JP2022514342A - 核酸の標的化組込み - Google Patents

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Abstract

本開示の主題は、外因性核酸コードのゲノムへのランダム組込み（ＲＩ）をもたらすスーパートランスフェクションに供された、組換えタンパク質の発現に適した標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞、ならびに前記スーパートランスフェクションされたＴＩ宿主細胞を産生および使用する方法に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２１日に出願された米国特許出願第６２／７８４，０１９号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が組み込まれている。
本開示の主題は、組換えタンパク質の発現に適した標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞であって、該ＴＩ宿主細胞はスーパートランスフェクションされ、その結果外因性核酸がそれらのゲノムにコード化されてランダム組込み（ＲＩ）標的化組込み宿主細胞、ならびに前記スーパートランスフェクションされたＴＩ宿主細胞の製造法、および使用法に関する。
［配列表］
本明細書は、配列表（２０１９年１２月１９日に「００Ｂ２０６０８６６ＳＥＱ．ｔｘｔ」という名前のｔｘｔファイルとして電子的に提出）を参照する。００Ｂ２０６０８６６ＳＥＱ．ｔｘｔファイルは２０１９年１２月１０日に作成されたものであり、サイズは１，２５１，２００バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
細胞生物学および免疫学の急速な進歩により、がん、心血管疾患および代謝疾患を含む様々な疾患のための新規治療用組換えタンパク質を開発する需要が高まっている。これらのバイオ医薬品候補は、一般に、目的のタンパク質を発現することができる市販の細胞株によって製造される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、モノクローナル抗体を産生するように広く適合されている。
市販の細胞株を開発するための従来の戦略は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダム組込み、続いて目的のポリペプチドを産生する細胞株の選択および単離を含む。しかしながら、この手法にはいくつかの欠点がある。第１に、そのような組込みはまれな事象であるだけでなく、ヌクレオチド配列がどこに組み込まれる部位に関するランダム性を考慮すると、これらのまれな事象は様々な遺伝子発現および細胞増殖表現型をもたらし得る。「位置効果変異」として知られるそのような変異は、少なくとも部分的に、真核細胞ゲノムに存在する複雑な遺伝子調節ネットワーク、ならびに組込みおよび遺伝子発現のための特定のゲノム遺伝子座の利用可能性に起因する。第２に、ランダム組込み戦略は一般に、宿主細胞ゲノムに組み込まれる遺伝子コピーの数を制御しない。実際に、高産生細胞を得るために遺伝子増幅法がしばしば使用される。しかしながら、そのような遺伝子増幅は、不安定な細胞増殖および／または産物発現などの望ましくない細胞表現型をもたらし得る。第３に、ランダム組込みプロセスに固有の組込み遺伝子座の不均一性のために、目的のポリペプチドの望ましいレベルの発現を示す細胞株を単離するためにトランスフェクション後に数千のクローンをスクリーニングすることは時間がかかるとともに、労力を要する。そのような細胞株を単離した後でさえ、目的のポリペプチドの安定発現は保証されず、安定した市販の細胞株を得るためにはさらなるスクリーニングが必要な場合がある。最後に、ランダム組込み細胞株から作製されたポリペプチドは、高度な配列変動を示し、これは、部分的には、目的のポリペプチドの高レベルの発現を選択するために使用される選択剤の変異原性に起因し得る。
本開示の主題は、一部は、組換えタンパク質の発現に適した標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞であって、該ＴＩ宿主細胞はスーパートランスフェクションされ、その結果、外因性核酸がそれらのゲノムにコード化されてランダム組込み（ＲＩ）標的化組込み宿主細胞、ならびに前記スーパートランスフェクションされたＴＩ宿主細胞の製造法、および使用法に関する。本開示の主題は、高い生産性を有する宿主細胞ＴＩ部位を提供するだけでなく、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって宿主細胞の単一のＴＩ遺伝子座に目的の複数の配列を導入する新規方法も提供し、本明細書に概説されるように、細胞をスーパートランスフェクションに供して、目的の配列の発現の増加を達成し、ＴＩ宿主細胞ゲノムに外因性核酸コードをランダムに組み込む（ＲＩ）ことによって目的の配列の発現増加を達成する。
特定の実施形態では、スーパートランスフェクトされたＴＩ宿主細胞は、最初から（ＲＩに供される前に）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含んでいるか、またはその後に（ＲＩに供された後に）含むようになり、遺伝子座は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０～４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０～２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１～４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３～７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１～３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３～２６６２０５４およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４～９７７０５と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０～４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２～７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０～６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９～１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６～３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５～２７０１７６８またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６～１０５１１７と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作動可能に連結される。
特定の実施形態では、スーパートランスフェクトされたＴＩ宿主細胞は、最初から（ＲＩに供される前に）、ＬＯＣ１０７９７７０６２（配列番号１）、ＬＯＣ１００７６８８４５（配列番号２）、ＩＴＰＲ２（配列番号３）、ＥＲＥ６７０００．１（配列番号４）、ＵＢＡＰ２（配列番号５）、ＭＴＭＲ２（配列番号６）、ＸＰ＿００３５１２３３１．２（配列番号７）、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含んでいるか、またはその後に（ＲＩに供された後に）含むようになる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２（配列番号１）、ＬＯＣ１００７６８８４５（配列番号２）、ＩＴＰＲ２（配列番号３）、ＥＲＥ６７０００．１（配列番号４）、ＵＢＡＰ２（配列番号５）、ＭＴＭＲ２（配列番号６）、ＸＰ＿００３５１２３３１．２（配列番号７）、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子に作動可能に連結された組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチドは、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に隣接する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される配列の全部または一部に直接隣接する組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞である。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
特定の実施形態では、宿主細胞は、外因性ヌクレオチド配列を含み、その配列の組込みが標的化され、外因性ヌクレオチド配列は１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。
特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第３のＲＲＳをさらに含み、第３のＲＲＳは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第１の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第２の選択マーカーをさらに含み、第１の選択マーカーは、第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第３の選択マーカーおよび内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み得、該ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１または第２の選択マーカーとは異なり得る。選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。選択マーカーはまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、改良型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカーからなる群から選択される。
特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性の目的配列（ＳＯＩ）を含む。特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む。特定の実施形態では、標的化組込みによって組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、ならびに第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む。目的の配列は本明細書に列挙された例を含むがこれらに限定されない、いずれかの目的のポリペプチドをコードし得る。ＳＯＩは、同一でも異なってもよく、例えば、ＳＯＩには、抗体の両方の鎖のコード配列を含めることができる。２つ以上の異なるポリペプチドが発現される場合、目的の配列は、２つのポリペプチドを様々な比率で含み得、例えば、８つのコード配列が１：７、２：６などを含むがこれらに限定されない２つの異なるポリペプチドをコードする場合である。ＳＯＩは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードし得る。
本開示の主題はまた、目的のポリペプチドの発現を促進するための宿主細胞への外因性核酸の標的化組込みのための方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に標的化組込みが導入される方法を提供する。特定の実施形態では、そのような方法は、リコンビナーゼ媒介組換えによる宿主細胞への外因性核酸の標的化組込みを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内の部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞に関する。特定の実施形態では、そのような方法は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む細胞に関し、遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程；ｂ）ａ）で供給される細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程；ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識する工程；ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳが異種特異的であり、すなわち、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳがマッチしないＲＲＳであり、それゆえ、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳのいずれか２つがリコンビナーゼ媒介組換えの影響を受けない工程；ｂ）ａ）で供給される細胞に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入する工程；ｃ）ａ）で供給される細胞に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入する工程；ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入する工程であって、その１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識する工程；ならびにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させる方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程；ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させるための方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび１つの選択マーカーが、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接する工程、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む。
本明細書で開示される主題はまた、ＴＩ宿主細胞の使用によって目的のポリペプチドを産生する組成物および方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される組成物および方法を提供する。そのような組成物および方法は、ＴＩ宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の組込みを促進するポリヌクレオチドおよびベクターに加えて、外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞および組成物ならびにその使用方法を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み得、そのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択することができる。
特定の実施形態では、本開示の方法は、相同組換え、相同組換え修復（ＨＤＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介した目的のポリペプチドをコードする外因性核酸の宿主細胞への標的化組込みを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、ＬＯＣ１０７９７７０６２（配列番号１）、ＬＯＣ１００７６８８４５（配列番号２）、ＩＴＰＲ２（配列番号３）、ＥＲＥ６７０００．１（配列番号４）、ＵＢＡＰ２（配列番号５）、ＭＴＭＲ２（配列番号６）、ＸＰ＿００３５１２３３１．２（配列番号７）、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内の部位での細胞への目的のポリペプチドをコードする外因性核酸の組込みを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位での目的のポリペプチドをコードする外因性核酸の細胞内への組込みを含み、遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同なヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含む宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程；ｂ）ベクターを前記宿主細胞に導入する工程であって、ベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む、工程；ならびにｃ）選択マーカーを選択して、ゲノム遺伝子座中に組み込まれたＳＯＩを含有するＴＩ宿主細胞を単離して目的のポリペプチドを発現させる工程を含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、標的化組込みを促進するための外因性ヌクレアーゼの使用を含む。外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択することができる。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ以上の遺伝子座内の部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、１つ以上の遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上のＲＲＳを含む工程；ｂ）ａ）で供給される細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入する工程；ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程であって、リコンビナーゼがＲＲＳを認識する工程；ならびにｄ）誘導物質の存在下で外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させる方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）２つのＲＲＳに隣接し、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた調節可能なプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程；ならびにｂ）前記細胞を、ＳＯＩを発現させるのに適した条件下で培養し、そこから目的のポリペプチドを回収する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、第１および第２の目的ポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、同一または異なる目的のポリペプチドをコードするランダム組込み外因性核酸の前に、後に、または同時に、目的のポリペプチドをコードする配列の標的化組込みが導入される方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内での部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳが異種特異的であり、すなわち、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳがマッチしないＲＲＳであり、それゆえ、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳのいずれか２つが、リコンビナーゼ媒介組換えの影響を受けないことになる工程；ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入する工程；ｃ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入する工程；ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入する工程であって、１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識する工程；ならびにｅ）誘導物質の存在下で外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、ａ）第１の目的のポリペプチドと、２つの組換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する第１の選択マーカーとをコードする、標的化組込み外因性核酸目的配列（ＳＯＩ）であって、前記標的化組込み外因性ＳＯＩが前記宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれている、標的化組込み外因性核酸ＳＯＩ；およびｂ）第２の目的のポリペプチドおよび第２の選択マーカーをコードするランダム組込み外因性核酸ＳＯＩであって、前記ランダム組込みＳＯＩが前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれている、外因性核酸ＳＯＩを含む、宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとは同一であり得る。特定の実施形態では、第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとは同一であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、ランダムに組み込まれた１個～１０個の外因性核酸ＳＯＩを含み得る。特定の実施形態では、標的化遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチドおよび第２の選択マーカーをコードする、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩをさらに含み、前記第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩおよび第１の選択マーカーが第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接し、前記第２の標的化組込外因性ＳＯＩおよび第２の選択マーカーが第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接し得る。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞であり得る。特定の実施形態では、ＳＯＩおよび選択マーカーの標的化組込みは、外因性ヌクレアーゼによって促進され得る。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択することができる。
本開示の主題はまた、目的のポリペプチドを発現させる方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させる方法であって、ａ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を供給する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程；ｂ）（ａ）で供給された細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の２つのＲＲＳとマッチし、第１の目的のポリペプチドおよび第２の選択マーカーをコードする第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む核酸を導入する工程；ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程であって、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識する工程；ｄ）第２の選択マーカーを発現する細胞を選択する工程；ｅ）ランダム組込みを介して、第２の目的のポリペプチドおよび第３の選択マーカーをコードする第２の外因性ＳＯＩを宿主細胞のゲノムに導入する工程；ｆ）第３の選択マーカーを発現する細胞を選択する工程；およびｇ）第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培養する工程を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、宿主細胞培養液から、前記第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを回収することをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとは同一であり得る。特定の実施形態では、標的化遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり得る。特定の実施形態では、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。特定の実施形態では、任意のＳＯＩの標的化組込みは、外因性ヌクレアーゼによって促進され得る。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択することができる。特定の実施形態では、ＳＯＩの発現は、調節可能なプロモーターによって制御することができる。特定の実施形態では、調節可能なプロモーターは、ＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターからなる群から選択することができる。
図１は、抗体の安定した高発現を可能にする、ＣＨＯ ＴＩ遺伝子座を同定するためのゲノムワイドスクリーニング工程の概要を示す略図である。 図２Ａは、標的抗体発現集団を生成するために利用された２つの二重選択スキームを示す。トランスポザーゼ生成ＴＩ宿主を図２Ａに示す。 図２Ｂは、標的抗体発現集団を生成するために利用された２つの二重選択スキームを示す。ランダム組込み生成ＴＩ宿主を図２Ｂに示す。 図３は、２つの特定のＴＩ宿主によって生成された上位クローンの生産性を示す。 図４は、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行するために、３つのＲＲＳ部位の使用を伴う２プラスミドＲＭＣＥ戦略のスキームを示す。１つのベクター（前方）は、ＲＲＳ１、第１のＳＯＩおよびプロモーター（Ｐ）と、それに続く開始コドン（ＡＴＧ）およびＲＲＳ３を含む。他方のベクター（後方）は、開始コドン（ＡＴＧ）を含まないマーカーのコード配列に融合したＲＲＳ３、ＳＯＩ２およびＲＲＳ２を含む。２つのプラスミドが正しく標的化された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、細胞が選択に対して耐性を示す状態になる。 図５は、抗体Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＪの発現に関連して単一ベクターまたは２ベクターＲＭＣＥのいずれかを使用した結果を示す。ＦＡＣＳ、ゲノムＰＣＲおよび遺伝子コピー解析を評価して、両方のプラスミドカセットが正確にＴＩ部位を標的化したことを確認した。２プラスミドＲＭＣＥでは、単一プラスミドＲＭＣＥと比較して、より多くの総ＨＣおよびＬＣコピーがＴＩ部位を標的化した。 図６は、６つの分子の力価を示す 図７は、複合ｍＡｂ形式を発現させるために２ベクトルＲＭＣＥを使用した結果を示す。それぞれが４本の異なる鎖（２本のＨＣおよび２本のＬＣ）を必要とする２つの二重特異性分子を、産生および％二重特異性形成についてアッセイした。どちらも場合においても、８０％超の二重特異性含量で１．５ｇ／Ｌ超を示す細胞株が開発された。 図８は、四種の二重特異性分子の１４日目の力価を示す。 図９Ａは、ＲＴＩシステムにおいてｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の生成を示す。細胞株発生の組織学的結果を図９Ａに示す。 図９Ｂは、ＲＴＩシステムにおいてｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の生成を示す。ＲＴＩ細胞株発生（ＣＬＤ）プロセスの概略図を図９Ｂに示す。 図１０Ａは、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の力価および比生産性の結果を示す。産生終了力価を図１０Ａに示す。 図１０Ｂは、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の力価および比生産性の結果を示す。産生終了ＩＶＣＣを図１０Ｂに示す。 図１０Ｃは、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の力価および比生産性の結果を示す。産生終了比生産性を図１０Ｃに示す。 図１１Ａは、ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株のＨＣおよびＬＣ ｍＲＮＡの発現レベルを示す。ＨＣ ｍＲＮＡの発現レベルを図１１Ａに示す。 図１１Ｂは、ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株のＨＣおよびＬＣ ｍＲＮＡの発現レベルを示す。ＨＬ ｍＲＮＡの発現レベルを図１１Ａに示す。 図１２Ａは、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株におけるＨＣ、ＨＬおよびＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。ＲＴＩシステムに対するシクロヘキシミドおよびＤｏｘの効果の概略図を図１２Ａに示す。 図１２Ｂは、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株におけるＨＣ、ＨＬおよびＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。ｍＡｂ－ＡまたはｍＡｂ－Ｂを発現する細胞株の上清中におけるＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰの細胞内レベルに加えてＨＣおよびＬＣレベルを図１２Ｂに示す。 図１２Ｃは、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株におけるＨＣ、ＨＬおよびＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。一晩ＣＨＸで処理した後のｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株のＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰの細胞内レベルを図１２Ｃに示す。 図１２Ｄは、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株におけるＨＣ、ＨＬおよびＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。培養培地からのドキシサイクリン除去後のｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株のＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰの細胞内レベルを図１２Ｄに示す。 図１３Ａは、ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。産生終了力価を図１３Ａに示す。 図１３Ｂは、ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。ＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰの蓄積を図１３Ｂに示す。 図１３Ｃは、ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。鎖交換実験の概略図を図１３Ｃに示す。 図１３Ｄは、ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。ｍＡｂ－Ｉ、ｍＡｂ－ＩＩ、またはこれらの分子の鎖交換型を発現するＲＴＩプールのＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰの細胞内レベルを図１３Ｄに示す。 図１４Ａは、この分子のプール発現に対するｍＡｂ－Ａ ＨＣおよびＨＬの寄与を示す。産生終了力価を図１４Ａに示す。 図１４Ｂは、この分子のプール発現に対するｍＡｂ－Ａ ＨＣおよびＨＬの寄与を示す。産生終了ＩＶＣＣを図１３Ｂに示す。 図１４Ｃは、この分子のプール発現に対するｍＡｂ－Ａ ＨＣおよびＨＬの寄与を示す。産生終了比生産性を図１４Ｃに示す。 図１５Ａは、発現不良の一因となる可能性のあるＬＣおよびＨＣのＣＤＲ領域を示す。ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ ＬＣサブユニットの略図を図１５Ａに示す。 図１５Ｂは、発現不良の一因となる可能性のあるＬＣおよびＨＣのＣＤＲ領域を示す。ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ ＨＣ領域の略図を図１５Ｂに示す。 図１６Ａは、ＨＣＡの発現に関連してＨＣ定常領域で２つの点変異を使用した結果を示す。ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ ＨＣおよびＬＣサブユニット間の様々な鎖交換の産生終了力価を図１６Ａに示す。 図１６Ｂは、ＨＣＡの発現に関連してＨＣ定常領域で２つの点変異を使用した結果を示す。様々なＲＴＩプールのＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰの細胞内レベルを図１６Ｂに示す。 図１６Ｃは、ＨＣＡの発現に関連してＨＣ定常領域で２つの点変異を使用した結果を示す。低タンパク質発現の診断ツールとしてのＲＴＩシステム利用の概略図を図１６Ｃに示す。 図１７は、２つの異なる細胞培養プロセスを使用した産生を示す。 図１８Ａは、３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールの力価および比生産性の結果を示す。ＨＬおよびＨＬＬ構成を比較する３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールの１４日目の力価を図１８Ａに示す。 図１８Ｂは、３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールの力価および比生産性の結果を示す。ＨＬおよびＨＬＬ構成を比較する３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールの１４日目の比生産性（Ｑｐ）を図１８Ｂに示す。 図１８Ｃは、３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールの力価および比生産性の結果を示す。図１８Ａのプールから作製したクローンの１４日目の力価を図１８Ｃに示す。 図１８Ｄは、３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールの力価および比生産性の結果を示す。図１８Ａのプールから作製したクローンの１４日目のＱｐを図１８Ｄに示す。図１８Ｃおよび図１８Ｄでは、構成あたり６個のクローンを試験した。 図１９Ａは、３つの異なるプラスミド構成を比較するｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールについての力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分ＩＶＣＣで表わされる）、ｍＲＮＡ発現、ならびにタンパク質発現を示す。１４日目の力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を図１９Ａに示す。各バーは、単一のプールからのデータを表す。図１９Ａは、プールからのシードトレインｍＲＮＡ発現および細胞内抗体タンパク質発現である。 図１９Ｂは、３つの異なるプラスミド構成を比較するｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールについての力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分ＩＶＣＣで表わされる）、ｍＲＮＡ発現、ならびにタンパク質発現を示す。１４日目の力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を図１９Ｂに示す。各バーは、単一のプールからのデータを表す。 図１９Ｃは、３つの異なるプラスミド構成を比較するｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールについての力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分ＩＶＣＣで表わされる）、ｍＲＮＡ発現、ならびにタンパク質発現を示す。１４日目の力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を図１９Ｃに示す。各バーは、単一のプールからのデータを表す。 図１９Ｄは、３つの異なるプラスミド構成を比較するｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールについての力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分ＩＶＣＣで表わされる）、ｍＲＮＡ発現、ならびにタンパク質発現を示す。重鎖および軽鎖のｍＲＮＡ発現を、ＨＬＬ－ＨＬ構成を基準として正規化し、各バーは４つの技術的複製物の平均である（エラーバーは標準偏差である）。重鎖および軽鎖のｍＲＮＡ発現を、ＨＬＬ－ＨＬ構成を基準として正規化した。 図１９Ｅは、３つの異なるプラスミド構成を比較するｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールについての力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分ＩＶＣＣで表わされる）、ｍＲＮＡ発現、ならびにタンパク質発現を示す。ウェスタンブロットから定量化し、ＨＬＡ－ＨＬ構成を基準として正規化した全てのプールからの細胞内重鎖および軽鎖タンパク質発現を図１９Ｅに示す。各バーは３回の技術的反復の平均である（エラーバーは標準偏差である）。 図１９Ｆは、３つの異なるプラスミド構成を比較するｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールについての力価、Ｑｐおよび増殖（生細胞濃度の積分ＩＶＣＣで表わされる）、ｍＲＮＡ発現、ならびにタンパク質発現を示す。図１９Ｅに示すデータの代表的なウェスタンブロット画像を図１９Ｆに示す。 図２０Ａは、３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから作製したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩ発現を発現する単クローンの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる）を示す。ｍＡｂ Ｙ発現単クローンの１４日目の力価を図２０Ａに示す。 図２０Ｂは、３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから作製したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩ発現を発現する単クローンの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる）を示す。ｍＡｂ Ｙ発現モノクローンの１４日目のＱｐを図２０Ｂに示す。 図２０Ｃは、３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから作製したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩ発現を発現する単クローンの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる）を示す。ｍＡｂ Ｙ発現クローンの１４日目のＩＶＣＣを図２０Ｃに示す。 図２０Ｄは、３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから作製したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩ発現を発現する単クローンの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる）を示す。ｍＡｂ ＩＩＩ発現モノクローンの１４日目の力価を図２０Ｄに示す。 図２０Ｅは、３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから作製したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩ発現を発現する単クローンの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる）を示す。ｍＡｂ ＩＩＩ発現モノクローンの１４日目のＱｐを図２０Ｅに示す。 図２０Ｆは、３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから作製したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩ発現を発現する単クローンの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる）を示す。ｍＡｂ ＩＩＩ発現クローンの１４日目のＩＶＣＣを図２０Ｆに示す。 図２１Ａは、様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価およびＱｐを示す。鎖発現に対するプラスミド位置の影響を評価するためにトランスフェクトされた１本の重鎖、１本の軽鎖プラスミドの概略図を図２１Ａに示す。抗体重鎖（Ｈと略す）および軽鎖（Ｌと略す）を同じプラスミド上で発現させるか、または前方プラスミドと後方プラスミドとの間で分割した。Ｌ３、Ｌｏｘｆａｓおよび２Ｌ部位に注目し、後方プラスミド中のｐａｃピューロマイシン耐性遺伝子も同様である。 図２１Ｂは、様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価およびＱｐを示す。図２１Ａに示したＤＮＡ構成を有するプールからの重鎖および軽鎖のシードトレインｍＲＮＡ発現を図２３Ｂに示す。 図２１Ｃは、様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価およびＱｐを示す。様々な構成のＲＭＣＥプールの１４日目の力価を図２１Ｃに示す。 図２１Ｄは、様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価およびＱｐを示す。様々な構成の１４日目のＱｐを図２１Ｄに示す。 プールの重鎖および軽鎖ＤＮＡコピー数を図２１Ｅに示す。 図２２Ａは、ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）割合に対するＨＣ：ＬＣ比の効果がＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主７細胞上の抗体Ｓの１４日目の力価を図２２Ａに示す。 図２２Ｂは、ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）割合に対するＨＣ：ＬＣ比の効果がＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主７細胞上の抗体Ｓの高分子量種（ＨＭＷＳ）の割合を図２２Ｂに示す。 図２２Ｃは、ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）割合に対するＨＣ：ＬＣ比の効果がＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主４細胞上の抗体Ｓの１４日目の力価を図２２Ｃに示す。 図２２Ｄは、ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）割合に対するＨＣ：ＬＣ比の効果がＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主４細胞上の抗体Ｓの高分子量種（ＨＭＷＳ）の割合を図２２Ｄに示す。 図２３Ａは、抗体ＩＶの生産性および高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。宿主４細胞上の抗体ＩＶの１４日目の力価を図２３Ａに示す。 図２３Ｂは、抗体ＩＶの生産性および高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。宿主４細胞上の抗体ＩＶの高分子量種（ＨＭＷＳ）割合を図２３Ｄに示す。 図２４Ａは、２部位ＴＩ宿主細胞における抗体ＶＩの生産性および高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。２部位ＴＩ宿主細胞上の抗体ＶＩの１４日目の力価を図２４Ａに示す。 図２４Ｂは、２部位ＴＩ宿主細胞における抗体ＶＩの生産性および高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。２部位ＴＩ宿主細胞上の抗体ＶＩの高分子量種（ＨＭＷＳ）割合を図２４Ｂに示す。 図２５は、それぞれ８．４および８．７ｇ／Ｌの力価を有し、７．４％および５．６％の凝集体を有する２つのクローンを示す。 図２６は、異なる制御された標的化組込み細胞株における抗体Ｚの１４日目の力価を示す。 図２７は、異なる制御された標的化組込み細胞株における抗体Ｚの比生産性を示す。 図２８Ａは、スーパートランスフェクトおよび擬似トランスフェクトされたクローン上のｍＡｂ Ｚの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる。）を示す。ＨＬＡ－ＨＬ ＴＩを発現するｍＡｂ Ｚから作製されたスーパートランスフェクトおよび疑似トランスフェクトされたクローンの１４日目の力価を図２８Ａに示す。 図２８Ｂは、スーパートランスフェクトおよび擬似トランスフェクトされたクローン上のｍＡｂ Ｚの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる。）を示す。１４日目のＱｐを図２８Ｂに示す。 図２８Ｃは、スーパートランスフェクトおよび擬似トランスフェクトされたクローン上のｍＡｂ Ｚの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる。）を示す。１４日目のＩＶＣＣを図２８Ｃに示す。 図２８Ｄは、スーパートランスフェクトおよび擬似トランスフェクトされたクローン上のｍＡｂ Ｚの力価、Ｑｐおよび増殖（生存細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表わされる。）を示す。ＨＬＡ－ＨＬＨＬ親クローンおよびＨＬＡ－ＨＬ親クローンから作製された４つのスーパートランスフェクトされたクローンおよび４つの疑似トランスフェクトされたクローンからの重鎖および軽鎖ＤＮＡコピー数を図２８Ｄに示す。 図２９Ａは、抗体Ｚの様々なクローンに対する調節されたスーパートランスフェクションの力価を示す。抗体Ｚの制御された発現の１０日目および１３日目の力価を図２９Ａに示す。 図２９Ｂは、抗体Ｚの様々なクローンに対する調節されたスーパートランスフェクションの力価を示す。選択されたクローンの２つの異なる産生方法の力価比較を図２９Ｂに示す。 図２９Ｃは、抗体Ｚの様々なクローンに対する調節されたスーパートランスフェクションの力価を示す。制御されたスーパートランスフェクト細胞上の抗体Ｚの力価を図２９Ｃに示す。
