KR20200127175A - 보툴리눔 신경독소 바이오하이브리드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시냅토태그민(Syt) 수용체, 시냅스 연관 소포 2(SV2) 수용체 및 강글리오사이드(Gang) 수용체에 상승작용적으로 결합하도록 조정된 신규한 보툴리눔 신경독소(BoNT) 중쇄 결합 도메인(HC/TAB) 및 상기 신규한 HC/TAB를 포함하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 벡터 및 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 보툴리눔 신경독소 폴리펩타이드, 특히 키메라 보툴리눔 신경독소 중쇄에 관한 것이다.
보툴리눔 신경독소(BoNT)는 사람에게 알려진 가장 강력한 단백질 독소이며, 희귀 마비 질환인 보툴리누스 중독(botulism)의 원인 물질이다. 이 박테리아 독소 계열은 8가지 혈청형, BoNT/A-G 및 최근에 기술된 BoNT/X로 구성된다(Montal, 2010; Zhang et al., 2017). 이들은 모두 공통 구조를 공유하고 150 kDa의 단백질로 발현되어 번역 후 절단되어 단일 이황화 결합에 의해 중쇄(HC, 100 kDa)에 연결된 경쇄(LC, 50 kDa)로 구성된 이쇄(di-chain) 분자로 이루어진다. HC는 N-말단 전위 도메인(HN) 및 C-말단 결합 도메인(HC)을 갖는 2개의 기능성 도메인을 보유하는 반면, LC는 세포 내 촉매 활성을 담당한다. BoNT는 먼저 특정 세포 표면 수용체를 통해 콜린성 신경 말단을 인식한 후 소포 내에서 세포 내 이입된다. 산성 엔도솜 환경은 독소 전위(전좌)라고도 하는, 사이토졸 내에서 LC의 전위를 허용하는 형태 변화를 일으킨다. 이어서, 유리된 촉매 도메인인 아연-프로테아제는 3개의 뉴런 SNARE(soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptors) 중 하나를 특이적으로 표적으로 할 수 있다: BoNT/A, BoNT/C 및 BoNT/E는 SNAP-25를 절단하고; BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G 및 BoNT/X는 VAMP(시냅토브레빈)을 표적으로 하고; 신택신은 BoNT/C에 의해 절단된다(Schiavo et al., 2000; Zhang et al., 2017). 이 세 단백질은 시냅스 소포의 원형질막으로의 융합을 매개하는 복합체를 형성한다(Sudhof and Rothman, 2009). 여느 SNARE의 단백질 분해는 세포외 이입을 억제하고 그럼으로써 신경 전달 물질의 방출을 억제하여 보툴리누스의 이완성 마비 증상을 효과적으로 유발한다(Rossetto et al., 2014). 상기 3개의 기능적 도메인의 순서는 이전에 설명되었다(Lacy DB, et al. 1999.). 촉매 도메인은 Lacy DB 등의 BoNT/A 서열을 참조하여 아미노산 1 내지 437, 아미노산 448 내지 872의 전위 도메인 및 아미노산 873 내지 1295의 결합 도메인으로 구성된다. 모든 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입이 상당 부분 상동성이므로, 임의의 다른 혈청형 또는 서브 타입에서의 상응하는 도메인의 위치는 매우 유사할 것이다.
이러한 독소의 높은 효능은 사시(strabismus), 자궁경부 긴장이상(cervical dystonia) 및 안검 경련(blepharospasm)과 같은 신경 근육 장애의 증가하는 범위뿐만 아니라 다한증(hyperhydrosis)와 같은 아세틸콜린의 방출과 관련된 다른 병태의 치료에 이들을 매우 유용한 치료제로 만든다(Chen, 2012). BoNT/A 및 BoNT/B는 치료제로 승인되고 시판되는 유일한 혈청형이다. BoNT/A는 일반적으로 인간에서 더 높은 효능을 갖는 것으로 고려되므로 대부분의 경우 선택되는 혈청형이다(Bentivoglio et al., 2015). 그러나, BoNT를 이용한 치료는, 독소의 치료 효과가 단지 일시적이기 때문에 일반적으로 반복 주사를 필요로 한다. 이로 인해 BoNT/A에 대한 면역 반응을 보이는 환자의 소집단에서 저항이 발생하는 것으로 보고되었다(Lange et al., 2009; Naumann et al., 2013). BoNT/B가 대안으로 보여지지만, 그 효능이 낮다는 것은 더 높은 용량이 필요함을 의미하므로 면역원성의 위험이 더 크다는 것을 나타낸다(Dressler and Bigalke, 2005). 또한 BoNT/B는 고통스러운 주사, 더 짧은 작용 기간 및 보다 빈번한 부작용과 같은 몇 가지 불리한 결과와 관련된다(Bentivoglio et al., 2015). 주요 부작용은 미용 용도가 아니란 종종 근육 경련 치료와 관련이 있다. 이는 신체의 다른 부위로 독소가 확산되어 부작용이 발생하기 때문에 독소가 확산될 가능성은 주사 용량과 직접 관련이 있기 때문이다. 부작용은 안검하수 및 복시와 같은 일시적인 심각하지 않은 사건에서부터 생명을 위협하는 사건, 심지어 사망에 이르기까지 다양하다.
뉴런에 대한 BoNT/A 및 BoNT/B의 결합은 상세하게 특성 규명되었으며, 시냅스 소포 단백질 및 뉴런 막에 고정된 강글리오사이드를 포함하는 이중 수용체 메커니즘에 기초한다. BoNT/A에 대한 단백질 수용체는 SV2로 동정되었다(Dong et al., 2006, Mahrhold et al., 2006). 보다 정확하게는, BoNT/A는 몇몇 인간 SV2 이소 형태 A, B 및 C에 결합할 수 있지만, 독소는 SV2A 및 SV2B의 N-당화된 형태만을 인식한다(Yao et al., 2016). BoNT/B에 대한 단백질 수용체는 시냅토태그민(Syt)(Nishiki et al., 1994, 1996; Dong et al., 2003)이며, 인간에서 Syt2보다 Syt1을 선호한다(Strotmeier et al., 2012). 강글리오사이드 인식은 모든 BoNT에 대한 중독 과정의 첫 번째 단계이며(Binz and Rummel, 2009), 보존된 모티프 H… SxWY… G를 중심으로 하는 공유 바인딩 메커니즘에 의해 순서가 매개된다. BoNT/A는 GT1b 및 GD1a의 말단 N-아세틸갈락토사민-갈락토스 모이어티에 결합하는 것을 선호하는 반면(Takamizawa et al. 1986; Schengrund et al. 1991), BoNT/B에 대한 데이터는 GD1b 및 GT1b의 디실릴 모티프에 대한 선호를 제안한다. 다른 혈청형은 탄수화물 특이성과 친화도가 다르다(Rummel, 2013).
다양한 BoNT 혈청형의 모듈형 배열 및 독특한 특성으로 인해 상기 독소가 단백질 공학의 대상이 되었다. 특히, 여러 연구에 따르면 혈청형 간에 전체 도메인을 교환할 수 있으며(Masuyer et al., 2014), 그럼으로써 고유한 약제학적 잠재력을 가진 새로운 독소를 얻을 수 있다. 예를 들어, BoNT/A의 전위 및 촉매 도메인과 연합된 BoNT/B의 결합 도메인으로 구성된 몇몇 분자가 생산되었다(Rummel et al., 2011; Wang et al., 2012; Kutschenko et al., 2017). 이러한 소위 키메라 독소는 시냅토태그민에 대한 BoNT/B의 높은 친화도 및 SV2와 비교하여 뉴런에서 이 수용체의 높은 발현과 관련된 효능 및 활성 지속의 양태에서 매력적인 약리학적 특성을 나타내었다(Takamori et al., 2006; Wilhelm et al., 2014).
중화 항체의 생성 및 독소 확산은 주사된 용량과 직접적으로 관련되어 있기 때문에, 동일한 수준의 독소 활성을 유지하면서 독소 용량을 낮추는 것이 매우 바람직한데, 이는 개별 독소 분자의 효능이 향상되어야 함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 목적은 개선된 지속 기간 및 효능을 가지며 주사 부위로부터 퍼질 위험이 적은 BoNT 폴리펩타이드를 제공하는 것이다. 본 발명자들은 키메라 BoNT 폴리펩타이드 엔지니어링에서 상기 언급된 이전 시도의 주요 문제점을 확인하였다. 이전의 시도 중 어느 것도 폴리펩타이드의 구조적 양태를 고려하지 않았다.
본 발명자들은 BoNT/A 및 BoNT/B의 수용체 결합 메커니즘에 대한 구조-기반 접근법 및 현재의 지식을 사용하여, SV2C 수용체, 시냅토태그민 수용체 및 강글리오사이드 수용체를 인식할 수 있는 특별히 조작된 HC 도메인(HC/TAB)을 포함하는 새로운 분자 TriRecABTox(BoNT/TAB)를 조작하였다. 본 발명자들은 BoNT/TAB가 재조합적으로 발현되고 정제될 수 있음을 보여준다. X선 결정학을 사용하여, 본 발명자들은 BoNT/TAB가 3개의 수용체에 동시에 결합할 수 있음을 추가로 입증한다. 따라서, BoNT/TAB는 향상된 친화력을 갖는 뉴런 세포를 인식하고 BoNT/A 치료에 대한 고효율 대안이 될 가능성이 있다.
따라서 상기 목적은 제1 양태에서 보툴리눔 신경독소(BoNT) 중쇄 결합 도메인(HC/TAB)을 제공함으로써 달성되며, 여기서 상기 HC/TAB는 a) 시냅토태그민(Syt) 수용체 결합 부위, 및 b) 시냅스 연관 소포 2(SV2) 수용체 결합 부위, 및 c) 강글리오사이드(Gang) 수용체 결합 부위를 포함하고, 상기 HC/TAB는 시냅토태그민(Syt) 수용체, 시냅스 연관 소포 2(SV2) 수용체 및 강글리오사이드(Gang) 수용체에 상승작용적으로 결합하도록 되어 있다.
HC/TAB는 N-말단(HCN) 및 C-말단(HCC)을 갖는다. 일 실시형태에 따르면, HCC 도메인은 BoNT 혈청형 A(BoNT/A) 및 BoNT 혈청형 B(BoNT/B)로부터의 서열로 교환 가능하게(interchangeably) 구성된다.
추가의 실시형태에 따르면, 상기 HCC 말단은 서열 A1B1A2B2A3에 따라 구성되며, 여기서 A는 BoNT/A로부터의 서열을 나타내고, B는 BoNT/B로부터의 서열을 나타낸다.
또 다른 실시형태에 따르면, B1, A2 및 B2의 서열은 전체 HC/TAB에 대해 안정적인 분자 내 계면을 생성하기 위해 돌연변이 및/또는 결실을 포함한다.
또 다른 실시형태에 따르면, Gang 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 임의의 Gang-수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이들의 서브 타입으로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에 따르면, Gang 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 BoNT/B로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에 따르면, Gang 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 B2에 위치한다.
또 다른 실시형태에 따르면, Syt 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 임의의 Syt 수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이들의 서브 타입으로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에 따르면, Syt 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 BoNT B, DC 또는 G로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에 따르면, Syt 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 B1 및 B2에 위치한다.
또 다른 실시형태에 따르면, HCN 서열은 임의의 SV2-수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입으로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에 따르면, HCN 서열은 BoNT/A로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에 따르면, SV2 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 HCC에서 HCN 및 A1 및 A3에 위치한다.
또 다른 실시형태에 따르면, HC/TAB는 서열번호 1, 3, 5, 6, 8, 10 또는 12의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
제2 양태에 따르면, 직접적으로 또는 링커를 통해 임의의 다른 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 형광 프로브에 커플링된, 제1 양태 및 상기 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB를 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
제2 양태의 실시형태에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 BoNT 유사 폴리펩타이드 뿐만 아니라, BoNT 폴리펩타이드(BoNT/TAB)이며, 상기 BoNT/TAB는 HC/TAB 외에 중쇄 전좌 도메인(HN), 경쇄(LC) 및 상기 폴리펩타이드 서열에서 LC와 HN 사이에 위치된 프로테아제 부위를 포함하며, 여기서, HN과 LC는 각각 독립적으로 BoNT 혈청형 A, B, C, D, DC, E, En, F, G 또는 X 및 이의 서브 타입으로부터 유래한다.
추가의 실시형태에 따르면, 상기 폴리펩타이드는 직접 또는 링커를 통해 연결된 임의의 다른 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 형광 프로브를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에 따르면, 프로테아제 부위는 엑소 프로테아제 부위이다. 또 다른 실시형태에 따르면, 상기 엑소 프로테아제 부위는 Factor Xa 부위이다.
또 다른 실시형태에 따르면, 제2 양태에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 1, 3, 5, 6, 8, 10 또는 12의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
제3 양태에 따르면, 제1 양태 및 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB를 암호화하는 핵산 서열, 또는 제2 양태 및 제2 양태의 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 벡터가 제공된다.
제4 양태에 따르면, 제1 양태 및 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB, 또는 제2 양태 및 제2 양태의 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드의 치료 방법 또는 미용 방법에의 사용이 제공된다.
제4 양태의 실시형태에 따르면, 상기 치료 방법 또는 미용 방법은 근육을 약화 및/또는 불활성화시키는 치료이다.
제4 양태의 추가의 실시형태에 따르면, 상기 치료 방법은 신경근육 장애, 아세틸콜린의 방출과 관계된 병태, 및 경직성(spastic) 근육 장애를 포함하는 군으로부터 선택된 장애의 치료 및/또는 예방이다.
또 다른 실시형태에 따르면, 상기 장애는 연축발성장애(spasmodic dysphonia), 연축사경(spasmodic torticollis), 후두근긴장이상증(laryngeal dystonia), 구강하악 근긴장이상증(oromandibular dysphonia), 혀 근긴장이상증(lingual dystonia), 자궁 경부 긴장이상증(cervical dystonia), 국소 손 긴장이상증(focal hand dystonia), 안검연축(blepharospasm), 사시(strabismus), 반얼굴연축(hemifacial spasm), 안검장애(eyelid disorder), 뇌성마비(cerebral palsy), 국소 강직(focal spasticity) 및 기타 음성 장애(voice disorder), 연축대장염(spasmodic colitis), 신경성방광(neurogenic bladder), 항문경(anismus), 사지경직(limb spasticity), 틱증(tics), 떨림(tremors), 이갈이(bruxism), 항문 균열, 이완불능증(achalasia), 연하곤란(dysphagia) 및 기타 근긴장성 장애(muscle tone disorder), 및 근육군(muscle groups)의 불수의운동, 유루증(lacrimation), 다한증(hyperhydrosis), 과도한 타액 분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 연축으로 인한 통증, 두통, 스포츠 상해 및 우울증을 특징으로 하는 기타 장애를 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에 따르면, 제1 양태 및 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB, 또는 제2 양태 및 제2 양태의 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드는 시냅스 과정에서 상기 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 형광 프로브의 역할을 살펴보기 위하여 약리학적 시험에서 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에 따르면, 제1 양태 및 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB, 또는 제2 양태 및 제2 양태의 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드는 비히클에 결합된 임의의 단백질, 아미노산 서열 또는 형광 프로브를 뉴런 표면으로 효과적으로 수송하기 위한 당해 비히클로서 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에 따르면, 제1 양태 및 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB, 또는 제2 양태 및 제2 양태의 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드는 비히클에 결합된 임의의 단백질, 아미노산 서열 또는 형광 프로브를 독소 전위 시스템을 사용하여 뉴런 사이토졸로 효과적으로 수송하기 위한 당해 비히클로서 사용될 수 있다.
제5 양태에 따르면, 제1 양태 및 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB, 또는 제2 양태 및 제2 양태의 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 또는 미용 조성물이 제공된다.
제5 양태의 일 실시형태에 따르면, 상기 조성물은 약학적 및/또는 미용상 허용되는 부형제, 담체 또는 다른 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
제6 양태에 따르면, 제5 양태의 조성물 및 상기 조성물의 치료적 투여 지침을 포함하는, 부품 키트(kit of parts)가 제공된다.
제7 양태에 따르면, 원치 않는 뉴런 활성과 관련된 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 이 방법은 치료학적 유효량의, 제1 양태 및 제1 양태의 임의의 실시형태에 따른 HC/TAB, 또는 제2 양태 및 제2 양태의 임의의 실시형태에 따른 폴리펩타이드, 또는 제5 양태의 조성물을 대상체에게 투여하여 상기 병태를 치료하는 것을 포함하며, 상기 병태는 연축발성장애, 연축사경, 후두근긴장이상증, 구강하악 근긴장이상증, 혀 근긴장이상증, 자궁 경부 긴장이상증, 국소 손 긴장이상증, 안검연축, 사시, 반얼굴연축, 안검장애, 뇌성마비, 국소 강직 및 기타 음성 장애, 연축대장염, 신경성방광, 항문경, 사지 경직, 틱증, 떨림, 이갈이, 항문 균열, 이완불능증, 연하곤란 및 기타 근긴장성 장애, 및 근육군의 불수의운동, 유루증, 다한증, 과도한 타액 분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 연축으로 인한 통증, 두통, 스포츠 상해 및 우울증을 특징으로 하는 기타 장애, 및 피부과적 또는 미적/미용의 병태를 포함하는 군으로부터 선택된다.
