ES2867373B2 - Tratamiento terapeutico de leucemias linfoblasticas agudas de celulas t con un anticuerpo monoclonal frente al receptor pre-tcr - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
TRATAMIENTO TERAPÉUTICO DE LEUCEMIAS LINFOBLÁSTICAS AGUDAS DE
CÉLULAS T CON UN ANTICUERPO MONOCLONAL FRENTE AL RECEPTOR
PRE-TCR
La presente invención forma parte del sector de la química y la farmacia, en concreto se refiere al uso terapéutico de agentes de reconocimiento específico del receptor pre-TCR humano para el tratamiento y/o la prevención de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) humana de células T (T-ALL), incluyendo el tratamiento y/o prevención de recaídas de dicha enfermedad.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La causa más común de morbilidad pediátrica es la leucemia linfoblástica aguda (ALL, siglas en inglés de Acute Lymphoblastic Leukemia), un tumor agresivo que aparece por la transformación oncogénica de los progenitores linfoides T o B durante su desarrollo (leucemia T-ALL y B-ALL, respectivamente), y de las cuales la T-ALL constituye el 10-15% de los casos (Karrman and Johansson, Genes Chromosomes Cancer, 56 (2), 89 116 Feb 2017).
La ALL, especialmente la T-ALL, tiene un mal pronóstico, aunque el desarrollo de tratamientos de quimioterapia intensiva en las últimas décadas ha incrementado notablemente la esperanza de vida de los pacientes con ALL de ambos tipos celulares. La tasa de supervivencia a 5 años para pacientes de T-ALL está por encima del 70%. En casos de recaídas, la tasa de supervivencia de pacientes de T-ALL disminuye drásticamente a tan solo un 20% (Karrman and Johansson, Genes Chromosomes Cancer, 56 (2), 89-116 Feb 2017).
La mayoría de las recaídas de la ALL ocurren en fases tempranas postratamiento y reflejan la resistencia al tratamiento de una población clonal de células que ya estaban presentes en el momento del diagnóstico (Bailey et al., Lancet Oncol. 5 9: 873-883.
2008), y que son las responsables del inicio, la propagación y el mantenimiento de la leucemia, por lo que se denominan "células iniciadoras de la leucemia” (LIC, siglas en inglés de Leukemia Initiating Cells). El éxito del tratamiento frente a la ALL dependerá, por tanto, de la eficiente eliminación de las LICs. Aunque se han realizado importantes
esfuerzos para diseñar nuevos tratamientos que cumplan este objetivo, el desarrollo de drogas específicas frente a las LICs que reduzcan la frecuencia de recaídas está todavía en sus fases iniciales. Esta labor es compleja, ya que las LICs representan menos del 1% de la población leucémica total y aún no se han encontrado marcadores específicos de estas células. En consecuencia, el éxito de cualquier nueva terapia depende del desarrollo de estrategias que permitan identificar a las LICs de las T-ALL y B-ALL y caracterizarlas, para avanzar en el diseño de nuevas maniobras que permitan eliminarlas.
Los linfocitos T interaccionan con los antígenos a través del receptor antigénico de las células T (TCR, siglas en inglés de T-Cell Receptor), que reconoce a su antígeno diana procesado y presentado en forma de péptidos por las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC siglas en inglés de MajorHistocompatibility Complex). Este receptor TCR es un heterodímero específico de cada clon de células T, que se expresa en la superficie asociado al complejo CD3. Aproximadamente el 90% de las células T de sangre periférica (células TaP) expresan un TCR formado por una cadena polipeptídica TCRa y una TCRp. El 10% restante (células Ty6) expresan un TCR formado por una cadena TCRy y una TCR5. Cada una de estas cadenas del TCR es diferente en cada clon de células T, y está compuesta por una combinación única de los dominios denominados variable (V), [de diversidad (D)], de unión (J) y constante (C). En cada clon de células T, la combinación de los dominios V, (D) y J en ambas cadenas a y P o en ambas cadenas y y 6 participa en el reconocimiento del antígeno de manera específica, a través de 3 regiones complementarias (CDR, siglas en inglés de Complementarity Determining Region), principalmente de la CDR3.
Los genes del receptor TCR, como los genes de las inmunoglobulinas, consisten en una serie de regiones que codifican para los dominios V, D, J y C, que se reordenan durante el desarrollo de las células T en el timo. Los progenitores intratímicos de los linfocitos TaP tienen que hacer frente al menos a dos procesos de selección que están mediados por señales a través de dos receptores diferentes, el pre-receptor de las células T o pre-TCR, y el receptor maduro o TCRap, que se expresan secuencialmente durante el desarrollo intratímico (Borst et al., Curr Opin Immunol 1996; 8: 181-90). En el timo, los genes que codifican para la cadena TCRP se reordenan y expresan antes que los correspondientes al locus TCRa. Los timocitos que reordenan productivamente el locus TCRP expresan en primer lugar un complejo pre-TCR, independiente de TCRa, compuesto por una cadena TCRP unida covalentemente a una cadena invariante preTCRa (pTa), que se asocia con el complejo CD3 y promueve un proceso de control de calidad conocido generalmente como "selecciónfi" (Groettrup et al., Cell 1993; 75: 283 94). La selección p induce la supervivencia y la expansión proliferativa de aquellos timocitos en los que se lleva a cabo un reordenamiento correcto de TCRp y, simultáneamente, determina la inhibición de otros reordenamientos en este locus, o exclusión alélica (Dudley et al., Immunity 1994; 1: 83-93). La expansión celular inducida por el pre-TCR termina bruscamente tras su internalización y degradación, y en la población resultante de timocitos en reposo se inician seguidamente los reordenamientos en el locus TCRa (Petrie et al, Exp Med 1993; 178: 615-22). Tras la expresión de TCRa y la sustitución de pTa por TCRa, el receptor TCRap se expresa asociado con CD3 en la membrana celular, y los timocitos sufren un segundo proceso de selección, conocido como "selección positiva", son rescatados de la muerte celular programada, y tiene lugar la diferenciación final de estas células pre-T en células Tap maduras. Mediante un proceso adicional de "selección negativa" se inducirá la eliminación clonal de aquellos timocitos con receptores TCRap auto-reactivos, garantizándose así la tolerancia a los componentes propios del individuo.
Aprovechando la expresión selectiva de la molécula pTa como diana para la identificación de los linfocitos pre-T, se desarrolló un anticuerpo monoclonal (mAb siglas en inglés de monoclonal antibody) específico para pTa humana, denominado K5G3, que es capaz de identificar de manera específica las células de leucemias T-ALL representativas del estadio madurativo pre-T, y es por tanto útil para el análisis de la capacidad de respuesta de tales leucemias a la quimioterapia mediante análisis de las células residuales en la sangre (ES2190880A1).
Actualmente, el análisis de la enfermedad residual mínima (MRD, siglas en inglés de Minimal Residual Disease), ya sea mediante citometría de flujo (para inmunofenotipos aberrantes), mediante detección del gen de fusión por PCR (para leucemias con translocación en el TCR u otras), o reordenamiento del TCR, es el factor pronóstico de respuesta a tratamiento más claro y potente que existe para la T-ALL, tanto infantil como la del adulto. Disponer de un marcador específico de leucemia resulta de gran utilidad para el seguimiento de la respuesta del paciente al tratamiento y para la identificación temprana de grupos de alto riesgo de recaída, con la posibilidad de adaptar, e incluso anticipar, el tratamiento en estos pacientes.
