BR112020017323A2 - Bio-híbrido de neurotoxina botulínica - Google Patents

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Abstract

bio-híbrido de neurotoxina botulínica. a presente invenção diz respeito a um novo domínio de ligação de cadeia pesada (hc/tab) de neurotoxina botulínica (bont) adaptado para se ligar sinergicamente a um receptor de sinaptotagmina (syt), um receptor de vesícula sináptica 2 (sv2) associada e um receptor de gangliosídeo (gang), bem como polipeptídeos compreendendo o referido novo hc/tab, vetores que codificam os referidos polipeptídeos e usos dos mesmos.

Description

BIO-HÍBRIDO DE NEUROTOXINA BOTULÍNICA CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção se refere a polipeptídeos de neurotoxina botulínica e, em particular, a uma Cadeia Pesada de neurotoxina Botulínica quimérica.
ANTECEDENTES TÉCNICOS
[002] As neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são as toxinas proteicas mais potentes conhecidas pelo homem e o agente causador da rara doença paralítica, o botulismo. Essa família de toxinas bacterianas consiste em oito sorotipos, BoNT/AG, e o recentemente descrito BoNT/X (Montal, 2010; Zhang et al., 2017). Todos compartilham uma arquitetura comum e são expressos como uma proteína de 150 kDa que é clivada pós-traducionalmente em uma molécula de di-cadeia composta por uma cadeia leve (LC, 50 kDa), ligada por uma única ponte de dissulfeto à cadeia pesada (HC, 100 kDa). A HC contém dois dos domínios funcionais, com o domínio de translocação do N-terminal (HN) e o domínio de ligação do C-terminal (HC), enquanto a LC é responsável pela atividade catalítica intracelular. Os BoNTs primeiro reconhecem os terminais nervosos colinérgicos por meio de receptores de superfície celular específicos e são então endocitados dentro de uma vesícula. O ambiente endossômico ácido causa uma alteração conformacional que permite a translocação de LC dentro do citosol, também denominada translocação de toxinas. O domínio catalítico liberado, uma protease de zinco, pode então alvejar especificamente um dos três SNAREs neuronais (receptores de proteínas de ligação ao fator sensível de N- etilmaleimida solúvel): BoNT/A, /C e /E clivam SNAP-25; BoNT/B, /D, /F, /G e /X alvejam VAMP (sinaptobrevina); a sintaxina é clivada por BoNT/C (Schiavo et al., 2000; Zhang et al., 2017). Essas três proteínas formam um complexo que medeia a fusão da vesícula sináptica à membrana plasmática (Sudhof e Rothman, 2009).
A proteólise de qualquer um dos SNAREs inibe a exocitose e, portanto, a liberação de neurotransmissores, causando efetivamente a paralisia flácida sintomática do botulismo (Rossetto et al., 2014). A sequência dos três domínios funcionais foi descrita anteriormente (Lacy DB, et al. 1999.). O domínio catalítico é composto pelos aminoácidos 1-437, o domínio de translocação dos aminoácidos 448-872 e o domínio de ligação dos aminoácidos 873-1295, referindo-se à sequência de BoNT/A em Lacy DB, et al. Como todos os sorotipos BoNT e subtipos dos mesmos são homólogos em grande parte, a posição dos domínios correspondentes em qualquer outro sorotipo ou subtipo será muito semelhante.
[003] A alta potência dessas toxinas as torna um agente terapêutico extremamente útil no tratamento de uma gama crescente de distúrbios neuromusculares como estrabismo, distonia cervical e blefaroespasmo, bem como outras condições que envolvem a liberação de acetilcolina, como a hiperidrose (Chen, 2012). Os BoNT/A e /B são os únicos sorotipos aprovados e comercialmente disponíveis como terapêuticos. Considera-se geralmente que o BoNT/A tem maior eficácia em humanos e, portanto, é o sorotipo de escolha na maioria dos casos (Bentivoglio et al., 2015). No entanto, o tratamento com BoNT geralmente requer injeções repetidas, pois os efeitos terapêuticos das toxinas são apenas transientes. Segundo relatos, isso levou à emergência de resistência em um pequeno subconjunto de pacientes desenvolvendo uma resposta imune ao BoNT/A (Lange et al., 2009; Naumann et al., 2013). Enquanto o BoNT/B representa uma alternativa, sua eficácia inferior significa que são exigidas doses mais altas e, portanto, representa um risco maior de imunogenicidade (Dressler e Bigalke, 2005). Além disso, o BoNT/B também está associado a vários resultados adversos, como injeções dolorosas, menor duração da ação e efeitos colaterais mais frequentes (Bentivoglio et al., 2015). Os principais efeitos adversos também são frequentemente associados ao tratamento de espasmos musculares, mas não a aplicações cosméticas. Isso ocorre porque os efeitos adversos são devidos principalmente à difusão de toxinas para outras regiões do corpo e a possibilidade de difusão de toxinas está diretamente relacionada às doses injetadas. Os efeitos adversos variam de eventos não graves e transientes, como ptose e diplopia, a eventos com risco de vida, até a morte.
[004] A ligação de BoNT/A e /B a neurônios foi caracterizada em detalhes e baseia-se em um mecanismo de receptor duplo, envolvendo uma proteína da vesícula sináptica e um gangliosídeo ancorado na membrana neuronal. O receptor de proteína para o BoNT/A foi identificado como SV2 (Dong et al., 2006, Mahrhold et al., 2006). Mais precisamente, o BoNT/A pode se ligar a várias isoformas de SV2 humana A, B e C, embora a toxina reconheça apenas as formas N-glicosiladas de SV2A e SV2B (Yao et al., 2016). O receptor de proteína para BoNT/B é a sinaptotagmina (Syt) (Nishiki et al., 1994, 1996; Dong et al., 2003), com preferência por Syt1 em vez de Syt2 em humanos (Strotmeier et al., 2012). O reconhecimento de gangliosídeos é a primeira etapa do processo de intoxicação para todos os BoNTs (Binz e Rummel, 2009) e é mediado por um mecanismo de ligação compartilhado, centrado no motivo conservado H…SxWY...G em sua sequência. O BoNT/A prefere a ligação à fração de N- acetilgalactosamina - galactose terminal de GT1b e GD1a (Takamizawa et al. 1986; Schengrund et al. 1991), enquanto os dados sobre o BoNT/B sugerem uma preferência pelo motivo de disialil de GD1b e GT1b. Os diferentes sorotipos variam em sua especificidade e afinidade com carboidratos (Rummel, 2013).
[005] O arranjo modular e as propriedades distintas dos vários sorotipos BoNT tornaram as toxinas um alvo de escolha para a manipulação de proteínas. Em particular, vários estudos mostraram que era possível trocar domínios inteiros entre sorotipos (Masuyer et al., 2014) e, assim, obter novas toxinas com potencial farmacêutico singular. Por exemplo, várias moléculas consistindo no domínio de ligação do BoNT/B associado à translocação e aos domínios catalíticos do BoNT/A foram produzidas (Rummel et al., 2011; Wang et al., 2012; Kutschenko et al., 2017). Essas chamadas toxinas quiméricas apresentaram propriedades farmacológicas atraentes em termos de eficácia e duração da atividade, as quais foram associadas à alta afinidade do BoNT/B pela sinaptotagmina e à maior expressão desse receptor nos neurônios em comparação ao SV2 (Takamori et al., 2006; Wilhelm et al., 2014).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Como a geração de anticorpos neutralizantes e a difusão de toxinas estão diretamente relacionadas às doses injetadas, é altamente desejável diminuir as doses de toxinas, mantendo os mesmos níveis de atividade da toxina, o que significa que a eficácia de moléculas de toxina individuais deve ser aprimorada. É, portanto, um objetivo da presente invenção fornecer polipeptídeos BoNT com duração e potência melhoradas, e com menor risco de propagação a partir do sítio da injeção. Os inventores identificaram um problema fundamental com as tentativas anteriores mencionadas acima na manipulação de polipeptídeos BoNT quiméricos. Nenhuma das tentativas anteriores levou em consideração o aspecto estrutural do polipeptídeo.
[007] Usando uma abordagem baseada na estrutura e o conhecimento atual sobre os mecanismos de ligação ao receptor de BoNT/A e /B, os inventores projetaram uma nova molécula, a TriRecABTox (BoNT/TAB), que compreende um domínio de HC (HC/TAB) especificamente modificado que é capaz de reconhecer um receptor de SV2C, um receptor de sinaptotagmina e um receptor de gangliosídeo. Os inventores mostram que o BoNT/TAB pode ser expresso e purificado de maneira recombinante. Utilizando cristalografia de raios-X, os inventores demonstram ainda que o BoNT/TAB pode se ligar a seus três receptores simultaneamente. Assim, o BoNT/TAB deve reconhecer células neuronais com afinidade aprimorada e tem potencial para ser uma alternativa de alta eficácia ao tratamento com BoNT/A.
[008] O objetivo acima é, assim, alcançado, em um primeiro aspecto, ao fornecer um domínio de Ligação de Cadeia Pesada de neurotoxina botulínica (BoNT) (HC/TAB), em que o HC/TAB compreende a) um sítio de ligação ao receptor de sinaptotagmina (Syt) e b) um sítio de ligação ao receptor de vesícula sináptica 2 (SV2) associada, e c) um sítio de ligação ao receptor de gangliosídeo (Gang), e em que o referido HC/TAB é adaptado para se ligar de maneira sinérgica a um receptor de sinaptotagmina (Syt), a um receptor de vesícula sináptica 2 (SV2) associada e a um receptor de gangliosídeo (Gang).
[009] O HC/TAB possui uma extremidade do N-terminal (HCN) e uma extremidade do C-terminal (HCC). De acordo com uma modalidade, o domínio HCC é composto de maneira intercambiável por sequências do sorotipo BoNT A (BoNT/A) e do sorotipo BoNT B (BoNT/B).
[010] De acordo com uma modalidade adicional, a referida extremidade HCC é composta de acordo com uma sequência A1B1A2B2A3, em que A indica uma sequência de BoNT/A e B indica uma sequência de BoNT/B.
[011] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências B1, A2 e B2 compreendem mutações e/ou deleções para criar interfaces intramoleculares estáveis para todo o HC/TAB.
[012] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Gang se originam a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de Gang e subtipos dos mesmos.
[013] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Gang se originam a partir de BoNT/B.
[014] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Gang estão localizadas em B2.
[015] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Syt se originam a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de Syt e subtipos dos mesmos.
[016] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Syt se originam a partir de BoNT B, DC ou G.
[017] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Syt estão localizadas em B1 e B2.
[018] De acordo com ainda uma modalidade adicional, a sequência HCN se origina a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de SV2 e subtipos dos mesmos.
[019] De acordo com ainda uma modalidade adicional, a sequência HCN se origina a partir de BoNT/A.
[020] De acordo com ainda uma modalidade adicional, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de SV2 estão localizadas em HCN e em A1 e A3 no HCC.
[021] De acordo com ainda uma modalidade adicional, o HC/TAB tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 6, 8, 10 ou 12.
[022] De acordo com um segundo aspecto, é fornecido um polipeptídeo compreendendo o HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, acoplado a qualquer outra proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente, diretamente ou através de um ligante.
[023] De acordo com uma modalidade do segundo aspecto, o referido polipeptídeo é um polipeptídeo BoNT (BoNT/TAB), caracterizado pelo fato de que o referido BoNT/TAB além do HC/TAB compreende um domínio de Translocação de Cadeia Pesada (HN), uma cadeia Leve (LC) e um sítio de protease posicionado entre a LC e HN na sequência polipeptídica, em que o HN e a LC, respectivamente e independentemente um do outro, se originam a partir de qualquer um dos sorotipos BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G ou X e subtipos dos mesmos, bem como polipeptídeos semelhantes a BoNT.
[024] De acordo com uma modalidade adicional, o polipeptídeo pode compreender qualquer outra proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente, ligada ao mesmo, diretamente ou através de um ligante.
[025] De acordo com ainda uma modalidade adicional, o sítio de protease é um sítio de exoprotease. De acordo com ainda uma modalidade adicional, o sítio da exprotease é um sítio do Fator Xa.
[026] De acordo com ainda uma modalidade adicional, o polipeptídeo de cordo com o segundo aspecto tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 6, 8, 10 ou 12.
[027] De acordo com um terceiro aspecto, é fornecido um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto e qualquer modalidade do segundo aspecto.
[028] De acordo com um quarto aspecto, é fornecido para o uso do HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto e qualquer modalidade do segundo aspecto, em um método terapêutico ou em um método cosmético.
[029] De acordo com uma modalidade do quarto aspecto, o método terapêutico ou o método cosmético é um tratamento para amortecer e/ou inativar os músculos.
[030] De acordo com uma modalidade adicional do quarto aspecto, o método terapêutico é o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio escolhido a partir do grupo que compreende distúrbios neuromusculares, condições que envolvem a liberação de acetilcolina e distúrbios musculares espásticos.
