ES2708661T3 - Métodos para la fabricación de polipéptidos proteolíticamente procesados - Google Patents

Abstract

Un polipéptido proteolíticamente activo que consiste en una secuencia polipeptídica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, en el que dicho polipéptido proteolíticamente activo es capaz de hidrolizar la neurotoxina botulínica o del tétanos para producir una neurotoxina botulínica bicatenaria o una toxina del tétanos bicatenaria.

Description

DESCRIPCION

Metodos para la fabricacion de polipeptidos proteolfticamente procesados

La presente descripcion se refiere a un nuevo polipeptido proteolfticamente activo y a diversos usos del polipeptido para busquedas, y a metodos de fabricacion.

Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, concretamente las neurotoxinas botulmicas (BoNT) y la neurotoxina del tetanos (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas clostridiales (CNT) se unen espedficamente a celulas neuronales y alteran la liberacion de neurotransmisores. Clostridium botulinum segrega siete serotipos antigenicamente diferenciados denominados A a G de la neurotoxina botuftnica (BoNT). Todos los serotipos junto con la neurotoxina del tetanos (TeNT) relacionada segregados por Clostridium tetani, son Zn2+-endoproteasas que bloquean la exocitosis sinaptica rompiendo las protemas implicadas en la formacion del complejo SNARE que controla la fusion de membranas celulares Las c Nt provocan la paralisis muscular flacida observada en el botulismo y el tetanos. Ademas se ha demostrado que la actividad de las CNT afecta a la secrecion glandular. Estos efectos fisiologicos de las CNT sobre la actividad muscular y glandular cada vez se emplean mas en diversas aplicaciones terapeuticas y cosmeticas. La toxina botulmica de serotipo A (BoNT/A) fue aprobada para un uso humano en EE. UU. en 1989 para el tratamiento del estrabismo, el blefaroespasmo, y otros trastornos. Esta disponible en el mercado como una preparacion de protemas de la toxina botulmica A, por ejemplo, bajo el nombre comercial BOTOX (Allergan, Inc.) y bajo el nombre comercial DYSPORT (Ipsen Ltd). Para la aplicacion terapeutica, un complejo que comprende la neurotoxina y otras protemas bacterianas se inyecta directamente en el musculo que se va a tratar. A pH fisiologico, la toxina se libera del complejo de protemas (Eisele et al., 2011, Toxicon, 57(4):555-565) y se produce el efecto farmacologico deseado. Esta disponible una preparacion de BoNT/A mejorada que esta exenta de protemas complejantes con el nombre comercial XEOMIN o Bocouture (Merz Pharmaceuticals GmbH, Francfort/Alemania). El efecto de BoNT solo es temporal, lo cual constituye la razon de que normalmente sea necesaria una administracion repetida de BoNT para mantener un efecto terapeutico.

Cada CNT se sintetiza inicialmente como un polipeptido monocatenario inactivo. En el caso de la BoNT, el polipeptido de neurotoxina tiene un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. El procesamiento postraduccional de este polipeptido monocatenario implica una proteolisis limitada en una region expuesta denominada bucle (vease la tabla 1) y la formacion de un puente disulfuro cercano. La neurotoxina bicatenaria activa consiste en dos productos de la ruptura que surgen de la hidrolisis proteolftica del polipeptido precursor monocatenario: una cadena ligera N-terminal de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada de aproximadamente 100 kDa unidas por un enlace disulfuro. Las CNT consisten, desde el punto de vista estructural, en tres dominios, concretamente la cadena ligera catalftica, la cadena pesada que incluye el dominio de translocacion (mitad N-terminal) y el dominio de union al receptor (mitad C-terminal) (cf. Krieglstein, 1990, Eur. J. Biochem., 188:39; Krieglstein, 1991, Eur. J. Biochem., 202:41; Krieglstein, 1994, J. Protein Chem., 13:49; Lacy et al., 1998, Nat. Struct. Biol., 5(10):898-902). Dependiendo del numero de sitios de ruptura presentes en la cadena sencilla entre los restos aminoacidos que forman el dominio catalftico y los restos aminoacidos que forman el dominio de translocacion, la actividad endopeptidasa puede producir dos productos de la ruptura grandes, concretamente la cadena ligera y pesada y, ademas, unos peptidos cortos caractensticos que representan la anterior region de bucle, que en la cadena sencilla de la neurotoxina actuan como puente para lo que seran la cadena ligera y pesada (cf. tabla 1, a continuacion).

La purificacion de las CNT a partir de la disolucion de fermentacion es un reto importante, puesto que las neurotoxinas se encuentran como una mezcla de polipeptidos no procesados, parcialmente procesados y totalmente procesados que tienen propiedades bioqmmicas y ffsicas muy similares. Se generan neurotoxinas parcialmente procesadas generalmente si la actividad endoproteolftica ha hidrolizado el enlace peptfdico entre la cadena ligera y el bucle, mientras que el enlace peptfdico entre el bucle y la region N-terminal de la cadena pesada permanece intacto. Ademas, tambien pueden crearse neurotoxinas parcialmente procesadas si la actividad endoproteolftica ha liberado el peptido del bucle de la cadena pesada, mientras que el enlace peptfdico entre el peptido del bucle y la region C-terminal de la cadena ligera aun no ha sido hidrolizado. Dependiendo de las condiciones de fermentacion y del tipo de neurotoxina, el polipeptido totalmente procesado que no contiene el peptido del bucle puede verse significativamente contaminado con entre 5% al 90% de polipeptido parcialmente procesado o no procesado. No obstante, en algunos casos, la neurotoxina esta principalmente sin procesar y, antes del uso terapeutico, debe tratarse con una endopeptidasa para convertirse en biologicamente activa.

La tecnica anterior describe diversos intentos para tratar neurotoxinas clostridiales con proteasas heterologas para reducir la cantidad de protema precursora no procesada o parcialmente procesada. La proteasa que mas se emplea para la activacion de las neurotoxinas clostridiales, la tripsina, aunque es util para activar las neurotoxinas clostridiales de los serotipos B (BoNT/B) y E (BoNT/E) (DasGupta y Sugiyama, 1972, Biochem. Biophys. Res. Commun., 48:108-112; Kozaki et al., 1974, Infect. Immun., 10:750-756), parece producir productos secundarios, probablemente por medio de una accion proteolftica cerca de la region C-terminal de la subunidad pesada de BoNT/A y, por tanto, parece destruir la union de la toxina a su receptor celular (Shone et al., 1985, Eur. J. Bioch., 151:75-82). En teona, se esperanan unos productos de la ruptura mas espedficos con proteasas endogenas aisladas del hospedante nativo, tal como C. botulinum que produce BoNT/A. Por consiguiente, se ha intentado aislar, a partir de la celula hospedante nativa, la proteasa endogena implicada en la activacion proteolftica de las neurotoxinas clostridiales. Dekleva y DasGupta (Dekleva y DasGupta, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun., 162:767-772) purificaron, a partir de cultivos de C. botulinum que producen BoNT/A, una fraccion capaz de romper proteolfticamente la BoNT/A en una subunidad pesada y una subunidad ligera. Estudios posteriores realizados por los mismos autores han caracterizado mas a fondo la proteasa endogena aislada a partir de C. botulinum (Dekleva y DasGupta, 1990, J. Bact., 172:2498-2503) y han revelado una protema de 62 kDa, compuesta de un polipeptido de 15,5 kDa y un polipeptido de 48 kDa. Sin embargo, la observacion de una fragmentacion considerable de las CNT despues de una exposicion limitada a la protema de 62 kDa de Dekleva y DasGupta sugiere que la proteasa aislada puede no ser la enzima proteolftica no identificada responsable de la activacion de las CNT en cultivos celulares clostridiales y durante la infeccion. De hecho, otros autores han sugerido recientemente que la clostripama, tambien denominada clostridiopeptidasa B (Mitchel y Harrington, 1968, JBC, 243:4683-4692), puede estar implicada en la activacion espedfica de las CNT (Sebaihia et al., 2007, Genome Res., 17(7):1082-1092; documento WO2009/014854). De modo interesante, la estructura y la especificidad de sustrato de esta enzima se parecen a las de la alfa-clostripama segregada de Clostridium histolyticum (Dargatz et al., 1993), un homologo (74% de identidad de aminoacidos) que esta presente en C. botulinum (CBO1920). La alfa-clostripama de C. histolyticum es una cistema endopeptidasa con especificidad estricta por el enlace arginilo. Se sintetiza como una prepro-enzima inactiva que sufre una ruptura autocatalftica para generar polipeptidos de 15,4 y 43 kDa que se asocian para formar una enzima heterodimerica activa (Dargatz et al., 1993). Tanto la alfa-clostripama de C. histolyticum como la proteasa de 62 kDa de C. botulinum necesitan un agente reductor y calcio para lograr la actividad completa, y son susceptibles a los mismos inhibidores de proteasas. Estos datos sugieren con gran fuerza que el ortologo de alfaclostripama de C. botulinum (CBO1920) es la proteasa endogena responsable de la melladura proteolftica de la neurotoxina de C. botulinum. Tambien esta presente un gen que codifica la clostripama (CPE0846) en C. perfringens, y se ha descubierto que es regulado positivamente por el sistema de dos componentes VirR/VirS (Shimizu et al., 2002b).

Sin embargo, hasta la fecha, no han aparecido mas pruebas experimentales concluyentes, y en la tecnica aun no esta disponible una proteasa capaz de convertir, de modo eficaz, el precursor monocatenario de las CNT en los productos de la ruptura maduros autenticos, es decir, la neurotoxina bicatenaria.

Senan muy deseables medios y metodos para reducir la cantidad de polipeptidos de neurotoxina no procesados y/o parcialmente procesados y, con ello, mejorar la calidad de las preparaciones de neurotoxinas, pero todavfa no estan disponibles. Asf, un problema tecnico que subyace a la presente descripcion puede considerarse como el suministro de medios y metodos para mejorar la fabricacion de polipeptidos de neurotoxina mediante la satisfaccion de las necesidades anteriormente mencionadas. El documento WO 2009/014854 describe metodos para activar toxinas clostridiales. La invencion se define por medio de las reivindicaciones. Los aspectos/casos de la presente descripcion que constituyen la invencion son definidos por las reivindicaciones.

En la presente se describe un polipeptido proteolfticamente activo que comprende una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1. En un aspecto, la presente descripcion se refiere a un polipeptido proteolfticamente activo que consiste en una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, en el que dicho polipeptido proteolfticamente activo es capaz de hidrolizar la neurotoxina botulmica o del tetanos para producir una neurotoxina botulmica bicatenaria o una toxina del tetanos bicatenaria. En otra realizacion, la presente descripcion se refiere a un polipeptido proteolfticamente activo que consiste en una secuencia polipeptfdica como se muestra en SEQ ID NO:1.

La expresion "polipeptido proteolfticamente activo", tal como se emplea en la presente, se refiere a la funcion catalftica del polipeptido de la presente descripcion y significa que el polipeptido de la presente descripcion es capaz de hidrolizar un enlace peptfdico. En un aspecto, un "polipeptido proteolfticamente activo" se refiere a un polipeptido que es capaz de hidrolizar un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. La expresion "polipeptido proteolfticamente inactivo", tal como se emplea en la presente, se refiere a la funcion catalftica del polipeptido de la presente descripcion y significa que el polipeptido de la presente descripcion es incapaz de hidrolizar un enlace peptfdico.

Los expertos en la tecnica pueden determinar si un polipeptido segun la definicion de secuencia mencionada en la presente es un polipeptido segun la presente descripcion ensayando la actividad proteolftica de dicho polipeptido. Un ensayo o un sistema de ensayo para determinar la actividad proteolftica comprende poner en contacto un polipeptido que consiste en una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1, en el que dicho polipeptido proteolfticamente activo es capaz de hidrolizar la neurotoxina botulmica o del tetanos para producir una neurotoxina botulmica bicatenaria o del tetanos bicatenaria con un sustrato de ensayo. Un sustrato de ensayo generalmente es un polipeptido del cual se sabe que puede ser roto por el polipeptido de la presente descripcion. Preferiblemente, el sustrato de ensayo es una CNT, tal como BoNT o uno de sus fragmentos. El sustrato de ensayo puede ser, por ejemplo, BoNT no rota/no procesada, denominada en la presente "scBoNT", que puede ser, por ejemplo, del serotipo A, B, Cl, D, E, F o G (por ejemplo, "scBoNT/A", "scBoNT/B", etc.) o el sustrato de ensayo puede ser la neurotoxina del tetanos. Como alternativa, el sustrato de ensayo puede ser un fragmento de una neurotoxina clostridial, y dicho fragmento comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. El fragmento puede ser un polipeptido de 50 o mas restos aminoacidos o un peptido de hasta 49 restos aminoacidos. Tal como se emplea a traves de la presente memoria descriptiva, el termino "polipeptido" se refiere a moleculas con 50 o mas restos aminoacidos, mientras que el termino "peptido" se refiere a moleculas con 2 a 49 restos aminoacidos. En un aspecto, el sustrato de ensayo es un fragmento de neurotoxina soluble denominado LHn, que comprende el polipeptido de cadena ligera, la region del peptido del bucle expuesta y la mitad N-terminal del polipeptido de cadena pesada, el dominio de translocacion Hⁿ. En otro aspecto, el sustrato de ensayo es o comprende un peptido seleccionado de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25 (cf. tabla 1). En otra realizacion, el sustrato de ensayo es una neurotoxina quimerica que comprende restos aminoacidos derivados de dos o mas serotipos.

Un ensayo para determinar la actividad proteolftica comprendena generalmente una etapa de determinar el grado de conversion del sustrato de ensayo en su producto o productos de la ruptura. La observacion de uno o mas productos de ruptura generados despues de poner en contacto el polipeptido con el sustrato de ensayo, o la observacion de un aumento en la cantidad de producto o productos de la ruptura es indicativa de la actividad proteolftica del polipeptido. Dicha etapa de determinacion puede implicar comparar el sustrato y el producto o productos de la ruptura. Dicha comparacion puede implicar determinar la cantidad de sustrato y/o la cantidad de uno o mas productos de la ruptura y tambien puede implicar calcular la proporcion de sustrato y producto o productos de la ruptura. Ademas, el ensayo para determinar la actividad proteolftica puede comprender una etapa de comparar una muestra de ensayo con una muestra de referencia, en la que la muestra de referencia generalmente comprende (a) un polipeptido que consiste en una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:1 y que se sabe que es proteolfticamente activo, y (b) un sustrato de ensayo del cual se sabe que puede ser roto por el polipeptido de (a). En un aspecto, el ensayo para determinar la actividad proteolftica comprende separar el sustrato y el producto o productos de la ruptura mediante electroforesis o mediante cromatograffa en columna y, opcionalmente, un analisis espectrometrico. Puede resultar conveniente marcar el sustrato de ensayo con uno o mas marcadores para detectar con mas facilidad la disminucion del sustrato de ensayo y/o el aumento en el producto o productos. El termino "marcador", tal como se emplea en la presente, significa un marcador detectable e incluye, preferiblemente, un marcador radiactivo, un anticuerpo, un marcador fluorescente. La cantidad de sustrato de ensayo y/o producto de la ruptura puede determinarse, por ejemplo, mediante metodos de autorradiograffa o espectrometna, que incluyen metodos basados en la transferencia de energfa de resonancia entre al menos dos marcadores. Como alternativa, pueden emplearse metodos inmunologicos, tales como un analisis de la transferencia Western o ELISA, para la deteccion. Un ensayo preferido para determinar la actividad proteolftica del polipeptido de la presente descripcion se describe en la presente a continuacion en los ejemplos que ilustran la descripcion. En un caso particularmente preferido de la presente descripcion, un polipeptido es proteolfticamente activo si mas del 20%, preferiblemente mas del 95% del sustrato de ensayo se convierte en los productos de la ruptura, tales como la cadena ligera y la cadena pesada en 120 min a 37 °C utilizando un tampon seleccionado de Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, o PBS (Na2HpO450 mM, NaCl 150, pH 7,4). Se aplican las mismas condiciones si el sustrato de ensayo no es una neurotoxina de longitud completa, sino que es, por ejemplo, un fragmento de la neurotoxina de longitud completa o un derivado de la neurotoxina. Es evidente que, en este caso, los productos de la ruptura seran diferentes. Sin embargo, los expertos en la tecnica pueden cuantificar los correspondientes productos de la ruptura. En otro aspecto, en el ensayo se emplean generalmente 100 ng del polipeptido proteolfticamente activo y una proporcion molar de 1:100 con respecto al sustrato. En otro aspecto, puede tomarse una muestra a intervalos para seguir la actividad catalftica a lo largo del tiempo. El ensayo puede modificarse, por ejemplo, empleando multiples cantidades del polipeptido proteolfticamente activo.