特定の実施形態では、本明細書中に記載される宿主細胞、遺伝子構築物（例えば、ベクター）、組成物および方法は、標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞の開発および／または使用において使用され得る。特定の実施形態では、そのようなＴＩ宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子または特定の遺伝子座内に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
開示を明確にする目的で、かつ限定を目的とせずに、詳細な説明を以下のサブセクションに分ける。
１．定義
２．組込み部位
３．外因性ヌクレオチド配列
４．宿主細胞
５．標的化組込み
６．ＴＩ宿主細胞の調製および使用
７．産物
８．例示的な非限定的な実施形態
１． 定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、本明細書におけるいかなる定義をも含む本出願が優先する。好ましい方法および材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料は、現在開示されている主題の実施または試験に使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「有する（ｈａｓ）」、「することができる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびこれらの変形は、更なる作用または構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書における数値範囲の列挙のために、同じ程度の精度でその間に介在する各数字が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６および９に加えて数値７および８が企図され、６．０～７．０の範囲では、番号６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図される。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容できる誤差範囲を意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」とは、当該技術分野での慣習に従い、３または３を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、更により好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、または特異的に排除されることを可能にする該遺伝子を表す。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、遺伝子の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ、形質転換されていない宿主細胞は、該選択的培養条件下で増殖または生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にすることができるのに対し、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞を選択的に排除することを可能にし得る。選択マーカーは、薬剤耐性を付与し、または宿主細胞の代謝的もしくは異化的欠陥を補い得る。原核細胞では、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が使用され得る。真核細胞の選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号および国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
選択マーカーは、対応する選択剤の存在下での選択を容易にするだけでなく、通常は細胞中に存在しない分子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅをコードする遺伝子を代わりに提供し得る。そのような遺伝子を保有する細胞は、例えば、コードされたポリペプチドによって放射される蛍光の検出によって、この遺伝子を保有しない細胞と区別され得る。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つ以上の構成要素の並置を指し、該構成要素は、意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーがコード配列の転写を調節するように作用する場合、該プロモーターおよび／またはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣接している。特定の実施形態では、例えば、分泌リーダーおよびポリペプチドなどの２つのタンパク質をコードする領域を結合する必要がある場合、該配列は、連続して隣接し、同じリーディングフレーム内に存在する。特定の実施形態では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置し、それに隣接し得る。特定の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの構成要素は隣接していなくても、作動可能に連結され得る。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、該エンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されエンハンサーは、コード配列の上流、配列内、または下流に位置し得、コード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。作動可能な連結は、当技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ法を使用して、および／または都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。都合の良い制限部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の方法に従って使用し得る。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、該ＩＲＥＳは、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写および／または翻訳を指す。特定の実施形態では、所望の産物の転写レベルは、存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定され得る。例えば、目的の配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量され得る。特定の実施形態では、目的の配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物活性についてアッセイすることによって、またはそのような活性に依存しないアッセイ、例えば、タンパク質を認識してそれに結合する抗体を使用するウェスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイなどを用いることによって定量され得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、本最も広義に使用され、抗体が所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、半抗体、および抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔら、「Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、第９１頁（２００７年）を参照されたい。）単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために充分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体のＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離され、それぞれ、相補的ＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングしてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７，１９９３；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８，１９９１．を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「重鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖を指す。
本明細書中で使用される場合、「軽鎖」という用語とは、免疫グロブリン軽鎖を指す。
抗体の「クラス」とは、抗体の重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス、すなわち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に更に分ける場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれαα、δδ、εε、γγ、またはμμと呼ばれる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一であり、および／または同一のエピトープを結合している抗体を指すが、例えば、自然に生じる突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる可能性のあるバリアント抗体を除いて、そのようなバリアントは、一般的に微量に存在する。通常、異なる決定基（エピトープ）に対して指向する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従うモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、そのような方法および本明細書に記載されているモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない。
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様において、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；ならびに、抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリなどのヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、そのドメイン中ではＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応することになる。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一であり、および／または同一のエピトープと結合しているが、例えば、自然に生じる突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のあるバリアント抗体を除いて、そのようなバリアントは、一般的に微量で存在する。通常、異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈すべきではない。
「治療用抗体」という用語は、疾患の治療に使用される抗体を指す。治療用抗体は、様々な作用機序を有する場合がある。治療用抗体は、抗原に関連する標的と結合し、その正常な機能を中和する場合がある。例えば、がん細胞の生存に必要なタンパク質の活性を遮断するモノクローナル抗体は、細胞死を引き起こす。別の治療用モノクローナル抗体は、抗原に関連する標的の結合し、その正常な機能を活性化する場合がある。例えば、モノクローナル抗体は、細胞上のタンパク質に結合し、アポトーシスシグナルを誘発し得る。さらに別のモノクローナル抗体は、疾患組織上にのみ発現される標的抗原に結合し得、毒性ペイロード（効果的な薬剤）、例えば、化学療法剤または放射性薬剤などとモノクローナル抗体との複合化によって、毒性ペイロードを患部組織に特異的に送達するための薬剤が作製され、健康な組織への害が減少し得る。治療用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の一部または全部ではないにしても少なくとも１つを示し、その機能は標的抗原への少なくとも特異的な結合を含む。
「診断用抗体」という用語は、疾患の診断試薬として使用される抗体を指す。診断用抗体は、特定の疾患に特異的に関連するか、または特定の疾患において発現の増加を示す標的抗原に結合し得る。診断用抗体は、例えば、患者からの生体試料中の標的を検出するために、または患者における腫瘍などの疾患部位の画像診断において使用され得る。診断用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の一部または全部ではないにしても少なくとも１つを示し、その機能は標的抗原への少なくとも特異的な結合を含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞および継代の数に関わらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。元々形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫は、本明細書に含まれる。
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基またはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、およびリン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基配列によって記載され、それにより、塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’～３’へと表される。本明細書中、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成形態、およびこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状または環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖、ならびに一本鎖形態および二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖もしくはリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基または化学的に修飾された残基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主または患者において、インビトロおよび／またはインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、または修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、インビボで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性および／またはコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい。（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６または欧州特許第２１０１８２３Ｂ１号を参照。）
「単離された」核酸とは、核酸分子が自然環境の構成要素から分離されたものを指す。単離核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が、染色体外に存在するか、または本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を増殖し得る核酸分子を意味する。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、およびベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。特定の実施形態では、ベクターは、それらが作動可能に連結している核酸の発現を誘導する。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「相同配列」という用語は、配列のアラインメントによって判定されたとき、有意に配列類似性を共有する配列を指す。例えば、２つの配列は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％相同であり得る。アラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＨＭＭＥなどを含むがこれらに限定されないアルゴリズムおよびコンピュータプログラムによって実行され、配列を比較し、要素、例えば配列の長さ、配列の同一性および類似性、ならびに配列のミスマッチおよびギャップの存在および長さなどに基づいて、マッチの統計的有意性を算出する。相同配列は、ＤＮＡ配列およびタンパク質配列の両方を指し得る。
本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、第１のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端、または両端のいずれかに位置することを指す。隣接するヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列に隣接するか、または第２のヌクレオチド配列から規定の距離にあり得る。隣接するヌクレオチド配列の長さに、具体的な制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対または数千塩基対であり得る。特定の実施形態では、隣接するヌクレオチド配列の長さは、約少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対、少なくとも４，０００塩基対、少なくとも５，０００塩基対、少なくとも６，０００塩基対、少なくとも７，０００塩基対、少なくとも８，０００塩基対、少なくとも９，０００塩基対、少なくとも１０，０００塩基対であり得る。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来せず、従来のＤＮＡ送達方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換法によって宿主細胞に導入されるものを示す。「内因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来することを指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成の点で同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって宿主細胞中に導入され得る。
２． 組込み部位
本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みに適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞、すなわち、ＴＩ宿主細胞のゲノム上の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、宿主細胞ゲノム内の核酸配列を含む。特定の実施形態では、組込み部位は、宿主細胞ゲノム上の２つの隣接するヌクレオチド間に存在する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が挿入され得るヌクレオチドのいずれかの間にヌクレオチドのストレッチを含む。特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置する。特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞の内因性遺伝子内に存在する。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の番号が付された１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、および４，０００～４，３０１ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の番号が付された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、および７００，０００～７２８７８５ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の番号が付された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、および４００，０００～４１３，９８３となるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、および３０，０００～３０，７５７ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、および６０，０００～６８，９６２ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、および５０，０００～５１，３２６ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の番号が付された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、および２０，０００～２２，９０４ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５およびそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７およびそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７およびそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＳＯＩを含む。特定の実施形態では、作動可能に連結されたヌクレオチド配列は、ランダム組込みＳＯＩと比較して、ＳＯＩの発現レベルを増加させる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ＳＯＩは、ランダム組込みＳＯＩよりも約２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、または１０倍高く発現される。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５ならびにそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の５’側に隣接し、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７ならびにそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の３’側に隣接する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’側に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’側に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチドは、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される配列の全部または一部にすぐ隣接する遺伝子座に組み込まれる。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７およびそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に隣接する。ある特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７およびそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される配列から約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１ｋｂ以内の距離にある。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の番号が付与された１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、および４，０００～４，３０１ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の番号が付与された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、および７００，０００～７２８７８５ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の番号が付与された１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、および４００，０００～４１３，９８３となるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、および３０，０００～３０，７５７ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、および６０，０００～６８，９６２ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、および５０，０００～５１，３２６ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の番号が付与された１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、および２０，０００～２２，９０４ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしない。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、シス作用性エレメント、例えば、プロモーターおよびエンハンサーを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む遺伝子座は、遺伝子発現を増強する任意のシス作用性エレメント、例えばプロモーターおよびエンハンサーを含まない。
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子内における組込み部位に組み込まれる。内因性ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子には、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の野生型および全ての相同配列が含まれる。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の相同配列は、野生型ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同であり得る。ある特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型哺乳動物ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ヒトＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ハムスターＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。
特定の実施形態では、組込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に作動可能に連結される。特定の実施形態では、組込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に隣接する。
表１は、例示的なＴＩ宿主細胞組込み部位を提供する。
Figure 2022514342000002
特定の実施形態では、組込み部位および／またはその組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、実験的に同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位および／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、１つ以上の外因性ヌクレオチド配列に組み込まれた１つまたは複数のＳＯＩによってコードされる目的のポリペプチドを望ましいレベルで発現する宿主細胞を単離するためのゲノムワイドスクリーニング手法によって同定することができ、外因性配列はそれ自体、宿主細胞のゲノム内の１つ以上の遺伝子座に組み込まれる。特定の実施形態では、組込み部位および／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、トランスポザーゼに基づくカセット組込み事象後のゲノムワイドスクリーニング手法によって同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位および／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、ブルートフォースランダム組込みスクリーニングによって同定され得る。特定の実施形態では、組込み部位および／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、標的化遺伝子座増幅（ＴＬＡ）、それに続く次世代シーケンシング（ＮＧＳ）および全ゲノムＮＧＳなどの従来のシーケンシングアプローチによって決定され得る。特定の実施形態では、染色体上の組込み部位の位置は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析などの従来の細胞生物学的アプローチによって決定され得る。
特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノム内の特定の第１の遺伝子座内の第１組込み部位に組み込まれた第１の外因性ヌクレオチド配列と、ゲノム内の特定の第２の遺伝子座内の第２の組込み部位に組み込まれた第２の外因性ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノム中の複数の組込み部位で組み込まれた複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＴＩ宿主細胞は、少なくとも２つの異なる外因性ヌクレオチド配列、例えば、少なくとも１つのＲＲＳを含む外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、２つ以上の外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上のＳＯＩの導入の標的とされ得る。特定の実施形態では、ＳＯＩは同一である。特定の実施形態では、ＳＯＩは異なる。特定の実施形態では、第１の外因性ヌクレオチド配列を含む親ＴＩ宿主細胞は、第１の外因性ヌクレオチド配列の組込み部位とは異なる組込み部位に第２の外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
特定の実施形態では、組込み部位は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、組込み部位は、同じ染色体上に存在し得る。特定の実施形態では、組込み部位は、同じ染色体中で互いに１～１，０００ヌクレオチド、１，０００～１００，０００ヌクレオチド、１００，０００～１，０００，０００ヌクレオチドまたはそれを超える範囲内に位置する。特定の実施形態では、組込み部位は異なる染色体上存在する。特定の実施形態では、１つの組込み部位に外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞は、同じまたは異なる組込み部位に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、またはそれ以上の外因性ヌクレオチド配列を挿入するために使用され得る。
特定の実施形態では、少なくとも２つの組込み部位のリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）の実現可能性が、各部位について個別に評価され得る。特定の実施形態では、少なくとも２つの組込み部位のＲＭＣＥの実現可能性が同時に評価され得る。複数の部位のＲＭＣＥの実現可能性は、当技術分野で公知の方法、例えば、ポリペプチド力価またはポリペプチド比生産を測定することによって評価され得る。特定の実施形態では、評価は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞の培養物の力価および／または比生産を評価することによって実施され得る。例示的な培養方針としては、流加振盪フラスコ培養およびバイオリアクター流加培養物が挙げられるが、これらに限定されない。目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の力価および比生産は、当技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ウェスタンブロット分析によって評価することができるが、これらに限定されない。
３． 外因性ヌクレオチド配列
外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞に由来しないが、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換法などの従来のＤＮＡ送達方法によって、宿主細胞に導入され得るヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的配列（ＳＯＩ）、例えば目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。しかしながら、特定の実施形態では、本開示との関連で用いられる外因性ヌクレオチド配列は、さらなる核酸配列、例えばＳＯＩの導入を促進する要素、例えば１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）および１つ以上の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、追加の核酸配列の導入を促進する外因性ヌクレオチド配列は、本明細書では「ランディングパッド」と呼ばれる。したがって、ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、（１）１つ以上のＳＯＩ、例えば、外因性部位特異的ヌクレアーゼ媒介性（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性）標的化組込みによって宿主細胞ゲノム中の特定の遺伝子座に組み込まれたＳＯＩを含む外因性ヌクレオチド配列；（２）１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列；または（３）１つ以上のＳＯＩが組み込まれている１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノム中の１つ以上の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つ以上の組込み部位に組み込まれる。例えば、限定するものではないが、少なくとも１つの外因性核酸配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同な１つ以上の遺伝子座に組み込まれ得る。
３．１ ランディングパッド
