TOXINA DE CLOSTRIDIU BOTULINUM MÜTADA PEGILADA
Descripción de la Invención La presente invención se refiere a botulinotoxinas (BoNT) modificadas que en comparación con las botulinotoxinas nativas análogas tienen una mayor estabilidad y por consiguiente una prolongada duración del efecto terapéutico. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que contienen estas botulinotoxinas modificadas. Finalmente la presente invención se refiere a ácidos nucléicos que codifican para estas botulinotoxinas modificadas. Clostridium botulinu es una bacteria de crecimiento anaeróbico formadora de esporas que forma una proteína altamente tóxica. Esta llamada botulinotoxina es la causa del botulismo, un envenenamiento de los alimentos que sin el uso de intensivas medidas medicinales puede provocar la muerte del paciente de botulismo. Se diferencian siete serotipos (tipo A-G, denominación abreviada como BoNT/A, BoNT/B, etc.), que tienen una secuencia de aminoácido similar pero inducen una respuesta de anticuerpo diferente. Las toxinas (a continuación también llamadas neurotoxinas o botulinotoxinas) consisten de dos cadenas funcionales, la cadena ligera (~ 50 kD) y la pesada (~ 100 kD) , que se Ref.195404 producen en algunas cepas de clostridios mediante la escisión proteolítica de la proteína predecesora de cadena única. Otras cepas no tienen una proteasa análoga, por lo tanto la escisión de las cadenas solamente tiene lugar en el tracto estomacal-intestinal del paciente (por ejemplo, mediante tripsina) . En la forma bicatenaria las unidades subordinadas (es decir, la cadena pesada y la cadena ligera) se encuentran conectadas una con otra mediante un puente de disulfuro (además existe un puente de disulfuro intramolecular, por ejemplo en BoNT/A) es decir, entre dos residuos de cisteina de la cadena pesada) . Las neurotoxinas puras no existen libres in vivo en condiciones ácidas, sino que forman complejos con otras proteínas clostridiales , los llamados complejos de toxina (Clostridium botulinum) . En estos complejos participan diversas proteínas, entre otras con propiedades de hemoaglutinación. La composición de los complejos difiere de serotipo a serotipo. La integración en un complejo protege a la neurotoxina en el paso por el pasaje estomaco-intestinal . Probablemente estas otras proteínas clostridiales (las proteínas formadoras de complejos o proteínas de complejo) también desempeñan un papel en la resorción de la neurotoxina. O sea que el acoplamiento al complejo tiene por efecto que la neurotoxina esté biodisponible en forma oral y, por consiguiente, sea un veneno en el alimento. El sitio de efecto de la neurotoxina se encuentra en la placa terminal motora en donde el músculo es activado por el nervio. La motoneurona derrama acetilcolina para activar el músculo. Este derrame es impedido por la botulinotoxina . El efecto inhibidor tiene lugar en 3 pasos secuenciales : acoplamiento, transposición, proteólisis. La cadena pesada de la botulinotoxina se acopla con alta especificidad a la motoneurona y a continuación es incorporada por la célula nerviosa en endosornas . En la sección N-terminal de la cadena pesada previa a la región de acoplamiento que se localiza en la terminal C de la cadena pesada se encuentra la región de transposición, la cual mediante un mecanismo que hasta ahora no se conoce con precisión transporta la cadena ligera al citosol de la célula nerviosa, respectivamente permite la transposición. En el citosol la cadena ligera se vuelve activa como proteasa, escinde en forma altamente específica las llamadas proteínas SNARE. La especificidad proteolítica de los tipos individuales de botulinotoxinas se resume en la tabla 1. Estas proteínas SNARE son responsables de la fusión de las vesículas secretoras cargadas de acetilcolina con la membrana celular de la motoneurona. La escisión proteolítica de una de estas proteínas SNARE evita la formación de un complejo de fusión y con ello el derrame adicional de acetilcolina. El músculo afectado ya no se activa. Los músculos previamente hiperactivos se paralizan.
Tabla 1
Este mecanismo de actividad se aprovecha en la terapia de una multitud de distonías y espasmos que se caracterizan por un derrame incontrolado de acetilcolina (por ejemplo, blefaroespasmo, tortícolis, espasticidad) . Para la terapia de la distonía se inyectan cantidades extremadamente pequeñas de la neurotoxina (en la gama de pg a ng) en el músculo hiperactivo. La neurotoxina se difunde a la placa terminal motora y llega al citosol de la neurona para allí evitar el derrame de acetilcolina. Después de 1-2 días el músculo está paralizado. Diversas arrugas de la cara se producen por crispación de los músculos que se encuentran debajo de ' la piel, o sea, igualmente por un derrame incontrolado de acetilcolina . Es en este aspecto que las botulinotoxinas encuentran su uso cosmético: mediante la inyección de cantidades extremadamente pequeñas de botulinotoxina se pueden eliminar las arrugas por aproximadamente 3 meses. Actualmente están autorizados cuatro preparados que contienen botulinotoxina por la ley farmacológica: Botox® (Allergan) , Xeomina® (Merz) , Dysport® (Ipsen) y NeuroBloc® (Soistice Neurosciences ) . Botox®, Xeomina® y Dysport® son liofilizados de la botulinotoxina tipo A (como complejo, neurotoxina o respectivamente complejo) , Botox® y Xeomina® con respectivamente 100 unidades por ampolleta de inyección, Dysport® con 500 unidades. NeuroBloc® contiene botulinotoxina tipo B (como complejo) con 5000 y 10000 unidades en formulación líquida. Con excepción de NeuroBloc los preparados existen como liofilizados que se reconstituyen con solución salina y que se inyectan en los músculos respectivos en dosis predeterminadas en función del preparado y de la indicación. Dentro de 48 h se paraliza el músculo tratado. El efecto dura aproximadamente 3 meses, después de esto tiene que efectuarse otra inyección si es que el músculo debe seguir paralizado, es decir, se tiene que seguir tratando la distonía. Hasta la fecha no se ha aclarado de manera inequívoca cuales son los procesos que controlan la disminución del efecto. Mientras la cadena ligera está activa como proteasa se escinde la proteína SNARE (por ejemplo, SNAP 25 de la cadena ligera de la neurotoxina de tipo A) correspondiente. En consecuencia con estas condiciones se evita la fusión de las vesículas secretoras con la membrana del plasma y con ello el derrame de acetilcolina, el músculo se mantiene paralizado. Si se tuviera éxito en sostener la actividad de proteasa de la cadena ligera en la célula durante un tiempo prolongado, entonces también se prolongaría la duración del efecto de un medicamento correspondiente. A diferencia de muchos principios activos de bajo peso molecular, los principios activos