовательности HCVR, LCVR и/или CDR с, например, 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативными аминокислотными заменами относительно любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе. Консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу R) со схожими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом консервативная аминокислотная замена по существу не приводит к изменению функциональных свойств белка. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со схожими химическими свойствами, включают: (1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; (2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; (3) амидосодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; (4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; (5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; (6) кислые боковые цепи: аспартат и глутамат, и (7) серосодержащие боковые цепи - цистеин и метионин. Предпочтительными группами консервативных аминокислотных замен являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В качестве альтернативы, консервативной заменой является любое изменение, имеющее положительное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Умеренно консервативной заменой является любое изменение, имеющее неотрицательное значение в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.
Настоящее изобретение также включает антигенсвязывающие молекулы, содержащие антигенсвязывающий домен, имеющий аминокислотную последовательность HCVR, LCVR и/или CDR, по существу идентичную любой из аминокислотных последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, раскрытых в настоящем документе. Термин по существу идентичность или по существу идентичный применительно к аминокислотной последовательности означает, что две аминокислотные последовательности при оптимальном выравнивании, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием штрафов за открытие гэпа по умолчанию, обладают по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% или 99% идентичностью последовательностей. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. В случаях, когда две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности или степень сходства последовательностей могут быть скорректированы в большую сторону, чтобы внести поправку на консервативный характер замены. Средства для осуществления этой корректировки хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331.
Сходство последовательностей для полипептидов, которое также называют идентичностью последовательностей, обычно измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков подбирает схожие последовательности, применяя меры сходства, присвоенные различным заменам, делециям и другим модификациям, в том числе консервативным аминокислотным заменам. Например, программное обеспечение GCG содержит такие программы, как Gap и Bestfit, которые могут быть использованы с параметрами по умолчанию для опре
- 17 045943 деления гомологии или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды от разных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутеином. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать с помощью FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами - программы в GCG версии 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивания и процент идентичности последовательностей областей наилучшего перекрытия между заданной и найденной последовательностями (см. Pearson (2000) выше). Еще одним предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности согласно изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей от разных организмов, является компьютерная программа BLAST, в особенности BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
рН-зависимое связывание.
Настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/антиPSMA с рН-зависимыми характеристиками связывания. Например, антитело к CD28 согласно настоящему изобретению может демонстрировать пониженное связывание с CD28 при кислом рН по сравнению с нейтральным рН. В качестве альтернативы, антитела к PSMA согласно изобретению могут демонстрировать повышенное связывание с PSMA при кислом рН по сравнению с нейтральным рН. Выражение кислый рН включает значения рН менее приблизительно 6,2, например, приблизительно 6,0, 5,95, 5,9, 5,85, 5,8, 5,75, 5,7, 5,65, 5,6, 5,55, 5,5, 5,45, 5,4, 5,35, 5,3, 5,25, 5,2, 5,15, 5,1, 5,05, 5,0 или менее. В контексте настоящего документа выражение нейтральный рН означает рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,4. Выражение нейтральный рН включает значения рН, равные приблизительно 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35 и 7,4.
В некоторых случаях пониженное связывание ... при кислом рН по сравнению с нейтральным рН выражается посредством отношения значения KD связывания антитела с его антигеном при кислом рН к значению KD связывания антитела с его антигеном при нейтральном рН (или наоборот). Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно рассматривать как демонстрирующие пониженное связывание с CD28 при кислом рН по сравнению с нейтральным рН в контексте настоящего изобретения, если указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент демонстрируют отношение кислой/нейтральной KD, равное приблизительно 3,0 или более. В отдельных иллюстративных вариантах осуществления отношение кислой/нейтральной KD для антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению может составлять приблизительно 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 100,0 или более.
Антитела с рН-зависимыми характеристиками связывания могут быть получены, например, путем скрининга популяции антител на предмет пониженного (или повышенного) связывания с определенным антигеном при кислом рН по сравнению с нейтральным рН. Кроме того, модификации антигенсвязывающего домена на аминокислотном уровне могут давать антитела с рН-зависимыми характеристиками. Например, путем замены одной или нескольких аминокислот антигенсвязывающего домена (например, в CDR) остатком гистидина можно получить антитело с пониженным связыванием антигена при кислом рН по сравнению с нейтральным рН.
Антитела, содержащие варианты Fc.
Согласно отдельным вариантам осуществления настоящего изобретения предложены биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/анти-PSMA, содержащие Fc-домен, содержащий одну или более мутаций, которые повышают или понижают связывание антитела с рецептором FcRn, например, при кислом рН по сравнению с нейтральным рН. Например, настоящее изобретение включает антитела и антигенсвязывающие молекулы, содержащие мутацию в области СН2 или СН3 Fc-домена, где мутациями) увеличивает аффинность Fc-домена к FcRn в кислой среде (например, в эндосоме, где рН составляет от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0). Такие мутации могут приводить к увеличению периода полужизни антитела в сыворотке крови при введении животному. Неограничивающие примеры таких модификаций Fc включают, например, модификацию в положении 250 (например, Е или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или Т), 254 (например, S или Т) и 256 (например, S/R/Q/E/D или Т); или модификацию в положении 428 и/или 433 (например, H/L/R/S/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в положении 250 и/или 428; или модификацию в положении 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В одном из вариантов осуществления модификация включает модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 259I (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254Т и 256Е); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); и модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308Р).
Например, настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы антиCD28/анти-PSMA, содержащие Fc-домен, содержащий одну или более пар или групп мутаций, выбранных из группы, состоящей из: 250Q и 248L (например, T250Q и M248L); 252Y, 254Т и 256Е (например, M252Y, S254T и Т256Е); 428L и 434S (например, M428L и N434S); и 433K и 434F (например, H433K и
- 18 045943
N434F). Все возможные комбинации вышеупомянутых мутаций Fc-домена и других мутаций в вариабельных доменах антитела, раскрытых в настоящем документе, предусмотрены в объеме настоящего изобретения.
Биологические характеристики антител и антигенсвязывающих молекул.
Настоящее изобретение включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают CD28 человека и/или PSMA с высокой аффинностью. Настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают CD28 человека и/или PSMA со средней или низкой аффинностью, в зависимости от терапевтического контекста и конкретных требуемых свойств нацеливания. Например, в контексте биспецифичной антигенсвязывающей молекулы, в которой одно плечо связывает CD28, а другое плечо связывает антиген-мишень (например, PSMA), может быть желательно, чтобы плечо, связывающее антиген-мишень, связывало его с высокой аффинностью, а плечо к CD28 связывало CD28 только с умеренной или низкой аффинностью. Таким образом может быть достигнуто избирательное нацеливание антигенсвязывающей молекулы на клетки, экспрессирующие антиген-мишень, при одновременном предотвращении неизбирательного/нецелевого связывания CD28 и связанных с этим сопутствующих побочных действий.
Согласно отдельным вариантам осуществления настоящее изобретение включает антитела и антигенсвязывающие фрагменты антител, которые связывают CD28 человека (например, при 25°C) с KD менее чем приблизительно 210 нМ при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа согласно примеру 3 в настоящем документе. В отдельных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению связывают CD28 с KD менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 130 нМ, менее чем приблизительно 120 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 80 нМ, менее чем приблизительно 60 нМ, менее чем приблизительно 40 нМ или менее чем приблизительно 30 нМ при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например, с использованием формата анализа согласно примеру 3 в настоящем документе или по существу схожего анализа. В отдельных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению связывают CD28 с KD от приблизительно 30 нМ до приблизительно 207 нМ.
Настоящее изобретение также включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают CD28 с диссоциативным периодом полужизни (t1/2), превышающим приблизительно 3,5 мин при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, с использованием формата анализа согласно примеру 3 в настоящем документе или по существу схожего анализа. В отдельных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению связывают CD28 с t1/2 более чем приблизительно 5 мин, более чем приблизительно мин, более чем приблизительно 20 мин, более чем приблизительно 30 мин, более чем приблизительно мин, более чем приблизительно 50 мин, более чем приблизительно 60 мин, более чем приблизительно мин, более чем приблизительно 80 мин, более чем приблизительно 90 мин, более чем приблизительно
100 мин, более чем приблизительно 200 мин, более чем приблизительно 300 мин, более чем приблизительно 400 мин, более чем приблизительно 500 мин, более чем приблизительно 600 мин, более чем приблизительно 700 мин, более чем приблизительно 800 мин, более чем приблизительно 900 мин, более чем приблизительно 1000 мин или более чем приблизительно 1200 мин при измерении с помощью поверхностного плазмонного резонанса при 25 или 37°C, например, с использованием формата анализа согласно примеру 3 в настоящем документе или по существу схожего анализа.
Настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы (например, биспецифичные антитела), способные одновременно связываться с CD28 человека и PSMA человека. Согласно отдельным вариантам осуществления биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению специфично взаимодействуют с клетками, экспрессирующими CD28 и/или PSMA. Степень, в которой биспецифичная антигенсвязывающая молекула связывает клетки, экспрессирующие CD28 и/или PSMA, может быть оценена методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), как проиллюстрировано в примере 4 в настоящем документе. Например, настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, специфично связывающие линии клеток человека, экспрессирующие CD28, но не PSMA (например, HEK293, генетически модифицированные для экспрессии CD28), и линии клеток карциномы предстательной железы человека, экспрессирующие PSMA, но не CD28 (например, С4-2). Настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, связывающие любые из вышеупомянутых клеток и линий клеток со значением ЕС50 от приблизительно 9,6х10-9 до приблизительно 3,5х10-101 или менее при определении с использованием анализа FACS согласно примеру 4 или по существу схожего анализа.
Настоящее изобретение также относится к биспецифичным антигенсвязывающим молекулам антиCD28/анти-PSMA, которые индуцируют или увеличивают опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток. Например, настоящее изобретение включает антитела к CD28xPSMA, которые индуцируют или увеличивают опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток с ЕС50 менее чем приблизительно 78 пМ при измерении в анализе опосредованного Т-клетками уничтожения опухо
- 19 045943 левых клеток in vitro, например, с использованием формата анализа согласно примеру 6 в настоящем документе (например, оценки степени уничтожения опухолевых клеток С4-2 МНПК человека в присутствии антител к CD28xPSMA) или по существу схожего анализа. В отдельных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящему изобретению индуцируют опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток (например, опосредованное МНПК уничтожение клеток С4-2) со значением ЕС50 менее чем приблизительно 40 пМ, менее чем приблизительно 20 пМ, менее чем приблизительно 16 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ, менее чем приблизительно 5,0 пМ, менее чем приблизительно 4,0 пМ, менее чем приблизительно 3,0 пМ, менее чем приблизительно 2,5 пМ, менее чем приблизительно 2,0 пМ, менее чем приблизительно 1,5 пМ или менее чем приблизительно 1,45 пМ при измерении в анализе опосредованного Т-клетками уничтожения опухолевых клеток in vitro, например, с использованием формата анализа согласно примеру 6 в настоящем документе или по существу схожего анализа.
Настоящее изобретение также включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы антиCD28/анти-PSMA, которые связываются с экспрессирующими CD28 Т-клетками человека со значением ЕС50 от 1,0 пМ до 1000 нМ. В отдельных вариантах осуществления биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/анти-PSMA связываются с экспрессирующими CD28 Т-клетками человека со значением ЕС50 от 48 нМ до 180 нМ. Например, настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/анти-PSMA, которые связываются с экспрессирующими CD28 Тклетками человека со значением ЕС50, равным приблизительно 1 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 10 нМ, приблизительно 20 нМ, приблизительно 30 нМ, приблизительно 40 нМ, приблизительно 50 нМ, приблизительно 60 нМ, приблизительно 70 нМ, приблизительно 80 нМ, приблизительно 90 нМ, приблизительно 100 нМ, приблизительно 200 нМ, приблизительно 300 нМ, приблизительно 500 нМ, приблизительно 800 нМ, приблизительно 1000 нМ или более.
Настоящее изобретение также включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы антиCD28/анти-PSMA, демонстрирующие одну или более характеристик, выбранных из группы, состоящей из: (a) индукции пролиферации Т-клеток in vitro (см., например, пример 8 в настоящем документе); (b) активации Т-клеток, индукции повышающей регуляции CD25 и PD-1 в МНПК человека (см., например, пример 8 в настоящем документе); (с) повышения опосредованной Т-клетками человека цитотоксичности в отношении линий клеток, экспрессирующих PSMA (см., например, пример 8 в настоящем документе); (d) индукции опосредованной наивными Т-клетками приматов цитотоксичности в отношении линий клеток, экспрессирующих PSMA (см., например, пример 8 в настоящем документе); (е) истощения опухолевых клеток у мышей (например, пример 10 в настоящем документе); (f) повышения элиминации опухоли у мышей (например, пример 10 в настоящем документе); (g) отсутствия индукции цитокинового шторма (например, пример 10 в настоящем документе); (h) отсутствия индукции системного действия Тклеток у яванского макака (например, пример 11 в настоящем документе); (i) усиления влияния блокады PD-1 на индуцированное активацией Т-клеток уничтожение опухолевых клеток (например, пример 13 в настоящем документе); (j) усиления экспансии Т-клеток памяти (например, пример 13 в настоящем документе).
Настоящее изобретение включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы антu-CD28/антuPSMA, способные сокращать пул опухолевых клеток у субъекта (см., например, пример 8). Например, согласно отдельным вариантам осуществления предложены биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/анmи-PSMA, где разовое введение биспецифичной антигенсвязывающей молекулы субъекту (например, в дозе приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,08 мг/кг, приблизительно 0,06 мг/кг приблизительно 0,04 мг/кг, приблизительно 0,04 мг/кг, приблизительно 0,02 мг/кг, приблизительно 0,01 мг/кг или менее) вызывает уменьшение количества опухолевых клеток у субъекта.
Картирование эпитопа и связанные технологии.
Эпитоп на CD28 или PSMA, с которым связываются антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению, может состоять из одной непрерывной последовательности из 3 или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) аминокислот белка CD28 или белка PSMA. В качестве альтернативы, эпитоп может состоять из множества несмежных аминокислот (или аминокислотных последовательностей) CD28 или PSMA. Антитела согласно изобретению могут взаимодействовать с аминокислотами, содержащимися в мономере CD28, или могут взаимодействовать с аминокислотами на двух разных цепях CD28 димера CD28. Термин эпитоп в контексте настоящего документа относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует с определенным антигенсвязывающим сайтом в вариабельной области молекулы антитела, известным как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, разные антитела могут связываться с разными областями на антигене и могут оказывать разные биологические действия. Эпитопы могут быть конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образован сближенными в пространстве аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образованный смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В определенных обстоятельствах эпитоп может включать фрагменты сахаридов, фосфорильных групп или сульфонильных
- 20 045943 групп на антигене.
Различные методики, известные специалистам в данной области техники, могут быть использованы для определения того, взаимодействует ли с одной или более аминокислотами в полипептиде или белке антигенсвязывающий домен антитела. Иллюстративные методы, которые могут быть использованы для определения эпитопа или связывающего домена определенного антитела или антигенсвязывающего домена, включают, например, стандартный перекрестный конкурентный анализ, такой как описанный в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), точечный мутагенез (например, мутагенез с аланиновым сканированием, мутагенез с аргининовым сканированием и т.д.), блотанализ пептидов (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), анализ с защитой от протеаз и анализ с использованием расщепления пептидов. Кроме того, могут быть использованы такие методы, как вырезание эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Еще одним методом, который можно использовать для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым взаимодействует антитело, является водородно-дейтериевый обмен, определяемый с помощью масс-спектрометрии. В общих чертах, метод водородно-дейтериевого обмена включает мечение дейтерием представляющего интерес белка с последующим связыванием антитела с меченым дейтерием белком. Затем комплекс белок/антитело переносят в воду, чтобы обеспечить протекание водородно-дейтериевого обмена на всех остатках, за исключением остатков, защищенных антителом (которые остаются мечеными дейтерием). После диссоциации антитела целевой белок подвергают расщеплению протеазой и масс-спектрометрическому анализу, тем самым выявляя меченые дейтерием остатки, которые соответствуют конкретным аминокислотам, с которыми взаимодействует антитело. См., например, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Рентгенодифракционный анализ кристаллической структуры также может быть использован для идентификации аминокислот в полипептиде, с которым взаимодействует антитело.
Настоящее изобретение дополнительно включает антитела к CD28 и к PSMA, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое из конкретных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе (например, антител, содержащих любую из аминокислотных последовательностей, представленных в табл. 1 в настоящем документе). Аналогичным образом настоящее изобретение также включает антитела к CD28 и/или к PSMA, которые конкурируют за связывание с CD28 и/или PSMA с любым из конкретных иллюстративных антител, описанных в настоящем документе (например, антителами, содержащими любую из аминокислотных последовательностей, представленных в табл. 1 в настоящем документе).
Настоящее изобретение также включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28 человека, и второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывает PSMA человека, где указанный первый антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом на CD28, что и любой из конкретных иллюстративных CD28-специфичных антигенсвязывающих доменов, описанных в настоящем документе, и/или где указанный второй антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом на PSMA, что и любой из конкретных иллюстративных PSMA-специфичных антигенсвязывающих доменов, описанных в настоящем документе.
Аналогичным образом настоящее изобретение также включает биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28 человека, и второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфично связывает PSMA человека, где указанный первый антигенсвязывающий домен конкурирует за связывание с CD28 с любым из конкретных иллюстративных CD28-специфичных антигенсвязывающих доменов, описанных в настоящем документе, и/или где указанный второй антигенсвязывающий домен конкурирует за связывание с PSMA с любым из конкретных иллюстративных PSMA-специфичных антигенсвязывающих доменов, описанных в настоящем документе.
Можно легко определить, связывается ли конкретная антигенсвязывающая молекула (например, антитело) или ее антигенсвязывающий домен с тем же эпитопом, что и референсная антигенсвязывающая молекула согласно настоящему изобретению, или конкурирует ли она с ней за связывание, используя стандартные методы, известные в данной области техники. Например, чтобы определить, связывается ли исследуемое антитело с тем же эпитопом на CD28 (или PSMA), что и референсная биспецифичная антигенсвязывающая молекула согласно настоящему изобретению, референсной биспецифичной молекуле сначала дают связываться с белком CD28 (или белком PSMA). Затем оценивают способность исследуемого антитела связываться с молекулой CD28 (или PSMA). Если исследуемое антитело способно связываться с CD28 (или PSMA) после насыщающего связывания с референсной биспецифичной антигенсвязывающей молекулой, можно сделать вывод, что исследуемое антитело связывается с эпитопом CD28 (или PSMA), отличным от связываемого референсной биспецифичной антигенсвязывающей молекулой. С другой стороны, если исследуемое антитело неспособно связываться с молекулой CD28 (или PSMA) после насыщающего связывания с референсной биспецифичной антигенсвязывающей молекулой, то исследуемое антитело может связываться с тем же эпитопом CD28 (или PSMA), что и эпитоп, связанный референсной биспецифичной антигенсвязывающей молекулой согласно изобретению. Затем может быть
- 21 045943 проведен дополнительный стандартный эксперимент (например, анализ мутаций и связывания пептида) для подтверждения того, связано ли фактически наблюдаемое отсутствие связывания исследуемого антитела со связыванием с тем же самым эпитопом, что и референсная антигенсвязывающая молекула, или отсутствие наблюдаемого связывания обусловлено стерическим блокированием (или другим явлением). Эксперименты такого типа могут быть проведены с помощью ELISA, RIA, Biacore, проточной цитометрии или любого другого количественного или качественного анализа связывания антител, доступного в данной области техники. Согласно отдельным вариантам осуществления настоящего изобретения два антигенсвязывающих белка связываются с одним и тем же (или перекрывающимся) эпитопом, если, например, 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антигенсвязывающего белка ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, но предпочтительно на 75%, 90% или даже на 99% при измерении в анализе конкурентного связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). В качестве альтернативы считают, что два антигенсвязывающих белка связываются с одним и тем же эпитопом, если по существу все аминокислотные мутации в антигене, которые уменьшают или устраняют связывание одного антигенсвязывающего белка, уменьшают или устраняют связывание другого. Считают, что два антигенсвязывающих белка имеют перекрывающиеся эпитопы, если только подмножество аминокислотных мутаций, которые уменьшают или устраняют связывание одного антигенсвязывающего белка, уменьшают или устраняют связывание другого.
Чтобы определить, конкурирует ли антитело или его антигенсвязывающий домен за связывание с референсной антигенсвязывающей молекулой, описанную выше методику определения связывания применяют в двух ориентациях: в первой ориентации референсной антигенсвязывающей молекуле дают связываться с белком CD28 (или белком PSMA) в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания исследуемого антитела с молекулой CD28 (или PSMA). Во второй ориентации исследуемому антителу дают связываться с молекулой CD28 (или PSMA) в насыщающих условиях с последующей оценкой связывания референсной антигенсвязывающей молекулы с молекулой CD28 (или PSMA). Если в обеих ориентациях только первая (насыщающая) антигенсвязывающая молекула способна связываться с молекулой CD28 (или PSMA), то делают вывод, что исследуемое антитело и референсная антигенсвязывающая молекула конкурируют за связывание с CD28 (или PSMA). Как будет понятно специалисту в данной области техники, антитело, которое конкурирует за связывание с референсной антигенсвязывающей молекулой, не обязательно должно связываться с тем же эпитопом, что и референсное антитело, но может стерически блокировать связывание референсного антитела путем связывания перекрывающегося или соседнего эпитопа.
Получение антигенсвязывающих доменов и конструирование биспецифичных молекул.
Антигенсвязывающие домены, специфичные к конкретным антигенам, могут быть получены с помощью любой технологии получения антител, известной в данной области техники. После получения два разных антигенсвязывающих домена, специфичные к двум разным антигенам (например, CD28 и PSMA), можно соответствующим образом расположить друг относительно друга для получения биспецифичной антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению с использованием стандартных методов. (Обсуждение иллюстративных форматов биспецифичных антител, которые могут применяться для конструирования биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению, приведено в других местах в настоящем документе). В отдельных вариантах осуществления один или более отдельных компонентов (например, тяжелая и легкая цепи) мультиспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно изобретению получены из химерных, гуманизированных или полностью антител человека. Способы получения таких антител хорошо известны в данной области техники. Например, одна или более тяжелых и/или легких цепей биспецифичных антигенсвязывающих молекул согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием технологии VELOCIMMUNE™. Используя технологию VELOCIMMUNE™ (или любую другую технологию получения антител человека), первоначально выделяют химерные антитела с высокой аффинностью к определенному антигену (например, CD28 или PSMA), имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Определяют характеристики антител и осуществляют их отбор по желаемым характеристикам, включая аффинность, селективность, эпитоп и т.д. Мышиные константные области заменяют желаемой человеческой константной областью для создания полностью человеческих тяжелых и/или легких цепей, которые могут быть включены в биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению.
Для получения биспецифичных антигенсвязывающих молекул человека могут быть использованы генетически модифицированные животные. Например, может быть использована генетически модифицированная мышь, неспособная к реаранжировке и экспрессии эндогенной последовательности вариабельной области легкой цепи мышиного иммуноглобулина, при этом мышь экспрессирует только один или два человеческих вариабельных домена легкой цепи, кодируемых последовательностями иммуноглобулина человека, функционально связанными с геном мышиной константной области каппа в эндогенном мышином локусе каппа. Таких генетически модифицированных мышей можно использовать для получения полностью человеческих биспецифичных антигенсвязывающих молекул, содержащих две
- 22 045943 разные тяжелые цепи, ассоциированные с идентичной легкой цепью, содержащей вариабельный домен, полученный из одного из двух различных сегментов гена человеческой вариабельной области легкой цепи. (Подробное обсуждение таких генетически модифицированных мышей и их использования для получения биспецифичных антигенсвязывающих молекул см., например, в заявке US 2011/0195454).
Биоэквиваленты.
Настоящее изобретение охватывает антигенсвязывающие молекулы, имеющие аминокислотные последовательности, которые отличаются от последовательностей описанных антител, но сохраняют способность связывать CD28 и/или PSMA. Такие вариантные молекулы содержат одно или более добавлений, делеций или замен аминокислот по сравнению с исходной последовательностью, но проявляют биологическую активность, которая по существу эквивалентна активности описанных антигенсвязывающих молекул. Аналогичным образом, последовательности ДНК согласно настоящему изобретению, кодирующие антигенсвязывающие молекулы, охватывают последовательности, содержащие одно или более добавлений, делеций или замен нуклеотидов по сравнению с раскрытой последовательностью, но которые кодируют антигенсвязывающую молекулу, которая по существу биоэквивалентна описанным антигенсвязывающим молекулам согласно изобретению. Примеры таких вариантных аминокислотных и ДНК-последовательностей обсуждались выше.
Настоящее изобретение включает антигенсвязывающие молекулы, биоэквивалентные любой из иллюстративных антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе. Два антигенсвязывающих белка или антитела считаются биоэквивалентными, если, например, они представляют собой фармацевтические эквиваленты или фармацевтические альтернативы, скорость и степень абсорбции которых не демонстрируют значимой разницы при введении в той же молярной дозе в аналогичных экспериментальных условиях, как в разовой дозе, так и в многократных дозах. Некоторые антитела будут считаться эквивалентами или фармацевтическими альтернативами, если они эквивалентны по степени их абсорбции, но не по скорости их абсорбции, и, тем не менее, могут считаться биоэквивалентными, поскольку такие различия в скорости абсорбции являются преднамеренными и отражены в маркировке, не имеют существенного значения для достижения эффективных концентраций лекарственного средства в организме, например, при хроническом применении, и считаются с медицинской точки зрения незначительными для конкретного исследуемого лекарственного препарата.
В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если не существует клинически значимых различий в их безопасности, чистоте и эффективности.
В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если пациент может один или несколько раз быть переведен с референсного продукта на биологический продукт и наоборот без ожидаемого увеличения риска побочных действий, в том числе клинически значимого изменения иммуногенности или уменьшения эффективности, по сравнению с непрерывной терапией без такого перевода.
В одном из вариантов осуществления два антигенсвязывающих белка являются биоэквивалентными, если оба они действуют посредством одного и того же механизма или механизмов действия для условия или условий применения в той мере, в которой такие механизмы известны.
Биоэквивалентность может быть продемонстрирована с помощью способов in vivo и in vitro. Варианты оценки биоэквивалентности включают, например, (a) тест in vivo на людях или других млекопитающих, в котором измеряют динамику концентрации антитела или его метаболитов в крови, плазме, сыворотке или другой биологической жидкости; (b) тест in vitro, который был соотнесен с данными о биологической доступности у людей in vivo и позволяет в разумных пределах их прогнозировать; (с) тест in vivo на людях или других млекопитающих, в котором измеряют динамику соответствующего фармакологического действия разовой дозы антитела (или его мишени); и (d) в хорошо контролируемом клиническом исследовании, в котором устанавливается безопасность, эффективность или биодоступность или биоэквивалентность антитела.
Биоэквивалентные варианты иллюстративных антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, могут быть сконструированы, например, с помощью различных замен остатков или последовательностей или удаления концевых или внутренних остатков или последовательностей, которые не являются необходимыми для проявления биологической активности. Например, цистеиновые остатки, несущественные для биологической активности, могут быть подвергнуты делеции или заменены другими аминокислотами, чтобы предотвратить образование ненужных или неправильных внутримолекулярных дисульфидных мостиков при ренатурации. В других контекстах биоэквивалентные антитела могут включать иллюстративные биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, представленные в настоящем документе, содержащие аминокислотные замены, которые модифицируют характеристики гликозилирования антител, например, мутации, которые устраняют или убирают гликозилирование.
Видовая селективность и перекрестная реактивность между видами.
Настоящее изобретение, согласно отдельным вариантами осуществления, относится к антигенсвязывающим молекулам, которые связываются с CD28 человека, но не с CD28 других видов. Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающим молекулам, которые связываются с PSMA человека, но не с PSMA других видов. Настоящее изобретение также включает антигенсвязывающие молекулы,
- 23 045943 которые связываются с CD28 человека и с CD28 одного или более видов, отличных от человека; и/или антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с PSMA человека и с PSMA одного или более видов, отличных от человека.
Согласно отдельным иллюстративным вариантам осуществления изобретения предложены антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с CD28 человека и/или PSMA человека, и могут связываться или не связываться, в зависимости от конкретного случая, с одним или более из CD28 и/или PSMA мыши, крысы, морской свинки, хомяка, песчанки, свиньи, кошки, собаки, кролика, козы, овцы, коровы, лошади, верблюда, яванского макака, мартышки, макака-резуса или шимпанзе. Например, в частном иллюстративном варианте осуществления настоящего изобретения предложены биспецифичные антигенсвязывающие молекулы, содержащие первый антигенсвязывающий домен, который связывает CD28 человека и CD28 яванского макака, и второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA человека.
Иммуноконъюгаты.
Настоящее изобретение охватывает антигенсвязывающие молекулы, конъюгированные с терапевтическим фрагментом (иммуноконъюгат), таким как цитотоксин, химиотерапевтическое лекарственное средство, иммунодепрессант или радиоизотоп. Цитотоксические агенты включают любой агент, разрушающий клетки. Примеры подходящих цитотоксических агентов и химиотерапевтических агентов для образования иммуноконъюгатов известны в данной области техники (см., например, WO 05/103081).
Терапевтический препарат и введение.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению. Фармацевтические композиции согласно изобретению составлены с подходящими носителями, вспомогательными веществами и другими агентами, которые обеспечивают улучшенный перенос, доставку, переносимость и тому подобное. Множество подходящих препаратов можно найти в справочнике, известном всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Эти препараты включают, например, порошки, пасты, мази, желе, воски, масла, липиды, липидсодержащие (катионные или анионные) везикулы (такие как LIPOFECTIN™, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния), конъюгаты ДНК, безводные абсорбирующие пасты, эмульсии типа масло в воде и вода в масле, эмульсии на основе карбовакса (полиэтиленгликоли с разной молекулярной массой), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. См. также Powell et al. Compendium of excipients for parenteral formulations PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
Доза антигенсвязывающей молекулы, вводимая пациенту, может варьироваться в зависимости от возраста и размера пациента, подлежащего лечению заболевания, состояний, способа введения и тому подобного. Предпочтительную дозу обычно рассчитывают в зависимости от массы тела или площади поверхности тела. При применении биспецифичной антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению в терапевтических целях у взрослого пациента может быть предпочтительным внутривенное введение биспецифичной антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению, как правило, в разовой дозе от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг массы тела, более предпочтительно от приблизительно 0,02 до приблизительно 7, от приблизительно 0,03 до приблизительно 5 или от приблизительно 0,05 до приблизительно 3 мг/кг массы тела. В зависимости от тяжести состояния частота и продолжительность лечения могут быть скорректированы. Эффективные дозировки и схемы введения биспецифичной антигенсвязывающей молекулы могут быть определены опытным путем; например, можно контролировать течение заболевания пациента путем периодического обследования и корректировать дозу соответствующим образом. Кроме того, может быть осуществлено межвидовое масштабирование дозировок с использованием хорошо известных в данной области техники методов (например, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения фармацевтической композиции согласно изобретению, например, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, рецепторноопосредованный эндоцитоз (см., например, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Способы введения включают, не ограничиваясь перечисленным, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный способы.
Композиция может быть введена любым удобным способом, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или слизисто-кожные покровы (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.) и может быть введена вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть доставлена подкожно или внутривенно с помощью стандартной иглы и шприца. Кроме того, в случае подкожной доставки при доставке фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению весьма подходящей является шприц-ручка. Такой шприц-ручка может быть многоразовым или одноразовым. В многоразовом шприце-ручке для доставки обычно используется сменный картридж, содержащий фармацевтическую композицию. После введения всей фармацевтической композиции из картриджа и его опустошения пус
- 24 045943 той картридж можно легко выбросить и заменить новым картриджем, содержащим фармацевтическую композицию. Затем шприц-ручка может быть использован повторно. В одноразовом шприце-ручке нет сменного картриджа. Напротив, одноразовый шприц-ручка приходит уже заполненным фармацевтической композицией, содержащейся в резервуаре внутри устройства. После освобождения резервуара от фармацевтической композиции устройство выбрасывают целиком.
