JP2023515747A - 免疫調節分子を発現する細胞および免疫調節分子を発現するための系 - Google Patents

Abstract

本明細書において、細胞外標識ドメインを含む免疫細胞活性化因子ポリペプチドを発現し、それらの細胞表面膜に組み込むように操作された免疫細胞（すなわち、Ｂａｉｚｅ Ｓｕｐｅｒ細胞）を開示する。１つ以上のポリペプチドエフェクター分子を分泌するように操作された免疫細胞、ならびに両方の分子を発現するように操作された免疫細胞も開示される。免疫細胞においてこれらの分子を発現させるための核酸ベクターが開示されている。免疫細胞活性化因子ポリペプチドを発現する免疫細胞を別の細胞に特異的に結合させるために使用することができる、二重特異性ポリペプチドもまた開示される。免疫細胞と、同じまたは異なる細胞標的上の異なる細胞表面タンパク質に結合する様々な二重特異性ポリペプチドの両方を含む系であって、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞を増殖させ、様々な種類の腫瘍を処置するために使用することができる系も開示されている。【選択図】図１

Description

本明細書に開示される主題は、免疫系調節タンパク質または他のエフェクターポリペプチド、キメラ免疫細胞活性化因子ポリペプチド（ＩＣＡＰ）を発現する細胞（Ｂａｉｚｅ Ｓｕｐｅｒ細胞）、およびそれらの細胞におけるそのようなタンパク質およびポリペプチドの発現を制御するために使用される系に関する。このような系は、二重特異性結合活性を有するポリペプチドを含むことができ、したがって、ポリペプチド標的ドメインにも結合すると、免疫系調節タンパク質または他の有効なポリペプチドを発現するためのベクターを含む細胞を活性化することができる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、がんの処置の免疫療法様式として開発されている。一般に、ＣＡＲは、活性化リガンドに結合する細胞外ドメイン、「標的」細胞との免疫シナプスの形成に関与する膜貫通ドメイン、およびＴ細胞関連転写応答を活性化することによって細胞外ドメインの結合に応答する細胞内ドメインを含む。

現在のＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの治療法は、ＣＡＲ中のＴＡＡ認識細胞外ドメインが単一であるために、異種ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）発現を伴う腫瘍または新たな抗原欠損バリアントに対して有効ではない。

現在のＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの治療法は、患者の処置前のＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖に依存する。

さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞の分布および運命をｉｎ ｖｉｖｏで監視するために利用できる容易な方法はない。

さらに、活性化されたＣＡＲ－Ｔ細胞活性を制御する方法、または望ましくないＣＡＲ－Ｔ細胞を排除するためのいかなる方法も存在しない場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、継続的かつ制御不能に増殖し、抗原に応答して活性化し、致命的なｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ毒性、サイトカイン放出症候群、または神経毒性を引き起こす可能性がある。

ＣＡＲ細胞外抗原認識ドメインのほとんどはｓｃＦｖタンパク質であり、２つのｓｃＦｖドメインが、ドメインスワッピングなどによって非共有結合により連結した二量体を形成できることが明らかになっている。隣接するｓｃＦｖドメイン間のこのタイプの相互作用は、ＣＡＲ－Ｔ細胞における持続性シグナル伝達を強力に強化し、制御不能な活性を引き起こす。

本明細書において、免疫細胞活性化因子ポリペプチド（ＩＣＡＰ）を発現し、それらの細胞表面膜に組み込むように操作されている免疫細胞を開示する。１つ以上のポリペプチドエフェクター分子を分泌するように操作されている免疫細胞、ならびに両方の分子を発現するように操作されている免疫細胞も開示される。

したがって、本開示の一態様では、
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む１つの（または第１の）核酸ベクターを含む免疫細胞が提供される。
このような免疫細胞は、
（ｄ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｅ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む第２の核酸ベクターをさらに含む細胞であり得る。

あるいは、操作された免疫細胞は、第１の核酸ベクターが、１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む細胞であり得る。

本開示の別の態様は、
（ａ）標識ドメイン；
（ｂ）膜貫通ドメイン；および
（ｃ）シグナル伝達ドメイン
を含む免疫細胞活性化因子ポリペプチドにある。

本開示のさらなる態様は、
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む核酸ベクターである。

本開示の別の態様は、
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む核酸ベクターである。

本開示のさらに別の態様は、
（ａ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドの標識ドメインに特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む標識結合ドメイン（Ｌ－ｂｄ）と；
（ｂ）細胞の細胞表面受容体に特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む細胞表面タンパク質結合ドメイン（ＣＳＰ－ｂｄ）と、
を含むナノボディ標的化および制御ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）である二重特異性ポリペプチドである。

本開示はまた、標的細胞の近位で１つ以上のポリペプチドエフェクター分子をｉｎ ｓｉｔｕで産生するためのキットであって、
Ｉ．
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および標識ドメインを含む免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む核酸ベクターと、
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む第２の核酸ベクターと、
を含む免疫細胞、ならびに
ＩＩ．
（ａ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドの標識ドメインに特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む標識結合ドメイン（Ｌ－ｂｄ）と；
（ｂ）細胞の細胞表面受容体に特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む細胞表面タンパク質結合ドメイン（ＣＳＰ－ｂｄ）と、
を含む二重特異性ポリペプチド
を含む、キットについても記載している。

あるいは、操作された免疫細胞は、第１の核酸ベクターが、分泌されたエフェクターポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む細胞であり得る。このような実施形態において、分泌されたエフェクターポリヌクレオチドは、第２の発現カセット中にコードされ得る。このようなキットは、
（ａ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドの標識ドメインに特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む標識結合ドメイン（Ｌ－ｂｄ）；および
（ｂ）細胞の細胞表面受容体に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む細胞表面タンパク質結合ドメイン（ＣＳＰ－ｂｄ）
を含む、ナノボディ標的化および制御ポリペプチドである二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）をさらに含む。

本開示はまた、対象における腫瘍細胞の局所における免疫系環境を調節するための方法であって、
（ａ）
（ｉ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｉｉ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域
を含む第１の核酸ベクターを含み、
（ｉ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｉｉ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域
を含む第２の核酸ベクターをさらに含む、
操作された免疫細胞の有効量を対象に投与するステップ；
（ｂ）
（ｉ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドの標識ドメインに特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む標識結合ドメイン（Ｌ－ｂｄ）；および
（ｉｉ）リンパ球の細胞表面受容体に特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む細胞表面タンパク質結合ドメイン（ＣＳＰ－ｂｄ）
を含む、第１の二重特異性ポリペプチドの有効量を対象に同時にまたは逐次的に投与するステップ；
（ｃ）
（ｉ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドの標識ドメインに特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む標識結合ドメイン（Ｌ－ｂｄ）；および
（ｉｉ）腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合する特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む細胞表面タンパク質結合ドメイン（ＣＳＰ－ｂｄ）
を含む、第２の二重特異性ポリペプチドの有効量を対象に投与するステップ
を含む、方法も提供する。

対象内の操作された免疫細胞の量を測定するステップは、ステップｂとｃの間で実施することができる。

あるいは、対象における腫瘍細胞の局所における免疫系環境を調節するための方法は：
（ａ）対象の形質転換されたＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、増殖したＴ細胞を得るステップであって、Ｔ細胞が、
（ｉ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｉｉ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域、
を含む核酸ベクターを含む第１の核酸ベクター；ならびに
（ｉ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｉｉ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域、
を含む第２の核酸ベクターを含むステップ；ならびに
増殖したＴ細胞を対象に投与するステップ；
ならびに
（ｂ）増殖したＴ細胞を活性化して、増殖したＴ細胞によって発現される標識ドメインに特異的に結合する決定されたアミノ酸配列のＬ－ｂｄおよび腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合するＣＳＰ－ｂｄを含むＶＨＨ－ＴＣＰの分泌されたポリペプチドエフェクター分子を発現するのに有効な量を対象に投与するステップ、
を含み得る。

本明細書は、本明細書に記載の主題を特に指摘し、明確に主張する特許請求の範囲と共に終了するが、主題は、添付の図面と併せて特定の実施例の以下の説明からよりよく理解されると考えられ、この中で同様の参照番号は、同じ要素を特定する：

免疫細胞活性化因子ポリペプチドの発現を示し、免疫調節エフェクター分子を分泌する「Ｂａｉｚｅ Ｓｕｐｅｒ細胞」などの本明細書に記載の例示的なエフェクター細胞を示す図であり、抗ＰＤ１－ＶＨＨナノボディが示されている。 ナノボディ標的化および制御ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）を示す図であり、免疫細胞活性化因子タンパク質の標識ドメイン（標識－ＶＨＨ）および細胞の細胞表面タンパク質、この例ではＢ細胞のＣＤ１９リガンド（ＣＤ１９－ＶＨＨ）に結合するドメインが示されている。Ｆｃ媒介免疫応答（ｈＦｃ－ＶＨＨ）、ＦＩＴＣ蛍光色素（ＦＩＴＣ－ＶＨＨ）の結合、および血清アルブミン（アルブミン－ＶＨＨ）への結合を活性化するための追加のドメインも示されている。 免疫細胞型宿主細胞においてＩＣＡＰおよびエフェクタータンパク質を発現させるための例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図３Ａでは、エフェクタータンパク質抗ＰＤ－１－ＶＨＨ－Ｆｃ（ＥＱ）は、ベクターｐＳ３３８Ｂ－１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）内の発現構築物の構造遺伝子から発現される。図３Ｂでは、標識ポリペプチドドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通（ＴＭ）ドメインおよびＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ｚドメインを有するＩＣＡＰが、発現構築物ｐＮＢ３３８Ｂ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨ内の構造遺伝子から発現される。 免疫細胞型宿主細胞においてＩＣＡＰおよびエフェクタータンパク質を発現させるための例示的な発現ベクターのマップを示す図である。図３Ａでは、エフェクタータンパク質抗ＰＤ－１－ＶＨＨ－Ｆｃ（ＥＱ）は、ベクターｐＳ３３８Ｂ－１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）内の発現構築物の構造遺伝子から発現される。図３Ｂでは、標識ポリペプチドドメイン、ＣＤ８ヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通（ＴＭ）ドメインおよびＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ｚドメインを有するＩＣＡＰが、発現構築物ｐＮＢ３３８Ｂ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨ内の構造遺伝子から発現される。 図４Ａは、メソセリン（ＭＳＬＮ）に対するＭ２３３９（ＶＨＨ）のフロー型結合親和性を示す図である。図４Ｂは、メソセリン（ＭＳＬＮ）に対するＢ０２９（ＶＨＨ）のフロー型結合親和性を示す図である。図４Ｃは、ＥＧＦＲに対するＥ４５４（ＶＨＨ）のフロー型結合親和性を示す図である。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された様々なメソセリンＥＣＤドメインへのＭ２３３９ＶＨＨ－６ｈｉｓの結合速度論を示す図である。 様々なＭ－ＩＣＡＰ（メソセリンＩＩ＋ＩＩＩ領域に由来）ベクターの概略図を示す図である。１９Ｒ７３は、標準的なＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ型（陽性対照）であり、その他は、Ｍ－ＩＣＡＰベクターである。これらのベクターの細胞内領域は、同じであり、すべて４－ＢＢおよびＣＤ３ζを含むが、細胞外領域は、異なる。Ｍ－ＩＣＡＰは、６－Ｈｉｓタグを含まない。Ｈｉｓ－１／２－Ｍ－ＩＣＡＰ：６－Ｈｉｓタグは、Ｍ－ＩＣＡＰのＮ末端またはＣ末端に位置する。ＳＰ３－Ｈｉｓ－Ｍ－ＩＣＡＰおよびＳＰ５Ｈｉｓ－Ｍ－ＩＣＡＰ：シグナルペプチドは、ヒトタンパク質データベースから選択されるＳＰ３またはＳＰ５である。ＳＰ３（シグナルペプチド３）：ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１）；ＳＰ５（シグナルペプチド５）：ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号２）； ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしたＭ－ＩＣＡＰベクターのＦＡＣＳ結果を示す図である。図７Ａは、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした様々なＭ－ＩＣＡＰベクターの陽性率を示す図である。図７Ｂは、ＦＡＣＳ結果のドットプロットを示す図である。 Ｍ－ＩＣＡＰの発現およびＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の構造を示す図である。図８Ａは、Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の構造を示す概略図である。図８Ｂは、Ｍ－ＩＣＡＰ、ＳＰ３－Ｍ－ＩＣＡＰ、およびＳＰ５－Ｍ－ＩＣＡＰ発現ベクターの概略を提供する。図８Ｃおよび図８Ｄは、トランスフェクションの８日後および１３日後のＭ－ＩＣＡＰ、ＳＰ３－Ｍ－ＩＣＡＰ、ＳＰ５－Ｍ－ＩＣＡＰ Ｔ細胞の陽性率のデータを表す（図８Ｃ：それぞれＭ２３３９＋抗ＣＤ２８または抗Ｈｉｓ＋抗ＣＤ２８によって活性化されている；図８Ｄ：Ｍ２３３９＋抗ＣＤ２８によって活性化されている）。略語：Ｍ－ＩＣＡＰ－メソセリンＩＩ＋ＩＩＩ由来のペプチド；ＳＰ－メソセリン－メソセリンの内因性シグナルペプチド；ＳＰ３（シグナルペプチド３）：ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号１）；ＳＰ５（シグナルペプチド５）：ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号２）；Ｍ２３３９、抗Ｍ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨ－ＦｃクローンＭ２３３９；抗ＣＤ２８－抗ＣＤ２８ ｍＡｂ；抗Ｈｉｓ－抗ＨｉｓｍＡｂ。 ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の代表的な調製および品質検証を示す図である。図９Ａは、Ｍ－ＩＣＡＰ、Ｍ－ＩＣＡＰ－２８、Ｍ－ＩＣＡＰ－２８ＢＢ発現ベクターの概略を提供する。図９Ｂは、異なるＴＣＰまたは抗体の活性化によって得られたＩＣＡＰ－Ｔ増幅（末梢血単球、ＰＢＭＣ）の比較を示している。図９Ｃは、ＰＢＭＣからのＩＣＡＰ－Ｔ細胞の調製中の増大を示している。図９Ｄは、ＩＣＡＰ－Ｔ細胞産物のＩＣＡＰ陽性の割合を示している。図９Ｅは、ＩＣＡＰ－Ｔ細胞産物のＣＤ３陽性細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８陽性の割合を示している。図９Ｅは、ＩＣＡＰ－Ｔ細胞産物のＣＤ３陽性細胞におけるＴｅｍ／Ｔｃｍ陽性の割合を示している。 ＦＡＣＳによって測定されたＢＣＭＡ－ＴＣＰの結合親和性を示す図である。図１０Ａは、ＭＳＬＮ過剰発現細胞株の細胞への３つのＢＣＭＡ－ＴＣＰのＦＡＣＳによる結合曲線を示している。図１０Ｂは、ＢＣＭＡ過剰発現細胞株の細胞への３つのＢＣＭＡ－ＴＣＰのＦＡＣＳによる結合曲線を示している。 抗ＢＣＭＡ ＴＣＰの血漿安定性を示す図である。 ＦＡＣＳによって測定された２つの異なる細胞型に対するＴＣＰ０１１－Ｐの結合親和性を示す図である。図１２Ａは、ＣＤ１９過剰発現細胞株の細胞へのＴＣＰ０１１－ＰのＦＡＣＳによる結合曲線を示している。図１２Ｂは、ＭＳＬＮ過剰発現細胞株の細胞へのＴＣＰ０１１－ＰのＦＡＣＳによる結合曲線を示している。 ＦＡＣＳによって測定された２つの異なる細胞型へのＴＣＰ０２１－Ｐの結合親和性を示す図である。図１３Ａは、ＥＧＦＲ過剰発現細胞へのＴＣＰ０２１－ＰのＦＡＣＳによる結合曲線を示している。図１３Ｂは、ＭＳＬＮ過剰発現細胞へのＴＣＰ０２１－ＰのＦＡＣＳによる結合曲線を示している。 標的細胞に対するＴＣＰによるＭ－ＩＣＡＰ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅を示す図である。図１４Ａおよび図１４Ｂは、Ｍ－ＩＣＡＰでトランスフェクトされたＴ細胞およびＤａｕｄｉ細胞をＴＣＰと４日間共培養した後のＴ／Ｄａｕｄｉ細胞の数を示す。図１４Ｃおよび図１４Ｄは、Ｍ－ＩＣＡＰをトランスフェクトしたＴ細胞およびマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で処理したＤａｕｄｉ細胞をＴＣＰと４日間共培養した後のＴ／Ｄａｕｄｉ細胞の数を示す。 ＲＰＭＩ－８２２６細胞に対するＭ－ＩＣＡＰ－ＴのＴＣＰ用量依存性細胞傷害性効果を示す図である。図１５Ａは、浮遊細胞での細胞溶解アッセイの概略を示す。図１５Ｂは、３つの異なるＥ：Ｔ比でのＴＣＰ００１－Ｃと組み合わせたＭ－ＩＣＡＰ－ＴのＲＰＭＩ－８２２６細胞に対する用量依存的細胞溶解放出比を示す。図１５Ｃ～１５Ｅは、異なるＥ：Ｔ比の細胞溶解分析曲線を示す。 ＲＰＭＩ－８２２６／Ｌ３６３細胞に対する異なるＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ／ＣＡＲ－Ｔの細胞傷害性およびＩＦＮγ分泌の比較を示す図である。図１６Ａおよび１６Ｂは、０．５μｇ／ｍｌ（Ａ）または０．２μｇ／ｍｌ（Ｂ）の濃度の異なるＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ／ＣＡＲ－Ｔ細胞のＬ３６３細胞に対する細胞傷害性効果の比較を示す。図１６Ｃおよび１６Ｄは、ＲＰＭＩ－８２２６（Ｃ）またはＬ３６３（Ｄ）細胞に対する異なるＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ／ＣＡＲ－ＴのＩＦＮγ分泌を示している。 ＦａＤｕ／ＳＫ－ＯＶ３細胞に対するＴＣＰ（ＥＧＦＲに結合する）と組み合わせたＩＣＡＰの細胞溶解効果を示す図である。図１７Ａは、異なるＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ／ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＦａＤｕ細胞の細胞溶解を示している。図１７Ｂは、異なるＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ／ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＳＫ－ＯＶ３細胞の細胞溶解を示している。 Ｄａｕｄｉ細胞に対するＴＣＰを有するＩＣＡＰ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γの放出および細胞溶解効果を示す図である。図１８Ａは、Ｄａｕｄｉ細胞に対する異なるＴＣＰを有するＩＣＡＰ／ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出を示している。図１８Ｂは、異なるＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ／ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＤａｕｄｉ細胞の細胞溶解を示している。 Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔが、抗体を分泌する能力を有し、陽性率が影響を受けないことを示す図である。図１９Ａは、分泌型Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の陽性率の比較を示している。ヒトナイーブＴ細胞にＭ３ ＣＡＲを同時にトランスフェクトし、抗ＰＤ－１、抗ＴＧＦβ、抗ＰＤ－Ｌ１などの抗体のプラスミドを分泌させた。１３日後、４つの実験群間にはほとんど差がなく、陽性率約６０～７０％であった。抗ＰＤ－１、抗ＴＧＦβ、および抗ＰＤ－Ｌ１抗体も、Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞から十分に分泌された。これらのデータは、抗体分泌の種類およびレベルが、Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の陽性変換にほとんど影響を有さないことを示している。ＶＨＨもｓｃＦｖも、Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞から十分に分泌され、ＥＬＩＳＡによって検出できる。 抗ＰＤ－１－Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔが抗ＰＤ－１ ＶＨＨを分泌して、表面のＰＤ－１タンパク質を遮断できることを示す図である。細胞を５μｇ／ｍｌ Ｍ２３３９－ＩｇＧ４またはＩｇＧ４対照によって４８時間刺激した。抗ＰＤ－１ＶＨＨＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞群の表面ＰＤ１の検出のみが、市販のＰＤ－１ｍＡｂによって遮断される。 Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔによって分泌された抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖが、ＴＧＦβＲＩＩに結合することを示す図である。ＴＧＦβリガンドは、ＴＧＦβＲＩＩに結合し、ルシフェラーゼシグナルを刺激する。Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞によって分泌される抗ＴＧＦβｓｃＦｖは、２９３Ｔ細胞上のＴＧＦβＲＩＩに結合し、ルシフェラーゼレポーターの発現を遮断することもできる。ＣＡＲ－Ｔ－１０Ｃ、１０Ｂおよび０１Ａは、異なるドナーから調製された抗ＴＧＦβＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞である。 ＴＣＰ００１－Ｃと組み合わせたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験におけるＮＰＳＧマウスでのＬ３６３－ＰＤＬ１同所性腫瘍の体重変化を示す図である。 ＴＣＰ００１－Ｃと組み合わせたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験におけるＮＰＳＧマウスでのＬ３６３－ＰＤＬ１同所性腫瘍の腫瘍体積変化を示す図である。 マウスの全血中の抗ＰＤ－１ＶＨＨおよびＴＣＰ００１－Ｃ濃度の分析を示す図である。図２４Ａは、血清中抗ＰＤ－１ＶＨＨレベルの分析を示している。図２４Ｂは、血清中ＴＣＰ００１－Ｃレベルの分析を示している。略語：Ｄ１５－２４ｈ、１４日目にＴＣＰ００１－Ｃ注射２４時間後の１５日目での尾静脈採血；Ｄ２２－４８ｈ、２０日目にＴＣＰ００１－Ｃ注射４８時間後の２２日目での尾静脈採血。示されているベクターの各々中のプロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターであり、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、両方のベクターでの転写終結に使用される。発現構築物は両方とも、５’および３’ＩＴＲ配列を含む。 ＦＡＣＳによって分析されたＨＥＫ２９３Ｔ－ＭＳＬＮ細胞への抗ＭＳＬＮ－１４４４ＶＨＨ（１４４４（ＶＨＨ））の結合を示す図である。 抗ＭＳＬＮ－１４４４ＶＨＨとの融合ポリペプチドＢＣＭＡ ＩＣＡＰ ＢＣＭＡｍｕｔ１の発現を示す図である。 様々な抗ＢＣＭＡ ＶＨＨに結合するＢＣＭＡ ＩＣＡＰ ＢＣＭＡｍｕｔ１のＳＰＲ速度論を示す図である。 ＢＣＭＡｍｕｔ１－ＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化および増幅を示す図である。図２８Ａは、ＢＣＭＡｍｕｔ１－ＭＳＬＮ－１４４４ベクターの概略図を示している。図２８Ｂは、ドナー１において抗ＢＣＭＡｍｕｔ１ ＶＨＨ３６＃または抗ＭＳＬＮで刺激されたＢＣＭＡｍｕｔ１－ＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲ－Ｔの増幅を示している。図２８Ｃは、ドナー２において抗ＢＣＭＡｍｕｔ１ ＶＨＨ ３６＃または抗ＭＳＬＮで刺激されたＢＣＭＡｍｕｔ１－ＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲ Ｔの増幅を示している。 ２名のドナーにおいて、抗ＢＣＭＡｍｕｔ１ ＶＨＨ ３６＃または抗ＭＳＬＮで刺激されたＢＣＭＡｍｕｔ１－ＭＳＬＮ－１４４４ＣＡＲ－Ｔの増幅のＦＡＣＳ結果のドットプロットを示す図である。 ＭＳＬＮ－１４４４ＣＡＲ－Ｔの抗ＢＣＭＡｍｕｃ１ＶＨＨ ３６＃特異的活性化および増幅を示す図である。図３０Ａは、ＭＳＬＮ－１４４４ベクターの概略図を示している。図３０Ｂは、ドナー１において抗ＢＣＭＡｍｕｃ１ ＶＨＨ ３６＃または抗原ＭＳＬＮで刺激されたＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲ Ｔの増幅を示している。図３０Ｃは、ドナー２において抗ＢＣＭＡｍｕｃ１ ＶＨＨ ３６＃または抗ＭＳＬＮで刺激されたＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲ Ｔの増幅を示している。