de proteína se caracterizan por una estabilidad considerablemente menor. Por ejemplo, en algunos principios activos de proteína el periodo de semidesintegración (HWZ) en la circulación sanguínea es de solamente pocos minutos, de manera que el efecto de actividad (terapéutico) es limitado, y es necesario volver a inyectar a intervalos cortos. El HWZ se puede prolongar si se tiene éxito en proteger la proteína de los procesos de desintegración y eliminación. Una ruta teórica posible, en particular en el caso de las proteínas eucarióticas , reside en una glicosilacion más alta (más restos de carbohidratos) y en adaptar las estructuras de carbohidratos a las estructuras de las glicoproteínas humanas. Otra ruta que se siguió en una serie de principios activos autorizados consiste en el acoplamiento de la proteína con polietilenglicol (PEG) . El PEG se puede acoplar de manera covalente a los residuos de diferentes aminoácidos, por ejemplo a residuos de lisina (función amino) o cisteína (función SH) . El PEG aumenta el peso molecular de la proteína sin que se produzcan estructuras inmunógenas que inducen la formación de anticuerpos contra el principio activo. Al contrario: la PEGilación disminuye la inmunogenidad del principio activo. Mediante el aumento del peso molecular la proteína se elimina más lentamente y se obtiene un aumento notable del HWZ en el suero. El medicamento se necesita inyectar con menos frecuencia para mantener un determinado nivel de suero necesario . Los principios activos de proteína PEGilados ya se procesan en algunos medicamentos autorizados (ver tabla 2) . El uso de las proteínas que en parte son pequeñas (por ejemplo, interferona a 2a: Mr = 19.3 kD) en la forma original, es decir, no modificadas demostró que las proteínas son eliminadas muy rápidamente del suero. El PEGilado condujo a un aumento notable del peso molecular, y por consiguiente a un periodo de semidesintegración sustancialmente más largo en el suero. Así, por ejemplo, en el caso de interferona a 2a el periodo de semidesintegración del suero es de 9 h, el PEGilado con una cadena de PEG de 40 kD incrementa drásticamente el peso molecular y prolonga el periodo de semidesintegracion de 9 a 72 h. Tabla 2
Sin embargo, el acoplamiento con una o varias cadenas de PEG está sujeto a limitaciones: 1. Preferiblemente la cadena de PEG no disminuye la actividad biológica de la proteína modificada, o sólo de manera insignificante (en comparación con la proteína nativa sin modificar) (por actividad biológica disminuida o en forma insignificante de la proteína modificada se entiende de conformidad con la invención una actividad biológica de la proteína modificada que corresponde a al menos el 20%, preferiblemente el 30-40% o 50-70% ó inclusive el 75-95% de la actividad biológica de la proteína nativa sin modificar) . Pero una actividad disminuida es completamente tolerable en muchos casos: la actividad antiviral de la interferona PEGilada, por ejemplo, es del 25-35% de la interferona a 2b no PEGilada. La interferona a 2a PEGilada incluso sólo tiene 1-7% de la actividad de la forma no PEGilada. 2. En virtud de que una multitud de proteínas que se utilizan terapéuticamente desarrolla la actividad a través del acoplamiento a un receptor específico, la PEGilación preferiblemente no influye en la interacción con el receptor, o sólo de manera insignificante (la interacción puede ser mermada, por ejemplo, mediante obstaculización estérica directa en la región de acoplamiento o mediante variaciones de la estructura espacial de la proteína que tienen efecto sobre la región del acoplamiento, y por consiguiente sobre el acoplamiento) . 3. Si el efecto farmacológico de la proteína terapéutica es mediado (también) mediante una actividad enzimática (como, por ejemplo, en la asparaginasa) , la PEGilación preferiblemente no estrangula la actividad enzimática o sólo en forma insignificante. La PEGilación de la botulinotoxina satisface preferiblemente estos tres criterios. La modificación de la botulinotoxina con PEG preferiblemente no influye ni en (a) la región de acoplamiento de la cadena pesada ni en (b) la actividad enzimática de la cadena ligera, es decir, la cadena de PEG preferiblemente no inhibe la interacción de la región de la cadena ligera con el sustrato (proteína SNARE) . A diferencia de otras proteasas que escinden péptidos cortos, las botulinotoxinas requieren péptidos más largos como sustrato. Así, un péptido que le sirve como sustrato a la botulinotoxina de tipo B preferiblemente tiene una secuencia de aproximadamente 40 residuos de aminoácido de la proteína SNARE VAMP 2. Es cierto que los péptidos con secuencias SNARE más cortas también son escindidos, pero esto con eficiencia considerablemente menor. La cadena de PEG preferiblemente no influye en la región de escisión en la cadena ligera de la botulinotoxina que tiene una longitud comparable a la secuencia de identificación de aproximadamente 40 residuos de aminoácido. Además, se debe tener en cuenta que además de la región de escisión que es responsable del contacto directo del sustrato (proteína SNARE o bien péptido con la secuencia SNARE de aproximadamente 40 residuos de aminoácido) con la cadena ligera se requieren sitios de contacto adicionales con secuencias que sobre la cadena ligera se encuentran alejadas de la región catalítica para la actividad óptima de la botulinotoxina . En este aspecto se comprobó que sobre la cadena ligera de botulinotoxina tipo A existen otros cinco sitios de contacto para su sustrato SNAP 25: 4 "exositos a" (AS 102-113, 310-321, 335-348, 351-358) y un "exosito ß" (AS 242-259) . Preferiblemente el contacto no se inhibe, o sólo de manera insignificante, mediante una conjugación de la cadena ligera con PEG. Además, la parte terminal C de la cadena pesada, la región de transposición, debe ser capaz de funcionar, es decir, encargarse de que la cadena ligera se transporte de los endosomas al citosol. Este proceso de transporte imprescindible para la actividad también puede ser inhibido mediante obstaculizaciones estéricas de una cadena ligera PEGilada, cuanto más que la región de transposición posiblemente forma un poro en la membrana del endosoma a través del que no sería posible hacer pasar una cadena ligera PEGilada "abultada" . En una solicitud de patente US (2002/0197278) se describe un acoplamiento de PEG a botulinotoxina. El acoplamiento sirve para disminuir la antigenidad o respectivamente inmunogenidad así como para aumentar el peso molecular para reducir la difusión. Para la elección de los sitios (determinantes antigénicos) o respectivamente residuos de aminoácidos adecuados para la PEGilación se remite al trabajo de Bavari et al. (Vaccine 16: 1850-1856, 1998) . En este trabajo se describen secuencias de la cadena