ES2634261T3 - Métodos para la fabricación de polipéptidos procesados proteolíticamente - Google Patents

Abstract

El uso de Lys-C para el procesamiento proteolítico de una neurotoxina botulínica de cadena sencilla serotipo A (BoNT/A) por hidrólisis para producir neurotoxina botulínica di-cadena serotipo A (BoNT/A).

Description

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DESCRIPCION

Metodos para la fabricacion de polipeptidos procesados proteoltticamente Descripcion

En el presente documento se describe un nuevo polipeptido proteoltticamente activo y diversos usos del polipeptido en metodos de cribado y fabricacion.

Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas altamente potentes, es decir, neurotoxinas botulmicas (BoNTs) y la neurotoxina tetanica (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas clostridiales (CNTs) se unen espedficamente a las celulas neuronales y alteran la liberacion de neurotransmisores. Clostridium botulinum secreta siete serotipos antigenicamente distintos designados A a G de la neurotoxina botulmica (BoNT). Todos los serotipos junto con la neurotoxina relacionada con el tetanos (TeNT) secretada por Clostridium tetani, son Zn2+- endoproteasas que bloquean la exocitosis sinaptica mediante la escision de protemas implicadas en la formacion del complejo SNARE que controla la fusion de la membrana celular. Las CNT causan la paralisis muscular flacida que se observa en el botulismo y el tetanos. Ademas, se ha demostrado que la actividad de la CNT afecta a la secrecion glandular. Estos efectos fisiologicos de las CNT sobre la actividad muscular y glandular se utilizan cada vez mas en diversas aplicaciones terapeuticas y cosmeticas. La neurotoxina botulmica del serotipo A (BoNT/A) fue aprobada para uso humano en los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento del estrabismo, blefaroespasmo y otros trastornos. Esta comercialmente disponible como una preparacion de protema de toxina botulmica A, por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOX (Allergan Inc.) y bajo el nombre comercial DYSPORT (Ipsen Ltd). Para la aplicacion terapeutica, un complejo que comprende la neurotoxina y protemas bacterianas adicionales se inyecta directamente en el musculo a tratar. A pH fisiologico, la toxina se libera del complejo proteico (Eisele et al. 2011, Toxicon 57 (4): 555-65.) y tiene lugar el efecto farmacologico deseado. Una preparacion mejorada de BoNT/A que esta libre de protemas complejantes esta disponible con los nombres comerciales XEOMIN o Bocouture (Merz Pharmaceuticals GmbH, Frankfurt/Alemania). El efecto de la BoNT es solo temporal, razon por la cual se requiere habitualmente la administracion repetida de BoNT para mantener un efecto terapeutico.

Cada CNT se sintetiza inicialmente como un polipeptido de cadena unica inactivo. En el caso de BoNT, el polipeptido de neurotoxina tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. El procesamiento postraduccional de este polipeptido de cadena unica implica una proteolisis limitada en una region expuesta llamada bucle (vease la tabla 1) y la formacion de un puente disulfuro proximo. La neurotoxina di-cadena activa consiste en dos productos de escision resultantes de la hidrolisis proteolttica del polipeptido precursor de cadena sencilla: una cadena ligera N- terminal de aprox. 50 kDa y una cadena pesada de aprox. 100 kDa unidas por un enlace disulfuro. Las CNT estructuralmente consisten en tres dominios, es decir, la cadena ligera catalttica, la cadena pesada que abarca el dominio de translocacion (mitad N-terminal) y el dominio de union al receptor (mitad C-terminal) (cf. Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188: 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202: 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13: 49; Lacy et al., 1998, Nat. Struct. Biol. 5(10): 898 - 902). Dependiendo del numero de sitios de escision presentes en la cadena unica entre los residuos de aminoacidos que forman el dominio catalttico y los residuos de aminoacidos que forman el dominio de translocacion, la actividad de endopeptidasa puede dar lugar a dos productos de escision grandes, es decir, la cadena ligera y la cadena pesada y, ademas, peptidos cortos caractensticos que representan la region del bucle anterior, uniendo en la cadena unica de la neurotoxina lo que se convertira en la cadena ligera y pesada (vease la tabla 1).

La purificacion de las CNT a partir de la solucion de fermentacion es un desaffo particular, puesto que las neurotoxinas estan contenidas en la misma como una mezcla de polipeptidos no procesados, parcialmente procesados y completamente procesados, todos los cuales tienen propiedades bioqmmicas y ffsicas muy similares. Las neurotoxinas procesadas parcialmente se generan tfpicamente, si la actividad endoproteolttica ha hidrolizado el enlace peptfdico entre la cadena ligera y el bucle, mientras que el enlace peptfdico entre el bucle y el extremo N de la cadena pesada esta todavfa intacto. Ademas, tambien puede crearse la neurotoxina parcialmente procesada si la actividad endoproteolftica ha liberado el peptido de bucle de la cadena pesada, mientras que el enlace peptfdico entre el peptido de bucle y el extremo C-terminal de la cadena ligera aun no se ha hidrolizado. Dependiendo de las condiciones de fermentacion y del tipo de neurotoxina, el polipeptido completamente procesado que esta desprovisto del peptido del bucle puede contaminarse significativamente, con entre 5% a 90% de polipeptido parcialmente procesado o no procesado. Sin embargo, en algunos casos, la neurotoxina esta principalmente sin procesar y, antes del uso terapeutico, necesita ser tratada con una endopeptidasa para ser biologicamente activa.

La tecnica anterior describe varios intentos de tratar neurotoxinas clostridiales con proteasas heterologas con el fin de reducir la cantidad de protema precursora no procesada o parcialmente procesada. La proteasa mas utilizada para la activacion de neurotoxinas clostridiales, la tripsina, siendo util para activar las neurotoxinas clostridiales de los serotipos B (BoNT/B) y E (BoNT/E) (DasGupta & Sugiyama 1972, Biochem. Biophys. Res. Comun. 48:108-112; Kozaki et al., 1974, Infect. Immun. 10:750-756) parece producir productos secundarios, presumiblemente por accion proteolftica cerca del extremo C-terminal de la subunidad pesada de BoNT/A y, portanto, parece destruir la union de la toxina a su receptor celular (Shone et al., 1985, Eur. J. Bioch. 151:75-82). Teoricamente se esperan productos de escision mas espedficos de las proteasas endogenas, aisladas del huesped nativo, tales como BoNT/A de C. botulinum. Por consiguiente, se han hecho varios intentos para aislar de la celula huesped nativa la proteasa

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endogena implicada en la activacion proteolftica de las neurotoxinas clostridiales. Dekleva & DasGupta (Dekleva y DasGupta, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comun. 162:767-772) purificaron a partir de cultivos de C. botulinum que producen BoNT/A una fraccion capaz de escindir proteolfticamente BoNT/A en una subunidad pesada y ligera. Estudios posteriores de los mismos autores caracterizaron ademas la proteasa endogena aislada de C. botulinum (Dekleva y DasGupta, 1990, J. Bact. 172:2498-2503) y revelaron una protema de 62 kDa, compuesta por un polipeptido de 15,5 kDa y un polipeptido de 48 kDa. Sin embargo, la observacion de una fragmentacion considerable de las CNT despues de una exposicion limitada a la protema de 62kDa de Dekleva & DasGupta sugiere que la proteasa aislada puede no ser la enzima proteolftica no identificada responsable de la activacion de las cNt en cultivos de celulas clostridiales y durante la infeccion. De hecho, otros han sugerido recientemente que el Clostripain, tambien designado clostridiopeptidasa B (Mitchel y Harrington, 1968, JBC 243: 4683 - 4692), podna estar implicado en la activacion espedfica de las CNT (Sebaihia et al., 2007, Genome Res. 17(7): 1082 - 1092; documento WO2009/014854). Curiosamente, la estructura y la especificidad del sustrato de esta enzima son reminiscentes de los de la secretada alfa-clostripain de Clostridium histolyticum (Dargatz et al., 1993), un homologo (74% de identidad de aminoacidos) del cual esta presente en C. Botulinum (CBO1920). El alfa-clostripain de C. Histolyticum es una cistema endopeptidasa con una especificidad estricta para el enlace arginilo. Se sintetiza como una prepro-enzima inactiva que experimenta una escision autocatalftica para generar polipeptidos de 15,4 y 43 kDa, los cuales se asocian para formar una enzima activa heterodimerica (Dargatz et al., 1993). Ambos alfaclostripain de C. histolyticum y la proteasa de 62-kDa de C. Botulinum requieren un agente reductor y calcio para la actividad completa y son susceptibles a los mismos inhibidores de la proteasa. Estos datos sugieren definitivamente que el ortologo de C. Botulinum de alfa-clostripain (CBO1920) es la proteasa endogena responsable de la mella proteolftica de la neurotoxina de C. Botulinum. Un gen que codifica clostripain (CPE0846) tambien esta presente en C. Perfringens, y se ha encontrado que se regula positivamente por el sistema de dos componentes VirR/VirS (Shimizu et al., 2002b).

Sin embargo, hasta el dfa de hoy, faltan pruebas experimentales concluyentes y no esta todavfa disponible en la tecnica una proteasa capaz de convertir eficientemente las CNT precursoras de cadena sencilla en los productos de escision maduros autenticos, es decir, la neurotoxina de cadena di.

Los medios y metodos para reducir la cantidad de polipeptidos de neurotoxina no procesados y/o parcialmente procesados y, de este modo, para mejorar la calidad de los preparados de neurotoxina son altamente deseables pero aun no estan disponibles. Por lo tanto, el problema tecnico subyacente a la presente invencion puede verse como la provision de medios y metodos para mejorar la fabricacion de polipeptidos de neurotoxina mediante el cumplimiento de las necesidades antes mencionadas. El problema tecnico se resuelve mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en la presente memoria.

Se describe en la presente memoria un polipeptido proteolfticamente activo que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con la secuencia de SEQ ID NO: 1. En el presente documento se describe un polipeptido proteolfticamente activo que consiste en una secuencia polipeptfdica que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Se describe en este documento un polipeptido proteolfticamente activo que consiste en una secuencia polipeptfdica como se muestra en la SEQ ID NO: 1.

La expresion “polipeptido proteolfticamente activo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la funcion catalftica del polipeptido de la presente invencion y significa que el polipeptido de la presente invencion es capaz de hidrolizar un enlace peptfdico. Un "polipeptido proteolfticamente activo" puede referirse a un polipeptido que es capaz de hidrolizar un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25. La expresion “polipeptido proteolfticamente inactivo”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la funcion catalftica del polipeptido de la presente invencion y significa que el polipeptido de la presente invencion es incapaz de hidrolizar un enlace peptfdico.

El experto en la materia puede determinar si un polipeptido de acuerdo con la definicion de secuencia mencionada en este documento es un polipeptido descrito en la presente memoria, probando la actividad proteolftica de dicho polipeptido. Un sistema de ensayo o prueba para determinar la actividad proteolftica comprende poner en contacto un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1 con un sustrato de prueba. Un sustrato de prueba es tfpicamente un polipeptido que se sabe que es escindible por un polipeptido descrito en la presente memoria. Se describe en este documento un sustrato de prueba que es una CNT tal como BoNT o un fragmento de la misma. El sustrato de prueba puede ser p. ej. BoNT no digerido/sin transformar, designado en la presente memoria como "scBoNT" y puede ser p. ej. de serotipo A, B, C1, D, E, F o G (por ejemplo, "scBoNT/A", "scBoNTB", etc.) o el sustrato de prueba puede ser la neurotoxina tetanica. Alternativamente, el sustrato de prueba puede ser un fragmento de una neurotoxina clostridial, comprendiendo dicho fragmento una secuencia de aminoacidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25. El fragmento puede ser un polipeptido de 50 o mas residuos de aminoacidos o un peptido de hasta 49 restos de aminoacidos. Tal como se utiliza a lo largo de la presente memoria descriptiva, el termino “polipeptido” se refiere a moleculas con 50 o mas residuos de aminoacidos, mientras que el termino “peptido” se refiere a moleculas con de 2 a 49 residuos de aminoacidos. El sustrato de prueba puede ser un fragmento de neurotoxina soluble llamado LHN que comprende el polipeptido de cadena ligera, la region de peptido de bucle expuesto y la mitad N-terminal del polipeptido de cadena pesada, el dominio de translocacion Hn. El sustrato de prueba puede ser o puede comprender

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un peptido seleccionado de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25 (vease latabla 1). El sustrato de prueba puede ser una neurotoxina quimerica que comprende residuos de aminoacidos derivados de dos o mas serotipos.

Un ensayo para determinar la actividad proteolftica comprendena tipicamente una etapa de determinar el grado de conversion del sustrato de prueba en su(s) producto(s) de escision. La observacion de uno o mas productos de escision generados despues de ponerse en contacto el polipeptido con el sustrato de ensayo o la observacion de un aumento en la cantidad de producto(s) de escision es indicativa de la actividad proteolftica del polipeptido. Dicha etapa de determinacion puede implicar comparar el sustrato y el (los) producto(s) de escision. Dicha comparacion puede implicar determinar la cantidad de sustrato y/o la cantidad de uno o mas productos de escision y tambien puede implicar el calculo de la relacion de sustrato y producto(s) de escision. Ademas, el ensayo para determinar la actividad proteolftica puede comprender una etapa de comparacion de una muestra de ensayo con una muestra de referencia, en la que la muestra de referencia comprende tfpicamente (a) un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1 y que se sabe que es proteolfticamente activo y (b) un sustrato de ensayo conocido por ser escindible por el polipeptido de (a). El ensayo para determinar la actividad proteolftica puede comprender separar el sustrato y los producto(s) de escision por electroforesis o por cromatograffa en columna y, opcionalmente, un analisis espectrometrico. Puede ser conveniente marcar el sustrato de ensayo con uno o mas marcadores con el fin de detectar con mayor facilidad la disminucion del sustrato de ensayo y/o el aumento del producto(s). El termino "marcador", tal como se utiliza en la presente memoria, significa marcador detectable e incluye, por ejemplo, un marcador radioactivo, anticuerpo, marcador fluorescente. La cantidad de sustrato de ensayo y/o producto de escision se puede determinar p. ej. por metodos de autorradiograffa o espectrometna, incluyendo metodos basados en la transferencia de resonancia de energfa entre al menos dos marcadores. Alternativamente, se pueden usar metodos inmunologicos tales como Western blot o ELISA para la deteccion. Un ensayo preferido para determinar la actividad proteolftica de un polipeptido ensenado en la presente invencion se describe a continuacion en los Ejemplos. Un polipeptido puede ser proteolfticamente activo, si mas del 20%, preferiblemente mas del 95% del sustrato de ensayo se convierte en los productos de escision tales como la cadena ligera y la cadena pesada en 120 minutos a 37°C usando un tampon seleccionado entre Tris - HCl 100 mM, pH 8,0 o PBS (NaHPO4 50 mM2, NaCl 150 mM, pH 7,4). Se aplican las mismas condiciones, si el sustrato de ensayo no es una neurotoxina de longitud completa, sino, en cambio, p. ej., un fragmento de la neurotoxina de longitud completa o un derivado de la neurotoxina. Es evidente que los productos de escision difieren en este caso. Sin embargo, el experto en la materia puede cuantificar los correspondientes productos de escision. Tfpicamente, se pueden usar en el ensayo 100 ng de polipeptido proteolfticamente activo y una relacion molar de 1:100 con respecto al sustrato. Se puede tomar una muestra a intervalos para seguir la actividad catalftica a lo largo del tiempo. El ensayo puede modificarse, p. ej. utilizando multiples cantidades del polipeptido proteolfticamente activo.

La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia polipeptfdica de un polipeptido proteolfticamente inactivo derivado de una cepa ATCC 3502 de Clostridium botulinum, n° de acceso GenBank: "CAL82988.1", que tiene una longitud de aminoacidos de 581 residuos. La SEQ ID NO: 1 muestra un derivado proteolfticamente activo de SEQ ID NO: 2, que carece de los residuos de aminoacidos 1 a 248 de SEQ ID NO: 2.

La expresion “polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con la secuencia de SEQ ID NO: 1” se refiere a un polipeptido que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Ademas, la expresion se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Dicho polipeptido puede tener aminoacidos adicionales, por ejemplo en una posicion interna o N- o C-terminal a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 o en una posicion interna o N- o C-terminal a una secuencia de aminoacidos que es al menos un 50% identica con la secuencia de SEQ ID NO: 1, en el que una metionina puede estar presente en el extremo N del polipeptido. Ademas, la expresion se refiere a un polipeptido que carece de uno o mas residuos de aminoacidos, por ejemplo en una posicion interna o en el extremo N o C de la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o en una posicion interna o el N - o C - terminal de secuencia que es al menos 50% identica en secuencia a SEQ ID NO: 1.