La SEQ ID NO:2 muestra la secuencia polipeptfdica de un polipeptido proteolfticamente inactivo derivado de Clostridium botulinum, cepa ATCC 3502, n.° de registro de GenBank: "CAL82988.1", que tiene un longitud de 581 restos aminoacidos. La SEQ ID NO:1 muestra un derivado proteolfticamente activo de SEQ ID NO:2 que carece de los restos aminoacidos 1 a 248 de SEQ ID NO:2.

La expresion "un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:1" se refiere un polipeptido que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:1. Ademas, la expresion se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1. Dicho polipeptido puede presentar aminoacidos adicionales, por ejemplo, en una posicion interna o N- o C-terminal a la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1, o en una posicion interna o N- o C-terminal a una secuencia de aminoacidos que es al menos 50% identica a la secuencia de SEQ ID NO:1, en el que una metionina puede estar presente en la region N-terminal del polipeptido. Ademas, la expresion se refiere a un polipeptido que carece de uno o mas restos aminoacidos, por ejemplo, en una posicion interna o en la region N- o C-terminal de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:1, o en una posicion interna o en la region N- o C-terminal de una secuencia que es al menos 50% identica a la secuencia de SEQ ID NO:1.

La expresion "identidad de secuencia", tal como se emplea en la presente, se refiere a la determinacion de la identidad entre una secuencia de aminoacidos de referencia y una secuencia problema, en la que las secuencias se alinean de modo que se obtiene el apareamiento de orden mayor, y puede calcularse usando tecnica publicadas o metodos codificados en programas informaticos tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, 1990, J. Mol. Biol., 215:403). Los valores de porcentaje de identidad, en una realizacion, se calculan a lo largo de la secuencia de aminoacidos completa. En otra realizacion, la identidad de secuencia se calcula a lo largo de una longitud de secuencia de hasta 50 restos aa, hasta 100 aa, hasta 150 aa, hasta 250 aa, 300 aa, 350 aa, 400 aa, 450 aa, 500 aa, o 550 restos aa. En otra realizacion, la identidad de secuencia se calcula a lo largo de al menos 50 restos aa, al menos 100 aa, al menos 150 aa o al menos 250 restos aa. En casos preferidos, la identidad de secuencia se determina a lo largo de la longitud completa de SEQ ID NO:1 o 2, concretamente, a lo largo de una longitud de 333 aa o 581 aa, respectivamente. Para los expertos en la tecnica estan disponibles una serie de programas basados en una diversidad de algoritmos para comparar secuencias diferentes. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman producen resultados particularmente fiables. Para realizar los alineamientos de secuencia y calcular los valores de identidad de secuencia indicados en la presente, se empleo el programa disponible en el mercado DNASTAR Lasergene MegAlign version 7.1.0 basado en el algoritmo Clustal W a lo largo de la region de secuencia completa con los siguientes ajustes: parametros de alineamiento apareado: penalizacion de hueco: 10,00, penalizacion de longitud de hueco: 0,10, matriz de peso de proterna Gonnet 250, que, a menos que se indique lo contrario, se emplearan siempre como ajustes patron para los alineamientos de secuencia.

La expresion "al menos 50% de identidad de secuencia", tal como se emplea en la presente, significa al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o 100%.

El polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion puede tener el mismo numero de aminoacidos que la secuencia polipeptfdica de referencia mostrada en SEQ ID NO:1. En la presente descripcion tambien se incluyen polipeptidos que tienen mas o menos restos aminoacidos. En una realizacion, el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion es o comprende un mutante de truncamiento de SEQ ID NO:1 o 2 o de un polipeptido que presente al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:1. En la presente se indica un mutante de truncamiento de SEQ ID NO:2, por ejemplo, que carece de uno o mas restos aminoacidos N-terminales a la posicion de aminoacido 249. Un mutante de truncamiento puede ser un mutante de truncamiento N- o C-terminal y/o un mutante de truncamiento interno que es proteolfticamente activo. En una realizacion, dicho mutante de truncamiento de SEQ ID NO:2 carece de los aminoacidos en las posiciones 1 a 248 de SEQ ID NO:2, y el mutante de truncamiento de SEQ ID NO:2 es un mutante de truncamiento C-terminal. El mutante de truncamiento indicado en la presente carece de hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100, 150 o hasta 170 restos aminoacidos consecutivos. En otra realizacion, el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion tiene una longitud de aminoacidos de al menos 200 restos aa, de al menos 250 restos aa, de al menos 300 restos aa o de al menos 333 restos aa. En otra realizacion, el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion tiene hasta 333 restos aa o hasta 350 restos aa. En la presente tambien se indica un polipeptido proteolfticamente activo que tiene hasta 573 restos aminoacidos, hasta 581 restos aa, hasta 592 restos aa, hasta 600 restos aa o hasta 617 restos aa.

En otra realizacion, el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion incluye un polipeptido que comprende restos aminoacidos adicionales en el N- o C-terminal y/o en una posicion interna de la cadena polipeptfdica de SEQ ID NO:1, o una secuencia polipepftdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:1. Estos restos aminoacidos adicionales pueden comprender hasta 5, hasta 10 o incluso hasta 200, 300 o hasta 400 restos aminoacidos consecutivos. En una realizacion, los restos aminoacidos adicionales actuan como un inhibidor de la actividad proteolftica. En otra realizacion, los restos aminoacidos adicionales pueden ser retirados por una proteasa. En otra realizacion, los restos adicionales que inhiben la actividad proteolftica del polipeptido de la presente descripcion son excluidos. Los restos aminoacidos adicionales pueden estar flanqueados por uno o mas sitios de ruptura de proteasa. En otra realizacion, los restos aminoacidos adicionales actuan como un marcador detectable y/o permiten la union a un soporte solido.

En otra realizacion, la cadena polipeptfdica de SEQ ID NO:1 o una secuencia polipepftdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1 es modificada intercambiando uno o mas restos aminoacidos. El termino "intercambio", tal como se emplea en la presente, significa reemplazar un aminoacido por otro aminoacido diferente. Por ejemplo, pueden ser reemplazados hasta 1 aa, 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, 10 aa, 15 aa, 20 aa o hasta 50 aa dentro de la secuencia polipepftdica. Los intercambios pueden implicar cambios conservativos o no conservativos de aminoacidos dirigidos, por ejemplo, a aumentar o disminuir la union al sustrato o la actividad proteolftica del polipeptido de la presente descripcion.

En una realizacion, el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion incluye un polipeptido que es capaz de hidrolizar un sustrato en dos o mas productos de la ruptura nativos. En otra realizacion, el polipeptido de la presente descripcion hidroliza el sustrato en dos o mas productos de la ruptura que se diferencian de los productos de la ruptura nativos. La expresion "productos de la ruptura nativos" o "productos nativos", tal como se emplea en la presente, se refiere a productos que son identicos en la secuencia de aminoacidos cuando se comparan con productos generados a partir del mismo sustrato en cultivos celulares de tipo salvaje, a partir de los cuales se origina el sustrato. En una realizacion, el producto de la ruptura es la neurotoxina bicatenaria de una neurotoxina botulmica o de una neurotoxina del tetanos, y en otro aspecto, la neurotoxina bicatenaria es una neurotoxina aislada a partir de C. botulinum de serotipo A, B, C1, D, E, F o G. En otra realizacion, dicha neurotoxina bicatenaria es una neurotoxina bicatenaria nativa.

Tabla 1 - muestra el precursor, la neurotoxina bicatenaria nativa de TeNT y BoNT/A-G, e identifica el bucle expuesto que comprende la secuencia de aminoacidos rota por el polipeptido de la presente descripcion.

Debe entenderse que las definiciones y explicaciones de los terminos realizadas anteriormente y a continuacion se aplican, mutatis mutandis, a todos los aspectos descritos en esta memoria descriptiva a continuacion, a menos que se indique lo contrario

El polipeptido proteoltticamente activo de la presente descripcion es adecuado para diversas aplicaciones. Una aplicacion importante desde el punto de vista comercial es su uso en la produccion de neurotoxinas terapeuticas, tales como las aisladas a partir de C. botulinum. En la actualidad, los cultivos celulares de C. botulinum empleados para la preparacion de preparaciones disponibles en el mercado de la neurotoxina botulmica estan contaminados con cantidades significativas de neurotoxinas parcialmente procesadas y/o no procesadas, y ambas alteran negativamente, en concreto reducen la actividad espedfica, estas composiciones farmaceuticas. Empleando el polipeptido proteoltticamente activo o activado de la presente descripcion, por ejemplo, despues de la lisis de C. botulinum, ahora es posible tratar composiciones que comprenden neurotoxinas parcialmente procesadas y/o no procesadas y, por tanto, convertir estos contaminantes en neurotoxinas totalmente procesadas. En consecuencia, se puede proporcionar a los productos comerciales una mayor actividad espedfica de la neurotoxina, por lo cual puede reducirse la cantidad total de protema bacteriana, reduciendo aun mas el riesgo de que los pacientes formen anticuerpos.

En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de la presente descripcion y, opcionalmente, elementos reguladores. La expresion "elementos reguladores", tal como se emplea en la presente, se refiere a elementos reguladores de la expresion genica, incluyendo la transcripcion y la traduccion, e incluye elementos tales como la caja tata, un promotor, potenciador, sitio de union a ribosomas, secuencia de Shine-Dalgarno, region IRES, senal de poliadenilacion, estructura de cierre de cadena terminal y similares. Dicho elemento regulador puede comprender uno o mas elementos reguladores heterologos, o uno o mas elementos reguladores homologos. Un "elemento regulador homologo" es un elemento regulador de una celula de tipo salvaje, a partir de la cual se deriva la molecula de acido nucleico de la presente descripcion, que esta implicado en la regulacion de la expresion genica de la molecula de acido nucleico o del polipeptido en dicha celula de tipo salvaje. La presente descripcion tambien incluye moleculas de acidos nucleicos que comprenden elementos reguladores heterologos. La expresion "elemento regulador heterologo" es un elemento regulador que no esta implicado en la regulacion de la expresion genica de la molecula de acido nucleico o del polipeptido en dicha celula de tipo salvaje. Tambien se incluyen elementos reguladores para la expresion inducible, tales como promotores inducibles. La molecula de acido nucleico puede ser, por ejemplo, ARNhn, ARNm, ARN, ADN, ANP, ANL y/o moleculas de acidos nucleicos modificadas. La molecula de acido nucleico puede ser circular, lineal, puede estar integrada en un genoma o puede ser episomica. Tambien se incluyen concatameros que codifican protemas de fusion que comprende tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipeptidos de la presente descripcion. Ademas, la molecula de acido nucleico puede contener secuencias que codifican secuencias senal para el transporte intracelular, tales como senales para el transporte hacia el interior de un compartimento intracelular o para el transporte a traves de la membrana celular.

En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a un vector que comprende una molecula de acido nucleico segun la molecula de acido nucleico de la presente descripcion. Un vector puede ser adecuado para la expresion in vitro y/o in vivo del polipeptido de la presente descripcion. El vector puede ser un vector para la expresion de genes transitoria y/o estable. En un caso, el vector comprende ademas elementos reguladores y/o marcadores de seleccion. Dicho vector, en un caso, es de origen vrnco, en otro caso es de origen de fago y en otro caso es de origen bacteriano.

En otro aspecto, la presente descripcion se refiere a una celula que comprende la molecula de acido nucleico o el vector de la presente descripcion. El termino "celula", tal como se emplea en la presente, incluye celulas procariotas y/o eucariotas adecuadas para expresar dicha molecula de acido nucleico o dicho vector y, en particular, el polipeptido de la descripcion. Dicha celula puede ser una celula hospedante que no expresa el polipeptido de la presente descripcion o un homologo de este. El termino "homologo", tal como se emplea en la presente, se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1. Sin embargo, la presente descripcion tambien incluye celulas, en particular celulas de tipo salvaje, que expresan el polipeptido de la presente descripcion o un homologo de este. En una realizacion concreta, la celula de la presente descripcion se selecciona de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii y C. tetani. En una realizacion preferida, la celula es C. botulinum de serotipo A, B o F. En otra realizacion, dicha celula es la cepa

Hall (ATCC 3502) de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa ATCC 19397 productora de BoNT/A, tambien conocida como NCTC 4587 y NCTC 7272, de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa

NCTC 2916 productora de BoNT/A de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula son las cepas Kyoto-F y Mauritius/NCTC 9837 productoras de BoNT/A2 de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa A254

Loch Maree/NCTC 2012 productora de BoNT/A3 de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa CDC657 productora de BoNT/A4 y B de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa H04402 065 productora de BoNT/A5 y B3' de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa Okra/NCTC 7273 productora de BoNT/B1 de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa CDC4013/NCTC 12265 productora de BoNT/B y F de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es la cepa Langeland/NCTC 102 productora de BoNT/F1 de C. botulinum. En otra realizacion, dicha celula es Clostridium sporogenes, Clostridiu perfringens, Clostridium acetobutylicum, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoidis, B. thermoproteolyticus, B. anthracis,

B. megaterium, B. subtilis, E. coli, o una celula de levadura. En una realizacion, el polipeptido de la presente descripcion se modifica dentro de la celula (es decir, se glicosila, fosforila, es procesado por proteasas, etc.). La modificacion tambien incluye la adicion de cofactores no proteicos que incluyen iones metalicos. Las celulas que comprenden el polipeptido proteoltticamente inactivo descrito anteriormente, cualquier producto de polipeptido intermedio, asf como el polipeptido proteoltticamente activo final descrito en la presente se incluyen en esta descripcion. La presente descripcion tambien incluye celulas que comprenden un inductor de la expresion del polipeptido de la presente descripcion. Dicho inductor de la expresion puede ser una molecula de acido nucleico o un polipeptido o una entidad qmmica, que incluye una entidad qmmica pequena, que tenga el efecto de aumentar la cantidad o la actividad del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion en cultivos celulares o lisados de estos. El inductor de la expresion, por ejemplo, puede aumentar la transcripcion o la traduccion de una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido de la presente descripcion. Como alternativa, un inductor de la expresion indicado en la presente puede ser un compuesto capaz de activar el polipeptido proteolfticamente activo de SEQ ID NO:2 o un polipeptido que comprende una secuencia polipepftdica que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:2. En una realizacion, dicha celula comprende un inductor que es un polipeptido proteolfticamente activo capaz de retirar restos aminoacidos inhibidores de la region N-terminal de dicho polipeptido. El inductor, por ejemplo, puede ser expresado por medios recombinantes conocidos por los expertos en la tecnica. Como alternativa, el inductor puede aislarse de una celula, por ejemplo, una celula clostridial.

La presente descripcion tambien se refiere al uso de la molecula de acido nucleico de la presente descripcion para la fabricacion del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion.

