KR102264478B1

KR102264478B1 - 재조합 클로스트리디움 보툴리눔 신경독

Info

Publication number: KR102264478B1
Application number: KR1020207026658A
Authority: KR
Inventors: 에이미 코신스; 매튜 비어드; 막스 필립
Original assignee: 입센 바이오이노베이션 리미티드; 입센 바이오팜 리미티드
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2021-06-15
Also published as: KR102188539B1; US20150247139A1; TW201825680A; EP2914282B1; CN110499321A; MX367080B; PT3326644T; DK3326644T3; WO2014068317A1; JP2019068823A; US10030238B2; AU2018203556B2; EA201590794A1; AU2018203556A1; ES2662402T3; HUE036764T2; AU2013340610A1; MX2019009222A; AR117738A2; EP2914282A1

Abstract

본 발명은 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공하는 것으로, 인접 뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖으며, 그리고 인접 뉴클레오티드의 서열은 단일-사슬 BoNT/E1 단백질을 암호화한다. 본 발명은 또한 가용성 이중-사슬(di-chain) BoNT/E1 단백질의 제조 방법과 함께, E. coli 숙주 세포에서 가용성 단일-사슬(single-chain) BoNT/E1 단백질의 제조방법을 제공한다.

Description

재조합 클로스트리디움 보툴리눔 신경독{Recombinant Clostridium botulinum neurotoxins}

본 특허출원은 2012년 10월 31일에 출원된 영국특허 제1219602.8호에 대해 우선권이 주장되며, 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 인용된다.

도면 목록
도 1
BoNT/E1로부터 트립신의 분리를 하는 음이온 교환 칼럼에서 용출 분획을 평가하였다. 트립신, BoNT/E1 및 염 구배(salt gradient)의 피크(peak)가 표시되었다. 도 1a: Q-세파로오스(Sepharose) HP; 도 1b: DEAE 세파로오스.
도 2
BoNT/E1로부터 트립신의 분리를 하는 소수성 상호작용 칼럼에서 용출 분획을 평가하였다. 트립신, BoNT/E1 및 염 구배의 피크가 표시되었다. 도 2a: 페닐 세파로오스 HP; 도 2b: 부틸 세파로오스 HP; 도 2c:) 옥틸 세파로오스 FF.
도 3
통상의(commercial) BoNT/E1와 비교하여, 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의해 결정된 rBoNT/E1 배양(culture)의 가용성 발현 수준(level).
도 4
이중-사슬 구조의 형성을 확인하는 비-환원(non-reducing) 및 환원(reducing) 조건(condition)하에서 rBoNT/E1의 SDS-PAGE.

본 발명은 혈청형 E (BoNT/E)의 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) (C. 보툴리눔) 신경독을 암호화(encoding)하는 핵산 서열, 및 재조합BoNT/E의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 BoNT/E의 해당되는 의료 용도에 관한 것이다.

보툴리눔 신경독은 다수의 부속(accessory) 단백질에 BoNT 그자체로 복합되어 구성되는 거대 단백질 복합체의 형태인 C. 보툴리눔(C. botulinum)에 의해서 제조된다. 현재 일곱가지의 다른 보툴리눔 신경독의 종류가 있다. 즉: 보툴리눔 신경독 혈청형 A, B, C₁, D, E, F 및 G, 이들 모두는 비슷한 구조 및 작용기작(modes of action)을 공유한다. 각각 다른 BoNT 혈청형은 아미노산 수준에서 백분율 서열 동일성과 관련있는 혈청형에 의한 분류에 의해서, 특정 중화 항혈청(anti-sera)에 의한 불활성화를 기반으로 구별될 수 있다. 주어진(given) 혈청형의 BoNT 단백질은 아미노산 백분율 서열 동일성을 기반으로 서로 다른 하위유형으로 구분된다.

BoNT는 혈청형에 따라 0.5 내지 5 ng/kg의 범위에서 쥐에 대한 반수 치사량(LD50) 값을 가진, 알려진 가장 강력한 독소이다. BoNT는 위장관에서 흡수되고, 그리고 일반적인 순환을 한 후에 콜린성 신경 말단의 시냅스 전 막에 흡착하고, 그리고 이들 신결전달물질 아세틸 콜린의 방출을 막는다. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G는 시냅토브레빈/소낭(vesicle)-관련 막 단백질 (VAMP)을 절단한다; BoNT/C, BoNT/A 및 BoNT/E는 25 kDa의 시냅토솜(synaptosomal)-관련 단백질(SNAP-25)을 절단한다; 그리고 BoNT/C는 신택신(syntaxin)을 절단한다.

자연적으로, 클로스트리디움 신경독은 이황화 결합에 의해 함께 결합된 두개의 폴리펩티드 사슬을 형성하기 위해 단백질 가수분해 절단 사건(event)에 의해서 후-번역으로 변형된(modified) 단일-사슬 폴리펩티드로 합성된다. 절단(cleavage)은 특정 절단 부위(cleavage site)에서 일어나고, 종종 활성 부위라고도 하고, 이것은 사슬간 이황화 결합을 제공하는 시스테인 잔기 사이에 위치한다. 이것은 독소의 활성 형태인 이중-사슬 형태이다. 두개의 사슬은 약 100 kDa의 분자량을 가진 중사슬(H-사슬), 그리고 약 50 kDa의 분자량을 가진 경사슬(L-사슬)이라 칭한다. H-사슬은 C-말단 표적화(targeting) 성분(H_C 도메인) 및 N-말단 전좌(translocation) 성분(H_N도메인)을 포함한다. 절단 부위는 L-사슬 및 전좌 성분 사이에 위치한다. 표적 뉴론에 H_C 도메인의 결합 및 엔도솜을 통해 세포안으로 결합된 독소의 내재화에 따라서, H_N 도메인은 엔도조말(endosomal) 막을 가로질러 시토졸(cytosol) 내에서 L-사슬을 전좌(translocate)하고, 그리고 L-사슬은 단백질분해효소(protease) 기능을 제공한다(또한, 비-세포독성 단백질분해효소라고도 함).

비-세포독성 단백질분해효소(non-cytotoxic protease)는 SNARE 단백질(예; SNAP-25, VAMP, 또는 신택신)로 알려진 세포내 운송 단백질을 단백질 가수분해-절단(cleaving)하는 역할을 한다- 참조 Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. 두문자어 SNARE는 가용성 NSF 부착 수용체(Soluble NSF Attachment Receptor)로부터 유래한다. 여기서, NSF는 N-에틸말레이미드-민감 인자(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)를 의미한다. SNARE 단백질은 세포 소낭 융합(intracellular vesicle fusion)에 필수적이고, 따라서 세포로부터 소장이동을 통한 분자의 분비에 필수적이다. 단백질분해효소 기능은 아연-의존 엔도펩티다제 활성이고 그리고 SNARE 단백질에 대한 높은 기질 특이성을 나타낸다. 따라서, 일단 원하는 표적 세포로 전달되면, 비-세포독성 단백질분해효소는 표적 세포로부터 세포 분비를 억제할 수 있다. 클로스트리디움 신경독의 L-사슬 단백질분해효소는 SNARE 단백질을 절단하는 비-세포독성 단백질분해효소이다.

보툴리눔 신경독은 이완성 근육마비(flaccid muscle paralysis )를 야기시킬 수 있는 능력에 대해 잘 알려져 있다. 상기 근육-이완 특성은 보툴리눔 신경독(예: BoNT/A)이 미간 라인 또는 과잉 운동된 얼굴 라인, 두통, 반축안면경련, 방광의 과잉활동, 다한증, 코 입술 라인, 경부근긴장이상증(cervical dystonia), 안검 경련, 및 경련의 치료를 포함하는 다양한 의학 및 미용 시술에 적용되게 한다.

전통적으로, BoNT의 제조는 C. 보툴리눔 박테리아의 배양에 의해서 수행되고, 뒤이어 보툴리눔 신경독 복합체(complex)의 분리 및 정제가 수행된다. 그러나, 이러한 방법에 의한 BoNT의 제조는 비효율적이고 그리고 낮은 단백질 수율을 제공한다. 게다가, C. 보툴리눔은 포자-형성(spore-forming) 박테리아이고 따라서 Escherichia coli (E. coli)과 같은 박테리아의 배양을 위해서는 요구되지 않는 전문적인 배양 장비 및 설비가 요구된다. BoNT의 사용이 증가됨에 따라서 대안의 및/또는 BoNT의 제조 및 정제 방법의 개선이 필요하다.

미국특허 제20080103098호는 E. coli 숙주 세포에서 재조합 핵산 구축물(construct)의 발현을 포함하는 이중-사슬 형태인 재조합 BoNT 단백질의 제조방법을 설명한다. 그러나, 상기 방법은 신경독의 루프 도메인 안에 특정, 비-자생(non-native)(즉, 비-클로스트리디움(clostridial)) 펜타펩티드 서열의 삽입을 요구한다. 삽입된 펜타펩티드 서열은 세포 용해되면 내생의 E. coli 단백질분해효소에 의해 절단되어 활성 절단 부위(cleavage site)를 형성한다. 따라서, 미국특허 제20080103098호에 의한 방법은 최적의 BoNT 발현을 달성하기 위해, BoNT 서열이 비-자생(non-native) 절단 부위의 삽입에 의해서 변형되어야 함을 나타낸다.

미국특허 제7132259호는 BoNT 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자를 설명한다. 그러나, 미국특허 제 7132259의 상기 핵산분자는 자생(native) 절단 부위를 비-자생(non-native) 절단 부위로 치환하기 위해 변형되어야 한다. 이리하여, 미국특허 제7132259호의 방법은 또한, 최적의 BoNT 발현을 위해서 비-자생 절단 부위의 삽입이 요구됨을 나타낸다.

미국특허 제6495143호는 면역반응(백신접종과 같은) 유도에 사용하기 위한, BoNT의 중사슬(heavy chain)(Hc) 단편(fragment)을 암호화하는 재조합 핵산 분자를 개시한다. 그러나, 상기 핵산 분자는 전체 길이 BoNT 서열을 암호화하지 않는다. E. coli 에서의 발현 및 테타누스 독소(tetanus toxin) 및 BoNT의 개별 H 사슬과 L 사슬의 정제는 달성될 수 있다; 이러한 단리된 사슬(isolated chain)은 그자체로 무-독성이다. 이러한 펩티드 사슬의 별도 생산 및 엄격하게 통제된 조건하에 따라 H 및 L 서브유닛은 활성 이중-사슬을 형성하기 위해서 산화 이황화 결합에 의해 결합될 수 있다. 불행하게도, 이러한 전략은 몇가지 단점이 있다. 첫째, 이것은 다량의 개별 사슬을 발현 및 단리(isolate)시키는데 실용적이지 않다; 특히, H-사슬의 부재하에서 단리된 L-사슬은 수용액에서 매우 불수용성이고 단백질 가수분해 저하에 매우 민감하다. 두번째로, 활성 이중-사슬을 형성하기 위해서 개별적으로 발현되고 정제된 H 사슬 및 L 사슬의 시험관내(in vitro) 산화는 매우 비효율적이고, 그리고 이것은 활성 독소의 저수율에 이르게 하며 많은 불활성의 잘못 접힌(folded) 또는 산화된 형태의 생산으로 이어지게 한다. 이러한 비활성 형태와 미반응 분리된 H 및 L 사슬에서의 분리 때문에, 정확하게 접힌 또는 산화된 H 및L 사슬-함유한 독소의 정제는 어렵다. 따라서, 미국특허 제6495143호는 상당한 단점을 가지고 있다.

따라서, 당업계는 재조합 BoNT의 개선된 제조방법이 필요하다. 특히, 활성화된 이중-사슬 BoNTs 재조합 BoNT/E의 제조방법이 필요하다.

본 발명은 청구범위에 규정된 핵산 서열 및 방법을 제공하여, 위에 언급된 하나 이상의 문제를 해결한다.

일 측면에서, 본 발명은 인접 뉴클레오티드(contiguous nucleotides)의 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 여기서 인접 뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NO: 1의 핵산서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖으며(예를 들면, 적어도 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9, 또는 100%), 여기서 인접 뉴클레오티드의 서열은 단일-사슬 BoNT/E1 단백질을 암호화한다.