도 1: BoNT/A 및 BoNT/B에 의한 수용체 결합에 대한 구조적 정보. (a) GT1b(PDB 2VU) 및 인간 글리코실화된 SV2C(PDB 5JLV)와의 복합체에서 BoNT/A의 결합 도메인의 결정 구조의 중첩. (b) GD1a 및 래트 시냅토태그민 2(PDB 4KBB)와의 복합체에서 BoNT/B의 결합 도메인의 결정 구조. 리본 모드로 표현된 단백질과 스틱으로 표현된 탄수화물. (c) 2차 구조 요소가 제공되는 Hc/A(Uniprot P10845) 및 Hc/B(Uniprot P10844)의 서열 정렬(ESPript3.0으로 준비된 도면; Robert and Gouet, 2014). 수용체 결합에 직접 관여하는 영역은 SV2 수용체에 대하여 Hc/A 서열 위, 및 Syt 수용체에 대하여 Hc/B 서열 아래에 라인으로 각 도메인에 대해 강조 표시되고; 강글리오사이드 수용체 결합 부위는 회색 줄무늬로 밑줄이 그어져 있음.
도 2: H C /A 및 H C /B에 의한 수용체 결합과 H C /TAB의 서열 정렬.
단백질 서열을 ClustalO(Sievers et al., 2011)와 정렬시켰다. HC/TAB 설계에 사용된 HC/A 및 HC/B 세그먼트는 각각 검은색(흰색 글자)과 밝은 회색(검정색 글자)로 강조 표시되었다. 결실이 포함된 위치는 진한 회색(대시)으로 표시된다.
도 3: H C /TAB의 특성 규명. (a) 정제된 HC/TAB의 SDS-PAGE 분석 및 HC/A 및 HC/B 대조군과의 비교. (b) 폴리-히스티딘 프로브를 사용한 웨스턴 블롯 분석, (a)에서와 동일한 샘플임. 'M'은 분자량 마커를 나타낸다.
도 4: SV2C, 인간 시냅토태그민 1 및 GD1a와의 복합체에서 TriRecABTox의 결합 도메인의 X-선 결정 구조. (a) SV2C, hSyt1 및 GD1a와 함께한 HC/TAB의 리본 표현. (b 내지 d) SV2C 수용체 결합 부위(b), GD1a(c) 및 hSyt1(d) 주위의 2σ에서 2Fo-Fc 전자 밀도 맵 (메쉬)의 예.
도 5: SV2 수용체에 대한 결합. (a) hSV2C와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/A(PDB 4JRA)의 결정 구조의 중첩. (b) 글리코실화된 hSV2와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/A(PDB 5JLV)의 결정 구조의 중첩. 결합에 관여하는 잔기(Benoit et al., 2014)는 스틱으로 표시되며 상응 HC/A 위치에 따라 표지된다.
도 6: 시냅토태그민에 대한 결합. 인간 Syt1 및 랫트 Syt2와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/B (PDB 4KBB)의 결정 구조의 중첩. 결합에 관여하는 잔기(Jin et al., 2006; Chai et al., 2006)는 스틱으로 표시되고 상응 HC/B 위치에 따라 표지된다.
도 7: GD1a에 대한 결합. GD1a와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/B(PDB 4KBB)의 결정 구조의 중첩(각각 진한 및 밝은 회색). 결합에 관여하는 잔기(Berntsson et al., 2013)는 스틱으로 표시되고 해당 HC/B 위치에 따라 표지된다.
도 8: BoNT/TAB의 특성 규명. (a) HC/A 및 HC/B 대조군을 사용한 정제된 BoNT/TAB의 SDS-PAGE 분석. (b 내지 d) 폴리-히스티딘 프로브(b); HC/A(c) 및 HC/B(d) 항혈청을 사용한 웨스턴 블롯 분석. (a)에서와 동일한 샘플이며,'M'은 분자량 마커를 나타낸다.
도 9: BoNT/TAB의 활성화. (a) 기능적 도메인 구성을 설명하는 BoNT/TAB 구성의 도식적 표현. 조작된 프로테아제 활성화 부위는 검은 점선으로 표시된다. 경쇄와 중쇄 사이의 자연 이황화 브릿지는 일반적인 검은 선으로 표시됨, (b) BoNT/TAB 활성화 에세이의 SDS-PAGE 분석. 비환원(NR) 및 감소 (R) 비활성화 BoNT/TAB(왼쪽) 및 인자 Xa 활성화된 BoNT/TAB(오른쪽). 관심 단편에 주석이 달려 있음. 'M'은 분자량 마커를 나타낸다.
도 10: H C /TAB의 확장된 사용. (a) HC/TAB와 관련된 잠재적 기능성 BoNT 유도체의 개략도. 이 작제물은 임의의 혈청형 또는 서브 타입('n')의 기능적 BoNT 도메인으로 구성된다. 프로테아제 활성화 부위(검은 점선)도 포함되어야 한다. (b) 카고 단백질을 뉴런 세포의 표면으로 수송하기 위해 HC/TAB를 사용하는 잠재적 작제물의 개략도.
도 11: H C /TAB의 정제. (a) 5㎖ HisTrap FF 칼럼을 사용한 친화성 크로마토 그래피 정제로부터의 크로마토 그래피(A280 트레이스). (b) Superdex200 칼럼을 사용한 크기 배제 정제로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). 정제 공정의 단계 및 HC/TAB가 있는 분획이 강조된다.
도 12: SV2C, hSyt1 및 GD1a와의 복합체에서의 H C /TAB의 결정. (a) 20 % v/v 폴리에틸렌글리콜 6000, 0.1M 시트레이트 pH 5.0에서 성장된 결정. (b) Diamond I04-1 스테이션에서 데이터 수집을 위해 cryo-loop에 장착된 결정. (c) 결정의 X-선 회절 패턴.
도 13: BoNT/TAB의 정제. (a) 5㎖ HisTrap FF 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피 정제로부터의 크로마토 그래피(A280 트레이스). (b) Superdex 200 칼럼을 사용한 크기 배제 정제로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). 정제 공정의 단계 및 BoNT/TAB가 있는 분획이 강조되어 있다.
도 14: SV2C, 인간 시냅토태그민 1 및 GD1a와의 복합체에서 H C /TAB의 결합 도메인의 X-선 결정 구조. (a) 및 (b) 결정 구조 HC/TAB(a) 및 HC/TAB 2.1(b)의 온도 계수 분석(temperature facture analysis) - 퍼티(putty) 반경 표현, 여기서 반경은 B-인자에 비례함, 360과 362의 위치는 검은 색으로 강조 표시되어 '360' 루프가 표시됨. (c) SV2C, hSyt1 및 GD1a를 갖는 복합체 HC/TAB 2.1의 X-선 결정 구조 (스틱 표현). (d) 지질 결합 루프가 표지되고 소수성 잔기가 스틱으로 도시된 (c)와 동일함.
도 15: H C /TAB 2.1의 정제. (a) 5㎖ HisTrap FF 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피 정제로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). (b) Superdex200 칼럼을 사용한 겔 여과로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스), HC/TAB2.1의 분획이 표시됨. (c) 및 (d) HC/TAB 2.1의 특성 규명. (c)의 친화성 크로마토그래피 및 (d)의 겔 여과 크로마토그래피를 거친 정제된 HC/TAB 2.1의 분획의 SDS-PAGE 분석; 왼쪽의 첫 번째 레인은 분자량 마커를 보여줌, HC/TAB 2.1에 해당하는 밴드가 표시됨.
도 16: H C /TAB 2.1.1 및 H C /TAB 2.1.3의 정제. (a) 및 (b) HC/TAB 2.1.1의 각 친화성 크로마토그래피 정제 및 겔 여과로부터 크로마토그래피(A280 트레이스). HC/TAB 2.1.1이 있는 분획이 표시됨. (c) 및 (d) HC/TAB 2.1.3의 각 친화성 크로마토그래피 정제 및 겔 여과로부터 크로마토그래피(A280 트레이스). HC/TAB 2.1.3이 있는 분획이 표시됨. (d) HC/TAB 2.1.1 및 HC/TAB 2.1.3의 특성 규명. 정제된 샘플의 SDS-PAGE 분석; 왼쪽의 첫 번째 레인은 분자량 마커를 보여줌, HC/TAB 2.1.1 및 HC/TAB 2.1.3에 해당하는 밴드가 표시됨.
도 17: 도 X4: BoNT/TAB 2.1.3의 정제. (a) 및 (b) BoNT/TAB 2.1.3 정제를 거친 분획의 SDS-PAGE 분석. 친화성 크로마토그래피(a) 및 겔 여과(b)를 거친 분획; 왼쪽의 첫 번째 레인은 분자량 마커를 보여주고, BoNT/TAB 2.1.3에 해당하는 밴드가 표시됨. (c) 정제된 BoNT/TAB 2.1.3 샘플의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 트롬빈 활성화 전 샘플, 레인 2: 최종 활성화 샘플(트롬빈 처치 후). 전장(단일 사슬), HC 및 LC에 해당하는 밴드가 표시됨. 오른쪽의 레인은 분자량 마커를 보여줌. (d) Superdex 200 칼럼을 사용한 최종 겔 여과(트롬빈 절단 후)로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). BoNT/TAB 2.1.3이 있는 분획이 표시됨.
도 2: H C /A 및 H C /B에 의한 수용체 결합과 H C /TAB의 서열 정렬.
단백질 서열을 ClustalO(Sievers et al., 2011)와 정렬시켰다. HC/TAB 설계에 사용된 HC/A 및 HC/B 세그먼트는 각각 검은색(흰색 글자)과 밝은 회색(검정색 글자)로 강조 표시되었다. 결실이 포함된 위치는 진한 회색(대시)으로 표시된다.
도 3: H C /TAB의 특성 규명. (a) 정제된 HC/TAB의 SDS-PAGE 분석 및 HC/A 및 HC/B 대조군과의 비교. (b) 폴리-히스티딘 프로브를 사용한 웨스턴 블롯 분석, (a)에서와 동일한 샘플임. 'M'은 분자량 마커를 나타낸다.
도 4: SV2C, 인간 시냅토태그민 1 및 GD1a와의 복합체에서 TriRecABTox의 결합 도메인의 X-선 결정 구조. (a) SV2C, hSyt1 및 GD1a와 함께한 HC/TAB의 리본 표현. (b 내지 d) SV2C 수용체 결합 부위(b), GD1a(c) 및 hSyt1(d) 주위의 2σ에서 2Fo-Fc 전자 밀도 맵 (메쉬)의 예.
도 5: SV2 수용체에 대한 결합. (a) hSV2C와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/A(PDB 4JRA)의 결정 구조의 중첩. (b) 글리코실화된 hSV2와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/A(PDB 5JLV)의 결정 구조의 중첩. 결합에 관여하는 잔기(Benoit et al., 2014)는 스틱으로 표시되며 상응 HC/A 위치에 따라 표지된다.
도 6: 시냅토태그민에 대한 결합. 인간 Syt1 및 랫트 Syt2와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/B (PDB 4KBB)의 결정 구조의 중첩. 결합에 관여하는 잔기(Jin et al., 2006; Chai et al., 2006)는 스틱으로 표시되고 상응 HC/B 위치에 따라 표지된다.
도 7: GD1a에 대한 결합. GD1a와의 복합체에서 HC/TAB 및 HC/B(PDB 4KBB)의 결정 구조의 중첩(각각 진한 및 밝은 회색). 결합에 관여하는 잔기(Berntsson et al., 2013)는 스틱으로 표시되고 해당 HC/B 위치에 따라 표지된다.
도 8: BoNT/TAB의 특성 규명. (a) HC/A 및 HC/B 대조군을 사용한 정제된 BoNT/TAB의 SDS-PAGE 분석. (b 내지 d) 폴리-히스티딘 프로브(b); HC/A(c) 및 HC/B(d) 항혈청을 사용한 웨스턴 블롯 분석. (a)에서와 동일한 샘플이며,'M'은 분자량 마커를 나타낸다.
도 9: BoNT/TAB의 활성화. (a) 기능적 도메인 구성을 설명하는 BoNT/TAB 구성의 도식적 표현. 조작된 프로테아제 활성화 부위는 검은 점선으로 표시된다. 경쇄와 중쇄 사이의 자연 이황화 브릿지는 일반적인 검은 선으로 표시됨, (b) BoNT/TAB 활성화 에세이의 SDS-PAGE 분석. 비환원(NR) 및 감소 (R) 비활성화 BoNT/TAB(왼쪽) 및 인자 Xa 활성화된 BoNT/TAB(오른쪽). 관심 단편에 주석이 달려 있음. 'M'은 분자량 마커를 나타낸다.
도 10: H C /TAB의 확장된 사용. (a) HC/TAB와 관련된 잠재적 기능성 BoNT 유도체의 개략도. 이 작제물은 임의의 혈청형 또는 서브 타입('n')의 기능적 BoNT 도메인으로 구성된다. 프로테아제 활성화 부위(검은 점선)도 포함되어야 한다. (b) 카고 단백질을 뉴런 세포의 표면으로 수송하기 위해 HC/TAB를 사용하는 잠재적 작제물의 개략도.
도 11: H C /TAB의 정제. (a) 5㎖ HisTrap FF 칼럼을 사용한 친화성 크로마토 그래피 정제로부터의 크로마토 그래피(A280 트레이스). (b) Superdex200 칼럼을 사용한 크기 배제 정제로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). 정제 공정의 단계 및 HC/TAB가 있는 분획이 강조된다.
도 12: SV2C, hSyt1 및 GD1a와의 복합체에서의 H C /TAB의 결정. (a) 20 % v/v 폴리에틸렌글리콜 6000, 0.1M 시트레이트 pH 5.0에서 성장된 결정. (b) Diamond I04-1 스테이션에서 데이터 수집을 위해 cryo-loop에 장착된 결정. (c) 결정의 X-선 회절 패턴.
도 13: BoNT/TAB의 정제. (a) 5㎖ HisTrap FF 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피 정제로부터의 크로마토 그래피(A280 트레이스). (b) Superdex 200 칼럼을 사용한 크기 배제 정제로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). 정제 공정의 단계 및 BoNT/TAB가 있는 분획이 강조되어 있다.
도 14: SV2C, 인간 시냅토태그민 1 및 GD1a와의 복합체에서 H C /TAB의 결합 도메인의 X-선 결정 구조. (a) 및 (b) 결정 구조 HC/TAB(a) 및 HC/TAB 2.1(b)의 온도 계수 분석(temperature facture analysis) - 퍼티(putty) 반경 표현, 여기서 반경은 B-인자에 비례함, 360과 362의 위치는 검은 색으로 강조 표시되어 '360' 루프가 표시됨. (c) SV2C, hSyt1 및 GD1a를 갖는 복합체 HC/TAB 2.1의 X-선 결정 구조 (스틱 표현). (d) 지질 결합 루프가 표지되고 소수성 잔기가 스틱으로 도시된 (c)와 동일함.
도 15: H C /TAB 2.1의 정제. (a) 5㎖ HisTrap FF 칼럼을 사용한 친화성 크로마토그래피 정제로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). (b) Superdex200 칼럼을 사용한 겔 여과로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스), HC/TAB2.1의 분획이 표시됨. (c) 및 (d) HC/TAB 2.1의 특성 규명. (c)의 친화성 크로마토그래피 및 (d)의 겔 여과 크로마토그래피를 거친 정제된 HC/TAB 2.1의 분획의 SDS-PAGE 분석; 왼쪽의 첫 번째 레인은 분자량 마커를 보여줌, HC/TAB 2.1에 해당하는 밴드가 표시됨.
도 16: H C /TAB 2.1.1 및 H C /TAB 2.1.3의 정제. (a) 및 (b) HC/TAB 2.1.1의 각 친화성 크로마토그래피 정제 및 겔 여과로부터 크로마토그래피(A280 트레이스). HC/TAB 2.1.1이 있는 분획이 표시됨. (c) 및 (d) HC/TAB 2.1.3의 각 친화성 크로마토그래피 정제 및 겔 여과로부터 크로마토그래피(A280 트레이스). HC/TAB 2.1.3이 있는 분획이 표시됨. (d) HC/TAB 2.1.1 및 HC/TAB 2.1.3의 특성 규명. 정제된 샘플의 SDS-PAGE 분석; 왼쪽의 첫 번째 레인은 분자량 마커를 보여줌, HC/TAB 2.1.1 및 HC/TAB 2.1.3에 해당하는 밴드가 표시됨.
도 17: 도 X4: BoNT/TAB 2.1.3의 정제. (a) 및 (b) BoNT/TAB 2.1.3 정제를 거친 분획의 SDS-PAGE 분석. 친화성 크로마토그래피(a) 및 겔 여과(b)를 거친 분획; 왼쪽의 첫 번째 레인은 분자량 마커를 보여주고, BoNT/TAB 2.1.3에 해당하는 밴드가 표시됨. (c) 정제된 BoNT/TAB 2.1.3 샘플의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 트롬빈 활성화 전 샘플, 레인 2: 최종 활성화 샘플(트롬빈 처치 후). 전장(단일 사슬), HC 및 LC에 해당하는 밴드가 표시됨. 오른쪽의 레인은 분자량 마커를 보여줌. (d) Superdex 200 칼럼을 사용한 최종 겔 여과(트롬빈 절단 후)로부터의 크로마토그래피(A280 트레이스). BoNT/TAB 2.1.3이 있는 분획이 표시됨.