Un gran avance en el tratamiento de la ALL ha sido la incorporación de la terapia dirigida
mediante mAb, tales como anti-CD20, anti-CD19, y anti-CD22, entre otros. Estos mAb van dirigidos contra las células B malignas, pero también reconocen células B normales que son eliminadas junto a las tumorales, por lo que es necesario infundir inmunoglobulinas a los pacientes. En el caso de la T-ALL existen algunos estudios realizados con anti-CD52, que reconoce tanto células T como B, con resultados no muy esperanzadores y efectos secundarios considerables, debido a la eliminación de células T normales, lo que conlleva la aparición de una inmunodeficiencia severa (Angiolillo et al., Pediatr Blood Cancer. 2009; 53:978-83). Más recientemente, se han desarrollado otras terapias, como las células T con un receptor antigénico quimérico (CAR-T, siglas en inglés para Chimeríc Antigen Receptor), que son células T modificadas genéticamente para expresar un receptor que reconoce al tumor y que se activan para eliminarlo. Un ejemplo de tales terapias se divulga en el documento US2020010555A1, donde se describe un tratamiento por inmunoterapia CAR-T anti-CD123, siendo la B-ALL una de las dianas del tratamiento. Otro ejemplo de inmunoterapia dirigida a B-ALL y a otras leucemias de células B se divulga en el documento US2019062430, el cual se refiere específicamente a la inmunoterapia CAR-T CD19. Estos tratamientos mejoran la tasa de supervivencia en el 50 - 76% de los casos de recaídas de B-ALL, pero su eficacia en el tratamiento de T-ALL aún no se ha demostrado, y parece dudosa por el momento debido a que no se han identificado dianas específicas de las células T tumorales, que eviten la eliminación de las células T normales y el fratricidio de las CAR-T (Tandon y Punnet, Advances in Hematologic Malignancies, Gamal Abdul Hamid, IntechOpen, 23 Oct 2019).
Así, teniendo en cuenta el estado actual del arte, es urgente el desarrollo de agentes terapéuticos alternativos para el tratamiento de la ALL, especialmente T-ALL, que vayan dirigidos a nuevas dianas terapéuticas implicadas selectivamente en la enfermedad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención está dirigida a la identificación de dianas moleculares en las células iniciadoras de leucemia (LIC) linfoblástica aguda (ALL), especialmente ALL de células T (T-ALL), y de agentes terapéuticos frente a esas dianas.
En la presente invención los inventores demuestran que un receptor que se expresa durante el desarrollo de los linfocitos T, conocido como pre-TCR (de pre-T cell receptor en inglés), participa en la función de las células iniciadoras de la leucemia en un grupo
numeroso de T-ALL pediátricas y es, por tanto, una diana terapéutica de especial relevancia para actuar frente a la enfermedad, particularmente frente a las recaídas. Además de identificar el pre-TCR como un biomarcador y potencial diana terapéutica presente en la superficie de las células tumorales de la T-ALL responsables de las recaídas en los pacientes, los inventores demuestran la eficacia de una nueva estrategia de inmunoterapia basada en la administración de un anticuerpo monoclonal (mAb) específico para dicho receptor pre-TCR en un modelo preclínico de xenotrasplante de T-ALL humana en ratones.
En la presente invención los inventores demuestran que el receptor pre-TCR se expresa en la superficie de las células leucémicas durante todos los estadios de progresión de la enfermedad en un modelo de generación de T-ALL humana en ratones. Ello se debe a un bloqueo de la diferenciación de los linfocitos T en el estadio madurativo en que se expresa el pre-TCR, expandiéndose la población pre-TCR+. Además, en la presente invención los inventores demuestran que las células pre-TCR+ de T-ALL tienen actividad iniciadora de leucemia (LIC) y por tanto una función importante en la progresión y recaída de la T-ALL en los pacientes, lo que indica que pre-TCR es una diana terapéutica adecuada para abordar el tratamiento de la T-ALL y prevenir recaídas.
Así, un aspecto de la presente invención es el uso del receptor pre-TCR humano, expresado en la superficie de células T en leucemias linfoblásticas agudas, como diana terapéutica para la identificación, cribado o diseño de compuestos, moléculas, fármacos o similares, útiles para el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de leucemia, preferiblemente leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), más preferiblemente T-ALL pre-TCR+, o útiles para el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de recaídas de leucemia, preferiblemente leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), más preferiblemente T-ALL pre-TCR+.
El término "diana terapéutica” se refiere al receptor pre-TCR humano a nivel de gen, proteína o mRNA, el cual es útil para estudiar el efecto bioquímico de moléculas capaces de unirse a él y neutralizar su función o actividad y/o inducir la lisis celular. Los compuestos, moléculas, fármacos o similares, de interés serán aquellos capaces de ejercer un efecto bloqueante o neutralizante sobre dicho receptor que prevenga su actividad génica o proteica y/o induzca la lisis celular. Estas moléculas pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, aptámeros, RNAs de interferencia, pequeños RNAs interferentes (siRNAs), shRNAs, microRNAs
(miRNAs), oligonucleótidos antisentido, péptidos, peptidomiméticos, pequeñas moléculas, agentes químicos orgánicos o inorgánicos, etc.
Otro aspecto de la invención se refiere a un inhibidor del receptor pre-TCR humano, expresado en la superficie de células T en leucemias linfoblásticas agudas, para su uso como medicamento, preferiblemente para su uso en el tratamiento y/o prevención de leucemia, más preferiblemente leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), aún más preferiblemente T-ALL pre-TCR+; o para su uso en el tratamiento y/o prevención de recaídas de leucemia, más preferiblemente leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), aún más preferiblemente T-ALL pre-TCR+. En otra realización preferida, dicho inhibidor es el anticuerpo de la invención descrito más adelante.
El "inhibidor del receptor pre-TCR humano” se refiere a un inhibidor de la proteína o gen pre-TCR y puede ser cualquier molécula que reduzca los niveles y/o actividad de dicho receptor a nivel génico, proteico o de mRNA. Ejemplos de dichos inhibidores son secuencias antisentido, preferiblemente mRNAs antisentido, siRNAs, shRNAs, anticuerpos anti-pre-TCR humano o fragmentos inmunológicamente activos de los mismos, agonistas, formas solubles del receptor pre-TCR humano que actúen como competidores, o moléculas o compuestos descubiertos o diseñados por métodos de cribado.
Otro aspecto de la invención es el uso del receptor pre-TCR humano como biomarcador, de ahora en adelante el biomarcador de la invención, de células iniciadoras de leucemias (LIC) linfoblásticas agudas. En una realización preferida el biomarcador de la invención corresponde a la subunidad pTa del receptor pre-TCR. En otra realización preferida las células iniciadoras de leucemias linfoblásticas agudas son células T iniciadoras de leucemias, más preferiblemente células T iniciadoras de leucemias T-ALL pre-TCR+. Así, la presente invención propone el uso del biomarcador de la invención para el diagnóstico in vitrn, en una muestra biológica aislada ex vivo, de leucemia linfoblástica aguda, preferiblemente de células T, y/o para el diagnóstico y/o pronóstico de recaídas de leucemia linfoblástica aguda, preferiblemente de células T.
El término "biomarcador” como se usa en la presente invención se refiere a una sustancia, cuya presencia se puede determinar y cuantificar objetivamente, que se utiliza como indicador de la presencia/ausencia de la enfermedad o del pronóstico de la misma, particularmente de la posibilidad de recaídas. El biomarcador de la invención se
puede detectar y/o cuantificar, es decir, se puede únicamente detectar su presencia o bien se pueden detectar y/o cuantificar cambios en la cantidad o concentración del mismo.
El término "leucemia", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere al aceptado término médico para un cáncer de los tejidos de la médula ósea que forman la sangre. Se caracteriza por el crecimiento de glóbulos blancos inmaduros. La enfermedad puede clasificarse en función de qué células sanguíneas son anormales. Los linfomas son cánceres del tejido linfoide (ganglios linfáticos, bazo y otros órganos del sistema inmunológico).
El término “leucemia linfoblástica aguda (ALL)”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un cáncer hematológico caracterizado por la transformación oncogénica de los progenitores linfoides durante su desarrollo.
La expresión “leucemia linfoblástica aguda de células T”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un cáncer hematológico caracterizado por un crecimiento anormal de los progenitores de las células T (un tipo de glóbulos blancos -leucocitos) que se originan en el timo y que progresan rápidamente. La expresión “células iniciadoras de leucemias pre-TCR+”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a células T iniciadoras de leucemias que expresan el receptor pre-TCR en su superficie celular.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitrn, de ahora en adelante el método de la invención, para monitorizar la enfermedad residual mínima (MRD) en pacientes de ALL, preferiblemente de T-ALL, que comprende detectar y/o cuantificar el biomarcador de la invención en una muestra biológica aislada obtenida del paciente, donde la detección del biomarcador en la muestra biológica aislada es indicativo de la presencia de células iniciadoras de leucemias (LIC) linfoblásticas agudas de células T y, por tanto, de la existencia de enfermedad residual mínima en el paciente y de un pronóstico asociado a recaída.