BoNT/E 혈청형은 90% 아미노산 서열 동일성을 공유하는, 적어도 8개의 하위유형(subtype)인 BoNT/E1 내지 BoNT/E8으로 나뉜다; 주어진 하위 유형내의 BoNT/E 단백질은 더 높은 아미노산 백분율 서열 동일성을 공유한다(예를 들면, 적어도 95%이상). 상술한 바와 같이, 본 발명의 핵산 서열은 BoNT/E1 단백질을 암호화한다. BoNT/E1 단백질의 예는 UniParc 아미노산 서열 UPI000016EA7F에 의해 암호화된 단백질이다. BoNT/E1 단백질의 다른 예는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열에 의해 암호화된 단백질이다.

본 발명의 핵산 서열은 바람직하게 E. coli 세포내에서 고발현을 제공하도록 고안되었다.

많은 인자(factor)들은 주어진 단백질의 발현 수준에 영향을 미친다. 하나의 이러한 인자는 단백질이 번역 되는(translated) mRNA 서열 암호화하는 속도이다. 이러한 인자는 그 자체로 mRNA가 단백질의 각각의 아미노산을 지정하는데 사용되는 특정 코돈에 의해서 영향을 받는다. 일부 코돈은 다른 것보다 훨씬 빨리 번역된다. mRNA 코돈은 자연적으로 퇴화하기 때문에 각 아미노산에 대한 코돈의 선택은 다를 수 있다. 여러 다른 코돈은 모두 동일한 아미노산을 지정(specify)할 수 있다; 따라서, 여러 다른 mRNA 서열은 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 같은 아미노산을 지정한 다른 코돈은 동의 코돈(synonymous codons)이라고 한다. 특정 mRNA 동의 코돈의 정확한 혼합물은 암호화된 단백질의 번역 속도에 영향을 미친다.

일부 코돈이 다른 것들보다 더 빠르게 번역되는 것을 설명하는 몇 가지 다른 이유들이 있다. 각 코돈은 아미노산에 부착된 tRNA 분자를 모집(recruiting)하여 아미노산을 지정한다. 번역 속도는 다양한 다른 tRNA 분자의 상대 존재비(relative abundance)에 의해서, 각 특정 tRNA 분자가 그것을 모집하는 코돈에 결합하는 친화력에 의해서, 그리고 또한 얼마나 잘 코돈-tRNA 분자 쌍(pair)이 번역 기관의 다른 요소와 상호작용을 하는 지와 같은 다른 인자에 의한 영향을 받는다. 대략의 코돈 번역 속도는 다른 코돈이 높게-발현된 유전자에서 발견되는 빈도를 밝힘으로써 예측될 수 있다. 그러나, 자주 발생하는 모든 코돈이 최적의 발현을 야기하는 것은 아니다.

임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 BoNT/E1 핵산 서열의 최적의 발현은 특정 코돈, 이하, "슬로우 코돈(slow codon)"의 빈도(frequency)(즉, 하나의 서열에서 발생 횟수)를 감소시킴으로써 달성될 수 있다고 믿는다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 상기 슬로우 코돈은 감소된 번역 속도와 연관된다고 믿는다.

본 발명자는 본 발명의 핵산 서열을 생산하기 위해서 합리적인 서열 설계의 공정을 사용하였다. 본 발명의 핵산 서열이 암호화된 BoNT/E1 단백질의 높은 발현 수준을 제공하기 위한 한가지 방법은 최적화된 수의 슬로우 코돈을 가지는 것이다(예를 들면, 슬로우 코돈이 서열안에서 나타나는 빈도의 감소).

일 구체예에 있어서, 핵산 서열은 최대 160개의 슬로우 코돈을 갖는다(예를 들면, 최대 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 또는 87개의 슬로우 코돈).

따라서, 일 구체예에 있어서, 핵산 서열은 0 내지 160개 사이의 슬로우 코돈을 갖는다(예를 들면 0-160, 0-150, 0-140, 0-130, 0-120, 0-110, 0-100, 0-90, 0-95, 0-94, 0-93, 0-92, 0-91, 0-90, 0-89, 0-88, 또는 0-87개의 슬로우 코돈).

일 구체예에 있어서, 핵산 서열은 60 내지 160개 사이의 슬로우 코돈을 갖는다(예를 들면, 60-160, 60-150, 60-140, 70-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70-90, 80-130, 80-120, 80-110, 80-100, 또는 80-90개의 슬로우 코돈).

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 핵산 서열의 두번째 50%에서 보다 핵산 서열의 첫번째 50%안에 더 적은 슬로우 코돈이 있다. 핵산 서열의 첫번째 50%(the first 50% of the nucleic acid sequence)는 출발점으로서 뉴클레오티드 위치 번호 1을 참조하여 정의되고, 따라서 번역 개시 부위를 포함한다; 핵산 서열의 두번째 50%(the second 50% of the nucleic acid sequence)는 번역 종결 부위를 포함한다. 예로서, SEQ ID NO: 1(3759 뉴클레오티드 총 길이를 갖는)를 참조하고, 상기 서열의 첫번째 절반(half)은 뉴클레오티드 위치 1-1881(627 뉴클레오티드 삼중자(triplet)를 포함) 로 나타내질 수 있고, 그리고 상기 서열의 두번째 절반은 위치 1882-3759(626 뉴클레오티드 삼중자를 포함)로 나타내 질 수 있다; 그렇지 않으면, 상기 서열의 첫번째 절반은 뉴클레오티드 위치 1-1878(626 뉴클레오티드 삼중자를 포함)으로 나타낼 수 있고, 상기 서열의 두번째 절반은 위치 1879-3759(627 뉴클레오티드 삼중자를 포함)에 의해서 나타낼 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 상기(전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 30개의 페닐알라닌 슬로우 코돈(RNA=UUU; DNA=TTT)을 포함한다(예를 들면, 30, 25, 20, 15, 또는 10). 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 10개의 페닐알라닌 슬로우 코돈(RNA=UUU; DNA=TTT)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 30개(예를 들면, 30, 25, 20, 19, 또는 18)의 타이로신 슬로우 코돈(RNA=UAU; DNA=TAT)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 18개의 타이로신 슬로우 코돈(RNA=UAU; DNA=TAT)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌 및/또는 타이로신 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 19개(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5)의 류신 슬로우 코돈(RNA=UUA 및/또는 CUA; DNA=TTA 및/또는 CTA)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌 및/또는 타이로신 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 5개의 류신 슬로우 코돈(RNA=UUA 및/또는 CUA; DNA=TTA 및/또는 CTA)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 및/또는 류신 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 14개(예를 들면, 14, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 또는 3)의 글루타민 슬로우 코돈(RNA=CAA; DNA=CAA)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 및/또는 류신 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 3개의 글루타민 슬로우 코돈(RNA=CAA; DNA=CAA)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 및/또는 글루타민 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 20개(예를 들면, 20, 19, 18, 17, 또는 16)의 세린 슬로우 코돈(RNA=UCA 및/또는 UCG; DNA=TCA 및/또는 TCG)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 및/또는 글루타민 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 16개의 세린 슬로우 코돈(RNA=UCA 및/또는 UCG; DNA=TCA 및/또는 TCG)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 및/또는 세린 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 23개(예를 들면, 23, 22, 21, 20, 또는 19)의 프롤린 슬로우 코돈(RNA=CCA 및/또는 CCG; DNA=CCA 및/또는 CCG)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 및/또는 세린 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 19개의 프롤린 슬로우 코돈(RNA=CCA 및/또는 CCG; DNA=CCA 및/또는 CCG)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 세린, 및/또는 프롤린 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 3개(예를 들면 3, 또는 2)의 시스테인 슬로우 코돈 (RNA=UGU; DNA=TGT)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 세린, 및/또는 프롤린 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 2개의 시스테인 슬로우 코돈(RNA=UGU; DNA=TGT)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 세린, 프롤린, 및/또는 시스테인 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 5개(예를 들면 5, 또는 4)의 히스티딘슬로우 코돈(RNA=CAU; DNA=CAT)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 세린, 프롤린, 및/또는 시스테인 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은) 핵산 서열은 최대 4개의 히스티딘 슬로우 코돈(RNA=CAU; DNA=CAT)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 세린, 프롤린, 시스테인, 및/또는 히스티딘 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 5 내지 10(예를 들면, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10)개의 아르기닌 슬로우 코돈(RNA=CGG; DNA=CGG)을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여(페닐알라닌, 타이로신, 류신, 글루타민, 세린, 프롤린, 시스테인, 및/또는 히스티딘 슬로우 코돈에 관한 이전에 기재된 구체예를 포함), 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 10개의 아르기닌 슬로우 코돈(RNA=CGG; DNA=CGG)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 30개(예를 들면, 30, 25, 20, 15, 또는 10; 바람직하게 10)의 페닐알라닌 슬로우 코돈(RNA=UUU; DNA=TTT)을 포함하고, 최대 30개(예를 들면, 30, 25, 20, 19, 또는 18; 바람직하게 18)의 타이로신 슬로우 코돈(RNA=UAU; DNA=TAT)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 30개(예를 들면, 30, 25, 20, 15, 또는 10; 바람직하게 10)의 페닐알라닌 슬로우 코돈 (RNA=UUU; DNA=TTT)을 포함하고, 최대 30개(예를 들면, 30, 25, 20, 19, 또는 18; 바람직하게 18)의 타이로신 슬로우 코돈(RNA=UAU; DNA=TAT)을 포함하며, 그리고 최대 19(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5; 바람직하게 5)개의 류신 슬로우 코돈(RNA=UUA 및/또는 CUA; DNA=TTA 및/또는 CTA)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 30(예를 들면, 30, 25, 20, 15, 또는 10; 바람직하게 10)개의 페닐알라닌 슬로우 코돈(RNA=UUU; DNA=TTT)을 포함하고, 최대 30(예를 들면, 30, 25, 20, 19, 또는 18; 바람직하게 18)개의 타이로신 슬로우 코돈(RNA=UAU; DNA=TAT)을 포함하고, 최대 19(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5; 바람직하게 5)개의 류신 슬로우 코돈(RNA=UUA 및/또는 CUA; DNA=TTA 및/또는 CTA)을 포함하며, 그리고 최대 14(예를 들면, 14, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 또는 3; 바람직하게 3)개의 글루타민 슬로우 코돈(RNA=CAA; DNA=CAA)을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 10개의 페닐알라닌 슬로우 코돈; 최대 18개의 타이로신 슬로우 코돈; 최대 2개의 시스테인 슬로우 코돈; 최대 4개의 히스티딘 슬로우 코돈; 최대 3개의 글루타민 슬로우 코돈; 최대 19의 프롤린 슬로우 코돈; 최대 16개의 세린 슬로우 코돈; 및 최대 5개의 류신 슬로우 코돈을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 구체예 중 임의의 하나 이상과 함께 선택적으로 조합하여, 상기 (전술한 바와 같은)핵산 서열은 최대 10개의 페닐알라닌 슬로우 코돈; 최대 18개의 타이로신 슬로우 코돈; 최대 2개의 시스테인 슬로우 코돈; 최대 4개의 히스티딘 슬로우 코돈; 최대 3개의 글루타민 슬로우 코돈; 최대 19개의 프롤린 슬로우 코돈; 최대 16개의 세린 슬로우 코돈; 최대 5개의 류신 슬로우 코돈; 및 최대 10개의 아르기닌 슬로우 코돈을 포함한다.

일 구체예에 있어서, 여기서 핵산 서열은 전술한 바와 같은 핵산 서열이고, 단일-사슬 BoNT/E1 단백질은 인접 아미노산의 서열을 포함하며, 그리고 여기서 인접 아미노산의 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들면, 적어도 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다.

일 구체예에 있어서, 여기서 핵산 서열은 전술한 바와 같은 핵산 서열이고, 단일사슬 BoNT/E1 단백질은 KGIRK, VKGIRKS, SVKGIRKSI, VSVKGIRKSI, IVSVKGIRKSI, NIVSVKGIRKSI, KNIVSVKGIRKSI, CKNIVSVKGIRKSI, KNIVSVKGIRKSIC, 및CKNIVSVKGIRKSIC로부터 선택된 하나의 아미노산 서열에 의해 제공되는 자생(native) 활성화 부위(activation site)를 포함한다.