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、該ＲＲＳは、リコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは異種特異的である、すなわち同じリコンビナーゼによって認識されない。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つの全てのＲＲＳが異種特異的である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、複数のＲＲＳを含む。特定の実施形態では、複数の２つ以上のＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、２つ以上のＲＲＳが異種特異性である。特定の実施形態では、各ＲＲＳは、異なるリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、ＲＲＳの総数のサブセットは、同種特異性であり、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識され、ＲＲＳの総数のサブセットは、異種特異性であり、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識されない。特定の実施形態では、ＲＲＳまたは複数のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つのＲＲＳおよび少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接し、すなわち、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’上流に位置し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’下流に位置する。特定の実施形態では、第１のＲＲＳは選択マーカーの５’末端に隣接し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端に隣接する。
特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳ、いずれもＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳはいずれもＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは異種特異的である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’に位置する。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは同じ方向に配置される。特定の実施形態では、２つのＲＲＳはいずれもフォワードまたはリバース方向に存在する。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは反対方向に配置される。
特定の実施形態では、選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、またはマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子であり得る。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、またはＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーであり得る。特定の実施形態では、選択マーカーは、少なくとも２つの選択マーカーを含む融合構築物であり得る。特定の実施形態では、選択マーカーまたは選択マーカーの断片をコードする遺伝子は、異なる選択マーカーまたはその断片をコードする遺伝子に融合され得る。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接する２つの選択マーカーを含み、第１の選択マーカーは、第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、２つの選択マーカーは両方とも、グルタミンシンテターゼ選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ選択マーカーであり、第２の選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なる。
特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーおよびＩＲＥＳを含み、ＩＲＥＳは選択マーカーに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ＩＲＥＳに作動可能に連結された選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＩＲＥＳに作動可能に連結される選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。目的特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳおよび２つの選択マーカーを含み、そのＩＲＥＳは第２の選択マーカーに機能的に連結される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳと、２つのＲＲＳに隣接する３つの選択マーカーとを含み、ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳおよび３つの選択マーカーを含み、ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。特定の実施形態では、第３の選択マーカーは、第１または第２の選択マーカーとは異なる。ある特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結された第１の選択マーカーおよびＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の選択マーカーを含む。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されたグルタミンシンテターゼ選択マーカーおよびＩＲＥＳに作動可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されたチミジンキナーゼ選択マーカーおよびＨＹＧ選択マーカーならびにＩＲＥＳに作動可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーを含む。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、３つのＲＲＳ全てが同一である。特定の実施形態では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つの全てのＲＲＳ異種特異的である。
３．２ 目的の配列（ＳＯＩ）
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、および少なくとも１つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはそれを超えるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＳＯＩは同一である。特定の実施形態では、ＳＯＩは異なる。
特定の実施形態では、ＳＯＩは、一本鎖抗体またはその断片をコードする。特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体重鎖配列またはその断片をコードする。特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体軽鎖配列またはその断片をコードする。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、および抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、および抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第１の抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、および抗体軽鎖配列またはその断片をコードする第２のＳＯＩを含む。特定の実施形態では、重鎖および軽鎖配列をコードするＳＯＩの数は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの所望の発現レベルを達成するように、例えば所望の量の二重特異性抗体産生を達成するように選択することができる。特定の実施形態では、重鎖および軽鎖配列をコードする個々のＳＯＩは、例えば、単一の組込み部位に存在する単一の外因性核酸配列に、単一の組込み部位に存在する複数の外因性核酸配列に、またはＴＩ宿主細胞内の異なる組込み部位に組み込まれた複数の外因性核酸配列に組み込まれ得る。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび１つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、ＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーまたは少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接して位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、および２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、選択マーカーおよび外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、選択マーカーおよび外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは異なる。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーおよび外因性ＳＯＩの３’に位置する。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳおよび２つの外因性ＳＯＩを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１のＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、第２のＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１のＳＯＩと第２のＳＯＩは異なる。特定の実施形態では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である。特定の実施形態では、第１のＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３部位であり、第２のＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ部位であり、第３のＲＲＳはＬｏｘＦａｓ部位である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、１つの外因性ＳＯＩ、および１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、ＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、選択マーカーは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、２つの外因性ＳＯＩ、および１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１のＳＯＩおよび選択マーカーは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、第２のＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。
特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは目的のポリペプチドをコードする。そのような目的のポリペプチドは、抗体、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、ワクチンタンパク質、または治療機能を有するタンパク質を含む群から選択され得るがこれらに限定されない。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、抗体またはその抗原結合断片をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）またはＦｃ融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（または複数のＳＯＩ）は、標準抗体をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（または複数のＳＯＩ）は、半抗体、例えば、限定されないが、本開示の抗体Ｂ、Ｑ、ＴおよびｍＡｂＩをコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（または複数のＳＯＩ）は、複合抗体をコードする。特定の実施形態では、複合抗体は、二重特異性抗体、例えば、本開示の二重特異性分子Ａ、二重特異性分子Ｂ、二重特異性分子Ｃ、または二重特異性分子Ｄであり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、少なくとも１つのシス作用性エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサーに作動可能に連結される。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結される。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳと、２つのＲＲＳの間に位置する少なくとも２つの外因性ＳＯＩとを含む。特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖および１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖および２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳおよび少なくとも２つの外因性ＳＯＩを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、少なくとも１つのＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖および１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、第２の抗体の１本の重鎖および１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖および２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、第２の抗体の１本の重鎖および１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖および３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、第１の抗体の１本の軽鎖、ならびに第２の抗体の１本の重鎖および１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖および３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置し、第１の抗体の２本の軽鎖、ならびに第２の抗体の１本の重鎖および１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、複数の抗体の重鎖および軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間、ならびに第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。
特定の実施形態では、ＳＯＩの数は、ＳＯＩを発現する宿主細胞の力価および／または比生産性を増加させるように選択される。例えば、限定するものではないが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上のＳＯＩの組込みは、力価および／または比生産性の増加をもたらし得る。
抗体発現に関連して、ＳＯＩをコードするさらなる重鎖または軽鎖を含めると、力価および／または比生産性の増加をもたらし得る。例えば、限定するものではないが、コピー数を１本の重鎖および１本の軽鎖をコードする配列（ＨＬ）から１本の重鎖および２本の軽鎖をコードする配列（ＨＬＬ）に増加させる場合、力価および／または比生産性の増加が達成され得る。同様に、以下の実施例で概説するように、ＨＬＬ（３つのＳＯＩ）からＨＬＬ－ＨＬ（５つのＳＯＩ）またはＨＬＬ－ＨＬＬ（６つのＳＯＩ）に増加させると、力価および／または比生産性の増加を提供し得る。さらに、コピー数をＨＬＬ－ＨＬ（５つのＳＯＩ）またはＨＬＬ－ＨＬＨＬ（７つのＳＯＩ）に増加させることにより、力価および／または特異的生産性の増加をもたらし得る。重鎖および軽鎖のＳＯＩコピー数のさらなる選択肢としては、ＨＨＬ；ＨＨＬ－Ｈ；ＨＬＬ－Ｈ；ＨＨＬ－ＨＨ；ＨＨＬ－ＨＬ；ＨＨＬ－ＬＬ；ＨＬＬ－ＨＨ；ＨＬＬ－ＨＬ；ＨＬＬ－ＬＬ；ＨＨＬ－ＨＨＬ；ＨＨＬ－ＨＨＨ；ＨＨＬ－ＨＬＬ；ＨＨＫ－ＬＬＬ；ＨＬＬ－ＨＨＬ；ＨＬＬ－ＨＨＨ；ＨＬＬ－ＬＬＬ；ＨＨＬ－ＨＨＨＬ；ＨＨＬ－ＨＨＨＨ；ＨＨＬ－ＨＨＬＬ；ＨＨＬ－ＨＬＬＬ；ＨＨＬ－ＬＬＬＬ；ＨＬＬ－ＨＨＨＬ；ＨＬＬ－ＨＨＨＨ；ＨＬＬ－ＨＬＬＬ；およびＨＬＬ－ＬＬＬＬが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、追加のコピーの包含は単一のゲノム遺伝子座で起こるが、特定の実施形態では、ＳＯＩコピーは２つ以上の遺伝子座で組み込むことができ、例えば、複数のコピーは単一の遺伝子座に組み込むことができ、１つ以上のコピーは１つ以上の追加の遺伝子座に組み込み得る。
特定の実施形態では、ＳＯＩの位置、例えば、１つのＳＯＩが別のＳＯＩに対して３’または５’に位置するかどうかは、ＳＯＩを発現する宿主細胞の力価および／または比生産性を高めるように選択される。例えば、限定するものではないが、抗体産生に関連して、重鎖および軽鎖ＳＯＩの組込み位置は、力価および／または比生産性の増加をもたらし得る。図２３Ａ～Ｄおよび以下に提示される実施例に概説されるように、重鎖および軽鎖ＳＯＩの相対的な位置は、ＳＯＩコピー数に変化がないにもかかわらず、力価および比生産性に影響を及ぼし得る。
４． 宿主細胞
本開示の主題は、ヌクレオチド配列の標的化組込みおよび目的のポリペプチドの発現に適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２およびそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子、または宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含み、遺伝子座は、配列番号１～７およびそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
特定の実施形態では、宿主細胞は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるような、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される。
特定の実施形態では、宿主細胞は細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ある特定の世代数にわたって培養された細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、発現レベルが特定のレベルに維持され、１０、２０、３０、５０、１００、２００または３００世代にわたって２０％未満で増加し、または減少する場合に安定である。特定の実施形態では、培養物を選択せずに維持することができる場合、目的のポリペプチドの発現は安定である。特定の実施形態では、目的の遺伝子のポリペプチド産物が約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌまたは約１６ｇ／Ｌに達する場合、目的のポリペプチドの発現が高い。
本開示の主題はまた、目的のポリペプチドを産生する方法に関する。特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程；ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む。特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび１つの選択マーカーが、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接する工程、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む。特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を供給する工程；ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む。特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を供給する工程であって、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび１つの選択マーカーが、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接する工程；ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドが産生され、細胞培養培地中に分泌される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは宿主細胞内で発現し、保持される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、宿主細胞膜で発現され、挿入され、保持される。
目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーションまたは注入を含むが、これらに限定されない従来の細胞生物学的方法によって宿主細胞に導入され得る。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、脂質ベースのトランスフェクション法、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション法、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション法、またはナノ粒子ベースのトランスフェクションを含む化学ベースのトランスフェクション法によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス媒介形質導入を含むがこれらに限定されないウイルス媒介形質導入によって、宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、遺伝子銃媒介注入によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子が、いずれも本明細書中に記載される方法を使用して宿主細胞に導入される。
５． 標的化組込み
標的化組込みは、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組込みは、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてＨＤＲおよび／またはＮＨＥＪによって媒介される。
特定の実施形態では、標的化組込みは、ランダム組込みと組み合わせ得る。特定の実施形態では、標的化組込みは、ランダム組込みの後に続けることができる。特定の実施形態では、ランダム組込みは、当該技術分野において公知の任意の方法またはシステムにより媒介されることができる。特定の実施形態では、ランダム組込みは、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）電気穿孔システムにより媒介される。
５．１． リコンビナーゼ媒介性組換えによる標的化組込み
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼ媒介性組換え事象に必要かつ十分である。ＲＲＳは、組換え事象がヌクレオチド配列内で発生する位置を定義するために使用され得る。
特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。
特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰまたはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰまたはφＣ３１ ａｔｔＢ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。リコンビナーゼを、該酵素のコード配列を含む発現ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系で広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内および分子間組換えの両方を媒介できる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐの逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域で構成されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内の組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介性組換えは高効率で起こり、他の宿主因子を必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた円として切り出される。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の方向が反転する。ＬｏｘＰ配列を異なる染色体上に配置して、異なる染色体間の組換えを促進することもできる。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列の組込みをもたらす。
特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、変異体ＬｏｘＰ配列である。変異体ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ媒介性組込みまたは置換の効率を高めるために開発された。特定の実施形態では、変異体ＬｏｘＰ配列は、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、およびＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列では、左側の１３ｂｐの反復で５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列では、右側の１３ｂｐの反復で５ｂｐが変異している。野生型と変異体の両方のＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ依存性組換えを媒介し得る。
ＦＬＰ－ＦＲＴ部位特異的組換えシステムは、Ｃｒｅ－Ｌｏｘシステムに類似している。それは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μｍプラスミドに由来するフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼを含む。ＦＬＰはまた、チロシンファミリー部位特異的リコンビナーゼに属する。ＦＲＴ配列は、各々が８ｂｐのスペーサーに隣接する１３ｂｐの２つの回文配列からなる３４ｂｐの配列である。ＦＬＰは、１３ｂｐの回文配列に結合し、８ｂｐスペーサー内のＤＮＡ切断、交換およびライゲーションを媒介する。Ｃｒｅリコンビナーゼと同様に、２つのＦＲＴ配列の位置および配向によって、ＦＬＰ媒介性組換えの結果が決定される。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、変異体ＦＲＴ配列である。野生型および変異体のＦＲＴ配列は、いずれもＦＬＰ依存性組換えを媒介し得る。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、限定されないが、タモキシフェン応答性受容体ドメイン配列などの応答性受容体ドメイン配列に融合される。
Ｂｘｂ１およびφＣ３１はセリンリコンビナーゼファミリーに属する。それらはいずれもバクテリオファージに由来し、溶原性を確立して細菌ゲノムへのファージゲノムの部位特異的組込みを促進するためにこれらのバクテリオファージによって使用される。これらのインテグラーゼは、ａｔｔＰおよびａｔｔＢ配列と呼ばれる短い（４０～６０ｂｐ）ＤＮＡ基質間の部位特異的組換え事象を触媒し、その配列は、それぞれファージＤＮＡおよび細菌ＤＮＡ上に位置する元々の付着部位である。組換え後、２つの新しい配列が形成され、これらはａｔｔＬ配列およびａｔｔＲ配列と呼ばれ、各々がａｔｔＰおよびａｔｔＢに由来する半分の配列を含む。組換えはまた、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間で起こり、組み込まれたファージを細菌ＤＮＡから切り出し得る。両方のインテグラーゼは、さらなる宿主因子の助けを借りずに組換えを触媒し得る。補助因子が全く存在しない場合、これらのインテグラーゼは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間の一方向性の組換えを８０％の効率で媒介する。これらのインテグラーゼによって認識され得る短いＤＮＡ配列および一方向性組換えのために、これらの組換えシステムは、遺伝目的のために広く使用されているＣｒｅ－ＬｏｘＰ系およびＦＲＴ－ＦＬＰ系の補完物として開発された。
「マッチＲＲＳ」及び「同種特異的ＲＲＳ」という用語は、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態では、２つのマッチＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは変異体ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、両方のＲＲＳは変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、２つのマッチするＲＲＳは異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態では、第１のマッチＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２のマッチＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１のマッチするＲＲＳは、φＣ３１ａｔｔＢ配列であり、第２のマッチするＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、ベクターは、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチする２つのＲＲＳを含む、すなわち、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳが、ベクター上の第１のＲＲＳとマッチし、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳが、ベクター上の第２のＲＲＳとマッチする。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよびベクター上の第１のＲＲＳは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよびベクター上の第２のＲＲＳと同一である。そのような「単一ベクターＲＭＣＥ」戦略の非限定的な例を図２Ａに示す。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよびベクター上の第１のＲＲＳは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよびベクター上の第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよびベクター上の第１のＲＲＳは、いずれもＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよびベクター上の第２のＲＲＳは、いずれもＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。
特定の実施形態では、「２ベクターＲＭＣＥ」戦略が使用される。例えば、限定ではないが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は３つのＲＲＳを含み、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在し、一方で、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳにマッチする２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳおよび第２のＲＲＳにマッチする２つのＲＲＳを含む場合の配置であり得る。２ベクターＲＭＣＥ戦略の例を図４に示す。そのような例において、ＲＲＳ１、ＲＲＳ２およびＲＲＳ３は、異種特異的であり、例えば、それらは互いに交差反応しない。いくつかの実施形態では、１つのベクター（前方）は、ＲＲＳ１、第１のＳＯＩおよびプロモーターに続いて、開始コドンおよびＲＲＳ３を（この順序で）含む他方のベクター（後方）は、開始コドン（ＡＴＧ）を含まないマーカーのコード配列に融合したＲＲＳ３、ＳＯＩ２およびＲＲＳ２（この順で）を含む。融合タンパク質のインフレーム翻訳を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列との間に追加のヌクレオチドが挿入される場合がある。いくつかの実施形態では、第１のＳＯＩは抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第２のＳＯＩは抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質である。特定の実施形態では、第１のＳＯＩおよび第２のＳＯＩによってコードされる抗体が対合して、多重特異性、例えば二重特異性抗体を形成する。
このような２ベクターＲＭＣＥ戦略では、ＲＲＳの各対間に適切な数のＳＯＩを組み込むことにより、８つのＳＯＩの導入が可能になる。
単一ベクターおよび２ベクターＲＭＣＥはいずれも、１つ以上のドナーＤＮＡ分子を宿主細胞ゲノムの所定の部位に一方向に組み込み、ドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡカセットを、組込み部位が存在する宿主ゲノム上のＤＮＡカセットとの正確な交換を可能にする。ＤＮＡカセットは、少なくとも１つの選択マーカー（ただし、特定の２ベクターＲＭＣＥの例では、本明細書で概説するように「分割選択マーカー」を使用できる）、および／または少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを特徴とする。ＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバーイベントを伴う。ＲＭＣＥは、ＳＯＩまたは選択マーカーのコピーを宿主細胞ゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。たった１回のクロスオーバーイベントを伴う組換えとは異なり、ＲＭＣＥは、原核生物のベクター配列が宿主細胞のゲノムに導入されないように実行できるため、宿主の免疫または防御機構の望ましくないトリガーを低減および／または防止する。ＲＭＣＥの手順を、複数のＤＮＡカセットで繰り返し得る。
特定の実施形態では、標的化組込みは、少なくとも１つの外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含む１つの外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる１つの交差組換え事象によって達成される。特定の実施形態では、標的化組込みは、１回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーを含むＤＮＡカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組込みは、２回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーをそれぞれ含む、２つの異なるＤＮＡカセットがいずれも、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組込みは、複数回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーをそれぞれ含む、複数のベクター由来のＤＮＡカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、選択マーカーは、両方のＲＭＣＥの組込みが選択マーカーの発現を可能にするように、第１のベクター上で部分的にコードされ、第２のベクター上で部分的にコードされ得る。このようなシステムの例を図４に示す。
特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介性組換えを介した標的化組込みは、原核生物ベクターに由来し、宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の組込み部位に組み込まれる、選択マーカーまたは１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介性組換えを介した標的化組込みは、原核生物ベクターからの配列を含まない宿主細胞ゲノムの１つ以上の所定の組込み部位に組み込まれる、選択マーカーまたは１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。
５．２ 相同組換え、ＨＤＲまたはＮＨＥＪを介した標的化組込み
本開示の主題はまた、相同組換えによって、または外因性部位特異的ヌクレアーゼとそれに続くＨＤＲもしくはＮＨＥＪによって媒介される標的化組込みに関する。
相同組換えは、広範な配列相同性を共有するＤＮＡ分子間の組換えである。それは、二本鎖ＤＮＡ切断のエラーのない修復を誘導するために使用することができ、減数分裂中に配偶子の配列多様性を生成する。相同組換えは、２つの相同ＤＮＡ分子間の遺伝情報の交換を伴うので、染色体上の遺伝子の全体的な配置を変化させるわけではない。相同組換えの間、ニックまたは切断が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に形成され、続いて一本鎖ＤＮＡ末端による相同ｄｓＤＮＡ分子の侵入、相同配列の対形成、ホリディジャンクションを形成するための分岐移動、および最終的なホリディ接合部の分離が起こる。
二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ＤＮＡ損傷の最も深刻な形態であり、そのようなＤＮＡ損傷の修復は、全ての生物におけるゲノム完全性の維持に不可欠である。ＤＳＢを修復するためには２つの主な修復経路がある。第１の修復経路は相同組換え修復（ＨＤＲ）経路であり、相同組換えはＨＤＲの最も一般的な形態である。ＨＤＲは細胞内に存在する相同ＤＮＡの存在を必要とするので、この修復経路は通常、細胞周期のＳ期およびＧ２期において活性であり、新しく複製された姉妹染色分体が相同鋳型として利用可能である。ＨＤＲはまた、ＤＮＡ複製中に崩壊した複製フォークを修復するための主要な修復経路である。ＨＤＲは、比較的エラーのない修復経路と考えられている。ＤＳＢの第２の修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。ＮＨＥＪは、相同ＤＮＡ鋳型を必要とせずに、切断されたＤＮＡの末端が一緒に連結される修復経路である。
標的化組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼに続いてＨＤＲによって促進され得る。これは、特定の標的ゲノム部位にＤＳＢを導入することにより、相同組換えの頻度を高めることができるためである。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓおよびＴＡＬＥＮシステムは、最も容易な構築および高効率を提供する２つのゲノム編集ツールである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、侵入バクテリオファージに対する細菌の免疫防御機構として同定された。Ｃａｓは、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって誘導されると、細胞内の特定のヌクレオチド配列と会合し、例えば一本鎖切断、ＤＳＢ、および／または点突然変異の１つまたは複数を行なうことによって、そのヌクレオチド配列内またはその周囲のＤＮＡを編集し得るヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであり、ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）のＤＮＡ結合ドメインおよび制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインから構成される。ＤＮＡ結合ドメインのモノマーの高度可変残基領域に存在するアミノ酸を変化させることによって、様々なヌクレオチド配列を標的とする異なる人工ＴＡＬＥＮを作製することができる。ＤＮＡ結合ドメインはその後、ヌクレアーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを作成する。
相同組換えまたはＨＤＲによる標的化組込みは、組込み部位に対する相同配列の存在を含む。特定の実施形態では、相同配列は、ベクター上に存在する。特定の実施形態では、相同配列は、ポリヌクレオチド上に存在する。
