CN112334572A - Hiv治疗组合物和方法 - Google Patents

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杰弗里·萨夫瑞特
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Abstract

使用剥离清除方法可以显著改善HIV治疗，并且尤其是对潜伏的感染的CD4细胞的治疗，该剥离清除方法采用免疫刺激组分和/或HDAC抑制作为一种治疗组分，并且还可以包括第二组分，其中施用疫苗组合物、各种NK细胞、CAR‑T细胞和/或广泛中和性抗体。

Description

HIV治疗组合物和方法
本申请要求2018年6月19日提交的序列号为62/686,846的我们的美国临时专利申请的优先权。
技术领域
本发明的领域是潜伏病毒感染的组合物和方法，并且特别地涉及HIV的潜伏感染。
背景技术
以下描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
尽管许多抗逆转录病毒药物治疗有效地抑制HIV复制，但是不幸的是，它们无法有效治愈感染。这种无法根除病毒的根本原因是在长期存活的静息记忆CD4+ T细胞中建立了潜伏感染。因此，当治疗中断或终止时，当前的抗病毒疗法将导致快速的病毒反弹和疾病进展。最近，有人提出，可以通过将潜伏逆转剂与选择的免疫效应物组合来攻击静息记忆CD4+T细胞中的病毒储库，这些潜伏逆转剂诱导病毒抗原的表达。此策略称为“剥离清除法(kickandkill)”，或可替代地称为“激活并杀死(shock and kill)”。例如，报道了用HIV特异性抗体靶向重新激活的感染细胞，导致自然杀伤(NK)细胞、单核细胞和粒细胞的参与，这些细胞被认为通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)消除感染细胞(参见例如，TheJournal ofinfectious diseases[传染病杂志]215，S152-S159(2017)；Nature communications[自然通讯]7，10844(2016)；和CurrHIVRes[当今HIV研究]11，388-406(2013))。尽管此类策略至少在概念上具有吸引力，但是它们在临床环境中并非同样有效。
在其他方法中，如WO 2010/067980中所述，采用某些组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂来如此重新激活来自CD4+ T细胞储库的潜伏HIV-1原病毒。在这里，诸位发明人将这些HDAC抑制剂与HAART混合物组合以减少潜伏病毒储库。在另一种方法中，将常规抗逆转录病毒疗法与HDAC抑制剂组合以引发HIV重新激活。然而，不幸的是，HDAC抑制剂与常规抗逆转录病毒剂的组合不太成功，这可能是由于抗逆转录病毒剂的免疫抑制作用。
在另外已知的方法中，如“A Phase 1 Study Of Alt-803(Il-15 Superagonist)To Clear Latent Hiv Reservoirs[Alt-803(Il-15超激动剂)清除潜伏Hiv储库的1期研究]”(Conference on retroviruses and Opportunistic Infections：Abstract 356[关于逆转录病毒和机会性感染的会议：摘要356]，2018年3月4日至7日|马萨诸塞州波士顿)中所述，使用IL15超激动剂(ALT-803)来清除潜伏HIV储库。还观察到IL-15超激动剂ALT-803将SIV特异性CD8+ T细胞引导至B细胞滤泡中。然而，尽管通常是良好耐受的，但是ALT-803在产生潜伏HIV储库的持续清除方面也不太有效。
因此，即使本领域已知治疗HIV的多种方法，但是它们中的全部或几乎全部均有一个或多个缺点。因此，仍然需要改善的组合物和方法以改善潜伏的HIV感染的CD4+细胞的治疗和/或清除。
发明内容
本发明主题提供了组合物和方法，在这些方法中，使潜伏的感染的CD4细胞经受剥离清除方法，该剥离清除方法使用免疫刺激和/或HDAC抑制作为一种治疗组分，且可以进一步增加有包括疫苗组合物、各种NK细胞、CAR-T细胞和/或广泛中和性抗体在内的第二组分。
在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种治疗潜伏的HIV感染的细胞的方法，该方法包括将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于免疫刺激性细胞因子或其衍生物和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的至少一种的步骤，其中该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和/或该HDAC抑制剂以在该感染细胞中有效引发病毒抗原表达的浓度和时间存在于该感染细胞处；以及任选地将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于以下中的一种或多种的另一个步骤：(a)针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物；(b)任选地经基因修饰以表达高亲和力CD16受体或嵌合抗原受体的自然杀伤细胞；(c)CAR-T细胞；和/或(d)广泛中和性抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，该免疫刺激性细胞因子或其衍生物是ALT-803或具有与该病毒抗原或CD4 T细胞上的抗原(例如，CD2、CD20或CD32)结合的结合部分的TxM，而在其他在方面，该HDAC抑制剂是伏立诺他(vorinostat)、帕比司他(panobinostat)、丙戊酸、苯基丁酸酯、恩替诺特(entinostat)、CI-994、莫赛替诺司他(mocetinostat)、维瑞塔(Viracta)3996、达诺司他(dacinostat)、比维尼克斯(pivanex)、吉诺司他(givinostat)或贝利司他(belinostat)。最典型地，在体内进行将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和/或该组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的步骤。此外，设想到了将该潜伏的HIV感染的细胞还暴露于针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体中的一种或多种。
关于该疫苗组合物，设想到了该疫苗可以是细菌疫苗、酵母疫苗和/或病毒疫苗，并且该疫苗组合物包含编码至少一种病毒抗原的重组核酸。例如，在该疫苗是细菌疫苗的情况下，优选的是该细菌疫苗是经基因工程化以具有减少的脂多糖表达或缺乏脂多糖表达的大肠杆菌(E.coli)疫苗。另一方面，在该疫苗是酵母疫苗的情况下，优选的是该酵母疫苗是酿酒酵母(S.cerevisiae)疫苗，并且在该疫苗是病毒疫苗的情况下，优选的是该病毒疫苗是腺病毒疫苗。
此外，关于该自然杀伤细胞，设想到了此类细胞典型地包括自体NK细胞、NK92细胞、aNK细胞、haNK细胞或taNK细胞。关于合适的CAR-T细胞，设想到了这些CAR-T细胞具有嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体具有与CD2、CD20或CD32结合的胞外域。关于该广泛中和性抗体，通常优选的是该抗体与gp120结合，并且更典型地与gp120的gp41交界位点、gp120的V1/V2聚糖位点、gp120的V3聚糖位点或gp120的CD4结合位点结合。
因此，诸位发明人还设想了一种治疗携带潜伏的HIV感染的细胞的个体的方法。此类治疗方法将典型地包括向该个体施用免疫刺激性细胞因子或其衍生物和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的至少一种的步骤。最典型地，以在该感染细胞中有效引发病毒抗原表达的剂量和时间表施用该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和/或该HDAC抑制剂。在需要的情况下，此类方法还可以包括向该个体施用以下中的一种或多种的步骤：(a)针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物；(b)任选地经基因修饰以表达高亲和力CD16受体或嵌合抗原受体的自然杀伤细胞；(c)CAR-T细胞；和(d)广泛中和性抗体或其抗原结合片段。最典型地，顺序进行向该个体施用该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和该组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的至少一种的步骤以及施用针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞和该广泛中和性抗体中的一种或多种的步骤，其中这两个步骤间隔至少24小时。