La expresion “identidad de secuencia”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la determinacion de la identidad entre una secuencia de aminoacidos de referencia y una secuencia de consulta en la que las secuencias estan alineadas de modo que se obtiene la coincidencia de orden mas alto y que se puede calcular usando tecnicas publicadas o metodos codificados en programas informaticos como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215: 403). Los valores de identidad porcentual estan en un aspecto calculados sobre toda la secuencia de aminoacidos. La identidad de secuencia puede calcularse sobre una longitud de secuencia de hasta residuos de 50aa, hasta 100aa, hasta 150aa, hasta 250aa, 300aa, 350aa, 400aa, 450aa, 500aa o residuos de 550aa.

La identidad de la secuencia se puede calcular sobre al menos residuos de 50aa, al menos 100aa, al menos 150aa o al menos residuos de 250aa. La identidad de secuencia puede determinarse a lo largo de toda la longitud de SEQ ID NO: 1 o 2, es decir, en una longitud de 333aa o 581aa, respectivamente. Una serie de programas basados en una variedad de algoritmos esta disponible para el experto en la tecnica para comparar secuencias diferentes. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente fiables. Para llevar a cabo las alineaciones de secuencias y calcular los valores de identidad de secuencia en este documento

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indicados, se utilizo el programa comercial DNASTAR Lasergene MegAlign version 7.1.0 basado en el algoritmo Clustal W en toda la region de secuencias con los siguientes parametros: Parametros de alineacion por pares: penalizacion de espacio: 10,00, penalizacion de longitud de espacio : 0,10, Matriz de peso de la protema Gonnet 250, que, a menos que se especifique lo contrario, se utilizaran siempre como ajustes estandar para las alineaciones de secuencia.

La expresion "al menos 50% de identidad de secuencia", tal como se utiliza en la presente memoria, significa al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80% al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o el 100%.

El polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria puede tener el mismo numero de aminoacidos que la secuencia polipeptfdica de referencia como se muestra en la SEQ ID NO: 1. Tambien se incluyen polipeptidos que tienen residuos de aminoacidos adicionales o menos. En el presente documento se describe un polipeptido proteolfticamente activo que es o comprende un mutante truncado de la SEQ ID NO: 1 o 2 o de un polipeptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o 2. El mutante de truncamiento de SEQ ID NO: 2 puede carecer, por ejemplo, de uno o mas residuos aminoacidos N- terminales a la posicion de aminoacidos 249. Un mutante de truncamiento puede ser un mutante de truncamiento N

0 C-terminal y/o un mutante de truncamiento interno que es proteolfticamente activo. En la presente memoria descriptiva se describe un mutante de truncamiento de SEQ ID NO: 2 que carece de las posiciones de aminoacidos

1 a 248 de SEQ ID NO: 2. Se describe en este documento un mutante truncado de la SEQ ID NO: 2 que es un mutante de truncamiento C-terminal. En este documento se describe un mutante de truncamiento que carece de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 150 o hasta 170 residuos de aminoacidos consecutivos. En el presente documento se describe un polipeptido proteolfticamente activo que tiene una longitud de aminoacidos de al menos residuos de 200aa, de al menos residuos de 250aa, de al menos residuos de 300aa o de al menos residuos de 333aa. En el presente documento, se describe un polipeptido proteolfticamente activo que tiene residuos de hasta 333aa, residuos de hasta 350aa, residuos de hasta 573, residuos de hasta 581aa, residuos de hasta 592aa, residuos de hasta 600aa o hasta 617aa.

En el presente documento se describe un polipeptido proteolfticamente activo que abarca un polipeptido que comprende residuos de aminoacidos adicionales en el extremo N o C y/o en una posicion interna de la cadena polipeptfdica de SEQ ID NO: 1 o una secuencia polipeptfdica que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Estos residuos de aminoacidos adicionales pueden comprender hasta 5, hasta 10 o incluso hasta 200, 300 o hasta 400 residuos de aminoacidos consecutivos. Los residuos de aminoacidos adicionales pueden funcionar como un inhibidor de la actividad proteolftica. Los residuos de aminoacidos adicionales pueden eliminarse mediante una proteasa. Pueden excluirse residuos adicionales que inhiban la actividad proteolftica del polipeptido. Los residuos de aminoacidos adicionales pueden estar flanqueados por uno o mas sitios de escision de proteasas. La secuencia de aminoacidos adicional puede funcionar como un marcador detectable y/o permite la union a un soporte solido.

Se describe en este documento una cadena polipeptfdica de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de un polipeptido que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1 que se modifica intercambiando uno o mas residuos de aminoacido. El termino "intercambio", tal como se utiliza en este documento, significa reemplazar un aminoacido por un aminoacido diferente. Por ejemplo, se pueden sustituir hasta 1aa, 2aa, 3aa, 4aa, 5aa, 6aa, 7aa, 8aa, 9aa, 10aa, 15aa, 20aa o hasta 50aa dentro de la secuencia polipeptfdica. Los intercambios pueden implicar cambios de aminoacidos conservadores o no conservadores, dirigidos, p. ej. al aumentar o disminuir la union al sustrato o la actividad proteolftica del polipeptido descrito en el presente documento.

Se describe en este documento un polipeptido proteolfticamente activo que abarca un polipeptido que es capaz de hidrolizar un sustrato en dos o mas productos de escision nativos. Se describe en este documento un polipeptido que hidroliza el sustrato en dos o mas productos de escision que difieren de los productos de escision nativa. La expresion "productos de escision nativa" o "productos nativos", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a productos, que son identicos en la secuencia de aminoacidos cuando se comparan con productos generados a partir del mismo sustrato en cultivos de celulas de tipo salvaje, de los cuales se origina el sustrato. En el presente documento se describe un producto de escision que es la neurotoxina de cadena doble de una neurotoxina botulrnica o una neurotoxina tetanica, una neurotoxina de di-cadena que es una neurotoxina aislada de C. botulinum del serotipo A, B, C1, D, E, F o G. En otra descripcion mas, dicha neurotoxina de di-cadena es una neurotoxina nativa de di-cadena.

La tabla 1 muestra el precursor, la neurotoxina di-cadena nativa de TeNT y de BoNT/A-G e identifica el bucle expuesto que comprende la secuencia de aminoacidos escindida por el polipeptido descrito en el presente documento.

Toxina

Bucle expuesto LC Hn Hcn Hcc

BoNT/A1

SEQ ID NO: 4 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296

BoNT/A2

SEQ ID NO: 5 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296

BoNT/A3

SEQ ID NO: 6 M1-K434 A445-N868 I869-S1088 N1089-L1292

BoNT/A3

SEQ ID NO: 7 M1-K434 A445-N868 I869-S1088 N1089-L1292

BoNT/A4

SEQ ID NO: 8 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296

BoNT/A5

SEQ ID NO: 9 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296

B0NT/A6

SEQ ID NO: 5 M1-K438 A449-N872 I873-S1093 N1094-L1297

BoNT/A7

SEQ ID NO: 10 M1-K438 A449-N872 I873-S1092 N1093-L1296

BoNT/B1

SEQ ID NO: 11 M1-K441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291

BoNT/B2

SEQ ID NO: 12 M1-R441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291

BoNT/B3

SEQ ID NO: 12 M1-R441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291

BoNT/B4bv

SEQ ID NO: 11 M1-K441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291

BoNT/B5nP

SEQ ID NO: 13 M1-K441 V442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291

B0NT/B6

SEQ ID NO: 11 M1-K441 A442-I860 L861-S1079 Y1080-E1291

BoNT/C1

SEQ ID NO: 14 M1-R444 T450-I868 N869-L1092 Q1093-E1291

BoNT/CD

SEQ ID NO: 14 M1-R444 T450-I868 N869-Q1083 I1084-E1280

BoNT/D

SEQ ID NO: 15 M1-K442 D446-I864 N865-Q1079 I1080-E1276

BoNT/DC

SEQ ID NO: 16 M1-R442 D446-I864 N865-L1088 Q1089-E1285

BoNT/E1-E5

SEQ ID NO: 17 M1-K419 S424-I847 K848-P1067 N1068-K1252

B0NT/E6

SEQ ID NO: 18 M1-K419 S424-I847 K848-P1067 N1068-K1252

BoNT/F1

SEQ ID NO: 19 M1-R435 A440-I866 K867-P1085 D1086-N1278

BoNT/F2

SEQ ID NO: 20 M1-R435 Q440-I866 K867-P1088 D1089-E1280

BoNT/F3

SEQ ID NO: 20 M1-R435 Q440-I866 K867-P1088 D1089-E1279

BoNT/F4

SEQ ID NO: 21 M1-R435 A440-I866 K867-P1085 D1086-E1277

BoNT/F5

SEQ ID NO: 22 M1-K434 P440-I863 K864-P1085 D1086-E1277

B0NT/F6

SEQ ID NO: 19 M1-R435 A440-I866 K867-P1088 D1089-E1275

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Toxina

Bucle expuesto LC Hn Hcn Hcc

BoNT/F7

SEQ ID NO: 23 M1-K427 N432-I857 I858-P1076 D1077-E1268

BoNT/G

SEQ ID NO: 24 M1-K442 S447-I865 S866-S1086 S1087-E1297

TeNT

SEQ ID NO: 25 M1-R449 T456-K883 S884-L1109 S1110-D1315

Debe entenderse que las definiciones y explicaciones de los terminos y expresiones anteriores y siguientes se aplican mutatis mutandis para todos los aspectos descritos en esta memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario.

El polipeptido proteoltticamente activo descrito en la presente memoria es adecuado para diversas aplicaciones. Una aplicacion comercialmente relevante es su uso en la produccion de neurotoxinas terapeuticas, tales como las aisladas de C. botulinum. En la actualidad, los cultivos celulares de C. botulinum utilizados para la preparacion de preparaciones comercialmente disponibles de neurotoxina botulmica estan contaminados con cantidades significativas de neurotoxina parcialmente procesada y/o sin procesar, que alteran negativamente, es decir, reducen la actividad espedfica de estas composiciones farmaceuticas. Usando el polipeptido proteolfticamente activo o activado descrito en este documento, por ejemplo, despues de la lisis de C. botulinum, ahora sera posible tratar composiciones que comprenden la neurotoxina no procesada y/o parcialmente procesada y, por tanto, convertir estos contaminantes en neurotoxina completamente procesada. En consecuencia, los productos comerciales pueden proporcionarse con una actividad espedfica incrementada de la neurotoxina, en la que la cantidad total de protema bacteriana puede reducirse, reduciendo aun mas el riesgo de los pacientes de la formacion de anticuerpos.

Se describe en este documento una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de la presente invencion y, opcionalmente, elementos reguladores. La expresion "elementos reguladores", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a elementos reguladores de la expresion genica, incluyendo la transcripcion y la traduccion, e incluye elementos tales como caja tata, promotor, potenciador, sitio de union a ribosomas, secuencia Shine-Dalgarno, region IRES, senal de poliadenilacion, estructura de terminacion terminal y similares. Dicho elemento regulador puede comprender uno o mas elementos reguladores heterologos o uno o mas elementos reguladores homologos. Un "elemento regulador homologo" es un elemento regulador de una celula de tipo salvaje, a partir de la cual se deriva la molecula de acido nucleico de la presente invencion, que esta implicada en la regulacion de la expresion genica de la molecula de acido nucleico o del polipeptido en dicha celula de tipo salvaje. Se describen en este documento moleculas de acido nucleico que comprenden elementos reguladores heterologos. La expresion "elemento regulador heterologo" es un elemento regulador que no esta implicado en la regulacion de la expresion genica de la molecula de acido nucleico o del polipeptido en dicha celula de tipo salvaje. Tambien se incluyen elementos reguladores para la expresion inducible, tales como promotores inducibles. La molecula de acido nucleico puede ser, por ejemplo, hnRNA, mRNA, ARN, ADN, PNA, LNA y/o moleculas de acido nucleico modificadas. La molecula de acido nucleico puede ser circular, lineal, integrada en un genoma o episomal. Tambien se incluyen los concatemeros que codifican protemas de fusion que comprenden tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipeptidos de la presente invencion. Ademas, la molecula de acido nucleico puede contener secuencias que codifican secuencias senal para el transporte intracelular tales como senales para el transporte a un compartimento intracelular o para el transporte a traves de la membrana celular.

Se ensena un vector que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con la molecula de acido nucleico descrita en la presente memoria. Un vector puede ser adecuado para la expresion in vitro y/o in vivo del polipeptido descrito en la presente memoria. El vector puede ser un vector para la expresion genica transitoria y/o estable. En la presente memoria se describe un vector que comprende ademas elementos reguladores y/o marcadores de seleccion. En el presente documento se describe un vector de origen viral, de origen de fago o de origen bacteriano.

Se describe en este documento una celula que comprende la molecula de acido nucleico o el vector que se ensena en la presente memoria. El termino "celula", tal como se utiliza en la presente memoria, abarca celulas procarioticas y/o eucariotas adecuadas para expresar dicha molecula de acido nucleico o dicho vector y en particular el polipeptido descrito en la presente memoria. Dicha celula puede ser una celula huesped que no expresa el polipeptido descrito en la presente memoria o un homologo del mismo. El termino "homologo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia polipeptidica que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con la secuencia de la SEQ ID NO: 1. Sin embargo, tambien se describen en este documento celulas, en particular celulas de tipo salvaje, que expresan el polipeptido descrito en la presente memoria o un homologo del mismo. La celula descrita en este documento puede seleccionarse de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii y C. tetani. La celula puede ser C. botulinum del serotipo A, B o F. La celula puede ser la cepa Hall (ATCC 3502) de C. botulinum. La celula puede ser la cepa productora de BoNT/A ATCC 19397, tambien conocida como NCTC 4587 y NCTC 7272 de C. botulinum.

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La celula puede ser la cepa productora de BoNT/A NCTC 2916 de C. botulinum. Dicha celula puede ser las cepas productoras de BoNT/A2 Kyoto-F y Mauritius/NCTC 9837 de C. botulinum. Dicha celula puede ser la cepa productora de BoNT/A3 A254 Loch Maree/NCTC 2012 de C. botulinum. Dicha celula puede ser la cepa productora de BoNT/A4 y B CDC657 de C. botulinum. Dicha celula puede ser la cepa productora de BoNT/A5 y b3' H04402 065 de C. botulinum. Dicha celula puede ser la cepa productora de BoNT/B1 Okra/NCTC 7273 de C. botulinum. Dicha celula puede ser la cepa productora de BoNT/B y F CDC4013/NCTC 12265 de C. botulinum. Dicha celula puede ser la cepa productora de BoNT/F1 Langeland/NCTC 10281 de C. botulinum. Dicha celula puede ser Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoidis, B. thermoproteolyticus, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli o una celula de levadura. El polipeptido descrito en este documento puede modificarse dentro de la celula (es decir, glicosilado, fosforilado, procesado por proteasas, etc.). La modificacion tambien incluye la adicion de cofactores no proteinaceos incluyendo iones metalicos. Se describen en este documento celulas que comprenden el polipeptido proteolfticamente inactivo descrito anteriormente, cualquier producto polipeptfdico intermedio, asf como el polipeptido proteolfticamente activo final descrito en la presente memoria. Tambien se describen en este documento celulas que comprenden un inductor de la expresion del polipeptido descrito en la presente memoria. Tal inductor de la expresion puede ser una molecula de acido nucleico o un polipeptido o una entidad qmmica, incluyendo una pequena entidad qmmica, que tiene el efecto de incrementar la cantidad o actividad del polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria en cultivos celulares o lisados de los mismos. El inductor de la expresion puede, p. ej., aumentar la transcripcion o traduccion de una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido descrito en el presente documento. Alternativamente, el inductor de la expresion puede ser un compuesto capaz de activar el polipeptido proteolfticamente inactivo SEQ ID NO: 2 o un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 2. Se describe en este documento una celula que comprende un inductor que es un polipeptido proteolfticamente activo capaz de eliminar residuos de aminoacidos inhibidores del extremo N de dicho polipeptido. El inductor puede expresarse, por ejemplo, por medios recombinantes conocidos por los expertos en la tecnica. Alternativamente, el inductor puede aislarse de una celula, p. ej., de una celda clostridial.

En la presente memoria se describe el uso de la molecula de acido nucleico descrita en el presente documento para la fabricacion del polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria.