El término “monitorizar”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a observar y comprobar el progreso de la evolución de la enfermedad a lo largo de un período de tiempo.
La expresión “monitorizar la enfermedad residual mínima (MRD)”, se refiere a la detección y posible cuantificación de la cantidad de células tumorales residuales en los pacientes, preferiblemente de células iniciadoras de leucemia (LIC), más allá de la sensibilidad de la citomorfología. Así, monitorizar la MRD se puede definir como aquellos métodos que posibiliten la detección de, por lo menos, una célula tumoral en 10,000 células. Posibles métodos para realizar la monitorización de la MRD son, sin limitación, citogenética, citometría de flujo y sus variantes, como la selección de células activada por fluorescencia (FACS del nombre en inglés Fluorescence Activated Cell Sorter) o la citometría de flujo multiparamétrica de inmunofenotipos asociados con leucemia, técnicas de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR del inglés Polymerase Chain Reaction), técnicas de secuenciación de alto rendimiento, citometría de flujo de nueva generación, PCR en gotas digitales y secuenciación de nueva generación.
La obtención de una muestra biológica aislada del paciente incluye cualquier procedimiento que permita obtener una muestra del sujeto susceptible de ser analizada por el método de la invención. En una realización preferida del método de la invención, la muestra biológica es seleccionada de la lista que consiste en: sangre periférica y muestra de médula ósea. En una realización más preferida la muestra biológica aislada es una muestra de médula ósea.
La expresión “detectar y/o cuantificar el biomarcador de la invención en la muestra biológica aislada” se refiere a cualquier procedimiento que posibilite la identificación de la presencia y/o la medida de la cantidad del biomarcador de la invención en la muestra. Los métodos aplicables a la detección y/o cuantificación son, por ejemplo, los mismos que los empleados para determinar la MRD, o western blot, RMN, citometría de flujo, ensayos de inmunoprecipitación, arrays, preferiblemente basados en anticuerpos, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ensayos enzimáticos inmunoabsorbentes (ELISA) o cualquier otro método enzimático, incubación con un ligando específico, técnicas cromatográficas preferiblemente combinadas con espectrometría de masas, espectroscopía, espectrometría de masas, colorimetría, electroforesis o isoelectroenfoque. Preferiblemente, la detección y/o cuantificación del biomarcador de la invención se realiza mediante hibridación inmunológica in situ, más preferiblemente mediante inmunoensayo tipo ELISA.
En otra realización preferida, la detección y/o cuantificación del biomarcador de la
invención en una muestra biológica aislada en el método de la invención se realiza con un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en la European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom, el día 8 de agosto de 2001, bajo el número de depósito 01080805, capaz de reconocer específicamente la cadena pTa del receptor celular pre-T (pre-TCR) asociada a TCRp y a CD3, de ahora en adelante el “anticuerpo de la invención” o anticuerpo K5G3. En una realización más preferida, el anticuerpo de la invención está conjugado con un marcador detectable.
Dicha "conjugación" se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en el arte para conectar funcionalmente los dominios de un anticuerpo con un marcador que produzca una señal susceptible de ser visualmente detectada, incluyendo sin limitación, la fusión recombinante con o sin dominios intermedios, la fusión mediada por el anticuerpo, la asociación no covalente y la unión covalente, por ejemplo, la unión del anticuerpo con el disulfuro, la unión del hidrógeno, la unión electrostática y la unión conformacional, por ejemplo, las asociaciones de biotina-avidina. La conjugación con un marcador puede darse por medios químicos o recombinantes. Los medios químicos se refieren a una reacción entre el anticuerpo y la etiqueta o marcador de tal manera que se forma un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una sola molécula.
El término "marcador o etiqueta detectable", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a moléculas que pueden generar una señal que es detectable por un método adecuado para dicha detección. Los métodos de detección de marcadores incluyen, entre otros, la fluorescencia, la microscopía óptica, confocal y electrónica, la resonancia magnética y la espectroscopia; fluoroscopia, tomografía computarizada y tomografía por emisión de positrones, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, cromatografía de exclusión de tamaño por detección de fluorescencia, ensayo de flujo lateral, radioinmunoensayo, radiomarcado, western blotting, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia, inmunoprecipitación e inmunospot de tipo enzimático. Los marcadores adecuados incluyen, entre otros, fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluoróforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, flúor-18 y otros radionúclidos emisores de positrones. Además, las sondas o etiquetas pueden ser bi o multifuncionales y ser detectables por más de uno de los métodos enumerados. El marcador o etiqueta puede ser, por ejemplo, un compuesto cromogénico, fluorogénico, magnético, electrodenso, radiactivo y/o quimioluminiscente.
En una realización preferida de la presente invención, la etiqueta o marcador detectable se selecciona de la lista que consiste en: isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC) o cualquier otro colorante fluorescente pertinente en la citometría de flujo, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP), perlas de oro y hierro paramagnético.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al anticuerpo de la invención, para su uso como medicamento. El anticuerpo de la invención está dirigido a la cadena pTa del pre-TCR, lo que supone un valor adicional para su uso como medicamento, ya que la cadena pTa se expresa selectivamente durante el desarrollo intratímico pero está ausente en linfocitos T periféricos, permitiendo por tanto evitar efectos adversos por eliminación de células T normales que podrían inducir una inmunodeficiencia agresiva.
En la presente invención el término “anticuerpo” se refiere a las moléculas de inmunoglobulina o a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígenos que se unen específicamente (reacciones inmunes). Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulina inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima como la pepsina o recombinantemente.
La expresión "anticuerpo monoclonal" alude a una población de moléculas de anticuerpo que contienen una sola especie de un sitio de fijación antigénica capaz de reaccionar inmunológicamente con un epítopo particular del antígeno. El anticuerpo monoclonal puede estar biológicamente alterado mediante manipulación genética, o puede ser sintético. El anticuerpo puede además no tener, en su totalidad o en partes, porciones que no son necesarias para reconocer el antígeno (receptor pre-TCR humano), siendo tales partes sustituidas por otras que transmiten propiedades ventajosas adicionales al anticuerpo.
Los métodos de producción y detección de anticuerpos específicos mediante la tecnología del hibridoma son rutinarios y bien conocidos en el arte. Brevemente, los ratones pueden ser inmunizados con un antígeno no murino y una vez que se detecta una respuesta inmunológica, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno en el suero del ratón, se cosecha el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan, mediante técnicas bien conocidas, con
cualquier célula de mieloma adecuada. Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante una dilución limitada. Los clones de hibridomas son luego ensayados por métodos conocidos en el arte de las células que secretan anticuerpos capaces de unirse a pre-TCR. El líquido de las ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede ser generado por la inmunización de ratones con clones de hibridomas positivos.
El anticuerpo de la invención también puede ser recombinante, quimérico, humanizado, biespecífico, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores.
Un anticuerpo "quimérico” se forma por la región de la cadena H (de heavy) y/o cadena L (de light) que corresponden a secuencias de anticuerpos de ciertas especies o que pertenecen a una clase o subclase de ciertos anticuerpos, mientras que las restantes partes son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otras clases o subclases de anticuerpos, y a fragmentos de tales anticuerpos, de manera que exhibe la actividad biológica deseada. Un anticuerpo "humanizado” es un anticuerpo quimérico donde la región que reconoce el antígeno proviene de otro organismo que no es el humano y las restantes regiones del anticuerpo corresponden a secuencias de anticuerpos humanos. En una realización preferida el anticuerpo de la invención está humanizado.
Los ejemplos divulgados en la presente invención sugieren que el anticuerpo de la invención también induce la internalización del pre-TCR de la superficie celular, lo que supone un mecanismo molecular explotable desde un punto de vista terapéutico, ya que las terapias basadas en el empleo de anticuerpos monoclonales unidos a toxinas son especialmente eficientes en los casos de internalización de las correspondientes dianas moleculares. Así, en otra realización preferida el anticuerpo de la invención se encuentra acoplado a una toxina.