[031] De acordo com ainda uma modalidade adicional, o distúrbio é escolhido a partir do grupo que compreende disfonia espasmódica, torcicolo espasmódico, distonia laríngea, disfonia oromandibular, distonia lingual, distonia cervical, distonia focal das mãos, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, distúrbio palpebral, paralisia cerebral, espasticidade focal e outros distúrbios da voz, colite espasmódica, bexiga neurogênica, anismo, espasticidade nos membros, tiques, tremores, bruxismo, fissura anal, acalasia, disfagia e outros distúrbios de tônus muscular e outros distúrbios que tem como características por movimentos involuntários de grupos musculares, lacrimação, hiperidrose, salivação excessiva, secreções gastrointestinais excessivas, distúrbios secretores, dor de espasmos musculares, dor de cabeça, lesões esportivas e depressão.
[032] De acordo com ainda uma modalidade adicional, o HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto e qualquer modalidade do segundo aspecto, pode ser usado em um teste farmacológico, para investigar o papel da referida proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente em um processo sináptico.
[033] De acordo com ainda uma modalidade adicional, o HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto e qualquer modalidade do segundo aspecto, pode ser usado como veículo para efetivamente transportar qualquer proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente acoplada ao mesmo a uma superfície neuronal.
[034] De acordo com ainda uma modalidade adicional, o HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto e qualquer modalidade do segundo aspecto, pode ser usado como veículo para efetivamente transportar qualquer proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente para um citosol neuronal usando um sistema de translocação de toxinas.
[035] De acordo com um quinto aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica ou cosmética compreendendo o HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto e qualquer modalidade do segundo aspecto.
[036] De acordo com uma modalidade do quinto aspecto, a composição pode compreender adicionalmente excipientes, carregadores ou outros aditivos farmaceuticamente e/ou cosmeticamente aceitáveis.
[037] De acordo com um sexto aspecto, é fornecido um kit de partes compreendendo a composição do quinto aspecto e instruções para administração terapêutica da composição.
[038] De acordo com um sétimo aspecto, é fornecido um método para o tratamento de uma condição associada à atividade neuronal indesejada, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do HC/TAB de acordo com o primeiro aspecto e qualquer modalidade do primeiro aspecto, ou o polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto e qualquer modalidade do segundo aspecto, ou composição do quinto aspecto, a um indivíduo para desse modo tratar a condição, em que a condição é escolhida a partir do grupo que compreende disfonia espasmódica, torcicolo espasmódico, distonia laríngea, disfonia oromandibular, distonia lingual, distonia cervical, distonia focal das mãos, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, distúrbio palpebral, paralisia cerebral, espasticidade focal e outros distúrbios da voz, colite espasmódica, bexiga neurogênica, anismo, espasticidade nos membros, tiques, tremores, bruxismo, fissura anal, acalasia, disfagia e outros distúrbios de tônus muscular e outros distúrbios que tem como características por movimentos involuntários de grupos musculares, lacrimação, hiperidrose, salivação excessiva, secreções gastrointestinais excessivas, distúrbios secretores, dor de espasmos musculares, dor de cabeça, lesões esportivas e depressão e condições dermatológicas ou estéticas/cosméticas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[039] Figura 1: Informações estruturais sobre a ligação do receptor por BoNT/A e /B. (a) Superposição das estruturas cristalinas do domínio de ligação de BoNT/A em complexo com GT1b (PDB 2VU) e com SV2C glicosilado humano (PDB 5JLV).(b) Estrutura cristalina do domínio de ligação de BoNT/B em complexo com GD1a e sinaptotagmin2 de rato (PDB 4KBB). As proteínas representadas no modo fita e os carboidratos como palitos. (c) Alinhamento sequencial de Hc/A (Uniprot P10845) e /B (Uniprot P10844), em que também são fornecidos elementos estruturais secundários (figura preparada com ESPript3.0; Robert e Gouet, 2014). As regiões diretamente envolvidas na ligação do receptor são destacadas para cada domínio com linha acima da sequência Hc/A para o receptor de SV2 e abaixo da sequência Hc/B para o receptor de Syt; o sítio de ligação do receptor gangliosídeo está sublinhado com uma linha cinza listrada. Figura 2 Alinhamento de sequência de HC/TAB com ligação de receptor por HC/A e /B.
[040] As sequências de proteínas foram alinhadas com ClustalO (Sievers et al., 2011). Os segmentos de HC/A e HC/B usados no projeto de HC/TAB são destacados em preto (escrita branca) e cinza claro (escrita preta), respectivamente. As posições em que as exclusões foram incluídas são mostradas em cinza mais escuro (traço).
[041] Figura 3: Caracterização de HC/TAB. (a) Análise SDS-PAGE de HC/TAB purificado, e comparada com os controles HC/A e HC/B. (b) Análise de Western- blot utilizando uma sonda de poli-Histidina, as mesmas amostras que em (a). 'M' denota os marcadores de peso molecular.
[042] Figura 4: A estrutura cristalina de raio-X do domínio de ligação de TriRecABTox em complexo com SV2C, sinaptotagmin1 humana e GD1a. (a) Representação em fita de HC/TAB, com SV2C, hSyt1 e GD1a. (b-d) Exemplo de 2Fo-Fc mapa de densidade de elétrons (malha) a 2σ em torno do sítio de ligação do receptor de SV2C (b), GD1a (c) e hSyt1 (d).
[043] Figura 5: A ligação ao receptor de SV2. (a) Superposição da estrutura cristalina de HC/TAB e HC/A (PDB 4JRA) em complexo com hSV2C. (b) Superposição da estrutura cristalina de HC/TAB e HC/A (PDB 5JLV) em complexo com o hSV2 glicosilado. Os resíduos envolvidos na ligação (Benoit et al., 2014) são mostrados como palitos e rotulados de acordo com a posição de H C/A correspondente.
[044] Figura 6 Ligação à sinaptotagmina. A sobreposição da estrutura cristalina de HC/TAB e HC/B (PDB 4KBB) em complexo com o Syt1 humano e o Syt2 de ratos, respectivamente. Os resíduos envolvidos na ligação (Jin et al., 2006; Chai et al., 2006) são mostrados como palitos e rotulados de acordo com a posição de HC/B correspondente.
[045] Figura 7: Ligação a GD1a. A sobreposição da estrutura cristalina de HC/TAB e HC/B (PDB 4KBB) em complexo com GD1a (cinza escuro e claro,
respectivamente). Os resíduos envolvidos na ligação (Berntsson et al., 2013) são mostrados como palitos e rotulados de acordo com a posição de H C/B correspondente.
[046] Figura 8: A caracterização de BoNT/TAB. (a) Análise de SDS-PAGE de BoNT/TAB purificado, com os controles HC/A e HC/B. (b-d) Análise de Western- blot utilizando uma sonda de poli-Histidina (b); HC/A (c) e HC/B (d) antissoro. Mesmas amostras que em (a), 'M' denota os marcadores de peso molecular.
[047] Figura 9: Ativação de BoNT/TAB. (a) Representação esquemática do construto de BoNT/TAB que descreve a organização do domínio funcional. O sítio de ativação da protease manipulada é mostrado como uma linha preta tracejada. A ponte de dissulfeto natural entre as cadeias leve e pesada é representada como uma linha preta simples. (b) Análise SDS-PAGE do ensaio de ativação de BoNT/TAB. O BoNT/TAB não ativado não reduzido (NR) e reduzido (R) (à esquerda) e o BoNT/TAB ativado por Fator Xa (à direita), respectivamente. Os fragmentos de interesse são anotados; 'M' denota os marcadores de peso molecular.
[048] Figura 10: Uso prolongado de HC/TAB. (a) Representação esquemática de potenciais derivados de BoNT funcionais associados a H C/TAB. Os construtos consistiriam nos domínios de BoNT funcionais de quaisquer sorotipos ou subtipos ('n'). Um sítio de ativação de protease (linha preta tracejada) também deve ser incluído. (b) Representação esquemática do construto potencial que utiliza HC/TAB para o transporte de proteínas de carga para a superfície das células neuronais.
[049] Figura 11: Purificação de HC/TAB. (a) Cromatógrafo (traço A280) da purificação por cromatografia de afinidade usando uma coluna HisTrap FF de 5 mL. (b) Cromatógrafo (traço A280) da purificação por exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex200. As etapas do processo de purificação e as frações com HC/TAB são destacadas.
[050] Figura 12: Cristais de HC/TAB em complexo com SV2C, hSyt1 e GD1a. (a) Cristal cultivado em 20% v/v de polietilenoglicol 6000, citrato 0,1 M, pH 5,0. (b) Cristal montado em um cryo-loop para coleta de dados na estação Diamond I04-1. (c) Padrão de difração de raio-X do cristal.
[051] Figura 13: Purificação de BoNT/TAB. (a) Cromatógrafo (traço A280) da purificação por cromatografia de afinidade usando uma coluna HisTrap FF de 5 mL. (b) Cromatógrafo (traço A280) da purificação por exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex200. As etapas do processo de purificação e as frações com BoNT/TAB são destacadas.
[052] Figura 14: Estrutura cristalina de raio-X do domínio de ligação de HC/TAB em complexo com SV2C, sinaptotagmina humana e GD1a. (a) e (b) Análise de fator de temperatura das estruturas cristalinas de HC/TAB (a) e HC/TAB2.1 (b) - Representação do raio da massa de vidraceiro, em que o raio é proporcional aos B-fatores. O loop '360' é indicado, com as posições 360 e 362 destacadas em preto. (c) estrutura cristalina de raio-X do complexo HC/TAB2.1, com SV2C, hSyt1 e GD1a (representação em palitos). (d) O mesmo que (c) com o loop de ligação lipídica marcado e os resíduos hidrofóbicos mostrados como palitos.
[053] Figura 15: Purificação de HC/TAB2.1. (a) Cromatógrafo (traço A280) da purificação por cromatografia de afinidade usando uma coluna HisTrap FF de 5 mL. (b) Cromatógrafo (traço A280) da filtração em gel usando uma coluna Superdex200. As frações com HC/TAB2.1 são indicadas. (c) e (d) Caracterização de HC/TAB2.1. Análise por SDS-PAGE de frações de HC/TAB2.1 purificado, a partir da cromatografia de afinidade em (c) e filtração em gel (d); as primeiras pistas à esquerda mostram os marcadores de peso molecular. A banda correspondente a HC/TAB2.1 é indicada.
[054] Figura 16: Purificação de HC/TAB2.1.1 e HC/TAB2.1.3. (a) e (b) Cromatógrafos (traço A280) da purificação por cromatografia de afinidade e filtração em gel de HC/TAB2.1.1, respectivamente. As frações com HC/TAB2.1.1 são indicadas. (c) e (d) Cromatógrafos (traço A280) da purificação por cromatografia de afinidade e filtração em gel de HC/TAB2.1.3, respectivamente. As frações com HC/TAB2.1.3 são indicadas. (d) Caracterização de HC/TAB2.1.1 e HC/TAB2.1.3. Análise por SDS-PAGE das amostras purificadas; a primeira pista à esquerda mostra os marcadores de peso molecular. As bandas correspondentes a HC/TAB2.1.1 e HC/TAB2.1.3 são indicadas
[055] Figura 17: Figura X4: Purificação de BoNT/TAB2.1.3. (a) e (b) análise por SDS-PAGE das frações da purificação de BoNT/TAB2.1.3. As fracções da cromatografia de afinidade (a) e a filtração em gel (b); as primeiras pistas à esquerda mostram os marcadores de peso molecular. A banda correspondente a BoNT/TAB2.1.3 é indicada. (c) análise por SDS-PAGE da amostra de BoNT/TAB2.1.3 purificada. Na pista 1: amostra antes da ativação de trombina, na pista 2: amostra final ativada (tratamento pós-trombina). As bandas correspondentes ao comprimento total (cadeia única), HC e LC são indicadas. A pista à direita mostra os marcadores de peso molecular. (d) Cromatógrafo (rastreio A280) da filtração em gel final (clivagem pós-trombina) usando uma coluna Superdex200. As frações com BoNT/TAB2.1.3 são indicadas.
DEFINIÇÕES
[056] Conforme utilizado na presente invenção, o termo neurotoxina Botulínica "BoNT" abrange qualquer polipeptídeo ou fragmento de uma neurotoxina Botulínica. O termo BoNT pode se referir a um BoNT de comprimento completo. O termo BoNT pode se referir a um fragmento do BoNT que pode executar o mecanismo celular geral pelo qual um BoNT entra em um neurônio e inibe a liberação de neurotransmissores. O termo BoNT pode simplesmente se referir a um fragmento do BoNT, sem exigir que o fragmento tenha qualquer função ou atividade específica.
[057] Conforme usado na presente invenção, o termo "domínio de translocação" ou "HN" significa um domínio de BoNT que pode executar a etapa de translocação do processo de intoxicação que media a translocação de cadeia leve de BoNT. Assim, um HN facilita o movimento de uma cadeia leve de BoNT através de uma membrana para o citoplasma de uma célula.