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）処置技術は、がんの免疫細胞治療の分野である。ＣＡＲ－Ｔ技術は、遺伝子工学技術を使用して、例えば、抗体のＣＤＲ部分をコードする遺伝子の少なくとも一部を含む抗体可変領域遺伝子配列をＴリンパ球免疫受容体の細胞内領域によりスプライングし、次に、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター、トランスポゾンまたはトランスフェクションにより、スプライス構築物をＴ細胞に導入する。発現カセットまたはｍＲＮＡは、リンパ球に形質導入され、細胞表面上に融合タンパク質を発現し、Ｔリンパ球が、ＭＨＣ非拘束性で特定の抗原を認識できるようにし、それらが腫瘍を認識して殺滅する能力を向上させる。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構造は、１９８９年にイスラエルのＥｓｈｈａｒ研究チームによって提案された。それ以来、ＣＡＲ構造の細胞表面タンパク質を示すＴ細胞が、腫瘍免疫療法に良好な効果を有することが確認されている。

第一世代のＣＡＲ受容体は、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含み、細胞内活性化シグナルは、ＣＤ３ζ（ＣＤ３ｚ）シグナル鎖によって伝達された。しかし、第１世代のＣＡＲ受容体は、Ｔ細胞共刺激シグナルを提供するドメインを有さないため、ＣＡＲ－Ｔ細胞が、一過性の効果のみを発揮し、身体内での細胞の生存期間が短く、サイトカインの分泌が少なくなる。第２世代のＣＡＲ受容体は、共刺激シグナル伝達分子の細胞内ドメインを導入し、これには、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ１３７／４－１ＢＢ、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）、ならびにＴ細胞増殖およびサイトカイン分泌を増強する他のドメインが含まれる。ＩＬ－２、ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＣＳＦの産生が増加すると、それにより、腫瘍微小環境の免疫抑制が破壊され、例えばＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ））が起こる。

第３世代のＣＡＲ受容体は、共刺激構造ＣＤ２８とＩＴＡＭシグナル鎖との間で４－１ＢＢなどの二次共刺激分子を再結合し、これにより、３シグナルのＣＡＲ受容体を生成する。

操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでより良好なエフェクター機能および生存期間を有する。現在、治療法において一般的に使用されているＣＡＲ構造は、第二世代のＣＡＲ受容体であり、その構造は、４つの部分：抗体単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞内刺激シグナル伝達ポリペプチドに分割され得る。ＣＡＲヒンジ領域構造は、正しいコンフォメーションの形成および二量体の形成に寄与する。ヒンジ領域の長さおよびアミノ酸配列の特徴は、ＣＡＲの空間的コンフォメーションの決定に寄与し、腫瘍細胞表面抗原に結合するＣＡＲの能力にも影響を及ぼす。

悪性リンパ腫は、２つのカテゴリー：ホジキンリンパ腫（ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に分割される。ホジキンリンパ腫は、リンパ腫の１０％～１５％を占めるが、非ホジキンリンパ腫は、発症患者の中で、最も急速に成長する悪性腫瘍である。ＷＨＯの統計によると、現在、世界には毎年約３５万人の新規ＮＨＬ患者が存在し、死亡者数は、２０万人を超えている。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方に見られ得る。現在、リンパ腫の臨床処置は、グルココルチコイドおよびアルキル化剤などの細胞傷害性薬、および特定の分子標的に基づく標的薬（リツキシマブなど）を含み、標的薬をベースにした組み合わせ化学療法は、患者の応答、臨床的寛解率、および治癒率を有意に改善する。しかし、感受性がないか、または不十分な効果を有し、「実際に」難治性患者である、多数のリンパ腫患者が存在する。いくつかの新しい処置（細胞免疫療法など）は、部分的に再発したリンパ腫または難治性リンパ腫の患者を軽減し、その生存を延長させた。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗カッパ軽鎖、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０およびＣＡＲ改変Ｔ細胞を構築するための他の抗体を使用する治療法などの血液悪性腫瘍のために現在開発されている多くのタイプのＣＡＲ－Ｔが存在する。抗腫瘍試験が実施されており、この試験では、これらの抗ＣＤ１９モノクローナル抗体および抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が、最も一般的に使用されている抗体であった。

標的として適切な腫瘍抗原を選択することは、安全かつ有効なＣＡＲ－Ｔ細胞を設計するための鍵である。ＣＤ１９は、分化の様々な段階で正常および悪性のＢ細胞中でのみ発現し、他の非Ｂ細胞（造血幹細胞など）では発現しないため、Ｂ系列腫瘍の処置の潜在的な標的であり、ＣＡＲ－Ｔ研究におけるホットスポットである。したがって、ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔは、急性Ｂリンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、慢性Ｂリンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＮＨＬ、および多発性骨髄腫（ＭＭ）などの悪性腫瘍に広く使用されている。ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔは、Ｂ細胞リンパ腫の臨床試験処置に使用されている。

ＰＤ－１（プログラムされた細胞死１、リプログラムされた細胞死受容体１）は、制御性Ｔ細胞ＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、免疫グロブリン受容体スーパーファミリーに属する。ＰＤ－１およびそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２は、Ｔ細胞の共抑制および障害に重要な役割を果たす。それらの相互作用は、共刺激Ｔ細胞の増殖およびサイトカインの分泌を阻害する。抗アポトーシス分子ＢＣＬ－ｘｌの発現は、腫瘍特異的Ｔ細胞の機能を障害し、これにより、一部の腫瘍患者が、腫瘍を完全に消失させることができないようになる。抗ＰＤ－１抗体は、腫瘍特異的Ｔ細胞表面のＰＤ－１分子との結合に関してリガンドＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２と競合し、それによってＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２との複合体形成を阻害する。これは次に、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２との複合体形成によって引き起こされる免疫微小環境の阻害に打ち勝つ。

現在市販されている抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブおよびピジリズマブである。これらの２つのモノクローナル抗体は、黒色腫、大腸がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、および腎細胞癌などの固形腫瘍において優れた臨床効果を有することが示されている。近年の臨床研究では、ＰＤ－１抗体がリンパ腫治療法に使用できることが確認されている。しかし、抗ＰＤ－１抗体は、臨床応用において回避できないいくつかの問題をなおも有する。一方で、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、静脈内投与されるので、ＰＤ－１抗体遮断薬を投与されているほとんどの患者は、様々な程度の薬物投与の副作用を有する。また、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生は、複雑な産生調製および精製プロセスを伴い、これには費用を要し、高価な処置となる。

要約すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞を殺滅する能力を有し、腫瘍組織に有効に侵入することができるが、これらの活性は、腫瘍微小環境で容易に阻害され、ＰＤ－１抗体は、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を再活性化することができる。しかし、従来の高分子抗体またはその大きな断片は、固形腫瘍に浸透する力が不十分であり、全身薬は、大きい毒性副作用を有し、薬物の費用が高い。

したがって、この問題の解決策が本明細書に開示され、ここでは、抗ＰＤ－１抗体は、ＣＡＲ保有免疫細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）およびＰＤ－１抗体の殺滅毒性を維持することによって効果的に発現されることができ、また、ＰＤ－１抗体は、ＣＡＲ保有細胞によって腫瘍内または腫瘍の近くで、高レベルで発現される。この活性は、処置費用を低減させながら、ＣＡＲ保有細胞の腫瘍殺滅効果を高めることが予測されている。

本明細書において、ＣＡＲ－Ｔに類似しているが、より一般化された性質のいくつかの特徴を有する系を開示する。また、「免疫細胞活性化因子ポリペプチド」（ＩＣＡＰ）」として、ＣＡＲを有するエフェクター細胞および細胞表面抗原を保有する標的細胞の両方に結合する二重特異性結合活性を有する細胞外（おそらく合成および天然に存在しないアミノ酸配列の）ペプチド分子を含むことによって、ＣＡＲを保有するエフェクター細胞の活性レベルを、ＣＡＲに結合するために利用可能なＩＣＡＰの量を制御することによって調節することができる。このような系を適用して、従来技術のＣＡＲ－Ｔ細胞によって呈される高い持続性活性の問題を解決することができる。

本開示に関連する用語のいくつかを以下に説明する。

本開示において、「発現カセット」という用語は、プロモーター、コード配列、およびｐｏｌｙＡテーリングシグナル配列などの遺伝子の発現に必要とされるエレメント全体を指す。

「コード配列」という用語は、本明細書では、ポリペプチド産物（例えば、ＣＡＲ、一本鎖抗体またはそのドメイン）のアミノ酸配列をコードする核酸配列の一部として定義される。コード配列の境界は、典型的には、コードされたｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流のリボソーム結合部位（原核細胞の場合）およびコードされたｍＲＮＡの３’末端のオープンリーディングフレームのすぐ下流の転写終結配列によって決定される。コード配列には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換え核酸配列が含まれ得るが、これらに限定されない。

「Ｆｃ」（結晶化可能な断片）という用語は、哺乳動物抗体の一部であり、抗体の重鎖定常領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む抗体分子の「Ｙ」構造のハンドルの末端に位置するペプチドを指し、また、哺乳動物抗体の生物学的効果のいくつかを提供する多くの分子的および細胞的相互作用の部位である。

「共刺激分子」という用語は、抗原提示細胞の表面上に存在し、Ｔｈ細胞上の共刺激分子受容体に結合して、共刺激シグナルを生成する分子を指す。リンパ球の増殖には、抗原の結合のみでなく、共刺激分子のシグナルも必要である。共刺激シグナルは、主に抗原提示細胞の表面にある共刺激分子ＣＤ８０に結合することによってＴ細胞に伝達され、ＣＤ８６は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８分子に結合する。Ｂ細胞は、ＬＰＳなどの一般的な病原体成分、補体成分、または活性化された抗原特異的Ｔｈ細胞表面タンパク質ＣＤ４０Ｌを通過できる共刺激シグナルを受ける。

「リンカー」という用語は、例えば、リガンドの結合の立体阻害を緩和することによって、タンパク質またはポリペプチドの機能または活性を維持するために、連結されたタンパク質またはポリペプチドの空間的関係を維持する目的で、異なるタンパク質またはポリペプチド間を連結するポリペプチド断片である。例示的なリンカーとしては、グリシンおよび／またはセリン、ならびに例えば、フリン２Ａペプチドを含むリンカーが挙げられる。

「特異的に結合する」という用語は、例えば、抗体または抗原結合断片とそれが向けられる抗原との間のような、結合タンパク質およびリガンドとの反応を指す。特定の実施形態では、抗原に特異的に結合する抗体（または抗原に特異的である抗体）は、抗体－抗原親和性が、約１０^－５Ｍ未満の結合定数Ｋｄ、例えば、約１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍまたは１０^－１０Ｍ以下であることを特徴とすることを意味する。「特異的に認識する」または「特異的認識」は、同様の意味を有する。

「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、当技術分野で周知である、対象および活性成分に薬理学的および／または生理学的に適合性のある担体および／または賦形剤を指し（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｅｄｉｔｏｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ． Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５、参照によりその全体およびすべての目的のために本明細書に組み込まれる）、これらとしては、限定するものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調整剤としては、これに限定されないが、リン酸緩衝液が挙げられ、界面活性剤としては、これらに限定されないが、カチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０が挙げられ、イオン強度増強剤としては、これに限定されないが、塩化ナトリウムが挙げられる。

「有効量」という用語は、対象において本明細書に記載の疾患または状態の処置、予防、緩和、および／または緩和を達成することができる用量を指す。

「疾患および／または状態」という用語は、本明細書に記載の疾患および／または状態に関連する対象の身体的状態を指す。

「対象」または「患者」という用語は、本発明の疾患または状態を処置、予防、改善および／または緩和するために本発明の医薬組成物を受ける患者または他の動物、特に哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、サル、ウシ、ウマなどを指し得る。

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、特定の分子、例えば腫瘍細胞表面抗原に結合し、免疫細胞型エフェクター細胞における増殖プログラムを刺激する人工的に操作されたタンパク質である。ＣＡＲは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端の順に、任意のシグナルペプチド（宿主細胞の細胞膜におけるＣＡＲの局在化プロセスの間に除去され得る）；一本鎖抗体の抗原結合領域などの、別のタンパク質に特異的に結合するポリペプチド（「標識ドメイン」）；任意による（が、典型的には、存在する）ヒンジ領域；膜貫通領域；および細胞内シグナル伝達領域（例えば、図１を参照）を含む。標識ドメインポリペプチドは、天然ポリペプチドに由来するものであり得るか、または合成ポリペプチドであり得る。

本出願において、「ＶＨＨドメイン」は、ラクダ科動物抗体などの単一の重鎖抗体（「ＶＨＨ抗体」）の可変ドメインを指し得る。「一本鎖抗体」（ＳＣＡ）は一本鎖ポリペプチドであり、典型的には、ポリペプチドが折りたたまれてフレームワーク領域（ＦＲ領域）を形成するときに一緒に会合する複数の比較的保存されたドメイン、および一緒に結合して可変抗原結合ドメインを形成する可変領域を含む。したがって、ＶＨＨ抗体は、一種のＳＣＡである。この用語によれば、天然に存在する一本鎖重鎖抗体に存在する可変ドメインは、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」と称する）および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と称する）と区別するために、本明細書では「ＶＨＨドメイン」とも称する。

単離された単一の可変ドメインポリペプチドは、好ましくは、それらの同族のＳＣＡの完全な抗原結合能力を有するポリペプチドであり、水溶液中で安定である。

ＶＨドメインなどの哺乳動物抗体のドメインに由来する、またはそれに類似する１つ以上のドメイン（ＦＲまたは可変領域起源のいずれか）を含む安定な抗原結合一本鎖ポリペプチドもまた、本明細書の「一本鎖抗体」に含まれる。

「ナノボディ」は、ＳＣＡまたはＶＨＨ抗体、またはそれらの１つ以上のドメインを含み得るが、この単語は、より典型的には、１つ以上のＶＨＨドメインを含み、任意により１つ以上のＦＲドメインをさらに含む操作されたポリペプチドを説明するために使用され、追加的または代替的に、蛍光色素への結合または細胞外受容体の結合および活性化などの、いくつかのさらなる生物活性を有する追加の安定なドメインをさらに含む。