Se describe en la presente memoria un metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente activo, que comprende las etapas de: (a) sintetizar qmmicamente o traducir a partir de una secuencia de nucleotidos un polipeptido, que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1; y (b) purificar el polipeptido de la etapa (a).

La expresion "sintetizar qmmicamente" significa sintetizar polipeptidos por medios qmmicos. Estos metodos se revisan, por ejemplo, en Nilsson et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2005. 34: 91-118. La expresion "purificar el polipeptido" significa retirar de una mezcla que comprende el polipeptido descrito en este documento compuestos distintos a dicho polipeptido. La expresion tambien significa retirar el polipeptido descrito en el presente documento de una mezcla que comprende compuestos distintos de dicho polipeptido. La expresion puede significar separar el polipeptido proteolfticamente activo de su precursor proteolfticamente inactivo.

El acido nucleico puede traducirse en una celula o en un sistema libre de celulas. Varios sistemas para la traduccion libre de celulas estan disponibles para los expertos en la tecnica. La traduccion en un sistema de traduccion de protemas sin celulas que comprende lisados de reticulocitos de conejo, lisados de germen de trigo, lisados de E. coli u otros lisados celulares, por ejemplo, lisados generados a partir de C. botulinum y similares se describe en la presente memoria. Tambien se describe en este documento traducir el polipeptido descrito en el presente documento a partir de la secuencia de nucleotidos o del vector descrito en el presente documento. La transcripcion puede ser regulada o controlada por uno o mas elementos reguladores heterologos o por elementos reguladores homologos. Tambien se describe en este documento la traduccion en una celula de tipo salvaje, es decir, una celula aislada de la naturaleza, tal como cualquier aislado conocido de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii y C. tetani. Dicha celula puede ser la cepa Hall de C. botulinum (ATCC 3502). Estan disponibles para el experto en la tecnica diversos medios y metodos estandar para llevar una molecula de acido nucleico o un vector a la celula y para expresar el polipeptido descrito en la presente memoria como protema recombinante en una celula. Ademas, el experto en la tecnica conoce muchas tecnicas estandar para aislar polipeptidos de celulas o lisados celulares o sistemas de expresion libres de celulas (p. ej., Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Cualquiera de estos medios y metodos se pueden utilizar en los metodos descritos en la presente memoria.

El primer polipeptido descrito en la presente memoria puede traducirse a partir de una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido proteolfticamente activo. La SEQ ID NO: 26 es un ejemplo de dicha molecula de acido nucleico. Alternativamente, dicha molecula de acido nucleico puede codificar un polipeptido precursor que es proteolfticamente inactivo, pero que puede convertirse en el polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria. La SEQ ID NO: 27 es un ejemplo de dicha molecula de acido nucleico. El precursor proteolfticamente inactivo tambien se denomina "BoNTHydrolase inactiva", abreviado iBH. Este polipeptido

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proteolfticamente inactivo puede, p. ej., ser activado durante o despues de la traduccion o poniendo en contacto, por ejemplo, dicho polipeptido proteolfticamente inactivo con una proteasa capaz de eliminar los residuos de aminoacidos inactivantes en el extremo N del polipeptido proteolfticamente inactivo. Un ejemplo de un polipeptido proteolfticamente inactivo es el polipeptido representado por SEQ ID NO: 2. Otro ejemplo es un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 2. La expresion "inactivar residuos de aminoacidos en el extremo N" en un aspecto se refiere a los primeros restos de 248aa de dicho polipeptido. Esta expresion puede referirse a un fragmento de hasta 10aa, 50aa, 100aa, 150aa, 200aa, 250aa residuos de dicho polipeptido. Cualquiera de estos polipeptidos es util en el metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria. Se describe en este documento una proteasa capaz de eliminar los residuos de aminoacidos inactivos del extremo N de este polipeptido que se afsla, p. ej., de Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii y Clostridium tetani. En el presente documento se describe una proteasa capaz de eliminar dicho aminoacido inactivante proporcionando un lisado fraccionado o no fraccionado de dichas celulas. Los residuos de aminoacidos inactivantes se pueden eliminar poniendo en contacto el polipeptido proteolfticamente inactivo con dicho lisado e incubando hasta que el polipeptido proteolfticamente inactivo se transforme en el polipeptido proteolfticamente activo.

En el presente documento se describe un metodo en el que el polipeptido se traduce en una celula. La celula puede ser una celula procariota o eucariotica. Se describe en este documento una celula seleccionada entre E. coli, B. subtilis o levadura. Tambien se describe en este documento la traduccion del polipeptido descrito en el presente documento en una celula de tipo salvaje, es decir, una celula aislada de la naturaleza, tal como cualquier aislado conocido de Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii y Clostridium tetani. Dicha celula puede ser la cepa Hall de C. botulinum (ATCC 3502). Dicha celula puede ser la celula descrita anteriormente en este documento.

Los productos de traduccion obtenidos por el metodo pueden purificarse por diversos medios, todos los cuales son conocidos por los expertos en la tecnica (p. ej., Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Los metodos tfpicos de purificacion del polipeptido descrito en la presente invencion pueden implicar la centrifugacion de lisado celular, la precipitacion de protemas con sulfato de amonio, la resuspension de protemas, la centrifugacion de protemas resuspendidas, la cromatograffa de intercambio ionico, la cromatograffa de exclusion por tamanos, la cromatograffa de interaccion hidrofoba y similares. Varias combinaciones de tales etapas, en orden diferente, pueden ser utiles para purificar el polipeptido. Un metodo para purificar el polipeptido se describe en los Ejemplos.

En una descripcion, la etapa de purificacion comprende la union del polipeptido a un soporte solido. La expresion "soporte solido" se refiere a una matriz que abarca, p. ej., sflice, dextrano reticulado, poliacrilamida reticulada o agarosa reticulada y similares. Tambien se incluyen, en particular, polipeptidos, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, polietilenglicol (PEG), dextrano, nilon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. Un soporte solido puede ser una matriz de polisacarido seleccionada del grupo que consiste en: sepharose, sephadex, agarosa, sephacell, microcelulosa y perlas de alginato. Dicho soporte solido puede consistir en perlas de vidrio y/o matrices de polipeptidos.

En una descripcion, el soporte solido esta unido al anticuerpo descrito en la presente memoria. El termino "enlazado" significa, en una descripcion, establemente unido o establemente asociado. En otra descripcion, enlazado incluye interacciones tales como enlaces indirectos o directos, no reversibles o reversibles, ffsicos y qrnmicos, electrostaticos y/o covalentes. En una descripcion, el anticuerpo esta unido covalentemente, directamente o a traves de una molecula enlazadora, al soporte solido. El anticuerpo puede unirse a dicho soporte solido a traves de un enlazante, incluyendo compuestos moleculares pequenos y moleculas enlazadoras de peptidos (o polipeptidos). El soporte solido puede tener practicamente cualquier configuracion o disposicion estructural posible siempre que el anticuerpo acoplado sea capaz de unirse a su antfgeno. Por lo tanto, la matriz o soporte solido puede ser esferico, como en una perla, o cilmdrico, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser irregular o plana tal como una hoja o tira de ensayo.

Dicho anticuerpo enlazado al soporte solido puede usarse p. ej., en un metodo de fabricacion o en un metodo de diagnostico. Dicho metodo de fabricacion puede comprender una etapa de cromatograffa de afinidad, en la que dicha cromatograffa de afinidad se basa en un anticuerpo unido a un soporte solido. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido proteolfticamente inactivo descrito en la presente memoria.

Se describe en este documento un metodo para fabricar el polipeptido proteolfticamente activo que comprende purificar el polipeptido a partir de una mezcla que contiene componentes adicionales. La purificacion puede basarse, p. ej., en la polaridad, la carga electrica y el tamano. Por lo tanto, el metodo puede comprender una o mas etapas de separacion seleccionadas del grupo que consiste en: HPLC en fase normal, HPLC en fase inversa, cromatograffa de interaccion hidrofflica (HILIC), cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC), cromatograffa de intercambio ionico

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(IEC), incluyendo cromatograffa de intercambio anionico y cromatograffa de intercambio cationico, cromatograffa de exclusion portamanos (SEC), cromatograffa de permeacion de gel (GPC).

Se describe en este documento una purificacion que comprende las etapas de: (a) separacion por cromatograffa de intercambio anionico; (b) separacion por cromatograffa de exclusion por tamanos; (c) separacion por cromatograffa de interaccion hidrofobica; y (d) separacion por cromatograffa de exclusion portamanos.

Una o mas fracciones recogidas de una columna de cromatograffa pueden concentrarse, p. ej., por precipitacion o ultrafiltracion.

En el presente documento se describe una composicion que comprende el polipeptido proteolfticamente activo. Utilizando el metodo descrito en la presente memoria, es posible fabricar un polipeptido proteolfticamente activo, que esta sustancialmente libre de polipeptido proteolfticamente inactivo. En otras palabras, el metodo proporciona un polipeptido proteolfticamente activo y una composicion que no comprende contaminacion sustancial con protema precursora inactiva del polipeptido. Se considera que una composicion no contiene contaminacion sustancial o esta sustancialmente libre de polipeptido precursor proteolfticamente inactivo si, mediante un metodo de deteccion basado en Western Blot, se puede detectar menos del 5% de precursor proteolfticamente inactivo, en donde dicho 5% se refiere a la cantidad de precursor proteolfticamente inactivo en relacion con la suma de polipeptido proteolfticamente activo e inactivo. Dicha composicion puede ser sustancialmente pura y comprender al menos un 50% de polipeptido proteolfticamente activo, en donde dicho 50% se refiere a la cantidad de precursor proteolfticamente activo en relacion con la cantidad total de protema contenida en la composicion. Dicha composicion sustancialmente pura puede comprender al menos 75%, 80%, 90% o al menos 98% de polipeptido proteolfticamente activo.

Se describe en la presente memoria un polipeptido que se puede obtener a partir del metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente activo como se ha descrito en este documento anteriormente y como se ilustra en los Ejemplos. En el presente documento se describe un polipeptido proteolfticamente activo que es un polipeptido proteolfticamente activo con la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 1. En el presente documento se describe un polipeptido proteolfticamente activo que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1. Se describe en la presente memoria un polipeptido proteolfticamente activo que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con la secuencia de SEQ ID NO: 1. La expresion "polipeptido que se puede obtener", como se usa en la presente memoria, se refiere en un aspecto a un polipeptido que se traduce a partir del acido nucleico descrito en el presente documento. El polipeptido puede posteriormente someterse a modificacion postraduccional tal como acilacion, alquilacion, amidacion, adicion de aminoacidos, delecion de aminoacidos, glicosilacion, oxidacion, S-glutationilacion, fosforilacion, sulfatacion, procesamiento proteolftico y similares. Ademas, el polipeptido puede unirse a un ion metalico tal como Li+, N/a+, K+, Ag+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Co2+, Ni2+, Mn2+, Cu2+ o Zn2+. Preferiblemente, dicho ion metalico es Zn2+, Mn2+ o Co2+.

En la presente memoria se describe un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido descrito en la presente memoria. El termino "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente memoria, abarca un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo de cadena unica, un anticuerpo humano, humanizado, primatizado o quimerico, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo sintetico, derivados modificados qmmicamente o enzimaticamente, un fragmento de cualquiera de dichos anticuerpos o aptameros que consisten en acidos nucleicos naturales y/o modificados qmmicamente. Los fragmentos de dichos anticuerpos incluyen fragmentos F(ab')2, F(ab), Fv o scFv o derivados modificados qmmicamente o enzimaticamente de cualquiera de estos fragmentos.

En una descripcion, el anticuerpo se unira espedficamente al polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria o a su precursor proteolfticamente inactivo. Un anticuerpo que es espedfico para el polipeptido proteolfticamente activo reacciona de forma cruzada con el polipeptido proteolfticamente inactivo descrito en el presente documento. Se describe en este documento un anticuerpo capaz de discriminar entre el polipeptido proteolfticamente activo y su precursor inactivo. En otra descripcion, el epftopo para el cual dicho anticuerpo es espedfico esta localizado en una region de aminoacidos que esta presente en el polipeptido proteolfticamente inactivo pero no en el polipeptido proteolfticamente activo. Por ejemplo, dicho epftopo puede ser un epftopo de una region polipeptfdica que consiste en los residuos de aminoacidos 1 a 248 de un polipeptido que comprende la secuencia polipeptfdica que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 2.

Se describe en este documento un epftopo formado por restos de aminoacidos situados en el extremo N del aminoacido 249 de un polipeptido que comprende la secuencia polipeptfdica que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con la secuencia de la SEQ ID NO: 2. Dicho epftopo se puede eliminar del polipeptido proteolfticamente inactivo descrito en la presente memoria mediante un procesamiento proteolftico.

En una descripcion, el epftopo para el cual el anticuerpo es espedfico es un epftopo situado en el extremo N de un polipeptido que comprende la secuencia polipeptfdica que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1. El termino "N-terminal", tal como se utiliza en esta descripcion, se refiere a una region del polipeptido que comprende los 50 restos de aminoacidos N-terminales de dicha secuencia polipeptfdica, preferiblemente los 25 residuos de aminoacidos N-terminales de dicha secuencia polipeptfdica. En una descripcion particular, el termino se refiere a los 14 residuos de aminoacidos N-terminales. El termino "epftopo", tal como se

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utiliza en la presente memoria, se refiere al determinate antigenico que es reconocido por el anticuerpo descrito en la presente memoria. En una descripcion, el epftopo es un epftopo lineal, en otra descripcion el epftopo es un epftopo conformacional. En una descripcion particular, el determinate antigenico consiste en un peptido quetiene la secuencia de aminoacidos del extremo N del polipeptido proteolfticamente activo descrito en el presente documento, en el que dicho peptido puede tener una longitud de aminoacidos de 7 a 14, preferiblemente de 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de aminoacidos.

La expresion "se une espedficamente" o "que se une espedficamente a" en una descripcion significa que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada en una extension significativa con otros epftopos, ya sea sobre el polipeptido descrito en la presente memoria o sobre otros polipeptidos en general. La especificidad del epftopo es una caractenstica importante del anticuerpo. La especificidad del anticuerpo con respecto al polipeptido proteolfticamente activo frente al proteolfticamente inactivo debera ser, en un aspecto, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%. La union espedfica se puede probar mediante diversas tecnicas bien conocidas que incluyen, por ejemplo, estudios de competicion. Otra caractenstica importante es la sensibilidad del anticuerpo. La sensibilidad debe ser, en una descripcion, tal que al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% del epftopo comprendido por una muestra esta unido. La sensibilidad se puede probar por tecnicas bien conocidas. Los expertos en la tecnica seran capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y optimas para cada determinacion empleando experimentacion rutinaria. Las tecnicas convencionales para estudios de union incluyen radioinmunoensayo, ELISA, dialisis de equilibrio, microcalorimetna isotermica, ensayos BIACORE® (resonancia de plasmon de superficie, SPR) u otros metodos de adsorcion superficial. El sistema BIACORE® SPR mide la interaccion anticuerpo-antigeno. La respuesta SPR refleja un cambio en la concentracion de masa en la superficie del detector cuando los analitos se unen o disocian. Basado en SPR, las mediciones BIACORE® en tiempo real monitorean las interacciones directamente cuando ocurren, vease BIA Applications Handbook, version AB (reimpreso 1998), BIACORE® codigo No: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB (reimpreso 1998), BIACORE® codigo No: BR-1001-84. Las propiedades de union, tales como la sensibilidad de un anticuerpo de la presente invencion, pueden determinarse en principio mediante estudios de union utilizando un antfgeno inmovilizado (el ligando) presentado en una superficie del sensor. El anticuerpo a ensayar (el analito) se proporcionara en la fase movil, es decir, en una solucion. En algunos casos, el antfgeno esta unido indirectamente a la superficie a traves de la union a otra molecula inmovilizada que se denomina molecula de captura. Cuando el anticuerpo se inyecta en un pulso discreto a traves de la superficie con los antfgenos inmovilizados, se pueden subdividir esencialmente tres fases: (i) asociacion del anticuerpo con el antfgeno durante la inyeccion de la muestra; (ii) Equilibrio o estado estacionario durante la inyeccion de la muestra, donde la velocidad de union del anticuerpo se equilibra por disociacion del complejo anticuerpo-antfgeno; (iii) Disociacion del anticuerpo de la superficie durante el flujo de tampon. Se entendera que dicho ensayo puede realizarse alternativamente con los anticuerpos inmovilizados a investigar y una solucion que contiene el antfgeno como fase movil. Las fases de asociacion y disociacion proporcionan informacion sobre la cinetica de la interaccion analito-ligando (ka y kd, las velocidades de formacion y disociacion del complejo, kd/ka=Ko). La fase de equilibrio proporciona informacion sobre la afinidad de la interaccion analito-ligando (Kd). El anticuerpo puede tener una Kd de menos de 0,5 |iM, en otra descripcion inferior a 0,05 |iM y, en otra descripcion, inferior a 0,02 |iM.