일 구체예에 있어서, 상기 핵산 서열은 전술한 바와 같은 핵산 서열이고, 전술한 단일-사슬 BoNT/E1 또는 전술한 인접 아미노산의 서열은 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 또는 8)의 다음의 아미노산을 포함한다는 단서를 갖는다(여기서 아미노산 위치번호는 BoNT/E1 단백질의 N-말단 아미노산 잔기에서 시작하고 그리고 C-말단 아미노산 잔기로 끝남):

위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴.

일 구체예에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산은 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 및 위치 1195에서 아스파라긴을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 177에서 글리신; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 및 위치 1195에서 아스파라긴을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 177에서 글리신, 그리고 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 198에서 세린, 그리고 위치 177에서 글리신; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 및 위치 1195에서 아스파라긴 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 340에서 알라닌, 그리고 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 773에서 류신, 그리고 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 963에서 류신, 그리고 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 964에서 글루타민, 그리고 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 967에서 알라닌, 그리고 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 1195에서 아스파라긴 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 위치 1195에서 아스파라긴, 그리고 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌 중 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)을 포함한다(또는 이루어진다).

일 구체예에 있어서, 전술한 바와 같이, 하나이상의 아미노산의 존재는 상기 아미노산이 결핍된 BoNT/E1 단백질에 비해 개선된 용해도(solubility)를 가지는 BoNT/E1 단백질을 제공한다. 개선된 용해도(solubility)는 이종의 (E. coli) 발현 시스템에서 단백질의 수율을 증가시킨다.

일 구체예에 있어서, 여기서 핵산 서열은 전술한 바와 같은 핵산 서열이고, 인접 뉴클레오티드의 서열은 야생형BoNT/E1(SEQ ID NO: 3)의 핵산 서열과 비교할 때 적어도 770개(예를 들면, 적어도 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 또는 880)의 동의 코돈(synonymous codons)을 갖는다. 따라서, 일 구체예에 있어서, 핵산 서열은 야생형 BoNT/E1(SEQ ID NO: 3)의 핵산 서열에 상응하는 코돈으로, 동일한 아미노산을 암호화하는 적어도 770개의 다른 코돈을 포함한다.

일 구체예에 있어서, (전술한 바와 같은)핵산 서열은 적어도 41%의 G-C 함량을 갖는다(예를 들면, 적어도 41 또는 42%). 일 구체예에 있어서, (전술한 바와 같은)핵산 서열은 42%의 G-C 함량을 갖는다. 핵산G-C 함량의 개념은 (GC 함량 또는 G+C 함량이라고 함)은 G(구아닌) 또는 C(시토신) 중 어느 하나인 주어진 핵산 서열의 뉴클레오티드의 비율과 관련된다. 본 발명에 따른 핵산 서열의 G-C 함량은 E. coli 숙주세포에서 우선적으로 발현된 핵산의 G-C 함량과 더 밀접하게 매치되기 위해서 변한다(예를 들면, 동의 코돈의 치환에 의해서). 따라서 서열의 발현이 개선되고 증가된 단백질 수율을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 핵산 서열을 암호화하는 발현 벡터를 제공한다. 일 구체예에 있어서, 발현 벡터는 pET-26b(+) 벡터이다.

일 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포 또는 전술한 바와 같은 발현 벡터를 제공한다. 일 구체예에 있어서, 숙주 세포는 E. coli 세포이다. 일 구체예에 있어서, E. coli 숙주 세포는 E. coli BLR(DE3) 세포이다.

일 측면에서, 본 발명은 E. coli 숙주 세포에서 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질의 제조방법을 제공하고, 상기 방법은 E. coli 발현 시스템에서 핵산 서열(전술한 바와 같이)을 발현하는 단계를 포함한다.

E. coli (Escherichia coli) 발현 시스템에서 이종 단백질을 발현하는데 사용된 방법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

일 구체예에 있어서, 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질은 E. coli 숙주 세포 의 세포질내에서 발현된다.

일 구체예에 있어서, 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질은 적어도 3 mg/L의 수준으로 발현된다(예를 들면, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 25, 40, 45, 또는 50 mg/L).

일 구체예에 있어서, 전술한 바와 같이, 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질의 제조방법은 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질을 함유하는 E. coli 숙주 세포 균질액을 제공하기 위해서 E. coli 숙주 세포의 용해(lysis)를 포함한다. E. coli 숙주 세포와 같은 숙주세포를 용해하기 위해 사용된 방법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 실시예는 초음파 분해(sonication) 및 프렌치 프레스(French press)의 사용을 포함한다.

일 측면에서, 본 발명은 가용성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질의 제조방법을 제공한다. 이 방법은 인접 아미노산의 서열을 포함하는 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질을 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 인접 아미노산의 서열은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들면, 적어도 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖으며, 그리고 용매(solution)에서 BoNT/E1 단백질과 트립신이 접촉(contacting)하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 단일-사슬 BoNT/E1 단백질이 트립신과 접촉할 때, 트립신의 단백질 분해 작용은 이중-사슬 단백질을 생산하기 위해서 L-사슬 단백질분해효소 성분 및 전좌(translocation) 성분 사이의 부위에서 단일-사슬 단백질을 절단(cleave)하고, 여기서 두개의 사슬은 이황화 결합(disulphide bridge)에 의해서 연결된다(더 자세히, 활성화 부위(activation site)에서 단일-사슬 BoNT/E1의 절단(cleavage) 다음으로 형성된 두개의 사슬은 절단에 의해 제거된 잔기 420, 421 및 422와 함께, 아미노산 잔기의 제1 사슬 1-419 및 아미노산 잔기의 제2 사슬 423-1252이다). 따라서, 트립신은 활성 이중-사슬 형태로 그것을 전환시켜 단일-사슬 폴리펩티드를 활성화시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 유리하게도, 트립신의 사용은 본 발명의 BoNT/E1 안에 외인성(exogenous) (비-자생) 절단 부위(cleavage site)를 조작할 필요가 없음을 의미한다.

일 구체예에 있어서, 참고로 트립신은 트립신으로서 동일한 단백질분해효소 절단 부위(cleavage site)에서 절단하는 트립신과 같은(trypsin-like) 효소를 포함한다.

트립신은 특정 아미노산이 절단된 펩티드 결합의 양측면상의 특정 위치에 놓인 단백질 서열을 절단한다. 이러한 서열은 P4-P3-P2-P1-절단된 결합-P'1-P'2-P'3-P'4 명명법으로 나타낼 수 있다; 여기서 P1 내지 P4는 각각 절단된 펩티드 결합의 N-말단 측면에 1 내지 4위치에 배치된 아미노산을 나타내고 그리고 P'1 내지 P'4 는 각각 절단된 펩티드 결합의 C-말단 1 내지 4 위치를 나타낸다.

가장 중요하게 트립신은 Arg 또는 Lys 아미노산 중 어느 하나가 P1 위치를 점유하는 단백질 서열을 절단한다. Lys 이 P1 위치에 있을때, 트립신에 민감하지 않은 3가지 서열의 주요 유형이 있다:

(1) P'1 위치에서 Pro는 일반적으로 트립신 의한 절단에 대한 민감성을 감소시킨다(그러나 Trp이 위치 P2에 있는 경우는 아님).

(2) P'1 위치에서 Asp과 함께 P2 위치에서 Cys 또는 Asp 중 어느 하나는 트립신에 의한 절단에 대한 민감성을 감소시킨다.

(3) P'1 위치에서 His 또는 Try 중 어느 하나와 함께 P2 위치에서 Cys는 트립신에 의한 절단에 대한 민감성을 감소시킨다.

또한, Arg이 P1 위치에 있을 때 트립신에 민감하지 않은 서열의 3가지 주요 유형이 있다:

(1) P'1 위치에서 Pro는 일반적으로 트립신에 의한 절단에 대한 민감성을 감소시킨다.(그러나 Met 또는 어쩌면 Glu 중 어느 하나가 위치 P2에 있는 경우는 아님).

(2) P'1 위치에서 Lys과 함께 P2 위치에서 Cys는 트립신에 의한 절단에 대한 민감성을 감소시킨다.

(3) P'1 위치에서 His 또는 Arg 중 어느 하나와 함께 P2 위치에서 Arg은 트립신에 의한 절단에 대한 민감성을 감소시킨다.

일 구체예에 있어서, 본 발명은 가용성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질의 제조방법을 제공하고(전술한 바와 같이), 상기 인접 아미노산의 서열은 하나이상(예를 들면, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 또는 7)의 다음의 아미노산을 포함한다는 단서를 갖는다(여기서 아미노산 위치 번호는 BoNT/E1 단백질의 N-말단 아미노산 잔기에서 시작하고 그리고 C-말단 아미노산 잔기로 끝남): 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴.

일 구체예에 있어서, 전술한 바와 같이(전술한 바와 같이 하나 이상의 아미노산의 다수의 순열을 참조하여), 하나 이상의 아미노산의 존재는 상기 아미노산이 결핍된 BoNT/E1 단백질에 비해 개선된 용해도(solubility)를 가지는 BoNT/E1 단백질을 제공한다. 개선된 용해도는 이종 발현 시스템에서 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다.

일 구체예에 있어서, 여기서 본 발명은 가용성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 제조하는 방법을 제공하며(전술한 바와 같이), 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질은 E. coli 숙주 세포에서 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질을 제조하기 위해서 전술한 바와 같은 방법으로 제공된다.

일 구체예에 있어서, 본 발명은 가용성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 제조하는 방법을 제공하며(전술한 바와 같이), 이 방법은 가용성 BoNT/E1 단백질 및 트립신을 함유하는 용매와 소수성 표면을 접촉시켜 트립신으로부터 가용성 BoNT/E1 단백질을 분리하는 단계를 포함한다. 여기서 가용성 BoNT/E1 단백질은 우선적으로 소수성 표면에 결합한다.

본 발명자는 트립신으로부터 활성화된 이중-사슬 폴리펩티드를 분리하기 위해서 소수성 정제 공정을 사용하여 활성화된(activated) 이중-사슬 BoNT/E1 단백질의 고수율을 얻을 수 있음을 발견하였다. 놀랍게도, 이러한 공정은 이온교환 크로마토그래피를 사용하여 표준 정제보다 우수한 정제를 제공하며, 본 발명자는 트립신으로부터 활성화된 이중-사슬 폴리펩티드를 분리하는데 비효과적임을 밝혔다. 게다가, 이 공정은 유리하게, 일반적인 정제 공정의 일부로서, 활성화(activating) 단백질 분해효소가 없는 활성화된 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 제공한다.

활성 재조합BoNT/E1의 제조는 활성 이중-사슬 형태에서 분자를 절단하는 단백질 가수분해 단계를 요구한다. 이러한 절단은 단백질 분해효소인, 트립신을 사용하여 체외(in vitro)에서 활성화 단계에 의해 달성될 수 있다. 활성화 단계후, BoNT/E1의 추가적인 비-특이적 절단을 막기 위해서 최종 생성물로부터 단백질 분해효소를 제거하는 것이 중요하다.

트립신 및 BoNT/E1의 등전점(isoelectric point, pI)은 각각 9.32 및 6.2이고, 이는 두 단백질의 분리는 두 분자 사이의 전하 차이를 이용한, 이온 교환(IEX) 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있음을 나타낸다. 단백질의 순전하(net charge)는 단백질의 주변환경 pH에 의해 영향을 받고, 그리고 양성자를 얻을지 또는 잃을지에 따라서 양전하 또는 음전하로 하전될 것이다. pI는 분자가 전하를 수반하지 않을 때의 pH 값이고, 따라서 하전된 IEX 매체와 상호작용을 하지 않을 것이다. 이는, 만약 단백질이 자신의 pI 이상인 pH에 있다면, 그때 단백질은 순 음이온 전하(net negative charge)를 수반할 것이고, 그리고 음이온 교환체와 같은 양전하로 하전된 매체에 결합할 것을 의미한다. 마찬가지로, 만약 버퍼 pH가 pI보다 아래이면, 그때 단백질은 순(net) 양전하를 수반할 것이고 그리고 음이온 교환체와 결합하지 않을 것이다.

pH 8에서 이러한 원리를 근거로, BoNT/E(6.2의 pI를 갖는)는 음이온 교환칼럼(column)에 결합할 것이고, 반면 9.32의 pI를 갖는 트립신은 두개의 단백질이 분해되는 것을 허용하기 때문에, 그러하지 않을 것이다. IEX는 고염도 버퍼에 있기 위해서 칼럼상에 단백질이 가득차는(loaded)것을 요구하지 않기 때문에 간단하고 저렴한 크로마트그래피 방법이고, 이것은 침전(precipitation)에 의해서 단백질 손실을 일으킬 수 있다.

