CN114026118A

CN114026118A - 通过铰链结构域增强多肽和嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN114026118A
Application number: CN202080047640.1A
Authority: CN
Inventors: R·G·马兹纳; C·L·麦考尔; L·拉巴尼; S·P·里特伯格
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2022-02-08
Also published as: JP2022531439A; US20220218751A1; WO2020227446A1; EP3966236A4; CA3139319A1; AU2020268372A1; EP3966236A1

Abstract

本公开文本尤其涉及包括来自CD28的铰链结构域和任选的不是来自CD28的共刺激结构域的新型嵌合多肽和嵌合抗原受体(CAR)。本公开文本还提供了可用于产生此类分子的组合物和方法，以及用于检测和治疗疾病如癌症的方法。

Description

通过铰链结构域增强多肽和嵌合抗原受体

关于联邦政府资助研发的声明

本发明是在政府资助下在美国国立卫生研究院授予的批准号1P01CA217959下以及美国国家癌症研究所授予的批准号U54 CA232568-01下完成的。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年5月7日提交的美国临时专利申请序列号62/844,683的优先权权益。上面引用的申请的公开内容通过引用以其整体(包括任何附图)明确地并入本文。

序列表的并入

所附序列表中的材料特此通过引用并入本申请。所附的名称为078430-506001WO-Sequence Listing.txt的序列表文本文件创建于2020年4月20日，并且为80KB。

技术领域

本公开文本总体上涉及肿瘤学和免疫治疗学领域，并且特别涉及新型多肽，例如包括来自CD28的铰链结构域和任选的不是来自CD28的共刺激结构域的嵌合抗原受体。本公开文本还提供了可用于产生此类分子的组合物和方法，以及用于检测和治疗病症如疾病(例如癌症)的方法。

背景技术

近年来，嵌合抗原受体(CAR)已成为一种有前景的免疫治疗方法，并在许多制药和生物技术公司进行的临床试验中成为头条。CAR是抗原特异性重组受体，它在单个分子中改变了包括T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和巨噬细胞在内的许多免疫细胞的特异性和功能。例如，在CAR-T细胞疗法中，CAR-T细胞用于癌症免疫疗法的一般前提是快速产生肿瘤靶向T细胞，绕过主动免疫的障碍和增量动力学，并消除在抗原识别中的MHC限制。一旦在T细胞中表达，CAR修饰的T细胞就会获得超生理特性，并充当“活药物”，可以发挥即时和长期的作用。已经开发了多次迭代的CAR，主要集中在抗原结合部分和细胞内信号传导模块，这些被认为是CAR设计的关键。为了获得适当的共刺激信号以激活效应T细胞、改善应答并延长持久性，可以单独、串联或以更大的阵列并入许多不同类型的共刺激受体。然而，非信号传导细胞外模块，如铰链和跨膜(TM)结构域，对转导的T细胞的增殖和CAR治疗功效的影响仍在很大程度上不清楚。

据报道，CAR的效力通常是有限的，特别是在实体瘤中如此。这通常是由于微环境中靶抗原密度低和免疫抑制因素所致。因此，仍然需要更有效的CAR来克服这些障碍，以将这些治疗剂的范围扩展到更多的疾病并治疗更多的患者。本文描述的本发明提供了解决这些障碍的方案并且还提供了额外的益处。

发明内容

本公开文本总体上涉及开发包括增强的多肽和嵌合抗原受体(CAR)在内的免疫治疗剂，以及包含所述免疫治疗剂的用于治疗各种病症如疾病(例如癌症)的药物组合物。如下文更详细地描述，已经发现铰链结构域(亦称铰链区)的各种修饰对CAR的效力和低抗原密度的识别具有显著影响。特别地，已经确定将CD28铰链结构域并入不含有共刺激结构域或含有并非源自CD28的共刺激结构域的多肽或CAR中可导致出人意料地增强的功能。另外，本文描述的实验结果已证明，具有CD28铰链结构域的CAR优于市场上的其他产品。

在一方面，本文提供了各种嵌合多肽，所述嵌合多肽包括：(i)包含能够结合抗原的细胞外结构域(ECD)的第一多肽区段；(ii)包含源自CD28的铰链结构域的第二多肽区段；(iii)包含跨膜结构域(TMD)的第三多肽区段；以及(iv)任选的包含含有一个或多个共刺激结构域的细胞内信号传导结构域(ICD)的第四多肽区段，其中所述一个或多个共刺激结构域不是来自CD28。

本公开文本所公开的嵌合多肽的非限制性示例性实施方案包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，ICD还包括CD3ζICD。在一些实施方案中，所述嵌合多肽是嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，所述抗原选自磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7-H3)、IL-13-受体α1、IL-13-受体α2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD123、CD93、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、ALK、DLK1、FAP、NY-ESO、WT1、HMB-45抗原、蛋白质黑色素-A(T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD19、CD20、CD5、CD7、CD3、TRBC1、TRBC2、BCMA、CD38、CD123、CD93、CD34、CD1a、SLAMF7/CS1、FLT3、CD33、CD123、TALLA-1、CSPG4、DLL3、IgGκ轻链、IgAλ轻链、CD16/FcγRIII、CD64、FITC、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、GD3、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、表皮生长因子受体(EGFR)及其同种变体、TEM-8、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、prostein、NKG2D、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(CD61)、催乳素、K-Ras(V-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因)和Ral-B。在一些实施方案中，所述抗原以低密度表达。

在一些实施方案中，所述抗原是GPC2、Her2/neu、CD276(B7-H3)或IL-13-受体α。在一些实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激4-1BB(CD137)多肽序列、共刺激CD27多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激诱导型T细胞共刺激(ICOS)多肽序列和CD2共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括共刺激4-1BB(CD137)多肽序列。在一些实施方案中，TMD源自CD28 TMD、CD8αTMD、CD3 TMD、CD4 TMD、CTLA4 TMD和PD-1 TMD。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)源自CD28、CD8、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)源自CD8的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合HER2抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD28、CD8、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合GPC2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD28、CD8、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合B7-H3抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:27、SEQID NO:39、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本文提供了各种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含编码如本文公开的嵌合多肽的核酸序列。所述重组核酸分子的非限制性示例性实施方案包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述核酸序列编码嵌合多肽。在一些实施方案中，所述嵌合多肽是CAR。在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽包含(i)能够结合抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)TMD；以及(iv)包含一个或多个共刺激结构域的ICD，其中所述一个或多个共刺激结构域不是来自CD28。在一些实施方案中，所述核酸序列还编码CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，所述抗原是磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7-H3)或IL-13-受体α。在一些实施方案中，所述共刺激结构域选自共刺激4-1BB(CD137)多肽序列、共刺激CD27多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激诱导型T细胞共刺激(ICOS)多肽序列和CD2共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括共刺激4-1BB(CD137)多肽序列。在一些实施方案中，TMD源自CD28 TMD、CD8αTMD、CD3 TMD、CD4 TMD、CTLA4 TMD和PD-1 TMD。

在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)源自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)源自CD8的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合HER2抗原的ECD；(ii)源自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合GPC2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合B7-H3抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述重组核酸分子包含编码嵌合多肽的核酸序列，所述嵌合多肽具有与选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述核酸序列与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:68的核酸序列具有至少80％序列同一性。在一些实施方案中，所述重组核酸分子与异源核酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述重组核酸分子进一步被限定为载体中的表达盒。在一些实施方案中，所述载体是质粒载体。在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些实施方案中，所述病毒载体源自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒或逆转录病毒。

在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及重组细胞，所述重组细胞包含：(a)如本文所述的嵌合多肽；和/或如本文所述的核酸分子。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是免疫系统细胞。在一些实施方案中，所述免疫系统细胞是T淋巴细胞。

在另一方面，本文公开的一些实施方案涉及制备重组细胞的方法，其中所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且(b)用本公开文本的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生重组细胞。因此，在相关方面，本文还提供了通过本公开文本的方法产生的重组细胞。在另外的相关方面，本公开文本的一些实施方案提供了细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种本公开文本的重组细胞和培养基。

在另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和以下中的一种或多种：(a)本公开文本的嵌合多肽；(b)本公开文本的核酸分子；和/或(c)本公开文本的重组细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含本公开文本的重组核酸和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述组合物包含本公开文本的重组细胞和药学上可接受的载体。

在又另一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于在有需要的受试者中预防和/或治疗病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包含以下中的一种或多种的组合物：(a)本公开文本的嵌合多肽，(b)本公开文本的重组核酸，(c)本公开文本的重组细胞，以及(d)本公开文本的药物组合物。所公开的方法的示例性实施方案包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述病症是增殖性疾病。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、尿路上皮癌、肝癌、头颈癌、肉瘤、宫颈癌、胃癌(stomach cancer)、胃部癌症(gastric cancer)、黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆管癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，所施用的组合物赋予所述受试者增加的干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素-2(IL-2)的产生。在一些实施方案中，所施用的组合物抑制所述受试者中癌症的肿瘤生长或转移。

在一些实施方案中，将所述组合物单独作为第一疗法或与第二疗法组合施用于所述受试者。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、和手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法相伴施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述第二疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前和/或之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法以单一配制品一起施用。

在另一方面，本公开文本的一些实施方案提供了用于实践本文公开的方法的各种试剂盒。一些实施方案涉及用于在有需要的受试者中诊断、预防和/或治疗病症的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下中的一种或多种的：本公开文本的嵌合多肽；本公开文本的重组核酸；本公开文本的重组细胞和本公开文本的药物组合物。

在另一方面，本文提供了以下中的一种或多种用于诊断、预防和/或治疗病症的用途：本公开文本的嵌合多肽、本公开文本的重组核酸、本公开文本的重组细胞和药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是增殖性疾病。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。

在另一方面，本文提供了以下中的一种或多种用于制造预防和/或治疗健康状况的药物的用途：本公开文本的嵌合多肽、本公开文本的重组核酸、本公开文本的重组细胞或本公开文本的药物组合物。在一些实施方案中，所述病症是增殖性疾病。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。

前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。

除非从实施方案或方面的上下文中明确或清楚地排除，否则本文所述的每个方面和实施方案都能够一起使用。

在整个说明书中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。本文引用的所有专利、专利申请和其他出版物的披露内容出于所有目的特此通过引用以其整体并入。

附图说明

图1示出目前FDA批准的临床抗CD19嵌合抗原受体的示意图。

图2A-图2B以图形方式总结了实验结果，证明CD28铰链整合到CD19 CAR(CD19-28Hi-28TM-41BBz)导致与CD19-CD8Hi-CD8TM-41BBz(Kymriah)相比，增强对CD19^低细胞的杀伤和响应于一系列CD19抗原密度的细胞因子产生，与CD19-28z CAR(Axi-Cel)相媲美。图2A：将表达963个表面CD19分子的NALM6克隆与CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞以1:1比率共培养，并且在Incucyte测定中测量肿瘤细胞杀伤。代表采用不同T细胞供体的三个实验。用重复测量方差分析进行统计分析。图2B：将CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞与表达不同量CD19的NALM6克隆共培养24小时，并且通过ELISA测量上清液中的IL-2。代表采用不同T细胞供体的三个实验。通过学生t检验(双侧)在CD19-4-1BBζ与CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞之间进行统计比较。

图3A-图3B示意性地总结了实验结果，表明CD19-CD28Hi-CD28TM-41BBz与CD19-CD8Hi-CD8TM-41BBz相比，对于低抗原密度具有更好的功能，如使用CD19^低白血病的体内模型确定的。图3A：通过尾静脉注射将100万个NALM6-CD^192,053细胞移植到NSG小鼠中。四天后，对小鼠注射300万个CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞。通过生物发光光度法测量肿瘤进展，并且使用Living Image软件计算通量值(每秒光子数)。示出了单独小鼠的量化肿瘤通量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图3B：如图3A中处理的小鼠的小鼠存活曲线。用对数秩检验进行统计分析。呈现于图3A-图3B中的结果代表采用不同T细胞供体的三个实验(每组n＝5只小鼠)。

图4A-图4B以图形方式总结了实验结果，表明CD19-CD28Hi-CD28TM-41BBz与CD19-CD8Hi-CD8TM-41BBz相比，在正常(天然)抗原密度下具有更好的功能，如通过其中用亚治疗剂量的CAR T细胞处理具有白血病的小鼠的体内应激测试模型确定的。图4A：通过尾静脉注射将100万个NALM6野生型细胞移植到NSG小鼠中。三天后，对小鼠注射2.5×10⁵个CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞。通过生物发光光度法测量肿瘤进展，并且使用Living Image软件计算通量值(每秒光子数)。示出了单独小鼠的量化肿瘤通量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图4B：如(f)中处理的小鼠的小鼠存活曲线。用对数秩检验进行统计分析。呈现于图4A-图4B中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验(每组n＝5只小鼠)。

图5A-图5E示意性总结了为评估脾和骨髓组织中靶向CD19的CAR的功能而进行的实验的结果。通过尾静脉注射将100万个NALM6野生型细胞移植到NSG小鼠中。三天后，对小鼠注射500万个CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞。在CAR T细胞处理后第+9、+16和+29天(第+29天仅显示脾)获得经处理小鼠(每组n＝5)的脾(图5A-图5C)和骨髓(图5D-图5E)。通过流式细胞术评估CAR阳性T细胞的存在。进行一次(每个时间点每个CAR构建体n＝5)。由Mann Whitney在指定组之间进行统计比较。对于体外实验，误差棒代表SD，而对于体内实验，误差棒代表SEM。p<0.05被认为具有统计学显著性，并且p值用星号表示如下：p>0.05，不显著，NS；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，和****p<0.0001。

图6A-图6C示意性总结了为评估靶向Her2的CAR在体内各种肿瘤模型和CAR架构中的功能而进行的实验的结果。图6A是含有CD28铰链跨膜区和4-1BB共刺激结构域的Her2CAR(Her2-CD28H/T-4-1BBζ)的示意图。图6B：将100万个143b骨肉瘤细胞原位植入NSG小鼠的后腿。七天后，将小鼠用1000万个Her2-4-1BBζCAR T细胞、Her2-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞或未经转导的对照T细胞(模拟)处理。每周用数显卡尺测量两次获得腿部测量值。示出单独小鼠的测量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图6C：如图6B中处理的小鼠的存活曲线：用对数秩检验进行统计分析。呈现于图6B-图6C中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验(每组n＝5只小鼠)。

图7A-图7D示意性总结了为评估靶向B7-H3的CAR在各种肿瘤模型和CAR架构中的功能而进行的实验的结果。图7A描绘了含有CD28铰链跨膜区和4-1BB共刺激结构域的B7-H3CAR(B7-H3-CD28H/T-4-1BBζ)的示意图。图7B：在转移性神经母细胞瘤模型中，通过尾静脉注射将100万个CHLA255神经母细胞瘤细胞移植到NSG小鼠中。六天后，对小鼠注射1000万个B7-H3-4-1BBζCAR T细胞、B7-H3-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞或未经转导的对照T细胞(模拟)。通过生物发光光度法测量肿瘤进展，并且使用Living Image软件计算通量值(每秒光子数)。示出了代表性的生物发光图像。图7C：如图7B中处理的单独小鼠的量化肿瘤通量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图7D：如图7B中处理的小鼠的存活曲线。用对数秩检验进行统计分析。呈现于图7B-图7D中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验。对于体外实验，误差棒代表SD，而对于体内实验，误差棒代表SEM。p<0.05被认为具有统计学显著性，并且p值用星号表示如下：p>0.05，不显著，NS；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，和****p<0.0001。