El anticuerpo al que se hace referencia en este documento puede fabricarse usando metodos que se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane, 1988 (Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988). Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante las tecnicas descritas originalmente en Kohler y Milstein, 1975 (Kohler y Milstein 1975, Nature 256: 495) y Galfre y Milstein, 1981 (Galfre y Milstein 1981, Meth Enzymol 73: 3). Dichas tecnicas comprenden la fusion de celulas de mieloma de raton a celulas de bazo derivadas de mamferos inmunizados. Los anticuerpos se pueden mejorar adicionalmente mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, la resonancia de plasmon de superficie, tal como se emplea en el sistema BIACORE®, puede usarse para aumentar la eficacia de anticuerpos fagicos que se unen al epftopo antes mencionado dentro del polipeptido de la presente invencion (cf. Schier et al., 1996, Human Antibodies Hybridomas 7: 97; Malmborg et al., 1995, J. Immunol Methods 183: 7).

Se describe en este documento un anticuerpo producido usando un peptido que comprende o que consiste en el epftopo antes mencionado. El peptido se puede producir p. ej., sinteticamente o por expresion recombinante. Alternativamente, el anticuerpo puede producirse aplicando un polipeptido proteolfticamente activo o inactivo de origen natural descrito en la presente memoria. En este ultimo caso, debe entenderse que los anticuerpos resultantes se someteran ulteriormente a prueba de especificidad con respecto al polipeptido descrito en el presente documento. Se describe en este documento un anticuerpo monoclonal producido usando un polipeptido descrito en la presente memoria que puede tratarse con un detergente con el fin de hacer que el epftopo este inmunologicamente disponible. Sin embargo, se entendera que en un caso en que el anticuerpo se dirija contra un epftopo conformacional, no se llevara a cabo dicho tratamiento con detergente. Los agentes de estimulacion inmune tales como la hemocianina de lapa californiana (KLH) tambien se pueden aplicar en tal procedimiento, especialmente cuando se usa un peptido sintetico.

El anticuerpo puede utilizarse, por ejemplo, para cromatograffa de afinidad, inmunoprecipitacion e inmunolocalizacion del polipeptido de la presente invencion, asf como para la monitorizacion de la presencia de dicho polipeptido en muestras o en organismos recombinantes. Ademas, el anticuerpo puede usarse en un metodo

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de deteccion o en un metodo de diagnostico. En una descripcion particular, el anticuerpo se usa en Western Blot o ELISA. Ademas, el anticuerpo se puede usar en aplicaciones terapeuticas. En particular, el anticuerpo puede usarse para inhibir la actividad del polipeptido proteolfticamente activo descrito en el presente documento. Por lo tanto, el anticuerpo tambien tiene diversas aplicaciones terapeuticas descritas en este documento mas adelante.

En el presente documento se describe el uso del polipeptido proteolfticamente activo descrito en el presente documento en un metodo para procesar proteolfticamente un polipeptido. Se describe en este documento un metodo para la fabricacion de un polipeptido procesado proteolfticamente, que comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipeptido, siendo dicho primer polipeptido el polipeptido descrito en la presente memoria, con (b) un segundo polipeptido, siendo dicho segundo polipeptido susceptible de proteolisis por dicho polipeptido, en el que dicho contacto da como resultado el procesamiento proteolftico de dicho segundo polipeptido en al menos dos productos de escision.

El uso de Lys-N o Lys-C y arginil endopeptidasa (endoproteinasa Arg-C, LeR) de Lysobacter enzymogenes (ATCC 29487) (Wright DS, Graham LD, Jennings PA. Biochim Biophys Acta. 1998 Dic 22; l443 (3): 369 - 74) se describe en la presente memoria. El uso de plasmina y/o omptina (OmpT), una serina proteasa unida a la membrana que escinde en motivos (Arg/Lys) - (Arg/Lys) (K. Sugimura y T. Nishihara. J. Bacteriol. 170 (1988), pp. 5625-5632) en un metodo para procesar proteolfticamente CNT tal como BoNT/A se describe en la presente memoria. En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para la fabricacion de un polipeptido procesado proteolfticamente, que comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipeptido, siendo dicho primer polipeptido Lys-C, con (b) un segundo polipeptido, siendo dicho segundo polipeptido susceptible a la proteolisis por dicho primer polipeptido, donde dicho contacto da como resultado un procesamiento proteolftico de dicho segundo polipeptido en al menos dos productos de escision, y en el que el segundo polipeptido es la cadena unica de BoNT/A y en el que dicho primer polipeptido hidroliza el serotipo A de la neurotoxina botulmica de cadena sencilla (BoNT/A) para producir un serotipo A de neurotoxina botulmica di-cadena (BoNT/A). El termino "Lys-C" se refiere a la serina endoproteinasa Lys-C de 33 kDa de Lysobacter enzymogenes (Lysyl endopeptidase, LeK, Genbank acc. Q7M135) que escinde espedficamente enlaces peptfdicos C-terminalmente a lisina. El termino "Lys-N" se refiere a la metaloendopeptidasa Lys-N aislada de Grifola frondosa y Pleurotus ostreatus (Nonaka T et al., 1997, J Biol Chem. 272: 30032-30039; Nonaka T et al., 1998, J Biochem. 1998, 124: 157-162; Hori T y col., 2001, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57: 361-368). Tambien se incluyen en el termino homologos de dicha proteasa que tienen al menos un 60% de identidad de secuencia.

Se describe en este documento un metodo utilizado, por ejemplo, para fabricar una neurotoxina procesada proteolfticamente (CNT) o una neurotoxina botulmica (BoNT). El termino "BoNT", tal como se emplea en su totalidad, significa una neurotoxina botulmica y se refiere a la neurotoxina obtenible de C. botulinum tal como BoNT del serotipo A, B, C1, D, E, F o G. Tambien se incluye en el termino "CNT" y "BoNT" una neurotoxina recombinante y modificada que comprende una o mas modificaciones incluyendo la modificacion qmmica o la modificacion genetica. La expresion "modificacion genetica" significa supresion, sustitucion o adicion de uno o mas residuos de aminoacidos. Usando el metodo de la presente invencion, ahora es posible obtener composiciones de neurotoxina con una contaminacion significativamente menor por neurotoxina no procesada o parcialmente procesada, ya que estos contaminantes se procesan eficientemente en la neurotoxina de di-cadena. En un aspecto, la di-cadena (BoNT/A) es una di-cadena nativa (BoNT/A), en la que el extremo C-terminal de la cadena ligera y el extremo N- terminal de la cadena pesada son identicos a los correspondientes di-cadena (BoNT/A) aislada de clostridios naturales.

La expresion "poner en contacto", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a poner al menos dos compuestos diferentes en proximidad ffsica para permitir la interaccion ffsica y/o qmmica de dichos compuestos. De acuerdo con el metodo de esta invencion, dichos dos compuestos diferentes son, en un aspecto, el primer y el segundo polipeptidos que estan comprendidos por la solucion. El contacto se lleva a cabo bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interaccion del primer y segundo polipeptido. La expresion "polipeptido procesado proteolfticamente", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere en un aspecto a un polipeptido, cuya cadena polipepffdica ha sido hidrolizada o escindida en uno o mas enlaces pepffdicos. En otro aspecto, la expresion se refiere a un polipeptido que ha sido escindido proteolfticamente por una endoproteinasa o endopeptidasa. En otro aspecto, la expresion se refiere a un polipeptido que ha sido escindido hasta un grado de al menos 50%. En otro aspecto, dicho polipeptido procesado proteolfticamente es el segundo polipeptido. En otro aspecto, al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 95% se procesan proteolfticamente.

La expresion "segundo polipeptido", tal como se utiliza en este documento, se refiere al sustrato de dicho primer polipeptido. La expresion "ser susceptible a la proteolisis" se refiere a una caractenstica o requisito del segundo polipeptido y se usa en la presente memoria significando que el segundo polipeptido es escindible proteolfticamente por dicho primer polipeptido. En otras palabras, la expresion "ser susceptible a la proteolisis" significa que el segundo polipeptido comprende un sitio de reconocimiento y escision de proteasa que le permite funcionar como un sustrato del primer polipeptido. El "segundo polipeptido" es un sustrato del primer polipeptido y se procesa proteolfticamente en dos o mas productos de escision. Usando el ensayo descrito anteriormente, el experto en la materia puede probar si un polipeptido dado es un sustrato del primer polipeptido y, por lo tanto, un "segundo polipeptido" de acuerdo con la definicion de la presente invencion. La expresion "al menos dos productos de escision" incluye, por ejemplo, hasta dos, tres, cuatro, cinco y hasta seis productos de escision.

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Este metodo puede usarse, por ejemplo, para preparar una composicion farmaceutica que comprende neurotoxina clostridial o para generar fragmentos polipeptfdicos usados en un metodo de espectrometna de masas. El primer polipeptido y el segundo polipeptido pueden ponerse en contacto en diversas etapas en el proceso de fabricacion del polipeptido procesado proteolfticamente. En un aspecto, la etapa de poner en contacto el primer polipeptido y el segundo polipeptido es dentro de una celula. En un aspecto particular de esta realizacion, el primer y el segundo polipeptidos se expresan en dicha celula.

En otro aspecto, dicha etapa de contacto es en un lisado celular o en un lisado celular purificado. Este aspecto abarca la adicion del primer polipeptido al lisado o al lisado purificado. El primer polipeptido se puede anadir en varias etapas durante la purificacion del segundo polipeptido a partir del lisado celular. Por ejemplo, se puede anadir el primer polipeptido antes o despues de la precipitacion de protemas, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de interaccion hidrofoba y/o cromatograffa de exclusion por tamanos. Ademas, tambien se incluye la adicion del primer polipeptido a una composicion farmaceutica. En este aspecto, el polipeptido de la presente invencion se utiliza p. ej., para la escision proteolftica del segundo polipeptido, p. ej., para activar un segundo polipeptido que es un agente terapeutico contenido en la composicion farmaceutica. Tambien se preve la administracion del primer polipeptido a un sujeto, con el fin de procesar proteolfticamente un segundo polipeptido en el sujeto. La administracion tambien incluye la coadministracion del primer y segundo polipeptidos. Tambien se abarca por este metodo una etapa de incubacion en condiciones y durante un tiempo suficiente para escindir el segundo polipeptido. En un aspecto, las condiciones pueden comprender la adicion de un tampon seleccionado del grupo que consiste en Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 o PBS (NaHPO4 50 mM2, NaCl 150 mM, pH 7,4). Las condiciones de tampon preferidas incluyen Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. El "tiempo suficiente para escindir" se puede determinar usando el ensayo descrito anteriormente en este documento. En un aspecto, dicho "tiempo suficiente para escindir" depende del grado de escision que debe tener el polipeptido procesado proteolfticamente o una composicion que lo comprende. En un aspecto, el metodo comprende una etapa de incubar el primer y el segundo polipeptidos durante al menos 30 min, 60 min, 120 min o al menos 240 min. En otro aspecto, el primer y el segundo polipeptidos se incuban durante hasta 30 min, 60 min, 120 min, 240 min, 480 min o hasta 600 min. En otro aspecto, el metodo comprende una etapa de incubar el primer y el segundo polipeptidos a 4°C o a 37°C. En otro aspecto, el metodo comprende una etapa de incubacion durante hasta 1 h, hasta 2 h, 4 h, 6 h, 10 h o hasta 16 h.

En un aspecto, la cadena polipeptfdica de dicho segundo polipeptido comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25. En un aspecto mas particular, la cadena polipeptfdica de dicho segundo polipeptido comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25 y en la que el segundo polipeptido es escindido en C-terminal en un resto de aminoacido basico dentro de dicha secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 4 a 25. Dichas secuencias representan secuencias de aminoacidos de sustratos conocidos del polipeptido proteolfticamente activo de la presente invencion. Como se muestra en este documento, dichos sustratos se escinden en C-terminal a un residuo de aminoacido basico contenido en la secuencia, comparar la Tabla 1, la columna LC y HN. En un aspecto preferido, dicho segundo polipeptido comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 4 a 10. En otro aspecto preferido, dicho segundo polipeptido es BoNT/A o un derivado del mismo, incluyendo p. ej., el polipeptido de SEQ ID NO: 3 y sus derivados. El termino “derivado”, tal como se usa con respecto a este y otros aspectos de la invencion, comprende mutaciones de aminoacidos tales como adicion, sustitucion, delecion o truncamiento de uno o mas residuos de aminoacidos.

En un aspecto, el segundo polipeptido comprende un derivado de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25, o de SEQ ID NO: 3, en el que dicho derivado tiene una o mas mutaciones puntuales y/o uno o mas residuos de aminoacidos adicionales. En otro aspecto, dicho derivado tiene hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10, hasta 15 mutaciones puntuales. Usando el ensayo de actividad para determinar la actividad de proteasa, como se describe en la presente memoria, el experto en la materia puede determinar si un derivado dado se procesa por el polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria. En otro aspecto, el derivado contiene una mutacion puntual que cambia un residuo de aminoacido basico en un resto de aminoacido no basico. En otro aspecto, el derivado tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25. En otro aspecto, dicho derivado o un polipeptido que comprende el derivado es un sustrato del primer polipeptido y es proteolfticamente escindible por el primer polipeptido. Un ejemplo tfpico es un derivado de la SEQ ID NO: 3 que comprende, por ejemplo, una o mas mutaciones puntuales en la cadena ligera o pesada.

Se describe en este documento un segundo polipeptido que comprende (a) una secuencia polipeptfdica que tiene al menos un 30% de identidad de secuencia con la secuencia de sEq ID NO: 3 [(BoNT/A de ATCC 3502, Genbank ac. AAA23262)]; o (b) una secuencia polipeptfdica seleccionada del grupo que consiste en neurotoxina tetanica, protema del Factor X de coagulacion o Protrombina (Factor II), enzimas digestivas del pancreas como la tripsina, quimotripsina, pepsina, papama. Al menos el 30% significa al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 85%. En un aspecto particular, la identidad de secuencia de dicha segunda secuencia polipeptfdica que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 3 se determina basandose en la posicion de aminoacido 420 a 466 de SEQ ID NO: 3, en otro aspecto, dicha identidad de secuencia se determina basandose en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25. Se describe en el presente documento un segundo polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que tiene, p. ej., una identidad de secuencia de al menos el 30% con respecto a la secuencia polipeptfdica encontrada entre las posiciones de aminoacidos 420 y 466 de SEQ ID NO: 3 o al menos 30% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptfdica de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25. Un polipeptido segun esta definicion es, p. ej., obtenible de C. botulinum, C. tetani o C. sporogenes. Se describe en este

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documento un segundo polipeptido que puede ser, por ejemplo, una neurotoxina natural tal como BoNT/A, B, C1, D, E, F o G o un derivado de la misma que comprende una o mas mutaciones de aminoacidos tales como adicion, sustitucion, delecion o truncamiento de uno o mas residuos de aminoacidos. Se incluyen, por ejemplo, los derivados que carecen de, p. ej., el dominio nativo de neurotoxina HC o partes de los mismos o derivados con otros residuos de aminoacidos que reemplazan el dominio de neurotoxina HC asf como derivados con una cadena ligera adicional u otra molecula de carga protemica fusionada en N terminal a la cadena ligera de BoNT.

En otro aspecto, el segundo polipeptido puede contener residuos de aminoacidos adicionales en el extremo N o C o en una posicion interna. Los residuos de aminoacidos adicionales pueden estar flanqueados por uno o mas sitios de escision de proteasas. En otro aspecto, la secuencia de aminoacidos adicional funciona como un marcador detectable y/o permite la union a un soporte solido. Un ejemplo es una marcador his o un marcador GST. Otro ejemplo es la secuencia de aminoacidos VPPTPGSAWSHPQFEk que contiene Streptag, preferiblemente anadido al extremo C-terminal.

Se describe en este documento un segundo polipeptido que es un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica como se muestra en GenBank no: CBZ04958.1, YP_002805603.1, ZP_001788403.1,

YP_001782718.1, ZP_02616437.1, ZP_02614241.1, YP_001392361.1, YP_001255575.1 o un homologo de la misma que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia.