본 발명자는 pH 8에서, 가교된(cross-linked) 아가로스(agarose) 비드에 부착된 강한 작용기 및 약한 작용기 모두를 사용하여, 여러 가지 음이온 교환 칼럼을 테스트하였다. 예상한 대로, 각각의 경우, 트립신의 많은 비율은 칼럼에 결합되지 않고, 관류(flow-through)에 존재하였다. 그러나, 칼럼이 증가하는 이온 강도의 선형 구배(linear gradient)를 가지고 용출(elute)되었을 때, 트립신은 트립신의 비율(proportion)이 칼럼에 결합할 수 있었던 것을 나타내는 칼럼으로부터 용출되었다. BoNT/E1의 용출(elution)과 비교할때, 예기치 않게, 트립신이 예측대로 분리되지 않고 그리고 BoNT/E1 저하의 추가 가능성을 가진 최종 정제된 BoNT/E1 생성물 내에 존재함을 나타내는 유사한 이온강도(표1; 도1)에서 트립신이 용출하였음을 발견하였다.

표 1: BoNT/E1로부터 트립신의 분리를 하는 음이온 교환 칼럼에서 용출 분획을 평가하였다. 피크(peak)는 칼럼 볼륨(column volume, CV)의 수로 명시된다. F/T: 칼럼으로부터의 관류(flow-through), FF: 빠른 흐름 수지.

칼럼	트립신		BoNT/E1
칼럼	메이저 피크 (Major Peak)	마이너 피크 (Minor Peak)	메이저 피크 (Major Peak)	마이너 피크 (Minor Peak)
ANX	F/T	8.8, 11.3, 12.3	10.7	17.3
QHP	F/T	9.0, 10.6	-	-
DEAE	F/T	10.5	9.8	13.2
Q FF	F/T	9.2, 10.9	16.1	10.7

본 발명자는 상기 과제를 해결하였다. 보다, 구체적으로, 본 발명자는 놀랍게도, 최적의 트립신-BoNT/E1 분리는 소수성의 분리 표면(예를 들면, 이러한 단백질 및 HIC 매체의 소수성 표면사이의 가역적 상호작용을 이용하여 이들의 표면 소수성의 차이에 따른 단백질을 분리하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해서)의 이용에 의해 달성될 수 있을음 알아내었다.일 구체예에 있어서, 소수성 표면(hydrophobic surface)은 아릴기 또는 알킬기로 이루어진 리간드가 부착된 비활성 매트릭스이다.

용어 "아릴기"는 방향족을 나타내며, 예를 들면 페닐, 나프틸, 티에닐(thienyl), 및 인돌릴(indolyl)이다.

용어 "알킬기"는 직쇄, 분지쇄, 고리형족(cyclic group) 및 이들의 조합을 포함하는 지방족을 나타낸다. 알킬기는 1 내지 12의 탄소 원자를 갖을 수 있다. 알킬기의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, 프로필(예를 들면, n-프로필, 이소프로필), 부틸(예를 들면, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸), 펜틸, 헥실, 헵틸, 및 옥틸과 같은 기(group)를 포함한다.

일 구체예에 있어서, 소수성 표면은 부틸, 페닐 또는 옥틸 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 구체예에 있어서, 소수성 표면은 부틸 리간드를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 소수성 표면은 페닐 리간드를 포함한다. 일 구체예에 있어서, 소수성 표면은 옥틸 리간드를 포함한다.

본 발명자는 BoNT/E로부터 트립신 분리에 관한 특별히 바람직한 결과는 가교된(cross-linked) 아가로스(agarose) 또는 폴리스티렌 비드와 같은 비활성 매트릭스에 연결된(coupled), 알킬기 또는 아릴기를 함유하는(예를 들면, 부틸, 페닐 및 옥틸 리간드) 크로마토그래피 수지를 사용한 HIC를 가지고 얻는다는 것을 발견하였다(표 2; 도 2).

표 2: BoNT/E로부터 트립신 분리를 하는 통상(commercial) 소수성 상호작용 칼럼에서 용출 분획을 평가하였다. 피크는 칼럼 볼륨(column volume, CV)의 수로 명시된다. F/T: 칼럼으로부터의 관류(flow-through), FF: 빠른 흐름 수지, HP: 고성능수지, (LS): 소수성 기(group)의 낮은 치환(substitution), (HS): 소수성 기의 높은 치환.

칼럼	트립신		BoNT/E
칼럼	메이저 피크	마이너 피크	메이저 피크	마이너 피크
페닐 (HS) FF	23.3	-	32.2	-
페닐 (LS) FF	F/T	-	21.4	-
페닐 HP	F/T	16.1	24.4	-
부틸 FF	F/T	16.8	23.7	-
부틸 HP	18	워시(Wash)	27.6	-
옥틸 FF	F/T	-	27.1	-

일 구체예에 있어서, 트립신으로부터 활성화된 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 분리하기 위한 소수성 정제의 공정은 적어도 100배(fold), 적어도 150배, 적어도 200배, 적어도 250배, 적어도 300배, 적어도 350배, 적어도 400배, 적어도 450배, 또는 적어도 500배로 트립신의 농도를 감소시킨다. 바람직한 구체예로, 트립신으로부터 활성화된 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 분리하기 위한 소수성 정제의 공정은 적어도 350배로 트립신의 농도를 감소시킨다.다른 측면에서, 본 발명은 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 제공한다. 여기서 제1 사슬은 인접 아미노산의 서열을 포함하고, 그리고 여기서 인접 아미노산의 서열은 SEQ ID NO: 2의 위치 1-419의 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들면, 적어도 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는다; 여기서 제2 사슬은 인접 아미노산의 서열을 포함하고, 그리고 여기서 인접 아미노산의 서열은 SEQ ID NO: 2의 위치 423-1252의 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들면, 적어도 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는다; 여기서 제1 및 제2 사슬은 제1 사슬상의 시스테인 412와 제2 사슬상의 시스테인 426사이의 이황화 결합에 의해서 함께 연결(join)된다; 인접 아미노산의 서열은 하나이상(예를 들면, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 또는 8) 다음의 아미노산을 포함한다는 단서를 갖는다(여기서 아미노산 위치 번호는 BoNT/E1 단백질의 N-말단 아미노산 잔기에서 시작하고 그리고 C-말단 아미노산 잔기로 끝남): 위치 177에서 글리신; 위치 198에서 세린; 위치 340에서 알라닌; 위치 773에서 류신; 위치 963에서 류신; 위치 964에서 글루타민; 위치 967에서 알라닌; 위치 1195에서 아스파라긴.

관련된 측면에서, 본 발명은 가용성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질의 제조방법(전술한 바와 같이)에 의해 얻을 수 있는 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 제공한다.

일 측면에서, 본 발명은 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질(전술한 바와 같은)을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 조성물은 실질적으로 트립신을 포함하지 않는다.

따라서, 조성물은 바람직하게, 실질적으로 트립신 단백질분해효소(활성 이중-사슬 형태로 그것을 전환시켜 단일-사슬 폴리펩티드를 활성시키기 위해 사용된)를 포함하지 않는다, 이리하여 원치 않는 BoNT/E1 단백질의 비-특이적 절단을 막는다.

일 구체예에 있어서, 여기서 (전술한 바와 같은)조성물은 실질적으로 트립신을 포함하지 않으며, 조성물은 BoNT/E1 단백질 100 나노그램(ng) 당 100 피코그램(pg) 미만의 트립신을 포함한다; 예를 들면, BoNT/E1 단백질 100 ng 당 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 pg 미만의 트립신을 포함한다. 일 구체예에 있어서, (전술한 바와 같은)조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 5 pg 미만의 트립신을 포함한다. 바람직한 구체예로, (전술한 바와 같은)조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신을 포함한다.

따라서, 일 구체예에 있어서, 구절 "실질적으로 트립신을 포함하지 않는다(substantially free from trypsin)"는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 100 pg 미만의 트립신을 의미한다; 예를 들면, BoNT/E1 단백질 100 ng 당 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 pg 미만의 트립신, 바람직하게 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신을 의미한다.

조성물에서 트립신이 농도를 결정하는 방법은 종래기술분야에서 알려져 있다. 예로서, 본 발명에 따른 조성물내에서 트립신의 농도는 샌드위치 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)을 사용하여 결정될 수 있다.

또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 (a) 전술한 바와 같은 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질, 및 (b) 안정화제를 포함하는 고형 또는 액상 약제학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에 있어서, (전술한 바와 같은)조성물은 실질적으로 트립신을 포함하지 않는다. 일 구체예에 있어서, 조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 100 pg 미만의 트립신을 포함한다, 예를 들면, BoNT/E1 단백질 100 ng 당 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 pg 미만의 트립신을 포함한다. 일 구체예에 있어서, 조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물에서 사용될 수 있는 안정화제는 알부민, 특히 인혈청알부민 (HSA)과 같은 단백질성 안정제 및 비-단백질성 안정제를 포함한다.

본 발명에 따른 조성물에서 사용될 수 있는 비-단백질성 안정화제는 계면활성제, 특히 비-이온성계면활성제를 포함한다. 비-이온성계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80과 같은 폴리소르베이트, 그리고 폴록사머(즉, 폴리에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체)와 같은 블럭 공중합체를 포함한다.

특정 구체예에서, 조성물은 안정화제로서 단백질은 포함하지 않는다.

본 발명의 특정 구체예에 따른, 약제학적 조성물은 (a) 전술한 바와 같은 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질; (b) 계면활성제인 비-단백질성 안정화제; 및 (c) 물;을 포함하는 액상 약제학적 조성물이고, 여기서 상기 액상 약제학적 조성물은 단백질성 안정화제를 포함하지 않고; 그리고 여기서 액상 약제학적 조성물은 실질적으로 트립신을 포함하지 않는다(예를 들면, 액상 약제학적 조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 100 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질100 ng 당 5 pg 미만의 트립신을 포함하고; 바람직하게 여기서 액상 약제학적 조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신을 포함한다).

일 구체예에 있어서, 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질은 1-100 ng/ml 농도로 (전술한 바와 같은)조성물에서 존재한다. 일 구체예에 있어서, 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질은 5-50 ng/ml의 농도로, 예를 들면, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 ng/ml의 농도로 (전술한 바와 같은)조성물에서 존재한다. 바람직한 구체예로서, 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질은 약 20 ng/ml의 농도로 존재한다.

일 구체예에 있어서, (전술한 바와 같은)계면활성제는 20 내지 100 단량체 단위의 범위에서 평균 중합도(mean polymerisation degree)를 가지는 폴리소르베이트와 같은, 폴리소르베이트이고, 그리고 예를 들면 폴리소르베이트 80일 수 있다. 바람직한 구체예로서, 폴리소르베이트는 채소-유래된(vegetable-derived) 것이다. 계면활성제의 농도는 바람직하게 1% v/v보다 낮고, 예를 들면 폴리소르베이트 80의 경우, 약 0.005% 내지 0.02% v/v이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 결정제(crystalline agent)를 포함할 수 있다.

