JP2022511885A - ヒト抗ａｎｔｘｒキメラ抗原受容体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＡＮＴＸＲ（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に標的化するリガンドを含むキメラ抗原受容体に関し、特に、ＡＮＴＸＲ１（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）又はＡＮＴＸＲ２（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）に特異的に結合するＰＡ６３リガンドを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクター、前記ベクターを含む組換え細胞、前記組換え細胞を含む固形癌予防又は治療用医薬組成物及び治療方法に関する。本発明に係る抗ＡＮＴＸＲキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いて固形癌を治療でき、抗癌薬物を投与することが有効でない固形癌患者、特に膵癌患者に対してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を投与することによって、薬物投与を制限し、効率的で安全なカスタマイズの固形癌予防又は治療が可能である。
Description
本発明は、ＡＮＴＸＲ（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を特異的に標的化するリガンドを含むキメラ抗原受容体に関し、より詳しくは、ＡＮＴＸＲ１（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）又はＡＮＴＸＲ２（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）に特異的に結合するＰＡ６３リガンドを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクター、前記ベクターを含む組換え細胞、前記組換え細胞を含む固形癌予防又は治療用医薬組成物及び治療方法に関する。
炭疽菌毒素受容体（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、ＡＮＴＸＲ１（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）とＡＮＴＸＲ２（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）を含み、そのリガンドとしては、炭疽菌が分泌する毒素である炭疽菌毒素（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ）が知られている。炭疽菌毒素は、グラム陽性菌であるバシラスアンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）によって分泌され、３つの毒素タンパク質、即ち、防御抗原（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＡ），８３ｋＤａ）、致死要素（ｌｅｔｈａｌ ｆａｃｔｏｒ（ＬＦ），９０ｋＤａ）、浮腫要素（ｅｄｅｍａ ｆａｃｔｏｒ（ＥＦ），８９ｋＤａ）で構成されている（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｎ．（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４５：１６２１－１６２６）。このうち、ＰＡが細胞表面の炭疽菌毒素受容体（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＮＴＸＲ）と結合すれば、フーリン（ｆｕｒｉｎ）系列のタンパク質加水分解酵素によってアミノ末端２０ｋＤａ（ＰＡ２０）が切断された６３ｋＤａ（ＰＡ６３）はヘプタマー（ｈｅｐｔａｍｅｒ）をなし、その後、ＬＦが結合する（Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｒ．Ｊ（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９：４５－７０）。
ＡＮＴＸＲ１は細胞外基質タンパク質であり、別称はＴＥＭ８（ｔｕｍｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍａｒｋｅｒ ８）である。ＡＮＴＸＲ１は、様々な腫瘍の内皮で発現するＩ型膜貫通タンパク質（ｔｙｐｅ Ｉ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、腫瘍の血管新生過程（ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）中に発現が増加する遺伝子として既に明らかにされており（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２８９：１１９７）、腫瘍の血管内皮細胞における細胞外基質タンパク質を媒介にした細胞の付着又は移動などにも関与するものと知られている（Ｂｒａｄｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４：２２８－２２９；Ｎａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ １６：４４－４９）。ＡＮＴＸＲ１は、細胞外リガンド（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｇａｎｄ）に対する受容体として作用することから、血管新生過程の治療のためのターゲットとされているが（Ｃａｒｓｏｎ－Ｗａｌｔｅｒ，Ｅ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：６６４９）、膵癌組織における報告は現在のところない。ＡＮＴＸＲ２の別称はＣＭＧ２（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ２）であり、ＡＮＴＸＲ２も血管新生に関与することが知られている。また、ＡＮＴＸＲ２は、上皮細胞と内皮細胞を含む種々の細胞の付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）及び移動（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）にも関与することが知られている（Ｌｉｎ Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ ４５：１５６５－１５７３）。
癌の検出、予防及び治療において進歩があったが、普遍的な治療戦略の成功は未だ実現されていない。癌治療の様々な形態の反応は混合されているが、化学療法及び放射線療法を含む癌を治療する従来の方法は、毒性副作用によって有用性が制限されている。治療用抗体を用いた免疫療法は、不良な薬物動態プロファイル、血清プロテアーゼによる抗体の迅速な除去及び糸球体における濾過及び腫瘍部位内への制限された透過及び腫瘍細胞に対する標的抗原の発現レベルに部分的に起因して制限された成功を提供する。
最近では、癌に対する新しい量子免疫遺伝子治療として、遺伝子変形細胞療法が注目されている。この治療法は、癌細胞の表面抗原への特異性と細胞の活性化能を有するキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）をコードする核酸をＴ細胞又はＮＫ細胞に導入し、得られた遺伝子導入細胞を体外で増殖させて提供する方法である。この方法は、抗体医薬に比べて抗癌効果がより強力であり、効果もより長期間持続すると考えられており、その臨床効果が大きく期待されている。
そこで、本発明者らは、新規な固形癌治療用キメラ抗原受容体を開発しようと努力した結果、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２は正常組織では殆ど発現しなく、膵癌組織でのみ特異的に発現するということを見出し、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２を特異的に標的化するＰＡ６３リガンドを確認し、本発明を完成するに至った。
本背景技術の部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に既に知られた先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
本発明の目的は、細胞外結合ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）をコードする核酸であって、前記細胞外結合ドメインはＡＮＴＸＲ（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を認識することを特徴とする核酸を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクター、該ベクターを含む組換え細胞、該組換え細胞を含む固形癌予防又は治療用医薬組成物及び治療方法を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸であって、前記細胞外結合ドメインはＡＮＴＸＲを認識することを特徴とする、キメラ抗原受容体をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターを提供する。
本発明はまた、前記ベクターを含む組換え細胞を提供する。
本発明はまた、前記組換え細胞を含む固形癌予防又は治療用医薬組成物を提供する。
本発明はまた、前記組換え細胞を個体に投与する段階を含む固形癌予防又は治療方法を提供する。
本発明はまた、固形癌の予防又は治療のための前記組換え細胞の用途を提供する。
本発明はまた、固形癌の予防又は治療用薬剤の製造のための前記組換え細胞の使用を提供する。
別に断りのない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、一般に用いられるものである。
