ES2662402T3

ES2662402T3 - Neurotoxinas recombinantes de Clostridium botulinum

Info

Publication number: ES2662402T3
Application number: ES13811605.8T
Authority: ES
Inventors: Aimee Cossins; Matthew Beard; Philip Marks
Original assignee: Ipsen Biopharm Ltd; Ipsen Bioinnovation Ltd
Current assignee: Ipsen Biopharm Ltd; Ipsen Bioinnovation Ltd
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2018-04-06
Anticipated expiration: 2033-10-31
Also published as: TW201435084A; TWI673361B; CN110499321A; PL3326644T3; DK2914282T3; IN2015MN00436A; EP3326644A1; MX2019009222A; MX2015005156A; CA2885519A1; HUE036764T2; JP2020078321A; TW201825680A; AU2013340610B2; UA118837C2; AR117738A2; TWI626307B; EP2914282A1; JP2019068823A; HUE048802T2

Abstract

Un método para producir proteína BoNT/E1 de doble cadena soluble, comprendiendo dicho método: proporcionar una proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble que comprende una secuencia de aminoácidos contiguos, en el que dicha secuencia de aminoácidos contiguos tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, poner en contacto dicha proteína BoNT/E1 con tripsina en solución, y separar la proteína BoNT/E1 soluble de la tripsina poniendo en contacto la solución que contiene la proteína BoNT/E1 soluble y la tripsina con una superficie hidrófoba, en el que la proteína BoNT/E1 soluble se une preferentemente a la superficie hidrófoba.

Description

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La presente divulgación proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos contiguos, donde dicha secuencia de nucleótidos contiguos tiene al menos 80% (por ejemplo, al menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 1, y en el que dicha secuencia de nucleótidos contiguos codifica una proteína BoNT/E1 de cadena sencilla.

El serotipo BoNT/E se divide en ocho subtipos, BoNT/E1 a BoNT/E8, que comparten al menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos; las proteínas BoNT/E dentro de un subtipo dado comparten un mayor porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos (por ejemplo, al menos 95% o más). Como se describió anteriormente, las secuencias de ácidos nucleicos de la divulgación codifican una proteína BoNT/E1. Un ejemplo de una proteína BoNT/E1 es la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de UniParc UPI000016EA7F. Otro ejemplo de una proteína BoNT/E1 es la proteína codificada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Las secuencias de ácidos nucleicos de la presente divulgación se han diseñado para proporcionar ventajosamente altos niveles de expresión en células de E. coli.

Varios factores influyen en los niveles de expresión de una proteína determinada. Uno de tales factores es la velocidad a la que se traduce la secuencia de ARNm que codifica esa proteína. Este factor en sí mismo se ve afectado por los codones particulares que utiliza el ARNm para especificar cada aminoácido de la proteína. Algunos codones se traducen más rápidamente que otros. La elección del codón para cada aminoácido puede variar debido a que los codones del ARNm son de naturaleza degenerada. Varios codones diferentes pueden todos especificar el mismo aminoácido; por lo tanto, varias secuencias de ARNm diferentes pueden codificar la misma proteína. Los diferentes codones que especifican el mismo aminoácido se llaman codones sinónimos. La mezcla precisa de codones sinónimos en un ARNm particular afecta la velocidad de traducción de la proteína codificada.

Hay una serie de razones diferentes que explican por qué algunos codones se traducen más rápidamente que otros. Cada codón especifica un aminoácido al reclutar una molécula de ARNt unida a ese aminoácido. La velocidad de traducción se ve afectada por la abundancia relativa de varias moléculas diferentes de ARNt, por la afinidad con la que cada molécula particular de ARNt se une al codón que la recluta y también por otros factores tales como qué tan bien interactúa el par codón-molécula de ARNt con otros elementos de la maquinaria de traducción. Las velocidades aproximadas de traducción de codones pueden estimarse determinando la frecuencia a la que se encuentran diferentes codones en genes altamente expresados. Sin embargo, no todos los codones frecuentes producen una expresión óptima.

Sin desear estar ligados a ninguna teoría particular, los presentes inventores creen que la expresión óptima de las secuencias de ácidos nucleicos de BoNT/E1 se consigue reduciendo la frecuencia (es decir, el número de apariciones en una secuencia) de ciertos codones, en lo sucesivo denominados "codones lentos" y se exponen a continuación. A este respecto, los presentes inventores creen que dichos codones lentos están asociados con velocidades de traducción reducidas.