결정제는 그 중에서도, 동결건조된(lyophilised) 보툴리눔 신경독 복합체(complex) (형태 A, B, C, D, E, F 또는 G) 또는 고순도 보툴리눔 신경독 (형태 A, B, C, D, E, F 또는 G)에 기계적으로 강한 케이크 구조를 유지하는 제제를 의미한다. 고형제제 안에 포함될 때, 결정제는 또한 팽화효과(bulking effect)를 가진다. 결정제는 특히 염화나트륨을 포함한다. 결정제의 농도는 예를 들면, 0.1 내지 0.5 M, 바람직하게 0.1 내지 0.4 M, 특히 약 0.15 내지 0.3 M일 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 pH 5.5 내지 7.5 사이, 또는 pH 6.0 내지 7.0 사이를 포함하는 수준을 유지하기 위해서 버퍼(buffer)를 포함할 수 있다. 버퍼는 적절한 pH를 유지할 수 있는 임의의 버퍼일 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 조성물을 위한 버퍼는 숙시네이트, 디소듐포스페이트/구연산, 및 히스티딘과 같은 아미노산으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 버퍼의 농도는 예를 들면, 1 내지 50 mM, 바람직하게 5 내지 20 mM, 바람직하게 약 10 mM일 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 또한 이당(disaccharide)을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에서 사용된 이당은 수크로오스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 만니톨(mannitol) 및 락토오스(lactose)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 이당은 수크로오스이다. 이당의 농도는 예를 들면 5 내지 50 mM, 바람직하게 5 내지 25 mM, 보다 바람직하게 10 내지 20 mM, 그리고 가장 바람직하게 약 11.7 mM일 수 있다.

특정 구체예에서, 약제학적 조성물은 (a) 전술한 바와 같은 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질; (b) 계면활성제인 비-단백질성 안정화제; (c) 염화나트륨(sodium chloride), (d) pH 5.5 내지 7.5 사이를 유지하기 위한 버퍼; (e) 이당; 및 (f) 멸균수;를 포함하는 액상 약제학적 조성물이다. 여기서 액상 약제학적 조성물은 단백질성 안정화제를 포함하지 않는다; 그리고 여기서 액상 약제학적 조성물은 실질적으로 트립신을 포함하지 않는다 (예를 들면, 액상 약제학적 조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 100 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 5 pg 미만의 트립신을 포함하고; 바람직하게 여기서 액상 약제학적 조성물은 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신, 또는 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 7 pg 미만의 트립신을 포함한다).

하나의 특정 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 액상 형태인 약제학적 조성물은 액체/기체의 접점(interface)이 없는 유리병(vial) 또는 주사기와 같이 즉시 사용가능한 장치(ready-to-use)내에 밀봉되며, 23 내지 27 ℃에서 적어도 3개월 또는 적어도 6개월 동안 안정적이고 그리고 2 내지 8 ℃에서 적어도 12개월 동안 안정적이다.

일 측면에서, 본 발명은 전술한 바와 같은 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질, 또는 전술한 바와 같은 단일-사슬 BoNT/E1 단백질의 단백질 가수분해 절단(proteolytic cleavage)에 의해 얻을 수 있는 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질, 또는 전술한 바와 같은 조성물, 또는 전술한 바와 같은 액상 약제학적 조성물을 치료에 사용하기 위해서 제공한다.

본 발명자는 본 발명의 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질, 및 이의 조성물 및 이의 액상 약제학적 조성물이 치료에 이용될 수 있음을 확인하였다. 적합한 치료는 미용 치료(cosmetic treatment) 및 의학적 치료의 방법을 포함할 수 있다.

SEQ ID 넘버에 대한 설명

SEQ ID NO: 1 최적화된 BoNT/E1 핵산 서열

SEQ ID NO: 2 BoNT/E1 아미노산 서열

SEQ ID NO: 3 야생형(wildtype) BoNT/E1 핵산 서열

SEQ ID NO: 1 최적화된 BoNT/E1 핵산 서열

ATGCCGAAAATCAACTCTTTCAACTACAACGACCCGGTTAACGACCGTACCATCCTGTAT

ATCAAACCGGGTGGTTGCCAGGAGTTCTACAAATCTTTCAACATCATGAAAAACATCTGG

ATCATCCCGGAACGTAACGTTATCGGTACCACCCCGCAGGACTTCCACCCGCCGACCTCT

CTGAAAAACGGTGACTCTTCTTACTACGACCCGAACTACCTCCAGTCTGACGAAGAAAAA

GACCGTTTCCTGAAAATCGTTACCAAAATCTTCAACCGTATCAACAACAACCTGTCTGGT

GGTATCCTGCTGGAAGAACTGTCTAAAGCTAACCCGTACCTGGGTAACGACAACACCCCG

GACAACCAGTTCCACATCGGTGACGCTTCTGCTGTTGAAATCAAATTCTCTAACGGTTCT

CAGGACATCCTGCTGCCGAACGTTATCATCATGGGTGCTGAACCGGACCTGTTCGAAACC

AACTCTTCTAACATCTCTCTGCGTAACAACTACATGCCGTCTAACCACGGTTTCGGTTCT

ATCGCTATCGTTACCTTCTCTCCGGAATACTCTTTCCGTTTCAACGACAACAGCATGAAC

GAGTTCATCCAGGACCCGGCTCTGACCCTGATGCACGAACTGATCCACTCTCTGCACGGT

CTGTACGGTGCTAAAGGTATCACCACCAAATACACCATCACCCAGAAACAGAACCCGCTG

ATCACCAACATCCGTGGTACCAACATCGAAGAGTTCCTGACCTTCGGTGGTACCGACCTG

AACATCATCACCTCTGCTCAGTCTAACGACATCTACACCAACCTGCTGGCTGACTACAAA

AAAATCGCTTCTAAACTGTCTAAAGTTCAGGTTTCTAACCCGCTGCTGAACCCGTACAAA

GACGTTTTCGAAGCTAAATACGGTCTGGACAAAGACGCTTCTGGTATCTACTCTGTTAAC

ATCAACAAATTCAACGACATCTTCAAAAAACTGTACTCTTTCACCGAGTTCGACCTGGCG

ACCAAATTCCAGGTTAAATGCCGTCAGACCTACATCGGTCAGTACAAATACTTCAAACTG

TCTAACCTGCTGAACGACTCTATCTACAACATCTCTGAAGGTTACAACATCAACAACCTG

AAAGTTAACTTCCGTGGTCAGAACGCTAACCTGAACCCGCGTATCATCACCCCGATCACC

GGTCGTGGTCTGGTTAAAAAAATCATCCGTTTCTGCAAGAATATTGTAAGCGTTAAAGGA

ATAAGAAAAAGTATCTGCATCGAAATCAACAACGGTGAACTGTTCTTCGTTGCTTCTGAA

AACTCTTACAACGACGACAACATCAACACCCCGAAAGAAATCGACGACACCGTTACCTCT

AACAACAACTACGAAAACGACCTGGACCAGGTTATCCTGAACTTCAACTCTGAATCTGCT

CCGGGTCTGTCTGACGAAAAACTGAACCTGACCATCCAGAACGACGCTTACATCCCGAAA

TACGACTCTAACGGTACCTCTGACATCGAACAGCACGACGTTAACGAACTGAACGTTTTC

TTCTACCTGGACGCTCAGAAAGTTCCGGAAGGTGAAAACAACGTTAACCTGACCTCTTCT

ATCGACACCGCTCTGCTGGAACAGCCGAAAATCTACACCTTCTTCTCTTCTGAGTTCATC

AACAACGTTAACAAACCGGTTCAGGCTGCTCTGTTCGTTTCTTGGATTCAGCAGGTTCTG

GTTGACTTCACCACCGAAGCTAACCAGAAATCTACCGTTGACAAAATCGCTGACATCTCT

ATCGTTGTTCCGTACATCGGTCTGGCTCTGAACATCGGTAACGAAGCTCAGAAAGGTAAC

TTCAAAGACGCTCTGGAACTGCTGGGTGCTGGTATCCTGCTGGAGTTCGAACCGGAACTG

CTGATCCCGACCATCCTGGTTTTCACCATCAAATCTTTCCTGGGTTCTTCTGACAACAAA

AACAAAGTTATCAAAGCTATCAACAACGCTCTGAAAGAACGTGACGAAAAATGGAAAGAA

GTTTACTCTTTCATCGTTTCTAACTGGATGACCAAAATCAACACCCAGTTCAACAAACGT

AAAGAACAGATGTACCAGGCTCTCCAGAACCAGGTTAACGCTATCAAAACCATCATCGAA

TCTAAATACAACTCTTACACCCTGGAAGAAAAAAACGAACTGACCAACAAATACGACATC

AAACAGATCGAAAACGAACTGAACCAGAAAGTTTCTATCGCTATGAACAACATCGACCGT

TTCCTGACCGAATCTTCTATCTCTTACCTGATGAAACTCATCAACGAAGTTAAAATCAAC

AAACTGCGTGAATACGACGAAAACGTTAAAACCTACCTGCTGAACTACATCATCCAGCAC

GGTTCTATCCTGGGTGAATCTCAGCAGGAACTGAACTCTATGGTTACCGACACCCTGAAC

AACTCTATCCCGTTCAAACTGTCTTCTTACACCGACGACAAAATCCTGATCTCTTACTTC

AACAAATTCTTTAAACGCATTAAGAGTTCATCGGTTCTGAATATGCGGTACAAAAATGAT

AAATATGTCGATACTTCTGGATATGATAGCAATATCAACATTAACGGCGACGTGTATAAA

TATCCGACAAATAAAAACCAGTTTGGGATATATAACGACAAGCTGTCGGAGGTCAATATT

TCTCAAAACGACTATATCATTTACGATAATAAATATAAAAACTTTAGCATTAGTTTTTGG

GTTCGTATACCTAATTATGACAATAAAATTGTAAATGTGAATAACGAGTATACCATTATA

AACTGTATGCGCGACAATAACAGTGGTTGGAAGGTATCGCTGAACCATAATGAGATTATC

TGGACCCTGCAGGATAATGCAGGTATAAACCAGAAACTGGCTTTTAACTATGGAAACGCA

AATGGGATCTCAGATTACATTAATAAATGGATTTTTGTTACCATTACGAACGATCGCTTA

GGCGACTCAAAACTTTATATTAATGGCAATCTGATAGATCAGAAATCAATCTTAAATTTG

GGCAATATTCATGTCTCTGATAACATCTTGTTCAAGATCGTTAATTGCAGTTACACTCGT

TATATTGGCATTCGTTACTTTAATATCTTCGATAAAGAACTGGACGAGACGGAAATCCAG

ACTCTGTATTCAAACGAGCCCAATACTAATATATTGAAAGATTTTTGGGGTAACTATCTT

TTATATGATAAAGAATACTATCTCCTGAATGTATTGAAGCCAAACAATTTCATAGATAGA

CGCAAGGATAGCACATTAAGTATCAACAATATCAGATCTACTATACTGTTAGCAAATCGC

CTCTACTCCGGTATTAAAGTGAAGATTCAGCGGGTTAATAACTCCAGTACCAATGATAAT

CTGGTCCGTAAGAACGATCAGGTATACATCAATTTCGTCGCGAGCAAAACTCATCTCTTC

CCGCTTTACGCCGATACAGCTACGACAAACAAGGAAAAAACCATAAAAATTTCCAGCTCC

GGAAACAGATTCAATCAAGTAGTTGTAATGAACTCTGTGGGTAATAATTGTACGATGAAC

TTTAAGAATAACAATGGGAACAATATTGGACTTTTGGGCTTCAAAGCCGACACAGTGGTG

GCGTCCACCTGGTATTACACGCACATGCGGGACCATACGAATTCGAACGGTTGCTTCTGG

AACTTTATCTCGGAAGAACACGGGTGGCAAGAAAAATAA

SEQ ID NO: 2 BoNT/E1 아미노산 서열

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTS

LKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTP

DNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGS

IAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPL

ITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYK

DVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKL

SNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKG

IRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESA

PGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSS

IDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADIS

IVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNK

NKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIE

SKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKIN

KLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYF

NKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNI

SQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEII

WTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNL

GNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYL

LYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDN

LVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMN

FKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

SEQ ID NO: 3 야생형 BoNT/E1 핵산 서열

ATGCCAAAAATTAATAGTTTTAATTATAATGATCCTGTTAATGATAGAACAATTTTATAT

ATTAAACCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTATAAATCATTTAATATTATGAAAAATATTTGG

ATAATTCCAGAGAGAAATGTAATTGGTACAACCCCCCAAGATTTTCATCCGCCTACTTCA

TTAAAAAATGGAGATAGTAGTTATTATGACCCTAATTATTTACAAAGTGATGAAGAAAAG

GATAGATTTTTAAAAATAGTCACAAAAATATTTAATAGAATAAATAATAATCTTTCAGGA

GGGATTTTATTAGAAGAACTGTCAAAAGCTAATCCATATTTAGGGAATGATAATACTCCA

GATAATCAATTCCATATTGGTGATGCATCAGCAGTTGAGATTAAATTCTCAAATGGTAGC

CAAGACATACTATTACCTAATGTTATTATAATGGGAGCAGAGCCTGATTTATTTGAAACT

AACAGTTCCAATATTTCTCTAAGAAATAATTATATGCCAAGCAATCACGGTTTTGGATCA

ATAGCTATAGTAACATTCTCACCTGAATATTCTTTTAGATTTAATGATAATAGTATGAAT

GAATTTATTCAAGATCCTGCTCTTACATTAATGCATGAATTAATACATTCATTACATGGA

CTATATGGGGCTAAAGGGATTACTACAAAGTATACTATAACACAAAAACAAAATCCCCTA

ATAACAAATATAAGAGGTACAAATATTGAAGAATTCTTAACTTTTGGAGGTACTGATTTA

AACATTATTACTAGTGCTCAGTCCAATGATATCTATACTAATCTTCTAGCTGATTATAAA

AAAATAGCGTCTAAACTTAGCAAAGTACAAGTATCTAATCCACTACTTAATCCTTATAAA

GATGTTTTTGAAGCAAAGTATGGATTAGATAAAGATGCTAGCGGAATTTATTCGGTAAAT

ATAAACAAATTTAATGATATTTTTAAAAAATTATACAGCTTTACGGAATTTGATTTAGCA

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실시예

실시예 1

최적화된 BoNT/E1 핵산 서열의 구축(construction)