本発明者らは、新規な固形癌治療用キメラ抗原受容体を開発しようと努力した結果、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２は正常組織では殆ど発現せず、膵癌組織でのみ特異的に発現するということを確認した。本発明の一実施例によれば、膵癌患者から分離した癌組織とＩＰＭＮ組織、正常膵臓組織における遺伝子変化をマイクロアレイ方法を用いて分析し、膵癌組織で発現が増加した６種の遺伝子を選別した（表１）。前記１次選別された６種の遺伝子の中で、ｍＲＮＡ発現量が‘正常組織（Ｎｏｒｍａｌ）＜ＩＰＭＮ組織＜膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＰＤＡＣ）組織’であるとともに、発現タンパク質が細胞表面に存在し、正常組織で発現が殆ど見られない、という条件を全て満たす遺伝子は、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２だけであることを確認した。また、本発明は、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２を特異的に標的化するＰＡ６３リガンドを確認し、ＰＡ６３リガンドの受容体結合に必須なドメイン４又はドメイン４を含む断片を細胞外結合ドメインとして含む他、ＣＤ８αから由来した膜貫通ドメインとヒンジ領域、ＣＤ３ζ鎖の１次シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインとしてのＣＤ２８及びＣＤ１３７を含むように設計されたＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２に特異的なＣＡＲを開発した。
したがって、本発明は、一観点において、細胞外結合ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）をコードする核酸であって、前記細胞外結合ドメインはＡＮＴＸＲ（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を認識することを特徴とする、キメラ抗原受容体をコードする核酸に関する。
本発明の用語“キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）”とは、免疫エフェクター細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）において細胞に標的細胞及び細胞内信号生成を提供する組換えポリペプチド構築物を意味する。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体ベースの特異性を、特定抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するためにＴ細胞受容体－活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子である。本発明の用語“キメラ”とは、異なるタンパク質の一部又は異なる起源のＤＮＡで構成されるものを意味する。ＣＡＲは、少なくとも細胞外結合ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）、細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含む。
本発明の用語“細胞外結合ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）”とは、目的する標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲの部分を意味する。細胞外結合ドメインは、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体又は腫瘍タンパク質、脂質、多糖類、又はその他細胞表面標的分子、又はその成分）を特異的に認識し、それに結合する能力を保有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドを含むことができる。結合ドメインは、目的する生物学的分子のための任意の天然発生、合成、半合成又は組換えによって生成された結合パートナーを含む。
本発明の用語“特異的に結合する”とは、背景結合よりも大きい結合親和性で他の分子に対する分子の結合を意味する。例えば、細胞外結合ドメインは、約１０５Ｍ－１以上の親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定結合相互作用の平衡解離定数）で標的分子に結合するか、これと連合する場合、標的分子に対して特異的に結合する。又は、親和性は、Ｍの単位を有する特定結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ又はその以下）と定義できる。
本発明に係る細胞外結合ドメイン及びＣＡＲの親和性は、通常の技術、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素－結合した免疫吸着検定）又は標識されたリガンドを使用するか、バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）Ｔ１００（これは、ニュージャージー州ピスカタウェイバイアコアインコーポレイテッドから入手可能）などの表面プラスモン共鳴装置又はそれぞれコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）及びパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）から入手可能なＥＰＩＣシステム又はＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術を用いる結合会合又は置換分析によって容易に測定することができる。
本発明において、細胞外結合ドメインは、ＡＮＴＸＲを認識することを特徴とし得る。前記ＡＮＴＸＲを認識する細胞外結合ドメインは、ＡＮＴＸＲに特異的に結合する抗体、アプタマー又はリガンドであることを特徴とし得るが、それらに制限されない。
本発明において、前記リガンドは、ＰＡ６３リガンド又はその断片であることを特徴とし得る。
前記ＰＡ６３リガンドは、配列番号１のアミノ酸配列で表されることを特徴とし得る。
また、前記断片は、ＰＡ６３リガンドのドメイン４又はドメイン４を含む断片であることを特徴とし得る。
前記ＰＡ６３リガンドのドメイン４断片は、配列番号２のアミノ酸配列で表されることを特徴とし得る。
本発明では、Ｄ１はＰＡ６３リガンドのドメイン１；Ｄ２はＰＡ６３リガンドのドメイン２；Ｄ３はＰＡ６３リガンドのドメイン３；Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン４を意味する。Ｄ１＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン１及びドメイン４の結合；Ｄ２＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン２及びドメイン４の結合；Ｄ３＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン３及びドメイン４の結合；Ｄ４＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン４及びドメイン４の結合；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン１、ドメイン２及びドメイン４の結合；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン２、ドメイン３及びドメイン４の結合；Ｄ１＋Ｄ３＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン１、ドメイン３及びドメイン４の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４及びドメイン１の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４及びドメイン２の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４及びドメイン３の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ２はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４、ドメイン１及びドメイン２の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ３はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４、ドメイン１及びドメイン３の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２＋Ｄ３はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４、ドメイン２及びドメイン３の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４及びドメイン４の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４、ドメイン４及びドメイン１の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４、ドメイン４及びドメイン２の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４、ドメイン４及びドメイン３の結合；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４はＰＡ６３リガンドのドメイン４、ドメイン４、ドメイン４及びドメイン４の結合；とそれぞれ定義する。
前記ＰＡ６３リガンドのドメイン４を含む断片は、Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３及びＤ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
前記ＰＡ６３リガンドのドメイン４を含む断片は、配列番号２～配列番号９のアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
本発明の一実施例において、ＰＡ６３リガンドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞の効果と比較して、Ｄ４が導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞又はＤ４＋Ｄ４が導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性効果がより優れていることを確認した。