En un aspecto relacionado, la presente descripcion se refiere a un metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente activo, que comprende las etapas de: (a) sintetizar de modo qrnmico o traducir a partir de una secuencia de nucleotidos un polipeptido, que consiste en una secuencia polipepftdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, en el que dicho polipeptido proteolfticamente activo es capaz de hidrolizar la neurotoxina botulmica o del tetanos para producir una neurotoxina botulmica bicatenaria o una toxina del tetanos bicatenaria; y (b) purificar el polipeptido de la etapa (a).

La expresion "sintetizar de modo qrnmico" significa sintetizar polipeptidos por medios qmmicos. Estos metodos se resenan, por ejemplo, en Nilsson et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2005, 34:91-118. La expresion "purificar el polipeptido" significa retirarlo de una mezcla que comprende el polipeptido de la presente descripcion y otros compuestos distintos de dicho polipeptido. La expresion tambien significa retirar el polipeptido de la presente descripcion de una mezcla que comprende otros compuestos distintos de dicho polipeptido. En una realizacion concreta, la expresion significa separar el polipeptido proteolfticamente activo de su precursor proteolfticamente inactivo.

El acido nucleico puede traducirse en una celula o en un sistema sin celulas. Estan disponibles para los expertos en la tecnica diversos sistemas para la traduccion sin la presencia de celulas. La presente descripcion incluye, por ejemplo, la traduccion en un sistema de traduccion de protemas sin celulas que comprende un lisado de reticulocitos de conejo, lisado de germen de trigo, lisado de E. coli, u otros lisados celulares, por ejemplo, lisados generados a partir de C. botulinum y similares. Tambien se incluye la traduccion del polipeptido de la presente descripcion desde la secuencia de nucleotidos de la presente descripcion o el vector de la presente descripcion. La transcripcion puede ser regulada o controlada por uno o mas elementos reguladores heterologos o por elementos reguladores homologos. En este aspecto de la presente descripcion tambien se incluye la traduccion en una celula de tipo salvaje, es decir, una celula aislada de la naturaleza, tales como cualquier aislado conocido de C. botulinum, C. butyricum, C. baratii, y C. tetani. En una realizacion particular, dicha celula es C. botulinum de la cepa Hall (ATCC 3502). Estan disponibles para los expertos en la tecnica diversos medios y metodos convencionales para introducir una molecula de acido nucleico o un vector en la celula y para expresar el polipeptido de la presente descripcion como una protema recombinante en una celula. Ademas, los expertos en la tecnica conocen muchas tecnicas convencionales para aislar polipeptidos a partir de celulas o lisados de celulas o a partir de sistemas de expresion exentos de celulas (por ejemplo, Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Cualquiera de estos medios y metodos pueden usarse en los metodos de la presente descripcion.

El primer polipeptido de la presente descripcion puede traducirse a partir de una molecula de acido nucleico que codifica el polipeptido proteolfticamente activo. La SEQ ID NO:26 es un ejemplo de dicha molecula de acido nucleico. Como alternativa, dicha molecula de acido nucleico puede codificar un polipeptido precursor que es proteolfticamente inactivo pero que puede convertirse en el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion. La SEQ ID nO:27 es un ejemplo de dicha molecula de acido nucleico. El precursor proteolfticamente inactivo tambien se denomina "BoNTHidrolasa inactiva", abreviada como iBH. Este precursor proteolfticamente inactivo puede activarse, por ejemplo, durante o despues de la traduccion o poniendo en contacto, por ejemplo, dicho polipeptido proteolfticamente inactivo con una proteasa capaz de retirar restos aminoacidos inactivantes en la region N-terminal del polipeptido proteolfticamente inactivo. Un ejemplo de un polipeptido proteolfticamente inactivo es el polipeptido representado por SEQ ID NO:2. Otro ejemplo es un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:2. La expresion "restos aminoacidos inactivantes en la region N-terminal" se refiere, en un aspecto, a los primeros 248 restos aa de dicho polipeptido. En otro aspecto, esta expresion se refiere a un fragmento de hasta 10 restos aa, 50 aa, 100 aa, 150 aa, 200 aa, 250 aa de dicho polipeptido. Cualquiera de estos polipeptidos es util en el metodo de la presente descripcion para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente activo. En una realizacion, la proteasa capaz de retirar restos aminoacidos inactivantes de la region N-terminal de este polipeptido se afsla, por ejemplo, de Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii, y Clostridium tetani. En otra realizacion, la proteasa capaz de retirar dichos restos aminoacidos inactivantes se proporciona proporcionando un lisado fraccionado o no fraccionado de dichas celulas. Los restos aminoacidos inactivantes pueden retirarse poniendo en contacto el polipeptido proteolfticamente inactivo con dicho lisado e incubando hasta que el polipeptido proteolfticamente inactivo se transforma en el polipeptido proteolfticamente activo.

En otra realizacion del metodo de la presente descripcion, el polipeptido se traduce en una celula. La celula puede ser una celula procariota o eucariota. En una realizacion, la celula se selecciona de E. coli, B. subtilis o levadura. La presente descripcion tambien incluye la traduccion del polipeptido de la presente descripcion en una celula de tipo salvaje, es decir, una celula aislada de la naturaleza, tal como cualquier aislado conocido de Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium baratii, y Clostridium tetani. En una realizacion concreta, dicha celula es C. botulinum de la cepa Hall (ATCC 3502). En otra realizacion concreta, dicha celula es la celula de la presente descripcion descrita en la presente anteriormente.

Los productos de la traduccion obtenidos mediante el metodo de la presente descripcion pueden purificarse mediante diversos medios, todos los cuales son conocidos por los expertos en la tecnica (por ejemplo, Recombinant DNA Principles and Methodologies, J. Green, Marcel Dekker Inc., 1998; The Condensed Protocols: From Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2006; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 2000). Los metodos ffpicos para purificar el polipeptido de la presente descripcion pueden implicar la centrifugacion de un lisado de celulas, la precipitacion con sulfato de amonio de protemas, la resuspension de protemas, la centrifugacion de protemas resuspendidas, la cromatograffa de intercambio ionico, la cromatograffa de exclusion molecular, la cromatograffa de interaccion hidrofoba y similares. Pueden ser utiles varias combinaciones de dichas etapas, en diferente orden, para purificar el polipeptido de la presente descripcion. Un metodo preferido para purificar el polipeptido de la presente descripcion se describe en los ejemplos que ilustran la descripcion.

En una realizacion, la etapa de purificacion comprende unir el polipeptido de la presente descripcion a un soporte solido. El termino "soporte solido" se refiere a una matriz que incluye, por ejemplo, gel de sflice, dextrano reticulado, poliacrilamida reticulada o agarosa reticulada y similares. Tambien se incluyen, en concreto, polipeptidos, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, polietilenglicol (PEG), dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificada, poliacrilamidas, gabros, y magnetita. Un soporte solido, en una realizacion de la descripcion, es una matriz de polisacaridos seleccionada del grupo que consiste en Sepharose, Sephadex, agarosa, Sephacell, microcelulosa, y esferas de alginato. En otra realizacion, dicho soporte solido puede consistir en esferas de vidrio y/o matrices polipepffdicas.

En una realizacion, el soporte solido esta unido al anticuerpo de la presente descripcion. El termino "unido" significa, en un aspecto, unido de modo estable o asociado de modo estable. En otro aspecto, unido incluye interacciones, tales como enlaces indirectos o directos, no reversibles o reversibles, ffsicos y qmmicos, electrostaticos y/o covalentes. El anticuerpo indicado en la presente esta covalentemente unido, directamente o a traves de una molecula conectora, al soporte solido. El anticuerpo puede unirse a dicho soporte solido a traves de un conector, que incluye compuestos de molecula pequena, moleculas de conectores pepffdicos (o polipepffdicos). El soporte solido puede tener casi cualquier disposicion o configuracion estructural posible, con la condicion de que el anticuerpo acoplado sea capaz de unirse a su anffgeno. Asf, la matriz o el soporte solido puede ser esferico, tal como sucede en una esfera, o cilmdrico, tal como sucede en la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser irregular o plana, tal como una lamina o una tira de ensayo.

Dicho anticuerpo unido al soporte solido puede usarse, por ejemplo, en el metodo de fabricacion de la presente descripcion o en un metodo de diagnostico. En una realizacion, dicho metodo de fabricacion puede comprender una etapa de cromatograffa de afinidad, en la que dicha cromatograffa de afinidad se basa en un anticuerpo unido a un soporte solido. En un caso, dicho anticuerpo es un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion. En otro caso, dicho anticuerpo es un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido proteolfticamente inactivo de la presente descripcion.

En otra realizacion, el metodo para fabricar el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion comprende purificar el polipeptido de la presente descripcion a partir de una mezcla que contiene componentes adicionales. La purificacion puede basarse, por ejemplo, en la polaridad, la carga electrica y el tamano. Por tanto, en una realizacion, el metodo puede comprender una o mas etapas de separacion seleccionadas del grupo que consiste en HPLC en fase normal, HPLC en fase inversa, cromatograffa de interaccion hidrofila ("hydrophilicinteraction chromatography", HILIC), cromatograffa de interaccion hidrofoba ("hydrophobic-interaction chromatography", HIC), cromatograffa de intercambio ionico ("ion-exchange chromatography", IEC) que incluye la cromatograffa de intercambio anionico y la cromatograffa de intercambio cationico, la cromatograffa de exclusion molecular ("size-exclusion chromatography", SEC), la cromatograffa de permeacion en gel ("gel-permeation chromatography", GPC).

En otra realizacion, dicha purificacion comprende las etapas de: (a) una separacion mediante cromatograffa de intercambio anionico; (b) una separacion mediante cromatograffa de exclusion molecular; (c) una separacion mediante una cromatograffa de interaccion hidrofoba; y (d) una separacion mediante cromatograffa de exclusion molecular.

Una o mas fracciones recogidas de una columna de cromatograffa pueden concentrarse, por ejemplo, mediante precipitacion o ultrafiltracion.

En un aspecto, la presente descripcion se refiere a una composicion que comprende el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion. Utilizando el metodo descrito en la presente es posible fabricar el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion que este sustancialmente exento del polipeptido proteolfticamente inactivo. En otras palabras, el metodo de la presente descripcion proporciona un polipeptido proteolfticamente activo y una composicion que no comprende contaminacion sustancial por la protema precursora inactiva del polipeptido de la presente descripcion. Se considera que una composicion no contiene contaminacion sustancial o que esta sustancialmente exenta de polipeptido precursor proteolfticamente inactiva si cuando se emplea un metodo de deteccion basado en la transferencia Western, puede detectarse menos del 5% del precursor proteolfticamente inactivo, refiriendose dicho 5% a la cantidad de precursor proteolfticamente inactivo con relacion a la suma de polipeptido proteolfticamente activo e inactivo. En otra realizacion, dicha composicion es sustancialmente pura y comprende al menos 50% de polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion, refiriendose dicho 50% a la cantidad de precursor proteolfticamente activo con relacion a la cantidad total de protema contenida en la composicion. En otra realizacion, dicha composicion sustancialmente pura comprende al menos 75%, 80%, 90% o al menos 98% de polipeptido proteolfticamente activo.

En otra realizacion, la presente descripcion se refiere ademas a un polipeptido que puede obtenerse con el metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente activo, segun se describio anteriormente en la presente y tal como se ilustra en los ejemplos. Dicho polipeptido proteolfticamente activo es, en una realizacion, un polipeptido proteolfticamente activo con la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO:1. En otro aspecto, el polipeptido proteolfticamente activo es un polipeptido que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1. En otra realizacion, el polipeptido proteolfticamente activo es un polipeptido que consiste en una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1. La expresion "un polipeptido que puede obtenerse", tal como se emplea en la presente, se refiere, en un aspecto, a un polipeptido que se traduce a partir del acido nucleico de la presente descripcion. El polipeptido despues puede sufrir una modificacion postraduccional, tal como una acilacion, alquilacion, amidacion, adicion de aminoacidos, delecion de aminoacidos, glicosilacion, oxidacion, S-glutationilacion, fosforilacion, sulfatacion, procesamiento proteolftico y similares. Ademas, el polipeptido puede unirse a un ion metalico, tal como Li+, Na+, K+, Ag+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Co2+, Ni2+, Mn2+, Cu2+ o Zn2+. Preferiblemente, dicho ion metalico es Zn2+, Mn2+ o Co2+.

Tambien se describe un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido de la presente descripcion. El termino "anticuerpo", tal como se emplea en la presente, incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo quimerizado, primatizado, humanizado o humano, un anticuerpo biespedfico, un anticuerpo sintetico, derivados qrnmica o enzimaticamente modificados, un fragmento de cualquiera de dichos anticuerpos o aptameros que consisten en los acidos nucleicos naturales y/o qdmicamente modificados. Los fragmentos de dichos anticuerpos incluyen fragmentos F(ab')2, F(ab), Fv o scFv, o derivados qrnmica o enzimaticamente modificados de cualquiera de estos fragmentos.

En algunas descripciones, el anticuerpo de la presente descripcion se unira espedficamente al polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion o su precursor proteolfticamente inactivo. En otra descripcion, el anticuerpo que es espedfico del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion presenta reactividad cruzada con el polipeptido proteolfticamente inactivo descrito en la presente. En otra descripcion, el anticuerpo es capaz de discriminar entre el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion y su precursor inactivo. En otra descripcion, el epitopo para el cual dicho anticuerpo es espedfico se localiza en una region de aminoacidos que esta presente en el polipeptido proteolfticamente inactivo, pero no en el polipeptido proteolfticamente activo. Por ejemplo, dicho epitopo puede ser un epitopo de una region del polipeptido que consiste en los restos aminoacidos 1 a 248 de un polipeptido que comprende la secuencia polipeptfdica que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:2.

En otra indicacion, el epitopo esta formado por restos aminoacidos localizados en una posicion N-terminal con respecto al aminoacido 249 de un polipeptido que comprende la secuencia polipeptfdica que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID ⁿO:2. En otra descripcion, dicho epitopo se retira del polipeptido proteolfticamente inactivo descrito en la presente mediante procesamiento proteolftico.

En otra descripcion, el epitopo para el cual el anticuerpo de la presente descripcion es espedfico es un epitopo localizado en la region N-terminal de un polipeptido que comprende la secuencia polipeptidica que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:1. La expresion "region N-terminal", tal como se emplea en este aspecto de la descripcion, se refiere a una region del polipeptido que comprende los 50 restos aminoacidos N-terminales de dicha secuencia polipeptfdica, preferiblemente, los 25 restos N-terminales de dicha secuencia polipeptfdica. En una descripcion concreta, la expresion se refiere a los 14 restos aminoacidos N-terminales. El termino "epitopo", tal como se emplea en la presente, se refiere al determinante antigenico que es reconocido por el anticuerpo de la presente descripcion. En una descripcion, el epitopo es un epitopo lineal, y en otro aspecto el epitopo es un epitopo conformacional. En una descripcion particular, el determinante antigenico consiste en un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la region N-terminal del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion, en el que dicho peptido puede tener una longitud de aminoacidos de 7 a 14, 25 preferiblemente de 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 restos aminoacidos.