图8A-图8C以图形方式总结了实验结果，表明CD28铰链结构域即使在不存在共刺激的情况下(在第一代CAR构建体中)也负责增强CAR T细胞功效。图8A：是具有CD8或CD28铰链跨膜区的示例性第一代CD19 CAR(CD19-CD8H/T-ζ和CD19-CD28H/T-ζ)的示意图。图8B：将表达963或45,851个表面CD19分子的NALM6克隆与CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ、CD19-CD28H/T-ζ或CD19-CD8H/T-ζCAR T细胞以1:1比率共培养，并且在Incucyte测定中测量肿瘤细胞杀伤。代表采用不同T细胞供体的三个实验。在CD19-CD28H/T-ζ与CD19-CD8H/T-ζ之间用重复测量方差分析进行统计分析。图8C：将CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ、CD19-CD28H/T-ζ和CD19-CD8H/T-ζCAR T细胞与表达不同量CD19的NALM6克隆共培养24小时，并且通过ELISA在上清液中测量分泌的IL-2。代表采用不同T细胞供体的三个实验。在CD19-CD28H/T-ζ与CD19-CD8H/T-ζ之间，用学生t检验(双侧)进行统计比较。

图9A-图9D描绘了根据本公开文本的一些实施方案的四个示例性CAR设计的示意性结构。

图10A-图10B是流式图，示出了图9A-图9D中描述的CAR设计的表达。无论铰链结构域和跨膜结构域如何，所有CAR在T细胞表面的表达都相似。

图11A-图11B示意性总结了实验结果，表明CD28铰链结构域负责增强CAR功能，并进一步表明CD28Hi-CD8TM组合可以是更有效的形式。图11A：响应于与表达渐增量的CD19的NALM6克隆的共培养的IFNγ产生。图11B：响应于与表达渐增量的CD19的NALM6克隆的共培养的细胞因子IL-2产生。

图12示意性总结了实验结果，表明CD28铰链结构域负责增强针对CD19^低白血病的细胞杀伤功效。

图13A-图13C以图示方式总结了为说明CD28铰链-TMD导致更有效的受体簇集、T细胞激活和肿瘤细胞杀伤而进行的实验的结果。图13A-图13B：将CAR T细胞和NALM6细胞以低密度接种在微孔板上并扫描含有一个肿瘤细胞和一个CAR T细胞的孔。对两个不同的T细胞供体进行了6次实验。图13A：示出了来自单细胞微孔杀伤实验的代表性孔。将CAR T细胞和NALM6白血病细胞分别通过CellTrace Far Red(假色洋红色)和GFP(假色青色)标记进行区分。通过细胞不可渗透的碘化丙啶染料(PI，假色黄色)的流入来确定细胞死亡。裂解缀合物被定义为其中一个T细胞和一个NALM6细胞保持在阈值距离内并且NALM6细胞死亡(吸收PI)的事件。非裂解缀合物代表其中T细胞和肿瘤细胞相互作用但NALM6细胞没有死亡(不吸收PI)的缀合物。DIC：微分干涉相差，和Epi：落射荧光。图13B：在每个CAR构建体含有一个肿瘤细胞和一个T细胞的孔中测量从T细胞/肿瘤细胞相互作用到PI流入的时间。示出了来自所有6个实验(400-600个孔)的汇总数据。误差棒代表SD。用学生t检验(双侧)进行统计分析。图13C：在六个实验的每一个中测量导致T细胞死亡的非裂解缀合物(其中T细胞和肿瘤细胞相互作用但NALM6细胞没有死亡的缀合物)的分数。

图14A-图14I示意性总结了为说明CD28铰链-TMD在靶抗原密度低时导致更有效的受体簇集、T细胞激活和肿瘤细胞杀伤而进行的另外的实验的结果。图14A：TIRF(全内反射荧光)成像的图。为了刺激CD19-CD28H/T-4-1BBζ和CD19-4-1BBζCAR T细胞，将CAR T细胞暴露于平面支持的脂质双层(SLB)，所述平面支持的脂质双层由通过生物素-链霉亲和素-生物素桥偶联的自由扩散性CD19蛋白功能化。配体-受体接合导致配体结合的受体重组织为微簇，这些微簇将酪氨酸激酶ZAP70(与GFP融合，在此图中未示出)从胞浆募集到质膜，并驱动微簇从外周向心易位至细胞中心。这些事件通过TIRF显微镜(荧光：CAR-mCherry、ZAP70-GFP、链霉亲和素-Alexa647)可视化。平面支持的脂质双层中的配体密度通过含有小单层囊泡(SUV)的生物素-PE的浓度进行控制。为了评估在显示一系列表达水平的细胞间的募集水平/簇集程度，使用分散指数(即归一化方差，它等于标准差除以每个细胞的荧光强度均值，详情参见方法)。图14B：在图14A-图14I的实验中，在不同CD19密度下，对于每种CAR构建体，被募集到免疫突触的CAR分子的簇集程度(分散指数)。图14C：用在含有高(约6.0个分子/μm²；顶部小图)和低(约0.6个分子/μm2；底部小图)浓度CD19的平面支持的脂质双层上激活的ZAP70-GFP转导的单个CD19-CD28H/T-4-1BBζ-mCherry(左小图)和CD19-CD8H/T-4-1BBζ-mCherry(右小图)CAR T细胞的代表性图像。图14D：在四种不同的CD19密度下，对于每种CAR构建体，被募集到免疫突触的ZAP70-GFP的簇集程度(分散指数)。图14E：来自图14D的汇集的ZAP70簇集程度(分散指数)数据，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。图14F：激活的细胞(在阈值之上的ZAP70募集)百分比，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。图14G：在四种不同的CD19密度下，对于每种CAR构建体，被募集到免疫突触的配体-受体复合物的簇集程度(分散指数)。图14H：汇集的来自(h)的配体-受体复合物簇集程度(分散指数)数据，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。图14I：募集配体-受体复合物的细胞(在阈值之上)的百分比，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。在图14A-图14I中呈现的结果(示为均值±SD)是来自用不同T细胞供体进行的两个实验中的一个实验的代表。每个条件n>100。用双尾t检验进行统计分析。p<0.05被认为具有统计学显著性，并且p值用星号表示如下：p>0.05，不显著，NS；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，和****p<0.0001。数据代表来自采用不同T细胞供体的两个实验。每个条件n>100。用学生t检验进行统计分析。

具体实施方式

本公开文本尤其涉及嵌合多肽和嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合多肽和嵌合抗原受体包含来自CD28的铰链结构域和任选的与所述CD28铰链结构域异源的共刺激结构域，例如不是来自CD28的共刺激结构域。本文公开的各种嵌合多肽和CAR不含有共刺激结构域，而本文公开的嵌合多肽和CAR的其他形式含有一个或多个不是来自CD28的共刺激结构域。本公开文本还提供了可用于制备此类多肽和CAR的组合物和方法，以及用于检测和治疗病症如疾病(例如癌症)的方法。

嵌合抗原受体是重组受体构建体，以其通常的形式将抗体的特异性移植到T细胞的效应功能上。在嵌合抗原受体内，铰链结构域通常是指定位于靶向部分和T细胞质膜之间，即位于靶向部分与细胞内结构域之间的多肽结构。这些序列通常源自IgG亚类(如IgG1和IgG4)、IgD和CD8结构域，其中IgG1使用最广泛。近年来，铰链结构域的若干研究主要集中在以下方面：(1)降低与Fcγ受体的结合亲和力，从而消除某些类型的脱靶激活；(2)增强单链可变片段(scFv)的柔性，从而缓解肿瘤抗原上被靶向的特定表位与CAR的抗原靶向部分之间的空间限制；(3)减少scFv与靶表位之间的距离；以及(4)促进使用抗Fc试剂检测CAR表达。然而，铰链结构域对CAR T细胞生理学的影响尚未完全清楚。

如下文更详细的描述，为了更好地理解铰链结构域对CAR T细胞的影响，已经设计和构建了若干种形式的不具有或具有源自CD8α或CD28的铰链结构域的CAR。随后，系统地评价了铰链结构域的存在或不存在对CAR T细胞离体和体内的生长动力学、细胞因子产生和细胞毒性的影响。然后已经确定将CD28铰链结构域并入CAR构建体可以大大增强细胞杀伤，增强细胞因子例如IFNγ和白细胞介素-2(IL-2)响应于肿瘤的产生。此外，还发现具有或不具有CD28铰链结构域的抗CD19 CAR T细胞具有相似的表达水平，而CD28铰链结构域可以增强抗CD19 CAR T细胞的体内抗肿瘤活性。

本文中呈现的实验结果证明，在若干种CAR设计中并入的CD28铰链结构域能够提高相应CAR T细胞的抗肿瘤功效。这些结果表明了设计更有效的嵌合抗原受体以补充现有免疫治疗方法的潜在新型策略。

还提供了编码这些多肽和CAR的核酸分子。本公开文本还提供了可用于产生此类多肽和CAR的组合物和方法，以及用于预防和/或治疗病症如癌症的方法。

本公开文本中所提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同明确且单独地指示每个单独出版物或专利申请通过引用并入一般。

通用实验程序

除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中得到了充分解释，如Sambrook,J.,&Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第4版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.,&Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版).Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文联合称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology.NewYork,NY:Wiley(包括到2014年的增补版)；Bollag,D.M.等人(1996).Protein Methods.NewYork,NY:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.SanDiego:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:Gene Therapy andNeuroscience Applications.San Diego,CA:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).TheImmunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques.SanDiego,CA:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell andTissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology.New York,NY:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.&Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase Chain Reaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:A Laboratory Manual(第2版).New York,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current ProtocolsinNucleic Acid Chemistry.New York,NY:Wiley,(包括到2014年的增补版)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer and Expression in MammalianCells.Amsterdam,NL:Elsevier Sciences B.V.，将这些文献的披露内容通过引用并入本文。视情况而定，除非另有说明，否则通常根据制造商定义的方案和/或参数进行涉及市售试剂盒和试剂的使用的程序。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞旨在具有本公开文本所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的这些定义不必被解释为代表与本领域通常所理解的意义有实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员良好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。

除非上下文明确指示其他含义，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。本文中使用“A和/或B”来包括所有的以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。

如本文所用，术语“约”具有其通常的含义，即大致。如果根据上下文原本不清楚近似程度，则“约”意指在提供的值的正负10％以内，或四舍五入到最接近的有效数字，在所有情况下包括所提供的值。在提供范围的情况下，所述范围包括边界值。

如本文所用，术语“抗体”是指一类通常称为免疫球蛋白的蛋白质，所述免疫球蛋白特异性结合抗原分子。术语抗体包括全长单克隆抗体(mAb)，如IgG2单克隆抗体，其包括免疫球蛋白Fc区。术语抗体还包括双特异性抗体、双抗体、单链抗体片段(scFv)和诸如Fab、F(ab')2和Fv等抗体片段。在抗体是双特异性抗体的情况下，双特异性抗体可以处于许多不同的形式。抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以通过以下方式制备：通过本领域熟知的技术，如免疫宿主和收集血清(多克隆)，或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达至少编码为天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式。这样，抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括各种类别和同种型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。其片段可包括Fab、Fv和F(ab’)2、Fab'等。此外，只要保持对特定靶标(例如CD19、GPC2或HER2)的结合亲和力，就可以在适当的情况下使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物。

术语“细胞”、“细胞培养物”、“细胞系”不仅指特定的主题细胞、细胞培养物或细胞系，而且指这种细胞、细胞培养物或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系相同的功能即可。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指至少包含细胞外抗原结合结构域、TMD和细胞质信号传导结构域(也称为“细胞内信号传导结构域”或ICD)的多肽构建体。在一些情况下，细胞质信号传导结构域包括源自刺激分子的功能性信号传导结构域。刺激分子通常是与T细胞受体复合物相关的ζ链。任选地，ICD还可以包括源自至少一种共刺激分子(如4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28)的一个或多个功能性信号传导结构域。

通常，本公开文本的CAR包括各自由宿主细胞壁限定的胞外域和胞内域。在这方面，术语“胞外域”或“细胞外结构域”通常是指细胞外或膜脂质双层外部的CAR多肽的部分，其可包括抗原识别结合结构域、任选的铰链结构域和物理上跨越膜的氨基酸残基外部的任何间隔子结构域。相反，术语“胞内域”或“细胞内结构域”通常指细胞内或膜脂质双层内部的CAR多肽的部分，其还可包括物理上跨越膜的氨基酸残基内部的任何间隔子结构域、以及包含一个或多个共刺激信号传导结构域(例如，含有ITAM的序列、共刺激结构域等)的ICD。

本领域技术人员将理解，术语“源自”在关于核酸或多肽分子使用时是指所述分子的起源或来源，并且可以包括天然存在的、重组的、未纯化的或纯化的分子。当核酸或多肽分子包括以产生功能单元的方式装配的部分或元件时，所述核酸或多肽分子被认为“源自”。所述部分或元件可以从多个来源装配，只要它们保留进化上保守的功能即可。在一些实施方案中，衍生的核酸或多肽分子包括与来源核酸或多肽分子基本上相同的序列。例如，本公开文本的衍生的核酸或多肽分子可以与来源核酸或多肽分子具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指RNA分子和DNA分子两者，包括包含以下的核酸分子：cDNA、基因组DNA、合成DNA、以及含有核酸类似物的DNA或RNA分子。核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义链或反义链)。核酸分子可包含非常规或经修饰的核苷酸。如本文所用的术语“多核苷酸序列”和“核酸序列”可互换地指多核苷酸分子的序列。本文公开的多核苷酸和多肽序列使用如37CFR§1.82)中所述的对于核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写显示，所述规定通过引用并入WIPO标准ST.25(1998)附录2的表1-表6。

如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以其预期方式操作。例如，目的多核苷酸与调节序列(例如，启动子)之间的可操作连接是允许目的多核苷酸表达的功能连接。在这个意义上，术语“可操作地连接”是指调节区和待转录的编码序列的定位，使得调节区有效地调节目的编码序列的转录或翻译。在本文公开的一些实施方案中，术语“可操作地连接”表示这样的配置，其中调节序列被放置在相对于编码多肽或功能性RNA的序列的适当位置，使得控制序列引导或调节编码多肽、多肽和/或功能性RNA的mRNA的表达或细胞定位。因此，如果启动子可以介导核酸序列的转录，则其与核酸序列可操作地连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。在多肽的上下文中，“可操作地连接”是指氨基酸序列(例如，不同结构域)之间的物理连接(例如，直接或间接连接)以提供多肽的所述活性。在本公开文本中，本公开文本的重组多肽的各种结构域可以可操作地连接以保留细胞中重组多肽的适当折叠、加工、靶向、表达、结合和其他功能特性。本公开文本的重组多肽的可操作连接的结构域可以是连续的或不连续的(例如，通过接头彼此连接)。

在两个或更多个核酸或蛋白质的上下文中，如本文所用的术语“同一性百分比”是指相同的两个或更多个序列或子序列或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的两个或更多个序列或子序列，如使用采用如下所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量。参见例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。则将此类序列称为“基本上相同”。此定义也指或可应用于序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。可以使用已公布的技术和广泛可用的计算机程序来计算序列同一性，所述计算机程序如GCS程序包(Devereux等人,NucleicAcids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J Mol Biol 215:403,1990)。可以使用序列分析软件以所述软件的默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如University of Wisconsin Biotechnology Center(威斯康星州麦迪逊，大学大道1710号，53705)的Genetics Computer Group的序列分析软件包。一个或多个氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，例如在一个或多个CDR序列中的非必需氨基酸残基处。“保守氨基酸取代”理解为是用具有类似侧链的氨基酸残基取代原始氨基酸残基的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族是本领域已知的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

如本文所用的术语“重组”核酸分子、多肽和细胞是指已通过人为干预改变的核酸分子、多肽和细胞。作为非限制性例子，重组核酸分子可以是以下：1)已经例如使用化学或酶技术或核酸分子的重组在体外合成或修饰；2)包含在自然界中不连接的连接的核苷酸序列；3)已经使用分子克隆技术进行工程化，使得其缺乏关于天然存在的核酸分子序列的一个或多个核苷酸；和/或4)已经使用分子克隆技术进行操纵，使得其具有关于天然存在的核酸序列的一个或多个序列变化或重排。重组蛋白的非限制性例子是如本文提供的嵌合抗原受体。