在本发明主题的另一个方面，诸位发明人还设想了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含编码HIV的至少一种病毒抗原的重组核酸，其中将该疫苗组合物配制为细菌疫苗、配制为酵母疫苗或配制为病毒疫苗。最典型地，该细菌疫苗是经基因工程化以具有减少的脂多糖表达或缺乏脂多糖表达的大肠杆菌疫苗，该酵母疫苗是酿酒酵母疫苗，并且该病毒疫苗是腺病毒疫苗。如将理解的，HIV的该病毒抗原是gp120、gp160、gp41/gp160或p24。
在本发明主题的又另一个方面，诸位发明人设想了一种基因工程化的NK细胞，该基因工程化的NK细胞包括重组核酸，该重组核酸包含编码嵌合抗原受体的区段，该嵌合抗原受体具有与CD2、CD20或CD32结合的胞外域。还设想了基因工程化的T细胞，这些基因工程化的T细胞包括重组核酸，该重组核酸包含编码嵌合抗原受体的区段，该嵌合抗原受体具有与CD2、CD20或CD32结合的胞外域。
在本发明主题的仍另一个方面，诸位发明人设想了一种治疗试剂盒，该治疗试剂盒包括haNK细胞和针对HIV病毒的广泛中和性抗体(该抗体任选地与该haNK细胞的CD16受体结合)。
另外，设想了一种具有ALT-803部分和至少一个亲和部分的TxM，其中该亲和部分与病毒抗原或CD4 T细胞上的抗原结合。
根据优选实施方案的以下详细描述以及附图(其中相同的附图标记表示相同的组件)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1是ALT-803的示意图。
图2是TxM的示意图。
图3是描绘了用ALT-803刺激选择的免疫感受态细胞的示例性结果的图。
图4是描绘了在接受(A)ALT-803或(B)刀豆素A刺激之前和之后在8位参与者中HIV转录事件的平均频率和SEM的图。
图5是定量病毒生长测定的示意图。在这里，使用来自ARV抑制的研究参与者的CD4+ T细胞进行测定。以＜50％的孔为阳性的稀释度从HIV-p24+孔中分离病毒。使用TZM-b1测定，将来自这些孔中的每一个的一部分上清液直接用于评估病毒中和。另一部分用于感染激活的原代CD4+ T细胞。用CD4和HIV-Gag共染色以鉴定感染细胞，通过流式细胞术评估bNAb与这些感染细胞的结合。
图6A-6D是一组bNAb对重新激活的储库病毒的中和的广度和效力的示例性结果：(6A)针对来自研究参与者OM5162的病毒分离株#1和#3的代表性中和曲线。每个图代表针对一种病毒的、靶向相似表位的抗体，并且每条曲线代表来自一种bNAb的结果。在热图中显示了(6B)半最大抑制浓度(IC50)和(6C)IC80。抗体浓度越低，储库病毒对特异性bNAb越敏感(bNAb按结合表位类别显示；HIV-IG，阳性对照抗体；4G2-Hu，阴性对照抗体)。计算了针对所有测试的36种(或35种)储库病毒的几何平均浓度。(6D)显示抗体组合的中和覆盖的热图。示出了使用10μg/ml的IC80截止值被所指示的组合中的至少一种抗体中和的病毒分离株的％。
图7A-7D示出了一组bNAb对重新激活的储库病毒的结合的广度和效力的示例性结果。(7A)显示bNAb与感染储库病毒的细胞结合的代表性流式图，在活/CD3+细胞群上门控。对于每种bNAb/病毒组合，我们计算了中值荧光强度(MFI)比率，其定义为HIV感染细胞群(Gag+)中bnAb的MFI/HIV未感染细胞群(Gag-)中bnAb的MFI。所展示的小图提供了bNAb与不同病毒分离株结合的示例性参与者内多样性。(7B)显示5μg/ml的bNAb与所指示的病毒分离株的结合的热图。给出的数字是MFI比率，其中值越高指示结合水平越高。(7C)显示当以其IC80中和浓度进行测试时每种bNAb与感染细胞的结合的热图。(7D)显示单个bNAb和所有两种bNAb浓度的结合覆盖(MFI比率＞2)的热图。抗体组合的覆盖广度是基于使这两种bNAb中的至少一种以MFI比率＞2结合来定义的。
图8A-8B是显示Gag+CD4-群体代表与HIV Env的特异性结合的示例性结果。(8A)显示bNAb与CD4+(早期感染)和CD4-(晚期感染)群体的差异性结合的、在活/CD3+/HIV-Gag+(所有的感染细胞)上门控的代表性流式图。数字显示了每个象限中的细胞百分比，并且表明对于3BNC117和10-1074，大多数bNAb结合都在CD4-群体的情况下发生。(8B)分图A中表示的分析的总结数据，显示了在CD4+与CD4-群体之间的MFI比率的成对比较。MFI比率定义为(Gag+CD4+中bNAb的MFI)/(Gag-中bNAb的MFI)(绿色的点)或(Gag+CD4-中bNAb的MFI)/(Gag-中bNAb的MFI)(红色的点)。数字指示倍数差异(Gag+CD4-MFI比率的平均值)/(Gag+CD4+MFI比率的平均值)。
图9A-9B描绘了在5μg/mlbNAb浓度下病毒中和与成对的晚期感染细胞结合之间的相关性的结果。对于每种抗体，使用5μg/ml浓度，示出了IC80病毒中和值和与晚期感染细胞(Gag+CD4-)结合之间的相关性。(9A)一起测试的所有抗体的相关性。(9B)独立测试的每种bNAb的相关性。每种病毒/bNAb组合通过圆圈指示，并且每种颜色代表一位研究参与者。通过Spearman相关系数(r)分析相关性，其中统计显著性用红色字母突出显示。
具体实施方式
现在诸位发明人发现，使用剥离清除方法可以显著改善HIV治疗并且尤其是潜伏的感染的CD4细胞的治疗，该剥离清除方法采用免疫刺激组分和/或HDAC抑制作为一种治疗组分，并且优选地(但不是必须地)还包括第二组分，其中施用疫苗组合物、各种NK细胞、CAR-T细胞和广泛中和性抗体中的一种或多种。
最值得注意的是，并且在其他发现中，诸位发明人现在已经观察到IL-15并且尤其是IL-15的增强形式单独地或与HDAC抑制剂组合地均可以在潜伏的感染细胞中引起病毒蛋白的产生。此外，由于IL-15还充当免疫刺激性细胞因子，因此IL-15并且尤其是ALT-803(阿尔托生命科学公司(Altor Bioscience)，3958，2810N Commerce Pkwy，佛罗里达州米拉玛，33025)将在潜伏病毒重新激活后产生免疫刺激作用，并且因此可能由于NK和CD8+ T细胞的激活而有助于病毒和感染细胞的免疫清除。因此，通常优选的是通过施用ALT-803(典型地以从使用ALT-803的癌症免疫疗法中已知的剂量和时间表)可以实现‘剥离清除’方法中的至少‘剥离(kick)’阶段。图1示例性并且示意性地描绘了ALT-803。同样，HDAC抑制剂的剂量和时间表将与癌症疗法中目前已知的剂量和时间表平行。
此外，由于IL-15并且尤其是ALT-803(及其变体)的多向性效应，另外的免疫治疗剂将进一步(协同地)增强抗病毒作用。例如，在免疫治疗剂是疫苗的情况下，免疫刺激性细胞因子将显著增加T细胞和NK细胞的增殖和激活，这将靶向病毒蛋白和呈递这种蛋白质的细胞。类似地，在免疫治疗剂是NK和/或CAR-T细胞的情况下，免疫刺激性细胞因子将增加NK和/或CAR-T细胞的增殖和细胞毒性。同样，在免疫治疗剂是广泛中和性抗体或其抗原结合片段的情况下，免疫刺激性细胞因子将经由激活的细胞毒性T细胞或NK细胞(特别是在NK细胞具有高亲和力CD16的情况下)增加ADCC。
例如，并且关于免疫刺激性细胞因子或其衍生物，设想到了适合于ALT-803的剂量将在0.1-50μg/kg之间，并且更典型地在0.1-0.5μg/kg之间、或在0.5-5.0μg/kg之间、或在1-10μg/kg之间。因此，合适的剂量将是至少0.5μg/kg、或至少1.0μg/kg、或至少2.0μg/kg、或至少5.0μg/kg、或至少7.0μg/kg。施用可以是静脉内的和/或皮下的。类似地，合适的HDAC剂量(例如，对于伏立诺他)典型地每次施用在50-10,000mg之间、或每次施用在100-1,000mg之间、或每次施用在400-2,500mg之间、或每次施用在800-5,000mg之间、或每次施用在2,000-10,000mg之间。因此，合适的剂量将是至少400mg、或至少800mg、或至少1,200mg、或至少2,000mg、或至少4,000mg。施用优选地是口服的。进一步合适的HDAC抑制剂包括帕比司他、丙戊酸、苯基丁酸酯、恩替诺特、CI-994、莫赛替诺司他、维瑞塔VRx-3996(2533SCoast Hwy 101Suite 210，加利福尼亚州卡迪夫，92007)、达诺司他、比维尼克斯、吉诺司他和贝利司他，并且合适的剂量通常等于、低于或高于对于此类HDAC抑制剂公开的或以其他方式推荐的剂量。
在本发明主题的仍进一步的方面，尤其设想到了可以使免疫刺激对潜伏的感染细胞更具特异性。为此，可以构建TxM(参见阿尔托生命科学公司，3958，2810N CommercePkwy，佛罗里达州米拉玛33025)，其包括至少一个靶向潜伏的感染细胞上的一种或多种抗原的亲和部分(例如，scFv部分)。图2示例性地描绘了具有配置为scFv的各种结合(亲和)部分的TxM。例如，尤其合适的指示潜伏HIV感染的抗原包括表1中的那些。然而，可以被结合部分结合的特别优选的靶标包括CD2、CD4、CD20和/或CD32。
表1
Figure BDA0002846063340000071
当然，应当理解，此类TxM分子可以包括相同或不同的亲和部分。无论亲和部分的类型如何，都应当注意，TxM还在潜伏的感染细胞中提供免疫刺激以及表达病毒蛋白的引发信号。因此，应当注意，‘剥离清除’策略可以通过单独地或与HDAC抑制剂组合地施用免疫刺激性细胞因子或增强的免疫刺激性细胞因子(如ALT-803和/或TxM)来实现。