Множество многоразовых шприцев-ручек и шприцев-тюбиков подходит для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Вудсток, Великобритания), шприц-ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Бургдорф, Швейцария), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Индианаполис, Индиана), NOVOPEN™ I, II и III (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Копенгаген, Дания), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Франклин Лейкс, Нью-Джерси), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ и OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Франкфурт, Германия), и другие. Примеры одноразовых шприцев-ручек, подходящих для подкожной доставки фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным, шприц-ручку SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) и KWIKPEN™ (Eli Lilly), шприц-тюбик SURECLICK™ (Amgen, Таузанд-Окс, Калифорния), шприц-ручку PENLET™ (Haselmeier, Штутгарт, Германия), EPIPEN (Dey, L.P.) и HUMIRA™ (Abbott Labs, Абботт Парк, Иллинойс), и другие.
В определенных ситуациях фармацевтическая композиция может быть доставлена в системе с контролируемым высвобождением. В одном из вариантов осуществления может быть использован насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). В еще одном варианте осуществления могут быть использованы полимерные материалы; см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. В еще одном варианте осуществления система с контролируемым высвобождением может быть размещена в непосредственной близости от мишени композиции, в результате чего требуется только доля системной дозы (см., например, Goodson, 1984, в Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp. 115-138). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer, 1990, Science 249:1527-1533.
Инъекционные формы могут включать лекарственные формы для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных вливаний и т.д. Эти инъекционные формы могут быть получены с помощью общеизвестных способов. Например, инъекционные формы могут быть приготовлены, например, путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела или его соли, описанных выше, в стерильной водной среде или масляной среде, обычно используемой для инъекций. В качестве водной среды для инъекций существуют, например, физиологический раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные агенты и т.д., которые могут быть использованы в сочетании с подходящим солюбилизирующим агентом, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностно-активное вещество [например, полисорбат 80, НСО-50 (аддукт полиоксиэтилена (50 моль) и гидрогенизированного касторового масла)] и т.д. В качестве масляной среды используются, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., которые могут быть использованы в сочетании с солюбилизирующим агентом, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Приготовленной таким образом инъекцией предпочтительно наполняют подходящую ампулу.
Предпочтительно фармацевтические композиции для перорального или парентерального применения, описанные выше, готовят в лекарственных формах в единичной дозе, выбранной таким образом, чтобы она вмещала дозу активных ингредиентов. Такие лекарственные формы в единичной дозе включают, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъекции (ампулы), суппозитории и т.д. Содержащееся количество вышеупомянутого антитела, как правило, составляет от приблизительно 5 до приблизительно 500 мг на лекарственную форму в единичной дозе; предпочтительно, особенно в форме инъекции, чтобы вышеупомянутое антитело содержалось в количестве от приблизительно 5 до приблизительно 100 мг, и от приблизительно 10 до приблизительно 250 мг для других лекарственных форм.
Виды терапевтического применения антигенсвязывающих молекул.
Настоящее изобретение включает способы, включающие введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтической композиции, содержащей антитело к CD28 или биспецифичную антигенсвязывающую молекулу, которая специфично связывает CD28 и антиген-мишень (например, PSMA). Указанная терапевтическая композиция может содержать любое из антител или биспецифичных антигенсвязывающих молекул, как раскрыто в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В контексте настоящего документа выражение нуждающийся в этом субъект означает человека или животное, не являющееся человеком, которые демонстрируют один или более симптомов или признаков рака (например, субъект с признаками опухоли или страдающий любым из видов рака, упомянутых ниже в настоящем документе), или которые иным образом получили бы пользу от ингибирования или снижения активности PSMA или сокращения пула PSMA+ клеток.
Антитела и биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению (и содержащие
- 25 045943 их терапевтические композиции) пригодны, среди прочего, для лечения любого заболевания или расстройства, при котором может оказать благоприятное действие стимуляция, активация и/или нацеливание иммунного ответа. В частности, биспецифичные антигенсвязывающие молекулы анти-CD28/антиPSMA согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения, предупреждения и/или облегчения любого заболевания или расстройства, связанного с экспрессией или активностью PSMA или пролиферацией PSMA+ клеток, или опосредованного ими. Механизмы действия, посредством которых осуществляются методы терапии согласно изобретению, включают уничтожение клеток, экспрессирующих PSMA, в присутствии эффекторных клеток, например, Т-клеток. Клетки, экспрессирующие PSMA, для ингибирования или уничтожения которых могут применяться биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению, включают, например, онкогенные клетки предстательной железы.
Антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения, например, первичных и/или метастатических опухолей, возникающих при раке ободочной кишки, легкого, молочной железы, почки и подтипах рака мочевого пузыря. Согласно отдельным иллюстративным вариантам осуществления биспецифичные антигенсвязывающие молекулы согласно настоящему изобретению применяют для лечения рака предстательной железы.
Настоящее изобретение также включает способы лечения остаточного рака у субъекта. В контексте настоящего документа термин остаточный рак означает наличие или сохранение одной или более раковых клеток у субъекта после проведения противораковой терапии.
Согласно отдельным аспектам настоящего изобретения предложены способы лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией PSMA (например, рака предстательной железы), включающие введение одной или более биспецифичных антигенсвязывающих молекул, описанных в других местах настоящего документа, субъекту после того, как было установлено, что указанный субъект является резистентным к другим видам противораковой терапии. Например, настоящее изобретение включает способы лечения рака предстательной железы, включающие введение биспецифичной антигенсвязывающей молекулы анти-CD28/анти-PSMA пациенту через 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели или 4 недели, 2 месяца, 4 месяца, 6 месяцев, 8 месяцев, 1 год или более после того, как субъект получил стандартное лечение для пациентов, страдающих от рака, например, рака предстательной железы. В других аспектах биспецифичную антигенсвязывающую молекулу согласно изобретению (биспецифичную антигенсвязывающую молекулу анти-CD28/анти-PSMA), содержащую Fc-домен IgG4, первоначально вводят субъекту в один или несколько моментов времени (например, для обеспечения устойчивого начального сокращения пула клеток рака предстательной железы) с последующим введением эквивалентной биспецифичной антигенсвязывающей молекулы, содержащей другой домен IgG, такой как Fc-домен IgG1, в последующие моменты времени. Предполагается, что антитела анти-CD28/антиPSMA согласно изобретению могут применяться в сочетании с другими биспецифичными антигенсвязывающими молекулами, такими как биспецифичное антитело анmи-PSMA/анти-CD3. Также предполагается, что биспецифичные антитела согласно изобретению будут применяться в сочетании с ингибиторами контрольной точки, например, нацеленными на PD-1 и CTLA-4, и другие мишени. Применение комбинации двух биспецифичных антител, нацеленных на один и тот же опухолевый антиген (например, PSMA), может обеспечить преимущества, но при этом один из биспецификов должен быть нацелен на CD3 на Тклетках, а другой биспецифик должен быть нацелен на молекулу костимулятора, такую как CD28. Эта комбинация может применяться самостоятельно для усиления уничтожения опухолевых клеток или может применяться в комбинации с ингибитором контрольной точки.
Комбинированные терапии и препараты.
Настоящее изобретение включает композиции и терапевтические препараты, содержащие любые из иллюстративных антител и биспецифичных антигенсвязывающих молекул, описанных в настоящем документе, в комбинации с одним или более дополнительными терапевтически активными компонентами, и способы лечения, включающие введение таких комбинаций нуждающимся в этом субъектам.
Примеры дополнительных терапевтических агентов, которые могут применяться в комбинации или которые могут быть введены в комбинации с антигенсвязывающей молекулой согласно настоящему изобретению, включают, например, химиотерапию, радиационную терапию, ингибиторы контрольных точек, нацеленные на PD-1 (например, антитело к PD-1, такое как пембролизумаб или ниволумаб; см. также US9987500), CTLA-4, LAG3, TIM3 и другие, костимулирующие агонистические двухвалентные антитела, нацеленные на такие молекулы, как GITR, OX40, 4-1ВВ и другие), биспецифичные антитела к CD3 (см., например, WO 2017/053856 A1, WO 2014/047231 A1, WO 2018/067331 А1 и WO 2018/058001 A1), другие антитела, нацеленные на PSMA X CD3 (см., например, WO 2017/023761 A1), и другие костимулирующие биспецифичные антитела к CD28.
Другие агенты, которые могут оказать благоприятное действие при введении в комбинации с антителами согласно изобретению, включают, например, тамоксифен, ингибиторы ароматазы и ингибиторы цитокинов, включая низкомолекулярные ингибиторы цитокинов и антитела, которые связываются с цитокинами, такими как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, или с их соответствующими рецепторами. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению (например, фармацевтические композиции, содержащие биспецифичную антигенсвязывающую молеку
- 26 045943 лу aHTu-CD28/aHTu-PSMA, как раскрыто в настоящем документе) также могут быть введены как часть схемы лечения, включающей одну или более терапевтических комбинаций, выбранных из ICE: ифосфамид (например, Ifex®), карбоплатин (например, Paraplatin®), этопозид (например, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16); DHAP: дексаметазон (например, Decadron®), цитарабин (например, CytosarU®, цитозин-арабинозид, ara-С), цисплатин (например, Platinol®-AQ); и ESHAP: этопозид (например, Etopophos®, Toposar®, VePesid®, VP-16), метилпреднизолон (например, Medrol®), высокие дозы цитарабина, цисплатин (например, Platinol®-AQ).
Настоящее изобретение также включает терапевтические комбинации, содержащие любую из антигенсвязывающих молекул, упомянутых в настоящем документе, и ингибитор одного или более из VEGF, Ang2, DLL4, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvlll, cMet, IGF1 R, B-raf, PDGFR-o, PDGFR-I3, FOLH1, PRLR, STEAP1, STEAP2, TMPRSS2, MSLN, CA9, уроплакина или любого из вышеупомянутых цитокинов, где ингибитор представляет собой аптамер, антисмысловую молекулу, рибозим, кшРНК, пептитело, нанотело или фрагмент антитела (например, фрагмент Fab; фрагмент F(ab')2; фрагмент Fd; фрагмент Fv; scFv; фрагмент dAb; или другие сконструированные молекулы, такие как диатела, триатела, тетратела, минитела и минимальные рекогниционные единицы). Антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению также могут быть введены и/или включены в состав комбинированного препарата с противовирусными препаратами, антибиотиками, анальгетиками, кортикостероидами и/или НПВП (нестероидными противовоспалительными препаратами). Антигенсвязывающие молекулы согласно изобретению также могут быть введены как часть схемы лечения, которая также включает радиационную терапию и/или традиционную химиотерапию, или лечение биологическим препаратом, включая ингибиторы контрольных точек или другие биспецифичные антитела.
Настоящее изобретение включает композиции и терапевтические препараты, содержащие любую из антигенсвязывающих молекул, описанных в настоящем документе, в комбинации с одним или более химиотерапевтическими агентами. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (Cytoxan™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5оксо-Е-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дростанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функции надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; эльфорнитин; эллиптиния ацетат; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK™; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-С); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например, паклитаксел (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси) и доцетаксел (Taxotere™; Aventis, Антони, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги препаратов платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; препараты платины; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навельбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевую кислоту; эсперамицины; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеперечисленных. В это определение также включены антигормональные агенты, которые регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)имидазолы, ингибирующие ароматазу, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапристон и торемифен (фарестон); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышепе- 27 045943 речисленных.
Дополнительный терапевтически активный компонент(ы) может быть введен непосредственно перед, одновременно с или вскоре после введения антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению (в контексте настоящего изобретения такие схемы введения рассматриваются как введение антигенсвязывающей молекулы в комбинации с дополнительным терапевтически активным компонентом).
Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции, в которых антигенсвязывающая молекула согласно настоящему изобретению содержится в комбинации с одним или более дополнительными терапевтически активными компонентами, как описано в других местах в настоящем документе.
Схемы введения.
Согласно отдельным вариантам осуществления настоящего изобретения несколько доз антигенсвязывающей молекулы (например, антитела к CD28 или биспецифичной антигенсвязывающей молекулы, которая специфично связывает PSMA и CD28) могут быть введены субъекту в течение определенного периода времени. Способы согласно этому аспекту изобретения включают последовательное введение субъекту многократных доз антигенсвязывающей молекулы согласно настоящему изобретению. В контексте настоящего документа под последовательным введением подразумевается, что каждую дозу антигенсвязывающей молекулы вводят субъекту в другой момент времени, например, в разные дни с заданным промежутком (например, часы, дни, недели или месяцы). Настоящее изобретение включает способы, включающие последовательное введение пациенту разовой начальной дозы антигенсвязывающей молекулы с последующими одной или более вторичными дозами указанной антигенсвязывающей молекулы и, необязательно, с последующими одной или более третичными дозами указанной антигенсвязывающей молекулы.
Термины начальная доза, вторичные дозы и третичные дозы относятся к временной последовательности введения антигенсвязывающей молекулы согласно изобретению. Таким образом, начальная доза представляет собой дозу, которую вводят в начале схемы лечения (также называемую исходной дозой); вторичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после начальной дозы; и третичные дозы представляют собой дозы, которые вводят после вторичных доз. Начальная, вторичная и третичная дозы могут содержать одинаковое количество антигенсвязывающей молекулы, но, как правило, могут отличаться друг от друга с точки зрения частоты введения. В отдельных вариантах осуществления, однако, количество антигенсвязывающей молекулы, содержащееся в начальной, вторичной и/или третичной дозах, варьируют (например, корректируют в большую или меньшую сторону по мере необходимости) в течение курса лечения. В отдельных вариантах осуществления две или более (например, 2, 3, 4 или 5) дозы вводят в начале схемы лечения в виде ударных доз, за которыми следуют последующие дозы, которые вводят реже (например, поддерживающие дозы).
В одном из иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения каждую вторичную и/или третичную дозу вводят через 1-26 (например, через 1, 11/2, 2, 21/2, 3, 31/2, 4, 41/2, 5, 51/2, 6, 61/2, 7, 71/2, 8, 81/2, 9, 91/2, 10, 101/2, 11, 111/2, 12, 121/2, 13, 131/2, 14, 141/2, 15, 151/2, 16, 161/2, 17, 171/2, 18, 181/2, 19, 191/2, 20, 201/2, 21, 211/2, 22, 221/2, 23, 231/2, 24, 241/2, 25, 251/2, 26, 261/2 или более) недель после непосредственно предшествующей дозы. Фраза непосредственно предшествующая доза в контексте настоящего документа означает, в последовательности многократных введений, дозу антигенсвязывающей молекулы, которую вводят пациенту до введения непосредственно следующей дозы в последовательности без промежуточных доз.
Способы согласно данному аспекту изобретения могут включать введение пациенту любого количества вторичных и/или третичных доз антигенсвязывающей молекулы (например, антитела к CD28 или биспецифичной антигенсвязывающей молекулы, специфично связывающей PSMA и CD28). Например, в отдельных вариантах осуществления пациенту вводят только одну вторичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) вторичных доз. Аналогичным образом в отдельных вариантах осуществления пациенту вводят только одну третичную дозу. В других вариантах осуществления пациенту вводят две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более) третичных доз.
В вариантах осуществления, включающих введение многократных вторичных доз, каждую вторичную дозу можно вводить с той же частотой, что и другие вторичные дозы. Например, каждая вторичная доза может вводиться субъекту через 1-2 недели после непосредственно предшествующей дозы. Аналогичным образом в вариантах осуществления, включающих введение многократных третичных доз, каждую третичную дозу можно вводить с той же частотой, что и другие третичные дозы. Например, каждая третичная доза может вводиться пациенту через 2-4 недели после непосредственно предшествующей дозы. В качестве альтернативы частота, с которой субъекту вводят вторичные и/или третичные дозы, может варьировать в течение курса лечения. Частота введения может также корректироваться лечащим врачом в течение курса лечения в зависимости от потребностей конкретного пациента после клинического обследования.
Диагностические применения антител.
Биспецифичные антитела согласно настоящему изобретению также могут применяться для обнаружения и/или измерения CD28 или PSMA, или CD28-экспрессирующих, или PSMA-экспрессирующих
- 28 045943 клеток в образце, например, в диагностических целях. Например, антитело к CD28 х PSMA или его фрагмент могут применяться для диагностики состояния или заболевания, характеризующегося нарушенной экспрессией (например, сверхэкспрессией, недостаточной экспрессией, отсутствием экспрессии и т.д.) CD28 или PSMA. Иллюстративные диагностические анализы на CD28 или PSMA могут включать, например, приведение образца, полученного от пациента, в контакт с антителом согласно изобретению, где указанное антитело мечено детектируемой меткой или репортерной молекулой. В качестве альтернативы, немеченое антитело может применяться в диагностических целях в комбинации со вторичным антителом, которое само мечено пригодным для определения образом. Детектируемая метка или репортерная молекула может представлять собой радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32P, 35S или 125I; флуоресцентный или хемилюминесцентный фрагмент, такой как флуоресцеина изотиоцианат или родамин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза, пероксидаза хрена или люцифераза. Конкретные примеры анализов, которые могут быть использованы для обнаружения или измерения CD28 или PSMA в образце, включают иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA) и флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS). Образцы, которые могут быть использованы в диагностических анализах на CD28 или PSMA согласно настоящему изобретению, включают любой образец ткани или жидкости, который может быть получен от пациента, содержащий поддающиеся обнаружению количества белка CD28 или PSMA или его фрагментов в норме или при патологии. Как правило, будут измерены уровни CD28 или PSMA в определенном образце, полученном от здорового пациента (например, пациента, не страдающего заболеванием или состоянием, связанным с аномальными уровнями или активностью CD28 или PSMA), для первоначального установления исходного или стандартного уровня CD28 или PSMA. Затем этот исходный уровень CD28 или PSMA можно сравнить с уровнями CD28 или PSMA, измеренными в образцах, полученных от лиц с подозрением на наличие заболевания или состояния, связанного с CD28 или PSMA.
Примеры
Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как получать и применять способы и композиции согласно изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы данного изобретения считают созданным ими изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых чисел (например, количеств, температур и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, и давление находится на уровне или около атмосферного.
Аннотация.
Недавний клинический успех биспецифичных антител к опухолеспецифичному антигену (TSA) или опухолеассоциированному антигену (TAA)-CD3, таких как биспецифичные антитела к PSMAxCD3, меняет иммунотерапию рака. Антитела к TAA-CD3 обеспечивают относительно безопасные и доступные терапевтические решения, которые могут оказаться важным новым классом иммунотерапии. Однако они могут не достичь эффективности, наблюдаемой при использовании подходов с CAR-T-клетками, которые задействуют второй костимулирующий сигнал, часто опосредованный внутриклеточным доменом CD28. Действительно, антитела, активирующие CD28, невероятно эффективны, но также токсичны в исследованиях на людях. Термины TSA и ТАА могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо.
В настоящем документе описан новый класс биспецифичных антител, называемых TAA-CD28, которые представляются безопасными, хорошо переносятся сами по себе и в комбинации с TAA-CD3, для создания значительно усиленных и в высокой степени нацеленных противоопухолевых ответов. С помощью ТАА, таких как PSMA, экспрессируемых на опухоли предстательной железы, было обнаружено, что TAAxCD28 повышало активацию Т-клеток и значительно усиливало лизис опухолевых клеток в присутствии опухолевой мишени и стимула TCR/CD3.
Было продемонстрировано, что биспецифичные антитела к TAAxCD28 согласно изобретению значительно повышали противоопухолевый иммунитет, опосредованный активацией Т-клеток, индуцированной TAAxCD3, в моделях сингенных опухолей. Спаривание CD3 с опухолевым антигеном с ограниченной экспрессией в здоровой ткани практически не индуцировало продукцию периферических цитокинов при применении по отдельности или в комбинации с TAAxCD28 в моделях на нечеловекообразных приматах и гуманизированных мышах. Кроме того, TAAxCD28 по отдельности практически не индуцировало секрецию сывороточных цитокинов и активацию Т-клеток у яванских макаков по сравнению с антителом-суперагонистом к CD28. Эти результаты дают основания полагать, что объединение этого нового класса костимулирующих биспецифичных антител с развивающимся классом TAA-CD3 может обеспечить более безопасные, готовые к использованию биологические решения, которые могут заметно повысить эффективность традиционных биспецификов TAA-CD3.
Введение.
Хотя в течение последних двух десятилетий моноклональные антитела были признаны в качестве противоопухолевых терапевтических средств, они обладают ограниченной способностью мобилизовать
- 29 045943
Т-клетки и эффективно применять их цитотоксическую активность в месте опухоли. Ранее была продемонстрирована способность биспецифичных антител к направленной на Т-клетки иммунотерапии и последующему уничтожению опухолевых клеток. Действительно, платформа на основе биспецифичных антител направлена на рекрутирование иммунных эффекторных клеток путем объединения антитела к CD3 со связывающим доменом к опухолевой мишени. Недавно катумаксомаб (EpCAMxCD3) и блинатумомаб (CD19xCD3) получили одобрение надзорных органов для лечения острого лимфобластного лейкоза, в то время как многие другие биспецифичные антитела проходят исследования. Так, были сконструированы биспецифичные антитела, распознающие как В-клеточный маркер CD20, так и компонент CD3 репертуара Т-клеток, и в настоящее время они проходят клинические исследования для лечения гемобластозов. Так, TAA-CD3 обеспечивают относительно безопасные и готовые к использованию терапевтические решения, которые не требуют тщательной и кропотливой адаптации для отдельного пациента. Однако, хотя биспецифики TAA-CD3 могут оказаться важным новым классом иммунотерапии, перекрестные сравнения между исследованиями дают основания полагать, что они могут не достигнуть эффективности, наблюдаемой для подходов с применением CAR-T.
Два препарата на основе Т-клеток с химерными антигенными рецепторами (CAR-T-клеток), Kymriiah и Yescarta, недавно получили одобрение FDA для лечения В-клеточных гемобластозов, что свидетельствует о большом потенциале этого подхода в области персонализированной иммунотерапии рака. В обоих продуктах используется антиген CD19 в качестве опухолеассоциированного антигена (ТАА), который является идеальной мишенью для опосредованного Т-клетками уничтожения из-за его ограниченной экспрессии в В-клетках, что минимизирует нецелевую токсичность и повышает противоопухолевую эффективность. Однако высокая эффективность CAR-T-клеток была связана с побочными действиями, такими как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность. Кроме того, лечение пока не приносит пользы всем пациентам, а количество переменных, которые могут повлиять на клинический результат для каждого пациента, относительно велико как при аутологическом, так и при аллогенном подходах. Кроме того, попытки нацеливания на опухолеассоциированные антигены в солидных опухолях пока не дали больших результатов, демонстрируя либо минимальную противоопухолевую активность, либо серьезные побочные действия. Ингибирующее микроокружение опухоли, плохой доступ CAR-T-клеток ко всей опухолевой ткани вместе с трудоемкостью производства представляют собой некоторые из текущих проблем для многообещающей CAR-T-клеточной терапии.
Одним из ограничений существующих иммунотерапевтических видов лечения является оптимальная индукция собственного иммунного ответа пациента против опухолевых клеток посредством специфичного распознавания опухолевых клеток и индукции цитотоксичности. Эффективная активация наивных Т-клеток и индукция обученных антигеном популяций Т-клеток памяти требует костимулирующих сигналов (сигнал 2) в дополнение к антигенспецифичному стимулу посредством комплекса TCR/CD3 (сигнал 1). Агонизм костимулирующих сигнальных путей CD28 и 4-1ВВ может обеспечить значительное усиление лизиса клеток-мишеней, что может оказать положительное действие на резистентность пациентов к различным видам иммунотерапии. Однако более широкая роль костимуляции в клинической онкологии еще недостаточно оценена. Многие опухоли лишены костимулирующих рецепторов, что не позволяет им дополнительно усиливать индуцированную CD3xTAA активацию Т-клеток.
Слепой скрининг костимулирующих сигнальных путей, проведенный в настоящем документе путем принудительной экспрессии костимулирующих лигандов на панели сингенных опухолей, показал, что CD28 является одним из наиболее мощных костимулирующих рецепторов вместе с 4-1ВВ. Кроме того, в настоящем документе были сконструированы биспецифичные антитела на костимулирующей основе, соединяющие CD28 на поверхности Т-клеток с ТАА из тканей предстательной железы для усиления противоопухолевого ответа. В настоящем документе представлены данные, демонстрирующие, что комбинированная терапия биспецификами TAA-CD3 и TAA-CD28 эффективно усиливала активацию Т-клеток и цитотоксичность в условиях одновременной стимуляции ТАА и TCR, что приводило к усилению противоопухолевого иммунитета. Действительно, данные, раскрытые в настоящем документе, дают основания полагать, что комбинирование этого нового класса биспецификов (TAA-CD28) с развивающимся классом TAA-CD3 может обеспечить более безопасные, готовые к использованию биологические решения, эффективность которых может приближаться к эффективности индивидуализированной CART-клеточной терапии.
Более конкретно, были созданы иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28, и было продемонстрировано, что иллюстративное антитело к PSMAxCD28 усиливает индуцированную PSMAxCD3 или CD20xCD3 активацию Т-клеток in vitro и безопасно повышает противоопухолевую эффективность in vivo. Активность in vitro была продемонстрирована путем демонстрации изображений биспецифичных антител, локализованных в иммунологическом синапсе конъюгата Т-клетки и клеткимишени, усиления пролиферации, индуцированной PSMAxCD3, высвобождения цитокинов и цитотоксичности. Противоопухолевую эффективность in vivo оценивали на моделях опухолей у мышей (сингенных). Контролировали динамику объема опухоли и сывороточных уровней цитокинов, чтобы продемонстрировать ответ на лечение биспецифичными антителами. Было проведено исследование на яванских макаках для определения безопасности и переносимости иллюстративного PSMAxCD28 согласно изо
- 30 045943 бретению у нечеловекообразного примата. Животных исследовали на токсичность путем клинических наблюдений и сбора образцов крови для анализа сывороточных уровней цитокинов и фенотипа Т-клеток.
Как подробно описано ниже, иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 были созданы для усиления TCR/CD3-зависимой активации Т-клеток, тем самым имитируя костимуляцию (сигнал 2), обеспечиваемую профессиональными АПК.
Все процедуры проводили в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных NTH (Национальных институтов здравоохранения). Протоколы были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Regeneron Pharmaceuticals.
Пример 1. Конструирование антител к PSMAxCD28.
Получение антител к CD28.
Антитела к CD28 были получены путем иммунизации мыши VELOCIMMUNE® (т.е. генетически модифицированной мыши, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека) белком CD28 человека, слитым с Fc-частью мышиного IgG2a, или клетками, экспрессирующими CD28, или ДНК, кодирующей CD28. Иммунный ответ антитела отслеживали с помощью иммуноанализа, специфичного в отношении CD28. Когда был достигнут желаемый иммунный ответ, спленоциты собирали и сливали с клетками мышиной миеломы, чтобы сохранить их жизнеспособность и сформировать линии клеток гибридомы. Линии клеток гибридомы подвергали скринингу и отбирали для идентификации линий клеток, продуцирующих специфичные к CD28 антитела. С помощью этого метода было получено несколько химерных антител к CD28 (т.е. антител, обладающих человеческими вариабельными доменами и мышиными константными доменами). Кроме того, несколько полностью антител человека к CD28 были выделены непосредственно из антигенположительных В-клеток без слияния с клетками миеломы, как описано в заявке US 2007/0280945 А1.
Некоторые биологические свойства иллюстративных антител к CD28, полученных в соответствии со способами, использованными в данном примере, подробно описаны в примерах, изложенных ниже.
Получение антител к PSMA.
Антитела к PSMA получали путем иммунизации генетически модифицированной мыши антигеном PSMA человека или путем иммунизации генетически модифицированной мыши, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека, антигеном PSMA человека. В альтернативном варианте мышей иммунизировали клетками рака предстательной железы человека (LNCaP, ATTC, Манассас, Виргиния, США), экспрессирующими PSMA человека (№ UniProtKB/Swiss-Prot. Q04609). Иммунный ответ антитела отслеживали с помощью иммуноанализа, специфичного в отношении PSMA. Когда был достигнут желаемый иммунный ответ, спленоциты собирали у каждой мыши и либо (1) сливали с клетками мышиной миеломы, чтобы сохранить их жизнеспособность и сформировать линии клеток гибридомы, и подвергали скринингу на специфичность к PSMA, либо (2) сортировали В-клетки (как описано в заявке US 2007/0280945 A1) с использованием PSMA человека с Nконцевой 6-His-меткой (R&D, кат. № 4234-ZN) в качестве реагента для сортировки, который связывает и идентифицирует реактивные антитела (антиген-положительные В-клетки). Первоначально были выделены химерные антитела к PSMA, имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Были определены характеристики антител и осуществлен их отбор по желаемым характеристикам, включая аффинность, селективность и т.д. При необходимости мышиные константные области заменяли желаемой человеческой константной областью, например, IgG1 или IgG4 дикого типа или модифицированного IgG1 или IgG4, для создания полностью антитела человека к PSMA.
Получение биспецифичных антител, связывающих CD28 и PSMA.
Биспецифичные антитела, содержащие специфичный к PSMA связывающий домен и специфичный к CD28 связывающий домен, были сконструированы с использованием стандартных методик, где каждый из антигенсвязывающего домена к PSMA и антигенсвязывающего домена к CD28 содержит разные, отдельные HCVR в паре с общей LCVR. В некоторых случаях биспецифичные антитела были сконструированы с использованием тяжелой цепи из антитела к CD28, тяжелой цепи из антитела к PSMA и общей легкой цепи (см. табл. 1). В отдельных вариантах осуществления аминокислотная последовательность тяжелой цепи из антитела к CD28 для иллюстративного биспецифичного антитела (bs16429D) представлена в SEQ ID NO: 81. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи из антитела к PSMA для иллюстративного биспецифичного антитела (bs16429D) представлена в SEQ ID NO: 82. Аминокислотная последовательность общей легкой цепи для bs16429D представлена в SEQ ID NO: 83.
Биспецифичные антитела, созданные в соответствии с настоящим примером, содержат два отдельных антигенсвязывающих домена (т.е. связывающие плечи). Первый антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи, полученную из антитела к CD28 (CD28-VH), а второй антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи, полученную из антитела к PSMA (PSMA-VH). Как анти-PSMA, так и анти-CD28 имеют общую легкую цепь. Спаривание CD28VH/PSMA-VH создает антигенсвязывающие домены, которые специфично распознают CD28 на Тклетках и PSMA на опухолевых клетках.
Пример 2. Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей.
- 31 045943
В табл. 1 представлены идентификаторы аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и CDR различных биспецифичных антител, созданных в соответствии с примером 1. Соответствующие идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот представлены в табл. 2.
Таблица 1
Идентификаторы аминокислотных последовательностей
Идентификатор продукта биспецифичного антитела анти-PSMA х анти- CD28 | Второй антигенсвязывающий домен (D2, анти-PSMA) | Первый антигенсвязывающий домен (D1, анти-СП28) | Вариабельная область легкой цепи | |||||||||
D2- HCVR | D2- HCDR1 | D2- HCDR2 | D2- HCDR3 | D1- HCVR | D1- HCDR1 | D1- HCDR2 | D1- HCDR3 | D3- LCV R | D3- LCDR 1 | D3- LCDR 2 | D3- LCDR 3 | |
bsl6429D | шАЬ11838Р2 | шАЬ14226Р2 | 8567 | |||||||||
2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 | 24 | |
bsl6430D | шАЬ11810Р2 | шАЬ14193Р2 | 10082 | |||||||||
34 | 36 | 38 | 40 | 26 | 28 | 30 | 32 | 42 | 44 | 46 | 48 | |
bs!6431D | шАЬ11810Р2 | шАЬ14216Р2 | 10082 | |||||||||
50 1 | 52 1 | 54 1 | 56 | 58 1 | 60 | 62 | 64 | 66 | 68 1 | 70 | | 72 |
Таблица 2
Идентификаторы последовательностей нуклеиновых кислот
Идентификатор продукта биспецифичного антитела анти-PSMA х анти- CD28 | Второй антигенсвязывающий домен (D2, анти-PSMA) | Первый антигенсвязывающий домен (D1, анти-СП28) | Вариабельная область легкой цепи | |||||||||
D2- HCVR | D2- HCDR1 | D2- HCDR2 | D2- HCDR3 | D1- HCVR | D1- HCDR1 | D1- HCDR2 | D1- HCDR3 | D3- LCV R | D3- LCDR 1 | D3- LCDR 2 | D3- LCDR 3 | |
bsl6429D | шАЬ11838Р2 | шАЬ14226Р2 | 8567 | |||||||||
1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13 | 15 | 17 | 19 | 21 | 23 | |
bsl6430D | шАЬ11810Р2 | шАЬ14193Р2 | 10082 | |||||||||
33 | 1 35 | 1 37 | 1 39 | 25 | 27 | 1 29 | 31 | 41 | I 43 | I 45 | 1 47 | |
bsl6431D | шАЬ11810Р2 | ШАЫ4216Р2 | 10082 | |||||||||
49 | 1 51 | 1 53 | 55 | 57 | 59 | 1 61 | 63 | 65 | 67 | 69 | 71 |
Пример 3. CD28 и 4-1ВВ являются мощными костимулирующими рецепторами.