pesada de botulinotoxina que inducen anticuerpos neutralizadores . En la solicitud de patente mencionada únicamente se indica que (1) la PEGilación debe efectuarse en un sitio o cerca de un sitio o en los sitios o cerca de los sitios que actúa (n) como epitope(s) importante (s) , pero que se encuentran alejados de la región catalítica (o sea, alejados de la cadena ligera) , y que (2) PEG se puede conjugar a los grupos carboxi o amino terminales libres o a los grupos amino de cadenas laterales de lisina. (3) Como posibilidad adicional de introducir PEG en la toxina se propone utilizar grupos SH de residuos de cisteina normalmente existentes o introducidos deliberadamente, siendo que sin embargo se previene ante esta variante (3) en virtud de que los puentes de disulfuro entre la cadena pesada y la ligera de la botulinotoxina desempeñan un papel en la formación espacial de la molécula. No se menciona ningún ejemplo del cual se pudiera inferir la estructura de la neurotoxina PEGilada o a cual (es) residuo (s) de aminoácido se aplicó una molécula de PEG de que longitud. En otra solicitud de patente (WO 02/40506) que se refiere a la variación de la persistencia se propone que en la botulinotoxina se introduzcan, modifiquen o eliminen sitios para la glicosilación in vivo, la fosforilación in vivo y ante todo para la miristilación in vivo, para aumentar o disminuir a elección la estabilidad de la botulinotoxina . Se indican toda una serie de estos sitios de modificación potenciales que se encuentran sobre la cadena ligera de la neurotoxina a una notable distancia de los extremos terminales N y C. Para este propósito se deberán incorporar adicionalmente secuencias en la cadena de polipéptido en las que los enzimas celulares acoplan a la cadena ligera cadenas de carbohidrato o respectivamente residuos de fosfato y miristilato. Sin embargo faltan las indicaciones con respecto a una neurotoxina modificada de manera correspondiente y a su producción . En otra solicitud de patente US (2003/0027752) se incorpora en la neurotoxina o respectivamente en la cadena ligera un residuo de péptido con un llamado motivo de leucina (por ejemplo, XEXXXLL) para aumentar la persistencia de la cadena ligera en la célula nerviosa. Mediante el equipamiento de la cadena ligera con este motivo se debe lograr que se localice en la membrana en la proximidad de su sustrato. Se indica además un llamado "motivo a base de tirosina" (YXXXHy, Y = tirosina, Hy = aminoácido hidrófobo) que después de la incorporación en la cadena ligera deberá aumentar su persistencia. Finalmente esta solicitud propone una botulinotoxina tipo A modificada en la que la cadena ligera está mutada (en cada caso de alanina a leucina en las posiciones 427 y 428) . 0 sea que el problema que se abocaron a resolver los inventores a la vista del estado de la técnica precedentemente descrito consistía en proporcionar una forma adicional y descrita en forma concreta de la estabilización de botulinotoxina de cualquier serotipo, sin embargo preferiblemente del tipo A, B y Cl . 0 sea que aunado a esto, el objeto de los inventores era proporcionar variantes/análogos de las botulinotoxinas naturales que en comparación con las botulinotoxinas correspondientes sin modificar tienen in vivo una mayor estabilidad. Esto significa en primer lugar que la actividad biológica (de conformidad con la invención, actividad biológica se define como actividad total que comprende la actividad enzimática/catalítica de la cadena ligera así como el acoplamiento necesario para esto de la neurotoxina a la célula diana y la transposición de la cadena ligera a la célula diana) de las/los variantes/análogos de botulinotoxina en todo caso sólo deberá estar disminuida de manera insignificante (la definición como en lo precedente) y de preferencia nada en absoluto, y en segundo lugar que a pesar de su modificación la cadena ligera se transponga a su sitio de actividad, en el citosol de las motoneuronas . A diferencia del documento US 20020197278 ya mencionado en lo precedente, el objeto en que se funda la presente solicitud de patente no se enfoca a bloquear determinantes antigénicos, disminuir la antigenidad de las toxinas o limitar su difusión fuera del sitio de la inyección . Inesperadamente los inventores de la presente solicitud encontraron que la cadena ligera de las botulinotoxinas se puede PEGilar específicamente en su terminal N mediante la introducción de al menos un residuo de cisteína, sin que simultáneamente sea. mermada o incluso inhibida la actividad biológica (de acuerdo a la definición que se dio en lo precedente) de las botulinotoxinas. Una botulinotoxina PEGilada de esta manera se caracteriza por una estabilidad in vivo sorprendentemente más alta (notable aumento del HWZ y por consiguiente una duración prolongada del efecto (farmacológico) . La duración de la actividad (terapéutica) de las botulinotoxinas naturales en el paciente depende del serotipo. La botulinotoxina de tipo A se caracteriza por la actividad de mayor duración, de aproximadamente 3 meses. La actividad de botulinotoxina de tipo C tiene casi la misma duración que la del tipo A, en tanto que la actividad de la botulinotoxina del tipo B es de duración un poco mas corta. La actividad de la botulinotoxina de tipo E y F se reduce a solo aproximadamente 2 semanas, respectivamente. La corta duración del efecto de estos dos tipos no permite su uso clínico para el tratamiento de distonias. La presente invención permite (1) el uso clínico de todas las botulinotoxinas , incluso de aquellas que hasta ahora sólo tienen un efecto temporal corto, y (2) una terapia más favorable con las toxinas de los tipos A y B que ya se usan terapéuticamente, en virtud de que estas ya no se deberán aplicar cada cuarto de año, sino que, por ejemplo, cada medio año . Figura 1: Compilación de los oligonucleótidos (SEQ ID No. 1 a 14), que se usaron en las clonaciones de las toxinas y fragmentos de toxinas recombinantes . Las secuencias de identificación para las endonucleasas de restricción se encuentran subrayadas. Las secuencias largas con los SEQ ID No. 16 y 15 constituyen ejemplos de una botulino-neurotoxina de tipo A recombinante (mutada) que tiene añadida una terminal N de cisteina residual de una marca de histidina (consistente en 10 residuos de histidina) o respectivamente dé un DNA que codifica para esta. El residuo de prolina en la terminal N de la toxina nativa expresada y trasladada en forma monocistronica (posición 1) se sustituyó con un residuo de alanina para crear un sitio de corte en el sitio de multi-clonado (MCS) del vector. Y es que el vector comprende la secuencia que codifica para la marca His exactamente en proximidad 5' de este MCS. Además, en lugar del anillo nativo ya se introdujo entre la cadena