特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのベクターは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と相同なヌクレオチド配列、または少なくとも１つの選択マーカーに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのベクターは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子、または少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する配列番号１～７から選択される配列に相同のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのベクターは、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのベクターは、ＤＮＡカセットに隣接するＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩとを含む。特定の実施形態では、ベクターヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子に対して、または配列番号１～７から選択される配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、およびプラスミドからなる群から選択される。
特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのポリヌクレオチドは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子、または少なくとも１つの選択マーカーに隣接する配列番号１～７から選択される配列に相同なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのポリヌクレオチドは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ ２、ＭＴＭＲ ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子、または少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する配列番号１～７から選択される配列に相同なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのポリヌクレオチドは、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー、および少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのポリヌクレオチドは、ＤＮＡカセットに隣接するＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子に少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、隣接ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子、または配列番号１～７から選択される配列に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
特定の実施形態では、相同組換えは、補助因子を何ら用いることとなく実施される。特定の実施形態では、相同組換えは、組込み可能なベクターの存在によって促進される。特定の実施形態では、組込みベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよび組込みファージベクターからなる群から選択される。
５．３ 調節された標的化組込み
主にコードされるタンパク質が発現しにくいために、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多い。発現困難なタンパク質の発現レベルが低いのは、原因が多様であり、原因を特定するのが困難であり得る。１つの可能性は、宿主細胞中で発現するタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現系を使用して、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある毒性タンパク質を発現させることができる。これらの系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないが、テトラサイクリンまたはその類似体、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）などの小分子が培養物に添加された場合にのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用を軽減することができ、培養物が産生前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。特定の実施形態では、調節された標的化組込み（ＲＴＩ）システムは、特定の遺伝子座、例えば１つ以上のＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに作動可能に連結された調節プロモーター下で転写されるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＲＴＩシステムを使用して、限定されないが、抗体などの発現困難分子の低タンパク質発現の根本原因を決定することができる。特定の実施形態では、ＲＴＩシステムにおけるＳＯＩの発現を選択的に停止する能力を使用して、ＳＯＩの発現を観察された有害作用に結び付けることができる。
特定の実施形態では、発現困難な分子の根本原因分析における転写および細胞株多様性の影響を最小限に抑えるために、調節された標的化組込み（ＲＴＩ）システムが使用され得る。例えば、限定するものではないが、ＴＩ宿主におけるＳＯＩの発現は、調節因子、例えばドキシサイクリンの培養物への添加によって誘導され得る。特定の実施形態では、ＲＴＩベクターは、テトラサイクリン調節プロモーターを利用してＳＯＩを発現し、これは、例えば、ＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込むことができ、ＲＲＳ自体は宿主細胞のゲノム内の組込み部位に組み込まれ、ＳＯＩの調節された発現を可能にする。
特定の実施形態では、本開示に記載されるＲＴＩシステムを使用して、対照細胞株と比較して、ＳＯＩ、例えば治療用抗体の低タンパク質発現の根本原因が首尾よく決定され得る。特定の実施形態では、ＲＴＩ細胞株におけるＳＯＩ、例えば治療用抗体の発現が相対的に低いことが確認されると、タンパク質翻訳阻害剤処理、例えばＤｏｘおよびシクロヘキシミドを活用することによって、ＳＯＩの細胞内蓄積および分泌レベルが評価され得る。
５．４調節されたシステム
本開示の主題はまた、ＴＩで使用するための調節されたシステムに関する。例えば、限定するものではないが、そのような調節は、転写抑制因子または活性化因子と構成的または最小プロモーターとの調節されたカップリングによってｍＲＮＡ合成を遮断または活性化するための遺伝子スイッチに基づき得る。特定の非限定的な実施形態では、抑制は、例えば、タンパク質が転写開始を立体的にブロックするリプレッサータンパク質に結合することによって、または転写サイレンサーを介して転写を能動的に抑制することによって達成され得る。特定の非限定的な実施形態では、哺乳動物またはウイルスのエンハンサーレス最小プロモーターの活性化は、活性化ドメインへの調節されたカップリングによって達成され得る。
特定の実施形態では、転写抑制因子または転写活性化因子の条件的カップリングは、外部刺激に応答してプロモーターに結合するアロステリックタンパク質を使用することによって達成され得る特定の実施形態では、転写抑制因子または転写活性化因子の条件付きカップリングは、隔離タンパク質から放出されることで、標的プロモーターに結合し得る細胞内受容体を使用することによって達成され得る。特定の実施形態では、転写抑制因子または転写活性化因子の条件付きカップリングは、化学的に誘導された二量体化剤を使用することによって達成され得る。
特定の実施形態では、本開示のＴＩ系で使用されるアロステリックタンパク質は、抗生物質、細菌クオラムセンシングメッセンジャー、異化産物、または温度、例えば低温もしくは熱などの培養パラメータに応答して転写活性を調節するタンパク質であり得る。特定の実施形態では、そのようなＲＴＩシステムは、例えば、代替炭素源の異化遺伝子を抑制する細菌抑制因子が哺乳動物細胞に移入されている異化産物に基づくものであり得る。特定の実施形態では、標的プロモーターの抑制は、リプレッサーＣｙｍＲのクマート（ｃｕｍａｔｅ）応答性結合によって達成され得る。ある特定の実施形態では、異化産物に基づくシステムは、単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化ドメインに融合した、原核生物リプレッサーＨｄｎｏＲの６－ヒドロキシニコチン応答性結合によるキメラプロモーターの活性化に依存し得る。
特定の実施形態では、ＴＩシステムは、クオラムセンシング分子による集団内および集団間のコミュニケーションを管理する原核生物に由来するクオラムセンシングベースの発現系であり得る。これらのクオラムセンシング分子は、標的細胞中の受容体に結合し、同族プロモーターに対する受容体の親和性を調節し、特異的レギュロンスイッチの開始をもたらす。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、Ｎ－（３－オキソ－オクタノイル）－ホモセリンラクトンであり得、その存在下で、ＴｒａＲ－ｐ６５融合タンパク質が、ＴｒａＲ特異的オペレータ配列に融合した最小プロモーターからの発現を活性化する。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）ＳＣＢ１の非存在下でその同族オペレータＯＳｃｂＲに結合するＳｃｂＲリプレッサーに基づく系におけるブチロラクトンＳＣＢ１（ラセミ体２－（１’－ヒドロキシ－６－メチルヘプチル）－３－（ヒドロキシメチル）ブタノリド）であり得る。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ＲＴＩシステムで使用されるホモセリン由来誘導因子であり得、緑膿菌クオラムセンシング抑制因子ＲｈｌＲおよびＬａｓＲがＳＶ４０ Ｔ抗原核局在化配列および単純ヘルペスＶＰ１６ドメインに融合され、特定のオペレータ配列（ｌａｓボックス）を含むプロモーターを活性化し得る。
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムで使用されるアロステリックタンパク質を調節する誘導分子は、クマート、イソプロピル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、マクロライド、６－ヒドロキシニコチン、ドキシサイクリン、ストレプトグラミン、ＮＡＤＨ、テトラサイクリンであり得るが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムで使用される細胞内受容体は、細胞質または核受容体であり得る。特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、小分子を使用することにより、タンパク質の捕捉および阻害からの転写因子の放出を利用し得る。特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、ステロイド調節に依存し得、ホルモン受容体は、サイトゾルにおいてＨＳＰ９０から放出され得る天然または人工の転写因子に融合され、核内に移動し、選択されたプロモーターを活性化する。特定の実施形態では、内因性ステロイドホルモンによるクロストークを回避するために、合成ステロイド類似体によって調節される変異体受容体を使用し得る。特定の実施形態では、受容体は、４－ヒドロキシタモキシフェンに応答性のエストロゲン受容体バリアントまたはＲＵ４８６によって誘導可能なプロゲステロン受容体変異体であり得る。特定の実施形態では、ヒト核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に基づく核受容体由来ロシグリタゾン応答性転写スイッチが、本開示のＲＴＩシステムで使用され得る。特定の実施形態では、ステロイド応答性受容体のバリアントは、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈであり得、改変されたＣｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａエクジソン受容体およびＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６トランス活性化因子に融合されたマウスレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に基づく。合成エクジソンの存在下では、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈバリアントは、Ｇａｌ４応答エレメントのいくつかの反復配列に融合した最小プロモーターに結合し、これを活性化し得る。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩシステムは、同族オペレータと融合した最小コアプロモータの活性化のために、ＤＮＡ結合タンパク質の化学的に誘導された二量体化および転写活性化因子を利用し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩシステムは、ＦＲＢとＦＫＢＰのラパマイシン調節二量体化を利用し得る。この系では、ＦＲＢはｐ６５トランス活性化因子に融合され、ＦＫＢＰは、操作された最小インターロイキン－１２プロモーターの上流に配置される同族オペレータ部位に特異的なジンクフィンガードメインに融合される。特定の実施形態では、該ＦＫＢＰは変異され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩシステムは、細菌ジャイレースＢサブユニット（ＧｙｒＢ）を利用し得、ＧｙｒＢは抗生物質クーママイシンの存在下で二量体化し、ノボビオシンで解離する。
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、調節されたｓｉＲＮＡ発現のために使用され得る。特定の実施形態では、調節されたｓｉＲＮＡ発現システムは、テトラサイクリン、マクロライド、またはＯＦＦ型およびＯＮ型ＱｕｏＲｅｘ系であり得る。特定の実施形態では、ＲＴＩシステムは、５’非翻訳領域にヘアピン構造を形成することによって翻訳開始をブロックするＸｅｎｏｐｕｓ末端オリゴピリミジン要素（ＴＯＰ）を利用し得る。
特定の実施形態では、本開示に記載されるＲＴＩシステムは、気相制御発現、例えばアセトアルデヒド誘導調節（ＡＩＲ）システムを利用し得る。ＡＩＲシステムは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのＡｌｃＲ転写因子を使用し得、非毒性濃度の気体または液体のアセトアルデヒドの存在下で、最小ヒトサイトメガロウイルスのプロモーターに融合したＡｌｃＲ特異的なオペレータから組み立てられたＰＡＩＲプロモーターを特異的に活性化する。
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、Ｔｅｔ－ＯｎまたはＴｅｔ－Ｏｆｆシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、１つ以上のＳＯＩの発現は、テトラサイクリンまたはその類似体であるドキシサイクリンによって調節され得る。
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、ＰＩＰオンまたはＰＩＰオフシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、ＳＯＩの発現は、例えば、プリスチナマイシン、テトラサイクリンおよび／またはエリスロマイシンによって調節され得る。
６． ＴＩ宿主細胞の調製および使用
本開示の主題は、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのための方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、外因性ヌクレオチド配列を宿主細胞に組み込み、その後のＳＯＩの標的化組込みに適した宿主細胞を産生することに関する。特定の実施形態では、前記方法は、リコンビナーゼ媒介組換えを含む。特定の実施形態では、前記方法は、相同組換え、ＨＤＲおよび／またはＮＨＥＪを含む。
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の同じ宿主細胞へのランダム組込みと組み合わせた、外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への標的化組込み法に関する。特定の実施形態では、方法は、同一または異なるＳＯＩのランダム組込みと組み合わせて、ＳＯＩのその後の標的化組込みに適した宿主細胞を産生するための、外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への組込みに関する。特定の実施形態では、方法は、リコンビナーゼ媒介組換えを含む。特定の実施形態では、前記方法は、相同組換え、ＨＤＲおよび／またはＮＨＥＪを含む。
６．１ リコンビナーゼ媒介組換えを用いたＴＩ宿主細胞の調製
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程；ｂ）ａ）で供給される細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入する工程；ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第１のＤＮＡカセットを含む工程、ｂ）ａ）で供給された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第２のＤＮＡカセットを含むベクターを導入する工程、ｃ）リコンビナーゼを導入する工程であって、そのリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを１回実施する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第１のＤＮＡカセットを含む工程、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第２のＤＮＡカセットを含むベクターを導入する工程、ｃ）リコンビナーゼを導入する工程であって、そのリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを１回実施する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的である工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入する工程、ｃ）ａ）で供給される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを導入する工程、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼを導入する工程、ならびにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、第１のＳＯＩによって上流に隣接し、ＲＲＳによって下流に配置されたコドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的である工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入する工程、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入する工程、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼを導入する工程、ならびにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、第１のＳＯＩによって上流に隣接し、ＲＲＳによって下流に配置されたコドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含む第１のＤＮＡカセットを含み、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、第２のＤＮＡカセットを含む第１のベクターを導入する工程であって、その第２のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む工程、ｃ）ａ）で供給される細胞中に、第３のＤＮＡカセットを含む第２のベクターを導入する工程であって、その第３のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む工程、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入する工程であって、その１つ以上のリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを２回実施する工程、ならびにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、第１のＳＯＩによって上流に隣接し、ＲＲＳによって下流に配置されたコドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
特定の実施形態では、本開示は、第１および第２の目的ポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含む第１のＤＮＡカセットを含み、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、第２のＤＮＡカセットを含む第１のベクターを導入する工程であって、その第２のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む工程、ｃ）ａ）で供給される細胞中に、第３のＤＮＡカセットを含む第２のベクターを導入する工程であって、その第３のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む工程、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入する工程であって、その１つ以上のリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを２回実施する工程、ならびにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、第１のＳＯＩによって上流に隣接し、ＲＲＳによって下流に配置されたコドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するようにＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
本開示の主題はまた、目的のポリペプチドを産生する方法に関し、該方法は、ａ）本明細書に記載のＴＩ宿主細胞を供給する工程、ｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下でａ）のＴＩ宿主細胞を培養する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、３つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程であって、そのベクターの第１のＲＲＳが組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳとマッチし、そのベクターの第２のＲＲＳが組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の選択マーカーが第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する工程、ｃ）リコンビナーゼを導入する工程であって、そのリコンビナーゼが、ベクターおよび組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の両方の第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを認識する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ宿主細胞を選択することによって、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、園との標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、該方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、３つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程であって、そのベクターの第１のＲＲＳが組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳとマッチし、そのベクターの第２のＲＲＳが組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の選択マーカーが第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する工程、ｃ）リコンビナーゼを導入する工程であって、そのリコンビナーゼが、ベクターおよび組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の両方の第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳを認識する工程、ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ宿主細胞を選択することによって、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
６．２ 相同組換え、ＨＤＲまたはＮＨＥＪを使用した宿主細胞の標的化修飾方法
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同である工程、ｂ）ベクターをＴＩ宿主細胞中に導入する工程であって、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む工程、ｃ）選択マーカーを選択し、ゲノム遺伝子座中に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して目的のポリペプチドを発現させる工程を含む。特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程、ｂ）ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入する工程であって、そのポリヌクレオチドが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む工程、ｃ）選択マーカーを選択し、ゲノム遺伝子座中に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して目的のポリペプチドを発現させる工程を含む。特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
特定の実施形態では、相同組換えは、組込みベクターによって促進される。特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、およびプラスミドからなる群から選択される。特定の実施形態では、トランスポゾンは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムであり得る。
特定の実施形態では、組込みは、外因性ヌクレアーゼによって促進される。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程、ｂ）ベクターをＴＩ宿主細胞中に導入する工程であって、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーを含む工程、ｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程、ｂ）ポリヌクレオチドをＴＩ宿主細胞中に導入する工程であって、そのポリヌクレオチドが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーを含む工程、ｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程、ｂ）ベクターを宿主細胞中に導入する工程であって、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳおよび少なくとも１つの選択マーカーが第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する工程、ならびにｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程、ｂ）ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入する工程であって、そのポリヌクレオチドが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳおよび少なくとも１つの選択マーカーが第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する工程、ならびにｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組込みに適したＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その１つ以上の遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼまたはＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、ならびに第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その１つ以上の遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的である工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、少なくとも１つの組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入する工程、ｃ）ａ）で供給される細胞中に、少なくとも１つの組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを導入する工程、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼ、またはＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入する工程、ならびにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、少なくとも１つの第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、第１のＳＯＩによって上流に隣接し、ＲＲＳによって下流に配置されたコドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その１箇所以上の遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が１つ以上のＲＲＳを含む工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入する工程、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼまたはＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程、ならびにｄ）誘導物質の存在下で外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させる方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内に組み込まれた２つのＲＲＳおよび調節可能なプロモーターに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である工程、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下で細胞を培養する工程を含む。
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一であっても異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、該方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、その遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的である工程、ｂ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入する工程、ｃ）ａ）で供給される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第２のＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入する工程、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼ、またはＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入する工程、ならびにｅ）誘導物質の存在下で少なくとも第１の外因性ＳＯＩおよび第２の外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、第１のＳＯＩによって上流に隣接し、ＲＲＳによって下流に配置されたコドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
７． 産物
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子、例えば目的のポリペプチドの発現のために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用され得る。このようなポリペプチドの非限定的な例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、および抗体が挙げられる。特定の実施形態では、該抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、該抗体は、治療用抗体である。ある特定の実施形態では、該抗体は、診断用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
特定の実施形態では、本明細書における定義に包含されるポリペプチドの例としては、例えば、レニン等の哺乳類ポリペプチド；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；レプチン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファおよび－ベータ；腫瘍壊死因子受容体、例えば、細胞死受容体５およびＣＤ１２０；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂ－リンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）；増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現および分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）；血管内皮成長因子ファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰ１ＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｄ、およびそれらの二量体）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、およびＦＧＦ９；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子受容体、例えば、ＶＥＧＦ受容体（複数可）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４ 受容体）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＰＤＧＦＲ－αおよびＰＤＧＦＲ－β）、ならびに線維芽細胞増殖因子受容体（複数可）；ＴＩＥリガンド（アンジオポイエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）、アンジオポイエチン受容体、例えば、ＴＩＥ１およびＴＩＥ２；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－５、もしくはニューロトロフィン－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－ｂ；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦ－ベータ；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ－ＩおよびＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、およびＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、およびインターフェロン－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＧ－ＣＳＦ；サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；ミッドカイン；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、およびＶＣＡＭ；エフリン；Ｂｖ８；デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）；Ｄｅｌ－１；ＢＭＰ９；ＢＭＰ１０；フォリスタチン；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）；Ａｌｋ１；Ｒｏｂｏ４；ＥＳＭ１；パールカン；ＥＧＦ様ドメインマルチプル７（ＥＧＦＬ７）；ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー；トロンボスポンジン、例えば、トロンボスポンジン１およびトロンボスポンジン２；コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＸＶＩＩＩ；ニューロピリン、例えば、ＮＲＰ１およびＮＲＰ２；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；Ｎｏｔｃｈタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ４；セマフォリン、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、およびＳｅｍａ３Ｆ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）；イムノアドヘシン；ならびに上述のポリペプチドのいずれかの断片および／またはバリアント、ならびに例えば、上述のタンパク質のいずれかを含む１つ以上のタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられる。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性または多重特異性ポリペプチド、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体の様々な分子形式が当該技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。本明細書に同様に含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント構成成分、たとえば、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるためのＣＤ３に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。二重特異性抗体形式の更なる例としては、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーにより融合された、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号および国際公開第２００８／１１９５６７号、ＮａｇｏｒｓｅｎおよびＢａｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照のこと）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９，２９９－３０５（１９９６））およびその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定化のための、Ｃ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、および、全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子である、いわゆるトリオマブ（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３６，４５８－４６７（２０１０）で確認される）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、具体的なＴ細胞二重特異性抗体形式は、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、構成的にまたは調節して、目的の治療用タンパク質または分子を発現させながら、シャペロン、タンパク質修飾酵素、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡまたは他のタンパク質もしくはペプチド発現のために使用し得る。
