UA118837C2 - Рекомбінантний нейротоксин clostridium botulinum - Google Patents
Рекомбінантний нейротоксин clostridium botulinum Download PDFInfo
- Publication number
- UA118837C2 UA118837C2 UAA201502159A UAA201502159A UA118837C2 UA 118837 C2 UA118837 C2 UA 118837C2 UA A201502159 A UAA201502159 A UA A201502159A UA A201502159 A UAA201502159 A UA A201502159A UA 118837 C2 UA118837 C2 UA 118837C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- vomt
- protein
- sequence
- trypsin
- chain
- Prior art date
Links
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title abstract description 15
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 title description 8
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 title 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 97
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 96
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 47
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 113
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 108
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 106
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 97
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 69
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 52
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 48
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 30
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 30
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 29
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 26
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 22
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 15
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 15
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 15
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 15
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 15
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 15
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 12
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 6
- 229940124272 protein stabilizer Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 6
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 23
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 21
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 21
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 19
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 16
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 16
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 16
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 5
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 3
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010469 Qa-SNARE Proteins Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 102000050389 Syntaxin Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- -1 for example Chemical group 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical class 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-phenylpropan-2-amine Chemical compound CNC(C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 101100401100 Caenorhabditis elegans mes-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001495406 Candidatus Phytoplasma fraxini Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 244000182691 Echinochloa frumentacea Species 0.000 description 1
- 235000008247 Echinochloa frumentacea Nutrition 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010063006 Facial spasm Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000004095 Hemifacial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 101100365689 Homo sapiens SHC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 1
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020853 Hypertonic bladder Diseases 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 208000009722 Overactive Urinary Bladder Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 240000005546 Piper methysticum Species 0.000 description 1
- 235000016787 Piper methysticum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102100022340 SHC-transforming protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000016253 Synaptobrevin/Vesicle-associated membrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050004777 Synaptobrevin/Vesicle-associated membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000036861 Zinc-dependent endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091006982 Zinc-dependent endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- YLBMNMLHAAOXAL-UHFFFAOYSA-N aziv Chemical compound O1C(C)=C(O)C(=O)CC1OC1C2(C)CCC3(C)C4(C)CCC5C(C)(CO)C(OC6C(C(O)C(O)C(O6)C(O)=O)OC6C(C(O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(O)C(O)C(CO)O6)O)CCC5(C)C4CC=C3C2CC(C)(C)C1 YLBMNMLHAAOXAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000015111 chews Nutrition 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 230000001660 hyperkinetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 208000020629 overactive bladder Diseases 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000018448 secretion by cell Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
- A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Винахід належить до способу одержання розчинного дволанцюгового білка BoNT/E1, причому зазначений спосіб включає забезпечення розчинного одноланцюгового білка BoNT/E1, що містить послідовність суміжних амінокислот, де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 95 % ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2, приведення зазначеного білка BoNT/E1 у контакт із трипсином у розчині та відділення розчинного білка BoNT/E1 від трипсину шляхом приведення розчину, що містить розчинний білок BoNT/E1 та трипсин, у контакт із гідрофобною поверхнею, де розчинний білок BoNT/E1 зв'язується з гідрофобною поверхнею Також винахід стосується активного дволанцюгового білка BoNT/E1 та його застосування в композиції, в тому числі й фармацевтичній композиції для терапевтичних цілей.
Description
активного дволанцюгового білка ВОМТ/ЕЇ та його застосування в композиції, в тому числі й фармацевтичній композиції для терапевтичних цілей.
Дана патентна заявка заявляє пріоритет заявки СВ 1219602.8, поданої 31 жовтня 2012 року, яка тим самим включена за посиланням у своїй повноті.
Даний винахід відноситься до послідовностей нуклеїнової кислоти, що кодують нейротоксини серотипу Е (ВоМТ/Е) Сіовігідішт Боїціпит (С. Боїціпит), та до способів одержання рекомбінантного ВОМТ/Е. Даний винахід також відноситься до відповідних медичних застосувань рекомбінантного ВОМТ/Е.
Ботулінічний нейротоксин продукується С. роїшіїпит у вигляді великого білкового комплексу, що складається з самого ВоМТт у комплексі з рядом акцесорних білків. Наразі існують сім різних класів ботулінічного нейротоксину, а саме: серотипи А, В, Сі, О, Е, Е та С ботулінічного нейротоксину, усі з яких мають подібні структури та способи дії. Різні серотипи ВОМТ можна розрізняти за інактивацією конкретними нейтралізуючими антисироватками, причому така класифікація за серотипом співвідноситься 3 відсотком ідентичності послідовності на амінокислотному рівні. Білки ВОМТ даного серотипу додатково ділять на різні підтипи на основі відсотка ідентичності амінокислотної послідовності.
ВоМТ є найбільш сильнодіючими токсинами з відомих, причому значення середньої летальної дози (050) для мишей знаходяться в діапазоні від 0,5 до 5 нг/кг залежно від серотипу. ВОМТ поглинаються у шлунково-кишковому тракті та після попадання у загальний кровоток зв'язуються із пресинаптичною мембраною холінергічних нервових закінчень та перешкоджають вивільненню з них нейромедіатора ацетилхоліну. ВОМТ/В, ВоМТ/О, ВоМТ/Е та
ВоМТ/5 розщеплюють синаптобревін/везикуло-асоційований мембранний білок (МАМР);
ВоМтТ/С, ВоМТ/А та ВоМТ/Е розщеплюють синаптосомально-асоційований білок розміром 25 кДа (5МАР-25); та ВОМТ/С розщеплює синтаксин.
У природі клостридіальні нейротоксини синтезуються у вигляді одноланцюгового поліпептиду, який піддається посттрансляційній модифікації за допомогою явища протеолітичного розщеплення з утворенням двох поліпептидних ланцюгів, з'єднаних разом дисульфідним зв'язком. Розщеплення відбувається у конкретному сайті розщеплення, який часто називають сайтом активації, який знаходиться між цистеїновими залишками, які забезпечують міжланцюговий дисульфідний зв'язок. Саме ця дволанцюгова форма є активною формою токсину. Два ланцюги називають важким ланцюгом (Н-ланцюгом), який має
Зо молекулярну масу приблизно 100 кДа, і легким ланцюгом (І -ланцюгом), який має молекулярну масу приблизно 50 кДа. Н-ланцюг містить С-кінцевий націлювальний компонент (домен Нес) та
М-кінцевий транслокаційний компонент (домен Нм). Сайт розщеплення знаходиться між І- ланцюгом та транслокаційними компонентами. Після зв'язування домену Не з його нейроном- мішенню та інтерналізації зв'язаного токсину у клітину через ендосому домен Нм переміщує І - ланцюг через ендосомальну мембрану та у цитозоль, та І -ланцюг забезпечує протеазну функцію (також відомий як нецитотоксична протеаза).
Нецитотоксичні протеази діють шляхом протеолітичного розщеплення внутрішньоклітинних транспортних білків, відомих як білки ЗМАКЕ (наприклад, 5МАР-25, МАМР або синтаксин), див.
Сегаїд К (2002) "Се апа МоїІесшаг Віооду" (4 еайіоп) допп УмМіеу 5 Зоп5, Іпс. Абревіатура
ЗМАКЕ походить від виразу розчинний рецептор приєднання МЕ (5оїшбіе МЕ АКасптепі
Кесеріог), де МОРЕ означає фактор, чутливий до М-етилмалеїміду (М-еїпу!таїІеітіде-5епвйїме
ЕРасіог). Білки «зМАКЕ є важливими для злиття внутрішньоклітинних везикул і, отже, для секреції молекул шляхом транспорту везикул із клітини. Протеазна функція являє собою цинк-залежну ендопептидазну активність та проявляє високу субстратну специфічність щодо білків 5МАРЕ.
Відповідно, після доставки у потрібну клітину-мішень нецитотоксична протеаза здатна інгібувати клітинну секрецію із клітини-мішені. І-ланцюгові протеази клостридіальних нейротоксинів являють собою нецитотоксичні протеази, які розщеплюють білки ЗМАКЕ.
Ботулінічні нейротоксини добре відомі своєю здатністю викликати периферичний параліч м'язів. Зазначені властивості як міорелаксанта привели до використання ботулінічних нейротоксинів (таких як ВоМТ/А) у ряді медичних та косметичних процедур, включаючи обробку глабелярних зморшок або гіперкінетичних зморшок на обличчі, лікування головного болю, геміфацільного спазму, гіперактивності сечового міхура, гіпергідрозу, обробку носогубних зморшок, лікування шийної дистонії, блефароспазму та спастичності.
