CN115103857A - 表达免疫调节分子的细胞和表达免疫调节分子的系统 - Google Patents

表达免疫调节分子的细胞和表达免疫调节分子的系统 Download PDF

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Abstract

本文公开免疫细胞(白泽超级细胞,BS‑Cell)，其已被工程改造成表达包含胞外标记结构域的免疫细胞激活剂多肽并将该多肽纳入细胞膜表面中。还公开了经工程改造以分泌一种或多种多肽效应分子的免疫细胞，以及经工程改造以表达两种分子的免疫细胞。公开了用于在免疫细胞中表达这些分子的核酸载体。还公开了可用于将表达免疫细胞激活剂多肽的免疫细胞特异性结合至另一细胞的双特异性多肽。还公开了同时包括免疫细胞和各种双特异性多肽的系统，可以结合至相同或不同靶细胞的不同细胞表面蛋白，例如，可用于体内扩增免疫细胞和治疗各种肿瘤。

Description

表达免疫调节分子的细胞和表达免疫调节分子的系统
技术领域
本文公开的主题涉及表达免疫系统调节蛋白或其他效应物多肽，嵌合免疫细胞激活剂多肽(ICAP)的细胞，本文称“白泽超级细胞”，以及涉及用于控制这些蛋白质和多肽在这些细胞中表达的系统。这样的系统可以包括具有双特异性结合活性的多肽，因此可以在与多肽靶结构域结合后激活带有表达免疫系统调节蛋白或其他有效多肽的载体的细胞。
背景技术
带有嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR-T细胞)正在开发为癌症治疗的免疫治疗方式。通常，CAR包括结合激活配体的细胞外结构域，参与与“靶”细胞形成免疫突触的跨膜结构域和通过激活T细胞相关转录应答而响应细胞外结构域结合的细胞内结构域。
当前的基于CAR-T细胞的疗法由于在CAR中具有单个TAA(肿瘤相关抗原)识别性胞外结构域，因此对于具有异质TAA表达或新出现的抗原丢失的变体的肿瘤无效。
当前基于CAR-T细胞的疗法依赖于患者治疗之前的体外CAR-T细胞的增殖。
此外，没有简单的方法可用于体内监测CAR-T细胞分布和命运。
在没有任何控制活化的CAR-T细胞活性的方法或清除不需要的CAR-T细胞的方法的情况下，其他CAR-T细胞持续不断且不受控地响应抗原进行增殖和活化，可能导致致命的脱靶毒性，细胞因子释放综合征或神经毒性。
大多数CAR胞外抗原识别结构域是scFv蛋白，两个scFv结构域可以形成非共价连接的二聚体，例如通过结构域交换。相邻的scFv域之间的这种类型的相互作用会大大增强CAR-T细胞中的强直(tonic)信号传导，从而导致无法控制的活性。
发明内容
本文公开免疫细胞，其已被改造成表达免疫细胞激活剂多肽(ICAP)并将该多肽纳入细胞膜表面中。还公开了经工程改造以分泌一种或多种多肽效应分子的免疫细胞，以及经工程改造以表达两种分子的免疫细胞。
因此，在本公开的一个方面，提供了一种免疫细胞，其包含核酸载体(或第一核酸载体)，所述核酸载体包含
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(c)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域。
这样的免疫细胞可以是进一步包含第二核酸载体的细胞，所述第二核酸载体包含
(d)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(e)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；和
(f)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域。
或者，工程改造的免疫细胞可以是这样的免疫细胞，其中第一核酸载体还包含编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸。
本公开的另一方面涉及免疫细胞激活剂多肽，其包含：
(a)标记结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)信号转导结构域。
本公开的另一方面是核酸载体，其包含
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(c)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域。
本公开的另一方面是核酸载体，其包含
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸。
(c)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域。
本公开的另一方面是双特异性多肽，其是一个靶向目标细胞和控制免疫细胞的纳米抗体(VHH-TCP)，包括：
(a)标记结合域(L-bd)，该结构域包含与免疫细胞激活剂多肽的标记结构域特异性结合的单链多肽结构域；和
(b)细胞表面蛋白结合域(CSP-bd)，该结构域包含特异性结合至细胞的细胞表面受体的单链多肽结构域。
本公开还描述了用于在靶细胞附近原位产生一种或多种多肽效应分子的试剂盒，包括：
I.包含核酸载体的免疫细胞，所述核酸载体包含
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸，所述多肽包含信号转导结构域、跨膜结构域和标记结构域；和
(c)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域，和
第二核酸载体，包含
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；
(c)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
和
II.双特异性多肽，包含：
(a)标记结合域(L-bd)，该标记结合域包含与免疫细胞激活剂多肽的标记结构域特异性结合的单链多肽结构域；和
(b)细胞表面蛋白结合域(CSP-bd)，该结构域包含特异性结合至细胞的细胞表面受体的单链多肽结构域。
或者，工程改造的免疫细胞可以是这样的免疫细胞，其中第一核酸载体还包含编码分泌的效应多肽的氨基酸序列的多核苷酸。在这样的实施方式中，分泌的效应多核苷酸可以在第二表达盒中编码。此类试剂盒还包含双特异性多肽，该双特异性多肽是一个靶向和控制的纳米抗体多肽(VHH-TCP)，包括：
(a)标记结合域(L-bd)，该标记结合域包含与免疫细胞激活剂多肽的标记结构域特异性结合的单链多肽结构域；和
(b)细胞表面蛋白结合域(CSP-bd)，该结构域包含结合至细胞的细胞表面受体的单链多肽结构域。
本公开还提供在对象的肿瘤细胞的位置处调节免疫系统环境的方法，该方法包括：
(a)向对象给予有效量的工程改造的免疫细胞，其包含第一核酸载体，该第一核酸载体包含：
(i)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(ii)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(iii)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域。
并且进一步包含第二核酸载体，该第二核酸载体包含
(i)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(ii)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；和
(iii)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
(b)同时或顺序给予对象有效量的第一双特异性多肽，所述多肽包括：
(i)标记结合域(L-bd)，该标记结合域包含与免疫细胞激活剂多肽的标记结构域特异性结合的单链多肽结构域；和
(ii)细胞表面蛋白结合域(CSP-bd)，该结构域包含特异性结合至淋巴细胞的细胞表面蛋白的单链多肽结构域。
(c)向对象给予有效量的第二双特异性多肽，该多肽包括：
(i)标记结合域(L-bd)，该标记结合域包含与免疫细胞激活剂多肽的标记结构域特异性结合的单链多肽结构域；和
(ii)细胞表面蛋白结合域(CSP-bd)，该结构域包含特异性结合至肿瘤细胞的细胞表面蛋白的单链多肽结构域。
可以在步骤b和c之间执行测量对象中工程改造的免疫细胞数量的步骤。
在对象的肿瘤细胞的位置处调节免疫系统环境的方法可替代地包括：
(a)在体外增殖所述对象的转化的T细胞，其中所述T细胞包含第一核酸载体，所述第一核酸载体包含核酸载体，所述核酸载体包含：
(i)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(ii)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(iii)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
并且包含第二核酸载体，该第二核酸载体包含
(i)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(ii)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；和
(iii)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
以获得增殖的T细胞；并将增殖的T细胞给予对象；和
(b)向对象给予有效量以激活增殖的T细胞，从而表达分泌的多肽效应分子VHH-TCP，该VHH-TCP包含CSP-bd和具有确定氨基酸序列的L-bd，该L-bd与由所述增殖的T细胞表达的标记结构域特异性结合，该CSP-bd与肿瘤细胞的细胞表面蛋白特异性结合。
附图简述
尽管说明书总结于权利要求书，权利要求书特别指出并清楚地要求保护本文描述的主题，但是相信通过结合附图对某些示例的以下描述可以更好地理解该主题，其中，相同的附图标记表示相同的元素，其中：
图1描绘了本文所述的示例性效应细胞，例如“白泽超级细胞”，其显示了免疫细胞激活剂多肽的表达并分泌了免疫调节效应分子；示出了抗PD1-VHH纳米抗体。
图2描述了纳米抗体靶向和控制多肽(VHH-TCP)；示出了与免疫细胞激活剂蛋白的标记结构域(标记-VHH)和细胞的细胞表面蛋白(此处是B细胞的CD19配体(CD19-VHH))结合的结构域。还显示了用于激活Fc介导的免疫反应(hFc-VHH)，FITC荧光团(FITC-VHH)结合以及与血清白蛋白(白蛋白-VHH)结合的其他结构域。
图3A和3B描绘示例性表达载体图，用于在免疫细胞类宿主细胞中表达ICAP和效应蛋白。在图3A中，效应蛋白抗PD-1-VHH–Fc(EQ)由载体pS338B-1182-Fc(EQ)中的表达构建体中的结构基因表达。在图3B中，由表达构建体pNB338B-ICAPs-VHH中的结构基因表达具有标记多肽结构域，CD8铰链结构域，CD28跨膜(TM)结构域和CD28细胞内信号传导结构域和CD3z结构域的ICAP。
图4A描绘M 2339(VHH)对间皮素(MSLN)的流动结合亲和力。图4B显示B029(VHH)对BCMA的流动结合亲和力。图4C显示了E454(VHH)对EGFR的流动结合亲和力。
图5显示了通过表面等离子共振(SPR)测定的M2339 VHH-6his与不同间皮素ECD结构域的结合动力学。
图6显示了各种M-ICAP(源自间皮素II+III区)载体的图。19R73是经典CD19CAR-T(阳性对照)的版本，其他的是M-ICAP载体。这些载体的胞内区域相同，均含有4-BB和CD3ζ，但是胞外区域不同。M-ICAP不含有6-His标签。His-1/2-M-ICAP：6-His标签位于M-ICAP的N端或C端。SP3-His-M-ICAP和SP5His-M-ICAP：信号肽为SP3或SP5，选自人类蛋白质数据库。SP3(信号肽3)：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO:1)；SP5(信号肽5)：MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:2)。
图7显示了转染到293T细胞中的M-ICAP载体的FACS结果。图7A显示了不同M-ICAP载体转染293T细胞的阳性率。图7B显示了FACS结果的点图。
图8说明了M-ICAP表达和M-ICAP-T细胞构建。图8A是M-ICAP-T细胞构建的示意图。图8B提供了M-ICAP、SP3-M-ICAP和SP5-M-ICAP表达载体的示意图。图8C和8D呈现转染后8和13天M-ICAP、SP3-M-ICAP和SP5-M-ICAP T细胞的阳性率数据(图8C：分别被M2339+抗CD28或抗His+抗CD28激活；图8D：由M2339+抗CD28激活)。缩写：M-ICAP——来自间皮素II+III的肽来源；SP-间皮素——间皮素的内源信号肽；SP3(信号肽3)：MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ IDNO:1)；SP5(信号肽5)：MTRLTVLALLAGLLASSRA(SEQ ID NO:2)；M2339，抗M-ICAP——VHH-Fc克隆M2339；抗CD28——抗CD28单克隆抗体；抗His——抗His mAb。
图9显示了ICAP-T细胞的代表性制备和质量验证。图9A提供了M-ICAP、M-ICAP-28、M-ICAP-28BB表达载体的示意图。图9B显示了通过不同TCP或抗体激活获得的ICAP-T扩增(来自外周血单核细胞，PBMC)的比较。图9C显示了在从PBMC制备ICAP-T细胞期间的扩增。图9D显示了ICAP-T细胞产物的ICAP阳性比例。图9E显示了ICAP-T细胞产物的CD3阳性细胞中CD4/CD8阳性比例。图9F显示了ICAP-T细胞产物的Tm细胞中Tem/Tcm阳性比例。
图10显示了通过FACS测量的BCMA-TCP的结合亲和力。图10A显示了三种BCMA-TCP与MSLN过表达细胞系的细胞的FACS结合曲线。图10B显示了三种BCMA-TCP与BCMA过表达细胞系的细胞的FACS结合曲线。
图11显示了抗BCMA TCP的血浆稳定性。
图12显示了经FACS测量的TCP011-P对两种不同细胞类型的结合亲和力。图12A显示了TCP011-P与CD19过表达细胞系的细胞的FACS结合曲线。图12B显示了TCP011-P与MSLN过表达细胞系的细胞的FACS结合曲线。
图13显示了通过FACS测量的TCP021-P对两种不同细胞类型的结合亲和力。图13A显示TCP021-P与EGFR过表达细胞的FACS结合曲线。图13B显示了TCP021-P与MSLN过表达细胞的FACS结合曲线。
图14显示了M-ICAP-T与TCP对靶细胞的体外扩增。图14A和14B显示了M-ICAP转染的T和Daudi细胞与TCP共培养4天后的T/Daudi细胞计数。图14C和14D显示了M-ICAP转染的T和丝裂霉素C(MMC)处理的Daudi细胞与TCP共培养4天后的T/Daudi细胞计数。
图15显示了M-ICAP-T对RPMI-8226细胞的TCP剂量依赖性细胞毒性作用。图15A显示了悬浮细胞裂解细胞测定的示意图。图15B显示了M-ICAP-T的TCP001-C与RPMI-8226细胞在三种不同E:T比率下的剂量依赖性细胞裂解释放率。图15C-15E显示不同E:T比率的细胞裂解分析曲线。
图16比较了与不同TCP组合的ICAP/CAR-T对RPMI-8226/L363细胞的细胞毒性和IFNγ分泌。图16A和16B比较了与不同TCP组合的ICAP/CAR-T细胞在0.5(A)或0.2(B)ug/ml浓度下对L363细胞的细胞毒作用。图16C和16D显示了与不同TCP组合的ICAP/CAR-T对RPMI-8226(C)或L363(D)细胞的IFNγ分泌。
图17显示与TCP(结合EGFR)组合的ICAP对FaDu/SK-OV3细胞的细胞裂解作用。图17A显示了组合不同TCP的ICAP/CAR-T细胞对FaDu细胞的细胞裂解。图17B显示了组合不同TCP的ICAP/CAR-T细胞对SK-OV3细胞的细胞裂解。
图18显示了具有TCP的ICAP-T细胞对Daudi细胞的IFN-γ释放和细胞裂解作用。图18A显示了具有不同TCP的ICAP/CAR-T细胞在Daudi细胞上的IFN-γ释放。图18B显示了组合不同TCP的ICAP/CAR-T细胞对Daudi细胞的细胞裂解。
图19显示了M-ICAP-T具有分泌抗体的能力，且阳性率不受影响。图19A显示了分泌型M-ICAP-T细胞的阳性率比较。人幼稚T细胞同时转染M3 CAR和分泌型抗体(如抗PD-1、抗TGFβ和抗PD-L1)的质粒。13天后，四个实验组之间差异很小，阳性率约为60-70％。M-ICAP-T细胞也较好地分泌了抗PD-1、抗TGFβ和抗PD-L1抗体。这些数据表明，抗体分泌的类型和水平对M-ICAP-T细胞的阳性转化影响不大。从M-ICAP-T细胞都可以很好地分泌VHH或scFv并通过ELISA检测。
图20显示抗PD-1-M-ICAP-T可以分泌抗PD-1 VHH来阻断表面PD-1蛋白。用5ug/mlM2339-IgG4或IgG4对照刺激细胞48小时。商购PD-1mAb仅阻断抗PD-1 VHH M-ICAP-T细胞组的表面PD1检测。
图21显示了由M-ICAP-T分泌的抗TGFβscFv与TGFβRII结合。TGFβ配体与TGFβRII结合并刺激荧光素酶信号。M-ICAP-T细胞分泌的抗TGFβscFv也可以与293T细胞上的TGFβRII结合并阻断荧光素酶报告基因的表达。CAR-T-10C、10B和01A是由不同供体制备的抗TGFβM-ICAP-T细胞。
图22显示了在M-ICAP-T细胞与TCP001-C组合的体内功效测试中，NPSG小鼠中L363-PDL1原位肿瘤的体重变化。