DNA 서열은 초기에BoNT/E1 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2)의 역번역에 의해서 설계되었다. 제한(restriction) 서열 (PstI)은 N-말단 및 종결 코돈에 추가되었고(added) 그리고 추가적인 제한(restriction) 서열, XbaI-종결 코돈-HindII는 C-말단에 추가되었다. DNA 서열은 그다음에 (전술한 바와 같은)슬로우 코돈의 수 및 위치에 근거하여 발현을 위해 최적화되었다.

서열은 슬로우 코돈에 반대하여(against) 선택되도록 최적화되었다. 이것은 좋은 개시를 얻고 그리고 번역을 시작하기 위해서 서열의 시작에서 특히 적용되었다. 슬로우 코돈이 포함된 경우(발현 숙주 코돈 바이어스에 따라 사용을 허용하기 위해서), 이들은 서열의 끝으로 향했다(서열의 시작하는 곳은 번역이 개시되는 곳이다).

일단 서열이 설계되면, 최적화된 DNA 서열은 전체-길이(full-length) 독소 유전자 안에서 나중의 조립을 위해서 유일한/자생(unique/native) PstI 부위를 사용하여 두개의 부분으로 합성된다. 첫번째 유전자 서열은 아미노말단에서 NdeI 부위를 포함하고, 카르복실 말단에서 PstI 부위를 포함했다. 유전자의 이 부분은 BoNT/E1 LC 및 HC의 아미노 부분을 암호화하고, 길이가 2895 bp였다. 두번째 유전자 서열은 N 말단에서 PstI 부위 및 카르복실 말단에서 HindIII 부위를 포함했고, 길이가 882 bp 이며, 그리고 BoNT/E1 HC의 카르복실 부분을 암호화 했다.

실시예 2

발현 벡터 BoNT/E1 핵산 서열의 구축

벡터 pET-26b(+)(Novagen)를 근거로 하는 발현 벡터가 적용되었고, 이는 BoNT/E1 ORF를 암호화하는 DNA의 시작 및 끝에 위치하는 복제(cloning) 제한 부위NdeI 및 HindIII을 포함한다. pET-26b(+) 벡터는 동원되는 것이 부족했으나(mobilisable-deficient) 다른 동원될 수 있는 플라스미드와 공동-거주(co-resident)한다면, 동원될 수 있다. pET-26b(+) 벡터는 이동성 유전자를 제거하고 그리고 그것이 동원되지 않게(non-mobilisable) 만들도록 수정되었다.

발현 벡터는 NdeI 및 PstI로 분해되었고(digested) 그리고 정제된 벡터 백본은 중간 생성물을 생성하기 위해서 동일한 제한 효소로 분해된 BoNT/E1 DNA의 첫번째 절편과 결찰되었다(ligated). 두번째 복제 단계에서, PstI 및 HindIII로 분해된 두번째 절편에서 BoNT/E1 DNA은 (또한 동일한 제한 효소로 분해된)단계 1로부터 중간 생성물로 결찰되었다. 이는 발현 벡터에서 BoNT/E1 DNA의 최종 생성물의 생성으로 이어졌다.

실시예 3

숙주안으로 BoNT/E1 발현 벡터의 삽입

임의의 다른 E. coli 발현 균주(strain)에 동일하게 적용될 수 있는 절차 및 방법이지만, 본 실시예는 E. coli BLR (DE3) 세포의 사용을 기초로 한다. E. coli BLR (DE3) 컴피턴트 세포(competent cells)는 필요할 때까지 -70℃ 아래로 저장되었다. 세포의 형질전환(transformation)은 제조자의 프로토콜 적응 기법을 사용하여 수행되었다. 세포는 얼음위에서 해동되었고 그리고 10 μL보다 적은 앨리쿼트(aliquot)로 준비되었다. 앨리쿼트는 1 μL의 플라스미드 DNA를 가지고 80초 동안 42 ℃에서 열충격을 가하여 형질전환되었다. 5분 동안 얼음위에서 회복된 후에, 이후 진탕배양기(shaking incubator)로 옮기고 그리고 37 ℃에서 250 rpm으로 1시간 동안 배양된 형질전환물에 비동물성 SOC 브로스(broth)를 첨가하였다. 배양후 각각의 90 μL의 형질전환물은 옮겨졌고 그리고 50 μg/mL의 카나마이신이 보충된 비동물성 LB 한천 평면(agar plate)위에 펼쳐졌다. 상기 평면(plate)을 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다.

실시예 4

숙주의 배양(culturing) 및 가용성 rBoNT/E1 단백질의 발현

BLR(DE3) 세포에서 형질전환된 BoNT/E1의 단일 콜로니(single colony)가 0.2%의 글루코사민 및 30 μg/ml의 카나마이신으로 보충된 변형된 테리핏 브로스(modified TerrificBroth, mTB) 100 ml가 포함된 250 ml짜리 삼각 플라스크에 접종하는데 사용되었다. 이러한 방법은 플라스크에 접종하기 위해서 마이크로뱅크 비드 또는 글리세롤 스톡(glycerol stock) (10-100 μl)을 사용할 때 동일하게 적용될 수 있을 것이다.

플라스크는 250 RPM 흔들림(shaking)으로 37 ℃에서 16시간 동안 배양되었다. 10 ml의 중균배양(starter culture)이 0.2%의 글루코사민 및 30 μg/ml의 카나마이신으로 보충된. 1 L를 각각 포함하는 2 L짜리 삼각플라스크에 접종하기 위해서 사용되었다. 0.5의 OD₆₀₀에 도달할때까지 세포는 37 ℃에서 225 RPM으로 2시간 동안 배양되었다. 이때, 배양온도는 16℃로 떨어졌다. 1시간후, 세포는 20시간 동안 1 mM의 IPTG를 첨가하여 BoNT/E1 이 발현되도록 유도되었다. 세포는 4 ℃에서 20분 동안 원심분리로 채취하고, 무게를 달고 그리고 -20 ℃에서 보관하였다.

실시예 5

숙주로부터 BoNT/E1 단백질의 추출 및 발현 수준의 분석

rBoNT/E1의 발현 세포 페이스트는 실온에서 해동되었고 그리고 10 μl의 벤조나제(benzonase)로 보충된 세포의 그램 당 3 ml의 Tris-NaCL 재부양(re-suspension)버퍼로 피펫팅하여 재부양되었다. 세포는 4 μm 진폭 10 x 30 s 온(on) + >45 s 오프(off)에서의 초음파 분해에 의해서 용해되었다. 용해물은 상청액에서 가용성 rBoNT/E1을 얻기 위해서 4 ℃에서 1시간 동안 4000 g으로 원심분리되었다.

제조된 용해물의 총 단백질 농도를 결정하기 위한 브래드포드 분석(Bradford Assay)

희석된 rBoNT/E1 용해물 또는 BSA 스탠다드(standard)중 하나의 시편(50 μL)은 1 mL의 플라스틱 큐벳에 첨가되었다. 450 μL의 쿠마씨 브래드포드 분석(Coomassie Bradford Assay) 시약이 각각의 큐벳에 첨가되고 그리고 OD₆₀₀를 읽기전에 실온에서 10분 동안 배양시키켰다. BSA 스탠다드로부터 얻어진 값은 용해물 시편에서 단백질의 양을 결정하는데 사용되었다.

반-정량적인 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석을 위한 용해물 시편의 제조

메타바이오로직스로부터 구입된 BoNT/E1 단백질의 통상의(commercial) 시편이 SDS-PAGE 스탠다드를 구성하는데 사용되었다. SDS-PAGE 시편은 그리고 나서 알려진 총 단백질 농도로 발현된 세포 배양으로부터 용해물 시편으로 제조되었다.

웨스턴 블로팅(western blotting)

겔은 탑재되었고 55분 동안 200V에서 실행되었으며 그리고 메탄올 프리(free) 블럿팅 버퍼에서 니트로셀룰로오스 막 쪽으로 1시간 동안 0.4 mA 흘려졌다. 니트로셀룰로오스 블롯(blot)은 PBS-0.1% Tween 20에서 0.5%의 BSA를 가지고 1시간 동안 차단되었고 그후에 1시간 동안 BoNT/E1에 항체를 가지고 조사되었다. 블롯은 슈퍼시그날 듀라웨스트(SuperSignal DuraWest) 기질로 개발된 HRP 공액(conjugated) 이차 항체로 검출되었다. 개발된 블롯은 신제네 영상기(Syngene Imaging Instrument)를 사용하여 나타내었다(도 3).

실시예 6

초기 정제 및 이중-사슬 형태로 표적 BoNT/E1 단백질의 활성화(activation)

본 실시예는 조합이 다른 순서로 동을한 특성을 사용하여 달라지거나 뒤바뀔수 있지만, 포획(capture) 및 중간 칼럼(column) 단계의 하나의 조합을 근거로 하였다. 정화된 상청액은 고염도 농도로 되었고 소수성 포획(capture) 칼럼 (부틸 세파로오스) 쪽으로 탑재되었다. 바운드(bound) rBoNT/E1은 저염 트리스 버퍼의 구배(gradient)를 사용하여 칼럼으로부터 용출되었다. 용출된 단백질은 그후에 고염도 트리스 버퍼의 구배로 용출하여, Q-세파로오스와 같은 이온-교환 칼럼을 사용하여 더욱 정제되었다. 트립신은 그후에 2.5 μg/ml의 최종 농도까지 용출된 rBoNT/E1 시편에 첨가되었고 그리고 37 ℃에서 40분 동안 배양되었다. SDS-PAGE(도 4)의 감소에 의해 확인된 것과 같이, 이것은 BoNT/E1 활성화 루프를 기록하였고 최종 BoNT/E1 이중-사슬구조를 형성하였다.

실시예 7

활성화시키는 단백질 분해효소(protease)가 없는 표적 BoNT/E1 단백질의 최종 정제

활성화된 rBoNT/E1 시편은 고염도 버퍼에서 소수성 칼럼(부틸 세파로오스)쪽으로 즉시 탑재되었다. 저염 트리스 버퍼의 구배가 칼럼 및 바운드(bound) rBoNT/E1 단백질로부터 트립신을 더 제거하기 위해 적용되기 전에, 칼럼은 고염도 버퍼로 약하게 연관된 트립신을 제거하기 위해서 고염도 버퍼로 세척되었다. rBoNT/E1 단백질은 그후에 트립신으로부터 떨어져, 구배에서 늦게 용출되었다.