本明細書において、新規の細胞治療産物である操作された免疫エフェクター細胞が開示され、これは、制御可能な方法でｉｎ ｓｉｔｕで分泌タンパク質を発現するように誘導され得るキメラ受容体を含む、いわゆる「Ｂａｉｚｅ Ｓｕｐｅｒ細胞」などの細胞であり得る。

いくつかの実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、一本鎖抗ＰＤ－１抗体（ＶＨＨ－ＰＤ－１）などの高レベルのエフェクターポリペプチドを構成的に発現する。いくつかのそのような実施形態では、細胞の細胞表面関連抗原が、Ｔ細胞である免疫エフェクター細胞の「標識ドメイン」が結合することによって活性化されるＴ細胞の増殖は、エフェクターポリペプチドを構成的に分泌する非常に多数のＴ細胞を提供する。標識ドメインに腫瘍細胞の表面上の抗原が結合する場合、免疫調節エフェクターポリペプチドは、構成的に発現され、腫瘍細胞の近位で分泌されることにより、例えば、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２複合体形成によって誘導される免疫寛容を軽減または回避するポリペプチドであり得る。

追加的または代替的に、本明細書に開示される操作されたエフェクター細胞は、免疫細胞において作動可能なプロモーターの制御下で発現される１つ以上の「エフェクターポリペプチド」をコードするコード配列構築物を含み、免疫細胞において作動可能な転写終結配列をさらに含む核酸ベクターを含むように操作され得る。プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターまたはＣＭＶプロモーターなどの構成的プロモーターであり得る。

核酸ベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。核酸ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンまたはＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンまたはその一部を含むことができる。ベクターは、典型的には、トランスポゾンベースのベクターの両端に位置するトランスポゾン特異的逆向き末端反復配列を含むことができる。

本明細書に開示される操作されたエフェクター細胞は、ＩＣＡＰをコードする発現カセットおよび１つ以上のエフェクターポリペプチドをコードする発現カセットのいずれかまたは両方が、エフェクター細胞の核ゲノムに組み込まれているものであり得る。

エフェクター細胞によって分泌されるタンパク質は４－１ＢＢもしくはＯＸ４０に特異的に結合するポリペプチドなどの免疫刺激性であるタンパク質、またはＴＮＦ－αもしくはＩＬ－６に特異的に結合するポリペプチドなどの免疫阻害性（例えば、アレルギー応答または関節炎病態を処置するため）であるタンパク質であり得る。

エフェクター細胞によって分泌される好ましいタンパク質は、抗体もしくはその断片、または一本鎖単一ドメインポリペプチドであるポリペプチド、例えば、ＶＨＨナノボディもしくはｓｃＦｖタンパク質である。分泌され得るタンパク質の１つのクラスは、Ｆｃドメインの有無にかかわらず免疫チェックポイント受容体アンタゴニストまたはアゴニスト抗体である。しかし、サイトカインまたは別の免疫調節タンパク質などの他のタンパク質が、操作されたエフェクター細胞によって発現および分泌され得る。例えば、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ－４０、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ－４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭまたはＬＩＧＨＴに対する抗体、抗体の抗原結合部分、または一本鎖抗体、例えばＶＨＨナノボディは、エフェクター細胞から発現および分泌することができる。エフェクター細胞から分泌されるサイトカインの例には、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ－α、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－１７が挙げられ得る。本発明の操作されたエフェクター細胞は、異なる抗体、サイトカイン、またはそれらの組み合わせを含むなどの２つ以上の異なる型のエフェクターポリペプチドを発現および分泌することができる。一例として、操作されたエフェクター細胞は、抗ＰＤＬ１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体、または抗ＰＤＬ１抗体およびＶＥＧＦ抗体を分泌することができる。

分泌されたエフェクタータンパク質の例は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＤＴＳＦＩＳＡＡＧＷＹＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡＡＩＴＮＴＧＩＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＧＡＰＰＰＧＧＬＧＹＤＥＳＤＹＷＧＱＧＴＱＴＶ（配列番号３）を有する抗ＰＤ－１ＶＨＨ抗体（１１８２）である。

操作される宿主免疫細胞は、様々なＴ細胞、ＣＩＫ（サイトカイン誘導キラー細胞）、ＤＣ－ＣＩＫ（樹状細胞／ＣＩＫ）、ＮＫ（ナチュラルキラー細胞）、ＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ細胞）、幹細胞、ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）、マクロファージおよび他の免疫細胞であり得る。宿主免疫細胞は、典型的には、疾患の処置を受けている対象の自己細胞である。

いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、少なくとも３つの構造成分：「活性化」Ｔ細胞において転写プログラムを活性化する細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のドメイン、例えば、Ｔ細胞表面糖タンパク質のＣＤ３ε（ＣＤ３ｅ）またはＣＤ３ζ（ＣＤ３ｚ）ドメインをコードするポリヌクレオチド；膜貫通ドメイン（および場合によりスペーサーペプチド）を含むドメイン、例えば、ＣＤ２８タンパク質からのドメインをコードする第２のポリヌクレオチド；「標識」ポリペプチドであるドメインをコードし、別のポリペプチドによるその特異的結合が、細胞内シグナル伝達ドメインを介してＴ細胞などの宿主免疫細胞における転写プログラムを活性化する第３のポリヌクレオチド、を有するコード配列構築物を含むベクターによって形質転換される。

細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫共刺激シグナル伝達に関与するドメイン（例えば、Ｂ７結合ドメイン）、および追加的または代替的に、ＣＤ３ｅのＩＴＡＭドメインを含むことができる。好ましくは、ＩＴＡＭドメインは、アミノ酸配列ＹＭＮＭ（配列番号４）を含む。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは両方とも、ＣＤ２８タンパク質のドメインである。

いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８／ＣＤ３ｅ、４－１ＢＢ／ＣＤ３ｅ、ＩＣＯＳ／ＣＤ３ｅ、ＣＤ２７／ＣＤ３ｅ、ＯＸ４０／ＣＤ３ｅまたはＣＤ４０Ｌ／ＣＤ３ｅなどのＣＤ３ｅドメインに連結された免疫共刺激ドメインを含む。

標識ドメインポリペプチドは、好ましくは、成人のヒト組織において発現されないか、または最小限に発現されるポリペプチドである。例えば、標識ポリペプチドは、胚性ヒト細胞でのみ発現されるか、または主に胚性ヒト細胞で発現されるタンパク質（すなわち、「フェトプロテイン」）に由来し得るか、または標識ポリペプチドは、完全に合成されたアミノ酸配列であり得る。

標識ポリペプチドが由来し得るフェトプロテインの例としては、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－２、およびＫｌｆ－２などの胚発生中に発現されるフェトプロテインが挙げられる。いくつかの実施形態では、完全な全長未満のタンパク質が使用され、典型的には、２０～１００ａａ長のポリペプチドが使用される。以下は、Ｏｃｔ－４、Ｓｏｘ－２、およびＫｌｆ－２のアミノ酸配列である：
Oct4:
MAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGI（配列番号5）
Sox-2：
MYNMMETELKPPGPQQTSGGGGGNSTAAAAGGNQKNSPDRVKRPMNAFMVWSR（配列番号6）
Klf-2：
MALSEPILPSFSTFASPCRERGLQERWPRAEPESGGTDDDLNSVLDFILSMGLD（配列番号7）

ＩＣＡＰの標識ドメイン部分は、アミノ酸配列ＭＡＧＨＬＡＳＤＦＡＦＳＰＰＰＧＧＧＧＤＧＰＧＧＰＥＰＧＷＶＤＰＲＴＷＬＳＦ（配列番号８）を有するポリペプチドであり得る。

ＩＣＡＰ標識ドメインは、ヒトメソセリンＥＣＤの構造的に不活性なドメインを含み得る。メソセリンドメインをコードするポリペプチドの場合、以下のドメインＩ、ＩＩ、またはＩＩＩのペプチド配列を含み得る。
EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDEL（ドメインI－配列番号9）
SLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQN（ドメインII－配列番号10）
CSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKL（ドメインIII－配列番号11）

標識ポリペプチドは、細胞内シグナル伝達機能または他の生物活性分子との相互作用を有さない構造膜タンパク質に由来し、通常は別のタンパク質または炭水化物によって結合されるものであることを条件として構造膜タンパク質の「構造的に不活性な」ドメインを提供することができ、このため、標識ドメインを構成するエピトープは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて抗体に曝露されない。標識ポリペプチドは、好ましくは、免疫原性をほとんどまたは全く有さない。標識ポリペプチドの免疫原性は、１）Ｔ細胞エピトープの数に関するｉｎ ｓｉｌｉｃｏ計算アルゴリズム、２）Ｔ細胞活性化能を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、および３）動物モデルを使用するｉｎ ｖｉｖｏ実験によって決定できる。

上記の任意の標識ドメインを、上記の任意の膜貫通ドメインおよび上記の任意の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせて、ＩＣＡＰポリペプチドを形成することができる。短いポリペプチドリンカーを使用して、ＩＣＡＰのドメインを連結することができる。

例えば、上記の標識ドメインはいずれも、図３Ｂに示されるプラスミドｐＮＢ３３８Ｂ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨの「標識ドメイン」部分としてコードされ得る。

この構築物は、エフェクター細胞内で発現され、「免疫細胞活性化ポリペプチド」（ＩＣＡＰ）を産生し、これは、標識ドメインが細胞外になるように細胞外膜に局在する。

本明細書に開示されるエフェクター細胞は、二重特異性ポリペプチド、すなわち、連結ポリペプチドによって、または化学的コンジュゲーションによって連結された２つの機能的ドメインを有するポリペプチドと共に使用することができ、各ドメインは、異なるリガンドに特異的に結合する活性を有する。本明細書において、いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、２つ以上の一本鎖ナノボディ（一本鎖、単一ドメイン抗体）を含む二重特異性ポリペプチドの好ましい形態として、「ＶＨＨ－ＴＣＰ」とも呼ばれる。

二重特異性ポリペプチドの１つのドメインは、エフェクター細胞の表面上にあるＩＣＡＰの標識ドメイン（Ｌ－ｂｄ）に特異的に結合するアミノ酸配列を含み、二重特異性ポリペプチドの１つのドメインは、好ましくは腫瘍細胞などの細胞標的であるが、標的タンパク質と結合した任意の細胞または表面（ＣＳＰ－ｂｄ）であり得る、「標的」の表面上のタンパク質に特異的に結合する。このような表面に提示された標的ポリペプチドは、本明細書では「細胞表面タンパク質」またはそのエピトープと呼ばれる。

このような細胞表面タンパク質は、例えば、ＣＤ１９、メソセリン、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、ビメンチン、Ｄｃｒ２またはＤＰＰ４などの腫瘍、自己免疫疾患、または細胞もしくは生物の老化に関連する抗原であり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、これらのタンパク質の１つ以上を量に関してまたは変異タンパク質として異常に発現する細胞、例えば、Ｂ細胞、中皮細胞、乳房細胞、または線維芽細胞の腫瘍である。

本明細書で使用される二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）は、追加の結合活性、または生化学活性もしくは生理活性を提供するために、例えば、同じ標的タンパク質からの複数のエピトープ、または複数の標的タンパク質からのエピトープを認識するために、追加のドメインを含むことができる（三重特異性、四特異性、五特異性、または六特異性ポリペプチドを含む「多重特異性ポリペプチド」）。二重特異性ポリペプチドはまた、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰ機序を介してエフェクター細胞活性スイッチャーに影響を与えるＩＣＡＰの標識ドメインとして、ヒトＩｇＧＦｃドメインを認識するための１つ以上の結合モチーフを含むことができる。

追加的または代替的に、二重特異性（多重特異性）ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの二重特異性ポリペプチドの半減期を制御するために、様々な分子量を有する血清アルブミンに由来する１つ以上のドメインを含み得る。

蛍光色素に結合するドメインを二重特異性ポリペプチドに含めることにより、二重特異性ポリペプチドおよび二重特異性ポリペプチドが特異的に結合する細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの追跡（例えば、蛍光色素染色組織サンプルを調べることによる）を可能にすることができる。

好ましくは、二重特異性ポリペプチドのドメインは、１つ以上のリンカーペプチドによってＮ末端からＣ末端に互いに連結することができる。リンカーの長さは、二重特異性ポリペプチドの分子量またはそのドメイン間の立体的相互作用を調節するために（例えば、それらを減少させるために）、調整することができる。

二重特異性ポリペプチドのリンカー部分はまた、血液中のペプチダーゼによる切断を受けやすいアミノ酸配列を含み得、それにより、血液中または細胞外マトリックス中の二重特異性ポリペプチドの半減期が制限される。例えば、アミノ酸配列ＲＶＬＡＥＡ（配列番号１２）、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ（配列番号１３）およびＧＧＩＥＧＲＧＳ（配列番号１４）は、マトリックスメタロプロテナーゼ－１によって切断可能であり、アミノ酸配列ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ（配列番号１５）は、第ＩＸａ因子／第ＶＩＩａ因子によって切断可能である。

いくつかの実施形態では、活性ドメインの１つ以上、例えばすべては、ＶＨＨナノボディポリペプチドから構成される。

Ｌ－ｂｄは、ラクダ科動物ＩｇＧのＶＨＨドメインに由来する単一の抗体ドメインであり得る。このようなＶＨＨドメインのＣＤＲ３領域は、標識ドメイン上にエピトープ（複数可）に結合するパラトープとして機能する１５～２０のアミノ酸を含み得る。

二重特異性ポリペプチドは、標識ポリペプチドに特異的に結合するＶＨＨドメインであるＬ－ｂｄと、ＣＤ１９またはＣＤ２０に特異的に結合するＶＨＨドメインであるＣＳＰ－ｂｄとを含むことができる。このような二重特異性ポリペプチドは、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞リンパ腫の処置に有用である。いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、標識ポリペプチドに特異的に結合するＶＨＨドメインであるＬ－ｂｄと、ＥＧＦＲに特異的に結合するＶＨＨドメインであるＣＳＰ－ｂｄとを含むことができる。ＶＨＨ抗体のＣＤＲ３領域由来のアミノ酸配列は、非小細胞肺がん細胞の表面上にあるＥＧＦＲに結合することができる。このような二重特異性ポリペプチドは、非小細胞肺がんの処置に有用であろう。

二重特異性ポリペプチドは、標識ポリペプチドに特異的に結合するＶＨＨドメインであるＬ－ｂｄと、ＣＰＣ３に特異的に結合するＶＨＨドメインであるＣＳＰ－ｂｄとを含むことができる。いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、標識ポリペプチドに特異的に結合するＶＨＨドメインであるＬ－ｂｄと、ＢＣＭＡに特異的に結合するＶＨＨドメインであるＣＳＰ－ｂｄとを含むことができる。いくつかの実施形態では、二重特異性ポリペプチドは、標識ポリペプチドに特異的に結合するＶＨＨドメインであるＬ－ｂｄと、ＨＥＲ２に特異的に結合するＶＨＨドメインであるＣＳＰ－ｂｄとを含むことができる。このような二重特異性ポリペプチドは、ＨＥＲ２^＋乳がん腫瘍の処置に有用である。

リンカーによって結合された２つのＶＨＨドメイン（ヒトメソセリンのＥＣＤ＋リンカー＋抗ＥＧＦＲ ＶＨＨに由来する構造的に不活性なペプチドを含む標識ドメインに結合するＶＨＨ）を含む例示的な二重特異性ポリペプチドは、アミノ酸配列QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFDFSSVTMSWHRQSPGKERETVAVISNIGNRNVGSSVRGRFTISRDNKKQTVHLQMDNLKPEDTGIYRCKAWGLDLWGPGTQVTVSS（配列番号１６）を有する。

好ましくは、標的細胞以外の他の細胞上でのエピトープへの二重特異性ポリペプチドの結合は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、二重特異性ポリペプチドの薬物動態または薬物分布に有意な影響を有さず、好ましくは、生じる結合は、二重特異性ポリペプチドによって結合される関連する標識ドメインを発現するエフェクター細胞を活性化すること以外、いかなる有意な観察可能な生理学的効果も引き起こさない。

本明細書に例示し、記載した実施形態により、出願人は、本明細書に開示される操作されたエフェクター細胞および二重特異性ポリペプチドを使用して、腫瘍を処置するための方法およびその変形を考案した。

このような方法の１つでは、Ｔ細胞であり得る操作された免疫細胞、またはエフェクター細胞として本明細書に記載されている他の細胞型が、固形腫瘍に直接注射される。あるいは、操作された免疫細胞を静脈内投与することができる（ＩＶ、例えば白血病またはリンパ腫が処置される場合）。疾患の適応に応じて、異なる投与方法を実施してもよい。ほとんどの場合、ＩＶ投与は、疾患を処置するために実施される。腹腔内投与は、悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）を処置するために実施され得る。

固形腫瘍の処置では、腫瘍への直接注射により、細胞の腫瘍微小環境内でのより良好な分布をもたらすこと（より大量の操作された免疫細胞が標的腫瘍細胞の近位にあること）が予測される。

典型的な処置方法では、投与されるＶＨＨ－ＴＣＰの量は、例えば５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、または１×１０^６個の操作された細胞／ｍｌの濃度の操作された免疫細胞と一緒に１０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。

ＶＨＨ－ＴＣＰ活性化分子を利用しない処置方法の一例の実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｂ細胞上のＣＤ１９に特異的に結合するＶＨＨ標識ドメインを有する、ならびに一般的なＴ細胞受容体（すなわちＣＤ２８およびＣＤ３ｅ）の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを有するＩＣＡＰを発現するＴ細胞である。操作されたＴ細胞はまた、構成的プロモーターの制御下にある抗ＰＤ－１－Ｆｃエフェクターポリペプチドの発現のためのベクターを含む。細胞を対象に投与後、ＩＣＡＰの標識－ＶＨＨドメインは、Ｂ細胞上のＣＤ１９に特異的に結合し、結合により、操作された免疫細胞にシグナルが伝達され、これらがＣＤ３およびＣＤ２８の細胞内シグナル伝達時に活性化され、Ｂ細胞標的の近くで増殖する。増殖中の細胞は、結合したＢ細胞の近くに大量の抗ＰＤ１エフェクタータンパク質を分泌する。

開示された系は、その様々な実施形態において、以下の利点のうちの１つ以上を提供する。必ずしもすべての実施形態が、以下に示す利点のすべてを呈するものではない。

ＩＣＡＰ標識ドメインの実施形態では、フェトプロテインまたは構造膜タンパク質に由来するポリペプチドは、ＶＨＨ－ＴＣＰの結合のための可能な広範囲のＬ－ｂｄを提供し、
ドメインの免疫原性がないまたは低いため、細胞治療法の安全性が向上し得る。