图23显示了在M-ICAP-T细胞与TCP001-C组合的体内功效测试中，NPSG小鼠中L363-PDL1原位肿瘤的肿瘤体积变化。
图24显示了小鼠全血中抗PD-1VHH和TCP001-C浓度的分析。图24A显示了血清抗PD-1 VHH水平的分析。图24B显示了血清TCP001-C水平的分析。缩写：D15-24h，D15尾静脉出血，第14天注射TCP001-C后24h；D22-48h，D22尾静脉出血，第20天注射TCP001-C后48h。
所示的每个载体中的启动子是EF1a启动子，并且SV40聚腺苷酸化信号在两个载体中用于转录终止。所述表达构建体均包含5'和3'ITR序列。
图25显示了FACS分析的抗MSLN-1444 VHH(1444(VHH))在HEK293T-MSLN细胞上的结合。
图26显示了融合多肽BCMA ICAP BCMAmutl与抗MSLN-1444 VHH的表达。
图27显示了BCMA ICAP BCMAmut1与不同抗BCMA VHH结合的SPR动力学。
图28显示了BCMAmutl-MSLN-1444 CAR-T的体外活化和扩增。图28A显示BCMAmut1-MSLN-1444载体的示意图；图28B，用抗BCMAmut1 VHH 36#或抗MSLN刺激的BCMAmut1-MSLN-1444 CAR-T在供体1中的扩增；和图28C，用抗BCMAmut1 VHH 36#或抗MSLN刺激的BCMAmut1-MSLN-1444 CAR T在供体2中的扩增。
图29显示了在2个供体中用抗-BCMAmut1 VHH 36#或抗-MSLN刺激的BCMAmut1-MSLN-1444 CAR-T扩增的FACS结果的点图。
图30显示了MSLN-1444 CAR-T的抗BCMAmuc1 VHH 36#特异性活化和扩增。图30A显示了MSLN-1444载体的示意图。图30B显示了用抗BCMAmuc1 VHH 36#或抗原MSLN刺激的MSLN-1444 CAR T在供体1中的扩增。图30C显示了用抗BCMAmuc1 VHH 36#或抗MSLN刺激的MSLN-1444 CAR T在供体2中的扩增。
具体实施方式
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗技术属于癌症免疫细胞治疗领域。CAR-T技术使用基因工程技术，用T淋巴细胞免疫受体的细胞内区域剪接例如包含编码抗体的CDR部分的至少一部分基因的抗体可变区基因序列，然后通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转染将剪接构建体引入T细胞。表达盒或mRNA转导到淋巴细胞中，并在细胞表面表达融合蛋白，使T淋巴细胞能够以非MHC限制的方式识别特异性抗原，提高其识别并杀死肿瘤的能力。
嵌合抗原受体(CAR)的结构是由以色列的Eshhar研究小组于1989年提出的。此后，已证实具有CAR结构化的细胞表面蛋白的T细胞在肿瘤免疫治疗中具有良好效果。
第一代CAR受体包含单链可变片段(scFv)，并且细胞内激活信号通过CD3ζ(CD3z)信号链传输。但是，第一代CAR受体缺乏提供T细胞共刺激信号的结构域，这导致CAR-T细胞仅发挥瞬时作用，在体内细胞的存活时间短，细胞因子分泌少。第二代CAR受体引入了共刺激信号传导分子的胞内结构域，包括例如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)，可诱导性T细胞共刺激物(ICOS)，DNAX激活蛋白10(DAP10)和其他结构域来增强T细胞增殖和细胞因子分泌。IL-2，IFN-γ和GM-CSF产量增加，从而破坏了所述肿瘤微环境的免疫抑制，例如AICD(激活诱导的细胞死亡(AICD))。
第三代CAR受体在共刺激结构CD28和ITAM信号链之间重组次级共刺激分子，例如4-1BB，从而产生三信号CAR受体。
工程改造的CAR-T细胞在体内具有更好的效应功能和存活时间。目前，治疗中常用的CAR结构是第二代CAR受体，其结构可分为以下四个部分：抗体单链可变区(scFv)，铰链区，跨膜区和细胞内刺激信号传导多肽。CAR的铰链区结构有助于形成正确的构象并形成二聚体。铰链区的长度和氨基酸序列特征有助于确定CAR的空间构象，并且还影响CAR结合肿瘤细胞表面抗原的能力。
恶性淋巴瘤分为两类：霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤的10％-15％，而非霍奇金淋巴瘤是发病患者中生长最快的恶性肿瘤。根据世界卫生组织的统计，目前全世界每年约有35万新NHL患者，死亡人数超过20万人。在霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中均可见到B细胞淋巴瘤。当前，淋巴瘤的临床治疗方法包括细胞毒性药物(如糖皮质激素和烷化剂)以及基于特定分子靶标的靶向药物(如利妥昔单抗等)，其中基于靶向药物的联合化疗可显著改善患者的响应、临床缓解率和治愈率。但是，仍有大量的淋巴瘤患者对之不敏感或疗效较差，是“真正的”难治性患者。一些新的治疗方法(例如细胞免疫疗法)已缓解并延长了部分复发或难治性淋巴瘤患者的生存期。目前针对血液系统恶性肿瘤开发的CAR-T种类很多，包括使用抗CD19，抗CD20，抗κ轻链，抗CD22，抗CD23，抗CD30，抗CD70和其他抗体构建CAR修饰的T细胞的疗法。已经进行了抗肿瘤研究，其中抗CD19和抗CD20单克隆抗体是最常用的抗体。
选择正确的肿瘤抗原作为靶标是设计安全有效的CAR-T细胞的关键。由于CD19仅在正常和恶性B细胞中于分化的各个阶段表达，而在其他非B细胞(例如造血干细胞)中则不表达，因此它是治疗B谱系肿瘤的潜在靶标和CAR-T研究中的热点。因此，CD19CAR-T被广泛用于恶性肿瘤，例如急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，NHL和多发性骨髓瘤(MM)。CD19CAR-T已用于B细胞淋巴瘤的临床试验治疗。
PD-1(程序性死亡1，程序性细胞死亡受体1)是调节性T细胞CD28家族的成员，属于免疫球蛋白受体超家族。PD-1及其配体PD-L1/PD-L2在T细胞的共抑制和衰竭中起重要作用。它们的相互作用抑制了共刺激性T细胞的增殖和细胞因子的分泌。抗凋亡分子BCL-x1的表达削弱了肿瘤特异性T细胞的功能，导致一些肿瘤患者无法完全消除肿瘤。抗PD-1抗体与配体PD-L1/PD-L2竞争结合肿瘤特异性T细胞表面的PD-1分子，从而抑制PD-1和PD-L1/PD-L2的复合。这继而克服了由PD-L1/PD-L2引起的PD-1复合所引起的免疫微环境抑制。
当前商业化的抗PD-1抗体是纳武单抗(nivolumab)和皮地利珠单抗(pidilizumab)。这两种单克隆抗体已显示在实体瘤如黑色素瘤，结肠癌，前列腺癌，非小细胞肺癌和肾细胞癌中具有良好的临床疗效。最近的临床研究证实，PD-1抗体可用于淋巴瘤治疗。然而，抗PD-1抗体在临床应用中仍然存在一些不可避免的问题。一方面，由于抗PD-1单克隆抗体是静脉内给药，因此大多数接受PD-1抗体阻断的患者将有不同程度的药物给药副作用。而且，抗PD-1单克隆抗体的体外生产涉及复杂的生产准备和纯化过程，非常昂贵并导致治疗费用高昂。
综上所述，CAR-T细胞具有杀死肿瘤细胞的能力，可以有效进入肿瘤组织，但在肿瘤微环境中其活性很容易被抑制；PD-1抗体可重新激活T细胞的抗肿瘤活性。但是，常规的大分子抗体或其大片段对实体瘤的穿透力不足，全身性药物具有较大的毒副作用，且药物成本高。
因此，本文公开了针对该问题的解决方案，其中可以通过维持带有CAR的免疫细胞(例如CAR-T细胞)的杀伤毒性来高效地表达抗PD-1抗体，并且带有CAR的细胞在肿瘤中或附近以高水平表达PD-1抗体。预期该活性将增加带有CAR的细胞的杀肿瘤功效，同时还降低治疗成本。
当前公开的是一种系统，其具有与CAR-T相似的一些特征，但是具有更普遍的性质。而且，通过将具有双特异性结合活性的细胞外(可能是合成的且不是天然存在的氨基酸序列)肽分子作为“免疫细胞激活剂多肽”(ICAP)包含在内，可以通过控制可用于结合CAR的ICAP的量来调节带有CAR的效应细胞的活性水平，所述双特异性结合活性是结合带有CAR的效应细胞和带有细胞表面抗原的靶细胞。这样的系统可以用于解决现有技术的CAR-T细胞表现出的高强直(tonic)活性的问题。
下面解释与本公开有关的一些术语。
在本公开中，术语“表达盒”是指基因表达所需的整个元件，包括启动子，编码序列和多聚A尾信号序列。
术语“编码序列”在本文中定义为编码多肽产物(例如，CAR，单链抗体或其结构域)的氨基酸序列的核酸序列部分。编码序列的边界通常由紧接在编码的mRNA的5'端的开放阅读框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和编码的mRNA的3'端的开放阅读框下游的转录终止序列决定。编码序列可以包括但不限于DNA，cDNA和重组核酸序列。
术语“Fc”(可结晶的片段)是哺乳动物抗体的一部分，是指位于抗体分子“Y”结构手柄末端的肽，包含抗体重链恒定区的CH2和CH3结构域，是许多分子和细胞相互作用的位点，可提供哺乳动物抗体的某些生物学作用。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原呈递细胞的表面上并与Th细胞上的共刺激分子受体结合以产生共刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要共刺激分子的信号。共刺激信号主要通过与抗原呈递细胞表面上的共刺激分子CD80结合而传递到T细胞，而CD86与T细胞表面上的CD28分子结合。B细胞接收共刺激信号，该信号可以通过常见的病原体成分(例如LPS)，或通过补体成分或通过活化的抗原特异性Th细胞表面蛋白CD40L。
术语“接头”是在不同蛋白质或多肽之间连接的多肽片段，其目的是(例如通过减轻对配体结合的空间抑制)维持所连接蛋白质或多肽的空间关系，以维持蛋白质或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有甘氨酸和/或丝氨酸的接头，以及例如弗林蛋白酶(Furin)2A肽。
术语“特异性结合”是指结合性蛋白与配体的反应，例如在抗体或抗原结合片段与它所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合抗原的抗体(或对抗原具有特异性的抗体)是指抗体-抗原亲和性的特征在于结合常数Kd小于约10-5M，例如小于约10-6M，10-7M，10-8M，10-9M或10-10M或以下。“特异性识别”或“特定识别”具有相似的含义。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指与对象和活性成分在药理和/或生理上相容的运载体和/或赋形剂，其在本领域是周知的(参见，例如，《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)，Gennaro AR编，第19版，宾夕法尼亚州马克出版公司，1995，其以引用的方式全文并入本文并用于所有目的)，包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲剂；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或非离子表面活性剂，例如吐温80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可以在对象中实现治疗，预防，减轻和/或减轻本文所述的疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指与本文所述的疾病和/或病症相关的对象的身体状态。
术语“对象”或“患者”可以指接受本发明的药物组合物以治疗，预防，改善和/或减轻本发明的疾病或病症的患者或其他动物，特别是哺乳动物，例如人，狗，猴，牛，马等。
如本文所用，“嵌合抗原受体”(CAR)是结合特定分子(例如肿瘤细胞表面抗原)并刺激免疫细胞型效应细胞中的增殖程序的人工工程蛋白。CAR通常从氨基末端到羧基末端依次包含任选的信号肽(可以于CAR在宿主细胞的细胞膜中定位的过程中被除去)；特异性结合其他蛋白质(“标记结构域”)的多肽，例如单链抗体的抗原结合区；可选的(但通常存在)铰链区；跨膜区；和胞内信号传导区(参见例如图1)。标记结构域多肽可以是天然多肽衍生的多肽，也可以是合成多肽。
在本申请中，“VHH结构域”可以指单个重链抗体(“VHH抗体”)例如骆驼科动物抗体的可变结构域。“单链抗体”(SCA)是单链多肽，通常包括多个相对保守的结构域，这些结构域随着多肽折叠而结合在一起形成框架区(FR区)，而可变区结合在一起以形成可变抗原结合域。因此，VHH抗体是SCA的一种。根据该术语，天然存在的单个重链抗体中存在的可变域在本文中也称为“VHH结构域”，以便将其与常规4-链抗体中存在的重链可变域(在本文中称为“VH结构域”)以及常规4-链抗体中存在的轻链可变域(在本文中称为“VL结构域”)区分开。
分离的单可变域多肽优选是具有其同源SCA的全部抗原结合能力并且在水溶液中稳定的多肽。
本文的“单链抗体”也涵盖了稳定的、具有抗原结合力的单链多肽，该多肽包含衍生自或类似于哺乳动物抗体的结构域的(或来自FR或可变区的)一个或多个结构域，例如VH结构域。
“纳米抗体”可包括SCA或VHH抗体或其一个或多个结构域，但是该词更通常用于描述包含一个或多个VHH结构域，并且任选地进一步包含一个或多个FR结构域的工程改造的多肽，并且另外地或替代地，还可包括具有一些其他生物学活性的另外的稳定结构域，所述其他生物学活性例如与荧光团结合或结合并激活细胞外受体。
本文公开了一种新的细胞治疗产品，一种工程改造的免疫效应细胞，其可以是诸如所谓的“白泽超级细胞”，其包含可以被诱导以可控方式原位表达分泌蛋白的嵌合受体。
在一些实施方式中，工程改造的免疫效应细胞组成性表达高水平的效应多肽，例如单链抗PD-1抗体(VHH-PD-1)。在一些这样的实施方式中，由细胞的细胞表面相关抗原结合免疫效应细胞T细胞的“标记结构域”而活化的T细胞增殖提供了非常大量的T细胞，所述T细胞组成性地分泌效应多肽。在标记结构域被肿瘤细胞表面上的抗原结合的情况下，免疫调节效应多肽可以是组成型表达的，并且由于其在肿瘤细胞附近的分泌而减轻或避免了由例如PD-1:PD-L1/L2复合物的形成而诱导的免疫耐受。
另外地或替代地，本文公开的工程改造的效应细胞可以被工程改造以包含核酸载体，该核酸载体包含编码在免疫细胞中可操作的启动子的控制下表达一种或多种“效应多肽”的编码序列构建体，并且进一步包含在免疫细胞中可操作的转录终止序列。所述启动子可以是组成型启动子，例如EF1a启动子或CMV启动子。
核酸载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。核酸载体可以是DNA或RNA载体。载体可以包含PiggyBac(PB)转座子或SleepingBeauty(SB)转座子或其部分。载体可以包含转座子特异性的反向末端重复序列，其通常位于基于转座子的载体的两端。
本文所公开的工程改造的效应细胞可以是这样的细胞，其中编码ICAP的表达盒和编码一种或多种效应多肽的表达盒中的一个或两个被整合到效应细胞的核基因组中。
待由效应细胞分泌的蛋白质可以是免疫刺激性蛋白质，例如特异性结合4-1BB或OX40的多肽，或者是免疫抑制性蛋白质(例如，用于治疗过敏反应或关节炎病症)，例如特异性结合TNF-α或IL-6的多肽。
待由效应细胞分泌的优选蛋白质是抗体或其片段，或者是单链单结构域多肽的多肽，例如VHH纳米抗体或scFv蛋白。可以分泌的一类蛋白质是具有或不具有Fc结构域的免疫检查点受体拮抗剂或激动剂抗体。但是，其他蛋白可由工程改造的效应细胞表达和分泌，例如细胞因子或其他免疫调节蛋白。例如，针对PDL1，CTLA-4，CD-40，LAG-3，TIM-3，BTLA，CD160，2B4，CD40，4-1BB，GITR，OX-40，CD27，HVEM或LIGHT的抗体、抗体的抗原结合部分或单链抗体(例如VHH纳米抗体)可以由效应细胞表达和分泌。例如效应细胞分泌的细胞因子可能包括TGF-β，VEGF，TNF-α，CCR5，CCR7，IL-2，IL-7，IL-15和IL-17。本文公开的工程改造的效应细胞可以表达和分泌两种或两种以上不同类型效应多肽，包括不同的抗体、细胞因子或组合。举例来说，工程改造的效应细胞可以分泌PDL1抗体和CTLA-4抗体，或PDL1和VEGF抗体。
分泌的效应蛋白的示例是具有以下氨基酸序列的抗PD-1 VHH抗体：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGDTSFISAAGWYRQAPGKERELVAAITNTGITYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCNAGAPPPGGLGYDESDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:3)。
经过工程改造的宿主免疫细胞可以是各种T细胞，CIK(细胞因子激活的杀伤细胞)，DC-CIK(树突状细胞/CIK)，NK细胞(自然杀伤细胞)，NKT细胞(自然杀伤T细胞)，干细胞，TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)，巨噬细胞和其他免疫细胞。宿主免疫细胞通常是被治疗疾病的对象的自体细胞。
在一些实施方式中，用包含具有至少3种结构组分的编码序列构建体的载体转化工程改造的免疫细胞：编码第一结构域的多核苷酸，该第一结构域包括在“活化的”T细胞中激活转录程序的细胞内信号传导结构域，例如T细胞表面糖蛋白的CD3ε(CD3e)或CD3ζ(CD3z)结构域；第二多核苷酸编码包含跨膜结构域(和任选的间隔肽)的结构域，例如CD28蛋白的结构域；和第三多肽，其编码“标记”多肽结构域，该结构域与另一多肽的特异性结合通过细胞内信号传导结构域激活宿主免疫细胞(例如T细胞)中的转录程序。