Традиційно, одержання ВоМТ здійснюють шляхом культивування бактерій С. роїшііпит з наступним виділенням та очищенням комплексу ботулінічного нейротоксину. Проте одержання
ВоОМТт таким чином є неефективним та забезпечує низькі виходи білка. Окрім того, С. роїціпит є бактеріями, що утворюють спори, та, таким чином, вимагають спеціалізованого обладнання та установок для культивування, які не потрібні для такої культури бактерій, як ЕбсПегіспіа сої (Е. соїї). Зростаюче застосування ВоМТ привело, таким чином, до потреби у альтернативних та/або 60 вдосконалених способах одержання та очищення ВоМТ.
У патентному документі 5 20080103098 описується спосіб одержання рекомбінантних білків ВоМТ у дволанцюговій формі, що включає експресію конструкції рекомбінантної нуклеїнової кислоти у клітині-хазяїні Е. соїї. Проте зазначений спосіб вимагає введення конкретної ненативної (тобто неклостридіальної) пентапептидної послідовності у петльовий домен нейротоксину. Уведена пентапептидна послідовність утворює сайт активації розщеплення, який розщеплюється ендогенною протеазою Е. соїї при лізисі клітини. Спосіб з патентного документа ОБ 20080103098, таким чином, повідомляє про те, що для досягнення оптимальної експресії ВоМТ послідовність ВоМТ має бути модифікована шляхом вставки ненативного сайту розщеплення.
У патентному документі О5 7132259 описані молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодують білки ВОМТ. Проте молекули нуклеїнової кислоти з патентного документа 05 7132259 модифікують із заміною нативного сайту розщеплення ненативним сайтом розщеплення. Отже, спосіб з патентного документа 05 7132259 також повідомляє, що введення ненативного сайту розщеплення необхідне для оптимальної експресії ВОМТ.
У патентному документі 05 6495143 описуються молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодують фрагменти важкого ланцюга (Нс) ВоМтТ, для застосування в індукції імунних реакцій (як наприклад, при вакцинації). Проте молекули нуклеїнової кислоти не кодують послідовності ВОМТ повної довжини. Експресія в Е. соїї та очищення окремих Н- та І -ланцюгів правцевого токсину та ВоОМТ є досяжними; ці виділені ланцюги самі по собі є нетоксичними.
Після окремого одержання цих пептидних ланцюгів та у суворо контрольованих умовах Н- та 1 - субодиниці можна об'єднати за допомогою утвореного завдяки окисненню дисульфідного містка з утворенням активних дволанцюгових форм. На жаль, ця стратегія має декілька недоліків. По- перше, експресія та виділення великих кількостей окремих ланцюгів не є можливим на практиці; зокрема, за відсутності Н-ланцюга виділений І -ланцюг є майже нерозчинним у водному розчині та дуже чутливий до протеолітичного руйнування. По-друге, окиснення іп мійго окремо експресованих та очищених Н- та І -ланцюгів з одержанням активної дволанцюгової форми є вкрай неефективним та приводить до низьких виходів активного токсину та утворення великої кількості неактивних неправильно згорнутих або окиснених форм. Очищення токсину, що містить правильно згорнуті та окиснені Н- та І -ланцюг, є важким, як і його відокремлення від цих
Зо неактивних форм та окремих Н- та І -ланцюгів, які не прореагували. Отже, спосіб з патентного документа 05 6495143 пов'язаний зі значними недоліками.
Таким чином, в даній галузі техніки існує потреба в удосконалених способах одержання рекомбінантних ВОоМТ, зокрема, активованих дволанцюгових ВоМТт з рекомбінантних ВОМТ/Е.
Даний винахід розв'язує одну або декілька з вищезазначених проблем, забезпечуючи послідовності нуклеїнової кислоти та способи, які визначені у формулі винаходу.
В одному аспекті даний винахід передбачає послідовність нуклеїнової кислоти, що містить послідовність суміжних нуклеотидів, де зазначена послідовність суміжних нуклеотидів характеризується щонайменше 80 95 (наприклад, щонайменше 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 або 100 95) ідентичністю послідовності з послідовністю нуклеїнової кислоти ЗЕ ІО МО: 1, та де зазначена послідовність суміжних нуклеотидів кодує одноланцюговий білок ВОМТ/Е1.
Серотип ВоМТ/Е ділять на вісім підтипів, від ВОМТ/ЕТЇ до ВоМТ/Е8, які характеризуються щонайменше 90 95 ідентичністю амінокислотної послідовності; білюи ВОМТ/Е в межах заданого підтипу характеризуються вищим відсотком ідентичності амінокислотної послідовності (наприклад, щонайменше 95 95 або вищою). Як описано вище, послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом кодують білок ВОМТ/Е1. Прикладом білка ВОМТ/Е1! є білок, який кодується амінокислотною послідовністю ШРІОООО1Є6ЕА7ТЕ з ОпіРаго. Іншим прикладом білка
ВоМТ/Е1 є білок, який кодується амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 2.
Послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом було сконструйовано для того, щоб переважно забезпечувати високі рівні експресії у клітинах Е. соїї.
Ряд факторів впливає на рівні експресії даного білка. Одним таким фактором є швидкість, з якою транслюється послідовність МРНК, що кодує цей білок. Цей фактор сам знаходиться під впливом того, які конкретні кодони мРНК використовуються для визначення кожної амінокислоти у білку. Деякі кодони транслюються швидше, ніж інші. Вибір кодону для кожної амінокислоти може змінюватись, оскільки кодони мРНК є виродженими за своєю природою. Усі декілька різних кодонів можуть визначати однакову амінокислоту; таким чином, декілька різних послідовностей мРНК можуть кодувати один і той самий білок. Різні кодони, які визначають одну й ту саму амінокислоту, називають синонімічними кодонами. Точна суміш синонімічних кодонів у конкретній МРНК впливає на швидкість трансляції кодованого білка.
Існує ряд різних причин, які обумовлюють те, що деякі кодони транслюються швидше, ніж інші. Кожний кодон визначає амінокислоту шляхом залучення молекули тРНК, прикріпленої до даної амінокислоти. На швидкість трансляції впливає відносне поширення різноманітних молекул різних тРНК, афінність, з якою кожна конкретна молекула тРНК зв'язується з кодоном, що її залучає, а також інші фактори, як наприклад, якою мірою пара кодон-молекула тРНК взаємодіє з іншими елементами механізму трансляції. Приблизні швидкості трансляції кодону можна оцінити за допомогою визначення частоти, з якою різні кодони виявляються у генах з високим рівнем експресії. Проте не всі кодони, що часто зустрічаються, приводять у результаті до оптимальної експресії.
Не вдаючись до будь-якої конкретної теорії, автори даного винаходу вважають, що оптимальна експресія послідовностей нуклеїнової кислоти ВОоМТ/Е!ї досягається шляхом зниження частоти (тобто числа випадків появи у послідовності) певних кодонів, які нижче у даному документі вважають "повільними кодонами" та які наведені нижче. У зв'язку з цим автори даного винаходу вважають, що зазначені повільні кодони пов'язані зі зниженими швидкостями трансляції.
У ДНК)
Автори даного винаходу використали спосіб раціонального конструювання послідовності для одержання послідовностей нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Один шлях, за допомогою якого послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом забезпечують високі рівні експресії кодованих білків ВОМТ/Е!Ї, полягає в тому, що вони характеризуються оптимізованим числом повільних кодонів (наприклад, зниженням частоти, з якою повільні кодони з'являються у послідовності).
В одному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти містить максимум 160 повільних кодонів (наприклад, максимум 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88 або 87 повільних кодонів).
Отже, в одному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти містить від 0 до 160 повільних кодонів (наприклад, 0-160, 0-150, 0-140, 0-130, 0-120, 0-110, 0-100, 0-90, 0-95, 0-94, 0- 93, 0-92, 0-91, 0-90, 0-89, 0-88 або 0-87 повільних кодонів).