En otro aspecto, la actividad biologica de dicho segundo polipeptido esta modulada por la escision proteolftica. Es bien conocido por los expertos en la materia que la funcion de muchos polipeptidos puede ser modulada por procesamiento proteolftico. "Modulado", tal como se usa en la presente memoria, significa aumento o disminucion, activacion o inactivacion. Por ejemplo, la actividad biologica de muchas neurotoxinas clostridiales se incrementa o se desencadena mediante el procesamiento proteolftico de una neurotoxina de cadena unica en una neurotoxina di- cadena, en donde la neurotoxina di-cadena se compone de una cadena polipeptica ligera y una pesada, que estan unidas covalentemente a traves de un puente disulfuro. La actividad biologica de la neurotoxina abarca al menos tres actividades separadas: la primera actividad es una "actividad proteolftica" que reside en la cadena ligera de la neurotoxina y es responsable de hidrolizar el enlace peptfdico de uno o mas polipeptidos implicados en la regulacion de la fusion de la membrana celular. Una segunda actividad es una "actividad de translocacion", que reside en el extremo N-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesada y esta implicada en el transporte de la cadena ligera a traves de la membrana lisosomal y en el citoplasma. Una tercera actividad es una "actividad de union al receptor", que reside en el extremo C-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesada y que participa en la union y absorcion de la neurotoxina a una celula diana. En un aspecto preferido, la expresion “actividad biologica”, como se usa en la presente memoria, significa actividad proteolftica. En un aspecto mas preferido, la expresion significa actividad proteolftica incrementada.

La actividad biologica de la neurotoxina clostridial se puede medir mediante diversos ensayos, todos conocidos por los expertos en la tecnica. Estas pruebas permiten determinar una o mas de las actividades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, el ensayo LD50 de raton o el ensayo de hemidiafragma de nervio frenico de raton ex vivo (MPN) como se describe por Pearce et al., 1994 (Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994), Toxicol Appl Pharmacol 128: 69 - 77) y Habermann et al., 1980 (Habermann E, Dreyer F, Bigalke H. (1980), Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 311: 33-40) permiten determinar el efecto toxico de una preparacion de neurotoxina en un organismo vivo o en una preparacion neuromuscular aislada. Para establecer el efecto toxico en un ensayo LD50, la neurotoxina debe ser biologicamente activa en cada una de dichas tres actividades mencionadas anteriormente. Ademas, estan disponibles otros diversos ensayos, que permiten, por ejemplo, determinar si una neurotoxina o la cadena ligera de la neurotoxina es proteolfticamente activa. Dichos ensayos se basan, p. ej., en poner en contacto BoNT/A con SNAP-25. Alternativamente, se puede usar un peptido que represente el sitio de escision de SNAP-25, donde el peptido puede marcarse para facilitar la deteccion. En un aspecto preferido, la actividad biologica se determina usando el ensayo de MPN descrito anteriormente en esta memoria.

Se describe en el presente documento un primer polipeptido activado mediante procesamiento proteolftico de un polipeptido precursor inactivo, comprendiendo dicho polipeptido precursor inactivo una secuencia polipeptfdica que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 2. Esto descansa en la observacion de que un polipeptido que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 2 es proteolfticamente inactivo, mientras que los truncamientos N - terminales de los mismos son proteolfticamente activos. En la presente memoria se describe el uso del polipeptido proteolfticamente inactivo en los metodos descritos en la presente memoria. El polipeptido proteolfticamente inactivo descrito en la presente memoria puede activarse, p. ej., mediante la eliminacion de un fragmento del extremo N-terminal o de todo el extremo N que comprende los residuos de aminoacidos 1 a 248 de la SEQ ID NO: 2. En una descripcion, el extremo N-terminal se elimina por una proteasa, en otra descripcion, el extremo N-terminal se elimina por autoproteolisis de SEQ ID NO: 2. El 60% de identidad de secuencia se refiere a una alineacion de secuencia con NT02CB1447 de longitud completa.

En otro aspecto, el metodo de la presente invencion para la fabricacion de un polipeptido procesado proteolfticamente comprende la etapa de purificar el segundo polipeptido procesado proteolfticamente o al menos uno o dos o mas productos de escision de los mismos. La purificacion de BoNT/A expresado por C. botulinum puede hacerse p. ej., como se describe esencialmente en el estado de la tecnica (DasGupta 1984, Toxicon 22, 415;

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Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461). En particular, la purificacion de la neurotoxina puede contener una o mas etapas de precipitacion y extraccion, una o mas etapas de concentracion y otras etapas cromatograficas distintas. El BoNT/A de cadena sencilla recombinante y su purificacion se describen en la tecnica anterior (Rummel et al., 2004, Mol Microbiol. 51: 631-43).

En una realizacion preferida, la cepa de Clostridium es C. botulinum, que produce BoNT/A, o un derivado de la misma. Para la fermentacion, el proceso descrito por DasGupta B. R. et al. en Toxicon, vol. 22, No. 3, pag. 414 a 424, 1984, se puede usar. Por lo tanto, se anaden 0,5% de extracto de levadura y 0,6% de pasta de levadura esterilizada en autoclave a 2% del medio NZ-amina tipo A, y un pH de 7,2 se ajustara con ayuda de NaOH 4N y el medio preparado de tal manera despues se sometera a autoclave. A este medio se puede anadir por separado glucosa sometida a autoclave (20% en peso por volumen), para llegar a una concentracion final de glucosa de 0,5% en el medio. La incubacion puede ocurrir, p. ej., a 37°C sin agitacion, en el que la fermentacion se interrumpe, p. ej., despues de 96 horas. Esta dentro del alcance de la presente invencion que ademas de la fermentacion discontinua descrita antes tambien de la fermentacion semi- discontinua, se puede realizar una fermentacion discontinua repetida o una fermentacion continua.

Despues de la fermentacion y separacion reales del medio de fermentacion de las celulas, el medio de fermentacion puede someterse a una primera precipitacion con el objetivo de eliminar grandes protemas. La precipitacion es preferiblemente una precipitacion acida. Las condiciones de reaccion para tal precipitacion acida son conocidas por los expertos en la tecnica. Tfpicamente, puede usarse H2SO41,5 M para acidificar el sobrenadante a un pH de 3,5. La centrifugacion ocurre usualmente durante 20 minutos a 2400 x g a 4°C. El granulo recibido a traves de la centrifugacion se puede lavar con agua, preferiblemente repetidamente. Posteriormente, el granulo puede extraerse con un tampon de acido cftrico y citrato de trisodio 0,1 M, pH 5,5, p. ej., durante una hora. Posteriormente, se puede realizar una etapa de centrifugacion adicional, p. ej., a 9800 x g durante 20 minutos a 4°C. El granulo asf obtenido puede extraerse de nuevo opcionalmente como se ha descrito anteriormente. El sobrenadante de la extraccion, y ambos sobrenadantes en caso de repeticion de la extraccion, pueden ser sometidos a precipitacion con sulfato de protamina. La precipitacion puede continuar durante la noche, p. ej., a 8°C. Posteriormente, el precipitado puede centrifugarse, p. ej., durante 20 minutos a 4°C y a 12.000 x g. El sobrenadante de la centrifugacion puede someterse a una precipitacion tal como una precipitacion con sulfato de amonio, por lo que se pueden eliminar otras protemas mas grandes. Despues de la etapa de precipitacion con sulfato de amonio, se puede anadir otra etapa de centrifugacion y posteriormente se puede volver a disolver el sedimento asf obtenido y, opcionalmente, someterse a una dialisis. El extracto que se dializa preferentemente y se centrifuga de nuevo, puede someterse a una sucesion de etapas de cromatograffa con el objetivo de purificar la neurotoxina. Cada una de las etapas de cromatograffa sirve para eliminar contaminantes tales como sulfato de protamina, ADN restante, partes de protemas mas pequenas y protemas de tamano medio, asf como las hemaglutininas del complejo de protema de neurotoxina botulmica. Para este proposito, se puede usar una o mas etapas de cromatograffa en una realizacion preferida. Opcionalmente, el eluato de, p. ej., la ultima etapa de cromatograffa, se puede filtrar para reducir germenes. Opcionalmente, el eluato se puede diluir antes de la filtracion y se pueden anadir adyuvantes adecuados. Durante los pasos adicionales puede realizarse otra filtracion esteril despues de la adicion de los adyuvantes. En un aspecto, la filtracion se lleva a cabo en recipientes de reaccion que pueden someterse luego a una etapa de liofilizacion.

Se describe en este documento una composicion que puede obtenerse mediante el metodo de la presente invencion para la fabricacion de un polipeptido procesado proteoltticamente. Se describe en la presente memoria una composicion que comprende una mezcla del segundo polipeptido procesado y no procesado, en el que dicha mezcla puede contener menos del 5%, 4%, 3%, 2% o menos del 1% del segundo polipeptido no procesado . Una composicion, en la que dicho segundo polipeptido es BoNT o un derivado del mismo se describe en la presente memoria. Se describe en este documento un BoNT, p. ej., seleccionado del grupo que consiste en BoNT del serotipo A, B, C, D, E, F y G, incluyendo un derivado del mismo. La composicion puede ser, p. ej., una composicion lfquida o solida y puede contener uno o mas vehmulos, coadyuvantes y/o excipientes.

Se describe en la presente memoria un metodo para la fabricacion de un medicamento, es decir, una composicion farmaceutica, que comprende las etapas del metodo anteriormente mencionado y la etapa adicional de formular la neurotoxina di-cadena purificada como medicamento. En una descripcion, dicho medicamento comprende una mezcla del segundo polipeptido procesado y no procesado, en el que dicha mezcla contiene menos del 5% del segundo polipeptido sin procesar.

En el presente documento se describe una mezcla que contiene menos del 4%, 3%, 2% o menos del 1% del segundo polipeptido sin procesar.

Se describen diversos usos medicos de los compuestos descritos en la presente memoria:

un polipeptido proteolfticamente activo descrito en este documento para su uso como un medicamento o en una composicion farmaceutica.

una composicion descrita en la presente memoria para su uso como medicamento o en una composicion farmaceutica.

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un anticuerpo descrito en este documento para su uso como un medicamento o en una composicion farmaceutica.

un inhibidor descrito en este documento para su uso como medicamento o en una composicion farmaceutica.

una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido descrito en el presente documento, el anticuerpo descrito en el presente documento, la composicion descrita en la presente memoria o el inhibidor descrito en la presente memoria.

El termino "composicion", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier composicion formulada en forma solida, ftquida, en aerosol (o gaseosa) y similares. Dicha composicion comprende, p. ej., un compuesto terapeuticamente activo descrito en el presente documento opcionalmente junto con compuestos auxiliares adecuados tales como diluyentes o vetnculos o ingredientes adicionales. En una descripcion, el compuesto terapeuticamente activo es el polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria. Un compuesto terapeutico descrito en la presente memoria es el segundo polipeptido procesado proteolfticamente como se ha descrito anteriormente, tal como la neurotoxina di-cadena. Se ensena en la presente invencion un compuesto terapeuticamente activo que es el anticuerpo descrito en la presente memoria. Se ensena en la presente invencion un compuesto terapeuticamente activo que es el inhibidor del polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria.

En este contexto, se distingue entre compuestos auxiliares, es decir, compuestos que no contribuyen a los efectos provocados por el compuesto descrito en la presente invencion durante la aplicacion de la composicion para su finalidad deseada, e ingredientes adicionales, es decir, compuestos que contribuyen a un efecto adicional o modulan el efecto del compuesto descrito en la presente memoria. Los diluyentes y/o vetnculos adecuados dependen del proposito para el cual se va a usar la composicion y de los otros ingredientes. Los expertos en la materia pueden determinar tales diluyentes y/o vetnculos adecuados sin mas dilacion.

El o los vetnculos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulacion y no ser nocivos para el receptor de los mismos. El vetnculo farmaceutico empleado puede incluir un solido, un gel o un ftquido. Ejemplos de vetnculos solidos son lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, acido estearico y similares. Ejemplos de vetnculos ftquidos son solucion salina tamponada con fosfato, jarabe, aceite, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. De manera similar, el vetnculo o diluyente puede incluir un material de retardo de tiempo bien conocido en la tecnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera. Dichos vetnculos adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la tecnica, vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania.

El o los diluyentes se seleccionan de manera que no afecten a la actividad biologica de la combinacion. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, solucion salina fisiologica, soluciones de Ringer, solucion de dextrosa y solucion de Hank, ademas, la composicion o formulacion farmaceutica tambien puede incluir otros vetnculos, coadyuvantes o estabilizantes no toxicos, no terapeuticos, no inmunogenicos y similares.

Una composicion farmaceutica descrita en el presente documento comprende la neurotoxina biologicamente activa obtenida por el metodo, y opcionalmente, uno o mas vetnculos farmaceuticamente aceptables. La neurotoxina activa puede estar presente en forma liquida o liofilizada. Dicho compuesto puede estar presente junto con glicerol, estabilizadores de protemas (por ejemplo, albumina de suero humano (HSA)) o estabilizantes no proteinaceos tales como polivinilpirrolidona o acido hialuronico. La composicion farmaceutica se puede administrar topicamente. La administracion de farmacos de uso convencional se administra por via intramuscular, subcutanea (cerca de las glandulas). Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y el modo de accion de un compuesto, la composicion farmaceutica puede administrarse tambien por otras vfas. El polipeptido de neurotoxina de di-cadena es el ingrediente activo de la composicion y esta en un aspecto administrado en formas de dosificacion convencionales preparadas combinando el farmaco con vetnculos farmaceuticos estandar segun procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden implicar la mezcla, la granulacion y la compresion, o la disolucion de los ingredientes segun sea apropiado para la preparacion deseada. Se apreciara que la forma y el caracter del vetnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable esta dictado por la cantidad de ingrediente activo con la que se va a combinar, la via de administracion y otras variables bien conocidas.

Una dosis terapeuticamente eficaz se refiere a una cantidad del compuesto, la neurotoxina, que se utilizara en una composicion farmaceutica descrita en el presente documento que previene, mejora o trata los smtomas que acompanan a una enfermedad o afeccion referida en esta memoria descriptiva. La eficacia terapeutica y la toxicidad del compuesto se pueden determinar mediante procedimientos farmaceuticos estandar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, ED50 (la dosis terapeuticamente eficaz en el 50% de la poblacion) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la poblacion). La relacion de dosis entre los efectos terapeuticos y toxicos es el mdice terapeutico, y puede expresarse como la relacion, LD50/ ED50.

El regimen de dosificacion sera determinado por el medico de cabecera y otros factores clrnicos. Como es bien conocido en la tecnica medica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamano del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el tiempo y la

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v^a de administracion, la salud general y de otros farmacos que se administren simultaneamente. El progreso se puede monitorear mediante una evaluacion periodica. Las composiciones farmaceuticas y formulaciones a las que se hace referencia en la presente memoria se administran al menos una vez con el fin de tratar o mejorar o prevenir una enfermedad o afeccion descritas en esta memoria descriptiva. Sin embargo, dichas composiciones farmaceuticas pueden administrarse mas de una vez.