然而，在本发明主题的进一步设想的方面，该治疗可以进一步扩展至包括施用(a)针对病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物；(b)任选地经基因修饰以表达高亲和力CD16受体或嵌合抗原受体的自然杀伤细胞；(c)CAR-T细胞；和/或(d)广泛中和性抗体或其抗原结合片段。
疫苗配制剂将典型地包括细菌疫苗配制剂、酵母疫苗配制剂和病毒疫苗配制剂，它们将典型地是包括编码一种或多种HIV抗原的区段的重组疫苗。此外，应当注意，疫苗配制剂还可以编码患者特异性HIV抗原，即经由电脑模拟确定与个体MHC类型结合的抗原片段。此外，通常优选的是疫苗将靶向感染中的潜伏(即，早期)病毒。尽管许多HIV抗原被认为适合用于制备疫苗，但是通常优选的是，所靶向的抗原是HIV的gag(多聚)蛋白。
关于细菌疫苗配制剂，通常设想到了此类疫苗包括基因工程化的细菌，其组成性地或诱导性地表达HIV相关抗原。无论表达方式如何，都可以对基因工程化的细菌进行辐照，或者以其他方式使其成为复制缺陷的或被杀死。然后可以将编码所需HIV相关抗原的重组核苷酸序列插入盒中，并且克隆到具有特异性启动子的载体中，使得它可以在细菌中表达。尽管可以使用适合于表达蛋白质的任何载体，但是优选的是可以携带至少1k、优选地2k、更优选地5k碱基对的盒大小的载体。最优选地，设想了可以被亚克隆到不同载体中的盒，以如此有利于产生携带相同盒的不同重组实体(例如，酵母和/或病毒)。
具有经修饰的脂多糖的一种示例性细菌菌株包括
Figure BDA0002846063340000081
BL21(DE3)电感受态细胞。此细菌菌株是BL21，具有基因型F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm lonλ(DE3[lacIlacUV5-T7基因1ind1 sam7 nin5])msbA148ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA。在此情况下，应当理解，若干个特定的缺失突变(ΔgutQΔkdsDΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA)编码LPS向脂质IVA的修饰，而一个另外的补偿突变(msbA148)使得细胞能够在LPS前体脂质IVA的存在下维持活力。这些突变导致寡糖链从LPS缺失。更具体地，六条酰基链中有两条发生缺失。LPS的六条酰基链是由与髓样分化因子2(MD-2)复合的Toll样受体4(TLR4)识别的引发物，导致NF-kB的激活和促炎性细胞因子的产生。仅含有四条酰基链的脂质IVA不被TLR4识别，并且因此不会引发内毒素应答。尽管提供电感受态BL21细菌作为实例，但是诸位发明人设想到了经基因修饰的细菌也可以是化学感受态细菌。
可替代地，诸位发明人还设想到了患者自身的内共生细菌可以用作媒介物，以在体内表达HIV相关抗原，从而引起免疫应答。如本文所用，患者的内共生细菌是指存在于患者体内的细菌，无论患者的健康状况如何，没有引起任何实质性的免疫应答。因此，设想到了患者的内共生细菌是患者的正常菌群。例如，患者的内共生细菌可以包括通常在人的肠或胃中发现的大肠杆菌或链球菌属(Streptococcus)。在这些实施方案中，患者自身的内共生细菌可以从活检样品或从生物样品(例如，唾液、粪便等)获得。然后可以在体外培养患者的内共生细菌，并且用编码一种或多种人疾病相关抗原的核苷酸转染。
因此，应当理解，本文提供的方法中使用的细菌可以来自产生LPS的菌株或经基因工程化以具有减少的或消除的一种或多种导致LPS(其由TLR并且特别是TLR4识别)形成的酶表达的菌株。最典型地，此类细菌将被基因修饰以按可诱导的方式表达至少一种HIV相关抗原。在其他选择中，可以用哺乳动物中不常见的合成化合物(例如，IPTG、取代的苯、环己酮相关化合物)或用哺乳动物中天然存在的化合物(例如，糖(包括1-阿拉伯糖、1-鼠李糖、木糖和蔗糖)、ε-己内酰胺、丙酸酯或肽)来诱导表达，或者诱导可以在一种或多种环境因子(例如，温度或氧敏感启动子)的控制下。最典型地，将对细菌疫苗中的细菌进行热灭活或辐照，以使细胞不再能够在患者体内繁殖。
类似地，关于酵母疫苗配制剂，设想到了许多酵母生物可以与本文提供的教导结合使用。然而，尤其优选的酵母生物包括以下属的各种物种：酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、隐球酵母属(Cryptococcus)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosachharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。如上针对细菌疫苗所述，酵母优选地是重组酵母，其被转染以至少表达至少一种HIV相关抗原。例如，在WO 2008/097863中描述了产生疫苗的合适酵母菌株和方法。此外，应当理解，酵母或细菌疫苗中的重组核酸可以编码单一抗原或多种抗原(典型地配置为多表位)。
关于病毒疫苗配制剂，应当注意，用导致至少一种抗原蛋白或肽表达的核酸构建体基因修饰病毒。例如，合适的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、疱疹病毒、慢病毒等。然而，腺病毒是特别优选的。此外，进一步优选的是，病毒是复制缺陷的非免疫原性病毒，其典型地通过靶向缺失选择的病毒蛋白(例如，E1、E3蛋白)来实现。此类希望的特性可以通过缺失E2b基因功能来进一步增强，并且如最近报道的(例如，J Virol.[病毒学杂志]1998年2月；72(2)：926-933)，可以使用经基因修饰的人293细胞来获得高滴度的重组病毒。
无论重组病毒的类型如何，都设想到了可以使用病毒来离体地或在体内感染患者(或非患者)细胞。例如，病毒可以皮下地或静脉内地注射，或者可以鼻内地或经由吸入施用，以如此感染患者细胞并且尤其是抗原呈递细胞。可替代地，可以在体内感染患者的(或来自同种异体来源的)免疫感受态细胞(例如，NK细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等)，并且然后输注给患者。在其他实施方案中，免疫疗法无需依赖病毒，但是也可以使用RNA或DNA或者导致所需的一种或多种抗原(例如，作为单一肽、串联小基因等)在所需细胞并且尤其是免疫感受态细胞中表达的其他重组载体进行核酸转染或疫苗接种来实现。
最典型地，所需核酸序列(用于从病毒感染的细胞中表达)在本领域熟知的适当的调节元件的控制下。例如，合适的启动子元件包括组成型强启动子(例如，SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK、CAGG启动子)，但是诱导型启动子也被认为适合用于本文，特别是在对于肿瘤微环境典型的诱导条件下。例如，诱导型启动子包括对缺氧敏感的那些启动子和对TGF-β或IL-8敏感的启动子(例如，经由TRAF、JNK、Erk或其他应答元件启动子)。在其他实例中，合适的诱导型启动子包括四环素诱导型启动子、黏病毒耐药蛋白1(Mxl)启动子等。在WO 2017/222619中描述了用于本文的合适的示例性病毒表达构建体。此外，设想到了例如使用NetMHC2.0或其他已知软件可以针对与患者的MHC类型的结合来选择重组核酸中编码的抗原。
除了(或作为替代)设想的疫苗治疗，合适的治疗和方法还可以包括将自体或异源NK细胞输注给患者，并且特别是经基因修饰以展现出较少的细胞毒性细胞杀伤抑制的NK细胞。例如，经基因修饰的NK细胞可以是NK-92衍生物，其被修饰以具有减少的或消除的至少一种杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)表达，这将使此类细胞被组成性地激活。当然，应当注意，可以使一种或多种KIR缺失或者可以抑制它们的表达(例如，经由miRNA、siRNA等)，包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3和KIR3DS1。可以使用本领域熟知的方案制备此类经修饰的细胞。可替代地，此类细胞可以作为aNK细胞(‘激活的自然杀伤细胞)从南圭斯特公司(NantKwest)商购获得。另外，适合用于本文的设想的NK细胞还包括具有消除的或沉默的NKG2A表达的那些，NKG2A是Treg和MDSC的激活信号。如将容易理解的，如上所述的免疫刺激性细胞因子ALT-803或TxM将激活NK细胞，并且因此放大本文所述的NK细胞的生物学活性。
可替代地，基因工程化的NK细胞还可以是经修饰以表达高亲和力Fcγ受体(CD16-158V)的NK-92衍生物。Fcγ受体的高亲和力变体的序列是本领域熟知的，并且所有产生和表达的方式均被认为适合用于本文。如本领域熟知的，据信这种受体的表达允许使用广泛中和性抗体特异性靶向潜伏的感染细胞。有利地，此类细胞还可以作为haNK细胞(‘高亲和力自然杀伤细胞)从南圭斯特公司商购获得，并且然后可以进一步修饰(例如，以表达共刺激分子)。例如，可以共施用haNK细胞与靶向CD20的抗体。此外，应当理解，haNK细胞可以‘预装’有一种或多种靶向抗体(如广泛中和性抗体和/或特异性或优先与潜伏的感染细胞结合的抗体)(关于合适的标记物，参见表1)。可替代地，haNK细胞也可以与合适的抗体顺序施用，其中典型地在细胞输注之前施用抗体。