细胞内信号传导域可以包括参与免疫共刺激信号传导的结构域(例如，B7结合域)，以及另外地或替代地，包括CD3e的ITAM域。优选地，ITAM结构域包括氨基酸序列YMNM(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方式中，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域均是CD28蛋白的结构域。
在一些实施方式中，信号转导结构域包含连接至CD3e结构域的免疫共刺激结构域，例如CD28/CD3e，4-1BB/CD3e，ICOS/CD3e，CD27/CD3e，OX40/CD3e或CD40L/CD3e。
标记结构域多肽优选是在成人组织中不表达或表达最少的多肽。例如，标记多肽可以源自仅在胚胎人类细胞中表达或主要表达的蛋白质(即“胎儿蛋白”)，或者标记多肽可以是完全合成的氨基酸序列。
可以衍生出标记多肽的胎儿蛋白的示例包括在胚胎发生过程中表达的胎儿蛋白，例如Oct-4，Sox-2和Klf-2。在一些实施方式中，使用少于完整全长蛋白质的部分；例如，通常使用20-100个氨基酸长的多肽。以下是Oct-4，Sox-2和Klf-2的氨基酸序列：
Oct4:
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGI(SEQ IDNO:5)
Sox-2:
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSR(SEQ ID NO:6)
Klf-2:
MALSEPILPSFSTFASPCRERGLQERWPRAEPESGGTDDDLNSVLDFILSMGLD(SEQ ID NO:7)
ICAP的标记结构域部分可以是具有以下氨基酸序列的多肽：MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSF(SEQ ID NO:8)。
ICAP标记结构域可含有来自人间皮素ECD的结构性惰性结构域。对于编码间皮素域的多肽，其包含如下所示的结构域I、II或III的肽序列：
EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDEL(结构域I-SEQ ID NO:9)
SLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQN(结构域II-SEQ ID NO:10)
CSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKL(结构域III-SEQ ID NO:11)
标记多肽可以衍生自不具有胞内信号转导功能或不与其他生物活性分子相互作用的结构膜蛋白，以提供结构膜蛋白的“结构性惰性”结构域，前提是该结构膜蛋白通常与另一种蛋白或碳水化合物结合，从而构成标记结构域的表位在体内不暴露于抗体。标记多肽优选具有很少或没有免疫原性。标记多肽的免疫原性可通过以下方法确定：1)对T细胞表位数量的计算机计算算法；2)体外测定以确定T细胞活化潜能；和3)使用动物模型进行体内实验。
上述任何标记结构域可以与上述任何跨膜结构域和上述任何细胞内信号传导结构域组合以形成ICAP多肽。短多肽接头可用于连接ICAP的结构域。
例如，上述的任何标记结构域可被编码为图3B所示的质粒pNB338B-ICAPs-VHH的“标记结构域”部分。
该构建体在效应细胞中表达以产生“免疫细胞激活多肽”(ICAP)，其定位于细胞外膜，使得标记结构域位于细胞外。
本文公开的效应细胞可与双特异性多肽一起使用-即具有通过连接多肽或通过化学偶联连接的两个功能结构域的多肽，每个结构域具有特异性结合不同配体的活性。在此，在一些实施方式中，双特异性多肽也称为“VHH-TCP”，作为包含两个或更多个单链纳米抗体(单链，单结构域抗体)的双特异性多肽的优选形式。
双特异性多肽的一个结构域(L-bd)包含与效应细胞表面上的ICAP的标记结构域特异性结合的氨基酸序列，并且双特异性多肽的一个结构域(CSP-bd)与“靶标”表面上的蛋白质特异性结合，所述“靶标”优选是细胞靶标，例如肿瘤细胞，但可以是与靶蛋白结合的任何细胞或表面。这样的表面呈递的靶多肽在本文中称为“细胞表面蛋白”或其表位。
这种细胞表面蛋白可以是与肿瘤，自身免疫性疾病或细胞或机体衰老相关的抗原，例如CD19，间皮素，BCMA，EGFR，波形蛋白，Dcr2或DPP4。在一些实施方式中，靶细胞是就数量或突变蛋白质而言异常表达一种或多种这些蛋白质的细胞，例如B细胞，间皮细胞，乳腺细胞，或成纤维细胞的肿瘤。
双特异性多肽(本文称为VHH-TCP)可以包含其他结构域，以提供额外的结合，或生化或生理活性，例如识别来自同一靶蛋白的多个表位或来自多个靶蛋白的表位(称为“多特异性多肽”，举例来说，包括三特异性多肽、四特异性多肽、五特异性多肽、六特异性多肽)。双特异性多肽还可包含一个或多个结合基序，以将人IgG Fc结构域识别为ICAP的标记结构域，从而通过ADCC，CDC和ADCP机制实现效应细胞活性切换。
另外地或替代地，双特异性(多特异性)多肽(VHH-TCP)还可包括衍生自具有不同分子量的血清白蛋白的一个或多个结构域，以控制双特异性多肽在体内的半衰期。
一种用于结合荧光团的结构域可以被包括在双特异性多肽中，以允许体内跟踪(例如，通过荧光染色的组织样品的检查)双特异性多肽和所述双特异性多肽特异性结合的细胞。
优选地，双特异性多肽的结构域可以通过一个或多个接头肽以N端至C端彼此连接。可以调节接头的长度以调节双特异性多肽的分子量或在其结构域之间的空间相互作用(例如减少空间相互作用)。
双特异性多肽的接头部分还可以包括易于被血液中的肽酶切割的氨基酸序列，从而限制了双特异性多肽在血液或细胞外基质中的半衰期。例如，氨基酸序列RVLAEA(SEQ IDNO:12)，EDVVCCSMSY(SEQ ID NO:13)和GGIEGRGS(SEQ ID NO:14)可被基质金属蛋白酶-1切割，而氨基酸序列VSQTSKLTRAETVFPDV(SEQ ID NO:15)可被因子IXa/因子VIIa切割。
在一些实施方式中，一个或多个(例如全部)活性结构域包含VHH纳米抗体多肽。
L-bd可以是单个抗体结构域，衍生自骆驼科动物IgG的VHH结构域。这样的VHH结构域的CDR3区可包含15-20个氨基酸，其充当与标记结构域上的一个或多个表位结合的互补位。
双特异性多肽可包括L-bd(特异性结合标记多肽的VHH结构域)和CSP-bd(特异性结合CD19或CD20的VHH结构域)。这样的双特异性多肽可用于治疗B细胞淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，所述双特异性多肽可包括L-bd(特异性结合标记多肽的VHH结构域)和CSP-bd(特异性结合EGFR的VHH结构域)。来自VHH抗体的CDR3区域的氨基酸序列可以与非小细胞肺癌细胞表面上的EGFR结合。这样的双特异性多肽可用于治疗非小细胞肺癌。
所述双特异性多肽可包括L-bd(特异性结合标记多肽的VHH结构域)和CSP-bd(特异性结合CPC3的VHH结构域)。在一些实施方式中，所述双特异性多肽可包括L-bd(特异性结合标记多肽的VHH结构域)和CSP-bd(特异性结合BCMA的VHH结构域)。在一些实施方式中，所述双特异性多肽可包括L-bd(特异性结合标记多肽的VHH结构域)和CSP-bd(特异性结合HER2的VHH结构域)。这样的双特异性多肽可用于治疗HER2+乳腺癌肿瘤。
示例性的双特异性多肽，包含通过接头连接的两个VHH域(与标记结构域结合的VHH+接头+抗EGFR VHH，该标记结构域包含衍生自人间皮素ECD的结构性惰性肽)，其氨基酸序列如下所示：QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFDFSSVTMSWHRQSPGKERETVAVISNIGNRNVGSSVRGRFTISRDNKKQTVHLQMDNLKPEDTGIYRCKAWGLDLWGPGTQVTVSS(SEQ ID NO:16)。
优选地，双特异性多肽与靶细胞以外的其他细胞上的表位的结合对双特异性多肽在体内的药代动力学或药理分布没有显著影响，并且优选地，这种结合发生时不会引起除了激活效应细胞外的任何明显可观察到的生理作用，所述效应细胞表达将被双特异性多肽结合的相关标记结构域。
借助于本文图示和描述的实施方式，申请人已经设计了用于使用本文公开的工程改造的效应细胞和双特异性多肽来治疗肿瘤的方法及其变体。
在一种这样的方法中，将工程改造的免疫细胞作为效应细胞直接注射到实体瘤中，所述工程改造的免疫细胞可以是T细胞或本文所述的其他细胞类型。替代地，工程改造的免疫细胞可以静脉内给予(IV，例如当治疗白血病或淋巴瘤时)。可根据疾病指征来执行不同给药方法。在大多数情况下，进行静脉内给药以治疗疾病。腹膜内给药可用于治疗恶性胸膜间皮瘤(MPM)。
对于实体瘤的治疗，预期直接注射到肿瘤中会导致细胞在肿瘤微环境中更好的分布(在靶肿瘤细胞附近有更多的工程改造的免疫细胞)。
在典型的治疗方法中，VHH-TCP的给药量可为10ng/ml至100ng/ml，工程改造的免疫细胞的浓度如5x104、1x105、5x105或1x106个工程改造的细胞/ml。
在不利用VHH-TCP激活性分子的治疗方法的一个示例实施方式中，工程改造的免疫细胞是表达ICAP的T细胞，所述ICAP具有与B细胞上的CD19特异性结合的VHH标记结构域，并具有常见T细胞受体(即CD28和CD3e)的胞内信号传导结构域和跨膜结构域。工程改造的T细胞还包含在组成型启动子的控制下表达抗PD-1-Fc效应多肽的载体。将细胞给予对象后，ICAP的标记VHH结构域与B细胞上的CD19特异性结合，该结合将信号转导至工程改造的免疫细胞，然后经CD3和CD28细胞内信号传导激活并在B细胞靶标附近增殖。增殖细胞在结合的B细胞附近分泌大量抗PD1效应蛋白。
在各种实施方式中，所公开的系统提供以下优点中的一个或多个。并非每个实施方式都将表现出以下每个优点。
在ICAP标记结构域的实施方式中，源自胎儿蛋白或结构膜蛋白的多肽为VHH-TCP结合提供了广泛的可能L-bd，并且由于该结构域没有免疫原性或免疫原性降低，可以提高细胞治疗的安全性。
可以包含在双特异性多肽(VHH-TCP)中的结构域的多样性提供了改变许多特性的能力，例如对效应细胞的VHH-TCP亲和力，并且可被CSP-bd靶向的细胞范围很广。还可以添加其他功能域，并且可以调节表位结合价以高效和安全地使用该系统治疗疾病。
与免疫细胞激活剂多肽(包括激活免疫细胞宿主增殖的信号传导结构域)的标记结构域特异性结合并与B细胞的细胞表面蛋白(例如CD19配体)特异性结合的双特异性多肽(VHH-TCP)可以在体内诱导效应细胞的增殖，从而在B细胞结合附近增加免疫效应细胞的数量，继而增加效应多肽的量。这节省了时间并避免了在体外生产效应多肽的成本。
可以以多种形式工程改造双特异性多肽(VHH-TCP)，以通过双特异性多肽(VHH-TCP)中VHH之间接头的长度和柔性、每个结合基序的位置以及VHH-TCM的总体大小来优化效应细胞的活性。
体内效应细胞的活性可以通过给予不同量的双特异性多肽(VHH-TCP)和/或控制VHH-TCP的半衰期来控制。这是一种新颖且全面的方法，可最大程度地减少基于CAR的疗法的毒性。
此外，使用与Fc表位特异性结合的合适的标记蛋白，效应细胞可以被ADCC效应激活。
重要的是，纳米抗体的特征(例如小尺寸、高稳定性和易于工程改造)为优化体内治疗系统提供了独特的优势。
停止向对象给予VHH-TCP可以预防与持续的效应细胞活性相关的不良反应，同时还为疾病复发事件的后续VHH-TCP给药提供了机会。
抗体(优选由激活的效应细胞分泌的纳米抗体)的原位分泌，可以抑制或刺激免疫检查点受体，从而通过TME(肿瘤微环境)的渗透、增殖和持久性提高对实体瘤的靶向性。纳米抗体双特异性多肽由于其体积小和稳定性好，在穿透TME方面具有优于常规抗体的优势。
本文公开的效应细胞-双特异性多肽(VHH-TCP)系统可以改善当前CAR-T疗法带来的许多陷阱：例如，通过具有单个标准化免疫受体靶向多种肿瘤抗原，并且VHH-TCP的多样化结构可用于控制和优化免疫细胞活性。利用所公开的系统的治疗预期表现出较小的毒性或副作用。此外，该系统的组件可被容易且低成本地制造。可纳入ICAP和双特异性多肽(VHH-TCP)中的配体和结合域的多样性使模块化系统可用于治疗多种疾病或进行研究，例如将FITC结合域纳入VHH-TCP可以在体内追踪激活的效应细胞的命运。
实施例
实施例1：代表性工作实施例
1.通过电穿孔产生修饰的效应T细胞
ICAP包括标记多肽(胎儿蛋白或间皮素的27个氨基酸)，CD28跨膜结构域，CD28细胞内共刺激信号传导结构域(CD28IC)和CD3ζ。1182-Fc(EQ)包含VHH-1182和IgG4 Fc结构域。
将1182-Fc(EQ)结构基因克隆到piggyBac转座子载体pS338B中以获得质粒pS338B-1182-Fc(EQ)(图3A)。PCR扩增ICAP-VHH基因，并将其克隆到piggyBac转座子载体pNB338B中，以获得质粒pNB338B-ICAP-VHH(图3B)。将ICAP-VHH基因替换为空多克隆(MCS)基因，以产生MOCK构建体质粒。
健康捐献者的人外周血单核细胞(PBMC)购自AllCells(中国上海)。PBMC在添加了2％胎牛血清(FBS；Gibco公司，美国)的AIM-V培养基中，在5％CO2湿润的培养箱中于37℃下培养0.5-1小时，然后收获并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。
根据制造商的说明，对PBMC进行计数，并使用
Figure BDA0003718994750000221
人T细胞
Figure BDA0003718994750000222
试剂盒在电穿孔器(瑞士Lonza)中用6μg pNB338B-ICAP-VHH质粒或等量的MOCK质粒进行电穿孔。之后，将经ICAP-VHH/1182-Fc(EQ)质粒或MOCK/1182-Fc(EQ)质粒转染的T细胞在6孔板中特异性刺激持续4-5天，所述6孔板用抗CD3抗体/抗CD28抗体(5μg/mL)包被。然后将转化的T细胞在含有2％FBS和100U/mL重组人白介素2(IL-2)的AIM-V培养基中培养10天，以产生足够量的效应T细胞。
2.转导效率测定
使用生物素偶联的抗IgG4(Fc)抗体和PE偶联的链霉亲和素二抗，通过流式细胞术确定标记多肽进入T细胞的转导效率。
3.结合效率测定
使用抗CD19-PE抗体通过流式细胞术测量双特异性多肽与普通T细胞的结合。比较对CD19和标记物(例如内消旋体)阳性的细胞的比例，以确定结合效率。
4.增殖能力测定(与双特异性VHH和肿瘤细胞培养)
将1x107个转化的T细胞用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯预染色10分钟，并在培养基中回收另外10分钟。对5x105个细胞进行计数，并与表达不同抗原(包括BCMA，EGFR，间皮素和GPC3)的肿瘤细胞系以及双特异性VHH共培养7天，每3-4天用新鲜培养基(AIM-V+2％FBS)替换培养基。然后通过流式细胞术测定效应细胞的增殖。
5.定量1182-Fc-VHH分泌
用1毫升培养基将5x105个细胞接种在6孔板中，然后加入肿瘤细胞和双特异性VHH，共培养48小时。然后将效应T细胞悬浮液以3000rpm离心3分钟；保留上清液并通过ELISA定量检测1182-Fc蛋白。
6.细胞毒性测定(对于粘附细胞系)
通过使用基于阻抗的xCELLigence RTCA TP仪器确定转导有标记构建体或载体对照的效应T细胞的细胞毒性。
将目标肿瘤细胞在RTCA TP仪器中以每孔10,000个细胞接种在底部有电阻器的96孔板中过夜(超过16小时)。将双特异性VHH抗体添加至培养的靶肿瘤细胞，并将细胞进一步培养30分钟。然后将携带质粒pS338B-1182-Fc(EQ)和pNB338B-ICAP-VHH(效应细胞)的转化T细胞与靶肿瘤细胞以不同的效应细胞：靶细胞比例孵育约100小时(终点取决于转化的T细胞的杀伤效率)。在实验过程中，细胞指数值与肿瘤细胞粘附密切相关，因此较低的细胞附着表明较高的细胞毒性，并通过RTCA系统和
Figure BDA0003718994750000241
多标记酶标仪(PerkinElmer公司)每5分钟收集一次。实时杀伤曲线由系统软件自动生成。使用终点数据计算每个转化的T细胞的特异性杀伤(Specific lysis)(％)[特异性杀伤＝(单独的肿瘤细胞的细胞指数–与肿瘤细胞共培养的转化T细胞的细胞指数)/单独的肿瘤细胞的细胞指数]。
7.细胞毒性测定(对于悬浮细胞系)
根据制造商的规程(
Figure BDA0003718994750000242
EuTDA细胞毒性试剂AD0116–PerkinElmer公司)确定转导有标记构建体或载体对照的效应T细胞的细胞毒性。简言之，将靶肿瘤细胞用PBS和荧光增强配体洗涤并在37℃下孵育5-30分钟。将100ul的靶细胞(10,000个细胞)放入含有双特异性多肽的V底平板中，该多肽特异性结合两个靶肿瘤细胞和效应细胞(即转化的T细胞)，并且以不同细胞浓度加入100ul的效应细胞。在室温下孵育15分钟后，将20ul上清液转移到200μL Europium溶液中。在时间分辨荧光计中测量荧光。比释放(％)＝实验释放(次数)-自发释放(次数)/最大释放(次数)-自发释放(次数)x100。
8.体内特异性靶向活性