本発明の用語“ＰＡ６３”とは、炭疽菌毒素（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ）タンパク質の一つである防御抗原（ＰＡ（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ），８３ｋＤａ）の切断された６３ｋＤａの部分を意味する。炭疽菌毒素は、グラム陽性菌であるバシラスアンスラシスによって分泌される。
一般に、炭疽菌の病原性は、毒素生成能力と莢膜形成によって決定されると知られている。このうち、炭疽の毒素生成能力に影響を与えるタンパク質は、防御抗原（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＰＡ）、浮腫要素（ｅｄｅｍａ ｆａｃｔｏｒ，ＥＦ）及び致死要素（ｌｅｔｈａｌ ｆａｃｔｏｒ，ＬＦ）である。それらは個別に毒性を示すことはできないが、防御抗原及び浮腫要素が結合して浮腫毒素（ＥｄＴｘ，ｅｄｅｍａ ｔｏｘｉｎ）を形成し、防御抗原及び致死要素が結合して致死毒素（ＬｅＴｘ，ｅｔｈａｌ ｔｏｘｉｎ）を形成する。
ＰＡは、大食細胞のような感染細胞株表面の受容体タンパク質（Ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合した後、タンパク質分解酵素（ｆｕｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅａｓｅ）によってＰＡ２０（２０ｋＤａ）とＰＡ６３（６３ｋＤａ）とに切られるが、このうちＰＡ６３がヘプタマー化しながらＬＦ或いはＥＦと結合してそれを細胞内に運搬させる毒素タンパク質運搬体（Ｔｏｘｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｃｈａｎｎｅｌ）として役割を担うことが知られている。
それらの複合体は、エンドサイトーシス機序で細胞内に入り、エンドソームのｐＨが低くなればＰＡ６３ヘプタマーに構造的変化が生じながらエンドソームメンブレインに気孔を形成し、結果的に、ＬＦ或いはＥＦは細胞質に遊離して毒性効果を示すことになる（Ｊｉａｎｇ Ｊ．Ａｔｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｔｈｒａｘ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｏｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｅｓ ｔｏｘｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５）。
本発明の実施例では、Ｄ４をコードする核酸が導入されたＣＡＲとＤ４＋Ｄ４をコードする核酸が導入されたＣＡＲを構築し、それらをＴ細胞に導入したＣＡＲ－Ｔ細胞の膵癌治療効能を確認した。ＰＡ６３リガンドをコードする核酸が導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、Ｄ４又はＤ４＋Ｄ４をコードする核酸が導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の膵癌治療効能が優れていることが確認できた。
したがって、Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３又はＤ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４をコードする核酸を導入してＣＡＲを構築する場合にも同一或いは類似の効果を示し得ることは、通常の技術者にとって明らかであろう。
本発明において、前記ＡＮＴＸＲは、ＡＲＴＸＲ１（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）又はＡＲＴＸＲ２（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）であることを特徴とし得る。
本発明の用語“ＡＮＴＸＲ１（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）”とは、細胞外基質タンパク質のことを意味し、別称はＴＥＭ８（Ｔｕｍｏｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍａｒｋｅｒ８）である。その具体的な核酸配列は、ＮＣＢＩに公知されている（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０３２２０８．２）。
本発明の用語“ＡＮＴＸＲ２（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）”とは、、血管新生に関与するタンパク質を意味し、別称はＣＭＧ２（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ２）である。その具体的な核酸配列はＮＣＢＩに公知されている（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０５８１７２．５）。
また、本発明において、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２とＰＡ６３リガンドとの親和度は、Ｋｄ１７０～７８０Ｐｍであり、既存に開発されたＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤であるＲＯＲ１、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに使用されている抗体の親和度（Ｋｄ値は１ｎＭ）に比べて格段に高い敏感度を示している（Ｋａｒｌ Ａ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ５２２１：１；Ｈｅａｔｈｅｒ Ｍ．Ｓ．（２００５）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：１０６－１１２）。
本発明の用語“膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）”とは、細胞外結合部分及び細胞内シグナル伝達ドメインを融合させ、免疫作動細胞の原形質膜にＣＡＲを固定させるＣＡＲの一部である。膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成又は組換え供給源から由来し得る。本発明において、前記膜貫通ドメインは、Ｔ－細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選ばれることを特徴とし得るが、それらに制限されない。
また、膜貫通ドメインは、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介してＣＡＲの細胞外結合ドメインに付着可能である。例えば、リンカーは、２～１０個アミノ酸長の短いオリゴ－又はポリペプチドリンカーでよく、、好ましくは、グリシン（Ｇ）－セリン（Ｓ）二重体（ｄｏｕｂｌｅｔ）であるが、それに制限されない。本発明において、ＣＡＲは、配列番号１０のアミノ酸配列で表されるＧ４Ｓ１（ＧＧＧＧＳ）をリンカーとして含むことを特徴とし得る。
ＣＡＲの結合ドメインは、一般に、一つ以上の“ヒンジドメイン（ｈｉｎｇｅ ｄｏｍａｉｎ）”が後続する。本発明の用語“ヒンジドメイン”とは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を可能にするように作動細胞表面から離れて抗原結合ドメインの位置決定に重要な役割を担当するＣＡＲの一部である。ＣＡＲは、一般に、細胞外結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に一つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成又は組換え供給源から由来し得る。ヒンジドメインは、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域又は変化された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。“変化されたヒンジ領域”は、（ａ）最大で３０％のアミノ酸変化（例えば、最大で２５％、２０％、１５％、１０％又は５％のアミノ酸置換又は欠失）を有する天然発生ヒンジ領域、（ｂ）最大で３０％アミノ酸変化（例えば、最大で２５％、２０％、１５％、１０％又は５％のアミノ酸置換又は欠失）を有する少なくとも１０個アミノ酸（例えば、少なくとも１２、１３、１４又は１５個アミノ酸）長の天然発生ヒンジ領域の一部、又は（ｃ）コアヒンジ領域（これは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５、又は少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個アミノ酸長でよい。）を含む天然発生ヒンジ領域の一部のことを指す。特定の実施形態において、天然発生免疫グロブリンヒンジ領域において一つ以上のシステイン残基は、一つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、一つ以上のセリン残基）に置換されてよい。変化された免疫グロブリンヒンジ領域は代案として又は追加としてさらに他のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）に置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有することができる。ヒンジドメインはＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの類型１膜タンパク質の細胞外領域から由来するヒンジ領域を含み、これは、それらの分子からの野生型ヒンジ領域であってもよく、変化されてもよい。
本発明において、リンカーで連結される膜貫通ドメインは、ＣＤ８αから由来した配列番号１１の核酸配列によってコードされることを特徴とし得るが、それに制限されない。
本発明において、ヒンジドメインを含む膜貫通ドメインは、ＣＤ８αから由来した配列番号１５の核酸配列によってコードされることを特徴とし得るが、それに制限されない。
本発明の用語“細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）”とは、作動細胞機能、例えば、ＣＡＲ－結合した標的細胞に対する細胞毒性因子の放出を含む活性化、サイトカイン生成、増殖及び細胞毒性活性、又はＣＡＲの細胞外結合ドメインに対する抗原結合に起因したその他の細胞反応を誘発するために、免疫作動細胞の内部に標的抗原に対する効果的ＣＡＲ結合のメッセージの伝達に関与するＣＡＲの部分を意味する。作動機能とは、細胞の特殊な機能を意味し、例えば、Ｔ細胞の作動機能は、細胞溶解活性であるか、又はサイトカインの分泌を含む活性を支援できるものであるか或いは活性であってよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは、作動機能信号を伝達し、細胞が特殊な機能を行うように指示するタンパク質の一部を意味する。