Для определения того, какие костимулирующие рецепторы являются эффективными в обеспечении костимулирующего сигнала, важного для активации Т-клеток, был проведен слепой скрининг костимулирующих сигнальных путей путем принудительной экспрессии костимулирующих лигандов на панели сингенных опухолей (табл. 3 и фиг. 2), в котором вновь было установлено, что CD28 наряду с 4-1ВВ является одним из наиболее мощных костимулирующих рецепторов. В табл. 3 обобщенно представлено количество мышей без опухолей в слепом скрининге. В каждой группе тестировали по пять (5) мышей. Анализы проводили на трех (3) различных линиях опухолевых клеток, которые были генетически модифицированы для экспрессии семи (7) различных костимулирующих лигандов. Вкратце, опухолевые клетки EL4, МС38 и B16F10.9 были генетически модифицированы для экспрессии индивидуальных костимулирующих лигандов с помощью лентивирусной трансдукции. Клетки подкожно имплантировали мышам C57BL6 WT. Рост опухоли измеряли на 18, 24 и 25 день после имплантации опухолей типов EL4, МС38 и B16F10.9, соответственно. Это было временной точкой, когда объем опухолей из контрольных групп достиг максимально допустимого размера (>2000 мм3). Были измерены размеры опухолей. В согласии с данными в табл. 3, CD28 и 4-1ВВ также являются одними из наиболее эффективных в уменьшении размера опухолей (данные не показаны).
- 32 045943
Таблица 3
Ингибирование роста опухоли в генетически модифицированных линиях клеток с введенной экспрессией костимулирующего лиганда
Костимулирующи й Лиганд | Костимулирующи й Рецептор | Лимфома (EL4) | Карцинома (МСЗ 8) | Меланома (B16F10.9) |
4-1BBL | 4-ВВ | 3 | 4 | 1 |
CD80(B7.1) | CD28 | 2 | 2 | 2 |
CD86 (В7.2) | CD28 | 1 | 0 | 2 |
CD70 | CD27 | 5 | 0 | |
OX40L | 0X40 | 0 | 0 | 2 |
CD40 | CD40L | 0 | 1 | 0 |
ICOSL | ICOS | 0 | 0 | 0 |
Пустой вектор | 0 | 0 | 0 | |
Родительские | 0 | 0 |
Пример 4. Аффинности связывания и кинетические константы биспецифичных антител к PSMAxCD28, полученные из анализа методом поверхностного плазмонного резонанса.
Для определения кинетики связывания биспецифичных моноклональных антител к PSMAxCD28 определяли аффинности связывания и кинетические константы биспецифичных антител к PSMAxCD28 и соответствующих родительских моноклональных антител к PSMA и/или CD28 в анализе методом поверхностного плазмонного резонанса.
Кинетика связывания биспецифичных моноклональных антител к PSMAxCD28 с PSMA.
Равновесные константы диссоциации (значения KD) для связывания 6h.hPSMA (рекомбинантный белок PSMA/FOLH1 человека, R&D, кат. № 4234-ZN) с очищенным биспецифичным моноклональным антителом к PSMAxCD28 или двухвалентным родительским моноклональным антителом к PSMA определяли с использованием биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса в режиме реального времени с использованием прибора Biacore Т-200. Поверхность сенсора СМ5 Biacore модифицировали путем связывания по аминогруппе с моноклональным мышиным антителом к Fc человека для захвата очищенных биспецифичных антител к PSMAxCD28 или родительских моноклональных антител к PSMA и к CD28.
Это исследование связывания Biacore проводили в буфере, состоящем из 0,01 MHEPES рН 7,4, 0,15 MNaCl, 0,5 мМ MgCl2, 1,0 мМ СаС12, 0,05 об.% сурфактанта Р20 (подвижный буфер HBS-P++). Различные концентрации hPSMA с N-концевой полигистидиновой меткой (6h.hPSMA, R&D) были приготовлены в подвижном буфере HBS-P++ в диапазоне от 10 нМ до 0,4 нМ с последовательными 3-кратными разведениями для биспецифичных антител к PSMAxCD28 и родительских моноклональных антител к PSMA или к CD28.
Различные концентрации 6h.hPSMA пропускали над поверхностью с захваченными моноклональными антителами со скоростью потока 50 мкл/мин. Ассоциацию 6h.hPSMA с захваченным моноклональным антителом отслеживали в течение 3 минут, а диссоциацию 6h.hPSMA в подвижном буфере HBS-P++ отслеживали в течение 10 мин. Кинетические константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) определяли путем аппроксимации сенсограмм в реальном времени к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения для аппроксимации кривых Scrubber 2.0с (BioLogic Software). Равновесные константы диссоциации связывания (KD) и диссоциативные периоды полужизни (t1/2) рассчитывали из кинетических констант скорости по формуле: KD (М) = kd/ka, и t1/2 (мин) = 0,693/kd/60.
Кинетические параметры связывания для связывания 6h.hPSMA с очищенными моноклональными антителами при 25°C представлены ниже в табл. 4.
Таблица 4
Аффинности связывания моноклональных антител с PSMA при 25°C в Biacore
Идентификатор антитела | Обычное название | ka (1/Мс) | kd (1/с) | KD(M) | Т'/2 (мин ) |
bsl6429D | моноклональное антитело к | 1,96Е+05 | 4,92Е-05 | 2,51Е- 10 | 234,6 |
- 33 045943
PSMAxCD28 | |||||
bsl6430D | моноклональное антитело к PSMAxCD28 | TBD | TBD | TBD | TBD |
bsl6431D | моноклональное антитело к PSMAxCD28 | 2,80Е+05 | 3,85Е-05 | 1,3 7Е- 10 | 300,4 |
шАЬ11810Р2 | моноклональное антитело к PSMA | 4,45Е+05 | 2,99Е-05 | 6,72Е- 11 | 386,3 |
mAbll838P2 | моноклональное антитело к PSMA | TBD | TBD | TBD | TBD |
шАЬ14226Р2 | моноклональное антитело к CD28 | NB | NB | NB | NB |
mAbl4193P2 | моноклональное антитело к CD28 | NB | NB | NB | NB |
шАЬ14216Р2 | моноклональное антитело к CD28 | NB | NB | NB | NB |
TBD: не тестировалось
NB: связывания не наблюдалось
Кинетические параметры связывания 6h.hPSMA с одним очищенным иллюстративным моноклональным биспецифичным антителом при 37°C представлены ниже в табл. 5. Одна (1) RU (единица ответа) представляет собой 1 пг белка на мм2, как определено производителем.
Таблица 5
Аффинности связывания моноклонального антитела с PSMA при 37°C в Biacore
Идентифика тор антитела | Захват mAb (RU) | Связывание 10 нМ HPSMA.6H (RU) | Ka (1/Мс) | Kd (1/с) | KD(M) | 1½ |
bsl6429D | 256,8±0,9 | 43,5 | 2,00Е+05 | 7,93Е-05 | 3,96Е-10 | 145,7 |
Идентифика тор антитела | Захват mAb (RU) | Связывание 20 нМ HPSMA.6H (RU) | Ка (1/Мс) | Kd (1/с) | KD(M) | 1½ |
bsl6429D | 189,7±1,6 | 73,7 | 2,93Е+05 | 6,36Е+05 | 2,ΠΕ-ΙΟ | 181,6 |
Кинетика связывания биспецифичных моноклональных антител к PSMAxCD28 с CD28.
Равновесные константы диссоциации (значения KD) для связывания hCD28.mmh с очищенными моноклональными антителами определяли с использованием биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса в режиме реального времени с использованием прибора Biacore Т-200. Поверхность сенсора СМ5 Biacore модифицировали путем связывания по аминогруппе с моноклональным мышиным антителом к Fc человека для захвата очищенных биспецифичных моноклональных антител к PSMAxCD28 и родительских моноклональных антител к PSMA или к CD28.
Различные концентрации hCD28.mmh пропускали над поверхностью с захваченными моноклональными антителами со скоростью потока 50 мкл/мин. Ассоциацию hCD28.mmh с захваченным моноклональным антителом отслеживали в течение 5 мин, а диссоциацию hCD28.mmh в подвижном буфере HBS-P++ отслеживали в течение 10 мин. Кинетические константы скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) определяли путем аппроксимации сенсограмм в реальном времени к модели связывания 1:1 с использованием программного обеспечения для аппроксимации кривых Scrubber 2.0с. Равновесные константы диссоциации связывания (KD) и диссоциативные периоды полужизни (t1/2) рассчитывали из кинетических констант скорости по формуле: KD (M) = kd/ka, и t1/2 (мин) = 0,693/kd/60.
Кинетические параметры связывания для связывания hCD28.mmh с очищенным биспецифичным моноклональным антителом к PSMAxCD28 или двухвалентным родительским моноклональным антителом к CD28 при 25°C представлены ниже в табл. 6.
- 34 045943
Таблица 6
Аффинности связывания моноклональных антител с CD28 при 25°C в Biacore
Идентификатор антитела | Обычное название | ка (1/Мс) | kd (1/с) | KD(M) | Т'/2 (ми н) |
моноклональное | 3,26Е- | ||||
bsl6429D | антитело к PSMAxCD28 | 2,26Е+04 | 03 | 1,44Е-07 | 3,5 |
моноклональное | ТВ | ||||
bsl6430D | антитело к PSMAxCD28 | TBD | TBD | TBD | D |
моноклональное | 1,41Е- | ||||
bsl6431D | антитело к PSMAxCD28 | 6,79Е+03 | 03 | 2,07Е-07 | 8,2 |
моноклональное | |||||
mAB11810P2 | антитело к PSMA | NB | NB | NB | NB |
моноклональное | ТВ | ||||
mAB11838P2 | антитело к PSMA | TBD | TBD | TBD | D |
mAB14226P2 | моноклональное | 2,34Е+04 | 3,28Е- | 1,40Е-07 | 3,5 |
антитело к CD28 | 03 | ||||
моноклональное | 2,64Е- | ||||
mAB14193P2 | антитело к CD28 | 8,73Е+03 | 04 | 3, ОЗЕ-08 | 43,7 |
моноклональное | 1,41Е- | ||||
mAB14216P2 | антитело к CD28 | 1Д2Е+04 | 03 | 1,27Е-07 | 8,2 |
TBD: не тестировалось
NB: связывания не наблюдалось
Кинетические параметры связывания для связывания hCD28.mmh с очищенным биспецифичным моноклональным антителом к PSMAxCD28 при 37°C представлены ниже в табл. 7.
Таблица 7
Аффинности связывания моноклональных антител с CD28 при 37°C
Идентификатор антитела | Захват шАЬ (RU) | Связывание 400 нМ hCD28.6H (RU) | Ка (1/Мс) | Kd (1/с) | KD(M) | t'/2 |
bs!6429D | 1576,3±5,0 | 98,9 | 2,46Е+04 | б,70Е-03 | 2,72Е-07 | 1,7 |
Как показано в табл. 4-7, несколько антител к CD28 согласно настоящему изобретению связывают CD28 с высокой аффинностью. Несколько антител к PSMA согласно настоящему изобретению связывают PSMA с высокой аффинностью. Несколько биспецифичных антител к PSMAxCD28 связывают как CD28, так и PSMA с высокой аффинностью.
Пример 5. Эффективность и специфичность связывания биспецифичных моноклональных антител к PSMAxCD28 с PSMA и CD28 на клеточной поверхности.
Чтобы оценить способность этих антител (моноклональных антител к PSMA, к CD28 и к PSMAxCD28) специфично связываться с белками клеточной поверхности, были разработаны анализы связывания in vitro с использованием клеток, экспрессирующих PSMA человека или CD28 с помощью платформы для определения на основе электрохемилюминесценции (MSD). Было проведено два исследования. В одном исследовании оценивали эффективность и специфичность связывания моноклональных антител с антигенами клеточной поверхности. Эти антитела (антитела к PSMA, к CD28 и к PSMAxCD28) демонстрировали специфичное связывание с линиями клеток, экспрессирующими PSMA человека или CD28 человека. В дополнительном эксперименте было проведено расширяющее исследование с изотипом антител IgG4s.
Методы, использованные для определения эффективности и специфичности клеточного связывания биспецифичных антител к PSMAxCD28 с PSMA и CD28.
Линия клеток эпителиальной карциномы предстательной железы человека, С4-2 (UroCor), эндогенно экспрессирует PSMA человека. Линия клеток, экспрессирующая HEK293/hCD28, была генетически модифицирована путем трансдукции эмбриональных клеток почки человека из АТСС (CRL-1573) устой- 35 045943 чивой к неомицину лентивирусной конструкцией, кодирующей CD28 человека (hCD28, регистрационный номер NP_006130.1). Для оценки специфичности связывания эти две линии клеток оценивали параллельно с родительской линией клеток HEK293HZ (которая является отрицательной в отношении PSMA и CD28) с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Антитело человека IgG1 к Feld1 было включено в качестве отрицательного контроля для обнаружения IgG.
Описанные выше линии клеток однократно промывали буфером 1xPBS без Ca2+/Mg2+ (Irvine Scientific, кат. № 9240) и инкубировали в течение 10 мин при 37°C с раствором для диссоциации клеток, не содержащим ферментов (Millipore, кат. № S-004-C) для отделения клеток от колбы. Проводили дополнительную промывку lxPBS с Ca2+/Mg2+ (Irvine Scientific, кат. № 9236). Затем клетки подсчитывали с помощью счетчика клеток Cellometer™ Auto T4 (Nexcelom Bioscience, модель № Auto T4). Приблизительно 10000 клеток на лунку в буфере для промывки клеток высевали по отдельности в 96-луночные планшеты с пластинчатыми угольными электродами (планшет с высоким связыванием MULTI-ARRAY, MSD, Meso Scale Discovery, кат. № L15XB-3/LX11XB-3) и инкубировали в течение 1 ч при 37°C, чтобы дать клеткам прикрепиться. Сайты неспецифичного связывания блокировали 2% BSA (мас./об.) (Sigma, кат. № A85771L) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
Растворы, содержащие антитела к PSMA, к CD28, к PSMAxCD28 или контрольные антитела в последовательных разведениях от 1,7 пМ до 100 нМ или растворы без антитела добавляли к связанным с планшетом клеткам и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Если не указано иное, анализы проводили в двух повторах. Затем планшеты промывали для удаления несвязанных антител с использованием устройства для промывки планшетов AquaMax2000 с головкой для промывки клеток (MDS Analytical Technologies, модель № 2000). Связанные с планшетом антитела определяли с помощью конъюгированного с SULFO-TAG™ козьего поликлонального антитела к IgG человека, специфичного к тяжелой и легкой цепям (Jackson ImmunoResearch, кат. № 109-005-088) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывок планшеты проявляли с помощью буфера для считывания (MSD, Meso Scale Discovery, кат. № R92TD-2) в соответствии с процедурой, рекомендованной производителем, и регистрировали люминесцентные сигналы с помощью прибора SECTOR Imager 600 (Meso Scale Discovery, модель № 600).
Сигналы от прямого связывания (в относительных световых единицах, RLU) анализировали как функцию концентрации антитела. Данные аппроксимировали сигмоидальной (четырехпараметрической логистической) моделью доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism™ (программное обеспечение GraphPad версии № 6). Значения ЕС50, определяемые как концентрация антитела, при которой обрнаруживается 50% от максимального сигнала связывания, определяли для связывания с клетками HEK293/hCD28 и С4-2, чтобы обозначить силу связывания каждого антитела с CD28 или PSMA, соответственно. Кроме того, были рассчитаны отношения сигналов связывания антител при 11,1 нМ на клетках HEK293/hCD28 или С4-2 к клеткам HEK293HZ. Эта репрезентативная концентрация была выбрана ввиду высокого связывания с клетками-мишенями, но низкого фонового сигнала на CD28, PSMA-отрицательных клетках HEK293HZ. Антитела с отношением связывания менее 3 помечены как NB в приведенной ниже табл. 8. NB определено как в условиях анализа специфичного связывания не наблюдалось.
В дополнительном исследовании был проведен отдельный эксперимент с использованием того же протокола, что описан выше, но включая изотипический контроль IgG4 (см. USSN 15/147,791) и родительское моноклональное антитело к CD28. Тестируемые растворы содержали от 3,4 пМ до 200 нМ антител к PSMA, антител к CD28, биспецифичных моноклональных антител к PSMAxCD28 или контрольных антител в последовательных разведениях. Отношения связывания рассчитывали при 7,4 нм.
Результаты, краткие итоги и выводы.
Способность биспецифичных антител к PSMAxCD28 специфично связываться с клетками, экспрессирующими PSMA либо CD28, оценивали по сравнению с линией клеток, отрицательной в отношении экспрессии PSMA или CD28, с использованием анализа методом иммуносвязывания. Двухвалентные родительские антитела, специфичные к PSMA или CD28, были включены для сравнения. Дозозависимое связывание антитела с клетками на 96-луночных планшетах с высоким связыванием (MSD, Meso Scale Discovery, кат. № L15XB-3/LX11XB-3) с концентрациями антител до 100 нМ определяли с использованием конъюгированного с SULFO-TAG™ антитела к IgG человека, и сигналы связывания в электрохемилюминесценции регистрировали на Sector Imager 600 (MSD). Значения RLU определяли для связывания антител с клетками. Для клеток, экспрессирующих CD28 или PSMA, значения ЕС50 рассчитывали как меру эффективности. Для образцов, которые привели к высокому фоновому сигналу, более высокие концентрации были исключены из расчета значений ЕС50, и значения отмечены звездочкой в табл. 8. Сравнение сигналов связывания антител при 11,1 нМ с клетками HEK293/hCD28 или С4-2 с отрицательными клетками HEK293HZ использовали для оценки специфичности связывания антител. Специфичное связывание определено как антитела, связывание которых с клетками, экспрессирующими CD28 или PSMA, в 3 или более раз выше, чем с клетками HEK293HZ при этой концентрации.
Результаты по связыванию обобщены в табл. 8. В концентрации 11,1 нМ три иллюстративных биспеци
- 36 045943 фичных антитела к PSMAxCD28 согласно изобретению (bs16429D, bs16430D и bs16431D) специфично связывались как с клетками HEK293-hCD28, так и с клетками С4-2, с 13-31-кратным и 4-10-кратным отношением относительно клеток HEK293HZ, соответственно. Эффективность биспецифичных антител варьировала от значений ЕС50 5,31-9,58 нМ на клетках HEK293-hCD28 до 0,35-5,24 нМ на клетках С4-2.
Таблица 8
Связывание моноклональных антител с антигенами клеточной поверхности
Идентификатор антитела | ес50 (М) HEK293-hCD28 | ес50 (М) С4-2 | НЕК293hCD28/ HEK293HZ** | С4-2/ HEK293HZ*** |
bsl6429D | 9,58Е-09 | 8,53Е-10 | 31 | 10 |
шАЬ14226Р2 (CD28) | 1,04Е-09 | NB | 68 | 1 |
ШАЫ1838Р2 (PSMA) | NB | 7,38Е-10* | <1 | 4 |
bsl6430D | 8,47Е-09 | 5,24-09 | 41 | 10 |
шАЬ14193Р2 (CD28) | 1,02Е-08 | NB | 110 | 1 |
шАЬ11810Р2 (PSMA)# | NB | 9,46Е-10 | 1 | 25 |
bsl6431D | 5,31Е-09 | 3,50Е-10* | 13 | 4 |
шАЬ14216Р2 (CD28) | 2,47Е-09 | NB | 114 | 1 |
КОНТРОЛЬ | ||||
Антитело к Feld# | NB | NB | 1 | 1 |
NB: неспецифичное связывание, о чем свидетельствует менее чем 3-кратное отношение сигнала связывания с клеткой к HEK293HZ при 11,1 нМ * : концентрация выше 11,1 нм исключена из расчета ЕС50 из-за высокого фонового значения #: образцы обработаны как однократное последовательное разведение * *: отношение сигнала связывания 11,1 нМ антитела с клеткой (RLU) для HEK293-hCD28 относительно родительских HEK293HZ * **: отношение сигнала связывания 11,1 нМ антитела с клеткой (RLU) для С4-2 относительно HEK293HZ
Родительские антитела специфично связывались с клетками, соответствующими антигену, использованному для их создания, как указано в скобках в колонке с идентификатором антитела. Значения ЕС50 для связывания с клетками HEK293-hCD28 и С4-2 для родительских антител варьировали от 1,04-10,2 нМ на клетках HEK293-hCD28 до 0,738-0,946 нМ на клетках С4-2. Для антител значения связывания mAb11838Р2 и mAb11810Р2 при более высоких концентрациях на клетках С4-2 были исключены из расчета значений ЕС50, чтобы компенсировать высокое фоновое значение на отрицательных клетках. Как и ожидалось, контрольное антитело IgG не показало специфичного связывания с линиями клеток, экспрессирующими CD28 или PSMA.
Дополнительный эксперимент был проведен, как описано выше, но включал изотипический контроль IgG4 и родительское моноклональное антитело к CD28. Эти данные были получены в качестве расширяющего исследования для демонстрации незначительного фонового сигнала с использованием изотипического контроля hIgG4s. Данные обобщенно представлены в табл. 9. Как показано в табл. 9, антитело к CD28 mAb14226Р2 специфично связывается с клеткой, экспрессирующей CD28 человека,
HEK293-hCD28 P-3. Антитело к CD28 mAb14226P2 не связывается с клетками, которые не экспрессируют CD28 человека, вне зависимости от того, экспрессируют эти клетки PSMA (С4-2) или нет (HEK293HZ).
Таблица 9
Связывание изотипа моноклональных антител с антигеном на клеточной поверхности
Идентификатор антитела | ес50 (М) НЕК293hCD28 Р-3 | ЕС50 (М) С4-2 Р-7 | НЕК293hCD28/ HEK293HZ* | С42/HEK293HZ йй |
тАЫ4226Р2 | 8,41Е-10 | NB | 99 | 1 |
КОНТРОЛЬ | ||||
hlgGlKFeldl | NB | NB | 1 | 1 |
hIgG4KFeldl | NB | NB | 1 | 1 |
NB: неспецифичное связывание, о чем свидетельствует менее чем 3-кратное отношение сигнала связывания с клеткой к HEK293HZ при 11,1 нМ * : отношение сигнала связывания 7,4 нМ антитела с клеткой (RLU) для HEK293-hCD28 относительно родительских HEK293HZ * *: отношение сигнала связывания 7,4 нМ антитела с клеткой (RLU) для С4-2 относительно
HEK293HZ
- 37 045943
Связывание биспецифичных антител к PSMAxCD28 с Т-клетками и клетками-мишенями.
Методика эксперимента.
Для определения связывания биспецифичных антител к PSMAxCD28 с С4-2, 22RV1, RAJI, Тклетками человека и яванского макака использовали анализ методом проточной цитометрии с последующим определением меченым фикоэритрином (РЕ) антителом к IgG человека. Вкратце, 1x105 клеток/лунку инкубировали в течение 30 мин при 4°C с последовательными разведениями биспецифичных антител к PSMAxCD28 или антитела человека IgG4 (см. USSN 15/147,791), которое связывает антиген человека без перекрестной реактивности с CD28 человека или яванского макака, в диапазоне от 133 нМ до 8,14 пМ для Т-клеток человека и яванского макака и в диапазоне от 133 нМ до 61 пМ для клеток, экспрессирующих PSMA. После инкубации клетки дважды промывали холодным PBS, содержащим 1% фильтрованного FBS, и добавляли к клеткам конъюгированное с РЕ вторичное антиантитело человека (Jackson Immunoresearch, кат. № 709-116-149) и инкубировали в течение еще 30 мин. К инкубируемым Тклеткам человека и яванского макака добавляли краситель для определения жизнеспособности клеток. Лунки, не содержащие антител или содержащие только вторичные антитела, использовали в качестве контролей.
После инкубации с клетками, экспрессирующими PSMA, клетки промывали, повторно суспендировали в 200 мкл холодного PBS, содержащего 1% фильтрованный FBS, и анализировали методом проточной цитометрии на BD FACS Canto II.
После инкубации с Т-клетками человека или яванского макака клетки промывали и окрашивали смесью антител к CD2 (BD, кат. № 562638), к CD16 (BD, кат. № 562874), к CD4 (BD, кат. № 564305) и к CD8 (BD, кат. № 563795) в окрашивающем буфере Brilliant (BD, кат. № 566349), и продолжали инкубацию еще 20 мин при 4°C. После промывки клетки повторно суспендировали в 200 мкл холодного PBS (Gibco, кат. № 14190-144), содержащего 1% фильтрованного FBS (ТСВ, кат. № 101), гейтировали по гейту живые/CD2+/CD4+/CD16- или живые/CD2+/CD8+/CD16- и анализировали методом проточной цитометрии на BD FACS LSR-Fortessa-X20.
Результаты, краткие итоги и выводы
Связывание биспецифичных антител к PSMAxCD28 с поверхностью Т-клеток человека исследовали методом проточной цитометрии.
bs16429D связывалось со всеми Т-клетками со значением ЕС50 4,80x10’8 М. Оно связывалось как с CD4+, так и с CD8+ Т-клетками, со значениями ЕС50 5,09x10’8 М и 5,89x10’8 М, соответственно.
bs16431D слабо связывалось со всеми Т-клетками со значением ЕС50 1,80x10’7. Оно слабо связывалось как с CD4+, так и с CD8+ Т-клетками, со значениями ЕС50 1,67Е-07 М и 1,80Е-07 М, соответственно.
Связывание биспецифичных антител к PSMAxCD28 с поверхностью линий клеток, экспрессирующих PSMA, исследовали методом проточной цитометрии.
С4-2 представляет собой линию клеток СаР (рак предстательной железы), полученную из клеток LNCaP (андроген-чувствительных клеток аденокарциномы предстательной железы человека, полученных из метастазов в лимфатические узлы; см. Wu et al., Int. J. Cancer, 57:406-412 (1994)). Как bs16429D, так и bs16431D связывалось с клетками С4-2 (см. Liu et al., 2004, Prostate, 60:98-108) со значениями ЕС50 3,87x10’9 М и 1,50x10’9 М, соответственно.
22RV1 представляет собой линию клеток эпителиальной карциномы предстательной железы (см. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., 1999, 35(7):403-409). Как bs16429D, так и bs16431D связывалось с клетками 22RV1 со значениями ЕС50 3,05x10’9 М и 6,33x10’09 М, соответственно.
Эти результаты обобщены в табл. 10-12.
Таблица 10
Связывание биспецифичных антител к PSMAxCD28 с Т-клетками человека
Идентификатор антитела | CD2+ Т-клетки человека, FACS [М] | CD4+ Т-клетки человека, FACS [М] | CD8+ Т-клетки человека, FACS [М] |
bsl6429D | 4,80Е-08 | 5,09Е-08 | 5,89Е-08 |
bsl6431D | (Слабое) 1,80Е-07 | (Слабое) 1,67Е-07 | (Слабое) 1,80Е-07 |
Изотипический | Связывание | Связывание | Связывание |
контроль | отсутствует | отсутствует | отсутствует |
- 38 045943
Таблица 11
Связывание биспецифичных антител к PSMAxCD28 с Т-клетками яванского макака
Идентификатор антитела | CD2+ Т-клетки яванского макака, FACS [М] | CD4+ Т-клетки яванского макака, FACS [М] | CD8+ Т-клетки яванского макака, FACS [М] |
bsl6429D | 1,10Е-08 | 1,93Е-08 | (слабое) 6,84Е-08 |
bsl6431D | (слабое) 1,34Е-07 | (слабое) 2,81Е-07 | Очень слабое связывание |
Изотипический | Связывание | Связывание | Связывание |
контроль | отсутствует | отсутствует | отсутствует |
Таблица 12
Связывание биспецифичных антител к PSMAxCD28 с клетками, экспрессирующими PSMA
Идентификатор антитела | клетки С4-2, FACS [М] | клетки 22RV1, FACS [М] | клетки Raji, FACS [Μ] |
bsl6429D | 3,87Е-09 | 3,05Е-09 | Связывание отсутствует |
bsl6431D | 1,50Е-09 | 6,ЗЗЕ-09 | Связывание отсутствует |
Изотипический контроль | Связывание отсутствует | Связывание отсутствует | Связывание отсутствует |
Пример 6. Исходный и генетически модифицированный биоанализ на биспецифичные антитела к PSMAxCD28.
Активация Т-клеток осуществляется путем стимуляции Т-клеточных рецепторов (TCR), которые распознают определенные пептиды, презентированные белками главного комплекса гистосовместимости класса I или II (ГКГС I или ГКГС II) на антигенпрезентирующих клетках (АПК) (Goldrath et al., Selecting and maintaining a diverse T-cell repertoire, Nature 402, 255-262 (1999)). Активированный TCR, в свою очередь, инициирует каскад сигнальных событий, которые можно отслеживать с помощью репортерных генов, управляемых различными факторами транскрипции, такими как белок-активатор 1 (АР-1), ядерный фактор активированных Т-клеток (NFAT) или ядерный фактор каппа-би (NFkB). Затем Тклеточный ответ дополнительно уточняется путем задействования корецепторов, экспрессируемых или конститутивно, или индуцибельно на Т-клетках, таких как CD28, CTLA-4 (цитотоксический Тлимфоцит-ассоциированный белок 4), PD-1 (белок программируемой клеточной смерти 1), LAG-3 (ген 3 активации лимфоцитов) или другие молекулы (Sharpe et al., The B7-CD28 Superfamily, Nat. Rev. Immunol., 2(2): 116-26 (2002)). Костимулирующая молекула CD28 активируется ее эндогенными лигандами CD80 или CD86, экспрессируемыми на АПК. CD28 усиливает клеточные сигналы, такие как сигнальные пути, контролируемые фактором транскрипции NFkB, после активации TCR. Сопутствующий сигнал CD28 важен для эффективной активации Т-клеток, такой как дифференцировка, пролиферация, высвобождение цитокинов и уничтожение клеток Т-клетками (Smeets et al., NFkB activation induced by T cell receptor/CD28 costimulation is mediated by protein kinase C-θ, PNAS, 97(7):3394-3399 (2012).
Чтобы идентифицировать антитела, которые усиливают активность Т-клеток при одновременном присутствии как первичной стимуляции, так и экспрессии мишени PSMA, антитела к CD28 и биспецифичные антитела к PSMAxCD28 были охарактеризованы с помощью генетически модифицированного репортерного биоанализа и клеточных анализов с использованием первичных Т-клеток человека. В анализах оценивается поведение биспецифичного антитела к PSMA/CD28 в условиях наличия и отсутствия первичной стимуляции, а также в условиях наличия и отсутствия экспрессии мишени. Схема анализов представлена на фиг. 3. Анализы проводили для отбора биспецифичных антител к PSMAxCD28, которые усиливают активность Т-клеток в условиях первичной стимуляции и экспрессии мишени. Соответственно, в анализах оценивали поведение биспецифичных антител в условиях наличия и отсутствия первичной стимуляции и экспрессии мишени.
1) Репортерный анализ на основе люциферазы.
а) Генетическая модификация репортерных Т-клеток.
Полученный из Jurkat Т-клеточный клон JRT3.T3.5 (АТСС, № TIB-153) трансдуцировали репортерной конструкцией с геном люциферазы NFkB (NFkB-Luc, SA Biosciences/Qiagen, кат. № CLS-013L). По
- 39 045943 сле выделения клона, устойчивого к пуромицину (JRT3.T3.5/NFkB-Luc клон 1С2), клетки дополнительно генетически модифицировали для экспрессии полноразмерной человеческой альфа-субъединицы TCR (1G4A - аминокислоты с M1 по S274) и бета-субъединицы TCR (1G4B - аминокислоты с M1 по G311) (Robbins et al., Single and Dual Amino Acid Substitutions in TCR CDRs Can Enhance Antigen-Specific T Cell Functions, J. Immunol. 180(9): 6116-31(2008)). После выделения единственного клона (J.RT3-T3.5/NFkBLuc/1G4AB клон 1D2) клетки дополнительно генетически модифицировали для экспрессии полноразмерной человеческой альфа-субъдиницы CD8 (hCD8a - аминокислоты с M1 по V235 под регистрационным № NP_001139345) и человеческой бета-субъединицы CD8 (hCD8b - аминокислоты с M1 по K210 под регистрационным № Р10966). Снова получали единственный клон (J.RT3-T3.5/NFkBLuc/1G4AB/hCD8ab клон 1D5) и дополнительно трансдуцировали его полноразмерным CD28 человека (hCD28 - аминокислоты с M1 по S220, регистрационный № Р10747). Клетки сортировали по высокой экспрессии CD28 и поддерживали в RPMI+20% FBS+пенициллин/стрептомицин/глутамин (P/S/G) + NEAA+NaPyr+1 мкг/мл пуромицина+500 мкг/мл G418+250 мкг/мл гигромицина+10 мкг/мл бластицидина. Для более быстрого роста генетически модифицированные репортерные Т-клетки содержали в среде для культивирования клеток без антибиотиков и использовали для клеточных экспериментов с люциферазой в качестве генетически модифицированных репортерных Т-клеток. Сведения о реагентах следующие: RPMI 1640, Irvine Scientific, кат. № 9160; FBS, Seradigm, кат. № 1500-50; пенициллин/стрептомицин/глутамин 100х (P/S/G), Thermo Fisher Scientific, кат. № 10378-016; заменимые аминокислоты (NEAA), Irvine Scientific, кат. № 9304; пируват натрия (NaPyr), Millipore, кат. № TMS-005-C; пуромицин, Sigma, кат. № Р8833; генетицин (G418), Thermo Fisher Scientific, кат. № 11811-098; гигромицин; бластицидин.
b) Генетическая модификация АПК.