[058] Conforme usado na presente invenção, o termo "domínio de ligação" é sinônimo de "domínio de HC" e significa qualquer domínio de ligação do receptor de BoNT de ocorrência natural que pode executar a etapa de ligação celular do processo de intoxicação, incluindo, por exemplo, a ligação do BoNT a um sistema receptor específico de BoNT localizado na superfície da membrana plasmática de uma célula alvo.
[059] Na presente invenção, os termos "ácido nucleico" e "gene" são usados de maneira alternada para descrever uma sequência de nucleotídeos, ou um polinucleotídeo, que codifica para um polipeptídeo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[060] Conforme especificado acima na seção dos antecedentes técnicos, um BoNT compreende uma cadeia leve (LC), conectada por uma ponte de dissulfeto única à cadeia pesada (HC). A Cadeia pesada (HC) contém dois dos domínios funcionais, com o domínio de translocação do N-terminal (HN) e o domínio de ligação do C-terminal (HC), enquanto a LC é responsável pela atividade catalítica intracelular. Assim, a HC compreende os domínios de ligação do receptor que são capazes de se ligar específica e irreversivelmente aos receptores específicos expressos nos neurônios suscetíveis, enquanto o HN forma um canal que permite que a LC anexada se transloque a partir das vesículas da membrana do tipo endossomal no citosol. Diferentes sorotipos de
BoNT têm conjuntos diferentes de sítios de ligação ao receptor no HC, tipicamente dois sítios de ligação ao receptor. Os inventores fizeram uso deste conhecimento na manipulação de um novo domínio de ligação de BoNT HC (HC/TAB) compreendendo sítios de ligação para três receptores diferentes.
[061] Os inventores conseguiram isso ao manipular um domínio de HC/TAB compreendendo: a) um sítio de ligação do receptor de sinaptotagmina (Syt), e b) um sítio de ligação do receptor de vesícula sináptica 2 (SV2) associada, e c) um sítio de ligação do receptor de gangliosídeo (Gang),
[062] A estrutura do domínio de HC/TAB manipulado permite que o HC/TAB se ligue de maneira sinérgica a um receptor de sinaptotagmina (Syt), um receptor de vesícula sináptica 2 (SV2) associada e um receptor de gangliosídeo (Gang). Assim, é realizada uma ligação sinérgica a três receptores na célula neuronal, fazendo com que o novo domínio de HC/TAB tenha afinidade aprimorada em comparação com outros domínios de BoNT HC. Assim, uma ligação geral aos neurônios é melhorada e, consequentemente, a eficácia da toxina é melhorada.
[063] O HC/TAB compreende adicionalmente uma extremidade do N- terminal (HCN) e uma extremidade do C-terminal (HCC). Uma característica chave da presente invenção é a estrutura da extremidade HCC do HC/TAB, que é onde os domínios de ligação do receptor estão localizados no BoNT.
[064] Em uma modalidade do HC/TAB, a extremidade HCC é composta de maneira intercambiável por sequências do sorotipo BoNT A (BoNT/A) e do sorotipo BoNT B (BoNT/B). Ao manipular essa estrutura intercambiável, os inventores conseguiram otimizar uma ligação sinérgica a todos os três receptores.
[065] Em uma modalidade adicional da invenção, a extremidade H CC é composta de acordo com uma sequência A1B1A2B2A3, em que A indica uma sequência do BoNT/A e B indica uma sequência de BoNT/B, vide a Fig. 2. Isso adicionalmente otimiza a estrutura do HC/TAB, permitindo que os três domínios de ligação do receptor se liguem pelo menos de maneira sinérgica a todos os três referidos receptores, possivelmente até simultaneamente. Os inventores mostraram que a ligação simultânea a todos os três receptores ocorre in vitro com esta sequência A1B1A2B2A3. A sequência manipulada A1B1A2B2A3 de acordo com esta modalidade particular é descrita na SEQ ID NO: 1.
[066] A fim de otimizar ainda mais o HC/TAB de acordo com o descrito acima, foram introduzidas mutações e deleções para criar interfaces intramoleculares estáveis, vide Fig. 2. Na SEQ ID NO: 1, foram feitas substituições nas posições 306, 360 e 362, e foram feitas deleções, em comparação com a sequência original, entre as posições 265/266 e 360/361. No entanto, o técnico apreciará que mutações e/ou deleções para um aminoácido na posição +1, +2, +3, +4, +5 ou -1, -2, -3, -4 ou -5 a partir das posições especificadas acima podem ter o mesmo efeito. Assim, qualquer modificação em uma posição de +/- 5 aminoácidos a partir das posições especificadas de aminoácidos cai dentro do escopo da presente invenção.
[067] De acordo com modalidades específicas acima, e todos os exemplos abaixo, o sítio de ligação do receptor de gangliosídeo se origina a partir de BoNT/B, mas é concebível que ele possa se originar a partir de qualquer sorotipo de BoNT de ligação ao receptor de Gang e subtipos dos mesmos, como os sorotipos BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G ou X ou subtipos dos mesmos, uma vez que todos os sorotipos possuem um sítio de ligação ao receptor de gangliosídeo.
[068] De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Gang estão localizadas em B2.
[069] O domínio de ligação receptor de SV2 normalmente pode se originar a partir de qualquer sorotipo BoNT de ligação ao receptor SV2 e subtipos dos mesmos, e em particular a partir dos sorotipos BoNT A, D, E e F. Nas modalidades específicas acima e em todos os exemplos abaixo, o domínio de ligação ao receptor de SV2 se origina a partir de BoNT/A, mas, como o técnico compreenderá, qualquer sorotipo compreendendo um domínio de ligação ao receptor de SV2 pode ser usado como origem do referido domínio, de acordo com a finalidade e o uso pretendido do HC/TAB de acordo com as reivindicações anexas.
[070] Parte do domínio de ligação do receptor de SV2 está presente na extremidade de HCN. Assim, como uma consequência, a sequência de HCN pode se originar a partir de qualquer um dos sorotipos BoNT de ligação ao receptor de SV2 e subtipos dos mesmos. Nas modalidades específicas acima e em todos os exemplos abaixo, a extremidade de HCN se origina a partir de BoNT/A. No entanto, como o técnico irá apreciar, desde que o domínio de ligação ao receptor de SV2 seja funcional, a sequência de HCN também pode se originar a partir de qualquer um dos sorotipos BoNT C, D, E, F ou G.
[071] Além disso, de acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de SV2 estão localizadas em HCN e em A1 e A3 no HCC.
[072] O sítio de ligação do receptor de Syt pode se originar a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de Syt e subtipos dos mesmos. Em particular, o sítio de ligação ao receptor de Syt pode se originar a partir dos sorotipos BoNT B, quimera DC ou G. De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Syt estão localizadas em B1 e B2.
[073] A presente invenção também fornece um polipeptídeo compreendendo o HC/TAB de acordo com o descrito acima. O polipeptídeo pode assim compreender qualquer outra proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente, sendo acoplado ao HC/TAB diretamente ou através de um ligante. Doravante, uma proteína, polipeptídeo ou sequência de aminoácido a ser acoplada ao HC/TAB é referida como "proteína".
[074] De acordo com uma modalidade preferencial, o polipeptídeo é um polipeptídeo de BoNT recombinante (BoNT/TAB) compreendendo adicionalmente um HN e um LC, bem como um sítio de exoprotease posicionado entre a LC e HN na sequência polipeptídica.
[075] O sítio de exoprotease permite que o polipeptídeo de cadeia única seja clivado em uma molécula de di-cadeia, fazendo com que a molécula se torne uma toxina ativa. De acordo com uma modalidade da invenção, o sítio de exoprotease é um sítio do Fator Xa, embora isso não seja uma característica limitante do polipeptídeo de acordo com a invenção.
[076] De acordo com uma modalidade, o BoNT/TAB em sua forma ativa está de acordo com a SEQ ID NO: 5. De acordo com outra modalidade, o BoNT/TAB em sua forma ativa está de acordo com qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 6, 8, 10 ou 12. Preferencialmente, o BoNT/TAB na sua forma ativa é de acordo com a SEQ ID NO: 12.
[077] Tanto o HN como a LC podem, respectivamente e independentemente, originar-se a partir de qualquer um dos sorotipos BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G ou X e subtipos dos mesmos, bem como polipeptídeos semelhantes a BoNT. Novas proteínas que se assemelham ao BoNT, isto é, com uma arquitetura de domínio semelhante e um grau variável de identidade de sequência, mas produzidas por outros organismos que não o C. botulinum, estão emergindo. Assim, o técnico poderá escolher um HN e/ou um LC a partir de qualquer um dos sorotipos BoNT, subtipos dos mesmos ou polipeptídeos similares a BoNT.
[078] As mutações e deleções que são introduzidas no HC/TAB, conforme especificado acima, garantem adicionalmente que um BoNT/TAB manipulado possa ser produzido como uma proteína solúvel com a estrutura correta e a atividade exigida.
[079] Um polipeptídeo de acordo com o acima descrito é preferencialmente produzido de maneira recombinante, uma vez que o H C/TAB precisa ser produzido de maneira recombinante.
[080] Assim, a presente invenção também fornece ácidos nucleicos isolados e/ou recombinantes que codificam qualquer um do HC/TAB ou polipeptídeos ou de acordo com o descrito acima. Os ácidos nucleicos que codificam o HC/TAB ou polipeptídeos da presente invenção podem ser DNA ou RNA, fita dupla ou fita simples. Em certos aspectos, os ácidos nucleicos do sujeito que codificam os fragmentos de polipeptídeo isolados são compreendidos adicionalmente como incluindo ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que são variantes de qualquer um do HC/TAB ou polipeptídeos ou descritos na presente invenção. Sequências nucleotídicas variantes incluem sequências que diferem por uma ou mais substituições, adições ou deleções nucleotídicas, como variantes alélicas.
[081] A presente invenção também fornece um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o HC/TAB de acordo com o descrito acima. O vetor pode compreender adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer outra proteína ou sonda que deve ser produzida de maneira recombinante juntamente com o HC/TAB, de modo a obter a referida proteína ou sonda acoplada ao HC/TAB em um polipeptídeo. O vetor é preferencialmente um vetor de expressão. O vetor pode compreender um promotor operacionalmente ligado ao ácido nucleico. Uma variedade de promotores pode ser usada para a expressão dos polipeptídeos descritos na presente invenção e são conhecidos pelo técnico no assunto.
[082] Um vetor de expressão compreendendo o ácido nucleico pode ser transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais (por exemplo, eletroporação, transfecção lipossômica e precipitação de fosfato de cálcio) e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir os polipeptídeos descritos na presente invenção. Em algumas modalidades, a expressão dos polipeptídeos descritos na presente invenção é regulada por um promotor constitutivo, indutível ou específico de tecido.
[083] Os polipeptídeos podem ser produzidos em qualquer célula, eucariótica ou procariótica, ou em levedura. Os polipeptídeos de acordo com a invenção podem adicionalmente ser produzidos em um sistema livre de células. O técnico será capaz de aplicar prontamente o sistema de expressão preferido a essa pessoa. O sistema de expressão utilizado para a produção dos polipeptídeos da invenção não se limita ao escopo da invenção.
[084] A purificação e a modificação de proteínas recombinantes são bem conhecidas na técnica, de modo que o projeto do precursor de poliproteína pode incluir uma série de modalidades prontamente apreciadas por um técnico no assunto.
[085] A proteína a ser incluída no polipeptídeo pode ser qualquer proteína de interesse a ser transportada para uma célula neuronal e/ou internalizada em uma célula neuronal.
[086] Pode ser vantajoso compreender um HN de acordo com o descrito acima no polipeptídeo, juntamente com o HC/TAB, e substituir a LC pela proteína de interesse, se uma internalização da proteína for desejada, como o HN fornecerá um canal que permite que a proteína se transloque para a célula neuronal. Pode ser vantajoso acoplar a proteína de interesse diretamente ao HC/TAB se a superfície celular neuronal for o alvo da proteína. Assim, as seguintes combinações podem ser obtidas, dependendo da liberação pretendida: i) Proteína - HC/TAB ii) Proteína - HN - HC/TAB iii) Proteína - LC - HN - HC/TAB
[087] Ao acoplar uma proteína de carga ao H161659 HC/TAB, de acordo com i) acima, a proteína de carga pode ser direcionada para a superfície neuronal. Provavelmente ocorreria alguma internalização através de processos regulares de reciclagem da superfície celular, mas a superfície neuronal seria o principal alvo dessa abordagem.
[088] Ao acoplar uma proteína de carga a um HN acoplado ao HC/TAB de acordo com ii) acima, ou ao BoNT/TAB de acordo com iii) acima, as referidas proteínas de carga podem ser transportadas mais efetivamente dentro dos neurônios usando o sistema de translocação de toxinas. Uma vez que a toxina BoNT tenha sido internalizada na célula do neurônio nas vesículas, conforme descrito nos antecedentes, o ambiente endossômico ácido na vesícula causa uma alteração conformacional que permite a translocação da LC a partir da vesícula para o citosol da célula. Assim, o referido sistema de translocação de toxina, que é o mecanismo para translocar a LC do BoNT a partir da vesícula internalizada para o citosol, pode ser usado para translocar a proteína de carga acima mencionada para o citosol da célula do neurônio, usando o BoNT/TAB. Uma proteína de carga pode ser acoplada ao HN em vez da LC, com um sítio de exoprotease posicionado entre a proteína de carga e HN conforme revelado acima, ou uma proteína de carga pode ser acoplada à LC. Ambas as variantes permitirão o transporte da proteína de carga para o citosol da célula neuronal.