ligera y pesada una secuencia que es reconocida por las células E. coli, tras lo cual el prepéptido nativo (N-cadena ligera-anillo-cadena pesada-C) se escinde en la neurotoxina bicatenaria activa y se obtiene como tal ya durante la producción recombinante de la neurotoxina y sin la adición de proteasas exogenas. Figura 2: Describe un gel de SDS el cual presenta en el caso de una aplicación no reductora una banda adicional intensa con movilidad levemente disminuida Figura 3 : Análisis de la preparación PEGilada y de control de C-Hi0-BoNT/A (ejemplo 5) en el gel de SDS-poliacrilamida en condiciones no reductoras . Banda 1: marcador de peso molecular; banda 2: preparación de control; banda 3: preparación PEGilada. Para solucionar el problema impuesto (ver lo precedente) los inventores desarrollaron botulinotoxinas modificadas. Por consiguiente, un aspecto y objeto de la invención es una botulinotoxina modificada que comprende una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada, siendo que la modificación de la cadena ligera consiste en (1) que comprende una prolongación de la cadena en su terminal N, que en dirección del extremo terminal N al C tiene la estructura siguiente: - (C) n- ( tag) m- (X) ?- , siendo que representan: C un residuo de cisteina, tag una marca cualquiera a discreción, por ejemplo, para una marca Strep o una marca His, y X el residuo de cualquier aminoácido que existe naturalmente, siendo n un número entero de 1 a 50, m 0 ó 1 , y 1 0 ó un número entero de 1 a 50, y (2) que al menos uno de los residuos de cisteina se acopla en la prolongación de la cadena a al menos una cadena PEG. Una botulinotoxina modificada de esta manera a continuación también se denomina butilino o neurotoxina mutada PEGilada. De conformidad con una forma de realización preferida son válidas las condiciones siguientes: n = 1, 2 o 3, m = 0 ó 1, 1 = : 0 ó 1 ? 0, n = l,m = 1,1 = 0; n - 2 , m = 1,1 = 0; n = 3 , m - 1,1 = 0; n = l,m = 0,1 = 0; n = 2 , m = 0,1 = 0; n = 3 , m = 0,1 = 0; n = l,m = 1,1 ? 0; n = 2 , m = 1,1 ? 0; n = 3 , m = 1,1 ? 0; n = l,m = 0,1 ? 0; n = 2 , m = 0,1 ? 0; n = 3 , m = 0,1 ? 0, siendo que las toxinas se acoplan por molécula a una, a dos o a tres moléculas de PEG, en función de que n = 1, 2 ó 3. Por consiguiente, entre las botulinotoxinas modificadas de la presente invención mencionadas en lo precedente se incluyen preferiblemente aquellas botulinotoxinas modificadas (en particular de los tipos A, B y Cl) cuya cadena ligera está modificada de manera que esta en su terminal N comprende una prolongación de la cadena, siendo que la cadena prolongada tiene una de las secuencias siguientes : -(C)i-(tagh-(X)o, -(C)2-(tag)i-(X)0-, - (C)3- (tag) i- (X) o-, -(C) - (tag)i- (X)o-, - (C)5- (tag)i- (X)0-, -(C)r(tag)i-(X) , - (C) 2- ( tag) i- (X) i-, - (C)3- (tag)i- (X)i-, -(C)4- (tag)!- (X)!-, -(C)5-(tag)i-(X)i-, -(C)i-(tagh-(X)2-, - (C)2- (tag)i- (X)2-, - (C) 3- (tag) i- (X) 2- , -(C)4- (tag)i- (X)2-, - (C)5- (tag)i- (X)2-, - (C)i- (tag)i- (X)3-, - (C) 2- ( tag) i- (X) 3- , - (C) 3- ( tag) i- (X) 3- , -(C)4- (tag)i-(X)3-, - (C)5- (tag)i- (X)3-, -(C)i-(tag)i-(X)4-, - (C) 2- (tag) i- (X) 4- , - (C) 3- (tag) ?- (X) 4-, -(C) - (tag)i- (X)4-, - (C)5- (tag)i- (X) -, etc. siendo que para cada una de las 25 formas de realización preferidas listadas en lo precedente m puede también ser 0 en lugar de 1, y/o en cada caso todos los residuos de ciste na presentes en la prolongación de la cadena ligera también están PEGilados . Naturalmente que 1 también puede ser cualquier número entero a discreción de 11 a 50, ó también superior a 50, en particular superior a 100 ó superior a 250. Pero entre más grande es 1 tanto más larga se vuelve la cadena ligera sin que por un determinado límite superior de la longitud de la cadena ligera se vea amenazada su actividad enzimática/catalítica o bien la actividad biológica (total) de la neurotoxina (de acuerdo a la definición precedente) . Pero por motivos prácticos se presta para 1 un límite superior de 10-20, de manera que los valores preferidos para 1 se encuentran en el intervalo de 1-10, en cuanto 1 no sea, de manera particularmente preferida, 0. Los mismos razonamientos también son válidos para n, siendo que su limite superior de conformidad con la invención se fijó en 50 únicamente por motivos prácticos y económicos. Sin embargo, preferiblemente n se encuentra en el intervalo de 1-10, mejor 1-5, para no introducir o tener que introducir demasiadas moléculas de PEG (ya que preferiblemente todos los residuos de cisteina introducidos también se PEGilan) y restarle a la botulino- /neurotoxina mutada PEGilada su actividad biológica de acuerdo a la definición precedente. Esto puede suceder fácilmente si se introducen demasiados residuos de cisteina y PEG o respectivamente si se introducen demasiados residuos de cisteina y PEG en posiciones equivocadas, ya que la cadena ligera eventualmente no se traspone a la célula diana a pesar del acoplamiento de la toxina a la célula diana. La estructura de la botulinotoxina de tipo A fue publicada por Lacy & Stevens 1998 (Nat . Struct. Biol . 5, 898-902), la estructura de la botulinotoxinade tipo B por Swaninathan & Eswaramoorthy (Nat. Struct. Biol. 7, 693-699 (2000) ) . Con ello también se conoce la estructura de las cadenas ligeras y se puede determinar que regiones de la cadena pesada y respectivamente ligera se encuentran en la superficie de la proteína y que por este motivo pueden ser adecuadas para un acoplamiento con PEG. La forma de proceder frecuentemente elegida, el acoplamiento de un PEG adecuadamente activado (por ejemplo, PEG-propionato de succinimidilo) a un grupo amino e de lisinas residuales no le pareció prometedora a los inventores . Un PEG activado puede atacar en numerosos residuos de lisina - también en la zona de acoplamiento de la cadena pesada, lo cual experimentalmente condujo a una drástica desactivación. En lugar de esto los inventores identificaron residuos de aminoácido de la cadena ligera que son adecuados para ser primero intercambiados por al menos un residuo de cisteína y a continuación se PEGilan al mínimo de un residuo de cisteína introducido. También estas botulinotoxinas modificadas que a continuación serán caracterizadas con mayor detalle son una configuración preferida de la presente invención, como conjugados con PEG tienen una actividad biológica suficiente (incluso enzimática/catalítica) (que de acuerdo a la definición corresponde al menos a 20%, preferiblemente al 30-40%, 50-70% ó incluso 75-95% de la actividad biológica de la proteína sin modificar) al tiempo de una mayor estabilidad (en comparación con las neurotoxinas nativas correspondientes) y a continuación se designan igualmente como botulino o neurotoxinas mutadas PEGiladas de la presente invención.