En una descripcion, la composicion antes mencionada es un medicamento o una composicion cosmetica. En una descripcion, dicho medicamento, que comprende la neurotoxina biologicamente activa, puede usarse para la prevencion y/o el tratamiento de al menos una de las siguientes enfermedades y trastornos: fuerza muscular voluntaria, distoma focal, incluyendo distoma cervical, craneal y blefaroespasmo esencial benigno, espasmo hemifacial y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis y correccion cosmetica de las arrugas, en otro aspecto tambien blefaroespasmo, distoma oromandibular, tipo de apertura de mandfbula, cierre de mandfbula, bruxismo, smdrome de Meige, distoma lingual, apraxia del parpado, abertura de distoma cervical, antecolis, retrocolis, laterocolis, tortmolis, distoma farmgea, distoma larmgea, disfoma espasmodica/tipo aductor, disfoma espasmodica/tipo abductor, disnea espasmodica, distoma de los miembros, distoma de brazo, distoma espedfica de la tarea, calambre del escritor, calambre del musico, codo de golfista, distoma de la pierna, aduccion del muslo, flexion de la rodilla de abduccion del muslo, extension de la rodilla, flexion del tobillo, extension del tobillo, pie zambo, deformidad, distoma del pie, dedo del pie estriado, flexion del dedo del pie, extension del dedo del pie, distoma axial, smdrome de pisa, distoma del vientre, distoma segmentaria, hemidistonia, distoma generalizada, distoma Parkinsonismo ligado al cromosoma X, distoma en la degeneracion corticobasal, distoma en Parkinsonismo ligado al cromosoma X, distoma tardfa, distoma en la ataxia espinocerebelosa, distoma en la enfermedad de Parkinson, distoma en la enfermedad de Huntington, distoma en la enfermedad de Hallervorden Spatz, disquinesias inducidas por dopa/distoma inducida por dopa, discinesias tardfas/distomas ta^as, discinesias/distonias panodsticas, miocloma palatina inducida por accion cinesigenica no cinesigenica, miocloma mioquimia, rigidez, calambres musculares benignos, temblor hereditario de la barbilla, actividad de los musculos mandibulares, espasmos hemimilasticos, hipertrofia de miocardiopatfa, hipertrofia meseterica, hipertrofia tibial anterior, nistagmo, oscilopsia, paralisis visual supranuclear, , epilepsia, partialis continua, planificacion de la operacion toracica espasmodica, paralisis de la cuerda vocal del abductor, disfuncion mutacional recalcitrante, disfuncion esfinter esofagico superior, granuloma del pliegue vocal, tartamudeo Gilles del smdrome de Tourette, miocloma del ofdo medio, cierre protector de la laringe, postlaringectoirna, fallo del habla, ptosis protectora, disfuncion de Oddi del esfmter entropion, trastornos motores del esofago pseudoacalasicos, no acalasicos, , vaginismo, temblor por inmovilizacion postoperatoria, disfuncion de la vejiga, disinergfa detrusor-esfmter, espasmo de esfmter-vejiga, espasmos hemifaciales, discinesias de reinervacion, patas de gallo de uso de cosmeticos , asimetnas faciales con ceno fruncido, hoyuelos de menton, smdrome de persona ngida, hiperplasia de prostata tetanica, adipositas, tratamiento del estrabismo con paralisis cerebral infantil, paralftico mixto concomitante, despues de cirug^a de desprendimiento de retina, despues de cirugfa de catarata, en estrabismo miosftico de afaquia, estrabismo miopatico, desviacion vertical disociada, como un complemento a la cirugfa de estrabismo, esotropia, exotropfa, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de glandula exocrina, smdrome de Frey, Smdrome de las lagrimas de cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea plantar palmar axilar, hipersalivacion relativa en accidente cerebrovascular, en Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, afecciones espasticas, en encefalitis y procesos autoinmunes de la mielitis, esclerosis multiple, mielitis transversa, smdrome de Devic, infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fungicas, en la paraparesia espastica hereditaria, smdrome postapopectico, infarto hemisferico, infarto del tronco encefalico, infarto mielmico, migrana, traumatismos del sistema nervioso central, lesiones hemisfericas, lesiones del tronco encefalico, lesion mielmica, en hemorragias del sistema nervioso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea, hemorragia intraspinal, en neoplasias, tumores hemisfericos, tumores del tronco encefalico, tumores mielmicos, ronquidos (documento WO 2000/033863). Para detalles y smtomas, vease, por ejemplo, Jost 2007, Drugs 67 (5), 669 o Dressler 2000 en Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, Nueva York.

Se describe en este documento una composicion que es una composicion cosmetica que se puede formular como se describe para una composicion farmaceutica anterior. Para una composicion cosmetica, asimismo, se preve que el compuesto descrito en la presente memoria se pueda usar en forma sustancialmente pura. Las composiciones cosmeticas pueden aplicarse por via intramuscular. Como se describe en este documento, las composiciones cosmeticas que comprenden la neurotoxina pueden formularse como una solucion antiarrugas.

Se describe en este documento una composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o el inhibidor descrito en la presente memoria. Dado que el polipeptido descrito en la presente memoria es responsable de activar neurotoxinas clostridiales, el anticuerpo sera util para reducir el efecto toxico observado durante la infeccion con clostridios. Por lo tanto, el anticuerpo puede usarse para tratar una infeccion por Clostridia, incluyendo Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium baratii, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium acetobutylicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi y Clostridium oedematiens. Ademas, el anticuerpo puede usarse para el tratamiento de smtomas asociados con dicha infeccion. Ademas, dicho anticuerpo puede usarse en el tratamiento de una afeccion o un smtoma asociado con la afeccion, en el que la afeccion se selecciona entre botulismo, tetanos, colitis pseudomembranosa, gangrena, intoxicacion alimentaria y similares.

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Se describe en este documento una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria. Dicha composicion farmaceutica puede utilizarse para la escision proteolftica de polipeptidos implicados en la coaglutinacion, en particular para el tratamiento de pacientes con hipocoaglutinacion. La composicion farmaceutica puede utilizarse como fibrinolftico, en particular para tratar pacientes con infarto de miocardio, embolismo pulmonar, tromboembolismo venoso profundo, es decir, para eliminar coagulos sangurneos. Tambien se preve el uso de la composicion farmaceutica en el tratamiento del ictus. Ademas, la composicion farmaceutica puede usarse en el tratamiento de la insuficiencia pancreatica exocrina para reemplazar cualquiera de tripsina, quimiotripsina, pepsina. Ademas, la composicion farmaceutica puede utilizarse en el tratamiento de pacientes afectados por reacciones inflamatorias, en el tratamiento de pacientes con cancer, en particular para la segmentacion proteolftica de antigenos tumorales expuestos a la superficie. Ademas, la composicion farmaceutica se puede usar en el tratamiento del papiloma.

Se describe en este documento un metodo de seleccion de un inhibidor que comprende la etapa de (a) poner en contacto el polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria con un sustrato conocido y, opcionalmente, con un inhibidor putativo; y (b) determinar el efecto del inhibidor putativo sobre la conversion del sustrato en el producto de escision, en el que una reduccion en la cantidad de producto de escision es indicativa del efecto inhibidor del inhibidor putativo. Se describe en la presente memoria un inhibidor putativo que es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25, en el que al menos un aminoacido basico de dicha secuencia de aminoacidos se reemplaza con un aminoacido no basico.

Se describe en este documento un peptido que comprende una o mas modificaciones qmmicas. Se describe en este documento cualquier inhibidor que sea un peptidomimetico de dicho peptido. Se describe en este documento un inhibidor putativo que es parte de un microarray de compuesto qmmico, es decir, una coleccion de compuestos qmmicos organicos. Se ensena en la presente invencion un inhibidor que es el anticuerpo descrito en la presente memoria. Este metodo es util para identificar compuestos capaces de inhibir el polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria. Una seleccion inicial puede basarse, por ejemplo, en un peptido que comprenda una secuencia de aminoacidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25. Los peptidos capaces de inhibir el polipeptido descrito en la presente memoria pueden ser modificados para aumentar la inhibicion. Las modificaciones incluyen sustituciones de aminoacidos o modificaciones qmmicas. Tfpicamente, este metodo se lleva a cabo poniendo en contacto el polipeptido en este documento descrito con un sustrato conocido en presencia y ausencia de un inhibidor putativo (etapa (a) del metodo) y comparando el efecto del inhibidor putativo con la conversion del sustrato en el producto de escision. Una reduccion de la tasa de conversion en presencia del inhibidor putativo es indicativa de un efecto inhibidor.

En la presente memoria se describe un inhibidor del polipeptido proteolfticamente activo descrito en la presente memoria, en el que dicho inhibidor es (a) un inhibidor que comprende una secuencia de aminoacidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 25, en la que un aminoacido basico contenido en la misma se reemplaza con un aminoacido no basico; o (b) el anticuerpo descrito en el presente documento.

Las figuras muestran:

Figura 1: Prueba de actividad de las fracciones recogidas de HiPrep 16/10 Q FF.

5 |il de fracciones recogidas de HiPrep 16/10 Q FF se analizaron para determinar la actividad enzimatica mediante la incubacion de 2 |jg de scBoNTA (carril 2) durante 1 h a 37°C y posterior SDS-PAGE al 10%. Carril 1: marcador de bajo peso molecular (LMW): 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa.

Figura 2: Analisis de las fracciones recogidas de SEC (HiLoad 16/60 Superdex 75) con respecto al contenido de nBH con un peso molecular de ~37,3 kDa por SDS-PAGE al 12,5%.

Las fracciones 9 a 11 contienen la mayona de nBH. (Carril 1: LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18,4 kDa, 14,4 kDa)

Figura 3: Analisis SDS-PAGE al 12,5% para la determinacion de la pureza y la concentracion de protema de tres lotes de purificacion de nBH.

Carril 1, LMW (116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18,4 kDa, 14,4 kDa); Carril 2, nBH Lote TE311206 (192 ng/jl maduro NT02CB1446/CBO1444, aminoacidos 254 - 594 de Genbank ac. CaL82987,1, PM: 38,6 kDa); Carril 3, nBH Lote TIK301009 (130 ng/jl maduro NT02CB1447/CBO1445, SEQ ID NO: 1, aminoacidos 249-581 de Genbank ac. CAL82988,1, PM: 37,3 kDa); Carril 4, nBH Lote TIK280509 (114 ng/jl maduro NT02CB1447/CBO1445, SEQ ID NO: 1, aminoacidos 249-581 de Genbank ac. CAL82988,1, PM: 37,3 kDa).

Figura 4: Informe del analisis de espectro ESI-MS/MS.

Se identifico la banda de protema de 38,6 kDa del lote TE311206 de nBH como NT02CB1446/CBO1444 con una puntuacion de Mascot de 725 y una cobertura de secuencia de MS/MS de peptido de 29,6% sobre todo el marco de lectura abierto (ORF). No se identifico el peptido (caja gris, peptido de MS identificado, cuadrados rojos, aminoacido identificado y-/b-ion del peptido despues de la desintegracion de MS/MS) derivado de los 253 aminoacidos N-

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terminales. El analisis MS/MS del lote TE311206 mostro una cobertura de secuencia del 52% de acuerdo con los aminoacidos C-terminales 254-594 que forman el nBH.

Figura 5: Informe del analisis del espectro ESI-MS/MS.

Se identifico la banda de la protema de 37,3 kDa del lote nBH TIK301009 como NT02CB1447/CBO1445 con una puntuacion de Mascot de 555 y una cobertura de secuencia de MS/MS de peptido de 28,4% sobre todo el marco de lectura abierto (ORF). Excepto uno todos los peptidos (caja gris, peptido de MS identificado, cuadrados rojos, aminoacido identificado y-/b-ion del peptido despues de la desintegracion de MS/MS) identificados derivan de los 333 aminoacidos C-terminales. El analisis MS/MS del lote TIK301009 mostro una cobertura de secuencia de 49,5% de acuerdo con los aminoacidos C-terminales 249-581 que forman el nBH.

Figura 6: Comparacion de la actividad proteolitica dependiente de la concentracion de nBH derivada de tres lotes de purificacion.

A. Una SDS-PAGE al 12,5% de ensayo de actividad analizando nBH derivado de los lotes TIK301009, TIK280509 y TE311206 utilizando las siguientes diluciones de la concentracion de nBH: 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000. El ensayo se realizo incubando 1 |jg de scBoNT/A y 2 jl de dH2O y 1 jl de nBH correspondiente diluido durante 60 min a 37°C. Para el analisis SDS-PAGE, se anadieron 3 jl de un tampon Laemmli 4x SDS reductor a un volumen final de 10 jl. scBoNT/A de 150 kDa se escindio en la cadena pesada de 100 kDa y la cadena ligera de 50 kDa.

B Se cuantifico la densidad optica de las bandas de protemas de cadena pesada, cadena ligera y scBoNT/A y la suma de bandas de productos de cadena ligera y pesada se dividio por la suma de las bandas de protemas LC, HC y scBoNT/A. Una mayor dilucion del primer polipeptido disminuye la velocidad de escision. La actividad proteolttica espedfica de los tres lotes diferentes es casi identica.

Figura 7: Escision dependiente del tiempo de scBoNT/A de tipo natural y mutantes que contienen un bucle modificado por nBH.

A Modificacion de la secuencia del bucle. En scBoNTAS Throm se eliminan todos los residuos de lisina y se inserta la secuencia de reconocimiento de trombina LVPRGS mientras que en scBoNT Res el bucle carece de cualquier aminoacido basico. Acortar el bucle a ocho pequenos residuos o cinco aminoacidos con cadenas laterales voluminosas produce scBoNTAS (GGSG)2 y scBoNTAS FQWYI, respectivamente. En scBoNTAS CGS-C se suprime todo el bucle y el puente disulfuro que forma cistemas se reemplaza por glicina y serina.

B Analisis SDS-PAGE de la escision dependiente del tiempo de scBoNT/A de tipo natural y mutantes.

C ScBoNTAS de tipo natural es activado por nBH de una manera dependiente del tiempo en la cadena ligera y la cadena pesada dentro de 120 min. La falta de lisinas y la insercion de un solo residuo de arginina prolonga la escision del bucle (scBoNTAS Throm). Un bucle que carece de cualquier residuo basico es todavfa escindible (scBoNTAS Res). Acortar el bucle al peptido 8mer, introducir cinco aminoacidos con cadenas laterales voluminosas o eliminar el bucle completo produce un scBoNT/A inescindible.

Figura 8: Analisis MS/MS de los productos de escision de 50 kDa y 100 kDa tras la digestion de scBoNT/A con nBH.

A Analisis del producto de escision de 50 kDa que se identifico como cadena ligera de BoNT/A con una puntuacion de Mascot de 1460. El peptido mas atribuido a C-terminal cubre los aminoacidos G433 a K438 que corresponde al extremo C-terminal fisiologicamente observado de BoNT/A LC.

B Analisis del producto de escision de 100 kDa que se identifico como cadena pesada de BoNT/A con una puntuacion de Mascot de 96. El peptido N-terminal mas atribuido a N-terminal cubre los aminoacidos A449 a K456 que corresponde al extremo N-terminal fisiologicamente observado de BoNT/A HC.

Figura 9: A El contenido de protema (mg/ml) de anti-nBH-IgY de tres grupos subsiguientes se analizo mediante SDS-PAGE al 12,5%. B ELISA: Las placas de microvaloracion Nunc Maxisorp F96 se recubrieron con nBH de varios lotes (500 ng/ml) en PBS durante la noche a 4°C y luego se bloquearon durante 1 h con tampon de bloqueo de PBS que contema Tween-20 al 0,1% y leche desnatada sin grasa al 2%. Despues del lavado, se anadio una dilucion de IgY de cada grupo (10 jg/ml en tampon de bloqueo) durante 1 h y se detecto usando IgY anti-pollo de burro marcado con biotina, estreptavidina-peroxidasa de rabano picante (ambos Dianova, Hamburgo, Alemania) y 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (Sigma).

Figura 10: A Expresion recombinante y aislamiento de BH 1-581 inactivo (63 kDa) por Talon IMAC. Analisis SDS-PAGE al 10% de fracciones de Talon IMAC (LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, SS34, lisado claro, TD, flujo a traves; W, fraccion de lavado, E1-E7, fracciones eluidas de imidazol 1 a 7). B No se observa endoproteolisis de scBoNT/A en LC (50 kDa) y HC (100 kDa) con iBH recombinante (SEQ ID NO: 2; "E"; 63 kDa) a 37°C despues de 1 h (carril 6) ( LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa).

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Figura 11: Uso de BoNTHydrolase (nBH) activa purificada para obtener polipeptido procesado proteoliticamente

A 200 |ig de scBoNT/A purificado recombinante se incuban con 350 ng de BoNTHydrolase activa purificada durante 12 min a 37°C. Para detener la reaccion, nBH se elimina por SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, tampon: NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de escision es analizada por SDS-PAGE al 10%. B La fraccion 1 (1800 jl) que contiene ~ 40% de BoNT/A procesado se incuba con 350 ng de BoNTHydrolase activa purificada durante 15 min a 37°C y se concentra a 300 jl por ultrafiltracion. Para detener finalmente la reaccion se separa nBH por SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, tampon: NaP 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de escision se analiza mediante SDS-PAGE al 10%. C Las fracciones 1 y 2 (1800 jl) que contienen ~ 80% de BoNT/A procesado se combinan y se incuban con 120 ng de BoNTHidrolasa activa purificada durante 25 min a 37°C y se concentran a 300 jl por ultrafiltracion. Para detener finalmente la reaccion se separa nBH por SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, tampon: NaP 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de escision se analiza mediante SDS-PAGE al 10%. Se obtiene un BoNT/A procesado al 95% (SEQ iD No: 3).