[089] Assim, ambos o HC/TAB e o BoNT/TAB podem ser utilizados como veículos para transportar qualquer proteína para e/ou em um neurônio. Isso também fornece a possibilidade de usar o HC/TAB e/ou o BoNT/TAB em um teste farmacológico para investigar o papel de uma proteína em, por exemplo, um processo sináptico.
[090] A proteína de carga pode, por exemplo, ser qualquer etiqueta de proteína, como etiquetas de afinidade ou fluorescentes ou sondas. Assim, qualquer ácido nucleico correspondente a essa etiqueta de proteína pode ser incluído no vetor revelado acima. O técnico será capaz de usar métodos de clonagem padrão para compreender qualquer gene de interesse no vetor, bem como protocolos padrão para a expressão da proteína.
[091] O domínio de ligação de BoNT e da proteína de carga podem ser expressos separadamente com um sistema sortase que permite sua recombinação em pós-tradução. A atividade da transpeptidase da sortase pode, assim, ser usada como uma ferramenta para produzir proteínas de fusão in vitro e está bem dentro do conhecimento de um técnico neste campo da técnica. Em resumo, um motivo de reconhecimento (LPXTG) é adicionado ao C-terminal de uma proteína de interesse, enquanto um motivo de oligo-glicina é adicionado ao N-terminal da segunda proteína a ser ligada. Após a adição de sortase à mistura de proteínas, os dois peptídeos são covalentemente conectados através de uma ligação peptídica nativa. Este método pode ser utilizado para produzir um polipeptídeo de acordo com a presente invenção. No presente caso, isso significa que o motivo de reconhecimento é adicionado ao C-terminal da proteína de interesse e o motivo de oligoglicina é adicionado ao N-terminal do HC/TAB ou BoNT/TAB.
[092] Adicionalmente, o HC/TAB e/ou o BoNT/TAB podem ser utilizados em um método terapêutico ou um método cosmético. Normalmente, o uso do HC/TAB e/ou do BoNT/TAB pode ser muito semelhante aos usos já existentes para os produtos de BoNT/A e/ou BoNT/B. Isso inclui métodos e tratamentos nos quais o objetivo do método e tratamento é amortecer e/ou desativar os músculos.
[093] O HC/TAB de acordo com a invenção permite injeções de um BoNT/TAB tendo uma maior afinidade para a célula e consequentemente uma maior eficiência. Assim, são exigidas doses mais baixas e uma maior duração da ação é possível. Portanto, uma quantidade menor de BoNT/TAB, em comparação com BoNT/A ou BoNT/B, pode ser injetada para o mesmo efeito, o que diminui os efeitos adversos à medida que menos BoNT/TAB se espalha do sítio da injeção. Com uma eficiência mais alta, uma ligação mais forte e mais eficiente e uma dose mais baixa exigida, há menos BoNT/TAB redundante disponível para se espalhar para além do sítio da injeção. Além disso, o BoNT poderia ser administrado com menos frequência com efeito sustentado, o que também minimizaria o risco de uma resposta imune e reações adversas como consequência do mesmo.
[094] Condições médicas típicas que podem ser tratadas e/ou prevenidas com o HC/TAB e/ou o BoNT/TAB de acordo com o descrito acima são distúrbios escolhidos a partir do grupo que compreende distúrbios neuromusculares, condições que envolvem a liberação de acetilcolina e distúrbios de músculo espástico. Mais especificamente, pode dizer respeito a distúrbios escolhidos a partir do grupo que compreende disfonia espasmódica, torcicolo espasmódico, distonia laríngea, disfonia oromandibular, distonia lingual, distonia cervical, distonia focal das mãos, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, distúrbio palpebral, paralisia cerebral, espasticidade focal e outros distúrbios da voz, colite espasmódica, bexiga neurogênica, anismo, espasticidade nos membros, tiques, tremores, bruxismo, fissura anal, acalasia, disfagia e outros distúrbios de tônus muscular e outros distúrbios que tem como características movimentos involuntários de grupos musculares, lacrimação, hiperidrose, salivação excessiva, secreções gastrointestinais excessivas, distúrbios secretores, dor de espasmos musculares, dor de cabeça, lesões esportivas e depressão.
[095] No que diz respeito aos métodos cosméticos, o HC/TAB e/ou o BoNT/TAB podem preferencialmente ser usados para prevenir e/ou tratar rugas, sulcos na sobrancelha ou linhas indesejadas, a fim de reduzir as referidas rugas, sulcos e linhas.
[096] O HC/TAB e/ou o BoNT/TAB de acordo com o acima podem ser formulados em qualquer composição farmacêutica ou cosmética adequada. A composição farmacêutica compreendendo o HC/TAB e/ou o BoNT/TAB pode compreender adicionalmente excipientes, carregadores ou outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica compreendendo o HC/TAB e/ou o BoNT/TAB pode compreender adicionalmente excipientes, carregadores ou outros aditivos cosmeticamente aceitáveis.
[097] A administração da composição farmacêutica ou cosmética pode ser via injeção, em que a injeção é administrada no sítio do corpo onde está presente atividade neuronal indesejada. Tipicamente, as composições para administração por injeção são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico sítio para aliviar a dor no sítio da injeção.
[098] Além disso, a composição farmacêutica ou cosmética pode estar compreendida em um kit com instruções para administração terapêutica da composição. Nesse kit, os ingredientes da composição podem ser supridos separadamente ou misturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou saqueta, indicando a quantidade de agente ativo. A composição pode ser administrada por infusão e, nesse caso, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água ou solução salina estéril de grau farmacêutico. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração. Uma composição para administração sistêmica pode ser um líquido, por exemplo, solução salina estéril, solução de Ringer com lactato ou de Hank. Além disso, a composição pode estar em formas sólidas e redissolvida ou suspensa imediatamente antes do uso. Formas liofilizadas também são contempladas. A composição pode estar contida dentro de uma partícula lipídica ou vesícula, tal como um lipossoma ou microcristais, o que também é adequado para administração por via parentérica.
[099] Assim, os inventores desenvolveram um bio-híbrido de BoNT manipulado adaptado para se ligar simultaneamente a todos os três dos receptores de SV2C, receptor de sinaptotagmina e o receptor de gangliosídeo. Desse modo, é fornecido um bio-híbrido de BoNT que possui uma potência, eficácia e duração mais altas do que os polipeptídeos de BoNT do estado da técnica. A utilização do presente bio-híbrido permite assim a administração de doses mais baixas da toxina do que de acordo com o estado da técnica, mantendo o mesmo efeito. Além disso, o uso do presente bio-híbrido permite administrações menos frequentes do que as para BoNTs usadas anteriormente. Assim, um tratamento de um paciente com o bio-híbrido de BoNT da presente invenção será mais confortável, pois a administração não precisa ocorrer com a mesma frequência que no estado da técnica. Seção experimental Materiais e Métodos
[0100] Construtos. O cDNA que codifica HC e o TriRecABTox (inativo) de comprimento total (HC/TAB e BoNT/TAB, respectivamente) foram otimizados por códon para expressão de E. coli (vide informações adicionais para a sequência de DNA), sintetizados e clonados em um vetor pET-28a(+) com uma etiqueta N-terminal 6 x His (GenScript, NJ, EUA). O construto TriRecABTox usado em nosso estudo possui três mutações no sítio catalítico para evitar quaisquer preocupações de segurança (E224Q/R363A/Y366F) (Rossetto et al, 2001; Binz et al, 2002). O gene BoNT/TAB codifica 1311 aminoácidos e o gene HC/TAB corresponde aos resíduos [875-1311].
[0101] Expressão e purificação de proteínas. Os plasmídeos portadores do gene de interesse foram transformados em células E. coli BL21 (DE3) (New England BioLabs, EUA). Um protocolo semelhante foi usado para ambas as proteínas. As expressões foram realizadas ao cultivar células em meio de caldo terrific com 50 µg/mL de canamicina a 37°C por aproximadamente 3 horas e depois induzidas com uma concentração final de 1 mM de IPTG e deixadas durante a noite a 18°C, em um sistema LEX (Epyphite3, Canadá). As células foram colhidas e armazenadas a -80°C. A lise celular para extração de proteínas foi realizada com um Emulsiflex-C3 (Avestin, Alemanha) a 20 kPsi em HEPES a 25 mM, pH 7,2 com NaCl a 200 mM, imidazol a 25 mM e glicerol a 5% (v/v). Os detritos celulares foram centrifugados por ultracentrifugação a 4°C, 267.000g por 45 min. A proteína foi primeiro purificada por cromatografia de afinidade: o sobrenadante foi carregado em uma coluna HisTrap FF de 5 mL (GE Healthcare, Suécia), lavado com HEPES 25 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM, NaCl 200 mM, imidazol 25 mM e glicerol a 5% (v/v) e a proteína eluída com HEPES 25 mM, pH 7,2, NaCl 200 mM, imidazol 250 mM e glicerol a 5% (v/v). A amostra foi então dialisada contra HEPES 25 mM pH 7,2, NaCl 200 mM e glicerol a 5% (v/v) durante a noite, antes de uma etapa final de purificação por exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex200 em um tampão semelhante (GE Healthcare, Suécia). HC/TAB foi mantido em 4,5 mg/mL e BoNT/TAB em 7,3 mg/mL, em HEPES 25 mM, pH 7,2 com NaCl 200 mM, TCEP 0,025 mM e glicerol a 5%.
[0102] Caracterização de proteínas. As amostras de proteína foram analisadas por eletroforese em gel usando géis NuPAGE 4-12% Bis-Tris, e os Western blots foram realizados em membranas de PVDF (ThermoFisher, Suécia). Os anticorpos primários contra HC/A e HC/B foram preparados internamente (criados em coelho) e sondados com um anticorpo anti-IgG-Peroxidase de coelho (catálogo #SAB3700852, Sigma, Suécia). A etiqueta de poli-histidina foi sondado utilizando um anticorpo monoclonal conjugado com HRP (AD1.1.10, catálogo #MA1-80218, ThermoFisher, Suécia). O substrato de TMB (Promega, Suécia) foi utilizado para detecção. Controles internos purificados de forma semelhante a HC/TAB e consistindo em HC/A e HC/B etiquetados com His foram incluídos para comparação.
[0103] Ativação de BoNT/TAB. O TriRecABTox (inativo) de comprimento total foi modificado com um sítio de clivagem do Fator Xa (IEGR) entre as cadeias leve e pesada para ativação em uma forma de di-cadeia. A ativação foi realizada ao incubar 100 µg de BoNT/TAB com 2 µg. do Fator Xa (New England BioLabs, EUA) durante a noite a 4°C. Os resultados da ativação foram analisados por eletroforese em gel (como acima).
[0104] Clonagem, expressão e purificação de SV2C-L4. A parte de interação do quarto domínio luminal da glicoproteína 2C da vesícula sináptica (SV2C-L4, resíduos 474-567 Uniprot ID Q496J9) foi amplificada a partir do cDNA e clonada em um vetor pNIC28-Bsa4 (etiqueta His6 do N-terminal com sítio de TEV) usando clonagem LIC. O SV2CL4 foi expresso em E. coli BL21 (DE3) (New England BioLabs, EUA), utilizando um protocolo semelhante ao descrito acima. A SV2C-L4 etiquetada com His foi purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna HisTrap HP de 2 mL (GE Healthcare, Suécia), lavada com HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, 10% (v/v) de glicerol, imidazol 50 mM e 0,5 mM de TCEP. A proteína eluiu com 20 mM de HEPES, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% (v/v) de glicerol, 500 mM de Imidazol e 0,5 mM de TCEP. O SV2CL4 foi então purificado adicionalmente por exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex 75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare, Suécia) em 20 mM HEPES, pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% (v/v) de glicerol e 0,5 mM TCEP.
[0105] Cristalografia de raio-x. As amostras para cristalização foram preparadas por pré-incubação por 15 min à temperatura ambiente de HC/TAB a 3,6 mg/mL, com SV2C-L4 a 1mg/mL (loop-4 extracelular de SV2C humano recombinante [resíduos 475-565], Peptídeo 1 mM hSytI (GEGKEDAFSKLKEKFMNELHK, sintetizado por GenScript, EUA) e oligossacarídeo 4 mM GD1a (Elicityl, França).
[0106] Os cristais foram crescidos com 200 nL de amostra misturada com 100 nL de solução de reservatório consistindo em 20% v/v de polietilenoglicol 6000, Citrato 0,1 M pH 5.0 (JCSG-plus tela B9, Molecular Dimensions, Reino Unido) usando uma preparação de gotas de assentamento. e incubado a 21°C. Os cristais apareceram dentro de 2 semanas e foram transferidos para um cryo- loop e congelados em nitrogênio líquido.