Las botulinotoxinas modificadas de la presente invención mencionadas al último también son conjugados de botulinotoxinas mutadas con PEG. También estas botulinotoxinas modificadas se acoplan a PEG mediante cisteínas residuales que se introducen por separado. Para este propósito se sustituye en cada caso mediante un residuo de cisteína al menos uno, pero opcionalmente también 2, 3, 4, 5, 10 ó incluso todos los 20 de los primeros 20 aminoácidos residuales del extremo terminal N de la cadena ligera de la botulinotoxina correspondiente. Estas botulinotoxinas modificadas comprenden igualmente una cadena pesada natural y una cadena ligera modificada, siendo que la modificación de la cadena ligera consiste en que al menos uno hasta máximo 20 de sus aminoácidos residuales que se encuentran naturalmente en su terminal N se muta(n) en un residuo de cisteína. Opcionalmente comprenden adicionalmente una prolongación N-terminal, de manera que la secuencia de la cadena ligera en la dirección del extremo terminal N al C tiene la estructura siguiente : - ( tag)m- (X) i-Bo T (X1-20C) , siendo que representan: C un residuo de cisteina, tag una marca cualquiera a discreción, por ejemplo, para una marca Strep o una marca His, y X el residuo de cualquier aminoácido que existe naturalmente, siendo m O ó 1 , y 1 O ó un número entero de 1 a 50. Al menos uno del máximo de 20 residuos de cisteína en la terminal N se acopla a al menos una cadena PEG. Para la BoNT/A resultan por lo tanto mutantes que se caracterizan por al menos uno - y como máximo 20 - de los siguientes intercambios de aminoácidos residuales, de manera que en los residuos de cisteína introducidos puede tener lugar una PEGilación: PIC, F2C, V3C, N4C, K5C, Q6C, F7C, N8C, Y9C, 10C, D11C, P12C, V13C, N14C, G15C, V16C, D17C, 118C, A19C, Y20C. De conformidad con una forma de realización preferida son válidas las condiciones siguientes: m = 1,1 = 0, solamente uno de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteína, en particular solamente el residuo en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; m = 0,1 = 0, solamente uno de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteína, en particular solamente el residuo en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; m = 1,1 ? 0, solamente uno de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteína, en particular solamente el residuo en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10;
m = 0,1 ? 0, solamente uno de los aminoácidos residuales N- terminales está sustituido por un residuo de ciste na, en particular solamente el residuo en la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; m = 1,1 = 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N- terminales está sustituido por un residuo de cisteina, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6 ; m = 0,1 = 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteina, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6; m = 1,1 ? 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteina, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6 ; m = 0,1 ? 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteina, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6 ó 4 y 6 ; m = 1,1 = 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteina, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6; m = 0,1 = 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N- terminales está sustituido por un residuo de cisteína, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6; m = 1,1 ? 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteína, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6; m = 0,1 ? 0, solamente dos de los aminoácidos residuales N-terminales está sustituido por un residuo de cisteína, en particular solamente los residuos en la posiciones 1 y 2, 2 y 3, 3 y 4, 4 y 5 ó 5 y 6; siendo que las toxinas se acoplan por molécula a una o dos moléculas de PEG, en función de que se hayan sustituido N-terminales uno o dos residuos de aminoácido por (un) residuo(s) de cisteína. Por consiguiente, entre las botulinotoxinas modificadas de la presente invención que se mencionan en lo precedente se cuentan preferiblemente aquellas botulinotoxinas (en particular de los tipos A, B y Cl) cuya cadena ligera está modificada de manera que en su terminal T comprende una prolongación de la cadena, siendo que la terminal N de la cadena ligera prolongada tiene una de las secuencias siguientes: -(tag)i-(X)0-BoNT(PlC) , - ( tag) i- (X) 0-BoNT (F2C) , - ( tag) i- (X) 0-BoNT(V3C), - ( tag) i- (X) o-BoNT (N4C) , - ( tag) i- (X) 0-Bo T (K5C) , - (tag)i- (X)i-BoNT(PlC) , - ( tag) i- (X) 1-BoN (F2C) , - ( ag) i- (X) 1-BoNT(V3C) , - (tag) i- (X) i-BoNT (N4C) , - ( tag) i- (X) 1-B0NT (K5C) , - (tag)i- (X)2-BoNT(PlC) , - ( tag) i- (X) 2-BoNT (F2C) , - ( tag) x- (X) 2-BoNT(V3C) , - (tag)i- (X) 2-BoNT (N4C) , - ( tag) i- (X) 2-BoNT (K5C ) , - (tag)i- (Xh-BoNT(PlC) , - ( tag) i- (X) 3-B0NT (F2C) , - ( tag) 1- (X) 3-BoNT(V3C), -(tag)i-(X)3-BoNT(N4C) , - ( tag) 1- (X) 3-B0 T (K5C) , - (tag)i- (X)4-BoNT(PlC) , - ( tag) 1- (X) 4-B0NT (F2C) , - ( tag) 1- (X) -BoNT(V3C) , - (tag)i- (X) 4-B0NT (N4C ) , - ( tag) 1- (X) 4-B0NT (K5C) , etc . , siendo que para cada una de las 25 formas de realización preferidas listadas en lo precedente m también puede ser 0 en lugar de 1, y/o en cada caso todos los residuos de cisteína introducidos en terminal N también están PEGilados. Naturalmente que 1 también puede ser cualquier número entero a discreción de 11 a 50, ó también superior a 50, en particular superior a 100 a ó superior a 250. Pero sin embargo, cuanto mayor es 1 tanto más larga se vuelve la cadena ligera sin que por un determinado limite superior de la longitud de la cadena ligera se vea amenazada su actividad enzimática/catalí tica o bien la actividad biológica (total) de la neurotoxina en el sentido de la definición precedente. Pero por motivos prácticos se presta 1 un limite superior de 10-20, de manera que los valores preferidos para 1 se encuentran en el intervalo de 1-10, en cuanto 1 no sea, de manera particularmente preferida, 0.
