BR112015027567B1

BR112015027567B1 - Polipeptídeo, sequência de ácido nucleico isolada, vetor, método de obtenção de célula, uso de uma célula

Info

Publication number: BR112015027567B1
Application number: BR112015027567-2A
Authority: BR
Inventors: Craig Hofmeister; Jianhua Yu; Jianhong Chu
Original assignee: Ohio State Innovation Foundation
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2024-02-20
Also published as: JP2021177771A; JP2016524598A; EP2992020A4; BR112015027567A2; US11845794B2; CN115028735A; EP3663320A1; US10358494B2; JP2019146579A; MX370173B; HK1218925A1; WO2014179759A1; US20160075784A1; EP2992020B1; US20200002418A1; US20170320941A1; KR102098985B1; JP7221338B2; US10227409B2; DK2992020T3

Abstract

polipeptídeo, sequência de ácido nucleico isolada, vetor, método de obtenção de célula, uso de uma célula. são aqui descritos receptores de antígeno quiméricos (car) que podem reconhecer especificamente antígenos associados a tumor (taa) em células de mieloma múltiplo (mm). também são divulgadas células efetoras imunes, tais como células t ou células exterminadoras naturais (nk), que são projetadas para expressar estes car. portanto, também são divulgados métodos de fornecimento de uma imunidade antitumoral em um sujeito com mm que envolve a transferência adotiva das células efetoras imunes divulgadas projetadas para expressar os car descritos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica benefício do Pedido Provisório U.S. Num. 61/819,141, depositado em 3 de maio de 2013 e Pedido Provisório U.S. Num. 61/876.492, depositado em 11 de setembro de 2013, que são incorporados neste documento a adendo por referência em suas totalidades.

FUNDAMENTOS

[0002] Mieloma múltiplo (MM) é um tumor maligno de célula B caracterizado pela expansão clonal aberrante de células plasmáticas (PCs) dentro da medula óssea, com uma estimativa de 21.700 novos casos e 10.710 mortes por MM identificadas nos Estados Unidos em 2012 (Siegel R, et al. Cancer J Clin 2012 62: 10-29). Em 2013, estima-se que 22.350 novos indivíduos serão diagnosticados com MM nos Estados Unidos e 10.710 morrerão por ele, respondendo por 20% das mortes de todas as malignidades hematológicas. Apesar do uso de inibidores do proteassoma e drogas imune-moduladoras, que melhoraram a sobrevivência em geral (Palumbo A, et al. Leukemia 2009 23:449-456), MM continua a ser uma malignidade incurável (Podar K, et al. Leukemia 2009 23: 10-24) para qual novas abordagens terapêuticas são urgentemente necessárias.

RESUMO

[0003] Neste documento são divulgados polipeptídios de receptor quimérico de antígeno quimérico (CAR) que podem ser usados com transferência de célula adotiva para direcionar e exterminar células de mieloma múltiplo (MM). A glicoproteína de superfície celular CS1 é altamente e ubiquitamente expressa na superfície das células de mieloma enquanto sendo expressas em níveis muito baixos na maioria das células imunes efetoras. Portanto, os polipeptídios CAR divulgados contém em um ectodomínio um agente de ligação anti-CS1 que liga células MM expressando CS1. Tal como acontece com outros CARs, os polipeptídios divulgados também podem conter um domínio transmembrana e um endodomínio capaz de ativar uma célula efetora imune. Por exemplo, o endodomínio pode conter um domínio de sinalização intracelular e, opcionalmente, uma região de sinalização co-estimulatória.

[0004] O agente de ligação anti CS1 é em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo ou um fragmento de ligação de antígeno que liga especificamente CS1. Por exemplo, o domínio de ligação de antígeno pode ser uma Fab ou um fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo que liga especificamente CS1. O agente de ligação anti-CS1 é em algumas modalidades um aptâmero que liga especificamente CS1. Por exemplo, o agente de ligação anti-CS1 pode ser um aptâmero peptídeo selecionado a partir de um conjunto de sequência aleatório, com base na sua capacidade de ligar CS1. O agente de ligação anti-CS1 também pode ser um ligante natural de CS1, ou uma variante e/ou fragmento do mesmo capaz de ligar CS1.

[0005] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular é um domínio de sinalização zeta CD3 (CD 3Z), e a região de sinalização co-estimulante compreende o domínio citoplasmático de CD28, 4-1BB ou uma combinação destes. Em alguns casos, a região de sinalização co-estimulante contém 1, 2, 3 ou 4 domínios citoplasmáticos de uma ou mais sinalização intracelular e/ou moléculas co-estimulantes.

[0006] Também são divulgadas sequências de ácido nucleico isoladas que codificam os polipeptídios CAR divulgados, vetores compreendendo estes ácidos nucleicos isolados e células que contêm estes vetores. Por exemplo, a célula pode ser uma célula efetora imune selecionada a partir do grupo consistindo em uma célula T, uma célula exterminadora natural (NK), um linfócito T citotóxico (CTL) e uma célula T reguladora. Em algumas modalidades, a célula exibe uma imunidade anti-tumoral quando o domínio de ligação do antígeno do CAR se liga ao CS 1.

[0007] Também é divulgado um método de fornecer uma imunidade anti-tumoral em um sujeito com mieloma múltiplo (MM) que envolve a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma célula efetora imune geneticamente modificada com um CAR específico para CS1 divulgado.

[0008] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção estão estabelecidos nos desenhos acompanhantes e a descrição abaixo. Outros recursos, objetos e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0009] As figuras 1A a 1C mostram a geração de um CAR específico para CS1 e sua expressão em células T transfectadas por CAR. A Figura 1A é um diagrama esquemático de uma construção retroviral Pinco-CS1-CAR contendo um scFv contra CS1 ligada a endodomínios CD28 e CD3Z. LTR, repetição de terminal longa; SP, sinal de peptídeo; VH, variável, H, Cadeia; L, ligante; VL, variável L cadeia. Na figura IB, PBMC (células mononucleares de sangue periférico) foram ativadas com grânulos CD3 e CD28 e transfectadas com a construção Pinco-CS1-CAR ou Pinco. Células GFP-positivas foram organizadas, e lisados celulares foram submetidos à análise de IMMUNOBLOT sob condições de redução com anticorpo primário CD3Z anti-humano. Na Figura 1C, ou células T de simulação ou transfectadas por CS1-CAR1 de doadores saudáveis foram coradas com anticorpo de controle rotulado com biotina de cabra anti- camundongo específico a Fab ou combinado quanto a isótipo, seguido por streptavidina e coloração de anticorpo CD3.

[0010] As figuras 2A a 2C mostram que células T redirecionadas por CS1 secretam mais IFN-y e IL-2 do que células de simulação T em resposta a linhas de célula de mieloma expressando CS1. A figura 2A mostra a análise de fluxo citométrico doe expressão de CS1 na superfície das linhas de células de mieloma. As quatro linhas de célula de mieloma indicadas foram coradas com anticorpo mAb anti-CS1 conjugados com PE (linha contínua) ou anticorpo de controle combinado quanto a isótopo (linha pontilhada). As Figuras 2B e 2C são gráficos de barra mostrando a secreção de IFN-y (Fig. 2B, ng/ml) e IL-2 (Fig. 2C, pg/ml) em células T de doador saudável transfectadas por CS1-CAR ou de simulação (2 x 105) que foram cultivadas sozinhas (sem destino) ou estimuladas com igual número de células de mieloma expressando diferentes níveis de CS1 por 24 horas.

[0011] As figuras 3A a 3D mostram que células T redirecionadas pra CS1 preferencialmente eliminam células de mieloma obviamente expressando a proteína CS1. Na figura 3A, células de mieloma rotuladas com 51Cr NCI-H929, IM9, MM. IS e RPMI-8226 (5x103) foram co-cultivados com células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação nas razões E/T indicadas por 4 horas, e lise alvo (liberação de 51Cr) foi medido. Na Figura 3B, a expressão do marcador de degranulação CD 107a e do marcador de ativação de células T CD69 em células T CS1-CAR transfectadas ou de simulação foram avaliados por citometria de fluxo após 4 horas de co-cultura com células NCI-H929. Comparado com as células T transfectadas por simulação, as células T transfectadas por CS1-CAR exibiram degranulação superior e maior ativação de células T em resposta a células expressando CS1 NCI-H929. Na Figura 3C, células T transfectadas por CS1-CAR e de simulação foram permeabilizadas para coloração intracelular com mAb específico para granzima B e perforina e analisadas por citometria de fluxo.

[0012] As figuras 4A a 4D mostram a superexpressão ectópica de CS1 em citotoxicidade melhorada de disparadores de células MM e secreção de citocinas, após o reconhecimento pelas células T CS1-CAR. A figura 4A mostra coloração de fluxo citométrico para proteína CS1 ou controle de isotipo IgG (linha pontilhada) na superfície de células RPMI-8226 superexpressando CS1 (RPMI-8226-CS1, linha contínua pesada) ou um controle de vetor vazio (linha contínua leve RPMI-8226- PCDH). A Figura 4B é um gráfico mostrando a citotoxidade de células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação contra RPMI-8226-CS1 e células RPMI-8226-PCDH. Células RPMI-8226-CS1 e RPMI-8226-PCDH foram incubadas com simulação células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação em razões indicadas E/T por 4 horas, e lise específica foi determinada utilizando um lançamento de ensaio padrão51Cr. Figuras 4C e 4D são gráficos de barra mostrando secreção de IFN-y (Fig. 4C, pg/ml) e IL-2 (Fig. 4D, pg/ml) nas células T transfectadas por CS1- CAR ou de simulação (1 x 105) cultivadas sozinhas ou estimuladas com um número igual de células RPMI-8226-CS1 ou RPMI-8226-PCDH.

[0013] As Figuras 5A a 5D mostram que células T CS1-CAR especificamente reconhecem e eliminam células primárias humanas expressando CS1 de mieloma EX VIVO. A Figura 5A mostra resultados de fluxo citométrico de PBMCs de pacientes com MM que foram ativados com grânulos anti-CD3 e anti-CD28, transduzidos com a construção Pinco ou Pinco-CS1-CAR (simulação) e corados com anticorpos Fab anti-camundongo e CD3 anti-humanos. Resultados de 1 dos 4 pacientes com dados similares são mostrados. A Figura 5B mostra coloração de fluxo citométrico para proteína CS1 em CD138 + células de mieloma recém isoladas de pacientes com MM. resultados de 3 dos 10 pacientes com dados similares são mostrados. A Figura 5C é uma série de gráficos que mostram a Lise específica (51Cr lançamento de ensaio) de CD138+células de mieloma em (B) co- cultivadas com as células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação autólogas em (A) nas razões indicadas E/T por 4 horas. A Figura 5D é um gráfico de barras mostrando a secreção de IFN-Y (pg/ml) pelas células tratadas como em (C) , exceto que a razão E/T foi de 1: 1 e o tempo de incubação foi estendido para 24 horas.

[0014] As figuras 6A e 6B mostram que células T redirecionadas por CS1 inibem o crescimento de tumor e prolongam a sobrevivência de camundongo em um modelo de camundongo de xenoenxerto ortotópico MM. 1S . A Figura 6A é uma série de imagens de bioluminescência dorsais e ventrais dos cinco camundongos representativos portando MM. tumores 1S de cada grupo indicado. Os camundongos NSG foram inoculados por via intravenosa com células 8 x 106 MM. 1S expressando luciferase (dia 0). Nos dias 7 e 14 após a inoculação, cada camundongo recebeu PBS (grupo de controle placebo), 10 x 106 células T de simulação (grupo controle simulado) ou células T CS1-CAR (grupo de tratamento CAR). A figura 6B mostra as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos de fragmentação de MM.1 tratados com PBS, células T simuladas ou células T CS1-CAR.

[0015] As figuras 7A a 7E mostram que 293 células T transformadas expressando CS1 eram suscetíveis a reconhecimento e lise de células T CS1-CAR. A Figura 7A mostra que as células parentais 293T foram negativas para expressão de CS1. Células 293T foram coradas com anticorpo PE-conjugado anti-CS1 mAb (linha contínua) ou controle combinado por isótipo Ab (linha pontilhada) e analisadas por citometria de fluxo. A figura 7B mostra coloração de fluxo citométrico para proteína CS1 na superfície das células 293T superexpressando CS1 (293T-CS1, linha contínua pesada escura) ou um vetor vazio ( 293T-PCDH, linha pesada contínua cinza). Células T 293 expressando CS1 manchado com isotipo IgG (linha pontilhada) serviram como controle de ligação não-específico. A Figura 7C mostra um gráfico de células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação contra células 293T-CS1 e 293T-PCDH. Células 293T- CS1 e 293T-PCDH foram incubadas com células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação em razões indicadas E/T por 4 horas, e lise específica foi determinada utilizando um 51Cr lançamento de ensaio padrão. Figuras 7D e 7E são gráficos de barra mostrando secreção de IFN-y (Fig. 7D, pg/ml) ou secreção de IL-2 (Fig. 7E, pg/ml) por célula T transfectada por CS1-CAR ou de simulação cultivadas sozinhas ou estimuladas com células 293T-CS1 ou 293T-PCDH.

[0016] As figuras 8A e 8B demonstram que as células T CD4+ e CD8+ CS1-CAR T foram ativadas em resposta a células de mieloma. Na Figura 8A, células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação foram cultivadas sozinhas ou estimuladas com NCI- H929 e células MM. 1S por 12 h e, em seguida, expressão de superfície de CD3 e CD8, bem como IFN-y intracelular, foram avaliadas por citometria de fluxo. As parcelas foram delimitadas em linfócitos CD3 +. É mostrado um experimento representativo de três com resultados semelhantes. Na Figura 8B, células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação foram cultivadas sozinhas ou estimuladas com NCI-H929 e células MM. 1S por 4 h e, em expressão de CD3, CD8, bem como o marcador de desgranulação CD107a, foram avaliados por citometria de fluxo. As parcelas foram delimitadas em linfócitos CD3 + em atividade. É mostrado um experimento representativo de três com resultados semelhantes.

[0017] As figuras 9A e 9B mostram que células T redirecionadas por CS1 inibem o crescimento de tumor e prolongam a sobrevivência de camundongo em um modelo de camundongo de xenoenxerto ortotópico IM-9. A Figura 9A mostra imagens de bioluminescência dorsais e ventrais dos cinco camundongos representativos portando tumores IM9 de cada grupo indicado. Camundongos NSG foram inoculados por i.v. com 5 x 105 células IM9 expressando luciferase (dia 0). Nos dias 7 e 21 após a inoculação, cada camundongo recebeu PBS (grupo de controle placebo), 10 x 106 células T de simulação (grupo controle simulado) ou células T CS1-CAR (grupo de tratamento CAR). As cruzes brancas "+" representam os camundongos que morreram de doença MM no grupo tratado por PBS no momento do imageamento. A figura 9B são curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos portando IM-9 tratados com PBS, células T simuladas ou células T CS1-CAR.