트립신 수준을 결정하기 위한 분석

트립신 ELISA은 칼럼 분획 및 최종 BoNT/E1 시편에서 현재 수준을 결정하기 위해서 개발되었다. 항-트립신 포획 항체는 극소량 판(micro-titre plates)에 37 ℃에서 1시간 동안 씌웠었다. 두번째 항-트립신 항체 검출전에 트립신 스탠다드 및 테스트 시편은 판(100 μL/well) 쪽으로 추가되었고 그리고 37 ℃에서 1시간 동안 배양되었다. 각각의 시편/칼럼 분획에서 트립신의 양은 그후에 스탠다드로부터 보간되었고(interpolated) 그리고 BoNT/E1으로부터 트립신의 분리를 확인하기 위해서 정제 크로마토그램 위에 중첩되었다(도 2B).

실시예 8

트립신을 실질적으로 포함하지 않는 활성 이중-사슬 BoNT/E1을 포함하는 제제(formulation)

활성 이중-사슬 BoNT/E1을 포함하는 다음의 6가지 액상 조성물이 제조되었다(표 3).

	1	2	3	4	5	6
폴리소르베이트 80	0.10 mg/mL	0.10 mg/mL	0.10 mg/mL	0.10 mg/mL	-	-
폴록사머	-	-	-	-	0.04 mg/mL	0.04 mg/mL
수크로오스	4.0 mg/mL	-	4.0 mg/mL	-	4.0 mg/mL	-
만니톨	-	4.0 mg/mL	-	4.0 mg/mL	-	4.0 mg/mL
염화나트륨	8.76 mg/mL	8.76 mg/mL	8.76 mg/mL	8.76 mg/mL	8.76 mg/mL	8.76 mg/mL
pH	6.5	6.5	6.5	6.5	6.5	6.5
버퍼	L-히스티딘/ 염산	L-히스티딘/ 염산	디소듐포스페이트/ 무수 구연산	디소듐포스페이트/ 무수 구연산	L-히스티딘/ 염산	L-히스티딘/ 염산
이중-사슬 BoNT/E1	20 ng/mL	20 ng/mL	20 ng/mL	20 ng/mL	20 ng/mL	20 ng/mL
MilliQ water	적량(q.s.) 내지 1 mL	적량 내지 1 mL	적량 내지 1 mL	적량 내지 1 mL	적량 내지 1 mL	적량 내지 1 mL

모든 6가지 조성물은 12주 동안 25 ℃에서 저장되었다. 이중-사슬 BoNT/E1 단백질분해효소 기능의 안정성은 무세포(cell free) 엔도펩티다제 분석을 사용하는 그 기간 동안 평가되었다. 6가지 제제에 대한 매월의 저하율은 12주를 넘어서 달마다 5% 아래에 있었고, 이는 6가지 조성물의 이중-사슬 BoNT/E1 단백질분해효소 기능이 적어도 12주 동안 25 ℃에서 안정적으로 유지됨을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> SYNTAXIN LIMITED IPSEN BIOPHARM LIMITED <120> Recombinant Clostridium botulinum neurotoxins <130> P39711WO <150> GB 1219602.8 <151> 2012-10-31 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimised BoNT/E1 nucleic acid sequence <400> 1 atgccgaaaa tcaactcttt caactacaac gacccggtta acgaccgtac catcctgtat 60 atcaaaccgg gtggttgcca ggagttctac aaatctttca acatcatgaa aaacatctgg 120 atcatcccgg aacgtaacgt tatcggtacc accccgcagg acttccaccc gccgacctct 180 ctgaaaaacg gtgactcttc ttactacgac ccgaactacc tccagtctga cgaagaaaaa 240 gaccgtttcc tgaaaatcgt taccaaaatc ttcaaccgta tcaacaacaa cctgtctggt 300 ggtatcctgc tggaagaact gtctaaagct aacccgtacc tgggtaacga caacaccccg 360 gacaaccagt tccacatcgg tgacgcttct gctgttgaaa tcaaattctc taacggttct 420 caggacatcc tgctgccgaa cgttatcatc atgggtgctg aaccggacct gttcgaaacc 480 aactcttcta acatctctct gcgtaacaac tacatgccgt ctaaccacgg tttcggttct 540 atcgctatcg ttaccttctc tccggaatac tctttccgtt tcaacgacaa 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Trp Ile Ile Pro Glu Arg Asn Val Ile 35 40 45 Gly Thr Thr Pro Gln Asp Phe His Pro Pro Thr Ser Leu Lys Asn Gly 50 55 60 Asp Ser Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Gln Ser Asp Glu Glu Lys 65 70 75 80 Asp Arg Phe Leu Lys Ile Val Thr Lys Ile Phe Asn Arg Ile Asn Asn 85 90 95 Asn Leu Ser Gly Gly Ile Leu Leu Glu Glu Leu Ser Lys Ala Asn Pro 100 105 110 Tyr Leu Gly Asn Asp Asn Thr Pro Asp Asn Gln Phe His Ile Gly Asp 115 120 125 Ala Ser Ala Val Glu Ile Lys Phe Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ile Leu 130 135 140 Leu Pro Asn Val Ile Ile Met Gly Ala Glu Pro Asp Leu Phe Glu Thr 145 150 155 160 Asn Ser Ser Asn Ile Ser Leu Arg Asn Asn Tyr Met Pro Ser Asn His 165 170 175 Gly Phe Gly Ser Ile Ala Ile Val Thr Phe Ser Pro Glu Tyr Ser Phe 180 185 190 Arg Phe Asn Asp Asn Ser Met Asn Glu Phe Ile Gln Asp Pro Ala Leu 195 200 205 Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Ser Leu His Gly Leu Tyr Gly Ala 210 215 220 Lys Gly Ile Thr Thr Lys Tyr Thr Ile Thr Gln Lys Gln Asn Pro Leu 225 230 235 240 Ile Thr Asn Ile Arg Gly Thr Asn Ile Glu Glu Phe Leu Thr Phe Gly 245 250 255 Gly Thr Asp Leu Asn Ile Ile Thr Ser Ala Gln Ser Asn Asp Ile Tyr 260 265 270 Thr Asn Leu Leu Ala Asp Tyr Lys Lys Ile Ala Ser Lys Leu Ser Lys 275 280 285 Val Gln Val Ser Asn Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Lys Asp Val Phe Glu 290 295 300 Ala Lys Tyr Gly Leu Asp Lys Asp Ala Ser Gly Ile Tyr Ser Val Asn 305 310 315 320 Ile Asn Lys Phe Asn Asp Ile Phe Lys Lys Leu Tyr Ser Phe Thr Glu 325 330 335 Phe Asp Leu Ala Thr Lys Phe Gln Val Lys Cys Arg Gln Thr Tyr Ile 340 345 350 Gly Gln Tyr Lys Tyr Phe Lys Leu Ser Asn Leu Leu Asn Asp Ser Ile 355 360 365 Tyr Asn Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Ile Asn Asn Leu Lys Val Asn Phe 370 375 380 Arg Gly Gln Asn Ala Asn Leu Asn Pro Arg Ile Ile Thr Pro Ile Thr 385 390 395 400 Gly Arg Gly Leu Val Lys Lys Ile Ile Arg Phe Cys Lys Asn Ile Val 405 410 415 Ser Val Lys Gly Ile Arg Lys Ser Ile Cys Ile Glu Ile Asn Asn Gly 420 425 430 Glu Leu Phe Phe Val Ala Ser Glu Asn Ser Tyr Asn Asp Asp Asn Ile 435 440 445 Asn Thr Pro Lys Glu Ile Asp Asp Thr Val Thr Ser Asn Asn Asn Tyr 450 455 460 Glu Asn Asp Leu Asp Gln Val Ile Leu Asn Phe Asn Ser Glu Ser Ala 465 470 475 480 Pro Gly Leu Ser Asp Glu Lys Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asn Asp Ala 485 490 495 Tyr Ile Pro Lys Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Ser Asp Ile Glu Gln His 500 505 510 Asp Val Asn Glu Leu Asn Val Phe Phe Tyr Leu Asp Ala Gln Lys Val 515 520 525 Pro Glu Gly Glu Asn Asn Val Asn Leu Thr Ser Ser Ile Asp Thr Ala 530 535 540 Leu Leu Glu Gln Pro Lys Ile Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Glu Phe Ile 545 550 555 560 Asn Asn Val Asn Lys Pro Val Gln Ala Ala Leu Phe Val Ser Trp Ile 565 570 575 Gln Gln Val Leu Val Asp Phe Thr Thr Glu Ala Asn Gln Lys Ser Thr 580 585 590 Val Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Ile Val Val Pro Tyr Ile Gly Leu 595 600 605 Ala Leu Asn Ile Gly Asn Glu Ala Gln Lys Gly Asn Phe Lys Asp Ala 610 615 620 Leu Glu Leu Leu Gly Ala Gly Ile Leu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Leu 625 630 635 640 Leu Ile Pro Thr Ile Leu Val Phe Thr Ile Lys Ser Phe Leu Gly Ser 645 650 655 Ser Asp Asn Lys Asn Lys Val Ile Lys Ala Ile Asn Asn Ala Leu Lys 660 665 670 Glu Arg Asp Glu Lys Trp Lys Glu Val Tyr Ser Phe Ile Val Ser Asn 675 680 685 Trp Met Thr Lys Ile Asn Thr Gln Phe Asn Lys Arg Lys Glu Gln Met 690 695 700 Tyr Gln Ala Leu Gln Asn Gln Val Asn Ala Ile Lys Thr Ile Ile Glu 705 710 715 720 Ser Lys Tyr Asn Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Leu Thr Asn 725 730 735 Lys Tyr Asp Ile Lys Gln Ile Glu Asn Glu Leu Asn Gln Lys Val Ser 740 745 750 Ile Ala Met Asn Asn Ile Asp Arg Phe Leu Thr Glu Ser Ser Ile Ser 755 760 765 Tyr Leu Met Lys Leu Ile Asn Glu Val Lys Ile Asn Lys Leu Arg Glu 770 775 780 Tyr Asp Glu Asn Val Lys Thr Tyr Leu Leu Asn Tyr Ile Ile Gln His 785 790 795 800 Gly Ser Ile Leu Gly Glu Ser Gln Gln Glu Leu Asn Ser Met Val Thr 805 810 815 Asp Thr Leu Asn Asn Ser Ile Pro Phe Lys Leu Ser Ser Tyr Thr Asp 820 825 830 Asp Lys Ile Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Lys Phe Phe Lys Arg Ile Lys 835 840 845 Ser Ser Ser Val Leu Asn Met Arg Tyr Lys Asn Asp Lys Tyr Val Asp 850 855 860 Thr Ser Gly Tyr Asp Ser Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asp Val Tyr Lys 865 870 875 880 Tyr Pro Thr Asn Lys Asn Gln Phe Gly Ile Tyr Asn Asp Lys Leu Ser 885 890 895 Glu Val Asn Ile Ser Gln Asn Asp Tyr Ile Ile Tyr Asp Asn Lys Tyr 900 905 910 Lys Asn Phe Ser Ile Ser Phe Trp Val Arg Ile Pro Asn Tyr Asp Asn 915 920 925 Lys Ile Val Asn Val Asn Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Arg 930 935 940 Asp Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser Leu Asn His Asn Glu Ile Ile 945 950 955 960 Trp Thr Leu Gln Asp Asn Ala Gly Ile Asn Gln Lys Leu Ala Phe Asn 965 970 975 Tyr Gly Asn Ala Asn Gly Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys Trp Ile Phe 980 985 990 Val Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Asn 995 1000 1005 Gly Asn Leu Ile Asp Gln Lys Ser Ile Leu Asn Leu Gly Asn Ile 1010 1015 1020 His Val Ser Asp Asn Ile Leu Phe Lys Ile Val Asn Cys Ser Tyr 1025 1030 1035 Thr Arg Tyr Ile Gly Ile Arg Tyr Phe Asn Ile Phe Asp Lys Glu 1040 1045 1050 Leu Asp Glu Thr Glu Ile Gln Thr Leu Tyr Ser Asn Glu Pro Asn 1055 1060 1065 Thr Asn Ile Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Tyr Leu Leu Tyr Asp 1070 1075 1080 Lys Glu Tyr Tyr Leu Leu Asn Val Leu Lys Pro Asn Asn Phe Ile 1085 1090 1095 Asp Arg Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ile Asn Asn Ile Arg Ser 1100 1105 1110 Thr Ile Leu Leu Ala Asn Arg Leu Tyr Ser Gly Ile Lys Val Lys 1115 1120 1125 Ile Gln Arg Val Asn Asn Ser Ser Thr Asn Asp Asn Leu Val Arg 1130 1135 1140 Lys Asn Asp Gln Val Tyr Ile Asn Phe Val Ala Ser Lys Thr His 1145 1150 1155 Leu Phe Pro Leu Tyr Ala Asp Thr Ala Thr Thr Asn Lys Glu Lys 1160 1165 1170 Thr Ile Lys Ile Ser Ser Ser Gly Asn Arg Phe Asn Gln Val Val 1175 1180 1185 Val Met Asn Ser Val Gly Asn Asn Cys Thr Met Asn Phe Lys Asn 1190 1195 1200 Asn Asn Gly Asn Asn Ile Gly Leu Leu Gly Phe Lys Ala Asp Thr 1205 1210 1215 Val Val Ala Ser Thr Trp Tyr Tyr Thr His Met Arg Asp His Thr 1220 1225 1230 Asn Ser Asn Gly Cys Phe Trp Asn Phe Ile Ser Glu Glu His Gly 1235 1240 1245 Trp Gln Glu Lys 1250 <210> 3 <211> 3759 <212> DNA <213> Clostridium botulinum <400> 3 atgccaaaaa ttaatagttt taattataat gatcctgtta atgatagaac aattttatat 60 attaaaccag gcggttgtca agaattttat aaatcattta atattatgaa aaatatttgg 120 ataattccag agagaaatgt aattggtaca accccccaag attttcatcc gcctacttca 180 ttaaaaaatg gagatagtag ttattatgac cctaattatt tacaaagtga tgaagaaaag 240 gatagatttt taaaaatagt cacaaaaata tttaatagaa taaataataa tctttcagga 300 gggattttat tagaagaact gtcaaaagct aatccatatt tagggaatga taatactcca 360 gataatcaat tccatattgg tgatgcatca gcagttgaga ttaaattctc aaatggtagc 420 caagacatac tattacctaa tgttattata atgggagcag agcctgattt atttgaaact 480 aacagttcca atatttctct aagaaataat tatatgccaa gcaatcacgg ttttggatca 540 atagctatag taacattctc acctgaatat tcttttagat ttaatgataa tagtatgaat 600 gaatttattc aagatcctgc tcttacatta atgcatgaat taatacattc attacatgga 660 ctatatgggg ctaaagggat tactacaaag tatactataa cacaaaaaca aaatccccta 720 ataacaaata taagaggtac aaatattgaa gaattcttaa cttttggagg tactgattta 780 aacattatta ctagtgctca gtccaatgat atctatacta atcttctagc tgattataaa 840 aaaatagcgt ctaaacttag caaagtacaa gtatctaatc cactacttaa tccttataaa 900 gatgtttttg aagcaaagta tggattagat aaagatgcta gcggaattta ttcggtaaat 960 ataaacaaat ttaatgatat ttttaaaaaa ttatacagct ttacggaatt tgatttagca 1020 actaaatttc aagttaaatg taggcaaact tatattggac agtataaata cttcaaactt 1080 tcaaacttgt taaatgattc tatttataat atatcagaag gctataatat aaataattta 1140 aaggtaaatt ttagaggaca gaatgcaaat ttaaatccta gaattattac accaattaca 1200 ggtagaggac tagtaaaaaa aatcattaga ttttgtaaaa atattgtttc tgtaaaaggc 1260 ataaggaaat caatatgtat cgaaataaat aatggtgagt tattttttgt ggcttccgag 1320 aatagttata atgatgataa tataaatact cctaaagaaa ttgacgatac agtaacttca 1380 aataataatt atgaaaatga tttagatcag gttattttaa attttaatag tgaatcagca 1440 cctggacttt cagatgaaaa attaaattta actatccaaa atgatgctta tataccaaaa 1500 tatgattcta atggaacaag tgatatagaa caacatgatg ttaatgaact taatgtattt 1560 ttctatttag atgcacagaa agtgcccgaa ggtgaaaata atgtcaatct cacctcttca 1620 attgatacag cattattaga acaacctaaa atatatacat ttttttcatc agaatttatt 1680 aataatgtca ataaacctgt gcaagcagca ttatttgtaa gctggataca acaagtgtta 1740 gtagatttta ctactgaagc taaccaaaaa agtactgttg ataaaattgc agatatttct 1800 atagttgttc catatatagg tcttgcttta aatataggaa atgaagcaca aaaaggaaat 1860 tttaaagatg cacttgaatt attaggagca ggtattttat tagaatttga acccgagctt 1920 ttaattccta caattttagt attcacgata aaatcttttt taggttcatc tgataataaa 1980 aataaagtta ttaaagcaat aaataatgca ttgaaagaaa gagatgaaaa atggaaagaa 2040 gtatatagtt ttatagtatc gaattggatg actaaaatta atacacaatt taataaaaga 2100 aaagaacaaa tgtatcaagc tttacaaaat caagtaaatg caattaaaac aataatagaa 2160 tctaagtata atagttatac tttagaggaa aaaaatgagc ttacaaataa atatgatatt 2220 aagcaaatag aaaatgaact taatcaaaag gtttctatag caatgaataa tatagacagg 2280 ttcttaactg aaagttctat atcctattta atgaaattaa taaatgaagt aaaaattaat 2340 aaattaagag aatatgatga gaatgtcaaa acgtatttat tgaattatat tatacaacat 2400 ggatcaatct tgggagagag tcagcaagaa ctaaattcta tggtaactga taccctaaat 2460 aatagtattc cttttaagct ttcttcttat acagatgata aaattttaat ttcatatttt 2520 aataaattct ttaagagaat taaaagtagt tcagttttaa atatgagata taaaaatgat 2580 aaatacgtag atacttcagg atatgattca aatataaata ttaatggaga tgtatataaa 2640 tatccaacta ataaaaatca atttggaata tataatgata aacttagtga agttaatata 2700 tctcaaaatg attacattat atatgataat aaatataaaa attttagtat tagtttttgg 2760 gtaagaattc ctaactatga taataagata gtaaatgtta ataatgaata cactataata 2820 aattgtatga gagataataa ttcaggatgg aaagtatctc ttaatcataa tgaaataatt 2880 tggacattgc aagataatgc aggaattaat caaaaattag catttaacta tggtaacgca 2940 aatggtattt ctgattatat aaataagtgg atttttgtaa ctataactaa tgatagatta 3000 ggagattcta aactttatat taatggaaat ttaatagatc aaaaatcaat tttaaattta 3060 ggtaatattc atgttagtga caatatatta tttaaaatag ttaattgtag ttatacaaga 3120 tatattggta ttagatattt taatattttt gataaagaat tagatgaaac agaaattcaa 3180 actttatata gcaatgaacc taatacaaat attttgaagg atttttgggg aaattatttg 3240 ctttatgaca aagaatacta tttattaaat gtgttaaaac caaataactt tattgatagg 3300 agaaaagatt ctactttaag cattaataat ataagaagca ctattctttt agctaataga 3360 ttatatagtg gaataaaagt taaaatacaa agagttaata atagtagtac taacgataat 3420 cttgttagaa agaatgatca ggtatatatt aattttgtag ccagcaaaac tcacttattt 3480 ccattatatg ctgatacagc taccacaaat aaagagaaaa caataaaaat atcatcatct 3540 ggcaatagat ttaatcaagt agtagttatg aattcagtag gaaataattg tacaatgaat 3600 tttaaaaata ataatggaaa taatattggg ttgttaggtt tcaaggcaga tactgtagtt 3660 gctagtactt ggtattatac acatatgaga gatcatacaa acagcaatgg atgtttttgg 3720 aactttattt ctgaagaaca tggatggcaa gaaaaataa 3759