二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）に含まれ得るドメインの多様性により、エフェクター細胞へのＶＨＨ－ＴＣＰ親和性などの多くの特性を変更させる能力が提供され、ＣＳＰ－ｂｄが標的とすることができる細胞の範囲が広い。また、他の機能的ドメインを追加することができ、疾患を処置するための系の使用の有効性および安全性に合わせて、エピトープ結合価を調整することができる。

免疫細胞宿主の増殖を活性化するシグナル伝達ドメインを含む免疫細胞活性化因子ポリペプチドの標識ドメインに特異的に結合し、ＣＤ１９リガンドなどのＢ細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合する二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、エフェクター細胞の増殖を誘導することができ、免疫エフェクター細胞の集団を増加させ、したがって、Ｂ細胞結合の近傍において、エフェクターポリペプチドの量が増加する。これにより、エフェクターポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生の時間短縮および費用の回避が可能になる。

二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）は、二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）中のＶＨＨ間のリンカーの長さおよびフレキシビリティ、各結合モチーフの位置、ならびにＶＨＨ－ＴＣＭの全体的なサイズを通してエフェクター細胞活性を最適化するために、様々な形態で操作することができる。

Ｉｎ ｖｉｖｏでのエフェクター細胞活性は、異なる量の二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）を投与すること、および／またはＶＨＨ－ＴＣＰの半減期を制御することによって制御することができる。これは、ＣＡＲベースの治療法の毒性を最小限に抑えるための新規の包括的アプローチである。

さらに、Ｆｃエピトープに特異的に結合する適切な標識タンパク質を使用して、エフェクター細胞をＡＤＣＣ効果によって活性化することができる。

重要なのは、ナノボディの特性、例えば、小さいサイズ、高い安定性、および容易な操作性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの処置システムを最適化するための独自の利点を提供する。

対象へのＶＨＨ－ＴＣＰ投与を中断することにより、持続的なエフェクター細胞活性に関連する有害作用を防止できると共に、疾患が再発した場合にその後にＶＨＨ－ＴＣＰ投与の機会を提供することができる。

活性化エフェクター細胞による抗体、好ましくはナノボディのｉｎ ｓｉｔｕ分泌は、免疫チェックポイント受容体を阻害または刺激して、ＴＭＥ（腫瘍微小環境）の浸透、増殖および持続を介して固形腫瘍の標的化を改善することができる。ナノボディ二重特異性ポリペプチドは、サイズが小さく優れた安定性を有するため、ＴＭＥへの浸透において従来の抗体よりも利点を有する。

本明細書で開示されているエフェクター細胞－二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）系は、例えば、単一の標準化された免疫受容体により複数の腫瘍抗原を標的にすることによって、現在のＣＡＲ－Ｔ療法に伴う多くの危険を改善でき、多様なＶＨＨ－ＴＣＰ構造を使用して、免疫細胞の活性を制御および最適化することができる。開示された系を利用する処置は、より少ない毒性または副作用を示すことが予測される。さらに、系の構成成分は、容易に費用効果が高く製造される。ＩＣＡＰおよび二重特異性ポリペプチド（ＶＨＨ－ＴＣＰ）に組み込むことができるリガンドおよび結合ドメインの多様性により、モジュラーシステムを使用して、様々な疾患の処置または研究の実施が可能になり、例えば、ＦＩＴＣ結合ドメインをＶＨＨ－ＴＣＰに組み込むことにより、活性化されたエフェクター細胞の運命をｉｎ ｖｉｖｏで追跡することができる。

実施例
実施例１－代表的な作業実施形態
１．エレクトロポレーションによる修飾エフェクターＴ細胞の生成
ＩＣＡＰは、標識ポリペプチド（２７ａａのメソセリンまたはフェトプロテイン）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８ＩＣ）、およびＣＤ３ζで構成されている。１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）は、ＶＨＨ－１１８２ドメインおよびＩｇＧ４Ｆｃドメインで構成されている。

１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）構造遺伝子をｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターｐＳ３３８Ｂにクローニングして、プラスミドｐＳ３３８Ｂ－１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）を得る（図３Ａ）。ＩＣＡＰ－ＶＨＨ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターｐＮＢ３３８Ｂにクローニングして、プラスミドｐＮＢ３３８Ｂ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨを得る（図３Ｂ）。ＩＣＡＰ－ＶＨＨ遺伝子を、空のマルチクローニング（ＭＣＳ）遺伝子に置き換え、ＭＯＣＫ構築物プラスミドを生成する。

健康なドナーのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から購入する。ＰＢＭＣを、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を添加したＡＩＭ－Ｖ培地、５％ＣＯ_２加湿インキュベーター内で３７℃で０．５～１時間培養した後、採取し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して２回洗浄する。

ＰＢＭＣをカウントし、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＴＣｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キットを製造業者の指示に従って使用して、エレクトロポレーター（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において、６μｇのｐＮＢ３３８Ｂ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨプラスミドまたは等量のＭＯＣＫプラスミドをエレクトロポレーションする。その後、ＩＣＡＰ－ＶＨＨ／１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）プラスミドまたはＭＯＣＫ／１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）プラスミドをトランスフェクトしたＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体／抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍＬ）をコーティングした６ウェルプレートで４～５日間特異的に刺激する。次に、形質転換されたＴ細胞を２％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含むＡＩＭ－Ｖ培地で１０日間培養し、十分な量のエフェクターＴ細胞を生成する。

２．形質導入効率アッセイ
標識ポリペプチドのＴ細胞への形質導入効率は、ビオチン結合抗ＩｇＧ４（Ｆｃ）抗体およびＰＥ結合ストレプトアビジン二次抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定される。

３．結合効率アッセイ
一般的なＴ細胞への二重特異性ポリペプチドの結合は、抗ＣＤ１９－ＰＥ抗体を使用したフローサイトメトリーによって測定される。ＣＤ１９および標識（例えば、メソ）に対して陽性である細胞の比率を比較して、結合効率を決定する。

４．増殖能アッセイ（二重特異性ＶＨＨおよび腫瘍細胞との培養）
１×１０^７個の形質転換Ｔ細胞をカルボキシフルオレセインスクシニンミジルエステルで１０分間前染色し、培地でさらに１０分間回収する。細胞５×１０^５個をカウントし、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＭＵＣ１、およびＧＰＣ３、ならびに二重特異性ＶＨＨなどの様々な抗原を発現する腫瘍細胞株と、３～４日ごとに培養培地を新鮮な培地（ＡＩＭ－Ｖ＋２％ＦＢＳ）に置き換えて、７日間共培養する。次に、エフェクター細胞をフローサイトメトリーによって増殖についてアッセイする。

５．１１８２－Ｆｃ－ＶＨＨ分泌の定量
５×１０^５個の細胞を１ｍｌの培地を含む６ウェルプレートに播種し、腫瘍細胞および二重特異性ＶＨＨを添加して、４８時間共培養する。次に、エフェクターＴ細胞懸濁液を３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を保持し、１１８２－Ｆｃタンパク質を、ＥＬＩＳＡによって定量的に検出する。

６．細胞傷害性アッセイ（接着細胞株用）
標識構築物またはベクター対照を形質導入したエフェクターＴ細胞の細胞傷害性は、インピーダンスベースのｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＴＰ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して決定する。

標的腫瘍細胞は、抵抗器が底部に貼られた９６ウェルプレートに、ＲＴＣＡ ＴＰ装置内で、細胞１０，０００個／ウェルで一晩（１６時間以上）播種する。培養した標的腫瘍細胞に二重特異性ＶＨＨ抗体を添加し、さらに３０分間培養する。次に、プラスミドｐＳ３３８Ｂ－１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）およびｐＮＢ３３８Ｂ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨ（エフェクター細胞）を有する形質転換Ｔ細胞を、異なるエフェクター細胞：標的細胞比で標的腫瘍細胞と約１００時間インキュベートする（エンドポイントは、形質転換されたＴ細胞の殺滅効率に依存する）。実験中、細胞指数値は、腫瘍細胞の付着と密接に相関し、これは、細胞接着が少ないほど細胞傷害性が高いことを示し、ＲＴＣＡシステムおよびＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）マルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって５分ごとに収集される。リアルタイムの殺滅曲線は、システムソフトウェアによって自動的に生成される。形質転換された各Ｔ細胞の特異的溶解（％）もエンドポイントのデータを使用して計算される［特異的溶解＝（腫瘍細胞のみの細胞指数－腫瘍細胞と共培養された形質転換Ｔ細胞の細胞指数）／腫瘍細胞のみの細胞指数］。

７．細胞傷害性アッセイ（浮遊細胞株用）
標識構築物またはベクター対照で形質導入されたエフェクターＴ細胞の細胞傷害性は、製造業者のプロトコル（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試薬ＡＤ０１１６－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従って決定される。簡潔に説明すると、標的腫瘍細胞をＰＢＳおよび蛍光増強リガンドで洗浄し、３７℃で５～３０分間インキュベートする。１００μｌの標的細胞（細胞１０，０００個）を、標的腫瘍細胞およびエフェクター細胞（すなわち、形質転換されたＴ細胞）の両方に特異的に結合する二重特異性ポリペプチドを含むＶ底プレートに入れ、１００μｌのエフェクター細胞を、様々な細胞濃度で添加する。室温で１５分間インキュベートした後、２０μｌの上清を２００μＬのユーロピウム溶液に移した。蛍光を、時間分解蛍光光度計で測定する。特異的放出（％）＝実験的放出（数）－自発的放出（数）／最大放出（数）－自発的放出（数）×１００。

８．Ｉｎ ｖｉｖｏでの特異的標的活性
ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２ Ｒγ－／－（ＮＳＧ）マウスを、病原体フリーの条件下で作製する（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）。動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ ＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されている。異種移植腫瘍モデルを確立するために、ＮＳＧマウスに５×１０^６個のＥＧＦＲ^＋肺腫瘍細胞および５×１０^６個のＭＳＬＮ^＋卵巣腫瘍細胞を、等量のマトリゲル（商標）と混合して皮下接種する。腫瘍寸法を、ノギスを使用して得て、腫瘍体積を、次式に基づいて計算する：Ｖ＝１／２（長さ×幅^２）腫瘍量が、約１００ｍｍ^３となると、Ｆｌｕｃ標識エフェクターＴ細胞および二重特異性ＥＧＦＲ標的ＶＨＨを静脈内注射する。エフェクターＴ細胞の肺への特異的標的化を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認する。５日目に、別の二重特異性ＭＳＬＮ標的ＶＨＨを静脈内注射して、エフェクターＴ細胞の卵巣腫瘍細胞への特異的標的化を観察する。Ｉｎ ｖｉｖｏでのエフェクターＴ細胞の増殖能を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用した生物発光イメージングによって監視する。

９．Ｉｎ ｖｉｖｏでの増殖および抗腫瘍活性
異種移植腫瘍モデルを確立するために、ＮＳＧマウスに等量のマトリゲル（商標）と混合した５×１０^６個のＦｌｕｃ標識腫瘍細胞を皮下接種させる。腫瘍量が約１００ｍｍ^３となると、マウスを無作為に３群（５匹のマウス／群）に分け、ＭＯＣＫ－Ｔ、エフェクターＴ細胞、またはポリペプチドＶＨＨを含むＰＢＳビヒクルを静脈内注射（ｉｖ）し、その時点を０日目として指定する。

すべてのマウスの末梢血を尾静脈から採取し、エフェクターＴ細胞の増殖およびＩＣＡＰ遺伝子のコピー数を検出する。瀕死状態に達したマウスは安楽死させ、骨髄、血液、脾臓を収集する。上記の組織内のＣＤ３^＋Ｔ細胞および脾臓中のメモリーＴ細胞サブセットのパーセントを、フローサイトメトリーによって分析する。Ｉｎ ｖｉｖｏでの実験全体の進行中、マウスの体重を、電子天秤を使用して測定する。腫瘍の進行は、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を使用する生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認する。測定はすべて、５日ごとに実施する。

１０．ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および免疫組織化学（ＩＨＣ）
細胞治療法の安全性を評価するために、Ｈ＆Ｅおよび免疫組織化学を実施する。マウス組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、および脳）をホルマリンで固定し、パラフィンで包埋する。ＲＭ２２４５ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して、組織を４μｍの厚さに連続的に切断し、Ｈ＆Ｅで染色する。エフェクターＴ細胞の腫瘍組織内への浸潤能を検出するために、１：１００希釈の抗ＣＤ３抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１６６６９）を使用して、ＩＨＣ分析を実施する。画像は、ＡＸＩＯＳＴＡＲ ＰＬＵＳ顕微鏡（ＺＥＩＳＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して撮影する。

１１．組織分布アッセイ
１１８２－ＶＨＨ、トランスフェクトされたＴ細胞、およびアダプターＶＨＨタンパク質の組織分布は、定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を使用して決定する。マウス組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、および脳）を消化して、単細胞浮遊液を調製する。ゲノムＤＮＡ抽出キットＶｅｒ．５．０（ＴＡＫＡＲＡ，Ｃｈｉｎａ）を製造業者の指示に従って使用して、Ｔ細胞から総ＤＮＡを抽出する。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して実施する。ＣＡＲおよびアクチンのプライマーおよびプローブは、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＧｅｎｅｒａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）が合成または標識する。定量的リアルタイムＰＣＲ反応は、２つのステップで実施する：（１）プレインキュベーション：９５℃で５分間；（２）増幅：９５℃で２０秒間、その後、６０℃で１分間を４０サイクル。すべての反応を、３連で実施する。

１２．統計分析
すべてのデータを、平均±ＳＤとして表す。Ｔ検定を使用して、２つの独立した群間の差異を評価する。一元配置分散分析を使用して、３つ以上の独立した群間に統計的に有意な任意の差異の有無を比較する。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、連続結果変数に対する２つの名目予測変数の効果を決定する。すべての統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７バージョンのソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実施する。エラーバーを含むすべてのデータは、平均±ＳＤとして表す。統計の有意差は、次のように考慮される。Ｐ≧０．０５（ｎｓ）、Ｐ＜０．０５（^＊）、Ｐ＜０．０１（^＊＊）、Ｐ＜０．００１（^＊＊＊）、Ｐ＜０．０００１（^＊＊＊＊）。

実施例２．ＭＳＬＮ、ＢＣＭＡ、またはＥＧＦＲに対して高い親和性を有する１つのＶＨＨ配列の同定および特徴付け
アルパカ免疫ライブラリーを使用した、高親和性を有するＭＳＬＮ、ＢＣＭＡ、またはＥＧＦＲに対する１つの特異的ＶＨＨナノボディの同定および特徴付けについて説明する。

１．ＭＳＬＮに対するＶＨＨナノボディ
最初の免疫では、完全フロイントアジュバントを使用して乳化した４００μｇのＭＳＬＮ－ｈＦｃを各アルパカに皮下投与した。２週間後、不完全フロイントアジュバントを使用して乳化した２００μｇのＭＳＬＮ－ｈＦｃを皮下投与した。その後、隔週で不完全フロイントアジュバントを使用して乳化した２００μｇのＭＳＬＮ－ｈＦｃによって、さらに５回の免疫を行った。ＭＳＬＮ－Ｈｉｓ抗原およびＨＥＫ２９３Ｔ－ＭＳＬＮ安定細胞株の両方に対する高い血清力価が、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって確認された。

最後の注射から７日後、５０ｍＬの血液を採取し、リンパ球をサンプルから精製し、ＲＮＡを抽出し、免疫ライブラリーの構築に使用した。ＭＳＬＮ－Ｈｉｓ抗原を用いて２ラウンドの固相タンパク質パニングを行い、その後、ＥＬＩＳＡスクリーニングおよびＦＡＣＳ検証を行った。Ｍ２３３９（ＶＨＨ）という名前の１つの陽性クローンを得た。

抗体は、特許公開ＷＯ２０２０１７６８１５（Ａ２）（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された手順で、Ｍ２３３９（ＶＨＨ）と名付けられたｈＦｃ融合タンパク質として発現した。ＭＳＬＮ抗原に対するＭ２３３９（ＶＨＨ）の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。まず、Ｍ２３３９（ＶＨＨ）を、プロテインＡをあらかじめ固定したセンサーチップの中に通過させ、抗体をプロテインＡによって捕捉した。次に、５つの濃度のＭＳＬＮ－Ｈｉｓタンパク質を移動相として使用し、結合時間および解離時間は、それぞれ３０分および６０分であった。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア２．０（ＧＥ）を使用して、オンレート（ｋｏｎ）、オフレート（ｋｏｆｆ）、および平衡定数（ＫＤ）を分析した。以下の表１に示すとおり、ＭＳＬＮ抗原に対するＭ２３３９（ＶＨＨ）の親和性は高く、Ｋ_Ｄは、２．６４Ｅ－１０であった。

ＨＥＫ２９３Ｔ－ＭＳＬＮ細胞に対するＭ２３３９（ＶＨＨ）の結合親和性を、フローサイトメトリーで同定した。１つの９６ウェルプレートをＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ－ＭＳＬＮ細胞と異なるウェルで細胞３×１０^５個／ウェルでインキュベートし、次に連続希釈したＭ２３３９（ＶＨＨ）を３０分間インキュベートし、その後、検出二次抗体抗ヒトＩｇＧ ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，コード：１０９－１１７－００８）をインキュベートし、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーターで検出した。「アイソタイプ」は、アイソタイプ対照（陰性対照）である。図４Ａに示すとおり、Ｍ２３３９（ＶＨＨ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＭＳＬＮ細胞株に対して優れた特異的結合親和性を示した。

２．ＢＣＭＡに対するＶＨＨナノボディ
この実施例では、アルパカ免疫ライブラリーを使用した、高親和性を有するＢＣＭＡに対する１つの特異的ＶＨＨナノボディの同定および特徴付けについて説明する。アルパカの免疫、採血、ライブラリー構築、固相パニング、陽性クローンのＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳスクリーニング、抗体精製、ならびにＳＰＲおよびＦＡＣＳによる抗体の特徴付けの手順は、上記の実施例２に記載している。Ｂ０２９（ＶＨＨ）という名前の１つの陽性クローンを得た。

表１に示すとおり、ＢＣＭＡ－Ｈｉｓ抗原に対するＢ０２９（ＶＨＨ）の親和性は高く、Ｋ_Ｄは、１．２５Ｅ－１０であった。

図４Ｂに示すとおり、Ｂ０２９（ＶＨＨ）は、ＣＨＯＫ１－ＢＣＭＡ細胞株に対して良好で特異的な結合親和性を示した。

３．ＥＧＦＲに対するＶＨＨナノボディ
この実施例では、アルパカ免疫ライブラリーを使用した、高親和性を有するＥＧＦＲに対する１つの特異的ＶＨＨナノボディの同定および特徴付けについて説明する。アルパカの免疫、採血、ライブラリー構築、固相パニング、陽性クローンのＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳスクリーニング、抗体精製、ならびにＳＰＲおよびＦＡＣＳによる抗体の特徴付けの手順は、上記の実施例２に記載している。Ｅ４５４（ＶＨＨ）という名前の１つの陽性クローンを得た。