[0018] As figuras 10A a 10C mostram que que células T CS1- CAR persistiram e se proliferaram na medula óssea (BM) de camundongos NSG enxertados com células MM.1S. Os camundongos NSG foram inoculados com células 8 x 106 MM. IS no dia 0, e no dia 7, os camundongos foram tratados com 10 x 106 de células T CS1-CAR. No dia 20, os camundongos foram injetados por i.p. com 1,5 mg Brdu em solução DPBS. Os ratos foram sacrificados no dia seguinte, e as células BM foram isoladas para coloração de superfície com anticorpos humanos específicos CD45 e CD3 e/ou anticorpos anti-Brdu (BD Biosciences) seguindo o protocolo do fabricante. A Figura 10A mostra a porcentagem de células T humanas (CD45+/CD3+) no BM de camundongos representativos. Na figura 10B, células T humanas delimitadas (CD45+/CD3+) foram coradas com IgG (painel esquerdo) ou anti- Fab Ab (painel direito) para verificar a expressão de CAR. Na figura 10C, células T humanas delimitadas (CD45+/CD3+) foram coradas com IgG (painel esquerdo) ou anti-Brdu Ab, e a porcentagem de células T incorporadas a Brdu são exibidas.

[0019] As figuras 11A a 11C mostram que células T CS1-CAR exibiram baixos níveis de reatividade contra células T NK e primárias. células NK e T humanas primárias rotuladas com 51 Cr (5 x 103) foram co cultivadas com células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação nas razões indicadas de Efetor/Alvo (E/T)por 4 h e lise de alvo (51Cr lançamento) das células NK (Fig. 11A) e células T (Fig. 11B) foi medido. A Figura 11C é um gráfico de barras mostrando a secreção de IFN-y por células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação cultivadas sozinhas ou estimuladas com células primárias NK, células T ou células de mieloma por 24 h.

[0020] A Figura 12 mostra que células NK primárias, ou células T não desencadearam a morte celular induzida por ativação aparente (AICD) em células T CS1-CAR. As células primárias NK e células T foram incubadas com um número igual de células T transfectadas por CS1-CAR ou de simulação rotuladas por 51Cr por 12h. Lise específica então foi determinada usando um ensaio de liberação51Cr.

[0021] As Figuras 13A a 13C mostram a geração de um CAR específico para CS1 e sua expressão em células NK transfectadas por CAR. A Figura 13A é uma representação esquemática da construção Lentivirus CS1-CAR. A Figura 13B mostra análise de mancha ocidental de expressão de CS1-CAR usando um Ab específico para CD3Z. Dados mostrados são representativos de três experimentos com resultados semelhantes. A Figura 13C mostra a expressão de CS1 scFv quimérico na superfície das células organizadas por FACS NK-92 e NKL transfectadas com a construção CS1-CAR ou vetor vazio (EV) analisados por citometria de fluxo, depois que as células foram manchadas com um anticorpo anti-myc ou um controle de isótipo IgG1. Dados mostrados são representativos de três experimentos com resultados semelhantes.

[0022] As figuras 14A a 14D mostram que células NK CS1-CAR erradicamCS1+ mas não células CS1- MM. A Figura 14A mostra determinação de expressão de CS1 na superfície de linhas celulares L363, IM9 e U266 MM por citometria de fluxo após as células terem sido manchadas com anticorpo de controle combinado por isótopo ou anti-CS1 mAb. Figuras 14B a 13D mostram atividade citotóxica de células NK-92 ou NKL transfectadas de simulação ou transfectadas por CS1-CAR contra células IM9 (Fig. 14B), L363 (Fig. 14C) e U266 (Fig 13D) usando um padrão 51Cr de lançamento de ensaio. NK-92-EV e NKL- EV indicam células de vetor vazio (EV) NK-92 e NKL transfectadas por controle, respectivamente. NK-92-CS 1 - CAR e NKL-CS 1-CAR indicam transdução de células NK-92 e NKL, respectivamente, com uma construção de CS1-CAR. * e * * indicam P < 0,05 e P < 0,01, respectivamente.

[0023] As figuras 15A a 15C mostram que o reconhecimento de célulasCS1 +MM induz a uma resposta mais forte de células CS1- CAR NK do que de células NK de controle. As figuras 15A a 15C são gráficos de barra, mostrando a secreção de IFN-y por células efetoras NK-92 ou NKL transfectadas por CS1-CAR o transfectadas de simulação, co-cultivadas com um número igual de IM9 células de mieloma (Fig. 15 A), L363 (Fig. 15B) ou U266 (Fig. 15C) por 24 h. NK-92-EV e NKL-EV indicam células de vetor vazio (EV) NK-92 e NKL transfectadas por controle, respectivamente. NK-92-CS1-CAR e NKL-CS1-CAR indicam transdução de células NK-92 e NKL, respectivamente, com uma construção de CS1-CAR.

[0024] As figuras 16A a 16C mostram que reconhecimento de alvo aprimorado de células NK-92-CS1-CAR depende da expressão de CS1 em células MM. A Figura 16A mostra mancha de fluxo citométrico para uma proteína CS1 ou um controle IgG (linha pontilhada) na superfície de células U266 superexpressando CS1 (U266-CS1, linha contínua pesada) ou um controle de vetor vazio (U266-Vetor, linha contínua leve). A Figura 16B mostra citotoxicidade de células NK-92 de simulação - ou transfectadas por CS1-CAR (NK-92-EV e NK-92-CS1-CAR, respectivamente) contra células U266-vetor e U266-CS1. Células U266-vetor ou U266-CS1 foram incubadas com células NK-92-CS1- CAR ou NK-92-EV em diferentes razões efetor/alvo (E/T) por 4 h. Lise específica foi determinada utilizando um lançamento de ensaio padrão51Cr. * indica P < 0,05. Células (c) NK-92-CS 1- CAR ou NK-92-EV foram co cultivadas com igual número de células de mieloma U266-vetor ou U266-CS1 por 24h. Sobrenadantes foram então colhidos para medição de secreção de IFN-Y usando ELISA.

[0025] As figuras 17A a 17C mostram uma caracterização fenotípica de células NK modificadas por CS1-CAR. Na figura 17A, células NK-92 transfectadas de simulação ou por CS1-CAR (NK-92-EV e NK-92-CS1-CAR, respectivamente) foram também cultivadas sozinhas, ou cultivadas com células IM9 MM por 4 h. Expressão de superfície de NKp30, NKp46, NKG2C, NKG2D, CD69 e HLA-DR foi avaliada por citometria de fluxo após coloração com os mAbs correspondentes e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi gravada. * indica P < 0,05. Na figura 17B, NK-92-EV e células NK-92-CS1-CAR foram permeabilizadas para coloração intracelular com mAb específico para perforina ou granzima B e analisadas por citometria de fluxo. A linha tracejada representa a coloração de células de controle NK-92-EV com anticorpo de controle IgG, linha contínua pesada denota coloração de células NK-92-CS1-CAR com anticorpo Granzima B ou Perforina, e a linha contínua leve indica coloração de células de controle NK-92-EV com anticorpo Granzima B ou perforina. A figura 17C mostra MFI para histogramas mostrados na figura 17B. * indica P < 0,05.

[0026] As figuras 18A a 18C mostram que células NK-92 transfectadas por CS1-CAR melhoram a exterminação de células de mieloma humano primário. A figura 18A mostra coloração de fluxo citométrico para proteína CS1 ou controle de isotipo IgG, demonstrando que células de mieloma primário CD138 +altamente expressam CS1. Os histogramas abertos e preenchidos representam coloração com anticorpos de controle combinados com isótipo e anticorpos anti-CS1, respectivamente. Dados mostrados são representativos de duas das seis amostras de pacientes com resultados semelhantes. A figura 18B mostra atividade citotóxica de células NK-92 traduzidas por CS1-CAR ou de simulação (NK-92-EV e NK-92-CS1-CAR, respectivamente) contra células de mieloma primário CD138+ de três dos seis pacientes com resultados semelhantes, usando um lançamento de ensaio 51Cr padrão. E/T indica a razão de célula efetora/célula alvo. * indica P < 0,05. A Figura 18C mostra secreção de IFN-y por células de mieloma primário CD 138+ co-cultivadas com células NK-92-EV ou NK-92-CS 1-CAR em uma razão E/T de 5: 1 por 24h. Dados mostrados são representativos de uma das três amostras de pacientes com resultados semelhantes.

[0027] As figuras 19A a 19D mostram que células CS1-CAR NK suprimem crescimento in vivo de células MM humanas ortotópicas e prolongam a sobrevivência de camundongos portando MM. A figura 19A (esquerda) é uma imagem mostrando grande infiltração de células humanas IM9, detectadas por coloração de hematoxilina-eosina (H & E), nas lesões ósseas de vértebras lombares de um camundongo representativo exibindo paralisias de pata traseira após ser injetado por i.v. com células IM9. A figura 19A (direita) mostra coloração imuno-histoquímica de lesões ósseas de vértebras lombares de camundongo com CD 138 mAb anti-humano. A figura 19B mostra imagens de bioluminescência dorsal de camundongos com tumores IM9. Os camundongos NSG foram inoculados com 5 x 105 células IM9 expressando luciferase através de uma injeção de veia de cauda (dia 0). Sete dias após a inoculação, os camundongos foram tratados com células NK-92 transfectadas de simulação (NK-92- EV), células NK-92 transfectadas por CS1-CAR (NK-92-CS 1-CAR) ou solução salina tamponada com fosfato (um controle negativo). A Figura 19C é um gráfico de barras mostrando o resumo de quantificação de unidades de fótons por segundo por camundongo da figura 19B. * indica P < 0,05; * * denota P < 0,01. A Figura 19D mostra as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de ratos portando IM0 tratados com células NK-92- CS1-CAR em comparação com os camundongos tratados com células NK-92-EV. * indica P < 0,05.

[0028] A figura 20 mostra que a introdução de CS1 CAR não leva à apoptose substancial em linhas celulares NK. Células NKL ou NK92 transfectadas por CS1-CAR ou de simulação foram coradas com 7AAD e anexina V-V450, seguidos de uma análise de fluxo citométrico. NK-92-EV e EV NKL indicam células NK092 transfectadas de controle de vetor vazio (EV) e NKL, respectivamente NK-92-CS 1 -CAR e NKL-CS 1-CAR indicam transdução de células NK-92 e NKL, respectivamente, com uma construção CS1-CAR.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0029] São divulgados neste documento receptores quiméricos de antígeno (CAR) que especificamente reconhecem antígenos associados a tumores (TAA) em células de mieloma múltiplo (MM). Também são divulgadas células efetoras imunes, tais como células T ou células exterminadoras naturais (NK), que são projetadas para expressar esses CARs. Portanto, também são divulgados métodos para prover uma imunidade anti-tumoral em um sujeito com MM que envolve transferência adotiva das células efetoras imunes divulgadas projetadas para expressar os CARs específicos para CS1.

Receptores quiméricos de antígeno específicos para CS1 (CAR)

[0030] CARs geralmente incorporam um domínio de reconhecimento de antígeno de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de um anticorpo monoclonal (mAb) com motivos de sinalização transmembranares envolvidos na ativação de linfócitos (Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45). A glicoproteína de superfície celular CS1 é altamente e ubiquamente expressa na superfície das células de mieloma (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 200814:2775-84). CS1 é expressa em níveis muito baixos na maioria das células efetoras imunes, incluindo as células exterminadoras naturais (NK), alguns subconjuntos de células T e células B normais e é quase indetectável em células mielóides (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84). Notavelmente, CS1 é expresso de forma desprezante em células-tronco hematopoiéticas humanas (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84), que podem ser usadas para transplante de células-tronco para tratar malignidades hematológicas, incluindo MM. As funções de CS1 em MM permanecem incompletamente compreendidas, e foi documentado que CS1 pode desempenhar um papel na aderência de célula de mieloma, crescimento clonogênico e tumorigenicidade (Benson DM Jr, et al. J Clin Oncol 2012 30:2013-5; Tai YT, et al. Blood 2009 113:4309-18). Foi demonstrado que ter como alvo o CS1 com mAb elotuzumab humanizado é seguro na clínica (Benson DM Jr, et al. J Clin Oncol 2012 30:2013-5; Tai YT, et al. Blood 2009 113:4309-18). Estudos pré-clínicos mostram que este anticorpo inibe a aderência de célula de mieloma a células de estroma da medula óssea, induz citotoxicidade celular dependente de anticorpo mediada por células de NK, e erradica os tumores de enxerto heterólogo iniciados pelas células de mieloma humanas em camundongos imunodeficientes (Benson DM Jr, et al. J Clin Oncol 2012 30:2013-5; Tai YT, et al. Blood 2009 113:4309-18; Tai YT, et al. Blood 2008 112: 1329-37). Portanto, é divulgado neste documento um receptor quimérico de antígeno (CAR) específico para CS1 que pode ser que pode ser expresso em células efetoras imunes para melhorar a atividade antitumoral contra mieloma múltiplo humano.

[0031] O CAR divulgado é geralmente composto por três endodomínio. O ectodomínio compreende a região de ligação de CS1 e é responsável pelo reconhecimento de antígeno. Também geralmente contém um peptídeo de sinal (SP) para que o CAR possa ser glicosilado e ancorado na membrana celular da célula efetora imune. O domínio transmembrana (TD), como seu nome sugere, conecta o ectodomínio ao endodomínio e reside dentro da membrana celular, quando expressos por uma célula. O endodomínio é a extremidade operativa do CAR que transmite um sinal de ativação para a célula efetora imune após reconhecimento de antígeno Por exemplo, o endodomínio pode conter um domínio de sinalização intracelular (ISD) e, opcionalmente, uma região de sinalização co-estimulatória (CSR).

[0032] Em algumas modalidades, o CAR divulgado é definido pela fórmula: SP-CS1-HG-TM-CSR-ISD; ou SP-CS1- HG-TM-ISD-CSR em que "SP" representa um peptídeo de sinal, em que "CS1" representa uma região de ligação CS1, em que "HG" representa um domínio de charneira opcional, em que "TM" representa um domínio transmembrana, em que "CSR" representa uma região de sinalização co- estimulatória, em que "ISD" representa um domínio de sinalização intracelular, e representa um vinculador bivalente.

[0033] O domínio de reconhecimento de antígeno do CAR divulgado é geralmente um scFv. Existem no entanto muitas alternativas. Um domínio de reconhecimento de antígeno das cadeias únicas de receptor de célula T nativo (TCR) alfa e beta único foram descritos, assim como ectodomínios simples (por exemplo, ectodomínio CD4 para reconhecer as células infectados pelo HIV) e componentes de reconhecimento mais exóticos tais como uma citocina ligada (que leva ao reconhecimento de células portadoras do receptor de citocina). Na verdade, quase tudo que liga um determinado destino com afinidade elevada pode ser usado como uma região de reconhecimento de antígeno.

[0034] O endodomínio é a extremidade operativa do CAR que, após o reconhecimento de antígeno, (i.e., CS1) transmite um sinal para a célula efetora imune, ativando pelo menos uma das funções efetoras normais da célula efetora imune. A função efetora de uma célula T, por exemplo, pode ser de atividade citolítica ou uma atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. Portanto, o endodomínio pode incluir o "domínio sinalização intracelular" de um receptor de células T (TCR) e co-receptores opcionais. Embora geralmente o domínio de sinalização intracelular inteiro possa ser empregado, em muitos casos não é necessário usar toda a cadeia. Na medida em que uma parte truncada do domínio de sinalização intracelular é usada, tal parte truncada pode ser utilizada no lugar da cadeia intacta, contanto que ela realize a transdução do sinal de função efetora.