El término "acoplado", tal como se usa en la presente invención, se refiere a que el anticuerpo se encuentra conectado funcionalmente o conjugado con la toxina, incluyendo sin limitación, la fusión recombinante con o sin dominios intermedios, la fusión mediada por el anticuerpo, la asociación no covalente y la unión covalente, por ejemplo, la unión del anticuerpo con el disulfuro, la unión del hidrógeno, la unión electrostática y la unión conformacional, por ejemplo, las asociaciones de biotinaavidina. El acoplamiento con una toxina puede darse por medios químicos o
recombinantes. Los medios químicos se refieren a una reacción entre el anticuerpo y la toxina de tal manera que se forma un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una sola molécula. Alternativamente, el anticuerpo y la toxina se pueden conjugar mediante un linker o conector.
La toxina acoplada al anticuerpo se puede seleccionar, sin limitaciones, de la lista que consiste en: citotoxinas o agentes citostáticos, moléculas radioactivas o radiomarcadas, fármacos y agentes quimioterapéuticos, o cualquier combinación de las mismas.
El término "medicamento", tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a toda sustancia o combinación de sustancias que tenga propiedades para el tratamiento o la prevención de enfermedades en organismos, preferentemente en los seres humanos, o que pueda utilizarse o administrarse a los organismos, preferentemente a los seres humanos, con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. El uso del anticuerpo de la invención como medicamento puede realizarse solo con el anticuerpo o en combinación con otros medicamentos o composiciones a modo de terapia combinada, y puede administrarse simultáneamente o a intervalos de tiempo diferentes (secuencialmente).
En otra realización preferida, el anticuerpo de la invención se usa en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de leucemia, preferiblemente leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), más preferiblemente T-ALL pre-TCR+.
El término "tratamiento", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferentemente un mamífero y, más preferentemente, un humano), incluyendo:
i) Inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo; ii) Aliviar la enfermedad o el estado patológico, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o el estado patológico o su sintomatología;
iii) Estabilizar la enfermedad o el estado patológico.
El término "prevención", tal como se utiliza en la presente invención, consiste en evitar la aparición o la reaparición de la enfermedad, es decir, evitar la enfermedad o el estado patológico o la recaída de la enfermedad en un sujeto (preferentemente un mamífero y, más preferentemente, un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene una
predisposición a la condición patológica pero aún no ha sido diagnosticado.
En otra realización preferida el anticuerpo de la invención se usa en el diagnóstico, tratamiento y/o prevención de recaídas de leucemia, preferiblemente de recaídas de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), más preferiblemente de recaídas de T-ALL pre-TCR+.
El término "recaída”, tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a que la leucemia, que había mostrado una regresión o un estancamiento después del tratamiento, reanuda su desarrollo o progresión, o desarrolla metástasis.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica, de ahora en adelante la composición farmacéutica de la invención, que comprende el anticuerpo monoclonal de la invención, producido por el hibridoma depositado en la European Collection of Cell Cultures bajo el número de depósito 01080805, capaz de reconocer específicamente la cadena pTa del pre-receptor de células T (pre-TCR) asociada a TCRp y a CD3, para su uso en el tratamiento y/o prevención de leucemia, preferiblemente leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), más preferiblemente T-ALL pre-TCR+.
En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención se usa en el tratamiento y/o prevención de recaídas de leucemia, preferiblemente de recaídas de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), más preferiblemente de recaídas de T-ALL pre-TCR+.
En otra realización preferida de la composición farmacéutica de la invención, el anticuerpo se encuentra acoplado a una toxina.
En otra realización preferida de la composición farmacéutica de la invención, el anticuerpo está humanizado.
En otra realización preferida de la invención la composición farmacéutica de la invención comprende además un adyuvante farmacéutico aceptable, un vehículo farmacéutico aceptable y/u otro principio activo.
La expresión "adyuvante farmacéutico aceptable”, tal como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la
preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o proporcionar sabores que la hagan más agradable. Así, los excipientes o adyuvantes podrían tener la función de mantener unidos los ingredientes, como por ejemplo en el caso de los almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorear, la función de proteger la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o de la humedad, la función de rellenar una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, una función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otros tipos de excipientes no mencionados en este párrafo.
La expresión "vehículo farmacéutico aceptable", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a una sustancia utilizada en la composición para diluir cualquiera de los componentes que la componen hasta un cierto volumen o peso. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción idéntica a cualquiera de los elementos comprendidos en la composición de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición.
La composición de la presente invención también puede adoptar la forma de una formulación de liberación sostenida de medicamentos o de cualquier otro sistema de liberación convencional, como por ejemplo, nanopartículas, liposomas o nanoesferas, material polimérico, implante biodegradable o no biodegradable o micropartículas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables. Esa composición y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal y, por lo tanto, a los seres humanos, de diversas formas, entre otras, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraespinal, intraestromal, intraarticular e intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, percutáneo, spray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna o bomba de infusión.
La administración del anticuerpo de la invención o de la composición farmacéutica de la invención se llevará a cabo en una dosis terapéuticamente eficaz, que sea suficiente para que demuestre un beneficio para el paciente, preferiblemente relacionado con una disminución del número de LICs, más preferiblemente T-ALL LICs, o de la capacidad replicativa de las mismas en el paciente. Tal beneficio puede suponer la mejora de al menos un síntoma relacionado con la leucemia linfoblástica aguda. La prescripción del
tratamiento, es decir, las decisiones sobre las dosis, periodicidad, duración, etc., recaerá bajo la responsabilidad del médico general o del especialista que atienda al paciente afectado.
El término "dosis terapéuticamente eficaz" o “cantidad terapéuticamente efectiva”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a una cantidad (o cantidad por unidad de masa del individuo al que se le administra) de un fármaco o agente terapéutico que ocasiona un efecto terapéutico detectable en un individuo o un grupo de individuos a los que les es administrada, ocasionando mínimos efectos secundarios o tóxicos. La cantidad terapéuticamente eficaz útil para producir un efecto terapéutico se puede determinar mediante técnicas convencionales bien conocidas por los especialistas en la técnica. El término “dosis terapéuticamente eficaz-50” o “dosis terapéuticamente eficaz-95” incluye un valor estadístico en el que el efecto terapéutico debe ser detectable en el 50% o el 95% de los individuos a los que les es administrada. En lo relativo a los efectos tóxicos del fármaco o compuesto, es preferible que la dosis terapéutica eficaz no ocasione ninguno. Sin embargo, aunque en ocasiones puedan darse efectos tóxicos, puede llegarse a un compromiso en el que se considera que éstos son preferibles al desarrollo normal de la enfermedad o dolencia sin la administración del fármaco o compuesto, y pueden a su vez ser tratados mediante terapias adicionales.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Generación de una leucemia humana T-ALL en ratones NSG (del inglés NOD scid gamma mouse) trasplantados con células progenitoras hematopoyéticas (HPCs siglas en inglés de Hematopoietic Progenitor Cells) de sangre de cordón umbilical transducidas con el oncogén Notch1 activo (ICN1). A) Esquema del ensayo de transducción y trasplante de ratones NSG. B) Cinética de reconstitución de la médula ósea (izquierda) o de la sangre periférica (derecha) de diferentes ratones trasplantados con células HPCs CD34+ transducidas con ICN1.
Fig. 2. Análisis de la expresión de pre-TCR en las células T-ALL humanas generadas de novo tras la expresión del oncogén ICN1. A) Fenotipo de las células leucémicas ICN1+ para la expresión de CD4, CD8, CD3 y TCRap en la médula ósea de los ratones trasplantados (Fig. 1A), a 20 semanas post-trasplante. Más del 45% de las células ICN1+ CD4+CD8+ doble positivas (DP) de la médula ósea expresan bajos niveles de CD3 en ausencia de TCRap , fenotipo de células pre-TCR+.B) La expresión del pre-TCR es específica de las células leucémicas ICN1+, y no se observa en las células control ICN1-. SP T, CD4+ o CD8+ Single-Positive (único positivo); DP T, CD4+CD8+TCR-afi+Double-Positive (doble positivo); Pre-TCR+, CD4+CD8+ TCR-afi-CD3lo; B, CD19+; Myeloid, CD33+CD13+; Prog. Lin-, CD34+ células que carecen de marcadores específicos de linaje.