在进一步的方面，基因工程化的NK细胞和/或T细胞还可以被基因工程化以表达嵌合T细胞受体。在尤其优选的方面，嵌合T细胞受体将具有scFv部分或具有针对潜伏的HIV感染的细胞的结合特异性的其他胞外域，并且适合于T细胞结合的靶标包括上表1的标记物。可替代地，因此基因工程化的NK细胞可以作为taNK细胞(‘靶标-激活的自然杀伤细胞’)从南圭斯特公司商购获得，并且根据需要进一步修饰。例如，合适的taNK细胞可以表达靶向CD20、CD32或CD4的嵌合抗原受体。如将容易理解的，CAR-T细胞或taNK细胞中的嵌合抗原受体的胞外域也可以衍生自患者的无能细胞。
另外地或可替代地，还设想到了在本文设想的治疗选择中，广泛中和性抗体或其抗原结合片段可以用作清除(kill)阶段的一部分。当然，应当理解，这些抗体可以与NK细胞并且尤其是haNK细胞协同作用，和/或可以独立地向患者施用。此外，应当注意，NK细胞可以是自体的(由于ALT-803施用后增殖增加)或同种异体的NK细胞(例如，haNK细胞、CARt-haNK细胞等)。关于中和性抗体，设想到了所有已知的广泛中和性抗体均被认为适合用于本文，并且适当的广泛中和性抗体包括靶向V3聚糖、CD4bs、gp41MPER、V1/V2、N332聚糖超位点等的那些。因此，合适的广泛中和性抗体包括10-1074、2F512A12、3BNC176、3BNC117、3BNC62、4E1、CAP256-VRC26.01、HGN194、PGT151、PGT152、Z13等。进一步合适的广泛中和性抗体可以在URL：bnaber.org处找到。当然，应当理解，可以采用多于一种单一类型的抗体。此外，广泛中和性抗体无需限于IgG分子，而且包括抗原结合片段，如Fab和scFv。
因此，应当理解，可以按多种方式实现引发潜伏病毒的激活和病毒储库的消除的剥离清除策略，这些方式将感染细胞中病毒蛋白的表达的引发与免疫刺激和/或免疫支持相组合。例如，并且如上已经指出的，可以通过施用ALT-803或靶向CD4(或CD2、CD20、CD32)的TxM、和/或施用HDAC抑制剂(例如，维瑞塔VRx-3996(2533S Coast Hwy 101Suite 210，加利福尼亚州卡迪夫，92007)实现剥离阶段，而清除阶段将优选地包括一种或多种靶向HIVgag(多聚)蛋白或gp120的疫苗组分(细菌、酵母、腺病毒)、NK/CAR-T细胞(靶向CD2、CD20或CD32)和BNAb(广泛中和性抗体)的施用。
实施例
免疫感受态细胞的ALT-803刺激：如从图3可以很容易地看出，ALT803显著增加CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞的活性。图3描绘了每次给药后CD4、CD8和NK细胞的增殖(Ki67)和激活(CD69)。基准＝基线/剂量1前。剂量1是第一次给药后24小时。剂量2是第二次给药后24小时。剂量3是第三次给药后24小时。第三次给药后48小时获得LN和PBMC。在所指示的每个时间点从冷冻样品获得流式数据。
病毒蛋白表达：图4示出了在接受(A)ALT-803或(B)刀豆素A刺激之前和之后在8位参与者中HIV转录事件的平均频率和SEM。使用基于下一代测序(NGS)的方案(称为EDITS(通过基于诱导转录的测序进行的包膜检测(Envelope Detection by InducedTranscription-based Sequencing)))来测量可诱导的细胞相关HIV RNA。在ConA刺激之前和之后，在来自非病毒血症HIV-1感染的受试者的1.25x 106个静息记忆细胞上使用巢式PCR检测包膜序列。
广泛中和性抗体通过抗体与潜伏的感染细胞的结合引发细胞杀伤：使用成对的中和与感染细胞结合测定，诸位发明人评估了bNAb针对从患者CD4+ T细胞重新激活的36种病毒的广度和效力。针对中和，单一抗体的广度范围为0-64％(IC80＜10μg/ml)，并且针对结合，其广度范围为0-89％，其中两种抗体的组合分别达到0-83％和50％-100％。对于大多数抗体，感染细胞结合与病毒中和相关(例如，3BNC117，r＝0.87，p＜0.0001)。简言之，使用了利用haNK或新鲜分离的PBMC NK细胞对原代HIV感染的CD4+ T细胞进行的ADCC测定。诸位发明人观察到对于这两种类型的NK细胞，抗体结合与ADCC之间都有很强的直接相关性。值得注意的是，对于haNK和新鲜的NK细胞观察到了相似的关系，尽管总体上被haNK杀伤更多。在其他中和性抗体中，尤其设想的抗体包括PGT121、10-1074、10E8、10E8v4-V5R-100cF、2F5、2G12、3BNC117、CAP256.VRC26.25、N6、PG9、PGDM1400、PGT121、VRC01和VRC07-523、VRC07523-LS、3BNC117-LS、10-1074-LS和CAP256-VRC26.25-LS，其中的每种都可以单独地或与其他治疗性实体组合地(并且尤其是与ALT-803组合地)使用，如下进一步更详细地描述的。
更具体地，在定量病毒生长测定(QVOA)中，诸位发明人平行地评估了bNAb对一组从8位ARV治疗的个体的潜伏储库重新激活的36种病毒的病毒中和与感染的原代CD4+ T细胞结合(参见示意图，图5)。诸位发明人定义了这些bNAb对来自进化枝B感染个体的地理定位群体的重新激活的储库病毒的中和与感染细胞结合活性的患者内和患者间广度和效力。对于所有展现可观的中和活性的bNAb，这都与感染细胞结合密切相关。
bNAb和bNAb组合对重新激活的储库病毒的病毒中和特征：为了测试bNAb中和储库病毒的能力，诸位发明人获得了一组目前正在开发用于人类临床的14种bNAb，并且将这些按其靶向表位分类。诸位发明人测量了这些bNAb对36种来自有限稀释定量病毒生长测定(QVOA)的已经从8位个体的潜伏储库重新激活的病毒分离株的中和活性(图6A)。V3聚糖特异性bNAb PGT121和10-1074以及V1V2特异性bNAb PG9展现出有效但是相对窄的活性，展现出病毒的53％-69％的可检测的中和(IC50＜50μg/ml)，其中几何平均IC50值范围为0.3-0.6μg/ml(图6B)。相比之下，CD4结合位点(CD4bs)特异性抗体VRC01、VRC07-523、N6和3BNC117以及靶向MPER的抗体10E8展现出广泛的活性，其中病毒的可检测中和为77％-100％(IC50＜50μg/ml)，但是IC50值显著更高(几何平均IC50在2.1-8.9μg/ml之间)(图6B)。这些趋势与使用假病毒测定的先前报道平行，这些假病毒测定还观察到CD4bs抗体和10E8总体上比V3聚糖和V1V2 apex抗体广泛得多，但是效力要低。在当前的实验中，CAP256.VRC26.25以可检测的IC50(IC50＜50μg/ml)仅中和了36种重新激活的储库病毒中的9种(26％)(图6B)。因为已经报道了CAP256.VRC26.25优先中和亚型C，并且这里测试的QVOA病毒分离株都是亚型B，所以诸位发明人观察到的低中和广度与已公开的数据兼容。该数据与已公开的假病毒组的那些数据之间的整体一致的一个例外是2G12，已经显示其在已公开的假病毒组中有效地中和亚型B病毒，但是诸位发明人在测定中仅观察到弱中和，其中只有三种病毒达到80％中和。
诸位发明人在个体的病毒准种内经常观察到中和敏感性的高度相似性，这与遗传相关性一致。例如，来自CIRC1096的五种病毒分离株均对CD4bs和MPER抗体的中和敏感，但是耐V3聚糖和V1V2抗体(图6B-6C)。然而，例外情况并不少见。例如，对于来自OM5346的四种QVOA病毒，这些病毒中的两种(#2和#4)对V1V2抗体(PG9、CAP256-VRC26.25、PGDM1400)高度敏感并且耐V3聚糖抗体(PGT121、10-1074和2G12)，然而病毒#3展现出相反的敏感性特征(图2B和C)。总体而言，在112种研究参与者/bNAb组合(8位参与者x 14种bNAb)中，仅有14种单一bNAb提供了来自给定参与者的所测试的每种病毒分离株的覆盖的情况(IC80＜10μg/ml，图6C中的粗体)。
鉴于上文在任何单一bNAb的覆盖广度和潜在逃逸中观察到的限制，可能任何临床干预都将需要多种bNAb的组合才能有效。因此，诸位发明人计算了在此研究中测试的两种bNAb的所有组合的总广度。诸位发明人基于先前证明在bNAb治疗的临床试验受试者中，此浓度与病毒血症的减少相关，通过使用IC80＜10μg/ml作为准种的几何平均敏感性的截止值确定了广度覆盖。N6与10-1074的组合显示了最大的覆盖广度，为83％(IC80＜10μg/ml)(图6D)，然后是VRC07-523和10-1074的组合，其对于81％的储库病毒分离株展示了IC80＜10μg/ml。对于78％的储库病毒分离株，以下几种抗体组合展示了IC80＜10μg/ml：N6和PGT121、VRC07-523和PGT121、3BNC117和10-1074、3BNC117和PG9、10E8v4-V5R-100cF和10-1074。因此，对于这种地理上离散的进化枝B感染群体，两种抗体组合能够以IC80＜10μg/ml提供重新激活的储库病毒的广泛中和覆盖。