В одному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти містить 60-160 повільних кодонів (наприклад, 60-160, 60-150, 60-140, 700-150, 70-140, 70-130, 70-120, 70-110, 70-100, 70- 90, 80-130, 80-120, 80-110, 80-100 або 80-90 повільних кодонів).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення, у перших 50 95 послідовності нуклеїнової кислоти присутня менша кількість повільних кодонів, ніж у других 50 90 послідовності нуклеїнової кислоти. Перші 50 95 послідовності нуклеїнової кислоти визначені відносно положення нуклеотиду номер 1 як відправної точки та, таким чином, містить сайт ініціації трансляції; другі 50 95 послідовності нуклеїнової кислоти містять сайт термінації трансляції. У якості прикладу, що стосується 5ЕО ІЮ МО: 1 (яка має загальну довжину 3759 нуклеотидів), перша половина зазначеної послідовності може бути представлена положеннями нуклеотидів 1-1881 (що включають 627 нуклеотидних триплетів), та друга половина зазначеної послідовності може бути представлена положеннями 1882-3759 (що включають 626 нуклеотидних триплетів); в якості альтернативи, перша половина зазначеної послідовності може бути представлена положеннями нуклеотидів 1-1878 (що включають 626 нуклеотидних триплетів), та друга половина зазначеної послідовності може бути представлена положеннями 1879-3759 (що включає 627 нуклеотидних триплетів).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 15 або 10) фенілаланінових повільних кодонів
(РНК-ОЦШ; ДНК-ТТТ). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 10 фенілаланінових повільних кодонів (РНК-ОШИ;
ДНК-ТТ).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 19 або 18) тирозинових повільних кодонів (РНК-ОАИ; ДНКУ-ТАТ). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 18 тирозинових повільних кодонів (РНК-ОАШ; ДНКУ-ТАТ).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових та/або тирозинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 19 (наприклад, 19, 18, 17, 16, 15, 12,10,9,8, 7,6 або 5) лейцинових повільних кодонів (РНК:ШЦА та/або СОДА; ДНК-ТТА та/або СТА). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових та/або тирозинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 5 лейцинових повільних кодонів (РНК-ОША та/або СОА; ДНК-ТТА та/або СТА).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових та/або лейцинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 14 (наприклад, 14, 12, 10, 8, 6, 5, 4 або 3) глутамінових повільних кодонів (РНК-САА; ДНК:АСАА). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів
Зо здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових та/або лейцинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум З глутамінові повільні кодони (РНК-САА; ДНКУСАА).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових та/або глутамінових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 20 (наприклад, 20, 19, 18, 17 або 16) серинових повільних кодонів (РНК-ОСА та/або СО; ДНК-ТСА та/або То). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових та/або глутамінових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 16 серинових повільних кодонів (РНК-ШСА та/або СО; ДНК-ТСА та/або ТС).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових та/або серинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 23 (наприклад, 23, 22, 21, 20 або 19) пролінові повільні кодони (РНК-ССА та/або ССО; ДНК-:ССА та/або ССО). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових та/або серинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 19 пролінових повільних кодонів (РНК:ССА та/або ССО; ДНКАССА та/або ССО).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових, серинових та/або пролінових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 3 (наприклад, З або 2) цистеїнові повільні кодони (РНК-О(ОИ; ДНК-ТСОТ). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що бо стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових, серинових та/або пролінових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 2 цистеїнові повільні кодони (РНК-ОВИ; ДНК-ТОТ).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових, серинових, пролінових та/або цистеїнових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 5 (наприклад, 5 або 4) гістидинових повільних кодонів (РНК-САШ; ДНКУ:САТ).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових, серинових, пролінових та/або цистеїнових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 4 гістидинові повільні кодони (РНК-САИ; ДНК-САТ).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових, серинових, пролінових, цистеїнових та/або гістидинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить від 5 до 10 (наприклад, 5, 6, 7, 8, 9 або 10) аргінінових повільних кодонів (РНК-СОоСс; ДНК-СОО). В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення (включаючи раніше описані варіанти здійснення, що стосуються фенілаланінових, тирозинових, лейцинових, глутамінових, серинових, пролінових, цистеїнових та/або гістидинових повільних кодонів), послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить 10 аргінінових повільних кодонів (РНК-СОО;
ДНК-СОб).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 15 або 10; переважно 10) фенілаланінових повільних кодонів (РНК-ОШОИО; ДНК-ТТТ) та максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 19 або 18; переважно 18) тирозинових повільних кодонів (РНК-ОАИШ; ДНКА-ТАТ).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома
Зо з вищенаведених варіантів здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 15 або 10; переважно 10) фенілаланінових повільних кодонів (РНК-ШШОЮ; ДНК-ТТТ), максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 19 або 18; переважно 18) тирозинових повільних кодонів (РНК-ШОШАО; ДНК-ТАТ) та максимум 19 (наприклад, 19, 18, 17, 16, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6 або 5; переважно 5) лейцинових повільних кодонів (РНКШОЦА та/або СОА; ДНК-ТТА та/або СТА).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 15 або 10; переважно 10) фенілаланінових повільних кодонів (РНК-ШШОЮ; ДНК-ТТТ), максимум 30 (наприклад, 30, 25, 20, 19 або 18; переважно 18) тирозинових повільних кодонів (РНК-ОАИІ; ДНКУ-ТАТ), максимум 19 (наприклад, 19, 18, 17, 16, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6 або 5; переважно 5) лейцинових повільних кодонів (РНКОША та/або СОА; ДНК-ТТА та/або СТА) та максимум 14 (наприклад, 14, 12, 10, 8, 6, 5, 4 або 3; переважно 3) глутамінових повільних кодонів (РНК-САА; ДНКУСАА).
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить: максимум 10 фенілаланінових повільних кодонів; максимум 18 тирозинових повільних кодонів; максимум 2 цистеїнові повільні кодони; максимум 4 гістидинові повільні кодони; максимум З глутамінові повільні кодони; максимум 19 пролінових повільних кодонів; максимум 16 серинових повільних кодонів та максимум 5 лейцинових повільних кодонів.
В одному варіанті здійснення, необов'язково у комбінації з будь-яким одним або декількома з вищенаведених варіантів здійснення, послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) містить: максимум 10 фенілаланінових повільних кодонів; максимум 18 тирозинових повільних кодонів; 60 максимум 2 цистеїнові повільні кодони;
максимум 4 гістидинові повільні кодони; максимум З глутамінові повільні кодони; максимум 19 пролінових повільних кодонів; максимум 16 серинових повільних кодонів; максимум 5 лейцинових повільних кодонів та максимум 10 аргінінових повільних кодонів.
В одному варіанті здійснення, де послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка описана вище, зазначений одноланцюговий білок
ВоМТ/Е1 містить послідовність суміжних амінокислот, та де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 95 95 (наприклад, щонайменше 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 або 100 95) ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 2.
В одному варіанті здійснення, де послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка описана вище, зазначений одноланцюговий білок
ВОоМТ/Е1 містить нативний сайт активації, який представлений амінокислотною послідовністю, вибраною з КОСЇКК, МКОСЇІКК5, 5МКОЇІКК5БІ, М5МКОЇІКК5БІ, ІМеМКОІККБІ, МІМ5МКОІККОІ,
КМІМЗУКСОСІВКБІ, СКМІМЗУКОІВКБІ, КМІМ5УКОЇВКВБІС та СКМІМ5МКСО!ІЕКОІС.
В одному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка описана вище, за умови, що одноланцюговий ВОМТ/Е1, який описаний вище, або послідовність суміжних амінокислот, яка описана вище, містить одну або декілька (наприклад, одну або декілька, дві або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім) з наступних амінокислот (де нумерація амінокислотних положень починається з М-кінцевого амінокислотного залишку та закінчується
С-кінцевим амінокислотним залишком у білку ВОМТ/Е1): гліцин у положенні 177; серин у положенні 198; аланін у положенні 340; лейцин у положенні 773; лейцин у положенні 963; глутамін у положенні 964; аланін у положенні 967; аспарагін у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) гліцин у положенні 177; серин у положенні 198; аланін у положенні 340; лейцин у
Зо положенні 773; лейцин у положенні 963; глутамін у положенні 964; аланін у положенні 967 та аспарагін у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) гліцин у положенні 177; аланін у положенні 340; лейцин у положенні 773; лейцин у положенні 963; глутамін у положенні 964; аланін у положенні 967 та аспарагін у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) гліцин у положенні 177 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з серину у положенні 198; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 773; лейцину у положенні 963; глутаміну у положенні 964; аланіну у положенні 967; аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) серин у положенні 198 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з гліцину у положенні 177; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 773; лейцину у положенні 963; глутаміну у положенні 964; аланіну у положенні 967 та аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) аланін у положенні 340 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з гліцину у положенні 177; серину у положенні 198; лейцину у положенні 773; лейцину у положенні 963; глутаміну у положенні 964; аланіну у положенні 967; аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) лейцин у положенні 773 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з гліцину у положенні 177; серину у положенні 198; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 963; глутаміну у положенні 964; аланіну у положенні 967; аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) лейцин у положенні 963 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два 60 або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з гліцину у положенні 177; серину у положенні 198; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 773; глутаміну у положенні 964; аланіну у положенні 967; аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) глутамін у положенні 964 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з гліцину у положенні 177; серину у положенні 198; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 773; лейцину у положенні 963; аланіну у положенні 967; аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) аланін у положенні 967 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з гліцину у положенні 177; серину у положенні 198; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 773; лейцину у положенні 963; глутаміну у положенні 964; аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення зазначені одна або декілька амінокислот містять (або включають) аспарагін у положенні 1195 та один або декілька (наприклад, один або декілька, два або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) з гліцину у положенні 177; серину у положенні 198; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 773; лейцину у положенні 963; глутаміну у положенні 964; аланіну у положенні 967.