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現するポリペプチドは、いずれかのタンパク質、例えば、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ １１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、およびＴＨＰＯ．ｋからなる群から選択されるサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、およびサイトカイン受容体を含むが、これらに限定されないタンパク質に結合し、またはそれと相互作用する場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞による発現されるポリペプチドは、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、およびＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、またはケモカイン関連タンパク質に結合し、または相互作用する場合がある。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現されるポリペプチドは、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（すなわち、卵巣癌抗原）、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；アミロイドベータ；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＳＬＧ６５９；ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体；ＢＬｙＳ受容体３；ＢＲ３；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；ブレビカン；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１－３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）；ＳＬＣ；エクソダス－２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α；免疫グロブリン関連アルファ；Ｂ細胞特異的タンパク質）；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン－７）；ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ；ＭＩＣＬ；およびＤＣＡＬ２）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；補体因子Ｄ；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ；ＣＲ１；ＣＲＧＦ；ＣＲＩＰＴＯ；ＴＤＧＦ１；奇形腫由来増殖因子）；ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１；Ｇタンパク質共役受容体）；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ１６（ＬＡＴ１；ＳＬＣ７Ａ５）；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥｐｈＢ２Ｒ；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）；ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）；ＳＰＡＰ１Ｂ；ＳＰＡＰ１Ｃ）；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（イプシロン）；ＦＩＬｌ（ゼータ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ－アルファ１；ＧＦＲ－アルファ－１）；ＧＥＤＡ；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ－ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミンおよびヒスタミン受容体；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ－ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ－ｌ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ－１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２；ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０Ｒα；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ－２２ｃ；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；インフルエンザＡ型；インフルエンザＢ型；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；
ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７およびαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＧＰＲ４９；ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）；ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体；遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７；ＲＩＧ－Ｅ；ＳＣＡ－２；ＴＳＡ－１）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体；遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ；ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体；遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧまたはＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ－２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ－６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ；ＭＳＬＮ；ＳＭＲ；巨核球増強因子；メソテリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４；仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）；、ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ、ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；ＯＸ４０；Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド依存性イオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ；Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ；ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２；ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ－ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復配列（１型および１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）および短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様および２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１；トモレグリン－１）；ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質；膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０；ＦＬＪ２００４１；ＴＲＰＭ４；ＴＲＰＭ４Ｂ；一過性受容体電位カチオンチャネル；サブファミリーＭ；メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬＣ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；および／またはＺＦＰＭ２に結合し、またはそれと相互作用する場合がある。
特定の実施形態では、本明細書に開示した細胞および方法により産生される抗体（または二重特異性抗体）の標的分子としては、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）、またはＨｓ．７３７９２）；ＣＤ３３；ＣＤ３４；ＣＤ６４；ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）；ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９）など；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体など；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、およびアルファｖ／ベータ３インテグリン、そのアルファまたはベータサブユニットのいずれかを含むもの（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）など；成長因子、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃなど；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、インターロイキン、例えば、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ１７ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥなど；血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ－４、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどが挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法を使用して、補体タンパク質Ｃ５（例えば、ヒトＣ５に特異的に結合する抗Ｃ５アゴニスト抗体）に特異的に結合する抗体（または多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体）を産生し得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、インフルエンザウイルスＢ赤血球凝集素、すなわち、「ｆｌｕＢ」に特異的に結合する抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、インフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａ系統に由来する赤血球凝集素と結合する抗体、インフルエンザＢウイルスのビクトリア系統に由来する赤血球凝集素と結合する抗体、インフルエンザＢウイルスの祖先系統に由来する赤血球凝集素と結合する抗体、またはインフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａ系統、ビクトリア系統、および祖先系統に由来する赤血球凝集素とインビトロおよび／またはインビボで結合する抗体）を産生するために使用され得る。抗ＦｌｕＢ抗体に関する更なる詳細は国際公開第２０１５／１４８８０６号で開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法により産生される抗体（または二重特異性抗体）は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１またはＬＲＰ－８またはトランスフェリン受容体、ならびに、ベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、アルファ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、タウセクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイドベータペプチド、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ｐ７５ ＮＴＲ、ＣＤ４０、およびカスパーゼ－６からなる群から選択される少なくとも１つの標的に結合する。
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法により産生される抗体は、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体はＲＧ７８７６である。
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法により産生されるポリペプチドは、標的化免疫サイトカインである。特定の実施形態では、標的化免疫サイトカインはＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態では、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインはＲＧ７８１３である。特定の実施形態では、標的化免疫サイトカインはＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態では、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインはＲＧ７４６１である。
特定の実施形態では、明細書で提供する方法により産生される本明細書において提供する細胞または方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＣＥＡ、および少なくとも１つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供する方法により産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、腫瘍標的化サイトカインおよび少なくとも１つの追加の標的分子と結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供する方法により産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ２ｖ（すなわち、インターロイキン２バリアント）に融合され、ＩＬ１系免疫サイトカイン、および少なくとも１つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供する方法により産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、Ｔ細胞二重特異性抗体（すなわち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーまたはＢｉＴＥ）である。
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法により産生される産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ－１アルファおよびＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１２およびＩＬ－１Ｓ；ＩＬ－１３およびＩＬ－９；ＩＬ－１３およびＩＬ－４；ＩＬ－１３およびＩＬ－５；ＩＬ－５およびＩＬ－４；ＩＬ－１３およびＩＬ－１ベータ；ＩＬ－１３およびＩＬ－２５；ＩＬ－１３およびＴＡＲＣ；ＩＬ－１３およびＭＤＣ；ＩＬ－１３およびＭＥＦ；ＩＬ－１３およびＴＧＦ－～；ＩＬ－１３およびＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１２およびＴＷＥＡＫ；ＩＬ－１３およびＣＬ２５；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３およびＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３およびＡＤＡＭＳ；ＩＬ－１３およびＰＥＤ２；ＩＬ１７ＡおよびＩＬ１７Ｆ；ＣＥＡおよびＣＤ３；ＣＤ３およびＣＤ１９；ＣＤ１３８およびＣＤ２０；ＣＤ１３８およびＣＤ４０；ＣＤ１９およびＣＤ２０；ＣＤ２０およびＣＤ３；ＣＤ３ＳおよびＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３ＳおよびＣＤ２０；ＣＤ３ＳおよびＣＤ４０；ＣＤ４０およびＣＤ２０；ＣＤ－ＳおよびＩＬ－６；ＣＤ２０およびＢＲ３；ＴＮＦアルファおよびＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１ベータ；ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－３、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－４、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－５、ＴＮＦアルファおよびＩＬ６、ＴＮＦアルファおよびＩＬ８、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－９、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１０、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１１、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１２、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１３、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１４、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１５、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１６、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１７、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１８、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－１９、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２０、ＴＮＦアルファおよびＩＬ－２３、ＴＮＦアルファおよびＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファおよびＣＤ４、ＴＮＦアルファおよびＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファおよびＭＩＦ、ＴＮＦアルファおよびＩＣＡＭ－１、ＴＮＦアルファおよびＰＧＥ４、ＴＮＦアルファおよびＰＥＧ２、ＴＮＦアルファおよびＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファおよびＴｅ３８、ＴＮＦアルファおよびＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファおよびＣＤ２２、ＴＮＦアルファおよびＣＴＬＡ－４、ＴＮＦアルファおよびＧＰ１３０、ＴＮＦａおよびＩＬ－１２ｐ４０、ＶＥＧＦおよびアンジオポエチン、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－ＡおよびＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－ＡおよびＰＤＧＦ、ＨＥＲ１およびＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡおよびＡＮＧ２、ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ、ＨＥＲ２およびＤＲ５、ＶＥＧＦおよびＩＬ－８、ＶＥＧＦおよびＭＥＴ、ＶＥＧＦＲおよびＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲおよびＭＥＴ、ＶＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ、ＨＥＲ２およびＣＤ６４、ＨＥＲ２およびＣＤ３、ＨＥＲ２およびＣＤ１６、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）およびＨＥＲ２、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ３、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ４、ＩＬ－１４およびＩＬ－１３、ＩＬ－１３およびＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４およびＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ－１Ｒ、ＴＮＦＲ１およびＩＬ－６ＲならびにＴＮＦＲ１およびＩＬ－１８Ｒ、ＥｐＣＡＭおよびＣＤ３、ＭＡＰＧおよびＣＤ２８、ＥＧＦＲおよびＣＤ６４、ＣＳＰＧｓおよびＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ－４およびＢＴＮ０２；ＩＧＦ１およびＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２およびＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧおよびＲＧＭ Ａ；ＮｇＲおよびＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡおよびＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐおよびＲＧＭ Ａ；ＰＯＬ－ｌおよびＣＴＬＡ－４；ならびにＲＧＭ ＡおよびＲＧＭ Ｂから選択される少なくとも２つの標的分子に結合する。
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法より産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＲＧ７８０２である。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関する更なる詳細は、国際公開第２０１４／１２１７１２号に提供されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。
特定の実施形態では、本明細書にて開示した方法により作製した多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体二重特異性抗体はＣｒｏｓｓｍａｂである。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体はＲＧ７７１６である。
特定の実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体はＲＧ７２２１である。特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体はＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。
他の多くの抗体および／または他のタンパク質が、本開示においては宿主細胞によって発現されてよく、上記の一覧は限定的であることを意味しない。
本開示の宿主細胞は、製造規模での目的の分子の製造に使用され得る。治療用タンパク質または他のタンパク質の「製造規模」での生産は、生産されるタンパク質および必要性に応じて、約４００Ｌ～約８０，０００Ｌの範囲の細胞培養物を利用する。通常、そのような製造規模での生産は、約４００Ｌ～約２５，０００Ｌの細胞培養サイズを利用する。この範囲内で、４，０００Ｌ、約６，０００Ｌ、約８，０００、約１０，０００、約１２，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、または約１６，０００Ｌなどの特定の細胞培養サイズが利用されてもよい。
特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性または多重特異性ポリペプチド、例えば二重特異性抗体である。
本開示の宿主細胞は、現在の細胞培養法で使用されている非ＴＩ細胞と比較して、より短い時間枠で、目的の分子を、大量に産生するのに用いることができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、現在の細胞培養法で使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の品質を改善するために用いられ得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、細胞ストレスおよびクローン不安定性を経時的に引き起こし得る産物によって引き起こされ得る慢性毒性を防止することによってシードトレイン安定性を高めるために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、急性毒性産物の最適発現に使用され得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞、ＴＩシステムは、細胞培養プロセスの最適化および／またはプロセス開発に使用され得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、従来の細胞培養方法で使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の産生を約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、または約１０週間早め得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、従来の細胞培養方法で使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の採取を約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、または約１０週間早め得る。
特定の実施形態では、本実施形態の宿主細胞は、従来の細胞培養方法に使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的分子の凝集レベルを減少させるために用いられ得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、ランダム組込み宿主細胞と比較して、目的のポリペプチド（またはポリペプチド）の発現の増加を達成し得る。例えば、限定するものではないが、本開示の宿主細胞は、少なくとも３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌまたはそれを超える力価での標準抗体および半抗体の発現、ならびに少なくとも１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌまたはそれを超える力価で多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体の発現を達成し得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ランダム組込み宿主細胞と比較して、二重特異性含有量の増加を達成し得る。例えば、限定するものではないが、本開示の宿主細胞は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％またはそれを超える二重特異性含有量を達成し得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を、治療分子の選択されたサブユニットの構成的発現および同じ治療分子の他の異なるサブユニットの調節された発現のために使用し得る。特定の実施形態では、治療分子は、融合タンパク質であり得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、完全に組み立てられた抗体分子の発現および分泌における各抗体サブユニットの役割および効果を理解し得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、調査ツールとして使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、様々な細胞における問題のある分子の低タンパク質発現の根本原因を突き止めるための診断ツールとして使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を使用して、観察された現象または細胞挙動を細胞における導入遺伝子発現に直接結び付け得る。本開示の宿主細胞はまた、観察された挙動が細胞において可逆的であるか否かを実証するために使用され得る。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を利用して、細胞における導入遺伝子の転写および発現に関する問題を同定および緩和し得る。
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、発現困難な分子の導入遺伝子サブユニット、例えば、これらに限定されないが、抗体のＨＣおよびＬＣサブユニットなどを、ＴＩシステム中の平均分子のものと交換して、問題となるサブユニットを同定するために使用され得る。特定の実施形態では、次いで、アミノ酸配列分析を使用して、低タンパク質発現に関与し得るアミノ酸残基または領域を絞り、それに焦点を合わせ得る。
８． 例示的な非限定的実施形態
Ａ．標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞であって、前記宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の組込み部位に組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含み、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる標的化組込み（ＴＩ）宿主細胞。
Ａ１． 組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０～４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０～２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１～４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３～７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１～３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３～２６６２０５４またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４～９７７０５と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２． 組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０５からの少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対の配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ３． 組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ４． 組み込まれた外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６からの少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対の配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ５． 組み込まれた標的化外因性ヌクレオチド配列が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、Ａ～Ａ４のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ６． ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内の組込み部位に組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列、ならびにランダム組込み外因性核酸配列を含む、ＴＩ宿主細胞であって、前記ランダム組込み配列が、宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる、ＴＩ宿主細胞。
Ａ７． ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子に作動可能に連結された組込み部位に組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列、ならびにランダム組込み外因性核酸配列を含み、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる、ＴＩ宿主細胞。
Ａ８． 配列番号１～７から選択される配列に少なくとも約９０％相同な配列およびランダム組込み外因性核酸配列からなる群から選択される配列の全部または一部に直接隣接する組込み部位に組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞であって、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる、ＴＩ宿主細胞。
Ａ９． ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、Ａ～Ａ８のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１０． ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ａ９に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１１． ＴＩ宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ａ９またはＡ１０に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１２． 標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、該ＲＲＳがリコンビナーゼによって認識され得る、Ａ～Ａ１１のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１３． 標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が少なくとも２つのＲＲＳを含む、Ａ１２に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１４． リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、Ａ１２またはＡ１３に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１５． リコンビナーゼがＢｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、Ａ１２またはＡ１３に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１６． ＲＲＳが、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰＬ３配列、ＬｏｘＰ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される、Ａ１２～Ａ１５のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１７． 標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーとを含む、Ａ１３～Ａ１６のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ１８． 第１の選択マーカーを含み、該第１の選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸からなる群から選択される、Ａ１７に記載のＴＩ細胞。
Ａ１９． 第２の選択マーカーをさらに含み、前記第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが異なる、Ａ１７またはＡ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２０． 第２の選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸からなる群から選択される、Ａ１９に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２１． 第３の選択マーカーおよび内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み、前記ＩＲＥＳが、前記第３の選択マーカーに作動可能に連結される、Ａ１９またはＡ２０に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２２． 第３の選択マーカーが第１または第２の選択マーカーと異なる、Ａ２１のＴＩ宿主細胞。
Ａ２３． 第３の選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、改良型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－モノマーマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される、Ａ２１またはＡ２２に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２４． 標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、第３のＲＲＳをさらに含み、第３のＲＲＳが第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、第３のＲＲＳが、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳと比較して異種特異的である、Ａ１７～Ａ２３のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２５． 標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの選択マーカーおよび少なくとも１つの外因性目的配列（ＳＯＩ）を含む、Ａ１２～Ａ２４のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２６． 標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、Ａ１２～Ａ２５のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２７． 標的化組込み外因性ＳＯＩが、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する、Ａ２６に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２８． 標的化組込みＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ａ２６またはＡ２７に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ２９． 標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩ、および第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの標的化組込み統合外因性ＳＯＩをさらに含む、Ａ２４～Ａ２８のいずれか１つに記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ３０． 標的化組込みＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ａ２９に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ３１． 標的化組込みＳＯＩが、ランダム組込み宿主細胞と比較してより高いレベルで発現される抗体をコードする、Ａ２６に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ３２． 抗体が、少なくとも３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、またはそれを超える力価で発現される標準抗体または半抗体である、Ａ３１に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ３３． 抗体が、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌの力価で発現される多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である、Ａ３１に記載のＴＩ宿主細胞。