Fig. 3. Seguimiento in vivo de la progresión tumoral de leucemias T-ALL pre-TCR+ en un modelo preclínico de xenotrasplante. A) Expresión específica de pre-TCR en la línea T-ALL SUPT1, y ausencia en la línea T-ALL HPB-ALL, definida por la unión simultánea de anticuerpos anti-CD3s y anti-pTa (UCHT1 y el anticuerpo de la invención K5G3, respectivamente). B) Esquema del xenotrasplante en ratones NSG de células SUPT1 o células T-ALL primarias, transducidas con luciferasa para su seguimiento in vivo. C) Análisis por bioluminiscencia de la progresión tumoral de las células SUPT1 o T-ALL primarias, como modelo de leucemia/linfoma pre-TCR+.
Fig. 4. Progresión in vivo en trasplantes seriados de las células pre-TCR+ de la T-ALL generada de novo. (A) Fenotipo heterogéneo TCRap+ y pre-TCR+ de las células leucémicas generadas in vivo a partir de progenitores HPCs humanos ICN1+ en el modelo de patogénesis de T-ALL (Fig. 1). (B) Enriquecimiento (>95%) de las células leucémicas pre-TCR+ generadas en (A) en trasplantes seriados en ratones NSG.
Fig. 5. Estudio de las rutas moleculares de supervivencia y proliferación celular activadas por el pre-TCR expresado en las células con capacidad iniciadora de leucemia (LIC) de la T-ALL generada de novo. A) Fenotipo 100% pre-TCR+ de las células T-ALL obtenidas de la médula ósea de ratón tras 4 trasplantes seriados de una T-ALL generada de novo como se describe en la Fig. 1. B) Análisis por western blot de la activación de las vías de supervivencia y proliferación indicadas, tras la estimulación de las células T-ALL pre-TCR+ en (A) por entrecruzamiento con anticuerpos que reconocen la subunidad CD3s o la cadena pTa del pre-TCR (UCHT1 y el anticuerpo de la invención K5G3, respectivamente).
Fig. 6. Análisis de la progresión in vivo en trasplantes seriados de células T-ALL primarias de pacientes y estudio de la función de su pre-TCR. (A) Enriquecimiento en las células leucémicas pre-TCR+ de un paciente en trasplantes seriados en ratones NSG. (B) Cuantificación del enriquecimiento (>65%). C) Activación de rutas moleculares de supervivencia y proliferación por entrecruzamiento del pre-TCR con anticuerpos que reconocen la subunidad CD3s o la cadena pTa del pre-TCR (UCHT1 y el anticuerpo de la invención K5G3, respectivamente) en células T-ALL primarias.
Fig. 7. Separación de subpoblaciones pre-TCR+ y pre-TCR- de células T-ALL primarias y esquema del ensayo de su actividad LIC in vivo. A) Las células primarias T-ALL17 aisladas de la sangre de un paciente se separaron por citometría de flujo en dos poblaciones: CD3+TCRap- (pre-TCR+) y CD3+TCRap+ (pre-TCR-), ambas con expresión intracelular de TCRp (TCRpic). B) Las poblaciones pre-TCR- y pre-TCR+ aisladas se trasplantaron en números crecientes (10-105) en ratones NSG en los que se analizó el injerto en la sangre a los días indicados.
Fig. 8. Actividad LIC de células pre-TCR+ y pre-TCR- de una leucemia T-ALL primaria de paciente. A) Frecuencia de células con actividad LIC en las subpoblaciones T-ALL pre-TCR+ y pre-TCR- del mismo paciente. B) Supervivencia de los ratones trasplantados con las poblaciones T-ALL pre-TCR+ y pre-TCR-.
Fig. 9. Análisis de la progresión in vivo de una T-ALL primaria trasplantada tras la inhibición funcional del pre-TCR. A) Estrategia de inhibición de la función del pre-TCR expresado en células T-ALL de pacientes, mediante silenciamiento del adaptador CMS con vectores lentivirales shRNA-CMS. (B, E) Eficiencia de la transducción medida por expresión de GFP. (C, F) Progresión tumoral en los órganos indicados de células T-ALL transducidas con shRNA-CMS o shRNA-control (shsc) trasplantadas en ratones inmunodeficientes Rag2-/- x yc-/-. MO: Medula Ósea y NL: Nódulo Linfático. (D) El silenciamiento de CMS impide la progresión tumoral y la esplenomegalia inducida por células T-ALL.
Fig. 10. Análisis de la generación de leucemia T-ALL inducida por el oncogén Notch1 en progenitores hematopoyéticos con una mutación que afecta la función del pre-TCR. A) Expresión del marcador ckit (arriba) y del oncogén Notch1 (ICN1) abajo) en células progenitoras de médula ósea de ratones normales (wt del inglés wild type) o mutantes (C80G) transducidas con un vector lentiviral portador de ICN1 y GFP. B) Porcentajes y números absolutos de células ICN1+ wt o C80G que injertan la médula ósea, el bazo, la sangre y el hígado de ratones NSG a las 5 semanas del trasplante. C) Números absolutos de células ICN1+ e ICN1- que injertan la médula ósea de los ratones en (B).
Fig. 11. Supervivencia de ratones NSG trasplantados con progenitores de médula ósea normales o mutantes para la función del pre-TCR, transducidos con ICN1. Se muestra la supervivencia tras un trasplante primario (izquierda) o secundario (derecha) a los días post-trasplante indicados.
Fig. 12. Titulación del anticuerpo de la invención K5G3 (anti-pTa) en las líneas celulares T-ALL humanas SUPT1 y Jurkat. Se muestra la expresión específica del pre-TCR en la línea SUPT1, medida por citometría de flujo utilizando el anticuerpo anti-CD3s UCHT1 (BD Biosciencies) y concentraciones crecientes del anticuerpo de la invención K5G3 anti-pTa. K5G3, al contrario que UCHT1, no se une a la línea celular T-ALL Jurkat que carece de pre-TCR, pero expresa el TCRap asociado a CD3.
Fig. 13. Unión del anticuerpo de la invención K5G3 (anti-pTa) a progenitores pre-T de timo humano y a células T-ALL primarias de pacientes. Análisis de la expresión de pre-TCR utilizando el anticuerpo anti-CD3s UCHT1 y el anticuerpo de la invención K5G3 anti-pTa en (A) células de timo humano y (B) células T-ALL primarias obtenidas de un paciente (T-ALL4). Los análisis fenotípicos en (A) muestran que las subpoblaciones de timocitos humanos que expresan los receptores TCRap o TCRyS, en asociación con CD3, no son reconocidos por el mAb anti-pTa, lo que demuestra la especificidad del anticuerpo de la invención K5G3.
Fig. 14. Estudio de la funcionalidad del anticuerpo de la invención anti-pTa humano K5G3 en ensayos de movilización de calcio. Aislamiento de células pre-TCR+ de timo humano por selección inmunomagnética de timocitos CD8+ TCRap-(izquierda) y movilización de calcio en los timocitos aislados pre-TCR+ tras el entrecruzamiento del pre-TCR con el anticuerpo anti-CD3s UCHT1 o con el anticuerpo de la invención anti-pTa K5G3 (derecha).
Fig. 15. Inmunoterapia por administración del anticuerpo de la invención anti-pTa K5G3 en un modelo preclínico de xenotrasplante de T-ALL humana. A) Esquema de la pauta de administración del anticuerpo anti-pTa de la invención, o de un anticuerpo isotípico (IgG2a) control, en ratones SCID en los que se ha establecido la enfermedad tras el trasplante de una T-ALL de paciente. B) Supervivencia de los animales tratados respecto a los controles. C) Porcentaje de células T-ALL pre-TCR+ en la sangre periférica (SP) de los animales tratados y control.