El listado de secuencias muestra:

SEQ ID NO: 1: polipeptido proteolfticamente activo derivado de una cepa de Clostridium botulinum ATCC 3502, n° de acceso GenBank: "CAL82988.1", que carece de 248 residuos de aminoacidos N-terminales

SEQ ID NO: 2: polipeptido proteolfticamente inactivo derivado de una cepa de Clostridium botulinum ATCC 3502, n° de acceso GenBank: "CAL82988.1"

SEC ID N°: 3: BoNT/A de ATCC 3502, Genbank ac. "AAA23262"

SEQ ID NO: 4: Bucle de BoNT/A1 SEQ ID NO: 5: Bucle de BoNT/A2/A6 SEQ ID NO: 6: Bucle de BoNT/A3 SEQ ID NO: 7: Bucle de BoNT/A3 SEQ ID NO: 8: Bucle de BoNT/A4 SEQ ID NO: 9: Bucle de BoNT/A5

SEQ

ID NO: 10: Bucle de BoNT/A7

SEQ

ID NO: 11: Bucle de BoNT/B1/B4bv/B6

SEQ

ID NO: 12: Bucle de BoNT/B2B3

SEQ

ID NO: 13: Bucle de BoNT/B5np

SEQ

ID NO: 14: Bucle de BoNT/C/CD

SEQ

ID NO: 15: Bucle de BoNT/D

SEQ

ID NO: 16: Bucle de BoNT/DC

SEQ

ID NO: 17: Bucle de BoNT/E1 - E5

SEQ

ID NO: 18: Bucle de BoNT/E6

SEQ

ID NO: 19: Bucle de BoNT/F1/F6

SEQ

ID NO: 20: Bucle de BoNT/F2/F3

SEQ

ID NO: 21: Bucle de BoNT/F4

SEQ

ID NO: 22: Bucle de BoNT/F5

SEQ

ID NO: 23: Bucle de BoNT/F7

SEQ

ID NO: 24: Bucle de BoNT/G

SEQ

ID NO: 25: Bucle de TeNT

SEQ ID NO: 26: secuencia de acido nucleico que codifica SEQ ID NO: 1

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SEQ ID NO: 27: secuencia de acido nucleico que codifica SEQ ID NO: 2

Los siguientes Ejemplos ilustran la invencion y, de ningun modo, deben ser interpretados para limitar su alcance. Ejemplos

Ejemplo 1: Purificacion y caracterizacion de la BoNTHydrolase nativa (nBH), que escinde especificamente BoNT/A de cadena sencilla en su forma di-cadena activa

(1) Lectura del sistema/prueba de actividad: Para detectar y purificar espedficamente una actividad enzimatica que hidroliza la neurotoxina A botulmica (BoNT/A) en la cadena ligera de 50 kDa (LC) y la cadena pesada de 100 kDa (HC) en sobrenadantes de cultivo de C. Botulinum y entre los pasos cromatograficos se ha expresado el BoNT/A de 150 kDa como polipeptido de cadena sencilla (sc) en E coli. La incubacion del scBoNT/A recombinante con la actividad enzimatica apropiada (nBH) debena producir una LC de 50 kDa y una HC de 100 kDa visualizada mediante la reduccion en SdS - PAGE al 10 -13%.

(2) Expresion de la proteasa clostridial: Una sola colonia de la cepa de C. Botulinum ATCC 3502 se inoculo en medio de 100 ml de infusion de corazon cerebral (BHI) y el cultivo se incubo durante la noche a 37°C en condiciones anaerobicas. Se inocularon 10 ml de cultivo O/N en 11 medios BHI y se incubaron anaerobicamente durante 48-72 h.

(3) Precipitacion con sulfato de amonio: El sobrenadante del cultivo 11 se recogio mediante centrifugacion (4°C, 6500 x g, 25 min). Se anadio sulfato de amonio a una concentracion final del 85% (en este caso 575 g), la suspension se agito durante 6 horas a 4°C y posteriormente se centrifugo (4°C, 6500 x g, 30 min). El precipitado de sulfato de amonio en forma de granulo se disolvio en un pequeno volumen (en este caso 5 ml) de NaP 50 mM, pH

7.5, y se dializo frente a NaP 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Finalmente, el dializado se centrifugo (4°C, 40000 x g, 60 min) y el sobrenadante se utilizo para la IEC.

(4) Cromatografia de intercambio ionico (IEC, columna HiPrep 16/10 Q FF): El sobrenadante de (3) (Figura 1, carril 3) se aplico a una columna de intercambio anionico HiPrep 16/10 Q FF equilibrada y se hizo funcionar con un tampon que contema NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. El ensayo se realizo a un caudal de 1 ml/min. Se realizo una prueba de actividad incubando 5 jl de cada otra fraccion con 2 |jg de scBoNTA durante 1 h a 37°C y posterior analisis en SDS-PAGE (Figura 1). Las fracciones 6-24 se combinaron y su volumen se concentro hasta 3,5 ml mediante ultrafiltracion (Amicon-Ultra MWCO 10.000).

(5) Cromatografia de exclusion por tamanos (SEC, HiLoad 16/60 Superdex 200): Posteriormente, la solucion de protema concentrada de (4) se cargo en una columna HiLoad 16/60 Superdex 200, equilibrada con NaP 50 mM pH

7.5, NaCl 150 mM. La separacion se realizo a un caudal de 1 ml/min. Las fracciones con un volumen de retencion entre 80 ml y 100 ml se analizaron usando el ensayo de actividad (1) y las fracciones apropiadas que conteman la actividad enzimatica (nBH) se combinaron (~ 10 ml) y se concentraron a 3 ml mediante ultrafiltracion. Posteriormente, se anadio sulfato de amonio a una concentracion final de 12,5% = 500 mM (+ 0,2 g).

(6) Cromatografia de interaccion hidrofobica (HIC, HiTrap Phenyl Sepharose): NBH se unio a la Fenil Sefarosa en tampon A (NaP 50 mM, pH 7,5, sulfato amonico 500 mM). El nBH unido se eluyo reduciendo la cantidad de sulfato de amonio debido a un gradiente lineal creciente con tampon B (NaP 50 mM, pH 7,5) a un caudal de 1 ml/min. Todas las fracciones que conteman protema se analizaron usando el ensayo de actividad (1) y las fracciones apropiadas se combinaron y concentraron por ultrafiltracion a 3,5 ml. El tampon de la solucion se ajusto a NaP 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM.

(7) SEC (HiLoad 16/60 Superdex 75): Finalmente, el nBH se purifico mediante SEC utilizando la columna HiLoad 16/60 Superdex 75 a NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y un caudal de 1 ml/min. Las fracciones con un volumen de retencion entre 70 ml y 80 ml se analizaron mediante SDS-PAGE al 12,5% (Figura 2) y las fracciones 8-12 que contienen la nBH que migra a ~37,3 kDa se combinaron (~ 10 ml) y se concentraron a 1 ml por ultrafiltracion.

(8) La protema prominente que migra a aproximadamente 37,3 kDa (nBH) se analizo por secuenciacion del peptido N-terminal de acuerdo con el protocolo de degradacion de Edman. La secuencia del peptido identificado es V Q G Q S V K G V G y corresponde a los diez primeros residuos de la SEQ ID NO: 1.

(9) Se aislaron reproduciblemente dos lotes de nBH (NT02CB1447, 37,3 kDa, Figura 3, carril 3: TIK301009, carril 4: TIK280509) de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Despues de las modificaciones del procedimiento de aislamiento se obtiene la isoforma nBH NT02CB1446 (38,6 kDa, Figura 3, carril 2, lote TE311206):

(i) crecimiento del cultivo de C. botulinum : 18 h en lugar de 48 a 72 h; (ii) variacion de los pasos cromatograficos: iEc -> SEC Superdex 75 -> HIC Fenil Sepharose en lugar de IEC-> SeC Superdex 200 -> HiC Fenil Sepharose -> SEC Superdex 75.

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Ejemplo 2: Identificacion de secuencia de nBH de C. botulinum por espectrometria de masas (MS)

(1) Digestion triptica: Las bandas de protema que emigraron a aproximadamente 38 kDa (nBH) en SDS-PAGE se cortaron para digestion tripttica y se destineron agitando suavemente en NH4HCO3, acetonitrilo al 50% durante 30 min a 37°C. Se repitio el descoloramiento hasta que los puntos de gel estaban claros. Se anadio acetonitrilo (100%) y se elimino despues de 3 min. Posteriormente, los puntos se secaron en un sistema de velocidad vac (Eppendorf, Alemania). Se anadio tripsina (10 ng/pl) en NH4HCO3 y se incubo sobre hielo durante 1 h. A continuacion, se retiro la solucion de tripsina restante, se anadio un pequeno volumen de NH4HCO3 y se llevo a cabo la digestion a 37°C durante la noche. Se recogio el sobrenadante y se extrajeron las piezas de gel utilizando TFA al 5%, acetonitrilo al 10% durante dos veces. Todos los fluidos se combinaron, se secaron en una vac de velocidad y los peptidos extrafdos se almacenaron a 4°C.

(2) Desorcion/ionizacion mediante laser asistida por matriz acoplada a un analizador TOF (tiempo de vuelo) (MALDI- TOF/TOF) MS: Las muestras se analizaron en un espectrometro de masas MALDI-TOF/TOF (Ultraflexl Bruker Daltonik GmbH) en modo lineal con una tension de aceleracion de 25 kV. Se detectaron masas desde 700 m/z hasta 4.500 m/z. Las muestras (2 pl) se cocristalizaron con 2 pl de solucion de acido sinnapmico que contema acetonitrilo al 50% y acido acetico trifluorico (TFA) al 0,2% directamente sobre una placa diana MALDI de acero inoxidable. 500 tomas laser se recogieron para cada muestra.

(3) Separacion de peptidos por cromatografia de fase inversa: La separacion de peptidos se realizo mediante cromatograffa de fase inversa utilizando un sistema de nano-HPLC (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) que consistfa en un muestreador automatico y una bomba de gradiente. La muestra se disolvio en tampon A (acetonitrilo al 5%, acido formico al 0,1%) y se inyecto una almuota de hasta 10 pl en una columna C18 (Zorbax SB- C18, 5 pm, 300 A, 0,5 mm de diametro interno, longitud 15 cm) a un caudal de 5 pl/min. Despues de la carga, la columna se lavo durante 15 minutos con tampon A y los peptidos se eluyeron usando un gradiente de eluyente A y eluyente B (acetonitrilo al 70% (v/v) en acido formico al 0,1% (v/v) de 0% a 100% de eluyente B en 75 min.

(4) Espectrometria de masas de ionizacion por electrospray (ESI) y trampa de iones: La salida de HPLC se conecto directamente a la fuente nanoESI de un espectrometro de masas de trampa de iones y se utilizo el pulverizador de vaina coaxial-lfquido Agilent (Agilent Technologies). El capilar de salida estaba sujeto por una aguja de acero circundante y de 0,1 a 0,2 mm fuera de ella. La pulverizacion se estabilizo mediante N2 como gas nebulizador (5 l/min). El voltaje de ionizacion se ajusto a 4.500 V y se aplico gas seco a 5 psi y 250°C. Los espectros se recogieron con un espectrometro de masas de trampa de iones Esquire3000 + (Bruker Daltonik) a una velocidad de exploracion de 13.000 m/z por segundo. Usando ESI en modo positivo, se adquirieron espectros de masas de 50 a 1600 m/z en modo de escaneado y conmutacion dependiente de datos entre el analisis de MS y MS/MS. Para aumentar la calidad de los espectros MS/MS, solo se seleccionaron dos iones precursores de un espectro para el analisis MS/MS y la exclusion activa se fijo en 2 min para excluir los iones precursores que ya se habfan medido.

(4) Procesamiento de datos: El procesamiento de datos se realizo con los paquetes de software Data Analysis (version 3.0) y BioTools (version 3.0) (Bruker Daltonik). La identificacion de las protemas se realizo utilizando el software MASCOT (version 2.1) y la base de datos MSDB (Matrix Science, Londres, Reino Unido).

(5) Resultados:

Tabla 2: nBH identificado por MS

carril

Lote nBH Protema concentr. Nombre de la ORF Genbank acc. aa de ORF PM [kDa] Mascot resultado

2

TE311206 192 ng/pl NT02CB1446 CBO1444 CAL82987.1 254-594 38,6 725

3

TIK301009 130 ng/pl NT02CB1447 CBO1445 CAL82988.1 249-581 37,3 555

4

TIK280509 114 ng/pl NT02CB1447 CBO1445 CAL82988.1 249-581 37,3 609

La banda de protema de 38,6 kDa del carril 2 (lote nBH TE311206) se identifico como NT02CB1446/CBO1444 con una puntuacion de Mascot de 725 y una cobertura de secuencia de MS/MS de peptido de 29,6% sobre todo el marco de lectura abierto (ORF). No se identifico ningun peptido derivado de los 253 aminoacidos N-terminales (Figura 4). El analisis MS/MS del lote TE311206 mostro una cobertura de secuencia del 52% de acuerdo con los aminoacidos C-terminales 254-594 que formaban el nBH.

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55

Las bandas de protema de 37,3 kDa de la banda 3 (lote nBH TIK301009) y el carril 4 (lote nBH TIK280509) se identificaron como NT02CB1447/CBO1445 con una puntuacion de Mascot de 555 y 609, respectivamente. Excepto uno, todos los peptidos identificados derivan de los aminoacidos C-terminales 333 (Figura 5). El analisis MS/MS del lote TIK301009 mostro una cobertura de secuencia de 49,5% de acuerdo con los aminoacidos C-terminales 249-581 que formaban el nBH.

Ejemplo 3: Caracterizacion de la especificidad enzimatica de nBH

(1) Se comparo la actividad proteolttica dependiente de la concentracion de nBH derivada de tres lotes de purificacion (Figura 6). Un ensayo de actividad que analiza nBH derivado de los lotes TIK301009, TIK280509 y TE311206 usando diversas diluciones de nBH demuestra que las diluciones mas altas disminuyen la velocidad de escision. La actividad proteolftica de los tres lotes diferentes es casi identica, indicando que la isoforma madurada NT02CB1446 (TE311206) muestra una actividad espedfica similar a la NT02CB1447 madurada (SEQ ID NO: 1).

(2) La escision dependiente del tiempo de scBoNT/A de tipo natural y los mutantes por nBH se analizaron empleando la prueba de actividad (Figura 7]. ScBoNTAS de tipo natural es activado por nBH de una manera dependiente del tiempo en la cadena ligera y la cadena pesada dentro de 120 minutos en mas del 95%. La secuencia de bucle se modifico para caracterizar el sitio de escision. En scBoNTAS Throm se eliminan todos los residuos de lisina y se inserta la secuencia de reconocimiento de trombina LVPRGS que prolonga la velocidad de escision. En scBoNT Res, el bucle carece de cualquier aminoacido basico que retrase drasticamente la hidrolisis completa, indicando una fuerte preferencia de reconocimiento de nBH por residuos basicos como lisina y arginina en el sitio de escision. Ademas, la accesibilidad de nBH al bucle se ve afectada por el acortamiento del bucle en ocho residuos pequenos o cinco aminoacidos con cadenas laterales voluminosas (scBoNTAS (GGSG)2 y scBoNTAS FQWYI).

(3) El analisis de MS/MS del producto de escision de 50 kDa tras la digestion de scBoNT/A con nBH mostro que el peptido mas C-terminal adscrito cubre los aminoacidos G433 a K438, lo que corresponde al termino C fisiologicamente observado de BoNT/A LC (Figura 8A). El analisis del producto de escision de 100 kDa que se identifico como cadena pesada de BoNT/A demostro que el peptido mas atribuido en el extremo N-terminal cubre los aminoacidos A449 a K456, lo que corresponde al termino N fisiologicamente observado de BoNT/A HC (Figura 8B). De este modo, el nBH aislado produce el BoNT/A fisiologicamente procesado y preferiblemente hidroliza los enlaces peptfdicos C-terminales a los residuos de lisina y arginina.

Ejemplo 4: Conservacion evolutiva de BoNTHydrolase y sus isoformas

El analisis de la secuencia de protemas de SEQ ID NO: 2 (Genbank ac. CAL82988.1/YP_001253958.1) revelo tres dominios conservados. Los residuos 18-573 corresponden a una metaloproteasa de zinc (elastasa) o LasB implicada en el transporte de aminoacidos y el metabolismo con una puntuacion de Blast de 738. Los residuos 148 - 212 corresponden a un propeptido de peptidasa y el dominio YPEB o PepSY (Puntuacion Blast 97. Los residuos 336-573 son parte de la familia de la peptidasa m4 incluyendo termolisina, protealisina, aureolisina y proteasas neutras (puntuacion de Blast 803).