Aminoácido: Codón lento (ARN) Codón lento (equivalente de ADN)

Fenilalanina: UUU TTT

Tirosina: UAU TAT

Cisteína: UGU TGT

Histidina: CAU CAT

Glutamina: CAA CAA

Prolina: CCA y/o CCG CCA y/o CCG

Serina: UCA y/o UCG TCA y/o TCG

Arginina: CGG CGG

Leucina: UUA y/o CUA TTA y/o CTA

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huésped de E. coli.

En una realización, dicha proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble se expresa a un nivel de al menos 3 mg/L (por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/L).

En una realización, el método para producir proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble, como se describió anteriormente, comprende la lisis de la célula huésped de E. coli para proporcionar un homogeneizado de células huéspedes de E. coli que contiene dicha proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble. Los métodos y técnicas usados para lisar células huésped, tales como células huésped de E. coli, son conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen sonicación y el uso de una prensa francesa.

La invención proporciona un método para producir proteína BoNT/E1 de doble cadena soluble, comprendiendo dicho método: proporcionar una proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble que comprende una secuencia de aminoácidos contiguos, y en el que dicha secuencia de aminoácidos contiguos tiene al menos 95% (por ejemplo, al menos 95, 96, 97, 98, 99, 99,1; 99,2; 99,3; 99,4; 99,5; 99,6; 99,7; 99,8; 99,9 o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, y poner en contacto dicha proteína BoNT/E1 con tripsina en solución.

Cuando la proteína BoNT/E1 de cadena sencilla de la invención se pone en contacto con tripsina, la acción proteolítica de la tripsina escinde la proteína de cadena sencilla en un sitio entre el componente de la proteasa de la cadena L y el componente de translocación para producir una proteína de doble cadena, donde las dos cadenas están unidas por un puente disulfuro (en forma más detallada, las dos cadenas formadas después de la escisión de BoNT/E1 de cadena sencilla en el sitio de activación son una primera cadena de restos de aminoácidos 1-419 y una segunda cadena de restos de aminoácidos 423-1.252, con los restos 420, 421 y 422 eliminados por el evento de escisión). Por lo tanto, la tripsina puede usarse para activar el polipéptido de cadena sencilla convirtiéndolo en la forma de doble cadena activa. De este modo, ventajosamente, el uso de tripsina significa que no es necesario diseñar un sitio de escisión exógeno (no nativo) en una BoNT/E1 de la invención.

En una realización, la referencia a tripsina abarca enzimas de tipo tripsina que escinden en el mismo sitio de escisión de proteasa que la tripsina.

La tripsina escinde secuencias de proteína en las que determinados aminoácidos se encuentran en determinadas posiciones a ambos lados del enlace peptídico escindido. Tales secuencias se pueden representar mediante la nomenclatura P4-P3-P2-P1-enlace escindido-P'1-P'2-P'3-P'4; en la que P1 a P4 designan aminoácidos posicionados en las posiciones 1 a 4 en el lado del extremo terminal N del enlace peptídico escindido respectivamente y P'1 a P'4 designan a las posiciones 1 a 4 en el lado del extremo terminal C del enlace peptídico escindido respectivamente.

Lo más importante es que la tripsina escinde secuencias de proteína donde los aminoácidos Arg o Lys ocupan la posición P1. Cuando Lys está en la posición P1, hay tres tipos principales de secuencia que no son sensibles a la tripsina:

(1): Pro en la posición P'1 generalmente reduce la susceptibilidad a la escisión por tripsina (pero no cuando Trp está en la posición P2).

(2): O bien Cys o Asp en la posición P2 junto con Asp en la posición P'1 reduce la susceptibilidad a la escisión por tripsina.

(3): Cys en la posición P2 junto con His o Try en la posición P'1 reduce la susceptibilidad a la escisión por tripsina.

Cuando Arg está en la posición P1 también hay tres tipos principales de secuencia que no son sensibles a la tripsina:

(1): Pro en la posición P'1 generalmente reduce la susceptibilidad a la escisión por la tripsina (pero no cuando Met, o posiblemente Glu, está en la posición P2).

(2): Cys en la posición P2 junto con Lys en la posición P'1 reduce la susceptibilidad a la escisión por tripsina.

(3): Arg en la posición P2 junto con His o Arg en la posición P'1 reduce la susceptibilidad a la escisión por tripsina.