La expresion "se une espedficamente", en un aspecto, significa que el anticuerpo de la presente descripcion no presenta reaccion cruzada en un grado significativo con otros epitopos sobre el polipeptido de la presente invencion ni sobre otros polipeptidos en general. La especificidad de epitopo es una caractenstica importante del anticuerpo de la presente descripcion. La especificidad del anticuerpo con respecto al polipeptido proteolfticamente activo frente al polipeptido proteolfticamente inactivo sera, en un aspecto, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%. La union espedfica puede ensayarse mediante diversas tecnicas muy conocidas, que incluyen, por ejemplo, estudios de competicion. Otra caractenstica importante es la sensibilidad del anticuerpo. La sensibilidad, en un aspecto de la invencion, sera de tal forma que se una al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% del epitopo incluido en una muestra. La sensibilidad puede ensayarse mediante tecnicas muy conocidas. Los expertos en la tecnica seran capaces de determinar las condiciones de ensayo operativas y optimas para cada determinacion empleando la experimentacion habitual. Las tecnicas convencionales para los estudios de union incluyen el radioinmunoensayo, ELISA, dialisis en equilibrio, microcalorimetna isotermica, ensayos BIACORE® (resonancia de plasmon de superficie, "surface plasmon reasonance", SPR) u otros metodos de adsorcion sobre una superficie. El sistema BIACORE® SPR mide la interaccion anticuerpo-antigeno. La respuesta de SPR refleja un cambio en la concentracion de masa en la superficie del detector a medida que los analitos se unen o se disocian. Basandose en SPR, las mediciones de BIACORE® a tiempo real controlan las interacciones directamente a medida que suceden; vease BIAapplications Handbook, version AB (reeditado en 1998), n.° de codigo de BIACORE®: BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB (reeditado en 1998), n.° de codigo de BIACORE®: BR- 1001-84. Las propiedades de union, tales como la sensibilidad, de un anticuerpo de la presente descripcion pueden determinarse, en principio, mediante estudios de union empleando un antigeno inmovilizado (el ligado) presentado sobre una superficie detectora. El anticuerpo que se va a ensayar (el analito) se proporcionara en la fase movil, es decir, en una disolucion. En algunos casos, el antfgeno se une de modo indirecto a la superficie a traves de la union a otra molecula inmovilizada que se denomina molecula de captura. Cuando el anticuerpo se inyecta en un pulso discreto a traves de la superficie con los antfgenos inmovilizados, fundamentalmente pueden subdividirse tres fases: (i) asociacion del anticuerpo con el antfgeno durante la inyeccion de la muestra; (ii) estado en equilibrio o estacionario durante la inyeccion de la muestra, en el que la tasa de union del anticuerpo es equilibrada por la disociacion del complejo de anticuerpo-antfgeno; (iii) disociacion del anticuerpo de la superficie durante el flujo del tampon. Se entendera que dicho ensayo puede realizarse, como alternativa, con los anticuerpos inmovilizados que se van a investigar y con una disolucion que contenga el antfgeno como fase movil. Las fases de asociacion y disociacion proporcionan informacion sobre la cinetica de la interaccion de analito-ligando (k^a y k^d, las tasas de formacion de complejos y de disociacion, k^d/k^a = K^d ). La fase en equilibrio proporciona informacion sobre la afinidad de la interaccion analito-ligando (K^d ). El anticuerpo de la presente descripcion tiene una KD menor que 0,5 ^|iM, en otro aspecto, menor que 0,05 |iM y, en otro aspecto, menor que 0,02 |iM.

El anticuerpo mencionado en la presente descripcion puede fabricarse empleando metodos descritos, por ejemplo, en Harlow y Lane, 1988 (Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988). Pueden prepararse anticuerpos monoclonales mediante las tecnicas descritas originariamente en Kohler y Milstein, 1975 (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495) y Galfre y Milstein, 1981 (Galfre y Milstein. 1981, Meth. Enzymol., 73:3). Dichas tecnicas comprenden la fusion de celulas de mieloma de raton con celulas de bazo derivadas de mamfteros inmunizados. Los anticuerpos pueden mejorarse aun mas mediante tecnicas muy conocidas en la tecnica. Por ejemplo, la resonancia de plasmon de superficie, tal como se emplea en el sistema BIACORE®, puede emplearse para aumentar la eficacia de anticuerpos de fagos que se unen al epitopo mencionado anteriormente dentro del polipeptido de la presente descripcion (cf. Schier et al., 1996, Human Antibodies Hybridomas, 7:97; Malmborg et al., 1995, J. Immunol. Methods, 183:7).

El anticuerpo de la descripcion se produce usando un peptido que comprende o que consiste en el epitopo mencionado anteriormente. El peptido puede producirse de modo sintetico o mediante expresion recombinante. Como alternativa, el anticuerpo de la descripcion puede producirse aplicando un polipeptido proteolfticamente activo natural o un polipeptido proteolfticamente inactivo de la presente descripcion. En este ultimo caso, debe entenderse que los anticuerpos resultantes se ensayaran posteriormente para determinar su especificidad con respecto al polipeptido de la presente descripcion. En otra descripcion, un anticuerpo monoclonal de la descripcion se produce empleando un polipeptido de la presente descripcion que puede tratarse con un detergente para hacer que el epitopo este inmunologicamente disponible. Sin embargo, se entendera que, en el caso en que el anticuerpo se dirija contra un epitopo conformacional, no debe realizarse este tratamiento con detergente. En otra descripcion, tambien pueden aplicarse agentes de inmunoestimulacion, tales como hemocianina de lapa ("keyhole limpet hemocyanin", KLH), en dicho proceso, en especial cuando se usa un peptido sintetico

El anticuerpo de la presente descripcion puede utilizarse, por ejemplo, para una cromatograffa de afinidad, para la inmunoprecipitacion, y la inmunolocalizacion del polipeptido de la presente descripcion, asf como para controlar la presencia de dicho polipeptido en muestras o en organismos recombinantes. Ademas, el anticuerpo de la presente descripcion puede usarse en un metodo de deteccion o en un metodo de diagnostico. En un aspecto particular, el anticuerpo de la presente descripcion se emplea en una transferencia Western o un ELISA. Ademas, el anticuerpo de la presente descripcion puede usarse en aplicaciones terapeuticas. En particular, el anticuerpo puede usarse para inhibir la actividad del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion. Por tanto, el anticuerpo de la presente descripcion tambien tiene las diversas aplicaciones terapeuticas descritas en la presente a continuacion.

La presente descripcion tambien se refiere al uso del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion en un metodo para procesar proteolfticamente un polipeptido. En un aspecto, la presente descripcion se refiere a un metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente procesado que comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipeptido, siendo dicho primer polipeptido el polipeptido de la presente descripcion, con (b) un segundo polipeptido, siendo dicho segundo polipeptido susceptible a la proteolisis por dicho primer polipeptido, en el que dicho contacto provoca el procesamiento proteolftico de dicho segundo polipeptido para producir al menos dos productos de la ruptura.

La presente descripcion tambien se refiere al uso de Lys-N y/o Lys-C y/o arginil endopeptidasa (endoproteinasa Arg-C, LeR) de Lysobacter enzymogenes (ATCC 29487) (Wright D.S., Graham L.D., Jennings P.A., Biochim. Biophys. Acta, 22 de diciembre de 1998, 1443(3):369-3g74). Ademas, tambien incluye el uso de plasmina y/o omptina (OmpT), una serina proteasa unida a membrana que provoca la ruptura en los motivos (Arg/Lys)-(Arg/Lys) (K. Sugimura y T. Nishihara, J. Bacteriol., 170 (1988), pp. 5625-5632) en un metodo para procesar proteolfticamente una CNT, tal como BoNT/A. En la presente se describe un metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente procesado que comprende la etapa de poner en contacto: (a) un primer polipeptido, siendo dicho primer polipeptido Lys-C o Lys-N, con (b) un segundo polipeptido, siendo dicho segundo polipeptido susceptible a la proteolisis por dicho primer polipeptido, en el que dicho contacto provoca el procesamiento proteolftico de dicho segundo polipeptido para producir al menos dos productos de la ruptura, y en el que el segundo polipeptido es la cadena sencilla de BoNT/A descrita en la presente. La expresion "Lys-C" se refiere a la serina endoproteinasa Lys-C de 33 kDa de Lysobacter enzymogenes (lisil endopeptidasa, LeK, n.° de registro de Genbank Q7M135) que rompe espedficamente los enlaces pepffdicos en posicion C-terminal con respecto a la lisina o uno de sus homologos que tenga al menos 60% de identidad de secuencia. La expresion "Lys-N" se refiere a la metaloendopeptidasa Lys-N aislada a partir de Grifola frondosa y Pleurotus ostreatus (Nonaka T. et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:30032-30039; Nonaka T. et al., 1998, J. Biochem., 1998, 124:157-162; Hod T. et al., 2001, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 57:361-368). La expresion tambien incluye los homologos de dicha proteasa que tienen al menos 60% de identidad de secuencia.

Este metodo puede usarse, por ejemplo, para fabricar una neurotoxina (CNT) o neurotoxina botulmica (BoNT) proteolfticamente procesada. El termino "BoNT", tal como se emplea a traves de esta descripcion, significa la neurotoxina botulmica y se refiere a la neurotoxina que puede obtenerse a partir de C. botulinum, tal como BoNT de serotipo A, B, Cl, D, E, F o G. En el termino "CNT" y "BoNT" tambien se incluye una neurotoxina recombinante y modificada que comprende una o mas modificaciones, que incluyen una modificacion qmmica o una modificacion genetica. La expresion "modificacion genetica" significa delecion, sustitucion o adicion de uno o mas restos aminoacidos. Empleando el metodo de la presente descripcion, ahora es posible obtener composiciones de neurotoxinas con significativamente menos contaminacion por neurotoxinas no procesadas o parcialmente procesadas, puesto que estos contaminantes se procesan con eficacia para producir la neurotoxina bicatenaria. En una realizacion, la neurotoxina bicatenaria es una neurotoxina bicatenaria nativa, en la que la region C-terminal de la cadena ligera y la region N-terminal de la cadena pesada son identicas a la correspondiente neurotoxina bicatenaria totalmente procesada aislada a partir de clostridios de tipo salvaje.

La expresion "poner en contacto", tal como se emplea en la presente, se refiere a poner en proximidad ffsica al menos dos compuestos diferentes para permitir la interaccion ffsica y/o qmmica de dichos compuestos. Segun el metodo de esta descripcion, dichos dos compuestos diferentes son, en una realizacion, el primer y el segundo polipeptido que estan incluidos en la disolucion. El contacto se realiza bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interaccion del primer y segundo polipeptido. La expresion "polipeptido proteolfticamente procesado", tal como se emplea en la presente, se refiere, en un aspecto, a un polipeptido cuya cadena polipepffdica ha sido hidrolizada o rota en uno o mas enlaces pepffdicos. En otra realizacion, la expresion se refiere a un polipeptido que ha sido proteolfticamente roto por una endoproteinasa o endopeptidasa. En otra realizacion, la expresion se refiere a un polipeptido que ha sido roto hasta un grado de al menos 50%. En otra realizacion, dicho polipeptido proteolfticamente procesado es el segundo polipeptido. En otra realizacion, al menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% esta proteolfticamente procesado.

La expresion "primer polipeptido", tal como se emplea en la presente, se refiere al polipeptido de la presente descripcion, es decir, el polipeptido proteolfticamente activo o activado, tambien denominado "BoNTHidrolasa activa". Puesto que la BoNTHidrolasa activa puede obtenerse del sobrenadante de C. botulinum, en un principio se denomino BoNTHidrolasa nativa, abreviado como "nBH". Sin embargo, la expresion "primer polipeptido" y "nBH" tambien se refieren a BoNTHidrolasas que pueden obtenerse a partir de otras fuentes. La expresion "segundo polipeptido", tal como se emplea en la presente, se refiere al sustrato de dicho primer polipeptido. La expresion "es susceptible a la proteolisis" se refiere a una caractenstica o requisito del segundo polipeptido y, en la presente, se emplea para indicar que el segundo polipeptido puede ser roto proteolfticamente por dicho primer polipeptido. En otras palabras, la expresion "es susceptible a la proteolisis" significa que el segundo polipeptido comprende un sitio de reconocimiento y ruptura de proteasa que le permite actuar como sustrato del primer polipeptido. El "segundo polipeptido" es un sustrato del primer polipeptido y es proteolfticamente procesado para producir dos o mas productos de la ruptura. Empleando el ensayo descrito anteriormente en la presente, los expertos en la tecnica pueden determinar si un polipeptido concreto es un sustrato del primer polipeptido y, por tanto, un "segundo polipeptido" segun la definicion de la presente descripcion. La expresion "al menos dos productos de la ruptura" incluye, por ejemplo, hasta dos, tres, cuatro, cinco y hasta seis productos de la ruptura.

Este metodo puede usarse, por ejemplo, para preparar una composicion farmaceutica que comprende una neurotoxina clostridial o para generar fragmentos polipepffdicos usados en un metodo de espectrometffa de masas. El primer polipeptido y el segundo polipeptido pueden ponerse en contacto en diversas etapas en el proceso de fabricacion del polipeptido proteoffticamente procesado. En un aspecto, la etapa de poner en contacto el primer polipeptido y el segundo polipeptido se realiza dentro de una celula. En una realizacion particular de este caso, el primer y el segundo polipeptido se expresan en dicha celula.

En otra realizacion, dicha etapa de contacto se realiza en un lisado de celulas o en un lisado de celulas purificado. Este aspecto incluye la adicion del primer polipeptido al lisado o al lisado purificado. El primer polipeptido puede anadirse en diversas etapas durante la purificacion del segundo polipeptido del lisado de celulas. Por ejemplo, el primer polipeptido puede anadirse antes o despues de la precipitacion de las protemas, una cromatograffa de intercambio ionico, una cromatograffa de interaccion hidrofoba y/o una cromatograffa de exclusion molecular. Ademas, tambien se incluye la adicion del primer polipeptido a una composicion farmaceutica. En esta realizacion, el polipeptido de la presente descripcion se emplea, por ejemplo, para romper proteoffticamente el segundo polipeptido, por ejemplo, para activar un segundo polipeptido que es un agente terapeutico contenido en la composicion farmaceutica. Tambien se contempla la administracion del primer polipeptido a un sujeto para procesar proteoffticamente un segundo polipeptido en el sujeto. La administracion tambien incluye la coadministracion del primer y segundo polipeptido. En este metodo tambien se incluye una etapa de incubacion en condiciones y durante un tiempo suficiente para romper el segundo polipeptido. En una realizacion, las condiciones pueden comprender anadir un tampon seleccionado del grupo que consiste en Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, o PBS (Na2HPO450 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4). Las condiciones preferidas de tampon incluyen Tris-HCl mM, pH 8,0. El "tiempo suficiente para lograr la ruptura" puede determinarse empleando el ensayo descrito anteriormente en la presente. En una realizacion, dicho "tiempo suficiente para lograr la ruptura" depende del grado de ruptura que debe tener el polipeptido proteoffticamente procesado o una composicion que lo comprende. En una realizacion, el metodo comprende una etapa de incubar el primer y segundo polipeptido durante al menos 30 min, 60 min, 120 min o al menos 240 min. En otra realizacion, el primer y segundo polipeptido se incuban durante hasta 30 min, 60 min, 120 min, 240 min, 480 min o hasta 600 min. En otra realizacion, el metodo comprende una etapa de incubar el primer y segundo polipeptido a 4 °C o a 37 °C. En otra realizacion, el metodo comprende una etapa de incubar hasta 1 h, hasta 2 h, 4 h, 6 h, 10 h o hasta 16 h.

En una realizacion, la cadena polipepffdica de dicho segundo polipeptido comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. En una realizacion mas concreta, la cadena polipepffdica de dicho segundo polipeptido comprende una secuencia seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25, y en la que el segundo polipeptido es roto en una posicion C-terminal con respecto a un resto aminoacido basico dentro de dicha secuencia de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. Dichas secuencias representan secuencias de aminoacidos de sustratos conocidos del polipeptido proteoffticamente activo de la presente descripcion. Tal como se muestra en la presente, dichos sustratos son rotos en una posicion C-terminal con respecto a un resto aminoacido basico contenido en la secuencia; comparese la tabla 1, columna LC y Hn. En una realizacion preferida, dicho segundo polipeptido comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO:4 a 10. En otra realizacion preferida, dicho segundo polipeptido es BoNT/A o uno de sus derivados, incluyendo, por ejemplo, el polipeptido de SEQ ID NO:3 y sus derivados. El termino "derivado", tal como se emplea con respecto a este y otros aspectos de la descripcion, comprende mutaciones de aminoacidos, tales como la adicion, la sustitucion, la delecion o el truncamiento de uno o mas restos aminoacidos.