[0107] Os dados de difração foram coletados na estação I04-1 da Diamond Light Source (Didcot, Reino Unido), equipada com um detector PILATUS-6M (Dectris, Suíça). Um conjunto de dados completo para 1,5 Å foi coletado a partir de um único cristal a 100°K. As imagens de dados brutos foram processados e escalados com DIALS (Gildea et al, 2014) e AIMLESS (Evans, 2006) usando o CCP4
7.0 (CCP4, 1994).
[0108] A substituição molecular foi realizada com um modelo preparado a partir das coordenadas de HC/A no complexo com SV2C-L4 (código de PDB 4JRA) e de HC/B no complexo com SytII de rato e GD1a (código de PDB 4KBB) para determinar fases iniciais da solução estrutural em PHASER (McCoy et al., 2007). Os modelos de trabalho foram refinados usando REFMAC5 (Murshudov et al,
2011) e ajustados manualmente com COOT (Emsley et al., 2010). Moléculas de água foram adicionadas em posições em que os picos de densidade de elétrons de Fo-Fc excederam 3σ, e possíveis ligações de hidrogênio poderiam ser feitas. A validação foi realizada com MOLPROBITY (Chen et al., 2010). As estatísticas de Ramachandran mostram que 97,0% de todos os resíduos estão na região mais favorecida, com um único outlier na região não permitida. As estatísticas dos dados cristalográficos estão resumidas na Tabela 1. As figuras foram desenhadas com PyMOL (Schrödinger, LLC, EUA).
RESULTADOS Projeto de TriRecABTox: uma toxina botulínica projetada com sítios de ligação de três receptores.
[0109] Para materializar o conceito de uma toxina de três receptores, os inventores analisaram primeiro a informação estrutural disponível nas interações moleculares BoNT/A e /B com seus receptores. Trabalho recente de Yao et al. (2016) e Benoit et al. (2014) forneceram as estruturas cristalinas de raios-X do domínio de ligação ao receptor de BoNT/A em complexo com SV2C com (PDB 5JLV) e sem modificação pós-tradução (PDB 4JRA), respectivamente. O domínio luminal do SV2C (alça4) forma uma β-hélice quadrilateral que se associa a HC/A principalmente por meio de interações de cadeia principal-cadeia principal com uma β-fita aberta na interface dos dois subdomínios, enquanto o N-glicano de SV2C estende-se para HCN (Figura 1). Juntas, essas estruturas demonstraram um modo de ligação comum às duas formas de SV2 que também deveriam se estender a SV2A e SV2B glicosilados (Yao et al., 2016). Esses estudos destacaram os principais resíduos e múltiplos sítios envolvidos na interação toxina-SV2 que devem ser mantidos no projeto do TriRecABTox (Figura 1). Estes incluíram segmentos [949-953], [1062-1066], [1138-1157] e [1287-1296] de BoNT/A. Os números de resíduos são baseados na sequência de BoNT/A1
(Uniprot-P10845).
[0110] Várias estruturas cristalinas de BoNT/B em complexo com sinaptotagmina também foram descritas e ajudaram a definir a interação da toxina com seu receptor (Chai et al., 2006; Jin et al., 2006; Berntsson et al., 2013) (Figura 1). Após a ligação, o peptídeo Syt assume uma estrutura helicoidal curta que se liga ao longo de uma ranhura na ponta distal do subdomínio C-terminal, envolvendo diretamente os segmentos [1113-1118] e [1183-1205] de BoNT/B. Os números de resíduos são baseados na sequência de BoNT/B1 (Uniprot- P10844). Essas regiões foram, portanto, consideradas essenciais para incluir no construto TriRecABTox.
[0111] Além disso, as estruturas cristalinas BoNT/A e /B em complexo com seu receptor gangliosídeo (Stenmark et al., 2008; Hamark et al., 2017; Berntsson et al., 2013) forneceram uma descrição detalhada do sítio de ligação de carboidratos para cada sorotipo. O sítio é altamente conservado em toda a família das neurotoxinas botulínicas e consiste em um bolso raso no subdomínio HCC (Figura 1) composta pelo padrão SxWY central (1264-1267 em /A; 1260-1263 em /B) e as regiões de loop circundantes. Notavelmente, esse bolso é adjacente ao sítio de ligação ao receptor Syt em BoNT/B, separada por loop [1244-1253], no entanto, nenhum efeito alostérico foi relatado na ligação simultânea dos dois receptores (Bertnsson et al., 2013). No interesse de minimizar qualquer alteração estrutural no sítio de ligação ao receptor de Syt, foi considerado mais adequado incorporar o sítio de ligação ao receptor de gangliosídeo de BoNT/B, em vez de BoNT/A, no projeto de TriRecABTox.
[0112] Após a identificação dos componentes dos dois sorotipos essenciais para a ligação aos três receptores diferentes, foi realizada uma análise estrutural adicional para integrá-los em uma única molécula. Nesta medida, as sequências primárias de BoNT/A (Uniprot P10845) e BoNT/B (Uniprot P10844) foram alinhadas com ClustalO (Sievers et al., 2011) e as estruturas tridimensionais de seu domínio de ligação sobrepostas (Figura 1). Os dois sorotipos compartilham uma identidade de sequência geral de 40%, no entanto, a semelhança cai para 34% para o subdomínio C-terminal de HC, a principal região responsável pelo reconhecimento de receptores. A dobra do núcleo do domínio de ligação é conservada em todas as neurotoxinas clostridiais (Swaminathan, 2011; Rummel et al., 2011), mas com notável variação no comprimento dos loops de conexão. Portanto, era importante levar em consideração as estruturas secundárias (Figura 1), para manter intacta a arquitetura principal do domínio. O modelo para a molécula recém-projetada, consequentemente, apareceu como várias alternâncias entre os elementos BoNT/A e /B, criando novas interfaces intramoleculares não naturais que podem não ser compatíveis. A inspeção das estruturas de cristal sobrepostas de HC/A e HC/B permitiu que os inventores otimizassem o projeto corrigindo possíveis choques, seja por substituições simples de amino ou por exclusões em localizações chave (Figura 2). Particularmente, a cadeia lateral de cada resíduo nas áreas conflitantes foi revisada, resultando em três substituições de BoNT/B para o aminoácido equivalente de BoNT/A: N1180, G1234, N1236 (SEQ ID NO: 3). Além disso, vários aminoácidos foram removidos (Figura 2) para corresponder aos elementos da estrutura secundária e compensar as variações de comprimento entre BoNT/A e /B nas regiões de loop das interfaces de transição. Foram feitas deleções entre L1139 e G1140, bem como entre G1234 e T1235 (referente à SEQ ID NO: 3), comparadas às sequências BoNT/A e BoNT/B (Figura 2).
[0113] A molécula resultante, denominada TriRecABTox, deve ser capaz de se ligar aos três receptores: SV2, sinaptotagmina e gangliosídeos. Sua sequência de proteínas é fornecida em SEQ. ID NO: 3 (forma inativa) e SEQ. ID NO: 5 (forma ativa).
Produção e caracterização do domínio de ligação TriRecABTox.
[0114] O primeiro passo para a caracterização de TriRecABTox foi produzir de maneira recombinante o domínio de ligação (HC/TAB) para analisar suas propriedades bioquímicas. Para este fim, a sequência proteica foi otimizada por códon para expressão em E. coli. O gene resultante foi clonado em um vetor pET- 28a(+) de modo a incluir uma etiqueta de poli-histidina N-terminal e facilitar o processo de purificação de proteínas. Detalhes são fornecidos na seção de métodos. Os inventores mostraram que HC/TAB poderia ser expresso e parcialmente purificado (Figura 3) utilizando cromatografia de afinidade e técnicas de exclusão de tamanho (Figura 11). A amostra original apresentou alguns contaminantes de baixo peso molecular que provavelmente correspondem a proteínas residuais das células hospedeiras. Etapas de purificação adicionais usando métodos como cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica devem ajudar a obter uma amostra de maior pureza. Foi confirmada a presença de HC/TAB por Western blot, onde foi observada uma única banda no tamanho esperado (aproximadamente 53kDa) (Figura 3). Estrutura cristalina do domínio de ligação TriRecABTox em complexo com seus três receptores.
[0115] Em um esforço para avaliar a capacidade de HC/TAB de se ligar a seus três receptores, foram realizados ensaios de cocristalização que incluíam HC/TAB com o domínio luminal humano SV2C [resíduos 475-565], o peptídeo Syt1 humano [resíduos 34-53] e o hidrato de carbono GD1a. Foram obtidos cristais que difrataram em alta resolução (1,5Å) (Figura 12) e um conjunto de dados completo pode ser coletado (Tabela 1). A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando um modelo de entrada com todos os componentes potenciais. A solução confirmou que a estrutura cristalina continha todos os quatro elementos: HC/TAB ligou a ele três receptores simultaneamente (referido como
HC/TAB-3R) (Figura 4). Este resultado fornece a primeira evidência experimental de que TriRecABTox pode atingir seu objetivo in vitro e também permitiu uma análise completa do mecanismo de ligação ao receptor em detalhes atômicos.
Utilizando as informações estruturais recém-determinadas, poderíamos comparar diretamente a interação entre HC/TAB, HC/A, HC/B e seus respectivos receptores.
Tabela 1. Cristalografia de raios-X: estatísticas de coleta e refinamento de dados HC/TAB – SV2C – hSytI – complexo de GD1a Coleta de dados Grupo de espaço P212121 Dimensões de célula a, b, c (Å) 43,7, 115,9, 141,4 a, b, g () 90,0, 90,0, 90,0 Resolução (Å) 1,5-60,4 (1,51-1,53) * Nº reflexões totais/únicas 3.583.212 / 113.806 Rmerge 0,119 (1,926)* Rpim 0,021 (0.501)* CC1/2 1,00 (0,839)* I / sI 13,0 (1,1) * 26 Plenitude (%) 99,9 (97,2) * Redundância 31,5 (15,1) * Refinamento Rwork / Rfree (%) 17,4 / 22,1 Nº átomos 5 HC/TAB 3,682 SV2C 761 hSytI 143 GD1a 56 Água 446 B-fatores HC/TAB 27,4 10 SV2C 44,4 hSytI 35,8 GD1a 36,8 Água 40,2 Desvios R.M.S.
Comprimentos de ligação (Å) 0,009
Ângulos de ligação () 1,37 *Os valores entre parênteses são para envoltório de alta resolução.
[0116] Em primeiro lugar, o domínio de ligação do recém-modificado BoNT/TAB apresenta a dobra esperada com seus dois subdomínios: a HCN do tipo lectina e a dobra em trevo HCC (Figura 4). As múltiplas novas interfaces intramoleculares criadas não perturbaram a estrutura geral, conforme ilustrado pelos desvios quadrados médios das raízes (rmsd) de 0,69Å (acima de 364 Cα) quando sobrepostos com HC/A e de 0,81Å (370 Cα) com HC/B. O HC/TAB completo foi modelado [876-1311], exceto para a etiqueta e loop poli-histidina N-terminal [1169-1173] que foram desordenados. A falta de densidade de elétrons para essas partes pode ser explicada pelo fato de que essas regiões não estão envolvidas em nenhuma interação e localizadas dentro das áreas acessíveis ao solvente do cristal.
[0117] A estrutura HC/TAB-3R foi comparada com a de HC/A em complexo com SV2C. A estrutura do domínio luminal SV2C é idêntica em ambos os complexos, com um rmsd de 0,483Å (acima de 88 Cα). As duas estruturas foram alinhadas em três dimensões com base nos domínios HC e mostraram que o SV2C está no mesmo local, conforme esperado no projeto do inventor (Figura 5). Em particular, as regiões de HC/A que foram designadas como necessárias para a ligação ao receptor SV2 e foram incluídas em HC/TAB são totalmente preservadas. A interface entre HC/A e SV2C foi analisada com o PISA (Kissinel, 2015) e corresponde a uma área superficial de 540A2, envolvendo principalmente interações eletrostáticas, nas quais cadeias abertas de ambas as proteínas formam uma estrutura complementar de folha β (Benoit et al., 2014). A análise correspondente com HC/TAB mostra uma área de superfície com SV2C de 630Å2 e confirmou o mecanismo de ligação com um número comparável de ligações de hidrogênio. Além disso, os inventores também consideraram a ligação potencial ao SV2 glicosilado comparando o HC/TAB-3R com o complexo HC/A-gSV2C (Figura 5). Recentemente, a N-glicosilação de N559 mostrou-se essencial para o reconhecimento de receptores e é conservada nas isoformas SV2 (Yao et al., 2016). Notavelmente, a interação proteína-proteína entre HC/A e SV2C é altamente semelhante com ou sem glicosilação. A cadeia de carboidratos se estende em direção ao subdomínio HCN. A análise dos resíduos HC/A envolvidos na interação proteína-glicano mostra que sua posição é completamente conservada em HC/TAB-3R, assim, HC/TAB deve reconhecer as isoformas de N-glicosilado de SV2.