bNAb和bNAb组合对重新激活的储库病毒的感染细胞结合特征：接下来，诸位发明人测量了bNAb与感染已经针对中和进行评估的相同储库病毒分离株的原代CD4+ T细胞的结合。将来自未感染HIV的供体的激活的CD4+ T细胞用重新激活的储库病毒感染，并且用未缀合的bNAb染色，然后用Alexa Fluor647抗人IgG二抗染色。还将这些样品用HIV Gag染色以鉴定感染细胞。诸位发明人使用中值荧光强度(MFI)比率来定量特异性bNAb与感染细胞的结合活性[MFI比率＝(HIV-Gag+细胞中bNAb染色的MFI)/(HIV-Gag-细胞中bNAb染色的MFI)](图7A)。由于诸位发明人已经确定了每种病毒的几何平均IC80中和值，因此对于每种抗体，诸位发明人选择在以下两种浓度下测试感染细胞结合：i)5μg/ml-基于滴定实验选择(数据未显示)，ii)每种抗体的IC80中和浓度(图6C的表格下方指示了值)。
为了确定广度，诸位发明人将结合定义为MFI比率＞2。通常，除VRC01外，CD4bs Ab展现出优异的感染细胞结合广度，当在中和IC80浓度下进行测试时覆盖了83％-89％的储库分离病毒(图7C-7D)。然而，CD4bs的结合效力相对适度，其中大多数展现出在2-4之间的MFI比率(图7B-7C)。与CD4bs抗体相比，V3聚糖抗体PGT121、2G12和10-074展现出更有限的广度，但是显示出显著更高水平的与感染易感病毒的细胞的特异性结合，其中许多MFI比率超过5。对于来自同一个体的不同的病毒分离株，敏感性/抗性特征总体上相关，例如10-1074与来自5/8参与者的所有分离株强烈结合(图7B)，但是展现出缺乏与来自CIRC0196的所有病毒的结合(在两种浓度下)。然而，观察到患者内变异性，例如其中来自OM5162的5种病毒中有1种展现出对10-1074的高度敏感性，并且其余4种展现出抗性。除CAP256.VRC26.25(其主要是进化枝C特异性的)外，V1/V2 bNAb显示出有效的结合活性，特别是在PG9的情况下，其在IC80浓度下对36种储库病毒中的16种显示出高水平的特异性结合，其中MFI比率大于4(图7C)。MPER特异性抗体的感染细胞结合发生改变：10E8v4-V5R-100cF，针对增加的溶解度和效力进行优化的10E8形式45，其在5μg/ml下与36种分离株中的30种结合，其中这些中的13种具有高水平结合(MFI比率＞4)。然而，10E8和10E8v4-V5R-100cF也显示出与未感染的旁邻细胞(Gag-群体)的实质性结合(参见图7A，左侧的分图为代表性染色)。相比之下，MPER特异性bNAb 2F5和4E10展现出储库病毒分离株的总体上窄而弱的结合(图3B和C)。值得注意的是，与来自同一个体的其他分离株相比，来自患者OM5162的病毒#1显示出高度不同的bNAb结合特征：它被抗体VRC07-523、3BNC117、N6、PGT121、10-1074和PGDM1400强烈结合，然而其他自体病毒分离株则被这些bNAb弱结合(如果有的话)。类似地，来自OM5346的病毒在与V3聚糖特异性bNAb结合中也显示出个体内多样性，如所显示的PGDM1400和PG9与病毒#1和#3稳健结合(MFI比率＞6)，而未观察到与病毒#2和#4的结合(图7B和7C)。数据指示在与感染储库病毒分离株的细胞的结合中的个体内和个体间变异性，突显了在治疗剂中使用任何单一抗体的局限性。
在群体中实现病毒储库分离株的广泛覆盖可能需要至少两种bNAb的组合。为了在当前的群体中进行评估，诸位发明人使用通过中和IC80抗体浓度获得的结合数据计算了所有可能的两种抗体组合的结合覆盖(图7D)。当与2G12或V1/V2抗体或MPER抗体(4E10除外)组合时，所有的CD4bs(不包括VRC01)抗体均达到了＞92％的覆盖。值得注意的是，2G12与VRC07-523或N6或者10E8或10E8v4-V5R-100cF的组合达到了100％的覆盖，然而，如先前所提及，10E8v4-V5R-100cF在体外测定中显示出高水平的旁邻细胞结合。3BNC117+2G12和VRC07-523+PG9达到了97％的覆盖，因此代表了对于靶向重新激活的进化枝B储库病毒有前途的组合(图7D)。
关于所测试的抗体的不同浓度对结合的影响，由于在其9.3μg/ml的IC80浓度处观察到的背景结合减少，因此10E8v4-V5R-100cF在5μg/ml下总体上展现出更有利的结合特征(MFI比率)。相比之下，即使在5μg/ml下PG9也显示出缺乏背景结合，并且因此在此较高浓度下展示了有利的结合特征(图7B和7D)。
bNAb对早期(Gag+CD4+)与晚期(Gag+CD4-)HIV感染细胞具有差异性结合：通过Nef、Vpu和Env的协同作用，通过HIV感染细胞导致表面CD4表达的进行性且几乎完全的丧失。因此，在激活的CD4+ T细胞的短期体外感染中，Gag+CD4-细胞比其Gag+CD4+对应物(其尚未下调CD4)代表更晚期的感染。已经显示细胞表面CD4例如通过诱导gp120脱落和gp41残余部分(stump)暴露来影响顺式Env的构象(在同一细胞上)。上述的感染细胞结合数据集使我们有机会在这些感染重新激活的储库病毒的原代CD4+ T细胞中测试此类影响的证据。
然后，诸位发明人评估了在测定中是否存在bNAb与早期(Gag+CD4+)与晚期(Gag+CD4-)感染细胞的差异性结合。在活的HIV感染细胞(淋巴细胞、活细胞、CD3+、HIV-Gag+)上进行门控后，诸位发明人观察到明显的差异，其中一些bNAb(如3BNC117、10-1074和PGDM1400)显示出与晚期感染细胞(CD4-)的优先结合(图8A，上面的分图)，并且其他bNAb(如10E8v4-V5R-100cF)显示出与早期和晚期群体的相似结合(图8A)。为了系统地进行测试，诸位发明人选择了当在中和IC80浓度下测试时显示出结合(所有的Gag+/Gag-MFI比率＞2)的样品，并且比较了Gag+CD4+与Gag+CD4-群体中bNAb的感染细胞结合(MFI比率)(图8B)。另外，诸位发明人计算了这些早期和晚期感染群体之间的倍数差异＝(Gag+CD4-的几何平均MFI比率)/(Gag+CD4+的几何平均MFI比率)。诸位发明人观察到，所有gp120特异性bNAb均与晚期感染群体展现出比与匹配的早期感染群体更高水平的结合(倍数差异：1.7-3.9，图8B)。相比之下，每种gp41特异性bNAb与早期感染群体与晚期感染群体展现出相似或略高水平的结合(倍数差异：0.90-0.97，图4B)。由于在晚期感染细胞中Env以较高的水平表达并且因此可以预期与晚期感染细胞的结合更高，因此此结果和gp41特异性bNAb与存在于早期感染细胞上的Env的构象的优先结合一致。另外，这些结果与以下猜想是一致的，即不仅Env的量而且感染细胞表面上CD4的存在影响bNAb结合特征。一种含义是，图7中提供的结合数据-其是基于总Gag+细胞生成的-过度代表了与早期感染细胞的结合(对于gp120特异性抗体)，并且低度代表了与晚期感染细胞的结合。仅基于晚期感染群体计算的数据显示，对于在此研究中使用的大多数bNAb-最值得注意的是对于CD4bs bNAb和PG9，结合特征都显著增强。第二种含义是，细胞感染动力学可能影响检测感染细胞结合与病毒中和之间关系的能力。例如，如果病毒1以比病毒2更快的动力学复制，并且因此与Gag+CD4+细胞相比具有更大比例的Gag+CD4-细胞，则这将以非Env本身固有的方式使bNAb结合特征偏斜。为了进行解释，诸位发明人既基于总的Gag+细胞又仅基于Gag+CD4-晚期感染群体评估了这些关系(下文)。
对于大多数bNAb，病毒中和与感染细胞结合相关：已经广泛研究了bNAb对多种多样的HIV分离株的中和活性的广度和效力。相比之下，相对较少的研究评估了作为ADCC的重要先决条件的感染细胞结合的广度和效力。因此，利用bNAb指导针对感染细胞的ADCC的努力将从对可以从针对给定病毒的中和活性推断出的感染细胞结合的程度的理解中受益。成对的结合和中和数据集允许我们使用多种分析方法关于用于结合测定的两种bNAb浓度和靶细胞感染阶段进行评估。关于bNAb浓度，对于每种bNAb，以5μg/ml以及以该抗体对该组储库病毒的几何平均IC80中和浓度评估了与感染细胞的结合。对于后者，这意味着以＞5μg/ml测试了一些抗体(除了以49.2μg/ml测试了4E10)，然而以显著更低的浓度测试了其他抗体(例如以0.6μg/ml测试了PGT121)(图6C中的热图下方给出了几何平均IC80浓度)。因此，此方法试图归一化不同bNAb之间亲合力的固有差异。关于靶细胞的感染阶段，诸位发明人基于上述差异性结合模式分别测试了中和IC80与和总感染细胞(Gag+)或和晚期感染细胞(Gag+CD4-)的结合之间的相关性。其中，评估结合与中和之间关系的最适当的方法可能取决于所提出的问题。然而，重要的是，如下所述，证明在这些不同方法中诸位发明人观察到的关系是保守的。
诸位发明人首先测试了中和IC80浓度与在5μg/ml bNAb浓度下的结合水平(MFI比率)之间的相关性。如上所述，由于处于HIV感染早期阶段与晚期阶段的细胞展现出差异性的bNAb结合特征，因此复制动力学可能影响结合的整体评估。为了提高辨别结合与中和之间的Env固有关系的能力，诸位发明人因此将这种初始分析限制于晚期感染(Gag+CD4-)群体。当将所有抗体一起考虑时，诸位发明人观察到病毒中和与感染细胞结合之间的显著的直接相关性(p＜0.0001，r＝0.63)(图9A)。对于每种显示出可观的中和活性的bNAb(VRC01、VRC07、3BNC117、N6、PGT121、10-1074、PGDM1400、PG9、10E8和10E8v4-V5R-100cF)，诸位发明人观察到中和活性与感染细胞结合之间的显著的直接相关性(图9B)。抗体2F5和CAP256.VRC26.25在中和或结合方面几乎没有显示出来，从而排除了检测这些因素之间关系的可能性。2G12和(在较小程度上)4E10是明显的异常值，因为它们显示出了与此组中许多病毒的可观的结合能力，但是几乎没有相应的中和活性。这种缺乏有效的中和活性与来自假病毒测定的数据不一致，但是与使用从T细胞产生的病毒的先前数据一致，这表明2G12敏感性与病毒来源尤其有关。