En una realización, la invención proporciona un método (como se describió anteriormente) para producir proteína BoNT/E1 de doble cadena soluble, con la condición de que dicha secuencia de aminoácidos contiguos incluye uno o más (por ejemplo, uno o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, o siete) de los siguientes aminoácidos (en donde la numeración de posición de aminoácido comienza con el resto de aminoácido del extremo terminal N y termina con el resto de aminoácido del extremo terminal C de la proteína BoNT/E1): glicina en la posición 177; serina en la posición 198; alanina en la posición 340; leucina en la posición 773; leucina en la posición 963; glutamina en la posición 964; alanina en la posición 967; asparagina en la posición 1.195.

En una realización, la presencia de dichos uno o más aminoácidos, como se describió anteriormente (y con referencia a las permutaciones múltiples de dichos uno o más aminoácidos como se describió anteriormente),

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proporciona una proteína BoNT/E1 que tiene una solubilidad mejorada en comparación con un proteína BoNT/E1 que carece de dichos aminoácidos. Dicha solubilidad mejorada puede aumentar el rendimiento de la proteína en un sistema de expresión heterólogo.

En una realización, en la que la invención proporciona un método (como se describió anteriormente) para producir proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble, la proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble se proporciona mediante un método como se describió anteriormente para producir proteína BoNT/E1 de cadena sencilla soluble en una célula huésped de E. coli.

El método de la invención comprende separar la proteína BoNT/E1 soluble de la tripsina poniendo en contacto la solución que contiene la proteína BoNT/E1 soluble y la tripsina con una superficie hidrófoba, donde la proteína BoNT/E soluble se une preferentemente a la superficie hidrófoba.

Los presentes inventores han descubierto que pueden obtenerse altos rendimientos de la proteína BoNT/E1 de doble cadena activada usando un proceso de purificación hidrófoba para separar el polipéptido de doble cadena activado de la tripsina. Sorprendentemente, este proceso proporciona una purificación superior a la purificación estándar usando cromatografía de intercambio iónico, que los presentes inventores han encontrado que es ineficaz para separar el polipéptido de doble cadena activado de la tripsina. Además, el proceso proporciona ventajosamente una proteína BoNT/E1 de doble cadena activada que está libre de la proteasa activadora, como parte de un proceso de purificación general.

La producción de BoNT/E1 recombinante activa requiere una etapa proteolítica que escinde la molécula en la forma de doble cadena activa. Esta escisión se puede lograr mediante una etapa de activación in vitro usando la proteasa, tripsina. Después de la etapa de activación, es importante eliminar la proteasa del producto final, lo que también evita cualquier división adicional no específica de BoNT/E1.

Los puntos isoeléctricos (pI) de tripsina y BoNT/E1 son 9,32 y 6,2 respectivamente, lo que indica que la separación de las dos proteínas se debe lograr mediante cromatografía de intercambio iónico (IEX), que explota la diferencia de carga entre las dos moléculas. La carga neta de una proteína se ve afectada por el pH del entorno que la rodea y se volverá más positiva o negativamente cargada, dependiendo de si gana o pierde protones. El pI es el valor de pH al cual una molécula no porta carga eléctrica y por lo tanto no interactuará con un medio IEX cargado. Esto significa que, si una proteína está a un pH por encima de su pI, entonces tendrá una carga neta negativa y se unirá a un medio con carga positiva, como un intercambiador de aniones. Del mismo modo, si el pH del regulador está por debajo del pI, entonces la proteína tendrá una carga neta positiva y no se unirá a un intercambiador de aniones.

Con base en este principio a pH 8, se esperaría que BoNT/E (que tiene un pI de 6,2) se uniría a una columna de intercambio aniónico, mientras que la tripsina con un pI de 9,32 no lo haría, permitiendo que las dos proteínas se separen. El IEX es un método de cromatografía simple y económico, ya que no requiere que la proteína cargada en la columna esté en un regulador con alto contenido de sal, lo que puede provocar pérdidas de proteína por precipitación.

Los presentes inventores han probado una variedad de columnas de intercambio aniónico, utilizando grupos funcionales fuertes y débiles unidos a perlas de agarosa entrecruzada, a pH 8. En cada caso, se encontró que una gran proporción de tripsina no se unía a la columna como se había predicho y estaba presente en el flujo continuo. Sin embargo, cuando las columnas se eluyeron con un gradiente lineal de fuerza iónica creciente, la tripsina se eluyó de la columna indicando que una proporción de la tripsina era capaz de unirse a las columnas. Cuando se comparó con la elución de BoNT/E1, se descubrió que, inesperadamente, la tripsina se eluía con una fuerza iónica similar (Tabla 1; Figura 1) lo que indica que la tripsina no se separó como se predijo y estaría presente en el producto BoNT/E1 purificado final con la posibilidad adicional de una mayor degradación de BoNT/E1.