[0118] Os inventores compararam então a estrutura HC/TAB-3R com HC/B em complexo com rSyt2. Espera-se que BoNT/B se ligue à sinaptotagmina humana de maneira semelhante aos seus homólogos de roedores, embora com afinidades variadas (Tao et al., 2017). Na estrutura cristalina apresentada aqui, hSyt1 também assume um arranjo helicoidal α que fica dentro da mesma ranhura de ligação que rSyt2 em HC/B (Figura 6). A superposição de hSyt1 com rSyt2 ligada aos seus respectivos domínios HC confirma a configuração peptídica conservada com um rmsd de 0,560Å (acima de 13 Cα). Além disso, a bolsa de ligação ao receptor é completamente preservada em HC/TAB, com todos os resíduos envolvidos na ligação apresentando uma configuração semelhante em ambas as estruturas (Figura 6). Isso foi confirmado com uma análise do PISA, em que uma interface de 861Å2 foi calculada para a interação HC/TAB: hSyt1 que também inclui onze ligações eletrostáticas e é comparável à 712Å2 HC/B: interface rSyt2 (PDB 4KBB) com sete ligações eletrostáticas. O mecanismo de reconhecimento é principalmente baseado em fortes interações hidrofóbicas proteína-proteína. A pequena diferença na área da superfície de contato e o número de interações eletrostáticas pode ser explicada pela variação da sequência entre hSyt1 e rSyt2, particularmente em relação à metade C-terminal do peptídeo.
[0119] O terceiro receptor contido na estrutura HC/TAB-3R corresponde ao carboidrato GD1a, para o qual foi observada uma clara densidade de elétrons de Gal2 a Sia5 (Figura 4). Nenhuma densidade de elétrons era visível para Glc1 e Sia6, como pode ser esperado em frações de carboidratos flexíveis que não interagem. O sítio de ligação gangliosídeo-receptor foi estudado em detalhes, e a estrutura cristalina HC/B do complexo com GD1a confirmou a preferência desse sorotipo para a fração terminal Sia(α2-3)Gal (Bertnsson et al., 2013; Rummel, 2016). TriRecABTox foi modificado para integrar o bolso de ligação HC/B, e a comparação das duas estruturas (Figura 7) mostra que os principais resíduos do bolso de ligação (S1260, W1262, Y1263) são totalmente conservados e interagem com GD1a conforme a toxina nativa. A maior parte do sítio de ligação permanece inalterada quando comparada com a HC/B ligada a GD1a, com poucas exceções visíveis. Em HC/TAB-3R, a cadeia lateral do N1122 se afasta do ligante enquanto seu equivalente HC/B, N1105, faz uma ligação direta de hidrogênio com Sia5. Isso é um pouco compensado pela posição de I1257, que mostra uma interação hidrofóbica mais forte (a uma distância de 4,3Å) com Sia5 em HC/TAB-3R em comparação com I1240 na estrutura HC/B: GD1a (onde eles estão separados por 7Å).
[0120] No geral, os resultados obtidos da estrutura cristalina HC/TAB-3R confirma que uma única molécula TriRecABTox é capaz de se ligar simultaneamente ao receptor SV2, receptor de sinaptotagmina e seus receptores gangliosídeos de uma maneira que replica os mecanismos de ligação do precursor BoNT/A e /B. Produção e caracterização do TriRecABTox completo e inativo.
[0121] Tendo estabelecido a capacidade de ligação de HC/TAB, os inventores continuaram a expressar e purificar o TriRecABTox completo,
cataliticamente inativo (BoNT/TAB; SEQ ID NO: 3). Para este fim, os inventores projetaram um gene sintético que codifica aminoácidos 1311 e contém os três domínios funcionais BoNT, com LC e HN correspondendo aos domínios BoNT/A, associados a HC/TAB. Três mutações no sítio catalítico foram incluídas por considerações de segurança (E224Q/R363A/Y366F) (Rossetto et al., 2001; Binz et al, 2002). De acordo com o construto HC/TAB descrito acima, a sequência proteica foi otimizada por códon para expressão em E. coli e clonada em pET- 28a (+) com uma etiqueta de poli-histidina N-terminal. Detalhes são fornecidos na seção de métodos. Os inventores mostraram que BoNT/TAB pode ser expresso como uma proteína solúvel de aproximadamente 152 kDa. O método inicial usado para purificação produziu uma quantidade limitada de material não homogêneo (Figura 8; Figura 13), mas a purificação adicional usando métodos como cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica deve ajudar a obter material mais puro e eliminar as proteínas residuais das células hospedeiras visível por eletroforese em gel. Esse método foi usado recentemente para produzir uma construção recombinante de BoNT/B com mais de 80% de pureza (Elliot et al., 2017).
[0122] Caracterização adicional foi realizada e confirmou a presença da etiqueta de histidina e, embora a reação com o anticorpo sondador fosse muito fraca em comparação com os controles (Figura 8B), uma banda fraca era discernível no tamanho certo. O ensaio também mostrou reação cruzada com um contaminante de aproximadamente 70 kDa. Além disso, o BoNT/TAB reagiu de forma conclusiva com antissoros internos produzidos contra HC/A (Figura 8C) e HC/B (Figura 8C), como era esperado, uma vez que deveria conter epítopos de ambos os domínios de ligação. Ativação controlada do TriRecABTox.
[0123] O BoNT/TAB foi modificado com um sítio de clivagem do Fator Xa,
IEGR [442-445], entre as cadeias leve e pesada (Figura 9A), uma vez que a ativação em uma forma de di-cadeia é necessária para obter uma toxina totalmente ativa. A amostra completa de BoNT/TAB (SEQ ID NO: 5) descrita acima foi usada para realizar um ensaio de ativação. Apesar da heterogeneidade da amostra, a ativação total foi alcançada após a incubação de BoNT/TAB com Fator Xa, na razão de 1 µg de protease para 50 µg de toxina, durante a noite a 4°C (Figura 9B). A eletroforese em gel mostrou separação de BoNT/TAB em dois fragmentos de aproximadamente 100 e 50 kDa quando executada na presença de um agente redutor, provavelmente correspondendo a HC e LC, respectivamente. Essas duas cadeias são mantidas juntas por uma ponte de dissulfeto entre C430 e C458, explicando a banda única a aproximadamente 150 kDa em condições não redutoras. As bandas correspondentes a HC e LC também foram visíveis na amostra não redutora e podem ter sido causadas por algum nível de redução da ponte de dissulfeto durante a preparação da amostra, no entanto, essas bandas não eram claramente visíveis no controle não ativado.
[0124] No total, o ensaio de ativação primeiro forneceu evidências de que a proteína produzida corresponde ao BoNT/TAB manipulado e, em segundo lugar, que a etapa de ativação em uma molécula de di-cadeia poderia ser gerenciada com sucesso. Portanto, esse passo pode ser incluído na produção do TriRecABTox ativo completo. Otimização de BoNT/TAB Material e Métodos
[0125] Construtos. O cDNA que codifica HC/TAB e variantes foi clonado por GenScript (NJ, EUA), em um vetor pET28(a) como descrito anteriormente. BoNT/TAB2.1.3 foi clonado em um vetor pET29(a) por Toxogen GmbH (Hannover, Alemanha).
[0126] Expressão e purificação de proteínas. Como descrito anteriormente para as variantes HC/TAB. O BoNT/TAB2.1.3 foi produzido pela Toxogen GmbH (Hannover, Alemanha), com um protocolo semelhante ao utilizado para o HC/TAB (cromatografia de afinidade e filtração em gel). Além disso, a ativação e a remoção da etiqueta de BoNT/TAB2.1.3 foram realizadas com trombina a uma concentração de 0,05 U/µg, e o BoNT/TAB2.1.3 foi adicionalmente purificado por filtração em gel. As amostras foram armazenadas em HEPES 25 mM, pH 7,2 com NaCl 200 mM e glicerol a 5%.
[0127] Caracterização de proteínas. Como descrito anteriormente (eletroforese em gel usando géis NuPAGE 4-12% Bis-Tris).
[0128] Cristalografia de raios-X. As amostras para cristalização foram preparadas por pré-incubação por 15 minutos à temperatura ambiente de HC/TAB2.1 a 6,5 mg/mL, com SV2C-L4 a 1mg/mL (loop-4 extracelular humano SV2C recombinante [resíduos 475-565], peptídeo hSytI 1 mM (GEGKEDAFSKLKEKFMNELHK, sintetizado por GenScript, EUA) e oligossacarídeo GD1a 4 mM (Elicityl, França). Os cristais foram cultivados com 200 nL de amostra misturada com 100 nL de solução de reservatório consistindo em 20% v/v de polietilenoglicol 3350, citrato de potássio a 0,2 M (tela JCSG-plus B12, Molecular Dimensions, Reino Unido) usando uma configuração de gota parada e incubada a 21°C. Os cristais apareceram dentro de 1 semana e foram transferidos para um cryo-loop e congelados em nitrogênio líquido. Os dados de difração foram coletados na estação I04 da Diamond Light Source (Didcot, Reino Unido), equipada com um detector PILATUS-6M (Dectris, Suíça). Um conjunto de dados completo para 1,4 Å foi coletado de um único cristal a 100°K. As imagens de dados brutos foram processadas e escalonadas com DIALS (Gildea et al, 2014) e AIMLESS (Evans, 2006) usando o pacote CCP4 7.0 (CCP4, 1994).
[0129] A substituição molecular foi realizada com a estrutura de HC/TAB determinada anteriormente em PHASER (McCoy et al., 2007). Os modelos de trabalho foram refinados usando REFMAC5 (Murshudov et al, 2011) e ajustados manualmente com COOT (Emsley et al., 2010). Moléculas de água foram adicionadas em posições em que os picos de densidade de elétrons de Fo-Fc excederam 3σ, e possíveis ligações de hidrogênio poderiam ser feitas. A validação foi realizada com MOLPROBITY (Chen et al., 2010). As estatísticas de Ramachandran mostram que 97,0% de todos os resíduos estão na região mais preferencial, com um único outlier na região anulada. As estatísticas de dados cristalográficos estão resumidas na Tabela X1. Produção de um HC/TAB, HC/TAB2.1 otimizado
[0130] A estrutura cristalina do HC/TAB ligada aos seus três receptores foi analisada a fim de identificar sítios potenciais que poderiam ser modificados para melhorar a estabilidade e função da molécula.
[0131] Particularmente, a análise dos fatores de temperatura local (B-fator) dentro de uma estrutura cristalina pode ser interpretada como uma indicação da estabilidade sítio de uma proteína, com alto B-fator sugestivo de uma região desordenada. A partir desta análise, um loop na interface entre os dois subdomínios de HC/TAB, denominada 'loop 360', consistindo nos resíduos D357 a N362 (SEQ ID NO: 6), foi considerado para otimização (ver Figura 14) Os resíduos G360 e N362 (SEQ ID NO: 1) foram modificados para seus resíduos equivalentes em BoNT/B e mutados para P360 e Y362, respectivamente, para serem incorporados na sequência de um novo construto marcado com HC/TAB2.1 (SEQ ID NO: 6).
[0132] O plasmídeo para este novo construto foi preparado por mutagênese dirigida ao sítio (GenScript, EUA) e utilizado para a expressão recombinante de HC/ TAB2.1 em E. coli. O protocolo utilizado foi o mesmo para a produção de HC/TAB (consulte a seção original do método para expressão e purificação). Mostramos que HC/TAB2.1 poderia ser expresso e parcialmente purificado usando cromatografia de afinidade e técnicas de exclusão de tamanho (Figura 15). A amostra apresentou alguns contaminantes de baixo peso molecular que provavelmente correspondem à proteínas residuais das células hospedeiras. Etapas de purificação adicionais usando métodos como cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica devem ajudar a obter uma amostra de maior pureza.