Fig. 16. Efecto del tratamiento in vitro con el anticuerpo de la invención anti-pTa K5G3 sobre el número de células T-ALL pre-TCR+. A) Esquema del cultivo in vitro de una T-ALL en presencia del anticuerpo anti-pTa K5G3 de la invención, o de un anticuerpo inespecífico IgG2a usado como control. B) Fenotipo heterogéneo TCRap+ (pre-TCR-) y pre-TCR+ (TCRap-) de la leucemia T-ALL cultivada en (A). C) Niveles de expresión de CD3s en las células en (B) tras su cultivo durante 6 días en presencia del anticuerpo anti-pTa K5G3 de la invención, o de un anticuerpo inespecífico IgG2a usado como control. Abajo se muestra la superposición de ambos histogramas donde se observa la disminución selectiva de células pre-TCR+. D) Números absolutos de células TCRap+ y pre-TCR+ de la leucemia T-ALL en (B), tras su cultivo in vitro durante 6 días en presencia del anticuerpo anti-pTa K5G3 de la invención, o de un control IgG2a. E) Números absolutos y porcentajes de células apoptóticas recuperados tras el cultivo de 6 días de la leucemia T-ALL pre-TCR+ mostrada en la Fig. 5A en presencia del anticuerpo anti-pTa K5G3 de la invención, o de un control IgG2a. Se muestran los datos ± SEM derivados de 3 experimentos.
Fig. 17. Efecto del tratamiento in vitro con el anticuerpo de la invención anti-pTa humano K5G3 sobre la internalización del pre-TCR en la línea SUPT1 y en leucemias primarias de pacientes. A) Citometría de flujo de los niveles de expresión de los componentes CD3s y pTa del pre-TCR en células SUPT1 analizadas tras 24 de de incubación in vitro con un mAb irrelavante IgG2a (Control) o con el mAb anti-pTa de la invención (K5G3). B) Niveles de expresión de CD3s representativos de los niveles de pre-TCR en células SUPT1 (arriba) o en leucemias T-ALL primarias de pacientes (T-ALL3, T-ALL17) tratadas como se describe en (A). Los datos muestran los valores de intensidad de fluorescencia relativa (IFR) ± SEM de 3 experimentos. C) Cinética de endocitosis y reciclaje de la cadena CD3s del complejo pre-TCR en células SUPT1, tratadas durante 30min a 4°C (tiempo=0) con el mAb anti-pTa de la invención (K5G3),
y cultivada seguidamente a 37°C a los tiempos indicados.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del anticuerpo de la invención para los usos médicos propuestos y que el receptor que reconoce el anticuerpo de la invención, el pre-TCR, es una diana terapéutica adecuada para combatir las recaídas en los pacientes de T-ALL.
Ejemplo 1. Generación de leucemias T-ALL humanas en ratones NSG por trasplante de HPCs de sangre de cordón umbilical que sobre-expresan Notch1 activo (ICN1).
En colaboración con el Centro de Transfusión de la Comunidad de Madrid se han obtenido muestras de sangre de cordón umbilical, de las que se aislaron progenitores hematopoyéticos (HPCs) por selección inmunomagnética con anticuerpos anti-CD34. Las células seleccionadas se trasplantaron en ratones inmunodeficientes NSG, tras su transducción con un vector retroviral portador de la forma oncogénica de Notch1 (ICN1) y GFP, como se describió recientemente (García- Peydró et al., J Clin Invest. 2018 jul 2; 128(7): 2802-2818; Fig. 1). En este modelo, se analizó la presencia de células humanas leucémicas ICN1+ en sangre periférica y en aspirados de médula ósea de los animales trasplantados a lo largo de 8 meses, lo que permitió identificar la generación in vivo de una leucemia con características de T-ALL humana a partir de las 14-18 semanas en la médula y de las 30-36 semanas post-trasplante en la sangre de los ratones trasplantados (Fig. 1). Estos datos demuestran por primera vez la generación de novo de una leucemia T-ALL humana in vivo a partir de células sanas.
Ejemplo 2. Identificación y seguimiento in vivo de la expresión del pre-TCR durante la progresión de la T-ALL humana en los animales trasplantados.
Con el objetivo de hacer un seguimiento de las poblaciones celulares que participan en la patogénesis de la T-ALL humana y de las moléculas implicadas, se analizó por citometría de flujo el fenotipo de las células portadoras del oncogén ICN1 (ICN1+) en los aspirados de médula como se indica en la Fig.2. Los resultados obtenidos muestran que el complejo pre-TCR se expresa en momentos tempranos de la generación de la
leucemia y mantiene su expresión en la superficie de las células leucémicas durante los 10 meses de progresión de la T-ALL en los animales trasplantados. Asimismo, se incrementa la proporción de células pre-TCR+ a lo largo del tiempo, lo que indica que, durante el proceso de generación de la T-ALL, se produce un bloqueo de la diferenciación de los linfocitos T en el estadio madurativo en que se expresa el pre-TCR, expandiéndose la población pre-TCR+, lo que sugiere un papel relevante de este receptor en la progresión de la enfermedad. Para establecer las condiciones óptimas de seguimiento de la progresión de las leucemias humanas pre-TCR+ in vivo, se desarrolló un modelo de trasplante xenogénico en ratones inmunodeficientes NSG, utilizando como control de células T-ALL pre-TCR+ la línea celular SUPT1, que co-expresa las moléculas CD3s y pTa del pre-TCR, reconocidas por el mAb UCHT1 (BD Biosciences) y el anticuerpo de la invención (K5G3), respectivamente; mientras que las leucemias TCR+, como la HPB-ALL, sólo expresan CD3s (Fig. 3). El modelo se extendió al análisis de leucemias T-ALL pre-TCR+ primarias procedentes de pacientes. Las células se transdujeron con un vector lentiviral bicistrónico (pHRsin) portador del gen de la luciferasa y de GFP, lo que permite seguir la progresión de la leucemia y la infiltración de diferentes órganos periféricos en los ratones trasplantados. Mediante esta estrategia experimental, se pudo demostrar la eficiente expansión in vivo de la leucemia pre-TCR+ SUPT1 y de leucemias T-ALL primarias (Fig. 3).
Ejemplo 3. Validación in vivo y cuantificación de la actividad iniciadora de leucemia (LIC) de las células leucémicas pre-TCR+ humanas generadas de novo en animales y de leucemias T-ALL primarias procedentes de pacientes.
Para comprobar la relevancia del complejo pre-TCR en la expansión de la T-ALL in vivo, se realizaron trasplantes seriados de las células leucémicas generadas en los ratones trasplantados con progenitores HPCs humanos transducidos con ICN1 (Fig. 1). Las células procedentes de la médula de estos animales, que muestran un fenotipo mayoritario CD4+ CD8+ DP y contienen una subpoblación pre-TCR+ significativa (35%), se trasplantaron en un segundo ratón receptor NSG de 6-8 semanas de edad, irradiado subletalmente con 1.5 Gy, y así sucesivamente hasta 3 trasplantes. Este ensayo permitió analizar la actividad LIC de las células pre-TCR+ en los sucesivos trasplantes. El análisis del fenotipo de las células T-ALL obtenidas de la médula ósea tras 3 trasplantes mostró la expresión del pre-TCR en la membrana de >95% de las células leucémicas que se expandieron en los animales trasplantados (Fig. 4), lo que demuestra una ventaja proliferativa in vivo de las células pre-TCR+ sobre las células pre-TCR-.
Posteriores análisis bioquímicos de las células expandidas corroboraron la función del complejo pre-TCR en la activación de rutas moleculares implicadas en la supervivencia y proliferación celular, en respuesta al estímulo inducido con anticuerpos monoclonales anti-pre-TCR (anti-CD3s o el anticuerpo de la invención anti-pre-Ta K5G3). Entre estas rutas se incluyen: Pi3K/Akt, Erk y mTORC1/S6 (Fig. 5). Por tanto, las LICs de las T-ALL generadas expresan un pre-TCR funcional implicado en proliferación celular. Experimentos similares se realizaron con células leucémicas primarias de sangre periférica de pacientes diagnosticados de T-ALL (T-ALL17), utilizando el modelo de xenotrasplante en ratón. Se obtuvieron las células T-ALL humanas por centrifugación en Ficoll-Hypaque y se inyectaron (105) por vía intravenosa en ratones NSG de 6-8 semanas de edad, irradiados subletalmente con 1.5 Gy. Se analizó el potencial de expansión in vivo de las células leucémicas primarias mediante citometría de flujo de aspirados de médula de los ratones a diferentes semanas post-trasplante. El estudio reveló que los trasplantes en serie de muestras de T-ALL que expresan niveles muy bajos de CD3 inducen el enriquecimiento secuencial en estas células, que comprenden la población pre-TCR+, lo que demuestra su ventaja de proliferación in vivo y su actividad LIC. Ensayos bioquímicos corroboraron posteriormente la funcionalidad del pre-TCR induciendo la activación de rutas de supervivencia y proliferación también en las T-ALL primarias (Fig. 6). En conjunto, estos datos demuestran que las células pre-TCR+ de la T-ALL humana tienen actividad LIC y, por tanto, confirman que el pre-TCR puede ser una diana terapéutica para combatir las recaídas en los pacientes.