如通过其他方法测量的中和IC80浓度与结合之间的相关性表示如下：i)以5μg/ml的浓度测试的抗体与总感染群体(所有的Gag+)的结合；ii)以IC80中和浓度测试的抗体与晚期感染群体(Gag+CD4-)的结合；iii)以IC80中和浓度测试的抗体与总感染群体(所有的Gag+)的结合。在这些不同的分析中，相关系数变化相当大，其中对于不同的bNAb，不同的方法产生了更强的相关性，例如对于3BNC117：对于5μg/ml的总Gag+，Spearman的r＝0.82；相比之下，对于IC80浓度的总Gag+，Spearman的r＝0.60；对于PGT121：对于5μg/ml的总Gag+，Spearman的r＝0.47；相比之下，对于IC80浓度的总Gag+，Spearman的r＝0.71。然而，总体而言，通过一种分析方法展现出显著的相关性的每种抗体通过其他三种方法也展现出显著的相关性，并且对于缺乏显著相关性的那些抗体，反之亦然。因此，bNAb中和给定病毒的能力与其结合相应感染细胞的能力强烈相关。在这些体外测定中，这种相关性足够稳健，以在控制或不控制给定bNAb的亲合力或感染动力学的情况下都能观察到。
方法：诸位发明人使用了以下一组针对HIV的广泛中和性抗体(bNAb)：CD4结合位点抗体(CD4bs)-VRC01、VRC07-523、3BNC117、N6；V3聚糖抗体-PGT121、2G12、10-1074；V1/V2抗体-PGDM1400、CAP256.VRC26.25、PG9；MPER抗体-10E8、10E8v4-V5R-100cF、2F5、4E10；以及阳性对照抗体HIV-IG和阴性对照抗体4G2-Hu进行中和测定。抗体10-1074、2G12和对照抗体HIV-IG是通过NIH的NIAID的AIDS部门(DivisionofAIDS)的AIDS试剂计划分别从波利曼科学公司(Polymun Scientific)的Michel C.Nussenzweig博士以及NABI和NHLBI获得的。John Mascola博士提供了抗体蛋白2F5和4E10以及所有其他抗体重链和轻链表达质粒。抗体质粒通过293F细胞的瞬时转染表达为全长IgG1，并且使用HiTrap Protein A HP柱(通用医疗公司(GE Healthcare))通过亲和色谱纯化。
定量病毒生长测定(QVOA)：从外周血单核细胞(PBMC)(干细胞技术公司(STEMCELLTechnologies)，19052)富集人CD4 T细胞，通过白细胞去除术处理，所述外周血单核细胞是从长期ARV治疗的HIV感染的参与者中抽取的。将细胞稀释至一系列浓度(200万、100万、50万、20万和10万/孔)，然后铺板到24孔板中，并且每种浓度将有12个孔。添加PHA和经辐照的PBMC以重新激活感染细胞，并且在第2天添加MOLT-4细胞以扩增病毒。每3-4天更换培养基，并且在第14天运行p24 ELISA以测量病毒产生量。
p24酶联免疫吸附测定：使用获自NIH的国家癌症研究所(National CancerInstitute)的试剂盒组分进行p24酶联免疫吸附测定(ELISA)。简言之，用捕获抗体包被96孔高结合微孔板(葛莱娜第一生化公司(Greiner Bio-One))过夜，并且用1％BSA溶液封闭过夜。收集来自QVOA孔的上清液，并且用1％x-Triton缓冲液裂解2小时，然后转移至ELISA板中，并且在37”下温育1小时。用微孔板洗涤器(伯腾公司(BioTek))将板洗涤6次后，添加一抗。温育1小时后，添加过氧化物酶标记的二抗(KPL)，并且在37℃下再温育1小时。洗涤6次后，添加TMB底物(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))，并且使其显影15min，然后用终止溶液(百进生物公司(Biolegend))终止。用SpectraMax i3x多模式酶标仪(分子仪器公司(Molecular Device))在OD 450nm和570nm处测量吸光度，并且将截止值设置为＞2倍的阴性对照值的平均值。
中和测定：如先前所述，使用Tzm-b1细胞的感染来测量mAb对QVOA病毒样品的中和。简言之，使用A1phaLISAHIV p24无生物素检测试剂盒(珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)对每个病毒样品中的p24蛋白进行定量，并且将输入病毒归一化至5-10ng/ml用于测定。将10μl的从起始浓度为50μg/ml五倍连续稀释的mAb与40μl的复制感受态病毒样品一式两份地在37”下在96孔透明平底黑色培养板中温育30分钟(葛莱娜第一生化公司)。将Tzm-b1细胞以10,000个细胞/20μl的浓度添加到每个孔中的含有75μg/ml DEAE-葡聚糖和1μM茚地那韦的DMEM中。每个板上包括仅细胞和仅病毒对照。将板在37℃下在5％CO2培养箱中温育24小时，之后通过添加含有茚地那韦的完全DMEM将培养基的体积调节至200μl。感染后48小时，从每个孔中移出100μl，并且将100μl的SpectraMax GloSteady-Luc报告基因测定(分子仪器有限责任公司(Molecular Devices，LLC.)，加利福尼亚州)试剂添加到细胞中。在室温下温育10min以允许细胞裂解后，根据制造商的说明使用SpectraMax i3x多模式检测平台测量发光强度。计算中和曲线，将萤光素酶单位与背景减除后的仅病毒对照进行比较，并且使用GraphPad Prism中的非对称五参数逻辑斯谛方程通过非线性回归进行拟合(图6A)。将50％和80％抑制浓度(分别为IC50和IC80)定义为导致中和降低50％和80％的抗体稀释度。
bNAb结合测定：所有的结合测定均用未缀合的bNAb进行测试。用人CD4T细胞富集试剂盒(干细胞技术公司)分离CD4+ T细胞，并且用CD3/28抗体(百进生物公司)激活48小时。将从QVOA孔(p24+)中收集的上清液通过以下方式用于感染：添加到激活的CD4+ T细胞中，然后在培养中进行1小时和6天旋转接种，其中每3天更换一次培养基。在感染后第3和第5天检查感染率。当大多数感染达到＞5％时，进行bNAb染色。收集细胞，并且用MACS缓冲液(含2％FBS的DPBS)洗涤两次，并且然后等分到96孔板中(100万个细胞/孔)。根据概述的孔通过稀释至5μg/ml的终浓度或IC80浓度(其是根据中和测定生成的中和病毒的几何平均值)添加未缀合的bNAb，并且然后在37”下温育1小时。在不洗涤的情况下，添加Alexa Fluor647标记的二抗(南方生物科技公司(Southem Biotech)，2040-31)，并且在4℃下温育半小时。用MACS缓冲液洗涤两次后，添加以下表面抗体混合物：BV786抗人CD3(BD生物科学公司(BD Biosciences)，563800)、太平洋蓝抗人CD4(BD Pharmingen公司，558116)和LIVE/DEADaqua(生命技术公司(Life technology)，L34966)。30分钟后，洗涤细胞，并且用固定/透化溶液(BD生物科学公司，554714)固定/透化。使用抗HIV-1核心抗原抗体(KC57-RD1，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，6604667)来染色细胞内HIV-1gag蛋白。用1x Perm/Wash缓冲液洗涤两次后，通过流式细胞术(BD Fortessa X-20)检测细胞，并且使用flowjo v10进行数据分析。
统计学分析：使用Prism 7(GraphPad)进行统计学分析。使用flowjo v10分析流式数据。使用Excel生成热图。使用spearman检验校正中和IC80与IC80浓度bNAb结合之间的相关性。
以上结果的主要结论是，给定的bNAb中和临床病毒分离株的能力与其结合感染相同病毒的原代CD4+ T细胞上的细胞表面Env的能力强烈相关。此外，在一大组bNAb的比较中，感染细胞结合和病毒中和的相对水平持续相关-例如，与VRC01相比，10-1074显示出高水平的感染细胞结合和有效的中和。因此，诸位发明人得出结论-关于Ab的Fab组分-基于广泛和有效的中和活性选择Ab也很有可能还选择适合于感染细胞清除的那些Ab。值得注意的是，互反并不总是正确的；其中2G12展现出合理地有效和广泛的感染细胞结合，形成对比普遍缺乏这些衍生自储库的原代分离病毒的中和。尽管不那么引人注目，但是MPER特异性bNAb 2F5和4E10也展现出可观的感染细胞结合(在广度和大小上与VRC01相似)，但是具有最小的中和活性。诸位发明人提出，基于这种关系的方向性的差异可能与这两种功能的差异性抗原构象要求有关。为了使bNAb中和病毒，它必须结合存在于产生感染性病毒的细胞表面上的功能性Env三聚体。相比之下，还与非功能性包膜蛋白(如gp41残余部分)结合的抗体可能以比它们介导中和(如果它们中和的话)的程度更高的程度与感染细胞结合。因此，病毒中和是感染细胞结合的预测因子，但是互反关系并不成立。