如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人受试者)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目标疾病(例如癌症)和/或疾病的一种或多种症状的人患者或个体。所述受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为具有目标病症的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如，啮齿动物，例如小鼠)和非哺乳动物(如非人灵长类动物)，例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。

术语“载体”在本文中用于指能够转移或转运另一种核酸分子的核酸分子或序列。例如，载体可用作基因递送媒介物以将基因转移到细胞中。转移的核酸分子通常与载体核酸分子连接，例如插入所述载体核酸分子中。通常，当与适当的控制元件缔合时，载体能够复制。术语“载体”包括克隆载体和表达载体以及病毒载体和整合载体。“表达载体”是包含调节区从而能够在体外和/或体内表达DNA序列和片段的载体。载体可以包含引导细胞中自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。在一些实施方案中，载体是基因递送载体。

应理解，本文描述的本公开文本的方面和实施方案包括“包含(comprising)方面和实施方案”，“由方面和实施方案组成(consisting)”，以及“基本上由方面和实施方案组成(consisting essentially of)”。如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”排除在要求保护的组合物或方法中未指定的任何要素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由……组成”并不排除不会实质性地影响要求保护的组合物或方法的基本和新颖特征的材料或步骤。术语“包含”在本文中的任何叙述，特别是在组合物的组分的描述中或在方法的步骤的描述中，被理解为涵盖基本上由所列举组分或步骤组成以及由所列举组分或步骤组成的那些组合物和方法。

呈现标题(例如，(a)、(b)、(i)等)只是为了便于阅读说明书和权利要求。说明书或权利要求中的标题的使用不要求步骤或要素按字母或数字顺序或它们呈现的顺序进行。

如本领域的普通技术人员将理解的，出于任何和所有目的，如就提供书面描述方面而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合。任何所列范围都可容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文中讨论的每个范围可容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员可理解，所有诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等言辞都包括所述数字并且是指随后可分解为如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等等。

某些范围在本文中通过前面带有术语“约”的数值呈现。本文中使用术语“约”是为了对其后的精确数字以及接近或近似所述术语后的数字的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现它的上下文中提供具体列举的数字的基本等效形式的数字。

应了解，为明确起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征还可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。

本公开文本的组合物

如下文更详细地描述，本公开文本的一方面涉及包含来自CD28的铰链结构域的新型嵌合多肽和嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本公开文本的CAR还包含与CD28铰链结构域异源的共刺激结构域，例如不是来自CD28的共刺激结构域。还提供了编码此类嵌合多肽的重组核酸，以及经工程化以表达如本文公开的嵌合多肽并指向目的细胞(如癌细胞)的重组细胞。

嵌合多肽

在一方面，本文公开的一些实施方案涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽包含(i)包含能够结合抗原的ECD的第一多肽区段；(ii)包含来自CD28的铰链结构域的第二多肽区段；(iii)包含TMD的第三多肽区段。在一些实施方案中，所述多肽还包含第四多肽区段，所述第四多肽区段包含含有一个或多个共刺激结构域的ICD，其中所述一个或多个共刺激结构域不是来自CD28。ECD与其各自靶标的结合可以以与靶抗原的天然配体的竞争性或非竞争性方式进行。因此，在本公开文本的一些实施方案中，ECD与其靶抗原的结合可以是配体阻断的。在一些其他实施方案中，ECD与其靶抗原的结合不阻断天然配体的结合。在一些实施方案中，嵌合多肽包含至少一个多肽区段，所述至少一个多肽区段与第二多肽区段可操作地连接，在自然界中所述至少一个多肽区段并非天然连接到所述第二多肽区段。这些嵌合多肽区段可以通常存在于在本文公开的嵌合多肽中聚集在一起的单独蛋白质中，或者它们可以通常存在于相同的蛋白质中但在本文公开的嵌合多肽中以新的排列放置。如本文公开的嵌合多肽可以通过例如化学合成或通过产生和翻译其中多肽区段以所需关系被编码的嵌合多核苷酸来产生。

将所公开多肽的多肽区段指定为“第一”、“第二”、“第三”或“第四”多肽区段并非旨在暗示在嵌合多肽内“第一”、“第二”、“第三”或“第四”多肽区段的任何特定结构排列。此外或可替代地，嵌合多肽可以包含多于一个能够结合靶抗原的多肽区段；和/或至少两个多肽区段，每个多肽片段能够结合相同的靶抗原或不同的靶抗原。

在一些实施方案中，多肽区段中的至少两个彼此直接连接。在一些实施方案中，所有多肽区段彼此直接连接。在一些实施方案中，多肽区段中的至少两个通过至少一个共价键彼此直接连接。在一些实施方案中，多肽区段中的至少两个通过至少一个肽键彼此直接连接。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽包含将两个或更多个多肽区段连接在一起的一个或多个接头。在一些实施方案中，多肽区段中的至少两个彼此可操作地连接。对可用于本文所述的嵌合多肽中的接头没有特别限制。在一些实施方案中，所述接头是合成化合物接头，例如像化学交联剂。市场上可获得的合适的交联剂的非限制性例子包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)和双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)。

接头也可以是接头肽序列。因此，在一些实施方案中，多肽区段中的至少两个通过接头肽序列彼此可操作地连接。原则上，所述接头肽序列的长度和/或氨基酸组成没有特别的限制。在一些实施方案中，包含约一至100个氨基酸残基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等的氨基酸残基)的任何任意单链肽可以用作肽接头。在一些实施方案中，所述接头肽序列包含约5至50、约10至60、约20至70、约30至80、约40至90、约50至100、约60至80、约70至100、约30至60、约20至80、约30至90个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头肽序列包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25、约20至40、约30至50、约40至60、约50至70个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头肽序列包含约40至70、约50至80、约60至80、约70至90或约80至100个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述接头肽序列包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25个氨基酸残基。

嵌合抗原受体(CAR)

如上所述，本公开文本的嵌合多肽包含(i)能够结合抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)TMD；以及(iv)包含一个或多个共刺激结构域的ICD，其中所述一个或多个共刺激结构域不是来自CD28。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽被配置为嵌合抗原受体(CAR)。CAR是由以下构成的重组受体构建体：源自抗体的细胞外抗原结合部分，其连接到铰链结构域和TMD，后者进一步连接到T细胞受体的细胞内T细胞信号传导结构域。这样，CAR T细胞可以将抗体的特异性与T细胞的细胞毒性和记忆功能组合。在一些实施方案中，所公开的CAR不包含共刺激结构域。这些CAR称为第一代CAR(参见例如SEQ ID NO:39和图8A)。在一些实施方案中，所公开的CAR包含一个或多个共刺激结构域，其中所述一个或多个共刺激结构域不是源自CD28。

细胞外结构域(ECD)

在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽的ECD对一种或多种靶配体具有结合亲和力。在一些实施方案中，靶配体在细胞表面上表达，或以其他方式锚定、固定或限制，以便它可以对嵌合多肽施加机械力。这样，不受任何特定理论的束缚，本文提供的嵌合多肽的ECD与细胞表面配体的结合不一定从靶细胞表面去除靶配体，而是对嵌合多肽产生机械拉力。例如，如果其他可溶性配体结合至表面或细胞外基质中的分子，则所述其他可溶性配体可以被靶向。在一些实施方案中，靶配体是细胞表面配体。合适的配体类型的非限制性例子包括表面结合的细胞表面受体、粘附蛋白、碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白和脂多糖，整合素，粘蛋白以及凝集素。在一些实施方案中，配体是蛋白质。在一些实施方案中，配体是碳水化合物。

在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽的ECD包含结合一种或多种靶抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合部分包含抗体或其功能性抗原结合片段的一种或多种抗原结合决定簇。本领域技术人员在阅读本公开文本后将容易理解，术语“其功能片段”或“其功能变体”是指与衍生所述片段或变体的野生型分子具有共同的定量和/或定性生物活性的分子。例如，抗体的功能片段或功能变体是这样的，其保留与衍生所述功能片段或功能变体的抗体基本上相同的结合至相同表位的能力。例如，能够与细胞表面受体的表位结合的抗体可以在N末端和/或C末端处截短，并且使用本领域技术人员已知的测定评估其表位结合活性的保留。在一些实施方案中，抗原结合部分选自抗体、抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、双抗体、三抗体、微型抗体、F(ab’)2片段、F(ab)片段、VH结构域、VL结构域、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)、VNAR结构域、和VHH结构域、或其功能片段。在一些实施方案中，抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，抗原结合部分包含scFv。

抗原结合部分可包含天然存在的氨基酸序列或可被工程化、设计或修饰以提供所需和/或改进的特性，例如结合亲和力。通常，抗体或抗原结合部分对靶抗原(例如CD19抗原或GPC2抗原)的结合亲和力可以通过Frankel等人,Mol.Immunol,16:101-106,1979描述的Scatchard方法计算。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过抗原/抗体解离速率测量。在一些实施方案中，高结合亲和力可以通过竞争放射免疫测定测量。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过ELISA测量。在一些实施方案中，抗体亲和力可以通过流式细胞术测量。“选择性结合”靶抗原(如CD19或HER2)的抗体是以高亲和力结合靶抗原并且基本上不结合其他无关抗原但以高亲和力例如以如下平衡常数(KD)结合所述靶抗原的抗体：100nM或更小，如60nM或更小，例如30nM或更小，如15nM或更小、或10nM或更小、或5nM或更小、或1nM或更小、或500pM或更小、或400pM或更小、或300pM或更小、或200pM或更小、或100pM或更小。

熟练技术人员可以基于经基因修饰以表达本公开文本的嵌合多肽的细胞的所需定位或功能来选择ECD。例如，具有包括对HER2抗原具有特异性的抗体的ECD的嵌合多肽可以将细胞靶向表达HER2的乳腺癌细胞。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽的ECD能够结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。熟练技术人员会理解，TAA包括存在于肿瘤细胞和正常细胞上或许多正常细胞上但浓度远低于在肿瘤细胞上的浓度的分子，例如蛋白质。相比之下，TSA通常包括存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上的分子，例如蛋白质。

抗原

原则上，关于合适的靶抗原没有特别限制。在本公开文本的一些实施方案中，ECD的抗原结合部分对存在于由肿瘤细胞表达的抗原(即肿瘤相关抗原)中的表位具有特异性。肿瘤相关抗原可以是与例如以下相关的抗原：胰腺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、间皮瘤细胞、乳腺癌细胞、尿路上皮癌、肝癌细胞、头颈癌细胞、肉瘤细胞、宫颈癌细胞、胃癌细胞、胃部癌症细胞、黑色素瘤细胞、葡萄膜黑色素瘤细胞、胆管癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞和胶质母细胞瘤细胞。在一些实施方案中，抗原结合部分对存在于组织特异性抗原中的表位具有特异性。在一些实施方案中，抗原结合部分对疾病相关抗原中存在的表位具有特异性。

合适的靶抗原的非限制性例子包括磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7-H3)、IL-13-受体α1、IL-13-受体α2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)。其他合适的靶抗原包括但不限于酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD123、CD93、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、ALK、DLK1、FAP、NY-ESO、WT1、HMB-45抗原、蛋白质黑色素-A(T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1。

适用于本文公开的嵌合多肽和CAR的另外的抗原包括但不限于二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD19、CD20、CD5、CD7、CD3、TRBC1、TRBC2、BCMA、CD38、CD123、CD93、CD34、CD1a、SLAMF7/CS1、FLT3、CD33、CD123、TALLA-1、CSPG4、DLL3、κ轻链、λ轻链、CD16/FcγRIII、CD64、FITC、CD22、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、GD3、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、EGFR及其同种变体、TEM-8、精子蛋白17(Sp17)、间皮素。合适抗原的另外的非限制性例子包括PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、prostein、NKG2D、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(CD61)、催乳素、K-Ras(V-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因)和Ral-B。在一些实施方案中，所述抗原是磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、CD19、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7-H3)或IL-13-受体α。

在一些实施方案中，抗原在靶细胞上以低密度表达，例如每个细胞少于约6,000个靶抗原分子。在一些实施方案中，抗原以每个细胞小于约5,000个靶抗原分子、小于约4,000个靶抗原分子、小于约3,000个靶抗原分子、小于约2,000个靶抗原分子、小于约1,000个靶抗原分子或小于约500个靶抗原分子的密度表达。在一些实施方案中，抗原以每个细胞小于约2,000个靶抗原分子，例如小于约1,800个靶抗原分子、小于约1,600个靶抗原分子、小于约1,400个靶抗原分子、小于约1,200个靶抗原分子、小于约1,000个靶抗原分子、小于约800个靶抗原分子、小于约600个靶抗原分子、小于约400个靶抗原分子、小于约200个靶抗原分子或小于约100个靶抗原分子的密度表达。在一些实施方案中，抗原以每个细胞小于约1,000个靶抗原分子，例如小于约900个靶抗原分子、小于约800个靶抗原分子、小于约700个靶抗原分子、小于约600个靶抗原分子、小于约500个靶抗原分子、小于约400个靶抗原分子、小于约300个靶抗原分子、小于约200个靶抗原分子或小于约100个靶抗原分子的密度表达。在一些实施方案中，抗原以范围为每个细胞约5,000至约100个靶抗原分子，例如每个细胞约5,000至约1,000个靶抗原分子、约4,000至约2,000个靶抗原分子、约3,000至约2,000个靶抗原分子、约4,000至约3,000个靶抗原分子、约3,000至约1,000个靶抗原分子、约2,000至约1,000个靶抗原分子、约1,000至约500个靶抗原分子、约500至约100个靶抗原分子的密度表达。

在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含含有结合GPC2的抗原结合部分的ECD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含含有结合CD19的抗原结合部分的ECD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含含有结合HER2的抗原结合部分的ECD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含含有结合B7-H3的抗原结合部分的ECD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含含有抗原结合部分的ECD，所述抗原结合部分具有展现出与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:57至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分具有展现出与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:31的序列至少80％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分具有展现出与SEQ ID NO:43至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原结合部分具有展现出与SEQ IDNO:57至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列同一性的氨基酸序列。

铰链结构域

如上所述，在嵌合抗原受体内，术语“铰链结构域”通常是指位于靶向部分与TMD之间的柔性多肽连接区。这些序列通常源自IgG亚类(如IgG1和IgG4)、IgD和CD8结构域，其中IgG1使用最广泛。在一些实施方案中，铰链结构域为侧翼多肽区提供结构柔性。铰链结构域可由天然或合成多肽组成。本领域技术人员将理解，铰链结构域可以通过促进抗原结合部分相对于其识别的抗原部分的最佳定位来改善CAR的功能。应了解，在一些实施方案中，最佳CAR活性可能不需要铰链结构域。在一些实施方案中，包含短氨基酸序列的有益铰链结构域通过协助抗原结合(例如通过解除任何可能以其他方式改变抗体结合动力学的空间限制)来促进CAR活性。编码铰链结构域的序列可以定位于抗原识别部分与TMD之间。在一些实施方案中，铰链结构域可操作地连接在抗原结合部分的下游和TMD的上游。

铰链序列通常可以是从任何合适的分子衍生或获得的任何部分或序列。例如，在一些实施方案中，铰链序列可以源自人CD8α分子或CD28分子以及在为侧翼区域提供柔性方面提供类似功能的任何其他受体。铰链结构域的长度可以为约4个氨基酸(aa)至约50aa，例如约4aa至约10aa、约10aa至约15aa、约aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa、或约40aa至约50aa。合适的铰链结构域可以容易地选择并且可以具有许多合适长度中的任一个，如1个氨基酸(例如Gly)至20aa、2aa至15aa、3aa至12aa，包括4aa至10aa、5aa至9aa、6aa至8aa、或7aa至8aa，并且可以是1、2、3、4、5、6或7aa。合适的铰链结构域的非限制性例子包括CD8铰链结构域、CD28铰链结构域、CTLA4铰链结构域或IgG4铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域可以包括源自人CD8α(亦称CD8a)分子或CD28分子以及在为侧翼区域提供柔性方面提供类似功能的任何其他受体的区域。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含源自CD8α铰链结构域的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域可包含CD8α铰链结构域的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，本文公开的CAR包含源自CD28铰链结构域的铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域可包含CD28铰链结构域的一个或多个拷贝。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含如下铰链结构域，所述铰链结构域具有展现出与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45或SEQ IDNO:59的序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域具有展现出与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:59的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。