表１に示すとおり、ＥＧＦＲ Ｈｉｓ抗原に対するＥ４５４（ＶＨＨ）の親和性は高く、Ｋ_Ｄは、１．２７Ｅ－０９であった。

図４Ｃに示すとおり、Ｅ４５４（ＶＨＨ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＥＧＦＲ細胞株に対して良好で特異的な結合親和性を示した。

実施例３．メソセリンの領域ＩＩ＋ＩＩＩに特異的な高親和性ＶＨＨ
この実施例では、本発明で使用される標識の同定および特徴付けについて記載し、これは、メソセリンに対して同様の親和性結合を有するＭ２３３９（ＶＨＨ）と認識された。

ヒトＦｃを含む異なるメソセリンＥＣＤドメインを、２９３Ｔ細胞において発現させ、プロテインＡカラムによって精製した。親和性は、ＳＰＲによって決定した。プロテインＡチップを使用して、様々な抗原を捕捉し、様々な濃度のＭ２３３９（ＶＨＨ）を流速１０μｌ／分で注入し、結合時間は、１２０～１８０秒であり、解離時間は、１８０～１２００秒であった。結合速度論を、１：１フィットモデルでＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して決定した。

図５に示すとおり、Ｍ２３３９（ＶＨＨ）は、異なる親和性で完全なメソセリン、メソセリンＩ、メソセリンＩＩ＋ＩＩＩに結合した。メソセリンＩＩ＋ＩＩＩドメインは、Ｍ２３３９によって十分に認識され、ＫＤ値は、４．３２Ｅ－１１Ｍであり、完全なメソセリンポリペプチドと同様の親和性を示した（表２）。

これらの結果は、Ｍ２３３９がメソセリンＩＩ＋ＩＩＩに高い親和性で結合し、アダプターＶＨＨとして使用できることを示しており、メソセリンＩＩ＋ＩＩＩを、Ｔ細胞のＩＣＡＰ中で使用することができる。

実施例４．メソセリンＩＩ＋ＩＩＩ（Ｍ－ＩＣＡＰ）をベースにした免疫細胞活性化ポリペプチドの生成およびスクリーニング
Ｔ細胞などの免疫細胞を活性化するためのいわゆるＭ－ＩＣＡＰ－Ｔを生成するために、図６に示す様々なベクターを構築した。ベクターはすべて、４－１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内領域を含む同じ細胞内領域をコードしている。コードされるポリペプチドの細胞外領域は、異なった。Ｍ－ＩＣＡＰは、いかなるＨｉｓ－タグも含まない。Ｍ－ＩＣＡＰ－ｈｉｓ－１または２は、それぞれＭ－ＩＣＡＰのＮ末端またはＣ末端のいずれかに６×Ｈｉｓタグを含む。メソセリンシグナルペプチド（ＳＰ－ＭＳＬＮ）に加えて、発現率を最適化するために、他の２つのシグナルペプチド（ＳＰ）をヒトタンパク質データベースから選択した。ＳＰ３－Ｍ－ＩＣＡＰおよびＳＰ５－Ｍ－ＩＣＡＰは、異なるシグナルペプチドＳＰ３（ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ－配列番号１）またはＳＰ５（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ－配列番号２）を含む。

すべてのベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、２～４日後にフローサイトメトリーを使用してそれらの発現率を試験した。フローサイトメトリーによる検出では、１９Ｒ７３－ＣＤ１９ＣＡＲおよびＧＦＰベクターを使用してブランク細胞対照を調製し、Ｍ２３３９－ｈＦｃおよびビオチン結合抗Ｈｉｓ ｍＡｂを一次抗体として使用し、蛍光色素結合抗ヒトＦｃおよび蛍光色素結合ストレプトアビジンを二次抗体として使用した。表３および図７に示すとおり、Ｈｉｓタグの位置は、標識（Ｍ－ＩＣＡＰ）の発現率に影響を与え、Ｍ－ＩＣＡＰの発現率は、Ｎ末端のＨｉｓタグがＭ２３３９－ｈＦｃによって検出された場合に高かった。シグナルペプチドは、Ｍ２３３９－ｈＦｃおよび抗－Ｈｉｓの両方によって試験したＭ－ＩＣＡＰの発現にほとんど影響を示さなかった。

実施例５．Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の構築
図８Ａに示すとおり、異なるシグナルペプチド（ＳＰ－ＭＳＬＮ、ＳＰ３、ＳＰ５）を含むＭ－ＩＣＡＰ発現ベクターを構築して、従来のＣＡＲベクターのＴ細胞活性化／シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８／４－１ＢＢ、ＣＤ３ζ）と融合させた。ＩＣＡＰベクターは、標識ポリペプチドＭ－ＩＣＡＰ（メソセリンＩＩ＋ＩＩＩドメイン由来）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８／４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８／４－１ＢＢＩＣ）およびＣＤ３ζドメインを含んだ。ＩＣＡＰ－ＶＨＨ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターｐＮＢ３３８Ｂにクローニングして、プラスミドｐＮＢ３３８Ｂ－ＩＣＡＰ－ＶＨＨを得た（図８Ｂ）。

健康なドナーのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）から購入した。ＰＢＭＣを、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を添加したＡＩＭ－Ｖ培地、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、３７℃で０．５～１時間培養した後、採取し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して２回洗浄した。ＰＢＭＣをカウントし、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＴＣｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キットを製造業者の指示に従って使用して、エレクトロポレーター（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において、６μｇのＭ－ＩＣＡＰ、ＳＰ３－Ｍ－ＩＣＡＰ、およびＳＰ５－Ｍ－ＩＣＡＰベクターをエレクトロポレーションした。その後、トランスフェクトしたＴ細胞を、抗Ｈｉｓ／Ｍ２３３９（ＶＨＨ－Ｆｃ）および抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍＬ）でコーティングされた６ウェルプレートで４～５日間特異的に刺激し、２％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）を含むＡＩＭ－Ｖ培地で１０日間培養し、十分な量のエフェクターＴ細胞を生成した。Ｔ細胞上の標識ポリペプチドの形質導入効率（Ｍ－ＩＣＡＰ発現）を、ビオチン結合抗Ｈｉｓ抗体およびＰＥ結合ストレプトアビジン二次抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定した。

図８Ｃおよび図８Ｄに示すとおり、増大後、Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔの陽性率はすべて８日目で３０％を超え、１３日目で９２％であった。３つの異なるＩＣＡＰはすべて、Ｍ２３３９ＶＨＨまたは抗Ｈｉｓ抗体の刺激によって活性化され、増幅した。Ｔ細胞膜の外部でのＭ－ＩＣＡＰＥＣＤの発現およびＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の構築は成功した。

実施例６．Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の生成および検証
Ｍ－ＩＣＡＰを、いくつかの異なるＣＡＲ配列に融合し、得られたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞は、ドナー由来のＰＢＭＣ細胞を使用した特異的活性化と組み合わせたエレクトロポレーションによって得た。ＩＣＡＰベクターは、標識ポリペプチド（メソセリンＩＩ＋ＩＩＩドメイン由来）、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８／４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８／４－１ＢＢＩＣ）およびＣＤ３ζドメインを含んだ。１１８２－Ｆｃ（ＥＱ）は、ＶＨＨ－１１８２ドメインおよびＩｇＧ４Ｆｃドメインを含む。

エレクトロポレーションによるＩＣＡＰ ＣＡＲを発現する細胞（ＩＣＡＰ－Ｔ細胞）または古典的なＣＡＲ－Ｔ細胞の生成を実施例５に記載した。

増大後、改変されたＴ細胞を検証するためにＩＣＡＰ発現の陽性率、増幅効果、ＣＤ３陽性細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞の比率、およびメモリーＴ（Ｔｍ）細胞中のエフェクターメモリーＴ（Ｔｅｍ）細胞／セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞の比率を含む一連の試験を実施した。Ｔ細胞表面での標識ポリペプチドの発現率（Ｍ－ＩＣＡＰ発現）は、ビオチン結合抗Ｈｉｓ抗体およびＰＥ結合ストレプトアビジン二次抗体を使用したフローサイトメトリーによって決定した。図９に示すとおり、２名のドナー（ＡＣ１９０９ＡおよびＳＬ２００７Ａ）のＰＢＭＣから調製中のＩＣＡＰ－Ｔ細胞の増幅は、最大１０倍であり、ＩＣＡＰ発現率は最大８０％であり（ドナー供給源によって異なる）、ＣＤ４／ＣＤ８陽性値は、異なるドナーに応じて変動し、セントラルメモリーＴ細胞が、メモリー細胞の大部分を占めていた。異なるＣＡＲエレメント配列は、ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の陽性率および増幅に何らかの影響を及ぼした。例えば、Ｍ－ＩＣＡＰおよびＭ－ＩＣＡＰ－２８と比較すると、Ｍ－ＩＣＡＰ－２８ＢＢ－Ｔ細胞は、増殖およびＩＣＡＰ発現が少ないことを示した。Ｔ細胞の特異的活性化に関して、本発明者らは、Ｍ－ＩＣＡＰをトランスフェクトしたＰＢＭＣの増幅に及ぼす様々な抗体／ＴＣＰの効果を比較した。図に示すとおり、Ｍ２３３９、抗Ｈｉｓ抗体、およびＴＣＰ００１－Ｃ／Ｐは、ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の増大を特異的に活性化することができた。

実施例７．Ｍ２３３９ＶＨＨをベースにしたＴＣＰの設計および特徴付け
この実施例では、本出願で使用されるＴＣＰの設計および特徴付けについて説明する。ここで使用したＴＣＰは、標的Ｂ細胞または腫瘍特異的抗原（ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、およびＥＧＦＲなど）およびＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞のＭ－ＩＣＡＰポリペプチド（メソセリン由来）を同時に認識できる二重特異性抗体であるため、Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞の増殖または細胞傷害性を制御するためのアダプターとして使用できる。現在の作業実施例で設計され、適用されたＴＣＰを表４に示す。

１．ＴＣＰの設計および精製
以下でさらに説明する細胞傷害性アッセイおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイで使用するために、ＢＣＭＡ抗原およびＭ－ＩＣＡＰポリペプチド（メソセリンに由来する標識）を同時に標的化できるＢＣＭＡ－ＴＣＰを設計した。ＴＣＰの生物活性および安定性に対する様々なリンカーフォーマットの効果を調べるために、様々なリンカー（それぞれ、３×ＧＧＧＧＳリンカー、ｈＩｇＧ４－Ｆｃ、およびｈＩｇＧ４－ＣＨ３）を有する３つのフォーマットのＢＣＭＡ－ＴＣＰ（ＴＣＰ００１－Ｃ、ＴＣＰ００２－Ｃ、およびＴＣＰ００３－Ｃ）を設計した。ＴＣＰ００１－ＰおよびＴＣＰ００１－Ｎは、それぞれＴＣＰフォーマットの陽性対照および陰性対照であった。同時に、ＢＣＭＡおよびＭ－ＩＣＡＰをそれぞれ標的とするＭＣ００１ＣおよびＭＣ００１Ｄは、ｍＡｂフォーマット中の２つの陽性対照として構築された。

ＴＣＰ０１１－Ｐと名付けられる、３×Ｇ４ＳリンカーによってＣＤ１９抗原およびＭ－ＩＣＡＰポリペプチドを同時に標的化する１つのＣＤ１９－ＴＣＰを、ＣＤ１９抗原によって刺激されるＭ－ＩＣＡＰ－Ｔの増殖アッセイで使用するために設計した。

ＴＣＰ０２１－Ｐと名付けられる、３×Ｇ４ＳリンカーによってＥＧＦＲ抗原およびＭ－ＩＣＡＰポリペプチドを同時に標的化する１つのＥＧＦＲ－ＴＣＰを、ＥＧＦＲ発現固形腫瘍細胞株を標的として使用するＭ－ＩＣＡＰ－Ｔの細胞傷害性アッセイで使用するために設計した。

Ｍ－ＩＣＡＰポリペプチドを標的とするＮ末端Ｍ２３３９ＶＨＨ配列は、上記の実施例２および実施例３に記載したアルパカ免疫ＶＨＨライブラリーを使用するファージディスプレイから同定した。ＢＭＣＡを標的とするＢ０２９（ＶＨＨ）配列は、上記の実施例２に記載したアルパカ免疫ＶＨＨライブラリーによってファージディスプレイから同定した。ＢＭＣＡを標的とするＴＣＰ００１－Ｐ内のｓｃＦｖ配列は、ＣＮ第２０１５８００５０６３８号のＢ２１２１由来であった。ＧＦＰを標的とするＴＣＰ００１－ＮのＶＨＨ配列は、Ｋｕｂａｌａらによって記載されたＧＦＰ特異的ＶＨＨ由来であった（ＭＨ Ｋｕｂａｌａ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９：２３８９－２４０１（２０１０）（こうしたＶＨＨの説明およびその使用方法については、参照によりその全体が組み込まれる）。

ＣＤ１９を標的とするＴＣＰ０１１－Ｐ内のｓｃＦｖ配列は、中国特許出願ＣＮ第２０１４８００２７４０１．４号に記載されているＦＭＣ０６３由来であった（すべての目的のために参照によりその全体が組み込まれる）。ＥＧＦＲを標的とするＴＣＰ０２１－Ｐ内のＥ４５４配列は、上記の実施例２に記載したアルパカ免疫ＶＨＨライブラリーによってファージディスプレイから同定した。

これらの遺伝子は、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．が合成し、クローン化した。すべてのＯＲＦ ＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．４ベクターにＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間でクローン化した。抗体の発現、精製および純度品質管理は、刊行物ＷＯ２０２０１７６８１５号Ａ２（そのような方法の説明については、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のとおり実施した。

２．ＴＣＰの親和性特性化
最初に、ＢＭＣＡ抗原に対する精製されたＢＣＭＡ－ＴＣＰの結合親和性をＳＰＲによって評価した。ＢＣＭＡ－ｈｉｓ抗原をＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させた後、様々な抗ＢＣＭＡ ＢｓＡｂを１０μＬ／分の流速で、９００秒の解離時間で流した。結合速度論を、１：１フィットモデルで決定した。データは、３×Ｇ４Ｓリンカーを有するＴＣＰ００１－Ｃが、より大きなリンカーを有するＴＣＰ００２－ＣおよびＴＣＰ００３１－Ｃよりも高い結合親和性を有していたため、リンカー構造が結合親和性に影響を与える可能性があることを示した（表５）。

メソセリンおよびＢＣＭＡ過剰発現細胞の結合生物活性を、フローサイトメトリーによって評価した。０．２５％トリプシンを使用して、安定した細胞株を回収した。

サンプルあたり約５Ｅ５の細胞を収集し、細胞を１００μＬ／ウェルのＨｉｓタグを有する試験抗体中に再懸濁した。次に、細胞を抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｃｈｉｎａ）およびストレプトアビジン－ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃｈｉｎａ）と共にインキュベートした。各ステップのインキュベーションステップは、暗所で４℃で１時間行い、その後、細胞を２００μＬのＰＢＳバッファーで２回洗浄した。洗浄した細胞を２００μＬのＰＢＳバッファーに再懸濁し、サンプルをＦＡＣＳによって分析した。図１０に示すとおり、ＴＣＰ００２－Ｃは、両方の細胞株に最も強く結合したが、ＴＣＰ００３－Ｃの結合強度は、ＴＣＰ００１－Ｃよりも少し高かった。

３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血漿中のＢＣＭＡ－ＴＣＰの安定性
ＴＣＰ００１Ｃ、ＴＣＰ００２Ｃ、およびＴＣＰ００３Ｃは、１００％ヒト血漿中で、３７℃で最大２１日間インキュベートし、サンプルを、それぞれ０日目、１日目、３日目、７日目、１４日目、および２１日目に収集した。９６ウェルプレートをメソセリン抗原でコーティングし、プレートをブロックして洗浄した後、適切に希釈して収集したサンプルと段階希釈した標準サンプルをプレートと共に３７℃で１時間インキュベートした。抗－ＶＨＨ－カクテル－ＨＲＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ａ０２０１６）を検出抗体として使用し、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。最後に、試験サンプルは、標準サンプル群のフィットさせた曲線に従って分析した。

図１１に示すとおり、ＴＣＰ００１－Ｃ、ＴＣＰ００２－Ｃ、およびＴＣＰ００３－Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、３７℃で２１日よりも長い期間、ヒト血漿中で安定している。

ＣＤ１９およびＭＳＬＮの両方の過剰発現細胞についてのＴＣＰ０１１－Ｐの結合親和性（図１２）、ならびにＥＧＦＲおよびＭＳＬＮの両方の過剰発現細胞についてのＴＣＰ０２１－Ｐの結合親和性（図１３）は、ＢＣＭＡ－ＴＣＰに適用した同じ手順で、フローサイトメトリーによって確認した。

実施例８．標的細胞に向けたＴＣＰによるＭ－ＩＣＡＰ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅
標的細胞とのＴＣＰ培養によるＩＣＡＰ－Ｔ細胞の迅速な活性化および増幅を検証するために、Ｍ－ＩＣＡＰ（抗Ｈｉｓおよび抗ＣＤ２８によって活性化）をトランスフェクトしたＰＢＭＣ－Ｔ細胞を、それぞれ、ＴＣＰ０１１－ＰまたはＴＣＰ０１１－Ｎの存在下で、ＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞と共培養した。ＣＤ１９陽性のＤａｕｄｉリンパ腫細胞を５０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣの存在下または非存在下で２時間処置した。Ｍ－ＩＣＡＰ細胞をトランスフェクトした５×１０^５個のＰＢＭＣ－Ｔ細胞をカウントし、５×１０^５個のＤａｕｄｉ細胞、およびＴＣＰ０１１－ＰまたはＴＣＰ０１１－Ｎと４日間共培養した。次に、エフェクターまたは標的細胞を、増殖についてフローサイトメトリーによって分析した。

図１４に示すとおり、ＴＣＰ０１１－Ｐの存在下において、５日間、８日間、および１３日間トランスフェクトされたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞によって刺激されたときに、効果的に増大し、トランスフェクション後５日目および８日目において、増幅が最大であった。さらに、活性化Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞は、Ｄａｕｄｉ細胞を殺滅することができた。

実施例９．ＲＰＭＩ－８２２６細胞に対するＭ－ＩＣＡＰ－ＴのＴＣＰ用量依存性細胞傷害性効果
ＩＣＡＰ－Ｔ細胞をＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に作用させるには、ＢＣＭＡに特異的に結合できるＴＣＰを有する必要がある。ＴＣＰ００１－ＣおよびＴＣＰ００１－Ｐの２つの末端は、同時にＩＣＡＰ－Ｔ細胞およびＢＣＭＡ細胞に特異的に結合できる。特定のＴＣＰと組み合わせて、ＩＣＡＰ－ＴがＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に作用し、特異的細胞溶解／殺滅効果を有し得ることを確認するために、本発明者らは、異なるＴＣＰの存在下で、ＲＰＭＩ－８２２６細胞またはＬ３６３細胞と共培養したＩＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞（３つの異なるＥ：Ｔ比で）の細胞溶解／殺滅効果を比較した。