[0035] Sequências de sinalização citoplasmática que regulam a ativação primária do complexo TCR que atuam de forma estimulatória podem conter temas de sinalização que são conhecidos como temas de ativação imunoreceptores baseados em tirosina (ITAMs). Exemplos de ITAM contendo sequências de sinalização citoplasmáticas inclueme aqueles derivados de TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. No entanto, em modalidades preferenciais, o domínio de sinalização intracelular é derivado de CD3zeta (CD 3Z).

[0036] A cadeia (CD3Z) zeta CD3 de glicoproteína de superfície de célula T, também conhecido como cadeia zeta T3 de receptor de célula T ou CD247 (Conjunto de diferenciação 247), é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene CD247.

[0037] CARs de primeira geração normalmente tinham o domínio intracelular da cadeia CD3Z, que é o principal transmissor de sinais de TCRs endógenas. CARs de segunda geração adicionam domínios de sinalização intracelulares de vários receptores de proteína co-estimulatórios (por exemplo, CD28, 41BB, ICOS) para o endodomínio do CAR para fornecer sinais adicionais para a célula T. Estudos pré-clínicos indicaram que a segunda geração de projetos de CAR melhora a atividade antitumoral das células T. CARs mais recentes, de terceira geração combinam vários domínios de sinalização para aumentar ainda mais a potência. Células T enxertadas com esses CARs têm demonstrado maior expansão, ativação, persistência e eficiência de erradicação de tumor independente da interação co- estimulatória de receptor/ligante (Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5).

[0038] Por exemplo, o endodomínio do CAR pode ser projetado para incluir o domínio de sinalização CD3Z por si só ou combinado com qualquer outro(s) domínio(s) citoplasmático(s) desejado(s) útil(eis) no contexto do CAR da invenção. Por exemplo, o domínio citoplasmático do CAR pode compreender uma porção de cadeia zeta CD3 e uma região de sinalização co- estimulante. A região de sinalização co-estimulante refere-se a uma porção do CAR que compreende o domínio intracelular de uma molécula co-estimulante. Uma molécula co-estimulante é uma molécula de superfície celular que não seja um receptor quimérico de antígeno ou seus ligantes que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos a um antígeno. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno-1 associada a função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que liga especificamente CD83 e similares. Assim, enquanto o CAR é exemplificado principalmente com CD28 como elemento de sinalização co-estimulante, outros elementos co-estimulantes podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros elementos de sinalização co-estimulante.

[0039] Em algumas modalidades, o CAR compreende uma sequência de charneira. Uma sequência de charneira é uma pequena sequência de aminoácidos que facilita a flexibilidade do anticorpo (ver, por exemplo, Woof et al, Nat. Rev. Immunol, 4(2): 89-99 (2004)). A sequência de charneira pode serposicionada entre a fração de reconhecimento de antígeno (por exemplo, um anti- CS1 scFv) e o domínio transmembrana. A sequência de charneira pode ser qualquer sequência apropriada derivada ou obtida de qualquer molécula apropriada. Em algumas modalidades, por exemplo, a sequência de charneira é derivada de uma molécula CD8a ou uma molécula CD28.

[0040] O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Em que a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína de ligada a membrana ou transmembrana. Por exemplo, a região transmembrana pode ser derivada (ou seja, compreender pelo menos a região ou regiões transmembrana de) a cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33,CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ou CD154. Como alternativa, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que ele compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos como leucina e valina. Em alguns casos, um trio de fenilalanina, triptofano e valina se encontrarão em cada extremidade de um domínio de transmembrana sintético. Um ligante oligo - ou polipeptídio curto, tal como entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o domínio endoplásmico do CAR.

[0041] O vinculador bivalente pode ser qualquer molécula apropriada para ligar um composto ou ácido nucleico a uma sequência de polinucleotídicas. Métodos e composições para conjugação de biomoléculas, tais como polinucleótidos, são divulgados em G.T.Hermanon, Bioconjugate Techniques (2nd ed.), Academic Press (2008), que está incorporado por referência em sua totalidade para o ensino destas técnicas. Em alguns casos, o ligador bivalente compreende um ou mais aminoácidos. No entanto, isso também pode incluir uma ligação peptídica ligando diretamente os domínios divulgados.

[0042] Em algumas modalidades, o CAR específico para CS1 divulgado compreende um ou mais dentre SP, CS1, HG, TM, CSR, ISD, e/ou componentes de vinculador estabelecidos na Tabela 1, ou seus variantes tendo pelo menos 65%, 70%,71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência para as sequências estabelecidas na tabela 1.

[0043] Portanto, em algumas modalidades, as CAR específicas de CS1 divulgadas compreendem a sequência de aminoácidos Num SEQ ID NO: 1 (mostrado abaixo), ou uma variante desta tendo pelo menos uma identidade de sequência de 65%, 70%, 71%, 72%,73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%,80%, 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ao Num SEQ ID NO: 28.

Construção CS1-CD28-CD3Z:

[0044] MGWSSIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTTYW MNWVKQRPGQGLEWIGMIHPSDSETRLNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLS SPTSEDSAVYYCARSTMIATRAMDYWGQGTSVTVSGGGGSGGGGSGGGGSD IVMTQSQKSMSTSVGDRVSITCKASQDVITGVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYR YTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISNVQAEDLAVYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK LEPKSCDKTHTCPPCPDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRL LHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQ NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGE RR GKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (Num SEQ ID NO:28).

Ácidos nucleicos e vetores

[0045] Também são divulgados polinucleótidos e vetores polinucleotídicas codificando as CARs específicas de CS1 que permitem a expressão das CARs específicas de CS 1 nas células efetoras imunes divulgadas.

[0046] Por exemplo, em algumas modalidades, as CAR específicas de CS1 divulgadas são codificadas pela sequência de ácido nucleico NUM SEQ ID NO :28 (mostradas abaixo), ou uma variante destas tendo pelo menos uma identidade de sequência de 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ao Num SEQ ID NO:29. Construção PCDH-CS1-scFv-myc tag-CD28-CD3zeta (PCDH-CS1-CAR) : ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTC CACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGG AGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCGGGGTACTCCTTCACCACCTA CTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTG GCATGATTCATCCTTCCGATAGTGAAACTAGGTTAAATCAGAAGTTCAAG GACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCA ACTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAT CTACTATGATTGCGACGAGGGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCA GTCACCGTCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGG CGGTTCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCAGAAATCCATGTCCACATCAGT AGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTTATTACTG GTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAATTACTGATT TACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGT GGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAATGTGCAGGCTGAAGA CCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCTCTCACTTTCGG TGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAA CTCACACATGCCCACCGTGCCCGGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGG TTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTA TTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATG AACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTA TGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCA GGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAAC GAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGAC GTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCA GGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTAC AGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATG GCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTT CACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA (Num SEQ ID NO:29).

[0047] As sequências de ácido nucleico que codificam as CARs divulgadas e suas regiões, podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na arte, tais como, por exemplo, triagem de bibliotecas de células expressando o gene, ao derivar um vetor conhecido por incluir o mesmo gene, ou ao isolar diretamente de células e tecidos que contenham o mesmo, usando as técnicas padrão. Alternativamente, o gene de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.

[0048] Expressão de ácidos nucléicos codificando CARs normalmente é conseguida através da ligação operável de um ácido nucleico codificando o polipeptídio de CAR para um promovedor e incorporação de uma construção em um vetor de expressão. Vetores de clonagem típicos contêm terminadores de transcrição e translação, sequências de iniciação e promovedores úteis para regulação da expressão da sequência de ácido nucleico desejada.

[0049] O ácido nucleico divulgado pode ser clonado em um número de tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor, incluindo, mas não se limitando a um plasmídeo, um fagemídeo, um derivado de fago, um vírus de animal e um cosmídeo. Vetores de particular interesse incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sonda e vetores de sequenciamento.

[0050] Adicionalmente, o vetor de expressão pode ser provido para uma célula na forma de um vetor viral. Tecnologia de vetor viral é bem conhecida na arte e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Vírus, que são úteis como vetores incluem, mas não estão limitados a, retrovírus, adenovírus, vírus associados a adeno, vírus de herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promovedora, lugares de endonuclease de restrição conveniente e um ou mais marcadores selecionáveis. Em algumas modalidades, os vetores polinucleotídicos são vetores lentiviraiss ou retrovirais.

[0051] Um número de sistemas baseados em vírus foram desenvolvidos para a transferência de genes em células de mamíferos. Por exemplo, retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de entrega de gene. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e empacotado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas na técnica. O vírus recombinante pode ser isolado e entregue a células do sujeito in vivo ou ex vivo.

[0052] Um exemplo de um promovedor adequado é a sequência promovedora de citomegalovírus (CMV) imediata precoce. Esta sequência promovedora é uma sequência promovedora forte constitutiva capaz de conduzir elevados níveis de expressão de qualquer sequência polinucleotídica operativamente ligada aos mesmos. Outro exemplo de um promovedor adequado é Fator de Crescimento de Alongamento - 1α (EF-1α). No entanto, outras sequências promovedoras constitutivas também podem ser utilizadas, incluindo, mas não limitadas ao promovedor precoce de vírus simian 40 (SV40), promovedor de MND (vírus de sarcoma mieloproliferativa), vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), vírus de imunodeficiência humana (HIV) promovedor de repetição terminal longa (LTR), promovedor de MoMuLV, um promovedor de vírus de leucemia aviária, um promovedor precoce imediato do vírus Epstein - Barr, um promovedor do vírus do sarcoma de Rous, bem como promovedores de genes humanos, tais como , mas não se limitando a, o promovedor de actina, o promovedor de miosina, o promovedor de hemoglobina e o promovedor de quinase creatina. O promovedor pode alternativamente ser um promovedor indutível. Exemplos de promovedores indutíveis incluem, mas não estão limitados a um promovedor de metalotionina, um promovedor de glicocorticóide, um promovedor de progesterona e um promovedor de tetraciclina.

[0053] Elementos promovedores adicionais, por exemplo, potencializadores, regulam a frequência de iniciação transcricional. Normalmente, estes estão localizados na região 30-110 bp a montante do local de início, embora um número de promovedores recentemente tenha sido verificado contendo elementos funcionais a jusante do local de início também. O espaçamento entre os elementos promovedores frequentemente é flexível, de maneira que a função de promovedor seja preservada quando elementos são invertidos ou movidos em relação um ao outro.

[0054] A fim de avaliar a expressão de um polipeptídio de CAR ou suas porções, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula pode conter também um gene marcador selecionável ou um gene repórter, ou ambos, para facilitar a identificação e seleção de células de expressão da população de células procuradas para serem transfectadas ou infectadas por meio de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser transportado em um pedaço de DNA separado e usado em um procedimento de co-transfecção. Ambos os marcadores selecionáveis e genes repórteres podem ser flanqueados com sequências reguladoras apropriadas para permitir expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos.

[0055] Os genes repórter são utilizados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente em ou expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídio, cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, a atividade enzimática. Expressão do gene repórter é analisada em um tempo apropriado depois que introduziu-se o DNA nas células receptoras. Os genes repórter adequados podem incluir genes que codificam luciferase, beta-galactosidase, acetiltransferase cloranfenicol, fosfatase alcalina secretada ou o gene da proteína verde fluorescente. Sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidas comercialmente. Em geral, a construção com a região flanqueada mínima de 5' mostrando o alto nível de expressão do gene repórter é identificada como o promovedor. Tais regiões promovedoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar os agentes quanto à capacidade de modular transcrição dirigida por promovedor.

[0056] Métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bacteriana, fermento ou inseto por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[0057] Métodos físicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem a precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletroporação e afins. Métodos para a produção de células, compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al.(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Nova Iorque.

[0058] Métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Vetores virais e especialmente vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente utilizado para a inserção de genes em células mamíferas, por exemplo, humanas.

[0059] Meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos da macromolécula, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas baseados em lipídios, incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sistema coloidal exemplar para usar como um veículo de entrega in vitro e in vivo é um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial).

[0060] No caso em que um sistema de entrega não - viral é utilizado, um veículo de entrega exemplar é um lipossoma. Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser associado com um lipídio. O ácido nucleico associado com um lipídio pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossoma, intercalado dentro da bicamada lipídica de um lipossoma, anexado a um lipossoma através de uma molécula ligante que é associada com o lipossoma e o oligonucleotídeo, aprisionado em um lipossoma, complexado com um lipossoma, dispersado em uma solução contendo um lipídio, misturado com um lipídio, combinado com um lipídio, contido como uma suspensão em um lipídio, contido ou complexado com uma micela ou caso contrário, associado com um lipídio. Composições associadas a vetor de lipídios/expressão, lipídios ou lipídios/DNA não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, elas podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura de "colapso". Eles simplesmente também podem ser intercaladas em uma solução, eventualmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou formato. Lipídios são substâncias graxa que podem ser lipídios de ocorrência natural ou sintética. Por exemplo, lipídios incluem as gotas graxas que ocorrem naturalmente no citoplasma, bem como a classe de compostos que contém hidrocarbonos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, amino álcoois e aldeídos. Lipídios apropriados para o uso podem ser obtidos a partir de fontes comerciais. Por exemplo, dimiristil fosfatidilcolina ("DMPC") pode ser obtida de Sigma, St Louis, Mo.; fosfato de dicetil ("DCP") pode ser obtido de K & K Laboratories (Plainview, NY); colesterol ("Choi") pode ser obtido de Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") e outros lipídios podem ser obtidos de Avanti Polar Lipídios, Inc, (Birmingham, Alabama).

Células efetoras imunes

[0061] Também são divulgadas células efetoras imunes que são projetadas para expressar as CARs divulgadas. Estas células são obtidas de preferência do sujeito a ser tratado (ou seja, são autólogas). No entanto, em algumas modalidades, linhas de células efetoras imunes ou células efetoras de doador (alogênicas) são usadas. Células efetoras imunes podem ser obtidas a partir de várias fontes, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido do nó de linfa, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascite, derrame pleural, tecido de baço e tumores. Células imunes efetoras podem ser obtidas a partir de sangue coletado de um sujeito usando qualquer número de técnicas conhecidas pela pessoa versada na técnica, tais como a separação de Ficoll™. Por exemplo, células do sangue circulante de um indivíduo podem ser obtidas por aférese. Em algumas modalidades, as células imunes efetoras são isoladas de linfócitos do sangue periférico por lise de células vermelhas do sangue e empobrecimento dos monócitos, por exemplo, por meio de centrifugação através de uma gradiente PERCOLL™ ou por elutriação centrífuga de contracorrente. Uma subpopulação específica de células efetoras imunes pode ser ainda mais isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, células efetoras imunes podem ser isoladas usando uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície exclusivos para as células selecionadas positivamente, por exemplo, pela incubação com grânulos de anticorpo conjugado por um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células efetoras imunes desejadas. Como alternativa, o enriquecimento da população de células efetoras imunes pode ser realizado por seleção negativa usando uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície exclusivos para as células selecionadas negativamente.