共刺激结构域

通常，适用于嵌合多肽(例如本文公开的CAR)的共刺激结构域可以是本领域已知的任何一种共刺激结构域。可以增强细胞因子产生的合适共刺激结构域的例子包括但不限于源自4-1BB(CD137)、CD27、CD28、OX40(CD134)和共刺激诱导型T细胞共刺激(ICOS)多肽序列的共刺激多肽序列。因此，在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR的共刺激结构域选自共刺激4-1BB(CD137)多肽序列、共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列和共刺激诱导型T细胞共刺激(ICOS)多肽序列。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含源自共刺激4-1BB(CD137)多肽序列的共刺激结构域。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含共刺激4-1BB(CD137)多肽序列。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含源自共刺激CD28多肽序列的共刺激结构域。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含共刺激CD28多肽序列。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含如下共刺激结构域，所述共刺激结构域具有展现出与SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:63的序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含如下共刺激结构域，所述共刺激结构域具有展现出与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:63的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。

在本公开文本的一些实施方案中，所公开的CAR的ICD包含充当磷酸化底物的保守氨基酸基序，例如免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)和/或免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。在一些实施方案中，所公开的CAR的ICD包含选自ITAM基序、ITIM基序或充当磷酸化底物的相关细胞内基序的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个特定的基于酪氨酸的基序。在本公开文本的一些实施方案中，所公开的CAR的ICD包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个ITAM。通常，包括ITAM在内的任何ICD都可适用于构建如本文所述的嵌合多肽。ITAM通常包括保守蛋白质基序，所述保守蛋白质基序通常存在于许多免疫细胞中表达的信号传导分子的尾部。所述基序可以包含被6-8个氨基酸隔开的氨基酸序列YxxL/I的两个重复，其中每个x独立地是任何氨基酸，产生保守基序YxxL/Ix(6-8)YxxL/I。信号传导分子内的ITAM对于细胞内的信号转导很重要，所述信号转导的至少部分是由信号传导分子激活后在ITAM中的酪氨酸残基的磷酸化介导的。ITAM还可以起参与信号传导途径的其他蛋白质的停泊位点的作用。在一些实施方案中，ICD包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个ITAM，所述ITAM独立地选自源自CD3ζ、FcRγ及其组合的ITAM。在一些实施方案中，所公开的CAR的ICD包括CD3ζICD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含如下CD3ζICD，所述CD3ζICD具有展现出与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37、SEQID NO:51或SEQ ID NO:65的序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含如下CD3ζICD，所述CD3ζICD具有展现出与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:65的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。

跨膜结构域(TMD)

通常，适用于本文公开的嵌合多肽和CAR的跨膜结构域(也称为跨膜区)可以是本领域已知的任一种TMD。不受理论的束缚，认为TMD穿过细胞膜，将CAR锚定至细胞表面，并将ECD连接至ICD，从而影响CAR在细胞表面上的表达。合适的TMD的例子包括但不限于CD28TMD、CD8αTMD、CD3 TMD、CD4 TMD、CTLA4 TMD和PD-1 TMD。因此，在一些实施方案中，TMD源自CD28 TMD、CD8αTMD、CD3 TMD、CD4 TMD、CTLA4 TMD和PD-1 TMD。在一些实施方案中，TMD包括CD28 TMD、CD8αTMD、CD3 TMD、CD4 TMD、CTLA4 TMD和PD-1 TMD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含源自CD8α的TMD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含CD8αTMD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含源自CD28的TMD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含CD28 TMD。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含如下TMD，所述TMD具有展现出与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:61的序列至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开的嵌合多肽和CAR包含如下TMD，所述TMD具有展现出与SEQ ID NO:7、SEQID NO:21、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:61的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ICD包括CD3ζICD，不受任何特定理论的束缚，认为所述CD3ζICD在T细胞激活期间介导下游信号传导。

细胞外间隔子

在一些实施方案中，本文公开的CAR还包含细胞外间隔子结构域，所述细胞外间隔子结构域包含定位于ECD与铰链结构域之间的一个或多个间插氨基酸残基。在一些实施方案中，细胞外间隔子结构域与ECD下游和铰链结构域上游可操作地连接。原则上，对细胞外间隔子的长度和/或氨基酸组成没有特别限制。在一些实施方案中，包含约一至100个氨基酸残基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个等的氨基酸残基)的任何任意单链肽可以用作细胞外间隔子。在一些实施方案中，所述细胞外间隔子包含约5至50、约10至60、约20至70、约30至80、约40至90、约50至100、约60至80、约70至100、约30至60、约20至80、约30至90个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述细胞外间隔子包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25、约20至40、约30至50、约40至60、约50至70个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述细胞外间隔子包含约40至70、约50至80、约60至80、约70至90或约80至100个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述细胞外间隔子包含约1至10、约5至15、约10至20、约15至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，可以优化细胞外间隔子的长度和氨基酸组成以改变ECD和铰链结构域彼此的取向和/或接近度，以实现所需的CAR活性。在一些实施方案中，ECD和铰链结构域彼此的取向和/或接近度可以变化和/或优化为会增强或降低CAR功效的“调节”工具或效果。在一些实施方案中，ECD和铰链结构域彼此的取向和/或接近度可以变化和/或优化以产生CAR的全功能形式或部分功能形式。在一些实施方案中，细胞外间隔子结构域包含对应于IgG4铰链结构域和IgG4 CH2-CH3结构域的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合HER2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合B7-H3抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合GPC2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iii)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有100％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述嵌合多肽具有与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有100％序列同一性的氨基酸序列。

本领域技术人员将了解，本公开文本的嵌合多肽或CAR的完整氨基酸序列可用于构建回译基因。例如，可以合成含有编码给定嵌合多肽或CAR的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成编码所需CAR或抗体的各部分的若干小寡核苷酸，然后进行连接。单独寡核苷酸通常包含5'或3'突出端以进行互补装配。

除了通过已通过重组分子生物学技术改变的核酸分子的表达产生所需嵌合多肽或CAR之外，还可以化学合成根据本公开文本的主题嵌合多肽或CAR。化学合成的多肽由本领域技术人员常规地产生。

一旦装配好(通过合成、重组方法、定向诱变或其他合适的技术)，可以将编码如本文公开的嵌合多肽或CAR的DNA序列插入表达载体中并可操作地连接到适用于在期望的转化宿主中表达嵌合多肽或CAR的表达控制序列。正确的装配可以通过核苷酸测序、限制性酶切作图和生物活性多肽在合适宿主中的表达来确认。如本领域已知的，为了获得转染基因在宿主中的高表达水平，应考虑确保所述基因与在所选表达宿主中具有功能性的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。

核酸分子

在一方面，本文提供了包含编码本公开文本的嵌合多肽的核苷酸序列的各种核酸分子，包括含有这些核酸分子的表达盒和表达载体，所述这些核酸分子与异源核酸序列(例如允许在宿主细胞或离体无细胞表达系统中体内表达嵌合多肽的调节序列)可操作地连接。

本公开文本的核酸分子可以是任何长度的核酸分子，包含通常在约0.5Kb与约50Kb之间，例如在约0.5Kb与约20Kb之间、在约1Kb与约15Kb之间、在约2Kb与约10Kb之间，或在约5Kb与约25Kb之间，例如在约10Kb与15Kb之间、约15Kb与约20Kb之间、约5Kb与约20Kb之间、约5Kb与约10Kb之间，或约10Kb与约25Kb之间的核酸分子。在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子在约1.5Kb与约50Kb之间、在约5Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约30Kb之间、在约5Kb与约20Kb、或在约10Kb与约50Kb之间，例如在约15Kb至30Kb之间、在约20Kb与约50Kb之间、在约20Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约25Kb之间、或在约30Kb与约50Kb之间。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码CAR的核酸序列，所述CAR包含(i)包含能够结合抗原的ECD的第一多肽区段；(ii)包含来自CD28的铰链结构域的第二多肽区段；(iii)包含TMD的第三多肽区段。在一些实施方案中，由所述核酸序列编码的CAR还包含第四多肽区段，所述第四多肽区段包含含有共刺激结构域的ICD，其中所述共刺激结构域不是来自CD28。

在一些实施方案中，重组核酸包含编码CAR的核酸序列，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD。在一些实施方案中，由所述核酸序列编码的CAR还包含ICD，所述ICD包含(iv)来自4-1BB的共刺激结构域和/或(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码CAR的核酸序列，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码CAR的核酸序列，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码CAR的核酸序列，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码CAR的核酸序列，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合HER2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码CAR的核酸序列，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合B7-H3抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组核酸分子包含编码CAR的核酸序列，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合GPC2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iii)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组核酸包含与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:68的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:40、SEQID NO:54和SEQ ID NO:68的核酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:14的核酸序列具有100％序列同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:28的核酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:28的核酸序列具有100％序列同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:40的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:40的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:40的核酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:40的核酸序列具有100％序列同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:54的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:54的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:54的核酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:54的核酸序列具有100％序列同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:68的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:68的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:68的核酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:68的核酸序列具有100％序列同一性的核酸序列。

在一些实施方案中，所述重组核酸分子与异源核酸序列可操作地连接。

在一些实施方案中，所述重组核酸分子进一步被限定为表达盒或载体。应理解，表达盒通常包含遗传物质的构建体，其含有编码序列和足够的调节信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。通常可以将所述表达盒插入用于靶向期望的宿主细胞的载体中和/或个体中。这样，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含：如本文公开的嵌合多肽的编码序列，所述编码序列可操作地连接至表达控制元件如启动子，以及任选的影响编码序列转录或翻译的任何其他序列或其他核酸序列的组合。

在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达载体中。本领域技术人员将理解，术语“载体”通常是指如下重组多核苷酸构建体，其被设计用于在宿主细胞之间转移并且可用于转化的目的，例如将异源DNA引入宿主细胞中。这样，在一些实施方案中，载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以在其中插入另一个DNA区段以引起插入区段的复制。在一些实施方案中，表达载体可以是整合载体。

在一些实施方案中，表达载体可以是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，术语“病毒载体”广泛用于指包含源自病毒的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或指介导核酸转移的病毒颗粒，所述源自病毒的核酸元件通常促进将核酸分子转移或整合到细胞的基因组中。病毒颗粒通常包含各种病毒组分，并且有时除一种或多种核酸外还包含宿主细胞组分。术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构性和/或功能性遗传元件。在一些实施方案中，所述载体是源自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒或逆转录病毒的载体。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要源自逆转录病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有包括主要源自慢病毒(为逆转录病毒的属)的结构性和功能性遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。

在一些实施方案中，本文提供了编码具有与本文公开的嵌合多肽具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，本文提供了编码具有与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:67中的任一个具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:13具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:27具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:39具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:53具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述核酸分子编码具有与SEQ ID NO:67具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

可以针对在目的宿主细胞中的表达优化编码嵌合多肽的核酸序列。例如，可以将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，如参考宿主细胞中表达的已知基因所计算的。密码子使用优化的方法是本领域已知的。可以优化本文公开的嵌合受体的编码序列内的密码子使用以增强在宿主细胞中的表达，使得编码序列内的密码子的约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或多至100％已针对特定宿主细胞中的表达进行优化。

所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的那些序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽(例如抗体)的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA，或合成DNA(例如通过基于亚磷酰胺的合成产生的DNA))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。此外，核酸分子可以是双链或单链的(例如，有义或反义链)。

核酸分子不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包含位于编码序列(例如，嵌合受体的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)来产生。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情况下，分子可以例如通过体外转录产生。

重组细胞和细胞培养物

本公开文本的核酸分子可被引入细胞，如人T细胞或癌细胞，以产生含有所述核酸分子的重组细胞。因此，本公开文本的一些实施方案涉及制备重组细胞的方法，所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且用本公开文本的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生重组细胞。将本公开文本的核酸分子引入细胞可以通过本领域技术人员已知的方法进行，所述方法例如：病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。

因此，在一些实施方案中，可以将核酸分子通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物引入宿主细胞中以产生工程化细胞。例如，核酸分子可以稳定地整合到宿主基因组中、或者可以以附加体复制、或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于稳定或瞬时表达。因此，在本文公开的一些实施方案中，所述核酸分子在重组宿主细胞中作为附加体单元被维持和复制。在一些实施方案中，所述核酸分子稳定整合到重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典随机基因组重组技术或更精确的基因组编辑技术完成，如使用锌指蛋白(ZNF)、指导RNA引导的CRISPR/Cas9、DNA指导的核酸内切酶基因组编辑NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute)、或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。

核酸分子可以被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中，或者可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送手段和方法如电穿孔来递送。例如，可以通过病毒转导实现将核酸引入细胞。在一个非限制性例子中，杆状病毒或腺相关病毒(AAV)可以被工程化为通过病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了若干种AAV血清型，并且所有已知的血清型可以感染来自多种不同组织类型的细胞。AAV能够在体内转导广泛的物种和组织，没有毒性证据，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。

源自慢病毒的载体系统也可用于通过病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了若干种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞二者；(iii)具有广泛的组织趋性，包括重要的基因和细胞疗法靶细胞类型；(iv)载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含有内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和生产的系统。

在一些实施方案中，可以用例如本申请的载体构建体对宿主细胞进行基因工程化(例如，转导或转化或转染)，所述载体构建体可以是例如病毒载体或用于同源重组的载体(包含与宿主细胞基因组的一部分同源的核酸序列)，或者可以是用于表达目的嵌合多肽的表达载体。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用至少一种核酸分子转染的细胞。

在一些实施方案中，所述重组细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞在体内。在一些实施方案中，所述细胞是离体的。在一些实施方案中，所述细胞在体外。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是小鼠细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是免疫系统细胞，例如B细胞、单核细胞、NK细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、辅助性T细胞(T_H)、细胞毒性T细胞(T_CTL)、记忆性T细胞、γδ(γδ)T细胞、另一种T细胞、造血干细胞或造血干细胞祖细胞。

在一些实施方案中，所述免疫系统细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T淋巴细胞。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T淋巴细胞祖细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞。适用于本文公开的组合物和方法的CD8+T细胞毒性淋巴细胞的非限制性例子包括幼稚CD8+T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞、效应CD8+T细胞、CD8+干记忆T细胞和整体CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述T淋巴细胞是CD4+T辅助性淋巴细胞。合适的CD4+T辅助性淋巴细胞包括但不限于幼稚CD4+T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、效应CD4+T细胞、CD4+干记忆T细胞和整体CD4+T细胞。

如上所概述，本公开文本的一些实施方案涉及制备重组细胞的各种方法，所述方法包括(a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且用本公开文本的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生重组细胞。所公开的用于制备重组细胞的方法的非限制性示例性实施方案还可以包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，通过对从受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得宿主细胞，并且离体转导细胞。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述方法还包括分离和/或纯化产生的细胞。因此，通过本文公开的方法产生的重组细胞也在本公开文本的范围内。

用于转化多种多样的上述宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。例如，可以经由常规转化或转染技术将DNA载体引入真核细胞中。可以在Sambrook等人(2012年，同上)和其他标准分子生物学实验室手册中找到用于转化或转染细胞的合适方法，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、弹道引入、核穿孔、流体动力冲击、和感染。在一些实施方案中，将核酸分子通过转导程序、电穿孔程序或生物射弹程序引入宿主细胞中。因此，包括至少一种如本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适用于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。

在一方面，本公开文本的一些实施方案涉及重组细胞，所述重组细胞包含：(a)如本文所述的嵌合多肽；和/或如本文所述的核酸分子。在一些实施方案中，本公开文本的重组细胞包含编码CAR的核酸分子，所述CAR包含(i)包含能够结合抗原的ECD的第一多肽区段；(ii)包含来自CD28的铰链结构域的第二多肽区段；(iii)包含TMD的第三多肽区段。在一些实施方案中，由所述核酸序列编码的CAR还包含(iv)第四多肽区段，所述第四多肽区段包含含有共刺激结构域的ICD，其中所述共刺激结构域不是来自CD28。