En cuanto no se indique explícitamente otra cosa, lo que se expondrá a continuación es válido para las botulinotoxinas modificadas de la presente invención, independientemente de que se trate de una variante con residuo (s) de cisteína introducido (s) en la prolongación N-terminal de la cadena ligera o de la variante con residuo (s) de cisteína introducido (s) en el extremo N-terminal de la cadena ligera. Preferiblemente la botulinotoxina modificada es una botulinotoxina modificada que se deriva de BoNT/A, Bo T/B ó BoNT/Cl, pero igualmente también puede ser una botulinotoxina de los tipos D, E, F o G. Se prefiere igualmente por una parte que todos los residuos de cisteína que se introducen de manera artificial (preferiblemente se introducen 1-10 residuos de cisteína) comprendan al menos una cadena PEG, pero por otra parte que ninguno de los residuos de cisteína que existe de manera natural en la cadena pesada y ligera de la botulinotoxina esté PEGilado. Naturalmente que el experto comprende sin mayor problema que el significado de la marca (m = 1) se encuentra en la más fácil depuración de la botulinotoxina modificada producida de manera recombinante (por ejemplo, en E. coli) de la presente invención. O sea que la marca no se requiere para aumentar la estabilidad de la neurotoxina o su actividad biológica, sino que permite el aislamiento simplificado y casi cuantitativo de la botulinotoxina modificada a partir del cultivo de bacterias. En las cuestiones sobre una elección adecuada de n (en el caso de la variante con residuo (s) de ciste na introducido (s) en la prolongación N- terminal de la cadena ligera) y sobre el número y posición de los aminoácidos residuales a ser sustituidos por residuos de cisteina (en el caso de la variante con residuo (s) de cisteina introducido (s ) en el extremo N- terminal de la cadena ligera) se debe tener en cuenta que preferiblemente sólo se introducen tantos residuos de cisteina como son las PEGilaciones que se deben efectuar (lo correspondiente también es válido para el caso de que 1 ? 0 y al menos un residuo X de aminoácido sea un residuo de cisteina) . Preferiblemente es posible PEGilar, y completamente, todos estos residuos de cisteina introducidos sin que, y esto es el sorprendente descubrimiento de los inventores, resulte PEGilado tan sólo uno de los residuos de cisteina que existen de manera natural en la botulinotoxina, ya sea en la cadena pesada o en la ligera (además de un puente de disulfuro intra e intermolecular, respectivamente, la botulinotoxina de tipo A, por ejemplo, posee todavía tres residuos de cisteina adicionales en la cadena pesada (C79i, C967, C1060) así como dos residuos de cisteina adicionales en la cadena ligera (C134 y C165) ) · De esta manera es posible obtener un producto unitario (homogéneo) en forma de una botulinotoxina mutada PEGilada. Adicionalmente es razonable por otro motivo evitar que se introduzcan demasiados residuos de ciste na y PEG o respectivamente se introduzcan demasiados residuos de cisteina y PEG en posiciones equivocadas. Esto porque (i) entonces posiblemente la toxina se vuelve demasiada abultada como para poderse acoplar a la célula diana y/o la cadena ligera no se transpone, o no la medida suficiente a la célula diana, incluso a pesar del acoplamiento de la toxina a la célula diana. En otras palabras, la introducción de solamente un residuo de cisteina, en esta o aquella variante, y su PEGilación satisface regularmente la finalidad de conformidad con la invención y por lo tanto se prefiere particularmente. En consecuencia, las botulino- /neurotoxinas mutadas PEGiladas de conformidad con la presente invención son biológica y enzimáticamente (es decir, catalíticamente) tan activas como las correspondientes botulino- /neurotoxinas naturales (nativas), o tienen, en el sentido de la definición que se dio en lo precedente, una actividad biológica y enzimática/catalítica a lo sumo disminuida de manera insignificante, pero son más estables, en parte incluso considerablemente más estables que sus toxinas precursoras naturales de las que se derivaron. Así, se prefiere además una botulinotoxina mutada PEGilada cuya cadena ligera mutada PEGilada (modificada) tiene en el citosol de las motoneuronas una mayor estabilidad que la cadena ligera sin modificar de la botulinotoxina nativa correspondiente. Como se describió en lo precedente, la PEGilación de la cadena ligera conduce a una mayor estabilidad en comparación con la cadena ligera no modificada. O sea que de conformidad con la invención la cadena PEG se aplica a la cadena ligera de manera que 1. su actividad enzimática se mantiene invariable o en todo caso disminuida de manera insignificante (de acuerdo a la definición dada en lo precedente) y 2. la cadena ligera modificada, al igual que la cadena no modificada se transpone al citosol de las motoneuronas . La marca His, al igual que también otras marcas, por ejemplo, la marca Strep permiten un aislamiento sencillo de la neurotoxina mutada a partir del lisado de bacterias transformadas (por ejemplo, E. coli) . Se aplica más sencillamente a nivel DNA en la dirección 5' de la región codificadora del gen de la neurotoxina. En el caso de la marca His el aislamiento se efectúa mediante cromatografía de afinidad mediante Ni-NTA-sefarosa . La neurotoxina mutada aislada de esta manera se acopla en la etapa siguiente con PEG activado. La Cía. Nektar Therapeutics pone a disposición una serie de derivados de PEG activados, por ejemplo, PEG-máleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-yodoacetamida así como PEG-ortopiridildisulfuro, y proporciona con ellos instrucciones para la PEGilación. De conformidad con la invención estos derivados de PEG pueden tener diferentes longitudes de cadena: por ejemplo, existen en el comercio y se pueden usar de conformidad con la invención derivados de PEG con pesos moleculares de 5,000 Dalton, 10,000 Dalton, 20,000 Dalton y 30, 000 Dalton. Para determinar la actividad de proteasa de la botulinotoxina mutada y a continuación PEGilada se registra cuantitativamente la escisión de la proteína SNARE que corresponde al serotipo. Opcionalmente la actividad se compara entonces con la actividad (i) de la neurotoxina nativa (del serotipo correspondiente), (ii) de la neurotoxina mutada con marca para el aislamiento simplificado y/o (iii) de la neurotoxina mutada sin marca. La actividad de la