浮遊細胞株についてのＴ細胞の細胞傷害性アッセイを、製造業者のプロトコル（ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試薬ＡＤ０１１６－ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従って実施した。簡潔に説明すると、標的腫瘍細胞をＰＢＳおよび蛍光増強リガンドで洗浄し、３７℃で１５分間インキュベートした。５０μｌの標的細胞（細胞５，０００個）を、標的腫瘍細胞およびエフェクター細胞（すなわち、形質転換されたＴ細胞）の両方に特異的に結合する二重特異性ポリペプチドを含むＶ底プレートに入れ、５０μｌのエフェクター細胞を、様々な細胞濃度（Ｅ：Ｔ＝１６／８／４：１）で添加した。３．５時間のインキュベーション後、１０μｌの上清を１００μＬのＥｕｒｏｐｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎに移した。室温で１５分間インキュベートした後、時間分解蛍光光度計で蛍光を測定した。特異的放出（％）＝実験的放出（数）－自発的放出（数）／最大放出（数）－自発的放出（数）×１００。

Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌もアッセイした。ＩＦＮγの検出は、製造業者のプロトコル（ＩＦＮγ検出キット、ＶＡＬ１０４－Ｎｏｖｕｓ）に従って実施した。簡潔に説明すると、指示に従って、新鮮な洗浄液、着色剤、希釈剤、および標準産物を調製した。異なる濃度の標準液および希釈した実験サンプルを、対応するウェルに１００μｌ／ウェルで添加した。反応ウェルをシーリングテープで密封し、室温で２時間インキュベートした。洗浄バッファーを使用して４回洗浄後、２００μＬの酵素標識抗体を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。プレート洗浄操作を繰り返した後、２００μＬの前もって混合した色試薬を各ウェルに加え、反応を暗所で１０～３０分間インキュベートする。５０μｌ／ウェルの停止溶液を添加することによって、溶液の色が青から黄色に変化する。ＯＤ値を、分光光度計で２０分記録し、選択された「４パラメータ方程式」を使用してＥｘｃｅｌで分析し、標準サンプル群を使用して標準曲線を得る。

図１６に示すとおり、ＴＣＰ００１－Ｃと組み合わせたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔは、腫瘍標的細胞に対して強い特異的殺滅効果を示したが、Ｅ：Ｔ＝１６：１の場合、Ｔ細胞の非特異的殺滅効果がより明白であった。ＴＣＰ濃度が０．０２５μｇ／ｍｌを超える場合、Ｅ：Ｔ＝８：１および４：１の細胞溶解効果が増加している。ＴＣＰ００１－Ｃの濃度が０．１および０．５μｇ／ｍｌである場合、Ｅ：Ｔ＝１６：１および８：１が最善の殺滅効果を示した。ＴＣＰ００１－Ｃの濃度が２μｇ／ｍｌに達すると、Ｅ：Ｔ＝１６：１および８：１の効果はむしろ低下する。Ｅ：Ｔ＝１６：１は最善の殺滅効果を示した。異なるＥ：Ｔ比では、ＴＣＰのＥＣ５０値は、類似していた（ＥＣ５０＝０．０２８（Ｅ：Ｔ＝１６：１）、０．０２４（Ｅ：Ｔ＝８：１），０．０２２（Ｅ：Ｔ＝４：１））が、最大値は、Ｅ：Ｔ比に対応していた。

実施例１０．ＲＰＭＩ－８２２６／Ｌ３６３細胞に対する異なるＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ－Ｔの細胞傷害性の比較およびＩＦＮγ分泌の検出
ＴＣＰ００１－Ｃ／Ｐ、ＴＣＰ００２－Ｃ／Ｐ、およびＴＣＰ００３－Ｃ／Ｐの２つの末端は、Ｍ－ＩＣＡＰおよびＢＣＭＡに同時に結合する。ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に対するこれらのＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ－Ｔ細胞の特異的細胞溶解効果を確認し、比較するために、ＲＰＭＩ－８２２６細胞またはＬ３６３細胞と共培養したＩＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解／殺滅アッセイを、様々なＴＣＰの存在下で実施した（Ｅ：Ｔ＝８：１）。浮遊細胞株に対するＴ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮγ分泌アッセイは、実施例９に記載している。

図１６に示すとおり、ＴＣＰ００１－Ｃと組み合わせたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔは、腫瘍標的細胞に対して強力な特異的殺滅効果を有するが、ＴＣＰ００１－Ｃ（ＢＣＭＡ陽性細胞のみに結合）またはＴＣＰ－ＭＤ（ＢＣＭＡ陽性細胞への結合なし）の組み合わせは、ＦａＤｕ／ＳＫ－ＯＶ３細胞を効果的に殺滅することはできない。さらに、ＩＦＮγ分泌データは、細胞傷害性データと一致している。Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔを０．２μｇ／ｍｌのＴＣＰ００１－Ｃ／Ｐの両方と組み合わせることにより、陰性対照群（ＴＣＰ００１－ＮまたはＴＣＰ－ＭＤまたはＩｇＧ）と比較して、ＲＰＭＩ－８２２６細胞株およびＬ３６３細胞株でＩＦＮγの放出が特異的に誘導された。放出順位は、ＴＣＰ００１＞ＴＣＰ００３＞ＴＣＰ００２である。

実施例１１．ＦａＤｕ／ＳＫ－ＯＶ３細胞に対するＴＣＰ（ＥＧＦＲ結合）と組み合わせたＩＣＡＰ－Ｔ細胞の細胞溶解効果
ＩＣＡＰ－Ｔ細胞をＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞上で作用させるには、ＥＧＦＲに特異的に結合できるＴＣＰを有する必要がある。ＴＣＰ０２１－Ｐは、ＩＣＡＰおよびＥＧＦＲをそれぞれその２つの末端で組み合わせることができる。この特異的ＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ－Ｔ細胞が、ＦａＤｕ（ヒト咽頭扁平上皮癌）およびＳＫ－ＯＶ３（ヒト卵巣がん細胞）などのＥＧＦＲ陽性腫瘍細胞に作用できることを確認するために、様々なＴＣＰの存在下で、ＦａＤｕ／ＳＫ－ＯＶ３細胞と共培養したＩＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効果を比較した。

接着細胞株に対するＴ細胞の細胞傷害性アッセイは、インピーダンスベースのＲＴＣＡ ＴＰ機器および方法（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）を使用して実施する。標的腫瘍細胞を、抵抗器が底部に貼られた９６ウェルプレートに、ＲＴＣＡ ＴＰ装置内で、１０，０００細胞／ウェルで一晩（１６時間以上）播種する。二重特異性ＴＣＰまたは抗体を、培養した標的腫瘍細胞に添加し、さらに３０分間培養する。次に、ＩＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞を、異なるエフェクター細胞：標的細胞の比率で標的腫瘍細胞と共に約１００時間インキュベートする（エンドポイントは、形質転換されたＴ細胞の殺滅効率に依存する）。実験中、細胞指数値は、腫瘍細胞の接着と密接に関連し、これは、細胞接着が少ないほど細胞傷害性が高いことを示し、ＲＴＣＡシステムによって５～１０分ごとに収集される。リアルタイムの殺滅曲線は、システムソフトウェアによって自動的に生成される。形質転換された各Ｔ細胞の特異的溶解（％）も４８時間の時点のデータを使用して計算される［特異的溶解＝（腫瘍細胞のみの細胞指数－腫瘍細胞と共培養された形質転換Ｔ細胞の細胞指数）／腫瘍細胞のみの細胞指数］。

図１７に示すように、ＥＧＦＲ ＣＡＲ－Ｔと同様に、ＴＣＰ０２１－Ｐと組み合わせたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔは、２つの異なる腫瘍標的細胞に対して強い特異的殺滅効果を有する（Ｔ細胞の非特異的殺滅効果は、Ｅ：Ｔ＝４：１でより明白である）一方で、ＴＣＰ００１－Ｃ（ＢＣＭＡ陽性細胞のみに結合）またはＴＣＰ－ＭＤ（ＥＧＦＲ陽性細胞に結合しない）の組み合わせは、ＦａＤｕまたはＳＫ－ＯＶ３細胞を効果的に殺滅することはできない。

実施例１２．Ｄａｕｄｉ細胞に対するＴＣＰを有するＩＣＡＰ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γの放出および細胞溶解効果
ＩＣＡＰ－Ｔ細胞がＢ細胞に作用するためには、ＣＤ１９に特異的に結合できるＴＣＰを有する必要がある。ＴＣＰ０１１－Ｐは、その２つの末端でＩＣＡＰおよびＣＤ１９にそれぞれ結合することができる。ＣＤ１９陽性Ｂ細胞に対するこの特定のＴＣＰと組み合わせたＩＣＡＰ－Ｔ細胞の効果を確認するために、様々なＴＣＰの存在下で、ＩＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞をＤａｕｄｉ細胞と共培養した場合のＤａｕｄｉ細胞の細胞溶解およびＩＦＮ－γの放出を比較した。浮遊細胞株に関するＴ細胞の細胞傷害性およびＩＦＮγ分泌アッセイは、実施例９に記載している。

図１８に示すとおり、ＩＦＮ－γの分泌は有意差を示している。ＴＣＰ０１１－Ｐと組み合わせたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔは、殺滅およびＩＦＮ－γの分泌においてＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔと類似していた。ＴＣＰ００１－Ｃ（ＢＣＭＡに結合）は、Ｄａｕｄｉ細胞に対して殺滅効果を呈したが、Ｔ細胞によって分泌されるＩＦＮ－γのレベルは、有意に低下した。また、ＴＣＰ－ＭＤと組み合わせたときには、ＩＦＮ－γを効果的に分泌できなかった（Ｄａｕｄｉ細胞に結合できない）。

実施例１３．ＩＣＡＰ－Ｔを分泌するＶＨＨの生成および特徴付け
複雑な腫瘍微小環境のため、現在臨床で試験されている固形腫瘍を標的とするほとんどのＣＡＲ－Ｔ療法は、ほとんど臨床での有効性を示していない。ＩＣＡＰ－Ｔ細胞系の抗腫瘍効果を高めるために、免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＴＧＦβなどの腫瘍中の抑制サイトカインのアンタゴニストである抗ＰＤ－１を分泌するＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞を、ヒトナイーブＴ細胞にＭ－ＩＣＡＰペプチド（ＭＩＩ＋ＩＩＩペプチド由来）と分泌型免疫チェックポイント阻害剤をコードするプラスミドとを同時にトランスフェクトすることにより、産生した。

Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ調製の１３日後、ＩＣＡＰの発現を検出するためにＦＡＣＳを使用した。結果を図１９に示す。Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ対照と比較して、ＶＨＨまたはｓｃＦｖとして分泌されるタンパク質の性質は、ＩＣＡＰの発現にいかなる明確な影響も及ぼさなかった。

ＥＬＩＳＡを使用して、分泌タンパク質の濃度を試験した。抗原がコーティングされた９６ウェルプレートに上清を添加し、ＨＲＰ結合抗ＶＨＨおよびＨＲＰ－抗－Ｈｉｓを、それぞれ抗ＰＤ－１ ＶＨＨ、抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨ、および抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖの検出に使用した。結果を図１９Ｂに示し、分泌されたＶＨＨの濃度は、約７５ｎｇ／ｍｌであり、分泌された抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖの濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌであった。

実施例１４．抗ＰＤ－１ＶＨＨの分泌はＰＤ－１の表面発現を遮断した
分泌された抗ＰＤ－１ＶＨＨの結合能を、ＰＤ－１をその表面に発現しているＴ細胞のＦＡＣＳによって間接的に試験した。市販の抗ＰＤ－１抗体を使用して、競合アッセイにおいてＴ細胞上でのＰＤ－１発現レベルを調べた。図２０に示すとおり、抗ＰＤ－１を分泌するＩＣＡＰ－Ｔ細胞の上清は、市販の抗ＰＤ－１抗体のＣＤ３およびＣＤ２８により刺激されたヒト初代Ｔ細胞への結合を遮断した。

実施例１５．Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞によって分泌される抗ＴＧＦβｓｃＦｖは、ＴＧＦβ－１によって誘導されるルシフェラーゼ細胞のシグナル伝達を遮断した
市販のＴＧＦβＲＩＩ－２９３Ｔ－Ｌｕｃ細胞株を使用して、実施例１３で得られた分泌抗ＴＧＦβｓｃＦｖの遮断活性を決定した。５０００個のＴＧＦβＲＩＩ－２９３細胞を播種して一晩インキュベートし、試験サンプルを添加した後５ｎＭＴＧＦβを添加し、６時間後、ＯＮＥ－ＧＬＯを使用して生物発光を読み取った。結果を図２１に示す。Ｍ－ＩＣＡＰ Ｔ細胞によって分泌される抗ＴＧＦβｓｃＦｖは、ＴＧＦβによって誘導されるルシフェラーゼシグナルを遮断した。ＣＡＲ－Ｔ－１０Ｃ、１０Ｂおよび０１Ａは、異なるドナーから調製された抗ＴＧＦβＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞である。

実施例１６．Ｌ３６３－ＰＤＬ１－ＬＵＣ同所性腫瘍モデルにおいてＴＣＰ００１－Ｃと共に使用されたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔのｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
以下に記載する同所性腫瘍モデル実験では、ＮＰＳＧマウス（ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ^ｔｍ１／Ｐｎｋ）を用いる。

１．腫瘍接種、グループ分け、薬物投与および動物観察
（ａ）Ｌ３６３－ＰＤＬ１－ｌｕｃ腫瘍細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で、３７℃、空気中５％ＣＯ２の雰囲気で培養した。指数成長期で成長している細胞を採取し、腫瘍接種のためにカウントした。接種時の細胞数は、４．０９Ｅ＋８であり、生存率は、８３．６５％であった。
（ｂ）有効性試験のために、各マウスに２×１０^６個のＬ３６３－ＰＤＬ１－ｌｕｃ細胞を含む２００μＬＰＢＳをＩＶ接種した。腫瘍接種日を、０日目として定義した。８日目に腫瘍体積が約９．４Ｅ５に達すると、２４匹のマウスを選択し、動物の体重および腫瘍体積に応じて、無作為に７つの群にグループ化した。各群は、３～５匹の担癌マウスを有する。投与された薬物のカテゴリー、投薬量および投与頻度に基づいて、７つの群を設定した。群１は、試験段階全体でＰＢＳのみを注射した陰性対照群として設定した。群２は、別の陰性対照群であり、高用量（２０^＊Ｅ６）の抗ＰＤ－１ Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞を８日目に静脈内注射し、その後２日ごとにＰＢＳを７回皮下注射した。群３は、別の陽性対照群であり、５^＊Ｅ６古典的ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ（Ｂ２１２１）を８日目に静脈内注射し、その後２日ごとにＰＢＳを７回皮下注射した。群４および群５は、２つの実験群であり、それぞれ、低用量（５^＊Ｅ６）および高用量（２０^＊Ｅ６）の抗ＰＤ－１ Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞を注射し、その後２日ごとに５ｍｇ／ｋｇのＴＣＰ００１－Ｃを７回皮下注射した。群６および群７は、別の２つの実験群であり、それぞれ、５^＊Ｅ６および２０^＊Ｅ６のＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞を注射し、その後２日ごとに５ｍｇ／ｋｇのＴＣＰ００１－Ｃを７回皮下注射した。
（ｃ）この試験における動物の取り扱い、世話および処置に関連するすべての手順は、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ） ｏｆ ＢｉｏＤｕｒｏによって承認されているＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ，認定番号００１５１６）のガイドラインに従って実施した。定期的なモニタリングの時点で、動物は、運動性、食物および水の消費（観察のみによる）、および体重の増減（体重は、投与前段階では週に２回、投与段階では毎日測定した）、目／毛のもつれへの影響、および腫瘍潰瘍などの任意の他の異常な効果などの正常な行動に対する腫瘍の成長および／または処置のあらゆる悪影響についてチェックした。いずれの動物も、体重減少が１０％に達したときに試験依頼者に通知した。

２．体重；腫瘍測定
体重および生物発光シグナルを週に２回測定した。担癌マウスの体重変化の結果を図２２に示す。試験中、いずれの群にも、異常な体重変化は観察されなかった。
マウスの生物発光シグナルは、ＩＶＩＳ ｌｕｍｉｎａ ＸＲを使用して、細胞注射後４日目から開始し、試験全体を通して週に２回測定した。シグナルは、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアによって定量化した。図２３に示すとおり、試験期間中（８日目～２６日目）、群２（腫瘍接種後にのみＭ－ＩＣＡＰ－Ｔを注射）と群１（腫瘍接種のみ）の間の有効性に、有意差はなかった。比較すると、通常のＴＣＰ００１－Ｃによって活性化されたＭ－ＩＣＡＰ－Ｔを注射したすべての実験群（群４、５、６、および７）は、同所性腫瘍モデルにおいて、２つの陰性対照群（群１および群２）と比較して、Ｌ３６３－ＰＤＬ１に対して有意な有効性を示した。さらに、実験群（群４、５、６、および７）は、古典的なＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ療法（群３）と同様の有効性を示した。

確立されたＬ３６３－ＰＤＬ１－ＬＵＣ同所性腫瘍モデルでは、通常のＴＣＰ００１－Ｃ注射と一緒にＭ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞を２日に１回の頻度で注射することにより、腫瘍を有意に抑制することができる。

３．マウス全血中の抗ＰＤ－１およびＴＣＰ００１－Ｃ濃度の分析
マウスの全血中の抗ＰＤ－１およびＴＣＰ００１－Ｃ濃度の数を分析するために、週に１回１００μｌの末梢血を採取した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイのために、１μｇ／ｍｌのＰＤ－１タンパク質を９６ウェルプレートに一晩コーティングした。希釈したサンプルおよび希釈した標準サンプル（２ｎｇ／ｍｌから８希釈ポイント）をウェルに加え、３７℃で１時間放置した。次に、抗ＶＨＨ－カクテル抗体を検出抗体として添加し、アッセイ試薬を添加した。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。濃度は、実施例９のように標準曲線に対する分析によって決定した。

図２４に示すとおり、抗ＰＤ－１ ＶＨＨは、２つのサンプリング時点（１５日目、２２日目）で、群２、４、および５でのみ、有意に検出できる。群２、４、および５は、エフェクターＴ細胞として抗ＰＤ－１ Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔを使用し、これは、ＰＤ－１が、ｉｎ ｖｉｖｏで抗ＰＤ－１Ｍ－ＩＣＡＰ－Ｔ細胞によって首尾よく分泌され得ることを示している。