Ｔ細胞受容体単独で生成された信号はＴ細胞を十分に活性化できないものと知らされており、共刺激信号がさらに要求されることが公知されている。したがって、Ｔ細胞活性化は、細胞内シグナル伝達ドメインの２個の異なる部類によって媒介される。例えば、Ｔ細胞受容体による抗原－依存性一次活性化を開始する１次シグナル伝達ドメイン及び２次信号を提供するために、抗原－独立的方式で作用する共刺激シグナル伝達ドメインによってＴ細胞活性化が媒介される。したがって、本発明において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、“１次シグナル伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）”及び“共刺激シグナル伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）”を含むことを特徴とし得る。
本発明の用語“１次シグナル伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）”とは、Ｔ細胞受容体複合体の１次活性化を刺激又は抑制方式で調節するシグナル伝達ドメインを意味する。刺激方式で作用する１次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又はＩＴＡＭと公知されているシグナル伝達モチーフを含有することができる。１次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選ばれるものでよいが、それらに制限されない。
本発明において、前記１次シグナル伝達ドメインは、配列番号１２又は配列番号１６の核酸配列によってコードされるＣＤ３ζであることを特徴とし得るが、それに制限されない。
本発明の用語“共刺激シグナル伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）”とは、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを意味する。共刺激分子は、抗原受容体又は抗原に結合時にＴリンパ球の効率的活性化及び機能に要求される２次信号を提供するＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。本発明において、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれることを特徴とし得るが、それらに制限されない。
本発明において、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号１３又は配列番号１７の核酸配列によってコードされるＣＤ２８及び配列番号１４又は配列番号１８の核酸配列によってコードされるＣＤ１３７であることを特徴とし得るが、それに制限されない。
本発明に係るＣＡＲ設計時にＰＡ６３リガンド又はその断片の前にシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする核酸を挿入することを特徴とし得る。前記シグナルペプチドとしてはＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ８αのシグナルペプチドなどが使用されるが、大部分のＣＡＲ設計にＧＭ－ＣＳＦを使用しており、本発明の実施例においても、ＧＭ－ＣＳＦをシグナルペプチドとして使用している。
本発明は、他の観点において、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターに関する。
本発明の用語“ベクター”とは、他の核酸分子を転移させたり又は輸送することができる核酸分子を意味し、転移された核酸は一般にベクター核酸分子に連結されるが、例えば、ベクター核酸分子内に挿入される。ベクターは、細胞における自律的複製を指示する配列を含むか、或いは、宿主細胞ＤＮＡ内への統合を可能にするのに十分な配列を含むことができる。前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選ばれることを特徴とし得るが、それらに制限されない。これに制限されないが、好ましくは、レトロウイルスベクターであるｐＭＳＣＶベクターであることを特徴とし得る。
本発明は、さらに他の観点において、前記ベクターを含む組換え細胞に関する。
本発明の用語“組換え細胞”とは、癌の治療などに使用するために、本発明のＣＡＲを発現させるように遺伝的に変形された細胞を意味する。“遺伝的に変形された”とは、細胞において全体遺伝子材料にＤＮＡ又はＲＮＡの形態で外部遺伝子材料を付加することを意味する。
本発明において、前記細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であることを特徴とし得る。したがって、本発明に係るＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを含む組換え細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）又はＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）であることを特徴とし得る。
本発明において、前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）；腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）及び末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から分離したＴ細胞からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
好ましくは、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞であり、本発明の実施例では、ＮＹＥＳＯ－１Ｔ細胞を用いているが、それに制限されない。
本発明は、さらに他の観点において、前記組換え細胞を含む固形癌予防又は治療用医薬組成物に関する。
本発明は、さらに他の観点において、前記組換え細胞を個体に投与する段階を含む固形癌予防又は治療方法に関する。
本発明はまた、固形癌の予防又は治療のための前記組換え細胞の用途に関する。
本発明はまた、固形癌の予防又は治療用薬剤の製造のための前記組換え細胞の使用に関する。
本発明の用語“予防”とは、本発明の組成物の投与で固形癌を抑制させたり或いは進行を遅延させる全ての行為を意味し、“治療”とは、固形癌の発展の抑制、症状の軽減又は除去を意味する。
本発明の一実施例では膵癌細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌細胞毒性を確認したが、それに制限されない。
前記ＰＡ６３の細胞毒性作用機序によって、本発明に係るＰＡ６３リガンドのドメイン４又はドメイン４を含む断片は、膵癌の他、ＡＮＴＸＲを発現させる癌細胞又は癌組織にも特異的に結合でき、本発明に係るＰＡ６３リガンドのドメイン４又はドメイン４を含む断片を含むＣＡＲ含有細胞は、ＡＮＴＸＲを発現させる癌に対して細胞毒性効果があることは、通常の技術者にとって明らかである。
本発明の一実施例では、ＰＡ６３リガンドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞の効果と比較して、ＰＡ６３リガンドのドメイン４断片を含むＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性効果がより優れていることを確認した。
本発明の用語“固形癌”とは、血管又は結合性組織でできて一定の硬度及び形態を持つ腫瘍のことを意味し、これらに制限されないが、例えば、膵癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌などがある。
本発明において、前記固形癌は、ＡＮＴＸＲ（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現させる膵癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌又は卵巣癌であるが、それらに制限されるものではなく、前記ＡＮＴＸＲは、ＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２を含む。
本発明の用語“膵癌”とは、膵臓に生じた癌細胞からなる腫瘍のことを意味する。一般に、膵癌の９０％程度を膵管細胞で発生した膵臓腺管癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）が占めている。膵臓腺管癌の８５％以上が、膵癌の発生で活性化したＫ－ｒａｓ遺伝子点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を持っている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｌａｎｃｅｔ ３６３：１０４９－１０５７；Ｘｉｏｎｇ（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ ５４：Ｓ６９－７７）。膵癌の早期治療のためには、膵臓の前癌病変と進行過程、癌の病期又はサイズによる予後を理解する必要があるが、膵臓の代表的な前癌病変としては、膵臓の上皮内腫瘍形成（ＰａｎＩＮ）、膵管内乳頭状粘液腫瘍（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｎｅｏｐｌａｓｍ，ＩＰＭＮ）、粘液嚢性腫瘍（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃｙｓｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｍ，ＭＣＮ）などが知られている（Ｈｒｕｂａｎ ＲＨ，（２００１）Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．２５：５７９－５８６；Ｏｔｔｅｎｈｏｆ ＮＡ，（２００９）Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ．１３３：３７５－３８１；Ｓｉｐｏｓ Ｂ，（２００９）Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ ９：４５－５４）。特に、ＩＰＭＮは、近年、様々な映像医学的診断解像度の発展及び健康検診の増加によって発見の頻度が増加している。これは、低等級の腫瘍が悪性に徐々に進行し得る膵癌の前駆病変であり、この病変から離れた部位で膵癌を同伴する頻度が高いことから、大いなる関心が集まっている。