정의
본 명세서에서 사용된 용어 보툴리눔 신경독소 "BoNT"는 보툴리눔 신경독소로부터유래한 임의의 폴리펩타이드 또는 단편을 포함한다. 용어 BoNT는 전장 BoNT를 지칭할 수 있다. 용어 BoNT는 BoNT가 뉴런에 진입하여 신경 전달 물질 방출을 억제하는 전체 세포 메커니즘을 실행할 수 있는 BoNT의 단편을 지칭할 수 있다. 용어 BoNT는 그 단편이 임의의 특정 기능 또는 활성을 가질 필요없이 단순히 BoNT의 단편을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전위(전좌) 도메인"또는 "HN"은 BoNT 경쇄 전좌를 매개하는 중독 과정의 전좌 단계를 실행할 수 있는 BoNT 도메인을 의미한다. 따라서, HN은 BoNT 경쇄가 막을 가로 질러 세포의 세포질 내로 이동하는 것을 촉진한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "결합 도메인"은 "HC 도메인"과 동의어이며, 예를 들어 BoNT와 표적 세포의 원형질막 표면에 위치한 BoNT-특이적 수용체 시스템과의 결합을 포함하여, 중독 과정의 세포 결합 단계를 실행할 수 있는 임의의 자연 발생 BoNT 수용체 결합 도메인을 의미한다.
본 개시에서, 용어 "핵산" 및 "유전자"는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 폴리뉴클레오타이드를 기술하기 위해 교환 가능하게 사용된다.
상세한 설명
상기 배경기술 부문에서 명시된 바와 같이, BoNT는 단일 이황화 브릿지에 의해 중쇄(HC)에 연결된 경쇄(LC)를 포함한다. 중쇄(HC)는 N-말단 전좌 도메인(HN) 및 C-말단 결합 도메인(HC)을 갖는 2개의 기능성 도메인을 보유하며, LC는 세포 내 촉매 활성을 담당한다. 따라서, HC는 감수성 뉴런 상에 발현된 특정 수용체에 특이적이고 비가역적으로 결합할 수 있는 수용체 결합 도메인을 포함하는 반면, HN은 부착된 LC가 엔도솜 유사 막 소포에서 사이토졸로 전위될 수 있도록 하는 통로를 형성한다. 상이한 BoNT 혈청형은 HC 상에 상이한 세트의 수용체 결합 부위, 전형적으로 2개의 수용체 결합 부위를 갖는다. 본 발명자들은 3가지 상이한 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 신규한 BoNT HC 결합 도메인(HC/TAB)을 조작하는데 이러한 지식을 이용하였다.
본 발명자들은 다음을 포함하는 HC/TAB 도메인을 조작함(engineering)으로써 이를 달성하였다:
a)시냅토태그민(Syt) 수용체 결합 부위, 및
b) 시냅스 연관 소포 2(SV2) 수용체 결합 부위 및
c) 강글리오사이드(Gang) 수용체 결합 부위.
조작된 HC/TAB 도메인의 구조는 HC/TAB가 시냅토태그민(Syt) 수용체, 시냅스 연관 소포 2(SV2) 수용체 및 강글리오사이드(Gang) 수용체에 상승작용적으로 결합할 수 있게 한다. 따라서, 뉴런 세포상의 3개의 수용체에 대한 상승작용적인 결합이 달성되어, 새로운 HC/TAB 도메인이 다른 BoNT HC 도메인과 비교하여 향상된 친화성을 갖도록 한다. 따라서, 뉴런에 대한 전체적인 결합이 개선되고 결과적으로 독소의 효능이 개선된다.
HC는 N-말단(HCN) 및 C-말단(HCC)을 추가로 포함한다. 본 발명의 주요 특징은 HC/TAB의 HCC 말단의 구조이며, 이는 수용체 결합 도메인이 BoNT에 위치한다.
HC/TAB의 일 실시형태에서, HCC 말단은 BoNT 혈청형 A(BoNT/A) 및 BoNT 혈청형 B(BoNT/B)로부터의 서열로 교환 가능하게 구성된다. 이러한 교환 가능한 구조를 조작함으로써, 본 발명자들은 3개의 수용체 모두에 대한 상승작용적인 결합을 최적화시킬 수 있었다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, HCC 말단은 서열 A1B1A2B2A3에 따라 구성되며, 여기서 A는 BoNT/A로부터의 서열을 나타내고, B는 BoNT/B로부터의 서열을 나타낸다(도 2 참조). 이것은 HC/TAB의 구조를 최적화하여 3개의 수용체 결합 도메인이 3개의 상기 수용체 모두에 적어도 상승작용적으로, 심지어 동시에 결합할 수 있게 한다. 본 발명자들은 이 A1B1A2B2A3 서열로 시험관 내에서 3개의 수용체 모두에 대한 동시 결합이 발생함을 보여주었다. 이 특정 실시형태에 따른 조작된 A1B1A2B2A3 서열은 서열번호 1에 기재되어 있다.
상기에 따라 HC/TAB를 추가로 최적화하기 위해, 안정적인 분자 내 계면을 생성하기 위해 돌연변이 및 결실이 도입되었다(도 2 참조). 서열번호 1에서 위치 306, 360 및 362에서 치환이 이루어졌고, 원래의 서열과 비교하여 위치 265/266 및 360/361에서 결실이 있었다. 그러나, 당업자는 상기 특정 위치로부터 +1, +2, +3, +4, +5, 또는 -1, -2, -3, -4 또는 -5 위치에서 아미노산에 대한 돌연변이 및/또는 결실이 동일한 효과를 가질 수 있음을 이해할 수 있다. 따라서, 상기 특정 아미노산 위치로부터 +/- 5개의 아미노산 위치에서의 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 속한다.
상기 특정 실시형태 및 하기 모든 실시예에 따르면, 강글리오사이드 수용체 결합 부위는 BoNT/B로부터 유래하지만, 임의의 Gang 수용체-결합 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입, 예컨대 BoNT 혈청형 A, B, C, D, DC, E, En, F, G 또는 X, 또는 이들의 서브 타입으로부터 유래될 수 있음을 생각할 수 있는데, 이는 모든 혈청형이 강글리오사이드 수용체 결합 부위를 갖기 때문이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, Gang 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 B2에 위치한다.
SV2 수용체 결합 도메인은 일반적으로 임의의 SV2 수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입, 특히 BoNT 혈청형 A, D, E 및 F에서 유래할 수 있다. 상기 특정 실시형태 및 하기 모든 실시 예에서, SV2 수용체 결합 도메인은 BoNT/A로부터 유래하지만, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, SV2 수용체 결합 도메인을 포함하는 임의의 혈청형은 첨부된 청구범위에 따른 HC/TAB의 목적 및 의도된 용도에 따라 상기 도메인의 기원으로 사용될 수 있다.
SV2 수용체 결합 도메인의 일부는 HCN 말단에 존재한다. 따라서, HCN 서열은 임의의 SV2-수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이들의 서브 타입으로부터 유래될 수 있다. 상기 특정 실시 양태 및 하기 모든 실시 예에서, HCN 말단은 BoNT/A로부터 유래된다. 그러나, 당업자는 SV2 수용체 결합 도메인이 기능하는 한, HCN 서열은 또한 임의의 BoNT 혈청형 C, D, E, F 또는 G로부터 유래될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, SV2 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 HCN 및 HCC에서 A1 및 A3에 위치한다.
Syt 수용체 결합 부위는 임의의 Syt 수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이들의 서브 타입으로부터 유래될 수 있다. 특히, Syt 수용체 결합 부위는 BoNT 혈청형 B, 키메라 DC 또는 G로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, Syt 수용체 결합 부위를 형성하는 서열은 B1 및 B2에 위치한다.
본 발명은 또한 상기에 따른 HC/TAB를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 따라서, 폴리펩타이드는 직접적으로 또는 링커를 통해 HC/TAB에 커플링된 임의의 다른 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 형광 프로브를 포함할 수 있다. 이하, HC/TAB에 결합되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열을 "단백질"이라 한다.
바람직한 일 실시형태에 따르면, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 서열에서 LC와 HN 사이에 위치된 엑소프로테아제 부위뿐만 아니라 HN 및 LC를 추가로 포함하는 재조합 BoNT 폴리펩타이드(BoNT/TAB)이다.
엑소프로테아제 부위는 단일 쇄 폴리펩타이드가 이중 쇄(di chain) 분자로 절단되어 상기 분자가 활성 독소가 되도록 한다. 본 발명의 실시형태에 따르면, 엑소 프로테아제 부위는 인자 Xa 부위이지만, 이는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 제한적인 특징이 아니다.
일 실시형태에 따르면, 활성 형태의 BoNT/TAB는 서열번호 5에 따른다. 다른 실시형태에 따르면, 활성 형태의 BoNT/TAB는 서열번호 6, 8, 10, 또는 12의 서열에 따른다. 바람직하게는, 활성 형태의 BoNT/TAB는 서열번호 12에 따른다.
HN 및 LC는 각각 독립적으로 BoNT 혈청형 A, B, C, D, DC, E, En, F, G 또는 X 및 이들의 서브 타입뿐만 아니라 BoNT 유사 폴리펩타이드로부터 유래될 수 있다. BoNT와 유사한 새로운 단백질, 즉 유사한 도메인 구조 및 다양한 정도의 서열 동일성을 갖지만 클로스트리듐 보툴리눔(C.-botulinum) 이외의 다른 유기체에 의해 생성된 새로운 단백질이 출현하고 있다. 따라서, 당업자는 임의의 BoNT 혈청형, 이들의 서브 타입 또는 BoNT- 유사 폴리펩타이드로부터 HN 및/또는 LC를 선택할 수 있을 것이다.
상기 명시된 바와 같이, HC/TAB에 도입된 돌연변이 및 결실은 조작된 BoNT/TAB가 올바른 구조 및 필요한 활성을 갖는 가용성 단백질로서 생성될 수 있음을 추가로 보장한다.
상기한 바에 따른 폴리펩타이드는 HC/TAB가 재조합적으로 생성될 필요가 있기 때문에 재조합적으로 생성되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 개시내용은 또한 상기에 따른 임의의 HC/TAB 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 본 개시내용의 HC/TAB 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 특정 양태에서, 단리된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 본 발명의 핵산은 본원에 기재된 임의의 HC/TAB 또는 폴리펩타이드의 변이체인 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 것으로 추가로 이해된다. 변이체 뉴클레오타이드 서열은 대립 유전자 변이체와 같은 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실만큼 차이나는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 상기에 따른 HC/TAB를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 하나의 폴리펩타이드에서 HC/TAB에 커플링된 상기 단백질 또는 프로브를 수득하기 위해 HC/TAB와 함께 재조합적으로 생산될 임의의 다른 단백질 또는 프로브를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 상기 벡터는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 다양한 프로모터가 본원에 기재된 폴리펩타이드의 발현에 사용될 수 있으며, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다.
핵산을 포함하는 발현 벡터는 통상적인 기술(예를 들어, 전기천공, 리포좀 형질감염 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있고, 형질 감염된 세포는 통상적인 기술에 의해 배양되어 본원에 기재된 폴리펩타이드를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 폴리펩타이드의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직-특이적 프로모터에 의해 조절된다.
폴리펩타이드는 임의의 세포, 진핵 생물 또는 원핵 생물 또는 효모에서 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 세포 프리 시스템에서 추가로 생산될 수있다. 당업자는 선택되는 발현 시스템을 그에게 쉽게 적용할 수 있을 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는데 사용되는 발현 시스템은 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
재조합 단백질의 정제 및 변형은 당업계에 잘 알려져 있어서 단백질 전구체의 설계는 숙련된 작업자에 의해 용이하게 이해되는 다수의 실시형태를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드에 포함되는 단백질은 뉴런 세포로 수송되고/되거나 뉴런 세포로 내재화되는 관심있는 임의의 단백질일 수 있다.
HC/TAB와 함께 폴리펩타이드 내에서 상기에 따른 HN을 포함하고, 단백질의 내재화가 필요한 경우, LC를 관심있는 단백질로 대체하는 것이 유리할 수 있다. 상기 HN이 상기 단백질을 뉴런 세포로 전위시키도록 하는 통로를 제공할 것이기 때문이다. 신경 세포 표면이 단백질의 표적이라면 관심있는 단백질을 HC/TAB에 직접 커플링하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 목표 전달에 따라 다음과 같은 조합을 얻을 수 있다:
i) 단백질 - HC/TAB
ii) 단백질 - HN-HC/TAB
iii) 단백질 - LC-HN-HC/TAB
상기 i)에 따라 카고 단백질을 HC/TAB에 커플링함으로써, 카고 단백질은 뉴런 표면으로 표적화될 수 있다. 일반적인 세포 표면 리사이클링 과정을 통해 일부 내재화가 발생할 수 있지만, 상기 뉴런 표면이 그러한 접근의 주요 대상이 될 수 있다.
상기 ii)에 따라 카고 단백질을 HC/TAB에 커플링된 HN에, 또는 상기 iii)에 따라 BoNT/TAB에 커플링함으로써, 상기 카고 단백질은 독소 전위(toxin translocation) 시스템을 사용하여 뉴런 내부에 보다 효과적으로 수송될 수 있다. 배경에서 설명된 바와 같이 일단 BoNT 독소가 소포의 뉴런 세포에 내재화되면, 소포의 산성 엔도솜 환경은 소포에서 세포의 사이토졸로 LC의 전위를 허용하는 입체 구조 변화를 일으킨다. 따라서, BoNT의 LC를 내재화된 소포에서 사이토졸로 전위시키기 위한 메커니즘인 상기 독소 전위 시스템은 BoNT/TAB를 사용하여 상기 언급된 카고 단백질을 뉴런 세포의 사이토졸로 전위시키기 위해 사용될 수 있다. 카고 단백질은 상기 개시된 바와 같이 카고 단백질과 HN 사이에 위치된 엑소프로테아제 부위와 함께 LC 대신 HN에 커플링될 수 있거나 카고 단백질이 LC에 커플링될 수 있다. 두 변이체 모두 카고 단백질을 뉴런 세포의 사이토졸로 수송할 수 있게 한다.
따라서, HC/TAB 및 BoNT/TAB 모두는 임의의 단백질을 뉴런으로 및/또는 뉴런 내로 운반하기 위한 비히클로서 사용될 수 있다. 이것은 또한 약리학적 시험에서 HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB를 사용하여 예를 들어 시냅스 과정에서 단백질의 역할을 조사할 가능성을 제공한다.
카고 단백질은 예를 들어 친화성 또는 형광성 태그 또는 프로브와 같은 임의의 단백질 태그일 수 있다. 따라서, 이러한 단백질 태그에 대한 임의의 상응하는 핵산이 상기 개시된 벡터에 포함될 수 있다. 당업자는 단백질 발현에 대한 표준 프로토콜뿐만 아니라 벡터에 관심있는 임의의 유전자를 포함시키기 위해 표준 클로닝 방법을 사용할 수 있을 것이다.
BoNT의 결합 도메인 및 카고 단백질은 번역 후 재조합을 가능하게 하는 소르 타제 시스템(sortase system)으로 개별적으로 발현될 수 있다. 따라서, 소르타제의 트랜스펩티다제 활성은 시험 관내에서 융합 단백질을 생산하기 위한 도구로서 사용될 수 있으며, 이 기술 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 요컨대, 인식 모티프(LPXTG)는 관심있는 단백질의 C-말단에 첨가되고 올리고-글리신 모티프는 결찰되는 제2 단백질의 N-말단에 첨가된다. 단백질 혼합물에 소르타제의 첨가 시, 2개의 펩타이드는 천연 펩타이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 이 방법은 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 경우에, 이는 인식 모티프가 관심 단백질의 C-말단에 첨가되고 올리고-글리신 모티프가 HC/TAB 또는 BoNT/TAB의 N-말단에 첨가됨을 의미할 것이다.
또한, HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB는 치료 방법 또는 미용 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로, HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB의 사용은 BoNT/A 및/또는 BoNT/B 산물에 이미 사용된 것과 매우 유사할 수 있다. 여기에는 상기 방법 및 치료의 목적이 근육을 약화 및/또는 비활성화하는 방법 및 치료가 포함된다.
본 발명에 따른 HC/TAB는 세포에 대해 더 높은 친화력을 갖는 BoNT/TAB의 주입을 가능하게 하고 결과적으로 더 높은 효율을 가능하게 한다. 따라서, 더 적은 용량이 필요하고 더 긴 작용 기간이 가능하다. 따라서, BoNT/A 또는 BoNT/B와 비교하여 더 적은 양의 BoNT/TAB가 동일한 효과를 위해 주입될 수 있으며, 이는 주사 부위로부터 BoNT/TAB가 퍼뜨리는 부작용을 적게 감소시킨다. 더 높은 효율, 더 강력하고 더 효율적인 결합 및 더 적은 용량이 요구됨에 따라, 주입 부위를 넘어 확산될 수 있는 여분의 BoNT/TAB가 적다. 또한, BoNT는 지속적인 효과로 덜 빈번하게 투여될 수 있으며, 그 결과 면역 반응 및 부작용의 위험을 최소화할 수 있다.
상기에 따라 HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB로 치료 및/또는 예방될 수 있는 전형적인 의학적 상태는 신경 근육 장애, 아세틸콜린의 방출을 포함하는 상태 및 경련 근육 장애(spastic muscle disorder)를 포함하는 군으로부터 선택된 장애이다. 좀더 구체적으로는 상기 장애는 연축발성장애, 연축사경, 후두근긴장이상증, 구강하악 근긴장이상증, 혀 근긴장이상증, 자궁 경부 긴장이상증, 국소 손 긴장이상증, 안검연축, 사시, 반얼굴연축, 안검장애, 뇌성마비, 국소 강직 및 기타 음성 장애, 연축대장염, 신경성방광, 항문경, 사지 경직, 틱증, 떨림, 이갈이, 항문 균열, 이완불능증, 연하곤란 및 기타 근긴장성 장애, 및 근육군의 불수의운동, 유루증, 다한증, 과도한 타액 분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 경련으로 인한 통증, 두통, 스포츠 상해 및 우울증을 특징으로 하는 기타 장애를 포함하는 군으로부터 선택된다.