В одному варіанті здійснення присутність зазначених однієї або декількох амінокислот, які описані вище, забезпечує ВОМТ/Е1, що характеризується покращеною розчинністю порівняно із білком ВоМТ/ЕЇ, що не містить зазначених амінокислот. Зазначена покращена розчинність підвищує вихід білка у гетерологічній (Е. соїї) системі експресії.
В одному варіанті здійснення, де послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка описана вище, послідовність суміжних нуклеотидів характеризується щонайменше 770 (наприклад, щонайменше 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870 або 880) синонімічними кодонами порівняно з послідовністю нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е! дикого типу (ЗЕО ІО МО: 3). Отже, в одному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти містить щонайменше 770 кодонів, які відрізняються від відповідного кодону у послідовності нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е1Т дикого типу (ЗЕО ІЮ МО: 3), але кодують таку саму амінокислоту, що й він.
Зо В одному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) характеризується вмістом 5-С щонайменше 41 95 (наприклад, щонайменше 41 або 42 95). В одному варіанті здійснення послідовність нуклеїнової кислоти (яка описана вище) характеризується вмістом -С 42 95. Поняття вмісту 5-С у нуклеїновій кислоті (також відоме як вміст С або вміст 5-С) відноситься до співвідношення нуклеотидів у заданій послідовності нуклеїнової кислоти, які являють собою або с (гуанін), або С (цитозин). Отже, в одному варіанті здійснення вміст (3-С у послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом є зміненим (наприклад, шляхом заміни на синонімічні кодони) для того, щоб краще відповідати вмісту (5-С у нуклеїнових кислотах, що переважно експресуються у клітинах-хазяїнах Е. соїї, тим самим покращуючи експресію послідовності та забезпечуючи підвищені виходи білка.
В одному аспекті даний винахід передбачає вектор експресії, що кодує послідовність нуклеїнової кислоти, яка описана вище. В одному варіанті здійснення вектор експресії являє собою вектор рЕТ-26Б().
В одному аспекті даний винахід передбачає клітину-хазяїна, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка описана вище, або вектор експресії, який описаний вище. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн являє собою клітину Е. соїї. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн Е. соїї являє собою клітину Е. соїї ВІК (ОЕЗ).
В одному аспекті даний винахід передбачає спосіб одержання розчинного одноланцюгового білка ВоМТ/Еї у клітині-хазяїні Е. соїї, причому зазначений спосіб включає експресію послідовності нуклеїнової кислоти (яка описана вище) у системі експресії Е. соїї.
Способи та методики, які застосовують для експресії гетерологічних білків у системах експресії Е. соїї (ЕзсПегіспіа соїї) є добре відомими у рівні техніки.
В одному варіанті здійснення зазначений розчинний одноланцюговий білок ВОоМТт/Е1 експресується у цитоплазмі зазначеної клітини-хазяїна Е. соїї.
В одному варіанті здійснення зазначений розчинний одноланцюговий білок ВОоМТт/Е1 експресується на рівні щонайменше 3 мг/л (наприклад, щонайменше 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 25, 40, 45 або 50 мг/л).
В одному варіанті здійснення спосіб одержання розчинного одноланцюгового білка ВОМТ/Е1, який описаний вище, включає лізис клітини-хазяїна Е. соїї з забезпеченням гомогенату клітини- хазяїна Е. соїї, що містить зазначений розчинний одноланцюговий білок ВОМТ/Е1. Способи та 60 методики, які застосовують для лізису клітин-хазяїнів, таких як клітини-хазяїни БЕ. сої, є відомими у рівні техніки. Приклади включають обробку ультразвуком та застосування французького преса.
В одному аспекті даний винахід передбачає спосіб одержання розчинного дволанцюгового білка ВОМТ/ЕТ, причому зазначений спосіб включає забезпечення розчинного одноланцюгового білка ВОМТ/ЕТ, що містить послідовність суміжних амінокислот, та де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 95 95 (наприклад, щонайменше 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 або 100 95) ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕ ІЮ МО: 2, та приведення зазначеного білка ВОМТ/ЕТ у контакт із трипсином у розчині.
Коли одноланцюговий білок ВОМТ/Е1 за даним винаходом приводять у контакт із трипсином, протеолітична дія трипсину розщеплює одноланцюговий білок у сайті між І-ланцюговим протеазним компонентом та транслокаційним компонентом з одержанням дволанцюгового білка, в якому два ланцюги зв'язані дисульфідним містком (детальніше, два ланцюги, утворені після розщеплення одноланцюгового ВОМТ/Е!1 в сайті активації, являють собою перший ланцюг з амінокислотними залишками 1-419 та другий ланцюг з амінокислотними залишками 423-1252, причому залишки 420, 421 та 422 видаляються у процесі розщеплення). Отже, трипсин можна застосовувати для активації одноланцюгового поліпептиду шляхом його перетворення на активну дволанцюгову форму. Таким чином, переважно застосування трипсину означає, що конструювання екзогенного (ненативного) сайту розщеплення у ВОМТ/Е!1 за даним винаходом не є необхідним.
В одному варіанті здійснення посилання на трипсин охоплює трипсиноподібні ферменти, які розщеплюють у тому ж сайті розщеплення протеазою, що й трипсин.
Трипсин розщеплює послідовності білків, у яких конкретні амінокислоти знаходяться у певних положеннях на будь-якому боці від розщепленого пептидного зв'язку. Такі послідовності можуть бути представлені списком Р4-РЗ-Р2-РІ1-розщеплений зв'язок-Р'1-Р'2-Р'З-Р'4; у якому
РІ1І-Р4 позначають амінокислоти, розташовані у положеннях 1-4 відносно розщепленого пептидного зв'язка у бік М-кінця, відповідно, та Р'Ї-Р'ї позначають положення 1-4 відносно розщепленого пептидного зв'язку у бік С-кінця.
Найбільш важливо, трипсин розщеплює послідовності білків, у яких або амінокислоти Ага,
Зо або Гуз займають положення Р1. Коли Гуз знаходиться у положенні РІ, існують три головні типи послідовності, не чутливі до трипсину: (1) Рго у положенні Р'Ї звичайно зменшує чутливість до розщеплення трипсином (але не у випадку, коли Тгр знаходиться у положенні Ра); (2) або Суз, або Ар у положенні Р2 разом із А5р у положенні Р'Ї зменшує чутливість до розщеплення трипсином; (3) Су у положенні Р2 разом з одним із Ніх5 або Тгу у положенні Р'Ї знижує чутливість до розщеплення трипсином.
Коли Агд знаходиться у положенні РІ, існують три основні типи послідовності, які не є чутливими до трипсину: (1) Рго у положенні Р'Ї звичайно зменшує чутливість до розщеплення трипсином (але не у випадку, коли або Меї, або можливо Сіи знаходиться у положенні Рг); (2) Суз у положенні Р2 разом із ух у положенні Р'Ї зменшує чутливість до розщеплення трипсином; (3) Агд у положенні Р2 разом з одним із Ніх5 або Агуд у положенні Р'Ї зменшує чутливість до розщеплення трипсином.
В одному варіанті здійснення даний винахід передбачає спосіб (який описаний вище) одержання розчинного дволанцюгового білка ВОМТ/ЕЇ за умови, що зазначена послідовність суміжних амінокислот містить одну або декілька (наприклад, одну або декілька, дві або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше або сім) із наступних амінокислот (де нумерація амінокислотних положень починається 3 /М-кінцевого амінокислотного залишку та закінчується С-кінцевим амінокислотним залишком у білку
ВоМТ/Е1): гліцину у положенні 177; серину у положенні 198; аланіну у положенні 340; лейцину у положенні 773; лейцину у положенні 963; глутаміну у положенні 964; аланіну у положенні 967; аспарагіну у положенні 1195.