在一些实施方案中，重组细胞包含编码CAR的核酸分子，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组细胞包含编码CAR的核酸分子，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组细胞包含编码CAR的核酸分子，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合CD19抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8的TMD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组细胞包含编码CAR的核酸分子，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合HER2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组细胞包含编码CAR的核酸分子，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合B7-H3抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iv)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(v)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组细胞包含编码CAR的核酸分子，所述CAR在N末端至C末端的方向上包含：(i)能够结合GPC2抗原的ECD；(ii)来自CD28的铰链结构域；(iii)来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；(iii)包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；以及(iv)CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，重组细胞包含含有编码CAR的核酸序列的核酸分子，所述CAR与选自SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，重组细胞包含含有编码CAR的核酸序列的核酸分子，所述CAR与选自SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，重组细胞包含含有编码CAR的核酸序列的核酸分子，所述CAR与选自SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，重组细胞包含含有编码CAR的核酸序列的核酸分子，所述CAR与选自SEQ IDNO:53的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，重组细胞包含含有编码CAR的核酸序列的核酸分子，所述CAR与选自SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

在相关方面，本公开文本的一些实施方案涉及细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种如本文公开的重组细胞和培养基。通常，培养基可以是用于本文所述的细胞培养物的任何一种合适的培养基。在一些实施方案中，重组细胞表达本文所述的嵌合多肽或CAR。因此，包括至少一种如本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适用于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。

药物组合物

在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽、嵌合抗原受体(CAR)、核酸、重组细胞和/或细胞培养物可并入组合物，包括药物组合物。此类组合物通常包含如本文所述的嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞和/或细胞培养物以及药学上可接受的载体。因此，在一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于治疗、预防、改善、减少或延迟健康状况例如增殖性疾病(例如，癌症)的发作的药物组合物。

因此，本公开文本的一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和以下中的一种或多种：(a)本公开文本的嵌合多肽；(b)本公开文本的核酸分子；和/或(c)本公开文本的重组细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含(a)本公开文本的重组核酸和(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述组合物包含(a)本公开文本的重组细胞和(b)药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，根据本文公开的一些实施方案的药物组合物包含细胞培养物，所述细胞培养物在施用于有需要的个体之前可以被洗涤、处理、组合、补充或以其他方式改变。另外，施用可以以不同的剂量、时间间隔进行或是多次施用。

本文提供的药物组合物可以是允许将组合物施用于个体的任何形式。在一些具体实施方案中，所述药物组合物适用于人类施用。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的管理机构批准或者在美国药典或其他公认药典中列示用于动物，更特别是用于人。载体可以是与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，包括可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的例子由E.W.Martin描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。在一些实施方案中，所述药物组合物被无菌配制用于施用于个体。在一些实施方案中，所述个体是人。本领域普通技术人员应了解配制品应适于施用方式。

在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物被配制成适用于对个体的预期施用途径。例如，药物组合物可以被配制成适用于肠胃外、腹膜内、结直肠、腹膜内和肿瘤内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物可以被配制用于静脉内、口服、腹膜内、气管内、皮下、肌肉内、局部或肿瘤内施用。

适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM.(新泽西州帕西帕尼的BASF)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应是无菌的并且应是易于注射的程度的流体。其在制造和储存条件下应稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散液的情况下维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)，维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，通常在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可以通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。

无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，分散液是通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。

治疗方法

施用本文所述的任一种治疗组合物，例如嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物，可用于诊断、预防和/或治疗相关病症，如增殖性疾病(例如癌症)。在一些实施方案中，可以将如本文所述的嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物并入疗法和治疗剂中以用于预防和/或治疗具有、怀疑具有或者可能有高风险发生一种或多种健康状况(如增殖性疾病(例如癌症))的个体的方法中。在一些实施方案中，所述个体是在医生照料下的患者。

示例性增殖性疾病可以包括而不限于血管生成性疾病、转移性疾病、致瘤性疾病、肿瘤性疾病和癌症。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，所述癌症是儿科癌症。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、尿路上皮癌、肝癌、头颈癌、肉瘤、宫颈癌、胃癌(stomach cancer)、胃部癌症(gastric cancer)、黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆管癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，所述癌症是多药耐药性癌症或复发性癌症。设想到了此处公开的组合物和方法适用于非转移性癌症和转移性癌症。因此，在一些实施方案中，所述癌症是非转移性癌症。在一些其他实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，施用于受试者的组合物抑制受试者中癌症的转移。在一些实施方案中，施用的组合物抑制受试者的肿瘤生长。

因此，在一方面，本公开文本的一些实施方案涉及用于在有需要的受试者中预防和/或治疗病症的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用包含以下中的一种或多种的组合物：本公开文本的嵌合多肽，本公开文本的重组核酸，本公开文本的重组细胞，和/或本公开文本的药物组合物。

在一些实施方案中，本文所述的组合物，例如多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物，可用于治疗患有、怀疑患有或可能有高风险发生白血病的个体的方法中。在这些情况下，白血病通常可以是任何类型的白血病。可以使用本文所述的组合物(例如，多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物)治疗的合适的白血病包括但不限于急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性淋巴母细胞B细胞白血病、急性淋巴母细胞T细胞白血病、急性成髓细胞性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、急性单核母细胞白血病、急性红白血病性白血病、急性巨核细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化白血病、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和毛细胞白血病。在一些实施方案中，所述白血病是AML。

在一些实施方案中，与尚未被施用相同组合物的参考受试者相比，施用的组合物赋予受试者增加的干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素-2(IL-2)的产生。

在一些实施方案中，施用的组合物抑制受试者中靶癌细胞的增殖，和/或抑制癌症的肿瘤生长。例如，如果靶细胞的增殖减少，如果靶细胞的病理或致病行为减少，如果靶细胞被破坏或杀伤等，则靶细胞可以被抑制。抑制包括所测量的病理或致病行为减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，所述方法包括向个体施用有效数量的本文公开的重组细胞，其中与尚未被施用重组细胞的受试者中靶细胞的增殖和/或靶癌症的肿瘤生长相比，所述重组细胞抑制受试者中靶细胞的增殖和/或抑制靶癌症的肿瘤生长。

如本文所用，术语“施用”(“administration”和“administering”)是指通过包括但不限于以下施用途径来递送生物活性组合物或配制品：口服、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、肌肉内和局部施用、或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。

本文所述的组合物例如多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物的施用可用于刺激免疫应答。在一些实施方案中，在用化学疗法诱导癌症缓解之后，或在自体或同种异体造血干细胞移植之后，向个体施用如本文所述的多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物。在一些实施方案中，将本文所述的组合物施用于需要增加所治疗受试者中干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素-2(IL-2)产生(相对于尚未被施用本文公开的治疗组合物之一的受试者中这些分子的产生而言)的个体。

基于预期目标，例如肿瘤消退，确定本文所述组合物(例如多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物)的有效量。例如，在治疗现有癌症的情况下，本文公开的组合物的施用量可以大于施用组合物用于预防癌症的情况下的量。鉴于本公开文本，本领域普通技术人员将能够确定待施用的组合物的量和施用频率。根据治疗次数和剂量二者，施用量还取决于待治疗的个体、个体的状态和所需的保护。组合物的精确量还取决于从业者的判断并且因每个个体而异。根据从业者的判断，施用频率的范围可以是1-2天、到2-6小时、到6-10小时、到1-2周或更长。

在目标是预防的情况下，可以使用更长的施用间隔和更低量的组合物。例如，每剂施用的组合物的量可以是治疗活动性疾病时施用的剂量的50％，并且可以每周间隔施用。鉴于本公开文本，本领域普通技术人员将能够确定组合物的有效量和施用频率。该确定将部分取决于存在的具体临床情况(例如，癌症类型、癌症严重程度)。

在某些实施方案中，可能需要向待治疗的受试者例如患者提供本文公开的组合物的连续供应。在一些实施方案中，目的区域(如肿瘤)的连续灌注可能是合适的。灌注的时间段将由临床医生针对具体受试者和情况选择，但时间范围可以为约1-2小时、到2-6小时、到约6-10小时、到约10-24小时、到约1-2天、到约1-2周或更长。通常，通过连续灌注的组合物剂量将等同于通过单次或多次注射给予的剂量，针对施用剂量的时间段进行调整。

在一些实施方案中，通过推注施用。在一些实施方案中，通过静脉输注施用。在一些实施方案中，将组合物以每天约100ng/kg体重至每天约100mg/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，将如本文公开的组合物以每天约0.001mg/kg至100mg/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，将治疗剂以单次施用方式施用。在一些实施方案中，将治疗剂以多次施用方式施用(例如，每周一次或多次，持续一周或多周)。在一些实施方案中，大约每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更多天施用剂量。在一些实施方案中，有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个总剂量。在一些实施方案中，施用4个剂量，剂量之间跨度为3周。

本领域普通技术人员熟悉用于向个体施用本公开文本的组合物的技术。另外，本领域普通技术人员熟悉在施用于个体之前制备这些组合物所必需的技术和药物试剂。

在本公开文本的某些实施方案中，本公开文本的组合物将是包含如本文所述的嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物中的一种或多种的水性组合物。本公开文本的水性组合物含有在药学上可接受的载体或水性介质中的有效量的本文公开的组合物。因此，本公开文本的“药物制剂”或“药物组合物”可以包含任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除了在任何常规培养基或药剂与本文公开的重组细胞不相容的情况下，考虑将它们用于药物组合物的制造中。还可以将补充性活性成分并入组合物中。对于人体施用，制剂应满足FDA生物制剂中心要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。

本领域普通技术人员将了解，在适当的情况下，应对生物材料进行广泛透析以除去不希望的小分子量分子，和/或进行冻干以用于在所需媒介物中的更加就绪的配制品。然后，通常将本文所述的组合物(例如多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物)配制用于通过任何已知的途径施用(如肠胃外施用)。待施用的组合物的量的确定将通过本领域技术人员进行，并且将部分取决于癌症的程度和严重程度，以及是否正在施用重组细胞以治疗现存癌症或预防癌症。鉴于本公开文本，本领域技术人员将知晓含有本公开文本的嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物的组合物的制备。

在配制时，将以与剂量配制品相容的方式且以治疗有效的量施用本公开文本的组合物。可以将组合物以各种剂型(如上述可注射溶液类型)施用。对于肠胃外施用，应对本文公开的组合物适当缓冲。如下文更详细讨论的，可以将如本文所述的组合物与作为个体治疗方案一部分(如其他免疫疗法或化学疗法)的其他治疗剂一起施用。本文所述的嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物可用于抑制所治疗受试者中的肿瘤生长或癌症转移(相对于尚未被施用本文公开的治疗组合物之一的受试者中的肿瘤生长或转移而言)。在一些实施方案中，本文所述的抗体、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物可用于通过诱导干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素-2(IL-2)和其他促炎性细胞因子的产生刺激针对肿瘤的免疫应答。在一些实施方案中，本文所述的抗体、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物可用于刺激所治疗受试者中CAR T细胞的增殖和/或杀伤能力(相对于尚未被施用本文公开的治疗组合物之一的受试者中这些分子的产生而言)。与尚未被施用本文公开的治疗组合物之一的受试者中干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素-2(IL-2)的产生相比，干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素-2(IL-2)的产生可以被刺激产生多达约20倍，如约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或20倍或更多。

向受试者施用重组细胞

在一些实施方案中，本公开文本的方法涉及向有需要的受试者施用有效量或数量的此处提供的重组细胞。该施用步骤可以使用本领域中的任何植入递送方法来完成。例如，可以将重组细胞直接输注入受试者的血流中或以其他方式施用于受试者。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括将重组细胞通过导致将所引入细胞至少部分定位于所需部位从而产生一种或多种所需作用的方法或途径施用(该术语与术语“引入”、“植入”和“移植”可互换使用)于个体。可以将重组细胞或其分化的后代通过任何适当的途径施用，所述适当的途径导致递送至个体的所需位置，在该位置至少部分所施用的细胞或细胞组分保持存活。在施用于受试者后细胞的活力时间段可以短至数小时，例如二十四小时，至数天，至长至数年，或甚至个体的寿命，即长期移植。

当预防性提供时，可以将本文所述的重组细胞在待治疗的疾病或病症的任何症状出现之前施用于受试者。因此，在一些实施方案中，重组细胞群的预防性施用预防疾病或病症的症状的发生。

当在一些实施方案中以治疗方式提供时，在疾病或病症的症状或指征发作时(或之后)，例如在疾病或病症发作时，提供重组细胞。

为了在本文所述的各种实施方案中使用，如本文公开的重组细胞的有效量可以是至少10²个细胞、至少5×10²个细胞、至少10³个细胞、至少5×10³个细胞、至少10⁴个细胞、至少5×10⁴个细胞、至少10⁵个细胞、至少2×10⁵个细胞、至少3×10⁵个细胞、至少4×10⁵个细胞、至少5×10⁵个细胞、至少6×10⁵个细胞、至少7×10⁵个细胞、至少8×10⁵个细胞、至少9×10⁵个细胞、至少1×10⁶个细胞、至少2×10⁶个细胞、至少3×10⁶个细胞、至少4×10⁶个细胞、至少5×10⁶个细胞、至少6×10⁶个细胞、至少7×10⁶个细胞、至少8×10⁶个细胞、至少9×10⁶个细胞、或其倍数。所述重组细胞可以源自一个或多个供体或可以从自体来源获得。在一些实施方案中，将所述重组细胞在施用于有需要的受试者之前在培养物中扩增。

在一些实施方案中，通过方法或途径将重组细胞组合物(例如包含根据本文所述的任何细胞的多个重组细胞的组合物)递送至受试者体内导致将细胞组合物至少部分定位于期望部位。可以通过任何导致受试者中的有效治疗的适当途径施用包含重组细胞的组合物，例如，施用导致递送至受试者中的期望位置，在该期望位置处所递送组合物的至少一部分例如至少1×10⁴个细胞被递送至期望部位保持一段时间。施用方式包括注射、输注、滴注。“注射”包括而不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，通过注射或输注进行递送是标准的施用方式。

在一些实施方案中，将重组细胞例如经由输注或注射来全身施用。例如，不直接将重组细胞群施用于靶部位、组织或器官，而是使其进入受试者的循环系统，从而进行代谢和其他类似的生物过程。

包括本文提供的任何组合物的用于预防或治疗疾病或病症的治疗的功效可由熟练的临床医生确定。然而，本领域技术人员将理解，如果疾病的任何一种或全部体征或症状或标记物得到改善或改进，则预防或治疗被认为是有效的。还可以通过如由减少住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病进展停止或至少减缓)所评估的受试者恶化的失败来测量疗效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对受试者或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；以及(3)预防或减少症状发展的可能性。

功效程度的测量基于关于所治疗的疾病和所经历的症状所选择的参数。总体上，选择已知或被接受为与疾病的程度或严重程度相关的参数，如医学界接受或使用的参数。例如，在实体癌的治疗中，合适的参数可以包括转移的数量和/或大小的减少、无进展存活期的月数、总存活期、疾病的阶段或等级、疾病进展的速度、诊断生物标记物的减少(例如而不限于，循环肿瘤DNA或RNA的减少、循环无细胞肿瘤DNA或RNA的减少等)及其组合。应理解，有效剂量和功效程度通常将与单个受试者和/或一组或一群受试者相关来确定。本公开文本的治疗方法将症状和/或疾病严重程度和/或疾病生物标记物降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

如上文所讨论的，治疗有效量包括治疗组合物当施用于受试者时足以促进特定有益作用的量，所述受试者是如患有、怀疑患有或有风险患上疾病的受试者。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病的症状的量。应理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的有效量。