Tabla 1: Fracciones de elución de columnas de intercambio aniónico en las que se evaluó la separación de tripsina de BoNT/E1. Los picos se indican en el número de volúmenes de columna (CV) F/T: Flujo que pasa a través de la columna, FF: resina de flujo rápido.

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En una realización, el proceso de purificación hidrófoba para separar la proteína BoNT/E1 de doble cadena activada de tripsina reduce la concentración de tripsina al menos 100 veces, al menos 150 veces, al menos 200 veces, al menos 250 veces, al menos 300 veces, al menos 350 veces, al menos 400 veces, al menos 450 veces o al menos 500 veces. En una realización preferida, el proceso de purificación hidrófoba para separar la proteína BoNT/E1 de

30 doble cadena activada de tripsina reduce la concentración de tripsina al menos 350 veces.

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en el que dicha composición farmacéutica líquida no comprende un agente estabilizante de proteínas; y

en el que dicha composición farmacéutica líquida contiene menos de 10 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1, o menos de 7 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1, o menos de 5 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1; preferiblemente en el que dicha composición farmacéutica líquida contiene menos de 10 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1, o menos de 7 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1.

En una realización, la proteína BoNT/E1 de doble cadena activa está presente en la composición (como se describió anteriormente) a una concentración de 1-100 ng/mL. En una realización, la proteína BoNT/E1 de doble cadena activa está presente en la composición (como se describió anteriormente) a una concentración de 5-50 ng/mL, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 ng/mL. En una realización preferida, la proteína BoNT/E1 de doble cadena activa está presente a una concentración de aproximadamente 20 ng/mL.

En una realización, el tensioactivo (como se describió anteriormente) es un polisorbato, tal como un polisorbato que tiene un grado medio de polimerización que varía de 20 a 100 unidades monoméricas, y puede ser, por ejemplo, polisorbato 80. En una realización preferida, el polisorbato se deriva de una fuente vegetal. La concentración del tensioactivo es preferiblemente inferior al 1% v/v, por ejemplo de aproximadamente 0,005% a 0,02% v/v en el caso del polisorbato 80.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede comprender un agente cristalino.

Por agente cristalino se entiende un agente que, entre otros, mantiene una estructura de torta mecánicamente resistente para un complejo de neurotoxina botulínica liofilizada (tipo A, B, C, D, E, F o G) o una neurotoxina botulínica de alta pureza (tipo A, B, C, D, E, F o G). Cuando se incluyen en formulaciones sólidas, los agentes cristalinos también tienen un efecto de aumento de volumen. Los agentes cristalinos incluyen notablemente cloruro de sodio. La concentración de agente cristalino puede ser, por ejemplo, de 0,1 a 0,5 M, preferiblemente de 0,1 a 0,4 M, notablemente de aproximadamente 0,15 a 0,3 M.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede comprender un regulador para mantener el pH a un nivel comprendido entre 5,5 y 7,5, o entre 6,0 y 7,0. El regulador puede ser cualquier regulador capaz de mantener el pH adecuado. Por ejemplo, el regulador para las composiciones de acuerdo con la invención se puede elegir del grupo que consiste en succinato, fosfato disódico/ácido cítrico y un aminoácido tal como histidina. La concentración del regulador puede ser, por ejemplo, de 1 a 50 mM, preferiblemente de 5 a 20 mM, preferiblemente aproximadamente de 10 mM.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede comprender un disacárido.

El disacárido usado en las composiciones de acuerdo con la invención se puede elegir del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa, manitol y lactosa. En una realización específica, el disacárido es sacarosa. La concentración del disacárido puede ser, por ejemplo, de 5 a 50 mM, preferiblemente de 5 a 25 mM, más preferiblemente de 10 a 20 mM, y lo más preferiblemente de aproximadamente 11,7 mM.