En una realizacion, el segundo polipeptido comprende un derivado de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25, o de SEQ ID NO:3, en el que dicho derivado contiene una o mas mutaciones puntuales y/o uno o mas restos aminoacidos adicionales. En otra realizacion, dicho derivado tiene hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta 8, hasta 9, hasta 10, hasta 15 mutaciones puntuales. Empleando el ensayo de actividad para determinar la actividad proteasa, tal como se describe en la presente, los expertos en la tecnica pueden determinar si un derivado concreto es procesado por el polipeptido proteoffticamente activo de la presente descripcion. En otra realizacion, el derivado contiene una mutacion puntual que cambia un resto aminoacido basico por un resto aminoacido no basico. En otra realizacion, el derivado presenta al menos 50% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. En otra realizacion, dicho derivado o un polipeptido que comprende el derivado es un sustrato del primer polipeptido y es roto proteoffticamente por el primer polipeptido. Un ejemplo ffpico es un derivado de SEQ ID NO:3 que comprende, por ejemplo, una o mas mutaciones puntuales en la cadena ligera o pesada.

En otra realizacion, dicho segundo polipeptido comprende (a) una secuencia polipepffdica que presenta al menos 30% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ iD NO 3 [(BoNT/A de At CC 3502, n.° de registro de Genbank, AAA23262)]; o (b) una secuencia polipepffdica seleccionada del grupo que consiste en la neurotoxina del tetanos, la protema de la cascada de coagulacion factor X o protrombina (factor II), enzimas digestivas del pancreas, tales como tripsina, quimotripsina, pepsina, papama. Al menos 30% significa al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 85%. En una realizacion concreta, la identidad de secuencia de dicho segundo polipeptido que presenta al menos 50% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO:3 se determina basandose en las posiciones de los aminoacidos 420 a 466 de SEQ ID NO:3, y en otra realizacion, dicha identidad de secuencia se determina basandose en cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. En otras palabras, dicha realizacion se refiere a un segundo polipeptido que comprende una secuencia polipeptidica que presenta, por ejemplo, al menos 30% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptidica que se encuentra entre las posiciones de los aminoacidos 420 a 466 de SEQ ID NO:3 o al menos 30% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptfdica de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. Un polipeptido segun esta definicion puede obtenerse, por ejemplo, de C. botulinum, C. tetani o C. sporogenes. Dicho segundo polipeptido puede ser, por ejemplo, una neurotoxina natural, tal como BoNT/A, B, Cl, D, E, F o G o uno de sus derivados que comprende una o mas mutaciones de aminoacidos, tales como una adicion, una sustitucion, una delecion o un truncamiento de uno o mas restos aminoacidos. Se incluyen, por ejemplo, derivados que carecen, por ejemplo, del dominio H^e de neurotoxina nativo, o partes o derivados de este con otros restos aminoacidos que reemplazan al dominio H^e de neurotoxina, asf como derivados con una cadena ligera adicional u otra molecula de carga proteica condensada N-terminalmente con la cadena ligera de BoNT.

En otra realizacion, el segundo polipeptido puede contener restos aminoacidos adicionales en el N- o C-terminal o en una posicion interna. Los restos aminoacidos adicionales pueden estar flanqueados por uno o mas sitios de ruptura de proteasas. En otra realizacion, la secuencia de aminoacidos adicionales actua como marcador detectable y/o permite la union a un soporte solido. Un ejemplo es un marcador his o un marcador GST. Otro ejemplo es la secuencia de aminoacidos VPPTPGSAWSHPQFEK que contiene el marcador Strep, preferiblemente anadida al C-terminal.

En una realizacion concreta, dicho segundo polipeptido es un polipeptido que comprende una secuencia polipeptfdica como se muestra en GenBank n.° c Bz 04958.1, YP_002805603.1, ZP_ 02994746.1, YP_001788403.1, YP_001782718.1, ZP_02616437.1, ZP_02614241.1, YP_ 001392361.1, YP_001255575.1 o uno de sus homologos que tenga al menos 50% de identidad de secuencia.

En otra realizacion, la actividad biologica de dicho segundo polipeptido es modulada por la ruptura proteolftica. Los expertos en la tecnica saben que la funcion de muchos polipeptidos puede ser modulada mediante el procesamiento proteolftico. "Modular", tal como se emplea en la presente, significa aumentado o disminuido, activado o inactivado. Por ejemplo, la actividad biologica de muchas neurotoxinas clostridiales aumenta o se activa mediante el procesamiento proteolftico de una neurotoxina monocatenaria para producir una neurotoxina bicatenaria, en la que la neurotoxina bicatenaria esta compuesta de una cadena polipeptfdica ligera y una cadena polipeptfdica pesada que estan unidas covalentemente a traves de un puente disulfuro. La actividad biologica de la neurotoxina incluye al menos tres actividades distintas: la primera actividad es una "actividad proteolftica" que reside en la cadena ligera de la neurotoxina y es responsable de hidrolizar el enlace peptfdico de uno o mas polipeptidos implicados en la regulacion de la fusion de membranas celulares. Una segunda actividad es una "actividad de translocacion", que reside en el extremo N-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesada y esta implicada en el transporte de la cadena ligera a traves de la membrana lisosomica y hacia el interior del citoplasma. Una tercera actividad es una "actividad de union al receptor", que reside en el extremo C-terminal de la cadena pesada de la neurotoxina procesada y esta implicada en la union y captacion de la neurotoxina por una celula diana. En un aspecto preferido, la expresion actividad biologica, tal como se emplea en la presente, significa una actividad proteolftica. En un aspecto mas preferido, la expresion significa una mayor actividad proteolftica.

La actividad biologica de la neurotoxina clostridial puede medirse por medio de diversos ensayos, todos los cuales son conocidos por los expertos en la tecnica. Estos ensayos permiten determinar una o mas de las actividades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, el ensayo de DL⁵⁰ (DL: dosis letal) de raton o el ensayo de hemidiafragma del nervio frenico de raton ("mouse phrenic nerve hemidiaphragm", MPN) ex vivo, segun se describe en Pearce et al., 1994 (Pearce irst E.R., MacCallum R.D. (1994), Toxicol. Appl. Pharmacol., 128: 69-77) y Habermann et al., 1980 (Habermann E., Dreyer F., Bigalke H. (1980), Naunyn Schrniedebergs Arch. Pharmacol., 311:33-40) permiten determinar el efecto toxico de un neurotoxico concreto en preparacion para un organismo vivo o una preparacion neuromuscular aislada. Para establecer el efecto toxico en un ensayo de DL⁵⁰, la neurotoxina debe ser biologicamente activa en cada una de dichas tres actividades mencionadas anteriormente. Ademas estan disponibles diversos otros ensayos que permiten, por ejemplo, determinar si una neurotoxina o la cadena ligera de la neurotoxina es proteolfticamente activa. Dichos ensayos se basan, por ejemplo, en poner en contacto BoNT/A con SNAP-25. Como alternativa puede utilizarse un peptido que representa el sitio de union de SNAP-25, en el que el peptido puede marcarse para facilitar la deteccion. En una realizacion preferida, la actividad biologica se determina usando el ensayo de MPN descrito anteriormente en la presente.

En otra realizacion, dicho primer polipeptido es activado mediante el procesamiento proteolftico de un polipeptido precursor inactivo, y dicho polipeptido precursor inactivo comprende una secuencia polipeptfdica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO:2. Esta realizacion se basa en la observacion de que un polipeptido que tiene la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO:2 es proteolfticamente inactivo, mientras que sus truncamientos N-terminales son proteolfticamente activos. La presente descripcion tambien contempla el uso del polipeptido proteolfticamente inactivo en los metodos descritos en la presente. El polipeptido proteolfticamente inactivo descrito en la presente puede activarse, por ejemplo, retirando un fragmento de la region N-terminal o la region N-terminal completa que comprende los restos aminoacidos 1 a 248 de SEQ ID NO:2. En una realizacion, la region N-terminal es retirada por una proteasa, y en otra realizacion, la region N-terminal es retirada por medio de autoproteolisis de SEQ ID NO:2. Un 60% de identidad de secuencia se refiere a un alineamiento de secuencia con NT02CB1447 de longitud completa.

En otra realizacion, el metodo de la presente descripcion para la fabricacion de un polipeptido proteoffticamente procesado comprende la etapa de purificar el segundo polipeptido proteoffticamente procesado o al menos uno o dos de sus productos de la ruptura. La purificacion de B^oN^t /^a expresada en C. botulinum puede realizarse, por ejemplo, como se describe fundamentalmente en la tecnica anterior (DasGupta, 1984, Toxicon, 22, 415; Sathyamoorthy, 1985, J. Biol. Chemistry., 260, 10461). En particular, la purificacion de la neurotoxina puede comprender una o mas etapas de precipitacion y extraccion, una o mas etapas de concentracion y otras etapas cromatograficas distintas. La BoNT/A monocatenaria recombinante y su purificacion se describe en la tecnica anterior (Rummel et al., 2004, Mol. Microbiol., 51:631-643).

En un caso preferido, la cepa de Clostridium es C. botulinum, por ejemplo, productora de BoNT/A, o uno de sus derivados. Para la fermentacion, puede usarse el proceso descrito por DasGupta B. R. et al. en Toxicon, vol. 22, n.° 3, p. 414 a 424, 1984. Por tanto, se anade 0,5% de extracto de levadura y 0,6% de pasta de levadura sometida a autoclave a 2% del medio de N-Z-amina de tipo A, y se ajusta a un pH de 7,2 con la ayuda de NaOH 4 N, y el medio preparado de tal forma despues se sometera a autoclave. A este medio puede anadirse por separado glucosa sometida a autoclave (al 20% en peso por volumen) para alcanzar una concentracion final de glucosa de 0,5% en el medio. La incubacion puede realizarse, por ejemplo, a 37 °C sin agitacion, y la fermentacion puede detenerse, por ejemplo, despues de 96 horas. El alcance de la presente descripcion incluye que, ademas de la fermentacion discontinua descrita anteriormente, tambien pueda realizarse una fermentacion semidiscontinua, una fermentacion discontinua repetida o una fermentacion continua.

Despues de la fermentacion real y de la separacion del medio de fermentacion de las celulas, el medio de fermentacion puede sufrir una primera precipitacion con el objetivo de retirar las protemas grandes. La precipitacion preferiblemente es una precipitacion acida. Las condiciones de reaccion para dicha precipitacion acida son conocidas por los expertos en la tecnica. Generalmente puede emplearse H2SO4 1,5 M para acidificar el sobrenadante hasta un pH de 3,5. La centrifugacion habitualmente se produce durante 20 minutos a 2400 x g a 4 °C. El sedimento obtenido a traves de la centrifugacion puede lavarse con agua, preferiblemente de modo repetido. Despues, el sedimento puede extraerse con tampon citrato de trisodio-acido cftrico 0,1 M, pH 5,5, por ejemplo durante una hora. Despues, puede realizarse otra etapa de centrifugacion, por ejemplo, a 9800 x g durante 20 minutos a 4 °C. El sedimento obtenido de esta manera despues opcionalmente puede extraerse de nuevo como se describio anteriormente. El sobrenadante de la extraccion, y ambos sobrenadantes en el caso de repeticion de la extraccion, despues puede someterse a una precipitacion con sulfato de protamina. La precipitacion puede continuar durante la noche, por ejemplo, a 8 °C. Despues, el precipitado puede centrifugarse, por ejemplo, durante 20 minutos a 4 °C y a 12.000 x g. El sobrenadante de la centrifugacion puede someterse a una precipitacion, tal como una precipitacion con sulfato de amonio, por la cual pueden retirarse otras protemas mas grandes. Despues de la etapa de precipitacion con sulfato de amonio puede anadirse otra etapa de centrifugacion y, despues, el sedimento obtenido de esta manera puede redisolverse y opcionalmente someterse a una dialisis. El extracto que preferiblemente se dializa y centrifuga de nuevo puede someterse a una sucesion de etapas de cromatograffa con el objetivo de purificar la neurotoxina. Cada una de las etapas de cromatograffa sirve para retirar contaminantes, tales como sulfato de protamina, ADN remanente, partes de protemas mas pequenas y protemas de tamano intermedio, asf como las hemaglutininas del complejo de protemas de la neurotoxina botuffnica. Para este fin, pueden usarse una o mas etapas de cromatograffa en un caso preferido. Opcionalmente, el eluato, por ejemplo, de la ultima etapa de cromatograffa, puede filtrarse para reducir los germenes. Opcionalmente, el eluato puede diluirse antes de la filtracion y pueden anadirse adyuvantes adecuados. Durante otras etapas puede realizarse otra filtracion esteril despues de la adicion de los adyuvantes. En una realizacion, la filtracion se realiza en recipientes de reaccion que despues pueden someterse a una etapa de liofilizacion.

La presente descripcion tambien se refiere a una composicion que puede obtenerse mediante el metodo de la presente descripcion para la fabricacion de un polipeptido proteoffticamente procesado. En una realizacion, dicha composicion comprende una mezcla del segundo polipeptido procesado y no procesado, en la que dicha mezcla puede contener menos del 5%, 4%, 3%, 2% o menos del 1% del segundo polipeptido no procesado. En una realizacion de dicha composicion, dicho segundo polipeptido es BoNT o uno de sus derivados. La BoNT puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en BoNT de serotipo A, B, C, D, E, F y G, que incluye uno cualquiera de sus derivados. La composicion puede ser, por ejemplo, una composicion ffquida o solida y puede contener uno o mas vehmulos, adyuvantes y/o excipientes.

En otra realizacion, la presente descripcion tambien se refiere a un metodo para la fabricacion de un medicamento, concretamente, una composicion farmaceutica, que comprende las etapas del metodo mencionado anteriormente y la etapa posterior de formular la neurotoxina bicatenaria purificada como un medicamento. En una realizacion, dicho medicamento comprende una mezcla del segundo polipeptido procesado y no procesado, en la que dicha mezcla contiene menos del 5% del segundo polipeptido no procesado. En casos preferidos, la mezcla contiene menos del 4%, 3%, 2% o menos del 1% del segundo polipeptido no procesado.

La presente descripcion tambien se refiere a diversos usos medicos de los compuestos descritos en la presente. En una realizacion, la presente descripcion se refiere a un polipeptido proteoffticamente activo segun la presente descripcion para su uso como medicamento o en una composicion farmaceutica. En otra realizacion, la presente descripcion se refiere a una composicion segun la presente descripcion para su uso como medicamento o en una composicion farmaceutica. En otra realizacion, la presente descripcion se refiere a un anticuerpo segun la presente descripcion para su uso como medicamento o en una composicion farmaceutica. En otra realizacion, la presente descripcion se refiere a un inhibidor segun la presente descripcion para su uso como medicamento o en una composicion farmaceutica. En particular, la presente descripcion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido de la presente descripcion, el anticuerpo de la presente descripcion, la composicion de la presente descripcion o el inhibidor de la presente descripcion.

El termino "composicion", tal como se emplea en la presente, se refiere a cualquier composicion formulada en forma solida, lfquida, en aerosol (o gaseosa) y similares. Dicha composicion comprende, por ejemplo, un compuesto terapeuticamente activo de la descripcion opcionalmente junto con compuestos auxiliares adecuados, tales como diluyentes o vehmulos u otros ingredientes. En una realizacion, el compuesto terapeuticamente activo es el polipeptido proteoltticamente activo de la presente descripcion. En la presente se describe un compuesto terapeutico que es el segundo polipeptido proteoltticamente procesado, segun se describe en la presente anteriormente, tal como la neurotoxina bicatenaria. En otra descripcion, el compuesto terapeuticamente activo es el anticuerpo de la presente descripcion. En otra realizacion, el compuesto terapeuticamente activo es el inhibidor del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion.