本発明の固形癌の予防又は治療用組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含むことができる。
本発明において用語“薬学的に許容可能な担体”とは、生物体を刺激することなく投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤のことを指す。液状溶液として製剤化される組成物において薬学的に許容可能な担体としては、滅菌及び生体に適するものとして、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール及びそれらの成分のいずれか１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤として製剤化してもよい。
本発明の前記医薬組成物は、経口又は非経口の様々な剤形でよい。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、かかる固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤の他、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤なども含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基材としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
このような薬学的に許容可能な担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
本発明の組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。経口投与のとき、タンパク質又はペプチドは消化されてしまうため、経口用組成物は、活性薬剤をコートしたり或いは胃における分解から保護されるように剤形化でき、本発明の組成物は、活性物質の標的細胞への移動が可能な任意の装置によって投与することができる。
本発明の固形癌予防又は治療用組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、通常の熟練した医師にとっては、所望する治療又は予防に効果的な投与量が容易に決定及び処方可能である。
本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、或いは他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与できる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：固形癌に特異的な遺伝子確認
固形癌に特異的な遺伝子を確認するために、固形癌の中で膵癌に関連した組織を利用した。膵癌ｓｔａｇｅ１ ３人、ｓｔａｇｅ３ ８９人、ｓｔａｇｅ４ １２人の合計１０４人の膵癌患者から分離した膵癌組織を準備した。その後、癌組織、ＩＰＭＮ組織、そして正常膵臓組織における遺伝子変化をマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を用いて分析し、膵癌組織で発現の増加した６種の遺伝子を選抜した（表１）。
固形癌に特異的な遺伝子を確認するために、固形癌の中で膵癌に関連した組織を利用した。膵癌ｓｔａｇｅ１ ３人、ｓｔａｇｅ３ ８９人、ｓｔａｇｅ４ １２人の合計１０４人の膵癌患者から分離した膵癌組織を準備した。その後、癌組織、ＩＰＭＮ組織、そして正常膵臓組織における遺伝子変化をマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）を用いて分析し、膵癌組織で発現の増加した６種の遺伝子を選抜した（表１）。
１次選抜された６種の遺伝子から、下記のような３つの条件を全て満たす遺伝子をさらに選抜した。
１）ｍＲＮＡ発現量が‘正常組織（ｎｏｒｍａｌ）＜ＩＰＭＮ組織＜膵癌（ＰＤＡＣ）組織’である遺伝子
２）発現タンパク質が細胞表面に存在する遺伝子
３）正常組織から発現が殆ど見られない遺伝子
１）ｍＲＮＡ発現量が‘正常組織（ｎｏｒｍａｌ）＜ＩＰＭＮ組織＜膵癌（ＰＤＡＣ）組織’である遺伝子
２）発現タンパク質が細胞表面に存在する遺伝子
３）正常組織から発現が殆ど見られない遺伝子
図１は、１次選抜された６種の遺伝子の正常組織におけるタンパク質発現度を示すものである。ＡはＡＮＴＸＲ１（Ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＢはＡＮＴＸＲ２（Ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＣはＴＭＣ５（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈａｎｎｅｌ－ｌｉｋｅ ５）、ＤはＣＬＤＮ１８（Ｃｌａｕｄｉｎ １８）、ＥはＭＵＣ１３（Ｍｕｃｉｎ １３）、ＦはＭＭＰ１４（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １４）の発現量を示す。
１次選抜された６種の遺伝子はいずれも細胞表面に発現して上の条件１）及び２）を満たすが、図１から確認できるように、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２以外の４種の遺伝子は正常組織で発現するため、上の３つの条件を全て満たす遺伝子は、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２だけであった（図１）。
ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２の実際発現をさらに確認するために、血液内免疫細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ，ＰＢＭＣ）、プライマリー膵癌組織、膵癌細胞株を用いてＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）を行った。ＰＢＭＣは陰性対照群、ＰＡＮＣ－１は陽性対照群として用いられた。具体的に、全ＲＮＡは、トリゾール／クロロホルム（Ｔｒｉｚｏｌ／Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を用いて抽出した。ｍＲＮＡの増幅後、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｉｐｔａｓｅ）を用いてｃＤＮＡを製造した。表２のプライマーを入れて実時間ＲＴ－ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）を用いてＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２のｍＲＮＡの発現量を確認した。ｉＴａｑ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を用いて、ＳｔｅｐＯＮＥ ｐｌｕｓ実時間ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ｃＤＮＡの濃度は０．５μｇ／μｌ、各プライマーは１０ｐＭを使用した。変性（Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）は９５℃で１５分、アニーリング／伸長（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ／Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）は各６０℃で６０秒、４０サイクルを行った。
その結果、プライマリー膵癌組織ではＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２ ｍＲＮＡの発現が非常に増加したことが確認された（図２）。また、正常細胞であるＨＵＶＥＣ細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞、膵癌細胞株（ＡｓＰＣ１、Ｃａｐａｎ２、ＰＡＮＣ１、Ｍｉａ－ＰａＣａ２、ＳＮＵ－２１３、ＳＮＵ－３２４、ＳＮＵ－２４６６、ＳＮＵ－２４６９、ＳＮＵ－２４８５、ＳＮＵ－２５４３）を分析した結果、膵癌細胞株では、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２ ｍＲＮＡ発現が増加しており、特に、ＳＮＵ－２４６６、ＳＮＵ－２４６９ではＡＮＴＸＲ１ｍＲＮＡ発現が有意に増加していることを、ＡｓＰＣ１では、ＡＮＴＸＲ２ ｍＲＮＡ発現が有意に増加していることを確認した（図３）。
また、フローサイトメトリーを用いて正常細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、膵癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＰＡＮＣ１、ＳＮＵ－２１３、ＳＮＵ－２４６６）の細胞表面におけるＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２タンパク質発現度を分析した結果、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２タンパク質発現が増加していることを確認した（図４）。
また、正常細胞であるＨＵＶＥＣ細胞、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２ ｍＲＮＡ発現が非常に増加していることが確認された膵癌細胞株（ＡｓＰＣ１、Ｃａｐａｎ２、ＰＡＮＣ１、Ｍｉａ－ＰａＣａ２、ＳＮＵ－２１３、ＳＮＵ－３２４、ＳＮＵ－２４６６、ＳＮＵ－２４６９、ＳＮＵ－２４８５、ＳＮＵ－２５４３）に、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２のリガンドであるＰＡ６３に蛍光を示すＦＩＴＣが結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）している試薬を処理した後、フローサイトメトリーを用いて細胞表面タンパク質であるＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２の発現量を間接に再確認し、またＰＡ６３とＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２との結合を確認した（図５）。