Стабильную линию клеток HEK293 (АТСС, № CRL-1573), экспрессирующую CD20 человека (аминокислоты с M1 по P297 под регистрационным номером NP_068769.2), трансдуцировали PSMA человека (аминокислоты с M1 по A750 под регистрационным номером Q04609). PSMA-положительные клетки человека выделяли с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), и полученную линию клеток, отсортированную по HEK293/CD20/hPSMA выс, поддерживали в DMEM+10% + P/S/G+NEAA с добавкой 500 мкг/мл G418.
c) Стимуляция Т-клеток/АПК.
В этом эксперименте генетически модифицированные репортерные Т-клетки стимулируют двумя биспецифичными антителами. Первую стимуляцию осуществляют активирующим Т-клетки биспецифичным антителом, hIgG4 к CD3xCD20 (см. WO 14/047231, US 9657102 и USSN 14/661,334), нацеленным на молекулы CD3 на генетически модифицированных репортерных Т-клетках и CD20 на клетках HEK293. При этом первая стимуляция позволяет обойтись без активации TCR их естественными лигандами, которые представляют собой определенные пептиды, экспонируемые на молекулах ГКГС. Вторую стимуляцию вызывает биспецифичное антитело к CD28. Это антитело имитирует активацию CD28 на Тклетках его лигандами, CD80/CD86, экспрессируемыми на АПК. При этом антитело взаимодействует с CD28 на Т-клетках и PSMA на генетически модифицированных клетках HEK293 и запускает активацию CD28 на генетически модифицированных репортерных Т-клетках. Одновременная активация TCR и CD28 приводит к усилению транскрипционной активности NFkB, что, в свою очередь, индуцирует продукцию репортерного гена, люциферазы.
d) План люциферазного анализа.
RPMI1640 с добавками 10% FBS и P/S/G использовали в качестве среды для анализа для получения клеточных суспензий и разведения антител для скрининга биспецифичных антител к PSMAxCD28.
За день до скрининга генетически модифицированные репортерные Т-клетки культивировали до плотности 1х106 клеток/мл в среде для культивирования клеток. Трехкратно (1:3) последовательно разведенные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 и контроли тестировали в присутствии постоянной концентрации 50 пМ антитела к CD20xCD3 или изотипического контроля hIgG4. Диапазон 10-точечного разведения составлял от 15 пМ до 100 нМ, при этом конечное разведение не содержало антител к PSMAxCD28. Реагенты добавляли в следующем порядке: 1) последовательно разведенные антитела добавляли в 96-луночные белые планшеты с плоским дном в соответствующие лунки; 2) в каждую лунку добавляли фиксированную концентрацию 50 пМ антитела к CD20xCD3 или изотипического контроля hIgG4; 3) в планшеты добавляли АПК, повторно суспендированные до плотности 4х105 клеток/мл, с конечной концентрацией 1x104 клеток/лунку; 4) репортерные Т-клетки, культивированные в течение ночи, повторно суспендировали с плотностью 2х106/мл и добавляли в планшеты с конечной концентрацией 5x104 клеток/лунку. Планшеты инкубировали в течение 4-6 ч при 37°C/5% СО2 перед добавлением 100 мкл реагента ONE-Glo™ (Promega, кат. № Е6051) для лизирования клеток и определения люциферазной активности. Испускаемое излучение регистрировали в относительных световых единицах (RLU) на многоканальном планшетном анализаторе Envision (PerkinElmer, модель 2104). Все последовательные разведения были протестированы в двух повторах.
Значения ЕС50 антител определяли путем аппроксимации данных четырехпараметрическим логи
- 40 045943 стическим уравнением на 10-точечной кривой доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism™. Кратность индукции рассчитывали по следующему уравнению:
Кратность Средние значения RLU антитела Г100 нМ1 индукции = Средние значения RLU антитела [0 нМ]
2) Функциональный анализ IL-2 с использованием первичных CD4+ Т-клеток человека:
Был разработан функциональный анализ в первичных CD4 Т-клетках/АПК для оценки влияния активации CD28 на продукцию IL-2 при связывании с биспецифичными антителами к PSMAxCD28.
a) Выделение первичных CD4+ Т-клеток человека.
Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МНПК) выделяли из лейкоцитного концентрата, полученного от здорового донора. Выделение МНПК осуществляли центрифугированием в градиенте плотности с использованием пробирок SepMate™ на 50 мл (StemCell Technologies, кат. № 85450) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Вкратце, в пробирки SepMate на 50 мл наливали слой 15 мл FicollPaque PLUS с последующим добавлением 30 мл лейкоцитов, разведенных 1:2 с помощью D-PBS (натрий-фосфатный буфер Дульбекко, Irvine Scientific, кат. № 9240). Последующие стадии проводили в соответствии с протоколом производителя SepMate. Затем из МНПК выделяли CD4+ Т-клетки с использованием наборов микросфер к CD4 человека от Miltenyi Biotec (кат. № 130-045-101), следуя инструкциям производителя. Выделенные CD4+ Т-клетки замораживали в FBS, содержащем 10% ДМСО (Macron Fine Chemicals, кат. № 4948-02) в концентрации 5х106 клеток на флакон.
b) Высвобождение IL-2 из первичных CD4+ Т-клеток, обработанных антителами к CD28.
В этом анализе первичные CD4 Т-клетки активируют посредством перекрестного связывания CD3 на их поверхности с использованием биспецифичного антитела к CD20xCD3 в комбинации с клетками HEK293, генетически модифицированными для экспрессии CD20 человека. Связывание плеча к CD20 биспецифичных антител к CD20xCD3 с клетками HEK293, экспрессирующими CD20, запускает кластеризацию рецептора CD3, обеспечивая первый сигнал, важный для стимуляции Т-клеток. Однако для определения количественного высвобождения IL-2 важна костимуляция, которая может быть обеспечена путем перекрестного связывания молекул CD28. При этом биспецифичные антитела к PSMAxCD28 взаимодействуют с CD28 на CD4 Т-клетках и PSMA на генетически модифицированных клетках HEK293/hCD20, и запускают кластеризацию - активацию CD28. Комбинированное задействование TCR и CD28 приводит к усилению продукции IL-2, который высвобождается в культуральную среду. IL-2 обнаруживают и количественно определяют в клеточном супернатанте с использованием гомогенного, без промывок, набора AlphaLisa (PerkinElmer, кат. № AL221).
Ранее выделенные и замороженные CD4+ Т-клетки человека от донора размораживали в день проведения анализа в стимулирующей среде (среда для культивирования клеток Х-VIVO 15 (Lonza, кат. № 04-418Q) с добавками 10% FBS, HEPES, NaPyr, NEAA и 0,01 мМ ВМЕ (Р-меркаптоэтанол, Sigma-Aldrich, кат. № М-7522), содержащей 50 Ед/мл бензоназной нуклеазы (EMD Millipore, кат. № 71205-3)). Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин, повторно суспендировали в стимулирующей среде и высевали в 96-луночные круглодонные планшеты в концентрации 1х105 клеток/лунку. Клетки HEK293, генетически модифицированные для экспрессии CD20 человека, по отдельности или в комбинации с PSMA человека, обрабатывали 15 мкг/мл митомицина С (Sigma-Aldrich, кат. № М4287) в стимулирующей среде для первичного посева в концентрации 10х106 клеток/мл. После инкубации в течение 1 ч при 37°C, 5% СО2, клетки HEK293 3 раза промывали D-PBS, содержащим 2% FBS, и добавляли в лунки, содержащие CD4+ Т-клетки, в конечной концентрации 1х104 клеток на лунку.
Затем в лунки добавляли последовательно разведенные 1:3 биспецифичные антитела к PSMAxCD28 или контрольные антитела в диапазоне от 15 пМ до 100 нМ в присутствии 50 пМ анти-CD20xCD3 или изотипического контроля hIgG4. Конечная точка 10-точечного разведения не содержала антител к PSMAxCD28 или к CD28. После инкубации планшетов в течение 72 ч при 37°C, 5% СО2, их центрифугировали для осаждения клеток и собирали 40 мкл супернатанта среды. Из этого объема 5 мкл тестировали в анализе IL-2 человека методом AlphaLISA в соответствии с протоколом производителя. Измерения делали на многоканальном планшетном анализаторе Envision (PerkinElmer, модель 2104). Градуировочную кривую известных концентраций IL-2 использовали для определения концентраций IL-2, генерированных в анализируемых лунках. Все последовательные разведения были протестированы в двух повторах.
Значения ЕС50 антител определяли путем аппроксимации данных четырехпараметрическим логистическим уравнением на 10-точечной кривой доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism™. Кратность индукции рассчитывали по следующему уравнению:
Кратность Средние значения IL-2 антитела Г100 нМ1 индукции = Средние значения IL-2 антитела [0 нМ]
Результаты, краткие итоги и выводы.
Как показано на фиг. 4А и 4В, активация CD4 Т-клеток (измеренная по высвобождению IL-2) и генетически модифицированных клеток JRT3.T3/ 1G4/hCD28 (измеренная по люциферазной активности) усиливалась антителами к hPSMA x hCD28 в условиях первичной стимуляции (REGN2281 к CD20xCD3)
- 41 045943 и PSMA, экспрессируемого на клетках HEK293/hCD20. Двухвалентное антитело к CD28, mAb14193P2, незначительно усиливает активность Т-клеток в присутствии первичной стимуляции и незначительно в генетически модифицированном биоанализе в условиях отсутствия первичной стимуляции. Суперагонист к CD28, TGN1412, усиливает активацию Т-клеток как в первичном, так и в генетически модифицированном анализах в условиях стимуляции CD20xCD3, хотя и в меньшей степени, чем биспецифики PSMAxCD28, в условиях наличия мишени PSMA и первичной стимуляции.
1) Репортерный анализ на основе люциферазы.
Значения ЕС50 и кратности индукции обобщены в табл. 13 и 14 для генетически модифицированных репортерных Т-клеток, совместно инкубированных с клетками HEK293/hCD20 или HEK293/hCD20/hPSMA в дополнение к постоянной концентрации 50 пМ изотипического контроля hIgG4 или биспецифичного антитела к CD3xCD20 (биспецифичного антитела, стимулирующего Тклетки).
Таблица 13
Люциферазная активность в генетически модифицированных репортерных Т-клетках в отсутствие стимуляции TCR
Антитела | HEK293/hCD20 | HEK293/hCD20/hPSMA | ||
ес50 [М] | Кратность | ес50 [М] | Кратность | |
индукции | индукции | |||
bsl6429D | - | 0,81 | - | 1,04 |
bsl6430D | - | 0,87 | - | 0,89 |
bsl6431D | - | 0,94 | - | 0,98 |
шАЬ14226Р2 | 5,11 Е-09 | 4,76 | 4,90 Е-09 | 3,59 |
(CD28) | ||||
шАЬ14193Р2 | - | 0,86 | - | 0,89 |
(CD28) | ||||
шАЬ14216Р2 | η/с (не | 2,80 | п/с | 3,95 |
(CD28) | рассчитано | |||
) | ||||
Одно плечо | - | 0,83 | - | 0,88 |
тАЬ14226Р2 | ||||
Одно плечо | - | 0,88 | - | 0,86 |
шАЬ14193Р2 | ||||
Одно плечо | - | 0,89 | - | 0,91 |
шАЬ14216Р2 |
В табл. 14 обобщены результаты значений ЕС50 и кратности индукции для люциферазной активности в генетически модифицированных Т-клетках, совместно инкубированных с клетками HEK293/hCD20 или HEK293/hCD20/hPSMA и постоянной концентрацией 50 пМ изотипического контроля hIgG4.
- 42 045943
Таблица 14
Люциферазная активность в генетически модифицированных репортерных Т-клетках в условиях стимуляции TCR
Антитела | HEK293/hCD20 | HEK293/hCD20/hPSMA | ||
ес50 [М] | Кратность индукции | ес50 [М] | Кратность индукции | |
bsl6429D | - | 1,00 | 1,72 Е-10 | 16,15 |
bsl6430D | - | 0,92 | 4,57 Е-10 | 13,61 |
bsl6431D | - | 0,95 | 2,78 Е-10 | 24,47 |
шАЬ14226Р2 (CD28) | 3,59 Е-09 | 3,16 | 3,27 Е-09 | 3,03 |
шАЬ14193Р2 (CD28) | 2,23 Е-08 | 1,27 | - | 1,37 |
шАЬ14216Р2 (CD28) | п/с | 3,26 | п/с | 3,15 |
Одно плечо шАЬ14226Р2 | - | 0,99 | - | 0,95 |
Одно плечо шАЬ14193Р2 | 2,24 Е-08 | 1,Ю | - | 1,15 |
Одно плечо шАЬ14216Р2 | - | 0,96 | - | 0,94 |
В табл. 14 обобщены результаты значений ЕС50 и кратности индукции для люциферазной активности в генетически модифицированных Т-клетках, совместно инкубированных с клетками HEK293/hCD20 или HEK293/hCD20/hPSMA и постоянной концентрацией 50 пМ анти-CD3xCD20.
При обработке Т-клеток и АПК 50 пМ изотипического контроля hIgG4 ни одно из биспецифичных антител к CD28 не показало увеличения люциферазной активности в отсутствие стимуляции TCR, независимо от линии АПК, использованной в анализе. Небольшая активация люциферазы наблюдалась с одним из родительских антител к CD28 (mAb14226P2) на клетках HEK293/hCD20 (4,76x) и клетках HEK293/hCD20/hSPMA (3,59x), как показано в табл. 14.
Напротив, при обработке клеток 50 пМ биспецифичного антитела к CD3xCD20 все три биспецифичных антитела к PSMAxCD28, bs16429D, bs16430D и bs16431D, в высокой степени индуцировали люциферазную активность при совместной инкубации с АПК, экспрессирующими на своей поверхности hPSMA. Независимо от линии АПК практически не наблюдалось активации у контролей с одним плечом (одно плечо mAb14226Р2, шАЬ14193Р2 и шАЬ14216Р2). Небольшая активация люциферазы наблюдалась для всех трех родительских антител к CD28 (шАЬ14226Р2, шАЬ14193Р2 и шАЬ14216Р2), как показано в табл. 14.
2) Функциональный анализ IL-2 с использованием первичных CD4+ Т-клеток человека.
Способность биспецифичных антител к PSMAxCD28 обеспечивать костимуляцию посредством CD28 на Т-клетках в условиях отсутствия или наличия экспрессии мишени PSMA оценивали в функциональном анализе первичных CD4 T-клеток, измеряя продукцию цитокинов IL-2.
Значения ЕС50 и кратности индукции обобщены в табл. 15 для CD4 T-клеток, инкубированных совместно с клетками HEK293/hCD20 или HEK293/hCD20/hPSMA в дополнение к постоянной концентрации 50 пМ изотипического контроля hIgG4 или биспецифичного антитела к CD3xCD20 (биспецифичного антитела, стимулирующего Т-клетки).
Как и ожидалось, не наблюдалось какого-либо измеримого высвобождения IL-2 в лунках, содержащих постоянные количества изотипического контроля hIgG4, поскольку первичная стимуляция Т-клеток отсутствовала.
Напротив, измеримые уровни IL-2 были обнаружены в образцах, обработанных биспецифичным антителом к CD3xCD20. В этих условиях при совместной инкубации CD4 Т-клеток человека с клетками HEK293/hCD20 все протестированные моноклональные антитела к CD28, включая антитела к CD28 и биспецифичные антитела к PSMA х CD28, за исключением bs16430D и bs16431D, продемонстрировали повышенные уровни IL-2 (табл. 15). Родительское антитело шАЬ14226Р2 продемонстрировало наивысшую кратность индукции и ЕС50, равную приблизительно 6 нМ. Высвобождение IL-2 было обнаружено для всех трех биспецифичных антител к PSMAxCD28 (bs16429D, bs16430D и bs16431D) при совместном
- 43 045943 культивировании CD4+ Т-клеток с АПК, экспрессирующими hPSMA, и биспецифичным антителом к CD3xCD20. Более низкие уровни IL-2 измерены для их контролей с одним плечом и родительских антител в тех же условиях, что и в табл. 15.
Таблица 15
Продукция IL-2 первичными CD4+ T-клетками в условиях стимуляции TCR
Антитела | HEK293/hCD20 | HEK293/hCD20/hPSMA | ||
ес50 [М] | Кратность | ес50 [М] | Кратность | |
индукции | индукции | |||
bsl6429D | п/с | 22 | 0,27 Е-09 | 606 |
bsl6430D | - | 1 | 0,15 Е-09 | 165 |
bsl6431D | - | 1 | 0,22 Е-09 | 463 |
ШАЫ4226Р2 (CD28) | 6,05 Е-09 | 110 | 8,69 Е-09 | 46 |
ШАЫ4193Р2 (CD28) | п/с | 27 | п/с | 13 |
ШАЫ4216Р2 (CD28) | п/с | 13 | п/с | И |
Одно плечо ШАЫ4226Р2 | п/с | 21 | п/с | 14 |
Одно плечо ШАЫ4193Р2 | 13,78 Е-09 | 21 | 14,52 Е-09 | 13 |
Одно плечо ШАЫ4216Р2 | п/с | 9 | п/с | 6 |
В табл. 15 обобщены результаты значений ЕС50 и кратности индукции для продукции IL-2 первичными CD4+ Т-клетками, совместно инкубированными с клетками HEK293/hCD20 или HEK293/hCD20/hPSMA и постоянной концентрацией 50 пМ антитела к CD3xCD20.
Пример 7. Биспецифичные антитела к PSMAxCD28 усиливают активацию Т-клеток при одновременном присутствии как PSMA, так и стимуляции TCR анти-CD20xCD3.
Иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 были получены и проверены анализом Biacore (см., например, примеры 1 и 4). Пару биспецифичных антител (CD20xCD3 и иллюстративных биспецифичных антител к PSMAxCD28 согласно изобретению) использовали для индукции кластеризации Т-клеток и костимулирующих рецепторов на опухолевых клетках путем связывания с PSMA (CD20 и простатоспецифичный мембранный опухолевый антиген - PSMA) (фиг. 5А). Чтобы продемонстрировать, что PSMAxCD28 связывает и активирует CD28 в присутствии PSMA, экспрессируемого на клеткахмишенях, и активации TCR, была проведена серия клеточных анализов in vitro.
Локализация CD28.
Линии клеток.
Стабильную линию клеток HEK293 (АТСС, № CRL-1573) использовали для создания линий клеток HEK293/hCD20, HEK293/hPSMA и HEK293/hCD20/hPSMA. Для создания линии клеток HEK293/hPSMA проводили стабильную трансфекцию с использованием вектора для экспрессии в клетках млекопитающих, кодирующего управляемый промотором убиквитина-С PSMA (аминокислоты с M1 по A750 под регистрационным номером Q04609) и ген устойчивости к неомицину. Аналогичным образом была создана линия клеток HEK293/hCD20 с использованием вектора для экспрессии в клетках млекопитающих, кодирующего управляемый промотором убиквитина hCD20 (аминокислоты с M1 по P297 под регистрационным номером NP_068769.2). Трансфицированные клетки культивировали в 500 мкг/мл генетицина А для отбора стабильно экспрессирующих линий клеток.
Для получения клеток HEK293/hCD20/hPSMA использовали лентивирусную плазмиду, кодирующую PSMA человека (аминокислоты с M1 по A750 под регистрационным номером Q04609) и ген устойчивости к неомицину, для трансфекции клеток HEK293T, способствуя продуцированию вирусных частиц, которые впоследствии были использованы для инфицирования клеток HEK293/hCD20. PSMAположительные клетки человека выделяли с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Все полученные линии клеток поддерживали в DMEM+10% FBS+P/S/G+NEAA с добавкой 500 мкг/мл G418. Клон Jurkat E6-1 (АТСС, № TIB-152) культивировали в соответствии с рекомендован
- 44 045943 ным протоколом АТСС.
Для получения клеток MC38/hPSMA использовали лентивирусную плазмиду, кодирующую PSMA человека (аминокислоты с M1 по A750 под регистрационным номером Q04609) и ген устойчивости к неомицину, для трансфекции клеток HEK293T, способствуя продуцированию вирусных частиц, которые впоследствии были использованы для инфицирования родительских клеток МС38. PSMAположительные клетки человека выделяли с помощью FACS. MC38/hPMA поддерживали в DMEM+10% FBS+P/S/G+NEAA с добавкой 500 мкг/мл G418.
Amnis Image stream.
Т-клетки Jurkat и клетки-мишени (HEK293/hPSMA или HEK293/hPSMA/hCD20) инкубировали с CD20xCD3-Alexa488 (REGN2280, 0,5 мкг/мл), отдельно или вместе с PSMAxCD28-Alexa647 (bs16429D, 1 мкг/мл), в течение 1 ч при 37°C. Клетки дважды осторожно промывали буфером для FACS (3% FBS, 2 мМ ЭДТА в PBS) и окрашивали антителом к CD28 с биотином (REGN1412, 2 мкг/мл) в течение 15 мин при 4°C, а затем стрепmавидином-PE-CF594 (BD 562284, 1 мкг/мл) и Hoechst 33342 (Thermo Fisher H3570, 1 мкМ) в течение 15 мин при 4°C. Клетки промывали PBS и хранили в стабилизирующем фиксаторе BD (BD 338036). Изображения клеток получали на проточном цитометре с визуализацией Amnis® и анализировали с помощью программного обеспечения IDEAS®. Клетки гейтировали по светлопольному дуплету, дуплетному ядру, фокусу ядра, подсчету одиночных пятен, синглету CD28. Площадь синапсов определяли наложением маски Valley на основе окрашивания ядра. Клетки с неправильной маской Valley удаляли путем гейтирования по области перекрытия между маской Valley и CD28. Отношение CD28 в синапсе/вне синапса рассчитывали по следующей формуле:
CD28 в синапсе/вне синапса=интенсивность CD28 в синапсе/(общая интенсивность CD28 - интенсивность CD28 в синапсе) х 100%.
Результаты, краткие итоги и выводы.
Т-клетки культивировали совместно с генетически модифицированными клетками-мишенями (HEK293/hPSMA или HEK293/hCD20/hPSMA), сверхэкспрессирующими CD20 и PSMA, и флуоресцентно мечеными биспецификами (CD20xCD3 - зеленым, PSMAxCD28 - красным). Для определения локализации CD28 клетки фиксировали и окрашивали антителом к CD28 после инкубации в течение 1 ч при 37°C. Изображения конъюгатов Т-клеток и клеток-мишеней были получены с использованием проточного цитометра с визуализацией Amnis ImageStream. В отсутствие экспрессии PSMA на клетках-мишенях биспецифик CD20xCD3 сам по себе практически не индуцировал кластеризацию CD28 на Т-клетках. При экспрессии PSMA на клетках-мишенях CD20xCD3 локализовался на границе раздела конъюгатов Тклеток и клеток-мишеней и образовывал иммунологический синапс (ИС), где был локализован CD28. PSMAxCD28 вместе с CD20xCD3 дополнительно усиливали накопление CD28 в ИС. Распределение CD28 количественно оценивали путем расчета отношения окрашивания CD28 внутри ИС и за его пределами (фиг. 5В).
Был сделан вывод, что PSMAxCD28 в присутствии PSMAxCD3 и клеток-мишеней, экспрессирующих PSMA, вызывает устойчивое накопление CD28 в ИС - месте, где происходит передача сигналов для активации Т-клеток.
Высвобождение цитокинов.
Для дальнейшего изучения влияния TAAxCD28 на активацию Т-клеток измеряли пролиферацию Тклеток и высвобождение цитокинов IL-2 и IFNy после инкубации с титрованными дозами биспецификов CD20xCD3 или PSMAxCD28 в совместном культивировании с первичными Т-клетками человека и генетически модифицированными клетками-мишенями, сверхэкспрессирующими различные ТАА (HEK293/hPSMA, HEK293/hCD20 или HEK293/hCD20/hPSMA) (фиг. 5C-5G). Было подтверждено, что иллюстративные антитела к PSMAxCD28 согласно изобретению и биспецифичные антитела к PSMAxCD3 не конкурируют за связывание с клетками, экспрессирующими PSMA, и, следовательно, связываются с разными эпитопами (фиг. 5Н). Кроме того, было подтверждено, что PSMAxCD28 индуцировало активацию Т-клеток в условиях одновременной стимуляции CD3 и экспрессии PSMA на клеткемишени (HEK293/hCD20/hPSMA плюс 5 пМ CD20xCD3). Активация Т-клеток иллюстративными биспецифичными антителами к PSMAxCD28 не наблюдалась в отсутствие экспрессии PSMA на клеткахмишенях (совместное культивирование с HEK293/hCD20) или в отсутствие стимуляции CD3 (совместное культивирование с HEK293/PSMA плюс 5 пМ CD20xCD3 или HEK293/hCD20/hPSMA плюс 5 пМ изотопического контроля) (фиг. 5E-5G). В целом было продемонстрировано, что иллюстративные антитела к PSMAxCD28 согласно изобретению стимулируют активацию Т-клеток в присутствии PSMAxCD3 и экспрессирующих PSMA клеток-мишеней, что приводит к повышенной пролиферации и секреции цитокинов.
Пример 8. Уничтожение клеток, экспрессирующих PSMA.
Было проведено два исследования цитотоксичности на основе FACS. В первом исследовании исследовали цитотоксичность на основе FACS на клетках С4-2 в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека в условиях наличия или отсутствия стимуляции антиPSMAxCD28. Стимуляцию проводили в присутствии фиксированной концентрации биспецифичного антитела к PSMAxCD28 и последовательных разведений биспецифичного антитела к PSMAxCD3. Вто
- 45 045943 рое исследование было идентично первому за исключением того, что вместо МНПК человека использовали МНПК яванского макака. Был сделан вывод, что биспецифичные антитела к PSMAxCD28 усиливают активацию Т-клеток и цитотоксичность в отношении опухолевых клеток предстательной железы в условиях стимуляции TCR посредством PSMAxCD3.
Методики проведения экспериментов.
Выделение первичных CD4+ Т-клеток человека.
Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) человека выделяли из лейкоцитного концентрата, полученного от здорового донора. Выделение МНПК осуществляли центрифугированием в градиенте плотности с использованием пробирок SepMate™ на 50 мл в соответствии с протоколом производителя. Затем из МНПК выделяли CD4+ Т-клетки с использованием набора для выделения CD4+ Тклеток человека EasySep™ от StemCell Technologies, следуя инструкциям, рекомендованным производителем. Выделенные CD4' Т-клетки замораживали в FBS, содержащем 10% ДМСО, в концентрации 50х 106 клеток на флакон.
Анализ активации первичных Т-клеток человека.
Ранее выделенные и замороженные CD4+ Т -клетки человека размораживали в день проведения анализа в стимулирующей среде (среда для культивирования клеток X-VIVO 15 с добавками 10% FBS, HEPES, NaPyr, NEAA и 0,01 мкМ ВМЕ), содержащей 50 Ед/мл бензоназной нуклеазы. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин, повторно суспендировали в стимулирующей среде и высевали в 96-луночные круглодонные планшеты в концентрации 1х105 клеток на лунку. Клетки HEK293 (HEK293/hPSMA, HEK293/hCD20 или HEK293/hPSMA/hCD20) обрабатывали 15 мкг/мл митомицина С в стимулирующей среде для первичного посева в концентрации 10х106 клеток/мл. После инкубации в течение 1 ч при 37°C, 5% СО2, клетки HEK293 3 раза промывали D-PBS, содержащим 2% FBS, и добавляли в лунки, содержащие CD4+ Т-клетки в конечной концентрации 2х 104 клеток на лунку.
Для определения субоптимальной концентрации биспецифичного антитела к CD20xCD3 для активации Т-клеток, CD20xCD3 последовательно разводили 1:3 в диапазоне от 1,5 пМ до 10 нМ в присутствии 500 пМ биспецифика PSMAxCD28 или изотипического контроля hIgG4s. Была выбрана постоянная концентрация 5 мкМ биспецифика CD20xCD3 или контрольного hIgG4, и следующие антитела: 1) PSMAxCD28; 2) контрольное ненацеленное х CD28; 3) родительское CD28; 4) CD28SA (суперагонист); 5) изотипический контроль hIgG4 и 6) изотипический контроль hIgG4s, титровали от 15 пМ до 100 нМ с разведением 1:3. Конечная точка 10-точечного разведения не содержала титруемых антител, только 5 пМ биспецифика CD20xCD3 или контрольного hIgG4.
После инкубации планшетов в течение 48 ч при 37°C, 5% СО2, их центрифугировали для осаждения клеток и собирали 50 мкл супернатанта среды. Из этого объема 5 мкл тестировали в анализе IL-2 человека и IFNy человека методом AlphaLISA в соответствии с протоколом производителя. Измерения делали на многоканальном планшетном анализаторе Envision от Perkin Elmer. Была построена градуировочная кривая известных концентраций IL-2 или IFNy для экстраполяции пг/мл IL-2 или IFNy, генерированных в анализируемых лунках. Все последовательные разведения были протестированы в двух повторах. Осажденные клетки инкубировали с [метил-3Н]-тимидином, 0,25 мкКи/лунку в течение 16 ч при 37°C, 5% СО2. Клетки собирали на планшеты Perkin Elmer Unifilter с использованием сборщика клеток Unifilter 96 Cell Harvester от Perkin Elmer. После добавления 30 мкл сцинтилляционной жидкости планшеты запечатывали и регистрировали число импульсов в минуту для каждой лунки, используя TopCount NXT от Perkin Elmer.
Значения ЕС50 антител определяли из четырехпараметрического логистического уравнения на 10точечной кривой доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism™.
Анализ цитотоксичности на основе FACS.
Чтобы отслеживать уничтожение PSMA+ клеток в присутствии комбинации антител к PSMAxCD3 и к PSMAxCD28, клетки С4-2 метили 1 мкМ флуоресцентного отслеживающего красителя Violet Cell Tracker (Invitrogen, кат. № 34557). После мечения клетки высевали на ночь при 37°C. Отдельно МНПК человека (New York Blood Center (Нью-Йоркский центр крови)) или МНПК яванского макака (Covance, Кранфорд, Нью-Джерси) высевали в среду RPMI с добавками в концентрации 1 х 106 клеток/мл и инкубировали в течение ночи при 37°C для обогащения лимфоцитами за счет обеднения адгезивными макрофагами, дендритными клетками и некоторыми моноцитами. На следующий день клетки-мишени совместно инкубировали с обедненными адгезивными клетками наивными МНПК (соотношение эффектор/клеткамишень составляло 4:1) и последовательными разведениями биспецифичного антитела к PSMAxCD3 или контроля IgG4 (диапазон концентраций: 0,42 нМ - 0,1 пМ), по отдельности или в комбинации с фиксированной концентрацией костимулирующих молекул к PSMAxCD28, bs16429D или bs16431D, при 2,5 мкг/мл (16,7 нМ) в течение 96 ч при 37°C.
После инкубации клетки удаляли из планшетов для культивирования клеток с помощью буфера для диссоциации трипсин-ЭДТА (Millipore, кат. № SM-2004-C) и анализировали методом FACS на FACS BD LSRFortessa-X20 (BD).