미용 방법과 관련하여, HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB는 바람직하게는 주름, 고랑 및 라인을 감소시키기 위해 주름, 눈썹 고랑 또는 원치 않는 라인을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
상기에 따른 HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB는 임의의 적합한 약제학적 또는 화장품 조성물로 제제화될 수 있다. HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB를 포함하는 약제 학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 다른 첨가제를 더 포함할 수 있다. HC/TAB 및/또는 BoNT/TAB를 포함하는 화장료 조성물은 화장품용으로 허용되는 부형제, 담체 또는 다른 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
약학 또는 미용 조성물의 투여는 주사를 통해 이루어질 수 있으며, 여기서 주사는 원치 않는 뉴런 활성이 존재하는 신체 부위에 투여된다. 전형적으로, 주사 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위해 가용 화제 및 국소 마취제를 포함할 수 있다.
또한, 상기 약제학적 또는 화장품 조성물은 상기 조성물의 치료적 투여를 위한 지침과 함께 키트에 포함될 수 있다. 이러한 키트에서, 상기 조성물의 성분은 앰퓰과 같은 밀폐 용기 또는 활성제의 양을 나타내는 샤켓 내에서 예를 들어 동결건조된 분말 또는 물이 없는 농축물로서 단위용량으로 개별적으로 또는 서로 혼합되어 공급될 수 있다. 상기 조성물은 주사(infusion)에 의해 투여될 수 있고, 이 경우 멸균 의약품 등급수 또는 식염수를 함유하는 주사병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있다. 전신 투여용 조성물은 액체, 예를 들어 멸균 식염수, 락테이트 링거 또는 행크 용액일 수 있다. 또한, 조성물은 고체 형태일 수 있고 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결 건조된 형태가 또한 고려된다. 상기 조성물은 리포좀 또는 미세 결정과 같은 지질 입자 또는 소포 내에 함유될 수 있으며, 이것은 또한 비경구 투여에 적합하다.
따라서, 본 발명자들은 SV2C 수용체, 시냅토태그민 수용체 및 강글리오사이드 수용체의 3가지 모두에 동시에 결합하도록 설계된 조작 BoNT 바이오 하이브리드를 개발하였다. 이에 의해, 종래 기술의 BoNT 폴리펩타이드보다 더 높은 강도, 효능 및 지속 기간을 갖는 BoNT 바이오 하이브리드가 제공된다. 본 발명의 바이오 하이브리드의 사용은 동일한 효과를 유지하면서 종래 기술에 비해 더 적은 양의 독소의 투여를 가능하게한다. 또한, 본 바이오 하이브리드의 사용은 이전에 사용된 BoNT보다 덜 빈번한 투여를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 BoNT 바이오 하이브리드로 환자를 치료하는 것은 종래 기술에서처럼 투여를 자주 하지 않아도 된다는 점에서 더욱 편할 것이다.
실험 부분
재료 및 방법
작제물. HC 및 전장(비활성) TriRecABTox(각각 HC/TAB 및 BoNT/TAB)를 인코딩하는 cDNA를 대장균 발현(DNA 서열에 대한 보충 정보 참조)을 위해 코돈 최적화하고, 합성하여 N-말단 6 x His-태그(GenScript, 미국 뉴저지주 소재)를 갖는 pET-28a(+) 벡터에 클로닝하였다. 본 연구에 사용된 TriRecABTox 작제물은 촉매 부위에서 세 가지 돌연변이를 가지고 있어 안전성 우려를 피할 수 있다(E224Q/R363A/Y366F)(Rossetto et al, 2001; Binz et al, 2002). BoNT/TAB 유전자는 1311개의 아미노산을 암호화하고 HC/TAB 유전자는 잔기[875 내지 1311]에 상응한다.
단백질 발현 및 정제. 관심 유전자를 보유하는 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3)세포(New England BioLabs, 미국 소재)로 형질전환시켰다. 두 단백질 모두에 유사한 프로토콜이 사용되었다. 37℃에서 약 3시간 동안 50 ㎍/㎖의 카나마이신을 갖는 좋은 브로쓰 배지에서 세포를 성장시킴으로써 발현을 행한 다음, 1mM 최종 농도의 IPTG로 유도하고, LEX 시스템(Epyphite3, 캐나다 소재)에서 18℃에서 밤새 두었다. 세포를 수확하고 -80℃에서 보관하였다. 단백질 추출을 위해 세포 용해를 200mM NaCl, 25mM 이미다졸 및 5 %(v/v) 글리세롤과 함께 25mM HEPES pH 7.2에서 20kPsi에서 Emulsiflex-C3(Avestin, 독일 소재)로 행하였다. 세포 파편을 4℃, 267,000g에서 45분 동안 한외 원심분리를 통해 회전 침전시켰다. 단백질을 먼저 친화성 크로마토그래피로 정제하였다: 상청액을 5㎖ HisTrap FF 칼럼(GE Healthcare, 스웨덴 소재)에 로딩하고, 25mM HEPES pH 7.2, 200mM NaCl, 25mM 이미다졸 및 5 % (v/v) 글리세롤로 세척하고, 단백질을 25mM HEPES pH 7.2, 200mM NaCl, 250mM 이미다졸 및 5 %(v/v) 글리세롤로 용출하였다. 이어서, 유사한 완충액(GE Healthcare, 스웨덴 소재)에서 Superdex200 칼럼을 사용하여 최종 크기 배제 정제 단계 전에 샘플을 25mM HEPES pH 7.2, 200mM NaCl 및 5 %(v/v) 글리세롤에 대해 밤새 투석하였다. 200mM NaCl, 0.025mM TCEP 및 5% 글리세롤과 함께 25mM HEPES pH 7.2에서 HC/TAB를 4.5 ㎎/㎖로, BoNT/TAB를 7.3 ㎎/㎖로 유지하였다.
단백질 특성 규명. 단백질 샘플은 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔을 사용한 겔 전기 영동으로 분석하였고 PVDF 막(ThermoFisher, 스웨덴 소재) 상에서 웨스턴 블롯을 수행하였다. HC/A 및 HC/B에 대한 1 차 항체를 인하우스에서 준비하고(토끼에서 생성), 항 토끼 IgG-퍼옥시다제 항체(카탈로그 # SAB3700852, 스웨덴 시그마)로 프로빙하였다. 폴리히스티딘 태그는 HRP-접합된 단일 클론 항체(AD1.1.10, 카탈로그 # MA1-80218, ThermoFisher, 스웨덴 소재)를 사용하여 프로빙되었다. 검출에는 TMB 기질(Promega, 스웨덴 소재)이 사용되었다. HC/TAB와 유사하게 정제되고, His-태그된 HC/A 및 HC/B로 구성된 인하우스 대조군을 비교를 위해 포함시켰다.
BoNT/TAB의 활성화. 전장(비활성) TriRecABTox는 이중 쇄 형태로의 활성화를 위해 경쇄와 중쇄 사이에 Factor Xa 절단 부위(IEGR)가 있게 설계되었다. 100㎍의 BoNT/TAB를 2㎍의 Factor Xa(New England BioLabs, 미국 소재)와 함께 4℃에서 밤새 배양함으로써 활성화를 수행하였다. 활성화 결과는 겔 전기영동에 의해 분석되었다(상기 참조).
SV2C-L4의 클로닝, 발현 및 정제. 시냅스 소포 당단백질 2C(SV2C-L4, 잔기 474-567 Uniprot ID Q496J9)의 네 번째 루미날 도메인의 상호 작용 부분을 cDNA로부터 증폭시키고 LIC 클로닝을 사용하여 pNIC28-Bsa4(TEV 부위를 갖는 N-말단 His6 태그) 벡터로 클로닝 하였다. SV2CL4는 상기 기술된 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 E. coli BL21 (DE3)(New England BioLabs, 미국 소재)에서 발현되었다. His- 태그된 SV2C-L4를 2mL HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare, 스웨덴 소재)에서 친화성 크로마토 그래피로 정제하고, 20mM HEPES, pH 7.5, 500mM NaCl, 10 %(v/v) 글리세롤, 50mM 이미다졸 및 0.5mM TCEP로 세척하였다. 단백질은 20mM HEPES, pH 7.5, 500mM NaCl, 10 %(v/v) 글리세롤, 500mM 이미다졸 및 0.5mM TCEP로 용출되었다. 이어서 SV2CL4를 20mM HEPES, pH 7.5, 300mM NaCl, 10 %(v/v) 글리세롤 및 0.5mM TCEP에서 Superdex75 HiLoad 16/60 칼럼(GE Healthcare, 스웨덴 소재)을 사용하여 크기 배제에 의해 더 정제하였다.
X-선 결정학. 결정화를 위한 샘플은 실온에서 3.6 ㎎/㎖의 HC/TAB과 1 ㎎/㎖의 SV2C-L4(재조합 인간 SV2C 세포외 루프-4[잔기 475-565]), 1mM hSytI 펩타이드(GEGKEDAFSKLKEKFMNELHK, 미국 GenScript에 의해 합성됨) 및 4mM GD1a 올리고당(Elicityl, 프랑스)를 15분 동안 예비 배양하여 준비되었다.
시팅 드롭 셋업을 사용하여 20 % v/v 폴리에틸렌글리콜 6000, 0.1M 시트레이트 pH 5.0(JCSG-plus screen B9, Molecular Dimensions, 영국 소재)으로 구성된 100nℓ의 저장 용액과 혼합된 200nℓ의 샘플로 결정을 성장시켰고, 21℃에서 배양하였다. 결정은 2주 내에 나타났으며 동결 루프로 옮겨 액체 질소로 동결하였다.
PILATUS-6M 검출기(Dectris, 스위스 소재)가 장착된 Diamond Light Source(Didcot, 영국 소재)의 스테이션 I04-1에서 회절 데이터를 수집하였다. 1.5Å까지 완전한 데이터 세트를 100°K에서 단결정으로부터 수집하였다. 원시 데이터 이미지는 CCP4 suite 7.0(CCP4, 1994)을 사용하여 DIALS(Gildea et al, 2014) 및 AIMLESS(Evans, 2006)로 처리 및 스케일링되었다.
SV2C-L4(PDB 코드 4JRA)와의 복합체에서의 HC/A와 래트 SytII와 GD1a(PDB 코드 4KBB)와의 복합체에서의 HC/B의 좌표로부터 준비된 모델로 분자 대체를 수행하여 PHASER(McCoy et al., 2007)에서 구조 용액에 대한 초기 단계를 결정하였다. REFMAC5(Murshudov et al., 2011)를 사용하여 작업 모델을 수정하고 COOT(Emsley et al., 2010)로 수동으로 조정하였다. Fo-Fc 전자 밀도 피크가 3σ를 초과하는 위치에 물 분자를 첨가하여 잠재적인 수소 결합을 만들 수 있었다. 검증은 MOLPROBITY(Chen et al., 2010)로 수행되었다. Ramachandran 통계에 따르면 모든 잔기 중 97.0%가 가장 선호되는 구역에 있으며, 허용되지 않은 구역에 단일 특이점이 있다. 결정학적 데이터 통계는 표 1에 요약되어 있다. 도면은 PyMOL(Schrodinger, LLC, 미국 소재)로 작성하였다.
결과
TriRecABTox의 설계: 3개의 수용체 결합 부위가 있는 조작된 보툴리눔 독소.
3-수용체 독소의 개념을 구체화하기 위해, 본 발명자들은 먼저 BoNT/A 및 BoNT/B 분자 상호작용에 이용 가능한 구조 정보와 그들의 수용체를 분석하였다. 문헌[Yao et al. (2016) 및 Benoit et al. (2014)]의 최근 연구는 번역 후 변형이 있는(PDB 5JLV) 그리고 번역 후 변형이 없는(PDB 4JRA) SV2C와의 복합체에서 BoNT/A의 수용체-결합 도메인의 X-선 결정 구조를 제공했다. SV2C의 루미날 도메인(loop4)은 2개의 서브 도메인의 인터페이스에서 주로 열린 β-나선과 백본-백본 상호 작용을 통해 HC/A와 연관되는 사변형 β-나선을 형성하고 SV2C의 N-글리칸은 HCN 쪽으로 확장된다(도 1). 이들 구조는 함께 글리코실화된 SV2A 및 SV2B로 또한 확장되는 2개의 SV2 형태에 대한 공통 결합 모드를 입증하였다(Yao et al., 2016). 이 연구는 TriRecABTox의 설계에서 유지되어야 하는 독소-SV2 상호 작용에 관련된 핵심 잔기와 여러 부위를 강조했다(도 1). 이들은 BoNT/A의 세그먼트[949 내지 953], [1062 내지 1066], [1138 내지 1157] 및 [1287 내지 1296]을 포함했다. 잔기 번호는 BoNT/A1(Uniprot-P10845)의 순서를 기반으로 한다.
시냅토태그민과의 복합체에서 BoNT/B의 여러 결정 구조가 또한 기술되었고 독소와 그것의 수용체와의 상호 작용을 정의하는데 도움이 되었다(Chai et al., 2006; Jin et al., 2006; Berntsson et al., 2013)(도 1). 결합시에 Syt 펩타이드는 BoNT/B의 세그먼트[1113 내지 1118] 및 [1183 내지 1205]를 직접 포함하는 C-말단 서브 도메인의 원 위 팁의 홈을 따라 결합하는 짧은 나선형 구조를 취한다. 잔기 수는 BoNT/B1의 서열(Uniprot-P10844)을 기초로 한다. 따라서 이러한 구역은 TriRecABTox 구성에 포함되어야 하는 것으로 판단된다.
또한, 강글리오사이드 수용체(Stenmark et al., 2008; Hamark et al., 2017; Berntsson et al., 2013)와의 복합체에서 결정 구조 BoNT/A 및 BoNT/B는 각각의 혈청형에 대한 탄수화물 결합 부위에 대한 자세한 설명을 제공했다. 이 부위는 보툴리눔 신경독소 패밀리에서 고도로 보존되며 중앙 SxWY 모티프(/A의 1264 내지 1267; /B의 1260 내지 1263)와 주변 루프로 구성된 HCC 서브 도메인(도 1)의 얕은 포켓으로 구성된다. 이 포켓은 BoNT/B의 Syt 수용체 결합 부위에 인접하여 루프[1244 내지 1253]로 분리되어 있지만, 두 수용체의 동시 결합시 알로스테릭 효과는 보고되지 않았다(Bertnsson et al., 2013). Syt 수용체 결합 부위에 대한 임의의 구조적 변경을 최소화하기 위해, TriRecABTox의 설계에서 BoNT/A보다는 BoNT/B의 강글리오사이드 수용체 결합 부위를 포함시키는 것이 더 적합하다고 여겨졌다.
3개의 상이한 수용체에 결합하기 위해 필수적인 2개의 혈청형으로부터 성분을 확인한 후, 이들을 단일 분자에 통합시키기 위해 추가의 구조 분석을 수행하였다. 이 정도로 BoNT/A(Uniprot P10845)와 BoNT/B(Uniprot P10844)의 1 차 서열이 ClustalO(Sievers et al., 2011)와 정렬되었으며 그들의 결합 도메인의 3 차원 구조가 중첩되었다(도 1). 두 혈청형은 40 %의 전체 서열 동일성을 공유하지만, 수용체 인식을 담당하는 주요 영역인 HC의 C-말단 서브 도메인에 대한 유사성은 34 %로 떨어진다. 결합 도메인의 핵심 접힘은 모든 클로스트리듐 신경독에 걸쳐 보존되지만(Swaminathan, 2011; Rummel et al., 2011), 연결 루프의 길이는 눈에 띄게 변화한다. 따라서 도메인의 기본 아키텍처를 그대로 유지하려면 2차 구조(도 1)도 고려하는 것이 중요하다. 결과적으로 새로 설계된 분자의 템플릿은 BoNT/A와 BoNT/B 요소 사이에 여러 번 교대로 나타나서 호환되지 않을 수 있는 새로운 비천연 분자내 인터페이스를 만든다. HC/A 및 HC/B의 중첩된 결정 구조를 검사함으로써, 본 발명자들은 단일 아미노 치환 또는 주요 위치에서의 결실에 의한 잠재적 충돌을 바로잡음으로써 설계를 최적화할 수 있었다(도 2). 특히, 충돌 영역 내의 모든 잔기의 측쇄를 검토하여 BoNT/B로부터 동등한 BoNT/A 아미노산으로의 3개의 치환, 즉, N1180, G1234, N1236(서열번호 3)을 야기하였다. 또한, 2차 구조 요소를 맞추고 전이 인터페이스의 루프 영역에서 BoNT/A와 BoNT/B 사이의 길이 변화를 보상하기 위해 여러 아미노산이 제거되었다(도 2). BoNT/A 및 BoNT/B 서열과 비교하여(도 2), L1139와 G1140, 및 G1234와 T1235 사이에서 삭제가 이루어졌다(서열번호 3 참조).
TriRecABTox로 칭해진 결과적인 분자는 SV2, 시냅토태그민 및 강글리오사이드의 세 가지 수용체에 결합할 수 있다. 이의 단백질 서열은 서열번호 3(비활성 형태) 및 서열번호 5(활성 형태)로 제공된다.
TriRecABTox 결합 도메인의 제작 및 특성 규명.
TriRecABTox의 특성 규명을 향한 첫 번째 단계는 그 생화학적 특성을 분석하기 위해 결합 도메인(HC/TAB)을 재조합적으로 생성하는 것이었다. 이를 위해, 단백질 서열을 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화시켰다. 상기 생성된 유전자를 pET-28a(+) 벡터에 클로닝하여 N-말단 폴리-히스티딘 태그를 포함시켜 단백질 정제 공정을 용이하게 하였으며, 세부 사항은 방법 섹션에 제공된다. 본 발명자들은 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 기술(도 11)을 사용하여 HC/TAB가 발현되고 부분적으로 정제될 수 있음을 보여주었다(도 3). 원래의 샘플은 잔류 숙주 세포 단백질에 해당할 수 있는 저 분자량 오염물을 제공하였다. 이온 교환 또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하는 추가 정제 단계는 고순도의 시료를 얻는 데 도움이 된다. His-태그된 HC/TAB의 존재는 예상된 크기(약 53kDa)의 단일 밴드가 관찰되는 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다(도 3).