Ａ３４． 抗体が二重特異性抗体であり、二重特異性含有量がランダム組込み宿主細胞と比較して増加しているＡ３１のＴＩ宿主細胞。
Ａ３５． 抗体が二重特異性抗体であり、二重特異性含有量が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％またはそれを超える、Ａ１に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｂ． 目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、ＴＩ宿主細胞ゲノムの遺伝子座内における部位に組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列、およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程；ａ）で供給される細胞に、標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程；ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ、またはＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程；ならびに第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む、方法。
Ｂ１． 前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、Ｂに記載の方法。
Ｂ２． リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、Ｂに記載の方法。
Ｂ３． 前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｂ～Ｂ２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ４． 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、Ｂ～Ｂ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５． 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｂ４に記載の方法。
Ｂ６． 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｂ４またはＢ５に記載の方法。
Ｃ． 目的のポリペプチドを発現させるための方法であって、少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーを含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、前記少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーが、前記ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接し、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる工程；ならびに、ａ）において目的のポリペプチドを発現させ、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下で前記細胞を培養する工程を含む、方法。
Ｃ１． 少なくとも１つの標的化かれた組み込まれた外因性ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｃに記載の方法
Ｄ． 少なくとも第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法であって、前記宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、前記標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳと、前記第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的である工程；ａ）で供給される前記細胞中に、前記標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１および前記第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入する工程；ａ）で供給される前記細胞中に、前記組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２および前記第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の標的化組込み外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入する工程；１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入する工程であって、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識する工程；ならびに前記第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む、方法。
Ｄ１． 前記リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、Ｄに記載の方法。
Ｄ２． リコンビナーゼがＢｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、Ｄに記載の方法。
Ｄ３． 前記第１のベクターが、前記第１のＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して位置するコドンＡＴＧに作動可能に連結されるプロモーター配列をさらに含み、前記第２のベクターが、ＲＲＳの上流に、かつ前記第２のＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーをさらに含む、Ｄに記載の方法。
Ｄ４． 前記第１のＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｄ～Ｄ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ５． 前記第２のＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｄ～Ｄ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ６． 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、ＣまたはＤ～Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ７． 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｄ６に記載の方法。
Ｄ８． 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｄ７に記載の方法。
Ｅ． 目的のポリペプチドを発現させるための方法であって、少なくとも２つの標的化組込み外因性ＳＯＩと、前記宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた少なくとも１つの選択マーカーとを含む宿主細胞を供給する工程であって、前記遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列は、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩおよび１つの選択マーカーは、第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩは、第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接する工程；ならびに目的のポリペプチドを発現させ、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む、方法。
Ｅ１． 前記第１のＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｅに記載の方法。
Ｅ２． 前記第２のＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、ＥまたはＥ１に記載の方法。
Ｅ３． 前記ＴＩ宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、Ｅ～Ｅ２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４． 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｅ３に記載の方法。
Ｅ５． 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｅ４に記載の方法。
Ｆ． 目的のポリペプチドを発現させるための方法であって、少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの選択マーカーと、少なくとも１つのランダム組込み外因性ＳＯＩを含むランダム組込み外因性核酸配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、ランダム組込み配列が宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、少なくとも１つのランダム組込み外因性ＳＯＩの発現が調節可能である工程；ならびに前記ランダム組込みＳＯＩから前記目的のポリペプチドを発現させ、そこから前記目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下でａ）の細胞を培養する工程を含む、方法。
Ｆ１． 少なくとも１つのランダム組込み外因性ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｆに記載の方法。
Ｇ． 目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法であって、前記宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含む宿主細胞を提供する工程であって、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる、工程；ベクターを前記宿主細胞に導入する工程であって、前記ベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列に少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカーと、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩとを含む、工程；ならびに前記選択マーカーを選択して、前記ゲノムの遺伝子座に組み込まれ、前記目的のポリペプチドを発現する前記標的化組込みＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む、方法。
Ｇ１． 前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、インテグレーティングファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、およびプラスミドからなる群から選択される、Ｇに記載の方法。
Ｇ２． 前記少なくとも１つの標的化され組み込まれたＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、ＧまたはＧ１に記載の方法。
Ｇ３． 前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、Ｇ～Ｇ２のいずれか記載の方法。
Ｇ４． 前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｇ３に記載の方法。
Ｇ５． 前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｇ３またはＧ４に記載の方法。
Ｇ６． 前記少なくとも１つのＳＯＩおよび選択マーカーを含む、標的化組込み核酸の組込みが外因性ヌクレアーゼによって促進される、Ｇ１～Ｇ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｇ７． 前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ｇ６に記載の方法。
Ｇ８． 目的のポリペプチドが多重特異性抗体である、Ｇに記載の方法。
Ｇ９． 前記多重特異性抗体が二重特異性抗体である、Ｇ８に記載の方法。
Ｈ． 宿主細胞のゲノムの１箇所以上の特定の遺伝子座内の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞であって、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる、ＴＩ宿主細胞。
Ｈ１． ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内の１箇所以上の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列、ならびにランダム組込み外因性核酸配列を含むＴＩ宿主細胞であって、前記ランダム組込み配列が前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる、ＴＩ宿主細胞。
Ｈ２． 前記少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳがリコンビナーゼによって認識され得る、Ｈ～Ｈ１のいずれかに記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ３． 前記少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、Ｈ２記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ４． 前記宿主細胞が、前記宿主細胞のゲノムの第１の遺伝子座に少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列、および前記宿主細胞のゲノムの１箇所以上の第２の遺伝子座に少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含む、Ｈ～Ｈ３のいずれかに記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ５． 第１の遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ５．１． 第１の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ５．２． 第１の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ５．３． 第１の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ５．４． 第１の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ５．５． 第１の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ５．６． 第１の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ６． 第１の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ６．１． 第１の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ６．２． 第１の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ６．３． 第１の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ６．４． 第１の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ６．５． 第１の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ６．６． 第１の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ７． 第１の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ７．１． 第１の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ７．２． 第１の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ７．３． 第１の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ７．４． 第１の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ７．５． 第１の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ７．６． 第１の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ８． 第１の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ８．１． 第１の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ８．２． 第１の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ８．３． 第１の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ８．４． 第１の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ８．５． 第１の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ８．６． 第１の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ９． 第１の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ９．１． 第１の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ９．２． 第１の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ９．３． 第１の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ９．４． 第１の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ９．５． 第１の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ９．６． 第１の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１０． 第１の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１０．１． 第１の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１０．２． 第１の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１０．３． 第１の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１０．４． 第１の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１０．５． 第１の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１０．６． 第１の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１１． 第１の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１１．１． 第１の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１１．２． 第１の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１１．３． 第１の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１１．４． 第１の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１１．５． 第１の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１１．６． 第１の遺伝子座が配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の遺伝子座が配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１２． 第１の遺伝子座がＬＯＣ１０７９７７０６２遺伝子内の組込み部位であり、第２の遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＨ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１３． 第１の遺伝子座がＬＯＣ１００７６８８４５遺伝子内の組込み部位であり、第２の遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＨ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１４． 第１の遺伝子座がＩＴＰＲ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の遺伝子座が以下の 群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１５． 第１の遺伝子座が、ＥＲＥ６７０００．１遺伝子内の組込み部位であり、第２の遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１６． 第１の遺伝子座がＵＢＡＰ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＨ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１７． 第１の遺伝子座がＭＴＭＲ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の遺伝子座が、以下の群ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１８． 第１の遺伝子座がＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子内の組込み部位であり、第２の遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＨ４記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ１９． 第１の遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、調節可能なプロモーターを含む、Ｈ４～Ｈ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ２０． 第２の遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が調節可能なプロモーターを含む、Ｈ４～Ｈ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｈ２１． 第１の遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列および第２の遺伝子座に組み込まれた少なくとも１つのヌクレオチド配列が調節可能なプロモーターを含む、Ｈ４～Ｈ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
Ｊ． 少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、前記ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ以上の遺伝子座内の部位に組み込まれた少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、前記１つ以上の遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、前記少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、工程；ａ）で供給される細胞に、組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩおよび少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入する工程；ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ、またはＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程；ならびに前記第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ細胞を単離する工程を含む、方法。
Ｊ１． 少なくとも１つの第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法であって、前記宿主細胞のゲノムの１つ以上の遺伝子座内の部位に組み込まれた少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、１つ以上の遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、前記標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳ、ならびに前記第１のＲＲＳと前記第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的である工程；ａ）で供給される前記細胞に、前記少なくとも１つの組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１および前記第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第１の標的化組込み外因性ＳＯＩおよび第２の選択マーカーと隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入する工程；ａ）で供給される前記細胞に、前記少なくとも１つの組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２および前記第３のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの第２の標的化組込み外因性ＳＯＩと隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを導入する工程；前記ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼ、または前記ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入する工程；ならびに前記第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記少なくとも１つの第１および第２の目的ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む、方法。
Ｊ２． 目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法であって、ａ）前記ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ以上の遺伝子座内の部位に組み込まれた少なくとも１つの標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、前記１以上の遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、前記標的化組込み外因性ヌクレオチド配列が、１以上のＲＲＳを含む工程；ｂ）ａ）で供給される細胞に、組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳとマッチし、少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩに隣接し、少なくとも１つの調節可能なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入する工程；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ、またはＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程；ならびにｄ）誘導物質の存在下で前記目的の外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む、方法。
Ｊ３． 目的のポリペプチドを発現させるための方法であって、ａ）２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの標的化組込み外因性ＳＯＩと、前記宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた調節可能なプロモーターとを含む宿主細胞を供給する工程であって、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる工程；ならびにｂ）標的化組込みＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下で前記細胞を培養する工程を含む、方法。
Ｊ４． 第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法であって、ａ）前記宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を供給する工程であって、前記遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列およびランダム組込み外因性核酸配列と少なくとも約９０％相同であり、前記ランダム組込み配列が、前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれ、前記外因性ヌクレオチド配列が、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および前記第１のＲＲＳと前記第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的である工程；ｂ）ａ）で供給される細胞に、組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つの第１の標的化組込み外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入する工程；ｃ）ａ）で供給される前記細胞に、前記組み込まれた標的化組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２および前記第３のＲＲＳとマッチし、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される少なくとも１つの第２の標的化組込み外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入する工程；ｄ）ＲＲＳを認識する、１つ以上のリコンビナーゼ、またはＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入する工程；ならびにｅ）誘導物質の存在下で前記目的の第１および第２の標的化組込み外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離する工程を含む、方法。
Ｊ５． 少なくとも１つの標的化組込みＳＯＩを含む標的化組込み外因性核酸の組込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項Ｊ、Ｊ２およびＪ３のいずれかに記載の方法。
Ｊ６． 前記第１のＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードし、前記第２のＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項Ｊ１またはＪ４に記載の方法。
Ｊ７． 前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ｊ５に記載の方法。
Ｊ８． 調節可能なプロモーターがＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項Ｊ～Ｊ４のいずれかに記載の方法。
Ｊ９． 前記第１のベクターが、前記第１の標的化組込みＳＯＩの上流およびＲＲＳの下流に隣接して配置されたコドンＡＴＧに作動可能に連結されたプロモーター配列をさらに含み、前記第２のベクターが、ＲＲＳの上流に、かつ前記第２の標的化組込みＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーをさらに含む、請求項Ｊ２およびＪ４のいずれかに記載の方法。
特定の実施形態では、本発明の宿主細胞は、外因性ＳＯＩのランダム組込みによりさらなるゲノム部位を標的化するために使用し得る。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩのランダム組込みと組み合わせて本開示のＴＩ細胞を使用して、抗体、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、ワクチンタンパク質、または治療機能を有するタンパク質を含むがこれらに限定されない目的のポリペプチドを産生し得る。
Ｋ． 目的のポリペプチドを発現し得る宿主細胞であって、ａ）第１の目的のポリペプチドと、２つの組換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する第１の選択マーカーとをコードする、標的化組込み外因性核酸目的配列（ＳＯＩ）であって、前記標的化組込み外因性ＳＯＩが前記宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれている、標的化組込み外因性核酸ＳＯＩ；およびｂ）第２の目的のポリペプチドおよび第２の選択マーカーをコードするランダム組込み外因性核酸ＳＯＩであって、前記ランダム組込みＳＯＩが前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれている、外因性核酸ＳＯＩを含む、宿主細胞。
Ｋ１． 第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとが同一である、Ｋに記載の宿主細胞。
Ｋ２． 第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが同一である、Ｋの宿主細胞。
Ｋ３． ランダム組込み外因性核酸ＳＯＩを１～１０個含む、Ｋに記載の宿主細胞。
Ｋ４． 前記標的化遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、請求項Ｋに記載の宿主細胞。
Ｋ４．１． 標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｋ４に記載の宿主細胞。
Ｋ４．２． 標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｋ４に記載の宿主細胞。
Ｋ４．３． 標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｋ４に記載の宿主細胞。
Ｋ４．４． 標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｋ４に記載の宿主細胞。
Ｋ４．５． 標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｋ４に記載の宿主細胞。
Ｋ４．６． 標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｋ４に記載の宿主細胞。
Ｋ４．７． 標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｋ４に記載の宿主細胞。
Ｋ．５． 前記宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた少なくとも１つの第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩと、前記宿主細胞のゲノムの１つ以上の第二の遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチドＳＯＩをコードする少なくとも１つの第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩとを含む、Ｋ～Ｋ４のいずれかに記載の宿主細胞。
Ｋ６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ６．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ６．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ６．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ６．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ６．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ６．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ７． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ７．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ７．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ７．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ７．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ７．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ７．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ８． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ８．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ８．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ８．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ８．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ８．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ８．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ９． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ９．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ９．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ９．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ９．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ９．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ９．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１０． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１０．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１０．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１０．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１０．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１０．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１０．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１１．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１１．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１１．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１１．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１１．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１１．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１２．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１２．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１２．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１２．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１２．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１２．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座がＬＯＣ１０７９７７０６２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座がＬＯＣ１００７６８８４５遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座がＩＴＰＲ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座がＥＲＥ６７０００．１遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１７． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座がＵＢＡＰ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１８． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座がＭＴＭＲ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ１９． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座がＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｋ５に記載の宿主細胞。