neurotoxina mutada y de la neurotoxina mutada PEGilada es similar a la actividad de la neurotoxina nativa (no mutada) (es decir, la actividad biológica, de conformidad con la definción precedente, de la neurotoxina mutada y de la neurotoxina modificada de conformidad con la invención en todo caso está disminuida de manera insignificante en comparación con la actividad biológica de la neurotoxina nativa, en el sentido de la definición que se dio en lo precedente) . La actividad total de la neurotoxina mutada PEGilada se determina primero en un modelo ex-vivo, el llamado ensayo de diafragma o respectivamente hemidiafragma . La actividad paralizadora se determina en un preparado de nervio-músculo. De conformidad con la invención la actividad biológica de la neurotoxina modificada, es decir, de la neurotoxina mutada y a continuación PEGilada corresponde al menos al 20%, preferiblemente al 30-40% ó 50-70% ó incluso al 75-95% de la actividad biológica de la prote na (nativa) no modificada (la actividad biológica también aquí se debe entender de acuerdo a la definición precedente) . La toxicidad de la neurotoxina mutada PEGilada de conformidad con la invención se puede probar en el ratón en el ensayo LD50, en' donde se determina la dosis que después de la aplicación i.p. tiene un efecto mortal en la mitad de un grupo de ratones . La duración de la actividad de la neurotoxina mutada PEGilada de conformidad con la invención se determina in vivo, igualmente en el ratón. Tras la inyección de una dosis no letal de una botulinotoxina de tipo A mutada PEGilada de conformidad con la presente invención y respectivamente de la botulinotoxina nativa correspondiente en el músculo gastrocnemio de la pata trasera se determina el tiempo que el músculo se conserva paralizado. La intensidad de la parálisis se clasifica mediante una escala. La duración del efecto, que es más corta en el ratón que en el ser humano, se prolongó por 30-150% en función de la botulinotoxina de tipo A modificada que se utilizó (medida en comparación a la botulinotoxina de tipo A no mutada y no PEGilada) . La botulinotoxina mutada PEGilada de conformidad con la presente invención se puede procesar en una formulación adecuada para obtener un medicamento terminado que contiene una dosis (o un múltiplo de número entero de la dosis) en el intervalo de la dosis terapéutica (por ejemplo, 100 unidades LD50 por ampolleta de inyección) . De conformidad con una forma de realización preferida, la composición farmacéutica se estabiliza sin la adición de seroálbumina humana (HSA según sus siglas en inglés) . Pero también se puede estabilizar con seroálbumina humana (HSA) . En este aspecto se prefiere particularmente el uso de una composición sin HSA para estabilizar principios activos de proteína como se describe en el documento WO 2005/007185. De conformidad con otra forma de realización preferida la composición farmacéutica de la presente invención se encuentra presente en forma liofilizada o líquida. Ambas formas son adecuadas para la inyección intramuscular en el músculo a ser tratado, eventualmente tras la incorporación en un disolvente adecuado . La botulinotoxina mutada PEGilada con mayor estabilidad y periodo de semidesintegración, o respectivamente el fármaco que la comprende se puede usar para la terapia de diversas distonias, como distonia espasmódica, distonia de la laringe, distonia cervical, distonia manual focal, blefarospasmo, estrabismo, paresia cerebral, espasmos hemifaciales , espasticidad, colitis espasmódica, anismo, TICS, temblores, bruxismo, cisura anal, acalasia, disfagia, hiperhidrosis así como para eliminar arrugas de la cara. Otros aspectos de la presente invención se refieren (1) a un ácido nucléico que codifica para la botulinotoxina modificada con mayor estabilidad que se describió detalladamente en lo precedente (el ácido nucléico es, en particular, DNA) ; (2) a un vector que comprende un ácido nucléico de acuerdo con (1); y (3) a una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con (2) (la célula huésped es, en particular, una célula huésped procariótica, en particular de E. coli) . Los siguientes ejemplos explican la invención en detalle, pero sin embargo sin limitarla a los parámetros específicos allí mencionados. Ejemplos Ejemplo 1: Clonación y expresión de botulino-neurotoxina del tipo A (BoNT/A) Para clonar las secuencia de DNA de la cadena ligera así como las regiones de transposición, de un cultivo de Clostridium botulinum tipo A (cepa ATCC 3502) se aisló DNA cromosonal. Mediante amplificación PCR con los cebadores SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2 se obtuvo un fragmento de gen que codifica para la cadena ligera de BoNT/A con secuencia de anillo modificada. El producto amplificado por PCR se clonó a través de los sitios de corte de restricción para Neo I y Bgl II en el plásmido de expresión pQE-??? que se derivó de pQE-60 y que codifica para una marca His (que consta de 10 residuos de histidina) en el lado 5' del sitio de clonación. Con esta clonación se generó el plasmido pQE-Hi0-BoNT/A-L . Mediante amplificación PCR con los cebadores SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4 se obtuvo el fragmento de gen que codifica para la cadena pesada de BoNT/A. A través de los sitios de corte de restricción para Stu I y Bgl II se clonó al extremo 3 ' de la secuencia de anillo de la cadena ligera en pQE-Hi0-BoNT/A-L (plásmido pQE-Hi0-BoNT/A) . La cepa de expresión E. coli Ml5[pREP4] (Qiagen) se transformó con el plásmido pQE-Hi0-BoNT/A. La expresión de la toxina recombinante se llevó a cabo mediante una inducción escalonada con 500 uM (concentración final) de IPTG a 25 eC durante la noche. Las células se abrieron en un regulador de fosfato de 50 mM a pH 8.0 con 300 mM de NaCl mediante tratamiento de lisozima y ultrasonido. El lisado centrifugado se incubó durante 5 h a la temperatura ambiente y después de un almacenamiento intermedio se cromatografió a -202C sobre una columna de Ni-NTA-agarosa. Para finalizar se efectuaron una diálisis de las fracciones lixiviadas contra un regulador de acoplamiento (100 mM de hidrofosfato de sodio pH 7.5, 150 mM de NaCl, 10 mM de EDTA) y una determinación de la concentración de proteína. Un análisis en el gel de SDS-poliacrilamida dio por resultado que mediante coomassie con condiciones reductoras se tiñieron dos bandas intensas en aproximadamente 50 kD y 100 kD así como una banda débil en 150 kD, en tanto que en condiciones no reductoras únicamente se pudo observar una banda en aproximadamente 150 kD, la cual corresponde al patrón de banda de una botulino-neurotoxina de tipo A en su estructura predominantemente bicatenaria con puentes de disulfuro . Ejemplo 2: Clonación y expresión de botulino-neurotoxina tipo B (BoNT/B) La clonación y expresión de una botulino neurotoxina del tipo B provista con una marca de histidina en terminal N (consistente en 10 residuos de histidina) se llevó a cabo de manera análoga a la toxina tipo A. Para la amplificación de la cadena ligera y pesada se usaron DNA cromosomales de Clostridium botulinum tipo B (cepa ocra) así como los cebadores SEQ ID No. 5 y SEQ ID No . 