另外的疗法

如上所讨论的，可以将如本文公开的任何一种组合物，例如嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物，作为单个疗法(例如，单一疗法)施用于有需要的受试者。此外或可替代地，在本公开文本的一些实施方案中，可以将本文所述的嵌合多肽、CAR、核酸、重组细胞、细胞培养物和/或药物组合物与一种或多种另外的疗法(例如至少一种、两种、三种、四种或五种另外的疗法)组合施用于受试者。有待与本公开文本的组合物组合施用的合适疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、靶向疗法和手术。其他合适的疗法包括治疗剂，如化疗剂、抗癌剂和抗癌疗法。

与一种或多种另外的疗法“组合”施用包括同时(并行)和以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、和手术。如本文所用的术语化学疗法包括抗癌剂。各种类别的抗癌剂可适用于本文公开的方法。抗癌剂的非限制性例子包括：烷化剂、抗代谢物、蒽环类、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、鬼臼毒素、抗体(例如单克隆或多克隆的)、酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(

或

))、激素治疗、可溶性受体和其他抗肿瘤药。

拓扑异构酶抑制剂也是可用于本文的另一类抗癌剂。拓扑异构酶是维持DNA拓扑结构的基本的酶。对I型或II型拓扑异构酶的抑制会通过扰乱正确的DNA超螺旋化来干扰DNA的转录和复制。一些I型拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱，如伊立替康和拓扑替康。II型抑制剂的例子包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。这些是鬼臼毒素的半合成衍生物，所述鬼臼毒素是天然存在于美洲八角莲(美洲鬼臼(Podophyllum peltatum))根中的生物碱。

抗肿瘤药包括免疫抑制剂更生霉素、多柔比星、表柔比星、博来霉素、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺。抗肿瘤化合物通常通过化学修饰细胞的DNA起作用。

烷化剂可以在存在于细胞中的条件下将许多亲核官能团烷基化。顺铂和卡铂以及奥沙利铂是烷化剂。它们通过与生物学重要分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键来损害细胞功能。

长春花生物碱与微管蛋白上的特定位点结合，从而抑制微管蛋白装配成微管(细胞周期的M期)。长春花生物碱包括：长春新碱、长春碱、长春瑞滨和长春地辛。

抗代谢物类似于嘌呤(硫唑嘌呤、巯基嘌呤)或嘧啶，并可防止这些物质在细胞周期的“S”期期间掺入DNA中，从而阻止正常发育和分裂。抗代谢物还影响RNA合成。

植物生物碱和萜类化合物从植物中获得，并通过阻止微管功能阻断细胞分裂。由于微管对细胞分裂至关重要，没有它们，细胞分裂就不会发生。主要的例子是长春花生物碱和紫杉烷。

鬼臼毒素是源自植物的化合物，据报道它有助于消解，以及可用于产生其他两种细胞抑制药物即依托泊苷和替尼泊苷。它们阻止细胞进入G1期(DNA复制的开始)和DNA复制(S期)。

作为组的紫杉烷包括紫杉醇和多西紫杉醇。紫杉醇是一种天然产品，最初称为泰素(Taxol)，且最初来自太平洋紫杉的树皮。多西紫杉醇是紫杉醇的半合成类似物。紫杉烷增强微管的稳定性，从而防止染色体在细胞分裂后期期间分离。

在一些实施方案中，抗癌剂可以选自类克(remicade)、多西紫杉醇、塞来昔布、美法仑、地塞米松

类固醇、吉西他滨、顺铂、替莫唑胺、依托泊苷、环磷酰胺、特莫达(temodar)、卡铂、丙卡巴肼、格立得(gliadel)、他莫昔芬、拓扑替康、甲氨蝶呤、吉非替尼

泰素、泰素帝、氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、希罗达(xeloda)、CPT-11、干扰素α、聚乙二醇化干扰素α(例如，PEG INTRON-A)、卡培他滨、顺铂、噻替帕、氟达拉滨、卡铂、脂质体道诺霉素、阿糖胞苷、doxetaxol、紫杉醇、长春碱、IL-2、GM-CSF、达卡巴嗪、长春瑞滨、唑来膦酸、棕榈酸酯、克拉霉素(biaxin)、白消安、泼尼松、硼替佐米

二膦酸盐、三氧化二砷、长春新碱、多柔比星

紫杉醇、更昔洛韦、阿霉素、雌莫司汀磷酸钠

舒林酸、依托泊苷及其任何组合。

在其他实施方案中，抗癌剂可以选自硼替佐米、环磷酰胺、地塞米松、多柔比星、干扰素-α、来那度胺、美法仑、聚乙二醇化干扰素-α、泼尼松、沙利度胺或长春新碱。

在一些实施方案中，如本文所述的预防和/或治疗方法还包括免疫疗法。在一些实施方案中，所述免疫疗法包括施用一种或多种检查点抑制剂。因此，本文所述的治疗方法的一些实施方案包括进一步施用抑制一种或多种免疫检查点分子的化合物。免疫检查点分子的非限制性例子包括CTLA4、PD-1、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、TIM3及其任何组合。在一些实施方案中，抑制一种或多种免疫检查点分子的化合物包括拮抗性抗体。适用于本文公开的组合物和方法的拮抗性抗体的例子包括但不限于伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、度伐鲁单抗、阿特珠单抗、曲美木单抗和阿维鲁单抗。

在一些方面，一种或多种抗癌疗法是放射疗法。在一些实施方案中，放射疗法可以包括施用放射以杀伤癌细胞。放射与细胞中的分子(如DNA)相互作用以诱导细胞死亡。放射还会损害细胞膜和核膜以及其他细胞器。根据放射类型，DNA损伤的机制可能会有所不同，相关的生物有效性也可能会有所不同。例如，重粒子(即质子、中子)直接损伤DNA并具有更高的相对生物有效性。电磁辐射通过主要由细胞水电离产生的短寿命羟基自由基导致间接电离作用。放射的临床应用由外射束放射(来自外部源)和近距离放射治疗(使用植入或插入患者体内的放射源)组成。外射束放射由X射线和/或γ射线组成，而近距离放射治疗使用放射性核，这些放射性核会衰变并发射α粒子或β粒子以及γ射线。本文还考虑的放射包括例如将放射性同位素定向递送至癌细胞。本文还考虑了其他形式的DNA损伤因子，如微波和UV辐照。

可以按单剂量或以剂量分次时间表中的一系列小剂量给予放射。本文考虑的放射量范围为约1至约100Gy，包括例如约5至约80、约10至约50Gy或约10Gy。总剂量可以按分次方案应用。例如，所述方案可以包括2Gy的分次单独剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期以及所发射的放射的强度和类型。当放射包括使用放射性同位素时，同位素可以与靶向剂如治疗性抗体缀合，所述靶向剂将放射性核苷酸携带至靶组织(例如，肿瘤组织)。

本文所述的手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理去除、锻炼和/或破坏。肿瘤切除是指物理去除肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除外，手术治疗还包括激光手术、低温手术、电外科和显微控制手术(莫氏手术)。本文还考虑去除癌前组织或正常组织。

因此，在一些实施方案中，本公开文本的方法包括将本文公开的组合物作为单个疗法(例如，单一疗法)单独施用于受试者。在一些实施方案中，将本公开文本的组合物作为与第二疗法组合的第一疗法施用于受试者。在一些实施方案中，所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法、和手术。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法相伴施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法与所述第二疗法同时施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，在所述第二疗法之前和/或之后施用所述第一疗法。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。在一些实施方案中，将所述第一疗法和所述第二疗法以单一配制品一起施用。

试剂盒

本文还提供了用于实践本文所述方法的各种试剂盒。特别地，本公开文本的一些实施方案提供了用于诊断受试者的病症的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于在有需要的受试者中预防病症的试剂盒。一些其他实施方案涉及用于在有需要的受试者中治疗病症的方法的试剂盒。例如，在一些实施方案中，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含如本文提供和描述的嵌合多肽、重组核酸、工程化细胞或药物组合物中的一种或多种，以及制备和使用它们的书面说明书。

在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒还包含可用于将所提供的嵌合多肽、重组核酸、工程化细胞或药物组合物中的任一种施用于个体的一种或多种装置。例如，在一些实施方案中，本公开文本的试剂盒还包含一个或多个注射器(包括预充注射器)和/或导管(包括预充注射器)，以用于将所提供的嵌合多肽、重组核酸、工程化细胞或药物组合物中的任一种施用于个体。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述一种或多种另外的治疗剂可与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于期望目的，例如用于诊断、预防或治疗有需要的受试者的病症。

任何上述试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照多肽、阳性对照多肽、适用于体外产生嵌合多肽的试剂。

在一些实施方案中，试剂盒的组分可以在分开的容器中。在一些其他实施方案中，试剂盒的组分可以组合在单个容器中。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包含使用试剂盒的组分来实践本文所公开方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，所述说明书可以印刷在基材上，如纸或塑料等。所述说明书可以作为包装插入物存在于试剂盒中、试剂盒的容器或其组分的标签中(例如，与包装或分包装相关联)等。所述说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情形下，实际说明书不存在于所述试剂盒中，而是可以提供用于从远程源(例如，经由互联网)获得所述说明书的装置。这个实施方案的例子是包含网址的试剂盒，在其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，将这种用于获得说明书的手段可以记录在合适的基材上。

不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且发明人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但是该提及并不意味着承认这些文件中的任何文件构成了本领域中公知常识的一部分。

本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本之后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。

实施例

在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。

实施例1

将CD28铰链整合到CD19 CAR中(CD19-28铰链-28TM-41BBz)导致增强对CD19^低细胞的杀伤和细胞因子产生

本实施例描述了进行的实验，以证明CD28铰链并入CD19 CAR中(CD19-28铰链-28TM-41BBz)导致与CD19-CD8铰链-CD8TM-41BBz(Kymriah)相比，增强对CD19低细胞的杀伤和响应于一系列CD19抗原密度的细胞因子产生，与CD19-28z CAR(Axi-Cel)相媲美。

如图2A中所示，编码具有所指示结构的CD19 CAR的逆转录病毒载体是商业合成的，并通过标准方法克隆。在瞬时转染逆转录病毒质粒后，在293GP细胞中产生病毒上清液。NALM6^低细胞是通过使用CRISPR-Cas9技术从NALM6肿瘤系中敲除CD19，然后使用基于慢病毒的载体重新引入蛋白质的截短形式(仅细胞外和跨膜部分)来生成的。对细胞进行FACS分选和单细胞克隆，以获得不同CD19抗原密度的克隆文库。CD19 CAR被转导到人T细胞中。在用CD3/CD28珠激活后，用病毒上清液转导原代人T细胞。将具有所指示结构的CD19 CAR与表达极低水平CD19(每个细胞大约1,000个分子)的NALM6细胞共培养，并通过测量GFP(NALM6细胞表达GFP)在Incucyte中随时间测量剩余的肿瘤细胞(存活)。如图2A中所示，将表达963个表面CD19分子的NALM6克隆与CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞以1:1比率共培养，并且在Incucyte测定中测量肿瘤细胞杀伤。代表采用不同T细胞供体的三个实验。用重复测量方差分析进行统计分析。据观察，与传统的CD19-41BB-ζCAR相比，在含有4-1BB和CD3-ζ内结构域的CD19 CAR中包含CD28铰链和CD28 TMD导致针对具有低抗原密度的肿瘤的细胞溶解功能增强，类似于传统的CD19-CD28-ζCAR。据观察，与传统的CD19-41BB-ζCAR相比，在含有4-1BB和CD3-ζ内结构域的CD19 CAR中包含CD28铰链和CD28 TMD导致针对具有低抗原密度的肿瘤的功能增强，类似于传统的CD19-CD28-ζCAR。

进行了另外的实验，以说明含有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR只有当它们含有CD28铰链结构域时才展现出对低抗原密度的识别增强。如图2B中所示，将CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞与表达不同量CD19的NALM6克隆共培养24小时，并且通过ELISA测量上清液中的IL-2。代表采用不同T细胞供体的三个实验。通过学生t检验(双侧)在CD19-4-1BBζ与CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞之间进行统计比较。

实施例2

与CD19-CD8Hi-CD8TM-41BBz相比，CD19-CD28Hi-CD28TM-41BBz具有更好的功能

本实施例描述了进行的实验，以证明与CD19-CD8Hi-CD8TM-41BBz相比，CD19-CD28Hi-CD28TM-41BBz对于低抗原密度具有更好的CAR功能，如使用CD19-低白血病的体内模型确定的。

在这些实验中，如图3A中所示，通过尾静脉注射将100万个NALM6-CD^192,053细胞移植到NSG小鼠中。四天后，对小鼠注射300万个CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞。通过生物发光光度法测量肿瘤进展，并且使用Living Image软件计算通量值(每秒光子数)。示出了单独小鼠的量化肿瘤通量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图3B：如图3A中处理的小鼠的小鼠存活曲线。用对数秩检验进行统计分析。呈现于图3A-图3B中的结果代表采用不同T细胞供体的三个实验(每组n＝5只小鼠)。

实施例3

在天然抗原密度下，与CD19-CD8Hi-CD8TM-41BBz相比，CD19-CD28Hi-CD28TM- 41BBz赋予更好的功能

本实施例描述了进行的实验，以证明在正常(天然)抗原密度下，与CD19-CD8Hi-CD8TM-41BBz相比，CD19-CD28Hi-CD28TM-41BBz具有更好的功能，如通过体内应激测试模型确定的。

在这些实验中，如图4A中所示，通过尾静脉注射将100万个NALM6-野生型细胞移植到NSG小鼠中。三天后，对小鼠注射2.5×10⁵个CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞。通过生物发光光度法测量肿瘤进展，并且使用Living Image软件计算通量值(每秒光子数)。示出了单独小鼠的量化肿瘤通量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图4B：如(f)中处理的小鼠的小鼠存活曲线。用对数秩检验进行统计分析。呈现于图4A-图4B中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验(每组n＝5只小鼠)。

实施例4

与CD19-CD28Hi-CD28TM-28z相比，CD19-CD28Hi-CD28TM-41BBz赋予更好的增强的持久性，类似于CD19-CD8Hi-CD8TM-41BB

本实施例描述了进行的实验，以证明与CD19-CD28Hi-CD28TM-CD28z CAR相比，CD19-CD28Hi-CD28TM-41BBz赋予T细胞更好的持久性，如通过对来自体内Nalm6实验的骨髓和脾样品的流式细胞术确定的。

图5A-图5E示意性总结了为评估脾和骨髓组织中靶向CD19的CAR的持久性而进行的实验的结果。通过尾静脉注射将100万个NALM6野生型细胞移植到NSG小鼠中。三天后，对小鼠注射500万个CD19-CD28ζ、CD19-4-1BBζ或CD19-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞。在CAR T细胞处理后第+9、+16和+29天获得经处理小鼠(每组n＝5)的脾(图5A-图5C)和骨髓(图5D-图5E)。通过流式细胞术评估CAR阳性T细胞的存在。进行一次(每个时间点每个CAR构建体n＝5)。由Mann Whitney在指定组之间进行统计比较。对于体外实验，误差棒代表SD，而对于体内实验，误差棒代表SEM。p<0.05被认为具有统计学显著性，并且p值用星号表示如下：p>0.05，不显著，NS；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，和****p<0.0001。

实施例5

CD28Hi-CD28TM赋予若干种肿瘤模型和CAR架构增强的反应性

图6A-图6C示意性总结了为评估靶向Her2的CAR在各种肿瘤模型和CAR架构中的功能而进行的实验的结果。图6A是含有CD28铰链跨膜区和4-1BB共刺激结构域的Her2 CAR(Her2-CD28H/T-4-1BBζ)的示意图。图6B：将100万个143b骨肉瘤细胞原位植入NSG小鼠的后腿。七天后，将小鼠用1000万个Her2-4-1BBζCAR T细胞、Her2-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞或未经转导的对照T细胞(模拟)处理。每周用数显卡尺测量两次获得腿部测量值。示出单独小鼠的测量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图6C：如图6B中处理的小鼠的存活曲线：用对数秩检验进行统计分析。呈现于图6B-图6C中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验(每组n＝5只小鼠)。