В одному варіанті здійснення присутність зазначених однієї або декількох амінокислот, які описані вище (та з урахуванням багатьох перестановок зазначених однієї або декількох амінокислот, які описані вище), забезпечує білок ВОМТ/Е1, що характеризується покращеною розчинністю порівняно із білюм ВоОоМТ/Е!Ї, що не містить зазначених амінокислот. Зазначена покращена розчинність може підвищувати вихід білка у гетерологічній системі експресії.
В одному варіанті здійснення, у якому даний винахід передбачає спосіб (який описаний вище) одержання розчинного дволанцюгового білка ВОМТ/Е1, розчинний одноланцюговий білок
ВоМТ/Е1Ї забезпечують за допомогою описаного вище способу одержання розчинного одноланцюгового білка ВОМТ/Е1 у клітині-хазяїні Е. соїї.
В одному варіанті здійснення, у якому даний винахід передбачає спосіб (який описаний вище) одержання розчинного дволанцюгового білка ВоМТ/Е1ї, причому спосіб включає відділення розчинного білка ВОМТ/Е!Ї від трипсину шляхом приведення розчину, що містить розчинний білок ВОМТ/Е1 та трипсин, у контакт із гідрофобною поверхнею, де розчинний білок
ВоМТт/Е1 переважно зв'язується з гідрофобною поверхнею.
Автори даного винаходу виявили, що високі виходи активованого дволанцюгового білка
ВоМТ/Е1Ї можна одержати при застосуванні способу гідрофобного очищення для відділення активованого дволанцюгового поліпептиду від трипсину. Несподівано, даний спосіб забезпечує краще очищення, ніж стандартне очищення із застосуванням іонообмінної хроматографії, яка, як виявили автори даного винаходу, є неефективною для відділення активованого дволанцюгового поліпептиду від трипсину. Окрім того, спосіб переважно забезпечує активований дволанцюговий білок ВОМТ/ЕТ, який не містить активаційну протеазу як частину способу загального очищення.
Одержання активного рекомбінантного ВОМТ/Е1 вимагає стадії протеолізу, на якій молекула розщеплюється з утворенням активної дволанцюгої форми. Цього розщеплення можна досягти за допомогою стадії активації іп міго із застосуванням протеази, трипсину. Після стадії активації важливим є видалення протеази з кінцевого продукту, що також попереджає будь-яке подальше неспецифічне розщеплення ВОМТ/Е1.
Ізоелектричні точки (рі) трипсину та ВОМТ/Е1 становлять 9,32 та 6,2, відповідно, що вказує на те, що розділення цих двох білків буде досягатися за допомогою іонообмінної (ЕХ) хроматографії, яка використовує різницю у заряді між двома молекулами. На сумарний заряд білка впливає рН його навколишнього середовища, та заряд буде ставати більш позитивним або негативним залежно від того, чи одержує або втрачає протони білок. рі являє собою значення рН, при якому молекула не несе електричного заряду та, отже, не буде взаємодіяти з зарядженим ІЕХ середовищем. Це означає, що якщо білок знаходиться при рН, що перевищує
Зо його рі, то він буде нести сумарний негативний заряд та буде зв'язуватися з позитивно зарядженим середовищем, таким як аніонообмінна смола. Аналогічно, якщо рН буфера є нижчим рі, то білок буде нести сумарний позитивний заряд та не буде зв'язуватись з аніонообмінною смолою.
Виходячи з цього принципу, при рН 8 можна очікувати, що ВОоМТ/Е (рі якого становить 6,2) буде зв'язуватись з аніонообмінною колонкою, у той час як трипсин з рі 9,32 не буде, що забезпечує можливість розділення двох білків. ІЕХ є простим та недорогим способом хроматографії, оскільки він не вимагає, щоб білок, який завантажують на колонку, знаходився у буфері з високим вмістом солі, що може приводити до втрат білка внаслідок осадження.
Автори даного винаходу випробували ряд аніонообмінних колонок із застосуванням як сильних, так і слабких функціональних груп, прикріплених до бусин на основі зшитої агарози, при рН 8. У кожному випадку виявляли, що велика частка трипсину не зв'язувалася з колонкою, як передбачалося, а була присутня в елюаті. Проте, коли колонки елюювали при лінійному градієнті зі зростанням іонної сили, трипсин елюювався з колонки, що вказувало на те, що частина трипсину була здатна до зв'язування з колонками. При порівнянні з елююванням
ВОоМТ/Е1 було неочікувано виявлено, що трипсин елююється при подібній іонній силі (таблиця 1; фігура 1), що вказує на те, що трипсин не відділявся, як передбачалося, та був присутній у кінцевому очищеному продукті ВОМТ/Е1Ї з додатковою можливістю подальшого руйнування
ВОМ Т/Е1.
Таблиця 1
Елюйовані фракції з аніонообмінних колонок, на яких оцінювали відділення трипсину від ВОМТ/Е1. Піки виражені у кількості об'ємів колонки (СМ). ГБ/1: елюат із колонки; ЕЕ: смола для хроматографії у швидкому потоці
Колонка - - /Головнийтік | Мінорнийтік | Головнийпіє | Мінорнийтік
ОАЄ т 1061яв а
Автори даного винаходу розв'язали описану вище проблему. Детальніше, автори даного винаходу несподівано виявили, що оптимального розділення трипсин-ВоОМТ/ЕТ досягають при застосуванні гідрофобної поверхні для розділення (наприклад, за допомогою хроматографії гідрофобних взаємодій (НІС), яка розділяє білки за відмінностями у їхній поверхневій гідрофобності, використовуючи оборотну взаємодію між цими білками та гідрофобною поверхнею НІС середовища).
В одному варіанті здійснення гідрофобна поверхня являє собою інертну матрицю, до якої прикріплений ліганд, що включає арильні або алкільні групи.
Вираз "арил" стосується ароматичних груп, наприклад, фенілу, нафтилу, тієнілу та індолілу.
Вираз "алкіл" стосується аліфатичних груп, у тому числі лінійних, розгалужених, циклічних груп та їх комбінацій. Алкільна група може містити 1-12 атомів вуглецю. Приклади алкільних груп включають без обмеження такі групи, як метил, етил, пропіл (наприклад, н-пропіл, ізопропіл), бутил (наприклад, н-бутил, ізобутил, втор-бутил, трет-бутил), пентил, гексил, гептил та октил.
В одному варіанті здійснення гідрофобна поверхня вибрана з групи, що включає бутильні, фенільні або октильні ліганди.
В одному варіанті здійснення гідрофобна поверхня містить бутильні ліганди. В одному варіанті здійснення гідрофобна поверхня містить фенільні ліганди. В одному варіанті здійснення гідрофобна поверхня містить октильні ліганди.
Автори даного винаходу встановили, що особливо переважні результати для відділення трипсину від ВОМТ/Е одержують з НІС при застосуванні хроматографічних смол, що містять алкільні або арильні групи, наприклад, бутильні, фенільні та октильні ліганди, приєднані до інертної матриці, такої як бусини на основі зшитої агарози або полістиролу (таблиця 2; фігура 2).
Таблиця 2
Елюйовані фракції з комерційних колонок для хроматографії гідрофобних взаємодій, на яких оцінювали відділення трипсину від
ВоМТ/Е. Піки виражені у кількості об'ємів колонки (СМ). Е/: елюат із колонки; ЕЕ: смола хроматографії у швидкому потоці; НР: смола для високоефективної хроматографії, (І 5): низький ступінь заміщення гідрофобних груп; (Н5): високий ступінь заміщення гідрофобних груп ооголовнийтіє | Міорнийтію | Головний пік | Мінорнийпік еейлфяєк 12531 382 сені 17786010 24 оФенлНРЇГ///171 в 16и 1114 | 7-1
Буш 00017606 и 10011 оБумлнР 17111178 | Розмиий/ 276111 ол 00117501, 24 1
В одному варіанті здійснення спосіб гідрофобного очищення для відділення активованого дволанцюгового білка ВОМТ/Е1 від трипсину знижує концентрацію трипсину щонайменше у 100 разів, щонайменше у 150 разів, щонайменше у 200 разів, щонайменше у 250 разів, щонайменше у 300 разів, щонайменше у 350 разів, щонайменше у 400 разів, щонайменше у 450 разів або щонайменше у 500 разів. У переважному варіанті здійснення спосіб гідрофобного очищення для відділення активованого дволанцюгового білка ВОМТ/Е1 від трипсину знижує концентрацію трипсину щонайменше у 350 разів.