Для FACS-анализа клетки окрашивали с помощью красителя cell tracker дальнего красного спектра
- 46 045943 для определения жизнеспособности (Invitrogen) и напрямую конъюгировали антитела к CD2, CD4, CD8 и CD25 (BD). Образцы анализировали с калибровочными микросферами для подсчета клеток. Для оценки специфичности уничтожения клетки-мишени гейтировали как популяции, положительные на Violet cell tracker. Процент живых клеток-мишеней рассчитывали следующим образом: процент (%) жизнеспособных клеток = (R1/R2)x100, где RI^po^ht (%) живых клеток-мишеней в присутствии антитела, а К2=процент (%) живых клеток-мишеней в отсутствие исследуемого антитела. Активацию Т-клеток измеряли по проценту активированных (CD25+) Т-клеток из CD2+/CD4+ или CD2+/CD8+ Т-клеток. Количество Т-клеток измеряли путем расчета количества живых CD4+ или CD8+ клеток на калибровочную микросферу.
Уровни цитокинов, накопленных в среде, анализировали с использованием набора микросфер для проточной цитометрии для анализа цитокинов человека Th1/Th2/Th17, BD cytometric Bead Array (CBA) human Th1/Th2/Th17 Cytokine kit, в соответствии с протоколом производителя.
Для FACS-анализа клетки окрашивали красителем для анализа жизнеспособности в ближнем ИКдиапазоне (Invitrogen, кат. № L34976). Непосредственно перед FACS-анализом в каждую лунку добавляли пятьсот тысяч (5x105) калибровочных микросфер. Для каждого образца собирали сто тысяч (1x105) микросфер. Для оценки специфичности уничтожения клетки гейтировали по живым популяциям, меченным Violet. Регистрировали процент живой популяции и использовали его для расчета выживаемости.
Активацию Т-клеток и повышающую регуляцию маркера PD-1 оценивали путем инкубации клеток с напрямую конъюгированными антителами к CD2, CD4, CD8, CD25 и PD-1, а также путем регистрации процента поздно активированных (CD25+/CD8+) Т-клеток и PD-1+/CD4+ Т-клеток из общего количества Т-клеток (CD2+). Информация о напрямую конъюгированных антителах следующая: CD2, PE:CD2 (C1:RPA-2.1), BD, кат. № 555327; CD4, PerCP-Cy5.5:CD4 (Cl:OKT-4), Biolegend, кат. № 317428; CD8, APC:CD8 (C1:RPA-T8), Biolegend, кат. № 301049; CD25, BV510:CD25 (Cl:M-A251), BD, кат. № 563352; и PD-1, PE-Cy7:PDl (Cl:EH12.2H7), Biolegend, кат. № 329918.
Супернатант анализируемых лунок из анализа МНПК человека оценивали на высвобождение цитокинов Th1/Th2 с использованием набора микросфер для проточной цитометрии BD cytometric bead array human kit (BD, кат. № 560484) и следуя протоколу производителя.
Результаты, краткие итоги и выводы.
На фиг. 6А и 6В показано, что анти-PSMAxCD28 усиливало цитотоксическую активность bs13644D (анти-PSMAxCD3) в присутствии Т-клеток человека или яванского макака. Биспецифичное антитело к PSMAxCD3 было исследовано на предмет его способности индуцировать уничтожение наивными Тклетками человека клеток-мишеней, экспрессирующих PSMA человека, в качестве единственного агента или в присутствии костимулирующего биспецифичного антитела к PSMAxCD28. В исследовании, показанном на фиг. 6А и 6В, концентрацию антитела к PSMAxCD28 фиксировали на уровне 2,5 мкг/мл. Анtu-PSMAxCD3 последовательно разводили 1:4. Антитела инкубировали с клетками в течение 96 ч. В табл. 16 обобщены компоненты антител, использованных в этом исследовании.
Таблица 16
Компоненты биспецифичных антител в исследованиях цитотоксической эффективности
Идентификатор продукта антитела | Формат антитела | Плечо PSMA [VH] | Плечо CD28 [VH] | Легкая цепь |
bsl6429D | PSMAxCD28 | mAbll838P2 | mAbl4226P2 | 3-20 ULC |
bsl6431D | PSMAxCD28 | mAb!1810P2 | mAb!4216P2 | 1-39 ULC |
bsl3644D | PSMA (mABl 1835P2)xCD3 (7221G) | 1-39 ULC | ||
bs!7664D | Контроль EGFRvIIIxCD3(7221G) | 1-39 ULC |
Было проверено, могут ли иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 усиливать активацию Т-клеток и цитотоксичность в отношении клеток рака предстательной железы путем нацеливания на PSMA. С помощью анализа цитотоксичности и активации Т-клеток на основе FACS были протестированы иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 в комбинации с PSMAxCD3 (фиг. 6, 7A-7D). МНПК человека, содержащие Т-клетки, культивировали совместно с клетками рака предстательной железы С4-2, экспрессирующими эндогенно высокие уровни PSMA (данные не показаны). PSMAxCD28 значительно повышало эффективность цитотоксичности, индуцированной только PSMAxCD3, сдвигая ЕС50 с 4,3x10’11 до 1,5x10-1 (сдвиг в эффективности более чем на логарифм) (фиг. 6 и 7А). Согласуясь с индукцией Т-клеточной цитотоксичности, PSMAxCD28 повышало уровни высвобождения IFNy, индуцированного PSMAxCD3, в 4 раза (фиг. 7В). Точно так же комбинация PSMAxCD28 и PSMAxCD3 увеличивала количество CD4 и CD8 Т-клеток и экспрессию маркера активации CD25 (фиг. 7С и 7D). Никакого влияния на цитотоксичность или активацию Т-клеток не наблюдалось, когда иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 использовались в комбинации с ненацеленным
- 47 045943 биспецифичным антителом к CD3. Кроме того, чтобы продемонстрировать, что иллюстративное биспецифичное антитело к PSMAxCD28 может усиливать цитотоксичность PSMAxCD3 и активацию Т-клеток у нечеловекообразных приматов, были проведены такие же анализы с использованием МНПК от яванских макаков с получением аналогичных результатов (фиг. 6, 7E-7G). Эти результаты продемонстрировали, что иллюстративное биспецифичное антитело к PSMAxCD28 может эффективно усиливать опосредованную PSMAxCD3 активацию Т-клеток не только посредством пролиферации и высвобождения цитокинов, но также за счет цитотоксичности. На фиг. 7Н показано, что иллюстративное биспецифичное антитело к PSMAxCD28 связывается с клеточными мишенями согласно результатам анализа методом проточной цитометрии.
Биспецифичное антитело к PSMA x CD3 активировало и направляло Т-клетки человека на сокращение пула клеток С4-2 (линия клеток рака предстательной железы человека). Уничтожение клетокмишеней отслеживали в присутствии биспецифичного антитела к PSMAxCD3, и клетки С4-2 были уничтожены дозозависимым образом со значениями ЕС50 в пикомолярном диапазоне (табл. 17). Наблюдаемый лизис клеток-мишеней был связан с повышающей регуляцией CD25+ и PD-1+ клеток на CD2+ Тклетках, снова со значениями ЕС50 в пикомолярном диапазоне (табл. 17). Биспецифичное антитело к PSMAxCD3 индуцировало высвобождение человеческих цитокинов. Цитотоксическая активность, наблюдаемая для биспецифичного антитела к PSMAxCD3 при применении в качестве единственного агента, усиливалась в присутствии фиксированной концентрации костимулирующих молекул к PSMAxCD28 (биспецифичных антител) (табл. 17).
Таким образом, костимуляция биспецифичным антителом к PSMAxCD28 увеличивала активацию Т-клеток, повышающую регуляцию PD-1 и высвобождение цитокинов по сравнению с наблюдениями, сделанными при применении биспецифичного антитела к PSMAxCD3 в качестве единственного агента. В табл. 16 обобщены результаты экспериментов с использованием МНПК человека.
Таблица 17
Влияние анти-PSMAxCD28 на цитотоксичность анти-PSMAxCD3 в отношении клеток С4-2 в присутствии МНПК человека
Антитело | EC50 уничтожения C4-2 [Μ] | ЕС50 активации Τклеток [Μ] (CD8+/CD25+) | ес50 повышающей регуляции PD-1 [M] (CD4+/PD1+) |
Анти-Р SM AxCD3 | 4,35Ε-11 | 7,53Ε-11 | 3,ОЗЕ-11 |
Анти-Р SM AxCD3 +bsl6429D | 1,45Ε-12 | 4,95Ε-12 | 3,71Е-12 |
Анти-Р SM AxCD3 +bsl6431D | 4,88Ε-12 | 6,44Ε-12 | 4,38Е-12 |
Биспецифичное антитело к PSMAxCD3 также было исследовано на предмет его способности индуцировать уничтожение наивными Т-клетками яванского макака клеток-мишеней, экспрессирующих PSMA человека, в качестве единственного агента или в присутствии костимулирующего биспецифичного антитела к PSMAxCD28. При выбранном титре антитела биспецифичное антитело к PSMAxCD3 активировало Т-клетки человека, но не направляло Т-клетки на сокращение пула клеток С4-2 (табл. 18). Костимуляция антителом к PSMAxCD28 привела к повышению активации Т-клеток, усилению цитотоксической активности и повышающей регуляции маркера PD-1 на Т-клетках (табл. 18).
Таблица 18
Влияние анти-PSMAxCD28 на цитотоксичность анти-PSMAxCD3 в отношении клеток С4-2 в присутствии МНПК яванского макака
Антитело | ЕС50 уничтожения С4-2 [М] | ЕС50 активации Т-клеток [М] (CD8+/CD25+) | ЕС50 повышающей регуляции PD-1 [М] |
- 48 045943
(CD4+/PD1+) | |||
Анти-Р SM AxCD3 | н/д | l,71E-10 | 2,29E-10 |
Анти-Р SM AxCD3 +bsl6429D | 1,55E-11 | 1,64E-11 | 5,64E-12 |
Анти-Р SM AxCD3 +bs!6431D | 7,72E-11 | 2,76E-11 | 2,66E-11 |
Пример 9. Высвобождение цитокинов из клеток.
Как указано в других местах в настоящем документе, анализы высвобождения цитокинов ex vivo с использованием МНПК человека в растворимом формате не смогли предсказать высвобождение цитокинов. Для этого были разработаны форматы анализа с покрытием.
Биспецифичные антитела к PSMA/CD28 и антитела к CD28 согласно настоящему изобретению оценивали на их способность индуцировать пролиферацию МНПК человека и высвобождение цитокинов из клеток с использованием формата анализа с покрытием. Для анализа пролиферации МНПК использовали свежевыделенные МНПК в количестве 1х105/лунку. Для совместного культивирования добавляли клетки С4-2, обработанные митомицином С, в количестве 1 х104 лунку. Разведения антител наносили на планшеты мокрым или сухим способом в течение ночи. Планшеты промывали перед добавлением МНПК. Супернатанты собирали примерно через 54 ч для анализа цитокинов с помощью Meso Scale Diagnostics (MSD, Роквилл, Мэриленд). Добавляли 3Н тимидин на 18 ч и измеряли пролиферацию.
Результаты показали, что растворимое биспецифичное антитело к PSMAxCD28 индуцировало пролиферацию МНПК человека в присутствии стимула CD3. Напротив, суперагонист к CD28 индуцировал пролиферацию МНПК человека в отсутствие стимула CD3 (данные не показаны).
Кроме того, bs16429D (PSMAxCD28 А) и mAb14226Р2 (родительское к CD28 А), нанесенные мокрым способом, индуцировали меньшее высвобождение цитокинов, чем суперагонист к CD28, нанесенный мокрым способом, тогда как bs16431D (PSMAxCD28 В) и mAb14216Р2 (родительское к CD28 В) не индуцировали значительно большего высвобождения цитокинов по сравнению с контролем (данные не показаны).
Антитело к CD28 согласно настоящему изобретению демонстрирует несколько свойств, отличающихся от суперагониста TGN1412. Считается, что обычные агонистические моноклональные антитела к CD28 (несуперагонисты) связываются с мембранно-дистальными эпитопами, обеспечивая только моновалентное связывание антител (Dennehy et al., Cutting Edge: monovalency of CD28 maintains the antigen dependence of T cell costimulatory responses, J. of Immunol. 176(10): 5725-29 (2006)). Антитела к CD28 управляют оптимальной активацией Т-клеток в присутствии антигенспецифичного распознавания пептида-ГКГС с помощью TCR. Передача сигналов CD28 регулирует порог активации TCR и значительно снижает количество взаимодействий TCR, необходимых для эффективной активации Т-клеток. Напротив, антитело к CD28 TGN обладало некоторыми суперагонистическими свойствами (Luhder et al., Topological requirements and signaling properties of T cell-activating, anti-CD28 antibody superagonists, J. of Exp. Med. 197(8): 955-966 (2003)); Riley et al., the CD28 family: a T-cell rheostat for therapeutic control of Tcell activation, Blood, 105(1): 13-21 (2005)). Например, антитело к CD28 TGN индуцировало мощную пролиферацию Т-клеток и продукцию IL2 in vitro и in vivo даже в отсутствие передачи сигналов TCR, усиливало активность NF-kB более эффективно, чем обычная передача сигналов антителом к CD28/CD3, и индуцировало активацию AP-1/SRE, и связывалось с эпитопами CD28 вблизи клеточной поверхности, обеспечивая возможность двухвалентного связывания.
Соответственно, как показано на фиг. 8, суперагонист к CD28 TGN 1412 активировал репортер АР1 в отсутствие первичной стимуляции CD3. Напротив, антитело к CD28 согласно данному изобретению (родительское антитело для PSMAxCD28) минимально активировало АР-1 в биоанализе люциферазного репортера АР-1.
Пример 10. Исследование антитела к PSMAxCD28 in vivo.
Модель сингенной опухоли.
В согласии с исследованием in vitro в примере 8, комбинация нацеленных на опухолевый антиген биспецифичных антител к CD3xPSMA и CD28xPSMA повышала элиминацию опухоли в модели на мышах. Для проверки эффективности биспецифичного антитела к PSMAxCD28 в качестве монотерапии или в комбинации с биспецифичным антителом к PSMAxCD3 были проведены эксперименты с сингенными опухолями на мышах, экспрессирующих CD28 человека, CD3 человека и PSMA человека вместо соответствующих мышиных генов, полученных с использованием собственной технологии Velocigene (мыши hCD3/hCD28/hPSMA). Был сделан вывод, что биспецифик к PSMAxCD28 усиливает противоопухолевый иммунитет in vivo за счет активации Т-клеток, индуцированной анти-PSMAxCD3.
Активация Т-клеток инициируется после связывания комплекса Т-клеточный рецептор (TCR)/CD3 с комплексами пептид-ГКГС (сигнал 1); затем активация усиливается за счет задействования второго
- 49 045943 костимулирующего рецептора, такого как рецептор CD28 на Т-клетках, связывающегося с его когнатным лигандом(ами) на клетке-мишени (сигнал 2). Недавно описанные биспецифичные антитела на основе CD3 действуют путем замены обычного сигнала 1, связывая Т-клетки с опухолевыми клетками путем связывания опухолеспецифичного антигена (TSA) с одним плечом биспецифичного антитела и соединения посредством другого плеча с TCR/CD3. Хотя некоторые из этих биспецификов TSAxCD3 продемонстрировали многообещающую противоопухолевую эффективность у онкологических больных, их активность еще предстоит оптимизировать. Как описано в других местах в настоящем документе, в настоящем изобретении вводится новый класс биспецифичных антител, которые имитируют сигнал 2, соединяя второй TSA с костимулирующим рецептором CD28 на Т-клетках. Эти биспецифичные антитела называют биспецификами TSAxCD28 или биспецификами к TSA/CD28. Как описано в настоящем документе, одно иллюстративное антитело согласно по настоящему изобретению специфично в отношении антигенов рака предстательной железы (например, PSMA). В отличие от суперагонистов к CD28, которые активируют широкий спектр Т-клеток и в некоторых случаях приводили к значительной токсичности в ранних клинических испытаниях, эти биспецифики TSAxCD28 проявляют ограниченную активность и не токсичны при использовании по отдельности в моделях на генетически гуманизированных иммунокомпетентных мышах или у приматов. Однако в комбинации с биспецифичными антителами к TSAxCD3 иллюстративное антитело согласно изобретению повышало искусственный синапс между Тклеткой и ее клеткой-мишенью, усиливало активацию Т-клеток и заметно улучшало противоопухолевую активность CD3-биспецификов в моделях сингенных опухолей. Сочетание этого нового класса CD28костимулирующих биспецифичных антител с развивающимся классом биспецификов TSAxCD3 может обеспечить хорошо переносимые, готовые к использованию варианты антителотерапии с потенциально повышенной противоопухолевой эффективностью.
Способность Т-клеток распознавать и уничтожать свои клеточные мишени, такие как инфицированные вирусом клетки или опухолевые клетки, зависит от согласованного набора взаимодействий. Прежде всего они включают распознавание и связывание клетки-мишени комплексом TCR (который включает связанные γ-, δ-, ε-, ζ-цепи CD3); это взаимодействие было названо сигналом 1 для активации Т-клеток. TCR может распознавать вирусный или опухолевый пептид, презентируемый в бороздке белков ГКГС, экспрессируемых на поверхности клеток-мишеней. Это связывание обычно имеет низкую аффинность; поэтому для успешного запуска сигнала 1 важно иметь кластеризацию многих комплексов TCR вдоль границы раздела между Т-клеткой и ее клеткой-мишенью, и эта граница раздела была названа иммунным синапсом (J. В. Huppa, M. M. Davis, T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol 3, 973-983 (2003)). Активация и пролиферация Т-клеток затем дополнительно стимулируются дополнительными взаимодействиями с костимулирующими рецепторами, такими как CD28 (сигнал 2) (J.H. Esensten, Y. A. Helou, G. Chopra, A. Weiss, J. A. Bluestone, CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity 44, 973-988 (2016)). Когда Т-клетка распознает клетку-мишень посредством комплекса TCR и задействует сигнал 2 посредством связывания CD28 с его когнатным лигандом(ами) (CD80/B7.1 и/или CD86/B7.2) на профессиональной антигенпрезентирующей клетке или клетке-мишени, активация Т-клеток повышается. Как и в случае с сигналом 1, опосредованный CD28 сигнал 2, вероятно, возникает в результате совместной кластеризации в иммунном синапсе.
Обычные моноклональные антитела, нацеленные против опухолеспецифичных антигенов (TSA), использовались в качестве противоопухолевых терапевтических средств на протяжении последних двух десятилетий (G. Salles et al., Rituximab in B-Cell Hematologic Malignancies: A Review of 20 Years of Clinical Experience. Adv Ther 34, 2232-2273 (2017); M. V. Mateos et al., Daratumumab plus Bortezomib, Melphalan, and Prednisone for Untreated Myeloma. N Engl J Med 378, 518-528 (2018): W. Eiermann, G. International Herceptin Study, Trastuzumab combined with chemotherapy for the treatment of HER2-positive metastatic breast cancer: pivotal trial data. Ann Oncol 12 Suppl 1, S57-62 (2001); J. M. Connors et al., Brentuximab Vedotin with Chemotherapy for Stage III or IV Hodgkin's Lymphoma. N Engl J Med 378, 331-344 (2018); V. Dieras et al., Trastuzumab emtansine versus capecitabine plus lapatinib in patients with previously treated HER2positive advanced breast cancer (EMILIA): a descriptive analysis of final overall survival results from a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 18, 732-742 (2017)). Однако этот класс антител обладал ограниченной способностью индуцировать опосредованную Т-клетками цитотоксичность, и вместо этого действовал путем стимуляции антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и/или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), или путем доставки токсина в опухолевые клетки. Недавно появился новый класс биспецифичных антител (TSAxCD3), которые могут эффективно запускать опосредованное Т-клетками уничтожение опухолевых клеток, связывая Т-клетку с опухолевой клеткой и активируя комплекс CD3/TCR (обычно через эпсилон-цепь CD3) с помощью заместительного механизма, тем самым имитируя сигнал 1. Ранняя версия такого биспецифика (одно плечо связывается с CD19 на клетках лейкоза, а второе связывается с CD3) недавно получила одобрение надзорных органов для лечения Вклеточного острого лимф областного лейкоза (R. Bargou et al., Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell engaging antibody. Science 321, 974-977 (2008); H. Kantarjian et al., Blinatumomab versus Chemotherapy for Advanced Acute Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med 376, 836-847 (2017)). Недавно было показано, что улучшенные версии биспецификов обладают хорошей активностью против неход
- 50 045943 жкинских лимфом, нацеливая CD20 на эти лимфомы (Е. J. Smith et al., A novel, native-format bispecific antibody triggering T-cell killing of Bcells is robustly active in mouse tumor models and cynomolgus monkeys. Sci Rep 5, 17943 (2015); L. L. Sun et al., Anti-CD20/CD3 T cell-dependent bispecific antibody for the treatment of В cell malignancies. Sci TranslMed 7, 287ra270 (2015); M. Bacac et al., CD20-TCB with Obinutuzumab Pretreatment as Next-Generation Treatment of Hematologic Malignancies. Clin Cancer Res 24, 4785-4797 (2018); R. Bannerji et al., Emerging Clinical Activity of REGN1979, an Anti-CD20 x Anti-CD3 Bispecific Antibody, in Patients with Relapsed/Refractory Follicular Lymphoma (FL), Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL), and Other B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma (B-NHL) Subtypes. American Society of Hematology, (2018); L. Budde et al., Mosunetuzumab, a Full-Length Bispecific CD20/CD3 Antibody, Displays Clinical Activity in Relapsed/Refractory B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma (NHL): Interim Safety and Efficacy Results from a Phase 1 Study. American Society of Hematology, (2018)). Однако, хотя биспецифики TSAxCD3 получили развитие как важный новый класс иммунотерапии при гемобластозах, перекрестные сравнения между исследованиями (Е. A. Zhukovsky, R. J. Morse, M. V. Maus, Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection. Curr Opin Immunol 40, 24-35 (2016)) дают основания полагать, что в некоторых случаях они могут не достичь уровня эффективности, наблюдаемого для терапии персонализированными Т-клетками с химерными антигенными рецепторами (CAR-T).
Одна из причин высокой эффективности CAR-T-клеточной терапии заключается в том, что химерный антигенный рецептор (CAR) генетически модифицирован для обеспечения как сигнала 1 (через часть цитодомена CD3z), так и сигнала 2 (например, через часть цитодомена CD28) при связывании со своей мишенью на опухолевой клетке. Два вида CAR-T-клеточной терапии недавно получили одобрение FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США) для лечения В-клеточных злокачественных новообразований, оба из которых действуют путем связывания антигена CD19 и нацеливания на него (S. S. Neelapu et al., Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large В Cell Lymphoma. N Engl J Med 377, 2531-2544 (2017); S. J. Schuster et al., Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. N Engl J Med 377, 2545-2554 (2017)). Подходы с использованием CAR-T-клеток могут быть связаны с серьезными побочными действиями, такими как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и нейротоксичность (S. S. Neelapu et al., Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol 15, 47-62 (2018); J. Gust et al., Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells. Cancer Discov 7, 1404-1419 (2017); A. Shimabukuro-Vornhagen et al., Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer 6, 56 (2018)); и из-за высоко персонализированных процессов производства и необходимости проведения предварительной химиотерапевтической подготовки (S. S. Neelapu et al., Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large В Cell Lymphoma. N Engl J Med 377, 25312544 (2017); S. J. Schuster et al., Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas. N Engl J Med 377, 2545-2554 (2017); P. Salmikangas, N. Kinsella, P. Chamberlain, Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CART-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharm Res 35, 152 (2018)) многие пациенты не считаются подходящими кандидатами.
Преимущества биспецификов TSAxCD3 как относительно хорошо переносимых и готовых к использованию терапевтических решений для более широких популяций пациентов были бы увеличены, если бы их противоопухолевая активность могла быть дополнительно оптимизирована, особенно если бы это можно было сделать без ущерба для переносимости или, возможно, даже увеличить специфичность к опухолевым клеткам относительно здоровых клеток. С этой целью была выдвинута гипотеза, что применение биспецификов TSAxCD3 в паре с новым классом биспецификов, которые независимо активируют сигнал 2, может обеспечить потенциально повышенную эффективность, а также возможность для увеличения специфичности. Поэтому был разработан второй класс биспецификов. Эти биспецифики могут задействовать либо второй эпитоп на том же опухолеспецифичном антигене, либо второй, отдельный опухолевый антиген, во взаимодействие с костимулирующим рецептором CD28 (биспецифики TSAxCD28), экспрессируемым на Т-клетках. Было высказано предположение, что комбинирование TSAlxCD3 с TSA2xCD28 должно обеспечить направленную и усиленную имитационную активацию Тклеток за счет запуска как сигнала 1, так и сигнала 2, со специфичностью, нацеленной только против опухолевых клеток, экспрессирующих оба эпитопа или оба антигена, что обеспечивает более высокую противоопухолевую активность вместе с потенциалом увеличения специфичности.
В настоящем документе описано получение и тестирование костимулирующих биспецифичных антител к TSAxCD28, нацеленных на рак предстательной железы (PSMAxCD28, которое связывает простатоспецифичный мембранный опухолевый антиген). Токсикологические исследования на генетически гуманизированных иммунокомпетентных мышах, а также на яванских макаках демонстрируют, что эти биспецифики проявляют ограниченную активность и не обладают токсичностью при применении в качестве монотерапии. Однако эти новые костимулирующие биспецифики можно эффективно комбинировать с развивающимся классом биспецификов TSAxCD3 для усиления противоопухолевых ответов в моделях сингенных опухолей. В совокупности эти данные дают основания полагать, что комбинирование этого нового класса биспецификов на основе CD28 (TSAxCD28) с биспецификами на основе CD3 (TSAxCD3) может обеспечить хорошо переносимые, готовые к использованию биологические решения с
- 51 045943 заметно усиленной и синергической противоопухолевой активностью.
Материалы и методы.
В примерах 10 и 13 использовали следующие материалы и методы.
Исследования на сингенных опухолях.
Мыши, экспрессирующие CD28 человека, CD3 человека и PSMA человека вместо соответствующих мышиных генов (называемые гуманизированными мышами hCD3/hCD28/hPSMA), были получены с использованием технологии Velocigene®, как описано ранее (Valenzuela (2003), Nat Biotechnol, Jun;21(6):652-9; Crawford et al. 2018, рукопись на стадии подготовки). Для каждой гуманизированной мыши правильное нацеливание на гены в клонах эмбриональных стволовых (ES) клеток F1H4 (гибрид C57BL/6 х 129) было идентифицировано с помощью анализа потери аллелей, как описано ранее (Poueymirou et al. (2007), Nat Biotechnol, Jan;25(1):91-9). Нацеленные ES клетки инъецировали эмбрионам Swiss Webster на 8-клеточной стадии для получения полностью гетерозиготных мышей поколения F0 для скрещивания с мышами C57BL/6N (Taconic, Ренселер, Нью-Йорк) до гомозиготности. Мышам hCD3/hCD28/hPSMA (4-8 мышей/группа, возраст 8-16 недель) подкожно инъецировали 1х106 опухолевых клеток MC38/hPSMA. Биспецифичное антитело к PSMAxCD28, биспецифичное антитело к PSMAxCD3 или IgG4 человека изотипического контроля вводили в виде монотерапии или в комбинации путем внутрибрюшинной инъекции в 0, 3 и 7 день в дозе 5 мг/кг.
Динамику роста опухоли контролировали, используя штангенциркуль для измерения диаметра X и Y. Рассчитывали объем опухоли (X*Y*(X/2)). Мышей умерщвляли, когда опухоли вырастали до размера, превышающего 2000 мм3.
Измерение уровней цитокинов в сыворотке мышей.
В указанные моменты времени кровь собирали посредством пункции подчелюстной вены в пробирки для сыворотки microtainer (BD 365967). Уровни цитокинов анализировали с использованием набора V-plex Human Prolnflammatory-10 Plex в соответствии с инструкциями производителя (Meso Scale Diagnostics, Роквилл, Мэриленд).
Результаты, краткие итоги и выводы.
Экспрессия CD28 человека на Т- и NK-клетках была подтверждена с помощью FACS (данные не показаны). Функциональные характеристики трижды гуманизированных мышей подтверждали с использованием анализа пролиферации Т-клеток in vitro (данные не показаны). Экспрессия PSMA была подтверждена с помощью кПЦР (количественной ПЦР) (данные не показаны). У трижды гуманизированных мышей hCD3/hCD28/hPSMA (описано выше) контролировали динамику роста опухоли MC38/hPSMA (фиг. 9А). По сравнению с изотипическим контролем монотерапия как PSMAxCD3, так и PSMAxCD28 значительно ингибировала рост опухоли (р<0,001 и р<0,0001, соответственно). Рост опухоли был еще больше ингибирован комбинированной терапией (р<0,00001). По сравнению с изотипическим контролем комбинация биспецификов PSMAxCD3 и PSMAxCD28 обеспечивала наибольшую продукцию цитокинов (фиг. 9С и 9D). Чтобы лучше понять роль комбинированной терапии в состоянии активации внутриопухолевых CD8' Т-клеток, был проведен анализ viSNE (фиг. 9В). viSNE представляет собой инструмент для визуализации высокоразмерных цитометрических данных в 2D при сохранении высокоразмерной структуры. Каждый вариант лечения приводил к появлению уникальных кластеров CD8+ Т-клеток в селезенке и опухоли. Комбинированная терапия стимулировала экспансию фенотипа активированных Тклеток/Т-клеток памяти (экспрессирующих TCF1, CD1-2, CD127, PD-1, ICOS, KLRG1 и CD38), как показано в кластере 4 в опухоли.
Были проведены исследования для определения сывороточных уровней цитокинов (IFNy, IL-2, IL-6, IL-10, TNFa, IL-4 и IL-5) как у мышей hCD3+/+/hPSMA+/+/hCD28+/+, так и у мышей hCD3+/-/hPSMA+//hCD28+/-. Кровь брали в 0 (4 часа), 3, 7 и 11 день после лечения. За исключением IL-10 у мышей hCD3+/+/hPSMA+/+/hCD28+/+, в 0 день уровни цитокинов значительно повысились при лечении, включавшем антитела к PSMAxCD3, а комбинированная терапия анти-PSMAxCD3 и анти-PSMAxCD28 привела к наибольшему высвобождению цитокинов. Напротив, контрольное IgG и монотерапия антиPSMAxCD28 не вызывали увеличения продукции цитокинов. За исключением IL-5 и IL-10, продукция цитокинов снизилась через три (3) дня до аналогичного уровня во всех группах лечения. Продукция IL-5 была значительно выше на 3 день, хотя и ниже, чем в 0 день, у мышей hCD3+/+/hPSMA+/+/hCD28+/+, но не у мышей hCD3+/-/hPSMA+/-/hCD28+/-, получавших комбинированное лечение. У мышей hCD3+/+/hPSMA+/+/hCD28+/+ продукция IL-10 была аналогичной для всех групп лечения в 0 день и на 3 день, но комбинированная терапия обеспечивала значительно более высокий уровень в комбинированной терапии на 7 день и 11 день. У мышей hCD3+/-/hPSMA+/-/hCD28+/- комбинированная терапия вызвала значительно больше IL-10 в 0 день, 3 день и 11 день, но не на 7 день. Монотерапия анти-PSMAxCD3 вызвала значительно больше IL-10 в 0 день и 3 день, но не на 7 день и 11 день. Монотерапия антиPSMAxCD28 вызвала значительно больше IL-10 только на 11 день (данные не показаны).
Как показано на фиг. 9А, в отличие от предыдущих анализов in vitro, в которых CD28-биспецифики имели очень ограниченную активность при применении в качестве монотерапии (см. пример 8 выше), CD28-биспецифики в этих сингенных моделях MC38/hPSMA имели более значительную активность при
- 52 045943 применении в качестве монотерапии. Это говорит о том, что сигнал 1 уже был в некоторой степени активирован в этой модели МС38. В согласии с этими данными, ранее было показано, что опухолевые клетки МС38 экспрессируют высокие уровни реактивированных эндогенных ретровирусных белков, таких как р15Е, и что мыши C57BL6 могут генерировать эндогенные Т-клетки, которые распознают этот неоэпитоп и отвечают на него (J. С. Yang, D. Perry-Lalley, The envelope protein of an endogenous murine retrovirus is a tumor-associated T-cell antigen for multiple murine tumors. J Immunother 23, 177-183 (2000); H. J. Zeh, 3rd, D. Perry-Lalley, M. E. Dudley, S. A. Rosenberg, J. C. Yang, High avidity CTLs for two selfantigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. J Immunol 162, 989-994 (1999)). Действительно, было подтверждено, что в моделях МС38 могут легко быть обнаружены внутриопухолевые Тклетки, отвечающие на этот неоантиген р15Е. Таким образом, CD28-биспецифики в этих моделях сингенных опухолей могут усиливать эндогенные TCR/CD3-зависимые Т-клеточные ответы, которые затем могут быть дополнительно усилены путем обеспечения дополнительной активации сигнала 1 посредством CD3-биспецифичного антитела.