图7A-图7D示意性总结了为评估靶向B7-H3的CAR在各种肿瘤模型和CAR架构中的功能而进行的实验的结果。图7A为含有CD28铰链跨膜区和4-1BB共刺激结构域的B7-H3 CAR(B7-H3-CD28H/T-4-1BBζ)的图解。图7B：在转移性神经母细胞瘤模型中，通过尾静脉注射将100万个CHLA255神经母细胞瘤细胞移植到NSG小鼠中。六天后，对小鼠注射1000万个B7-H3-4-1BBζCAR T细胞、B7-H3-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞或未经转导的对照T细胞(模拟)。通过生物发光光度法测量肿瘤进展，并且使用Living Image软件计算通量值(每秒光子数)。示出了代表性的生物发光图像。图7C：如图7B中处理的单独小鼠的量化肿瘤通量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图7D：如图7B中处理的小鼠的存活曲线。用对数秩检验进行统计分析。呈现于图7B-图7D中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验。对于体外实验，误差棒代表SD，而对于体内实验，误差棒代表SEM。p<0.05被认为具有统计学显著性，并且p值用星号表示如下：p>0.05，不显著，NS；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，和****p<0.0001。

实施例6

评估具有源自CD28或CD8α的铰链结构域和跨膜结构域的不同组合的CD19 CAR的功能

为了研究具有铰链结构域和TMD的不同组合的CD19 CAR的功能，已经设计并测试了四种另外的CD19 CAR(参见例如图9A-图9D)。每种新的CAR设计都含有源自抗人B细胞CD19抗体(克隆FMC63)的抗原结合部分、来自4-1BB的共刺激结构域、CD3-ζ结构域、以及源自CD28或CD8α的铰链结构域和TMD的不同组合。然后分析了四种靶向CD19的CAR设计的表达(图10A-图10B)。

编码具有所指示结构的CD19 CAR的逆转录病毒载体是商业合成的，并通过标准方法克隆。在瞬时转染逆转录病毒质粒后，在293GP细胞中产生病毒上清液。在用CD3/CD28珠激活后，用病毒上清液转导原代人T细胞。观察到不论铰链和跨膜结构域如何，上述所有四种CAR都以类似的方式在T细胞表面表达。用识别FMC63的抗独特型抗体检测CAR表达。

图11A-图11B总结了实验结果，表明CD28铰链结构域负责增强CAR功能，并进一步表明CD28Hi-CD8TM组合可以是更有效的形式。在图11A中描述的实验中，将具有所指示结构的CAR与表达渐增量的CD19的白血病系共培养24小时(每个克隆代表渐增量的CD19：z＝每个细胞大约1,000个分子；F＝每个细胞大约2,500；11＝每个细胞大约6,000个分子；6＝每个细胞大约40,000个分子)，并且测量了上清液中的IFN-γ。如图11A中所示，含有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR只有当它们含有CD28铰链结构域时才展现出对低抗原密度的识别增强。

在图11B中描述的实验中，将具有所指示结构的CAR与表达渐增量的CD19的白血病系共培养24小时(每个克隆代表渐增量的CD19：z＝每个细胞大约1,000个分子；F＝每个细胞大约2,500；11＝每个细胞大约6,000个分子；6＝每个细胞大约40,000个分子)，并且测量了上清液中的IL-2。含有4-1BB共刺激结构域的CD19 CAR只有当它们含有CD28铰链结构域时才展现出对低抗原密度的识别增强。

图12总结了实验结果，表明CD28铰链结构域负责增强对低抗原表达细胞的细胞杀伤功效。在这些实验中，将具有所指示结构的CD19 CAR与表达极低水平CD19(每个细胞大约1000个分子)的NALM6细胞共培养，并通过测量GFP(NALM6细胞表达GFP)在Incucyte中随时间测量剩余的肿瘤细胞。

实施例7

CD28铰链结构域增强CAR活性

本实施例描述了进行的实验，以证明CD28铰链-TMD导致更有效的受体簇集、T细胞激活和肿瘤细胞杀伤，尤其是在较低的靶标密度下如此。

如图13A-图13B中所总结，将CAR T细胞和NALM6细胞以低密度接种在微孔板上并扫描含有一个肿瘤细胞和一个CAR T细胞的孔。对两个不同的T细胞供体进行了6次实验。如图13A中所示，示出了来自单细胞微孔杀伤实验的代表性孔。将CAR T细胞和NALM6白血病细胞分别通过CellTrace Far Red(假色洋红色)和GFP(假色青色)标记进行区分。通过细胞不可渗透的碘化丙啶染料(PI，假色黄色)的流入来确定细胞死亡。裂解缀合物被定义为其中一个T细胞和一个NALM6细胞保持在阈值距离内并且NALM6细胞死亡(吸收PI)的事件。非裂解缀合物代表其中T细胞和肿瘤细胞相互作用但NALM6细胞没有死亡(不吸收PI)的缀合物。DIC：微分干涉相差，和Epi：落射荧光。如图13B中所示，在每个CAR构建体含有一个肿瘤细胞和一个T细胞的孔中测量从T细胞/肿瘤细胞相互作用到PI流入的时间。示出了来自所有6个实验(400-600个孔)的汇总数据。误差棒代表SD。用学生t检验(双侧)进行统计分析。如图13C中所示，在六个实验的每一个中测量导致T细胞死亡的非裂解缀合物(其中T细胞和肿瘤细胞相互作用但NALM6细胞没有死亡的缀合物)的分数。本实施例中描述的实验结果证明，CD28铰链/TM赋予CAR T细胞在靶标接合后更快杀伤的能力。

实施例8

评估在靶向Her2抗原的CAR背景中的CD28铰链的功能

本实施例描述了为在细胞杀伤测定中评估靶向人143b骨肉瘤细胞(Her2^低)中的Her2的CAR的功能而进行的实验。

在这些实验中，将100万个143b骨肉瘤细胞原位植入NSG小鼠的后腿。七天后，将小鼠用1000万个Her2-4-1BBζCAR T细胞、Her2-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞或未经转导的对照T细胞(模拟)处理。每周用数显卡尺测量两次获得腿部测量值。示出单独小鼠的测量值。用重复测量方差分析进行统计分析。图6C描绘了如图6B中处理的小鼠的存活曲线，其中用对数秩检验进行统计分析。呈现于图6B-图6C中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验(每组n＝5只小鼠。CD28铰链-TM结构域赋予CAR(包括识别Her2的那些)在体内杀伤肿瘤细胞的能力，而传统CAR架构无法杀伤这些肿瘤细胞)。

实施例9

评估在靶向B7-H3抗原的CAR背景中的CD28铰链的功能

本实施例描述了进行的实验，以证明源自CD28的铰链结构域可以增强靶向B7-H3抗原的CAR的功能。

在这些实验中，在Incucyte测定中，在针对神经母细胞瘤肿瘤系CHLA255的延长杀伤测定中，将传统的B7-H3-41BBz CAR T细胞(含有CD8铰链区)与含有CD28铰链结构域和4-1BBz内结构域的B7-H3 CAR T细胞进行比较。如图20A中所示，通过标准克隆技术产生了含有CD28铰链区和4-1BB共刺激结构域的B7-H3 CAR。

用B7-H3-4-1BBζCAR T细胞或B7-H3-CD28H/T-4-1BBζCAR转导T细胞。随后，将这些CAR T细胞与神经母细胞瘤肿瘤系CHLA255(用红色荧光蛋白转导)以1:4的效应物与肿瘤比率共培养，并在Incucyte中在延长杀伤测定中进行比较。在这些实验中，在转移性神经母细胞瘤模型中，通过尾静脉注射将100万个CHLA255神经母细胞瘤细胞移植到NSG小鼠中。六天后，对小鼠注射1000万个B7-H3-4-1BBζCAR T细胞、B7-H3-CD28H/T-4-1BBζCAR T细胞或未经转导的对照T细胞(模拟)。通过生物发光光度法测量肿瘤进展，并且使用Living Image软件计算通量值(每秒光子数)。示出了代表性的生物发光图像。如图7C中所示，如图7B中处理的单独小鼠的量化肿瘤通量值。用重复测量方差分析进行统计分析。如图7D中所示，如图7B中处理的小鼠的存活曲线。用对数秩检验进行统计分析。呈现于图7B-图7D中的结果代表采用不同T细胞供体的两个实验。对于体外实验，误差棒代表SD，而对于体内实验，误差棒代表SEM。p<0.05被认为具有统计学显著性，并且p值用星号表示如下：p>0.05，不显著，NS；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，和****p<0.0001。

如图7B-图7D中所示，含有CD28铰链结构域和4-1BB-ζ内结构域的B7-H3 CAR T细胞根除肿瘤细胞，导致小鼠存活率提高，而具有传统CD8铰链结构域和4-1BB-ζ内结构域的那些细胞则不然。

实施例10

含有CD28铰链-TM结构域的CAR在响应于抗原进行簇集和募集近侧信号传导分子方面更有效

本实施例描述了进行的实验，以证明源自CD28的铰链-跨膜结构域增强CAR T细胞免疫突触形成，从而提高了功效，尤其是在抗原密度有限的情况下如此。

图14A-图14F示意性地总结了为说明CD28铰链-TMD导致更有效的受体簇集、T细胞激活和肿瘤细胞杀伤而进行的另外的实验的结果。基于成像的CAR T细胞激活测定的图解示于图14A中。为了刺激CD19-CD28H/T-4-1BBζ和CD19-4-1BBζCAR T细胞，将CAR T细胞暴露于平面支持的脂质双层(SLB)，所述平面支持的脂质双层由通过生物素-链霉亲和素-生物素桥偶联的自由扩散性CD19蛋白功能化。配体-受体接合导致配体结合的受体重组织为微簇，这些微簇将酪氨酸激酶ZAP70(与GFP融合，在此图中未示出)从胞浆募集到质膜，并驱动微簇从外周向心易位至细胞中心。这些事件通过TIRF显微镜(荧光：CAR-mCherry、ZAP70-GFP、链霉亲和素-Alexa647)可视化。平面支持的脂质双层中的配体密度通过含有小单层囊泡(SUV)的生物素-PE的浓度进行控制。为了评估在显示一系列表达水平的细胞间的募集水平/簇集程度，使用分散指数(即归一化方差，它等于标准差除以每个细胞的荧光强度均值，详情参见方法)。图14B中示出，在图14C-图14I的实验中，在不同CD19密度下，对于每种CAR构建体，被募集到免疫突触的CAR分子的簇集程度(分散指数)。图14C示出用在含有高(约6.0个分子/μm2；顶部小图)和低(约0.6个分子/μm2；底部小图)浓度CD19的平面支持的脂质双层上激活的ZAP70-GFP转导的单个CD19-CD28H/T-4-1BBζ-mCherry(左小图)和CD19-CD8H/T-4-1BBζ-mCherry(右小图)CAR T细胞的代表性图像。图14D：在四种不同的CD19密度下，对于每种CAR构建体，被募集到免疫突触的ZAP70-GFP的簇集程度(分散指数)。图14E：来自图14D的汇集的ZAP70簇集程度(分散指数)数据，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。图14F示出激活的细胞(在阈值之上的ZAP70募集)百分比，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。图14G示出在四种不同的CD19密度下，对于每种CAR构建体，被募集到免疫突触的配体-受体复合物的簇集程度(分散指数)。图14H示出汇集的来自(h)的配体-受体复合物簇集程度(分散指数)数据，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。图14I示出募集配体-受体复合物的细胞(在阈值之上)的百分比，绘制为针对配体密度的剂量反应曲线。在图14A-图14I中呈现的结果(示为均值±SD)是来自用不同T细胞供体进行的两个实验中的一个实验的代表。每个条件n>100。用双尾t检验进行统计分析。p<0.05被认为具有统计学显著性，并且p值用星号表示如下：p>0.05，不显著，NS；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，和****p<0.0001。数据代表来自采用两个不同T细胞供体的一个实验。每个条件n>100。用学生t检验进行统计分析。

尽管已经公开了本公开文本的特定替代方案，但是应理解，各种修改和组合是可能的并且涵盖于所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。

序列表

<110> 里兰斯坦福初级大学理事会

<120> 通过铰链结构域增强多肽和嵌合抗原受体

<130> 078430-506001WO

<140> PCT/US2020/031728

<141> 2020-05-06

<150> US 62/844,683

<151> 2019-05-07

<160> 68

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 1的多肽

<400> 2

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 3

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 抗CD19 ScFv

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 4

<211> 735

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 3的多肽

<400> 4

Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Ala Cys

1 5 10 15

Ala Gly Ala Cys Thr Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr

20 25 30

Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala

50 55 60

Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala

65 70 75 80

Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Gly Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr

85 90 95

Thr Thr Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys

100 105 110

Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys

115 120 125

Thr Gly Thr Thr Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys

130 135 140

Thr Ala Cys Cys Ala Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Thr

145 150 155 160

Thr Ala Cys Ala Cys Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys

165 170 175

Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys

180 185 190

Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Ala Thr Thr Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr

210 215 220

Thr Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Ala Ala

225 230 235 240

Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Cys Thr Thr

245 250 255

Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly

260 265 270

Thr Ala Ala Thr Ala Cys Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Thr Ala Cys

275 280 285

Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala

290 295 300

Cys Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Ala Ala Cys

305 310 315 320

Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala

325 330 335

Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr

340 345 350

Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys

355 360 365

Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala

370 375 380

Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys

385 390 395 400

Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys

405 410 415

Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys

420 425 430

Gly Thr Cys Ala Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Thr Cys Thr

435 440 445

Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr Cys Thr Cys Ala Thr Thr Ala Cys Cys

450 455 460

Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Gly Cys

465 470 475 480

Thr Gly Gly Ala Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys

485 490 495

Cys Ala Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala

500 505 510

Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Ala Ala Thr Ala

515 520 525

Thr Gly Gly Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala

530 535 540

Cys Ala Thr Ala Cys Thr Ala Thr Ala Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys

545 550 555 560

Thr Cys Thr Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly

565 570 575

Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala

580 585 590

Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Gly Thr

595 600 605

Thr Thr Thr Cys Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys

610 615 620

Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly

625 630 635 640

Ala Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr Thr Thr Ala Cys Thr Ala

645 650 655

Cys Thr Gly Thr Gly Cys Cys Ala Ala Ala Cys Ala Thr Thr Ala Thr

660 665 670

Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Gly Cys Thr

675 680 685

Ala Thr Gly Cys Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly

690 695 700

Gly Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys Thr Cys Ala

705 710 715 720

Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala

725 730 735

<210> 5

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28铰链结构域

<400> 5

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 6

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 5的多肽

<400> 6

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 7

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28跨膜结构域

<400> 7

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 7的多肽

<400> 8

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact g 71

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 4-1BB

<400> 9

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 10

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 9的多肽

<400> 10

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD3-ζ

<400> 11

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 12

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 11的多肽

<400> 12

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 13

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽-抗CD19 ScFv-CD28铰链-CD28TM-41BB-ζ

<400> 13

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 14

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 13的多肽

<400> 14

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgaa acggggcaga 1020

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 1200

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1473

<210> 15

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽

<400> 15

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 16

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 15的多肽

<400> 16

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 17

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 抗CD19 ScFv

<400> 17

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 18

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 17的多肽

<400> 18

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggactaagt tggaaataac aggctccacc tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag 360

ggatccacca agggcgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 420

cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 480

tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 540

accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 600

agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 660

gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 720

gtcaccgtct cctca 735

<210> 19

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28铰链结构域

<400> 19

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 20

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 19的多肽

<400> 20

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 21

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD8跨膜结构域

<400> 21

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 22

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 21的多肽

<400> 22

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact g 71

<210> 23

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 4-1BB

<400> 23

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 24

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 23的多肽

<400> 24

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 25

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD3-ζ

<400> 25

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 26

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 25的多肽

<400> 26

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 27

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽-抗CD19 ScFv-CD28铰链-CD8TM-41BB-ζ