Para confirmar que el pre-TCR es un biomarcador de células con actividad LIC, implicado en la progresión de las células iniciadoras de la leucemia, se separaron por FACS las dos subpoblaciones pre-TCR+ y pre-TCR-(TCRap+) incluidas en la leucemia T-ALL17 y se analizó por separado la actividad LIC de ambas subpoblaciones en xenotrasplantes de diluciones celulares decrecientes, según el esquema mostrado en la Fig. 7.
Seguidamente, se analizó la frecuencia de células con actividad LIC en las poblaciones pre-TCR+ y pre-TCR- del mismo paciente, mediante el seguimiento de la supervivencia de los animales trasplantados por estimación de Kaplan-Meier, utilizando el programa ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/). Los resultados mostraron que las células LIC están enriquecidas unas 40 veces en la población pre-TCR+ en comparación con la pre-TCR-. En consecuencia, los ratones trasplantados con células pre-TCR+ mostraron una supervivencia significativamente disminuida con respecto a la de los
ratones que recibieron células pre-TCR- del mismo paciente (Fig. 8).
Ejemplo 4. Análisis de la función del pre-TCR en la actividad LIC de la T-ALL: Silenciamiento del adaptador CMS en leucemias T-ALL humanas y análisis de su actividad LIC en modelos preclínicos in vivo.
Para determinar de forma directa la relevancia del pre-TCR en la actividad LIC de la T-ALL y, por tanto, en la progresión y recaída de la T-ALL en los pacientes, se analizó el impacto de la inhibición de la función del pre-TCR sobre la progresión tumoral de células T-ALL humanas trasplantadas en ratones inmunodeficientes NSG. Para ello, se consideraron los resultados previos publicados por los inventores (Navarro et al. Blood.
2007 Dec 15;110(13):4331-40), que indican que la función del pre-TCR es dependiente del adaptador CMS/CD2AP que se une a pTa, y se utilizaron estrategias de silenciamiento génico de CMS mediado por short-hairpin (sh)RNA-CMS expresado en vectores lentivirales bicistrónicos portadores también de GFP, o vectores portadores de un shRNA control (shsc) (Fig. 9). Se establecieron condiciones óptimas de silenciamiento utilizando la línea T-ALL pre-TCR+ SUPT1, que se trasladaron a dos leucemias primarias (T-ALL5 y T-ALL9) procedentes de pacientes, cuya eficiencia de transducción se analizó por expresión de GFP (Fig. 9). La T-ALL modificada se trasplantó por vía intravenosa y la progresión leucémica se analizó en los animales trasplantados, observándose una inhibición drástica de la progresión tumoral tras el silenciamiento de CMS (Fig. 9), lo que se tradujo en un bloqueo completo de la inducción de esplenomegalia observada en los animales trasplantados con T-ALL transducidas con vectores control (Fig. 9). Por tanto, se requiere la señalización intacta del pre-TCR para la progresión de las células T-ALL humanas in vivo, demostrando que la inhibición de la función del pre-TCR expresado en las células T-ALL bloquea eficientemente su actividad LIC y su expansión in vivo, lo que indica que el pre-TCR es una diana terapéutica de la T-ALL.
Ejemplo 5. Análisis de la relevancia del pre-TCR como diana molecular de las células con actividad LIC implicadas en la generación de la T-ALL humana.
El análisis fenotípico de las células leucémicas generadas en el modelo de inducción de leucemia T-ALL humana (Fig. 1) mostró la expresión mayoritaria del pre-TCR en todas las leucemias generadas (Fig. 2). Más importante, los trasplantes seriados sugerían una ventaja proliferativa in vivo de las células pre-TCR+ sobre las pre-TCR- y la implicación
del pre-TCR en la función de las células con actividad LIC implicadas en la generación de la T-ALL (Fig. 4).
Con el objetivo de confirmar la implicación funcional del pre-TCR en la generación de la T-ALL, posteriormente se examinó el potencial tumoral del oncogén Notch1 en progenitores hematopoyéticos procedentes de la médula ósea de ratones normales (wt del inglés wild type), o de ratones con una mutación (C80G) que impide la señalización mediada por el pre-TCR (Blanco et al. Sci Signal. 2014 Dec 2;7(354):ra115). Los progenitores de médula de ratones normales o C80G transducidos con una forma oncogénica de Notch1 (ICN1) asociada a GFP se trasplantaron en ratones inmunodeficientes NSG, y la generación de leucemia T-ALL se analizó a distintos tiempos en los animales trasplantados haciendo un seguimiento de las células GFP+ tumorales en distintos órganos.
El análisis por citometría de flujo demostró una expresión similar del oncogén ICN1 en las células normales y C80G. Sin embargo, sólo las células normales mostraron capacidad de injerto y expansión en la médula, sangre, bazo y otros órganos como el hígado en los animales trasplantados a las 5 semanas del trasplante, mientras que las células mutantes no fueron capaces de generar leucemia en ninguno de los órganos analizados a diferentes tiempos (Fig. 10). En consecuencia, la supervivencia de los animales trasplantados con células mutantes portadoras del oncogén no se vio afectada, reduciéndose dramáticamente la de los animales trasplantados con células normales, así como la de segundos receptores trasplantados con estas células (Fig. 11). Por tanto, podemos concluir que la función del pre-TCR es esencial en la generación de leucemia T-ALL inducida por el oncogén ICN1, lo que demuestra que el complejo pre-TCR es una diana óptima de intervención terapéutica.
Ejemplo 6. Análisis de la prevalencia de la expresión del pre-TCR en T-ALL primarias humanas.
Los datos obtenidos en el Ejemplo 4 y el Ejemplo 5 constituyen la prueba de concepto de la idoneidad de una nueva estrategia terapéutica dirigida a la eliminación de la función del pre-TCR y/o de las células leucémicas portadoras del mismo. Por tanto, el siguiente objetivo fue evaluar la prevalencia de la expresión del pre-TCR en las T-ALL de los pacientes y determinar la frecuencia de pacientes portadores de LIC pre-TCR+, posibles beneficiarios del tratamiento propuesto. Para ello, se estableció una
colaboración con el Grupo de Leucemias Agudas de la SEHOP, en concreto, con el Dr. Manuel Ramírez Orellana del Hospital Infantil Niño Jesús de Madrid y con la Dra. Mireia Camós del Hospital Sant Joan de Déu de Barcelona, así como con el Dr. Antonio Pérez Rodríguez del Hospital Universitario La Paz de Madrid, para determinar la expresión del pre-TCR en pacientes al diagnóstico, mediante citometría de flujo. Las muestras se analizaron con el anticuerpo de la invención. Se analizaron 13 muestras de T-ALL, observándose expresión del pre-TCR en 7 de ellas, lo que constituye >50% de las muestras analizadas (Tabla 1). Por tanto, un número significativo de los pacientes con T-ALL podrían beneficiarse del tratamiento anti-pre-TCR propuesto.
Tabla 1: Prevalencia de la expresión del pre-TCR en pacientes diagnosticados de
T-ALL
Muestras (a) TCR PRE-TCR IL7R CXCR4
T-ALL1 - - +
T-ALL2 - + ND
T-ALL3 - + ND
T-ALL5 - +
T-ALL8 - +
T-ALL9 - +
T-ALL10 - +
T-ALL17 +
T-ALL18 + +
T-ALL26 - + +
T-ALL29 ND ND
T-ALL30 - + +
T-ALL32 + - ++ ND
(a) Se analizó la expresión del pre-TCR, TCR, receptor de IL-7 (IL-7R) y receptor de quimioquinas CXCR4 en las muestras primarias indicadas, obtenidas de la sangre periférica o la médula ósea de pacientes diagnosticados de T-ALL.