実施例２：ＡＮＴＸＲ特異的ＣＡＲ設計及び作製
ＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２に特異的なＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、ＣＤ８αから由来した膜貫通ドメイン、Ｇ４Ｓ１（ＧＧＧＧＳ）リンカー又はヒンジ領域、ＣＤ３ζ鎖の１次シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８及びＣＤ１３７を共刺激シグナル伝達ドメインとして含むように設計された。
ＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２に特異的なＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、ＣＤ８αから由来した膜貫通ドメイン、Ｇ４Ｓ１（ＧＧＧＧＳ）リンカー又はヒンジ領域、ＣＤ３ζ鎖の１次シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８及びＣＤ１３７を共刺激シグナル伝達ドメインとして含むように設計された。
細胞外結合ドメインとしてはＰＡ６３リガンドが導入されたＣＡＲを設計し、図６Ａに示すベクターを作製した。
また、細胞外結合ドメインとしてＰＡ６３リガンドの受容体結合に必須なＤ４を含むように、Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４又はＤ１＋Ｄ３＋Ｄ４がそれぞれ導入されたＣＡＲを設計し、図６Ｂに示すベクターのＰＡ６３座に導入してベクターを作製した。また、さらに、Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４又はＤ１＋Ｄ３＋Ｄ４の前にシグナルペプチドをコードする核酸を含むように設計した。
前記シグナルペプチドは短いアミノ酸配列であり、合成されたタンパク質をＥＲに運搬する重要な役割を担当する。タンパク質がＥＲに到着すればシグナルペプチドは除去され、タンパク質は運搬体を通じてゴルジ（Ｇｏｌｇｉ ｃｏｍｐｌｅｘ）に運搬される。その後、細胞内小器官ではなく細胞膜に発現すべきタンパク質は、目的地に運搬される必要がある。本実施例では、合成されたタンパク質を目的地に運搬をするためのシグナルペプチドとしてＧＭ－ＣＳＦを使用した。
図６Ｂのベクターには、ＣＡＲの発現有無を確認するために、ｃｏｐＧＦＰをコードする核酸を導入したが、ＣＡＲを実際の治療剤として使用するためには省略されてよい。
表３は、ＰＡ６３リガンドを含むＣＡＲ製造に必要な配列を示し、表４は、ＰＡ６３リガンドの断片を含むＣＡＲ製造に必要な配列を示している。
ＰＡ６３リガンドのドメイン１～ドメイン４をコードする核酸は、下記表５に示している。
ＣＡＲのシグナルペプチド、細胞外結合ドメイン（Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４又はＤ１＋Ｄ３＋Ｄ４）、膜貫通ドメイン（ＣＤ８ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ＆ ｈｉｎｇｅ）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ３、ＣＤ１３４、ＣＤ２８）をＰＣＲを用いて増幅し、ＤＮＡリガーゼを用いてＴＡクローニングベクターに挿入した。
ＴＡクローニングベクターを結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）し、融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させ得るようにウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＭＳＣＶ、ｐＣＤＨ５２１ａ）に挿入した。ＣＡＲ導入用レンチウイルスベクターを用いてウイルスを作製し、パッケージング細胞である２９３ＦＴ細胞（５×１０６）に約９０％以上の効率でレンチウイルスベクターを誘導した。レンチウイルスベクター誘導４日目にレンチウイルスが作製され、浮遊している細胞培地（ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ）を回収し、これを超遠心分離機を用いて２０，０００ｒｐｍで２時間濃縮し、濃縮されたレンチウイルスを２９３ＦＴ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）し、これをフローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて濃度を計算した結果、３．４×１０９ＩＵ／ｍｌという高い収率でＣＡＲ遺伝子が導入されたレンチウイルスが得られた。
実施例３：ＣＡＲ－Ｔ細胞の培養
実施例２で作製されたＰＡ６３リガンド；Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４又はＤ１＋Ｄ３＋Ｄ４が導入されたＣＡＲ含有遺伝子が導入されたレンチウイルスを１００ＭＯＩの濃度でＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）から分離した細胞傷害性Ｔ細胞クローン（Ｃｙｔｏｔｏｃｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｅ）にそれぞれ形質導入させ、それぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。
実施例２で作製されたＰＡ６３リガンド；Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４又はＤ１＋Ｄ３＋Ｄ４が導入されたＣＡＲ含有遺伝子が導入されたレンチウイルスを１００ＭＯＩの濃度でＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）から分離した細胞傷害性Ｔ細胞クローン（Ｃｙｔｏｔｏｃｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｅ）にそれぞれ形質導入させ、それぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。
フローサイトメトリーを用いて約４７．９％の効率で発現を誘導したことを確認し、Ａｒｉａソーター（Ａｒｉａ ｓｏｒｔｅｒ）を用いてＣＡＲ発現が誘導された細胞だけを選別した。これを体外で増幅させるＲＥＰ（Ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を行ってＣＡＲ細胞の数を増幅させ、ＲＥＰ １０日目には約９８％の分布で純粋なＣＡＲ－Ｔの増殖がなされたことを確認した（図７）。
本実施例で用いられたＣＴＬは、ＮＹＥＳＯ－１ ＣＴＬ（ＭＤ ａｎｄｅｒｓｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｎｔｅｒ（ＵＳＡ））である。図８は、既存ＮＹＥＳＯ－１抗原を認識して活性を示し得るＮＹＥＳＯ－１ ＣＴＬ、及びこれにＣＡＲを導入してＮＹＥＳＯ－１とＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２を同時にターゲット可能なＣＡＲ－Ｔ細胞を示す図であり、ＮＹＥＳＯ－１ ＣＴＬがターゲッティングする同図左側の癌細胞の種類には、悪性黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）と滑膜肉腫（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｃｅｌｌ ｓａｒｃｏｍａ）などがある。ＮＹＥＳＯ－１ ＣＴＬは、腫瘍進行を抑制したり、或いは腫瘍減少を誘導することができる。
その他にも、ＴＩＬ（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、ＰＢＭＣ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）から分離したＴ細胞を用いてＣＡＲを誘導した後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製することができる。
実施例４：ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌細胞毒性確認
実施例４－１：膵癌細胞株に対する細胞毒性確認
実施例３で作製されたＤ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞の膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１、ＡｓＰＣ１）に対する抗癌細胞毒性を確認するために、それらを膵癌細胞株にそれぞれ処理した。
実施例４－１：膵癌細胞株に対する細胞毒性確認
実施例３で作製されたＤ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞の膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１、ＡｓＰＣ１）に対する抗癌細胞毒性を確認するために、それらを膵癌細胞株にそれぞれ処理した。
膵癌細胞株を９６ウェルプレート（丸底）に１×１０５個の細胞で分注した後、ＣＡＲが導入されていない細胞、Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ、及びＤ４＋Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔをそれぞれ１×１０５個の細胞に６時間培養し、サイトカインの放出を抑制するためのゴルジストップ（Ｇｏｌｇｉ ｓｔｏｐ）を処理した。６時間後、細胞内を染色するために固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）及び透過化（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ）後に、ＣＤ１０７ａとＩＦＮガンマ抗体を用いて細胞を染色した。その後、フローサイトメトリーを用いて、顆粒放出（ｇｒａｎｕｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ）が間接に確認可能なＣＤ１０７ａ、及びＣＡＲ－Ｔ細胞活性が確認可能なＩＦＮガンマを確認した。