[0062] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes compõem qualquer leucócito envolvido na defesa do organismo contra doenças infecciosas e materiais estranhos. Por exemplo, as células efetoras imunes podem compreender linfócitos, monócitos, macrófagos, células dentríticas, mastócitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos ou qualquer combinação das mesmas. Por exemplo, as células efetoras imunes podem compreender linfócitos T.

[0063] Células T ou linfócitos T podem ser distinguidos de outros linfócitos, tais como as células B e células exterminadoras naturais (células NK), pela presença de um receptor de células T (TCR) na superfície das células. Elas são chamadas de células T porque elas amadurecem no timo (embora algumas também amadureçam nas amígdalas). Existem vários subconjuntos de células T, cada um com uma função distinta.

[0064] As células auxiliares T (células TH) ajudam outras células brancas do sangue em processos imunológicos, incluindo a maturação de células B em plasmócitos e células B de memória e ativação de macrófagos e células T citotóxicas. Estas células são também conhecidas como células CD4 + T porque elas expressam a glicoproteína CD4 em sua superfície. As células auxiliares T se tornam ativadas quando elas são apresentadas com antígenos de peptídeo pelas moléculas de classe II MHC, que são expressas na superfície das células que apresentam antígeno (APCs). Uma vez ativadas, elas dividem-se rapidamente e secretam pequenas proteínas chamadas citocinas que regulam ou auxiliam na resposta imune ativa. Estas células podem diferenciar em um dos vários subtipos, incluindo TH1, TH2, TH3, TH17, TH9, or TFH, que secretam citocinas diferentes para facilitar um tipo diferente de resposta imune.

[0065] Células T citotóxicas (células Tc, ou CTLs) destroem células infectadas viralmente e células tumorais e também são implicadas na rejeição de transplante. Estas células são também conhecidas como células CD8+ T porque elas expressam a glicoproteína CD8 em sua superfície. Essas células reconhecem seus alvos por ligação ao antígeno associado com moléculas classe I MHC, que estão presentes na superfície de todas as células nucleadas. Através de IL-10, adenosina e outras moléculas secretadas por células T reguladoras, as células CD8 + podem ser inativadas para um estado anérgico, que previne doenças auto-imunes.

[0066] As células T de memória são um subconjunto de células T específicas de antígeno que persistem a longo prazo após uma infecção tenha sido resolvida. Eles rapidamente expandem-se para um grande número de células efetoras T sobre re-exposição ao seu antígeno cognato, proporcionando assim o sistema imunológico com "memória" contra infecções passadas. Células de memória podem ser CD4+ ou CD8+. células T de memória geralmente expressam a proteína de superfície celular CD45RO.

[0067] Células T regulatórias (Treg células), anteriormente conhecidas como células T supressoras, são cruciais para a manutenção da tolerância imunológica. Seu principal papel é de desligar a imunidade mediada por células T no final de uma reação imune e de suprimir as células T auto-reativas que escaparam do processo de seleção negativa no timo. Duas principais classes de células CD4+ Treg foram descritas — células Treg de ocorrência natural e células Treg adaptáveis.

[0068] Células T (NKT) exterminadoras naturais (não devem ser confundidas com células exterminadoras naturais (NK)) fazem a ponte do sistema imune adaptativo com o sistema imune inato. Ao contrário de células T convencionais que reconhecem antígenos de peptídeo apresentados pelas moléculas complexas de histocompatibilidade (MHC) principais, células NKT reconhecem o antígeno glicolipídio apresentado por uma molécula chamada CD 1d.

[0069] Em algumas modalidades, as células T compreendem uma mistura de células CD4 +. Em outras modalidades, as células T são enriquecidas por um ou mais subgrupos com base na expressão de superfície de célula. Por exemplo, em alguns casos, os componentes de T são linfócitos T CD8+ citotóxicos. Em algumas modalidades, as células T compreendem as células yδ T, que possuem um distinto receptor de células T (TCR) tendo uma cadeia y e uma cadeia δ em vez de cadeias αe β.

[0070] Células naturais exterminadores (NK) são linfócitos granulares grandes CD56+ CD3- que podem matar células viralmente infectadas e transformadas e constituem um subconjunto celular crítico do sistema imune inato (Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53: 1666-1676). Ao contrário de linfócitos T CD8+ citotóxicos, células NK liberam citotoxicidade contra células tumorais, sem a necessidade de sensibilização prévia, e também pode erradicar células MHC-I- negativas (Narni-Mancinelli E,et al. Int Immunol 2011 23:427431). As células NK são células efetoras mais seguras, já que elas podem evitar as complicações potencialmente letais de tempestades de citocina (Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851), síndrome de lise tumoral (Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733), e efeitos no alvo, fora de tumor. Embora as células NK tenham um papel bem conhecido como exterminadoras de células cancerosas, e deficiência de célula NK tenha sido extensivamente documentada como crucial para a progressão de MM (Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53: 1666-1676; Fauriat C, et al.Leukemia 2006 20:732-733), o meio pelo qual pode-se aumentar a atividade anti-MM mediada por células NK foi amplamente inexplorado anteriormente às CARs divulgadas.

Métodos Terapêuticos

[0071] Células efetoras imunes expressando as CARs divulgadas podem eliciar uma resposta imune anti-tumoral contra células MM. A resposta imune anti-tumoral provocada pelas células efetoras imunes modificadas por CAR divulgadas pode ser uma resposta imune ativa ou passiva. Além disso, a resposta imune mediada por CAR pode ser parte de uma abordagem de imunoterapia adotiva em que células efetoras imunes modificadas por CAR induzem uma resposta imune específica para CS1.

[0072] Transferência adotiva de células imunes efetoras expressando receptores quiméricos de antígeno é um promissor terapêutico anti-câncer. Seguindo a coleção de células efetoras imunes de um paciente, as células podem ser geneticamente manipuladas para expressar as CS1 específicas de CARs divulgadas, e então infundidas novamente ao paciente.

[0073] As células efetoras imunes modificadas por CAR divulgadas podem ser administradas sozinhas, ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes, tais como Il-2, IL-15, ou outras citocinas ou populações de célula. Brevemente, composições farmacêuticas podem incluir uma população de célula alvo conforme descrito neste documento, em combinação com um ou mais transportadores farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis, diluentes ou excipientes. Tais composições podem incluir tampões tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada de fosfato e semelhantes; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídios ou aminoácidos tais como a glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. Composições para uso nos métodos divulgados são em algumas modalidades formuladas para administração intravenosa. Composições farmacêuticas podem ser administradas em qualquer maneira apropriada de tratamento de MM. A quantidade e a frequência de administração serão determinadas por fatores tais como a condição do paciente e a gravidade da doença do paciente, embora as dosagens adequadas podem ser determinadas por ensaios clínicos.

[0074] Quando "uma quantidade imunologicamente eficaz", "uma quantidade anti-tumor eficaz", "uma quantidade eficaz de inibição de tumor", ou "quantidade terapêutica" é indicada, a quantidade exata das composições da presente invenção a ser administrada pode ser determinada por um médico considerando as diferenças individuais de idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase e condição do paciente (sujeito). Geralmente pode ser declarado que uma composição farmacêutica, compreendendo as células T aqui descritas pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109células/kg em peso corporal, tais como 105 a 106células/kg em peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro desses intervalos. Composições de célula T também podem ser administradas várias vezes nestas dosagens. As células podem ser administradas por meio de técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. de Med. 319: 1676, 1988). A dosagem e regime de tratamento ideais para um paciente específico facilmente podem ser determinadas por uma pessoa versada na técnica de medicina pela monitoração do paciente quanto a sinais de doença e ajuste do tratamento de maneira adequada.

[0075] Em determinadas modalidades, pode ser desejada a administração de células T ativadas a um sujeito e posteriormente re-tirar sangue (ou ter uma aférese executada), ativar as células T a partir disto, de acordo com os métodos divulgados e re-infundir o paciente com essas células T ativadas e expandidas. Este processo pode ser realizado várias vezes em semanas alternadas. Em determinadas modalidades, as células T podem ser ativadas de amostras de sangue de 10 cc a 400 cc. Em determinadas modalidades, as células T são ativadas de amostras de sangue de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, ou 100 cc. Usar este protocolo de múltiplas amostras/múltipla re-infusão de sangue pode servir para selecionar determinadas populações de células T.

[0076] A administração das composições divulgadas pode ser realizada de qualquer forma conveniente, incluindo por injeção, transfusão ou implantação. As composições aqui descritas podem ser administradas ao paciente por via subcutânea, por via intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.) , ou intraperitonealmente. Em algumas modalidades, as composições divulgadas são administradas ao paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em algumas modalidades, as composições divulgadas são administradas por injeção intravenosa. As composições também podem ser injetadas diretamente a um tumor, linfonodo ou local de infecção.

[0077] Em determinadas modalidades, as células efetoras imunes modificadas por CAR divulgadas são administradas ao paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo mas não se limitado a talidomida, dexametasona, bortezomibe e lenalidomida. Em outras modalidades, as células efetoras imunes modificadas por CAR podem ser utilizadas em combinação com a quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos, ou outros agentes immunoablativos tais como caminho CAM PATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias de anticorpo, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteróides, FR901228, citocinas e irradiação. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas por CAR são administradas ao paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) transplante de medula óssea, terapia ablativa de células T usando ambos agentes quimioterápicos, tais como, fludarabina, terapia de radiação de feixe externo (XRT), ciclofosfamida ou anticorpos tais como OKT3 ou CAMPATH. Em outra modalidade, as composições de célula da presente invenção são administradas após a terapia ablativa de célula B tais como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em algumas modalidades, sujeitos podem ser submetidos a tratamento com quimioterapia de alta dose, seguida de transplante de células-tronco do sangue periférico. Em determinadas modalidades, após o transplante, sujeitos recebem uma infusão das células imunes expandidas da presente invenção. Em uma modalidade adicional, células expandidas são administradas antes ou após a cirurgia.

Definições

[0078] O termo "sequência de aminoácidos" se refere a uma lista de abreviaturas, letras, caracteres ou palavras que representam os resíduos de aminoácidos. As abreviaturas de aminoácidos usadas neste documento são códigos de uma letra convencionais para os aminoácidos e são expressas como segue: A, alanina; B, asparagina ou ácido aspártico, C, cisteína; D, ácido aspártico; E, glutamato, ácido glutâmico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptofano; Y, tirosina; Z glutamina ou ácido glutâmico.

[0079] O termo "anticorpo" refere-se aos anticorpos naturais ou sintéticos que se ligam seletivamente a um antígeno alvo. O termo inclui anticorpos policlonais e monoclonais. Além de moléculas de imunoglobulina intacta, também incluídas no termo "anticorpos" estão os fragmentos ou polímeros dessas moléculas de imunoglobulina e versões de moléculas de imunoglobulina humanas ou humanizadas que ligam seletivamente o antígeno alvo.

[0080] O termo "aptâmeros" se refere a moléculas de ácido oligonucleico ou peptídeo que se ligam a uma molécula alvo específica. Estas moléculas são geralmente selecionadas a partir de um conjunto de sequência aleatória. Os aptâmeros selecionados são capazes de adaptar estruturas terciárias exclusivas e reconhecer as moléculas alvo com alta afinidade e especificidade. Um "aptâmero de ácido nucleico" é um ácido oligonucleico de DNA ou RNA que se liga a uma molécula-alvo através de sua conformação e, desse modo, inibe ou suprime as funções de tal molécula. Uma aptâmero de ácido nucleico pode ser constituído por DNA, RNA ou uma combinação desses. Um "aptâmero de peptídeo" é uma molécula de proteína combinatória com uma sequência de peptídeos variável inserida no interior de uma proteína de estrutura de suporte constante. Identificação de aptâmeros de peptídeos geralmente é executada sob condições estritas de fermento dihíbrido, que aumentam a probabilidade de que os aptâmeros de peptídeo selecionados sejam expressos de maneira estável e dobrados corretamente em um contexto intracelular.

[0081] O termo "transportador" significa um composto, composição, substância ou estrutura que, quando em combinação com um composto ou composição, auxilia ou facilita a preparação, armazenamento, administração, entrega, efetividade, seletividade ou qualquer outra característica do composto ou composição para seu uso pretendido ou finalidade. Por exemplo, um transportador pode ser selecionado para minimizar qualquer degradação do ingrediente ativo e minimizar quaisquer efeitos secundários adversos no sujeito.

[0082] O termo "molécula quimérica" refere-se a uma única molécula criada unindo-se duas ou mais moléculas que existem separadamente em seu estado nativo. A molécula sozinha, quimérica tem a funcionalidade desejada de todas suas moléculas constituintes. Um tipo de moléculas quimérica é uma proteína de fusão.

[0083] O termo "proteína de fusão" refere-se a um polipeptídio formado pela junção de dois ou mais polipeptídios através de uma ligação peptídica formada entre o terminal amino de um polipeptídio e o terminal carboxila de outro polipeptídio. A proteína de fusão pode ser formada pela junção química dos polipeptídios constituintes pode ser expressa como um único polipeptídio da sequência do ácido nucleico codificando a proteína de fusão contígua única. Uma proteína de fusão de cadeia única é uma proteína de fusão tendo uma estrutura principal de polipeptídio única contígua. Proteínas de fusão podem ser preparadas pela utilização de técnicas convencionais de biologia molecular para juntar os dois genes em armação em um único ácido nucleico e então, expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira apropriada sob condições em que a proteína de fusão é produzida.

[0084] O termo "identidade" refere-se a identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou polipeptídios. A identidade ou similaridade pode ser determinada, comparando-se uma posição em cada sequência a qual pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base, então as moléculas são idênticas nessa posição. Um grau de similaridade ou identidade entre sequências de ácido nucleico ou de aminoácido é uma função do número de nucleotídeos idênticos ou correspondentes nas posições compartilhadas pelas sequências de ácido nucleico. Vários algoritmos de alinhamento e/ou programas podem ser utilizados para calcular a identidade entre duas sequências, incluindo FASTA ou BLAST os quais estão disponíveis como parte do pacote de análise de sequência GCG (Universidade de Wisconsin, Madison, Wisconsin) e pode ser usado com, por exemplo, definição padrão. Por exemplo, polipeptídios tendo pelo menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de polipeptídios específicos descritos neste documento e de preferência exibindo substancialmente as mesmas funções, bem como polinucleotídicas codificando tais polipeptídios, são contemplados. A menos que indicado de outra forma uma pontuação de similaridade será baseada na utilização de BLOSUM62. Quando BLASTP é usado, a semelhança de porcentagem baseia-se na pontuação BLASTP positivos e a identidade de sequência de porcentagem baseia-se na pontuação de identidades BLASTP. "Identidades" BLASTP mostra o número e a fração do total dos resíduos nos pares de sequência de alta pontuação os quais são idênticos; e BLASTP "Positivos" mostra o número e a fração de resíduos para os quais as pontuações de alinhamento tem valores positivos e os quais são semelhantes entre si. Sequências de aminoácidos, tendo estes graus de identidade ou semelhança ou qualquer grau intermediário de identidade de semelhança com as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento são contempladas e englobadas por esta divulgação. As sequências de polinucleotídicas de polipeptídios semelhantes deduzem-se usando o código genético e podem ser obtidas por meios convencionais, em particular tradução reversa de sua sequência de aminoácidos, utilizando o código genético.