ＴＣＰ００１－Ｃ濃度を分析するための方法は、抗体産生および特徴付けのパート（実施例５）の「ヒト血漿中の抗体の安定性評価」の方法に記載している。高濃度のＴＣＰ００１－Ｃは、ＴＣＰ００１－Ｃ皮下注射後２４時間、４８時間で採取された末梢血中で検出することができる。これは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＣＰ００１－Ｃの半減期が４８時間より長く、２日に１回の注射頻度が、Ｌ３６３腫瘍細胞に対するＭ－ＩＣＡＰ－Ｔの有効性を支持するのに十分であることを示している。

実施例１７．ＣＡＲ－Ｔのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ増幅のための汎用タグ付けシステムとしての例示的なＢＣＭＡペプチドモチーフの同定および特徴付け
ペプチドモチーフ（長さ約２０～３０ａａ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ増幅のための汎用ＩＣＡＰとしてＣＡＲ－Ｔ細胞受容体の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）のＮ末端に融合した。ペプチドモチーフの設計には、以下の基準を使用した。

最初に、ペプチドは、約２０～３０ａａの長さである。次に、高結合親和性（ＫＤ＜１ｎＭ）を有するこのペプチドモチーフに特異的なナノボディを得ることができる。最後に、ペプチドを標的とするナノボディは、ペプチドを、ＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体の抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）のＮ末端に融合すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＡＲ－Ｔの増幅を首尾よく誘導した。

１．ＭＳＬＮに対して高い親和性を有する１つのＶＨＨ配列の同定および特徴付け
アルパカ免疫ライブラリーを使用して、ＭＳＬＮに対して高い親和性を有する１つのＶＨＨナノボディを同定した。アルパカ免疫のスクリーニング、採血、ライブラリー構築、固相パニング、陽性クローンのＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳスクリーニング、抗体精製、ならびにＳＰＲおよびＦＡＣＳによる抗体の特徴付けの手順は、実施例２に記載したとおりであった。抗ＭＳＬＮ－１４４４ＶＨＨと名付けられた１つの陽性クローンを得た。

表６に示すとおり、ＭＳＬＮ Ｈｉｓ抗原に対する抗ＭＳＬＮ－１４４４ ＶＨＨの親和性は高く、ＫＤは２．１０Ｅ－０９であった。

図２５に示すとおり、抗－ＭＳＬＮ－１４４４ ＶＨＨは、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＭＳＬＮ細胞に対して優れた特異的結合親和性を示した。

２．ＢＣＭＡ全長ＶＨＨ結合剤によって強力に認識できるＢＣＭＡペプチド（ＢＣＭＡ ＩＣＡＰ）の同定。
ＢＣＭＡ－ｈＦｃ抗原を含む以前に調製された免疫ライブラリーからのいくつかのＢＣＭＡ候補結合タンパク質および全長ＢＣＭＡへの様々な結合特性を有する多くの候補ＶＨＨ配列によって高い親和性で認識できる適切な長さ（約２０ａａ）を有する１つのＢＣＭＡペプチドモチーフを設計した。天然ＢＣＭＡの１つのポリペプチドＢＣＭＡ ｍｕｔ１（ＢＣＭＡ ＥＣＤドメインの１～２３ａａ、表７－配列番号１７）を選択し、ＢＣＭＡ ｍｕｔ１と、発現されるＭＳＬＮを標的とする抗ＭＳＬＮ－１４４４ＶＨＨ配列との融合ポリペプチドを図２６に示す。

次に、本発明者らは、それに対して高親和性を有する３つのＶＨＨ配列（以下に記載の＃３６、＃１０２、および＃３６７）を除外した。ＢＣＭＡ ｍｕｔ１の配列も表７に示す（配列番号１８）。３つのＶＨＨ配列は、特許公開ＷＯ２０２０１７６８１５号Ａ２（すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の手順に従って、３６（ＶＨＨ）、１０２（ＶＨＨ）、および３６７（ＶＨＨ）と名付けたｈＦｃ融合タンパク質として表した。３つのＶＨＨナノボディの結合親和性をＳＰＲによって測定した。図２７に示すとおり、３つのＶＨＨは、ＢＣＭＡ ｍｕｔ１への高親和性結合を示した。これら３つのＶＨＨの結合速度論パラメータを表８に示す。抗ＢＣＭＡ ＶＨＨ ３６＃は、ＢＣＭＡ ＩＣＡＰ ＢＭＣＡｍｕｔ１との親和性が高いため、刺激因子として選択した。

３．ＢＣＭＡ ＩＣＡＰは、ＢＣＭＡ ＩＣＡＰによってＣＡＲＴ細胞を特異的に増幅するために使用できる。
ＩＣＡＰ－１－２３－３ＧＳベクターは、図２８Ａに示すように構築され、（Ｇ４Ｓ）３リンカーで接続された抗ＭＳＬＮ ＣＡＲのＮ末端にＢＣＭＡｍｕｔ１（ＩＣＡＰ）を有する。ＢＣＭＡｍｕｔ１－ＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＭＡｍｕｔ１－ＭＳＬＮ－１４４４ベクターによるトランスフェクション後、プレートにコーティングされたＭＳＬＮおよび抗ＣＤ２８または抗ＢＣＭＡｍｕｔ１ ３６＃および抗ＣＤ２８でそれぞれ刺激することによって調製した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、９日間の培養後に抗原ＭＳＬＮによって刺激されたＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、２名のドナーにおいて抗ＢＣＭＡｍｕｔ１ ３６＃によって刺激された増幅能と同等の増幅能を示した（図２８Ｂ、図２８Ｃおよび図２９Ａ、図２９Ｂ）。

４．抗ＢＣＭＡｍｕｔ１３６＃は、ＢＣＭＡ ＩＣＡＰによるＣＡＲＴ細胞の非特異的増幅を刺激しなかった。
ＢＣＭＡ ＩＣＡＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する抗ＢＣＭＡｍｕｔ１３６＃の刺激の特異性を試験するために、図３０Ａに示すようにＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲベクターを構築し、ＰＢＭＣのトランスフェクション後、プレートにコーティングされたＭＳＬＮおよび抗ＣＤ２８または抗ＢＣＭＡｍｕｔ１３６＃および抗ＣＤ２８による刺激によってそれぞれ調製した。結果を図３０Ｂに示す。ＭＳＬＮおよび抗ＣＤ２８により刺激されたＣＡＲＴ細胞のみが明確な増幅を示した。抗ＢＣＭＡ３６＃および抗ＣＤ２８により刺激されたＭＳＬＮ－１４４４ ＣＡＲは、２名のドナーにおいて増幅を示さなかった。

追加の核酸およびアミノ酸配列
MSLN領域II+領域III（M3）DNA：
TCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCG(配列番号19)
MSLN領域II+領域III（M3）タンパク質：
SLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALS(配列番号20)
M-ICAP CAR ORF DNA:
ATGGCCTTGCCAACGGCTCGACCCCTGTTGGGGTCCTGTGGGACCCCCGCCCTCGGCAGCCTCCTGTTCCTGCTCTTCAGCCTCGGATGGGTGCAGCCCCACCACCACCATCACCACGGAGGAGGCGGATCTTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA(配列番号21)
M-ICAP CAR ORFタンパク質:
MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPHHHHHHGGGGSSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号22)
M-ICAP-SP3 CAR ORF DNA:
ATGAAGCACCTCTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCTAGATGGGTGCTGTCTCACCACCACCATCACCACGGAGGAGGCGGATCTTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA(配列番号23)
M-ICAP-SP3 CAR ORFタンパク質:
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSHHHHHHGGGGSSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号24)
M-ICAP-SP5 CAR ORF DNA：
ATGACCAGGCTGACAGTGCTGGCTCTGCTGGCCGGACTGCTGGCTTCTTCTAGAGCTCACCACCACCATCACCACGGAGGAGGCGGATCTTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGA(配列番号25)
M-ICAP-SP5 CAR ORFタンパク質:
MTRLTVLALLAGLLASSRAHHHHHHGGGGSSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号26)
M（2339VHH）DNA配列：
CAGCTGCAGCTGGGCGCCTCTGGCGGCGGCCTGGTCCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGTGCCCTGTCTGGCTTCACACTGAGAGAGCTGGACGAGTTCGCCATCGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCTGGCAAGGAGAGAGAGGGCGTGAGCTGTATCAGCGGCACAGGCGGCATCACACATTATGCTGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACAATCAGCAGAGACATCGCCAAGACAACCGTGTACCTGCAGATGAATAGCCTGAACAGCGAAGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCGCCGACGAGAGATGTACAGACAGACTGATCAGACCTCCTACATATTGGGGACAAGGCACCCAGGTGACAGTCTCTTCT(配列番号27)
M(2339VHH)タンパク質配列:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSS(配列番号28)
TCP001-CおよびMC001C中のBCMA B029(VHH)配列:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSS(配列番号29)
TCP011-P中のCD19 scFv配列(CN201480027401.4.):
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS(配列番号30)
ＴＣＰ０２１－Ｐ中のＥＧＦＲ Ｅ４５４（ＶＨＨ）配列：
QVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFDFSSVTMSWHRQSPGKERETVAVISNIGNRNVGSSVRGRFTISRDNKKQTVHLQMDNLKPEDTGIYRCKAWGLDLWGPGTQVTVSS(配列番号31)
TCP001-N中のGFP scFv配列:
QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSS(配列番号32)
抗TGFβscF（mAb12.7）-US7494651B2：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSEWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPALGSTNYNEMYEGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGIGNYALDAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNIEDPLTFGGGTKVEIK(配列番号33)
PD-L1 BMK1 VHH（エンバフォリマブ）－US20180327494：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGKMSSRRCMAWFRQAPGKERERVAKLLTTSGSTYLADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSFEDPTCTLVTSSGAFQYWGQGTLVTVSS(配列番号34)
1444（VHH）タンパク質配列：
QVQVVESGGGFVQAGGSLRLSCAASTPIISIAYMGWYRQISEKERQLVATINSGGKTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNMLKPEDTGMYYCAASNKDYNDYDPDWGQGTQVTVSS(配列番号35)
TCP001-P中のB2121 scFv配列:
DIVLTQSPASLAMSLGERATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISRVQAEDAAIYSCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGESVKISCKASGYTFTDYSINWVKQAPGQGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSS(配列番号36)
TCP001-C:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(配列番号37)
TCP001-P:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAMSLGERATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTISRVQAEDAAIYSCLQSRIFPRTFGQGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLVQSGSELKKPGESVKISCKASGYTFTDYSINWVKQAPGQGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFVFSLDTSASTAYLQISSLKAEDTAVYFCALDYSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(配列番号38)
TCP001-N:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(配列番号39)
TCP011-P:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(配列番号40)
TCP021-P:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAASGFDFSSVTMSWHRQSPGKERETVAVISNIGNRNVGSSVRGRFTISRDNKKQTVHLQMDNLKPEDTGIYRCKAWGLDLWGPGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(配列番号41)
TCP002-C:
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TCP003-C:
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TCP-MC:
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSITSIYAIGWYRQAPGKLRELVAAITTSGNTFYRDSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKSEDTAVYDCNGAPWGDHAPLVVSWDQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(配列番号44)
TCP-MD:
QLQLGASGGGLVQPGGSLRLSCALSGFTLRELDEFAIGWFRQAPGKEREGVSCISGTGGITHYADSVKGRFTISRDIAKTTVYLQMNSLNSEDTAVYYCAADERCTDRLIRPPTYWGQGTQVTVSSGGGGSEQKLISEEDLGGGGSHHHHHH(配列番号45)

本明細書に含まれる主題の例示的な実施形態を示し、説明しており、本明細書に記載の方法およびシステムのさらなる適応は、特許請求の範囲から逸脱することなく、適切な変形によって達成され得る。さらに、上記の方法およびステップが特定の順序で発生する特定のイベントを示す場合、特定のステップは、説明された順序で実施される必要はなく、実施形態が意図された目的で機能できるようにする限り、ステップが任意の順序で実施されることが意図される。したがって、本開示の趣旨の範囲内であるか、または特許請求の範囲に見られる発明と同等である本発明の変形が存在する限り、本特許はそれらの変形も網羅することが意図されている。いくつかのそのような変形は、当業者には明らかであるはずである。例えば、上記で論じた実施例、実施形態、幾何学、材料、寸法、比率、ステップなどは例示的なものである。したがって、特許請求の範囲は、書面による説明および図面に記載された構造および操作の特定の詳細に限定されるものではない。

実施形態
実施形態１：細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外標識ドメインを含む発現された免疫細胞活性化因子ポリペプチドを含む免疫細胞であって、１つ以上のポリペプチドエフェクター分子を分泌する、免疫細胞。

実施形態２：細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＶＨＨ抗体の結合ドメインまたは単鎖可変領域フラグメントおよび標識ドメインを含む細胞外キメラポリペプチドを含む発現された免疫細胞活性化因子ポリペプチドを含む免疫細胞であって、１つ以上のポリペプチドエフェクター分子を分泌する、免疫細胞。

実施形態３：標識ドメインが、構造膜タンパク質またはフェトプロテインに由来するポリペプチドを含む、実施形態１または実施形態２に記載の免疫細胞。

実施形態４：ポリペプチドエフェクター分子が、１つ以上の免疫調節剤に特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態５：抗体が、ＶＨＨ抗体である、実施形態４に記載の免疫細胞。

実施形態６：免疫調節剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１６０、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβＲ、ＨＶＥＭまたはＬＩＧＨＴである、実施形態４に記載の免疫細胞。

実施形態７：標識ドメインが、一本鎖ポリペプチドを含む標識結合ドメインおよび細胞の細胞表面受容体に結合する一本鎖ポリペプチドを含む細胞表面タンパク質結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドに特異的に結合する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態８：
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および標識ドメインを含む免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む核酸ベクターを含む免疫細胞。

実施形態９：
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む第２の核酸ベクターをさらに含む、実施形態８に記載の免疫細胞。

実施形態１０：核酸ベクターが、１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態８に記載の免疫細胞。

実施形態１１：免疫細胞活性化因子ポリペプチドが、ＶＨＨ抗体の結合ドメインまたは単鎖可変領域フラグメントをさらに含む、実施形態８～１０のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態１２：免疫細胞活性化因子ポリペプチドが、（ｉ）ＶＨＨ抗体の結合ドメインまたは単鎖可変領域フラグメントおよび（ｉｉ）標識ドメインを含むキメラポリペプチドを含む、実施形態８～１１のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態１３：キメラポリペプチドが分岐している、実施形態１２に記載の免疫細胞。

実施形態１４：標識ドメインが、フェトプロテインに由来するポリペプチドを含む、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態１５：標識ドメインが、構造膜タンパク質を含む、実施形態８～１３のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態１６：シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインを含む、実施形態８～１５のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態１７：共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌを含む、実施形態１６に記載の免疫細胞。

実施形態１８：ＴＣＲシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζまたはＣＤ３εを含む、実施形態１６または実施形態１７に記載の免疫細胞。

実施形態１９：シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８およびＣＤ３ζを含む、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態２０：膜貫通ドメインが、免疫共刺激シグナル伝達に関与するドメインを含む、実施形態８～１９のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態２１：膜貫通ドメインが、ＣＤ２８を含む、実施形態８～２０のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態２２：ＣＤ２８が、ＩＴＡＭドメインを含む、実施形態２１に記載の免疫細胞。

実施形態２３：ＣＤ３εドメインが、アミノ酸ＹＭＮＭを含む、実施形態８～１８および２０～２２のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態２４：少なくとも１つの核酸ベクターが、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをさらに含む、実施形態８～２３のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態２５：少なくとも１つの核酸ベクターが、トランスポゾン逆向き末端反復配列をさらに含む、実施形態８～２３のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態２６：ポリペプチドエフェクター分子が、１つ以上の免疫調節剤に特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む、実施形態８～２５のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態２７：抗体が、ＶＨＨ抗体である、実施形態２６に記載の免疫細胞。

実施形態２８：免疫調節剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１６０、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβＲ、ＨＶＥＭまたはＬＩＧＨＴである、実施形態２６または２７に記載の免疫細胞。

実施形態２８：ポリペプチドエフェクター分子が、サイトカインを含む、実施形態８～２５のいずれか１つに記載の免疫細胞。

実施形態３０：サイトカインが、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ－α、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５またはＩＬ－１７である、実施形態２９に記載の免疫細胞。

実施形態３１：Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、サイトカイン活性化キラー細胞、樹状細胞－サイトカイン活性化キラー細胞、γδ－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態８～３０のいずれかに記載の免疫細胞。

実施形態３２：
（ａ）標識ドメイン；
（ｂ）膜貫通ドメイン；および
（ｃ）シグナル伝達ドメイン
を含む免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態３３：シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインを含む、実施形態３２に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態３４：共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌを含む、実施形態３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態３５：ＴＣＲシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζまたはＣＤ３εを含む、実施形態３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態３６：シグナル伝達ドメインが、そのＣ末端でＣＤ３εシグナル伝達ドメインのＮ末端に連結されているＣＤ２８を含む、実施形態３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態３７：シグナル伝達ドメインが、そのＣ末端でＣＤ３εシグナル伝達ドメインのＮ末端に連結されている共刺激ドメイン４－１ＢＢを含む、実施形態３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態３８：標識ドメインが、フェトプロテインに由来するポリペプチドを含む、実施形態３２～３７のいずれか１つに記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態３９：標識ドメインが、構造膜タンパク質を含む、実施形態３２～３７のいずれか１つに記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態４０：膜貫通ドメインが、免疫共刺激シグナル伝達に関与するドメインを含む、実施形態３２～３９のいずれか１つに記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態４１：膜貫通ドメインが、ＣＤ２８または構造膜タンパク質を含む、実施形態３２～４０のいずれか１つに記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態４２：ＣＤ２８が、ＩＴＡＭドメインを含む、実施形態３２～４１のいずれか１つに記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態４３：ＣＤ３εドメインが、アミノ酸ＹＭＮＭを含む、実施形態３２～４２のいずれか１つに記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。

実施形態４４：
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む核酸ベクター。

実施形態４５：トランスポゾン逆向き末端反復配列をさらに含む、実施形態４４に記載の核酸ベクター。

実施形態４６：
（ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｂ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む核酸ベクター。

実施形態４７：トランスポゾン逆向き末端反復配列をさらに含む、実施形態４６に記載の核酸ベクター。

実施形態４８：ポリペプチドエフェクター分子が、１つ以上の免疫調節剤に特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む、実施形態４６または実施形態４７に記載の核酸ベクター。

実施形態４９：抗体がＶＨＨ抗体である、実施形態４８に記載の核酸ベクター。

実施形態５０：ポリペプチドエフェクター分子が、サイトカインを含む、実施形態４６または実施形態４７に記載の核酸ベクター。

実施形態５１：
（ａ）実施形態３２～４０のいずれか１つに記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチドの標識ドメインに特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む標識結合ドメイン（Ｌ－ｂｄ）；および
（ｂ）細胞の細胞表面受容体に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む細胞表面タンパク質結合ドメイン（ＣＳＰ－ｂｄ）
を含む、二重特異性ポリペプチド。