Ｋ２０． 目的のポリペプチドが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、Ｋ～Ｋ１９のいずれかに記載の宿主細胞。
Ｋ２１． 前記宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、Ｋ～Ｋ１９のいずれか１つに記載の宿主細胞。
Ｋ２２． 前記宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｋ２１に記載の宿主細胞。
Ｋ２３． 前記宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｋ２２８に記載の宿主細胞。
Ｋ２４． ＳＯＩおよび選択マーカーの標的化組込みが外因性ヌクレアーゼによって促進される、Ｋ～Ｋ２０のいずれか１つに記載の宿主細胞。
Ｋ２５． 外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ｋ２４に記載の宿主細胞。
Ｌ． 目的のポリペプチドを発現させる方法であって、ａ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を供給する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程；ｂ）（ａ）で供給される細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の２つのＲＲＳとマッチし、第１の目的のポリペプチドをコードする第１の外因性ＳＯＩおよび第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む核酸を導入する工程；ｃ）前記ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ、または前記ＲＲＳを認識するリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程；ｄ）第２の選択マーカーを発現する細胞を選択する工程；ｅ）ランダム組込みを介して、第２の目的のポリペプチドおよび第３の選択マーカーをコードする第２の外因性ＳＯＩを宿主細胞のゲノムに導入する工程；ｆ）第３の選択マーカーを発現する細胞を選択する工程；ならびにｇ）第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するのに十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
Ｌ１． 第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを宿主細胞培養物から回収することをさらに含む、Ｌに記載の方法。
Ｌ２． 第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとが同一である、Ｌに記載の方法。
Ｌ３． 標的化遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、Ｌに記載の方法。
Ｌ３．１． 標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｌ３に記載の方法。
Ｌ３．２． 標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｌ３に記載の方法。
Ｌ３．３． 標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｌ３に記載の方法。
Ｌ３．４． 標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｌ３に記載の方法。
Ｌ３．５． 標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｌ３に記載の方法。
Ｌ３．６． 標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｌ３に記載の方法。
Ｌ３．７． 標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｌ３に記載の方法。
Ｌ４． 宿主細胞が、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた少なくとも１つの第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩと、宿主細胞のゲノムの１つ以上の第２の遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチドＳＯＩをコードする少なくとも１つの第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩとを含む、Ｌ～Ｌ３のいずれかに記載の方法。
Ｌ５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ５．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ５．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ５．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ５．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ５．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ５．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ６．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ６．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ６．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｋ７．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ６．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ６．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ７． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ７．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ７．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ７．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ７．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ７．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ７．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ８． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ８．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ８．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一 Ｌ８．３．部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ８．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ８．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ８．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ９． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ９．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ９．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ９．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ９．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ９．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ９．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１０． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１０．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１０．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１０．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１０．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１０．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１０．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１１．１． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１１．２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１１．３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１１．４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１１．５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１１．６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｌ４に記載の方法。
Ｌ１２． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＬＯＣ１０７９７７０６２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＬ４に記載の方法。
Ｌ１３． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＬＯＣ１００７６８８４５遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＬ４に記載の方法。
Ｌ１４． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＩＴＰＲ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＬ４に記載の方法。
Ｌ１５． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＥＲＥ６７０００．１遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＬ４に記載の方法。
Ｌ１６． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＵＢＡＰ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２，ＬＯＣ１００７６８８４５，ＩＴＰＲ２，ＥＲＥ６７０００．１，ＭＴＭＲ２，ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＬ４に記載の方法。
Ｌ１７． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＭＴＭＲ２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２，ＬＯＣ１００７６８８４５，ＩＴＰＲ２，ＥＲＥ６７０００．１，ＵＢＡＰ２，ＸＰ＿００３５１２３３１．２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＬ４に記載の方法。
Ｌ１８． 第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子内の組込み部位であり、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２，ＬＯＣ１００７６８８４５，ＩＴＰＲ２，ＥＲＥ６７０００．１，ＵＢＡＰ２，ＭＴＭＲ２、およびそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組込み部位であるＬ４に記載の方法。
Ｌ１９． 第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項Ｌ～Ｌ１８のいずれかに記載の方法。
Ｌ２０． 前記宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、Ｌ～Ｌ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｌ２１． 宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｌ２０に記載の方法。
Ｌ２２． 前記宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｌ２１に記載の方法。
Ｌ２３． ＳＯＩのいずれかの標的化組込みが外因性ヌクレアーゼによって促進される、Ｌ～Ｌ２２のいずれかに記載の方法。
Ｌ２４． 前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ｌ２３に記載の方法。
Ｌ２５． ＳＯＩの発現が調節可能なプロモーターによって制御される、Ｌ～Ｌ２４のいずれかに記載の方法。
Ｌ２６． 調節可能なプロモーターがＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、Ｌ２５に記載の方法。
実施例
以下の実施例は、本明細書で開示されている主題の単なる例示であり、いかなる意味においても制限とみなすべきではない。
実施例１：
臨床用および商業用細胞株開発のためのＣＨＯ宿主細胞の生産性の高い標的化組込み部位の発見
この実施例は、高い生産性を有するＣＨＯゲノムにおける標的化組込み遺伝子座を同定するための方法を記載する。従来の細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的配列（ＳＯＩ）を保持するプラスミドのランダム組込み（ＲＩ）に基づいている。このプロセスは予測不可能であり、多大な労力を要する。そのため、高生産性のＲＩクローンを特定するには多大な労力が必要となる。従来のＲＩ ＣＬＤとは異なり、標的化組込み（ＴＩ）ＣＬＤは、ＣＨＯゲノム中の所定の「ホットスポット」に規定のコピー数（通常は１～２コピー）を有する導入遺伝子を導入する。コピー数が低く、かつ事前に試験した組込み部位を考えると、ＴＩ細胞株はＲＩ株と比較して安定性が優れているはずである。さらに、選択マーカーは適切なＴＩを有する細胞の選択にのみ使用され、高レベルの導入遺伝子発現を有する細胞の選択には使用されないため、変異原性の低いマーカーを適用して、配列バリアント（ＳＶ）の可能性を最小限に抑える場合があり、該ＳＶは、メトトレキサート（ＭＴＸ）やメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）などの選択剤の変異原性に部分的に起因する。
図１は、抗体の安定した高発現を可能にするＣＨＯ ＴＩ遺伝子座を同定するためのゲノムワイドスクリーニング工程の概要を示す図である。ＣＨＯゲノム中の転写活性配列をスクリーニングするために、２つのアプローチを利用して、抗体Ａまたは抗体Ｂのいずれかを発現し、抗体配列がＲＲＳ１およびＲＲＳ２に隣接する抗体カセットをＣＨＯゲノムに導入した。１つのアプローチは、従来のランダム組込み法であり、他方は、トランスポザーゼ発現プラスミドおよび抗体プラスミドの共トランスフェクションを必要とするトランスポザーゼベースによる組込みであった。１５ｋ～２０ｋトランスフェクタントを各方法についてスクリーニングした。インタクトなＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイおよび遺伝子コピー分析に基づいて、抗体力価が高く、ＨＣ遺伝子コピー数が少ない合計約３００個のクローンを、振盪フラスコにおける流加評価のために増殖させた。次いで、許容され得る力価および製品品質属性を有する、２つの方法によって同定された４０個の異なる可能性のある高度に転写活性な組込み部位を表す４０個のクローンを、ＧＦＰランディングパッドスワップのために選択し、ＴＩ宿主を作製した。
転写活性遺伝子座の抗体カセットを置換するために、同じＲＲＳ１およびＲＲＳ２に隣接するＧＦＰ遺伝子および適切な選択マーカーをコードするランディングパッドをＲＭＣＥ用に構築した。ＲＭＣＥを開始するために、リコンビナーゼおよびＧＦＰランディングパッドを上位４０のクローンのそれぞれに共トランスフェクトした。２つの選択マーカーを使用して、標的化組込み事象を増強した。ＲＭＣＥが成功すると、ＧＦＰランディングパッドが転写活性遺伝子座を標的とし、抗体カセットが置換され、ＧＦＰ発現の増加および抗体発現の喪失がもたらされるはずである。ＧＦＰ－／ｍＡＢ＋からＧＦＰ＋／ｍＡｂ－への表現型の変化は、ＦＡＣＳ分析を使用して容易に検出可能であるはずである。ＧＦＰ＋／ｍＡｂ－濃縮は、ＦＡＣＳ分析を使用して４０個のＲＭＣＥプールのうち１４個で検出された。次いで、個々のＴＩ宿主候補を単離するために、これらの１４個のＲＭＣＥプールのそれぞれを単一細胞クローン化した。１４個のプールからの合計９０個の有望なＴＩ宿主候補を、ＦＡＣＳおよびゲノムＰＣＲの確認に基づいて選択し、元の抗体カセットが除去され、目的の組込み部位においてＧＦＰランディングパッドで置換された。続いて、これらの候補宿主のいくつかを、同じＲＲＳ１およびＲＲＳ２に隣接する試験抗体Ｃを使用してＲＭＣＥ能力および効率について評価した。転写活性遺伝子座がどの方法で同定されたかに応じて、２つの二重選択スキームを利用して、標的化抗体発現集団を作製した（図２Ａおよび２Ｂ）。ランディングパッドの構成は、２つのスクリーニング方法でわずかに異なっていた。ＴＩトランスフェクションプールのＲＭＣＥ効率ならびに抗体産生性に基づいて、７つの最終宿主を選択し、高抗体発現のためのＣＨＯＫ１Ｍ宿主における７つの特有な組込み部位を表した。
これらの７つの宿主を、標的化遺伝子座増幅／次世代シーケンシング（ＴＬＡ／ＮＧＳ）によって分析して、組込み部位に隣接するＣＨＯゲノム配列を同定することにより、目的の組込み部位が存在する可能性のある遺伝子配列を提供した。
Figure 2022514342000003
組込み部位に基づいて、５’隣接配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０～４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０～２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１～４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３～７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１～３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３～２６６２０５４、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４～９７７０５を含み得る。
組込み部位に基づいて、３’隣接配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０～４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２～７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０～６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９～１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６～３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５～２７０１７６８、およびＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６～１０５１１７を含み得る。
２つの宿主、宿主４および７について、さらに分析したところ、単一のＧＦＰランディングパッドがＣＨＯ宿主ゲノムに挿入されたことが示された。これらの２つの宿主には抗体配列は見られず、転写的に活性な遺伝子座を同定するために使用される初期抗体カセットが完全に除去されたことが示された。さらに、これらの２つのＴＩ宿主から単離されたゲノムＤＮＡについて、社内で全ゲノムシーケンシングを実施した。これらの２つのＴＩ宿主では抗体特異的配列は検出されなかったが、（ランディングパッドからの）ＧＦＰ配列は容易に検出された。ＴＩ宿主については、６３倍を超えるゲノム範囲が達成された。ＴＩ宿主に抗体ＡおよびＢが存在しないことをさらに保証するために、抗体ＡおよびＢ以外の抗体を発現するＴＩ細胞株からの複数のＨＣＣＦ試料をＬＣ－ＭＳ試験を用いて評価した。ＬＣ－ＭＳデータを、０．５％超のレベルでバリアントペプチドを検出する能力を有するＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる配列バリアント分析と同様のアプローチを使用して分析した。抗体ＡまたはＢペプチドは、ＴＩ細胞株から採取した全ての試料で検出されなかった。最後に、これらの２つのＴＩ宿主のゲノム内のＧＦＰランディングパッドの染色体位置を決定するために、Ｃｈｒｏｍｂｉｏｓによって蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析も行った。
これらの２つの十分に特徴付けられたＴＩ宿主を、合計１６の異なる標準抗体を用いた臨床細胞株開発におけるＲＭＣＥロバスト性についてさらに評価した。図３は、これらのＴＩ宿主によって生成された上位クローンの生産性を示す。歴史的に、ランダム組込みによって作製された細胞株の平均生産性は約３ｇ／Ｌであった。試験を行ったほとんどの場合で、ＴＩ細胞株は、平均してＲＩクローンと同等またはそれよりも良好な生産性を示した。
ＴＩ細胞株は、抗体遺伝子コピー数が少ないため、ＲＩ細胞株よりも安定性が高く、ＳＶが低いと予想された。クローン安定性のために、毎月の流加生産を４ヶ月間設定し、生産性をモニターした。表３は、ＴＩ宿主のうちの１つによって作製されたＴＩ細胞株の１０％のみが、ＰＳＢから１２０日後に２０％を超えて力価が低下したことを示した。歴史的に、ＲＩ細胞株の６０％が同様の力価低下を有することとなるであろう。これは、同定された組込み部位が安定な抗体発現に非常に適していることを強く示唆している。ＴＩ細胞株を、ＮＡＴに基づく配列バリアント分析にも供した。ＲＩ細胞株と比較した場合、ＴＩ細胞株においてはＳＶ＞５％の頻度が有意に低かった（４％対１５％、表３）。
Figure 2022514342000004
実施例２：２プラスミドＲＭＣＥ戦略
標準抗体の高力価発現を達成し、多重鎖複合体形式を発現するという課題に対処するために、革新的な２プラスミドＲＭＣＥ戦略を開発した。２プラスミドＲＭＣＥ法では、８本以上の鎖を同時にＴＩ部位に標的化することを可能にする。このアプローチは、抗体のＨＣおよびＬＣ鎖比を調節して生産性を改善する柔軟性を高めるだけでなく、複数の鎖を有する複雑な分子、ならびに導入遺伝子、内因性遺伝子またはＲＮＡｉを抗体で標的化して細胞経路を改変することも可能にする。
２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行することを含む（図４）。したがって、上述のＴＩ宿主のランディングパッドは、ＲＲＳ１部位またはＲＲＳ２部位のいずれとも交差活性のない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含むように置き換えた。標的化する２つの発現プラスミドは、効率的標的化のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方の発現プラスミド（前方）はＲＲＳ１およびＲＲＳ３に隣接し、他方（後方）はＲＲＳ３およびＲＲＳ２に隣接する。２プラスミドＲＭＣＥの効率は低いと予想されるため、まれなＲＭＣＥ固有の事象を強化するには、厳密な選択スキームが有用である。２プラスミドＲＭＣＥには、少なくとも２つの選択マーカーが必要である。特定の実施形態では、３つの選択マーカーが使用され、１つの選択マーカー発現カセットが２つの部分に分割された（例えば、図４を参照のこと）。分割選択マーカー発現カセットを含む特定の実施形態では、前方プラスミドは、プロモーターと、それに続く開始コドンおよびＲＲＳ３配列とを含むであろう。後方プラスミドは、ＡＴＧ開始を差し引いた、選択マーカーのコード領域のＮ末端に融合したＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に追加のヌクレオチドを挿入する必要があり得る。２つのプラスミドが正しく標的化された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、細胞が選択に対して耐性を示す状態になる。図４は、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を示す模式図である。当然のことであるが、必要に応じて、ＲＲＳ１およびＲＲＳ２を使用して単一プラスミドＲＭＣＥを実施し得る。
２プラスミドＲＭＣＥアプローチのロバスト性を試験するために、以前に同定されたＴＩ宿主、すなわち宿主４を使用して、元のＧＦＰランディングパッドを３つのＲＲＳ部位を有する新しいＧＦＰランディングパッドに置き換えた。単一プラスミドＲＭＣＥと比較して、２プラスミドＲＭＣＥではより重度の生存率低下およびより長い回復時間が観察され、これは２プラスミドＲＭＣＥの初期ＲＭＣＥ効率の低下と一致していた。プールが回収すると、ＦＡＣＳ、ゲノムＰＣＲおよび遺伝子コピー分析を評価して、両方のプラスミドカセットがＴＩ部位に正しく標的化されたかを確認した。合計で５つの標準抗体（Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、およびＵ）を、単一プラスミドＲＭＣＥおよび２プラスミドＲＭＣＥの両方を用いて生産性について試験した（図５）。２プラスミドＲＭＣＥでは、単一プラスミドＲＭＣＥと比較して、より多くの総ＨＣおよびＬＣコピーがＴＩ部位に標的化された。５つ全ての場合において、２プラスミドＴＩトランスフェクションプールの生産性は一貫して高く、単一プラスミドプールの生産性と比較して最大２００％増加した。２プラスミドＲＭＣＥの力価の増加は、主に比生産性に起因し、単一プラスミドＲＭＣＥのレベルと比較してそのレベルは３００％も改善された。
十分に特徴付けられたＴＩ宿主、例えば宿主４を、５つの異なる抗体の高力価を達成する能力について、異なる細胞培養プラットフォームでさらに評価した。図６は、これらのＴＩ宿主による上記抗体の産生性を示す。ほとんどの抗体について、１４日目に１０ｇ／Ｌを超える生産性が達成され、１６日目に１２ｇ／Ｌを超える生産性が達成された。
２プラスミドＲＭＣＥを使用して、複合ｍＡｂ形式の発現を評価するために、二重特異性アセンブリのために同じ細胞内で発現される４つの異なる鎖（２つのＨＣおよび２つのＬＣ）を必要とする２つの二重特異性分子を試験した。２つの別個の発現プラスミドを同時に標的化することを可能にすることによって、異なる鎖のプラスミド構成を操作して、バランスのとれた発現のための最適な鎖比を達成し得る。いずれの場合も、２プラスミドＲＭＣＥを使用して、８０％を超える二重特異性含有量で、１．５ｇ／Ｌを超える宿主４に由来する細胞株を開発した（図７）。
二重特異性アセンブリのために４本の異なる鎖（２本のＨＣおよび２本のＬＣ）が同じ細胞内で発現されることが必要な４つの二重特異性分子の１４日目の力価も評価した。宿主４に由来する全ての細胞株は、２プラスミドＲＭＣＥを使用して、８０％を超える二重特異性含有量で、１．５ｇ／Ｌを超える力価を有するように開発された（図８）。
実施例３：ｍＡｂ－Ｉ（発現困難）対ｍＡｂ－ＩＩ（平均発現）抗体分子を発現するＲＴＩ細胞株の発現および増殖分析
発現困難な分子は、数回のＣＬＤの試みの後、生成された全ての細胞株が、標準的なＣＬＤプラットフォームプロセスから通常予想されるものより低い力価を達成する場合として定義される。すでに同定されている発現困難な抗体（ｍＡｂ－Ｉ）について、例えば、４回の別個のＣＬＤ試行からの１２０を超える細胞株を流加産生培養物において評価した。それにもかかわらず、２４個の細胞株のみがスクリーニングされた平均抗体分子（ｍＡｂ－ＩＩ）と比較した場合、最も高いｍＡｂ－Ｉ発現細胞株は、通常の力価の５０％しか達成することができなかった（図９Ａの表）。残念なことに、ランダム組込みシステムにおいて分子を発現困難にする可能性がある根本的な原因を追跡することは、主に異なる細胞株間の導入遺伝子コピー数および遺伝子組込み部位の違いのため、非常に困難である。
ｍＡｂ－Ｉを発現困難にした根本的な要因を同定するために、ＲＴＩシステムを使用してｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ分子の両方についてＣＬＤを開始した。ＨＣ構築物およびＬＣ構築物の両方を、誘導可能なＣＭＶ－ＴＯプロモーター制御下で発現ベクターにクローニングし、これらのベクターを、同様のレベルの導入遺伝子転写を有する細胞株を単離する可能性を高めるためにＴＩ宿主にトランスフェクトした。ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩのＲＴＩ ＣＬＤアプローチの全体概略図を図９Ｂに示す。トランスフェクトした細胞株を、２つの別々の条件を使用して選択に供した。この条件では、細胞株は、ＣＬＤプロセス全体を通して、１）Ｄｏｘ（誘導）の存在下で誘導されるか、または２）Ｄｏｘ（非誘導）の非存在下で誘導されたかのいずれかであった。Ｄｏｘの非存在下で誘導された細胞株は一時的に誘導されたのみであり、シードトレイン力価に基づいて、または示された場合の産生アッセイ中に順位付けされた。これにより、選択プロセス中の抗体発現の役割（発現圧）の評価が可能になった（図９Ｂ）。
ドキシサイクリンの存在下または非存在下で、「誘導」および「非誘導」シード－トレインアームの両方からの、宿主７に由来する２つの代表的なｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ細胞株を使用して、産生アッセイを実施した。後者を使用して、誘導の非存在下でのプロモーター漏出および基礎抗体産生レベルを評価した。ドキシサイクリンの非存在下での抗体発現がかなり厳しく制御されることが観察され、制御された発現系がこれらの細胞株で効果的に機能したことを示唆していた（図１０Ａおよび１０Ｃ）。ドキシサイクリンの存在下または非存在下での全ての細胞株の増殖（図１０Ｂ）プロファイルは同等であったが、ドキシサイクリンの非存在下では増殖プロファイルがわずかに良好であると思われた。「誘導」または「非誘導」シードトレイン条件下で誘導された細胞株は、産生中に比較的同等の力価および比産生性を示し（図１０Ａおよび１０Ｃ、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩについて細胞株１および２と、３および４を比較）、これは、選択中の構成的抗体発現が高力価細胞株の単離において有意な役割を果たさなかったことを示した（図１０）。さらに、ＲＩ ＣＬＤの試みと同様に、ｍＡｂ－Ｉ ＲＴＩ細胞株の力価および比産生性は、ｍＡｂ－ＩＩ ＲＴＩ細胞株よりも依然として５０％低かった（図１０Ａおよび１０Ｃ）。ｍＡｂ－Ｉの「誘導」および「非誘導」ＲＴＩ培養物のいずれもが、ｍＡｂ－ＩＩ対照細胞株と比較して同様に低い力価を示したので、この観察は、ｍＡｂ－Ｉの低発現の原因としての慢性毒性が除外された。
実施例４：ｍＡｂ－Ｉ細胞株におけるより低い抗体発現は、より低い転写に起因しなかった
ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株で観察されたより低い抗体発現を分析するために、ドキシサイクリン誘導および非誘導条件下で、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現するＲＴＩ細胞株における抗体ＨＣおよびＬＣのｍＲＮＡレベルを測定するためにｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行った。Ｄｏｘの非存在下では、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩ細胞株はＨＣまたはＬＣ ｍＲＮＡをほとんどまたは全く発現せず、誘導可能なプロモーターによる比較的厳しい転写調節を示した（図１１）。Ｄｏｘの存在下では、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株の抗体ＨＣおよびＬＣ転写レベルは、ｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株の転写レベルと同等であるか、またはそれより高かった（図１１Ａおよび１１Ｂ）。これらの結果により、導入遺伝子転写のレベルの低下が、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株における抗体発現が低いことの理由ではないことが確認された。さらに、「誘導」または「非誘導」条件下で単離された細胞株は同等のＨＣまたはＬＣ ｍＲＮＡレベルを有していたので（図１１Ａおよび１１Ｂ）、ＣＬＤプロセス中のシードトレイン培養物におけるドキシサイクリンの有無は、導入遺伝子転写速度に影響を及ぼさなかった。
実施例５：ｍＡｂ－Ｉ発現の誘導は、細胞内ＢｉＰの可逆的蓄積および抗体ＨＣ分解の遅延をもたらした
ｍＡｂ－Ｉ発現に影響を及ぼす根本的な要因を同定するために、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理および除去と共にＤｏｘ誘導を使用して、抗体の分泌、折り畳みおよび分解を調べた。これらの実験のために、「誘導」培養物をＣＨＸで処理してタンパク質合成を停止させ、５時間後、細胞を洗浄し、Ｄｏｘのみを含有する培地（ＣＨＸなし）に再懸濁してタンパク質合成を再開した（図１２Ａ）。ＨＣまたはＬＣは、ＣＨＸ除去後約６０分間、これらの培養物の上清中に検出されず、抗体分泌の漸進的な増加のみが、１２０分後および同様の割合で検出された（図１２Ｂ上部パネル）このことにより、適切に折り畳まれ、組み立てられた抗体分子の分泌が、ＣＨＸ除去後のｍＡｂ－Ｉ細胞株とｍＡｂ－ＩＩ細胞株との間で同等であったことが示唆された。抗体ＬＣの細胞内レベルもまた、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株とｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株との間でかなり同等であった（図１２Ｂ、ＬＣパネル）。しかしながら、ＣＨＸ処置の５時間後でさえ、ｍＡｂ－ＩＩ発現株と比較して、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株において有意に高いレベルの細胞内抗体ＨＣが検出された（図１２Ｂ、ＨＣパネル）。これは、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株において折り畳まれていない、または誤って折りたたまれた抗体ＨＣの分解およびクリアランスの遅延または問題を暗示していた。興味深いことに、ＣＨＸ処置前後において、ｍＡｂ－ＩＩ細胞株と比較して、ｍＡｂ－Ｉ中に非常に高いレベルの細胞内ＢｉＰが検出された（図１２Ｂ、下部パネル、ＢｉＰ）。シャペロンとしてのＢｉＰは、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）ならびに抗体ＨＣまたはＬＣ折り畳みに関与しており、シードトレイン培養物中のその存在はＥＲ関連細胞ストレスの指標となり得る。
ｍＡｂ－Ｉ発現と細胞内ＢｉＰ蓄積との間の相関をさらに調査するために、「誘導」シードトレイン培養物を、ドキシサイクリンを含有する培地中でＣＨＸの有無にかかわらず一晩処理し、これらの試料の細胞内ＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰレベルを評価した。ＣＨＸ処理をしないと、細胞内抗体ＨＣ分子の基礎レベルは、ｍＡｂ－ＩＩ細胞株と比較してｍＡｂ－Ｉでより高かったが、細胞内ＬＣのレベルは全ての試料セット間で同等であった。一方、ＢｉＰレベルは、ｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株と比較してｍＡｂ－Ｉの方がかなり高かった（図１２Ｃ、－ＣＨＸ試料）。これらの培養物をＣＨＸで一晩処理すると、全ての細胞株においてＨＣおよびＬＣのレベルが低下し、同時に、特にｍＡｂ－Ｉ発現細胞株においてＢｉＰレベルが低下した（図１２Ｃ、＋ＣＨＸ試料）。これは以前の知見と一致していた（図１２Ｂ）。シクロヘキシミドは全ての真核生物タンパク質の合成を無差別に阻害するので、ｍＡｂ－Ｉ細胞株におけるより高いＢｉＰレベルは、抗体ＨＣまたはＬＣサブユニットの蓄積に直接関連付けることができなかった。しかしながら、調節された発現システムにより、細胞内ＢｉＰと抗体ＨＣまたはＬＣレベルとの間の関連を直接試験する能力が提供された。その目的のために、ドキシサイクリンを培地から６日間除去して、他の内因性タンパク質の発現に影響を与えることなく抗体発現を特異的に止めて、細胞内ＨＣ、ＬＣおよびＢｉＰレベルをモニターした。抗体（ＨＣおよびＬＣ）発現とｍＡｂ－Ｉ細胞株に対する細胞内ＢｉＰの蓄積との間の直接的かつ特異的な関連を観察したが、ｍＡｂ－ＩＩの発現は細胞内ＢｉＰレベルに影響を示さなかった（図１２Ｄ）。
実施例６：ｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現は細胞内ＢｉＰの蓄積を誘発したが、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣも、この抗体の低発現に明確に寄与した