3개의 수용체와의 복합체에서 TriRecABTox 결합 도메인의 결정 구조.
3개의 수용체에 결합하는 HC/TAB의 능력을 평가하기 위한 노력으로, 인간 SV2C 루미날 도메인[잔기 475 내지 565], 인간 Syt1 펩타이드[잔기 34 내지 53] 및 GD1a 탄수화물과 HC/TAB를 포함하는 공 결정화(co-crystallization) 시험이 설정되었다. 고해상도로(1.5Å) 회절된 결정이 얻어졌으며(도 12), 완전한 데이터 세트가 수집될 수 있었다(표 1). 상기 구조는 모든 잠재적 성분을 가진 입력 모델을 사용한 분자 대체에 의해 해상되었다. 상기 해상은 그 결정 구조에 4가지 모든 요소: 3개의 수용체에 동시에 결합된 HC/TAB(HC/TAB-3R이라고 칭함)가 포함되어 있음을 확인하여 주었다(도 4). 이 결과는 TriRecABTox가 시험관 내에서 그 목적을 달성할 수 있고 원자적 디테일에서 수용체 결합 메커니즘의 완전한 분석을 가능하게 한 첫 번째 실험 증거를 제공한다. 새로 결정된 구조 정보를 사용하여 HC/TAB, HC/A, HC/B 및 이들 각각의 수용체 간의 상호 작용을 직접적으로 비교할 수 있다.
첫째, 새로 설계된 BoNT/TAB의 결합 도메인은 두 서브 도메인인 렉틴-유사 HCN과 HCC의 β-트레포일(trefoil) 접힘으로 예상되는 폴드를 나타낸다(도 4). 생성된 다수의 새로운 분자 내 계면은 HC/A로 중첩되었을 때 0.69Å(364 Cα 이상)의 낮은 근 평균 제곱 편차(rmsd) 및 HC/B로 중첩되었을 때 0.81Å(370 Cα 이상)의 낮은 근 평균 제곱 편차에서 보여지는 바와 같이 전체 구조를 교란시키지 않았다. 장애가 발생한 N-말단 폴리-히스티딘 태그 및 루프[1169 내지 1173]을 제외하고 완전한 HC/TAB를 모델링하였다[876 내지 1311]. 이들 부분에 대한 전자 밀도의 부족은 이들 영역이 어떠한 상호 작용에도 관여하지 않고 결정의 용매-접근 가능한 영역 내에 위치한다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
HC/TAB-3R 구조는 SV2C와의 복합체에서의 HC/A의 구조와 비교되었다. SV2C 루미날 도메인의 구조는 rmsd 0.483Å(88 Cα 이상)로 두 복합체에서 동일하다. 두 구조는 HC 도메인을 기준으로 3 차원으로 정렬되었으며 SV2C가 발명자의 설계로부터 예상한 것과 같은 위치에 있음을 보여주었다(도 5). 특히, SV2 수용체 결합에 필요한 것으로 지정되고 HC/TAB에 포함된 HC/A 유래 영역은 완전히 보존된다. HC/A와 SV2C 사이의 계면은 PISA(Kissinel, 2015)로 분석되었으며, 상기 계면은 두 단백질로부터의 열린 나선이 상보적인 β-시트 구조를 형성하는 대부분의 정전기 상호 작용과 관계되는 540 A2의 표면적에 상응한다(Benoit et al., 2014). HC/TAB를 이용한 상응하는 분석은 SV2C가 630A2인 표면적을 나타내고 유사한 수의 수소 결합을 갖는 결합 메커니즘을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 HC/TAB-3R을 HC/A-gSV2C 복합체와 비교함으로써 글리코실화된 SV2에 대한 잠재적 결합을 고려하였다(도 5). N559의 N-글리코실화는 최근 수용체 인식에 필수적인 것으로 나타났으며 SV2 이소 형태에 걸쳐 보존된다(Yao et al., 2016). 명백하게, HC/A와 SV2C 사이의 단백질-단백질 상호 작용은 글리코실화의 유무에 관계없이 매우 유사하다. 탄수화물 사슬은 HCN 서브 도메인을 향해 연장된다. 단백질-글리칸 상호 작용에 관여하는 HC/A 잔기의 분석은 이들의 위치가 HC/TAB-3R에서 완전히 보존되어 HC/TAB가 SV2의 N-글리코실화된 이소 형태를 인식할 수 있을 것임을 보여준다.
이어서, 본 발명자들은 HC/TAB-3R 구조를 rSyt2와의 복합체에서의 HC/B의 구조와 비교하였다. BoNT/B는 다양한 친화력이 있지만 이의 설치류 호몰로그와 유사한 방식으로 인간 시냅토태그민에 결합할 것으로 예상된다(Tao et al., 2017). 여기에 제시된 결정 구조에서, hSyt1은 HC/B의 rSyt2와 동일한 바인딩 그루브 내에 있는 α-나선 배열을 취한다(도 6). rSyt1과 각각의 HC 도메인에 결합된 hSyt2와의 중첩은 0.560Å의 rmsd(13 Cα 초과)로 보존된 펩타이드 배열을 확인시켜 준다. 또한 수용체 결합 포켓은 HC/TAB에서 완전히 보존되며 결합에 포함된 모든 잔기가 두 구조에서 유사한 구성을 나타낸다(도 6). 이는 PISA 분석으로 11개의 정전기적 결합을 또한 포함하는 HC/TAB:hSyt1 상호 작용에 대해 861Å2의 인터페이스가 계산되었고, 이것은 7개의 정전기적 결합을 갖는 712Å2 HC/B: rSyt2 인터페이스(PDB 4KBB)와 비슷하다. 인식 메커니즘은 주로 강력한 단백질-단백질 소수성 상호 작용에 기반한다. 접촉 표면적의 작은 차이 및 정전기적 상호 작용의 수는 hSyt1과 rSyt2 사이, 특히 펩타이드의 C-말단 절반에 대한 서열 변화에 의해 설명될 수 있다.
HC/TAB-3R 구조에 포함된 세 번째 수용체는 GD1a 탄수화물에 해당하며, 이를 위해 Gal2에서 Sia5까지 분명한 전자 밀도가 관찰되었다(도 4). 상호 작용하지 않는 유연한 탄수화물 모이어티로부터 예상될 수 있는 바와 같이, Glc1 및 Sia6에 대한 전자 밀도는 보이지 않았다. 강글리오사이드-수용체 결합 부위는 상세하게 연구되었으며, GD1a와의 복합체에서 HC/B의 결정 구조는 말단 Sia(α2-3)Gal 모이어티에 대한 이 혈청형의 선호를 확인하였다(Bertnsson et al., 2013; Rummel, 2016). TriRecABTox는 HC/B 결합 포켓을 통합하도록 설계되었으며, 두 구조의 비교(도 7)는 결합 포켓의 주요 잔기(S1260, W1262, Y1263)가 완전히 보존되고, 본연의 독소에 따라 GD1a와 상호 작용함을 보여준다. 눈에 띄는 예외가 거의 없이, GD1a-결합 HC/B와 비교할 때 대부분의 결합 부위는 변화가 없다. HC/TAB-3R에서, N1122의 측쇄는 리간드로부터 멀리 떨어져 있는 반면, 그의 HC/B 동등체인 N1105는 Sia5와 직접 수소 결합을 만든다. 이것은 HC/B:GD1a 구조(이들은 7Å 떨어짐)에서 I1240과 비교하여 HC/TAB-3R에서 Sia5와 더 강한 소수성 상호 작용(4.3Å 거리)을 나타내는 I1257의 위치에 의해 다소 보상된다.
HC/TAB-3R 결정 구조로부터 얻은 전체적인 결과는 단일 TriRecABTox 분자가, 부모 BoNT/A 및 BoNT/B의 결합 메커니즘을 복제하는 방식으로 SV2 수용체, 시냅토태그민 수용체 및 이의 강글리오사이드 수용체에 동시에 결합할 수 있음을 확인시켜 준다.
전장 비활성 TriRecABTox의 생산 및 특성 규명.
HC/TAB의 결합능을 확립한 후, 본 발명자들은 전장의 촉매적으로 불활성인 TriRecABTox(BoNT/TAB; 서열번호 3)를 발현시키고 정제하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 1311 아미노산을 인코딩하고, HC/TAB와 관련된 BoNT/A 도메인에 상응하는, LC 및 HN을 갖는 3개의 BoNT 기능성 도메인을 함유하는 합성 유전자를 설계하였다. 안전성 고려를 위해 촉매 부위에서 3개의 돌연변이가 포함되었다(E224Q/R363A/Y366F)(Rossetto et al, 2001; Binz et al, 2002). 상기 기재된 HC/TAB 작제물에 따라, 단백질 서열을 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화하고, N-말단 폴리-히스티딘 태그가 있는 pET-28a(+)에 클로닝하였다. 자세한 내용은 방법 항목에 제공된다. 본 발명자들은 BoNT/TAB가 대략 152 kDa의 가용성 단백질로서 발현될 수 있음을 보여주었다. 정제에 사용된 초기 방법은 제한된 양의 비균질 물질을 생성했지만(도 8, 도 13), 이온 교환 또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 추가로 정제하면 더 순수한 물질을 얻을 수 있고 겔 전기 영동에 의해 가시적인 잔류 숙주 세포 단백질을 제거할 수 있다. 이러한 방법은 최근에 80% 이상의 순도를 갖는 재조합 BoNT/B 작제물을 생성하는데 사용되었다(Elliot et al., 2017).
추가 특성 규명을 수행하고 히스티딘-태그의 존재를 확인하였고, 프로빙 항체와의 반응이 대조군과 비교하여 매우 약했지만(도 8b), 희미한 밴드가 적절한 크기로 식별될 수 있었다. 상기 분석은 또한 대략 70 kDa의 오염물과의 교차 반응을 보여주었다. 나아가, BoNT/TAB는 예상대로 HC /A(도 8c) 및 HC/B(도 8c)에 대해 초래된 인하우스 항-혈청과 결정적으로 반응하였는데, 이는 두 결합 도메인으로부터의 에피토프를 함유할 것이기 때문이다.
TriRecABTox 활성화 제어.
BoNT/TAB는 경쇄와 중쇄 사이에 인자 Xa 절단 부위, IEGR[442-445]가 존재하도록 설계되었으며(도 9a), 이는 이중 쇄 형태로의 활성화가 완전 활성 독소를 얻기 위해 필요하기 때문이다. 상기 기재된 전장 BoNT/TAB 샘플(서열번호 5)을 사용하여 활성화 분석을 수행하였다. 샘플의 이질성에도 불구하고, 인자 Xa와 BoNT/TAB를 1㎍의 프로테아제 대 50㎍의 독소의 비율로 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 완전 활성화를 달성하였다(도 9b). 겔 전기영동이 환원제 존재 하에서 실행될 때 BoNT/TAB가 대략 100 및 50 kDa의 2개의 단편으로 분리된 것으로 나타났는데, 이는 각각 HC 및 LC에 해당할 가능성이 높다. 이 두 체인은 C430과 C458 사이의 이황화 브리지에 의해 함께 유지되며 비 환원 상태에서 약 150kDa의 단일 밴드를 설명한다. 비환원 샘플에서 HC 및 LC에 상응하는 밴드도 볼 수 있었는데, 이는 샘플 제조 동안 이황화 브릿지의 어느 정도 환원에 의해 야기되었을 수 있지만, 이들 밴드는 활성화되지 않은 대조군에서는 명백히 보이지 않았다.
전체적으로 상기 활성화 분석은 우선, 생산된 단백질이 조작된 BoNT/TAB에 상응하고, 둘째로 이중 쇄 분자로의 활성화 단계가 성공적으로 관리될 수 있다는 증거를 제공하였다. 따라서, 이러한 단계는 활성 전장 TriRecABTox의 생산에 포함될 수 있다.
BoNT/TAB의 최적화
재료 및 방법
작제물. HC/TAB를 코딩하는 cDNA 및 변이체는 전술한 바와 같이 GenScript (NJ, 미국 소재)에 의한 pET28(a) 벡터에 클로닝하였다. BoNT/TAB2.1.3을 Toxogen GmbH(독일 하노버 소재)에 의한 pET29(a) 벡터에 클로닝하였다.
단백질 발현 및 정제. HC/TAB 변형에 대해 이전에 설명한 바와 같이, BoNT/TAB2.1.3은 HC/TAB에 사용된 것과 유사한 프로토콜(친화성 크로마토그래피 및 겔 여과)로 Toxogen GmbH(독일 하노버 소재)에 의해 제조되었다. 또한, BoNT/TAB2.1.3의 활성화 및 태그 제거를 트롬빈으로 0.05 U/㎍의 농도에서 수행하고, 겔 여과에 의해 BoNT/TAB2.1.3을 추가로 정제하였다. 샘플을 200mM NaCl 및 5% 글리세롤이 존재하는 25mM HEPES pH 7.2에 저장하였다.
단백질 특성 규명. 전술한 바와 같음(NuPAGE 4-12% 비스-트리스 겔을 사용한 겔 전기영동).
X-선 결정학. 결정화를 위한 샘플은 실온에서 15분 동안 6.5 ㎎/㎖ Hc/TAB 2.1를 1㎎/㎖ SV2C-L4(재조합 인간 SV2C 세포외 루프-4[잔기 475 내지 565]), 1mM hSytI 펩타이드(GEGKEDAFSKLKEKFMNELHK, GenScript(미국 소재)에 의해 합성됨) 및 4mM GD1a 올리고당(Elicityl, 프랑스 소재)과 예비 배양하여 준비하였다. 시팅 드롭 셋업을 사용하여 20 % v/v 폴리에틸렌글리콜 3350, 0.2M 시트르산 칼륨(JCSG-plus screen B12, Molecular Dimensions, 영국 소재)으로 구성된 100nℓ의 저장 용액과 혼합된 200nℓ의 샘플로 결정을 성장시켰고 21℃에서 배양하였다. 결정은 1주일 이내에 나타났으며 동결 루프로 옮겨 액체 질소로 동결되었다. PILATUS-6M 검출기(Dectris, 스위스 소재)가 장착된 다이아몬드 광원(영국 디드콧 소재)의 스테이션 I04에서 회절 데이터를 수집하였다. 100˚K에서 단결정으로부터 1.4Å까지의 완전한 데이터 세트를 수집하였다. 원시 데이터 이미지는 CCP4 suite 7.0(CCP4, 1994)을 사용하여 DIALS(Gildea et al, 2014) 및 AIMLESS(Evans, 2006)로 처리 및 스케일링되었다.
PHASER에서 이전에 결정된 HC/TAB의 구조에 분자 치환을 수행하였다(McCoy et al., 2007). REFMAC5(Murshudov et al., 2011)를 사용하여 작업 모델을 수정하고 COOT(Emsley et al., 2010)로 수동으로 조정하였다. Fo-Fc 전자 밀도 피크가 3σ를 초과하는 위치에 물 분자를 첨가하여 잠재적인 수소 결합을 만들 수 있었다. 검증은 MOLPROBITY(Chen et al., 2010)로 수행되었다. Ramachandran 통계에 따르면 모든 잔기 중 97.0%가 가장 선호되는 구역에 있으며, 허용되지 않은 구역에 단일 특이점이 있다. 결정학적 데이터 통계는 표 X1에 요약되어 있다.
최적화된 H
C
/TAB, H
C
/TAB 2.1 생산
3개의 수용체에 결합된 HC/TAB의 결정 구조를 분석하여 분자의 안정성 및 기능을 개선하기 위해 변형될 수 있는 잠재적 부위를 확인하였다.
특히, 결정 구조 내의 국소 온도 인자(B-factor)의 분석은 높은 B 인자는 무질서한 영역을 암시하여 단백질의 국소 안정성의 지표로 해석될 수 있다. 이 분석으로부터, 잔기 D357 내지 N362(서열번호 6)로 구성되는, HC/TAB의 두 서브 도메인 사이의 계면에 있는 루프, 표지된 'loop 360'이 최적화를 위해 고려되었다(도 14 참조). 잔기 G360 및 N362(서열번호 1)를 BoNT/B의 동등한 잔기로 변형시키고 각각 P360 및 Y362로 돌연변이시켜 HC/TAB2.1(서열번호 6)로 표지된 새로운 작제물의 서열에 통합시켰다.
이 새로운 작제물에 대한 플라스미드는 부위-지정 돌연변이유발(GenScript, 미국 소재)에 의해 제조되었고 대장균에서 HC/TAB2.1의 재조합 발현에 사용되었다. 사용된 프로토콜은 HC/TAB의 생산에서와 동일했다(발현 및 정제에 대한 원래의 방법 항목 참조). 우리는 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 기술을 사용하여 HC/TAB2.1이 발현되고 부분적으로 정제될 수 있음을 보여주었다(도 15). 샘플은 잔류 숙주 세포 단백질에 해당하는 저분자량 오염물을 제공하였다. 이온 교환 또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하는 추가 정제 단계는 더 높은 순도의 시료를 얻는데 도움이 된다.