[0085] O termo "ácidos nucleicos" refere-se a uma molécula natural ou sintética, compreendendo um único nucleotídeo ou dois ou mais nucleotídeos ligados por um grupo de fosfato na posição 3' de um nucleotídeo à extremidade 5' de um outro nucleotídeo. O ácido nucleico não é limitado pelo comprimento e, portanto, o ácido nucleico pode incluir Ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ácido ribonucleico (RN A).

[0086] O termo "operavelmente ligado ao" refere-se a relação funcional de ácidos nucleicos com outra sequência de ácido nucléico. Promotores, potenciadores, sítios de paragem transcripcional e translacional e outras sequências de sinal são exemplos de sequências de ácidos nucleicos operavelmente ligados a outras sequências. Por exemplo, operável ligável de DNA a um elemento de controle transcricional refere-se à relação física e funcional entre DNA e o promotor de tal forma que a transcrição de tal DNA é iniciada a partir do promotor por uma RNA polimerase que especificamente reconhece, liga e transcreve o DNA.

[0087] Os termos "peptídeo", "proteína" e "polipeptídio" são usados indistintamente para se referir a uma molécula natural ou sintética, compreendendo dois ou mais aminoácidos ligados pelo grupo carboxila de um aminoácido ao grupo alfa-amino de outro.

[0088] O termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a esses compostos, materiais, composições e/ou de formas farmacêuticas as quais são, no âmbito do julgamento médico adequados para uso em contato com os tecidos dos seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, reação alérgica, ou outros problemas ou complicações proporcionais com uma relação risco/benefício razoável.

[0089] O termo "domínio da proteína" refere-se a uma porção de uma proteína, porções de uma proteína, ou uma proteína inteira mostrando integridade estrutural; essa determinação pode basear-se na composição de aminoácidos de uma porção de uma proteína, porções de uma proteína, ou a proteína inteira.

[0090] Um "espaçador" neste documento refere-se a umpeptídeo que une as proteínas compreendendo uma proteína de fusão. Geralmente um espaçador não tem nenhuma atividade biológica específica diferente para juntar-se a proteínas ou preservar alguma distância mínima ou outra relação espacial entre eles. No entanto, os aminoácidos constituintes de um espaçador podem ser selecionados para influenciar alguma propriedade da molécula como a dobradura, carga líquida ou hidrofobicidade da molécula.

[0091] O termo "especificamente liga", como usado aqui, quando se refere a um polipeptídio (incluindo anticorpos) ou do receptor, refere-se a uma reação de ligação, a qual é determinante da presença da proteína ou polipeptídio ou receptor em uma população heterogênea de proteínas e outras biologias. Assim, sob condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio, no caso de um anticorpo), um ligante especificado ou anticorpo "especificamente se liga" a seu "alvo" particular (por exemplo, um anticorpo especificamente se liga a um antígeno endotelial) quando ele não liga em uma quantidade significativa de outras proteínas presentes na amostra, ou a outras proteínas, às quais o ligante ou anticorpo pode entrar em contato em um organismo. Geralmente, uma primeira molécula que "se liga especificamente" uma segunda molécula possui uma constante de afinidade (Ka) maior do due cerca de 105M 1(e π 106M 1 107 M 1 108 M 1 109 M 1 1010 o que cerca e e.g., , , , ,M-1, 1011 M-1, e 1012 M-1 ou mais) com essa segunda molécula.

[0092] O termo "especificamente entregar" como usado neste documento refere-se à associação preferencial de uma molécula com uma célula ou tecido suportando uma molécula alvo específico ou marcador e não a células ou tecidos que faltam essa molécula alvo. É claro, reconhece-se que um certo grau de interação não-específica pode ocorrer entre uma molécula e uma célula ou tecido não-alvo. No entanto, entrega específica, pode distinguir-se como mediada através de reconhecimento específico da molécula alvo. Entrega específico resulta tipicamente em uma associação muito forte entre a molécula entregue e células suportando a molécula alvo do que entre a molécula entregue e células faltando a molécula alvo.

[0093] O termo "sujeito" refere-se a qualquer pessoa singular que é o alvo da administração ou tratamento. O sujeito pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero. Assim, o sujeito pode ser um paciente humano ou veterinário. O termo "paciente" se refere a um sujeito sob o tratamento de um clínico, por exemplo, o médico.

[0094] O termo "terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade da composição usada é de quantidade suficiente para melhorar uma ou mais causas ou sintomas de uma doença ou distúrbio. Tal melhoria requer apenas uma redução ou alteração, não necessariamente eliminação.

[0095] Os termos "transformação" e "transfecção" significam a introdução de um ácido nucleico, por exemplo, um vetor de expressão, em uma célula de destinatário, incluindo a introdução de um ácido nucleico ao DNA cromossômico da dita célula.

[0096] O termo "tratamento" refere-se à gestão médica de um paciente com a intenção de curar, melhorar, estabilizar ou prevenir uma doença, condição patológica ou transtorno. Este termo inclui tratamento ativo, ou seja, o tratamento direcionado especificamente para a melhoria de uma doença, patologia ou distúrbio e inclui também o tratamento causal, ou seja, o tratamento direcionado para a remoção da causa da doença associada, condição patológica ou distúrbio. Além disso, este termo inclui tratamento paliativo, ou seja, tratamento concebido para o alívio dos sintomas ao invés da cura da doença, condição patológica ou distúrbio; tratamento preventivo, ou seja, o tratamento direcionado para minimizar parcialmente ou completamente inibir o desenvolvimento da doença associada, condição patológica ou distúrbio; e tratamento de suporte, ou seja, o tratamento empregado para complementar outra terapia específica direcionada para a melhoria da doença associada, condição patológica ou distúrbio.

[0097] O termo "variante" refere-se a um aminoácido ou sequência de peptídeo tendo substituições de aminoácidos conservador, substituições não conservadoras de aminoácido (ou seja, uma variante degenerada), substituições dentro da posição de oscilação de cada códon (ou seja, DNA e RNA) codificação de um aminoácido, aminoácidos adicionados ao terminal C de um peptídeo, ou um peptídeo tendo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência para uma sequência de referência.

[0098] O termo "vetor" refere-se a uma sequência do ácido nucleico capaz de transportar em uma célula outro ácido nucleico ao qual a sequência de vetor foi ligada. O termo "vetor de expressão" inclui qualquer vetor, (por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo ou fago cromossomo) contendo uma construção de gene em uma forma apropriada para a expressão por uma célula (por exemplo, ligada a um elemento de controle transcricional).

[0099] Um número de modalidades da invenção foi descrito. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem abandonar o espírito e o escopo da invenção. Nesse sentido, outras modalidades estão no âmbito das seguintes reivindicações.

[00100] EXEMPLOS

[00101] Exemplo 1: Modificação genética de células T desviada para CS1 aumenta a erradicação de células de mieloma

[00102] No presente estudo, as células T foram manipuladas para expressar um CAR de CS1 específico incorporando CD28-CD3Z porções de sinalização, demonstrando que células CAR T específicas de CS1 mediaram liberação de citocinas reforçadas e citotoxicidade em resposta a células de mieloma expressando CS1, que ocorreu em uma forma dependente de CS1. Além disso, em Modelos de camundongo de enxerto ortotópico MM, células T redirecionadas por CSl eficientemente erradicaram células de mieloma humano e sobrevivência significativamente prolongada do camundongo. Juntos, esses dados sugerem que terapia adotiva com células T armadas com um CAR de CS1 específico representa uma estratégia promissora contra MM reincidente.

Materiais e métodos Cultura celular

[00103] Linhas celulares de mieloma múltiplo humano IM9, NCI- H929, MM. 1S e RPMI-8226 foram obtidas a partir de coleção de cultura do tipo americano (ATCC) e mantidas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Invitrogen). 293T e células de embalagens fênix foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen) com 10% FBS. Células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) de doadores saudáveis e pacientes de mieloma múltiplo foram isoladas por centrifugação gradiente de densidade Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) e monócitos foram esgotados por adesão de plástico. Células de mieloma primário CD138 + positivamente foram selecionadas a partir de aspirados de medula óssea de pacientes usando MicroBeads anti-CD138 humano e separação de células assistida por ímã (MACS, Miltenyi Biotech), de acordo com as instruções do fabricante. Consentimento informado foi obtido de doentes com mieloma múltiplo, de acordo com um protocolo aprovado pelo Ohio State University Institutional Review Board.

[00104] Camundongos machos de 6 a 8 semanas de idade NOD-scid IL-2Rgamma null (NSG) camundongos foram obtidos a partir do laboratório Jackson. Camundongos foram monitorados com frequência para progressão da doença MM e sacrificados quando eles se tornaram moribundos com os sintomas da paralisia dos membros posteriores, letargia ou perda de peso evidente. Todo o trabalho animal foi aprovado pela Comissão de uso e de Cuidado Animal da Universidade do Estado de Ohio.

Geração do construto retroviral de CAR específica de CS1

[00105] O scFv anti-CSl foi derivado da linha de células de hibridoma Luc90. As sequências de domínio de codificação para regiões variáveis das cadeias leves (VL) e pesadas (VH) foram amplificadas separadamente e recombinadas usando um ligante pela sobreposição de reação PCR. O fragmento VH-ligante-VL foi incorporado no quadro com a porção CD28-CD3Z. Todo o fragmento anti-CS1-scFv- CD28-CD3Zfoi então ligado em um vetor retroviral designado Pinco (Yu J, et al. Immunity 2006 24:57590; Becknell B, et al. J Immunol Methods 2005 296: 115-23) para gerar uma construção Pinco-CS1-CAR.

Transdução retroviral de linfócitos T

[00106] Sobrenadantes retrovirais foram coletados a partir de células de embalagem fênix transfectadas transitoriamente com construção de Pinco- ou Pinco-CS1-CAR ou por 48 h, conforme descrito anteriormente (Becknell B, et al. J Immunol Methods. 2005 296(1-2): 115-123; Yu J, et al. Imunidade. 2006 24(5):575-590). PBMC foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de FBS e estimulados com ativador T CD3/CD28 humano Dynabeads (Invitrogen) e 150 IU/mL de interleucina-2 humana recombinante (IL-2, Hoffmann-La Roche Inc.) por 2 dias. Em seguida, as células foram re suspendidas em sobrenadantes infecciosos e aplicadas em placas de 6 poços tratadas com cultura de não tecido revestidas com RETRONECTIN (laboratórios Clontech) de acordo com o protocolo do fabricante. Uma vez no segundo dia, repetiu-se o processo de infecção. Então células foram transferidas para frascos tratados com cultura de tecido e mantidos na presença de 150 IU/mL IL-2. Células T Transfectadas foram purificadas usando um classificador de célula FACSARIA II (BD Biosciences) baseado na expressão de um marcador GFP na superfície das células codificada pelo vetor Pinco.

Análise de Citometria de Fluxo

[00107] Para a detecção de expressão de CAR CS1 na superfície da célula, T células transfectadas foram lavadas com PBS contendo 4% de albumina de soro bovino e incubadas com anticorpo policlonal anti-camundongo (Fab) 2 de cabra rotulado por biotina ou anticorpo de imunoglobulina de cabra policlonal normal G (IgG) (Jackson ImmunoResearch) como um controle de isotipo. Em seguida, as células foram coradas com aloficocianina (APC)-estreptavidina conjugada (Jackson ImmunoResearch) e anticorpo anti-CD3, conjugado com V450 (BD Biosciences). Para determinar a expressão de CS1 na superfície das células do mieloma, as células foram manchadas com anti- CSI mAb de camundongo conjugado com ficoeritrina (PE) (eBiosciences) e do anti-CD 138 mAb de camundongo conjugado com APC (Miltenyi Biotec). Marcação do anticorpo foi monitorada com um citômetro de fluxo BD LSRII. A análise dos dados foi realizada utilizando software FLOWJO (Tree Star Inc.)

Imunomarcação.

[00108] Células foram lisadas em tampão Laemmli. Lisados foram separados por gel SDS-PAGE e transferidos para a membrana de nitrocelulose (Millipore). A membrana foi sondada com CD3Z mAb anti-humano de camundongo (BD Pharmingen) e, em seguida, com um anticorpo de IgG de anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase de raiz forte. Ligação de anticorpo foi revelada pela utilização de um reagente de quimioluminescência reforçada (GE Healthcare Biosciences).

Geração de células RPMI-8226 expressando CS1

[00109] estável CS1 de comprimento total humano CS1 codificando sequência foi amplificado por PCR do cDNA IM9 e inserido em um vetor de Lentivirus designado PCDH-CMV-MCS-EF1- copGFP (PCDH, System Biosciences), rendendo PCDH-CS1. Para produzir lentivirus, células 293T foram co transfectadas com o plasmídeo PCDH-CS1 ou um plasmídeo de vetor vazio PCDH mais a plasmídeos de embalagem pCMV-VSVG e pCMV-dr9 usando o reagente de transfecção de fosfato de cálcio (Promega). Em seguida, os sobrenadantes de Lentivirus foram colhidos e usados para infectar células RPMI-8226 usando um protocolo publicado anteriormente (Becknell B, et al. J Immunol Methods. 2005 296(1-2): 115-123; Yu J, et al. Immunity. 2006 24(5):575-590).

Ensaio de citotoxicidade

[00110] Um ensaio de lançamento do padrão de 4 horas51Cr foi realizado conforme descrito anteriormente (Yu J, et al. Blood 2010 115:274-81). Brevemente, células-alvo foram rotuladas com 51Cr e co cultivadas com células T em várias proporções de efetor/alvo (E/T) em poços da placa de 96 poços fundo em V a 37 ° C por 4 horas. Sobrenadantes foram colhidas e transferidas dentro dos frascos de cintilação contendo um coquetel de cintilação líquida (Fisher Scientific) e o lançamento de 51Cr foi medido no contador TOPCOUNT (Packard Canberra). Células alvo Incubadas em meio completo ou 1% de SDS foram usadas para determinar a liberação de 51Cr espontânea ou máxima. A porcentagem de Lise específica foi calculada usando a fórmula padrão: 100 x (libertação experimental cpm - liberação espontânea de cpm) / (versão máxima cpm - liberação espontânea cpm).

Ensaios de liberação de citocinas

[00111] Células-alvo foram co cultivadas com igual número de células efetoras em Placas fundo V de 96 poços a 37 ° C por 24 horas. Sobrenadantes livres de célula foram colhidas e avaliadas para IFN-g e interleucina (IL)-2 secreção por ELISA usando kits de ELISA correspondentes a sistema de R&D de acordo com o protocolo do fabricante.

CD 107a um ensaio de degranulação

[00112] Ensaio CD 107a foi realizado conforme descrito anteriormente, com algumas modificações (He S, et al. Blood 2013 121 :4663-71). Brevemente, células-alvo MM (2,5x 105)foram co cultivadas com igual número de células efetoras em 0,2 mL por poço em placas de 96 poços de fundo em V. Células de controle são células T transfectadas por CS1-CAR- ou por simulação incubadas sem células-alvo. Anti-CD 107a ou anticorpo isotipo IgG1 conjugado a APC (BD Biosciences) juntamente com monensina 1ml (BD Biosciences) foi adicionado e incubado a 37 ° C por 4 horas. Células foram adicionalmente manchadas com anticorpos CD3 V450-conjugados e CD69 PE- conjugados, e analisados usando um citômetro de fluxo LSRII (BD Biosciences).