尽管可以很直观地看出病毒中和将与感染细胞的结合相关，但是诸位发明人并不认为没有实验证据就可以假设是这种情况。Env的构象可能受到细胞表面与病毒体环境之间的差异的影响，并且这种变异性可能影响不同的病毒分离株。例如，已经证明在感染细胞表面上CD4与Env之间的顺式相互作用可以诱导gp120脱落并且暴露gp41残余部分。已经报道，这增强gp41特异性Ab的感染细胞结合，同时减少gp120特异性Ab的结合。这样的影响可能差异性地影响不同的病毒-例如，Horwitz等人报道了YU2 gp120上的R456K突变减少了gp120脱落，从而导致旁邻细胞(Gag-CD4+)结合减少。该数据与这些观察结果一致，并且提供了CD4的顺式结合调节bNAb与感染细胞的结合的进一步的证据。诸位发明人发现在感染的晚期(CD4低)gp120特异性bNAb优先与细胞结合，而在感染的早期(CD4高)gp41特异性bNAb与细胞相似或稍微更好地结合。然而，尽管在病毒体与细胞表面环境之间存在任何此类差异，但是中和病毒的能力与感染细胞结合显著相关，并且这些关系决定了诸位发明人是考虑了所有的感染细胞(Gag+)还是仅考虑了晚期感染细胞(Gag+CD4-)。
与实验室适应的病毒相比，原发性HIV分离株对bNAb的敏感性较低。为了研究可以预测bNAb治疗促成HIV治愈的功效的因素，诸位发明人认为重要的是研究bNAb对衍生自重新激活的潜伏储库的病毒的特性。通过将QVOA方法与从来自不同的ART抑制的患者的CD4+T细胞的稀释液中分离病毒(其中＜50％的孔为p24+)组合，诸位发明人能够分离可能克隆的病毒以测试bNAb结合和中和特征并且评估患者内和患者间变异性。即使在给定的个体内，诸位发明人也观察到了相当水平的异质性，因此在大多数情况下，任何单一bNAb都无法提供个体的储库分离株的全方位覆盖。然而，两种抗体的组合在个体内和个体间提供了广泛的覆盖，如通过结合评估的，达到高达100％覆盖。注意，由于研究群体来自单个地点(加拿大多伦多)，因此从临床角度出发，这种广度评估代表了在北美进化枝B感染群组中进行单个地点研究的预期的结果。诸位发明人提出，这里提供的方法可以作为优先考虑给定区域患者群体的抗体组合以及个性化个体HIV治愈策略的手段应用于不同的群体，因为使用ART耐药性来指导ART疗法。QVOA测定的临床使用将可能受到其费用、细胞数量要求以及结果的延长时间线(14天)的限制。然而，事实上感染性克隆自体储库病毒作为主要测量的副产品而产生，存在明显的机会。以这种方式进行的HIV储库的定量和定性评估的配对先前称为Q2VOA。
在当前的研究中观察到的中和效力总体上弱于使用假病毒测定先前报道的那些中和效力-最值得注意的是对于2G12，除了两种病毒外，所有病毒均未达到80％的中和。尽管这可能部分由于临床病毒分离株的使用，但是诸位发明人还注意到病毒产生细胞在调节对中和的敏感性中的作用。解决此问题的研究已经报道，T细胞衍生的病毒比通过转染的293T细胞产生的假病毒更耐中和，并且具体地，由PBMC产生的具有复制能力的病毒比Env匹配的假病毒更耐中和。然而，生产细胞对中和敏感性的影响水平似乎存在抗体特异性差异。例如，一项研究报道，PG9对生产细胞的差异不是很敏感，而对于抗体2G12，据报道T细胞与假病毒之间的IC50差异很大。这些数据表明生产细胞差异性地影响Env在所得病毒体上的构象以及它们的密度和糖基化或病毒膜中gp120分子的数量。由于PG9优先靶向有序排列的、封闭的三聚体病毒刺突，这表明在由任一种细胞类型产生的病毒体上均存在同等数量的良好折叠的刺突，然而或许bNAb(如2G12)可以与错误折叠的三聚体同等良好地结合，并且因此对后者的增加更为敏感。此外，某些抗体(如2G12)的表位包括聚糖，并且生产细胞可以影响gp120的糖基化模式。因此，除了中和与感染细胞结合之间的比较之外，当前的研究还有助于重新评估bNAb中和效力，其可能比假病毒测定的数据更具临床适用性。
总之，以上结果为感染细胞结合与病毒中和之间的关系提供了新颖的见解，其可以帮助指导旨在治愈感染或实现对病毒复制的持久免疫控制的免疫治疗策略。即使在这种地理上离散的进化枝B群体内，bNAb敏感性的个体内和个体间变异程度也增强了在此类疗法中利用至少两种bNAb的组合的重要性。在个体或群体水平上筛选重新激活的储库病毒对bNAb的敏感性可以帮助选择抗体组合以获得最佳覆盖-例如，其中PG9与3BNC117或N6的组合在当前的研究群体中提供了94％的有效感染细胞结合覆盖和病毒中和(IC80＜10μg/ml)的72％-78％的覆盖。对于在感染细胞结合与中和之间展现出相关性的bNAb，该研究表明对这些因素中任一种的筛选足以推断两种功能都将抵抗重新激活的储库病毒。
如本文所用，并且除非上下文另外指明，否则术语“耦合至”旨在包括直接耦合(其中两个彼此耦合的要素彼此接触)和间接耦合(其中至少一个另外的要素位于两个要素之间)。因此，术语“耦合至”和“与......耦合”同义使用。
在一些实施方案中，用于描述和要求保护本发明某些实施方案的表达成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施方案中，本书面说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据通过具体实施方案试图获得的所需特性而变化。在一些实施方案中，数值参数应当按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入技术来解释。虽然阐述本发明一些实施方案的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实例中阐述的数值被尽可行地精确地报告。在本发明的一些实施方案中提供的数值可以含有必然由其各自测试测量中所发现的标准偏差引起的某些误差。
除非上下文指明相反，否则本文阐述的所有范围应当被解释为包括其端点，并且开放式范围应当被解释为仅包括商业实用值。类似地，除非上下文指示相反，否则应当将值的所有列表视为包括中间值。
如本文的说明书和随后的整个权利要求中所用，除非上下文清楚地另外指明，否则“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”以及“该(the)”的含义包括复数参照物。而且，如本文的说明书中所用，除非上下文清楚地另外指明，否则“在......中”的含义包括“在......中”和“在......上”。
本文中对值的范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另外指示，否则具有一定范围的每个单独的值被并入本说明书中，如同其在本文中单独陈述一样。除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对原本要求保护的本发明范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
本文披露的本发明的可替代的要素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独或以与组中其他成员或本文发现的其他要素的任何组合被提及和要求保护。出于方便和/或专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组中删除。当发生任何这种包括或删除时，在本文中认为本说明书含有经修改从而满足所附权利要求中使用的所有马库什群组(Markush group)的书面描述的组。
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，除了在所附权利要求的精神中之外，本发明主题不受限制。此外，在解释本说明书和权利要求时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，表明所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或利用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由A、B、C......和N组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要组中的一种要素，而不是A加N或B加N等。

Claims (41)

1.一种治疗潜伏的HIV感染的细胞的方法，该方法包括：
将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于免疫刺激性细胞因子或其衍生物和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的至少一种；
其中该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和/或该HDAC抑制剂以在该感染细胞中有效引发病毒抗原表达的浓度和时间存在于该感染细胞处；以及
任选地将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于以下中的一种或多种：
a)针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物；
b)任选地经基因修饰以表达高亲和力CD16受体或嵌合抗原受体的自然杀伤细胞；