<400> 27

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 28

<211> 1463

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 27的多肽

<400> 28

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgaa acggggcaga aagaaactcc 1020

tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct 1080

gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca 1140

ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc 1200

taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg 1260

ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata 1320

agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc 1380

acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca 1440

tgcaggccct gccccctcgc taa 1463

<210> 29

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽

<400> 29

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 30

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 29的多肽

<400> 30

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 31

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 抗CD19 ScFv

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 32

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 31的多肽

<400> 32

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggactaagt tggaaataac aggctccacc tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag 360

ggatccacca agggcgaggt gaaactgcag gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca 420

cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc 480

tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa 540

accacatact ataattcagc tctcaaatcc agactgacca tcatcaagga caactccaag 600

agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg caaactgatg acacagccat ttactactgt 660

gccaaacatt attactacgg tggtagctat gctatggact actggggtca aggaacctca 720

gtcaccgtct cctca 735

<210> 33

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28铰链结构域

<400> 33

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 34

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 33的多肽

<400> 34

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 35

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28跨膜结构域

<400> 35

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 36

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 35的多肽

<400> 36

ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 37

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD3-ζ

<400> 37

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 38

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 37的多肽

<400> 38

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 39

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽-抗CD19 ScFv-CD28铰链-CD28TM-ζ

<400> 39

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

340 345 350

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

355 360 365

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

370 375 380

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

385 390 395 400

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

405 410 415

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

420 425 430

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

435 440 445

<210> 40

<211> 1347

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 39的多肽

<400> 40

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag agtgaagttc 1020

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1080

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1140

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1200

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1260

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1320

cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1347

<210> 41

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽

<400> 41

Met Ala Arg Ser Val Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Thr

1 5 10 15

Gly Leu Tyr Ala Ala

20

<210> 42

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 41的多肽

<400> 42

atggctcgct cggtgaccct ggtctttctg gtgcttgtct cactgaccgg tttgtatgct 60

gct 63

<210> 43

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 抗Her2 ScFv

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Val

115 120 125

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

130 135 140

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro

165 170 175

Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser

195 200 205

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly

210 215 220

Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 44

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 43的多肽

<400> 44

gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60

atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc ttgagtctgg agtcccttct 180

cgcttctctg gatctagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240

gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 300

ggtaccaagg tggagatcaa agggtctaca tctggatctg ggaagccggg ttctggtgag 360

ggttctggtg aggttcagct ggtggagtct ggcggtggcc tggtgcagcc agggggctca 420

ctccgtttgt cctgtgcagc ttctggcttc aacattaaag acacctatat acactgggtg 480

cgtcaggccc cgggtaaggg cctggaatgg gttgcaagga tttatcctac gaatggttat 540

actagatatg ccgatagcgt caagggccgt ttcactataa gcgcagacac atccaaaaac 600

acagcctacc tgcagatgaa cagcctgcgt gctgaggaca ctgccgtcta ttattgttct 660

agatggggag gggacggctt ctatgctatg gacgtgtggg gtcaaggaac cctggtcacc 720

gtctcctcg 729

<210> 45

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28铰链

<400> 45

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 46

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 45的多肽

<400> 46

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 47

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28跨膜结构域

<400> 47

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 48

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 47的多肽

<400> 48

ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 49

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 4-1BB

<400> 49

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 50

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 49的多肽

<400> 50

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 51

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD3-ζ

<400> 51

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 52

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 51的多肽

<400> 52

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 53

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽-抗Her2 ScFv-CD28铰链-CD28TM-41BB-ζ

<400> 53

Met Ala Arg Ser Val Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Thr

1 5 10 15

Gly Leu Tyr Ala Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Glu Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His

100 105 110

Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Gly

130 135 140

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

165 170 175

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

180 185 190

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

195 200 205

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr

260 265 270

Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His

275 280 285

Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser

290 295 300

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

305 310 315 320

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 54

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 53的多肽

<400> 54

atggctcgct cggtgaccct ggtctttctg gtgcttgtct cactgaccgg tttgtatgct 60

gctgatatcc agatgaccca gtccccgagc tccctgtccg cctctgtggg cgatagggtc 120

accatcacct gccgtgccag tcaggatgtg aatactgctg tagcctggta tcaacagaaa 180

ccaggaaaag ctccgaaact actgatttac tcggcatcct tccttgagtc tggagtccct 240

tctcgcttct ctggatctag atctgggacg gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag 300

ccggaagact tcgcaactta ttactgtcag caacattata ctactcctcc cacgttcgga 360

cagggtacca aggtggagat caaagggtct acatctggat ctgggaagcc gggttctggt 420

gagggttctg gtgaggttca gctggtggag tctggcggtg gcctggtgca gccagggggc 480

tcactccgtt tgtcctgtgc agcttctggc ttcaacatta aagacaccta tatacactgg 540

gtgcgtcagg ccccgggtaa gggcctggaa tgggttgcaa ggatttatcc tacgaatggt 600

tatactagat atgccgatag cgtcaagggc cgtttcacta taagcgcaga cacatccaaa 660

aacacagcct acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 720

tctagatggg gaggggacgg cttctatgct atggacgtgt ggggtcaagg aaccctggtc 780

accgtctcct cggcggccgc aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag 840

aagagcaatg gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt 900

cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg ggggagtcct ggcttgctat 960

agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga aacggggcag aaagaaactc 1020

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440

atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1464

<210> 55

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽

<400> 55

Met Val Ala Thr Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro

1 5 10 15

His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 56

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 55的多肽

<400> 56

atggttgcca ccctgctcgt gacaagcctg ctgctgtgcg agctgcccca ccctgccttt 60

ctgctgatcc cc 72

<210> 57

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 抗B7-H3 ScFv

<400> 57

Asp Thr Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr

180 185 190

Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala

245

<210> 58

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 57的多肽

<400> 58

gataccgagg tgcagctggt ggaatctggc ggcggactgg tgcagcctgg cggatctctg 60

agactgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcagct tcggaatgca ctgggtgcgc 120

caggcccctg gcaaaggact ggaatgggtg gcctacatca gcagcgacag cagcgccatc 180

tactacgccg acaccgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacagc 240

ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggac gaggacaccg ccgtgtacta ttgcggcaga 300

ggcagagaga acatctatta cggcagcaga ctggactact ggggccaggg cacaaccgtg 360

acagtgtcta gcggaggcgg aggatcaggc ggcggaggaa gtggcggagg gggatctgat 420

atccagctga cccagagccc cagcttcctg agcgcctctg tgggcgacag agtgaccatc 480

acatgcaagg ccagccagaa cgtggacacc aacgtggcct ggtatcagca gaagcccggc 540

aaggccccta aggccctgat ctacagcgcc agctaccggt acagcggcgt gcccagcaga 600

ttttctggca gcggctccgg caccgacttc accctgacaa tcagcagcct gcagcccgag 660

gacttcgcca cctactactg ccagcagtac aacaactacc ctttcacctt cggccagggg 720

accaagctgg aaatcaaagc ggccgca 747

<210> 59

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28铰链

<400> 59

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro

35

<210> 60

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 59的多肽

<400> 60

attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60

catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117

<210> 61

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD28跨膜结构域

<400> 61

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 62

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 61的多肽

<400> 62

ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt g 81

<210> 63

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 4-1BB

<400> 63

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 64

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 63的多肽

<400> 64

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 65

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> CD3-ζ

<400> 65

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 66

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 65的多肽

<400> 66

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 67

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 信号肽-抗B7-H3 ScFv-CD28铰链-CD28TM-41BB-ζ

<400> 67

Met Val Ala Thr Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro

1 5 10 15

His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Thr Glu Val Gln Leu Val Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

35 40 45

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg

50 55 60

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Asp

65 70 75 80

Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

100 105 110

Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Arg Glu Asn

115 120 125

Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

130 135 140

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala

165 170 175

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val

180 185 190

Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

195 200 205

Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg

210 215 220

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

225 230 235 240

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn

245 250 255

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala

260 265 270

Ala Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn

275 280 285

Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys

290 295 300

Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val

305 310 315 320

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

325 330 335

Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

340 345 350

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

355 360 365

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

370 375 380

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

385 390 395 400

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

405 410 415

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

420 425 430

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

435 440 445

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

450 455 460

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

465 470 475 480

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490 495

<210> 68

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<220>

<221> 尚未归类的特征

<223> 编码SEQ ID NO: 67的多肽

<400> 68

atggttgcca ccctgctcgt gacaagcctg ctgctgtgcg agctgcccca ccctgccttt 60

ctgctgatcc ccgataccga ggtgcagctg gtggaatctg gcggcggact ggtgcagcct 120

ggcggatctc tgagactgag ctgtgccgcc agcggcttca ccttcagcag cttcggaatg 180

cactgggtgc gccaggcccc tggcaaagga ctggaatggg tggcctacat cagcagcgac 240

agcagcgcca tctactacgc cgacaccgtg aagggccggt tcaccatctc ccgggacaac 300

gccaagaaca gcctgtacct gcagatgaac tccctgcggg acgaggacac cgccgtgtac 360

tattgcggca gaggcagaga gaacatctat tacggcagca gactggacta ctggggccag 420

ggcacaaccg tgacagtgtc tagcggaggc ggaggatcag gcggcggagg aagtggcgga 480

gggggatctg atatccagct gacccagagc cccagcttcc tgagcgcctc tgtgggcgac 540

agagtgacca tcacatgcaa ggccagccag aacgtggaca ccaacgtggc ctggtatcag 600

cagaagcccg gcaaggcccc taaggccctg atctacagcg ccagctaccg gtacagcggc 660

gtgcccagca gattttctgg cagcggctcc ggcaccgact tcaccctgac aatcagcagc 720

ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagt acaacaacta ccctttcacc 780

ttcggccagg ggaccaagct ggaaatcaaa gcggccgcag cggccgcaat tgaagttatg 840

tatcctcctc cttacctaga caatgagaag agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg 900

aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg 960

gtggttgggg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1020

tgggtgaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1080

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1140

ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1200

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Claims

1.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽包含：

包含能够结合抗原的细胞外结构域(ECD)的第一多肽区段；

包含源自CD28的铰链结构域的第二多肽区段；

包含跨膜结构域(TMD)的第三多肽区段；以及

任选的包含含有一个或多个共刺激结构域的细胞内信号传导结构域(ICD)的第四多肽区段，其中所述一个或多个共刺激结构域不是来自CD28。

2.根据权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述ICD还包括CD3ζICD。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽是嵌合抗原受体(CAR)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原选自磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、IL-13-受体α1、IL-13-受体α2、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙视网膜蛋白、MUC-1、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、CD34、CD45、CD123、CD93、CD99、CD117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巨囊性病液体蛋白(GCDFP-15)、ALK、DLK1、FAP、NY-ESO、WT1、HMB-45抗原、蛋白质黑色素-A(T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、CD19、CD20、CD5、CD7、CD3、TRBC1、TRBC2、BCMA、CD38、CD123、CD93、CD34、CD1a、SLAMF7/CS1、FLT3、CD33、CD123、TALLA-1、CSPG4、DLL3、IgGκ轻链、IgAλ轻链、CD16/FcγRIII、CD64、FITC、CD27、CD30、CD70、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、EGFR及其同种变体、TEM-8、精子蛋白17(Sp17)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、prostein、NKG2D、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺六次跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(CD61)、催乳素、K-Ras(V-Ki-ras2柯尔斯顿大鼠肉瘤病毒癌基因)和Ral-B。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原以低密度表达。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原是磷脂酰肌醇蛋白聚糖2(GPC2)、人表皮生长因子受体2(Her2/neu)、CD276(B7-H3)或IL-13-受体α。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合多肽，其中所述共刺激结构域选自共刺激4-1BB(CD137)多肽序列、共刺激CD27多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激诱导型T细胞共刺激(ICOS)多肽序列和CD2共刺激结构域。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合多肽，其中所述共刺激结构域包含共刺激4-1BB(CD137)多肽序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的嵌合多肽，其中所述TMD源自CD28 TMD、CD8αTMD、CD3 TMD、CD4 TMD、CTLA4 TMD和PD-1TMD。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：

能够结合CD19抗原的ECD；

源自CD28的铰链结构域；

源自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；

包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；和

CD3ζ结构域。

12.根据权利要求11所述的嵌合多肽，其中所述TMD源自CD8。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：

能够结合CD19抗原的ECD；

源自CD28的铰链结构域；

源自CD8的TMD；和

CD3ζ结构域。

14.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：

能够结合HER2抗原的ECD；

源自CD28的铰链结构域；

源自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；

包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；和

CD3ζ结构域。

15.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：

能够结合GPC2抗原的ECD；

来自CD28的铰链结构域；

来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；

包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；和

CD3ζ结构域。

16.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽在N末端至C末端的方向上包含：

能够结合B7-H3抗原的ECD；

来自CD28的铰链结构域；

来自CD8、CD28、CD3、CD4、CTLA4或PD-1的TMD；

包含来自4-1BB的共刺激结构域的ICD；和

CD3ζ结构域。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

18.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含编码根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽的核酸序列。

19.根据权利要求18所述的重组核酸分子，其中所述核酸序列与选自SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:68的核酸序列具有至少80％序列同一性。

20.根据权利要求18至19中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子与异源核酸序列可操作地连接。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子进一步被限定为载体中的表达盒。

22.根据权利要求21所述的核酸分子，其中所述载体是质粒载体或病毒载体。

23.根据权利要求22所述的核酸分子，其中所述病毒载体源自慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒或逆转录病毒。

24.一种重组细胞，所述重组细胞包含：

根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽；和/或

根据权利要求18至23中任一项所述的核酸分子。

25.根据权利要求24所述的重组细胞，其中所述重组细胞是真核细胞。

26.根据权利要求24至25中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞是免疫系统细胞。

27.根据权利要求26所述的重组细胞，其中所述免疫系统细胞是T淋巴细胞。

28.一种制备重组细胞的方法，所述方法包括：

a)提供能够表达蛋白质的宿主细胞；并且

b)用根据权利要求18至23中任一项所述的重组核酸转导所提供的宿主细胞以产生重组细胞。

29.通过根据权利要求28所述的方法产生的重组细胞。

30.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含至少一种根据权利要求24至27中任一项所述的重组细胞和培养基。

31.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体以及：

a)根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽；

b)根据权利要求18至23中任一项所述的核酸分子；和/或

c)根据权利要求24-27和29中任一项所述的重组细胞。

32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据权利要求18至23中任一项所述的重组核酸、药学上可接受的载体。

33.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。

34.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述组合物包含根据权利要求24-27和29中任一项所述的重组细胞、药学上可接受的载体。

35.一种在有需要的受试者中预防和/或治疗病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，所述组合物包含：

a)根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽；

b)根据权利要求18至23中任一项所述的核酸分子；

c)根据权利要求24-27和29中任一项所述的重组细胞；和/或

d)根据权利要求31至34中任一项所述的药物组合物。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述病症是癌症。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、尿路上皮癌、肝癌、头颈癌、肉瘤、宫颈癌、胃癌、胃部癌症、黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤、胆管癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和胶质母细胞瘤。

38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所施用的组合物赋予所述受试者增加的干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素-2(IL-2)的产生。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所施用的组合物抑制所述受试者中癌症的肿瘤生长或转移。

40.根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中将所述组合物单独作为第一疗法或与第二疗法组合施用于所述受试者。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第二疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。

42.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法相伴施用。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法与所述第二疗法同时施用。

44.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法依序施用。

45.根据权利要求44所述的方法，其中在所述第二疗法之前施用所述第一疗法。

46.根据权利要求44所述的方法，其中在所述第二疗法之后施用所述第一疗法。

47.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中在所述第二疗法之前和/或之后施用所述第一疗法。

48.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法轮流施用。

49.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中将所述第一疗法和所述第二疗法以单一配制品一起施用。

50.一种用于在有需要的受试者中诊断、预防和/或治疗病症的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽；

b)根据权利要求18至23中任一项所述的核酸分子；

c)根据权利要求24-27和29中任一项所述的重组细胞；和/或

d)根据权利要求31至34中任一项所述的药物组合物。