Чтобы определить клеточный механизм, лежащий в основе комбинированной терапии, опухольинфильтрирующие и селезеночные CD8+ Т-клетки были профилированы на основе этих экспериментов с помощью высокоразмерной проточной цитометрии и с использованием подходов неконтролируемой кластеризации. Было обнаружено, что каждый вариант лечения приводил к появлению уникальных кластеров CD8+ Т-клеток в селезенке и опухоли. Схемы однократного лечения снижали уровни внутриопухолевых CD8+ Т-клеток с менее активированным фенотипом (с более низкими уровнями ICOS, KLRG1, Ki67, PD1, CD38 и LAG3, фиг. 9Е), как показано в кластере С35. Однако комбинированная терапия значительно способствовала экспансии более активированного фенотипа Т-клеток/Т-клеток памяти (экспрессирующих Tcf1, CD122, CD127, PD1, ICOS, KLRG1 и CD38, фиг. 9В), как показано в кластере С4.
Ahtu-CD28 x анти-PSMA не индуцирует повышения сывороточных уровней цитокинов у гуманизированных мышей CD28/CD3/PSMA в отсутствие и в присутствии опухоли.
Как указано в других местах в настоящем документе, TGN1412, антитело-суперагонист к CD28, вызвало цитокиновый шторм, губительный для пациента. Антитело к CD28 и биспецифичное антитело к CD28xPSMA согласно изобретению не вызывали цитокиновый шторм. В этом исследовании гуманизированным мышам hCD3/hCD28/hPSMA вводили несколько антител (обобщенно представленных в табл. 19) в дозировке 2,5 мг/кг или 0,25 мг/кг. Кровь у мышей брали через 4 ч и 3 дня после введения антител. Как показано на фиг. 10, биспецифичные антитела к PSMAxCD28 или родительские двухвалентные антитела к CD28 не индуцировали продукцию цитокинов в сыворотке у гуманизированных мышей CD3/CD28/PSMA в отсутствие опухоли.
Таблица 19
Антитела для исследования цитокинового шторма у гуманизированных мышей hCD3/hCD28/hPSMA
Идентификатор антитела | № партии | Название |
REGN1945 | REGN1945-L49 | h!gG4 |
тАЬ14226Р2 | REGN5705-L1 | mAb к CD28 |
REGN2329 (TeGenero) | REGN2329-L3 | Суперагонист (SA) к CD28 |
bsl6429D | bsl6429D-L2 | PSMAxCD28 |
ВЕ0146 | 614216J2B | PD1, RMP1-14 |
bs!5780D | bs!5780D-L2 | PSMAxCD3 |
При 2,5 мг/кг TGN1412 может вызывать значительное повышение уровней IL-2, IL-4, IL-5 и TNFa в крови (данные не показаны).
Кроме того, как показано на фиг. 28, лечение анти-PSMAxCD28 по отдельности или комбинированное лечение антителом к PD1 не повышало сывороточные уровни цитокинов у мышей с опухолями. Напротив, лечение анти-PSMAxCD3, по отдельности или в комбинации с антителом к PD1, повышало сывороточные уровни цитокинов, таких как TNFa, IL-5, IL-10, IL-2 и IL-4, у мышей с опухолями. Лечение анти-PSMAxCD3 индуцировало экспрессию цитокинов через 4 ч после введения дозы. Повышение уровней цитокинов не сохранялось по прошествии 7 дней. Это исследование было проведено на гуманизированных мышах hCD3/hCD28/hPSMA с опухолями MC38/hPSMA. Сыворотку собирали у гуманизированных мышей hCD3/hCD28/hPSMA с опухолями MC38/hPSMA через 4 ч после введения дозы в 0 день и 7 день, через 4 дня с 5 мг/кг указанных антител или биспецификов. Сывороточные уровни цитокинов измеряли с использованием 10-плексного набора для определения мышиных цитокинов методом MSD в соответствии с протоколом производителя.
Кроме того, как показано на фиг. 11, лечение суперагонистом к CD28 вызывало цитокиновый ответ через 4 ч у мышей NSG с привитыми МНПК, в отличие от антитела к CD28 согласно изобретению. В исследовании, показанном на фиг. 11, мышам NSG с иммунодефицитом прививали 5x106 МНПК от нор
- 53 045943 мального здорового донора на -10 день. В -1 день системное приживление Т-клеток подтверждали окрашиванием периферической крови на маркеры Т-клеток человека. В 0 день мышам внутрибрюшинно инъецировали 50 мкг антитела изотипического контроля IgG4, 5 мкг или 50 мкг суперагониста к CD28, или 5 мкг или 50 мкг антитела к CD28 mAb14226Р2. Через четыре часа после инъекции антител у животных собирали кровь и получали сыворотку.
Концентрации цитокинов в сыворотке анализировали с помощью мультиплексного анализа (набор Meso Scale Discovery V-PLEX). В то время как суперагонист к CD28 вызывал повышенные сывороточные уровни интерферона-гамма (IFN-γ), IL-2, IL-6 и TNFa по сравнению с животными, получавшими антитело изотипического контроля, в сыворотке животных, получавших щДЫ4226Р2 к CD28, не наблюдалось увеличения цитокинового ответа. Соответственно, биспецифик к CD28xPSMA имеет потенциально более безопасный токсикологический профиль среди костимулирующих биспецифичных антигенсвязывающих молекул. Биспецифик к CD28xPSMA не вызывал цитокинового ответа, в отличие от биспецифика к CD3xPSMA. Как показано на фиг. 12, aнти-CD3х PSMA вызывало повышение IFN-γ у гуманизированных мышей, в отличие от анти-CD28xPSMA. В этом исследовании сыворотку собирали у гуманизированных мышей CD3/CD28/PSMA или CD3/CD28 с опухолями MC38/hPSMA через 4 ч после введения дозы 5 мг/кг указанных биспецификов. Сывороточные уровни цитокинов измеряли с использованием 10-плексного набора для определения мышиных цитокинов методом MSD в соответствии с протоколом производителя. Точки на графике представляют собой индивидуальные уровни цитокинов на мышь. Столбцы на графике представляют собой среднее значение для каждой группы лечения. Планки погрешностей представляют собой ±SEM. Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Холма-Сидака, используя мышей, получавших изотип, в качестве контролей (**, р<0,01).
В согласии с данными, полученными на гуманизированных мышах, биспецифичное антитело к CD3xPSMA вызывало повышенный уровень CRP (С-реактивного белка) и системное высвобождение цитокинов у нечеловекообразных приматов, яванских макаков. В исследовании на обезьянах биспецифичное антитело к CD3xPSMA вводили яванскому макаку в дозировке 0,01, 0,1 и 0,5 мг/кг. У обезьяны наблюдались следующие симптомы: клинические признаки на первый день, такие как рвота, выгибание спины, красная/измененного цвета кожа; повышенный уровень CRP (приблизительно 10 против 1 мг/дл у контрольных мышей); повышенные уровни цитокинов в плазме (IL-6, TNFa, IFN-γ, IL-2 и МСР); и падение абсолютного количества Т-клеток в крови (данные не показаны).
Более того, мыши, получавшие лечение анти-CD28xPSMA, не демонстрировали продукцию цитокинов или маргинацию Т-клеток по сравнению с лечением анти-PSMAxCD3 или суперагонистом к CD28 (фиг. 13А и 13В).
Резюме.
Давно известно, что активация Т-клеток через комплекс TCR (сигнал 1) может быть заметно усилена костимулирующими сигналами, такими как сигналы, которые опосредуются при взаимодействии рецептора CD28 на Т-клетках со своими лигандами (CD80/B7.1 и CD86/B7.2) на клетках-мишенях (сигнал 2) (J. H. Esensten, Y. A. Helou, G. Chopra, A. Weiss, J. A. Bluestone, CD28 Costimulation:From Mechanism to Therapy. Immunity 44, 973-988 (2016)). В согласии с данными, раскрытыми в настоящем документе, потенциал костимуляции CD28 для повышения противоопухолевой активности Т-клеток был впервые продемонстрирован в исследованиях, в которых лиганды В7 были сверхэкспрессированы на опухолевых клетках (R. H. Schwartz, Costimulation of T lymphocytes: the role of CD28, CTLA-4, and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy. Cell 71, 1065-1068 (1992); L. Chen et al., Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4. Cell 71, 1093-1102 (1992)), что показало улучшенное отторжение Т-клетками таких В7-экспрессирующих опухолей. Этот потенциал вдохновил попытки оценить активирующие CD28 антитела в испытаниях на людях. К сожалению, испытание такого антитела (TGN1412) в 2006 году привело к угрожающим жизни осложнениям у всех шести добровольцев (G. Suntharalingam et al., Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 355, 1018-1028 (2006)), из-за полиорганной недостаточности в результате синдрома массивного высвобождения цитокинов (CRS). Эта катастрофа привела к прекращению любых дальнейших тестов активирующих CD28 антител на людях.
В настоящем документе описан новый класс костимулирующих биспецифичных антител к CD28, которые могут заметно и безопасно стимулировать противоопухолевую активность, обеспечивая костимулирующий сигнал 2. Эти CD28-биспецифики сами по себе обладают ограниченной активностью (в отсутствие сигнала 1), но могут заметно усиливать противоопухолевую активность в условиях сигнала 1, что может быть обеспечено путем применения этих ОЭ28-биспецификов в паре с развивающимся классом ОЭ3-биспецификов (или если эти ОЭ28-биспецифики используются в условиях, при которых уже присутствуют эндогенные популяции опухолеспецифичных Т-клеток). В настоящем документе описано получение и тестирование костимулирующих биспецифичных антител к TSAxCD28, нацеленных на рак предстательной железы (PSMAxCD28). Было показано, что в отсутствие сигнала 1 эти CD28биспецифики обладают минимальной активностью in vitro или in vivo. Однако эти ОО28-биспецифики
- 54 045943 можно применять в паре с CD3-биспецификами для образования искусственных иммунных синапсов, содержащих опухолевые антигены, а также комплексы TCR и CD28. Более того, в паре с подходящими CD3-биспецификами in vitro эти CD28-биспецифики могут эффективно и специфично способствовать активации Т-клеток и уничтожению опухолевых клеток антиген-зависимым образом. Кроме того, эти CD28-биспецифики также эффективно усиливают противоопухолевую активность CD3-биспецификов in vivo зависимым от опухолевого антигена образом в моделях сингенных опухолей; в таких моделях CD28-биспецифики обладают минимальной активностью при монотерапии, кроме тех случаев, когда опухолеспецифичные Т-клетки уже присутствуют, и в таких условиях они, по-видимому, усиливают эту специфичную активность зависимым от опухолевого антигена образом. Кроме того, комбинированная терапия TSAxCD28 и TSAxCD3 значительно стимулирует экспансию внутриопухолевого фенотипа активированных Т-клеток/Т-клеток памяти in vivo. Наконец, токсикологические исследования на генетически гуманизированных иммунокомпетентных мышах, а также на яванских макаках демонстрируют, что эти биспецифики проявляют ограниченную активность и не обладают токсичностью при монотерапии по сравнению с обычными CD28-активирующими антителами.
Часто характеристика клинических препаратов-кандидатов, специфичных для человека, в области иммуноонкологии ограничивается тестированием на моделях ксеногенных опухолей с привитыми иммунными клетками человека. Хотя эти ксеногенные модели могут быть очень полезными, у них есть ограничения. Мыши, используемые в таких ксеногенных моделях, не экспрессируют опухолевую мишень человека в своих здоровых тканях, тем самым препятствуя оценке тестируемого агента в условиях нормальной тканевой экспрессии мишени. Действительно, если мишень обычно также экспрессируется на высоких уровнях в здоровых тканях, это может ограничить противоопухолевую эффективность за счет отклонения исследуемого агента от опухоли и может привести к токсичности для этих здоровых тканей ничего из этого нельзя оценить на сингенных ксеногенной модели. Дополнительное ограничение может заключаться в активности привитых мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) человека, перенесенных иммунодефицитной мыши, которая может отличаться от активности нормальных Т-клеток хозяина, присутствующих в иммунокомпетентной системе. Чтобы преодолеть эти ограничения и улучшить модели для тестирования клинических препаратов-кандидатов, специфичных для человека, в настоящем изобретении были созданы дважды и трижды генетически гуманизированные мыши. В этих моделях опухолевые антигены были генетически гуманизированы, чтобы обеспечить их нормальную экспрессию в подходящих тканях хозяина, а компоненты CD3 и/или CD28 были генетически гуманизированы, чтобы позволить иммунокомпетентным клеткам-хозяевам отвечать на специфичные для человека клинические препараты-кандидаты. В этих генетически гуманизированных иммунокомпетентных сингенных моделях на животных было обнаружено, что CD28-биспецифики к опухолевой мишени PSMA усиливали противоопухолевую активность соответствующих CD3-биспецификов. Подобное повышение противоопухолевой эффективности различными биспецификами TSAxCD28 в нескольких доклинических моделях дает основания полагать, что этот терапевтический метод является надежным и не ограничивается конкретной моделью опухоли, а может иметь более широкое применение в качестве нового класса нацеленной иммунотерапевтической комбинации. В целом, результаты обращают внимание на то, что биспецифики TSAxCD28 могут действовать синергетически с биспецификами TSAxCD3 и могут обеспечить биологическое решение, которое может заметно повысить эффективность хорошо изученных биспецификов TSAxCD3 достаточно безопасным и хорошо переносимым образом, что оправдывает испытания в исследованиях на людях.
Биспецифики TSAxCD3 представляют собой многообещающий развивающийся класс иммунотерапии, но во многих случаях, несомненно, будет важна дальнейшая оптимизация противоопухолевой активности. Подобно тому, как в CAR-T-клеточных подходах использовали химерные рецепторы, которые искусственно активируют как сигнал 1, так и сигнал 2, чтобы улучшить их противоопухолевую активность (Е. A. Zhukovsky, R. J. Morse, M. V. Maus, Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection. Curr Opin Immunol 40, 24-35 (2016); S. L. Maude et al., Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med 378, 439-448 (2018)), в данном изобретении показано потенциальное преимущество комбинирования CD3специфичных препаратов (которые обеспечивают сигнал 1) с CD28-биспецификами (которые обеспечивают сигнал 2) для усиления противоопухолевой активности. В дополнение к практическим преимуществам, которые такой подход может иметь по сравнению с CAR-T-клеточной терапией - то, что он не требует трудоемкой подготовки клеточной терапии, которая должна быть индивидуально адаптирована для каждого пациента, а также не требует предварительного прохождения пациентами лимфодеплеции путем токсической химиотерапии, чтобы они могли получать такую клеточную терапию, часто связанной с побочными действиями (А. Shimabukuro-Vornhagen et al., Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer 6, 56 (2018); С. H. June, R. S. O'Connor, O. U. Kawalekar, S. Ghassemi, M. С. Milone, CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science 359, 1361-1365 (2018)), - биспецифичный подход согласно изобретению обеспечивает потенциал для повышения эффективности, а также повышенной безопасности и специфичности действия. Таким образом, можно воспользоваться преимуществом сочетательного нацеливания, комбинируя CD3-биспецифик к одному антигену с CD28-биспецификом, специфичным ко
- 55 045943 второму антигену - повышенная эффективность будет иметь место только на опухолевых клетках, экспрессирующих оба антигена - таким образом, фокусируя уничтожение Т-клеток только на опухолевых клетках, экспрессирующих оба антигена, при ограничении нецелевой токсичности в здоровых тканях, экспрессирующих только один из антигенов. В совокупности данные, раскрытые в настоящем документе, дают основания полагать, что комбинирование биспецификов на основе CD28 с биспецификами на основе CD3 может обеспечить хорошо переносимые, готовые к использованию биологические решения с заметно усиленной и синергической противоопухолевой активностью. Первоначальная проверка этой возможности в исследованиях на людях состоится в этом году. Пример 11. Токсикологические исследования на яванских макаках. Эти исследования продемонстрировали, что PSMAxCD28 по отдельности или в составе комбинированной терапии не индуцирует системного действия Т-клеток по сравнению с суперагонистом к CD28 у яванских макаков. Иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 согласно изобретению усиливали активацию Т-клеток яванских макаков посредством TAAxCD3 (пример 8, фиг. 7E-G). Для определения безопасности и переносимости иллюстративных биспецифичных антител к PSMAxCD28 согласно настоящему изобретению, по отдельности или в комбинации с анти-PSMAxCD3, было проведено исследование токсичности разовой дозы на яванских макаках. Самок или самцов яванских макаков распределяли по группам лечения, как указано в табл. 20.
Таблица 20
Поисковое исследование токсичности разовой дозы анти-PSMAxCD28 на обезьянах
Групп а | Лечение (разовая доза) | Общее количество животных | Уровни дозы/повышение дозы (30-минутая в/в инфузия) |
Самцы | |||
1 | PSMAxCD3 | 3 | 0,1 мг/кг |
2 | bsl6429D | 3 | 1 мг/кг |
3 | bsl6429D | 3 | 10 мг/кг |
4 | Суперагонист «SA» к CD28 | 3 | 10 мг/кг |
5 | Ь816429О+антитело к PD-1 | 3 | 10 мг/кг+10 мг/кг |
6 | bsl643 lD+антитело к PD-1 | 3 | 10 мг/кг+10 мг/кг |
7 | Ab изотипического контроля | 3 | 10 мг/кг |
Исследование на яванских макаках проводили в соответствии с рекомендациями IACUC (Институционального комитета по содержанию и использованию животных). Самцы яванских макаков (3 животных/группа) получали разовую дозу каждого исследуемого препарата посредством внутривенной инфузии в течение приблизительно 30 мин (комбинированное лечение вводили в виде отдельной инфузии в течение в общей сложности 1 ч). Оценка токсичности основывалась на клинических наблюдениях, качественных показателях потребления корма, массе тела, неврологических обследованиях, показателях жизненно важных функций (температура тела, частота сердечных сокращений, пульсоксиметрия и частота дыхательных движений), а также лабораторной диагностике и патологической анатомии. Были собраны образцы крови и тканей для анализа на цитокины, иммунофенотипирования методом FACS, гистопатологии и токсикокинетической оценки. Уровни CRP анализировали на системе Roche Modular P 800. Цитокины измеряли с помощью Meso Scale Diagnostics (MSD, Роквилл, Мэриленд). Для проведения проточной цитометрии периферической крови кровь собирали в пробирки с калием и ЭДТА, лизировали, окрашивали указанными антителами, такими как антитело к CD3, антитело к Ki67 и антитело к ICOS (BD Biosciences), и анализировали с помощью FACS Canto II. После введения разовой дозы PSMAxCD28 в дозе 1 или 10 мг/кг не наблюдалось значительного высвобождения цитокинов, маргинации Т-клеток или повышающей регуляции маркера активации Т-клеток (табл. 21).
- 56 045943
Таблица 21
Резюме токсикологического исследования на яванских макаках
Молекул а bsl6429D bsl6429D REGN232 9 (TeGenero ) | Описание антиPSMAxCD2 8 антиPSMAxCD2 8 суперагони ст к CD28 | Доза (мг/кг ) 1 10 10 | Лю 1 бые день - наб клин л-я ическ ----- не набл- 2-4 я дни | Абсолют ное колво Тклеток (ЕЗ/мкл) Пре дв- й 5 ч тес т 7,2 6,58 2 5,0 4,91 9 4,0 4,50 4 5,7 6,03 3 4,5 4,64 3 10,0 7,1 6 6 0,2 7,02 6 0,1 7,06 9 11,8 0,6 7 6 | Пролифер ирующие ΚΪ67+ Тклетки (ЕЗ/мкл) Пре дв168 й ч тес т 0,62 0,59 0,42 0,32 0,63 0,48 0,33 0,35 0,38 0,64 0,88 0,39 0,60 5,66 0,79 7,29 10,9 1,13 6 | CRP (мг/дл) 24 ч 0,5 0,5 1,1 0,2 0,2 1,3 15,4 15 15,3 | Цитокины плазмы через 5 часов после введения дозы (пг/мл) IL- IL- IF TN IL- IL- ILIL-6 8 10 Ν-γ F-α 2 4 5 BLQ BL BL BL BL BL BL BLQ * Q Q Q Q Q Q BL BL BL BL BL BL BLQ BLQ Q Q Q Q Q Q BL BL BL BL BL BL BLQ BLQ Q Q Q Q Q Q BL BL BL BL BL BL BLQ BLQ Q Q Q Q Q Q BL BL BL BL BL BL BLQ BLQ Q Q Q Q Q Q BL BL BL BL BL BL BLQ BLQ Q Q Q Q Q Q BL BL BL BL BL 116 764 3364 Q Q Q Q Q 9 109 1715 BL BL 2907 333 238 615 5 5 Q Q 532 150 5226 7918 163 522 342 198 4 9 |
mAblO154 РЗ | EGFRVIIIA b | 5,6 6,39 2 7,7 7,43 2 4,6 3,66 1 | 0,62 0,39 0,86 0,52 0,52 0,69 | 0,8 И 0,2 | BL BL BL BL BLQ BLQ 151 335 Q Q Q Q BL BL BL BL BLQ BLQ 267 378 Q Q Q Q BL BL BL BL BL BL BLQ BLQ Q Q Q Q Q Q |
BLQ: ниже нижнего предела количественного определения
Напротив, значительное высвобождение цитокинов, маргинация лимфоцитов и активация Т-клеток наблюдались у обезьян, которым вводили суперагонист к CD28. Кроме того, эти результаты были подтверждены с использованием анализа пролиферации Т-клеток человека с нанесением сухим и мокрым способом (пример 9). Действительно, индукция пролиферации Т-клеток человека иллюстративными биспецифичными антителами к PSMAxCD28, а также родительскими двухвалентными антителами к CD28 не наблюдалась по сравнению с антителом-суперагонистом к CD28. В целом поисковое исследование токсичности разовой дозы на обезьянах и анализы на основе Т-клеток человека in vitro дают основания полагать, что иллюстративные биспецифичные антитела к PSMAxCD28 согласно изобретению безопасны и хорошо переносятся.
Как показано в табл. 21, TGN1412, суперагонист к CD28, вызывал умеренное высвобождение цитокинов и временное увеличение уровней Т-клеток (измерено на 15 день). Исследование проводили на самцах яванского макака с еженедельным введением дозы от 5 до 50 мг/кг в течение 4 недель. FACSанализ субпопуляций лейкоцитов проводили на самце яванского макака после в/в инъекции еженедельных (в 1, 8, 15, 22 день) нарастающих доз (5, 10, 25, 50 мг/кг) TGN1412. Наблюдалось умеренное повышение уровней IL-2, IL-5, IL-6, IFN-γ в первые 2-24 ч (в 2-20 раз). Существенных изменений в IL-4 или ЮТане наблюдалось. Поисковое исследование токсичности разовой дозы aнти-CD28xPSMA на обезьянах было проведено для установления безопасности и фармакокинетического профиля биспецифичного антитела к CD28xPSMA.
Таким образом, было показано, что антитела к CD28xPSMA усиливали иммунитет в месте опухоли. Ahtu-CD28xPSMA превращало опухолевые клетки в антигенпрезентирующие клетки (АПК). Антитела к CD28xPSMA не индуцируют пролиферацию Т-клеток и не стимулируют высвобождение цитокинов по
- 57 045943 сравнению с суперагонистом к CD28.
Пример 12. Картирование эпитопа связывания mAb14226P2 с CD28 посредством водороднодейтериевого обмена.
Было проведено картирование эпитопа с помощью H/D-обмена и масс-спектрометрии (HDX-MS) для определения аминокислотных остатков в CD28 (рекомбинантный CD28 человека, представлен как hCD28 ecto (N19-P152).mmh; SEQ ID NO: 75), взаимодействующих с моноклональным антителом к hCD28. Общее описание метода H/D-обмена изложено, например, в Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; и Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
Эксперименты по HDX-MS проводили на интегрированной платформе для HDX/MS, состоящей из системы Leaptec HDX PAL для мечения дейтерием и остановки реакции, Waters Acquity M-Class (вспомогательная система для работы с растворителями) для расщепления и загрузки образцов, Waters Acquity M-Class (μ-двухканальная система для работы с растворителями) для аналитического градиента и массспектрометра Thermo Q Exactive HF для измерения массы пептидов.
Раствор для мечения готовили в виде буфера PBS в D2O при pD 7,0 (10 мМ фосфатного буфера, 140 мМ NaCl и 3 мМ KCl, что эквивалентно рН 7,4 при 25°C). Для мечения дейтерием 11 мкл CD28.mmH (белок REGN2011, самостоятельно полученный Regeneron, 127 мкМ) или CD28.mmH, предварительно смешанных с REGN5705 в молярном соотношении 1:0,6 (комплекс антиген-антитело), инкубировали при 20°C с 44 мкл раствора для мечения D2O для различных моментов времени, каждый в двух повторах (например, недейтерированный контроль=0 секунд; меченый дейтерием в течение 5 мин и 10 мин). Реакцию дейтерирования останавливали добавлением 55 мкл предварительно охлажденного буфера для остановки реакции (0,5 М ТСЕР-НС1, 8 М мочевины и 1% муравьиной кислоты) к каждому образцу и продолжали инкубацию в течение 5 мин при 20°C. Затем образец с остановленной реакцией вводили в HDX Manager от Waters для экспресс-расщепления пепсином/протеазой XIII. Расщепленные пептиды разделяли на колонке С8 (1,0x50 мм, NovaBioassays) с 13-минутным градиентом 10-32% В (подвижная фаза А: 0,5% муравьиной кислоты в воде, подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле). Элюированные пептиды анализировали методом масс-спектрометрии на Q Exactive HF в режиме ЖХ-МС/МС или ЖХМС.
Данные ЖХ-МС/МС недейтерированного образца CD28 сравнивали с базой данных, включающей CD28 и его рандомизированную последовательность, с помощью поисковой системы Byonic (Protein Metrics). Параметры поиска (в ELN (электронный лабораторный журнал)) были установлены по умолчанию с использованием неспецифичного ферментативного расщепления и гликозилирования человеческих белков в качестве частой вариабельной модификации. Список идентифицированных пептидов был затем импортирован в программное обеспечение HDX Workbench (версия 3.3) для расчета поглощения дейтерия каждым пептидом, определяемым с помощью ЖХ-МС, из всех дейтерированных образцов. Для имеющегося пептида использовали центроидную массу (средневзвешенную по интенсивности массу) в каждый момент времени для расчета поглощения дейтерия (D) и процента поглощения дейтерия (%D).
Поглощение дейтерия (поглощение D) =. Средняя масса (дейтерированная) - средняя масса(недейтерированная)
Поглощение D пептидом в каждый
Процент поглощения дейтерия момент времени X 100% (%D) = Максимальное поглощение D пептидом (определено в ELN)
В общей сложности 73 пептида из hCD28.mmH (SEQ ID NO: 75) было идентифицировано как из hCD28.mmH в отдельности, так и из hCD28.mmH в комплексе с образцами антитела к CD28, что составляет 85,8% покрытия последовательности hCD28. Любой пептид, который демонстрировал процентное отношения поглощения D выше 5%, характеризовали как значительно защищенный. Для hCD28.mmH (SEQ ID NO: 75) области, соответствующие аминокислотам 5-20 (VKQSPMLVAYDNAVNL; SEQ ID NO: 77), 29-38 (FSREFRASLH; SEQ ID NO: 78), 80-84 (YLQNL; SEQ ID NO: 79) и 91-108 (IYFCKIEVMYPPPYLDNE; SEQ ID NO: 80), были значительно защищены антителом к CD28, причем аминокислоты 91108 (IYFCKIEVMYPPPYLDNE; SEQ ID NO: 80) были определены как основной эпитоп на CD28. Защита этих остатков антителом к CD28 была подтверждена с использованием hCD28.mFc (SEQ ID NO: 76). См. также табл. 22 ниже, где обобщены результаты этого исследования.
- 58 045943
Таблица 22
Выбранные пептиды CD28.mmH со значительной защитой при связывании с антителом к CD28
Остатк и | Заряд (+) | 5 мин | 10 мин | |||
REGN2011 | REGN2011 + ШАЫ4226Р2 | REGN2011 | REGN2011 + шАЫ4226Р2 | |||
CD28 | Центрои | |||||
Центроид | Центроид | Центроид | Δ% | |||
ΔΌ | дная ΔΌ | |||||
ная МН+ | ная МН+ | ная МН+ | D | |||
МН+ | ||||||
5-11 | 1 | 805,74 | 805,53 -0,21 | 805,83 | 805,58 -0,25 | -7,1 |
5-11 | 2 | 806,69 | 806,48 -0,21 | 806,76 | 806,51 -0,24 | -7,1 |
8-11 | 1 | 449,28 | 449,11 -0,16 | 449,33 | 449,16 -0,17 | -10,5 |
12-19 | 1 | 869,61 | 869,30 -0,31 | 869,72 | 869,33 -0,39 | -7,2 |
12-19 | 2 | 869,95 | 869,72 -0,23 | 870,08 | 869,69 -0,39 | -6,4 |
12-20 | 1 | 982,96 | 982,54 -0,42 | 983,05 | 982,63 -0,41 | -7,4 |
15-20 | 1 | 648,02 | 647,61 -0,40 | 648,06 | 647,68 -0,38 | -12,3 |
29-32 | 1 | 540,44 | 540,06 -0,38 | 540,51 | 540,08 -0,44 | -25,4 |
29-37 | 2 | 1116,66 | 1116,15 -0,51 | 1116,79 | 1116,20 -0,60 | -9,9 |
29-37 | 3 | 1117,61 | 1117,74 -0,50 | 1117,11 | 1117,17 -0,57 | -9,6 |
30-37 | 2 | 969,13 | 968,85 -0,28 | 969,23 | 968,90 -0,33 | -6,4 |
30-38 | 3 | 1107,35 | 1106,93 -0,42 | 1107,48 | 1107,02 -0,46 | -7,8 |
33-37 | 1 | 595,17 | 595,23 -0,12 | 595,05 | 595,08 -0,15 | -5,8 |
33-38 | 1 | 732,40 | 732,24 -0,16 | 732,45 | 732,25 -0,19 | -5,5 |
33-38 | 2 | 733,43 | 733,25 -0,18 | 733,48 | 733,29 -0,19 | -5,7 |
80-84 | 1 | 652,81 | 652,51 -0,30 | 652,91 | 652,60 -0,31 | -12,6 |
81-84 | 1 | 489,26 | 488,99 -0,28 | 489,34 | 489,04 -0,30 | -17,9 |
91-93 | 1 | 443,49 | 443,50 -0,07 | 443,42 | 443,41 -0,09 | -10,1 |
93-97 | 1 | 641,40 | 641,48 -0,58 | 640,83 | 640,89 -0,59 | -24,4 |
94-105 | 2 | 1458,33 | 1456,70 -1,63 | 1458,63 | 1456,83 -1,80 | -30,7 |
94-107 | 2 | 1688,09 | 1686,36 -1,73 | 1688,33 | 1686,43 -1,90 | -25,2 |
94-108 | 2 | 1817,69 | 1816,15 -1,54 | 1817,88 | 1816,19 -1,69 | -20,2 |
96-107 | 2 | 1455,75 | 1455,07 -0,68 | 1455,91 | 1455,09 -0,82 | -13,4 |
98-107 | 2 | 1212,67 | 1212,07 -0,60 | 1212,78 | 1212,07 -0,70 | -16,3 |
98-108 | 2 | 1342,17 | 1341,57 -0,60 | 1342,10 | 1341,61 -0,48 | -5,0 |
Пример 13. Биспецифичные антитела к PSMAxCD28 эффективно повышают противоопухолевую эффективность иммунотерапии против PD-1.
Аннотация.
Активация Т-клеток усиливается за счет взаимодействия со вторым костимулирующим рецептором (сигнал 2), помимо антигенспецифичной активации TCR/CD3 (сигнал 1). Целью противораковой иммунотерапии является оптимальная активация и мобилизация Т-клеток для обнаружения и уничтожения опухолевых клеток. Однако современные методы лечения, как правило, не позволяют эффективно и селективно активировать Т-клетки в месте опухоли, часто не обеспечивая достижение длительных ответов и/или приводя к нежелательной токсичности. В настоящем документе был представлен новый нацеленный на опухоли иммунотерапевтический метод, сочетающий ингибирование PD-1 вместе с биспецифичными антителами. Биспецифичные антитела одним плечом связывают опухолеспецифичный антиген (TSA) (например, PSMA), а другим плечом - костимулирующий рецептор CD28 на Т-клетках. Действительно, ингибирование передачи сигналов PD-1-PD-L1 значительно увеличивает отношение CD28, накопленного в иммунологическом синапсе, что позволяет биспецифику TSAxCD28 оказывать свое действие.