[0133] O HC/TAB2.1 purificado (SEQ ID NO: 6) foi usado em ensaios de cocristalização com o domínio luminal SV2C humano [resíduos 475-565], o peptídeo Syt1 humano [resíduos 34-53] e o carboidrato GD1a. Foram obtidos cristais que difrataram em alta resolução (1,4Å) e um conjunto de dados completo pode ser coletado (Tabela 2). A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando a estrutura cristalina de HC/TAB ligada a ele três receptores (HC/TAB-3R). A nova estrutura apresentou todos os elementos já visíveis em HC/TAB-3R e forneceu evidências experimentais de que HC/TAB2.1 podem se ligar aos três receptores simultaneamente, como HC/TAB. A análise do B-fator mostrou uma estabilidade aprimorada para o loop '360' (D357 a Y362; Figura 14). No geral, o comportamento de HC/TAB2.1 foi semelhante ao de HC/TAB, com ambos os construtos mostrando perfis comparáveis em termos de rendimento e pureza. Tabela X1. Cristalografia de raios-X: estatísticas de coleta e refinamento de dados HC/TAB2.1 - SV2C - hSytI - complexo de GD1a Coleta de dados Grupo de espaço P212121 Dimensões de célula a, b, c (Å) 43,8, 117,5, 141,5 α, β, γ () 90,0, 90,0, 90,0 Resolução (Å) 1,4-60,6 (1,40-1,56) * Nº de reflexões totais/únicas 1.055.932 / 79.953 Rmerge 0,084 (1,070) * Rpim 0,024 (0,364) *
CC1/2 0,99 (0,716) * I / σI 16,0 (1,8) * Plenitude (%) 95,1 (70,1) * Redundância 13,2 (9,3) * Refinamento Rwork / Rfree (%) 17,7 / 20,4 Desvios R.M.S. Comprimentos de ligação (Å) 0,118 Ângulos de ligação () 1,60 *Os valores entre parênteses são para envoltório de alta resolução. Produção de uma variante mais solúvel, HC/TAB2.1.3
[0134] A fim de preparar a análise funcional futura das variantes HC/TAB, HC/TAB2.1 foi adaptada para ser compatível com um experimento de ligação de sortase descrita recentemente (Zhang et al, 2017). Esse experimento permite uma reconstrução segura e controlada de um BoNT ativo de comprimento total que pode ser usado para testar a atividade. Esta construção corresponde a um HC/TAB2.1 truncado no N-terminal com uma etiqueta His passível de ruptura no N-terminal e foi rotulado como HC/TAB2.1.1 (SEQ ID NO: 8). O clone para HC/TAB2.1.1 foi preparado (GenScript), usado para expressão e purificação como descrito anteriormente (Figura 16). Mostramos que HC/TAB2.1.1 poderia ser expresso e parcialmente purificado usando cromatografia de afinidade e técnicas de exclusão de tamanho (Figura 15). A amostra apresentou alguns contaminantes de baixo peso molecular que provavelmente correspondem a proteínas residuais das células hospedeiras. Etapas de purificação adicionais usando métodos como cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica devem ajudar a obter uma amostra de maior pureza.
[0135] Análises adicionais das características estruturais de HC/TAB2.1 destacaram a presença de um loop hidrofóbico exposta à superfície que se projeta do restante da proteína (resíduos 389-393, SEQ ID NO: 6; Figura 14d). Além disso, esse loop foi identificado recentemente como um elemento de ligação lipídica no BoNT/B e em outros sorotipos (Stern et al, 2018). Nossa hipótese foi de que essa região hidrofóbica poderia prejudicar a solubilidade do HC/TAB, portanto, um novo construto foi modificado no qual esse loop foi truncado e substituída por um padrão de asparagina dupla para aumentar a solubilidade. Este construto foi marcado como HC/TAB2.1.3 (SEQ ID NO: 10). O clone para HC/TAB2.1.3 foi preparado (GenScript), usado para expressão e purificação como descrito anteriormente (Figura 16). Mostramos que HC/TAB2.1.3 poderia ser expresso e parcialmente purificado usando cromatografia de afinidade e técnicas de exclusão de tamanho (Figura 15). A amostra apresentou alguns contaminantes de baixo peso molecular que provavelmente correspondem a proteínas residuais das células hospedeiras. Etapas de purificação adicionais usando métodos como cromatografia de troca iônica ou de interação hidrofóbica devem ajudar a obter uma amostra de maior pureza. Notavelmente, HC/TAB2.1.3 apresentou melhor rendimento de expressão e solubilidade em comparação com HC/TAB2.1.1 (Figura 16). Produção de um BoNT/TAB2.1.3 ativo e completo
[0136] Para preparar a análise funcional futura de BoNT/TAB, uma variante ativa de comprimento completo com base no construto HC/TAB2.1.3 foi produzida e rotulada BoNT/TAB2.1.3 (SEQ ID NO: 12). Todas as etapas da produção foram realizadas em uma instalação licenciada, sob contrato, na Toxogen GmbH (Hannover, Alemanha). O BoNT/TAB2.1.3 foi clonado em um vetor pET29 (a) e incluiu etiquetas de Strep e poli-histidina passíveis de ruptura no C-terminal, bem como um sítio de clivagem de trombina manipulado entre os domínios HC e LC (SEQ ID NO: 13 ), para ativação do produto, conforme descrito anteriormente. O BoNT/TAB2.1.3 pode ser expresso como uma proteína solúvel, purificada e ativada com trombina (Figura 17). O método utilizado para purificação incluiu cromatografia de afinidade e filtração em gel e levou a um produto BoNT/TAB2.1.3 com> 90% de pureza.
Experiências futuras Ensaios de ligação de receptor
[0137] Os ensaios serão realizados onde as propriedades de ligação ao receptor de BoNT/TAB serão comparadas com BoNT/A e/ou BoNT/B.
[0138] Por exemplo, serão realizados ensaios de ligação de receptor gangliosídeo que são adaptados dos métodos descritos anteriormente. Resumidamente, neste ELISA, o receptor gangliosídeo de interesse (GT1b, GD1b, GD1a ou GM1a) é imobilizado em uma microplaca de 96 poços (Chen et al., 2008; Willjes et al., 2013), as toxinas (ou sua ligação) são então aplicadas e o material ligado sondado com um anticorpo monoclonal anti-poli-Histidina conjugado com peroxidase de rabanete (HRP). Essa abordagem qualitativa deve fornecer informações suficientes para confirmar que as características de ligação de receptor gangliosídeo do BoNT/TAB são semelhantes às do BoNT/B.
[0139] ELISA de ligação de receptor gangliosídeo. Os gangliosídeos GT1b, GD1b, GD1a e GM1a são adquiridos na Carbosynth (Compton, Reino Unido). Os gangliosídeos são diluídos em metanol para atingir uma concentração final de 2,5 μg/mL; 100 μL (0,25 μg) são aplicados a cada poço de uma placa de ensaio de PVC de 96 poços. Após evaporação do solvente a 21°C (durante a noite), os poços são lavados (3x) com 200 mL de PBS/0,1% (p/v) de BSA. Os sítios de ligação não específicos são bloqueados por incubação por 2h a 21°C em 200 μL de PBS/2% (p/v) de BSA. Os ensaios de ligação são realizados em 100 μL de PBS/BSA a 0,1% (p/v) por poço por 2h a 4°C contendo as amostras (diluição em série de 3 vezes, variando de 6 μM a 0,003 μM). Após a incubação, os poços são lavados 3x com BSA PBS/0,1% (p/v) e depois incubados com um anticorpo HRP-anti-His (ThermoFisher #MA1-80218) a uma diluição de 1:2000 (100 μl/poço) por 1h a 4°C. Finalmente, após três etapas de lavagem com BSA PBS/0,1% (p/v), amostras ligadas são detectadas usando Ultra TMB (100 μL/poço). A reação é encerrada após incubação por 5 minutos a 21°C por adição de 100 μL de ácido sulfúrico 1M. A absorvência a 450 nm é medida com um Tecan Infinite 200 (Männedorf, Suíça). Os resultados são analisados com Prism (GraphPad, La Jolla, CA, EUA), utilizando um ajuste de ligação não linear.
[0140] Para avaliar as propriedades de ligação de receptor da sinaptotagmina, será realizada a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), de forma semelhante ao ensaio descrito por Berntsson et al. (2013). A ligação dos peptídeos hSyt às toxinas será medida e deve fornecer valores de afinidade (Kd) confirmando que o BoNT/TAB pode se ligar ao receptor, analogamente ao BoNT/B.
[0141] Calorimetria de titulação isotérmica. As amostras são preparadas por uma etapa adicional de cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex200, GE Healthcare, Suécia) em fosfato de potássio a 20 mM, pH 7,0, NaCl a 0,15 M. A associação dos peptídeos Syt ao BoNT ou seus domínios de ligação é medida em um ITC200 (GE Healthcare, Suécia) a 25°C e 750 rpm. Uma solução de 200 μL de proteína (a 20 μM) é adicionada à célula. A ligação é medida mediante a adição de peptídeo (GenScript, EUA) com 16 injeções em etapas de 2,5 μL cada, a uma concentração de 200 μM. A primeira titulação é definida como 0,5 μL e é posteriormente excluída na análise de dados. Os dados são analisados com o software Origin fornecido pelo fabricante.
[0142] A ligação ao SV2C será avaliada usando um ensaio suspenso conforme o descrito por Benoit et al. (2014). Resumidamente, a toxina marcada e o receptor não marcado (ou inversamente) serão incubados juntos e carregados em uma Ni-sefarose, depois lavados e eluídos. Os resultados serão visualizados pelo SDS-PAGE. Ensaio de Digit Abduction Score (DAS)
[0143] A potência da preparação do BoNT pode ser avaliada usando um ensaio de Digit Abduction Score (DAS) de camundongo (Broide et al., 2013). Este ensaio mede in vivo a eficácia de enfraquecimento muscular sítio da toxina após injeção intramuscular no músculo esquelético de membros posteriores de camundongos ou ratos. A toxina provoca uma diminuição mensurável dependente da dose na capacidade do animal de produzir uma resposta característica de sobressalto aos membros posteriores. Este método não letal tem sido usado regularmente para estimar as propriedades farmacológicas de diferentes sorotipos ou derivados de BoNT, como as moléculas recombinantes de BoNT/B recentemente descritas (Elliot et al., 2017). Uma metodologia semelhante será usada para avaliar a potência e a duração do efeito do BoNT/TAB, em comparação com o BoNT/A ou /B. Discussão
[0144] Neste estudo, os inventores descreveram como os detalhes estruturais e moleculares do mecanismo de ligação de BoNT/A e /B foram usados para projetar uma nova molécula, TriRecABTox, que possui capacidade aprimorada de reconhecimento celular. Uma comparação rigorosa e multidimensional das estruturas BoNT/A e /B permitiu que os inventores identificassem os elementos-chave necessários para manter um suporte de toxina intacto no qual integrar os sítios de ligação ao receptor para SV2, sinaptotagmina e um gangliosídeo, em uma única molécula. O projeto recém- criado, consistindo em uma alternância dos elementos BoNT/A e /B, foi otimizado incluindo mutações ou deleções adaptativas para compensar as interfaces intramoleculares não naturais recém-criadas. Tais modificações foram consideradas necessárias para garantir que a toxina manipulada, BoNT/TAB, pudesse ser produzida como uma proteína solúvel com a estrutura correta e a atividade necessária.
[0145] Os inventores primeiro avaliaram a estabilidade do projeto produzindo por si só o domínio de ligação, HC/TAB, que possui a função de reconhecimento de receptor modificado, através da expressão recombinante em E. coli. O HC/TAB foi expresso com uma etiqueta de poli-histidina N-terminal como uma proteína solúvel que poderia ser parcialmente purificada, demonstrando assim a viabilidade do construto manipulado. Em uma segunda etapa, os inventores prosseguiram com a produção do construto BoNT/TAB completo, em uma forma inativa de maneira catalítica. Novamente, os inventores mostraram que ele poderia ser expresso como uma proteína solúvel de 153 kDa e parcialmente purificado com técnicas padrão de cromatografia líquida. A presença da etiqueta poli-histidina em HC/TAB e BoNT/TAB permitiu sua purificação por cromatografia de afinidade com uma matriz de Ni-sefarose. Outros métodos de afinidade podem ser utilizados e incluem uma etiqueta de afinidade que deve ser posicionada preferencialmente na extremidade N- terminal da proteína, a fim de evitar interferência na ligação ao receptor. Embora a preparação inicial tenha mostrado pureza heterogênea da amostra, a otimização do processo de purificação deve levar a um produto de padrões farmacêuticos. Deve-se acrescentar que a forma ativa de BoNT/TAB teria uma estrutura geral semelhante e propriedades de ligação à molécula inativa usada no presente estudo. Os inventores contrataram a Toxogen GmbH (Hannover, Alemanha) para produzir uma versão ativa de BoNT/TAB (BoNT/TAB2.1.3) que foi purificada com sucesso com uma etiqueta C-terminal removível, de modo a não interferir na ligação de receptor.
[0146] Além disso, a clivagem pós-tradução de BoNT de cadeia única em uma molécula de di-cadeia é um passo essencial para a atividade da toxina (DasGupta e Sathyamoorthy, 1985; Shone et al, 1985). Enquanto a toxina nativa é geralmente ativada por uma protease hospedeira, qualquer produto BoNT recombinante precisa ser processado com uma exopeptidase. Trabalhos iniciais sobre a toxina mostraram que a tripsina poderia clivar não especificamente o BoNT/A para uma forma ativa de di-cadeia (Shone et al., 1985), no entanto, isso pode resultar em degradação adicional indesejada da toxina. Mais recentemente, as tecnologias recombinantes permitiram a manipulação de padrões específicos de reconhecimento de protease dentro de uma proteína de interesse, proporcionando melhor controle sobre a estratégia de ativação de BoNT (Sutton et al, 2005). Aqui, os inventores incluíram um sítio do fator Xa entre LC e HC e observaram a ativação completa da toxina, demonstrando assim a eficácia dessa enzima. A produção futura de BoNT/TAB deve incorporar uma etapa de purificação que permita a ativação da toxina, seguida pela remoção da exoprotease do produto final. Embora o fator Xa pareça adequado, outras enzimas podem ser testadas e comprovadamente bem-sucedidas em alcançar um rendimento aceitável de ativação. Os inventores contrataram a Toxogen GmbH (Hannover, Alemanha) para produzir uma versão ativa de BoNT/TAB (BoNT/TAB2.1.3) que foi ativada com sucesso com a exoprotease de trombina e purificada até a homogeneidade.