c)CAR-T细胞；和
d)广泛中和性抗体或其抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的方法，其中该免疫刺激性细胞因子或其衍生物是ALT-803或具有与该病毒抗原或CD4 T细胞上的抗原结合的结合部分的TxM。
3.如权利要求2所述的方法，其中该CD4 T细胞上的抗原是CD2、CD20或CD32。
4.如权利要求1所述的方法，其中该HDAC抑制剂是伏立诺他、帕比司他、丙戊酸、苯基丁酸酯、恩替诺特、CI-994、莫赛替诺司他、维瑞塔3996、达诺司他、比维尼克斯、吉诺司他或贝利司他。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在体内进行将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和该组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的至少一种的步骤。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体中的一种或多种。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物是细菌疫苗、酵母疫苗或病毒疫苗，并且其中该疫苗组合物包含编码至少一种病毒抗原的重组核酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中该细菌疫苗是经基因工程化以具有减少的脂多糖表达或缺乏脂多糖表达的大肠杆菌疫苗。
9.如权利要求7所述的方法，其中该酵母疫苗是酿酒酵母疫苗。
10.如权利要求7所述的方法，其中该病毒疫苗是腺病毒疫苗。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该自然杀伤细胞是自体NK细胞、NK92细胞、aNK细胞、haNK细胞或taNK细胞。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该CAR-T细胞具有嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体具有与CD2、CD20或CD32结合的胞外域。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该广泛中和性抗体与gp120的gp41交界位点、gp120的V1/V2聚糖位点、gp120的V3聚糖位点或gp120的CD4结合位点结合，或者其中该广泛中和性抗体选自由以下组成的组：PGT121、10-1074、10E8、10E8v4-V5R-100cF、2F5、2G12、3BNC117、CAP256.VRC26.25、N6、PG9、PGDM1400、PGT121、VRC01和VRC07-523。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体中的两种或更多种。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体中的三种或更多种。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将该潜伏的HIV感染的细胞暴露于针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体。
17.一种治疗携带潜伏的HIV感染的细胞的个体的方法，该方法包括：向该个体施用免疫刺激性细胞因子或其衍生物和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的至少一种；
其中以在该感染细胞中有效引发病毒抗原表达的剂量和时间表施用该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和/或该HDAC抑制剂；以及
任选地向该个体施用以下中的一种或多种：
a)针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物；
b)任选地经基因修饰以表达高亲和力CD16受体或嵌合抗原受体的自然杀伤细胞；
c)CAR-T细胞；和
d)广泛中和性抗体或其抗原结合片段。
18.如权利要求17所述的方法，其中该免疫刺激性细胞因子或其衍生物是ALT-803或具有与该病毒抗原或CD4 T细胞上的抗原结合的结合部分的TxM。
19.如权利要求18所述的方法，其中该CD4 T细胞上的抗原是CD2、CD20或CD32。
20.如权利要求17所述的方法，其中该HDAC抑制剂是伏立诺他、帕比司他、丙戊酸、苯基丁酸酯、恩替诺特、CI-994、莫赛替诺司他、维瑞塔3996、达诺司他、比维尼克斯、吉诺司他或贝利司他。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中顺序进行向该个体施用该免疫刺激性细胞因子或其衍生物和该组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂中的至少一种的步骤以及施用针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞和该广泛中和性抗体中的一种或多种的步骤，其中这两个步骤间隔至少24小时。
22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中向该个体施用针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体中的一种或多种。
23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中该疫苗组合物是细菌疫苗、酵母疫苗或病毒疫苗，并且其中该疫苗组合物包含编码至少一种病毒抗原的重组核酸。
24.如权利要求23所述的方法，其中该细菌疫苗是经基因工程化以具有减少的脂多糖表达或缺乏脂多糖表达的大肠杆菌疫苗。
25.如权利要求23所述的方法，其中该酵母疫苗是酿酒酵母疫苗。
26.如权利要求23所述的方法，其中该病毒疫苗是腺病毒疫苗。
27.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中该自然杀伤细胞是自体NK细胞、NK92细胞、aNK细胞、haNK细胞或taNK细胞。
28.如权利要求17-27中任一项所述的方法，其中该CAR-T细胞具有嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体具有与CD2、CD20或CD32结合的胞外域。
29.如权利要求17-28中任一项所述的方法，其中该广泛中和性抗体与gp120的gp41交界位点、gp120的V1/V2聚糖位点、gp120的V3聚糖位点或gp120的CD4结合位点结合，或者其中该广泛中和性抗体选自由以下组成的组：PGT121、10-1074、10E8、10E8n4-V5R-100cF、2F5、2G12、3BNC117、CAP256.VRC26.25、N6、PG9、PGDM1400、PGT121、VRC01和VRC07-523。
30.如权利要求17-29中任一项所述的方法，其中向该个体施用针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体中的两种或更多种。
31.如权利要求17-30中任一项所述的方法，其中向该个体施用针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体中的三种或更多种。
32.如权利要求17-31中任一项所述的方法，其中向该个体施用针对该病毒抗原产生免疫应答的疫苗组合物、任选地经基因修饰以表达该高亲和力CD16受体或该嵌合抗原受体的自然杀伤细胞、该CAR-T细胞以及该广泛中和性抗体。
33.一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含编码HIV的至少一种病毒抗原的重组核酸，其中将该疫苗组合物配制为细菌疫苗、配制为酵母疫苗或配制为病毒疫苗。
34.如权利要求33所述的疫苗组合物，其中该细菌疫苗是经基因工程化以具有减少的脂多糖表达或缺乏脂多糖表达的大肠杆菌疫苗。
35.如权利要求33所述的疫苗组合物，其中该酵母疫苗是酿酒酵母疫苗。
36.如权利要求33所述的疫苗组合物，其中该病毒疫苗是腺病毒疫苗。
37.如权利要求33所述的疫苗组合物，其中HIV的该病毒抗原是gp120、gp160、gp41/gp160或p24。
38.一种基因工程化的NK细胞，该基因工程化的NK细胞包括重组核酸，该重组核酸包含编码嵌合抗原受体的区段，该嵌合抗原受体具有与CD2、CD20或CD32结合的胞外域。
39.一种基因工程化的T细胞，该基因工程化的T细胞包括重组核酸，该重组核酸包含编码嵌合抗原受体的区段，该嵌合抗原受体具有与CD2、CD20或CD32结合的胞外域。
40.一种治疗试剂盒，该治疗试剂盒包含haNK细胞和针对HIV病毒的广泛中和性抗体。
41.一种具有ALT-803部分和至少一个亲和部分的TxM，其中该亲和部分与病毒抗原或CD4 T细胞上的抗原结合。
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