정제된 HC/TAB2.1(서열번호 6)을 인간 SV2C 루미날 도메인[잔기 475 내지 565], 인간 Syt1 펩타이드[잔기 34 내지 53] 및 GD1a 탄수화물과의 공 결정화 시험에 사용하였다. 고해상도로(1.4Å) 회절된 결정이 얻어졌으며, 완전한 데이터 세트가 수집될 수 있었다(표 2). 상기 구조는 3개의 수용체(HC/TAB-3R)에 결합된 HC/TAB의 결정 구조를 사용하여 분자 대체에 의해 해상되었다. 새로운 구조는 HC/TAB-3R에서 이미 보이는 모든 요소를 제시하고 HC/TAB2.1이 HC/TAB에 따라 3개의 수용체에 동시에 결합할 수 있다는 실험적 증거를 제공하였다. B-인자에 대한 분석 결과 루프 '360'(D357 내지 Y362; 도 14)에 대한 안정성이 개선된 것으로 나타났다. 전반적으로, HC/TAB2.1의 거동은 HC/TAB의 거동과 유사하였고, 두 구조는 수율 및 순도 면에서 유사한 프로파일을 보여주었다.
표 X1. X-선 결정학: 데이타 수집 및 리파인먼트 통계
더 가용성인 H
C
/TAB2.1.3의 생산
HC/TAB 변이체의 향후 기능 분석을 준비하기 위하여, HC/TAB2.1은 최근에 기술된 소르타제 결찰 실험과 호환되도록 조정되었다(Zhang et al, 2017). 이 실험은 활성을 테스트하는데 사용할 수 있는 전장 활성 BoNT의 안전하고 제어된 재구성을 가능하게 한다. 이 작제물은 절단 가능한 N-말단 His-태그가 있는 N-말단 절단된 HC/TAB2.1에 상응하고, HC/TAB2.1.1(서열번호 8)로 표시되었다. HC/TAB2.1.1에 대한 클론을 제조하고(GenScript), 전술한 바와 같이 발현 및 정제에 사용하였다(도 16). 본 발명자들은 HC/TAB2.1.1이 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 기술을 사용하여 발현되고 부분적으로 정제될 수 있음을 보여주었다. 샘플은 잔류 숙주 세포 단백질에 해당하는 저 분자량 오염물을 제공하였다. 이온 교환 또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하는 추가 정제 단계는 더 높은 순도의 시료를 얻는데 도움이 된다.
HC/TAB2.1의 구조적 특징의 추가 분석은 상기 단백질의 잔부로부터 돌출된 표면 노출된 소수성 루프의 존재를 강조하였다(잔기 389 내지 393, 서열번호 6, 도 14d). 또한, 이 루프는 최근 BoNT/B 및 기타 혈청형에서 지질 결합 요소로 확인되었다(Stern et al, 2018). 우리는 이 소수성 영역이 HC/TAB의 용해도를 방해할 수 있다는 가설을 세웠으므로, 용해도를 향상시키기 위해 이 루프가 절단되고, 이중 아스파라긴 모티프로 대체된 새로운 구조를 설계하였다. 이 작제물은 HC/TAB2.1.3(서열번호 10)으로 표시되었다. HC/TAB2.1.3에 대한 클론을 제조하고(GenScript), 전술한 바와 같이 발현 및 정제에 사용하였다(도 16). 우리는 HC/TAB2.1.3이 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 기술을 사용하여 발현되고 부분적으로 정제될 수 있음을 보여주었다. 상기 샘플은 잔류 숙주 세포 단백질에 해당할 것 같은 저분자량 오염물을 제공하였다. 이온 교환 또는 소수성 상호 작용 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하는 추가 정제 단계는 더 높은 순도의 시료를 얻는데 도움이 된다. 현저하게, HC/TAB2.1.3은 HC/TAB2.1.1에 비해 더 우수한 발현 수율 및 용해도를 나타냈다(도 16).
전장 활성 BoNT/TAB2.1.3 생산
BoNT/TAB의 향후 기능 분석을 준비하기 위하여, HC/TAB2.1.3 작제물에 기초한 전장 활성 변이체가 생성되었고 BoNT/TAB2.1.3(서열번호 12)로 표시되었다. 모든 생산 단계는 계약에 따라 Toxogen GmbH(독일 하노버 소재)의 허가된 시설에서 수행되었다. BoNT/TAB2.1.3을 pET29(a) 벡터에 클로닝하고, 절단 가능한 C-말단 스트렙- 및 폴리-히스티딘 태그, 및 이전에 설명된 대로 산물을 활성화하기 위해 HC와 LC 도메인 사이의 조작된 트롬빈 절단 부위(서열번호 13)를 포함시켰다. BoNT/TAB2.1.3은 가용성 단백질로 발현될 수 있으며, 정제되고 트롬빈으로 활성화될 수 있었다(도 17). 정제에 사용된 방법은 친화성 크로마토 그래피 및 겔 여과를 포함하였고, 90% 초과의 순도를 갖는 BoNT/TAB2.1.3 생성물을 야기하였다.
향후의 실험
수용체 결합 에세이
BoNT/TAB의 수용체-결합 특성이 BoNT/A 및/또는 BoNT/B와 비교되는 분석이 수행될 것이다.
예를 들어, 이전에 기재된 방법으로부터 구성된 강글리오사이드 수용체-결합 분석이 수행될 것이다. 간단히 말해서, 이 ELISA에서 관심 강글리오사이드 수용체(GT1b, GD1b, GD1a 또는 GM1a)를 96 웰 마이크로 플레이트에 고정하고(Chen et al., 2008; Willjes et al., 2013), 이어서 독소(또는 이들의 결합 도메인)를 적용하고, 결합된 물질을 말 무 과산화효소(HRP)에 접합된 단일 클론 항 폴리-히스티딘 항체로 프로빙한다. 이 정성적 접근법은 BoNT/TAB의 강글리오사이드 수용체-결합 특성이 BoNT/B의 것과 유사하다는 것을 확인하기에 충분한 정보를 제공할 것이다.
강글리오사이드 수용체 결합 ELISA. 강글리오사이드 GT1b, GD1b, GD1a 및 GM1a는 Carbosynth(영국 콤튼 소재)에서 구입한다. 강글리오사이드는 2.5 ㎍/㎖의 최종 농도에 도달하기 위해 메탄올에 희석되고 100㎕(0.25㎍)를 96-웰 PVC 분석 플레이트의 각 웰에 적용한다. 21℃에서 (밤새) 용매를 증발시킨 후, 웰을 200㎕의 PBS/0.1 %(w/v) BSA로 세척한다(3×). 비특이적 결합 부위는 200㎕의 PBS/2 %(w/v) BSA에서 21℃에서 2시간 동안 배양함으로써 차단된다. 결합 분석은 샘플을 함유하는 4℃에서 2시간 동안 웰당 100㎕의 PBS/0.1 %(w/v) BSA에서 수행된다(6μM 내지 0.003μM 범위로 연속 3배 희석). 인큐베이션 후, 웰을 PBS/0.1 %(w/v) BSA로 3회 세척한 다음, 1시간 동안 4℃에서 1:2000 희석(100㎕/웰)으로 HRP-항-His 항체(ThermoFisher # MA1-80218)와 인큐베이션한다. 마지막으로, PBS/0.1 %(w/v) BSA로 세 번의 세척 단계 후에, 결합된 샘플은 Ultra TMB(100㎕/웰)를 사용하여 검출된다. 상기 반응은 100㎕의 1M 황산을 첨가하여 21℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후 종결된다. 450㎚에서의 흡광도는 Tecan Infinite 200(Mannedorf, Switzerland)으로 측정된다. 비선형 결합 피팅을 사용하여 Prism(GraphPad, 미국 캘리포니아주 라호이아 소재)으로 결과를 분석한다.
시냅토태그민 수용체에 대한 결합 특성을 평가하기 위해, 등온 적정 열량 측정법(Isothermal titration calorimetry: ITC)이 문헌[Berntsson et al. (2013)]에 기술된 분석법과 유사하게 수행될 것이다. 독소에 대한 hSyt 펩타이드의 결합이 측정될 것이고 BoNT/TAB가 BoNT/B와 유사하게 수용체에 결합할 수 있음을 확인하는 친화도 값(Kd)을 제공할 것이다.
등온 적정 열량 측정법. 샘플은 20mM 포타슘 포스페이트 pH 7.0, 0.15M NaCl 중 추가 크기 배제 크로마토그래피 단계(Superdex200, GE Healthcare, 스웨덴 소재)에 의해 제조된다. BoNT 또는 이들의 결합 도메인에 대한 Syt 펩타이드의 연합은 ITC200(GE Healthcare, 스웨덴 소재) 상에서 25℃ 및 750 rpm에서 측정된다. 200㎕의 단백질 용액(20μM)을 세포에 첨가한다. 결합은 200μM의 농도에서 각각 2.5㎕의 16개의 단계별 주입으로 펩타이드(GenScript, 미국 소재)를 첨가할 때 측정된다. 첫 번째 적정은 0.5㎕로 설정되고 이후 데이터 분석에서 삭제된다. 제조업체에서 제공한 Origin 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.
SV2C에 대한 결합은 문헌[Benoit et al. (2014)]에 의해 기술된 것과 같은 풀다운 분석을 사용하여 평가될 것이다. 간단히 말하면, 태그된 독소 및 태그되지 않은 수용체(또는 반대로)는 함께 배양되고 Ni-세파로스에 로딩된 후 세척 및 용출될 것이다. 결과는 SDS-PAGE로 보여질 것이다.
DAS(Digit Abduction Score) 분석
마우스 DAS 분석을 이용하여 BoNT 제조의 효능을 평가할 수 있다(Broide et al., 2013). 이 분석은 마우스 또는 래트 뒷다리 골격근에 근육 내 주사 후 독소의 국소 근육 약화 효능을 생체 내에서 측정한다. 독소는 특징적인 뒷다리 깜짝 반응을 생성하는 동물의 능력에서 측정 가능한 용량 의존적 감소를 유도한다. 이 치명적이지 않은 방법은 최근에 기술된 재조합 BoNT/B 분자(Elliot et al., 2017)와 같은 다른 BoNT 혈청형 또는 유도체의 약리학적 특성을 평가하기 위해 보통 사용되어 왔다. BoNT/A 또는 BoNT/B와 비교하여 BoNT/TAB의 효능 및 지속 영향을 평가하기 위해 유사한 방법이 사용될 것이다.
논의
이 연구에서, 본 발명자들은 BoNT/A 및 BoNT/B의 결합 메커니즘의 구조적 및 분자적 세부 사항이 향상된 세포 인식 능력을 갖는 새로운 분자 TriRecABTox를 조작하기 위해 어떻게 사용되었는지를 설명하였다. BoNT/A 및 BoNT/B 구조의 엄격한 다차원 비교는 본 발명자들이 단일 분자에서 SV2, 시냅토태그민 및 강글리오사이드에 대한 수용체 결합 부위를 통합하기 위해 온전한 독소 스캐폴드를 유지하는데 필요한 주요 요소를 식별할 수 있게 하였다. BoNT/A 및 BoNT/B 요소가 교대로 구성된 새로 작성된 설계는 새로 작성된 비 천연 분자 내 인터페이스를 보상하기 위해 적응 돌연변이 또는 결실을 포함함으로써 최적화되었다. 이러한 변형은 조작된 독소, BoNT/TAB가 올바른 구조 및 필요한 활성을 갖는 가용성 단백질로서 생성될 수 있도록 보장하는데 필요한 것으로 생각되었다.
본 발명자들은 먼저 대장균에서의 재조합 발현을 통해 변형된 수용체 인식 기능을 보유하는 자체 HC/TAB에 결합 도메인을 생성함으로써 디자인의 안정성을 평가하였다. HC/TAB는 부분적으로 정제될 수 있는 가용성 단백질로서 N-말단 폴리 히스티딘 태그를 사용하여 발현되어, 조작된 작제물의 생존성을 입증하였다. 두 번째 단계에서, 본 발명자들은 촉매적으로 비활성 형태인 전장 BoNT/TAB 구조물의 생산을 진행하였다. 다시, 본 발명자들은 이것이 153 kDa의 가용성 단백질로서 발현될 수 있고 표준 액체 크로마토그래피 기술로 부분적으로 정제될 수 있음을 보여주었다. HC/TAB 및 BoNT/TAB 모두에 폴리 히스티딘 태그가 존재하여 Ni-세파로스 매트릭스를 갖는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있었다. 다른 친화성 방법이 사용될 수 있으며 수용체 결합과의 간섭을 방지하기 위해 단백질의 N-말단에 우선적으로 위치해야 하는 친화성 태그를 포함할 수 있다. 초기 제조는 이질적인 샘플 순도를 보여주었지만, 정제 공정의 최적화는 약제학적 표준의 생성물로 이어질 것이다. 활성 형태의 BoNT/TAB는 본 연구에 사용된 비활성 분자와 유사한 전체 구조 및 결합 특성을 가질 것임이 추가되어야 한다. 본 발명자들은 수용체 결합을 방해하지 않도록 제거 가능한 C-말단 태그로 성공적으로 정제된 활성 버전의 BoNT/TAB(BoNT/TAB2.1.3)를 생산하기 위해 Toxogen GmbH(독일 하노버 소재)와 계약하였다.
또한, 단일 쇄 BoNT의 이중 쇄 분자로의 번역 후 절단은 독소의 활동에 필수적인 단계이다(DasGupta and Sathyamoorthy, 1985; Shone et al, 1985). 천연 독소는 일반적으로 숙주 프로테아제에 의해 활성화되지만, 모든 재조합 BoNT 생성물은 엑소 펩티다제로 처리될 필요가 있다. 독소에 대한 초기 연구는 트립신이 BoNT/A를 활성 이중 쇄 형태로 비특이적으로 절단할 수 있음을 보여주었지만(Shone et al., 1985), 이는 독소의 원치 않는 추가적인 분해를 초래할 수 있다. 보다 최근에, 재조합 기술은 관심있는 단백질 내에서 특정 프로테아제 인식 모티프의 엔지니어링을 가능하게 하여 BoNT의 활성화 전략에 대한 더 나은 제어를 제공한다(Sutton et al, 2005). 여기에 본 발명자들은 LC와 HC 사이의 Factor Xa 부위를 포함시키고 독소의 완전한 활성화를 관찰하여 이 효소의 효과를 입증하였다. BoNT/TAB의 향후의 생산은 독소의 활성화를 허용하고 최종 제품에서 엑소 프로테아제를 제거할 수 있는 정제 단계를 포함할 것이다. 인자 Xa가 적절한 것으로 보이지만, 다른 효소가 시험될 수 있고 허용 가능한 수율의 활성화를 달성하는데 성공적임을 입증할 수 있다. 본 발명자들은 트롬빈 엑소 프로테아제로 성공적으로 활성화되고 균질하게 정제되는 활성 버전의 BoNT/TAB(BoNT/TAB2.1.3)를 생산하기 위해 Toxogen GmbH(독일 하노버 소재)와 계약하였다.
HC/TAB의 구조적 완전성을 검증하고 그 향상된 기능성을 확인하는 수단으로서, 본 발명자들은 정제된 샘플을 인간 SV2C, 인간 Syt1 및 GD1a 탄수화물과 함께 공 결정화시켰다. 상기 복합체의 X-선 결정 구조는 고해상도(1.5Å)로 분해되었고, 단일 분자의 HC/TAB가 3개의 수용체 모두에 동시에 결합할 수 있다는 결정적인 실험적 증거를 제공하였다. 또한, HC/A 및 HC/B의 공지된 구조를 이들 각 수용체와 비교하면 HC/TAB가 거의 동일한 결합 메커니즘을 따르는 것으로 나타났다.
결정 구조가 적어도 시험관 내에서 HC/TAB가 그 목적을 달성할 수 있음을 입증하였지만, 그의 수용체 결합 특성을 완전히 특성 규명하기 위해 추가적인 생화학적 실험이 수행될 필요가 있다. 여기에는 단백질 수용체에 대한 풀다운 및 단백질 수용체를 이용한 ITC 분석 및 강글리오사이드 수용체 결합 ELISA가 포함된다. BoNT/TAB는 SV2 수용체 결합에 대하여 BoNT/A와 유사하게, 강글리오사이드 수용체 및 시냅토태그민 수용체 결합에 관해 BoNT/B와 유사하게 수행할 것으로 예상된다. 또한, 생체 내 실험은 치료제로서 BoNT/TAB의 진정한 잠재력에 대한 주요 지표를 제공할 것이다. 마우스 DAS 분석은 고전적으로 BoNT 제제를 평가하는 데 사용되었으며(Broide et al., 2013), 본 발명자들이 현재 이용 가능한 제품과 비교하여 분자의 효능 및 지속 기간을 결정할 수 있도록 할 것이다.
또한, BoNT/TAB의 설계는 생화학적 특성 및 안정성을 개선하기 위해 일부 서열 요소를 변형시킴으로써 추가로 최적화될 수 있다. 이러한 변경은 가용성 BoNT가 여전히 동시에 3개의 수용체에 결합할 수 있게 하는 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명자들은 보다 안정한 변이체(HC/TAB2.1) 및 더 높은 생산 수율을 갖는 더 가용성인 변이체(HC/TAB2.1.3)를 성공적으로 생산하였다.
안전성 양태에서 BoNT/TAB는 기존의 2가지 혈청형에서 유래하기 때문에 새로운 위협을 나타내지 않는다. 그것은 BAT(Botulism Antitoxin Heptavalent) 또는 BoNT/A 및 BoNT/B에 대해 승인된 다른 해독제와 같은 현재 사용 가능한 항독소에 의해 인식될 것으로 예상된다.