在无病原体的条件下饲养NOD-SCID IL2 Rγ-/-(NSG)小鼠(中国上海)。动物实验得到机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。为了建立异种移植肿瘤模型，NSG小鼠皮下接种与等体积MatrigelTM混合的5×106个EGFR+肺肿瘤细胞和5×106个MSLN+卵巢肿瘤细胞。使用游标卡尺获得肿瘤尺寸，并基于下式计算肿瘤体积：V＝1/2(长度×宽度2)。当肿瘤负荷约为100mm3时，静脉注射Fluc标记的效应T细胞和靶向EGFR的双特异性VHH。通过生物发光成像(BLI)确认了效应T细胞对肺的特异性靶向。在第5天，静脉内注射靶向MSLN的另一种双特异性VHH，以观察效应T细胞对卵巢肿瘤细胞的特异性靶向。使用Xenogen IVIS成像系统(PerkinElmer公司，美国)通过生物发光成像监测效应T细胞的体内增殖能力。
9.体内增殖和抗肿瘤活性
为了建立异种移植肿瘤模型，将5×106个Fluc标记的肿瘤细胞与等体积的MatrigelTM混合并皮下接种NSG小鼠。当肿瘤负荷约为100mm3时，将小鼠随机分为三组(每组5只小鼠)，静脉注射(iv)MOCK-T、效应T细胞或含多肽VHH的PBS载剂，时间点指定为第0天。
从尾静脉取所有小鼠的外周血以检测效应T细胞的增殖和ICAP基因的拷贝数。在达到垂死状态后对小鼠实施安乐死，然后收集骨髓，血液和脾脏。通过流式细胞术分析上述组织中CD3+ T细胞的百分比和脾脏中记忆T细胞亚群。在整个体内实验过程中，使用电子天平测量小鼠体重。使用Xenogen IVIS成像系统(PerkinElmer公司，美国)通过生物发光成像(BLI)确认肿瘤的进展。所有测量每五天进行一次。
10.苏木精-伊红(H&E)染色和免疫组织化学(IHC)
进行H&E和免疫组织化学以评估超级细胞疗法的安全性。用福尔马林固定小鼠组织(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾和脑)，然后用石蜡包埋。使用RM2245切片机(Leica，德国)将组织连续切成4μm厚度，然后用H&E染色。为了检测肿瘤组织中效应T细胞的浸润能力，使用抗CD3抗体(Abcam公司，#ab16669)以1:100的稀释度进行IHC分析。图像使用AXIOSTAR PLUS显微镜(德国ZEISS公司)拍摄。
11.组织分布测定
使用实时定量PCR(RT-qPCR)确定1182-VHH、转染的T细胞和衔接子VHH蛋白的组织分布。消化小鼠组织(心脏，肝脏，脾脏，肺，肾和脑)以制备单细胞悬液。根据制造商的说明，使用基因组DNA提取试剂盒Ver.5.0(TAKARA公司，中国)从T细胞提取总DNA。实时聚合酶链反应使用TaqManTM通用主混合物II(美国ThermoFisher科学公司)进行。上海吉恩瑞(Generay)生物技术有限公司(中国上海)合成或标记了CAR和肌动蛋白的引物和探针。实时定量PCR反应分两个步骤进行：(1)预孵育：95℃5分钟；(2)扩增：40次循环的(95℃20秒，60℃1分钟)。所有反应均重复三次。
12.统计学分析
所有数据表示为平均值±SD。T检验用于评估两个独立组之间的差异。单向ANOVA用于比较三个或更多独立组之间是否存在统计学上的显著差异。双向ANOVA用于确定两个名义预测变量对连续结果变量的影响。所有统计分析均使用Graphpad Prism 7版本软件(加利福尼亚州拉霍亚)进行。所有带有误差线的数据均以平均值±SD表示。以下认为统计上显著差异：P≥0.05(ns),P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***),P<0.0001(****)。
实施例2：一种对MSLN、BCMA或EGFR具有高亲和力的VHH序列的鉴定和表征
描述了使用羊驼免疫文库(alpaca immune library)以高亲和力鉴定和表征一种针对MSLN、BCMA或EGFR的特异性VHH纳米抗体。
1.针对MSLN的VHH纳米抗体
对于第一次免疫，将使用弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)乳化的400μg MSLN-hFc皮下施用于每只羊驼。两周后，皮下施用弗氏不完全佐剂(Freund'sincomplete adjuvant)乳化的200μg MSLN-hFc。之后，每隔一周用弗氏不完全佐剂乳化的200μg MSLN-hFc进行5次额外免疫。ELISA和FACS证实了针对MSLN-His抗原以及HEK293T-MSLN稳定细胞系的高血清滴度。
最后一次注射后7天，收集50mL血液，从样品中纯化淋巴细胞，提取RNA并用于免疫文库构建。用MSLN-His抗原进行两轮固体蛋白淘选，然后进行ELISA筛选和FACS验证。获得了一个名为M2339(VHH)的阳性克隆。
抗体被表达为hFc融合蛋白，命名为M2339(VHH)，采用专利公布号WO2020176815A2(在此以引用的方式整体并入并用于所有目的)中描述的程序。M2339(VHH)对MSLN抗原的结合亲和力通过表面等离子共振(SPR)测试。首先，M2339(VHH)通过预先固定有蛋白A的传感器芯片，抗体被蛋白A捕获。然后以五种不同浓度的MSLN-His蛋白作为流动相，结合时间和解离时间分别为30min和60min。使用Biacore evaluation software2.0(GE)分析结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和平衡常数(KD)。如下表1所示，M2339(VHH)对MSLN抗原的亲和力高，KD为2.64E-10。
M2339(VHH)对HEK293T-MSLN细胞的结合亲和力用流式细胞仪鉴定。在96孔板的不同孔中将HEK293T细胞和HEK293T-MSLN细胞以3×105个细胞/孔孵育，接着将连续稀释的M2339(VHH)孵育半小时，孵育二抗抗人IgG PE(Jackson Immuno Research,Code:109-117-008)，然后用CytoFLEX流式细胞仪检测。“同种型(Isotype)”是同种型对照(阴性对照)。如图4A所示，M2339(VHH)对HEK293T-MSLN细胞系表现出良好的特异性结合亲和力。
2.针对BCMA的VHH纳米抗体
本实施例描述了用羊驼免疫文库(alpaca immune library)鉴定和表征一种对BCMA具有高亲和力的特定VHH纳米抗体。羊驼免疫程序、采血、文库构建、固体淘选(solidpanning)、ELISA或FACS筛选阳性克隆、抗体纯化和后续通过SPR和FACS进行的抗体表征描述于上文实施例2中。获得了一个名为B029(VHH)的阳性克隆。
如表1所示，B029(VHH)对BCMA-His抗原的亲和力高，KD为1.25E-10。
如图4B所示，B029(VHH)对CHOK1-BCMA细胞系表现出良好的特异性结合亲和力。
3.针对EGFR的VHH纳米抗体
本实施例描述了使用羊驼免疫文库(alpaca immune library)识别和表征一种针对EGFR具有高亲和力的特定VHH纳米抗体。羊驼免疫程序、采血、文库构建、固体淘选(solidpanning)、ELISA或FACS筛选阳性克隆、抗体纯化和后续通过SPR和FACS进行的抗体表征描述于上文实施例2中。获得了一个名为E454(VHH)的阳性克隆。
如表1所示，E454(VHH)对EGFR His抗原的亲和力很高，KD为1.27E-09。
如图4C所示，E454(VHH)对HEK293T-EGFR细胞系显示出良好和特异性结合亲和力。
表1：M2339(VHH)-MSLN、B029(VHH)-BCMA和E454(VHH)-EGFR的结合动力学
Figure BDA0003718994750000271
Figure BDA0003718994750000281
实施例3.对间皮素区域II+III特异的高亲和力VHH
本实施例描述了本发明中使用的标记的鉴定和表征，该标记被识别为具有与间皮素相似的结合亲和力的M2339(VHH)。
含人Fc的不同间皮素ECD结构域在293T细胞中表达并通过蛋白A柱纯化。亲和力由SPR确定。使用蛋白A芯片捕获不同的抗原，以10μl/min的流速注入不同浓度的M2339(VHH)，结合时间为120-180秒，解离时间为180-1200秒。使用Biacore Evaluation软件在1:1拟合模型中确定结合动力学。
如图5所示，M2339(VHH)以不同的亲和力与全长间皮素、间皮素I、间皮素II+III结合。间皮素II+III结构域被M2339良好识别，KD值为4.32E-11M，与完整的间皮素多肽亲和力相似(表2)。
表2：2339(VHH)与间皮素结构域的结合动力学
Figure BDA0003718994750000282
这些结果表明，M2339与间皮素II+Ⅲ具有高亲和力，可用作衔接子VHH，间皮素II+III可用于T细胞的ICAP。
实施例4：基于间皮素II+III(M-ICAP)的免疫细胞激活多肽的制备与筛选
如图6所示，为了产生所述的M-ICAP-T构建了不同的载体，用于激活免疫细胞，例如T细胞。所有载体都编码相同的细胞内区域，包括4-1BB和CD3ζ细胞内区域。该编码多肽的细胞外区域不同。M-ICAP不包含任何His标签。M-ICAP-his-1或2分别在M-ICAP的N端或C端包含6x His-tag。除了间皮素信号肽(SP-MSLN)外，还从人类蛋白质数据库中选择了另外两种信号肽(SP)以优化表达率。SP3-M-ICAP和SP5-M-ICAP含有不同的信号肽SP3(MKHLWFFLLLVAAPRWVLS-SEQ ID NO:1)或SP5(MTRLTVLALLAGLLASSRA-SEQ ID NO:2)。
用Lipofectamin2000(ThermoFisher,USA)将所有载体转染到293T细胞中，并在2- 4天后使用流式细胞术仪测其表达率。对于流式细胞仪检测，使用19R73-CD19CAR和GFP载体制备空白细胞对照，使用M2339-hFc和生物素偶联的抗His mAb作为一抗，荧光团偶联的抗人Fc和荧光团偶联的链霉亲和素用作二抗。如表3和图7所示，M2339-hFc检测其N端His标签时，His标签影响标记(M-ICAP)表达率的位置，M-ICAP表达率较高。信号肽对M2339-hFc和抗His测试的M-ICAP表达几乎没有影响。
表3：各种M-ICAP多肽的表达水平
质粒名称 频率(％) 检测的抗体
对照 0.03 M2339-IgG1
GFP 95.44 /
pNB338B-19R73 27.56 抗CD19-IgG1
pNB338B-M-ICAP 13.51 M2339-IgG1
pNB338B-SP3-M-ICAP 18.66 M2339-IgG1
pNB338B-SP5-M-ICAP 17.75 M2339-IgG1
pNB338B-His-1-M-ICAP 17.31 M2339-IgG1
pNB338B-His-1-M-ICAP 8.97 生物素抗His mAb
pNB338B-His-2-M-ICAP 9.72 M2339-IgG1
pNB338B-His-2-M-ICAP 8 生物素抗His mAb
pNB338B-SP3-His-M-ICAP 21.19 M2339-IgG1
pNB338B-SP3-His-M-ICAP 9.5 生物素抗His mAb
pNB338B-SP5-His-M-ICAP 18.38 M2339-IgG1
pNB338B-SP5-His-M-ICAP 10.56 生物素抗His mAb
实施例5：M-ICAP-T细胞构建
如图8A所示，构建了含不同信号肽(SP-MSLN、SP3、SP5)的M-ICAP表达载体，并使之与传统CAR载体的T细胞活化/信号转导结构域(CD28/4-1BB、CD3ζ)融合。ICAP载体由标记多肽M-ICAP(来自间皮素Ⅱ+Ⅲ结构域)、CD28跨膜结构域、CD28/4-1BB胞内共刺激信号结构域(CD28/4-1BBIC)和CD3ζ结构域组成。通过PCR扩增ICAP-VHH基因并克隆到piggyBac转座子载体pNB338B中，得到质粒pNB338B-ICAP(图8B)。
健康供体的人外周血单个核细胞(PBMC)购自AllCells(中国上海)。在37℃、5％CO2加湿培养箱中，于添加了2％胎牛血清(FBS；Gibco,USA)的AIM-V培养基中培养PBMCs0.5-1小时，然后收获细胞并使用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次。根据制造商的说明，在电穿孔器(Lonza,Switzerland)中使用
Figure BDA0003718994750000301
Human T Cell
Figure BDA0003718994750000302
Kit试剂盒对PBMC进行计数和电穿孔。此后，转染的T细胞在涂有抗His/M2339(VHH-Fc)和抗CD28抗体(5μg/mL)的6孔板中特异性刺激4-5天，然后在AIM-V培养基中培养含有2％FBS和100U/mL重组人白细胞介素2(IL-2)10天，以产生足够数量的效应T细胞。使用流式细胞仪、生物素缀合的抗His抗体和PE缀合的链霉抗生物素二抗来确定标记多肽(M-ICAP表达)在T细胞上的转导效率。
如图8C和8D所示，扩增后M-ICAP-T的阳性率在第8天均高于30％，在第13天为92％。所有三种不同的ICAP均通过M2339VHH或抗His抗体的刺激来激活和扩增。成功实现M-ICAPECD在T细胞膜外的表达和M-ICAP-T细胞构建。
实施例6：M-ICAP-T细胞的生成和验证
将M-ICAP融合到几个不同的CAR序列中，通过电穿孔联合使用供体来源的PBMC细胞的特异性激活获得M-ICAP-T细胞。ICAP载体包括标记多肽(来自间皮素Ⅱ+Ⅲ结构域)、CD28跨膜结构域、CD28/4-1BB细胞内共刺激信号结构域(CD28/4-1BBIC)和CD3ζ结构域。1182-Fc(EQ)包含VHH-1182和IgG4Fc结构域。
实施例5中描述了通过电穿孔产生表达ICAP CAR的细胞(ICAP-T细胞)或典型CAR-T细胞。
扩增后进行了一系列测试验证修饰的T细胞，包括ICAP表达阳性率、扩增效果、CD4/CD8阳性细胞在CD3阳性细胞中的比例，和效应记忆T细胞(Tem)/中央记忆T细胞(Tcm)在记忆T细胞(Tm)中的比例。使用生物素偶联的抗His抗体和PE偶联的链霉亲和素二抗，通过流式细胞仪测定T细胞表面上标记多肽的表达率(M-ICAP表达)。如图9所示，源于两个供体(AC1909A和SL2007A)PBMC的ICAP-T细胞制备过程中，扩增高达10倍，ICAP表达率高达80％(根据供体来源不同而不同)；CD4/CD8阳性值因供体不同而异，中枢记忆T细胞占记忆细胞的大部分。不同的CAR-element序列对ICAP-T细胞的阳性率和扩增有一定影响，例如，与M-ICAP和M-ICAP-28相比，M-ICAP-28BB-T细胞的增殖和ICAP表达较少。在T细胞的特异性激活方面，我们比较了不同抗体/TCP对M-ICAP转染的PBMC扩增的影响。如图所示，M2339、抗His抗体和TCP001-C/P可以特异性激活ICAP-T细胞的扩增。
实施例7：基于M2339VHH的TCP设计和表征
本实施例描述了本文中使用的TCP的设计和特性。此处使用的TCP是双特异性抗体，可同时识别M-ICAP-T细胞的靶B细胞或肿瘤特异性抗原(如CD19、BCMA和EGFR)和M-ICAP多肽(来自间皮素)，因此可用作控制M-ICAP-T细胞增殖或细胞毒性的衔接子。实施例中设计和应用的TCP列于表4中。
表4：实施例中使用的TCP的结构域、分子量和纯度
Figure BDA0003718994750000311
Figure BDA0003718994750000321
1.TCP的设计和纯化
设计能同时靶向BCMA抗原和M-ICAP多肽(衍生自间皮素的标记物)BCMA-TCP，用于下文进一步描述的细胞毒性和体外功效测定。为了研究不同接头形式对TCP的生物活性和稳定性的影响，设计了三种形式的BCMA-TCP(TCP001-C、TCP002-C和TCP003-C)，它们具有不同的接头(分别为3xGGGGS接头、hIgG4-Fc和hIgG4-CH3)。同时，构建分别针对BCMA和M-ICAP的MC001C和MC001D，作为mAb形式的两个阳性对照。
具有3xG4S接头能同时靶向CD19抗原和M-ICAP多肽的CD19-TCP，命名为TCP011-P，设计其用于由CD19抗原刺激的M-ICAP-T增殖测定。
具有3x G4S接头能同时靶向EGFR抗原和M-ICAP多肽的EGFR-TCP，命名为TCP021-P，设计其用于M-ICAP-T细胞毒性测定，使用表达EGFR的实体瘤细胞系作为靶标。
如上文实施例2和实施例3中所述，靶向M-ICAP多肽的N末端M2339VHH序列鉴定自羊驼免疫VHH文库的噬菌体展示。如上文实施例2所述，靶向BMCA的B029(VHH)序列鉴定自羊驼免疫VHH文库的噬菌体展示。靶向BMCA的TCP001-P中的scFc序列来源于CN201580050638中的B2121。靶向GFP的TCP001-N中的VHH序列来源于Kubala等(M.H.Kubala et al,ProteinSci.19:2389-2401(2010)(通过引用整体并入本文以描述此类VHH及其使用方式))描述的GFP特异性VHH。
靶向CD19的TCP011-P中的scFv序列来源于FMC063，描述于中国专利申请CN201480027401.4(在此全文引入作为参考)。如上文实施例2所述，靶向EGFR的TCP021-P中的E454序列鉴定自羊驼免疫VHH文库的噬菌体展示。
所述基因由Genewiz,Inc合成和克隆。所有的ORF DNA都被克隆到pcDNA3.4载体中的BamHI和EcoRI位点之间。本文所述的抗体表达、纯化和纯度质量控制按照WO2020176815A2进行(在此通过引用并入本文以描述此类方法)。
2.TCP的亲和性表征