В іншому аспекті даний винахід передбачає активний дволанцюговий білок ВОМТ/ЕТ, де перший ланцюг містить послідовність суміжних амінокислот, та де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 95 95 (наприклад, щонайменше 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 або 100 95) ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю у положеннях 1-419 у БЕО ІО МО: 2; де другий ланцюг містить послідовність суміжних амінокислот, та де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 95 95 (наприклад, щонайменше 95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8, 99,9 або 100 95) ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю у положеннях 423-1252 у 5ЕО ІЮ МО: 2; де перший та другий ланцюги з'єднані разом дисульфідним зв'язком між цистеїном 412 у першому ланцюзі та цистеїном 426 у другому ланцюзі; за умови, що зазначена послідовність суміжних амінокислот містить одну або декілька (наприклад, дві або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше або вісім) з наступних амінокислот (де нумерація амінокислотних положень починається з М-кінцевого амінокислотного залишку та закінчується С-кінцевим амінокислотним залишком у білку ВОМТ/Е1): гліцин у положенні 177; серин у положенні 198; аланін у положенні 340; лейцин у положенні 773; лейцин у положенні 963; глутамін у положенні 964; аланін у положенні 967; аспарагін у положенні 1195.
У пов'язаному аспекті даний винахід передбачає активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1, який можна одержати за допомогою способу (який описаний вище) одержання розчинного
Ко) дволанцюгового білка ВОМТ/Е1.
В одному аспекті даний винахід передбачає композицію, що містить активний дволанцюговий білок ВОМТ/ЕЇ (який описаний вище), де зазначена композиція практично не містить трипсину.
Отже, композиція переважно практично не містить трипсинової протеази (яку використовують для активації одноланцюгового поліпептиду шляхом його перетворення на активну дволанцюгову форму), тим самим попереджаючи небажане неспецифічне розщеплення білка ВОМТ/Е1.
В одному варіанті здійснення, у якому композиція (яка описана вище) практично не містить трипсину, композиція містить менш ніж 100 пікограмів (пг) трипсину на 100 нанограмів (нг) білка
ВоМТт/Е1; наприклад, менш ніж 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 або 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1. В одному варіанті здійснення композиція (яка описана вище) містить менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1, або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1, або менш ніж 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1. У переважному варіанті здійснення композиція (яка описана вище) містить менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1 або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1.
Отже, в одному варіанті здійснення фраза "практично не містить трипсину" означає менш ніж 100 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1; наприклад, менш ніж 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 або 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1, переважно менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1 або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1.
Способи визначення концентрації трипсину у композиції відомі у рівні техніки. У якості прикладу, концентрацію трипсину у композиції за даним винаходом можна визначити за допомогою сендвіч ЕГІЗА (твердофазного імуноферментного аналізу).
У додатковому аспекті даний винахід передбачає тверду або рідку фармацевтичну композицію, що містить: (а) активний дволанцюговий білок ВОМТ/ЕТ, який описаний вище, та (р) стабілізувальний засіб.
В одному варіанті здійснення композиція (яка описана вище) практично не містить трипсину.
В одному варіанті здійснення композиція містить менш ніж 100 пг трипсину на 100 нг білка
ВоМТ/Е1, наприклад, менш ніж 50, 20, 10, 9, 8, 7, 6 або 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1. В одному варіанті здійснення композиція містить менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е 1 або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1.
Стабілізувальні засоби, які можна застосовувати в композиціях згідно з даним винаходом, включають білкові стабілізатори, такі як альбумін, зокрема, сироватковий альбумін людини (НЗА), та небілкові стабілізатори.
Небілкові стабілізувальні засоби, які можна застосовувати в композиціях згідно з даним винаходом, включають поверхнево-активні речовини, зокрема, неіоногенні поверхнево-активні речовини. Приклади неіоногенних поверхнево-активних речовин включають полісорбати, такі як полісорбат 20 або полісорбат 80, та блок-співполімери, такі як полоксамери (тобто співполімери поліетилену та пропіленгліколю).
Зо У конкретному варіанті здійснення композиція не містить білок як стабілізувальний засіб.
Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу фармацевтична композиція являє собою рідку фармацевтичну композицію, яка містить: (а) активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е!1, який описаний вище; (р) небілковий стабілізувальний засіб, що являє собою поверхнево-активну речовину; та (с) воду; де зазначена рідка фармацевтична композиція не містить білкового стабілізувального засобу; та де зазначена рідка фармацевтична композиція практично не містить трипсину (наприклад, зазначена рідка фармацевтична композиція містить менш ніж 100 пг трипсину на 100 нг білка
ВОоМТ/Е1, або менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1, або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВоОМТ/Е1, або менш ніж 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1; переважно де зазначена рідка фармацевтична композиція містить менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка
ВоМТ/Е1 або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1).
В одному варіанті здійснення активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1 присутній у композиції (яка описана вище) у концентрації 1-100 нг/мл. В одному варіанті здійснення активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1 присутній у композиції (яка описана вище) у концентрації 5-50 нг/мл, наприклад, приблизно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 нг/мл. У переважному варіанті здійснення активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1 присутній у концентрації приблизно 20 нг/мл.
В одному варіанті здійснення поверхнево-активна речовина (описана вище) являє собою полісорбат, такий як полісорбат, що має середній ступінь полімеризації в діапазоні від 20 до 100 мономерних ланок, і може, наприклад, являти собою полісорбат 80. У переважному варіанті здійснення полісорбат має рослинне походження. Концентрація поверхнево-активної речовини переважно становить менше 1 95 об'єм/ об'єм, наприклад, становить від 0,005 95 до 0,02 95 об'єм/об'єм у випадку полісорбату 80.
Фармацевтична композиція згідно з даним винаходом також може містити кристалічний засіб.
Під кристалічним засобом мають на увазі засіб, який, серед іншого, забезпечує підтримання структури механічно міцного слою осаду клітин у ліофілізованому комплексі ботулінічного 60 нейротоксину (типу А, В, С, 0, Е, Е або с) або ботулінічному нейротоксині високого ступеня чистоти (типу А, В, С, 0, Е, Е або б). У випадку включення в тверді склади кристалічні засоби також мають ефект збільшення об'єму. Кристалічні засоби включають, зокрема, хлорид натрію.
Концентрація кристалічного засобу може становити, наприклад, від 0,1 до 0,5 М, переважно від 0,1 до 0,4 М, зокрема, від приблизно 0,15 до 0,3 М.
Фармацевтична композиція згідно з даним винаходом також може містити буфер для підтримання рівня рН у діапазоні від 5,5 до 7,5 або від 6,0 до 7,0. Буфер може являти собою будь-який буфер, здатний підтримувати рН на належному рівні. Наприклад, буфер для композицій згідно з даним винаходом можна вибрати з групи, яка включає сукцинат, фосфат динатрію/лимонну кислоту та амінокислоту, таку як гістидин. Концентрація буферу може становити, наприклад, від 1 до 50 мМ, переважно від 5 до 20 мМ, переважно приблизно 10 мМ.
Фармацевтична композиція згідно з даним винаходом також може містити дисахарид.
Дисахарид, застосовуваний у композиціях згідно з даним винаходом, можна вибрати з групи, яка включає сахарозу, трегалозу, маніт та лактозу. У конкретному варіанті здійснення дисахарид являє собою сахарозу. Концентрація дисахариду може становити, наприклад, від 5 до 50 мМ, переважно від 5 до 25 мМ, більш переважно від 10 до 20 мМ і найбільш переважно приблизно 11,7 мМ.
У конкретному варіанті здійснення фармацевтична композиція являє собою рідку фармацевтичну композицію, яка містить: (а) активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е!1, який описаний вище; (5) небілковий стабілізувальний засіб, що являє собою поверхнево-активну речовину; (с) хлорид натрію; (с) буфер для підтримання рН від 5,5 до 7,5; (є) дисахарид та (Ї) стерильну воду; де зазначена рідка фармацевтична композиція не містить білкового стабілізувального засобу; та де зазначена рідка фармацевтична композиція практично не містить трипсину (наприклад, зазначена рідка фармацевтична композиція містить менш ніж 100 пг трипсину на 100 нг білка
ВоМТ/Е1, або менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1, або менш ніж 7 пг трипсину на
Ко) 100 нг білка ВоОМТ/Е1, або менш ніж 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1; переважно де зазначена рідка фармацевтична композиція містить менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка
ВоМТ/Е1 або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1).