その結果、ＣＡＲが導入されていないＴ細胞の場合、膵癌細胞株に対する抗癌細胞毒性及び活性を示さなかったが、ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合には、膵癌細胞株に対する抗癌細胞毒性及び活性を示すことを確認した（図９）。図９で、Ｔ細胞のみ（Ｔ ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ）（陰性対照群）は、ＣＡＲが導入されていないＴ細胞であり、ＰＭＡ／ＩＯＮＯ（陽性対照群）は、ＰＭＡ／イオノアイシンを処理したものである。ＰＭＡ／イオノアイシンは細胞外イオン（Ｃａ２＋など）を細胞内に流入させる役割を担う化合物であって、Ｔ細胞に処理時に細胞の過活性を誘導することができる。このため、Ｔ細胞の活性程度を確認できる指標として使用することができる。
したがって、膵癌治療に対するＰＡ６３リガンドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞の治療剤としての有効性が確認できた。
実施例４－２：黒色腫細胞株及び膵癌細胞株に対する抗癌細胞毒性
実施例３で作製されたＤ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞とＤ４＋Ｄ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞の抗癌細胞毒性を確認するために、それらをそれぞれ膵癌細胞株及び黒色腫細胞株に処理した。
実施例３で作製されたＤ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞とＤ４＋Ｄ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞の抗癌細胞毒性を確認するために、それらをそれぞれ膵癌細胞株及び黒色腫細胞株に処理した。
膵癌細胞株と黒色腫細胞株をそれぞれ９６ウェルプレート（丸底）に１×１０５個の細胞で分注した後、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）（ＣＡＲが導入されていないＴ細胞）、空のベクター対照群（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｄ４又はＤ４＋Ｄ４を含まないベクターを発現させたＴ細胞）、Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ、及びＤ４＋Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔをそれぞれ、１×１０５個の細胞に６時間培養し、またサイトカインの放出を抑制するためのゴルジストップを処理した。６時間後、細胞内を染色するために固定及び透過化後に、ＣＤ１０７ａとＩＦＮガンマ抗体を用いて細胞を染色した。その後、フローサイトメトリーを用いて、顆粒放出が間接に確認可能なＣＤ１０７ａ、及びＣＡＲ－Ｔ細胞活性が確認可能なＩＦＮガンマを確認した。ＣＡＲが導入されていないＮＹＥＳＯ－１ ＣＴＬは対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。
ＮＹＥＳＯ－１ ＣＴＬは、黒色腫細胞株（５２６－ｍｅｌ）を標的（ｔａｒｇｅｔ）とするので、本発明のＣＡＲ導入の有無に関係なく、すなわち、黒色腫細胞株に対する抗癌細胞毒性及び活性を示した（図１０）。
膵癌細胞株（ＡｓＰＣ１、ＰＡＮＣ－１、Ｍｉａ－ＰａＣａ２）に対する抗癌細胞毒性を確認した結果、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）と空のベクター対照群（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ）のＴ細胞は、膵癌細胞株に対する抗癌細胞毒性及び活性を示さなかったが、Ｄ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞とＤ４＋Ｄ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞は、膵癌細胞株に対する抗癌細胞毒性及び活性を示した（図１０）。
また、実施例２で作製されたＤ４；Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；又はＤ１＋Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４含有ＣＡＲが導入されたレンチウイルスを１００ＭＯＩの濃度でＮＹＥＳＯ－１Ｔ細胞クローンにそれぞれ形質導入させ、それぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。
膵癌細胞株であるＰＡＮＣ－１を、１．５ｍＬチューブに１×１０６個の細胞を遠心分離して集めた後、５０μＬのＦＢＳで解き、Ｃｒ５１ ５０μＬを混ぜて３７℃インキュベーターで１時間染色した。
その後、Ｃｒ５１染色されたＰＡＮＣ－１細胞株をそれぞれ９６ウェルプレート（丸底）に１×１０５個の細胞で分注した後、ベクター対照群（Ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ）（Ｄ４又は各ドメインを含まないベクターを発現させたＴ細胞）、Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔと、Ｄ１＋Ｄ４、Ｄ２＋Ｄ４、Ｄ３＋Ｄ４、Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔをそれぞれ、エフェクター（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）（ＣＡＲ－Ｔ）：ターゲット（Ｔａｒｇｅｔ）（ＰＡＮＣ－１）比＝５（５×１０５）：１、１０（１×１０６）：１、２０（２×１０６）：１、４０（４×１０６）：１個の細胞に４時間培養し、その後、各ウェルの培地を回収し、Ｃｒ５１の放出をγ－カウンターを用いて確認した。その結果、Ｄ１＋Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ以外の全てのＣＡＲ－Ｔの細胞毒性が優れていることを確認し、その中でも、Ｄ４単独で含まれたＣＡＲ－Ｔの細胞毒性効果が最も優れていることが確認できた（図１１）。
実施例５：ＰＢＭＣから分離したＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の膵癌及び乳癌に対する抗癌細胞毒性確認
実施例２で作製されたＤ４含有ＣＡＲが導入されたレンチウイルスを、３人の健康な供与者から分離したＰＢＭＣにそれぞれ形質導入させ、それぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。Ｄ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞の抗癌細胞毒性を確認するために、それらをそれぞれ黒色腫、膵癌及び乳癌細胞株に処理した。
実施例２で作製されたＤ４含有ＣＡＲが導入されたレンチウイルスを、３人の健康な供与者から分離したＰＢＭＣにそれぞれ形質導入させ、それぞれのＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。Ｄ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞の抗癌細胞毒性を確認するために、それらをそれぞれ黒色腫、膵癌及び乳癌細胞株に処理した。
黒色腫、膵癌及び乳癌細胞株をそれぞれ１×１０５個で９６ウェルプレート（丸底）に分注した後、ＮＴ（ｎｏｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）又はＣＡＲ（Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ）をそれぞれ１×１０５個の細胞と一緒に２４時間培養し、この時、サイトカインの放出を抑制するためのゴルジストップを処理した。２４時間後、細胞内染色のために固定及び透過化した後、ＩＦＮガンマ抗体を用いて細胞を染色した。その後、フローサイトメトリーを用いてＣＡＲ－Ｔ細胞活性が確認可能なＩＦＮガンマを分析した。ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２を発現させない黒色腫（５２６－ｍｅｌ）及び乳癌細胞株（ＳＫ－ＢＲ３）は、対照群として使用した。
ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２を発現させない黒色腫（５２６－ｍｅｌ）及び乳癌細胞株（ＳＫ－ＢＲ３）は標的しないので、本実施例に係るＣＡＲ導入の有無に関係なく、５２６－ｍｅｌとＳＫ－ＢＲ３細胞株に対する抗癌活性は示さなかった（図１２）。
一方、ＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２を発現させるものと報告された膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１、Ｍｉａ－ＰａＣａ２）及び乳癌細胞株（ＭＤＡ－２３１、ＺＲ－５７１）に対する抗癌細胞毒性を確認した結果、ＮＴ（ｎｏｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）Ｔ細胞は、抗癌細胞毒性及び活性を示さなかったが、Ｄ４含有ＣＡＲ導入Ｔ細胞は、膵癌及び乳癌細胞株に対する抗癌細胞毒性及び活性を示した（図１２）。したがって、ＰＡ６３リガンドを含むＣＡＲ－Ｔ細胞の効果は、ＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２を発現させる癌細胞において毒性が優れていることが確認でき、このことから、ＡＮＴＸＲ１及びＡＮＴＸＲ２を発現させるいずれの癌腫においても抗癌効果があろうと期待される。
実施例６：ＰＢＭＣから分離したＴ細胞を用いて作製したＣＡＲ－Ｔ細胞の膵癌に対する細胞毒性確認
膵癌細胞株であるＰＡＮＣ－１に蛍光を標示できるようにＲＦＰ遺伝子を導入して作製した細胞株（ＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させるＰＡＮＣ－１細胞株；ＰＡＮＣ－１＿ＲＦＰ）を２４ウェルプレートに１×１０４個の細胞ずつ分注した後、健康な供与者のＰＢＭＣで作製されたＮＴ（ｎｏｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）Ｔ細胞又はＣＡＲ（Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ）をそれぞれエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ）：ターゲット（ＰＡＮＣ－１）比＝５（５×１０４）：１、１０（１×１０５）：１、２０（２×１０５）：１、４０（４×１０５）：１個の細胞に４８時間共培養した。２４ウェルプレートに残っている膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１＿ＲＦＰ）を回収し、フローサイトメトリーを用いてＲＦＰ陽性細胞カウンティング（ＲＦＰ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）をした。