実施形態５２：標識結合ドメインが、ラクダ科動物ＩｇＧのＶＨＨドメインを含む、実施形態５１に記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態５３：ＣＤＲ３ドメインの約１５～２０アミノ酸を含む、実施形態５１または実施形態５２に記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態５４：細胞がリンパ球である、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態５５：リンパ球がＢ細胞である、実施形態５４に記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態５６：細胞が腫瘍細胞である、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態５７：腫瘍が、リンパ腫、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、肝がん、または中皮腫である、実施形態５６に記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態５８：細胞表面タンパク質が、ＥＧＦＲである、実施形態５６または５７に記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態５９：細胞表面タンパク質が、ＧＰＣ３である、実施形態５６または５７に記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態６０：細胞表面タンパク質結合ドメインが、腫瘍細胞の表面上に発現するＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する、実施形態５１～５７のいずれか１つに記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態６１：細胞表面タンパク質結合ドメインが、リンパ腫細胞の表面上のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２に特異的に結合する、実施形態５１～５７のいずれか１つに記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態６２：ＶＨＨ抗体を含む、実施形態５１～５７のいずれか１つに記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態６３：追加の生化学的活性または生物学的機能を提供する１つ以上のドメインをさらに含む、実施形態５１～６２のいずれか１つに記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態６４：追加の生化学的活性または生物学的機能が、蛍光色素の特異的結合、ｉｎ ｖｉｖｏでの二重特異性ポリペプチドの半減期の延長、二重特異性ポリペプチドの親和性の増加、およびＦｃドメインによって媒介される免疫応答の調節を含む、実施形態６３に記載の二重特異性ポリペプチド。

実施形態６５：同じまたは異なる細胞の異なる細胞表面受容体（複数可）に結合する一本鎖ポリペプチドドメイン（複数可）を含む追加の細胞表面タンパク質結合ドメイン（複数可）を含む、実施形態５１～６２のいずれかの二重特異性ポリペプチド。

実施形態６６：標的細胞の近位で１つ以上のポリペプチドエフェクター分子をｉｎ ｓｉｔｕで産生するためのキットであって、
（ａ）実施形態８～３１のいずれか１つに記載の免疫細胞；および
（ｂ）実施形態５１～６６のいずれか１つに記載の二重特異性ポリペプチド
を含むキット。

実施形態６７：細胞表面タンパク質結合ドメインが、Ｂ細胞上のＣＤ１９に特異的に結合する、実施形態６６に記載のキット。

実施形態６８：細胞表面タンパク質結合ドメインが、腫瘍細胞上のＥＧＦＲ、メソセリン、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１またはＧＰＣ３に特異的に結合する、実施形態６６または実施形態６８に記載のキット。

実施形態６９：対象における腫瘍細胞の局所における免疫系環境を調節するための方法であって：
（ａ）実施形態９～３１のいずれか１つに記載の免疫細胞の有効量および実施形態５１～６５のいずれか１つに記載の第１の二重特異性ポリペプチドの有効量を対象に同時にまたは逐次的に投与するステップであって、二重特異性ポリペプチドが、リンパ球の細胞表面タンパク質に特異的に結合する細胞表面タンパク質結合ドメインを含むステップ、および
（ｂ）実施形態５１～６５のいずれか１つに記載の第２の二重特異性ポリペプチドの有効量を対象に投与するステップであって、二重特異性ポリペプチドが、腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合する細胞表面タンパク質結合ドメインを含むステップ、
を含む方法。

実施形態７０：ステップａとｂとの間に実施される、対象における免疫細胞の量を測定するステップをさらに含む、実施形態６９に記載の方法。

実施形態７１：対象の血液中の免疫細胞の量が測定される、実施形態７０に記載の方法。

実施形態７２：対象の腫瘍に浸潤する免疫細胞の量が測定される、実施形態７０に記載の方法。

実施形態７３：免疫細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、サイトカイン活性化キラー細胞、樹状細胞－サイトカイン活性化キラー細胞、γδ－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態６９～７２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７４：リンパ球の細胞表面タンパク質が、Ｂ細胞のＣＤ１９である、実施形態６９～７３のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７５：腫瘍細胞が、リンパ腫細胞、中皮腫細胞、非小細胞肺がん細胞、卵巣細胞、肝がん、または乳がん細胞である、実施形態６９～７４のいずれか１つに記載の方法。

実施形態７６：細胞表面タンパク質が、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１またはＧＰＣ３である、実施形態７５に記載の方法。

実施形態７７：対象における腫瘍細胞の局所における免疫系環境を調節するための方法であって、
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで対象の形質転換された免疫細胞を増殖させて、増殖したＴ細胞を得るステップであって、免疫細胞が、 （ｉ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｉｉ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；を含む核酸ベクターを含む第１の核酸ベクターを含み；
（ｉｖ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
（ｖ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
を含む第２の核酸ベクターをさらに含むステップ
；
および増殖したＴ細胞を対象に投与するステップ；
ならびに
（ｃ）増殖した免疫細胞を活性化して、増殖した免疫細胞によって発現する標識ドメインに特異的に結合する決定されたアミノ酸配列の標識結合ドメインおよび腫瘍細胞の細胞表面受容体に特異的に結合する細胞表面タンパク質結合ドメインを含む二重特異性ポリペプチドの免疫調節ポリペプチドを発現するのに有効な量を対象に投与するステップ
を含む、方法。

実施形態７８：腫瘍細胞が、メソセリンおよびＰＤＬ１を過剰発現する中皮腫細胞であり、細胞表面タンパク質が、中皮腫細胞の表面に発現されるメソセリンであり、エフェクター分子が、ＰＤ－１またはＣＤ４０に特異的に結合するＶＨＨドメインを含む、実施形態７７に記載の方法。

実施形態７９：腫瘍細胞が、Ｂ細胞であり、細胞表面タンパク質が、Ｂ細胞の表面上のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２である、実施形態７７または実施形態７８に記載の方法。

実施形態８０：免疫細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、サイトカイン活性化キラー細胞、樹状細胞－サイトカイン活性化キラー細胞、γδ－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、実施形態７７～７９のいずれか１つに記載の方法。

Claims (80)

1. 細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外標識ドメインを含む発現された免疫細胞活性化因子ポリペプチドを含む免疫細胞であって、前記免疫細胞が、１つ以上のポリペプチドエフェクター分子を分泌する、免疫細胞。
2. 細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＶＨＨ抗体の結合ドメインまたは単鎖可変領域フラグメントおよび標識ドメインを含む細胞外キメラポリペプチドを含む、発現された免疫細胞活性化因子ポリペプチドを含む免疫細胞であって、１つ以上のポリペプチドエフェクター分子を分泌する、免疫細胞。
3. 前記標識ドメインが、構造膜タンパク質またはフェトプロテインに由来するポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の免疫細胞。
4. 前記ポリペプチドエフェクター分子が、１つ以上の免疫調節剤に特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
5. 前記抗体が、ＶＨＨ抗体である、請求項４に記載の免疫細胞。
6. 前記免疫調節剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１６０、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβＲ、ＨＶＥＭまたはＬＩＧＨＴである、請求項４に記載の免疫細胞。
7. 前記標識ドメインが、一本鎖ポリペプチドを含む標識結合ドメイン、および細胞の細胞表面受容体に結合する一本鎖ポリペプチドを含む細胞表面タンパク質結合ドメインを含む、二重特異性ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の免疫細胞。
8. （ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
   （ｂ）シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および標識ドメインを含む免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
   （ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
   を含む核酸ベクターを含む、免疫細胞。
9. （ａ）前記免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
   （ｂ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
   （ｃ）前記免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
   を含む第２の核酸ベクターをさらに含む、請求項８に記載の免疫細胞。
10. 前記核酸ベクターが、１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８に記載の免疫細胞。
11. 前記免疫細胞活性化因子ポリペプチドが、ＶＨＨ抗体の結合ドメインまたは単鎖可変領域フラグメントをさらに含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
12. 前記免疫細胞活性化因子ポリペプチドが、
    （ｉ）ＶＨＨ抗体の結合ドメインまたは単鎖可変領域フラグメント、および
    （ｉｉ）前記標識ドメイン
    を含むキメラポリペプチドを含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の免疫細胞。
13. 前記キメラポリペプチドが分岐している、請求項１２に記載の免疫細胞。
14. 前記標識ドメインが、フェトプロテインに由来するポリペプチドを含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
15. 前記標識ドメインが、構造膜タンパク質を含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
16. 前記シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項８～１５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
17. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌを含む、請求項１６に記載の免疫細胞。
18. 前記ＴＣＲシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζまたはＣＤ３εを含む、請求項１６または１７に記載の免疫細胞。
19. 前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８およびＣＤ３ζを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の免疫細胞。
20. 前記膜貫通ドメインが、免疫共刺激シグナル伝達に関与するドメインを含む、請求項８～１９のいずれか一項に記載の免疫細胞。
21. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８を含む、請求項８～２０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
22. 前記ＣＤ２８が、ＩＴＡＭドメインを含む、請求項２１に記載の免疫細胞。
23. 前記ＣＤ３εドメインが、アミノ酸ＹＭＮＭを含む、請求項８～１８および２０～２２のいずれか一項に記載の免疫細胞。
24. 少なくとも１つの核酸ベクターが、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをさらに含む、請求項８～２３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
25. 前記少なくとも１つの核酸ベクターが、トランスポゾン逆向き末端反復配列をさらに含む、請求項８～２３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
26. 前記ポリペプチドエフェクター分子が、１つ以上の免疫調節剤に特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む、請求項８～２５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
27. 前記抗体が、ＶＨＨ抗体である、請求項２６に記載の免疫細胞。
28. 前記免疫調節剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１６０、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＴＧＦβ、ＴＧＦβＲ、ＨＶＥＭまたはＬＩＧＨＴである、請求項２６または２７に記載の免疫細胞。
29. 前記ポリペプチドエフェクター分子が、サイトカインを含む、請求項８～２５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
30. 前記サイトカインが、ＴＧＦ－β、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ－α、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５またはＩＬ－１７である、請求項２９に記載の免疫細胞。
31. Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、サイトカイン活性化キラー細胞、樹状細胞－サイトカイン活性化キラー細胞、γδ－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項８～３０のいずれか一項に記載の免疫細胞。
32. （ａ）標識ドメイン；
    （ｂ）膜貫通ドメイン；および
    （ｃ）シグナル伝達ドメイン
    を含む免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
33. 前記シグナル伝達ドメインが、共刺激ドメインおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項３２に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
34. 前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＯＸ４０またはＣＤ４０Ｌを含む、請求項３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
35. 前記ＴＣＲシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζまたはＣＤ３εを含む、請求項３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
36. 前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３εシグナル伝達ドメインのＮ末端に、Ｃ末端で連結されているＣＤ２８を含む、請求項３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
37. 前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３εシグナル伝達ドメインのＮ末端に、Ｃ末端で連結されている共刺激ドメイン４－１ＢＢを含む、請求項３３に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
38. 前記標識ドメインが、フェトプロテインに由来するポリペプチドを含む、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
39. 前記標識ドメインが、構造膜タンパク質を含む、請求項３２～３７のいずれか一項に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
40. 前記膜貫通ドメインが、免疫共刺激シグナル伝達に関与するドメインを含む、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
41. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８または構造膜タンパク質を含む、請求項３２～４０のいずれか一項に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
42. 前記ＣＤ２８が、ＩＴＡＭドメインを含む、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
43. 前記ＣＤ３εドメインが、アミノ酸ＹＭＮＭを含む、請求項３２～４２のいずれか一項に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチド。
44. （ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
    （ｂ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
    を含む核酸ベクター。
45. トランスポゾン逆向き末端反復配列をさらに含む、請求項４４に記載の核酸ベクター。
46. （ａ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
    （ｂ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
    （ｃ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
    を含む核酸ベクター。
47. トランスポゾン逆向き末端反復配列をさらに含む、請求項４６に記載の核酸ベクター。
48. 前記ポリペプチドエフェクター分子が、１つ以上の免疫調節剤に特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む、請求項４６または４７に記載の核酸ベクター。
49. 前記抗体が、ＶＨＨ抗体である、請求項４８に記載の核酸ベクター。
50. 前記ポリペプチドエフェクター分子が、サイトカインを含む、請求項４６または４７に記載の核酸ベクター。
51. （ａ）請求項３２～４０のいずれか一項に記載の免疫細胞活性化因子ポリペプチドの前記標識ドメインに特異的に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む、標識結合ドメイン（Ｌ－ｂｄ）；および
    （ｂ）細胞の細胞表面受容体に結合する一本鎖ポリペプチドドメインを含む、細胞表面タンパク質結合ドメイン（ＣＳＰ－ｂｄ）
    を含む、二重特異性ポリペプチド。
52. 前記標識結合ドメインが、ラクダ科動物ＩｇＧのＶＨＨドメインを含む、請求項５１に記載の二重特異性ポリペプチド。
53. ＣＤＲ３ドメインの約１５～２０アミノ酸を含む、請求項５１または請求項５２に記載の二重特異性ポリペプチド。
54. 前記細胞が、リンパ球である、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
55. 前記リンパ球が、Ｂ細胞である、請求項５４に記載の二重特異性ポリペプチド。
56. 前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
57. 前記腫瘍が、リンパ腫、非小細胞肺がん、乳がん、卵巣がん、肝がん、または中皮腫である、請求項５６に記載の二重特異性ポリペプチド。
58. 前記細胞表面タンパク質が、ＥＧＦＲである、請求項５６または５７に記載の二重特異性ポリペプチド。
59. 前記細胞表面タンパク質が、ＧＰＣ３である、請求項５６または５７に記載の二重特異性ポリペプチド。
60. 前記細胞表面タンパク質結合ドメインが、腫瘍細胞の表面上に発現するＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合する、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
61. 前記細胞表面タンパク質結合ドメインが、リンパ腫細胞の表面上のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２に特異的に結合する、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
62. ＶＨＨ抗体を含む、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
63. 追加の生化学的活性または生物学的機能を提供する１つ以上のドメインをさらに含む、請求項５１～６２のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
64. 前記追加の生化学的活性または生物学的機能が、蛍光色素の特異的結合、ｉｎ ｖｉｖｏでの前記二重特異性ポリペプチドの半減期の延長、前記二重特異性ポリペプチドの親和性の増加、およびＦｃドメインによって媒介される免疫応答の調節を含む、請求項６３に記載の二重特異性ポリペプチド。
65. 同じまたは異なる細胞の異なる細胞表面受容体（複数可）に結合する一本鎖ポリペプチドドメイン（複数可）を含む、追加の細胞表面タンパク質結合ドメイン（複数可）を含む、請求項５１～６２のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド。
66. 標的細胞の近位で１つ以上のポリペプチドエフェクター分子をｉｎ ｓｉｔｕで産生するためのキットであって、
    （ａ）請求項８～３１のいずれか一項に記載の免疫細胞；および
    （ｂ）請求項５１～６５のいずれか一項に記載の二重特異性ポリペプチド
    を含む、キット。
67. 前記細胞表面タンパク質結合ドメインが、Ｂ細胞上のＣＤ１９に特異的に結合する、請求項６６に記載のキット。
68. 前記細胞表面タンパク質結合ドメインが、腫瘍細胞上のＥＧＦＲ、メソセリン、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１またはＧＰＣ３に特異的に結合する、請求項６６または６７に記載のキット。
69. 対象における腫瘍細胞の局所における免疫系環境を調節するための方法であって、
    （ａ）請求項９～３１のいずれか一項に記載の免疫細胞の有効量および請求項５１～６５のいずれか一項に記載の第１の二重特異性ポリペプチドの有効量を、対象に同時にまたは逐次的に投与するステップであって、前記二重特異性ポリペプチドが、リンパ球の細胞表面タンパク質に特異的に結合する細胞表面タンパク質結合ドメインを含むステップ、および
    （ｂ）請求項５１～６５のいずれか一項に記載の第２の二重特異性ポリペプチドの有効量を対象に投与するステップであって、前記二重特異性ポリペプチドが、前記腫瘍細胞の細胞表面タンパク質に特異的に結合する細胞表面タンパク質結合ドメインを含むステップ
    を含む、方法。
70. ステップａとｂとの間に実施される、前記対象における前記免疫細胞の量を測定するステップをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
71. 前記対象の血液中の前記免疫細胞の量が測定される、請求項７０に記載の方法。
72. 前記対象の前記腫瘍に浸潤する前記免疫細胞の量が測定される、請求項７０に記載の方法。
73. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、サイトカイン活性化キラー細胞、樹状細胞－サイトカイン活性化キラー細胞、γδ－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項６９～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 前記リンパ球の前記細胞表面タンパク質が、Ｂ細胞のＣＤ１９である、請求項６９～７３のいずれか一項に記載の方法。
75. 前記腫瘍細胞が、リンパ腫細胞、中皮腫細胞、非小細胞肺がん細胞、卵巣細胞、肝がん、または乳がん細胞である、請求項６９～７４のいずれか一項に記載の方法。
76. 前記細胞表面タンパク質が、ＥＧＦＲ、メソセリン、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１またはＧＰＣ３である、請求項７５に記載の方法。
77. 対象における腫瘍細胞の局所における免疫系環境を調節するための方法であって
    （ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記対象の形質転換された免疫細胞を増殖させて、増殖したＴ細胞を得るステップであって、前記免疫細胞が、
    （ｉ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
    （ｉｉ）免疫細胞活性化因子ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
    を含む核酸ベクターを含む、第１の核酸ベクターを含み、
    （ｉｖ）免疫細胞での転写に有効なプロモーター領域；
    （ｖ）１つ以上の分泌されたポリペプチドエフェクター分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；および
    （ｖｉ）免疫細胞での転写を終結させるのに有効なターミネーター領域；
    を含む第２の核酸ベクターをさらに含むステップ；
    ならびに前記増殖したＴ細胞を前記対象に投与するステップ；
    ならびに
    （ｂ）前記増殖した免疫細胞を活性化して、前記増殖した免疫細胞によって発現する、前記標識ドメインに特異的に結合する決定されたアミノ酸配列の標識結合ドメイン、および前記腫瘍細胞の細胞表面受容体に特異的に結合する細胞表面タンパク質結合ドメインを含む、二重特異性ポリペプチドの前記免疫調節ポリペプチドを発現するのに有効な量を前記対象に投与するステップ
    を含む、方法。
78. 前記腫瘍細胞が、メソセリンおよびＰＤＬ１を過剰発現する中皮腫細胞であり、前記細胞表面タンパク質が、中皮腫細胞の表面で発現するメソセリンであり、前記エフェクター分子が、ＰＤ－１またはＣＤ４０に特異的に結合するＶＨＨドメインを含む、請求項７７に記載の方法。
79. 前記腫瘍細胞が、Ｂ細胞であり、前記細胞表面タンパク質が、Ｂ細胞の表面上のＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２である、請求項７７または７８に記載の方法。
80. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、サイトカイン活性化キラー細胞、樹状細胞－サイトカイン活性化キラー細胞、γδ－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項７７～７９のいずれか一項に記載の方法。
    
    

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