Згідно з конкретним варіантом здійснення фармацевтична композиція згідно з даним винаходом у рідкій формі міститься в герметичному флаконі або готовому до використання пристрої, такому як шприц, без межі поділу рідина/газ та є стабільною протягом щонайменше трьох місяців або щонайменше шести місяців при 23-27 "С та протягом щонайменше дванадцяти місяців при 2-8 "С.
В одному аспекті даний винахід передбачає активний дволанцюговий білок ВОМТ/ЕТ, який описаний вище, або активний дволанцюговий білок ВОМТ/ЕЇ, який можна одержати шляхом протеолітичного розщеплення одноланцюгового білка ВоМТ/ЕЇ, який описано вище, або композицію, яка описана вище, або рідку фармацевтичну композицію, яка описана вище, для застосування у терапії.
Автори даного винаходу виявили, що активні дволанцюгові білки ВоМТ/ЕЇ за даним винаходом, та композиції, та рідкі фармацевтичні композиції з ними можна застосовувати у терапії. Придатні види терапії можуть включати косметичні обробки та способи медичного лікування.
Пояснення до 5ЕО ІЮО МО
ЗЕО ІЮО МО: 1 Оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е1
ЗЕО ІЮ МО: 2 Амінокислотна послідовність ВОМТ/Е1
ЗЕО ІЮ МО: З Послідовність нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е1 дикого типу
ЗЕО ІЮО МО: 1 Оптимізована послідовність нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е1
АТаССОСАААДАТСААСТСТТТСААСТАСААСИАСССОааТТААСсАССОаТАССАТОСТОаТтАТ
АТСАААСССсаатасттасСсСАааАаТТСстТАСАААТСТТТСААСАТСАТОАААААСАТСТОаС
АТСАТСССОасСААСОТААСОаТТАТССИаТАССАССССОЯСсАа,аАСТТССАСССассаАССТОСТ
СТОаААААдАСаатТаАСТСТТСТТАСТАСИ,АСССОаААСТАССТоСАаТтСТаАСаААСпАдААА
САССИТТТОСТаААААТСИТТАССААААТСТТСААССаТАТСААСААСААССТОИатстаат сатТАтТоСстТасСстацпААСаААСТатСТтТАААасСтТААСССаТатАССТаси ГААСпАСААСАСоССа
САСААССАаТТоСАСАТСОСКЯ ТОАСО,СТТСоТастатТтаАААТСАААТТСТСТААСИаЦаИттст сАдапАСАТОСТаСТасСсСаААСаТтТАТСАТСАТОССЯ ТИСТаААсСсапвАССТаттосАААСС 60 ААСТСТТСТААСАТСТОТСТаСатААСААСТАСАТИАССИаТСТААССАССОССТ І ТссааТТоТ
АТСаСТАТСИТТАССТТСТСОТОСИаСААТАСТСОТТ ТОСИаТТТСААСаАСААСАаСАТОААС вАаТсСАТССАапАСССаасСТсТаАСсССсТаАТаСАСаААСТаАТССАСТСОТСОТОаСАСИастТ
СТаТАСОСТастТАААСааТАТСАССАССАААТАСАССАТСАСССАСАААСАЧААСССаТста
АТСАССААСАТССОЯтТааТАССААСАТССАдАсаАХаттоСстадсстттсаатааТАССаАсстТа
ААСАТСАТСАССТСТастТоАаТСсСтТААСОАСАТСТАСАССААССТастаасСстТаАСТАСАДА
ААДААТСастТТСстТАААСТатТсСТАААаТТСсАааТТТСсТААСССастасСстаААСССаТАСААдДА
САССТ ТТ СОААдаСТАААТАСОатСстТасАСААДАаАдСаТст СТОСТАТСТАСТСТаТтТТААС
АТСААСАААТТСААСОаАСАТСТТСААДААААСТатТАСТСОТТТСАССавАаИтСсаАсСТаасСа
АССАААТТССАСОТТАААТаССаТтСАСАССТАСАТСИИТСАСТАСАААТАСТТСАААСТа
ТСТААССТаСТаААСаАСТСТАТСТАСААСАТСТСТИаААСОТТАСААСАТСААСААССТОа
АААДСТТААСсТтоСсатасаТСАпААСаТстТААССТаААСССасСсаТАТСАТСАССССОАТСАСС вататааТСстТаайТТАААААААТСАТССИТ ТТ СТаСААСААТАТТИаТААлДаСатТАААСасА
АТААСАДАААСТАТСТаСАТСЯАААТСААСААСИаатТаААСТаИат стат ТастТсСтТалАА
ААСТСТТАСААСОАСаАСААСАТСААСАССССОВАААПАААТСОАСИПАСАССИатТАССТОТ
ААСААСААСТАСИАААДАСИаАССтТавАССАаИаТтТАТССТОаААСТТСААСТСОТаААТСТОаСсСтТ сс,аватстТатстТаАСОаАААдААСТаААССТаАССАТССАСААСОАСасСтТТАСАТСССОСАДА
ТАСОСАСТСТААСОИаТАССТСТаАСАТССААСАаСАСОАСИТТААСИаААСТОаААСИТТТТо
ТП СТАССТаСАСаСТСАСАААа ТТ ССапААпсТаААААСААСОИТТААССТОаАССТСТТСТ
АТСОАСАССИаСТоТастТапсААСАаССаААААТСТАСАССТТСТТСТСТСТаАаТТсСАТС
ААСААСатТТААСАААСсСсааттсАадчастасттат ат в тапАТСАаСсАсцаТттстТа
СТТОАСТТСАССАССОВААдаСТААССАСАААТСТАССИТТОАСААААТСаИТстадсСАТСТОТ
АТСаТтТаттсСатАСАТСОССТСТааСТСТаААСАТСОСТААСОПААасСТСАСпСАААСапаТтТААс
ТП сСАААдвдсастотасАдастаставатастааТАтсТаставпАа т СспААССасААСТа
СТаАТСССОАССАТССТаСТТТТсСАССАТСАААТСТТ ТОСТИ ТТ СОТ СТаАСААСААА
ААСАААСТТАТСАААДИаСТАТСААСААСаИастоТаАААпААСаТтаАСаАААААТаСААдАСАА
СТТТАСТСТТТСАТСОТТТСТААСТаСАТОАССААААТСААСАСССАССТТСААСАДАСИт
ААДАСААСАСАТатАССАаастоТ ССАСААССАааТТААСастТАТСААААССАТСАТСИАА
ТСТААДААТАСААСТСТТАСАСССТаСААСАААААААСОААСТаАССААСАААТАСОАСАТС
ААДАСАСАТСОСААААСОААСТаААССАПСАААаТ ТТ СТАТСИаСТАТОААСААСАТССОСАССаИТт
Зо т ССТаАССОААТСТТСТАТСТСТТАССТОАТОАААСТСАТСААСОААСТТААААТСААС
АААСТаСатаААТАСЧАСОААААСИТТААААССТАССТаСТаААСТАСАТСАТССАССАС ват СстТАТССТаСаТаААТСТСАаСАСаСпСААСТаААСТСТАТИаСТТАССОАСАСССТОААС