Claims

a. 가용성 단일-사슬 BoNT/E1 단백질을 제공하는 단계,
b. 상기 BoNT/E1 단백질을 트립신과 용매(solution)에서 접촉(contacting)하는 단계, 및
c. 소수성의 분리 표면에 가용성 BoNT/E1 단백질 및 트립신을 함유하는 상기 용액을 접촉시킴으로써 트립신으로부터 가용성 BoNT/E1 단백질을 분리하는 단계로서, 상기 가용성 BoNT/E1 단백질은 우선적으로 상기 소수성의 분리 표면에 결합하는 것인 단계
를 포함하는 가용성 이중-사슬 BoNT/E1의 제조방법에 의해 얻어질 수 있는, 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질.
제1항에 있어서, 상기 소수성의 분리 표면은 아릴기 또는 알킬기로 이루어진 리간드가 부착된 비활성 매트릭스인, 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질.
제2항에 있어서, 상기 소수성의 분리 표면은 부틸, 페닐 및 옥틸 리간드로 이루어진 군 중에 선택되는 것인, 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질.
제1항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 아미노산 420, 421 및 422에 상응하는 아미노산 잔기를 포함하지 않는 것인, 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질을 포함하고 BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신을 포함하는, 근육 이완제로 사용하기 위한 조성물.
a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질;
b. 계면활성제인 비-단백질성 안정화제; 및
c. 물;
을 포함하는 액상 약제학적 조성물로,
단백질성 안정화제를 포함하지 않고, BoNT/E1 단백질 100 ng 당 트립신 10 pg 미만을 포함하는, 근육 이완제로 사용하기 위한 액상 약제학적 조성물.
제6항에 있어서,
a. 염화나트륨,
b. pH 5.5 내지 7.5를 유지시키기 위한 버퍼, 및
c. 이당(disaccharide)
을 추가로 포함하고,
물은 멸균수인, 액상 약제학적 조성물.
a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 활성 이중-사슬 BoNT/E1 단백질; 및
b. 안정화제
를 포함하는, 근육 이완제를 제조하거나 근육 이완제로 사용하기 위한 고형 조성물.
제8항에 있어서, BoNT/E1 단백질 100 ng 당 10 pg 미만의 트립신을 포함하는 고형 조성물.
제8항에 있어서, 상기 안정화제가 비-단백질성 안정화제인 고형 조성물.
제8항에 있어서, 단백질 안정화제를 포함하지 않는 것인 고형 조성물.
제8항에 있어서, 상기 안정화제가 계면활성제인 고형 조성물.
제12항에 있어서, 상기 계면활성제가 비-이온성 계면활성제인 고형 조성물.
제12항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴록사머인 고형 조성물.
제14항에 있어서, 상기 계면활성제가 폴리소르베이트 80인 고형 조성물.
제12항에 있어서, 계면활성제의 농도가 1% 미만인 고형 조성물.
제15항에 있어서, 계면활성제가 0.005% 내지 0.02% v/v 농도의 폴리소르베이트 80인 고형 조성물.
제8항에 있어서, pH 5.5 내지 7.5를 유지시키기 위한 버퍼를 추가로 포함하는 고형 조성물.
제18항에 있어서, 상기 버퍼가 (i) 구연산; (ii) 숙시네이트; (iii) 디소듐포스페이트; 및 (iv) 아미노산, 임의로 히스티딘으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 고형 조성물.
제18항에 있어서, 상기 버퍼의 농도가
a. 1 내지 50 mM;
b. 5 내지 20 mM; 또는
c. 10 mM
인 고형 조성물.
제8항에 있어서, 이당(disaccharide)을 추가로 포함하는 고형 조성물.
제21항에 있어서, 상기 이당이 수크로오스, 트레할로스, 만니톨 및 락토오스로 이루어진 군에서 선택되는 것인 고형 조성물.
제21항에 있어서, 이당의 농도가
a. 5 내지 50 mM;
b. 5 내지 25 mM;
c. 10 내지 20 mM; 또는
d. 11.7 mM
인 고형 조성물.
제8항에 있어서,
(a) 안정화제가 폴리소르베이트 80이고;
(b) 구연산 및 히스티딘으로부터 선택된 버퍼를 추가로 포함하고;
(c) 수크로오스를 추가로 포함하는 것
인 고형 조성물.