Coloração intracelular de granzime B e perforina

[00113] Células T transfectadas CS1-CAR- ou simulação foram lavadas e coradas com mAb CD3 anti-humano V450-conjugado. Posteriormente, as células foram fixadas e permeabilizadas usando o Kit de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), rotulado com APC-conjugado anti-granzima B (Invitrogen), anticorpo anti-perforina conjugados a APC (eBiosciences) ou um anticorpo do isotipo APC-conjugados de camundongo e então analisados em um citômetro de fluxo LSRII BD (BD Biosciences).

Tratamento in vivo dos camundongos suportando MM e imagens de bioluminescência

[00114] MM. 1S e células de mieloma IM9 foram retrô Viralmente transfectadas com vírus Pinco-pGL3-luc/GFP expressando luciferase de vaga-lume e células GFP-positivas foram classificadas usando o método acima mencionado, produzindo células MM.1S-GL3 e IM9-GL3, respectivamente. Camundongos machos NSG foram injetados por via intravenosa com células 8 x 106MM.1S-GL3 ou células 5x 105IM9-GL3 células em 400 μL. de PBS através de veia de cauda no dia 0 para estabelecer um transplante ortotópico modelo MM. Nos dias 7 e 14 (MM. 1S) ou 21 (IM-9), os camundongos foram administrados por via intravenosa com 10 x 106 de células de efetoras, células T CS1-CAR-transfectadas ou células controle transfectadas de simulação, em 400 mL de PBS através da veia de cauda. Cinco semanas após a inoculação com células MM, os camundongos foram infundidos intraperitonealmente com D- luciferina (150 mg/kg de peso corporal; Gold Biotechnology), anestesiados com isoflurano e fotografados usando o In Vivo (PerkinElmer).

Análise estatística

[00115] Teste Student t não pareado foi utilizado para comparar dois grupos independentes para pontos de extremidade contínuos se normalmente distribuídos. Um ANOVA unidirecional foi usado quando três ou mais grupos independentes foram comparados. Para dados de sobrevivência, curvas de Kaplan- Meier foram plotadas e comparadas usando um teste log-rank. Todos os testes foram dos dois lados. Valores de P foram ajustados para comparações múltiplas, usando o método de Bonferroni. Um valor de P de menos de 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Resultados Geração de células T primárias expressando CAR CS1-específico

[00116] Pinco A CAR específico de CS1 codificando um CS1- específico de CAR (Pinco-CSl-CAR) foi construído, que consistiu em anti-CS1 scFv, dobradiça e regiões transmembranares da molécula CD8, a porção de sinalização de co-estimulação CD28 e o componente citoplasmático da molécula CD3Z (Fig. 1A) . Células T primárias ativadas por anticorpo Anti-CD3/CD28 de um doador saudável foram transfectadas com partículas retrovirais codificando CS1-CAR ou vetor vazio (simulação) e separadas a uma expressão de GFP, a qual foi codificada por construção de retrovirais. Para determinar se o CS1-CAR foi transferido com sucesso, as células classificadas foram lisadas e submetidas a imunomarcação com um mAb anti- CD3Z. Conforme indicado na Fig. 1B, em contraste com as expressaram proteína endógena CD3Z, células T transfectadas CS1-CAR expressaram a proteína de fusão quimérica CSl-scFv- CD28-CD3Z no tamanho previsto além de CD3Z nativo. Expressão de CS1-CAR na superfície das células foi demonstrada pela coloração de células T transfectadas com um anticorpo Fab anti-camundongo de cabra que reconheceu a porção scFv de anti- CS1, o qual detectou a expressão do scFV em 70,3% das células T CS1-CAR-transfectadas, Considerando que a expressão permaneceu quase indetectável nas células T transfectadas por simulação (Fig. 1C).

Reconhecimento de linhas de células de mieloma CS1 + por células T CAR de CS1-específico

[00117] Expressão de superfície de CS1 foi avaliada em quatro linhas de célula de mieloma comumente usados NCI-H929, IM9, MM.1 S e RPMI-8226 por citometria de fluxo, que revelou essa proteína CS1 foi variavelmente expressada nestas linhas de célula com maior expressão em células NCI-H929, IM9 e MM. 1S do que células RPMI-8226 com expressão de CS1 mínima (Fig. 2A). Como um controle negativo, a linhagem de células de rim humano transformado, 293T, não expressa CS1 em sua superfície (Fig. 7A). Para determinar a capacidade das células T de CS 1- CAR para reconhecimento de células de mieloma que endogenamente expressaram CS 1, IFN-y e secreção de IL-2 foi medido através de ELISA em sobrenadantes de células T de simulação-transfectadas ou células T de CS1-CAR-transfectadas na presença ou ausência de cada linhagem de células de mieloma. Células T transfectadas por simulação e células T CS1-CAR-transfectadas cada uma sozinha produziu níveis insignificantes de IFN-y e IL-2 (Fig. 2B e C); no entanto, após a exposição às células NCI-H929 e células IM9 expressando altos níveis de CS1, quantidades significativamente maiores de IFN-Y e proteínas IL-2 foram secretadas por células T de CS1- CAR, mas não por células T simuladas. Em resposta a células MM.1S com altos níveis de expressão de CS1, células T CS1-CAR- transfectadas também produziram uma maior quantidade de IFN-y que células T transfectadas por simulação (Fig. 2B) considerando que, por razões desconhecidas, as células T CS1- CAR-transfectadas não poderiam ser desencadeadas por esta linha de células que secretam níveis mais elevados de IL-2 do que células T transfectadas por simulação (Fig. 2C). Além disso, comparado com subconjuntos transfectados por simulação de células T CD4+(CD8-) e de células T CD8 +CS1-CAR exibidas aumentaram a secreção de IFN-g em resposta a células MM. IS ou NCI-H929 ou (Fig. 8A). Para células RPMI-8226 com níveis muito baixos de expressão CS1, ambas células T transfectadas em simulação e células T CS1-CAR-transfectadas produziram baixos níveis de IFN-g e IL-2 que foram comparáveis com fundo (Fig. 2B e C). Estes achados sugerem que, em comparação com as células T transfectadas por simulação, células T CS1-CAR- transfectadas mais especificamente reconhecem células MM com altos níveis de expressão de CS1 endógena e tornam-se mais ativadas após o reconhecimento dessas células MM.

Potência citolítica in vitro contra células de mieloma, desencadeada por CS1-específicos de CAR

[00118] Para determinar se o avançado reconhecimento de células de mieloma CS1 + pelas células T CS1-CAR podem levar a lise de célula de tumor mais eficiente, realizou-se um ensaio de liberação de cromo-51 padrão de 4 horas. Células NCI-H929, IM9 e MM. 1S, as quais expressam altos níveis de CS1, foram resistentes à morte mediada por célula T transfectada por simulação, mesmo em proporções E/T tão altas quanto 20: 1; no entanto, essas células foram eficientemente lisadas por células T CS1-CAR em todas as proporções de E:T testados (Fig. 3A, três deixadas). No entanto, em comparação com as células T transfectadas por simulação, a atividade citolítica de células RPMI-8226 expressando baixos níveis de CS1 poderia somente ser ligeiramente aumentada após co incubação com células T CS1- CAR-transfectadas (Fig. 3A, acertada). Degranulação e ativação de células T foi adicionalmente caracterizada por avaliar a expressão de CD 107a e CD69 em células T transfectadas por simulação e células T CS1-CAR-transfectadas após incubação com ou sem células do mieloma NCI-H929, as quais como mencionado acima, provocou uma forte nas células T CS1-CAR com relação a liberação de citocinas e atividade citolítica. Consistentes com os dados acima mencionados sobre a liberação de citocinas e atividade citolítica, ativação e degranulação ocorreram em maior medida em células T CS1-CAR do que nas células T em simulação em resposta a células NCI-H929, como evidenciado por regulação superior de coexpressão de superfície de CD 107a mobilizada e o marcador de ativação, CD69 (Fig. 3B).

[00119] Além disso, em comparação com subconjuntos transfectados por simulação correspondentes de células T, ambos células T both CD4+(CD8- ) e CD8+CS1-CAR expostas a maiores níveis de degranulação quando estimulados pelas células NCI-H929 ou MM. 1S (Fig. 8B). Além disso, usando uma aproximação de coloração intracelular, em comparação com as células T transfectadas por simulação, células T CS1-CAR- transfectadas expressaram níveis significativamente mais elevados de granzima B, mas não a perforina, mesmo na ausência de células alvo (Fig. 3 C e D), sugerindo que essa granzima B pode ser predominantemente envolvida mediando a atividade citolítica de células T Redirecionadas por CS1. Esta constatação está em consonância com um relatório anterior mostrando células T enxertadas com um CAR de antígeno específico carcinoembriônico incorporando um CD28-CD3Z combinado sinalizando níveis elevados abrigados de porção de granzime B comparado com as células T não modificadas (Koehler H, et al. Cancer Res 2007 67:2265-73).

[00120] Superexpressão forçada de CS1 nas células alvo aumenta reconhecimento e morte por células T CAR e específicas de CS1

[00121] A resposta consideravelmente mais forte nas células T CS1-CAR em termos de citocina liberar e citotoxicidade quando estimulado pelas células de mieloma expressando altos níveis de CS1 solicitado investigação de se expressão ectópica de CS1 em células de mieloma com baixos níveis de endogenicidade de expressão de CS1 poderia provocar aumento de lançamento de citocinas lançamento e citólise. Para este fim, células de mieloma RPMI-8226 com baixos níveis de expressão de CS1 endógena foram transfectadas com lentivírus codificando vetor vazio de CS1 ou PCDH humano como um controle de simulação- transfectada. A eficiência de transdução foi monitorada através da detecção da proteína GFP codificada pelos lentivírus, e a percentagem de células GFP-positivas foi de mais de 90% pela análise da citometria de fluxo. Superexpressão de CS1 foi confirmada pela coloração da superfície das células transfectadas com um anticorpo anti-CS1 PE-conjugados (Fig. 4A). Ensaio de lançamento de cromo-51 indicou que expressão de CS1 forçada resultou em um aumento perceptível a suscetibilidade das células RPMI-8226 a Lise por células T CS1-CAR-transfectadas em oposição a células T transfectadas por simulação (Fig. 4B). Em seguida, a produção de IFN-Y e IL-2 foi avaliada através de ELISA, mostrando que, em comparação com células T transfectadas por simulação, células T CS1-CAR-transfectadas produziram quantidades significativamente mais elevadas de IFN-y e IL-2 em resposta a células RPMI-8226 superexpressando CS1; Enquanto isso, havia apenas um moderado aumento na secreção de IFN-y e nenhuma mudança na secreção de IL-2, quando as células T CS1-CAR foram co cultivadas com células RPMI-8226 de vetor modificado vazias (Fig. 4C e D). Da mesma forma, superexpressão de CS1 em CST- 293T, uma linha de células transformadas, também liberação de citocinas reforçada desencadeada e citólise por células T CSI- CAR (Fig. 7B - 7D). Isto foi consistente com outros relatórios sobre as células T CAR alvejando outros antígenos de tumor (Sanchez C, et al. Prostate Cancer Prostatic Dis 2013 16:12331; Chinnasamy D, et al. J Clin Invest 2010 120:3953-68). Essas verificações corroboram que o reconhecimento do aumento e morte das células alvo por células T CS1-CAR ocorreram de forma dependente de CS1.

Reconhecimento e morte melhorada de células de mieloma primária por células T CAR específicas de CS1 autólogas

[00122] Para estudar os efeitos das células T CAR específicas de CS1 em um contexto mais clinicamente relevante, foi eficientemente poderiam reconhecer e matar células de tumor recém isoladas de pacientes com mieloma. Como células T de doadores saudáveis, células T de pacientes com mieloma múltiplo reincidente com êxito foram expandidas e manipuladas para expressar CS 1-CAR por infecção retroviral, manifestada por 60,7% das células T, colorando positivamente com ambos anticorpos anti-camundongo Fab anti-humanos CD3 e determinados por citometria de fluxo (Fig. 5A). Primário CD138 + células de mieloma de pacientes foram isoladas usando seleção magnética positiva, e células de mieloma primário foram observadas ser uniformemente positivas para a expressão de superfície de CS1 usando citometria de fluxo (Fig. 5B). Por meio de ensaio de liberação de cromo-51, observou-se que células de mieloma de pacientes foram altamente resistentes à Lise por células T transfectadas por simulação autólogas, mas tornou-se suscetível a células T CS1-CAR-transfectadas autólogas mesmo em uma baixa (2.5: 1) E/T) razão (Fig. 5C). De acordo com estes resultados de citotoxicidade, células T CS1-CAR autólogas produziram quantidades significativamente maiores de IFN-Y em resposta a células de mieloma comparado com células T autólogas transfectadas por simulação (Fig. 5D). Estes resultados demonstram que células T equipadas com CS1-CAR com eficiência podem reconhecer e erradicar as células de mieloma no cenário autólogo ex vivo.

[00123] Células T dirigidas por CS1 suprimem o crescimento tumoral in vivo e prolongam a sobrevivência do camundongos suportando tumor em modelos de mieloma de transplante ortotópico.

[00124] O potencial terapêutico de células T CS1-CAR foi avaliado em um modelo de camundongo de NSG enxertado com MM.1S-. Injeção intravenosa de células MM. 1S foi amplamente utilizada para estabelecer um modelo de enxerto heterólogo de camundongo de MM, porque isso pode originar a enxertia na medula óssea e osso, bem como o estabelecimento consistente de lesões ósseas multifocais, as quais recapitulam intimamente MM humano (Mitsiades CS, et al. Cancer Cell 2004 5:221-30; Runnels JM, et al. J Biomed Opt 2011 16:011006). Para facilitar a monitoração do crescimento do tumor, células MM. 1S foram projetadas para expressar luciferase tanto GFP e de vaga-lume por infecção retroviral e células GFP+ foram classificadas e enxertadas por via intravenosa em camundongos NSG para iniciar o crescimento tumoral. Estes camundongos foram então por via intravenosa repletos de células T transfectadas por simulação, células T CS1-CAR-transfectadas ou PBS. De acordo com os relatórios anteriores (Mitsiades CS, et al. Cancer Cell 2004 5:221-30; Runnels JM, et al. J Biomed Opt 2011 16:011006), criação de imagem de bioluminescência usando IVIS mostrou que camundongos NSG suportando MM.1 S no grupo tratado com PBS desenvolveram lesões disseminadas de tumor no crânio, vértebras, pélvis e fémures (Fig. 6A), e a maioria dos camundongos exibiu paralisa de peta a 5 semanas após a inoculação de células tumorais. Infusão de células T CS1-CAR notavelmente reduziu peso do tumor conforme determinado pela bioluminescência de imagem, bem como prolongou a sobrevivência global de camundongos NSG suportando MM. 1S, Considerando que a infusão de células T infectadas por simulação falhou a resultar na erradicação de tumor eficiente e sobrevivência melhorada de camundongos (Fig. 6A e B).