En una realización particular, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica líquida que comprende:

(a): una proteína BoNT/E1 de doble cadena activa, como se describió anteriormente,

(b): un agente estabilizante no proteico que es un tensioactivo,

(c): cloruro de sodio,

(c): un regulador para mantener el pH entre 5,5 y 7,5,

(e): un disacárido, y

(f): agua estéril,

en la que dicha composición farmacéutica líquida no comprende un agente estabilizante de proteína; y

en la que dicha composición farmacéutica líquida contiene menos de 10 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1, o menos de 7 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1, o menos de 5 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1; preferiblemente en la que dicha composición farmacéutica líquida contiene menos de 10 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1, o menos de 7 pg de tripsina por 100 ng de proteína BoNT/E1.

De acuerdo con una realización específica, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención en forma líquida se sella en un vial o en un dispositivo listo para usar, tal como una jeringa, sin interfase líquida/gaseosa, y es estable durante al menos tres meses o al menos seis meses a 23 a 27ºC y durante al menos doce meses a 2-8ºC.

En un aspecto, la invención proporciona una proteína BoNT/E1 de doble cadena activa como se describe en la reivindicación 9, o una proteína BoNT/E1 de doble cadena activa que se puede obtener por escisión proteolítica de

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SEQ ID NO: 3 Secuencia de ácidos nucleicos de BoNT/E1 de tipo silvestre 5

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Lista de Figuras

Figura 1: Fracciones de elución de columnas de intercambio aniónico en las que se evaluó la separación de tripsina de BoNT/E1. El pico de tripsina, BoNT/E1 y el gradiente de sal están marcados. Fig. 1A: Q-Sefarosa HP; Fig. 1B: DEAE Sefarosa.

Figura 2: Fracciones de elución de columnas de interacción hidrófoba en las que se evaluó la separación de tripsina de BoNT/E1. El pico de tripsina, BoNT/E1 y el gradiente de sal están marcados. Fig. 2A: Fenil Sefarosa HP; Fig. 2B: Butil Sefarosa HP; Fig. 2C: Octil Sefarosa FF.

Figura 3: Nivel de expresión soluble del cultivo de rBoNT/E1 determinado por transferencia Western, en comparación con BoNT/E1 comercial.

Figura 4: SDS-PAGE de rBoNT/E1 en condiciones no reductoras y reductoras que confirman la formación de la estructura de doble cadena.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construcción de una secuencia optimizada de ácido nucleico de BoNT/E1

La secuencia de ADN se diseñó inicialmente por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos de BoNT/E1 (SEQ ID NO: 2). Se añadió una secuencia de restricción (PstI) al extremo del terminal N y un codón de terminación y secuencias de restricción adicionales, XbaI-codón de detención-HindIII, al extremo del terminal C. La secuencia de ADN se optimizó luego para la expresión en función del número y la ubicación de los codones lentos (como se definió anteriormente).

La secuencia se optimizó para seleccionar contra codones lentos. Esto se aplicó particularmente al comienzo de la secuencia para obtener un buen inicio y comenzar la traducción. Cuando se incluyeron codones lentos (para permitir el uso de acuerdo con el sesgo de expresión del codón huésped), estos se encontraban hacia el final de la secuencia (donde el comienzo de la secuencia se define como el lugar donde se inicia la traducción).

Una vez que se había diseñado la secuencia, se sintetizó la secuencia de ADN optimizada en dos partes usando un sitio PstI único/nativo para su posterior ensamblaje en el gen de la toxina de longitud completa. La secuencia del primer gen incluía un sitio NdeI en el extremo terminal amino y un sitio PstI en el extremo terminal carboxilo. Esta parte del gen tenía una longitud de 2.895 pb, que codifica la LC de BoNT/E1 y la porción amino de HC. La secuencia del segundo gen incluía un sitio PstI en el extremo terminal N y el sitio HindIII en el extremo terminal carboxilo, tenía una longitud de 882 pb y codificaba la porción carboxilo de la HC de BoNT/E1.

Ejemplo 2

Construcción de la secuencia de ácidos nucleicos de BoNT/E1 del vector de expresión

Se empleó un vector de expresión basado en el vector pET-26b(+) (Novagen), que incluye los sitios de restricción de clonación NdeI y HindIII localizados al comienzo y al final del ADN que codifica el ORF de BoNT/E1. El vector pET26b(+) era de movilización deficiente pero podría movilizarse si era corresidente con otros plásmidos que pueden ser movilizados. El vector pET-26b(+) se modificó para eliminar los genes de movilidad y hacerlos inmovilizables.