首先，通过SPR评估纯化的BCMA-TCP对BMCA抗原的结合亲和力。将BCMA-his抗原偶联到CM5芯片(GE Healthcare Life Sciences)上，然后以10uL/min的流速流过多种抗BCMABsAb，解离时间为900s。结合动力学用1:1拟合模型确定。数据表明，接头结构可能会影响结合亲和力，因为具有3xG4S接头的TCP001-C比具有更大接头的TCP002-C和TCP0031-C具有更高的结合亲和力(表5)。
表5：BCMA-TCP与BMCA结合的动力学
Figure BDA0003718994750000331
通过流式细胞仪评估间皮素和BCMA过表达细胞的结合生物活性。使用0.25％胰蛋白酶收获稳定的细胞系。
每个样品收集大约5E5个细胞，并将细胞重悬于100μL/孔的带有His-tag的测试抗体中。然后将细胞与抗His-标签抗体(Genscript，中国)和链霉亲和素-PE(Biolegend，中国)孵育。每个步骤的孵育步骤在4℃避光下进行1小时，然后将细胞用200μL PBS缓冲液洗涤2次。将洗涤过的细胞重新悬浮在200μL PBS缓冲液中，并通过FACS分析样品。如图10所示，TCP002-C与两种细胞系的结合力最强，而TCP003-C的结合强度略高于TCP001-C。
3.BCMA-TCP在体外人血浆中的稳定性
TCP001C、TCP002C和TCP003C在100％人血浆中于37℃孵育长达21天，并分别在第0、1、3、7、14和21天收集样品。96孔板涂有间皮素抗原，并在板封闭和洗涤后，将收集的适当稀释的样品与连续稀释的标准样品一起在37℃下与板一起孵育1小时。抗VHH混合物HRP(Anti-VHH-cocktail-HRP，GenScript,A02016)用作检测抗体。在450nm处读取吸光度。最后，根据标准样品组的拟合曲线对被测样品进行分析。
如图11所示，TCP001-C、TCP002-C和TCP003-C在37℃体外人血浆中稳定时间超过21天。
对BCMA-TCP应用相同的流式细胞仪程序证实了TCP011-P对CD19和MSLN过表达细胞(图12)的结合亲和力，以及TCP021-P对EGFR和MSLN过表达细胞(图13)的结合亲和力。
实施例8：M-ICAP-T与TCP对靶细胞的体外扩增
为了验证TCP与靶细胞培养对ICAP-T细胞的快速激活和扩增，将转染了M-ICAP(由抗His和抗CD28激活)的PBMC-T细胞，与TCP011-P或-N分别存在下的CD19阳性Daudi淋巴癌细胞共培养。CD19阳性Daudi淋巴瘤细胞用或不用50ug/ml的丝裂霉素C处理2小时。转染了M-ICAP细胞的PBMC-T细胞计数为5x105且与5x105Daudi细胞以及TCP011-P或-N共培养4天。然后通过流式细胞仪分析效应细胞或靶细胞的增殖。
如图14所示，在TCP011-P存在下，转染5、8、13天的M-ICAP-T细胞在Daudi细胞刺激下均能有效扩增，转染后5天和8天扩增最高。此外，激活的M-ICAP-T细胞可以杀死Daudi细胞。
实施例9：M-ICAP-T对RPMI-8226细胞的TCP剂量依赖性细胞毒性作用
为了使ICAP-t细胞作用于BCMA阳性肿瘤细胞，需要有一个能与BCMA特异性结合的TCP。TCP001-C和-P两端可以同时特异性绑定ICAP-T和BCMA细胞。为了验证ICAP-T与特异性TCP组合后，可以作用于BCMA阳性肿瘤细胞并具有特异性细胞裂解/杀伤作用，我们比较了在不同TCP存在下，与RPMI-8226细胞或L363(三种不同的E:T比率中)共培养的ICAP-T或CAR-T细胞的细胞裂解/杀伤作用。
根据制造商的方案(
Figure BDA0003718994750000341
EuTDA Cytotoxicity Reagents AD0116–PerkinElmer)，对悬浮细胞系的T细胞进行细胞毒性测定。简而言之，用PBS和荧光增强配体洗涤靶肿瘤细胞，并在37℃下孵育15分钟。将50ul靶细胞(5,000个细胞)置于V底板中，该板含有特异性结合靶肿瘤细胞和效应细胞(即转化的T细胞)的双特异性多肽，以及添加50ul不同细胞浓度(E:T＝16/8/4:1)的效应细胞。孵育3.5小时后，将10ul上清液转移到100ul铕溶液中。在室温下孵育15分钟后，在时间分辨荧光计中测量荧光。比释放(％)＝实验释放(计数)-自发释放(计数)/最大释放(计数)-自发释放(计数)x100。
还测定了T细胞的IFNγ分泌。根据制造商的方案(IFNγ检测试剂盒，VAL104–Novus)进行IFNγ检测。简而言之，按照说明书制备新鲜的洗涤液、着色剂、稀释剂和标准品。将不同浓度的标准品和稀释的实验样品加入相应的孔中，每孔100ul。反应孔用密封胶带密封，室温孵育2小时。用洗涤缓冲液洗涤4次后，每孔加入200uL酶标抗体，室温孵育2小时。重复洗板操作后，每孔加入200uL预先混合好的显色试剂，反应物避光孵育10-30分钟。通过添加50ul/孔终止溶液，溶液的颜色将从蓝色变为黄色。用分光光度计在20分钟内记录OD值，并在Excel中使用选定的“四参数方程”进行分析，以获得使用标准样品组的标准曲线。
如图16所示，组合TCP001-C的M-ICAP-T对肿瘤靶细胞具有较强的特异性杀伤作用，而E:T＝16:1时对T细胞的非特异性杀伤作用更为明显。当TCP浓度>0.025ug/ml时，E:T＝8:1和4:1的细胞裂解作用增加。当TCP001-C浓度为0.1和0.5ug/ml时，E:T＝16:1和8:1杀伤效果最好。当TCP001-C的浓度达到2ug/ml时，E:T＝16:1和8:1的效果反而降低。E:T＝16:1杀伤效果最好。在不同的E:T比率下，TCP的EC50值相似(EC50＝0.028(E:T＝16:1),0.024(E:T＝8:1),0.022(E:T＝4:1))，但是最大值对应于E:T比率。
实施例10：ICAP-T与不同TCP组合对RPMI-8226/L363细胞的细胞毒性比较和IFNγ 分泌检测
TCP001-C/P、TCP002-C/P和TCP003-C/P两端同时结合M-ICAP和BCMA。为了验证和比较ICAP-T细胞与这些TCP组合对BCMA阳性肿瘤细胞的特异性细胞裂解作用，在各种TCP存在的情况下，对与RPMI-8226或l363细胞共培养的ICAP-T或CAR-T细胞(E:T＝8:1)进行细胞裂解/杀伤测定。实施例9中描述了用于悬浮细胞系的T细胞的细胞毒性和IFNγ分泌测定。
如图16所示，M-ICAP-T与TCP001-C的组合对肿瘤靶细胞具有较强的特异性杀伤作用，而TCP001-C(仅结合BCMA阳性细胞)或TCP-MD(不结合BCMA阳性细胞)不能有效杀死FaDu/SK-OV3细胞。此外，IFNγ分泌数据与细胞毒性数据一致。与阴性对照组(TCP001-N或TCP-MD或IgG)相比，M-ICAP-T与0.2ug/ml TCP001-C/P的组合特异性诱导RPMI-8226和L363细胞系上的IFNγ释放。IFNγ释放的排序为：TCP001>TCP003>TCP002。
实施例11：ICAP-T细胞与TCP(结合EGFR)的组合对FaDu/SK-OV3细胞的细胞裂解作 用
为了使ICAP-T细胞作用于EGFR阳性肿瘤细胞，需要有一个能够与EGFR特异性结合的TCP。TCP021-P可以在其两端分别结合ICAP和EGFR。为验证ICAP-T细胞与该特异性TCP联合作用对EGFR阳性肿瘤细胞如FaDu(人咽鳞状细胞癌)和SK-OV3(人卵巢癌细胞)的杀伤作用，我们比较了在各种TCP存在的情况下，与FaDu/SK-OV3细胞共培养的ICAP-T或CAR-T细胞的杀伤效果。
使用基于阻抗的RTCA TP仪器和方法(xCELLigence)进行T细胞对粘附细胞系的细胞毒性测定。将目标肿瘤细胞在RTCA TP仪器中以每孔10,000个细胞接种在底部有电阻器的96孔板中过夜(超过16小时)。将双特异性TCP或抗体添加到培养的靶肿瘤细胞中，并将细胞进一步培养30分钟。然后将ICAP-T或CAR-T细胞与靶肿瘤细胞以不同的效应细胞：靶细胞比率孵育约100小时(终点取决于转化的T细胞的杀伤效率)。实验过程中，细胞指数值与肿瘤细胞贴壁密切相关，细胞贴壁越低，细胞毒性越高，RTCA系统每5-10分钟采集一次。实时杀伤曲线由系统软件自动生成。每个转化T细胞的特异性杀伤(Specific lysis)(％)也使用48h点的数据计算[特异性杀伤＝(单独的肿瘤细胞的细胞指数-与肿瘤细胞共培养的转化T细胞的细胞指数)/单独的肿瘤细胞的细胞指数]。
如图17所示，与EGFRCAR-T类似，M-ICAP-T与TCP021-P的组合对两种不同的肿瘤靶细胞具有较强的特异性杀伤作用(T细胞的非特异性杀伤作用对E:T更为明显＝4:1)，而TCP001-C(仅结合BCMA阳性细胞)或TCP-MD(不结合EGFR阳性细胞)的组合不能有效杀伤FaDu或SK-OV3细胞。
实施例12：有TCP的ICAP-T细胞针对Daudi细胞的IFN-γ释放和细胞裂解作用
为了使ICAP-T细胞作用于B细胞，必须有能够特异性结合CD19的TCP。TCP011-P可以在其两端分别绑定ICAP和CD19。为了验证ICAP-T细胞与这种特异性TCP的租后对CD19阳性B细胞的影响，在存在各种TCP的情况下，我们比较了ICAP-T或CAR-T细胞与Daudi细胞共培养时Daudi细胞的细胞裂解和IFN-γ的释放情况。用于悬浮细胞系的T细胞的细胞毒性和IFNγ分泌检测测定如实施例9所述。
如图18所示，IFN-γ分泌显示出显著差异。M-ICAP-T与TCP011-P的组合在杀伤和IFN-γ分泌方面与CD19CAR-T相似。尽管TCP001-C(与BCMA结合)对Daudi细胞产生杀伤作用，但T细胞分泌的IFN-γ水平显著下降。此外，与TCP-MD(无法结合Daudi细胞)组合时，无法有效分泌IFN-γ。
实施例13：分泌VHH的ICAP-T的产生和表征
由于肿瘤微环境复杂，目前临床试验中大多数针对实体瘤的CAR-T疗法的临床疗效很低。为了增强ICAP-T细胞系统的抗肿瘤作用，制备分泌免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1，一种在肿瘤中抑制细胞因子的拮抗剂，如抗TGFβ等)的M-ICAP-T细胞，该细胞通过同时用M-ICAP肽(来自MII+III肽)和编码分泌的免疫检查点抑制剂的质粒转染人类幼稚T细胞而产生的。
在M-ICAP-T制备13天后，使用FACS进行ICAP表达检测。结果如图19所示。与M-ICAP-T对照相比，作为VHH或scFv分泌的蛋白质的性质对ICAP表达没有任何明显影响。
ELISA用于测试分泌蛋白的浓度。将上清液加入到抗原包被的96孔板中，HRP缀合的抗-VHH和HRP-抗-His分别用于抗-PD-1VHH、抗-PD-L1VHH和抗-TGFβscFv检测。结果如图19B所示，分泌的VHH浓度约为75ng/ml，分泌的抗TGFβscFv浓度约为150ng/ml。
实施例14：分泌抗PD-1VHH阻断表面表达的PD-1
分泌的抗PD-1 VHH的结合能力通过FACS对表面表达PD-1的T细胞进行间接测试。市售的抗PD-1抗体用于在竞争测定中检查T细胞上的PD-1表达水平。如图20所示，来自分泌抗PD-1的ICAP-T细胞的上清液阻断了市售抗PD-1抗体与CD3和CD28刺激的人原代T细胞的结合。
实施例15：M-ICAP-T细胞分泌的抗TGFβscFv阻断了TGFβ-1诱导的荧光素酶细胞信 号传导
使用市售的TGFβRII-293T-Luc细胞系来确定实施例13中获得的分泌型抗TGFβscFv的阻断活性。接种5000个TGFβRII-293细胞并孵育过夜，加入测试样品，然后加入5nMTGFβ，6小时后，用ONE-GLO读取生物发光。结果如图21所示。M-ICAP T细胞分泌的抗TGFβscFv阻断了TGFβ诱导的荧光素酶信号。CAR-T-10C、10B和01A是由不同供体制备的抗TGFβM-ICAP-T细胞。
实施例16：M-ICAP-T与TCP001-C在L363-PDL1-LUC原位肿瘤模型中的体内功效研 究
下文描述了原位肿瘤模型实验，使用了NPSG小鼠(NOD-PrkdcscidIL2rgtm1/Pnk)。
1.肿瘤接种，分组，给药和动物观察
(a)L363-PDL1-luc肿瘤细胞在补充有10％热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2气氛中培养。收获在指数生长期生长的细胞并计数肿瘤接种。接种时细胞数为4.09E+8；生存能力为83.65％。
(b)对于功效研究，每只小鼠静脉内接种200uL PBS中的2*106L363-PDL1-luc细胞。肿瘤接种日期定义为第0天。当第8天肿瘤体积达到约9.4E5时，选择24只小鼠，根据动物体重和肿瘤体积随机分为7组。每组有3-5只荷瘤小鼠。根据给药的类别、剂量和给药频率设置七组。Group1作为阴性对照组，整个试验阶段只注射PBS。第2组是另一个阴性对照组，在第8天静脉注射高剂量(20×E6)抗PD-1M-ICAP-T细胞，之后每2天用PBS皮下注射7次。第3组为阳性对照组，第8天静脉注射5*E6典型BCMA CAR-T(B2121)，之后每2天用PBS皮下注射7次。第4组和第5组为两个实验组，分别注射低剂量(5*E6)和高剂量(20*E6)抗PD-1M-ICAP-T细胞，之后每2天皮下注射7次5mg/kg TCP001-C。第6组和第7组是另外两个实验组，分别注射5*E6和20*E6 M-ICAP-T细胞，之后每2天共皮下注射7次5mg/kg TCP001-C。
(c)本研究中与动物处理、护理和治疗相关的所有程序均按照保诺的机构动物护理和使用委员会(IACUC)在实验动物护理评估和认证协会(AAALAC，认证编号为001516)的指导下进行。在常规监测时，检查动物是否存在肿瘤生长和/或治疗对正常行为的任何不利影响，例如对活动能力、食物和水消耗(仅通过观察)和身体的影响体重增加/减轻(在给药前每周两次测量体重，在给药阶段每天测量一次)，眼睛/头发消光和任何其他异常影响，包括肿瘤溃疡。当任何动物体重减轻达到10％时，告知发起人。
2.体重；肿瘤测量
每周两次测量体重和生物发光信号。荷瘤小鼠的体重变化结果如图22所示。试验期间在任何组中均未观察到异常体重变化。
从细胞注射后第4天开始，使用IVIS lumina XR每周两次测量小鼠体内的生物发光信号，并在整个研究过程中进行。信号由Living Image软件量化。如图23所示，在研究期间(第8天-第26天)，第2组(在肿瘤接种后仅注射M-ICAP-T)和第1组(仅肿瘤接种)之间的疗效没有显著差异。与两个阴性对照组(第1组和第2组)相比之下，注射由定期TCP001-C激活的M-ICAP-T的所有实验组(第4、5、6和7组)在原位肿瘤模型中显示出对L363-PDL1的显著功效。此外，实验组(第4、5、6和7组)显示出与典型BCMA CAR-T疗法(第3组)相似的功效。
在已建立的L363-PDL1-LUC原位肿瘤模型中，以每两天一次的频率注射M-ICAP-T细胞和定期TCP001-C注射可以显著抑制肿瘤。
3.小鼠全血抗PD-1和TCP001-C浓度分析
每周一次采集100μl外周血，用于分析小鼠全血中anti-PD-1和TCP001-C浓度的计数。在96孔板上将1μg/ml PD-1蛋白包被过夜，用于ELISA结合测定。将稀释的样品与稀释的标准样品(2ng/ml的8个稀释点)一起添加到孔中，并在37℃下静置1小时。然后加入抗VHH-混合物抗体作为检测抗体并加入测定试剂。在450nm处读取吸光度。如实施例9，通过对照标准曲线分析确定浓度。
如图24所示，抗PD-1 VHH只能在第2、4和5组两个采样时间点(第15天、第22天)显著检测到。第2、4和5组使用抗PD-1 M-ICAP-T作为效应T细胞，表明抗PD-1 M-ICAP-T细胞可以在体内成功分泌PD-1。
TCP001-C浓度的分析方法已在抗体生产和表征部分的“人血浆中抗体的稳定性评估”方法中进行了描述(实施例5)。皮下注射TCP001-C后，24小时以及48小时采集的外周血中可检测到高浓度的TCP001-C。这表明TCP001-C在体内的半衰期超过48小时，每两天注射一次的频率足以支持M-ICAP-T对L363肿瘤细胞的功效。
实施例17：鉴定和表征示例性BCMA肽基序作为用于体外和体内扩增CAR-T的通用 标签系统
肽基序(长约20-30个氨基酸)融合到抗原结合结构域的N端CAR-T细胞受体(scFv或VHH)作为通用ICAP用于体外或体内CAR-T扩增。以下标准用于肽基序设计。
首先，所述肽的长度约为20-30个氨基酸。第二，可以获得具有高结合亲和力的对该肽基序特异的纳米抗体(KD<1nM)。最后，当肽融合到CAR-T细胞的嵌合抗原受体的抗原结合结构域(scFv或VHH)的N端时，靶向所述肽的纳米抗体在体外或体内成功诱导CAR-T扩增。
1.一种对MSLN具有高亲和力的VHH序列的鉴定和表征
使用羊驼免疫文库鉴定了一种对MSLN具有高亲和力的VHH纳米抗体。羊驼免疫筛查程序、采血、文库构建、固体淘选、ELISA或FACS筛选阳性克隆、抗体纯化和随后通过SPR和FACS进行的抗体表征如实施例2中所述。获得了一个名为抗MSLN-1444 VHH的阳性克隆。
如表6所示，抗MSLN-1444对MSLN的VHH His抗原的亲和力很高，KD为2.10E-09。
表6：BCMA-TCP与BMCA结合的动力学
抗体 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
1444(VHH) 5.37E+04 7.50E-05 2.10E-09
如图25所示，抗MSLN-1444 VHH对HEK293T-MSLN细胞表现出良好的特异性结合亲和力。
2.BCMA全长VHH结合剂可有效识别的BCMA肽(BCMA ICAP)的鉴定
BCMA肽基序(～20aa)可以被来自先前制备的具有BCMA-hFc抗原的免疫文库中的一些BCMA候选结合蛋白以高亲和力识别，并且设计了许多候选VHH序列，这些序列具有与全长BCMA的各种结合特性。选择来自天然BCMA(BCMA ECD结构域的1-23aa，表7—SEQ ID NO:17)的BCMA mut1，并且待表达的靶向MSLN的抗MSLN-1444 VHH序列与BCMA mut1的融合多肽如图26所示。