[00125] Para validar adicionalmente a capacidade de anti-MM in vivo de células T CS1-CAR, o impacto de células T CS1-CAR foi avaliada usando um modelo de camundongo NSG enxertado com IM9. Observaram-se dados semelhantes àqueles mostrados usando MM. 1S. Imagens de bioluminescência indicaram que infusão de células T CSl-CAR-transfectadas com eficiência poderia erradicar tumores estabelecidos em camundongos suportando IM9, Considerando que a infusão de células T transfectadas por simulação não conseguiu reduzir a carga do tumor (Fig. 9A). Quarenta e quatro dias após o tratamento inicial, observou-se uma taxa de sobrevivência de 100% para camundongos suportando IM9 recebendo infusão de células T CS1-CAR, Considerando que a taxa de sobrevivência foi apenas 28,6% e 16.7% para camundongos controle recebendo células T de simulação e PBS, respectivamente (Fig. 9B).

[00126] Exemplo 2: Receptor de antígeno quimérico específico por CS1 (CAR)- projetou células exterminadoras naturais aumentam a atividade antitumoral in vitro e in vivo contra mieloma múltiplo humano.

[00127] Neste estudo, as células NK humanas foram projetadas para expressar um CAR que era CS 1 específico e incorporou um domínio de sinalização co-estimulatória CD28-CD3Z. A função anti-MM dessas células foi avaliada in vitro e em um modelo do camundongo de transplante ortotópico in vivo de MM. Os resultados mostraram que a expressão do CS1-CAR poderia redirecionar as células NK para erradicar especificamente e eficientemente células MM expressando CS1, tanto in vitro e in vivo e esta erradicação foi dependente de CS1. Os dados sugerem que esta estratégia de CAR é adequada para o desenvolvimento de uma imunoterapia eficaz baseada em célula NK como um meio para tratar pacientes com MM refratário ou reincidente. Além disso, em contraste com as células T CAR, células NK CAR permitem o uso de fontes alogênicas de célula NK, as quais são menos propensas a causar e podem até ajudar a suprimir o enxerto versus doença de hospedeiro (Olson JA, et al. Blood 2010 115:4293-4301), enquanto potencializando também um aumento na citotoxicidade devido à incompatibilidade de receptores de imunoglobulina do tipo exterminadores (KIRs) (Ruggeri L, et al. Science 2002 295:2097-2100).

Materiais e Métodos Cultura de Células

[00128] Linhas de Célula de mieloma múltiplo humana L363 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemanha), IM9 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EUA] e U266 (ATCC) foram mantidas em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). Linhas celulares NK dependente de IL-2 humana NK-92 (ATCC) e NKL foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de FBS e 150 IU/mL rhIL-2 (Inc. Hoffman-LaRoche, Nutley, NJ, USA). 293T (ATCC), e a linha de celular de empacotamento de Fênix foi mantida em meio DMEM com 10% de FBS. Células de CD 138+ MM primárias foram isoladas a partir de aspirado de medula óssea de pacientes MM usando o EASYSEP sangue completamente humano e kit de seleção positiva de medula óssea CD 138 (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá), de acordo com o protocolo do fabricante. Todo o trabalho humano foi aprovado pela Universidade institucional Estadual de Ohio Review Board.

Camundongos

[00129] Camundongos NOD.Cg-prkdcscid IL2rgtml Wjl/szJ (NSG) seis a oito semanas de idade foram obtidos a partir de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EUA). Todo o trabalho animal foi aprovado pela Comissão de uso e de Cuidado Animal da Universidade do Estado de Ohio. Camundongos foram monitorados com frequência para progressão da doença MM e sacrificados quando eles se tornaram moribundos com os sintomas da paralisia dos membros posteriores, letargia ou perda de peso evidente.

Geração de construção de Lentivirus CAR anti-CS1

[00130] O fragmento CS1-scFv, amplificado a partir da linha celular de hibridoma Luc90, foi fundida com uma sequência de codificação de um marcador Myc imediatamente a seguir a sequência codificando CS1-VL. As sequências de DNA fundidas foram incorporadas com CD28-CD3Z que foi incisão de um vetor retroviral. O fragmento de marcador-CD28-CD3Z CS1-scFv-myc inteiro estava ligado em um vetor de Lentivirus designado como PCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP (PCDH, System Biosciences, Mountain View, CA, EUA) para gerar uma construção de marcador-CD28- CD3Z(PCDH-CS1-CAR) PCDH-CSl-scFv-myc.

Produção e transdução de Lentivirus de células NK

[00131] Para produzir sobrenadante de lentivírus VSVG- pseudotipado, células 293T cultivadas em meios DMEM (Invitrogen) foram co transfectadas com PCDH-CS 1 - scFv-CD28- CD3Zou o vetor de controle PCDH (para gerar vírus de infecção simulada com o vetor vazio) juntamente com as construções de empacotamento, pCMV-VSVG e pCMV-dr9, usando o reagente de Transfeccao de fosfato de cálcio (Promega, Madison, WI, EUA). Após 24h, o meio DMEM foi substituído com meio RPMI 1640 contendo 20% de FBS. 48 h após a transfecção, meio condicionado contendo lentivirus foi colhido e filtrado através de uma unidade de filtro μir, 0.45 (Milliopore, Billerica, MA, EUA) para remover os resíduos de célula. Infecção viral foi realizada em placas de 6 poços usando células 2 x 106NK-92 ou NKL em um volume total de 2 mL de spbrenadante de Lentivirus contendo 8 μg/mL de polibreno (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e 450 UI/mL de rhIL-2. As células foram centrifugadas a 1.800 rpm a 32 ° C, durante 45 min, em seguida, as placas foram colocadas em uma incubadora a 37 ° C por 2 h. Infecção repetiu-se então uma segunda vez no mesmo dia e uma vez adicional no dia seguinte. Após a terceira transdução, as células foram mantidas em meios RPMI 1640 suplementados com 20% de FBS e 150 UI/mL de rhIL-2 a 37 ° C. Células NK transfectadas foram enriquecidas por duas rodadas de célula classificação usando um classificador de células FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Células positivas foram selecionadas com base na expressão de marcador de superfície de proteína de fluorescência verde (GFP), que foi codificada no vetor PCDH

Geração de uma linhagem de células U266 estável expressando CS1

[00132] Sequências de codificação humana CS1 foram amplificadas de cDNA isolado de células IM9 através de PCR, então subclonados em um vetor de Lentivirus PCDH para gerar uma construção PCDH-CS 1. Produção de Lentivirus e infecção das células U266 foram realizadas usando os métodos descritos acima. Células positivas GFP foram então classificadas usando um classificador de célula de FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

Análise de imunomarcação

[00133] As células foram lavadas com PBS e lisadas diretamente no tampão de laemmli. Lisados foram eletroforeticamente separados em um gel de SDS-PAGE gradiente 4% a 15% (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (EMD Millipore, Billerica, MA, EUA). A membrana foi bloqueada com 5% de leite em Soro fisiológico tri tamponado (TBS) suplementado com 0,1% de interpolação 20. anticorpo monoclonal de cadeira CD3Z anti-humano de Camundongo (BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) foi diluído 1: 1.000 com 5% de leite em TBS suplementado com 0,1% de solução interpolada 20 e este anticorpo foi adicionado para reagir com a membrana durante a noite. A membrana foi então lavada três vezes em TBS suplementado com interpolado 20. O anticorpo secundário conjugado HRP (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, PA, Estados Unidos da América) foi diluído 1: 5.000, com 5% de leite em TBS suplementado com 0,1% de interpolação 20 e adicionado à membrana em repouso durante 1 h. A membrana foi novamente lavada quatro vezes em TBS suplementado com interpolação 20 e um reagente de quimioluminescência reforçada (ECL; GE Healthcare Biosciences) foi adicionado por 1 min. O Borrão então foi exposto a película para vários comprimentos de tempo para gerar uma imagem corretamente exposta.

Citometria de fluxo

[00134] Para analisar a expressão de superfície de CS1-CAR, uma suspensão de célula única de células transfectadas NK foi incubada durante 1 h a 4° C, com uma mAb de camundongo de marcador anti-myc (Sigma-Aldrich). As células foram lavadas duas vezes com PBS e então incubadas por 30 min a 4° C, com anticorpo secundário IgGl anti-camundongo rato PE-conjugados (BD Pharmingen). Expressão de superfície de CS1 e CD138 em células de myeloma foi examinado por análise de FACS usando um analisador de BD LSRII depois que as células estavam manchadas com mAb anti-CSI de camundongo conjugado com PE (eBiosciences, San Diego, CA, USA) e de mAb 138 anti-CD de camundongo conjugado por APC (jogo de BD). A análise dos dados foi realizada utilizando software FLOWJO (Tree Star Inc., Ashland, OR, EUA)

Ensaio de citotoxicidade

[00135] Para a detecção de Lise mediada por células NK, células-alvo MM foram rotuladas por 1,5 h com 100 mCi de cromo-51 (51, Cr), lavadas quatro vezes com meio RPMI regular e ajustado a uma concentração de 5.000 células por poço no volume de 100 μ't de uma placa de microtitulação 96 poços de fundo V. As células NK de simulação enriquecidas com FACS ou CSl-CAR--transfectadas foram adicionadas em volume de μ't 100 em triplicado poços em várias efetoras para proporções alvo (E:T). Após 4 h de incubação a 37 ° C, 100 μt de sobrenadante foi colhida de cada poço e transferido para frascos de cintilação contendo um coquetel de cintilação líquida (Fisher científico, Pittsburgh, PA, Estados Unidos da América), para que o lançamento do 51 Cr poderia ser medido em um contador TOPCOUNT (Canberra Packard, Meriden, CT, EUA). Para determinar a liberação de 51Cr máxima, suspensão de células alvo foi incubado com 100 μ't de SDS. A porcentagem de Lise específica foi calculada usando a fórmula padrão: 100 x (cpm experimental libertação experimental cpm - liberação espontânea de cpm) / (liberação máxima cpm - liberação espontânea cpm).

Ensaio de liberação de interferon-y

[00136] Células-alvo de mieloma foram co-cultivadas com células efetoras NK em placas de fundo V de 96 poços por 24h. Ao todo, 2,5 x 105 células de linha de célula de mieloma ou 1,0x 105 células de mieloma primárias foram incubadas com 2.5 x 105ou 5.0 x 105as células NK, respectivamente. Sobrenadantes livres de células foram analisadas para secreção de interferon-Y (IFN-y) por ensaio imunoenzimático (ELISA) usando um kit de sistemas R&D (Minneapolis, MN, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Dados representados nas figuras representam valores médios de três vias de poços de um dos três experimentos representativos com resultados semelhantes.Um modelo de camundongo MM ortotópico e tratamento in vivo dos camundongos suportando MM e imagens de bioluminescência

[00137] células IM9 foram retrô Viralmente transfectadas com vírus Pinco-pGL3-luc/GFP expressando luciferase de vaga-lume como descrito anteriormente (He S, et al. Blood 2013 121 :4663— 4671). Células GFP-positivas foram classificadas usando um classificador de células de FACS Aria II (BD Biosciences) e foram designadas como células 'IM9-Luc'. Em seguida, camundongos NSG machos de seis a oito semanas de idade foram, por via intravenosa (i.v.), injetados com 0,5 x 106 células MM IM9-Luc 400 μLde fosfato-salino através da veia da cauda no dia 0 para estabelecer um transplante modelo MM ortotópico. Começando no dia 7, os ratos foram injetados i.v. com 5 x 106 células efetoras, ou seja, as células CS1-CAR NK-92 ou células de controle transfectadas por simulação , em 400 μL de fosfato-salino uma vez a cada 5 dias (cinco vezes no total). Quatro semanas após a inoculação IM9-Luc, os ratos foram intraperitonealmente (i.p.) infundidos com D-luciferina (150 mg/kg de peso corporal; Biotecnologia ouro, St Louis, MO, EUA), anestesiados com isoflurano e cuja imagem usando um sistema de Imageamento in vivo (IVIS-100, Perkin-Elmer, Waltham, MA, EUA) com o software de imagem vivendo (Perkin- Elmer).

Análise imuno-histoquímica

[00138] Vértebras da coluna vertebral foram fixadas em fosfato de formalina 10% tamponada descalcificadas em EDTA saturada e então incorporadas em parafina. 5 - seções espessas de micron foram coradas com hematoxilina e eosina (H & E) para exame histológico. As seções foram iimunocoloridas para identificação de células MM humanas com CD138 mAb anti-humano de camundongo (1:50 diluição; Thermo-científico, Waltham, MA, EUA) procedimentos de coloração imuno-histoquímica padrão a seguir. IgG anti-camundongo conjugada com peroxidase de Rábano foi usada como um anticorpo secundário, seguido de uma reação enzimática da peroxidase.

Estatísticas

[00139] Teste Student t não utilizado foi utilizado para comparar dois grupos independentes para pontos de extremidade contínuos se normalmente distribuídos. Um ANOVA unidirecional foi usado quando três ou mais grupos independentes foram comparados. Para pontos de extremidade não-normalmente distribuídos, tais como a intensidade de bioluminescência in vivo, um teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para comparar a mediana de NK-92-CS1-CAR-NK-92-EV e grupos de soro fisiológico tamponados com fosfato. Para dados de sobrevivência, curvas de Kaplan-Meier foram plotadas e comparadas usando um teste logrank. Todos os testes foram dos dois lados. Valores de P foram ajustados para comparações múltiplas pelo método de Bonferroni. Um P-valor de < 0,05 é considerado como estatisticamente significativo.

Resultados Geração de células NK-92 e NKL NK expressando CS1-CAR

[00140] A construção de CS1-CAR específica foi gerada com uma estrutura principal de vetor de Lentivirus PCDH, sequencialmente, contendo um peptídeo de sinal (SP), uma região variável de cadeia pesada (VH), um ligante, uma região variável da cadeia leve (VL), um marcador de Myc, uma dobradiça, CD28 e CD3Z(Figura 13). linhas de célula NK-92 e NK NKL foram transfectadas com a construção de CAR e então enviadas a uma expressão de GFP, um marcador expressado pelo vetor. Coloração ocidental das células classificadas demonstrou que CS1-CAR com êxito foi introduzido e expressado, como evidenciado pela expressão do receptor quimérico CS1-scFv contendo CD3Z em NK-92 e linhas de célula NKL transfectadas com a construção do CAR do que com o vetor de controle (figura 13B). Além disso, uma análise do fluxo citométrica após coloração de superfície anti-Myc Ab indicou que CS1-CAR foi expressa na superfície das células NK-92 e NKL transfectadas com construção de CSI-CAR (Figura 13C).