ｍＡｂ－Ｉ ＬＣが細胞内ＢｉＰの蓄積に役割を果たすかどうかを判定するために、ＬＣを構成的に発現させながら、調節されたプロモーター下でｍＡｂ－Ｉ ＨＣを発現する構築物を作製した。この構築物を、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩ（対照）の調節されたＨＣ／ＬＣを発現する構築物と共にＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、各トランスフェクションから２つの別個のプールを誘導した。プール力価を産生培養物で評価し（図１３Ａ）、シードトレイン培養物をドキシサイクリンの存在下および非存在下でウェスタンブロット分析によって評価した（図１３Ｂ）。産生アッセイの間、各プールをＤｏｘで誘導するか、誘導しないままにした。非誘導プールは産生中に抗体をほとんど発現せず、厳しい発現調節を示していた（図１３Ａ、－Ｄｏｘ）。産生中のＤｏｘ誘導培養物の分析により、「非誘導」シードトレイン培養物に由来する調節されたＨＣ／構成的ＬＣ ｍＡｂ－Ｉ発現プールが、シードトレイン中に「誘導」された調節ＨＣ／ＬＣ ｍＡｂ－Ｉプールおよび調節ＨＣ／構成的ＬＣ ｍＡｂ－Ｉプールと比較して力価がかなり低かったことが明らかになった（図１３Ａ）。「非誘導」培養物のウェスタンブロット分析により、全ての条件下で、Ｄｏｘを培地に添加した場合にのみ抗体ＨＣが発現されることが示された。さらに、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣを含まないｍＡｂ－Ｉ ＬＣ単独の構成的発現は、細胞内ＢｉＰの蓄積を誘導した（図１３Ｂ）。これらの結果は、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣサブユニットの発現と細胞内ＢｉＰの蓄積との間の直接的な関連を暗示していた。ＨＣの非存在下で構成的に発現されると、ｍＡｂ－ＩのＬＣ分子は、ＢｉＰシャペロンと相互作用するＥＲ内で折り畳まれていない凝集体を形成し、これらの細胞におけるＢｉＰの細胞内レベルの増加を引き起こす可能性がある。産生段階におけるｍＡｂ－Ｉ ＨＣの発現は、これらの細胞にさらに負担をかけ、ＨＣおよびＬＣ分子の両方のフォールディングに対応するための細胞内ＢｉＰの需要を増加させ、非効率的な抗体アセンブリ、折り畳みおよび分泌効率をもたらし得た（図１３Ａ）。
これらの知見は、細胞内ＢｉＰの蓄積によって示されるように、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現と細胞ＥＲストレスとの関連を示したが、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣの発現とｍＡｂ－Ｉ細胞株の低力価との間の直接的な関連を確立する必要があった。そのために、抗体分子を作製し、ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩの重鎖および軽鎖を交換して、ＨＣＩＬＣＩ、ＨＣＩＩＬＣＩＩ、ＨＣＩＬＣＩＩおよびＨＣＩＩＬＣＩ抗体の組み合わせを作製した。ＨＣＩＬＣＩＩ構築物は、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣおよびｍＡｂ－ＩＩ ＬＣを有する抗体を発現したが、ＨＣＩＩＬＣＩ構築物は、ｍＡｂ－ＩＩ ＨＣおよびｍＡｂ－Ｉ ＬＣを有する抗体を発現した。これら全ての構築物に対する抗体ＨＣおよびＬＣ発現は、ＲＴＩベクターシステムにおけるＣＭＶ－ＴＯプロモーターの制御下にあった（図１３Ｃ）。次いで、これらの構築物を本発明者らのＣＨＯ ＴＩ宿主細胞にトランスフェクトし、各構築物について２つの別個のＲＴＩプールを作製し、ｍＡｂ－ＩもしくはｍＡｂ－ＩＩ、またはこれらの抗体のハイブリッド型の発現を試験した。すでに言及したように（図１３Ｂ）、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現と細胞内ＢｉＰの蓄積との間の明確かつ直接的な相関が観察された（図１３Ｄ、ＬＣおよびＢｉＰブロット）。興味深いことに、細胞内ＢｉＰはまた、ＨＣＩＩＬＣＩＩと比較して、ＨＣＩＬＣＩＩハイブリッド抗体を発現するプールにおいて、それほど強くはないが、なお顕著な様式で蓄積され、おそらくＨＣＩの発現に起因するこれらのプールにおけるある程度のレベルのＥＲストレスを示唆していた（図１３Ｄ、ＨＣＩＩＬＣＩＩおよびＨＣＩＬＣＩ試料における長期曝露ＢｉＰレベルを比較）。Ｄｏｘ除去を介して抗体発現を停止すると、ｍＡｂ－ＩＩ（ＨＣＢＬＣＢ）プールを除く全てのＲＴＩプールにおいて細胞内ＢｉＰレベルが低下し、細胞内ＨＣとＢｉＰの両方の初期レベルはＤｏｘ除去前でさえかなり低かった（図１３Ｄ、ＨＣＩＩＬＣＩＩプールと他のプールにおける０日目のＨＣおよびＢｉＰレベルを比較）。
抗体発現全体に対するｍＡｂ－Ｉ ＨＣおよびＬＣの役割を評価するために、ＨＣＩＬＣＩ、ＨＣＩＩＬＣＩＩ、ＨＣＩＬＣＩＩおよびＨＣＩＩＬＣＩ ＲＴＩプールを産生アッセイで評価した。ドキシサイクリンの非存在下では、全てのＲＴＩプールがほとんど抗体を発現せず、抗体発現の厳密な制御を示した（図１４Ａ、－Ｄｏｘ）。全てのＲＴＩプールの増殖率は類似しており、誘導培養物は非誘導培養物と比較してわずかに低い増殖率を有していた（図１４Ｂ）。以前に観察されたように、ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩ ＲＴＩプールは、それぞれ最低および最高の力価および比産生性を有した（図１４Ａおよび１４Ｃ）。興味深いことに、ＨＣＩＩＬＣＩおよびＨＣＩＬＣＩＩＲＴＩプールはいずれも、ＨＣＩＬＣＩよりも高かったが、ＨＣＩＩＬＣＩＩＲＴＩプールよりも低い力価および比産生性を示した（図１４Ａおよび１４Ｃ）。これらの結果は、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣサブユニットおよびＬＣサブユニットが、いずれもｍＡｂ－ＩＩと比較してこの抗体のより低い発現に個々に寄与したことを示した。本発明者らの予想に反して、ＬＣＩサブユニットを発現したハイブリッドＲＴＩプールは、ＨＣＩサブユニットを発現したプールと比較して、わずかに高い力価および比産生性を有していた（図１４Ａおよび１４Ｃ）。これは、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣがＬＣサブユニットと比較して、この抗体のより低い発現においてわずかにより重要な役割を果たすことを示していた。ＲＴＩシステムと組み合わせた抗体鎖交換アプローチの使用により、生物学的ストレス（細胞内ＢｉＰ蓄積など）の明確な指標を同定できなかった場合でさえ、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣサブユニットの発現に関連する負の効果が明らかになった。
実施例７：ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩのＨＣサブユニットおよびＬＣサブユニットとの間のアミノ酸配列の相違
特定のアミノ酸残基がｍＡｂ－Ｉ ＨＣおよびＬＣの問題のある発現に寄与し得るかどうかを評価するために、ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩのＬＣ（図１５Ａ）およびＨＣ（図１５Ｂ）サブユニットのアミノ酸配列をアラインメントさせた。ｍＡｂ－ＩおよびｍＡｂ－ＩＩのＨＣおよびＬＣ分子の全てのＣＤＲ領域のアミノ酸組成は、異なる抗原を標的とするように開発されたため、互いに異なっていた。ＬＣサブユニットでは、残りの可変領域および全ての定常領域について、ｍＡｂ－Ｉ分子とｍＡｂ－ＩＩ分子との間にアミノ酸配列の相違はない。ＬＣＩのＣＤＲ１セグメントはＬＣＩＩよりも６アミノ酸長いが、ＬＣＩＩのＣＤＲ３セグメントはＬＣＩよりも１アミノ酸長い（図１５Ａ）。ＣＤＲセグメントを除く抗体ＨＣサブユニットに関しては、ＨＣＩおよびＨＣＩＩの可変領域および定常領域の残部は、４アミノ酸残基を除いて同一である（図１５Ｂ）。これらのアミノ酸変化のうちの２つはかなり保存的であり（Ｔ→ＳおよびＬ→Ａ）、したがってＨＣＩの低発現に寄与する可能性はなさそうである。ＨＣＩのＮ→Ｇ変化により、抗体ＨＣグリコシル化が防止される。したがって、ＨＣＩの発現に対するＨＣＩＩとＨＣＩとの間のＮ→ＧおよびＹ→Ｖアミノ酸の違いの影響を調べた。ＨＣＩのＧおよびＶアミノ酸残基をそれぞれＮおよびＹに変更する２つの点突然変異を生成した（ＨＣＡ二重変異体またはＨＣＩｄｍ）。ＨＣＩｄｍをＬＣＩおよびＬＣＩＩと共に使用してＲＴＩプールを生成し、これらのプールにおける抗体発現を産生培養物において評価した（図１６Ａ）。所見によると、ＬＣＩと共にＨＣＩｄｍを同時発現すると、ＨＣＩＩＬＣＩＩで観察されたレベルまで抗体発現が増加することが示され、これらの突然変異がＨＣＡ抗体の低い発現レベルを回復できることが示唆された（図１６Ａ）。興味深いことに、ＬＣＩＩと同時発現した場合、ＨＣＩｄｍはＨＣＩＩＬＣＩＩの力価よりもさらに高い力価を達成し、ＨＣＩｄｍがＨＣＩＩと比較して発現および折り畳みに優れていることが示唆された（図１６Ａ）。以前に観察されたように、ＨＣＩＬＣＩは最も低い力価を有し、一方、ＨＣＩＬＣＩＩは中間抗体発現プロファイルを示した（図１６Ａ）。ウェスタンブロット分析により、ＬＣＩの発現は、ＨＣＩｄｍと同時発現した場合でさえ、細胞内ＢｉＰ蓄積の増加と依然として関連していることが明らかになった（図１６Ｂ）。図１６Ｃは、ＲＴＩシステムを使用することで、発現困難な分子を発現する細胞株における問題の原因を分析し、特定し得る方法の診断ロードマップを示す。
実施例８：２の別個の独立したランディングパッドを含むＴＩ宿主細胞の生成。
宿主８は、抗体遺伝子の発現を個別にまたは同時に標的化することができる２つの別個の独立したランディングパッドを含む標的化組込み（ＴＩ）宿主である。宿主８の親細胞株は、単一のランディングパッドを含む宿主７（表２参照）である。第２のランディングパッドを、宿主４ＴＩ宿主内にランディングパッドが位置するゲノム位置で宿主８に挿入した（表２参照）。この挿入は、宿主７ＴＩ宿主内の宿主４ＴＩ部位位置への新しいランディングパッドのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとするノックインによって行った。
これを達成するために、宿主４ＴＩ部位のゲノム領域を、ＴＩ宿主４およびＴＩ宿主７内で特徴づけた。この情報に基づいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとするノックインを促進するために、この特定のゲノム領域を標的とするガイドＲＮＡを構築した。別個に、新たに作製されたランディングパッドを含むドナープラスミドをこの部位にノックインするために作製し、ノックインを促進するために標的化されたノックイン部位の上流および下流のゲノム領域に対応する相同アーム、ならびにノックインクローンのスクリーニングを可能にするためのさらなる遺伝子と共に構築した。ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の遺伝子を含有するプラスミド、ならびにドナープラスミドの同時トランスフェクションを行って、新しいランディングパッドのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとするノックインを促進した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースとするノックインを受けたクローンの選択およびスクリーニングの後、宿主８を最終的に同定し、さらなる評価を行った。既存の宿主７ランディングパッドはインタクトであると決定し、宿主４部位位置に新たにノックインされたランディングパッドも存在し、インタクトであり、正しい位置にあることが確認された。
次いで、両方の部位でのリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）の実現可能性を、各部位について個別に評価し、次いで同時に評価した。宿主７のランディングパッドのみ、宿主４のランディングパッドのみ、および両方の部位で同時にＲＭＣＥによってクローンを生成し、次いで１４日間の流加振盪フラスコ評価で評価した。両方の部位で同時に抗体を発現するクローンの力価および特異的生産性は、各部位での個々の発現と比較して高かった。細胞培養プラットフォームＡと比較して全てのクローンについて力価をさらに上昇させるために、異なる細胞培養プロセス、細胞培養プラットフォームＢでさらなる評価を行った（図１７）。プラットフォームＡ細胞培養物では、宿主４部位についての１４日目の平均力価は３．０ｇ／Ｌであり、宿主７部位については１．９ｇ／Ｌであり、両方の部位について同時に３．９ｇ／Ｌであった。
最終的に、ＴＩ宿主８を、ＴＩ宿主４のランディングパッドのゲノム位置に配置された第２のランディングパッドを追加することによってＴＩ宿主７から作製した。さらなる調査により、ランディングパッドのノックイン、および既存かつ新規の両方のランディングパッドにおけるＲＭＣＥの実現可能性が確認される。さらに、それぞれの部位および両方の部位で宿主８から作製されたクローンの評価は、抗体発現の生産性が同時に示される。個々の部位に対して同時に両方の部位での抗体遺伝子を発現することは、細胞培養プラットフォームＡおよび細胞培養プラットフォームＢの両方で見られる相加的な生産性効果を有する（図１７）。
方法
抗体プラスミドＤＮＡ構築物の構成：１プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣおよびＬＣ断片を、Ｌ３および２Ｌ配列ならびにピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼ（ｐａｃ）選択マーカーを含有するベクター骨格にクローニングした。２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣおよびＬＣ断片を、Ｌ３およびＬｏｘＦＡＳ配列を含む前方ベクター骨格、ならびにＬｏｘＦＡＳおよび２Ｌ配列ならびにｐａｃ選択マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ ＥＴら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２００５、３３、（１７）、ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ Ｓ ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９７，９４，（２６）、１４６０２－７、各内容が参照により本明細書に組み込まれる）を全てのＲＭＣＥプロセスに使用した。
細胞培養：１５０ｒｐｍ、３７℃、および５％ＣＯ２で振盪し、１２５ｍｌ振盪フラスコ容器中の独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２をベースとする培地中でＣＨＯ細胞を培養した。細胞を３～４日ごとに３×１０５細胞／ｍＬの播種密度で継代した。
ＲＭＣＥ安定細胞株の開発：発現プラスミドをＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）エレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によってＴＩ宿主にトランスフェクトした。
次いで、ピューロマイシンおよび１－（２’－デオキシ－２’－フルオロ－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシル－５－ヨード）ウラシル（ＦＩＡＵ）（Ｍｏｒａｖｅｋ）を用いて、ＲＭＣＥトランスフェクションプールを選択した。プール選択後、単一細胞クローニング（ＳＣＣ）を行って、さらなる評価のためにＴＩ細胞株を作製した。
流加産生アッセイ：フィードバッチ生産培養は、独自の化学的に定義された生産培地を含む振盪フラスコまたはａｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に１×１０６細胞／ｍＬで播種し、３日目に３７℃から３５℃に温度を変化させた。３、７、および１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、０、３、７、１０、および１４日目に、培養物中の細胞の生存細胞数（ＶＣＣ）および生存率割合を測定した。Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、７、１０および１４日目にグルコース濃度および乳酸濃度を測定した。ＵＶ検出を伴うタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。
液滴ＰＣＲによる遺伝子コピー数の測定：ｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して、液滴ＰＣＲアッセイを実施した。ｄｄＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、９００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、２５０ｕＭプローブ、３単位のＨａｅＩＩＩ制限酵素およびサンプルＤＮＡを含む各ｄｄＰＣＲ反応。室温で１０分間インキュベートした後、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて液滴を生成した。ＰＣＲ熱サイクル条件は、９５℃で１０分間、続いて９４℃で３０秒間および６０℃で１分間の４０サイクル、次いで９８℃で１０分間で酵素を失活させた。ＰＣＲ反応後、液滴をＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で読み取った。データを収集し、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析した。ＨＣおよびＬＣ遺伝子コピー数を、参照遺伝子Ｂａｘ、アルブミン、Ｈｐｒｔおよびｂ－ミクログロブリンの規定コピー数に基づいて正規化した。この試験で使用したプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。プライマーの配列を表４に列挙する。
Figure 2022514342000005
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲまたはＴａｑｍａｎ）分析：製造者の説明書に従って、シードトレイン培養物からのＲＮＡ試料を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキットを使用して精製した。ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲアッセイを、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ（登録商標）Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。各ＲＴ－ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応物は、ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒミックス、逆転写酵素、３００ｎＭのフォワードプライマー、３００ｎＭのリバースプライマー、１００ｎＭのプローブおよび１０ｎｇの精製ＲＮＡ試料を含有していた。熱サイクル条件は、４８℃で３０分間および９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルであった。全ての反応は、７９００ ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲ増幅後にＳＤＳ ｖ２．４ソフトウェア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてデータを分析した。ＨＣおよびＬＣの相対発現レベルをデルタＣｔ分析法に基づいて決定した。ハウスキーピング遺伝子であるシクロフィリンの発現レベルを参照遺伝子として使用して、各反応において異なるＲＮＡ試料を正規化した。この実験で使用したプライマーは、ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。プライマーの配列を表５に列挙する。
Figure 2022514342000006
ウェスタンブロット分析シードトレイン培養物からの細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤のミニｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＮＰ－４０溶解緩衝液に再懸濁した。細胞溶解物を１３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、上清を回収した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、各溶解物のタンパク質濃度を測定した。等しいタンパク質濃度の各溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液およびＮｕＰａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した後、９５℃で５分間熱変性させた。次いで、溶解物をＮｕＰａｇｅプレキャスト４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷し、電気泳動した。ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。膜を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）中５％脱脂乳溶液を使用して室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、膜を、特異的一次抗体を使用して室温で１時間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄した。二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体を室温で１時間加えた後、ＴＢＳ－Ｔで３回１５分間洗浄した。Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ検出試薬またはＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ検出試薬（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかを使用して膜を現像した。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ ５．１（Ｂｉｏｒａｄ社）をバンドシグナルの定量に使用した。以下の一次抗体を使用した：１：３０００のヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および１：２５００のマウス抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｒｄｉｃｈ）。以下の二次抗体を使用した：１：１００００のヒツジ抗マウス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ）。
実施例９：１本の重鎖、１本の軽鎖プラスミドＤＮＡ構成への追加の軽鎖の付加は、抗体力価および比生産性を改善する。
ＴＩ宿主の生産性に対する抗体コピー数の影響を調べるために、ＲＭＣＥプールを、１本の重鎖および１本の軽鎖（ＨＬ構成）または１本の重鎖および２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）のいずれかを含む単一プラスミドをトランスフェクトすることによって作製した。フローサイトメトリーによるＲＭＣＥの選択、回収および検証の後、プールの生産性を１４日間の流加産生アッセイで評価した。３つの別個の抗体（ｍＡｂ－Ｑ、ｍＡｂ－ＳおよびｍＡｂ－Ｔ）について、ＨＬプールと比較してＨＬＬプールについて力価がおよそ２倍増加したことが観察され、これは主に比生産性の１．５～２．５倍の増加によって引き起こされた（図１８Ａおよび１８Ｂ）。限界希釈を使用することによってトランスフェクトされたプールから追加の単一細胞クローンを生成し、力価および比産生性も、ＨＬ構成由来のクローンよりもＨＬＬ構成由来のクローンの方が高いことが確認された（図１８Ｃ、１８Ｄ）。
実施例１０：ＲＭＣＥプールにおける最大７本の抗体鎖によるトランスフェクションは、抗体の比生産性および力価を増加させる。
抗体の発現に対する抗体鎖数の増加の効果を評価した。ＨＬＬ単一プラスミド構成を、５つの抗体についてのＨＬＬ－ＨＬまたはＨＬＬ－ＨＬＬ二重プラスミド構成と比較した。
ｍＡｂ ＹのＨＬＬ－ＨＬ（５鎖）、ＨＬＬ－ＨＬＬ（６鎖）およびＨＬＬ－ＨＬＨＬ（７鎖）構成を比較した。産生中のＲＭＣＥプールの力価およびＱｐは、一般に、ＨＬＬ－ＨＬ構成からＨＬＬ－ＨＬＬ構成およびＨＬＬ－ＨＬＨＬ構成に増加した（図１９Ａ、１９Ｂ）が、異なるプールの中の増殖（生細胞数ＩＶＣＣの積分値として表される）は相対的に同等であった（図１９Ｃ）。これらのプールにおけるシードトレイン抗体ｍＲＮＡ発現を見ると、ＨＬＬ－ＨＬおよびＨＬＬ－ＨＬＬプールと比較して、ＨＬＬ－ＨＬからＨＬＬ－ＨＬＬおよびＨＬＬ－ＨＬＨＬへの軽鎖ｍＲＮＡの増加、ならびにＨＬＬ－ＨＬＨＬプールにおける重鎖ｍＲＮＡの増加が観察された（図１９Ｄ）。これらのＲＭＣＥプールからの重鎖および軽鎖の細胞内タンパク質レベルも、ウェスタンブロットを用いて測定した。細胞内軽鎖タンパク質レベルは、軽鎖ｍＲＮＡについて観察されたものと密接にマッチし、５鎖構成から６鎖構成および７鎖構成へと増加した（図１９Ｅ、１９Ｆ）。
実施例１１：７本鎖ＨＬＬ－ＨＬＨＬ構成を有する単一細胞クローンは、２つの試験抗体において高い力価および特異的生産性を有する。
７本鎖構成のＨＬＬ－ＨＬＨＬの高力価および生産性が単一細胞クローニング後に維持されるかどうかを評価するために、ｍＡｂ ＹのＨＬＬ－ＨＬ、ＨＬＬ－ＨＬＬおよびＨＬＬ－ＨＬＨＬ ＲＭＣＥプール由来の単一細胞単クローンを作製した。次いで、これらの単クローンを１４日間の流加産生アッセイで評価した。各構成からの上位６つのクローンを見ると、力価およびＱｐが、ＨＬＬ－ＨＬ構成からＨＬＬ－ＨＬＬおよびＨＬＬ－ＨＬＨＬにわずかに増加することがわかった（図２０Ａ、図２０Ｂ）が、増殖が同様のままである（図２０Ｃ）ことがわかった。
ＨＬＬ－ＨＬＨＬの構成が高い単クローン力価をもたらすことを確認するために、異なるｍＡｂ、ｍＡｂ ＩＩＩを使用して、ＨＬＬ－ＨＬ（５本鎖）およびＨＬＬ－ＨＬＨＬ（７本鎖）ＲＭＣＥプールから、宿主４由来の単一細胞クローンを作製した。１４日間のフィードバッチ産生アッセイで評価した後、ＨＬＬ－ＨＬクローンよりもＨＬＬ－ＨＬＨＬクローンの明らかな力価の利点が観察され（図２０Ｄ）、ｍＡｂ Ｕで見られたものよりも大きかった。力価の増大は、主にＨＬＬ－ＨＬＨＬクローンのＱｐがより高いことよって駆動されるようであり（図２０Ｅ）、２つの構成間のＩＶＣＣの平均差はほとんどなかった（図２０Ｆ）。
実施例１２：トランスフェクトされたプラスミドにおける抗体鎖位置は、その生産性に影響を及ぼす。
トランスフェクトされたプラスミドにおける重鎖および軽鎖の位置または配置が、抗体発現に及ぼす影響も評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、ｍＡｂ Ｚの１本の重鎖および１本の軽鎖を有するいくつかの異なる構成を含むプラスミドを用いて作製した。本開示のＴＩ宿主は、同じ組込み部位での２つの異なるプラスミドの組込みを支持するので、重鎖および軽鎖の両方が同じプラスミドから発現される場合、ならびにそれらが前後の異なるプラスミド上で分離される場合の位置効果を調べた（図２１Ａ）。
ＲＭＣＥプールを作成した後、シードトレイン培養物中の抗体Ｚ重鎖および軽鎖のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。重鎖のｍＲＮＡ発現は、軽鎖が先行すると減少し、前方および後方のプラスミドの両方におけるＬＨ構成は、ＨＬ立体配置よりも重鎖ｍＲＮＡ発現が低かった。しかしながら、軽鎖に対する位置の影響は、それがどのプラスミドから発現されたかに依存していた：前方プラスミドでは、軽鎖ｍＲＮＡ発現はＨＬに対してＬＨ構成で増加したが、後部プラスミドでは反対であった。また、前方プラスミド中の軽鎖カセット自体は高レベルの軽鎖ｍＲＮＡを発現したが、後方プラスミド中の単一軽鎖カセットは、任意の立体配置の最も低い軽鎖ｍＲＮＡレベルを有することが観察された（図２１Ｂ）。概して、前部プラスミドと比較して、後部プラスミドにおける重鎖および軽鎖の両方についてよりｍＲＮＡ発現レベルが低かったことが観察された。
これらの異なるＲＭＣＥプールの流加産生アッセイにより、抗体ｍＲＮＡ発現の傾向と同様の一連の力価および比生産性が得られた（図２１Ｃ、２１Ｄ）。ＬＨ－ｍＡｂなしの構成はＨＬ－ｍＡｂなしよりも高いＱｐおよび力価を有したが、最低レベルのＬＣ ｍＲＮＡ発現を有するプール－Ｈ－ＬおよびｍＡｂ－ＬＨなし－もまた最低のＱｐおよび力価を有した。
観察されたｍＲＮＡおよび抗体産生性の違いが抗体鎖位置に起因し、絶対コピー数の変動に起因しないことを確認するために、デジタル液滴ＰＣＲを使用してプールの重鎖および軽鎖のコピー数を測定した。予想通り、全てのプールは、およそ１本の重鎖および１本の軽鎖ＤＮＡコピーを有していた（図２１Ｅ）。
実施例１３：ｍＡｂの高分子量種の割合に対するＨＣとＬＣの比率の影響。
抗体のＨＣ：ＬＣ比が生産性および凝集体などの高分子量種（ＨＭＷＳ）及ぼす影響を評価した。さらに、ＴＩ部位に対する効果を、異なるＴＩ部位を有する細胞を使用することによって評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、ＴＩ宿主４または宿主７の位置において、１本の重鎖および１本の軽鎖（ＨＬ構成）または１本の重鎖および２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）のいずれかを含む単一プラスミドをトランスフェクトすることによって作製した。プールの生産性を、１４日間の流加産生アッセイで評価した（図２２Ａおよび２２Ｂ）。ＨＭＷＳの割合を評価し（図２２Ｂおよび２２Ｄ）、ＨＣ：ＬＣ比の影響が組込み部位とは無関係であることが示された。
生産性および高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＬＣコピーおよび抗体の増加の影響を、ｍＡｂ ＩＶに関連して評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、１本の重鎖および１本の軽鎖（ＨＬ構成）、１本の重鎖および２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）、２本の重鎖および３本の軽鎖（ＨＬＬ－ＨＬ構成）、２本の重鎖および４本の軽鎖（ＨＬＬ－ＨＬＬ構成）、２本の重鎖および５本の軽鎖（ＨＬＬ－ＨＬＬＬ構成）、３本の重鎖および６本の軽鎖（ＨＬＬＬ－ＨＬＬＨＬ構成）、または３本の重鎖および７本の軽鎖（ＨＬＬＬ－ＨＬＬＨＬＬ構成）のいずれかを含む単一プラスミドを、宿主４部位の位置に、または宿主４部位および７部位位置にトランスフェクトすることによって作製した（図２３および図２４）。
多数の力価および産生評価アッセイを通して、多数のクローンを同定し、特定の産生プロセスを用いたａｍｂｒ１５産生評価で評価した。この評価から、細胞培養性能、力価および製品品質属性（凝集割合を含む）によって同定された上位１０個のクローンを、さらなる評価のためにバンク化するように選択した。最終的に、高い力価、凝集割合がより低く、以前に作製されたｍＡｂ－ＶＩ細胞株と同等の産生品質を有するｍＡｂ－ＶＩを発現する２部位組込み細胞株を作製した。図２５は、８．４および８．７ｇ／Ｌの力価を有する上位２つのクローンが、それぞれ７．４％および５．６％の凝集体を有することを示す。
実施例１４：調節された標的化組込み：クローン評価。
この実験では、抗体をコードする配列の調節された標的化組込みを実施した後に、宿主４の調節された誘導体における抗体Ｚの発現を評価した。抗体Ｚの発現を調節するために使用されるシステムは、以下の３つの主要な構成要素：１）シグナル配列の前にタンデムｔｅｔオペロン配列を含む調節プロモーター、２）プロモーターおよびＴｅｔ－リプレッサータンパク質コード配列、ならびに３）抗体Ｚの発現を可能にするためのドキシサイクリンなどの誘導物質から構成される。
抗体Ｚをコードする配列の標的化組込みが確認されたら、振盪フラスコ法Ａで、（総体積の）１０％フィードを３、７および１０日目に実施してクローン評価を行った。１つの産生培養アッセイを行ってクローンを評価した。全てのクローンを、０日目に３×１０６細胞／ｍＬの播種密度で接種した。３、７、および１０日目に、１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを３６個全ての培養物に添加して、抗体Ｚの発現を誘導した。
最終力価および比生産性（Ｑｐ）をそれぞれ図２６および図２７に示す。１４日目に、採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）を力価分析に供した。力価は１～３．６８ｇ／Ｌの範囲であった（クローン７は除外）。バンク化のためのクローン選択を力価によって最初にランク付けし、最終選択は、Ｑｐおよび他のパラメータを含む細胞培養性能に基づいて行った。バンク化のために選択したクローンは、２．６９～３．６８ｇ／Ｌの範囲の力価を示した。
実施例１５：抗体プラスミドを標的化組込み細胞株にランダムに組み込むと、比生産性が５０％増加した。
ＴＩ部位の外側に加えられた追加のＤＮＡコピーが生産性を高めることができるかどうかを試験するために、ＧＳ選択システムを使用して、ＨＬＬ－ＨＬプラスミド構成を有する既存のＴＩ細胞株にＨＬプラスミド（ｍＡｂ Ｚ）をスーパートランスフェクトした。対照として、抗体を含まないＧＳプラスミドの疑似トランスフェクションも実施し、これらの細胞からのクローンを、スーパートランスフェクションしたクローンと同様に開発した。スーパートランスフェクトおよび擬似トランスフェクトされたクローンの両方のセットを用いた産生アッセイでは、擬似クローンと比較して、スーパートランスフェクトされたクローンのＱｐは５０％近く増加したことが観察された（図２８Ｂ）。しかしながら、スーパートランスフェクトされたクローンにおける同様の大きさのＩＶＣＣの減少は、力価に対する全体的な影響をほとんどもたらさなかった（図２８Ａ、図２８Ｃ）。スーパートランスフェクトされたクローンのサブセットについては、重鎖および軽鎖のＤＮＡコピー数が実際に増加したが、擬似トランスフェクトされたクローンはそれらの親ＴＩ細胞株のコピー数を保持していることが確認された（図２８Ｄ）。
実施例１６：抗体Ｚの制御されたスーパートランスフェクション産生。
目的のタンパク質の発現レベルを増加させるために、１つ以上の遺伝子が宿主ゲノムにランダムに組み込まれるように、目的のタンパク質をコードする遺伝子のコピーをさらに加えることによって、スーパートランスフェクションを実施した。目的のタンパク質の既存の構成的発現を有する細胞株を、異なる選択マーカー（すなわち、ピューロマイシン対ＭＳＸ選択）を有する同じ目的のタンパク質の調節可能な発現または構成的発現のいずれかを有する第２の発現ベクターでトランスフェクトした。グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）選択マーカーを有する調節発現カセットを使用して、ドキシサイクリンが添加されるまで抑制されたままである目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節し、その後、目的のタンパク質の発現を可能にした。そのような調節された発現は、選択プロセス中の発現圧力／ストレスをより少なくすることができ、培養中の成長の改善および誘導されるとより高い力価をもたらし得る。構成的発現のために、ＧＳ選択マーカーを有する構成的発現カセットを使用して、目的のタンパク質をコードするコピー遺伝子を導入した。
１３日目の力価は、１３日間の抗体Ｚの発現を伴う構成クローンと比較して、誘導性クローンの大部分がわずか１０日間のタンパク質発現で、それ以上または同等の力価を生じることを示している（図２９Ａ）。選択した細胞株に対して２つの異なる産生手順を使用した。調節された細胞株および構成的スーパートランスフェクトされた細胞株は、いずれも抗体Ｚについて親細胞株と比較して力価が増加していた（図２９Ｂ）。第２の発現ベクターにより制御され、ドキシサイクリンにより制御されたスーパートランスフェクションは、抗体Ｚの力価を０．２～１．２ｇ／Ｌに増加させた（図２９Ｃ）。
記載され、かつ特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられ得る。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例示および説明目的のために提示されている。網羅的であるように、または本開示の主題を開示される実施形態に限定することを意図するものではない。
本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物および方法に様々な修正および変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内の修正および変形を含むことを意図する。
様々な刊行物、特許、および特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (24)

  1. 目的のポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、
    ａ）第１の目的のポリペプチドと、２つの組換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する第１の選択マーカーとをコードする、標的化組込み外因性核酸目的配列（ＳＯＩ）であって、前記標的化組込み外因性ＳＯＩが前記宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれる、標的化組込み外因性核酸ＳＯＩ、および
    ｂ）第２の目的のポリペプチドおよび第２の選択マーカーをコードするランダム組込み外因性核酸ＳＯＩであって、前記ランダム組込みＳＯＩが前記宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれる、外因性核酸ＳＯＩ、を含む、宿主細胞。
  2. 前記第１の目的のポリペプチドと前記第２の目的のポリペプチドとが同一である、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 前記第１の選択マーカーと前記第２の選択マーカーとが同一である、請求項１に記載の宿主細胞。
  4. １個～１０個のランダム組込み外因性核酸ＳＯＩを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
  5. 前記標的化遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、請求項１に記載の宿主細胞。
  6. 前記宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチドおよび第２の選択マーカーをコードする、第２の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩをさらに含み、前記第１の標的化組込み外因性核酸ＳＯＩおよび前記第１の選択マーカーが第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接し、前記第２の標的化外因性ＳＯＩおよび第２の選択マーカーが第２のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに隣接している、請求項１に記載の宿主細胞。
  7. 前記目的のポリペプチドが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  8. 前記宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  9. 前記宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. 前記宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
  11. 前記ＳＯＩおよび選択マーカーの前記標的化組込みが外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項１～７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  12. 前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、１１に記載の宿主細胞。
  13. 目的のポリペプチドを発現させる方法であって、
    ａ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を供給する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む工程、
    ｂ）（ａ）で供給された細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の２つのＲＲＳとマッチし、第１の目的のポリペプチドおよび第２の選択マーカーをコードする第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む核酸を導入する工程、
    ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入する工程であって、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識する工程、
    ｄ）前記第２の選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、
    ｅ）ランダム組込みを介して、第２の目的のポリペプチドおよび第３の選択マーカーをコードする第２の外因性ＳＯＩを前記宿主細胞のゲノムに導入する工程、
    ｆ）前記第３の選択マーカーを発現する細胞を選択する工程、および
    ｇ）前記第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを発現するのに十分な条件下で前記宿主細胞を培養する工程、を含む、方法。
  14. 宿主細胞培養液から、前記第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第１の目的のポリペプチドと前記第２の目的のポリペプチドとが同一である、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記標的化遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記第１の目的のポリペプチドおよび第２の目的のポリペプチドが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＳＯＩのいずれかの標的化組込みが外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、およびクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＳＯＩの発現が調節可能なプロモーターによって制御される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
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