El vector de expresión se digirió con NdeI y PstI y la cadena principal del vector purificado se ligó con el primer fragmento de ADN de BoNT/E1 que se había digerido con las mismas enzimas de restricción para crear un producto intermedio. En la segunda etapa de clonación, el ADN de BoNT/E1 del segundo fragmento que había sido digerido con PstI y HindIII se ligó en el producto intermedio de la etapa uno (que también se había digerido con las mismas enzimas de restricción). Esto condujo a la creación del producto final de ADN de BoNT/E1 en el vector de expresión.

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llevó a una alta concentración de sal y se cargó en una columna de captura hidrófoba (butil sefarosa). La rBoNT/E1 unida se eluyó de la columna usando un gradiente de regulador Tris bajo en sal. La proteína eluida se purificó adicionalmente usando una columna de intercambio iónico tal como Q-sefarosa, eluyendo un gradiente de regulador Tris con alto contenido de sal. Luego se añadió tripsina a la muestra de rBoNT/E1 eluida hasta una concentración

5 final de 2,5 μg/mL y se incubó a 37ºC durante 40 minutos. Esto cortó el bucle de activación de BoNT/E1 y formó la estructura de doble cadena BoNT/E1 final, como se confirmó al reducir la SDS-PAGE (Figura 4).

Ejemplo 7

Purificación final de la proteína BoNT/E1 objetivo libre de activación de proteasa

La muestra de rBoNT/E1 activada se cargó inmediatamente en un regulador de alto contenido de sal en una

10 columna hidrófoba (butil sefarosa). La columna se lavó con regulador con alto contenido en sal para eliminar la tripsina débilmente asociada, antes de aplicar un gradiente de regulador Tris bajo en sal para eliminar adicionalmente la tripsina de la columna y la proteína rBoNT/E1 unida. La proteína rBoNT/E1 se eluyó luego tarde en el gradiente, lejos de la tripsina.

Ensayo para determinar los niveles de tripsina

15 Se desarrolló un ELISA de tripsina para determinar los niveles presentes en las fracciones de columna y en la muestra final de BoNT/E1. Se recubrió un anticuerpo de captura anti-tripsina con placas de microtitulación durante 1 hora a 37ºC. Los patrones de tripsina y las muestras de prueba se añadieron a la placa (100 μL/pozo) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC antes de su detección con un segundo anticuerpo anti-tripsina. La cantidad de tripsina en cada fracción de muestra/columna se interpoló luego a partir de los patrones y se superpuso sobre el cromatograma

20 de purificación para confirmar la separación de la tripsina de la BoNT/E1 (Figura 2B).

Ejemplo 8

Formulación que comprende BoNT/E1 de doble cadena activa sustancialmente libre de tripsina

Se prepararon las siguientes seis composiciones líquidas que comprenden BoNT/E1 de doble cadena activa (Tabla 3).

1: 2 3 4 5 6

Polisorbato 80: 0,10 mg/mL 0,10 mg/mL 0,10 mg/mL 0,10 mg/mL - -

Poloxámero: - - - - 0,04 mg/mL 0,04 mg/mL

Sacarosa: 4,0 mg/mL - 4,0 mg/mL - 4,0 mg/mL -

Manitol: - 4,0 mg/mL - 4,0 mg/mL - 4,0 mg/mL

Cloruro de sodio: 8,76 mg/mL 8,76 mg/mL 8,76 mg/mL 8,76 mg/mL 8,76 mg/mL 8,76 mg/mL

pH: 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

Regulador: L-Histidina/ ácido clorhídrico L-Histidina/ ácido clorhídrico Fosfato disódico/ ácido cítrico anhidro Fosfato disódico/ ácido cítrico anhidro L-Histidina/ ácido clorhídrico L-Histidina/ ácido clorhídrico

BoNT/E1 de doble cadena: 20 ng/mL 20 ng/mL 20 ng/mL 20 ng/mL 20 ng/mL 20 ng/mL

Agua MilliQ: suficiente hasta 1 mL suficiente hasta 1 mL suficiente hasta 1 mL suficiente hasta 1 mL suficiente hasta 1 mL suficiente hasta 1 mL

25 Las seis composiciones se almacenaron a 25ºC durante 12 semanas. La estabilidad de la función de la proteasa de BoNT/E1 de doble cadena se evaluó durante ese período usando un ensayo de endopeptidasa libre de células. Las tasas de degradación mensual para las seis formulaciones estuvieron por debajo del 5% por mes durante las 12 semanas, lo que muestra que la función de la proteasa BoNT/E1 de doble cadena de las seis composiciones permanece estable a 25ºC durante al menos 12 semanas.

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Claims

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