6 respectivamente SEQ ID No. 7 y SEQ ID No. 8. Ejemplo 3: Clonación y expresión de botulino-neurotoxina tipo Cl (BoNT/Cl) La clonación y expresión de una botulino neurotoxina del tipo Cl provista con una marca de histidina en terminal N (consistente en 10 residuos de histidina) se llevó a cabo de manera análoga a la toxina tipo A. Para la amplificación de la cadena ligera y pesada se usaron DNA cromosomales de Clostridium botulinum tipo B (cepa 205) así como los cebadores SEQ ID No. 9 y SEQ ID No. 10 respectivamente SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 12. Ejemplo 4: Clonación y expresión de C-Hi0-BoNT/A Para permitir una PEGilacion N terminal, en terminal N de la marca de histidina (consistente en 10 residuos de histidina) se añadió un residuo de cisteína a la secuencia de aminoácido. Esto se logró mediante mutagenésis dirigida en la región de secuencia de pQE-Hi0-BoNT/A, que codifica para la marca His. Para este propósito se utilizó el kit "QuickChange Site Directed Mugenesis" de la Cía. Stratagene. La reacción de mutagenésis tuvo lugar con los cebadores SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 14. El intercambio de nucleótidos en la secuencia de DNA se verificó mediante secuenciado de DNA de los clones aislados. La expresión y la depuración de la toxina mutada se efectuaron de manera análoga al ejemplo 1. Ejemplo 5: PEGilacion de C-Hi0-BoNT/A 1.2 mg de C-Hi0-BoNT/A se incubaron para la reducción de los dimeros con puente de disulfuro durante 30 minutos con 1 mM de DTT. Para eliminar el medio de reducción se cambió de regulador a regulador de acoplamiento sobre una columna PD-10. La solución de toxina se concentró mediante ultrafiltración a 3.6 mg/ml . Una pequeña parte se incubó sin tratamiento como prueba de control, el resto de la solución se mezcló con un excedente molar quintuplo de mPEG-Mal-5000 (Nektar Therapeutics ) y se rotó durante la noche a la temperatura ambiente. Para evitar posibles reacciones de derivatización en otros residuos de cisteina durante la preparación de la prueba para la SDS-PAGE el agente de PEGilacion se saturó con un excedente quintuplo de L-ciste na. En comparación con la preparación de control, en el gel de SDS se presentó en el caso de una aplicación no reductora una banda adicional intensa con movilidad levemente disminuida, en tanto que la intensidad de las bandas de toxina originales estaba notablemente disminuida a 150 kD (figura 2 ) . Ejemplo 6: Prueba de actividad in vitro La determinación de la actividad de proteasa específica (es decir, de la actividad catalítica sin acoplamiento y transposición) de los derivados de BoNT/A mutados PEGilados se efectuó en el formato ELISA. Para este propósito se clonó un polipéptido recombinante que en la región N terminal se compone de la pareja de fusión usual glutationa-S-transferasa (GST) y una secuencia de péptido C-terminal que comprende los 17 aminoácidos residuales C- terminales de SNAP- 25 . Estos 17 aminoácidos residuales representan la región de la proteína de sustrato SNAP-25 en que BoNT/A se escinde específicamente. Después de recubrir una placa de microtitulación con la proteína de fusión se incubó con Hi0-BoNT/A como prueba de referencia y con el mutante en la forma PEGilada y no PEGilada. La detección de los productos de escisión en cada caso generados se efectuó con un anticuerpo que reconoce específicamente la nueva terminal C producida. Los valores para C-Hi0-BoNT/A en su forma no PEGilada así como PEGilada así como para Hi0-BoNT/A (prueba de referencia) se indican en la tabla 3 . Teniendo en cuenta la amplitud de fluctuación del ensayo se puede comprobar que mediante la introducción de la mutación y la subsiguiente PEGilacion no se disminuye la actividad catalítica de la botulinotoxina, sino que más bien incluso se incrementó . Tabla 3
La actividad específica se determinó en unidades de proteasa/ng de proteína. Ejemplo 7 : Determinación de la actividad ex vivo en el ensayo de hemidiafragma Para determinar la actividad total de los derivados de toxina, es decir, el acoplamiento de la neurotoxina modificada al receptor de las células diana y la transposición a la célula nerviosa y proteólisis del sustrato SNARE se determinó el tiempo de parálisis de un preparado nervio-muscular del ratón después de la intoxicación. Como prueba de referencia sirvió nuevamente la Hi0-BoNT/A. Los valores de las actividades relativas se indican en la tabla 4. La disminución de la actividad de las botulinotoxinas modificadas de conformidad con la invención en comparación con la prueba de referencia a 20-30% evidentemente se debe a una menor capacidad del acoplamiento de la toxina a las células diana y a la menor capacidad de transponer la toxina a las células diana. Tabla 4
Ejemplo 8: Duración del efecto de la botulinotoxina mutada PEGilada (mPEG-C-Hi0-BoNT/A) se probó en ratones CD 1. En cada caso 10 ratones recibieron inyecciones intramusculares (2 x 0.05 mL) de botulinotoxina (i) mutada, (ii) mutada PEGilada y (iii) nativa en una dosificación de respectivamente 0.4 ó 0.6 unidades LD50/ratón (en solución salina fisiológica + 1 mg/mL de HSA) en el músculo gastrocnemio de la pata trasera. A continuación se calificó diariamente la parálisis del músculo mediante una escala (parálisis mínima, leve, intensa) . Después de 25 días ya no se observó parálisis del músculo en los animales que fueron tratados con la neurotoxina nativa. En los animales que se trataron con la botulinotoxina mutada y mutada PEGilada la duración del efecto se alargó por 7-20 días. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta .claro de la presente descripción de la invención.