Ejemplo 7. Estudio de las características funcionales del anticuerpo de la invención. Producción y purificación.
El anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal IgG2a de ratón dirigido contra el dominio extracelular de pTa humano, el componente específico del pre-TCR que se asocia a la cadena TCRp y al complejo CD3. Su producción se realizó del siguiente
modo: el hibridoma K5G3, depositado en la European Collection of Cell Cultures bajo el número de depósito 01080805, se expandió en grandes cantidades usando un biorreactor de fibra hueca (Fiber Cell Systems). La purificación del anticuerpo monoclonal secretado al sobrenadante del cultivo se realizó mediante cromatografía de afinidad en una columna de proteína G sefarosa (GE Healthcare), y el anticuerpo monoclonal purificado se analizó seguidamente en ensayos funcionales in vitro. Los estudios indican que el anticuerpo de la invención es capaz de unirse al pre-TCR expresado en la línea celular SUPT1 de manera específica y dependiente de su concentración, pero no se une al complejo TCR formado por una cadena TCRa unida a la cadena TCRp y al complejo CD3 en la línea celular T-ALL Jurkat (Fig. 12). Pese a los bajos niveles de expresión del pre-TCR en células pre-T humanas, el anticuerpo monoclonal de la invención también es capaz de unirse específicamente al pre-TCR expresado en timocitos pre-T humanos, sin unirse a las células TCRap o TCRyS del timo (Fig. 13), e inducir la activación de estos timocitos medida por movilización de calcio, a niveles similares a aquellos inducidos por el anticuerpo monoclonal UCHT1 anti-CD3s (Fig. 14). Además, como se muestra en las Fig. 5 y 6, el anticuerpo de la invención es tan eficaz como UCHT1 (o incluso más) para inducir la activación de las vías de señalización de PI3K / AKT / mTOR y MAPK en células T-ALL humanas primarias pre-TCR+.
Ejemplo 8. Validación in vivo, en modelos preclínicos, de la eficacia de una inmunoterapia dirigida frente a las LIC pre-TCR+ de la T-ALL.
El éxito de tratamientos como el RITUXIMAB, basados en el principio de reconocimiento específico de una proteína de membrana de la leucemia (B-ALL en este caso), y consiguiente eliminación de las células portadoras de la proteína por un anticuerpo monoclonal, sugiere que la estrategia de esta invención puede ser válida. El hecho de que la molécula elegida, la cadena pTa del pre-TCR, se exprese selectivamente durante el desarrollo intratímico, pero esté ausente en linfocitos T periféricos, supone un valor adicional de la estrategia para evitar efectos adversos por eliminación de células T maduras normales que podrían inducir una inmunodeficiencia agresiva.
Para analizar la eficiencia de la inmunoterapia propuesta in vivo, se utilizaron ratones SCID irradiados a dosis subletales (1.5Gy) y trasplantados con células T-ALL primarias procedentes de muestras de desecho de sangre periférica de pacientes de T-ALL al diagnóstico (Fig. 15). La cepa SCID, al contrario que la NSG, presenta intacta la función
de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), así como la de citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). Los animales trasplantados con la T-ALL se examinaron a diferentes días post-trasplante y se determinó la presencia de células leucémicas humanas en sangre periférica (SP). Se consideró que la enfermedad estaba establecida cuando los animales presentaron >1% de células leucémicas en sangre (>3 semanas post-trasplante). En ese momento, se inició el tratamiento, consistente en la administración intraperitoneal del anticuerpo de la invención o de un anticuerpo monoclonal isotípico control (200^g/ratón), 2 veces por semana durante 10 semanas (Fig. 15). Se analizó el injerto en aspirados de la médula ósea a lo largo del tratamiento, así como la infiltración en diferentes órganos linfoides (timo, bazo y sangre) y no linfoides (hígado y cerebro) en los animales trasplantados, observando una disminución selectiva de células leucémicas en los animales tratados con el anticuerpo de la invención en varios órganos. Aunque la suspensión del tratamiento se tradujo en la progresión de la leucemia, hay que destacar que la supervivencia de los animales tratados fue significativamente mayor que la de los animales control (de 70 a 110 días de media) (Fig. 15), obteniéndose resultados similares con otra leucemia procedente de un paciente diagnosticado de T-ALL, lo que valida la eficiencia de la inmunoterapia propuesta.
El análisis fenotípico de los órganos de los animales tratados demostró un efecto selectivo sobre las células leucémicas portadoras del pre-TCR, que disminuyeron en comparación con las células pre-TCR-, lo que asegura la especificidad del tratamiento (Fig. 15). Análisis adicionales, todavía preliminares, sugieren que el anticuerpo de la invención induce la muerte celular por apoptosis de las células tumorales in vivo, por un mecanismo de inducción de CDC y/o ADCC.
Ejemplo 9. Estudio de la capacidad del anticuerpo anti-pTa K5G3 de la invención de inducir endocitosis del pre-TCR y apoptosis en células pre-TCR+.
Estudios in vitro utilizando células T-ALL primarias, heterogéneas para la expresión del pre-TCR y del TCRap, cultivadas durante varios días en presencia del anticuerpo antipTa de la invención o de un anticuerpo irrelevante del mismo isotipo (IgG2a) indican que el anticuerpo de la invención no sólo induce la activación de las células leucémicas pre-TCR+ (Fig. 5, Fig. 6), sino también induce su desaparición específica, que se correlaciona con la inducción de muerte celular por apoptosis (Fig. 16).
Además, estudios de incubación in vitro de las células pre-TCR+ SUPT1 con el anticuerpo de la invención anti-pTa por cortos periodos de tiempo habían demostrado que este anticuerpo también induce la internalización del pre-TCR de la superficie celular (Navarro et al. Blood. 2007 Dec 15;110(13):4331-40). Los resultados mostrados en la Fig. 17 corroboran estos datos en células SUPT1 y los extienden a leucemias T-ALL pre-TCR+ primarias obtenidas de pacientes, detectándose en ambos casos una disminución significativa de los niveles de expresión y, por tanto, del porcentaje de células pre-TCR+, tras cortos periodos de incubación. Además, estudios de cinética de endocitosis por citometría de flujo corroboraron la capacidad de internalización del anticuerpo anti-pTa de la invención a los pocos minutos de su unión a su diana, pre-TCR, en la membrana celular (Fig. 17), lo que supone un mecanismo molecular explotable desde un punto de vista terapéutico, ya que las terapias basadas en el empleo de anticuerpos conjugados a toxinas/fármacos (ADC, del inglés Antibody-Drug Conjugates) son especialmente eficaces induciendo lisis celular en los casos de internalización del anticuerpo junto con las correspondientes dianas moleculares.
Claims (10)
1. Anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en la European Collection of Cell Cultures bajo el número de depósito 01080805, capaz de reconocer específicamente la cadena pTa del pre-receptor de células T (pre-TCR) asociada a TCR3 y a CD3, para su uso como medicamento.
2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), preferiblemente T-ALL pre-TCR+.
3. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso en el tratamiento y/o prevención de recaídas de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), preferiblemente de recaídas de T-ALL pre-TCR+.
4. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde dicho anticuerpo se encuentra acoplado a una toxina.
5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho anticuerpo está humanizado.
6. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en la European Collection of Cell Cultures bajo el número de depósito 01080805, capaz de reconocer específicamente la cadena pTa del pre receptor de células T (pre-TCR) asociada a TCRp y a CD3, para su uso en el tratamiento y/o prevención de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), preferiblemente T-ALL pre-TCR+.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento y/o prevención de recaídas de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), preferiblemente de recaídas de T-ALL pre-TCR+.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde el anticuerpo se encuentra acoplado a una toxina.
9. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el anticuerpo está humanizado.
10. 
La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 que comprende además un adyuvante farmacéutico aceptable, un vehículo farmacéutico aceptable y/u otro principio activo.
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