- 59 045943
Эта комбинированная иммунотерапия была проверена с использованием биспецифичных антител, специфичных к антигену предстательной железы (например, PSMA). В отличие от неспецифичных суперагонистов к CD28, которые активируют широкий спектр Т-клеток, биспецифики TSAxCD28 хорошо переносились при применении отдельно или в комбинации с блокатором PD-1 в моделях на генетически гуманизированных иммунокомпетентных мышах или у приматов. Важно отметить, что в присутствии эндогенного триггера TCR/CD3 TSAxCD28 разительным образом улучшал противоопухолевую активность антитела к PD-1, связанную с длительными противоопухолевыми ответами. Комбинированная терапия специфично усиливала внутриопухолевую активацию Т-клеток, способствуя эффекторному фенотипу Т-клеток, подобному Т-клеткам памяти, без системной секреции цитокинов в различных моделях сингенных и ксенотрансплантатов опухолей человека. Комбинация этого класса CD28костимулирующих биспецифичных антител с успешно прошедшим клинические исследования лечением антителом к PD-1 может обеспечить хорошо переносимые, готовые к использованию варианты антителотерапии с ощутимо повышенной противоопухолевой эффективностью.
Введение.
Множество моноклональных антител (mAb), предназначенных для усиления активации Т-клеток, проходят клинические исследования в качестве противоопухолевых терапевтических средств (M. K. Callahan, M. A. Postow, J. D. Wolchok, Targeting T Cell Co-receptors for Cancer Therapy. Immunity 44, 10691078 (2016)). Однако большинство современных методов лечения сталкиваются с проблемой преодоления ингибирующего характера микроокружения опухоли, что приводит к неспособности генерировать эффективную опухолеспецифичную активацию Т-клеток и последующее уничтожение опухолевых клеток (K. G. Anderson, I. M. Stromnes, P. D. Greenberg, Obstacles Posed by the Tumor Microenvironment to T cell Activity: A Case for Synergistic Therapies. Cancer Cell 31, 311-325 (2017)). Для нескольких блокирующих моноклональных антител, направленных против ингибиторов контрольных точек, таких как цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок (CTLA-4) и белок программируемой клеточной смерти 1 (PD-1)/лиганд белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-L1), одобрено проведение клинических исследований лечения меланомы, почечно-клеточной карциномы, немелкоклеточного рака легкого и распространенной метастатической плоскоклеточной карциномы кожи (J. S. Weber et al., Nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who progressed after anti-CTLA-4 treatment (CheckMate 037): a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 16, 375-384 (2015); S. L. Topalian et al., Survival, durable tumor remission, and long-term safety in patients with advanced melanoma receiving nivolumab. J Clin Oncol 32, 1020-1030 (2014); M. A. Postow, M. K. Callahan, J. D. Wolchok, Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol 33, 1974-1982 (2015); M. R. Migden et al., PD-1 Blockade with Cemiplimab in Advanced Cutaneous Squamous-Cell Carcinoma. N Engl J Med 379, 341-351 (2018)). Блокирование PD-1 снимает ограничения по активации Т-клеток, однако его эффективности в качестве монотерапии часто недостаточно для достижения элиминации опухоли и длительных противоопухолевых ответов. В комбинации αнτu-PD-1/PD-L1 и анти-CTLA-4 действительно дают высокую частоту ответа при некоторых типах опухолей, но часто наблюдаются выраженные токсические эффекты (J. Larkin et al., Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med 373, 23-34 (2015); D. B. Johnson et al., Fulminant Myocarditis with Combination Immune Checkpoint Blockade. N Engl J Med 375, 1749-1755 (2016); M. H. Pollack et al., Safety of resuming anti-PD-1 in patients with immune-related adverse events (irAEs) during combined anti-CTLA-4 and anti-PD1 in metastatic melanoma. Ann Oncol 29, 250-255 (2018); J. D. Wolchok et al., Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med 369, 122-133 (2013)). Следовательно, продолжают предприниматься значительные усилия по выявлению пациентов, которые с большей вероятностью будут отвечать на ингибирование контрольных точек путем идентификации биомаркеров, прогнозирующих ответ на терапию (R. Cristescu et al., Pan-tumor genomic biomarkers for PD-1 checkpoint blockade-based immunotherapy. Science 362, (2018)). Кроме того, проходят доклиническую и клиническую оценку комбинированные терапии, предназначенные для повышения эффективности блокады PD-1 и длительности противоопухолевого ответа путем комбинирования с агонистическими антителами, запускающими костимулирующие рецепторы, или с другими методами, такими как химиотерапия или радиационная терапия (S. Hu-Lieskovan, A. Ribas, New Combination Strategies Using Programmed Cell Death 1/Programmed Cell Death Ligand 1 Checkpoint Inhibitors as a Backbone. Cancer J 23, 10-22 (2017); Y. K. Chae et al., Current landscape and future of dual anti-CTLA4 and PD-1/PD-L1 blockade immunotherapy in cancer; lessons learned from clinical trials with melanoma and non-small cell lung cancer (NSCLC). J Immunother Cancer 6, 39 (2018); P. S. Chowdhury, K. Chamoto, T. Honjo, Combination therapy strategies for improving PD-1 blockade efficacy: a new era in cancer immunotherapy. J Intern Med 283, 110-120 (2018); B. Wang et al., Combination cancer immunotherapy targeting PD-1 and GITR can rescue CD8(+) T cell dysfunction and maintain memory phenotype. Sci Immunol 3, (2018); S. Chen et al., Combination of 4-1BB agonist and PD-1 antagonist promotes antitumor effector/memory CD8 T cells in a poorly immunogenic tumor model. Cancer Immunol Res 3, 149-160 (2015)). Микросателлитная нестабильность и высокая мутационная нагрузка генерируют потенциальные эндогенные антигены, которые экспрессируются при определенных видах рака (K. W. Mouw, M. S. Goldberg, P. A. Konstantinopoulos, A. D. D'Andrea, DNA Damage and Repair Biomarkers of Immunotherapy Response. Cancer Discov 7, 675-693 (2017)). Т-клетки распознают эти мути
- 60 045943 ровавшие пептиды как неоантигены (М. Efremova, F. Finotello, D. Rieder, Z. Trajanoski, Neoantigens Generated by Individual Mutations and Their Role in Cancer Immunity and Immunotherapy. Front Immunol 8, 1679 (2017)). Однако в изолированных условиях презентации этих антигенов недостаточно, чтобы способствовать устойчивой активации Т-клеток для генерации противоопухолевой активности (S. Spranger, R. Вао, Т. F. Gajewski, Melanoma-intrinsic beta-catenin signaling prevents anti-tumour immunity. Nature 523, 231-235 (2015)). Вероятно, это связано с иммуноингибирующим микроокружением опухоли.
В настоящем документе описан новый иммунотерапевтический метод с применением биспецификов к TSAxCD28, нацеленных на TSA рака предстательной железы PSMAxCD28, которые в комбинации с блокирующим PD-1 антителом индуцировали длительный противоопухолевый иммунитет и способствовали устойчивой внутриопухолевой активации Т-клеток и Т-клеточной памяти без признаков системного высвобождения цитокинов в моделях опухолей на животных. Токсикологические исследования на генетически гуманизированных иммунокомпетентных мышах и на яванских макаках продемонстрировали, что эти биспецифики не проявляют токсичность сами по себе или в комбинации с антителом к PD-1. В совокупности эти данные дают основания полагать, что комбинирование этого класса биспецификов на основе CD28 (TSAxCD28) с ингибированием PD-1 может обеспечить хорошо переносимые, готовые к использованию биологические решения с заметно усиленной, специфичной и синергической противоопухолевой активностью.
Материал и методы.
В примере 13 были использованы следующие материалы и методы.
План исследования.
В качестве примера одной из целей данного изобретения можно привести разработку биспецифичного антитела к TSAxCD28 и демонстрацию того, что TSAxCD28 усиливает индуцированную PD-1 активацию Т-клеток in vitro и безопасно повышает противоопухолевую эффективность in vivo. Активность in vitro была продемонстрирована путем демонстрации изображений биспецифичных антител, PD-1 и CD28, локализованных в иммунологическом синапсе конъюгатов Т-клеток и клеток-мишеней, усиления высвобождения цитокинов Т-клетками под действием PD-1. Противоопухолевую эффективность in vivo оценивали на модели сингенной опухоли у мышей. Динамику объемов опухолей и сывороточных уровней цитокинов контролировали, чтобы продемонстрировать ответ на лечение биспецифичными антителами. Одной из целей исследований на яванских макаках было определение безопасности и переносимости (фармакологический и токсикологический профиль) TSAxCD28 в качестве монотерапии или в комбинации с PD-1 у нечеловекообразных приматов. Животных исследовали на предмет токсичности путем клинических наблюдений и сбора образцов крови для анализа сывороточных уровней цитокинов и фенотипа Т-клеток.
Исследования на животных.
Все процедуры проводили в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных NIH. Протоколы были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Regeneron Pharmaceuticals.
Линии клеток.
Клон Jurkat E6-1 (АТСС, № TIB-152), Raji (ATCC, № CCL-86™), линию клеток HEK293 (АТСС, № CRL-1573) и А-431 (АТСС, CRL-1555™) культивировали в соответствии с рекомендованным протоколом АТСС. Линию клеток HEK293/hCD20 получали с использованием вектора для экспрессии в клетках млекопитающих, кодирующего управляемый промотором убиквитина hCD20 (аминокислоты с M1 по P297 под регистрационным номером NP_068769.2). Трансфицированные клетки культивировали в 500 мкг/мл генетицина A (G418) для отбора стабильно экспрессирующих линий клеток. Для получения клетки, экспрессирующей hCD80 или hPDL1, использовали лентивирусную плазмиду, кодирующую CD80 человека (длина 288 амк; регистрационный № NM_005191.4) и ген устойчивости к неомицину, или PDL1 человека (длина 290 амк; регистрационный № NM_14143.4) и ген устойчивости к пуромицину, для трансфекции клеток HEK293T, способствуя продуцированию вирусных частиц, которые впоследствии были использованы для инфицирования клеток HEK293/hCD20 или Raji. CD80- или PDL1-положительные клетки человека выделяли с помощью FACS. Клетки Jurkat трансдуцировали NFkB-Luc с использованием лентивируса от Qiagen (кат. № CLS-013L) и лентивирусной плазмиды, кодирующей PD-1 человека и ген устойчивости к пуромицину. Все полученные линии клеток поддерживали в DMEM+10% FBS+P/S/G+NEAA с добавкой 500 мкг/мл G418 и/или 0,5 мкг/мл пуромицина.
Линию клеток DU145/hPSMA получали путем трансдукции клеток DU145 (АТСС, НТВ-81) вирусными частицами, которые были продуцированы клетками HEK293T, трансфицированными лентивирусной плазмидой, кодирующей PSMA человека (аминокислоты с M1 по А750 под регистрационным номером Q04609) и ген устойчивости к неомицину. После инфицирования клетки культивировали в 500 мкг/мл генетицина А (G418) для отбора клеток, стабильно экспрессирующих PSMA. Созданную линию клеток, DU145/PSMA, поддерживали в МЕМ+10% FBS+P/S/G с 500 мкг/мл G418.
Для создания линий опухолевых клеток, генетически модифицированных для экспрессии костимулирующих лигандов, использовали лентивирусную плазмиду pLVX с промотором EF1a, кодирующую
- 61 045943 мышиный CD86 или пустой вектор и ген устойчивости к пуромицину (pLVX.EF1a.CD86-puro и pLVX.EF1a.EV-puro, соответственно), для трансфекции клеток HEK293T, способствуя продуцированию вирусных частиц, которые впоследствии были использованы для инфицирования МС38 (Национальный институт онкологии США, лаборатория опухолевой иммунологии и биологии). Генетически модифицированные линии клеток, экспрессирующие CD86, выделяли с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Клетки поддерживали в условиях, рекомендованных АТСС, в присутствии 0,5 мкг/мл пуромицина. Полученные линии клеток были названы MC38/CD86 и MC38/EV.
Для получения клеток MC38/hPSMA использовали лентивирусную плазмиду, кодирующую PSMA человека (аминокислоты с M1 по A750 под регистрационным номером Q04609) и ген устойчивости к неомицину, для трансфекции клеток HEK293T, способствуя продуцированию вирусных частиц, которые впоследствии были использованы для инфицирования родительских клеток МС38. PSMAположительные клетки человека выделяли с помощью FACS. MC38/hPMA поддерживали в DMEM+10% FBS+P/S/G+NEAA с добавкой 500 мкг/мл G418.
Amnis Image Stream.
Amnis Image Stream проводили, как описано в примере 7.
Выделение первичных CD3+ Т-клеток человека.
Выделение Т-клеток проводили, как описано в примере 8.
Высвобождение IL-2 из первичных CD3+ Т-клеток в реакции MLR с клетками DU145/PSMA.
Ранее выделенные и замороженные CD3+ Т-клетки человека размораживали в день проведения анализа в стимулирующей среде (среда для культивирования клеток X-VIVO 15 с добавками 10% FBS, HEPES, NaPyr, NEAA и 0,01 мМ ВМЕ), содержащей 50 Ед/мл бензоназной нуклеазы. Клетки центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин, повторно суспендировали в стимулирующей среде и высевали в 96-луночные круглодонные планшеты в концентрации 1х 105 клеток/лунку. Родительские клетки DU145 или клетки DU145, генетически модифицированные для экспрессии PSMA человека, обрабатывали 25 мкг/мл митомицина С в стимулирующей среде для первичного посева в концентрации 10х106 клеток/мл. После инкубации в течение 1 ч при 37°C, 5% СО2, обработанные митомицином С клетки 3 раза промывали D-PBS, содержащим 2% FBS, и добавляли в лунки, содержащие CD3+ Т-клетки в конечной концентрации 5х104 клеток на лунку. Чтобы предотвратить проявление возможной агонистической активности CD28 посредством заякоривания Fc-домена антитела к CD28 на Fc-рецепторах, в каждую анализируемую лунку было включено насыщающее количество неспецифичного антитела человека IgG (100 нМ каждого: hIgG1, hIgG4 и hIgG4s). Затем антитела PSMAxCD28, контрольное ненацеленное xCD28 или изотипический контроль hIgG4s титровали от 30 пМ до 200 нМ с разведением 1:3 и добавляли в лунки. Конечная точка 10-точечного разведения не содержала титруемых антител. Поскольку клетки DU145 эндогенно экспрессируют PD-L1, влияние подавления активности Т-клеток посредством PD-1 оценивали путем добавления в лунки постоянной концентрации 20 нМ антагониста PD-1 REGN2810. Также было включено условие в отсутствие ингибирования PD-1, где вместо него использовали 20 нМ изотипически сходного контроля hIgG4. Планшеты инкубировали в течение 72 ч при 37°C, 5% СО2, а затем центрифугировали для осаждения клеток. Собирали 50 мкл супернатанта среды, и из этого объема 5 мкл тестировали в анализе IL-2 человека методом AlphaLISA в соответствии с протоколом производителя. Измерения делали на многоканальном планшетном анализаторе Envision от Perkin Elmer. Была построена градуировочная кривая известных концентраций IL-2 для экстраполяции пг/мл IL-2 или IFNy, генерированных в анализируемых лунках. Все последовательные разведения были протестированы в двух повторах. Значения ЕС50 антител определяли из четырехпараметрического логистического уравнения на 10-точечной кривой доза-ответ с использованием программного обеспечения GraphPad Prism™.
Анализ цитотоксичности на основе FACS.
Анализ цитотоксичности на основе FACS проводили, как описано ранее (пример 8).
Исследования на сингенных опухолях.
MC38/EV и MC38/CD86 культивировали в соответствии с рекомендациями АТСС. 1х106 MC38/EV или MC38/CD86 подкожно имплантировали мышам C57BL/6. Мышам вводили антитело к PD-1 (RPM114, BioXcell) или крысиный изотипический контроль IgG2a (BioXcell) в дозе 5 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции в 0, 3, 7, 10 и 14 день после имплантации опухоли. Размеры опухолей измеряли дважды в неделю штангенциркулем (Roboz RS-6466). Объем опухоли рассчитывали по формуле X*Y*(X/2), где Y - самое большое измерение, а X - измерение, перпендикулярное ему. Мышей с опухолями более 2000 мм3 или с изъязвленными опухолями умерщвляли удушением СО2.
Гуманизированных мышей hCD3/hCD28/hPSMA получали, как описано в примере 10. Лечение антителами также было аналогичным, за исключением того, что указанные антитела или биспецифичные антитела вводили в виде монотерапии или в комбинации путем внутрибрюшинной инъекции в 0, 7 и 14 день (профилактическое лечение) или на 9, 13 и 22 день (отсроченное лечение) в дозе 5 мг/кг.
Анализ тканевых цитокинов ex vivo.
На 29 день после имплантации мышей CD3/CD28/PSMA с опухолями MC38/hPSMA умерщвляли удушением диоксидом углерода. Селезенки и опухоли собирали и хранили в среде на льду. Все следую- 62 045943 щие стадии проводили на льду или при 4°C, если не указано иное. Опухоли разрезали на мелкие кусочки и превращали фрагменты в суспензию отдельных клеток с использованием набора для диссоциации мышиных опухолей от Miltenyi в соответствии с протоколом производства (Miltenyi 130-096-730). Селезенки превращали в суспензию отдельных клеток, используя мягкую механическую диссоциацию MACS (программа для селезенки 4) и протирая через фильтр на 70 мкм с помощью резинового конца шприца на 3 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 мин. Эритроциты лизировали путем повторного суспендирования клеточного осадка в 1 мл лизирующего буфера ACK (аммонийхлорид-калий) и инкубирования на льду в течение 5 мин. Лизирующий буфер ACK гасили буфером для FACS. Клетки осаждали центрифугированием при 1200 об/мин в течение 5 мин. Клеточную суспензию повторно суспендировали в 1 мл среды и высевали 0,2 мл в 96-луночные планшеты (20-400 тыс. опухолевых клеток или 50-70 тыс. клеток селезенки). Клетки инкубировали в течение ночи при 37°C и собирали культуральный супернатант. Уровни цитокинов в супернатанте тканевой культуры измеряли с помощью набора V-Plex Proinflammatory MSD согласно протоколу производителя (Meso Scale Diagnostics K15048D-4). Количество клеток, высеянных на лунку, определяли с помощью FACS-анализа. Уровни цитокинов нормировали к количеству высеянных клеток. Калибровочные микросферы анализировали вместе с клетками для точного измерения количества клеток, используя следующий расчет:
Количество клеток = (количество введенных микросфер х количество клеток, подсчитанное посредством FACS)/количество микросфер, подсчитанное посредством FACS.
Измерение уровней цитокинов в сыворотке мышей.
Измерения уровней цитокинов в сыворотке мышей проводили, как описано ранее (пример 10).
Анализ методом проточной цитометрии.
Для анализа методом проточной цитометрии в экспериментах in vivo опухоли собирали, получали суспензии отдельных клеток и лизировали эритроциты с использованием лизирующего буфера ACK (ThermoFisher Scientific). Различение живых и мертвых клеток проводили с использованием набора для окрашивания мертвых клеток Live/dead fixable blue (ThermoFisher Scientific). Образцы были получены на Symphony (BD Bioscience) и проанализированы с использованием программного обеспечения Cytobank (Cytobank, Санта-Клара, Калифорния). Анализ проводили с равным числом событий на образец. Частоту событий определяли по образцу с наименьшим числом зарегистрированных событий. Для автоматической кластеризации Т-клеток на основе специфичных маркеров использовали анализ CITRUS от Cytobank.
Токсикологические исследования на яванских макаках.
Исследование на яванских макаках проводили, как описано ранее (пример 11).
Результаты.
Ингибирование контрольной точки PD-1 увеличивает относительное отношение CD28 в иммунологическом синапсе, позволяя биспецификам TSAxCD28 заметно усиливать способность антитела к PD-1 стимулировать активацию Т-клеток in vitro.
Чтобы проверить, могут ли костимулирующие биспецифичные агонисты дополнять ингибирование контрольной точки, иллюстративный биспецифик PSMAxCD28 согласно настоящему изобретению (bs16429D) был исследован на предмет его способности повышать эффективность блокады PD-1 при TCR/CD3-зависимой активации Т-клеток. Действительно, эффективная активация Т-клеток зависит от совместной кластеризации комплексов TCR/CD3 и CD28 в иммунном синапсе (ИС). Однако активационные сигналы как от TCR/CD3, так и от CD28 напрямую ингибируются фосфорилированием PD-1-Shp2 с последующей кластеризацией PD-1/PD-L1 в синапсе (Е. Hui et al., T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science 355, 1428-1433 (2017); J. M. Chemnitz, R. V. Parry, K. E. Nichols, С. H. June, J. L. Riley, SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. J Immunol 173, 945-954 (2004)). Чтобы определить относительную локализацию CD28 и PD-1 в ИС, был разработан in vitro анализ Amnis Image Stream, как описано в примере 7, с использованием Тклеток Jurkat, сверхэкспрессирующих PD-1, и опухолевых клеток-мишеней Raji, генетически модифицированных для сверхэкспрессии PD-L1. Флуоресцентно меченое биспецифичное антитело CD20xCD3 (E. J. Smith et al., A novel, native-format bispecific antibody triggering T-cell killing of B-cells is robustly active in mouse tumor models and cynomolgus monkeys. Sci Rep 5, 17943 (2015)) использовали для воспроизведения связывания пептида-ГКГС с TCR и для визуализации взаимодействий Т-клеток с клетками-мишенями, образующими ИС. Два разных флуоресцентно меченых моноклональных антитела к PD-1 (mAb к PD-1), блокатор (mAb к PD-1, REGN2810, (Е. Burova et al., Characterization of the Anti-PD-1 Antibody REGN2810 and Its Antitumor Activity in Human PD-1 Knock-In Mice. Mol Cancer Ther 16, 861-870 (2017)) и неблокирующее антитело (NB mAb к PD-1) использовали для одновременного блокирования взаимодействия с PD-L1 и визуализации локализации PD-1. Было обнаружено, что в отсутствие экспрессии PD-L1 на клетках-мишенях и в присутствии любого из mAb к PD-1 не наблюдалось изменений в относительном количестве PD-1 или CD28 в ИС (фиг. 14). Однако экспрессия PD-L1 на клетках-мишенях в присутствии неблокирующего mAb к PD-1 снижала содержание CD28 в синапсе и способствовала высокому накоплению PD-1 в ИС. Напротив, в присутствии блокирующего mAb к PD-1 локализация PD-1 была значительно снижена, и относительные уровни CD28 в ИС сохранялись. Распределение PD-1 и CD28 количествен
- 63 045943 но оценивали путем расчета отношения окрашивания антителами внутри ИС и за его пределами (фиг. 15). Эти данные показывают, что экспрессия PD-L1 на клетках-мишенях увеличивает локализацию PD-1 в ИС, снижая при этом уровень CD28. Кроме того, блокирующее mAb к PD-1 снижает относительное количество PD-1 в ИС и восстанавливает уровень CD28, тем самым увеличивая относительное отношение CD28 к PD-1.
Затем было проверено, может ли PSMAxCD28 усиливать влияние блокады PD-1 на индуцированное активацией Т-клеток уничтожение опухолевых клеток. Для этого использовали линию рака предстательной железы 22RV1. Клетки 22RV1 эндогенно экспрессируют PSMA и были генетически модифицированы для экспрессии PD-L1 (22RV1/PD-L1). Из-за отсутствия стимуляции TCR/CD3 посредством аллогенного Т-клеточного ответа использовали PSMAxCD3 (патент США № 10179819) для обеспечения первичного стимула. В совместных культурах мононуклеарных клеток периферической крови человека (МНПК, содержащих Т-клетки человека) и клеток 22RV1/PD-L1, PSMAxCD3 по отдельности индуцировало примерно 40% уничтожения опухолевых клеток (фиг. 16, ромбы, ЕС50 составила 8Е-10). Добавление mAb к PD-1 к PSMAxCD3 увеличивало уничтожение опухолевых клеток до примерно 55% (фиг. 16, сплошные треугольники, ЕС50 составила 4Е-10). Интересно, что комбинация PSMAxCD28 и PSMAxCD3 аналогичным образом увеличивала степень уничтожения опухолевых клеток до примерно 55% с повышенной эффективностью (фиг. 16, сплошные кружки, ЕС50 составила 6Е-11), что дает основания полагать, что PSMAxCD28 способно преодолевать опосредованное PD-1/PD-L1 ингибирование. Интересно, что тройная комбинация PSMAxCD28, mAb к PD-1 и PSMAxCD3 обеспечивала самое сильное уничтожение опухолевых клеток на уровне примерно 70%, что говорит о синергетическом эффекте этой комбинации (фиг. 16, сплошные квадраты, ЕС50 составила 7Е-11). Как и ожидалось, ни PSMAxCD28 по отдельности, ни mAb к PD-1, ни комбинация PSMAxCD28 плюс mAb к PD-1 не индуцировали какого-либо уничтожения опухолевых клеток (фиг. 16, незакрашенные символы). В согласии с этим наблюдалось максимальное увеличение высвобождения ZFNy при обработке тройной комбинацией (фиг. 17).
Затем было определено влияние комбинации PSMAxCD28 и mAb к PD-1 на активацию первичных Т-клеток человека in vitro. Для воспроизведения физиологической экспрессии PD-L1 и стимуляции TCR/CD3 использовали реакцию смешанной культуры лимфоцитов (MLR). В однонаправленной MLR несовместимость аллогенных детерминант приводит к активации Т-клеток, что можно количественно оценить по продукции цитокинов. В данном случае Т-клетки от здоровых доноров инкубировали с клетками DU145/PSMA, генетически модифицированной линией клеток рака предстательной железы, эндогенно экспрессирующей PD-L1 и сверхэкспрессирующей PSMA, и указанными антителами (фиг. 18). В присутствии клеток DU145/PSMA и Т-клеток биспецифик PSMAxCD28 приводил к дозозависимому увеличению высвобождения IL-2 примерно в 3-4 раза по сравнению с изотипическим контролем IgG4 (фиг. 18, кружки). Аналогичным образом добавление 20 нМ mAb к PD-1 в анализ MLR также увеличивало высвобождение IL-2 примерно в 3-4 раза по сравнению с изотипическим контролем IgG4 (фиг. 18, треугольники). Комбинация PSMAxCD28 и 20 нМ mAb к PD-1 заметно усиливала активацию, индуцированную биспецификом PSMAxCD28, причем максимальные уровни IL-2 были увеличены примерно в 20 раз по сравнению с изотипическим контролем (фиг. 18, квадраты), что говорит о том, что биспецифик PSMAxCD28 в комбинации с mAb, блокирующим PD-1, мощно и синергетически активирует Т-клетки в присутствии опухолевых клеток с эндогенными уровнями активации TCR/CD3 и ингибирования PD-L1.
В целом эти результаты продемонстрировали, что биспецифик PSMAxCD28 может эффективно повышать способность mAb к PD-1 способствовать активации Т-клеток в условиях передачи сигналов TCR/CD3 (управляемой CD3-биспецификом или аллогенным ответом), что приводит к увеличению высвобождения цитокинов и уничтожению опухолевых клеток, экспрессирующих PSMA и PD-L1, in vitro.
Сверхэкспрессия естественного лиганда CD28 на опухолевых клетках действует синергетически с лечением mAb к PD-1, индуцируя опосредованный CD8 Т-клетками длительный противоопухолевый иммунитет in vivo.
Чтобы определить, может ли взаимодействие CD28 с его естественным лигандом(ами) усиливать противоопухолевую эффективность mAb к PD-1 in vivo, опухолевые клетки МС38 были генетически модифицированы для сверхэкспрессии CD86, одного из костимулирующих лигандов для CD28 (данные не показаны). Комбинация клеток MC38/CD86 и лечения mAb к PD-1 значительно ингибировала рост опухоли (фиг. 19А), что привело к полной регрессии опухоли, связанной с устойчивым преимуществом в части выживаемости (фиг. 19В) по сравнению с клетками МС38 отрицательного контроля, трансфицированными контрольным пустым вектором (MC38/EV). Истощение CD8+ T-клеток во время курса лечения привело к полному исчезновению противоопухолевой эффективности, достигнутой при комбинировании терапии mAb к PD-1 с клетками MC38/CD86, что говорит о необходимости CD8+ Т-клеток (фиг. 19С). Следует отметить, что мыши без опухолей, которым изначально имплантировали клетки MC38/CD86 и вводили mAb к PD-1, отторгали вторую родительскую опухоль МС38, имплантированную более чем через 60 дней после имплантации первичной опухоли, что указывает на наличие ответа Т-клеток памяти (фиг. 19D). Следовательно, эти данные демонстрируют, что синергетический эффект конститутивной экспрессии лиганда CD28 и терапии антителом к PD-1 может привести к длительному CD8-зависимому противоопухолевому иммунитету in vivo.
- 64 045943
PSMAxCD28 действует синергетически с лечением mAb к PD-1 в отношении индукции противоопухолевого иммунитета в модели сингенной опухоли.
Результаты, описанные выше, были затем расширены, чтобы продемонстрировать противоопухолевую эффективность лечения с использованием биспецифичного антитела к TSAxCD28 по отдельности или в комбинации с mAb к PD-1 в моделях сингенных опухолей. Используя модель сформировавшейся сингенной опухоли МС38 у C57BL6, как описано в настоящем документе, ген hPSMA (pLVX.EFla.hPSMA) генетически вводили в клетки МС38 для создания опухолеспецифичного антигена MC38/hPSMA, как описано в настоящем документе. Чтобы избежать вероятности того, что мыши спонтанно отторгнут эти во всех прочих аспектах сингенные опухоли, экспрессирующие введенный опухолевый антиген человека, у этих мышей генетически гуманизировали PSMA. Кроме того, гены CD3y-5-e и CD28 также гуманизировали с использованием технологии VelociGene, как описано ранее (D. M. Valenzuela et al., High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659 (2003); W. T. Poueymirou et al., F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nat Biotechnol 25, 91-99 (2007)), так чтобы биспецифики распознавали Т-клетки хозяина (посредством hCD3 или hCD28), а также опухолевые антигены человека как в здоровых тканях, так и в опухолях (например, hPSMA), моделируя реальную клиническую ситуацию (Y. Kinoshita et al., Expression of prostate-specific membrane antigen in normal and malignant human tissues. World J Surg 30, 628-636 (2006)). В этой модели комбинация биспецифика PSMAxCD28 и mAb к PD-1 обеспечила наилучший контроль роста опухоли, что выражалось в устойчивом преимуществе в выживаемости.
Немедленное лечение комбинацией анти-CD28 X анти-PSMA и антитела к PD1 синергетически ингибирует рост опухоли.
В исследовании немедленного лечения анти-CD28 х анти-PSMA, антитело к PD1 или крысиный изотипический контроль IgG2a вводили в виде монотерапии или в комбинации путем внутрибрюшинной инъекции в 0, 7 и 14 день в дозе 5 мг/кг. Динамику роста опухоли контролировали, используя штангенциркуль для измерения диаметра X и Y. Рассчитывали объем опухоли (X*Y*(X/2)). Мышей умерщвляли, когда опухоли вырастали до размера, превышающего 2000 мм3.
Как показано на фиг. 20А-20Е, антитела анти-CD28 х анти-PSMA подавляли рост опухоли и увеличивали выживаемость у мышей при применении по отдельности, но также действовали синергетически с антителами к PD-1, способствуя отторжению опухоли и увеличивая выживаемость еще больше, чем при применении в отсутствие антитела к PD-1.
Лечение комбинацией CD28xPSMA и PD1 индуцирует долговременный противоопухолевый иммунитет к повторной имплантации опухоли.