膵癌細胞株であるＰＡＮＣ－１に蛍光を標示できるようにＲＦＰ遺伝子を導入して作製した細胞株（ＲＦＰ（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させるＰＡＮＣ－１細胞株；ＰＡＮＣ－１＿ＲＦＰ）を２４ウェルプレートに１×１０４個の細胞ずつ分注した後、健康な供与者のＰＢＭＣで作製されたＮＴ（ｎｏｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）Ｔ細胞又はＣＡＲ（Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ）をそれぞれエフェクター（ＣＡＲ－Ｔ）：ターゲット（ＰＡＮＣ－１）比＝５（５×１０４）：１、１０（１×１０５）：１、２０（２×１０５）：１、４０（４×１０５）：１個の細胞に４８時間共培養した。２４ウェルプレートに残っている膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１＿ＲＦＰ）を回収し、フローサイトメトリーを用いてＲＦＰ陽性細胞カウンティング（ＲＦＰ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）をした。
その結果、約５０％（５：１）から９０％（４０：１）まで膵癌細胞株（ＰＡＮＣ－１＿ＲＦＰ）に対する細胞毒性が確認できた（図１３）。
実施例７：ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた動物モデル
免疫欠乏マウス（Ｂａｌｂ／ｃヌード、雌、５週齢）に膵癌細胞株（Ｍｉａ－ＰａＣａ２）を１×１０７ｃｅｌｌ／１００μＬで皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した２５日後に、ＰＢＳと健康な供与者のＰＢＭＣで作製されたＮＴ（ｎｏｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）、ＧＦＰ ｏｎｌｙ（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）、ＣＡＲ（Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ）を１×１０７ｃｅｌｌ／３００ｕＬの濃度で静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。細胞注入約４週後に、Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔの腫瘍（ｔｕｍｏｒ）は、対照群（ＰＢＳ、ＮＴ、ＧＦＰ ｏｎｌｙ）に比べて８０％の体積が減少した。このことから、ＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２を発現させる固形癌腫を用いた動物モデルにおいてもＣＡＲ Ｔ効能が優れていることが確認できる（図１４）。
免疫欠乏マウス（Ｂａｌｂ／ｃヌード、雌、５週齢）に膵癌細胞株（Ｍｉａ－ＰａＣａ２）を１×１０７ｃｅｌｌ／１００μＬで皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した２５日後に、ＰＢＳと健康な供与者のＰＢＭＣで作製されたＮＴ（ｎｏｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ）、ＧＦＰ ｏｎｌｙ（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）、ＣＡＲ（Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔ）を１×１０７ｃｅｌｌ／３００ｕＬの濃度で静脈注射（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。細胞注入約４週後に、Ｄ４含有ＣＡＲ－Ｔの腫瘍（ｔｕｍｏｒ）は、対照群（ＰＢＳ、ＮＴ、ＧＦＰ ｏｎｌｙ）に比べて８０％の体積が減少した。このことから、ＡＮＴＸＲ１又はＡＮＴＸＲ２を発現させる固形癌腫を用いた動物モデルにおいてもＣＡＲ Ｔ効能が優れていることが確認できる（図１４）。
本発明に係る抗ＡＮＴＸＲキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を用いて固形癌を治療することができ、抗癌薬物を投与することが有効でない固形癌患者、特に膵癌患者に対してキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を投与することによって、薬物投与を制限し、効率的で安全なカスタマイズの固形癌予防又は治療が可能である。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
Claims (20)
- 細胞外結合ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）をコードする核酸であって、前記細胞外結合ドメインは、ＡＮＴＸＲ（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を認識することを特徴とする、キメラ抗原受容体をコードする核酸。
- 前記ＡＮＴＸＲを認識する細胞外結合ドメインは、ＡＮＴＸＲに特異的に結合する抗体、アプタマー又はリガンドであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
- 前記リガンドは、ＰＡ６３リガンド又はその断片であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
- 前記ＰＡ６３リガンドは、配列番号１のアミノ酸配列で表されることを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
- 前記断片は、ＰＡ６３リガンドのドメイン４又はドメイン４を含む断片であることを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
- 前記ＰＡ６３リガンドのドメイン４断片は、配列番号２のアミノ酸配列で表されることを特徴とする、請求項５に記載の核酸。
- 前記ＰＡ６３リガンドのドメイン４を含む断片は、Ｄ１＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ４；Ｄ２＋Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ１＋Ｄ３＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２＋Ｄ３；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ１；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ２；Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ３及びＤ４＋Ｄ４＋Ｄ４＋Ｄ４からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の核酸。
- 前記ＰＡ６３リガンドのドメイン４を含む断片は、配列番号２～配列番号９のアミノ酸配列からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の核酸。
- 前記ＡＮＴＸＲは、ＡＲＴＸＲ１（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）又はＡＲＴＸＲ２（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
- 前記膜貫通ドメインは、Ｔ－細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、１次シグナル伝達ドメイン（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及び共刺激シグナル伝達ドメイン（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
- 前記１次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸。
- 前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸。
- 請求項１～１３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクター。
- 前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載のベクター。
- 請求項１４に記載のベクターを含む組換え細胞。
- 前記細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の組換え細胞。
- 前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）；腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）及び末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から分離したＴ細胞からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１７に記載の組換え細胞。
- 請求項１６に記載の組換え細胞を含む、ＡＮＴＸＲ（ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現する固形癌予防又は治療用医薬組成物。
- 前記固形癌は、膵癌、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌及び卵巣癌からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
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