혈청형 A와 B는 시중에서 판매되는 유일한 승인된 BoNT이다. BoNT/A는 치료적으로 사용되는 주요 독소이지만 면역원성이 낮고 효능이 높은 분자는 더 안전한 대안을 제공할 것이다(Naumann et al., 2013). 약리학적 잠재력을 높이기 위해 BoNT의 특성을 개선하기 위한 여러 가지 시도가 있었다(Masuyer et al., 2014). 최근의 성공적인 사례는 BoNT/B(E1191M/S1199Y)의 핵심 위치에서 조작된 돌연변이가 인간 시냅토태그민 2 수용체에 대해 독소에 더 높은 친화성을 제공하고 야생형과 비교하여 신경 전달을 차단하는데 약 11배 더 높은 효능을 나타낸 문헌[Tao et al. (2017)]의 연구를 포함한다. BoNT 효능을 개선하기 위한 다른 접근법은 문헌[Elliott et al. (2017)]에 의해 행해졌는데, 여기서는 BoNT/B의 기질에 대한 촉매 활성을 증가시키는 것으로 알려진 단일 돌연변이(S201P)의 영향을 분석했다. 이 경우, BoNT/B 돌연변이체는 다수의 세포-기반 분석법 및 생체 내에서 야생형에 비해 어떠한 이점도 나타내지 않았다. BoNT/B에 대한 이 두 가지 연구는 독소의 효능의 제한 단계가 나중의 세포 내 활성보다는 초기 신경 인식에 있다고 제안한다.
한 혈청형의 결합 특성과 다른 혈청형의 촉매 활성을 결합하려는 초기의 연구는 전체 도메인이 교환된 키메라 분자의 설계를 이끌어냈다(Wang et al., 2008, 2012; Rummel et al., 2011). 보다 구체적으로, 문헌[Rummel et al. (2011)] 및 문헌[Wang et al. (2012)]에서는 BoNT/A의 HN + LC 도메인과 연합된 HC/B 도메인으로 구성된 유사체 분자를 설계하고 테스트하였다. 이러한 재조합 독소는 야생형 BoNT/A와 비교하여 마우스에서 강화된 효능을 나타내고 더 긴 효과를 유도하는 것으로 보고되었다(Kutschenko et al., 2017). 혈청형 A의 상보적 도메인(즉, LC + HN + Hcn)과 결합된 BoNT/B의 C-말단 서브 도메인(Hcc)으로 구성된 작제물을 평가할 때 유사한 관찰이 얻어졌으며, 이는 야생형과 비교할 때 네 배 이상 더 높은 효능을 보여주었다(Rummel et al., 2011). 상기 기술된 모든 분자는 BoNT/B의 2개의 수용체, 시냅토태그민 및 강글리오사이드 만을 인식할 것이라는 사실을 공통적으로 가졌다. 이러한 결과는 뉴런상에서 BoNT/B 수용체의 더 높은 우세에 의해 허용되는 LC/A의 더 많은 수용으로 인해 연장된 효과 및 더 높은 효능이 얻어질 수 있음을 시사한다. 또한, 이들 키메라 분자는 상이한 혈청형으로부터의 도메인을 조합함으로써 발생될 수 있고 이들 생성물의 포텐셜에 영향을 미칠 수 있는, 일어날 수 있는 도메인 간 분자 내 충돌을 고려하지 않았다.
BoNT 공학에 관한 최신 연구의 결과를 고려할 때, 초기 세포 인식을 수정하는 것이 치료 제품의 약리학적 특성을 향상시키는 가장 효율적인 방법 중 하나임이 명백하다. 따라서 BoNT/B 수용체, 시냅토태그민 및 강글리오사이드와 함께 SV2 수용체를 인식하도록 성공적으로 조작된 단일 산물인 BoNT/TAB는 큰 포텐셜을 나타내며 야생형 BoNT/A 및 BoNT/B보다 더 효과적일 수 있다.
BoNT/TAB의 주요 혁신은 다중 수용체 상호 작용을 허용하는 결합 도메인의 설계이다. 현재의 증거는 HC/TAB와 BoNT/A의 전위 및 촉매 도메인과의 연합이 이 분자에 가장 강력한 효능을 제공할 것임을 암시한다(BoNT/TAB에서 설계된 바와 같이). 그러나 HC/TAB는 다른 혈청형의 기능적 도메인과 결합될 때 여전히 관심 대상이 될 수 있다(도 10a). 또한 HC/TAB는 시냅스 과정을 조사하기 위한 약리학적 도구로 사용되기 위해 다른 관심 단백질과 결합될 수도 있다(도 10b). BoNT/TAB와 수행되는 생체 내 분석은 그러한 목적을 위해 그 유용성을 명확히 할 것이다.
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gacaacgaga aggataacta cctgaagggc gtgaccaaac tgttcgaacg tatctacagc 300
accgatctgg gtcgtatgct gctgaccagc attgttcgtg gcatcccgtt ttggggtggc 360
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gatggtagct accgtagcga ggaactgaac ctggtgatca ttggcccgag cgcggacatc 480
attcagtttg agtgcaagag cttcggtcac gaagttctga acctgacccg taacggttac 540
ggcagcaccc aatatatccg tttcagcccg gatttcacct ttggcttcga ggaaagcctg 600
gaagtggaca ccaacccgct gctgggtgcg ggcaagtttg cgaccgaccc ggcggttacc 660
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cgtgtgttca aagttaacac caacgcgtac tatgagatga gcggtctgga agtgagcttt 780
gaggaactgc gtaccttcgg tggccacgac gcgaagttta tcgatagcct gcaggagaac 840
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aaaagcattg tgggtaccac cgcgagcctg caatacatga agaacgtttt caaggagaag 960
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ctgtataaaa tgctgaccga gatctacacc gaagataact tcgtgaagtt ctttaaagtt 1080
ctgaacgcga aaacctttct gaacttcgac aaggcggttt ttaaaattaa catcgtgccg 1140
aaggttaact acaccatcta tgatggtttc aacctgcgta acaccaacct ggcggcgaac 1200
tttaacggcc agaacaccga gattaacaac atgaacttta ccaagctgaa aaacttcacc 1260
ggtctgtttg aattctataa actgctgtgc gtgcgtggca tcattaccag caagaccaaa 1320
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gttaacaact gggacctgtt ctttagcccg agcgaggaca acttcaccaa cgatctgaac 1440
aagggcgagg aaatcaccag cgacaccaac attgaagcgg cggaggaaaa catcagcctg 1500
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ttcccgaacg gcaagaaata cgaactggat aaatatacca tgttccacta cctgcgtgcg 1680
caagagtttg aacacggcaa gagccgtatt gcgctgacca acagcgtgaa cgaggcgctg 1740
ctgaacccga gccgtgttta taccttcttt agcagcgact acgtgaagaa agttaacaaa 1800
gcgaccgagg cggcgatgtt cctgggttgg gtggaacagc tggtttacga ctttaccgat 1860
gaaaccagcg aggtgagcac caccgacaaa attgcggata tcaccatcat tatcccgtat 1920
atcggtccgg cgctgaacat tggcaacatg ctgtacaagg acgattttgt gggtgcgctg 1980
atcttcagcg gcgcggttat cctgctggag ttcattccgg aaattgcgat cccggtgctg 2040
ggtacctttg cgctggttag ctacatcgcg aacaaggtgc tgaccgttca aaccattgat 2100
aacgcgctga gcaagcgtaa cgagaaatgg gacgaagtgt ataaatacat cgttaccaac 2160
tggctggcga aggttaacac ccagattgac ctgatccgta agaaaatgaa agaggcgctg 2220
gaaaaccaag cggaggcgac caaggcgatt atcaactatc agtacaacca atacaccgag 2280
gaagagaaaa acaacattaa cttcaacatc gacgatctga gcagcaagct gaacgaaagc 2340
atcaacaaag cgatgattaa catcaacaag tttctgaacc agtgcagcgt gagctatctg 2400
atgaacagca tgattccgta cggtgttaag cgtctggagg acttcgatgc gagcctgaag 2460
gacgcgctgc tgaaatatat ctacgataac cgtggtaccc tgattggcca agtggaccgt 2520
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agcattctga acctgcgtta tgaaagcaac cacctgatcg acctgagccg ttacgcgagc 2700
aagattaaca tcggtagcaa agttaacttc gacccgatcg ataaaaacca gattcaactg 2760
tttaacctgg agagcagcaa gattgaagtg atcctgaaaa acgcgatcgt ttacaacagc 2820
atgtatgaga actttagcac cagcttctgg attcgtatcc cgaaatattt caacagcatt 2880
agcctgaaca acgagtacac cattatcaac tgcatggaaa acaacagcgg ttggaaggtg 2940
agcctgaact acggcgagat tatctggacc ctgcaggaca cccaagaaat caagcagcgt 3000
gtggttttca agtacagcca aatgatcaac atcagcgatt acattaaccg ttggatcttt 3060
gttaccatta ccaacaaccg tctgaacaac agcaaaattt acatcaacgg tcgtctgatc 3120
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ctgaaagact tctggggcga ttacctgcaa tatgacaagc cgtattacat gtttaacgcg 3360
ggtaacaaga acagctacat caaactgaag aaagatagcc cggtgggtga aattctgggt 3420
ccgcgtggca gcgttatgac caccaacatc tatctgaaca gcagcctgta ccgtggcgaa 3480
aagttcatta tccgtcgtaa aagcaacagc cagagcatca acgacgatat tgtgcgtaac 3540
gaggactata tctacctgga tttctttaac ctgaaccaag aatggcgtgt ttacacctac 3600
aagtacttca agaaagaaga ggaaaagctg tttctggcgc cgattagcga cagcgatgaa 3660
ttctataaca ccattcagat caaagagtac gacgaacagg gtaccaacag ctgccaactg 3720
ctgtttaaga aagacgagga aagcaccgat gagatcggtc tgattggcat ccaccgtttt 3780
tacgaaagcg gcatcgtgtt cgaggaatac aaggattact tctgcatcag caagtggtat 3840
ctgaaagagg ttaagcgtaa accgtacaac ctgaaactgg gctgcaactg gcaatttatt 3900
ccggtggatg atggctgggg tgaacgtccg ctgtaa 3936
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<211> 1311
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Full-length active TreRecABTox with engineered activation site
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Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
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Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
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50 55 60
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Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
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Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
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Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
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180 185 190
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225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
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325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
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405 410 415
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420 425 430
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Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu
485 490 495
Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe
645 650 655
Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile
660 665 670
Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr
675 680 685
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690 695 700
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725 730 735
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Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe
755 760 765
Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala
770 775 780
Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu
785 790 795 800
Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp
805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro
900 905 910
Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile
915 920 925
Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn
930 935 940
Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile
945 950 955 960
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965 970 975
Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln
980 985 990
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995 1000 1005
Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
1010 1015 1020
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg
1025 1030 1035
Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala
1040 1045 1050
Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His
1055 1060 1065
Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu
1070 1075 1080
Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser
1085 1090 1095
Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys
1100 1105 1110
Pro Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys
1115 1120 1125
Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly
1130 1135 1140
Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg
1145 1150 1155
Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile
1160 1165 1170
Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe
1175 1180 1185
Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe
1190 1195 1200
Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser
1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Gly Thr Asn Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser
1235 1240 1245
Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser
1250 1255 1260
Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys
1265 1270 1275
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1280 1285 1290
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hc/TAB2.1, optimised loop 360
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1 5 10 15
His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser
20 25 30
Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn
35 40 45
Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr
50 55 60
Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro
65 70 75 80
Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu
100 105 110
Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val
115 120 125
Phe Lys Tyr Ser Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp
130 135 140
Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr
145 150 155 160
Ile Asn Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn
165 170 175
Ile His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp
180 185 190
Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu
195 200 205
Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser
210 215 220
Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro
225 230 235 240
Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys
245 250 255
Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly Ser Val Met
260 265 270
Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Glu Lys Phe
275 280 285
Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val
290 295 300
Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu
305 310 315 320
Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu
325 330 335
Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln
340 345 350
Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe
355 360 365
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370 375 380
Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe
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Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn
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Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hc/TAB2.1, codon optimised for expression in E. coli
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aacaacatca tgttcaagct ggacggttgc cgtgataccc accgttatat ctggattaag 600
tacttcaacc tgtttgataa agagctgaac gaaaaggaga ttaaagacct gtatgataac 660
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<211> 432
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hc/TAB2.1.1
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Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
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50 55 60
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Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
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Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Phe Asn
225 230 235 240
Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val
245 250 255
Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr
260 265 270
Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys
275 280 285
Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr
290 295 300
Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr
305 310 315 320
Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile
325 330 335
Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp
340 345 350
Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu
355 360 365
Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser
370 375 380
Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp
385 390 395 400
Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys
405 410 415
Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu
420 425 430
<210> 9
<211> 1299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hc/TAB2.1.1, codon optimised for expression in E. coli
<400> 9
accagcatcc tgaacctgcg ctacgagagc aaccacctga tcgacctgag ccgctacgcg 60
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gataaagagc tgaacgaaaa ggagattaaa gacctgtatg ataaccagag caacagcggt 660
atcctgaagg acttttgggg cgattatctg caatacgaca aaccgtacta tatgttcaac 720
gcgggtaaca agaacagcta cattaaactg aagaaagata gcccggtggg tgaaatcctg 780
ggtccgcgtg gcagcgttat gaccaccaac atctatctga acagcagcct gtaccgtggc 840
gagaagttca tcattcgtcg taaaagcaac agccagagca ttaacgacga tatcgtgcgt 900
aacgaagact acatttatct ggatttcttt aacctgaacc aagagtggcg tgtttacacc 960
tacaagtact tcaagaaaga ggaagagaag ctgttcctgg cgccgatcag cgacagcgat 1020
gaattctaca acaccatcca aatcaaggaa tacgacgagc agccgaccta tagctgccaa 1080
ctgctgttca agaaagacga agagagcacc gatgaaatcg gtctgatcgg cattcaccgt 1140
ttctacgaga gcggcatcgt gttcgaagag tacaaggatt acttctgcat cagcaagtgg 1200
tatctgaaag aggttaagcg taaaccgtac aacctgaaac tgggctgcaa ctggcaattt 1260
attccggtgg atgatggctg gggtgaacgt ccgctgtaa 1299
<210> 10
<211> 424
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hc/TAB2.1.3, increased solubility
<400> 10
Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu
1 5 10 15
Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp
20 25 30
Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys
35 40 45
Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu
50 55 60
Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn
85 90 95
Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu
100 105 110
Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gln
115 120 125
Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile
130 135 140
Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Arg Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile His Ala Ser Asn
165 170 175
Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp Thr His Arg Tyr Ile
180 185 190
Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys Glu Leu Asn Glu Lys Glu
195 200 205
Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp
210 215 220
Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Phe Asn
225 230 235 240
Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val
245 250 255
Gly Glu Ile Leu Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr
260 265 270
Leu Asn Ser Ser Leu Tyr Arg Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys
275 280 285
Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr
290 295 300
Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr
305 310 315 320
Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile
325 330 335
Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp
340 345 350
Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu
355 360 365
Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Asn Asn Lys
370 375 380
Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys
385 390 395 400
Pro Tyr Asn Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp
405 410 415
Asp Gly Trp Gly Glu Arg Pro Leu
420
<210> 11
<211> 1275
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hc/TAB2.1.3, codon optimised for expression in E. coli
<400> 11
accagcatcc tgaacctgcg ctacgagagc aaccacctga tcgacctgag ccgctacgcg 60
agcaagatta acatcggtag caaggtgaac tttgacccga ttgataaaaa ccagatccaa 120
ctgttcaacc tggaaagcag caagatcgaa gtgattctga aaaacgcgat tgtttataac 180
agcatgtacg aaaacttcag caccagcttt tggatccgta ttccgaagta ttttaacagc 240
atcagcctga acaacgaata caccatcatt aactgcatgg agaacaacag cggttggaaa 300
gtgagcctga actacggcga aatcatttgg accctgcagg acacccaaga gatcaagcag 360
cgtgtggttt tcaagtacag ccaaatgatc aacatcagcg attacatcaa ccgttggatt 420
ttcgttacca tcaccaacaa ccgtctgaac aacagcaaga tctacattaa cggtcgtctg 480
attgaccaga aaccgatcag caacctgggc aacattcacg cgagcaacaa catcatgttc 540
aagctggacg gttgccgtga tacccaccgt tatatctgga ttaagtactt caacctgttt 600
gataaagagc tgaacgaaaa ggagattaaa gacctgtatg ataaccagag caacagcggt 660
atcctgaagg acttttgggg cgattatctg caatacgaca aaccgtacta tatgttcaac 720
gcgggtaaca agaacagcta cattaaactg aagaaagata gcccggtggg tgaaatcctg 780
ggtccgcgtg gcagcgttat gaccaccaac atctatctga acagcagcct gtaccgtggc 840
gagaagttca tcattcgtcg taaaagcaac agccagagca ttaacgacga tatcgtgcgt 900