Кроме того, мыши без опухолей, у которых осуществляли имплантацию и вводили им комбинацию биспецифика PSMAxCD28 и mAb к PD-1, отторгали вторую линию родительских опухолевых клеток МС38, которая была имплантирована более чем через 60 дней после первичной имплантации опухоли, демонстрируя формирование иммунологической памяти (фиг. 21А), что согласуется с наблюдениями, описанными в настоящем документе. Эти результаты дают основания полагать, что эндогенный антигенспецифичный сигнал TCR (сигнал 1) формируется комплексом пептид-ГКГС в направлении имплантированных опухолевых клеток MC38/PSMA. Было показано, что опухолевые клетки МС38 экспрессируют высокие уровни реактивированных эндогенных ретровирусных белков, таких как р15Е, и что внутриопухолевые Т-клетки у мышей C57BL6 отвечают на этот антиген р15Е (J. С. Yang, D. Perry-Lalley, The envelope protein of an endogenous murine retrovirus is a tumor-associated T-cell antigen for multiple murine tumors. J Immunother 23, 177-183 (2000); H. J. Zeh, 3rd, D. Perry-Lalley, M. E. Dudley, S. A. Rosenberg, J. C. Yang, High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. J Immunol 162, 989-994 (1999)). В согласии с этим открытием было обнаружено, что комбинированная терапия PSMAxCD28 и mAb к PD-1 индуцировала реактивность периферических Т-клеток в отношении по меньшей мере одного эндогенного антигена Р15Е, что подтверждает формирование противоопухолевой иммунологической памяти (фиг. 21В). Примечательно, что в аналогичных экспериментах, где лечение PSMAxCD28 в комбинации с PSMAxCD3 индуцировало отторжение опухоли MC38/hPSMA, эти мыши без опухолей не смогли отторгнуть повторные опухоли (фиг. 21С). В целом эти данные демонстрируют, что CD28-биспецифики действует синергетически с mAb к PD-1 в этой модели сингенной опухоли, экспрессирующей PSMA, и могут усиливать эндогенные TCR/CD3-зависимые Т-клеточные ответы.
Терапевтическое лечение комбинацией анmи-CD28 x анти-PSMA и антитела к PD1 синергетически ингибирует рост опухоли.
Аналогичным образом, в протоколе отсроченного лечения комбинация PSMAxCD28 и mAb к PD-1 через 10 дней после имплантации ингибировала рост сформировавшихся опухолей MC38/hPSMA (фиг. 22А), а также приводила к значительному увеличению выживаемости (фиг. 22С) и уменьшению объемов опухолей (фиг. 22D). Интересно, что комбинированная терапия, нацеленная на опухоль, селективно повышала уровни внутриопухолевых цитокинов, как показано на примере IFNy (фиг. 22В). У этих же мышей не наблюдалось индукции селезеночных или системных цитокинов (фиг. 23А и 23В). Кроме того,
- 65 045943 профилирование экспрессии маркеров активации Т-клеток показало, что внутриопухолевая экспрессия PD-1 увеличивалась после лечения PSMAxCD28 (фиг. 24), что говорит в пользу данного комбинированного лечения. Чтобы дополнительно охарактеризовать подмножества отвечающих Т-клеток после комбинированного лечения, провели профилирование опухоль-инфильтрирующих CD8+ T-клеток на 17 день после имплантации опухоли с помощью высокоразмерной проточной цитометрии. Для независимой стратификации статистически значимо различающихся кластеров Т-клеток использовали CITRUS (cluster identification, characterization, and regression - идентификация, определение характеристик и регрессионный анализ кластеров). Важно отметить, что, как было установлено, блокада PD-1 вызвала экспансию эффекторных (CD44βыс CD62L низк) CD8' Т-клеток (кластер С1), экспрессирующих высокий уровень маркеров активации/истощения (PD-1, TIM3, LAG3, Ki67) (фиг. 25). Однако только комбинированное лечение было способно стимулировать экспансию внутриопухолевых CD8+ Т-клеток (кластер С2) с фенотипом, подобным клеткам памяти (высокий Tcf1, EOMES, CD62L, средний CD122 и CD127) и менее истощенным фенотипом (низкий PD-1, LAG3, TIM3, CD38, KLRG1, более высокий CD5) (фиг. 25) (М. Philip et al., Chromatin states define tumour-specific T cell dysfunction and reprogramming. Nature 545, 452-456 (2017)). Эти данные демонстрируют, что комбинированная терапия биспецификом PSMAxCD28 и антителом к PD-1 вызывает устойчивый противоопухолевый иммунитет, связанный с внутриопухолевой активацией Т-клеток с фенотипом, подобным клеткам памяти, и преимуществом в выживаемости.
TSAxCD28 по отдельности или в комбинации с терапией mAb к PD-1 не индуцирует системную активацию Т-клеток по сравнению с суперагонистом к CD28 у яванских макаков.
Данные ранее проведенного клинического исследования показали, что двухвалентные CD28активирующие антитела, названные суперагонистами к CD28 (CD28-SA), активировали широкий спектр Т-клеток и привели к выраженной токсичности, связанной с синдромом высвобождения цитокинов (CRS), в группе здоровых добровольцев (G. Suntharalingam et al., Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med 355, 1018-1028 (2006)). Для оценки переносимости биспецификов TSAxCD28 по отдельности или возможности синергетического фармакологического действия в комбинации с mAb к PD-1 были проведены поисковые исследования на генетически модифицированных трижды гуманизированных мышах и яванских макаках. Три обезьяны на группу лечения получали разовую дозу (10 мг/кг) PSMAxCD28 по отдельности или в комбинации с mAb к PD-1 (REGN2810) (10 мг/кг) путем внутривенной инфузии (группы комбинированного лечения получали последовательные инфузии) (табл. 20, фиг. 26А-26С и 27).
Кроме того, три обезьяны на группу получили разовую дозу (0,1 мг/кг) биспецифичного антитела к PSMAxCD3 и разовую дозу (10 мг/кг) антитела-суперагониста к CD28, как описано в настоящем документе (табл. 20, фиг. 26А-26С и 27). Оценка токсичности основывалась на клинических наблюдениях, качественных показателях потребления корма, массе тела, показателях жизненно важных функций (температура тела, частота сердечных сокращений, пульсоксиметрия и частота дыхательных движений), лабораторной диагностике и патологической анатомии по завершении эксперимента. Были собраны образцы крови для анализа на цитокины и иммунофенотипирования методом FACS. PSMAxCD28 по отдельности или в комбинации с PD-1 хорошо переносилось, и все животные выжили в течение всего периода исследования. Клинических наблюдений, связанных с исследуемым препаратом, не наблюдалось (данные не показаны). Не было обнаружено ни изменений массы органов, ни каких-либо макроскопических изменений при вскрытии после умерщвления (данные не показаны). Кроме того, не наблюдалось значительного высвобождения цитокинов, маргинации или активации Т-клеток (табл. 23, фиг. 26А-26С). Напротив, значительное высвобождение цитокинов, маргинация лимфоцитов и активация Т-клеток наблюдались у обезьян, которым вводили только суперагонист CD28 (фиг. 29А и 29В). Обильная инфильтрация иммунными клетками наблюдалась в почках, головном мозге и семенных пузырьках животных, получивших суперагонист CD28. Напротив, у животных, которым вводили PSMAxCD28 по отдельности или в комбинации с PD-1, никаких значимых гистологических изменений, связанных с лечением, не наблюдалось (данные не показаны).
Табл. 23. Никаких значимых клинических наблюдений или высвобождения цитокинов не наблюдалось при применении анти-PSMAxCD28 по отдельности или в комбинации с антителом к PD-1 в рамках поискового исследования токсичности разовой дозы на обезьянах.
- 66 045943
Таблица 23
Абсолю | Активи | ||||||||||||||||||
тное | Пролифе | рованн | |||||||||||||||||
Молекул а | Описание | Доза (мг/к г) | 1 день клин ичес | бые наб л-я | кол-во Тклеток (ЕЗ/мкл ) | рирующ ие ΚΪ67+ Т-клетки (ЕЗ/мкл) | ые Iклетки (ЕЗ/мкл) -ICOS | CRP (мг/дл) | Цитокины плазмы через 5 часов после введения дозы (пг/мл) | ||||||||||
кие | пР | пР | Пр | 96 | |||||||||||||||
набл -я | 2-4 дни | едв -й тес | 5 ч | едв -й тес | 96 | едв -й тес | ч | 24 ч | IL-6 | IL- 8 | IL- 10 | IF N- T | TN F-a | IL -2 | IL -4 | IL- 5 | |||
т | т | т | |||||||||||||||||
4,1 5 | 0,1 1 | 0,2 4 | 1,21 | 0,4 2 | 0,8 2 | 13,6 | 4449 | 53 1 | 287 8 | 15 9 | BL Q* | BL Q | BL Q | BL Q | |||||
bsl5780 D | антиPSMAxCD 3 | 0,1 | Выг иба ние | 7,4 1 | 0,1 5 | 0,8 8 | 1,69 | 0,4 0 | 0,6 4 | 14,9 | 1123 9 | 39 10 | 221 40 | 18 00 | BL Q | 35 7 | BL Q | 15 2 | |
5,6 8 | 0,0 1 | 0,4 2 | 3,87 | 0,6 8 | 3,7 5 | 15,4 | 1052 9 | 77 6 | 247 84 | 11 76 | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | |||||
bs16429 | анти- | 1 | - | - | 6,5 | 7,2 | 0,6 | 0,41 | о,з | 0,3 | 0,5 | BLQ | BL | BL | BL | BL | BL | BL | BL |
D | PSMAxCD | 8 | 2 | 2 | 3 | 2 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||
28 | - | - | 4,9 1 | 5,0 9 | 0,4 2 | 0,23 | 0,2 6 | 0,1 7 | 0,5 | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | ||
- | - | 4,5 0 | 4,0 4 | 0,6 3 | 0,39 | 0,5 1 | 0,4 8 | 1,1 | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | |||
bs16429 D | анти- PSMAxCD | 10 | - | - | 6,0 3 4,6 4 | 5,7 3 4,5 3 | 0,3 3 0,3 8 | 0,44 0,60 | 0,3 3 0,5 8 | 0,2 2 0,5 0 | 0,2 0,2 | BLQ BLQ | BL Q BL Q | BL Q BL Q | BL Q BL Q | BL Q BL Q | BL Q BL Q | BL Q BL Q | BL Q BL Q |
- | - | ю, 06 | 7,1 6 | 0,8 8 | 0,49 | 0,8 4 | 0,4 8 | 1,3 | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | |||
REGN23 29 (TeGener o) | суперагон ист к CD28 | 10 | - | - | 7,0 2 7,0 6 и, 87 | 0,2 6 0,1 9 0,6 6 | 0,6 0 0,7 9 1,1 3 | 2,57 1,55 3,61 | 0,5 1 0,4 3 0,4 8 | 1,9 4 1,1 1 2,0 9 | 15,4 15 15,3 | 764 2907 5226 | BL Q 10 95 53 24 | 336 4 171 55 791 8 | BL Q 33 3 15 09 | BL Q BL Q 163 | BL Q 23 8 52 2 | BL Q BL Q 34 2 | 11 69 61 5 19 8 |
bs16429 | анти- | - | - | 3,7 6 | 1,9 0 | о,з 8 | 0,37 | о,з 4 | 0,2 8 | 10,8 | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | |
D+REGN 2810 | PSMAxCD 28 +PD-1 | 10+10 | - | - | 3,6 6 | 2,0 7 | 0,5 4 | 0,52 | 0,2 2 | 0,2 0 | 1 | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | 195 | BL Q | 32 3 | BL Q |
- | - | 3,5 | 1,3 | о,з | 0,40 | 0,1 | 0,1 | И,9 | BLQ | BL | BL | BL | BL | BL | BL | BL | |||
4 | 4 | 9 | 2 | 0 | Q | Q | Q | Q | Q | Q | Q | ||||||||
bsl6431 D+REGN 2810 | анти- PSMAxCD 28 +PD-1 | 10+10 | 3,6 3 3,5 3 4,1 6 | 4,2 3 1,9 0 3,1 6 | о,з 6 о,з 5 0,4 2 | 0,42 0,19 0,32 | 0,2 4 0,1 3 0,2 6 | о,з 8 0,1 5 о,з 3 | 5,1 2,9 0,2 | BLQ BLQ BLQ | BL Q BL Q BL Q | BL Q BL Q BL Q | BL Q BL Q BL Q | BL Q BL Q 187 | BL Q BL Q BL Q | 33 3 BL Q 32 3 | BL Q BL Q BL Q | ||
- | - | 6,2 1 | 5,6 2 | 0,6 0 | 0,58 | 0,3 2 | 0,3 9 | 0,8 | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | 151 | BL Q | 33 5 | BL Q | |||
mAbl015 4P3 | EGFRVIII Ab | - | - | 7,2 2 | 7,7 2 | 0,8 4 | 0,77 | 0,3 9 | 0,4 1 | И | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | 267 | BL Q | 37 8 | BL Q | |
- | - | 3,5 5 | 4,6 1 | 0,5 1 | 0,75 | 0,2 6 | 0,4 4 | 0,2 | BLQ | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q | BL Q |
*BLQ: ниже нижнего предела количественного определения
В согласии с приведенными выше исследованиями у яванских макаков, у имеющих опухоли или не имеющих опухолей наивных трижды гуманизированных мышей (hCD3/hCD28/hPSMA), которым вводили PSMAxCD28, по отдельности или в комбинации с PD-1, не наблюдалось повышения уровней цитокинов (фиг. 27 и фиг. 29А и 29В). Напротив, введение суперагониста к CD28 индуцировало значительное
- 67 045943 повышение уровней ZFNy, TNFa, IL-2, IL-4 и IL-5 через 4 ч после введения дозы (фиг. 27 и фиг. 29А и 29В). В согласии с результатами, описанными выше, ранее было показано, что биспецифик TSAxCD28 (а также родительские двухвалентные антитела к CD28, не обладающие свойствами суперагонистов, использованные для создания этих биспецификов) не индуцирует пролиферацию Т-клеток человека в рекомендованном FDA анализе in vitro с нанесением сухим и мокрым способом (R. Stebbings, D. Eastwood, S. Poole, R. Thorpe, After TGN1412: recent developments in cytokine release assays. J Immunotoxicol 10, 7582 (2013)) по сравнению с сильной пролиферацией, индуцированной CD28-SA (данные не показаны). В целом эти данные дают основания полагать, что биспецифики к TSAxCD28 в значительной степени лишены иммуногенности.
Кроме того, как было описано ранее (пример 10, фиг. 28), лечение анти-PSMAxCD28, по отдельности или в комбинации с антителом к PD1, не повышало сывороточные уровни цитокинов у мышей с опухолями, тогда как лечение анти-PSMAxCD3, по отдельности или в комбинации с антителом к PD1, повышало сывороточные уровни цитокинов у мышей с опухолями.
Обсуждение.
В настоящем документе предложен и проверен новый вид иммунотерапии, нацеленной на опухоли, в котором используются биспецифики TSAxCD28 в комбинации с блокирующим PD-1 моноклональным антителом, где указанная иммунотерапия индуцирует долгосрочный противоопухолевый иммунитет и способствует устойчивой внутриопухолевой активации Т-клеток в моделях опухолей на животных. Токсикологические исследования на генетически гуманизированных иммунокомпетентных мышах и на яванских макаках продемонстрировали, что эти биспецифики не проявляют токсичности сами по себе или в комбинации с моноклональным антителом к PD-1, что дает основания полагать, что этот терапевтический подход может обеспечить хорошо переносимые, готовые к использованию биологические решения с заметно усиленной, специфичной и синергической противоопухолевой активностью.
Известно, что ингибирование контрольных точек с помощью блокирующего PD-1 моноклонального антитела снимает ограничения по активации Т-клеток, однако эффективности этих подходов в качестве монотерапии часто недостаточно для достижения элиминации опухоли и длительного противоопухолевого ответа при многих видах рака. В настоящее время изучаются несколько подходов к улучшению частоты ответа на ингибирование PD-1. Так, идентификация биомаркеров для прогнозирования восприимчивости к mAb к PD-1 (R. Cristescu et al., Pan-tumor genomic biomarkers for PD-1 checkpoint blockade-based immunotherapy. Science 362, (2018)), не нацеленные на опухоли комбинированные терапии с применением ингибирования PD-1 вместе с агонистическими антителами, запускающими костимулирующие рецепторы для улучшения активации Т-клеток, или с химиотерапией или радиационной терапией, в настоящее время проходят доклинические и клинические исследования (S. Hu-Lieskovan, A. Ribas, New Combination Strategies Using Programmed Cell Death 1/Programmed Cell Death Ligand 1 Checkpoint Inhibitors as a Backbone. Cancer J 23, 10-22 (2017); Y. K. Chae et al., Current landscape and future of dual anti-CTLA4 and PD1/PD-L1 blockade immunotherapy in cancer; lessons learned from clinical trials with melanoma and non-small cell lung cancer (NSCLC). J Immunother Cancer 6, 39 (2018); P. S. Chowdhury, K. Chamoto, T. Honjo, Combination therapy strategies for improving PD-1 blockade efficacy: a new era in cancer immunotherapy. J Intern Med 283, 110-120 (2018)). Однако проблема заключается в том, что многие из этих комбинаций часто основываются на доступности уже существующих лекарственных средств и апостериорных суждениях о рациональности комбинирования видов терапии, а не на истинном основанном на гипотезах подходе, что в некоторых случаях приводило к наихудшим результатам для пациента (М. J. Ahn, J. M. Sun, S. H. Lee, J. S. Ahn, K. Park, EGFR TKI combination with immunotherapy in non-small cell lung cancer. Expert Opin Drug Saf 16, 465-469 (2017)). Очевидно, что ингибирование контрольной точки и повторная активация иммунной системы обеспечивает возможность долгосрочной ремиссии у целого ряда пациентов (J. S. Weber et al., Nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who progressed after anti-CTLA-4 treatment (CheckMate 037): a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 16, 375-384 (2015); S. L. Topalian et al., Survival, durable tumor remission, and long-term safety in patients with advanced melanoma receiving nivolumab. J Clin Oncol 32, 1020-1030 (2014); M. A. Postow, M. K. Callahan, J. D. Wolchok, Immune Checkpoint Blockade in Cancer Therapy. J Clin Oncol 33, 1974-1982 (2015); M. R. Migden et al., PD-1 Blockade with Cemiplimab in Advanced Cutaneous Squamous-Cell Carcinoma. N Engl J Med 379, 341-351 (2018)), поэтому необходимы варианты дальнейшего улучшения или повышения активности Тклеток для обеспечения более длительного ответа. В настоящем документе для улучшения противоопухолевой эффективности mAb к PD-1 была предложена концепция применения биспецифика TSAxCD28 для усиления активации и передачи сигналов Т-клетками. Так, эта новая комбинированная иммунотерапия была проверена с использованием опухолевой мишени (например, PSMA), и было продемонстрировано, что костимулирующие биспецифичные антитела к CD28 действуют синергетически с mAb к PD-1, не только генерируя устойчивую активацию Т-клеток, но также обеспечивая длительные противоопухолевые ответы без системной токсичности. Следовательно, эта комбинированная терапия, нацеленная на опухоли, может обеспечить значительное преимущество перед нецелевыми подходами, описанными ранее. Применение CD28-биспецифuчных антител, которые не активируют CD28 напрямую, кроме тех случаев, когда он кластеризован на поверхности опухолевых клеток, дает возможность обеспечивать ко
- 68 045943 стимуляцию только в месте опухоли, избегая системной токсичности обычных CD28-активирующих антител (G. Suntharalingam et al., Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med355, 1018-1028 (2006)), которая часто наблюдается в случае комбинации CLTA-4 и блокады PD-1 (J. Larkin et al., Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med 373, 23-34 (2015); D. B. Johnson et al., Fulminant Myocarditis with Combination Immune Checkpoint Blockade. N Engl J Med 375, 1749-1755 (2016); M. H. Pollack et al., Safety of resuming anti-PD-1 in patients with immune-related adverse events (irAEs) during combined anti-CTLA-4 and anti-PD1 in metastatic melanoma. Ann Oncol 29, 250-255 (2018)) или других костимулирующих агонистических двухвалентных антител (N. H. Segal et al., Results from an Integrated Safety Analysis of Urelumab, an Agonist AntiCD137 Monoclonal Antibody. Clin Cancer Res 23, 1929-1936 (2017)). Токсикологические исследования на генетически гуманизированных иммунокомпетентных мышах, а также на яванских макаках, продемонстрировали, что эти биспецифики не проявляют токсичности при применении в качестве монотерапии или в комбинации с mAb к PD-1. Профиль безопасности вместе с повышением противоопухолевой эффективности посредством биспецифичных антител к PSMAxCD28 согласно изобретению с mAb к PD-1 в сингенных моделях дает основания полагать, что этот терапевтический метод является надежным и может иметь более широкое применение в качестве нового класса иммунотерапевтической комбинации.
Для усиления опосредованного Т-клетками уничтожения опухолевых клеток разрабатываются подходы, нацеленные на опухоль (Е. Dahlen, N. Veitonmaki, P. Norlen, Bispecific antibodies in cancer immunotherapy. Ther Adv Vaccines Immunother 6, 3-17 (2018)). Так, биспецифичные антитела на основе CD3 представляют собой новый класс антител, которые могут эффективно запускать активацию Т-клеток, связывая Т-клетку с опухолевой клеткой и активируя TCR/CD3 (Е. J. Smith et al., A novel, native-format bispecific antibody triggering T-cell killing of B-cells is robustly active in mouse tumor models and cynomolgus monkeys. Sci Rep 5, 17943 (2015)), тем самым имитируя обычный сигнал 1. Однако, несмотря на многообещающую клиническую эффективность, CD3-биспецифики могут быть связаны с синдромом высвобождения цитокинов (CRS) из-за прямой активации Т-клеток и отсутствия специфичности исключительно к опухоли (S. L. Maude, D. Barrett, D. Т. Teachey, S. A. Grupp, Managing cytokine release syndrome associated with novel T cell-engaging therapies. Cancer J 20, 119-122 (2014)). В настоящем изобретении было впервые продемонстрировано, что комбинированная терапия биспецификом TSAxCD28 и mAb к PD-1 индуцирует опухолеспецифичную активацию Т-клеток, связанную с долговременным анамнестическим ответом, на модели опухоли у иммунокомпетентных мышей. Биспецифичные антитела к TSAxCD28 практически не проявляют активности в отсутствие сигнала 1, а блокада PD-1 зависит от ответа специфичных к эндогенному антигену Т-клеток на опухолевые пептиды (W. Hugo et al., Genomic and Transcriptomic Features of Response to Anti-PD-1 Therapy in Metastatic Melanoma. Cell 165, 35-44 (2016);N. A. Rizvi et al., Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer. Science 348, 124-128 (2015); J. M. Mehnert et al., Immune activation and response to pembrolizumab in POLE-mutant endometrial cancer. J Clin Invest 126, 2334-2340 (2016); D. T. Le et al., Mismatch repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade. Science 357, 409-413 (2017)). Следовательно, сигнал 1, обеспечиваемый эндогенными опухолевыми антигенами, важен для комбинированного лечения PSMAxCD28 и mAb к PD-1. Это отличается от CD3-биспецификов, которые активируют Т-клетки независимо от специфичности их TCR и, следовательно, не могут генерировать долговременный опухолеспецифичный иммунитет. Действительно, было обнаружено, что, хотя при комбинированном лечении PSMAxCD3 и PSMAxCD28 достигается высокая противоопухолевая эффективность, оно не генерирует сильного анамнестического ответа. Кроме того, было показано, что опухолевые клетки МС38 экспрессируют высокие уровни реактивированных эндогенных ретровирусных пептидов, таких как р15Е, и мыши C57BL6 могут генерировать эндогенные Т-клетки, которые распознают этот неоэпитоп и отвечают на него (J. С. Yang, D. Perry-Lalley, The envelope protein of an endogenous murine retrovirus is a tumorassociated T-cell antigen for multiple murine tumors. JImrmmother 23, 177-183 (2000); H. J. Zeh, 3rd, D. PerryLalley, M. E. Dudley, S. A. Rosenberg, J. С Yang, High avidity CTLs for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo antitumor efficacy. J Immunol 162, 989-994 (1999)). В модели МС38, описанной в настоящем документе, было продемонстрировано, что комбинированная терапия PSMAxCD28 и mAb к PD1 увеличивала количество Т-клеток, отвечающих на этот неоантиген р15Е. Кроме того, в настоящем изобретении посредством обширного профилирования опухоль-инфильтрирующих Т-клеток было обнаружено, что комбинация PSMAxCD28 и mAb к PD-1 обеспечивает менее дисфункциональные CD8 Тклетки и способствует сильному внутриопухолевому фенотипу Т-клеток памяти. Таким образом, CD28биспецифики вместе с блокадой PD-1 могут усиливать эндогенные TCR/CD3-зависимые Т-клеточные ответы, вызывая длительные противоопухолевые ответы.
Приведенные в настоящем документе данные демонстрируют, что PD-1 накапливается в иммунном синапсе, когда PD-L1 экспрессируется клетками-мишенями, и его накопление связано с уменьшением CD28 в синапсе, что дает основания полагать, что PD-1 может ингибировать Т-клетки, предотвращая локализацию CD28 в синапсе. Кроме того, в настоящем изобретении было обнаружено, что блокада PD-1 предотвращала синаптическую локализацию PD-1, в то время как накопление CD28 в синапсе была повышено, что позволило биспецифику TSAxCD28 заметно усиливать способность mAb к PD-1 стимули
-
Claims (23)
- ровать активацию Т-клеток. Это может быть одним из механизмов, посредством которого блокирующее PD-1 антитело способствует активации Т-клеток. В целом, визуализация локализации PD-1 и CD28 в иммунологическом синапсе после взаимодействия PD-1-PD-L1 и/или ингибирования PD-1 позволяет лучше понять влияние блокады PD-1 на активацию Т-клеток, а также синергетическое взаимодействие между TSAxCD28 и mAb к PD-1 на уровне иммунного синапса.Хотя mAb к PD-1 представляют собой важный новый класс иммунотерапии, во многих случаях, несомненно, будет важна дальнейшая оптимизация противоопухолевой активности. Подобно тому, как в CAR-T-клеточных подходах использовали химерные рецепторы, которые искусственно активируют как сигнал 1, так и сигнал 2, чтобы улучшить их противоопухолевую активность (Е. A. Zhukovsky, R. J. Morse, M. V. Maus, Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection. Cut Opin Immunol 40, 24-35 (2016); A. I. Salter et al., Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function. Sci Signal 11, (2018)), в данном изобретении показано потенциальное преимущество комбинирования ингибирования PD-1 с CD28-биспецификами (которые обеспечивают сигнал 2) для усиления противоопухолевой активности. Этот подход обладает несколькими практическими преимуществами по сравнению с CAR-T-клеточной терапией - то, что он не требует трудоемкой подготовки клеточной терапии, которая должна быть индивидуально адаптирована для каждого пациента, а также не требует предварительного прохождения пациентами лимфодеплеции путем токсической химиотерапии, часто связанной с нежелательными явлениями, вследствие чего они не могут получать такую клеточную терапию (С. Н. June, R. S. O'Connor, О. U. Kawalekar, S. Ghassemi, M. С. Milone, CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science 359, 13611365 (2018)). Этот биспецифичный подход обеспечивает возможности для повышения эффективности, а также повышения безопасности за счет специфичности его действия. В совокупности эти данные дают основания полагать, что комбинирование биспецификов на основе CD28 с успешно прошедшими клинические исследования mAb к PD-1, такими как цемиплимаб, может обеспечить хорошо переносимые, готовые к использованию биологические решения с заметно усиленной и синергической противоопухолевой активностью.Настоящее изобретение не подлежит ограничению в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Действительно, различные модификации данного изобретения в дополнение к описанным в настоящем документе будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания и прилагаемых графических материалов. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Биспецифичное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий домен, который специфично связывает CD28 человека, и второй антигенсвязывающий домен, который специфично связывает PSMA человека, где первый антигенсвязывающий домен содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (D1-HCDR1, D1-HCDR2 и D1-HCDR3), содержащиеся в первой вариабельной области тяжелой цепи (D1-HCVR), и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в вариабельной области легкой цепи (LCVR), и где второй антигенсвязывающий домен содержит три определяющие комплементарность области тяжелой цепи (D2-HCDR1, D2-HCDR2 и D2-HCDR3), содержащиеся во второй вариабельной области тяжелой цепи (D2-HCVR), и три определяющие комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), содержащиеся в LCVR; где D1-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, D1-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, D1-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, D2-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, D2-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, D2-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.
- 2. Биспецифичное антитело по п.1, где D1-HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
- 3. Биспецифичное антитело по п.1, где D2-HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
- 4. Биспецифичное антитело по п.1, где D1-HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, D2-HCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и LCVR содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
- 5. Биспецифичное антитело по любому из пп.1-4, содержащее первую тяжелую цепь и парную легкую цепь, соединенные дисульфидными связями, где первая тяжелая цепь содержит HCVR и константную область тяжелой цепи, содержащую домены CH1, CH2 и СН3, и парная легкая цепь содержит LCVR и константную область легкой цепи, где первая тяжелая цепь и парная легкая цепь содержат первый антигенсвязывающий домен; и- 70 045943 вторую тяжелую цепь и парную легкую цепь, соединенные дисульфидными связями, где вторая тяжелая цепь содержит HCVR и константную область тяжелой цепи, содержащую домены CH1, CH2 и СН3, и парная легкая цепь содержит LCVR и константную область легкой цепи, где вторая тяжелая цепь и парная легкая цепь содержат второй антигенсвязывающий домен.
- 6. Биспецифичное антитело по п.5, где первая тяжелая цепь или вторая тяжелая цепь, но не обе, содержит домен СН3, содержащий модификацию H435R (согласно нумерации EU) и модификацию Y436F (согласно нумерации EU).
- 7. Биспецифичное антитело по п.5 или 6, где константная область тяжелой цепи первой тяжелой цепи и константная область тяжелой цепи второй тяжелой цепи относятся к изотипу IgG1.
- 8. Биспецифичное антитело по п.5 или 6, где константная область тяжелой цепи первой тяжелой цепи и константная область тяжелой цепи второй тяжелой цепи относятся к изотипу IgG4.
- 9. Биспецифичное антитело по п.5, где первая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 и парная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, и вторая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82 и парная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83.
- 10. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифичное антитело по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, для использования в лечении рака, экспрессирующего PSMA.
- 11. Выделенная клетка-хозяин, содержащая молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HCVR и LCVR, указанные в любом из пп.1-5.
- 12. Выделенная клетка-хозяин, содержащая векторы экспрессии, несущие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HCVR и LCVR, указанные в любом из пп.1-5.
- 13. Способ получения биспецифичного антитела по любому из пп.1-9, включающий культивирование выделенной клетки-хозяина по п.11 или 12 в условиях, позволяющих получить биспецифичное антитело, и выделение полученного таким образом биспецифичного антитела.
- 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что способ дополнительно включает составление биспецифичного антитела в виде фармацевтической композиции с подходящим носителем для использования в лечении рака, экспрессирующего PSMA.
- 15. Способ лечения рака, экспрессирующего PSMA, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту биспецифичного антитела по любому из пп.1-9 или фармацевтической композиции по п.10.
- 16. Способ по п.15, в котором рак представляет собой рак предстательной железы.
- 17. Способ по п.15 или 16, дополнительно включающий введение второго терапевтического агента или терапии.
- 18. Способ по п.17, в котором второй терапевтический агент или терапия включает противоопухолевый агент, радиационную терапию, конъюгат антитело-лекарственное средство, биспецифичное антитело, конъюгированное с противоопухолевым агентом, ингибитор контрольной точки или их комбинации.
- 19. Способ по п.17, в котором второй терапевтический агент представляет собой ингибитор контрольной точки.
- 20. Способ по п.19, в котором ингибитор контрольной точки нацелен на PD-1 или CTLA4.
- 21. Способ по п.20, где ингибитор PD-1 выбран из группы, состоящей из пембролизумаба, ниволумаба, атезолизумаба и цемиплимаба.
- 22. Способ по п.20, где ингибитор CTLA4 представляет собой ипилимумаб.
- 23. Способ по п.17, где второй терапевтический агент представляет собой биспецифичное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий домен, который связывается с CD3 человека, и второй антигенсвязывающий домен, который связывается с PSMA человека.-
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/688,227 | 2018-06-21 | ||
US62/781,980 | 2018-12-19 | ||
US62/781,930 | 2018-12-19 | ||
US62/815,878 | 2019-03-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045943B1 true EA045943B1 (ru) | 2024-01-22 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11548947B2 (en) | Bispecific anti-PSMA X anti-CD28 antibodies and uses thereof | |
JP6831426B2 (ja) | 腫瘍治療のための抗体組成物 | |
US11396544B2 (en) | Bispecific anti-CD28 × anti-CD22 antibodies and uses thereof | |
US11453721B2 (en) | Bispecific anti-MUC16 x anti-CD28 antibodies and uses thereof | |
AU2016302928B2 (en) | Anti-PSMA antibodies, bispecific antigen-binding molecules that bind PSMA and CD3, and uses thereof | |
JP2019521098A (ja) | 抗gitr抗体およびその使用 | |
EA045943B1 (ru) | Биспецифичные антитела анти-psma x анти-cd28 и их применения |