然后我们过滤出对其具有高亲和力的三个VHH序列(下文所述#36，#102和#367)。BCMA mut1的序列也显示在表7(SEQ ID NO:18)中，这三个VHH序列被表达为hFc融合蛋白，命名为36(VHH)、102(VHH)和367(VHH)，过程如专利公开文本WO2020176815A2(在此以引用的方式整体并入并用于所有目的)中所述。通过SPR测量三种VHH纳米抗体的结合亲和力。如图27所示，三个VHH显示出与BCMA mut1的高亲和力结合。这三种VHH的结合动力学参数显示在表8中。选择抗BCMA VHH 36#作为刺激剂是因为其对BCMA ICAP BMCA mut1具有更高的亲和力。
表7：BCMA ICAP BCMA mut1的序列
Figure BDA0003718994750000421
表8：抗BCMA VHH对BCMA ICAP BCMA mut1的动力学参数
分析物配体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
BCMA mut1#36 4.33E+07 1.24E-03 2.87E-11
BCMA mut1#367 6.55E+06 8.41E-04 1.29E-10
BCMA mut1#102 6.99E+06 0.001547 2.22E-10
3.BCMA ICAP可用于用BCMA ICAP特异性扩增CAR T细胞
如图28A所示构建ICAP-1-23-3GS载体，其中BCMAmut1(ICAP)在抗MSLN CAR的N末端与(G4S)3接头连接。通过以下过程制备BCMAmut1-MSLN-1444 CAR-T细胞：用BCMAmut1-MSLN-1444载体转染，然后分别用涂敷的MSLN和抗CD28或抗BCMAmut1 36#和抗CD28刺激。与培养9天后由抗原MSLN刺激的CAR-T细胞相比，上述CAR-T细胞在2个供体(图28B、28C和图29A、29B)中显示出相当的扩增能力。
4.抗BCMAmut 136#不刺激BCMA ICAP的CAR T细胞的非特异性扩增
为了测试抗BCMAmut1 36#刺激BCMA ICAP CAR-T细胞的特异性，如图30A所示构建了MSLN-1444 CAR载体，并通过以下过程制备：转染PBMC然后分别用涂敷的MSLN和抗CD28或抗BCMAmut1 36#和抗CD28刺激。结果如图30B所示；只有那些用MSLN和抗CD28刺激的CAR T细胞显示出清晰的扩增。用抗BCMA36#和抗CD28刺激的MSLN-1444 CAR在2个供体中未显示扩增。
其他核酸和氨基酸序列
MSLN区域II+区域III(M3)DNA：
TCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCG(SEQ ID NO:19)
MSLN区域II+区域III(M3)蛋白：
SLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALS(SEQ ID NO:20)
M-ICAP CAR ORF DNA：
ATGGCCTTGCCAACGGCTCGACCCCTGTTGGGGTCCTGTGGGACCCCCGCCCTCGGCAGCCTCCTGTTCCTGCTCTTCAGCCTCGGATGGGTGCAGCCCCACCACCACCATCACCACGGAGGAGGCGGATCTTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA(SEQ ID NO:21)
M-ICAP CAR ORF蛋白：
MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPHHHHHHGGGGSSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:22)
M-ICAP-SP3 CAR ORF DNA:
ATGAAGCACCTCTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCTAGATGGGTGCTGTCTCACCACCACCATCACCACGGAGGAGGCGGATCTTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA(SEQ ID NO:23)
M-ICAP-SP3 CAR ORF蛋白：
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSHHHHHHGGGGSSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:24)
M-ICAP-SP5 CAR ORF DNA:
ATGACCAGGCTGACAGTGCTGGCTCTGCTGGCCGGACTGCTGGCTTCTTCTAGAGCTCACCACCACCATCACCACGGAGGAGGCGGATCTTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA(SEQ ID NO:25)
M-ICAP-SP5 CAR ORF蛋白：
MTRLTVLALLAGLLASSRAHHHHHHGGGGSSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:26)
M(2339VHH)DNA序列：
CAGCTGCAGCTGGGCGCCTCTGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGTGCCCTGTCTGGCTTCACACTGAGAGAGCTGGACGAGTTCGCCATCGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCTGGCAAGGAGAGAGAGGGCGTGAGCTGTATCAGCGGCACAGGCGGCATCACACATTATGCTGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACAATCAGCAGAGACATCGCCAAGACAACCGTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAACAGCGAAGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCGCCGACGAGAGATGTACAGACAGACTGATCAGACCTCCTACATATTGGGGACAAGGCACCCAGGTGACAGTCTCTTCT(SEQ ID NO:27)
M(2339VHH)蛋白序列：QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:28)
TCP001-C和MC001C中的BCMA B029(VHH)序列：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSS(SEQ ID NO:29)
在TCP011-P中的CD19 scFv序列(来自CN201480027401.4)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:30)
TCP021-P中的EGFR E454(VHH)序列：
QVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFDFSSVTMSWHRQSPGKERETVAVISNIGNRNVGSSVRGRFTISRDNKKQTVHLQMDNLKPEDTGIYRCKAWGLDLWGPGTQVTVSS(SEQ ID NO:31)
TCP001-N中的GFP scFv序列：
QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:32)
来自的US7494651B2抗TGFβscF(mAb12.7)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSEWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPALGSTNYNEMYEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGIGNYALDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNIEDPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:33)
US20180327494中的PD-L1 BMK1 VHH(恩伐利单抗)：QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLTTSGSTYLADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:34)
1444(VHH)蛋白序列：
QVQVVESGGGFVQAGGSLRLSCAASTPIISIAYMGWYRQISEKERQLVATINSGGKTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNMLKPEDTGMYYCAASNKDYNDYDPDWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:35)
TCP001-P中的B2121 scFv序列：
DIVLTQSPASLAMSLGERATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISRVQAEDAAIYSCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGESVKISCKASGYTFTDYSINWVKQAPGQGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:36)
TCP001-C:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ IDNO:37)
TCP001-P:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAMSLGERATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISRVQAEDAAIYSCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGESVKISCKASGYTFTDYSINWVKQAPGQGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:38)
TCP001-N:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:39)
TCP011-P:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:40)
TCP021-P:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFDFSSVTMSWHRQSPGKERETVAVISNIGNRNVGSSVRGRFTISRDNKKQTVHLQMDNLKPEDTGIYRCKAWGLDLWGPGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:41)
TCP002-C:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSAAAESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSS(SEQ ID NO:42)
TCP003-C:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSAAAGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:43)
TCP-MC:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:44)TCP-MD:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(SEQ ID NO:45)
已经示出并描述了本文所包含的主题的示例性实施方式，可以通过适当的修改来实现本文所描述的方法和系统的进一步改变而不背离权利要求的范围。另外，在上述方法和步骤指示以特定顺序发生的某些事件的情况下，某些步骤不必以所描述的顺序执行，而是以任何顺序执行，只要这些步骤允许实施方式按其预期目的生效即可。因此，就本发明的变化而言，其在本公开的精神之内或等同于权利要求书中的发明，意图是该专利也将涵盖这些变化。一些这样的修改对于本领域技术人员应该是显而易见的。例如，以上讨论的示例，实施方式，几何形状，材料，尺寸，比率，步骤等是说明性的。因此，权利要求书不应限于书面说明书和附图中阐述的结构和操作的具体细节。
具体实施方式
实施方式1：一种免疫细胞，其包含表达的免疫细胞激活多肽，所述多肽包含胞内信号转导结构域、跨膜结构域和细胞外标记结构域，其中所述免疫细胞一种或多种分泌的多肽效应分子。
实施方式2：一种免疫细胞，其包含表达的免疫细胞激活多肽，所述多肽包含胞内信号转导结构域、跨膜结构域和胞外嵌合多肽，所述胞外嵌合多肽包含VHH抗体或单链可变片段的结合结构域和标记结构域，其中所述免疫细胞一种或多种分泌的多肽效应分子。
实施方式3：如实施方式1或实施方式2所述的免疫细胞，其中所述标记结构域包含衍生自结构膜蛋白或胎蛋白的多肽。
实施方式4：如实施方式1-3中任一项所述的免疫细胞，其中所述多肽效应分子包含特异性结合一种或多种免疫调节剂的抗体或其结合片段。
实施方式5：如实施方式4所述的免疫细胞，其中所述抗体是VHH抗体。
实施方式6：如实施方式4所述的免疫细胞，其中所述免疫调节剂是PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG-3、TIM-3、BTLA、CD3、CD27、CD28、CD40、CD160、2B4、4-1BB、GITR、OX40、VEGF、VEGFR、TGFβ、TGFβR、HVEM或LIGHT。
实施方式7：如实施方式1-6中任一项所述的免疫细胞，其中所述标记结构域特异性结合双特异性多肽，所述双特异性多肽包含标记结合结构域和细胞表面蛋白结合结构域，所述标记结合结构域包含单链多肽，所述细胞表面蛋白结合结构域包含结合细胞的细胞表面受体的单链多肽。
实施方式8：一种包含核酸载体的免疫细胞，所述核酸载体包含：
(a)对所述免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸，所述多肽包括信号转导结构域、跨膜结构域和标记结构域；和
(c)有效终止所述免疫细胞转录的终止子区域。
实施方式9：如实施方式8中所述的免疫细胞，所述免疫细胞进一步包含第二核酸载体，所述第二核酸载体包含：
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码一种或多种分泌型多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；
(c)有效终止免疫细胞转录的终止子区域。
实施方式10：如实施方式8中所述的免疫细胞，其中，所述核酸载体进一步包含编码一种或多种分泌型多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸。
实施方式11：如实施方式8-10中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞激活剂多肽还包含VHH抗体或单链可变片段的结合结构域。
实施方式12：如实施方式8-11中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞激活多肽含有嵌合多肽，所述嵌合多肽含有(i)VHH抗体的结合结构域或单链可变片段和(ii)所述标记结构域。
实施方式13：如实施方式12所述的免疫细胞，其中所述嵌合多肽是分支的。
实施方式14：如实施方式8-13中任一项所述的免疫细胞，其中所述标记结构域包含衍生自胎蛋白的多肽。
实施方式15：如实施方式8-13中任一项所述的免疫细胞，其中所述的标记结构域包含结构膜蛋白。
实施方式16：如实施方式8-15中任一项所述的免疫细胞，其中所述信号转导结构域包含共刺激结构域和T细胞受体(TCR)信号传导结构域。
实施方式17：如实施方式16所述的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包含CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40或CD40L。
实施方式18：如实施方式16或实施方式17所述的免疫细胞，其中所述TCR信号传导结构域包含CD3ζ或CD3ε。
实施方式19：如实施方式16-18中任一项的免疫细胞，其中所述信号转导结构域包含CD28和CD3ζ。
实施方式20：如实施方式8-19中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包含参与免疫共刺激信号传导的结构域。
实施方式21：如实施方式8-20中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包含CD28.