[0147] Como meio para verificar a integridade estrutural de HC/TAB e confirmar sua funcionalidade aprimorada, os inventores co-cristalizaram a amostra purificada em complexo com SV2C humano, Syt1 humano e carboidrato GD1a. A estrutura cristalina de raios-X do complexo foi resolvida em alta resolução (1,5Å) e forneceu evidências experimentais conclusivas de que uma única molécula de HC/TAB poderia se ligar aos três receptores simultaneamente. Além disso, a comparação com as estruturas conhecidas de HC/A e HC/B com seus respectivos receptores mostrou que HC/TAB segue um mecanismo quase idêntico de ligação.
[0148] Enquanto a estrutura cristalina demonstrou que HC/TAB poderia cumprir sua finalidade, pelo menos in vitro, experiências bioquímicas adicionais precisam ser realizadas para caracterizar completamente suas propriedades de ligação ao receptor. Isso incluirá ensaios suspensos e ITC com os receptores de proteína e ELISA de ligação ao receptor de gangliosídeo. Espera-se que o BoNT/TAB tenha um desempenho semelhante ao BoNT/A para a ligação ao receptor SV2, e semelhante ao BoNT/B no que diz respeito à ligação ao receptor gangliosídeo e ao receptor de sinaptotagmina. Além disso, as experiências in vivo fornecerão as principais indicações sobre o verdadeiro potencial de BoNT/TAB como terapêutico. O ensaio DAS de camundongo foi classicamente utilizado para avaliar as preparações de BoNT (Broide et al., 2013) e deve permitir que os inventores determinem a eficácia e a duração da ação de nossa molécula em comparação com os produtos atualmente disponíveis.
[0149] Além disso, o projeto de BoNT/TAB pode ser otimizado ainda mais, modificando alguns elementos de sequência para melhorar suas propriedades bioquímicas e estabilidade. Tais alterações podem incluir deleções ou mutações que levam a um BoNT solúvel ainda capaz de se ligar simultaneamente a três receptores. Os inventores produziram com sucesso uma variante mais estável (HC/TAB2.1) e uma variante mais solúvel com maior rendimento de produção (HC/TAB2.1.3).
[0150] Deve-se acrescentar que, de uma perspectiva de segurança, o BoNT/TAB não representa uma nova ameaça, pois é derivado de dois sorotipos existentes. Espera-se que seja reconhecido pelas antitoxinas atualmente disponíveis, como a Antitoxina Heptavalente do Botulismo BAT ou outros antídotos aprovados para BoNT/A e /B.
[0151] Os sorotipos A e B são os únicos BoNTs aprovados disponíveis no mercado. Embora BoNT/A seja a principal toxina usada terapeuticamente, moléculas com menor imunogenicidade e alta eficácia forneceriam alternativas mais seguras (Naumann et al., 2013). Várias tentativas foram feitas para melhorar as propriedades dos BoNTs, a fim de aumentar seu potencial farmacológico (Masuyer et al., 2014). Um exemplo recente de sucesso inclui o estudo de Tao et al. (2017), onde mutações modificadas em posições-chave do BoNT/B (E1191M/S1199Y) deram à toxina maior afinidade pelo receptor humano de sinaptotagmina2 e mostraram uma eficácia aproximadamente 11 vezes maior no bloqueio da neurotransmissão em comparação ao tipo selvagem. Outra abordagem para melhorar a eficácia de BoNT foi adotada por Elliott et al. (2017), onde analisaram o efeito de uma única mutação (S201P) conhecida por aumentar a atividade catalítica de BoNT/B em seu substrato. Nesse caso, o mutante BoNT/B não apresentou nenhuma vantagem sobre o tipo selvagem em vários ensaios baseados em células e in vivo. No total, esses dois estudos sobre BoNT/B sugerem que a etapa limitante da eficácia da toxina reside no reconhecimento neuronal inicial e não na atividade intracelular posterior.
[0152] Estudos anteriores que pretendiam combinar as propriedades de ligação de um sorotipo com a atividade catalítica de outro levaram ao projeto de moléculas quiméricas onde domínios inteiros foram trocados (Wang et al., 2008, 2012; Rummel et al., 2011). Mais particularmente, Rummel et al. (2011) e Wang et al. (2012) projetaram e testaram moléculas análogas que consistem no domínio HC/B associado aos domínios HN+LC de BoNT/A. Foi relatado que essas toxinas recombinantes exibiam potência aumentada e induziam um efeito mais longo em camundongos em comparação com o tipo selvagem BoNT/A (Kutschenko et al., 2017). Observações semelhantes foram obtidas ao avaliar um construto consistindo no subdomínio C-terminal (HCc) de BoNT/B acoplado aos domínios complementares do sorotipo A (isto é, LC+HN+HCn), e que mostrou uma potência quatro vezes maior em comparação com o tipo selvagem (Rummel et al., 2011). Todas as moléculas descritas acima tinham em comum o fato de que apenas reconheceriam os dois receptores de BoNT/B, sinaptotagmina e gangliosídeo. Esses resultados sugerem que efeito prolongado e maior eficácia podem ser obtidos graças a uma maior ingestão de LC/A permitida pela maior prevalência de receptores BoNT/B nos neurônios. Além disso, essas moléculas quiméricas não levaram em consideração os possíveis conflitos intramoleculares entre domínios que podem surgir da combinação de domínios de diferentes sorotipos e que podem afetar o potencial desses produtos.
[0153] Levando em consideração os resultados dos estudos mais recentes sobre a manipulação de BoNT, parece claro que modificar o reconhecimento celular inicial é uma das maneiras mais eficientes de aprimorar as propriedades farmacológicas do produto terapêutico. Portanto, o BoNT/TAB, um produto único modificado com sucesso para reconhecer o receptor SV2 junto com os receptores BoNT/B, sinaptotagmina e gangliosídeo, representa um grande potencial e ainda pode ser mais eficaz do que o tipo selvagem BoNT/A e /B.
[0154] A principal inovação no BoNT/TAB é o projeto do domínio de ligação, permitindo múltiplas interações com os receptores. As evidências atuais sugerem que a associação de HC/TAB com os domínios de translocação e catalítico de BoNT/A deve fornecer à molécula a potência mais forte (conforme modificado em BoNT/TAB). No entanto, HC/TAB ainda pode ser interessante quando combinado com os domínios funcionais de outros sorotipos (Figura 10a). Além disso, a HC/TAB também pode ser acoplada a outras proteínas de interesse (Figura 10b) para ser usado como uma ferramenta farmacológica para investigar processos sinápticos. Os ensaios in vivo a serem realizados com BoNT/TAB devem esclarecer sua utilidade para esse fim. Referências
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Claims (32)

REIVINDICAÇÕES
1. Domínio de Ligação de Cadeia Pesada (HC/TAB) de neurotoxina botulínica (BoNT) tendo uma extremidade N-terminal (HCN) e uma extremidade C-terminal (HCC), caracterizado pelo fato de que o HC/TAB compreende: a) um sítio de ligação do receptor de sinaptotagmina (Syt), e b) um sítio de ligação do receptor de vesícula sináptica 2 (SV2) associada, e c) um sítio de ligação do receptor de gangliosídeo (Gang), e em que o referido HC/TAB é adaptado para se ligar sinergicamente a um receptor de sinaptotagmina (Syt), um receptor de vesícula sináptica 2 (SV2) associada e um receptor de gangliosídeo (Gang).
2. HC/TAB, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Gang se originam a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de Gang e subtipos dos mesmos.
3. HC/TAB, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Syt se originam a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de Syt e subtipos dos mesmos.
4. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de SV2 se originam a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de SV2 e subtipos dos mesmos.
5. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência HCN se origina a partir de qualquer sorotipo BoNT que se liga ao receptor de SV2 e subtipos dos mesmos.
6. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio HCC é composto de maneira intercambiável de sequências a partir do sorotipo BoNT A (BoNT/A) e do sorotipo BoNT B (BoNT/B).
7. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida extremidade HCC é composta de acordo com uma sequência A1B1A2B2A3, em que A indica uma sequência a partir de BoNT/A e B indica uma sequência a partir de BoNT/B.
8. HC/TAB, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as sequências B1, A2 e B2 compreendem mutações e/ou deleções para criar interfaces intramoleculares estáveis para todo o HC/TAB.
9. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Gang se originam a partir de BoNT/B.
10. HC/TAB, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Gang são localizadas em B2.
11. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Syt se originam a partir de BoNT B, DC ou G.
12. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 8 e 10, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de Syt são localizadas em B1 e B2.
13. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a sequência HCN se origina a partir de BoNT/A.
14. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 8, 10 e 12, caracterizado pelo fato de que as sequências que formam o sítio de ligação do receptor de SV2 são localizadas em HCN e em A1 e A3 no HCC.
15. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14,
caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência da SEQ ID NO: 1.
16. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende o HC/TAB definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, acoplado a qualquer uma ou mais outras proteínas, polipeptídeos, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente, diretamente ou através de um ligante.
17. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 16, em que o referido polipeptídeo é um polipeptídeo BoNT (BoNT/TAB), caracterizado pelo fato de que o referido BoNT/TAB, em adição ao HC/TAB, compreende um domínio de Translocação de Cadeia Pesada (HN), uma cadeia Leve (LC) e um sítio de protease posicionado entre o LC e HN na sequência polipeptídica, em que o HN e o LC, respectivamente e independentemente um do outro, se originam a partir de qualquer um dos sorotipos BoNT A, B, C, D, DC, E, En, F, G ou X e subtipos dos mesmos.
18. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda qualquer outra proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente, ligada ao mesmo, diretamente ou através de um ligante.
19. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o sítio de protease é um sítio de exoprotease.
20. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12.
21. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica o HC/TAB definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou o polipeptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 20.
22. Vetor, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica à sequência de qualquer uma das SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 13.
23. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método terapêutico ou em um método cosmético.
24. HC/TAB ou polipeptídeo para uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o método terapêutico ou método cosmético é um tratamento para amortecer e/ou inativar músculos.
25. HC/TAB ou polipeptídeo para uso de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o método terapêutico é tratamento e/ou prevenção de um distúrbio escolhido a partir do grupo que compreende distúrbios neuromusculares e distúrbios de músculo espástico.
26. HC/TAB ou polipeptídeo para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é escolhido a partir do grupo que compreende disfonia espasmódica, torcicolo espasmódico, distonia laríngea, disfonia oromandibular, distonia lingual, distonia cervical, distonia focal das mãos, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, distúrbio palpebral, paralisia cerebral, espasticidade focal e outros distúrbios da voz, colite espasmódica, bexiga neurogênica, anismo, espasticidade nos membros, tiques, tremores, bruxismo, fissura anal, acalasia, disfagia e outros distúrbios de tônus muscular e outros distúrbios que tem como características movimentos involuntários de grupos musculares, lacrimação, hiperidrose, salivação excessiva, secreções gastrointestinais excessivas, distúrbios secretores, dor a partir de espasmos musculares, dor de cabeça, lesões esportivas e depressão.
27. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser para uso em um teste farmacológico para investigar o papel da referida proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente em um processo sináptico.
28. HC/TAB, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de ser para uso como um veículo para o transporte eficaz de qualquer proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente acoplada a uma superfície neuronal.
29. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado pelo fato de ser para uso como um veículo para o transporte eficaz de qualquer proteína, polipeptídeo, sequência de aminoácidos ou sonda fluorescente em um citosol neuronal usando um sistema de translocação de toxina.
30. Composição farmacêutica ou cosmética, caracterizada pelo fato de que compreende o HC/TAB definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou o polipeptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 20.
31. Kit de partes, caracterizado pelo fato de que compreende a composição definida na reivindicação 30 e instruções para administração terapêutica da composição.
32. Método de tratamento de uma condição associada com atividade neuronal indesejada, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do HC/TAB definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou o polipeptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 16 a 20, ou a composição farmacêutica definida na reivindicação 30, a um indivíduo para, desse modo, tratar a condição, em que a condição é escolhida a partir do grupo que compreende disfonia espasmódica, torcicolo espasmódico, distonia laríngea, disfonia oromandibular, distonia lingual, distonia cervical, distonia focal das mãos, blefaroespasmo, estrabismo, espasmo hemifacial, distúrbio palpebral, paralisia cerebral, espasticidade focal e outros distúrbios da voz, colite espasmódica, bexiga neurogênica, anismo, espasticidade nos membros, tiques, tremores, bruxismo, fissura anal, acalasia, disfagia e outros distúrbios de tônus muscular e outros distúrbios que tem como características movimentos involuntários de grupos musculares, lacrimação, hiperidrose, salivação excessiva, secreções gastrointestinais excessivas, distúrbios secretores, dor a partir de espasmos musculares, dor de cabeça, lesões esportivas e depressão e condições dermatológicas ou estéticas/cosméticas.
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