[00141] As células NK CS1-CAR-modificadas mais efetivamente erradicam célukasCS1 + MM, mas não células CS1-, in vitro, em comparação com as células NK transfectadas por simulação

[00142] Depois de gerar as células NK CS1-CAR, determinou-se que elas seletivamente exterminam CS1 + melhor do que as células CS1- MM. Para esta finalidade, primeiro foi confirmado que linhas de célula IM9 e L363 MM constitutivamente expressaram proteínas CS1 em sua superfície, enquanto expressão da CS1 foi insignificante em células U266 MM (figura 14A). Em seguida, um ensaio de liberação de cromo-51 4-h indicou que, em comparação com as células NK-92 de transfectadas por simulação, células NK-92 transfectadas com CS1-CAR foram significativamente reforçada em sua capacidade de exterminarCS1 +IM9 e células L363 (figuras 14B e 14C, deixada painéis). Dados semelhantes foram observados em experimentos repetidos usando células NKL transfectadas com CS1-CAR (figuras 14B e 14C, painéis da direita). No entanto, ambas as células CS1-CAR e NK-92 transfectadas por simulação ou NKL foram semelhantes em seus níveis baixos de citotoxicidade contra células de mieloma CS1U266 (Figura 14D). Além disso, expressão forçada de CS1-CAR não induz a apoptose óbvia em células NK-92 ou NKL conforme determinado pelas análises de coloração de 7AAD/anexina V- usando a citometria de fluxo (Figura 20), sugerindo que expressão de CS1-CAR não causa citotoxicidade para as células NK-92 ou NKL. Da mesma forma, a expressão de CS1-CAR o em células NK humanas primárias purificadas aumentou sua citotoxicidade contra células de mielomaCS1 +IM9.

[00143] Células NK modificadas pro CS1-CAR secretam IFN-y mais do que as células NK transfectadas por simulação fazem após a exposição às célulasCS1 + MM

[00144] O domínio de sinalização da molécula CD28 co- estimulatória, a qual foi incluída na construção de CAR, pode melhorar a ativação após o reconhecimento do scFv de CS1 com o antígeno CSl na superfície das células MM. Portanto, a inclusão deste domínio de sinalização pode ter a capacidade de ativar as células NK não só para ter citotoxicidade maior, mas também para produzir mais de IFN-y, o último dos quais é também importante para a vigilância do tumor e ativação de células T CD8 + e macrófagos (Martin-Figueiredo A, et al. Nat Immunol 2004 5: 1260-1265; Tu SP, et al. Cancer Res 2011 71 :4247-4259; Ma J, et al. Cell Mol Life Sci 2003 60:2334-2346). Para testar isso, as células NK modificadas por CS1-CAR ou engenharia de controle de células NK efetoras também foram cultivadas sozinhas ou co cultivadas com células CS1 + mieloma, incluindo as linhas de célula IM9 e L363 MM. Após 24h, a produção de IFN-y foi medida por ELISA. Como mostrado na Figura 15, ambas células modificadas por CS1-CAR e transfectadas por NK-92 ou NKL simulação produziram espontaneamente baixos ou insignificantes níveis de IFN-y quando incubadas sozinhas. Co-cultura com células de tumor CS1- MM (IM9 ou L363) induzida por IFN-y em ambas linhas celulares CS1-CAR e transfectadas por simulação NK-92 ou NKL; no entanto, significativamente mais elevados níveis de IFN-y foram produzidos por células NK-92 ou NKL modificadas por CAR do que pela NK-92 transfectada por simulação (figuras 15A e 15B, painéis da esquerda) ou células NKL (figuras 15A e 15B, painéis da direita). Quando co cultivadas com as linhas de células CS1-MM, U266, ambos células de NK-92 transfectadas por simulação e CS1-CAR-transfectadas, mas não as células NKL transfectadas produzidas Níveis mais altos de IFN-y do que células correspondentes que não tinham sido co cultivadas com células U266 (Figura 15C). Isto sugere que uma interação única entre receptores de célula NK em células NK-92 e seus ligantes nas células U266 pode induzir a produção de IFN-y do CS1 independente por células NK-92. Além disso, células CS1-CAR- transfectadas NK-92 e células NKL não conseguiram produzir IFN-Y mais do que as célulasNK-92 e NKL correspondentes transfectadas por simulação quando eles co foram cultivados com células U266 (Figura 15C). Estes resultados estão de acordo com os dados acima mencionados citotoxicidade e juntos, indicam que a modificação com CS1-CAR pode melhorar significativamente a qualidade funções de efetoras células NK, em termos tanto de citotoxicidade e produção de IFN-y, em resposta a CS1 +, mas não para as células de mieloma CS1 -.

[00145] Expressão CS1 forçada nas células U266 aumenta a citotoxicidade e produção de IFN-yde NK-92 - C S1-CAR.

[00146] Foi explorado em seguida se essa maior atividade das células NK CS1-CAR baseia-se na expressão de antígeno CS1 em células MM. A observação acima — que a introdução do CS1-CAR conferia células NK-92 com aumento da atividade citotóxica e maior produção de IFN-g em resposta a células CS1 + do mieloma múltiplo, mas não para as células de mieloma U266 CS1- solicitado investigação se superexpressão de CS1 nas células U266 é suficiente para alterar a sensibilidade das células U266 para células NK-92-CS1-CAR. Para este efeito, CS1 foi ectopicamente expresso em células U266 por infecção de Lentivirus. Análise de citometria de fluxo confirmou que proteína CS1 com êxito foi expressa na superfície das células U266-CS1 (Figura 16A). Ensaio de lançamento de cromo-51 indicou que, quando comparado com as células NK-92 transfectadas por simulação, houve um aumento significativo na atividade citotóxica de células NK-92 CS1-CAR-transfectadas para células U266 superexpressando CS1 (figura 16B). Da mesma forma, em comparação com culturas co paralelas, contendo células NK-92 transfectadas por simulação, as células NK-92- CS1-CAR co cultivadas com células U266 superexpressando CS1 secretou níveis significativamente mais elevados de IFN-g (Figura 16 C). No entanto, coerentes com os dados nas figuras 14 D e 15C, não houve diferença na citotoxicidade e secreção de IFN-Y entre células NK-92-CS1-CAR e as células NK-92 de transfectadas simulação quando eles foram incubados com células U266 transfectadas com um controle de vetor vazio (figuras 16B e 16C). Estes resultados sugeriram que o aumento do reconhecimento e extermínio de células de mieloma pelas células NK-92-CS1-CAR ocorre em um forma dependente de CS1.

[00147] Caracterização fenotípica de células NK-92-CS1-CAR

[00148] Foi em seguida investigado se a expressão de um CAR de CS1 específico poderia alterar o fenótipo de células NK. Citometria de fluxo foi usada para comparar a expressão de antígenos na superfície das células NK-92 CS1-CAR- transfectadas e transfectadas por simulação, seguindo a cultura na presença ou ausência de células de mieloma IM9. Como mostrado na figura 17A, não houve diferença entre as cultivadas na presença ou ausência de células IM9, na expressão de receptores de células NK, incluindo NKp30, NKp46, NKG2C e NKG2D. Expressão dos marcadores de ativação de células NK, CD6928 e HLA-DR (Phillips JH, et al. J Exp Med 1984 159:993-1008; Spits H, et al. Immunity 2007 26:11-16) também foi avaliada. Reconhecimento de células IM9 não elicita a expressão CD69 em CD69 NK-92 transfectadas por simulação, no entanto, induziu um aumento moderado, mas significativo, na expressão CD69 na superfície das células NK-92 transfectadas por CS1-CAR (figura 17A). Interessantemente, co incubação com células IM9 causou um aumento dramático na expressão de HLA-DR em ambas células NK-92 CS1-CAR-transfectadas e transfectadas por simulação. Na ausência de IM9 nas células-alvo, não houve diferença óbvia na expressão de HLA-DR entre células NK-92 CS1-CAR-transfectadas e transfectadas por simulação; no entanto, após estimulação com células IM9, a expressão de HLA- DR tornou-se significativamente maior em células NK-92-CS1-CAR do que na células NK-92 transfectadas por simulação. Assim, o aumento dos marcadores de ativação, especialmente HLA-DR, expressados em células NK-92-CS1-CAR pode ter ocorrido no âmbito da citotoxicidade reforçada e produção de IFN-y por essas células, quando eles são expostos a células CS1 + MM. Usando a coloração intracelular, quando comparado com as células NK transfectadas por simulação, células NK-92-CS1-CAR tinham níveis significativamente mais elevados de perforina e granzima expressão de B, mesmo na ausência de células tumorais MM (figuras 17B e 17C). Isto é consistente com um relatório anterior sobre a expressão elevada da granzima B em células T CAR (Koehler H, et al. Cancer Res 2007 67:2265-2273), e também coerente com o facto dessa expressão de perforina e granzime B geralmente são correlacionadas com atividade citotóxica de células NK (Krzewski K, et al. Front Immunol 2012 3:335).

[00149] Células NK-92 CS1-CAR-transfectadas mais efetivamente reconhecem e exterminam células MM primárias resistentes a NK ex vivo

[00150] Para tornar os resultados mais clinicamente relevantes, foi investigado se células NK-92 modificadas por CS1-CAR também abrigava reforçada atividade citolítica e produção de IFN-y quando reconhecendo células primárias MM ex vivo. Citometria de fluxo foi usada para avaliar a expressão de superfície de CS1 em células MM selecionada por grânulos magnéticos CD 138+ de pacientes MM (Figura 18). Em conformidade com o relatório anterior, mostrando que a proteína CS1 foi altamente expressa nas células de paciente MM purificada por grânulo CD 138 magnético de pacientes (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-2784; Tai YT, et al. Blood 2008 112: 1329-1337), proteína CS1 foi expressa na verdade uniformemente na superfície de células primárias MM (figura 18A). Por ensaio de lançamento de cromo-51, células de mieloma primário recém isoladas de pacientes MM foram mostradas para ser altamente resistente a Lise mediada por células de NK-92 mesmo nas proporções E:T tão elevadas quanto 40: 1 e 20:1; no entanto, esta resistência pode ser parcialmente superada pela expressão de célula NK-92 de CS1-CAR, que resultou em um aumento dramático na erradicação das células de mieloma primária (figura 18B). Em consonância com o resultado de citotoxicidade, após co-cultura de 24h com células de mieloma primário, células NK-92 transfectadas por CS1-CAR também secretados significativamente mais elevados níveis de IFN-y que células NK-92 transfectadas por simulação (Figura 18C).

[00151] Células NK-92 transfectadas por CS1-CAR inibem o crescimento do tumor MM e prolongam a sobrevivência dos camundongos suportando tumor em um modelo MM de transplante ortotópico

[00152] Para adicionalmente abordar a potencial aplicação terapêutica de células NK-92-CS1-CAR, sua atividade antitumoral foi examinada em camundongos NSG IM9- xenoenxertados Uma linha de celular IM9 expressando luciferase de vaga-lume (IM9-Luc) foi gerada pelas células IM9 transfectando retroviralmente com vírus expressando luciferase de vaga-lume, em seguida, executando a classificação de células baseadas em GFP. A expressão de luciferase de vaga- lume de comprimento total mRNA foi confirmada por RT-PCR. Como as células de mieloma típico, células de IM9-Luc células expressaram proteínas CD 138 em sua superfície. De acordo com um relatório anterior (Francisco JA, et al. Cancer Res 2000 60:3225-3231), camundongos NSG suportando IM9-Luc exibiram doença disseminada, manifestada por ataxia motor e paralisia do membro posterior. Exame histológico das vértebras da coluna vertebral em um camundongo exibindo paralisia do membro posterior mostrou a presença de numerosas células tumorais e lesões osteolíticas em tecido ósseo (figura 19A, à esquerda). Coloração imuno-histoquímica com anticorpos humanos específicos anti-CD 138 confirmou a presença de células tumorais (Figura 19A, direita). Imagem de Bio luminescência foi usada para monitorar o crescimento do tumor IM9-Luc. Conforme mostrado nas figuras 19B e 19C e de acordo com a citotoxicidade in vitro dados, comparando os camundongos que mais tarde receberam injeções com células de controle transfectadas por simulação, tumores IM9-Luc foram significativamente suprimidos em camundongos que em vez disso, mais tarde foram administradas células NK-92-CS1-CAR. Além disso, o tratamento com células NK-92-CS1-CAR significativamente prolongou a sobrevivência de camundongos suportando tumores IM9-Luc em comparação com o tratamento com as células de controle de NK-92 transfectadas por simulação (Figura 19D). De nota, quando células NK-92-CS1-CAR ou células NK-92 transfectadas por simulação foram administradas da mesma forma, mas sem injeção intravenosa de células IM9-Luc, camundongos não desenvolveram doença disseminada ou morreram.

[00153] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos neste documento têm os mesmos significados tão comumente compreendidos por uma pessoa versada na técnica a que pertence a invenção divulgada. Publicações citadas neste documento e os materiais para os quais eles são citados especificamente são incorporados por referência.

[00154] Aqueles versados na técnica irão reconhecer, ou serão capazes de verificar usando não mais do que rotina experimentação, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção aqui descri tos. Tais equivalents destinam-se a ser englobadas pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Polipeptídeo do receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar, um domínio de sinalização intracelular, e uma região de sinalização coestimuladora, em que o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento variável de cadeia simples (scFv) de um anticorpo que se liga especificamente a CS1, em que adicionalmente o domínio de ligação ao antígeno compreende SEQ ID NOS: 17, 19, 20 ou 21.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende o domínio citoplasmático de uma molécula coestimuladora selecionado a partir do grupo consistindo de CD28 e 4-1BB.

3. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do CAR é definido pela fórmula: SP-CS1-HG-TM-CSR-ISD; em que "SP" representa um peptídeo sinal, em que "CS1" representa o domínio de ligação ao antígeno CS1, em que "HG" representa um domínio dobradiça opcional, em que "TM" representa o domínio transmembranar, em que "CSR" representa a região de sinalização coestimuladora, em que "ISD" representa o domínio de sinalização intracelular, e em que "-" representa um ligante bivalente.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização zeta do CD3 (CD3Z).

5. Sequência de ácido nucleico isolada caracterizada pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 18.

6. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácido nucleico isolada conforme definida na reivindicação 5.

7. Método de obtenção de uma célula caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformar uma célula com o vetor, conforme definido na reivindicação 6; e b) cultivar a referida célula transformada sob condições de crescimento da célula.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a célula é selecionada a partir do grupo consistindo em uma célula T e uma célula exterminadora natural (NK).

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula apresenta uma imunidade antitumoral quando o domínio de ligação ao antígeno do CAR se liga a CS1.

10. Uso de uma célula efetora imune geneticamente modificada para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado por o referido uso ser para o preparo de um medicamento para prover imunidade antitumoral em um sujeito com mieloma múltiplo (MM), em que o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembranar, uma região de sinalização coestimuladora, e um domínio de sinalização intracelular, em que que o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento variável de cadeia simples (scFv) de um anticorpo que se liga especificamente a CS1, em que adicionalmente o domínio de ligação ao antígeno compreende as SEQ ID NOS: 17, 19, 20 ou 21, proporcionando, assim, uma imunidade antitumoral no mamífero.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula efetora imune é selecionada a partir do grupo consistindo em uma célula T e uma célula exterminadora natural (NK).

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimuladora compreende o domínio citoplasmático de uma molécula coestimuladora selecionado a partir do grupo consistindo em CD28 e 4-1BB.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo do CAR é definido pela fórmula: SP-CS1-HG-TM-CSR-ISD; em que "SP" representa um peptídeo sinal, em que "CS1" representa o domínio de ligação ao antígeno CS1, em que "HG" representa um domínio dobradiça opcional, em que "TM" representa o domínio transmembranar, em que "CSR" representa a região de sinalização coestimuladora, em que "ISD" representa o domínio de sinalização intracelular, e em que "-" representa um ligante bivalente.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização zeta do CD3 (CD3Z).