实施方式22：如实施方式21所述的免疫细胞，其中所述CD28包含ITAM结构域。
实施方式23：如实施方式8-18和20-22中任一项所述的免疫细胞，其中所述CD3ε结构域包含氨基酸YMNM。
实施方式24：根据实施方式8-23中任一项所述的免疫细胞，其中至少一种核酸载体还包含PiggyBac转座酶。
实施方式25：根据实施例8-23中任一项所述的免疫细胞，其中至少一种核酸载体进一步包含转座子反向末端重复序列。
实施方式26：如实施方式8-25中任一项所述的免疫细胞，其中所述多肽效应分子包含特异性结合一种或多种免疫调节剂的抗体或其结合片段。
实施方式27：如实施方式26所述的免疫细胞，其中所述抗体是VHH抗体。
实施方式28：如实施方式26或实施方式27所述的免疫细胞，其中所述免疫调节剂是PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG-3、TIM-3、BTLA、CD3、CD27、CD28、CD40、CD160、2B4、4-1BB、GITR、OX40、VEGF、VEGFR、TGFβ、TGFβR、HVEM或LIGHT。
实施方式28：如实施方式8-25中任一项所述的免疫细胞，其中所述多肽效应分子包含细胞因子。
实施方式30：如实施方式29所述的免疫细胞，其中所述细胞因子是TGF-β、VEGF、TNF-α、CCR5、CCR7、IL-2、IL-7、IL-15或IL-17。
实施方式31：如实施方式8-30中任一项所述的免疫细胞，其为T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子激活的杀伤细胞、树突细胞-细胞因子激活的杀伤细胞、γδ-T细胞、自然杀伤T细胞或自然杀伤细胞。
实施方式32：一种免疫细胞激活剂多肽，包括：
(a)标记结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)信号转导结构域。
实施方式33：如实施方式32所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述信号转导结构域包含共刺激结构域和T细胞受体(TCR)信号传导结构域。
实施方式34：如实施方式33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述共刺激结构域包含CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40或CD40L。
实施方式35：如实施方式33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述TCR信号传导结构域包含CD3ζ或CD3ε。
实施方式36：如实施方式33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述信号转导结构域包含CD28，其在其C末端连接至CD3ε信号结构域的N末端。
实施方式37：如实施方式33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述信号转导结构域包含共刺激结构域4-1BB，其在C末端连接CD3ε信号传导结构域的N末端。
实施方式38：如实施方式32-37中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述标记结构域包含衍生自胎蛋白的多肽。
实施方式39：如实施方式32-37中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述标记结构域包含结构膜蛋白。
实施方式40：如实施方式32-39中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述跨膜结构域包含参与免疫共刺激信号传导的结构域。
实施方式41：如实施方式32-40中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述跨膜结构域包含CD28或结构膜蛋白。
实施方式42：如实施方式32-41中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中CD28包含ITAM结构域。
实施方式43：如实施方式32-42中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中CD3ε结构域包含氨基酸YMNM。
实施方式44：一种核酸载体，包括
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(c)有效终止免疫细胞转录的终止子区域。
实施方式45：如实施方式44所述的核酸载体，其进一步包含转座子反向末端重复序列。
实施方式46：一种核酸载体，包括：
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码一种或多种分泌型多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸。
(c)有效终止免疫细胞转录的终止子区域。
实施方式47：如实施方式46所述的核酸载体，其进一步包含转座子反向末端重复序列。
实施方式48：根据实施方式46或实施方式47的核酸载体，其中所述多肽效应分子包含特异性结合一种或多种免疫调节剂的抗体或其结合片段。
实施方式49：根据实施方式48的核酸载体，其中所述抗体是VHH抗体。
实施方式50：根据实施方式46或实施方式47的核酸载体，其中所述多肽效应分子包含细胞因子。
实施方式51：一种双特异性多肽，包含：
(a)标记结合域(L-bd)，其包含与实施方式32-40中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽的标记结构域特异性结合的单链多肽结构域；和
(b)细胞表面蛋白结合结构域(CSP-bd)，其包含与细胞的细胞表面受体结合的单链多肽结构域。
实施方式52：如实施方式51所述的双特异性多肽，其中所述标记结合结构域包含骆驼科动物IgG的VHH结构域。
实施方式53：如实施方式51或实施方式52所述的双特异性多肽，其包含约15-20个氨基酸的CDR3结构域。
实施方式54：如实施方式51-53中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞是淋巴细胞。
实施方式55：如实施方式54所述的的双特异性多肽，其中所述淋巴细胞是B细胞。
实施方式56：如实施方式51-53中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞是肿瘤细胞。
实施方式57：如实施方式56所述的双特异性多肽，其中所述肿瘤是淋巴瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌或间皮瘤。
实施方式58：如实施方式56或57所述的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白是EGFR。
实施方式59：如实施方式56或57的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白是GPC3。
实施方式60：如实施方式51-57中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白结合结构域与肿瘤细胞表面上表达的EGFR蛋白特异性结合。
实施方式61：如实施方式51-57中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白结合结构域与淋巴瘤细胞表面上的CD19、CD20或CD22特异性结合。
实施方式62：如实施方式51-57中任一项所述的双特异性多肽，其包含VHH抗体。
实施方式63：如实施方式51-62中任一项所述的双特异性多肽，其进一步包含提供另外的生物化学活性或生物学功能的一个或多个结构域。
实施方式64：如实施方式63所述的双特异性多肽，其中所述另外的生物化学活性或生物学功能包括：荧光团的特异性结合、延长所述双特异性多肽的体内半衰期、增加所述双特异性多肽的亲和力，和调节由Fc结构域介导的免疫应答。
实施方式65：如实施方式51-62中任一项所述的双特异性多肽，其还包含另外的细胞表面蛋白结合域，所述细胞表面蛋白结合域包含单链多肽结构域，其结合相同或不同细胞的不同细胞表面受体。
实施方式66：一种用于在邻近靶细胞处原位产生一种或多种多肽效应分子的试剂盒，包括：
(a)如实施方式8-31中任一项所述的免疫细胞；和
(b)如实施方式51-65中任一项所述的双特异性多肽。
实施方式67：如实施方式66所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白结合结构域与B细胞上的CD19特异性结合。
实施方式68：如实施方式66或实施方式67所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白结合结构域与肿瘤细胞上的EGFR、间皮素、BCMA、MUC1或GPC3特异性结合。
实施方式69：一种在对象的肿瘤细胞的位置处免疫系统环境的方法，包括：
(a)向对象同时或依次给予有效量的实施方式9-31中任一项所述的免疫细胞和有效量的实施方式51-65中任一项所述的第一双特异性多肽，其中所述双特异性多肽包含特异性结合淋巴细胞的细胞表面蛋白的细胞表面蛋白结合域；和
(b)向对象给予有效量的实施方式51-65中任一项所述的第二双特异性多肽，其中所述双特异性多肽包含与肿瘤细胞的细胞表面蛋白特异性结合的细胞表面蛋白结合域。
实施方式70：如实施方式69所述的方法，进一步包括在步骤a和b之间执行的测量对象中免疫细胞的量的步骤。
实施方式71：如实施方式70所述的方法，其中测量所述对象的血液中的免疫细胞的量。
实施方式72：如实施方式70所述的方法，其中测量浸润所述对象肿瘤的免疫细胞的数量。
实施方式73：如实施方式69-72中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、细胞因子激活的杀伤细胞、树突细胞-细胞因子激活的杀伤细胞、γδ-T细胞、自然杀伤T细胞，或自然杀伤细胞。
实施方式74：如实施方式69-73中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞的细胞表面蛋白是B细胞的CD19。
实施方式75：如实施方式69-74中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞是淋巴瘤细胞、间皮细胞、非小细胞肺癌细胞、卵巢细胞、肝癌或乳腺癌细胞。
实施方式76：如实施方式75所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是EGFR、间皮素、BCMA、MUC1或GPC3。
实施方式77：一种在对象的肿瘤细胞位置处调节免疫系统环境的方法，包括：
(a)在体外增殖所述对象的转化的免疫细胞，以获得增殖的T细胞；并将增殖的T细胞给予对象；其中所述免疫细胞包含第一核酸载体，所述第一核酸载体包含核酸载体，所述核酸载体包含：
(i)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(ii)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(iii)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
并且所述免疫细胞包含第二核酸载体，所述第二核酸载体包含：
(iv)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(v)编码一种或多种分泌型多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；和
(vi)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
和
(b)向对象给予有效量以激活增殖的免疫细胞从而表达免疫调节多肽的双特异性多肽，所述双特异性多肽包含细胞表面蛋白结合域和具有确定的氨基酸序列的标记结合域，所述标记结合域与由增殖的免疫细胞表达的标记结构域特异性结合，所述细胞表面蛋白结合域与肿瘤细胞的细胞表面受体特异性结合。
实施方式78：如实施方式77所述的方法，其中所述肿瘤细胞是过表达间皮素和PDL1的间皮细胞，并且所述细胞表面蛋白是在间皮细胞表面上表达的间皮素，并且其中所述效应分子包含特异性结合PD-1或CD40的VHH结构域。
实施方式79：如实施方式77或实施方式78所述的方法，其中所述肿瘤细胞是B细胞，并且所述细胞表面蛋白是B细胞表面上的CD19、CD20或CD22。
实施方式80：如实施方式77-79中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞，细胞因子激活的杀伤细胞、树突细胞-细胞因子激活的杀伤细胞、γδ-T细胞、自然杀伤T细胞或自然杀伤细胞。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
上海细胞治疗集团药物技术有限公司
<120> 表达免疫调节分子的细胞和表达免疫调节分子的系统
<130> SHC001PCT
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人信号肽
<400> 1
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人信号肽
<400> 2
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala
<210> 3
<211> 123
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Ser Phe Ile Ser
20 25 30
Ala Ala Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Asn Thr Gly Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Ala Pro Pro Pro Gly Gly Leu Gly Tyr Asp Glu Ser Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人
<400> 4
Tyr Met Asn Met
1
<210> 5
<211> 60
<212> PRT
<213> 人
<400> 5
Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro
20 25 30
Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly
35 40 45
Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly Ile
50 55 60
<210> 6
<211> 53
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln
1 5 10 15
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe
35 40 45
Met Val Trp Ser Arg
50
<210> 7
<211> 54
<212> PRT
<213> 人
<400> 7
Met Ala Leu Ser Glu Pro Ile Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Ala Ser
1 5 10 15
Pro Cys Arg Glu Arg Gly Leu Gln Glu Arg Trp Pro Arg Ala Glu Pro
20 25 30
Glu Ser Gly Gly Thr Asp Asp Asp Leu Asn Ser Val Leu Asp Phe Ile
35 40 45
Leu Ser Met Gly Leu Asp
50
<210> 8
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 骆驼科动物ICAP标签结构域
<400> 8
Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro
20 25 30
Arg Thr Trp Leu Ser Phe
35
<210> 9
<211> 64
<212> PRT
<213> 人
<400> 9
Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val
20 25 30
Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro
35 40 45
Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu
50 55 60
<210> 10
<211> 96
<212> PRT
<213> 人
<400> 10
Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg
20 25 30
Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro
35 40 45
Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro
50 55 60
Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn
85 90 95
<210> 11
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<212> PRT
<213> 人
<400> 11
Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile
1 5 10 15
Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu
20 25 30
Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly
35 40 45
Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr
50 55 60
Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala
65 70 75 80
Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala
85 90 95
Glu Val Gln Lys Leu
100
<210> 12
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 金属蛋白酶可切割接头
<400> 12
Arg Val Leu Ala Glu Ala
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 金属蛋白酶可切割接头
<400> 13
Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr
1 5 10
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 金属蛋白酶可切割接头
<400> 14
Gly Gly Ile Glu Gly Arg Gly Ser
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 因子IXa/因子VIIa可切割接头
<400> 15
Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp
1 5 10 15
Val
<210> 16
<211> 254
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 16
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Asn
145 150 155 160
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Val Thr Met Ser
165 170 175
Trp His Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val Ala Val Ile
180 185 190
Ser Asn Ile Gly Asn Arg Asn Val Gly Ser Ser Val Arg Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Lys Lys Gln Thr Val His Leu Gln Met Asp
210 215 220
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Arg Cys Lys Ala Trp Gly
225 230 235 240
Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 17
<211> 54
<212> PRT
<213> 人
<400> 17
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala
50
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人
<400> 18
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro
20
<210> 19
<211> 624
<212> DNA
<213> 人
<400> 19
tccctggaga ccctgaaggc tttgcttgaa gtcaacaaag ggcacgaaat gagtcctcag 60
gtggccaccc tgatcgaccg ctttgtgaag ggaaggggcc agctagacaa agacacccta 120
gacaccctga ccgccttcta ccctgggtac ctgtgctccc tcagccccga ggagctgagc 180
tccgtgcccc ccagcagcat ctgggcggtc aggccccagg acctggacac gtgtgaccca 240
aggcagctgg acgtcctcta tcccaaggcc cgccttgctt tccagaacat gaacgggtcc 300
gaatacttcg tgaagatcca gtccttcctg ggtggggccc ccacggagga tttgaaggcg 360
ctcagtcagc agaatgtgag catggacttg gccacgttca tgaagctgcg gacggatgcg 420
gtgctgccgt tgactgtggc tgaggtgcag aaacttctgg gaccccacgt ggagggcctg 480
aaggcggagg agcggcaccg cccggtgcgg gactggatcc tacggcagcg gcaggacgac 540
ctggacacgc tggggctggg gctacagggc ggcatcccca acggctacct ggtcctagac 600
ctcagcatgc aagaggccct ctcg 624
<210> 20
<211> 208
<212> PRT
<213> 人
<400> 20
Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu
1 5 10 15
Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg
20 25 30
Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro
35 40 45
Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro
50 55 60
Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn
85 90 95
Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly
100 105 110
Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met
115 120 125
Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu
130 135 140
Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu
145 150 155 160
Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln
165 170 175
Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile
180 185 190
Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser
195 200 205
<210> 21
<211> 1293
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> M-ICAP CAR ORF 编码DNA
<400> 21
atggccttgc caacggctcg acccctgttg gggtcctgtg ggacccccgc cctcggcagc 60
ctcctgttcc tgctcttcag cctcggatgg gtgcagcccc accaccacca tcaccacgga 120
ggaggcggat cttccctgga gaccctgaag gctttgcttg aagtcaacaa agggcacgaa 180
atgagtcctc aggtggccac cctgatcgac cgctttgtga agggaagggg ccagctagac 240
aaagacaccc tagacaccct gaccgccttc taccctgggt acctgtgctc cctcagcccc 300
gaggagctga gctccgtgcc ccccagcagc atctgggcgg tcaggcccca ggacctggac 360
acgtgtgacc caaggcagct ggacgtcctc tatcccaagg cccgccttgc tttccagaac 420
atgaacgggt ccgaatactt cgtgaagatc cagtccttcc tgggtggggc ccccacggag 480
gatttgaagg cgctcagtca gcagaatgtg agcatggact tggccacgtt catgaagctg 540
cggacggatg cggtgctgcc gttgactgtg gctgaggtgc agaaacttct gggaccccac 600
gtggagggcc tgaaggcgga ggagcggcac cgcccggtgc gggactggat cctacggcag 660
cggcaggacg acctggacac gctggggctg gggctacagg gcggcatccc caacggctac 720
ctggtcctag acctcagcat gcaagaggcc ctctcgatct acatctgggc gcccctggcc 780
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 840
aagaagctcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 900
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 960
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1020
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1080
cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1140
cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1200
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1260
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc tga 1293
<210> 22
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-ICAP CAR ORF 蛋白
<400> 22
Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln
20 25 30
Pro His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu Glu Thr
35 40 45
Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln
50 55 60
Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp
65 70 75 80
Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys
85 90 95
Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp
100 105 110
Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp
115 120 125
Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser
130 135 140
Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu
145 150 155 160
Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr
165 170 175
Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu
180 185 190
Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu
195 200 205
Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp
210 215 220
Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr
225 230 235 240
Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Ile Tyr Ile Trp
245 250 255
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
260 265 270
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
275 280 285
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
290 295 300
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
305 310 315 320
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
325 330 335
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
340 345 350
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
355 360 365
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
370 375 380
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
385 390 395 400
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
405 410 415
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425 430
<210> 23
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> M-ICAP-SP3 CAR ORF-编码DNA
<400> 23
atgaagcacc tctggttctt cctcctgctg gtggcagctc ctagatgggt gctgtctcac 60
caccaccatc accacggagg aggcggatct tccctggaga ccctgaaggc tttgcttgaa 120
gtcaacaaag ggcacgaaat gagtcctcag gtggccaccc tgatcgaccg ctttgtgaag 180
ggaaggggcc agctagacaa agacacccta gacaccctga ccgccttcta ccctgggtac 240
ctgtgctccc tcagccccga ggagctgagc tccgtgcccc ccagcagcat ctgggcggtc 300
aggccccagg acctggacac gtgtgaccca aggcagctgg acgtcctcta tcccaaggcc 360
cgccttgctt tccagaacat gaacgggtcc gaatacttcg tgaagatcca gtccttcctg 420
ggtggggccc ccacggagga tttgaaggcg ctcagtcagc agaatgtgag catggacttg 480
gccacgttca tgaagctgcg gacggatgcg gtgctgccgt tgactgtggc tgaggtgcag 540
aaacttctgg gaccccacgt ggagggcctg aaggcggagg agcggcaccg cccggtgcgg 600
gactggatcc tacggcagcg gcaggacgac ctggacacgc tggggctggg gctacagggc 660
ggcatcccca acggctacct ggtcctagac ctcagcatgc aagaggccct ctcgatctac 720
atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 780
tactgcaaac ggggcagaaa gaagctcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 840
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 900
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 960
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1020
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1080
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1140
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1200
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgctg a 1251
<210> 24
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-ICAP-SP3 CAR 蛋白
<400> 24
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu
20 25 30
Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser
35 40 45
Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln
50 55 60
Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser
85 90 95
Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln
100 105 110
Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn
115 120 125
Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro
130 135 140
Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu
145 150 155 160
Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val
165 170 175
Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala
180 185 190
Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln
195 200 205
Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn
210 215 220
Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Ile Tyr
225 230 235 240
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
245 250 255
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
260 265 270
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
275 280 285
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
290 295 300
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
305 310 315 320
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
325 330 335
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
340 345 350
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
355 360 365
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
370 375 380
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
385 390 395 400
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405 410 415
<210> 25
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> [00245] M-ICAP-SP5 CAR ORF-编码DNA
<400> 25
atgaccaggc tgacagtgct ggctctgctg gccggactgc tggcttcttc tagagctcac 60
caccaccatc accacggagg aggcggatct tccctggaga ccctgaaggc tttgcttgaa 120
gtcaacaaag ggcacgaaat gagtcctcag gtggccaccc tgatcgaccg ctttgtgaag 180
ggaaggggcc agctagacaa agacacccta gacaccctga ccgccttcta ccctgggtac 240
ctgtgctccc tcagccccga ggagctgagc tccgtgcccc ccagcagcat ctgggcggtc 300
aggccccagg acctggacac gtgtgaccca aggcagctgg acgtcctcta tcccaaggcc 360
cgccttgctt tccagaacat gaacgggtcc gaatacttcg tgaagatcca gtccttcctg 420
ggtggggccc ccacggagga tttgaaggcg ctcagtcagc agaatgtgag catggacttg 480
gccacgttca tgaagctgcg gacggatgcg gtgctgccgt tgactgtggc tgaggtgcag 540
aaacttctgg gaccccacgt ggagggcctg aaggcggagg agcggcaccg cccggtgcgg 600
gactggatcc tacggcagcg gcaggacgac ctggacacgc tggggctggg gctacagggc 660
ggcatcccca acggctacct ggtcctagac ctcagcatgc aagaggccct ctcgatctac 720
atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 780
tactgcaaac ggggcagaaa gaagctcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 840
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 900
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 960
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1020
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1080
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1140
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1200
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgctg a 1251
<210> 26
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M-ICAP-SP5 CAR ORF 蛋白
<400> 26
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala His His His His His His Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu
20 25 30
Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser
35 40 45
Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln
50 55 60
Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser
85 90 95
Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln
100 105 110
Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn
115 120 125
Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro
130 135 140
Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu
145 150 155 160
Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val
165 170 175
Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala
180 185 190
Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln
195 200 205
Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn
210 215 220
Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser Met Gln Glu Ala Leu Ser Ile Tyr
225 230 235 240
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
245 250 255
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
260 265 270
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
275 280 285
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
290 295 300
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
305 310 315 320
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
325 330 335
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
340 345 350
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
355 360 365
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
370 375 380
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
385 390 395 400
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405 410 415
<210> 27
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> M(2339VHH) DNA 序列
<400> 27
cagctgcagc tgggcgcctc tggcggcggc ctggtccagc ctggcggctc tctgagactg 60
agctgtgccc tgtctggctt cacactgaga gagctggacg agttcgccat cggctggttc 120
aggcaggccc ctggcaagga gagagagggc gtgagctgta tcagcggcac aggcggcatc 180
acacattatg ctgacagcgt gaagggcagg ttcacaatca gcagagacat cgccaagaca 240
accgtgtacc tgcagatgaa tagcctgaac agcgaagaca cagccgtgta ctactgtgcc 300
gccgacgaga gatgtacaga cagactgatc agacctccta catattgggg acaaggcacc 360
caggtgacag tctcttct 378
<210> 28
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> M(2339VHH) 蛋白序列
<400> 28
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> [00249] TCP001-C MC001C BCMA B029(VH) 序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Thr Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn
85 90 95
Gly Ala Pro Trp Gly Asp His Ala Pro Leu Val Val Ser Trp Asp Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TCP011-P CD19 scFv 序列
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Lys Ala Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
130 135 140
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
145 150 155 160
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
195 200 205
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
210 215 220
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TCP021-P EGFR E454(VHH)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Asn Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Val
20 25 30
Thr Met Ser Trp His Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Asn Ile Gly Asn Arg Asn Val Gly Ser Ser Val Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Lys Lys Gln Thr Val His Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Arg Cys Lys
85 90 95
Ala Trp Gly Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 32
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TCP001-N GFP scFv 序列
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Arg Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Met Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Val Asn Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗TGFB scF
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Glu
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gln Ile Phe Pro Ala Leu Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Met Tyr
50 55 60
Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ile Gly Asn Tyr Ala Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Glu Ser Val Asp Phe Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser
180 185 190
Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ile Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 34
<211> 128
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Lys Met Ser Ser Arg Arg
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val
35 40 45
Ala Lys Leu Leu Thr Thr Ser Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser
100 105 110
Gly Ala Phe Gln Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 119
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 35
Gln Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Thr Pro Ile Ile Ser Ile Ala
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ile Ser Glu Lys Glu Arg Gln Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ser Asn Lys Asp Tyr Asn Asp Tyr Asp Pro Asp Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 246
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 37
<211> 287
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 37
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Ser Ile Tyr Ala Ile Gly
165 170 175
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile
180 185 190
Thr Thr Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn Gly Ala Pro
225 230 235 240
Trp Gly Asp His Ala Pro Leu Val Val Ser Trp Asp Gln Gly Thr Gln
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser
260 265 270
Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
275 280 285
<210> 38
<211> 413
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 38
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
130 135 140
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly Glu Arg Ala
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His
165 170 175
Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Ser Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro
225 230 235 240
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser
245 250 255
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
260 265 270
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Ser Val
275 280 285
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile
290 295 300
Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp
305 310 315 320
Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly
325 330 335
Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
340 345 350
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Leu
355 360 365
Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
370 375 380
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
385 390 395 400
Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
405 410
<210> 39
<211> 282
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 39
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
145 150 155 160
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Val Asn Arg Tyr Ser Met Arg
165 170 175
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala Gly Met
180 185 190
Ser Ser Ala Gly Asp Arg Ser Ser Tyr Glu Asp Ser Val Lys Gly Arg
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met
210 215 220
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Asn
225 230 235 240
Val Gly Phe Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser His His His His His His
275 280
<210> 40
<211> 411
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 40
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
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Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp
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Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile
210 215 220
Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Lys Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser
260 265 270
Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr
275 280 285
Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln
290 295 300
Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu
305 310 315 320
Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys
325 330 335
Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr
340 345 350
Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly
355 360 365
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
385 390 395 400
Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His
405 410
<210> 41
<211> 280
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 41
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
130 135 140
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Asn
145 150 155 160
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ser Val Thr Met Ser
165 170 175
Trp His Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val Ala Val Ile
180 185 190
Ser Asn Ile Gly Asn Arg Asn Val Gly Ser Ser Val Arg Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Lys Lys Gln Thr Val His Leu Gln Met Asp
210 215 220
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Arg Cys Lys Ala Trp Gly
225 230 235 240
Leu Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser His His His His His His
275 280
<210> 42
<211> 498
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 42
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ala Ala Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
130 135 140
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
145 150 155 160
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
165 170 175
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
180 185 190
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
195 200 205
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
210 215 220
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
225 230 235 240
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
245 250 255
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
260 265 270
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
275 280 285
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
290 295 300
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
305 310 315 320
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
325 330 335
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
340 345 350
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Ser Ile Tyr Ala Ile Gly Trp Tyr Arg
405 410 415
Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Thr Thr Ser
420 425 430
Gly Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
435 440 445
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
450 455 460
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn Gly Ala Pro Trp Gly Asp
465 470 475 480
His Ala Pro Leu Val Val Ser Trp Asp Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
485 490 495
Ser Ser
<210> 43
<211> 402
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 43
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Ala Ala Ala Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
130 135 140
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
165 170 175
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
180 185 190
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
195 200 205
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
210 215 220
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
225 230 235 240
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Ser Ile Tyr
275 280 285
Ala Ile Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
290 295 300
Ala Ala Ile Thr Thr Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys
305 310 315 320
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser Leu
325 330 335
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn
340 345 350
Gly Ala Pro Trp Gly Asp His Ala Pro Leu Val Val Ser Trp Asp Gln
355 360 365
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys
370 375 380
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
385 390 395 400
His His
<210> 44
<211> 146
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Thr Ser Ile Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Leu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Thr Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Arg Asp Ser Val Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Asp Cys Asn
85 90 95
Gly Ala Pro Trp Gly Asp His Ala Pro Leu Val Val Ser Trp Asp Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gln Lys
115 120 125
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser His His His His
130 135 140
His His
145
<210> 45
<211> 152
<212> PRT
<213> 羊驼(vicugna pacos)
<400> 45
Gln Leu Gln Leu Gly Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Leu Arg Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Phe Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Gly Val Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Gly Ile Thr His Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Thr
65 70 75 80
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Arg Cys Thr Asp Arg Leu Ile Arg Pro
100 105 110
Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser His His His His His His
145 150

Claims (80)

1.一种免疫细胞，包含表达免疫细胞激活剂多肽，所述多肽包含胞内信号转导结构域、跨膜结构域和胞外标记结构域，此外，所述免疫细胞分泌一种或多种多肽效应分子。
2.一种免疫细胞，包含表达免疫细胞激活剂多肽，所述多肽包含胞内信号转导结构域、跨膜结构域和胞外嵌合多肽，所述胞外嵌合多肽包含VHH抗体或单链可变片段的结合结构域和标记结构域，此外，所述免疫细胞分泌一种或多种多肽效应分子。
3.如权利要求1或2所述的免疫细胞，其中所述标记结构域包含衍生自结构膜蛋白或胎儿蛋白的多肽。
4.如权利要求1-3所述的免疫细胞，其中所述的多肽效应分子包括可以特异性结合到一种或多种免疫调节剂的抗体或其结合片段。
5.如权利要求4所述的免疫细胞，其中所述的抗体是VHH抗体。
6.如权利要求4所述的免疫细胞，其中所述的免疫调节剂是PD-1，PD-L1，CTLA4，LAG-3，TIM-3，BTLA，CD3，CD27，CD28，CD40，CD160，2B4，4-1BB，GITR，OX40，VEGF，VEGFR，TGFβ，TGFβR，HVEM或LIGHT。
7.如权利要求1-6中任一项所述的免疫细胞，其中所述的标记结构域特异性结合双特异性多肽，所述双特异性多肽包含标记结合结构域和细胞表面蛋白结合结构域，所述标记结合结构域包含单链多肽，所述细胞表面蛋白结合结构域包含结合细胞的细胞表面受体的单链多肽。
8.包含核酸载体的免疫细胞，所述核酸载体包含
(a)对所述免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸，所述多肽包含信号转导结构域、跨膜结构域和标记结构域；和
(c)有效终止所述免疫细胞中转录的终止子区域。
9.如权利要求8所述的免疫细胞，还包含第二核酸载体，所述第二核酸载体包含
(a)对所述免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；
(c)有效终止所述免疫细胞中转录的终止子区域。
10.如权利要求8所述的免疫细胞，其中所述核酸载体还包含编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸。
11.如权利要求8-10中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞激活剂多肽还包含VHH抗体或单链可变片段的结合结构域。
12.如权利要求8-11中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞激活剂多肽包含嵌合多肽，所述嵌合多肽包含(i)VHH抗体或单链可变片段的结合结构域和(ii)所述标记结构域。
13.如权利要求12所述的免疫细胞，其中所述嵌合多肽是分支的。
14.如权利要求8-13中任一项所述的免疫细胞，其中所述标记结构域包含衍生自胎儿蛋白的多肽。
15.如权利要求8-13中任一项所述的免疫细胞，其中所述标记结构域包含结构膜蛋白。
16.如权利要求8-15中任一项所述的免疫细胞，其中，所述信号转导结构域包含共刺激结构域和T细胞受体(TCR)信号传导结构域。
17.如权利要求16所述的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包含CD28，ICOS，CD27、4-1BB，OX40或CD40L。
18.如权利要求16或17所述的免疫细胞，其中所述TCR信号传导结构域包含CD3ζ或CD3ε。
19.如权利要求16-18中任一项所述的免疫细胞，其中所述信号转导结构域包含CD28和CD3ζ。
20.如权利要求8-19中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包含参与免疫共刺激信号传导的结构域。
21.如权利要求8-20中任一项所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包含CD28。
22.如权利要求21所述的免疫细胞，其中所述CD28包含ITAM结构域。
23.如权利要求8-18和20-22中任一项所述的免疫细胞，其中所述CD3ε结构域包含氨基酸YMNM。
24.如权利要求8-23中任一项所述的免疫细胞，其中至少一种核酸载体还包含PiggyBac转座酶。
25.如权利要求8-23中任一项所述的免疫细胞,其中至少一种核酸载体另外包含转座子反向末端重复序列。
26.如权利要求8-25中任一项所述的免疫细胞，其中所述多肽效应分子包含特异性结合至一种或多种免疫调节剂的抗体或其结合片段。
27.如权利要求26所述的免疫细胞，其中所述抗体是VHH抗体。
28.如权利要求26或27所述的免疫细胞，其中所述免疫调节剂是PD-1，PD-L1，CTLA4，LAG-3，TIM-3，BTLA，CD3，CD27，CD28，CD40，CD160，2B4，4-1BB，GITR，OX40，VEGF，VEGFR，TGFβ，TGFβR，HVEM或LIGHT。
29.如权利要求8-25中任一项所述的免疫细胞，其中所述多肽效应分子包括细胞因子。
30.如权利要求29所述的免疫细胞，其中所述细胞因子是TGF-β，VEGF，TNF-α，CCR5，CCR7，IL-2，IL-7，IL-15或IL17。
31.如权利要求8-30中任一项的免疫细胞，其是T细胞，TIL细胞，细胞因子激活的杀伤细胞，树突状细胞-细胞因子激活的杀伤细胞，γδ-T细胞，NKT细胞或自然杀伤细胞。
32.一种免疫细胞激活剂多肽，包括：
(a)标记结构域；
(b)跨膜结构域；和
(c)信号转导结构域。
33.如权利要求32所述的免疫细胞激活剂多肽，其中，所述信号转导结构域包含共刺激结构域和T细胞受体(TCR)信号传导结构域。
34.如权利要求33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述共刺激结构域包含CD28，ICOS，CD27、4-1BB，OX40或CD40L。
35.如权利要求33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中，所述TCR信号传导域包含CD3ζ或CD3ε。
36.如权利要求33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中，所述信号转导结构域包含CD28，其在C末端连接CD3ε信号传导结构域的N末端。
37.如权利要求33所述的免疫细胞激活剂多肽，其中，所述信号转导结构域包含共刺激结构域4-1BB，其在C末端连接CD3ε信号传导结构域的N末端。
38.如权利要求32-37中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述标记结构域包含衍生自胎儿蛋白的多肽。
39.如权利要求32-37中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述标记结构域包含结构膜蛋白。
40.如权利要求32-39中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述跨膜结构域包含参与免疫共刺激信号传导的结构域。
41.如权利要求32-40中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中所述跨膜结构域包含CD28或结构膜蛋白。
42.如权利要求32-41中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中，所述CD28包含ITAM结构域。
43.如权利要求32-42中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽，其中，所述CD3ε结构域包含氨基酸YMNM。
44.一种核酸载体，包含
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(c)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域。
45.如权利要求44所述的核酸载体，其还包含转座子反向末端重复序列。
46.一种核酸载体，包含
(a)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(b)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；
(c)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域。
47.如权利要求46所述的核酸载体，其还包含转座子反向末端重复序列。
48.如权利要求46或47所述的核酸载体，其中所述多肽效应分子包含特异性结合至一种或多种免疫调节剂的抗体或其结合片段。
49.如权利要求48所述的核酸载体，其中所述抗体是VHH抗体。
50.如权利要求46或47所述的核酸载体，其中所述多肽效应分子包括细胞因子。
51.一种双特异性多肽，包含：
(a)标记结合域(L-bd)，其包含与权利要求32-40中任一项所述的免疫细胞激活剂多肽的标记结构域特异性结合的单链多肽结构域；和
(b)细胞表面蛋白结合域(CSP-bd)，该结构域包含结合至细胞的细胞表面受体的单链多肽结构域。
52.如权利要求51所述的双特异性多肽，其中所述标记结合域包含骆驼科动物IgG的VHH结构域。
53.如权利要求51或52所述的双特异性多肽，其包含CDR3结构域的约15-20个氨基酸。
54.如权利要求51-53中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞是淋巴细胞。
55.如权利要求54所述的双特异性多肽，其中所述淋巴细胞是B细胞。
56.如权利要求51-53中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞是肿瘤细胞。
57.如权利要求56所述的双特异性多肽，其中所述肿瘤是淋巴瘤，非小细胞肺癌，乳腺癌，卵巢癌，肝癌或间皮瘤。
58.如权利要求56或57所述的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白是EGFR。
59.如权利要求56或57所述的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白是GPC3。
60.如权利要求51-57中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白结合域与肿瘤细胞表面上表达的EGFR蛋白特异性结合。
61.如权利要求51-57中任一项所述的双特异性多肽，其中所述细胞表面蛋白结合域与淋巴瘤细胞表面上的CD19，CD20或CD22特异性结合。
62.如权利要求51-57中任一项所述的双特异性多肽，其包含VHH抗体。
63.如权利要求51-62中任一项所述的双特异性多肽，其还包含提供另外的生物化学活性或生物学功能的一个或多个结构域。
64.如权利要求63所述的双特异性多肽，其中所述另外的生物化学活性或生物学功能包括：荧光团的特异性结合，延长所述双特异性多肽在体内的半衰期，增加所述双特异性多肽的亲和力，以及调节由Fc结构域介导的免疫应答。
65.如权利要求51-62中任一项所述的双特异性多肽，其还包含另外的细胞表面蛋白结合域，所述细胞表面蛋白结合域包含单链多肽结构域，可结合相同或不同细胞的不同细胞表面受体。
66.一种用于在邻近靶细胞处原位产生一种或多种多肽效应分子的试剂盒，包括
(a)权利要求8-31中任一项所述的免疫细胞；和
(b)权利要求51-65中任一项所述的双特异性多肽。
67.如权利要求66所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白结合域与B细胞上的CD19特异性结合。
68.如权利要求66或67所述的试剂盒，其中所述细胞表面蛋白结合域与肿瘤细胞上的EGFR、间皮素、BCMA、MUC1或GPC3特异性结合。
69.一种在对象的肿瘤细胞的位置处调节免疫系统环境的方法，包括：
(a)向对象同时或依次给予有效量的权利要求9-31中任一项所述的免疫细胞和有效量的权利要求51-65中任一项所述的第一双特异性多肽，其中所述双特异性多肽包含特异性结合淋巴细胞的细胞表面蛋白的细胞表面蛋白结合域；和
(b)向对象给予有效量的权利要求51-65中任一项所述的第二双特异性多肽，其中所述双特异性多肽包含与肿瘤细胞的细胞表面蛋白特异性结合的细胞表面蛋白结合域。
70.如权利要求69所述的方法，还包括在步骤a和b之间执行的测量对象中免疫细胞的量的步骤。
71.如权利要求70所述的方法，其中测量所述对象的血液中的免疫细胞的量。
72.如权利要求70所述的方法，其中测量所述对象的肿瘤浸润免疫细胞的量。
73.如权利要求69-72中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞，TIL细胞，细胞因子激活的杀伤细胞，树突状细胞-细胞因子激活的杀伤细胞，γδ-T细胞，NKT细胞或自然杀伤细胞。
74.如权利要求69-73中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞的细胞表面蛋白是B细胞的CD19。
75.如权利要求69-74中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞是淋巴瘤细胞、间皮瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞或乳腺癌细胞。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述细胞表面蛋白是EGFR、间皮素、BCMA、MUC1或GPC3。
77.一种在对象的肿瘤细胞位置处调节免疫系统环境的方法，包括：
(a)在体外增殖所述对象的转化的免疫细胞，以获得增殖的T细胞；并将增殖的T细胞给予对象；其中所述免疫细胞包含第一核酸载体，所述第一核酸载体包含核酸载体，所述核酸载体包含：
(i)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(ii)编码免疫细胞激活剂多肽的氨基酸序列的多核苷酸；和
(iii)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
并且所述免疫细胞包含第二核酸载体，所述第二核酸载体包含
(iv)对免疫细胞中的转录有效的启动子区域；
(v)编码一种或多种分泌的多肽效应分子的氨基酸序列的多核苷酸；和
(vi)有效终止免疫细胞中转录的终止子区域；
和
(b)向对象给予有效量以激活增殖的免疫细胞从而表达免疫调节多肽的双特异性多肽，所述双特异性多肽包含细胞表面蛋白结合域和具有确定的氨基酸序列的标记结合域，所述标记结合域与由增殖的免疫细胞表达的标记结构域特异性结合，所述细胞表面蛋白结合域与肿瘤细胞的细胞表面受体特异性结合。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述肿瘤细胞是过表达间皮素和PDL1的间皮细胞，并且所述细胞表面蛋白是间皮细胞表面上表达的间皮素，并且其中所述效应分子包含特异性结合至PD-1或CD40的VHH结构域。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中所述肿瘤细胞是B细胞，并且所述细胞表面蛋白是B细胞表面上的CD19，CD20或CD22。
80.如权利要求77-79中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞，TIL细胞，细胞因子激活的杀伤细胞，树突状细胞-细胞因子激活的杀伤细胞，γδ-T细胞，NKT细胞或自然杀伤细胞。
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