En este contexto, en la presente descripcion se distingue entre compuestos auxiliares, es decir, compuestos que no contribuyen a los efectos suscitados por el compuesto de la presente descripcion tras la aplicacion de la composicion para su objetivo deseado, y otros ingredientes, concretamente compuestos que contribuyen con otro efecto o que modulan el efecto del compuesto de la presente descripcion. Los diluyentes y/o vehmulos adecuados dependen del objetivo para el cual se va a usar la composicion y los otros ingredientes. Los expertos en la tecnica pueden determinar sin mas dichos diluyentes y/o vehmulos adecuados.

El vehmulo o vehmulos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulacion y no ser perjudiciales para el receptor de esta. El vehmulo farmaceutico empleado puede incluir un solido, un gel, o un lfquido. Los ejemplos de vehmulos solidos son lactosa, sulfato de calcio dihidratado, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arabiga, estearato de magnesio, acido estearico y similares. Los ejemplos de vehmulos lfquidos son disolucion salina tamponada con fosfato, jarabe, aceite, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes y similares. De forma similar, el vehmulo o diluyente puede incluir un material de retraso en el tiempo muy conocido en la tecnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, por sf solos o con una cera. Dichos vehmulos adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros muy conocidos en la tecnica; vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania.

El diluyente o diluyentes se seleccionan para que no afecten a la actividad biologica de la combinacion. Los ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, disolucion salina fisiologica, disoluciones de Ringer, disolucion de dextrosa y disolucion de Hank. Ademas, la composicion o formulacion farmaceutica tambien puede incluir otros vehmulos, adyuvantes, o estabilizantes no toxicos, no terapeuticos, no inmunogenicos y similares.

En una realizacion, una composicion farmaceutica, tal como se usa en la presente, comprende la neurotoxina biologicamente activa que puede obtenerse mediante el metodo de la presente descripcion, y opcionalmente uno o mas vehmulos farmaceuticamente aceptables. La neurotoxina activa puede estar presente en forma lfquida o liofilizada. En una realizacion, dicho compuesto puede estar presente junto con glicerol, estabilizantes de protemas (por ejemplo, albumina de suero humana (HS)) o estabilizantes que no son protemas, tales como polivinilpirrolidona o acido hialuronico. La composicion farmaceutica, en una realizacion, se administra por via topica. La administracion de farmacos que se emplea de modo convencional es la administracion intramuscular, subcutanea (cerca de glandulas). Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y del modo de accion de un compuesto, la composicion farmaceutica puede administrarse tambien por otras vfas. El polipeptido de neurotoxina bicatenario es el ingrediente activo de la composicion y, en una realizacion, se administra en formas de dosificacion convencionales preparadas combinando el farmaco con vehmulos farmaceuticos convencionales segun procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden implicar mezclar, granular y comprimir, o disolver los ingredientes segun sea apropiado para la preparacion deseada. Se apreciara que la forma y el caracter del vehmulo o diluyente farmaceuticamente aceptable vienen dictados por la cantidad de ingrediente activo que se va a combinar, por la via de administracion y por otras variables muy conocidas.

Una dosis terapeuticamente eficaz se refiere a una cantidad del compuesto, la neurotoxina, que se va a usar en una composicion farmaceutica de la presente descripcion que previene, mejora o trata los smtomas que acompanan a una enfermedad o un trastorno indicado en esta memoria descriptiva. La eficacia terapeutica y la toxicidad del compuesto pueden determinarse mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentacion, por ejemplo, DE⁵⁰ (la dosis terapeuticamente eficaz en 50% de la poblacion) y DL⁵⁰ (la dosis letal para 50% de la poblacion). La proporcion de dosis entre los efectos terapeuticos y toxicos es el mdice terapeutico, y puede expresarse como la proporcion DL⁵⁰/DE^g.

El regimen de dosificacion sera determinado por el medico encargado y por otros factores clmicos. Tal como se conoce en la tecnica medica, las dosificaciones para cualquier paciente concreto dependen de muchos factores, que incluyen el tamano del paciente, la superficie espedfica del cuerpo, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la via de administracion, la salud general y otros farmacos que se esten administrando al mismo tiempo. El avance puede controlarse mediante una evaluacion periodica. Las composiciones y formulaciones farmaceuticas mencionadas en la presente se administran al menos una vez para tratar o mejorar o prevenir una enfermedad o un trastorno indicado en esta memoria descriptiva. Sin embargo, dichas composiciones farmaceuticas pueden administrarse mas de una vez.

En otra realizacion de la descripcion, la composicion mencionada anteriormente es un medicamento o una composicion cosmetica. En una realizacion, dicho medicamento que comprende la neurotoxina biologicamente activa puede usarse para la prevencion y/o el tratamiento de al menos una de la siguientes enfermedades y trastornos: trastornos de la fuerza de los musculos voluntarios, distoma focal, que incluye distoma cervical, craneal, y blefaroespasmo esencial benigno, espasmo hemifacial, y espasticidad focal, trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis, y correccion de arrugas cosmetica, en otro aspecto tambien el blefaroespasmo, distoma oromandibular, del tipo de apertura de mandfbula, del tipo de cierre de mandfbula, bruxismo, smdrome de Meige, distoma lingual, apraxia del parpado, distoma cervical de apertura, antecollis, retrocollis, laterocollis, tortmolis, distoma farmgea, distoma larmgea, disfoma espasmodica/de tipo abductor, disnea espasmodica, distoma de extremidades, distoma del brazo, distoma espedfica de tareas, calambre del escritor, calambre del musico, calambre del golfista, distoma de pierna, abduccion del muslo, abduccion del muslo y flexion de la rodilla, extension de la rodilla, flexion del tobillo, extension del tobillo, equinovarus, distoma de deformidad del pie, dedo estriatal, flexion del dedo del pie, extension del dedo del pie, distoma axial, smdrome de Pisa, distoma de la bailarina del vientre, distoma segmental, hemidistoma, distoma generalizada, distoma en el smdrome de Lubag, distoma en la degeneracion corticobasal, distoma tardfa, distoma en la ataxia espinocerebelar, distoma en la enfermedad de Parkinson, distoma en la enfermedad de Huntington, distoma en la enfermedad de Hallervorden-Spatz, disquinesias inducidas por DOPA/distoma inducida por DOPA, disquinesias tardfas/distoma tardfa, disquinesias/distoma parcwsmicas, mioclonus palatal inducido por la accion quinesiogenica no quinesiogenica, mioclonia mioquimia, rigidez, espasmos musculares benignos, temblor de la barbilla hereditario, actividad paradojica del musculo de la mandfbula, espasmos hemimasticatorios, miopatfa branquial hipertrofica, hipertrofia maseterica, hipertrofia anterior tibial, nistagmo, oscilopsia, paralisis supranuclear progresiva, epilepsia, epilepsia partialis continua, planificacion de una operacion de tortmolis espasmodica, paralisis de las cuerdas vocales abductoras, disfoma mutacional recalcitrante, disfuncion del esfmter esofagico superior, granuloma de pliegue vocal, tartamudeo del smdrome de Gilles de la Tourette, mioclonus del ofdo medio, cierre protector de la laringe, postlaringectoirna, fallos del habla, ptosis protectora, entropion de disfuncion del esfmter de Odii, pseudoacalasia, no acalsia, trastornos motores esofagicos, vaginismo, temblor de inmovilizacion postoperatorio, disfuncion de la vejiga, disinergfa del esfmter detrusor, espasmo del esfmter y vejiga, espasmo hemifacial, disquinesias de reinervacion, uso cosmetico para las patas de gallo, asimetnas faciales de fruncimiento de ceno, barbilla rocosa, smdrome de la persona ngida, hiperplasia de prostata por tetanos, adipositas, tratamiento del estrabismo por paralisis cerebral infantil, paralttico mixto concomitante, despues de cirugfa de desprendimiento de retina, despues de cirugfa de cataratas, en estrabismo miosftico por afaquia, estrabismo miopatico, desviacion vertical disociada, como adjunto a la cirugfa por estrabismo, esotropia, exotropfa, acalasia, fisuras anales, hiperactividad de las glandulas exocrinas, smdrome de Frey, smdrome de las lagrimas de cocodrilo, hiperhidrosis, rinorrea plantar, palmar y axilar, hipersalivacion relativa en el ictus, en la enfermedad de Parkinson, en la esclerosis amiotrofica lateral, trastornos espasticos, en procesos autoinmunologicos de la encefalitis y mielitis, esclerosis multiple, mielitis transversal, smdrome de Devic, infecciones vmicas, infecciones bacterianas, infecciones parasitarias, infecciones fungicas, en la paraparesis espastica hereditaria, smdrome postapopletico, infarto hemisferico, infarto del tronco cerebral, infarto de la medula espinal, en traumatismos del sistema nervioso central, lesiones hemisfericas, lesiones del tronco cerebral, lesiones de la medula espinal, en hemorragias del sistema nervioso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnoidea, hemorragia subdural, hemorragia intraespinal, en neoplasias, tumores hemisfericos, tumores del tronco cerebral, tumores de la medula espinal, ronquidos (documento WO 2000/033863). Para los detalles y los smtomas, vease, por ejemplo, Jost, 2007, Drugs, 67(5), 669, o Dressler, 2000, en Botulinum Toxin Therapy, Thieme Verlag, Stuttgart, Nueva York.

En otra realizacion de la descripcion, la composicion es una composicion cosmetica que puede formularse como se ha descrito anteriormente para una composicion farmaceutica. De forma similar, para una composicion cosmetica se contempla que el compuesto de la presente descripcion, en una realizacion, se use en forma sustancialmente pura. Las composiciones cosmeticas, en otra realizacion, se aplicaran por via intramuscular. En otra realizacion de la descripcion, las composiciones cosmeticas que comprenden la neurotoxina pueden formularse como una disolucion antiarrugas.

En otra realizacion, la composicion farmaceutica comprende el anticuerpo o el inhibidor de la presente descripcion. Puesto que el polipeptido de la presente descripcion es responsable de la activacion de neurotoxinas clostridiales, el anticuerpo sera util para reducir el efecto toxico observado durante la infeccion con clostridios. Por tanto, el anticuerpo de la presente descripcion puede usarse, en un aspecto, para tratar una infeccion por clostridios, que incluyen Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium baratii, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium acetobutylicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi y Clostridium oedematiens. Ademas, el anticuerpo de la presente descripcion puede usarse, en otra indicacion, para el tratamiento de smtomas asociados con dicha infeccion. Ademas, dicho anticuerpo puede usarse en el tratamiento de un trastorno o un smtoma asociado con el trastorno, en el que el trastorno se selecciona de botulismo, tetanos, colitis pseudomembranosa, gangrena, intoxicacion alimentaria y similares.

En otro aspecto, la composicion farmaceutica comprende el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion. Dicha composicion farmaceutica puede usarse, en un aspecto, para romper proteolfticamente polipeptidos implicados en la coaglutinacion, en particular para tratar pacientes con hipocoaglutinacion. En otra realizacion, la composicion farmaceutica puede usarse como fibrinolftico, en particular para tratar pacientes con infarto de miocardio, embolia pulmonar, tromboembolia venosa profunda, concretamente para retirar coagulos sangumeos. Tambien se contempla el uso de la composicion farmaceutica para el tratamiento del ictus. Ademas, en otras realizaciones, la composicion farmaceutica puede usarse en el tratamiento de la insuficiencia pancreatica exocrina para reemplazar a la tripsina, la quimotripsina, la pepsina. Ademas, en otras realizaciones, la composicion farmaceutica puede usarse en el tratamiento de pacientes afectados por reacciones inflamatorias, en el tratamiento de pacientes con cancer, en particular para romper proteolfticamente antigenos tumorales expuestos sobre la superficie. Ademas, en otra realizacion, la composicion farmaceutica puede usarse en el tratamiento del papiloma. La presente descripcion tambien se refiere a un metodo para seleccionar un inhibidor del polipeptido proteolfticamente activo de la invencion, que comprende la etapa de (a) poner en contacto el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion con un sustrato conocido y, opcionalmente, con un inhibidor putativo; y (b) determinar el efecto del inhibidor putativo sobre la conversion del sustrato en el producto roto, en el que una reduccion en la cantidad de producto roto es indicativa del efecto inhibitorio del inhibidor putativo. En una realizacion, el inhibidor putativo es un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID nO:4 a 25, en la que al menos un aminoacido basico de dicha secuencia de aminoacidos esta reemplazado por un aminoacido no basico. En otra realizacion, dicho peptido comprende una o mas modificaciones qrnmicas. En otra realizacion, el inhibidor es un peptidomimetico de dicho peptido. En otra realizacion, el inhibidor putativo es parte de una micromatriz de compuestos qrnmicos, es decir, una coleccion de compuestos qrnmicos organicos. En otra realizacion, el inhibidor es el anticuerpo de la presente descripcion. Este metodo es util para identificar compuestos capaces de inhibir el polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion. Una seleccion inicial puede basarse, por ejemplo, en un peptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25. Los peptidos capaces de inhibir el polipeptido de la presente descripcion pueden modificarse para aumentar la inhibicion. Las modificaciones incluyen la sustitucion de aminoacidos o modificaciones qrnmicas. Generalmente, este metodo se realiza poniendo en contacto el polipeptido de la presente descripcion con un sustrato conocido en presencia y ausencia de un inhibidor putativo (etapa (a) del metodo) y comparando el efecto del inhibidor putativo sobre la conversion del sustrato en el producto de la ruptura. Una reduccion en la tasa de conversion en presencia del inhibidor putativo es indicativa de un efecto inhibitorio. La presente descripcion tambien se refiere a un inhibidor del polipeptido proteolfticamente activo de la presente descripcion, en el que dicho inhibidor (a) es un inhibidor que comprende una secuencia de aminoacidos segun se muestra en cualquiera de SEQ ID NO:4 a 25, en la que al menos un aminoacido basico contenido en ella esta reemplazado por un aminoacido no basico; o (b) es el anticuerpo de la presente descripcion.

Las figuras muestran:

Figura 1: Ensayo de la actividad de fracciones recolectadas de HiPrep 16/10 Q FF. Se analizaron 5 |il de fracciones recolectadas del ensayo de HiPrep 16/10 Q FF para la actividad enzimatica incubando 2 |ig de scBoNTA (carril 2) durante 1 h a 37 °C y despues con SDS al 10%-PAGE. Carril 1: marcador de peso molecular bajo ("low molecular weight marker", LMW): 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa.

Figura 2: Analisis de las fracciones recolectadas de SEC (HiLoad 16/60 Superdex 75) con respecto al contenido en nBH con un peso molecular de aproximadamente 37,3 kDa mediante SDS al 12,5%-PAGE. Las fracciones 9 a 11 contiene la mayona de nBH (carril 1: LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18,4 kDa, 14,4 kDa).

Figura 3: Analisis de SDS al 12,5%-PAGE para la determinacion de la pureza y la concentracion de protemas de tres lotes de purificacion de nBH. Carril 1, LMW (116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 18,4 kDa, 14,4 kDa); carril 2, nBH lote TE311206 (192 ng/|il de NT02CB1446/CBO1444 madurado, aminoacidos 254-594 de n.° de registro de Genbank CAL82987.1, PM: 38,6 kDa); carril 3, nBH lote TIK301009 (130 ng/|il de NT02CB1447/CBO1445 madurado, SEQ ID NO:1, aminoacidos 249-581 de n.° de registro de Genbank CAL82988.1, PM: 37,3 kDa); carril 4, nBH lote TIK280509 (114 ng/|il de NT02CB1447/CBO1445 madurado, SEQ ID NO:1, aminoacidos 249-581 de n.° de registro de Genbank CAL82988.1, PM: 37,3 kDa).