aacgaagact acatttatct ggatttcttt aacctgaacc aagagtggcg tgtttacacc 960
tacaagtact tcaagaaaga ggaagagaag ctgttcctgg cgccgatcag cgacagcgat 1020
gaattctaca acaccatcca aatcaaggaa tacgacgagc agccgaccta tagctgccaa 1080
ctgctgttca agaaagacga agagagcacc gatgaaatcg gtctgatcgg cattcaccgt 1140
ttcaacaaca aggattactt ctgcatcagc aagtggtatc tgaaagaggt taagcgtaaa 1200
ccgtacaacc tgaaactggg ctgcaactgg caatttattc cggtggatga tggctggggt 1260
gaacgtccgc tgtaa 1275
<210> 12
<211> 1343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BoNT/TAB2.1.3, full-length active protein
<400> 12
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
Val Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg
35 40 45
Asp Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu
50 55 60
Ala Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr
65 70 75 80
Asp Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu
85 90 95
Arg Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys
115 120 125
Val Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr
130 135 140
Arg Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile
145 150 155 160
Ile Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr
165 170 175
Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe
180 185 190
Thr Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu
195 200 205
Gly Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Ala
210 215 220
Leu Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn
225 230 235 240
Arg Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu
245 250 255
Glu Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys
260 265 270
Phe Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn
275 280 285
Lys Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val
290 295 300
Gly Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu
325 330 335
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp
340 345 350
Asn Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Ala Lys Thr Phe Leu Asn
355 360 365
Phe Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr
370 375 380
Thr Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn
385 390 395 400
Phe Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu
405 410 415
Lys Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg
420 425 430
Gly Ile Ile Thr Ser Lys Ala Gly Ala Gly Lys Ser Leu Val Pro Arg
435 440 445
Gly Ser Ala Gly Ala Gly Ala Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn
450 455 460
Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp
465 470 475 480
Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala
485 490 495
Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe
500 505 510
Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser
515 520 525
Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro
530 535 540
Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu
545 550 555 560
Arg Ala Gln Glu Phe Glu His Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn
565 570 575
Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe
580 585 590
Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met
595 600 605
Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr
610 615 620
Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile
625 630 635 640
Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp
645 650 655
Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu
660 665 670
Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val
675 680 685
Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala
690 695 700
Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val
705 710 715 720
Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys
725 730 735
Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile
740 745 750
Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile
755 760 765
Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn
770 775 780
Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser
785 790 795 800
Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp
805 810 815
Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn
820 825 830
Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn
835 840 845
Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp
850 855 860
Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile
865 870 875 880
Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp
885 890 895
Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe
900 905 910
Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser
915 920 925
Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr
930 935 940
Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn
945 950 955 960
Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn
965 970 975
Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr
980 985 990
Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser
995 1000 1005
Gln Met Ile Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val
1010 1015 1020
Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu Asn Asn Ser Lys Ile Tyr Ile Asn
1025 1030 1035
Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Pro Ile Ser Asn Leu Gly Asn Ile
1040 1045 1050
His Ala Ser Asn Asn Ile Met Phe Lys Leu Asp Gly Cys Arg Asp
1055 1060 1065
Thr His Arg Tyr Ile Trp Ile Lys Tyr Phe Asn Leu Phe Asp Lys
1070 1075 1080
Glu Leu Asn Glu Lys Glu Ile Lys Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ser
1085 1090 1095
Asn Ser Gly Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asp Tyr Leu Gln Tyr
1100 1105 1110
Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr
1115 1120 1125
Ile Lys Leu Lys Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Gly Pro
1130 1135 1140
Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser Ser Leu
1145 1150 1155
Tyr Arg Gly Glu Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln
1160 1165 1170
Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val Arg Asn Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu
1175 1180 1185
Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys
1190 1195 1200
Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser
1205 1210 1215
Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp
1220 1225 1230
Glu Gln Gly Thr Asn Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu
1235 1240 1245
Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr
1250 1255 1260
Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile
1265 1270 1275
Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn Leu
1280 1285 1290
Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Asp Gly Trp
1295 1300 1305
Gly Glu Arg Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Asn Ser Ser Ser
1310 1315 1320
Val Asp Lys Leu Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Leu Glu His
1325 1330 1335
His His His His His
1340
<210> 13
<211> 4032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BoNT/TAB2.1.3, sequence included in pEt29(a) vector for
expression in E. coli
<400> 13
atgccatttg tgaacaagca gtttaactat aaggacccgg tgaacggtgt ggatatcgcg 60
tatatcaaaa tcccgaatgc gggccagatg caaccagtca aggcgttcaa gattcataac 120
aagatttggg ttattccgga acgtgatacc ttcaccaatc cggaagaagg cgacttaaac 180
ccgccgccag aagccaaaca agtgccggtg agctactatg atagcacgta tcttagcacc 240
gataatgaaa aagacaatta cctgaagggc gtgaccaagt tgttcgagcg catctacagt 300
accgacttag gccgcatgtt gttgacgagc atcgttcgcg gtatcccgtt ctggggcggc 360
tcgaccattg ataccgagtt gaaagtcatt gacacgaact gtatcaatgt tatccaaccg 420
gacggcagtt atcgcagcga ggagttaaat ttggtcatca tcggtccaag cgcagatatt 480
attcagttcg aatgcaagag cttcggccat gaggtcttga atttgacgcg caacggttac 540
ggcagcaccc aatacatccg ctttagcccg gatttcacct ttggcttcga ggagagcttg 600
gaggtggaca ccaacccgct gttaggtgcc ggcaaattcg caaccgaccc ggcagtgacg 660
ttggcgcacg cgttgattca tgcgggtcac cgcttatacg gtatcgcgat caatccgaat 720
cgcgtcttta aagtcaatac caacgcgtac tacgaaatga gcggcttaga ggttagcttt 780
gaagaattac gcaccttcgg tggccacgac gccaagttca tcgacagcct gcaggaaaat 840
gagttccgct tgtactatta caataaattc aaggacatcg cgagcacctt aaataaagca 900
aagagcattg tgggcaccac cgcaagcttg cagtacatga agaacgtatt taaggaaaaa 960
tatttgttgt cggaggatac cagcgggaaa ttcagcgtcg ataagctgaa attcgacaaa 1020
ttgtataaaa tgctgaccga gatttacacc gaggataact tcgtcaagtt ttttaaggtg 1080
ttaaatgcga agaccttttt aaactttgat aaagcggtgt ttaaaattaa tatcgtgccg 1140
aaggtgaatt acaccatcta cgatggtttc aatttacgca acacgaatct ggcggcgaat 1200
tttaatggcc aaaacaccga aattaacaac atgaacttta cgaagttaaa gaatttcacg 1260
ggcttattcg aattctacaa gttattatgc gtgcgcggca tcattaccag caaggcaggt 1320
gcgggcaagt ccttggttcc gcgtggcagc gccggcgccg gcgcgctcaa tgatctgtgt 1380
attaaagtca ataactggga cctgttcttc agcccgagcg aggataactt taccaacgac 1440
ttaaacaaag gcgaggagat cacgagcgat acgaacatcg aggcggcgga ggaaaatatt 1500
agcctggacc tcattcagca gtactatctg acgttcaatt ttgacaatga gccggagaac 1560
atcagcattg aaaatctcag cagcgacatc atcggtcagt tggaactgat gccgaacatt 1620
gaacgctttc cgaacggcaa aaaatatgaa ctggacaagt ataccatgtt ccattactta 1680
cgcgcacagg aatttgagca cggcaagagc cgcattgcgc tgaccaatag cgttaacgag 1740
gccttgttaa atccgagccg tgtctacacg ttcttcagca gcgattatgt caaaaaagtg 1800
aacaaggcga ccgaagccgc gatgtttttg ggctgggtcg agcaattggt ttacgatttt 1860
accgacgaaa ccagcgaggt gagcacgacc gacaaaattg cagatatcac catcatcatt 1920
ccgtacatcg gtccggcgct caatatcggc aatatgttat acaaggacga ctttgtgggc 1980
gcgctgatct ttagcggcgc ggttatctta ttagaattca tcccggagat cgcaatcccg 2040
gtcttgggca cctttgcgtt ggtgagctat atcgcgaata aagtgctcac ggtccaaacc 2100
atcgataacg cgctcagcaa gcgtaatgag aaatgggacg aggtttataa gtatatcgtg 2160
accaactggt tagcaaaagt caatacgcag atcgatctca tccgcaaaaa aatgaaagaa 2220
gccttggaaa atcaagcgga ggcaaccaaa gccatcatta attaccagta taaccaatat 2280
accgaagaag aaaaaaacaa tatcaacttc aatatcgatg atttgagcag caaactgaac 2340
gagagcatta acaaagcgat gattaacatc aacaagttct tgaatcaatg cagcgtgagc 2400
tatctcatga acagcatgat cccgtatggc gtcaaacgct tggaagattt tgacgccagc 2460
ctgaaagatg cgctcctcaa gtatatttat gacaaccgcg gcaccctcat tggccaggtg 2520
gaccgcttga aggataaagt gaacaatacg ctcagcacgg atatcccgtt ccagctgagc 2580
aagtacgtcg acaaccagcg cttactgagc acctttaccg agtatatcaa gaacatcatt 2640
aataccagca tcctcaactt gcgctatgag agcaatcacc tgatcgacct cagccgctac 2700
gccagcaaga tcaacatcgg cagcaaggtc aatttcgacc cgatcgataa gaatcagatc 2760
caattgttta acctggaaag cagcaagatc gaggttatct tgaagaacgc gattgtgtac 2820
aacagcatgt atgagaactt tagcaccagc ttctggattc gtatcccgaa atatttcaac 2880
agcattagcc tgaacaacga gtacaccatt atcaactgca tggaaaacaa cagcggttgg 2940
aaggtgagcc tgaactacgg cgagattatc tggaccctgc aggacaccca agaaatcaag 3000
cagcgtgtgg ttttcaagta cagccaaatg atcaacatca gcgattacat taaccgttgg 3060
atctttgtta ccattaccaa caaccgtctg aacaacagca aaatttacat caacggtcgt 3120
ctgatcgacc agaagccgat tagcaacctg ggcaacatcc acgcgagcaa caacattatg 3180
ttcaagctgg acggttgccg tgatacccac cgttatattt ggatcaagta cttcaacctg 3240
ttcgataagg agctgaacga gaaggaaatc aaagacctgt atgataacca gagcaacagc 3300
ggtattctga aagacttctg gggcgattac ctgcaatatg acaagccgta ttacatgttt 3360
aacgcgggta acaagaacag ctacatcaaa ctgaagaaag atagcccggt gggtgaaatt 3420
ctgggtccgc gtggcagcgt tatgaccacc aacatctatc tgaacagcag cctgtaccgt 3480
ggcgaaaagt tcattatccg tcgtaaaagc aacagccaga gcatcaacga cgatattgtg 3540
cgtaacgagg actatatcta cctggatttc tttaacctga accaagaatg gcgtgtttac 3600
acctacaagt acttcaagaa agaagaggaa aagctgtttc tggcgccgat tagcgacagc 3660
gatgaattct ataacaccat tcagatcaaa gagtacgacg aacagggtac caacagctgc 3720
caactgctgt ttaagaaaga cgaggaaagc accgatgaga tcggtctgat tggcatccac 3780
cgtttttacg aaagcggcat cgtgttcgag gaatacaagg attacttctg catcagcaag 3840
tggtatctga aagaggttaa gcgtaaaccg tacaacctga aactgggctg caactggcaa 3900
tttattccgg tggatgatgg ctggggtgaa cgtccactag tgccacgcgg ttccgcgaat 3960
tcgagctccg tcgacaagct ttggagccac ccgcagttcg aaaaactcga gcaccaccac 4020
caccaccact ga 4032
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hSytI peptide
<400> 14
Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met
1 5 10 15
Asn Glu Leu His Lys
20
Claims (32)
- N-말단(HCN) 및 C-말단(HCC)을 갖는 보툴리눔 신경독소(BoNT) 중쇄 결합 도메인(HC/TAB)으로서, 상기 HC/TAB는,
a) 시냅토태그민(Syt) 수용체 결합 부위, 및
b) 시냅스 연관 소포 2(SV2) 수용체 결합 부위, 및
c) 강글리오사이드(Gang) 수용체 결합 부위
를 포함하되,
상기 HC/TAB는 시냅토태그민(Syt) 수용체, 시냅스 연관 소포 2(SV2) 수용체 및 강글리오사이드(Gang) 수용체에 상승작용적으로 결합하도록 조정된, HC/TAB. - 제1항에 있어서, 상기 Gang 수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 임의의 Gang 수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입으로부터 유래되는, HC/TAB.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Syt 수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 임의의 Syt 수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입으로부터 유래되는, HC/TAB.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SV2-수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 임의의 SV2 수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입으로부터 유래되는, HC/TAB.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCN 서열이 임의의 SV2 수용체 결합 BoNT 혈청형 및 이의 서브 타입으로부터 유래되는, HC/TAB.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCC 도메인은 BoNT 혈청형 A(BoNT/A) 및 BoNT 혈청형 B(BoNT/B) 유래 서열로 교환 가능하게(interchangeably) 구성되는 것을 특징으로 하는 HC/TAB.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCC 말단은 서열 A1B1A2B2A3에 따라 구성되고, A는 BoNT/A 유래 서열을 나타내고, B는 BoNT/B 유래 서열을 나타내는 것을 특징으로 하는 HC/TAB.
- 제7항에 있어서, 상기 B1, A2 및 B2의 서열은 전체 HC/TAB에 대해 안정적인 분자내 계면(intramolecular interface)을 생성하기 위해 돌연변이 및/또는 결실을 포함하는, HC/TAB.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Gang 수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 BoNT/B로부터 유래되는, HC/TAB.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 Gang 수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 B2에 위치되는, HC/TAB.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Syt 수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 BoNT B, DC 또는 G로부터 유래되는, HC/TAB.
- 제7항, 제8항, 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Syt 수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 B1 및 B2에 위치하는, HC/TAB.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCN 서열이 BoNT/A로부터 유래되는, HC/TAB.
- 제7항, 제8항, 제10항, 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SV2 수용체 결합 부위를 형성하는 서열이 HCN 내에 그리고 상기 HCC의 A1 및 A3 내에 위치되는, HC/TAB.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, HC/TAB.
- 직접적으로 또는 링커를 통해, 하나 이상의 다른 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 형광 프로브에 결합된, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 HC/TAB를 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제16항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 BoNT 폴리펩타이드(BoNT/TAB)이며, 상기 BoNT/TAB는 HC/TAB 외에 중쇄 전좌 도메인(HN), 경쇄(LC) 및 상기 폴리펩타이드 서열에서 LC와 HN 사이에 위치된 프로테아제 부위를 포함하며, 상기 HN과 상기 LC는 각각 독립적으로 BoNT 혈청형 A, B, C, D, DC, E, En, F, G 또는 X 및 이의 서브 타입으로부터 유래되는, 폴리펩타이드.
- 제17항에 있어서, 직접적으로 또는 링커를 통해 연결된 임의의 다른 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 형광 프로브를 더 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 프로테아제 부위가 엑소 프로테아제 부위인, 폴리펩타이드.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 HC/TAB 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
- 제21항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 또는 서열번호 13의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 벡터.
- 치료 방법 또는 미용 방법(cosmetic method)에 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 HC/TAB, 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드.
- 제23항에 있어서, 상기 치료 방법 또는 미용 방법이 근육을 약화 및/또는 불활성화시키는 처치인, HC/TAB 또는 폴리펩타이드.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 치료 방법이 신경 근육 장애(neuromuscular disorder) 및 경련 근육 장애(spastic muscle disorder)를 포함하는 군에서 선택된 장애의 치료 및/또는 예방인, HC/TAB 또는 폴리펩타이드.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장애가 연축발성장애(spasmodic dysphonia), 연축사경(spasmodic torticollis), 후두근긴장이상증(laryngeal dystonia), 구강하악 근긴장이상증(oromandibular dysphonia), 혀 근긴장이상증(lingual dystonia), 자궁 경부 긴장이상증(cervical dystonia), 국소 손 긴장이상증(focal hand dystonia), 안검연축(blepharospasm), 사시(strabismus), 반얼굴연축(hemifacial spasm), 안검장애(eyelid disorder), 뇌성마비(cerebral palsy), 국소 강직(focal spasticity) 및 기타 음성 장애(voice disorder), 연축대장염(spasmodic colitis), 신경성방광(neurogenic bladder), 항문경(anismus), 사지강직(limb spasticity), 틱증(tics), 떨림(tremors), 이갈이(bruxism), 항문 균열, 이완불능증(achalasia), 연하곤란(dysphagia) 및 기타 근긴장성 장애(muscle tone disorder), 및 근육군(muscle groups)의 불수의운동, 유루증(lacrimation), 다한증(hyperhydrosis), 과도한 타액 분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 경련으로 인한 통증, 두통, 스포츠 상해 및 우울증을 특징으로 하는 기타 장애를 포함하는 군으로부터 선택되는, HC/TAB 또는 폴리펩타이드.
- 제16항에 있어서, 시냅스 과정에서 상기 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산 서열 또는 형광 프로브의 역할을 조사하는 약리학적 시험에 사용하기 위한, 폴리펩타이드.
- 비히클에 결합된 임의의 단백질, 폴리펩타이드 아미노산 서열 또는 형광 프로브를 뉴런 표면에 효과적으로 운반하기 위한 상기 비히클로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 HC/TAB.
- 독소 전위(toxin translocation) 시스템을 사용하여 임의의 단백질, 폴리펩타이드 아미노산 서열 또는 형광 프로브를 뉴런 사이토졸로 효과적으로 운반하기 위한 비히클로서 사용하기 위한, 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 BoNT/TAB.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 HC/TAB 또는 제 16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 포함하는, 약제학적 또는 미용 조성물.
- 제30항의 조성물 및 상기 조성물의 치료적 투여 지침을 포함하는, 부품 키트(kit of parts).
- 원치 않는 신경 활동과 연관된 병태를 치료하는 방법으로서,
치료적 유효량의, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 HC/TAB 또는 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 제30항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여 상기 병태를 치료하는 단계를 포함하되,
상기 병태는 연축발성장애, 연축사경, 후두근긴장이상증, 구강하악 근긴장이상증, 혀 근긴장이상증, 자궁 경부 긴장이상증, 국소 손 긴장이상증, 안검연축, 사시, 반얼굴연축, 안검장애, 뇌성마비, 국소 강직 및 기타 음성 장애, 연축대장염, 신경성방광, 항문경, 사지 경직, 틱증, 떨림, 이갈이, 항문 균열, 이완불능증, 연하곤란 및 기타 근긴장성 장애, 및 근육군의 불수의운동, 유루증, 다한증, 과도한 타액 분비, 과도한 위장 분비, 분비 장애, 근육 경련으로 인한 통증, 두통, 스포츠 상해 및 우울증을 특징으로 하는 기타 장애, 및 피부과적 또는 미적/미용의 병태를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법.
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