La secuenciacion del genoma de C. botulinum ATCC 3502 ha revelado la existencia de seis ORFs que codifican isoformas de iBH (Sebaihia et al., 2007, Genome Res. 17(7): 1082 - 1092). Otros datos del genoma estan disponibles para 10 cepas de C. Botulinum del grupo I, asf como la C. sporogenes que secreta de no-BoNT que contienen todas entre cinco a siete ORFs que codifican iBH. La nBH (SEQ ID NO: 1) comparte una identidad de secuencia de aminoacidos del 64% como mmimo con las otras 63 isoformas.

Ejemplo 5: Generacion de anticuerpos especificos para la BoNTHydrolase

(1) Generacion de IgY: Pollos de dieciseis semanas (ISA Brown y Lohmann Selected Leghorn (LSL), Spreenhagener Vermehrungsbetrieb fur Legehennen GmbH, Bestensee, Alemania] fueron mantenidos en jaulas individuales, construidas exclusivamente para el mantenimiento de pollos (Ebeco, Castrop-Rauxel, Alemania). Alimentos (ssniff Legehuhner-Zucht 1 y 2, ssniff Spezialitaten GmbH, Soest, Alemania) y agua estaban disponibles ad libitum, y los pollos comenzaron a poner huevos entre las 23 y 25 semanas de edad. Los huevos se recogieron diariamente, se etiquetaron y se almacenaron a 4°C hasta que se procesaron despues. Todo el mantenimiento de los animales y los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices de las autoridades locales, Berlin (num. H0069/03). Los pollos se inmunizaron y se reforzaron a traves de la via i.m. (musculo pectoral, lado izquierdo y derecho) un total de 10 veces en un penodo de 1 ano, con intervalos entre 4 y 8 semanas. El intervalo utilizado se baso en trabajos anteriores que no mostraron celulas de memoria demostrables hasta al menos 3 semanas despues de la inmunizacion (Pei y Collisson, 2005). La concentracion de antfgeno utilizada fue de aproximadamente 20 |jg por inyeccion (nBH). No se inyectaron mas de 500 jl de solucion de antfgeno por inmunizacion. Se utilizo adyuvante completo de Freund para la primera inmunizacion y se utilizo FIA para las inyecciones de refuerzo posteriores. El metodo para la purificacion de IgY se adapto de Polson et al. (1980). Brevemente, la yema de huevo se diluyo 1:2 con PBS esteril (pH 7,4, Roche, Mannheim, Alemania). Para la eliminacion de lfpidos y lipoprotemas, se anadio polietilenglicol 3,5% (p/v) (PEG) 6000 (Roth, Karlsruhe, Alemania). Despues de agitacion suave seguido de centrifugacion (10.000 xg durante 20 min a 4°C), el sobrenadante se decanto y se anadio PEG 6000 solido a una

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concentracion final de 12% (p/v). Esta mezcla se centrifugo entonces como anteriormente. El precipitado se disolvio en 10 ml de PBS, se anadio PEG al 12% (p/v) y se centrifugo la solucion. Finalmente, el precipitado se disolvio en 1,2 ml de PBS, se transfirio a un dispositivo de microdialisis (QuixSep, Roth, Alemania) y se dializo contra PBS a 4°C. El contenido de protema (mg/ml) se analizo mediante SDS-PAGE al 12,5% (Figura 9A) y se midio fotometricamente a 280 nm y se calculo segun la ley Lambert-Beer con un coeficiente de extincion de 1,33 para IgY.

(2) ELISA: Se recubrieron placas de microvaloracion Nunc Maxisorp F96 (VWR International GmbH, Darmstadt, Alemania) con nBH de varios lotes (500 ng/ml) en PBS durante la noche a 4°C y despues se bloquearon durante 1 h con tampon de bloqueo de PBS que contema Tween- 20 y 2% de leche desnatada sin grasa (Merck, Darmstadt, Alemania). Despues del lavado, se anadio una dilucion de IgY (10 pg/ml en tampon de bloqueo) durante 1 h y se detecto usando IgY antipollo de burro marcado con biotina, estreptavidina - peroxidasa de rabano picante (ambos de Dianova, Hamburgo, Alemania) y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Sigma). El nBH detectado se ilustra en la figura 9B.

(3) Western blot: NBH se separo por SDS-PAGE al 12,5%, y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) usando tecnicas de inmunotransferencia estandar. La membrana se bloqueo durante la noche a 4°C, y se incubo con IgY (1:5.000 en tampon de bloqueo) durante 1 h. Despues del lavado, la membrana se probo con IgY anti-pollo de burro marcado con biotina durante 30 minutos y se desarrollo usando fosfatasa alcalina y CDP-Star (Perkin Elmer, Waltham, MA).

Ejemplo 6: Expresion recombinante de BoNTHydrolase

(1) Construcciones de plasmidos: Las porciones genicas que codifican BH nativo (SEQ ID NO: 1) y su propeptido (SEQ ID NO: 2) se amplificaron mediante PCR usando oligonucleotidos adecuados y ADN genomico de C. botulinum ATCC 3502, fusionado a un oligonucleotido que codifica His6Tag e insertado en pQE3 (Qiagen) produciendo el plasmido de expresion pQ-BH1445H6-249-581 y pQ-BH1445H6-1-581, respectivamente. Las secuencias de nucleotidos se verificaron por secuenciacion de ADN.

(2) Purificacion de protemas recombinantes: NBH e iBH, fusionados a un His6Tag carboxilo-terminal, se produjeron utilizando la cCepa de E coli M15pREP4 (Qiagen) durante diez horas de incubacion a temperatura ambiente, y se purificaron sobre perlas de Talon-Sepharose (Clontech Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las fracciones que conteman las proteinas deseadas se reunieron, se congelaron en nitrogeno lfquido y se mantuvieron a -70°C. IBH se aislo como protema recombinante con un PM de 63 kDa (Figura 10A). La inactividad de iBH se demostro usando la prueba de actividad: despues de 1 h a 37°C no se hidrolizo scBoNT/A wt en LC y HC (Figura 10b).

Ejemplo 7: Inhibicion de BoNTHydrolase

(1) Seleccion de inhibidores peptfdicos de BH: Los peptidos basados en SEQ ID NO: 4 a 25 se sintetizaran carentes de uno o mas residuos basicos. Cada peptido se anadira a la mezcla de acuerdo con el ensayo de actividad. Un peptido capaz de disminuir la cantidad de scBoNT/A procesado, prolongar la duracion requerida para el procesamiento completo de scBoNT/A o el procesamiento de bloques scBoNT/A se considera un inhibidor de nBH.

(2) Seleccion de inhibidores basados en anticuerpos: Los anticuerpos generados contra epttopos derivados de nBH como IgY del Ejemplo 5 se incuban con nBH y posteriormente se someten al ensayo de actividad. Un anticuerpo capaz de disminuir la cantidad de scBoNT/A procesado, prolongar la duracion requerida para el procesamiento completo de scBoNT/A o el procesamiento de bloques scBoNT/A se considera un inhibidor de nBH.

Ejemplo 8: Uso de BoNTHydrolase (nBH) activa purificada para obtener el polipeptido procesado proteolfticamente

(1) 200 pg de scBoNT/A purificado recombinante se incuban con 350 ng de BoNTHydrolase activa purificada durante 12 min a 37°C. Para detener la reaccion, nBH se elimina por SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, tampon: NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de escision es analizada por SDS-PAGE al 10% (Figura 11A).

(2) La fraccion 1 (1800 pl) que contiene ~ 40% de BoNT/A procesado se incuba con 350 ng de BoNTHydrolase activa purificada durante 15 min a 37°C y se concentra a 300 pl por ultrafiltracion. Para finalmente detener la reaccion, se separa nBH por SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, tampon: NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de escision se analiza mediante SDS-PAGE al 10% (Figura 11B).

(2) Las fracciones 1 y 2 (1800 pl) que contienen ~ 80% de BoNT/A procesado se combinan y se incuban con 120 ng de BoNTHidrolasa activa purificada durante 25 min a 37°C y se concentran a 300 pl por ultrafiltracion. Para detener finalmente la reaccion se separa nBH por SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, tampon: NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de escision se analiza mediante SDS-PAGE al 10% (Figura 11C). Se obtiene un BoNT/A procesado a >95% (SEQ ID NO: 3). Se obtiene el segundo polipeptido identico totalmente procesado (> 95% de BoNT/A procesado) si el segundo polipeptido se procesa en

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25

una etapa durante 50 min a 37°C (200 pg de scBoNT/A incubado con 350 ng de nBH). Despues de un tiempo de incubacion de 1 hora a 37°C, se procesa mas del 97% de BoNT/A.

Listado de secuencias

<110> Syntaxin Limited

<120> Metodos para la fabrication de polipeptidos procesados proteolUicamente

<130> P40008EP - D1

<140> Aun no asignado <141> 2011-05-11

<150> EP11004152.2 <151> 2011-05-11

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 333 <212> PRT

<213> Clostridium Botulinum <400> 1

Val Gin Gly Gin Ser Val Lys Gly Val Gly Lys Thr Ser Leu Asp Gly 15 10 15

Leu Val Asn lie Asp Val Thr Tyr Gly Asn Gly Lys Tyr Tyr Leu Lys 20 25 30

Asp Ser Asn Lys Asn lie Tyr Leu Tyr Asp Leu Lys Asn Gin val Asp 35 40 45

Glu Tyr Asp Leu Tyr Asn Tyr Leu Ser Arg Pro Asn Tyr Lys Gin lie 50 55 60

Leu Met Ser Lys Ser Glu Leu lie Ser Asn Tyr Asn Asn Asn Phe lie 65 70 75 80

Ala Asn Asn Gin Val Asn Ser Val Asp Ala Tyr Val Asn Thr Asn Lys 85 90 95

Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Lys Leu Asn Arg Asn Ser lie Asp Asn 100 105 110

Lys Gly Met Asn lie Asn Gly Phe val His val Gly Arg Asn Tyr Gly 115 120 125

Asn Ala Phe Trp Tyr Gly Pro Tyr Asp Gly Met Phe Phe Gly Asp Gly 130 135 140

Asp Gly lie Tyr Phe Ser ser Leu Ala Lys Ser Leu Asp val val Gly 145 150 155 160

His Glu Leu Ser His Gly val Thr Asn Lys Glu Ser Asn Leu Lys Tyr 165 170 175

Glu

Asn Glu Ser Gly Al a Leu Asn Glu Ser Phe Ser Q. < lie Met Gly

180 185 190

Val

Al a Val Glu Gly Lys Asn Phe Val Leu Gly Glu Asp cys T rp

Val

195 200 205

Al a

Gly Gly Val Met Arg Asp Met Glu Asn Pro Ser Arg Gly Gly Gin

210 215 220

Pro

Al a Hi s Met Lys Asp Tyr Lys Tyr Lys Thr Met Asn Asp Q. 10 < Asn

225

230 235 240

Gly

Gly

Val Hi s Thr Asn Ser Gly lie lie Asn Hi s Al a Al a Tyr Leu

245

250

Val Ala

Met Gly

Thr Asn 290

Asp

Gly lie Glu Lys Thr Gly Al a Lys Asn Ser Lys

260 265 270

Lys

lie Phe Tyr Thr Al a Asn Cys Tyr Lys T rp Asp

275

280 285

Phe

Al a Lys Cys Arg Asn Asp Val Val Gin Val Thr

295

300

255

Asp lie Glu Thr Lys Glu

Leu

Tyr Gly Glu Asn Ser Asn Tyr Val Lys lie

305

310 315

Q. 10 <

Gin Val Gly lie Thr Al a Thr Pro Gin Leu

325 330

Val Glu Lys Ala Phe 320

Pro Leu

<210> 2 <211> 581 <212> PRT

<213> Clostridium Botulinum <400>2

Met Lys Ser Lys Lys Leu 1 5

Phe Ser Thr Val Ser Ala 20

Lys Val Glu Pro Lys Thr 35

Asn Thr Lys Lys Ala Ala 50

Ser Glu Glu lie Thr Lys 65 70

10 Val Gin Lys Gly Ser Leu

Leu

Al a Thr Val Leu Ser Al a Val

10

Val

Tyr Al a Al a Pro Val Gly Lys

25 30

Thr

Thr

lie Thr T rp Glu Lys Asn

40 45

Thr

Asp lie Thr Glu Lys Lys Phe

55

60

Phe

Phe

Glu Lys Asn lie Ser Lys

75

Lys

Asn Thr Lys Thr Val Lys Asp

lie Thr 15

Glu Ser

Glu Gin

Asn Asn

Phe Gly 80

Glu Lys

5

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. El uso de Lys-C para el procesamiento proteolftico de una neurotoxina botulmica de cadena sencilla serotipo A (BoNT/A) por hidrolisis para producir neurotoxina botulmica di-cadena serotipo A (BoNT/A).
2. 2. El uso segun la reivindicacion 1, en el que el neurotoxina botulmica de cadena unica serotipo A (BoNT/A) es una neurotoxina natural, una neurotoxina recombinante o neurotoxina modificada, tal como una neurotoxina que carece del dominio Hc natural o partes de las mismas o derivados con otros residuos de aminoacidos que sustituyen al dominio Hc de la neurotoxina.
3. 3. El uso segun la reivindicacion 2, en el que la neurotoxina botulmica de cadena unica serotipo A (BoNT/A) comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad de secuencia del 50% con una secuencia polipeptfdica seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 25;

   preferiblemente en el que la Lys-C hidroliza el serotipo A de la neurotoxina botulmica de cadena sencilla (BoNT/A) en una posicion inmediatamente C-terminal a un resto de aminoacido basico dentro de dicha secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 25.
4. 4. El metodo para la fabricacion de un polipeptido procesado proteolfticamente, que comprende la etapa de poner en contacto:

   (a) un primer polipeptido, siendo dicho primer polipeptido Lys - C; con

   (b) un segundo polipeptido, siendo dicho segundo polipeptido susceptible a la proteolisis por dicho primer polipeptido;

   en donde dicho contacto da como resultado un procesamiento proteolftico de dicho segundo polipeptido en al menos dos productos de escision;

   en el que el segundo polipeptido es un serotipo A de la neurotoxina botulmica de una sola cadena (BoNT/A) y en el que dicho primer polipeptido hidroliza el neurotoxina botulmica de cadena sencilla serotipo A (BoNT/A) para producir un neurotoxina botulmica serotipo A di-cadena (BoNT/A).
5. 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicha neurotoxina botulmica de cadena unica serotipo A (BoNT/A) es una neurotoxina de origen natural, una neurotoxina recombinante o neurotoxina modificada, tal como una neurotoxina que carece del dominio Hc natural o partes del mismo o derivados con otros residuos de aminoacidos que sustituyen al dominio Hc de la neurotoxina .
6. 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el segundo polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con una secuencia polipeptfdica seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 25;

   preferiblemente en el que el primer polipeptido escinde proteolfticamente el segundo polipeptido en una posicion inmediatamente C-terminal a un resto de aminoacido basico dentro de dicha secuencia de cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 25.
7. 7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 - 6, en el que el extremo C de la cadena L y el extremo N de la cadena H de la neurotoxina botulmica di-cadena serotipo A ( BoNT/A) son identicas a la correspondiente neurotoxina botulmica di-cadena serotipo A (BoNT/A) aislada de clostridios naturales.
8. 8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, 7 o el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 4 - 7, en el que la neurotoxina botulmica di-cadena serotipo A (BoNT/A) tiene una secuencia de aminoacidos identica cuando se compara con el correspondiente polipeptido de la neurotoxina botulmica di-cadena serotipo A (BoNT/A) generado a partir del mismo polipeptido de serotonina A de neurotoxina botulmica de cadena unica (BoNT/A) en clostridios naturales.
9. 9. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 - 8, en el que dicho contacto tiene lugar dentro de una celula, en un lisado celular o en un lisado celular purificado.

   4^

   NJ

   Figura 1

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   M

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   111

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   iscBoNTA

   SN de C. bot (precipitado + dializado

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   T3

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   15

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   4

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   Figura 2

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   Figura 3

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   Figura 4

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    Figura 5

    Activacion

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    Figura 6A

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    Figura 8B

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    preinm.

    H110 grupo 1 H110 grupo 2 H110 grupo 3

    Figura 9

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    Figura 10A

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    LMW O’ . 37- ff 37° jT> ^

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    Figura 10B

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