Figura 4: Informe del analisis de espectros ESI-MS/MS. Se identifico la banda de protemas de 38,6 kDa de nBH lote TE311206 como NT02CB1446/CBO1444 con una puntuacion de Mascot de 725 y una cobertura de secuencia de MS/MS del peptido del 29,6% a lo largo del marco de lectura abierto ("open reading frame", ORF) entero. No se identificaron peptidos (recuadro gris, peptido identificado con MS; cuadrados rojos, y-/b-ion de aminoacido del peptido identificado despues de la descomposicion de MS/MS) derivados de los 253 aminoacidos N-terminales. El analisis de MS/MS del lote TE311206 mostro una cobertura de secuencia del 52% segun los 254-594 aminoacidos C-terminales que forman la nBH.

Figura 5: Informe del analisis de espectros ESI-MS/MS. Se identifico la banda de protemas de 37,3 kDa de nBH lote TIK301009 como NT02CB1447/CBO1445 con una puntuacion de Mascot de 555 y una cobertura de secuencia de MS/MS del 28,4% a lo largo del marco de lectura abierto (ORF) entero. Excepto uno, todos los peptidos identificados (recuadro gris, peptido identificado con MS; cuadrados rojos, y-/b-ion de aminoacido del peptido identificado despues de la descomposicion de MS/MS) se derivan de los 333 aminoacidos C-terminales. El analisis de MS/MS del lote TIK301009 mostro una cobertura de secuencia del 49,5% segun los 249-581 aminoacidos C-terminales que forman la nBH.

Figura 6: Comparacion de la actividad proteolftica dependiente de la concentracion de la nBH derivada de tres lotes de purificacion. A. SDS al 12,5%-PAGE del ensayo de actividad que analiza nBH derivado de los lotes TIK301009, TIK280509 y TE311206 usando las siguientes diluciones de la nBH concentrada: 1:10, 1:30, 1:100,1:300, 1:1000. El ensayo se realizo incubando 1 |ig de scBoNT/A y 2 |il de dH2O y 1 |il de la nBH diluido de modo correspondiente durante 60 min a 37 °C. Para el analisis de SDS-PAGE, se anadieron 3 |il de 4x tampon de SDS Laemmli reductor hasta un volumen final de 10 |il. La scBoNT/A de 150 kDa se rompio en una cadena pesada de 100 kDa y una cadena ligera de 50 kDa. B. Se cuantifico la densidad optica de las bandas de protemas de cadena pesada, cadena ligera y scBoNT/A, y la suma de las bandas de producto de cadena ligera y pesada se dividio entre la suma de la bandas de protemas de LC, HC y scBoNT/A. Una mayor dilucion del primer polipeptido disminuye la tasa de ruptura. La actividad proteolftica especftica de los tres lotes diferentes es casi identica.

Figura 7: Ruptura dependiente del tiempo de scBoNT/A de tipo salvaje y mutantes que contienen un bucle modificado por nBH. A. Modificacion de la secuencia de bucle. En scBoNTAS Throm se retiraron todos los restos lisina y se inserto la secuencia de reconocimiento de trombina LVPRGS, mientras que en scBoNT Res, el bucle carece de aminoacidos basicos. El acortamiento del bucle hasta ocho restos pequenos o cinco aminoacidos con cadenas laterales voluminosas produce scBoNTAS (GGSG)2 y scBoNTAS FQWYI, respectivamente. En scBoNTAS CGS-C, el bucle completo se deleciona, y las cistemas formadoras de puentes disulfuro se reemplazan por glicina y serina. B. Analisis de SDS-PAGE de la ruptura dependiente del tiempo de scBoNT/A de tipo salvaje y mutantes. C. La scBoNTAS de tipo salvaje es activada por nBH de una manera dependiente del tiempo para producir una cadena ligera y una cadena pesada dentro de 120 min. La falta de lisinas y la insercion de un unico resto arginina prolonga la ruptura del bucle (scBoNTAS Throm). Un bucle que carece de restos basicos aun puede romperse (scBoNTAS Res). El acortamiento del bucle a un peptido 8-mero, la introduccion de cinco aminoacidos con cadenas laterales voluminosas o la delecion del bucle entero produce una scBoNT/A que no puede romperse.

Figura 8: Analisis de MS/MS de los productos de la ruptura de 50 kDa y 100 kDa tras la digestion de scBoNT/A con nBH. A. Analisis del producto de la ruptura de 50 kDa que se identifico como la cadena ligera de BoNT/A con una puntuacion de Mascot de 1460. El peptido atribuido como el mas C-terminal cubre los aminoacidos G433 a K438 que se corresponden con la region C-terminal fisiologicamente observada de BoNT/A LC. B. Analisis del producto de la ruptura de 100 kDa que se identifico como la cadena pesada de BoNT/A con una puntuacion de Mascot de 96. El peptido atribuido como el mas N-terminal cubre los aminoacidos A449 a K456 que se corresponden con la region N-terminal fisiologicamente observada de BoNT/A HC.

Figura 9: A. El contenido en protemas (mg/ml) de anti-nBH-IgY de otros tres conjuntos se analizo mediante SDS al 12,5%-PAGE. B. ELISA: Se revistieron placas de microtitulacion Nunc Maxisorp F96 con nBH de diversos lotes (500 ng/ml) en PBS durante la noche a 4 °C y despues se bloquearon durante 1 h con tampon de bloqueo de PBS que contema Tween-20 al 0,1% y leche desnatada al 2%. Despues de lavar se anadio una dilucion de IgY de cada conjunto (10 |ig/ml en tampon de bloqueo) durante 1 h y se detecto usando anti-IgY de pollo de burro marcada con biotina y estreptavidina-peroxidasa de rabano (ambos de Dianova, Hamburgo, Alemania) y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Sigma).

Figura 10: A. Expresion recombinante y aislamiento de BH 1-581 inactivo (63 kDa) mediante Talon IMAC. Analisis de SDS al 10%-PAGE de fracciones de Talon IMAC (LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa; SS34, lisado transparente; TD, corriente; W, fraccion de lavado; E1-E7, fracciones eluidas con imidazol 1 a 7). B. No se observa endoproteolisis de scBoNT/A para producir LC (50 kDa) y HC (100 kDa) con iBH recombinante (SEQ ID NO:2; "E"; 63 kDa) a 37 °C despues de 1 h (carril 6) (LMW: 116 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25 kDa).

Figura 11: Uso de BoNTHidrolasa activa purificada (nBH) para obtener el polipeptido proteolfticamente procesado. A. Se incubaron 200 |ig de scBoNT/A purificada recombinante con 350 ng de BoNTHidrolasa activa purificada durante 12 min a 37 °C. Para detener la reaccion se retira la nBH mediante SEC (columna Superdex 200 10/300 GL, tampon: NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de ruptura se analiza mediante SDS al 10%-PAGE. B. La fraccion 1 (1800 ml) que contiene aproximadamente 40% de BoNT/A procesada se incuba con 350 ng de BoNTHidrolasa activa purificada durante 15 min a 37 °C y se concentra hasta 300 |il mediante ultrafiltracion. Para finalmente detener la reaccion se retira la nBH mediante SEC (columna Superdex 20010/300 GL, tampon: NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de ruptura se analiza mediante SDS al 10%-PAGE. C. Las fracciones 1 y 2 (1800 |il) que contienen aproximadamente 80% de BoNT/A procesada se combinan y se incuban con 120 ng de BoNTHidrolasa activa purificada durante 25 min a 37 °C y se concentran hasta 300 |il mediante ultrafiltracion. Para finalmente detener la reaccion se retira la nBH mediante SEC (columna Superdex 20010/300 GL, tampon: NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, volumen de muestra = 0,3 ml, caudal = 0,25 ml/min) y la cantidad de ruptura se analiza mediante SDS al 10%-PAGE. Se obtiene >95% de BoNT/A procesada (SEQ ID NO:3).

El listado de secuencias muestra:

SEQ ID NO:1: Polipeptido proteoltticamente activo derivado de Clostridium botulinum cepa ATCC 3502, n.° de registro de GenBank: "CAL82988.1", que carece de los 248 restos aminoacidos N-terminales

SEQ ID NO:2: Polipeptido proteoltticamente inactivo derivado de Clostridium botulinum cepa ATCC 3502, n.° de registro de GenBank: "CAL82988.1"

SEQ ID NO:3: BoNT/A de ATCC 3502, n.° de registro de Genbank "AAA23262"

SEQ ID NO:4: Bucle de BoNT/A1

SEQ ID NO:5: Bucle de BoNT/A2/A6

SEQ ID NO:6: Bucle de BoNT/A3

SEQ ID NO:7: Bucle de BoNT/A3

SEQ ID NO:8: Bucle de BoNT/A4

SEQ ID NO:9: Bucle de BoNT/A5

SEQ ID NO:10: Bucle de BoNT/A7

SEQ ID NO:11: Bucle de BoNT/B1/B4bv/B6

SEQ ID NO:12: Bucle de BoNT/B2/B3

SEQ ID NO:13: Bucle de BoNT/B5np

SEQ ID NO:14: Bucle de BoNT/C/CD

SEQ ID NO:15: Bucle de BoNT/D

SEQ ID NO:16: Bucle de BoNT/DC

SEQ ID NO:17: Bucle de BoNT/E1-E5

SEQ ID NO:18: Bucle de BoNT/E6

SEQ ID NO:19: Bucle de BoNT/F1/F6

SEQ ID NO:20: Bucle de BoNT/F2/F3

SEQ ID NO:21: Bucle de BoNT/F4

SEQ ID NO:22: Bucle de BoNT/F5

SEQ ID NO:23: Bucle de BoNT/F7

SEQ ID NO:24: Bucle de BoNT/G

SEQ ID NO:25: Bucle de TeNT

SEQ ID NO:26: Secuencia de acido nucleico que codifica SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:27: Secuencia de acido nucleico que codifica SEQ ID NO:2

Los siguientes ejemplos ilustran la descripcion y no deben considerarse, de ninguna manera, limitantes de su alcance.

Ejemplos

Ejemplo 1: Purificacion y caracterizacion de la BoNTHidrolasa nativa (nBH), que rompe espedficamente la BoNT/A monocatenaria para producir su forma bicatenaria activa

(1) Sistema de lectura/ensayo de actividad: Para detectar espedficamente y purificar una neurotoxina botulmica A hidrolizante con actividad enzimatica (BoNT/A) en la cadena ligera de 50 kDa (LC) y la cadena pesada de 100 kDa (HC) en sobrenadantes de cultivo de C. botulinum y entre etapas cromatograficas, se expreso la BoNT/A de 150 kDa como un polipeptido monocatenario ("single chain", sc) en E. coli. La incubacion de la scBoNT/A recombinante con la actividad enzimatica apropiada (nBH) debena producir una LC de 50 kDa y una HC de 100 kDa HC que se visualizan mediante SDS al 10-13%-pAg E reductora.

(2) Expresion de proteasa clostridial: Se inoculo una unica colonia de C. botulinum cepa ATCC 3502 en 100 ml de medio de infusion de cerebro y corazon ("brain heart infusion", BHI) y el cultivo se incubo durante la noche a 37 °C bajo condiciones anaerobias. Se inocularon 10 ml del cultivo cultivado durante la noche en 1 l de medio BHI y se incubo de modo anaerobio durante 48-72 h.

(3) Precipitacion con sulfato de amonio: El sobrenadante del cultivo de 1 l se recolecto mediante centrifugacion (4°C, 6500 x g, 25 min). Se anadio sulfato de amonio hasta una concentracion final del 85% (en este caso 575 g), la suspension se agito durante 6 horas a 4 °C y despues se centrifugo (4 °C, 6500 x g, 30 min). El precipitado de sulfato de amonio sedimentado se disolvio en un volumen pequeno (en este caso 5 ml) de NaP 50 mM, pH 7,5, y se dializo contra NaP 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Por ultimo, el dializado se centrifugo (4 °C, 40000 x g, 60 min) y el sobrenadante se uso para la IEC.

(4) Cromatograffa de intercambio ionico ("ion exchange chromatography", IEC, columna HiPrep 16/10 Q FF): El sobrenadante de (3) (figura 1, carril 3) se aplico a una columna de intercambio anionico HiPrep 16/10 Q FF equilibrada y ensayada con un tampon que contema NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. El ensayo se realizo con un caudal de 1 ml/min. Se realizo un ensayo de actividad incubando 5 |il de cada fraccion con 2 |ig de scBoNTA durante 1 h a 37 °C y un posterior analisis con SDS-PAGE (figura 1). Las fracciones 6-24 se reunieron y su volumen se concentro hasta 3,5 ml usando ultrafiltracion (Amicon-Ultra, valor de corte de peso molecular 10.000).

(5) Cromatograffa de exclusion molecular ("size exclusion chromatography", SEC, HiLoad 16/60 Superdex 200): Despues, la disolucion de protema concentrada de (4) se cargo sobre una columna HiLoad 16/60 Superdex 200, equilibrada con NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. La separacion se realizo con un caudal de 1 ml/min. Las fracciones con un volumen de retencion entre 80 ml y 100 ml se analizaron empleando el ensayo de actividad (1) y se reunieron las fracciones apropiadas que conteman la actividad enzimatica (nBH) (aproximadamente 10 ml) y se concentraron hasta 3 ml mediante ultrafiltracion. Despues se anadio sulfato de amonio hasta una concentracion final del 12,5% = 500 mM (+ 0,2 g).

(6) Cromatograffa de interaccion hidrofoba ("hydrophobic interaction chromatography", HIC, HiTrap Phenyl Sepharose): La nBH se unio a Phenyl Sepharose en tampon A (NaP 50 mM, pH 7,5, sulfato de amonio 500 mM). La nBH unida eluyo reduciendo la cantidad de sulfato de amonio por medio de un gradiente lineal creciente con tampon B (NaP 50 mM, pH 7,5) a un caudal de 1 ml/min. Todas las fracciones que conteman protemas se analizaron utilizando el ensayo de actividad (1) y las fracciones apropiadas se reunieron y se concentraron mediante ultrafiltracion hasta 3,5 ml. El tampon de la disolucion se ajusto a NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM.

(7) SEC (HiLoad 16/60 Superdex 75): Por ultimo, la nBH se purifico mediante SEC usando la columna HiLoad 16/60 Superdex 75 a NaP 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y un caudal de 1 ml/min. Las fracciones con un volumen de retencion entre 70 ml y 80 ml se analizaron mediante SDS al 12,5%-PAGE (figura 2) y se reunieron las fracciones 8­ 12 que conteman la nBH que migra a aproximadamente 37,3 kDa (aproximadamente 10 ml) y se concentraron hasta 1 ml mediante ultrafiltracion.

(8) La protema mas prominente que migra a aproximadamente 37,3 kDa (nBH) se analizo mediante secuenciacion pepffdica N-terminal segun el protocolo de degradacion de Edman. La secuencia del peptido identificado es V Q G Q s V K G V G y se corresponde con los primeros diez restos de SEQ ID NO:1.

(9) Se aislaron de modo reproducible dos lotes de nBH (NT02CB1447, 37,3 kDa, figura 3, carril 3: TIK301009, carril 4: TIK280509) segun el procedimiento descrito anteriormente. Ciertas modificaciones del procedimiento de aislacion producen la nBH de isoforma NT02CB1446 (38,6 kDa, figura 3, carril 2, lote TE311206): (i) crecimiento del cultivo de C. botulinum : durante 18 h en lugar de 48 a 72 h; (ii) variacion de las etapas cromatograficas: IEC -> SEC Superdex 75 -> HIC Phenyl Sepharose en lugar de IEC-> SEC Superdex 200 -> HiC Phenyl Sepharose -> SEC Superdex 75. Ejemplo 2: Identificacion de la secuencia de nBH a partir de C. botulinum mediante espectrometna de masas (MS) (1) Digestion tnptica: Las bandas de protemas que migran a aproximadamente 38 kDa (nBH) en SDS-PAGE se retiraron para la digestion tnptica y se destineron mediante una agitacion suave en NH⁴HCO³50 mM, acetonitrilo al 50% durante 30 min a 37 °C. El destenido se repitio hasta que las manchas de gel fueron transparentes. Se anadio acetonitrilo (al 100%) y se retiro despues de 3 min. Posteriormente, las manchas se secaron en un sistema al vacm rapido (Eppendorf, Alemania). Se anadio tripsina (10 ng/|il) en NH⁴HCO³ 50 mM y se incubo en hielo durante 1 h. Despues se retiro el resto de la disolucion de tripsina, se anadio un volumen pequeno de NH⁴HCO³50 mM y se llevo a cabo la digestion a 37 °C durante la noche. El sobrenadante se recogio y los trozos de gel se extrajeron usando TFA al 5%, acetonitrilo al 10% dos veces. Todos los fluidos se reunieron, se secaron al vacfo rapido y los peptidos extrafdos se conservaron a 4 °C.

(2) MS de tiempo de vuelo de ionizacion de desorcion de laser asistida por matriz ("matrix assisted laser desorption ionisation time of flight", MALDI-TOF/TOF): Las muestras se analizaron en un espectrometro de masas MALDI-TOF/TOF (Ultraflexl Bruker Daltonik GmbH) en modo lineal con un voltaje de aceleracion de 25 kV. Las masas se detectaron desde 700 m/z hasta 4.500 m/z. Las muestras (2 |il) se cocristalizaron con 2 |il de disolucion de acido sinapmico que contema acetonitrilo al 50% y acido trifluoroacetico (TFA) al 0,2% directamente sobre una placa diana de acero inoxidable MALDI. Se recogieron 500 disparos de laser para cada muestra.

(3) Separacion de los peptidos mediante cromatograffa en fase inversa: La separacion de los peptidos se realizo mediante una cromatograffa en fase inversa usando un sistema nano-HPLC (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) que consiste en un automuestreador y una bomba de gradiente. La muestra se disolvio en tampon A (acetonitrilo al 5%, acido formico al 0,1%) y una parte affcuota de hasta 10 |il se inyecto en una columna C18 (Zorbax SB-C18, 5 |im, 300 A, diametro interno de 0,5 mm, longitud 15 cm) a un caudal de 5 |il/min. Despues de cargar, la columna se lavo durante 15 min con tampon A y los peptidos eluyeron usando un gradiente de eluyente A y eluyente B (acetonitrilo al 70% (en v/v) en acido formico al 0,1% (en v/v)) desde 0% al 100% de eluyente B durante 75 min.

(4) Interfase de ionizacion de electropulverizacion ("electrospray ionisation", ESI)-espectrometna de masas de trampa de iones: La salida de la HPLC se conecto directamente con la fuente de nanoEsi de un espectrometro de masas de trampa de iones y se empleo la pulverizacion de ffquidos con envuelta coaxial Agilent (Agilent Technologies). La salida del capilar se sostema por medio de una aguja de acero circundante y sobresaffa de esta de 0,1 a 0,2 mm. El pulverizado se estabilizo mediante N2 como un gas nebulizador (5 l/min). El voltaje de ionizacion se ajusto a 4.500 V y se aplico gas seco a 34,47 kPa (5 psi) y 250 °C. Los espectros se recogieron con un espectrometro de masas de trampa de iones Esquire3000+ (Bruker Daltonik) a una velocidad de barrido de 13.000 m/z por segundo. Empleando ESI en modo positivo, se adquirieron espectros de masas desde 50 a 1600 m/z en el modo de barrido y el cambio entre analisis de MS y MS/m S dependiente de los datos. Para aumentar la calidad de los espectros de M^s/MS se seleccionaron solo dos iones precursores de un espectro para el analisis de MS/MS y la exclusion activa se ajusto a 2 min para excluir los iones precursores que ya habfan sido medidos.

(4) Procesamiento de los datos: El procesamiento de los datos se realizo con los paquetes informaticos Data Analysis (version 3.0) y BioTools (version 3.0) (Bruker Daltonik). La identificacion de las protemas se realizo empleando el programa informatico MASCOT (version 2.1) y la base de datos MSDB (Matrix Science, Londres, Reino Unido).

(5) Resultados:

Tabla 2 - nBH identificada mediante MS

La banda de protemas de 38,6 kDa del carril 2 (nBH lote TE311206) se identifico como NT02CB1446/CBO1444 con una puntuacion de Mascot de 725 y una cobertura de secuencia de MS/MS del peptido del 29,6% a lo largo del marco de lectura abierto (ORF) entero. No se identificaron peptidos derivados de los 253 aminoacidos N-terminales (figura 4). El analisis de M^s/MS del lote TE311206 mostro una cobertura de secuencia del 52% segun los 254-594 aminoacidos C-terminales que forman la nBH.

Las bandas de protemas de 37,3 kDa del carril 3 (nBH lote TIK301009) y carril 4 (nBH lote TIK280509) se identificaron como NT02CB1447/CBO1445 con una puntuacion de Mascot de 555 y 609, respectivamente. Excepto uno, todos los peptidos identificados se derivan de los 333 aminoacidos C-terminales (figura 5). El analisis de MS/MS del lote TIK301009 mostro una cobertura de secuencia del 49,5% segun los 249-581 aminoacidos C-terminales que forman la nBH.

Ejemplo 3: Caracterizacion de la especificidad enzimatica de nBH

(1) Se comparo la actividad proteofftica de nBH dependiente de la concentracion derivada de tres lotes de purificacion (figura 6). Un analisis de la actividad que analiza la nBH derivada de los lotes TIK301009, TIK280509 y TE311206 usando diversas diluciones de nBH demuestra que unas diluciones mayores disminuyen la tasa de ruptura. La actividad proteolftica de los tres lotes diferentes es casi identica, lo cual indica que la isoforma madurada ⁿT02CB1446 (TE311206) muestra una actividad espedfica similar a la NT02CB1447 madurada (SEQ ID NO:1).

(2) Se analizo la ruptura dependiente del tiempo de scBoNT/A de tipo salvaje y mutantes empleando el ensayo de actividad (figura 7). La scBoNTAS de tipo salvaje es activada por nBH de una manera dependiente del tiempo para producir la cadena ligera y la cadena pesada en 120 min en mas del 95%. La secuencia del bucle se modifico para caracterizar el sitio de ruptura. En scBoNTAS Throm se retiraron todos los restos lisina y se inserta la secuencia de reconocimiento de trombina LVPRGS que prolonga la tasa de ruptura. En scBoNT Res, el bucle carece de aminoacidos basicos que retrasan drasticamente la hidrolisis completa, indicando una fuerte preferencia de reconocimiento de nBH por los restos basicos, tales como lisina y arginina, en el sitio de ruptura. Ademas, la accesibilidad de nBH al bucle se ve dificultada por el acortamiento del bucle hasta ocho restos pequenos o cinco aminoacidos con cadenas laterales voluminosas (scBoNTAS (GGSG)2 y scBoNTAS FQWYI).

(3) El analisis de MS/MS del producto de ruptura de 50 kDa tras la digestion de scBoNT/A con nBH demuestra que el peptido atribuido como el mas C-terminal cubre los aminoacidos G433 a K438 que se corresponden con la region C-terminal fisiologicamente observada de BoNT/A LC (figura 8A). El analisis del producto de la ruptura de 100 kDa, que se identifico como la cadena pesada de BoNT/A, demuestra que el peptido atribuido como el mas N-terminal cubre los aminoacidos A449 a K456 que se corresponden con la region N-terminal fisiologicamente observada de BoNT/A HC (figura 8B). Asf, la nBH aislada produce BoNT/A fisiologicamente procesada e hidroliza preferentemente los enlaces peptfdicos C-terminales con respecto a los restos lisina y arginina.

Ejemplo 4: Conservacion evolutiva de BoNTHidrolasa y sus isoformas

El analisis de la secuencia de protemas de SEQ ID NO:2 (n.° de registro de Genbank CAL82988.1/YP_001253958.1) revelo tres dominios conservados. Los restos 18-573 se corresponden con una metaloproteasa de cinc (elastasa) o LasB implicado en el transporte de aminoacidos y el metabolismo con una puntuacion Blast de 738. Los restos 148­ 212 se corresponden con un propeptido de peptidasa y el dominio YPEB o PepSY (puntuacion Blast de 97). Los restos 336-573 son parte de la familia de peptidasas M4 que incluyen termolisina, protealisina, aureolisina y proteasas neutras (puntuacion de Blast de 803).

La secuenciacion del genoma de C. botulinum ATCC 3502 revelo la existencia de seis ORF que codifican isoformas de iBH (Sebaihia et al., 2007, Genome Res., 17(7):1082-1092). Otros datos del genoma estan disponibles para 10 cepas del grupo I de C. botulinum, asf como C. sporogenes que no segrega BoNT, conteniendo todas entre cinco y siete ORF que codifican iBH. La nBH (SEQ ID NO:1) comparte un mmimo del 64% de identidad de secuencia de aminoacidos con las otras 63 isoformas.

Ejemplo 5: Generacion de anticuerpo espedficos para la BoNTHidrolasa

(1) Generacion de IgY: Se mantuvieron gallinas de dieciseis semanas de edad [ISA Brown and Lohmann Selected Leghorn (LSL), Spreenhagener Vermehrungsbetrieb fur Legehennen GmbH, Bestensee, Alemania] en jaulas individuales, exclusivamente construidas para el mantenimiento de gallinas (Ebeco, Castrop-Rauxel, Alemania). Se les proporciono alimento (ssniff Legehuhner-Zucht 1 y 2; ssniff Spezialitaten GmbH, Soest, Alemania) y agua sin lfmite y las gallinas comenzaron a poner huevos entre las 23 y las 25 semanas de edad. Los huevos se recogieron a diario, se marcaron y se conservaron a 4 °C hasta que fueron procesados despues. El mantenimiento y los experimentos con los animales se realizaron segun las directrices de las autoridades locales, Berlin (n.° H0069/03). Las gallinas se inmunizaron y recibieron una inmunizacion de refuerzo por via intramuscular (musculo pectoral, lado izquierdo y derecho) un total de 10 veces a lo largo de un periodo de 1 ano, con intervalos de entre 4 y 8 semanas. El intervalo usado se baso en trabajos previos que demostraban que no se produdan celulas de memoria demostrables al menos hasta 3 semanas despues de la inmunizacion (Pei y Collisson, 2005). La concentracion de antfgeno empleada fue de aproximadamente 20 |ig por inyeccion (nBH). No se inyectaron mas de 500 |il de disolucion de antfgeno por inmunizacion. Se empleo adyuvante completo de Freund para la primera inmunizacion, y se uso FIA para las posteriores inyecciones de refuerzo. El metodo para la purificacion de IgY se adapto de Polson et al. (1980). Brevemente, la yema de huevo se diluyo 1:2 con PBS esteril (pH 7,4, Roche, Mannheim, Alemania). Para la eliminacion de los lfpidos y lipoprotemas se anadio polietilenglicol 6000 (PEG) al 3,5% (en p/v) (Roth, Karlsruhe, Alemania). Despues de una agitacion suave, seguida de una centrifugacion (10.000 x g durante 20 min a 4 °C), el sobrenadante se decanto y se anadio PEG 6000 solido hasta una concentracion final del 12% (en p/v). Esta mezcla despues se centrifugo como se indico anteriormente. El precipitado se disolvio en 10 ml de PBS, se anadio PEG hasta 12% (en p/vol), y la disolucion se centrifugo. Por ultimo, el precipitado se disolvio en 1,2 ml de PBS, se traslado a un dispositivo de microdialisis (QuixSep, Roth, Alemania) y se dializo contra PBS a 4 °C. El contenido en protemas (mg/ml) se analizo mediante SDS al 12,5%-PAGE (figura 9a ) y se midio fotometricamente a 280 nm y se calculo segun la ley de Lambert-Beer con un coeficiente de extincion de 1,33 para IgY.

(2) ELISA: Se revistieron placas de microtitulacion Nunc Maxisorp F96 (VWR International GmbH, Darmstadt, Alemania) con nBH de diversos lotes (500 ng/ml) en PBS durante la noche a 4 °C y despues se bloquearon durante 1 h con tampon de bloqueo de PBS que contema Tween-20 al 0,1% y leche desnatada al 2% (Merck, Darmstadt, Alemania). Despues de lavar se anadio una dilucion de IgY (10 |ig/ml en tampon de bloqueo) durante 1 h y se detecto usando anti-IgY de pollo de burro marcada con biotina y estreptavidina-peroxidasa de rabano (ambos de Dianova, Hamburgo, Alemania) y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Sigma). La nBH detectada se ilustra en la figura 9B. (3) Transferencia Western: La nBH se separo con SDS al 12,5%-PAGE, y se traslado a una membrana de

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. - Un polipeptido proteolfticamente activo que consiste en una secuencia polipeptidica que presenta al menos 60% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, en el que dicho polipeptido proteolfticamente activo es capaz de hidrolizar la neurotoxina botulrnica o del tetanos para producir una neurotoxina botulrnica bicatenaria o una toxina del tetanos bicatenaria.

2. - El polipeptido proteolfticamente activo segun la reivindicacion 1, en el que dicho polipeptido proteolfticamente activo consiste en SEQ ID NO:1.

3. - Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido proteolfticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

4. - Una molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 3 que comprende ademas elementos reguladores.

5. - Un vector que comprende una molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 3 o 4.

6. - Una celula que comprende una molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 3 o 4, o el vector segun la reivindicacion 5.

7. - Un metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente activo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende las etapas de:

(a.) sintetizar de modo qrnmico o traducir a partir de una secuencia de nucleotidos un polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2; y

(b.) purificar el polipeptido de la etapa (a.).

8. - El uso de un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido proteolfticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para una cromatograffa de afinidad, para la inmunoprecipitacion, para la inmunolocalizacion o para controlar la presencia del polipeptido proteolfticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

9. - Un metodo para la fabricacion de un polipeptido proteolfticamente procesado que comprende la etapa de poner en contacto:

(a) un primer polipeptido, comprendiendo dicho primer polipeptido el polipeptido proteolfticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, con

(b) un segundo polipeptido, siendo dicho segundo polipeptido susceptible a la proteolisis por dicho primer polipeptido;

en el que dicho contacto provoca el procesamiento proteolftico de dicho segundo polipeptido para producir al menos dos productos de la ruptura.

10. - El metodo segun la reivindicacion 9, en el que el segundo polipeptido presenta al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia polipeptfdica seleccionada de cualquiera de ^s E^q ID NO:3 a 25, y en el que el segundo polipeptido es roto en una posicion C-terminal con respecto a un resto aminoacido basico dentro de dicha secuencia de cualquiera de SEQ ID NO:3 a 25.

11. - Un metodo para seleccionar un inhibidor del polipeptido proteolfticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende la etapa de:

(a) poner en contacto el polipeptido proteolfticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 con un sustrato conocido y, opcionalmente, con un inhibidor putativo; y

(b) determinar el efecto del inhibidor putativo sobre la conversion del sustrato en el producto roto,

en el que una reduccion en la cantidad de producto roto es indicativa del efecto inhibitorio del inhibidor putativo.

12. - El metodo segun la reivindicacion 11, en el que el inhibidor es un anticuerpo que se une espedficamente al polipeptido proteolfticamente activo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

13. - El uso del polipeptido proteolfticamente activo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en la produccion de neurotoxinas terapeuticas.

14. - Una composicion que comprende un polipeptido proteolfticamente activo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y un vehfculo farmaceutico.