ААСТСТАТСССИаТТСАААСТатсоТттСсТТАСАССИАСОАСААААТССТаАТСТСТТАСТТО
ААСАААТТСТТТАААСаСАТТААДИаАХаИТТСАТСИСТТСТаААТАТаСасСТАСАААААТОИаАТ
ААДАТАТаТСаАТАСТТСТаСАТАТИаАТАаСААТАТСААСАТТААСИаСаАСаИатаТАТААА
ТАТССОАСАААТАААААССАаТ ПТ аспсАТАТАТААСЧАСААдасСстТатсааАааТСААТАТТ
ТСТСАААДАСОАСТАТАТСАТТТАССАТААТАААТАТААДАААСТТ ТАССАТТАСТТТТТОС аТТсСОаОТАТАССТААТТАТОАСААТААААТТаТАААТаТтаААТААСИаАаИТАТАССАТТАТА
ААСТатТАТаСаСаАСААТААСАИатасттапААааТТАТСИаСТаААССАТААТОАСАТТАТС тТОпАСССТаСАаССАТААТаСАааТтТАТАААССАСАААСТаасСТТТТААСТАТОСАДАСасСА
ААТаСаАТСТСАСАТТАСАТТААТАААТаСАТТ ТТТатТАССАТТАСИААСИАТСасттТА
СасСаАСтТСААААСТТТАТАТТААТИССААТСТаАТАСАТСАСАААТСААТСТТАААТТТО
СОСААТАТТСАТатТсСТСТтТаАТААСАТСТТаТтТТСААСАТСИТТААТТаСАСТТАСАСТСИТ
ТАТАТТИССАТТСИаТТАСТТТААТАТСТТССАТАААСААСТаСАСИ,пАпАСОасАААТССАС
АСТСТаТАТТСАДАСИадДассСААТАСТААТАТАТТИОХААаАТ ТТ ТасСасатТААСТАТСТТ
ТТАТАТЕОАТАААСААТАСТАТСТОСТОААТОТАТТОААаССАААСААТТТСАТАСАТАСА
СОСААДаСАТАССАСАТТААИТАТСААСААТАТСАСАТСТАСТАТАСТаТтТАаСААДАТСИОС
СТСТАСТОСОСТАТТАААИТаААСпАТТСАаСасИТТААТААСТОСАСТАССААТОАТААТ
СсТаатсСатААСААСаАТСсАпатТАТАСАТСААТТ ТСИтСасапАасСААААСТСАТСТСТТО
СсСасТТАСасССОАТАСАаСТАСИАСАААСААИапСААДААААССАТАААААТТТОСАОаСТОоС
СОАДАСАСАТТСААТСААСТАаТТаТтТААТаААСТОТаТтаспйаТААТААТТИатТАСИАТОаААС
ТТААСААТААСААТааСААСААТАТТаСАСТТ ТТ аСТТСАААаССОаАСАСАСТааТта
ВСсатсСАССТааСТтТАТТАСАСасСАСАТаСаспаАССАТАСОААТТССАдАСсаватта,|асттстас
ААСТТТАТСТСОСААдСААСАСаваТайСААСАААдАТАА
ЗЕО ІЮ МО: 2 Амінокислотна послідовність ВОМТ/Е1
МРКІМ5ЕМУМОРУМОВТІ МІКРССОЄЄМКОЕМІМКМУМПРЕАВММІСТТРООЕНРРТ5 г КМароБММОРММІ ОБОЕЄЕЕКОВЕЇКІМТКІЄМАІМММІ ЗИ СИ ЕБЕЇ 5КАМРМІ МОМ Р
ОМОЄНІСОАБАМЕЇКЕЗМОа БОС РММІИІМОАЕРОЇ ГЕТМ55МІбБІ ВЯММУМРУОМНИавБа5
ІАІМТЕ5РЕУЗЕВЕМОМОММЕРІООРАГ ТІ МНЕГІНБІ НОЇ МАКСІ ТКУТІТОКОМРІ. 60 ІГМІВОТМЕЕЕСТРааТТторІ МІТ5АОЗМОЇМ ТМ АОМККІАБКІ 5КМОМ5МРІ ЇЇ МРУК
ОМЕЕАКМУаИЇ ОКОАБИаМЗУМІМКЕМОЇЕККІ У5ЕТЕБОЇ АТКЕОУКСОТМІСОМКУЕКІ.
ЗМ МОБІММІЗЕСММІММІ КУМЕВСИОМАМІ МР ВИТРІТО ВО МККІВЕСКМІУБУКИа
ІВКБІСІЄІММСЕ гГЕМАБЕМОУМООМІМТ РКЕІЮОЮОТМТЗММММЕМОЇ СОМИ МЕМ5ЕБЗА
РОЇ 50ЕКІ МІ ТІОМОАМІРКУОБМОИ Т5ОТЕОНОММЕЇ ММЕЕМІ ОДОКУМРЕСЕМММУМІ 55
ІОТАГГЕОРКІМТЕЕЗ5ЕРІММУММКРМОААГЕМБУЛООМІ МОЕЄЕТТЕАМОКЗТМУМОКІАВІВ
ІМУРМІВІ А МІСМЕАОКОаМЕКОАЇГ ЕП ЧАСІ ЕРЕРЕСІРТІЇ МЕТІКОР 550МК
МКМІКАІММАСКЕВРЕКУМУКЕУМ5ЕМ5МММТКІМТОЄМКАКЕОММОАГОМОММАІКТИЕ
ЗКУМ5ОУТГЕЕКМЕСТМКМОЇКОТЕМЕЇ МОКМ5ІАМММІСАЕСТЕБОІВМІ МКГ ІМЕМКІМ
КІГ ВЕМОЕММУКТМІ І ММ ПОНаТві аЕБООБЇ М5ММУТОТІ ММ5ІРЕКІ 55Уи г ООКІ МЕ
МКЕЕКВІКЗЗОМІ ЯМА!АУКМОКУМОТаТмоБМІМІМЕ ОМ УКМИРТМКМОБСІММОКІ ЗЕММІ
БОМОМИМОМКУКМЕБІЗЕМУВІРММОМКІМММММЕМ ТІМСМАОММЗИаУКМ5І МНМЕЇ
М/П ООМАСІМОКГАЄЕМУСМАМИтОмМІМКУМЕМ ТІ Мова рБКІМІМаЕМОООКО МІ.
СМІНМБОМІ ЕКІММСЗМТАМІСТАМЕМІЄОКЕЇ ОЕТЕІОТІ М5МЕРМТМІ КОРМ СИМ.
ГМОКЕММ ММ КРУІМЕОВАКОБ5ТІ 5ІММІВЗТІ ГАМА М5ИаїкУкІОВУММоОТ МОМ
І УАКМООММІМЕМА5КТНІ ЕРІ МАОТАТТМКЕКТІКІЗОЗСМАЕМОУУУММеУСаММСТММ
ЕКМММСИмМмМмас сЕКАЮТУМАБТМ УУТНМв!ОоНТМОМаТсСсЕММЕІЗЕЕНОСМОЕК
ЗЕО ІЮ МО: З Послідовність нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е1 дикого типу
АТаССААДААДАТТААТАСТТТТААТТАТААТИОАТСОСТИаТТААТОАТАСААСААТТТТАТАТ
АТТАААССАпаСаатТаТСААСААТТТТАТАААТСАТТТААТАТТАТИАААААТАТТТОС
АТААТТССАСАСАСААДАТОТААТТаИаСТАСААССССССААСАТТТТСАТССасСсСТтТАСТТСА
ТТААДААДААТаСАСАТАСТАСТТАТТАТОАСССТААТТАТТ ТАСАДАДИТаАТОаААСАдДАДдОИ
САТАСАТТТТТААААДАТАИТСАСАААААТАТТТААТАСААТАААТААТААТСТТТСАСИаА
СОСАТТТТАТТАСААСААСТатТСсСААААаСТААТССАТАТТ ТАЙСОСААТОАТААТАСТОСА
САТААТСААТТССАТАТТаСТаАТаСАТСАИСАСТТОАСАТТАААТТСТСАААТаатТАас
САДСАСАТАСТАТТАССТААТаТТтТАТТАТААТОСМЧАЛаСАсСАаССТОаАТТТАТТТОАААСТ
ААСАСТТССААТАТТТСТСТААСАААТААТТАТАТаССААДИаСААТСАСОИССТТТТОСАТСА
АТАССТАТАСТААСАТТСТСАССТОаААТАТТСТТТТАСАТТТААТОАТААТАСТАТОААТ
СААТТТАТТСААСАТССТастТтоТтТАСАТТААТаСАТОААТТААТАСАТТСАТТАСАТОСА
СТАТАТОВЧОСТАААаасаАТТАСТАСАААСИТАТАСТАТААСАСАААДААСААДААТССССТА
Ко) АТААСАДАТАТААДИАдааТАСАААТАТТЯААСААТТСТТААСТТ ТТИСАСпаТтАСТОаАТТТА
ААСАТТАТТАСТАаЙТасСтТСАаТССААТОАТАТСТАТАСТААТСТТСТАИСТОАТТАТААА
ААДААТАаСатТСТАААСТТАИСАААИаТатАСААИТАТСТААТССАСТАСТТААТСОСТТАТААДА
САТаТтТ т ТаОАдАдаСАДАСТАТаСАТТАСАТАААСАТаСТАаСасААТТТАТТСИСТАААТ
АТАААСААДАТТТААТОАТАТТ ТТ ТАААДАААТТАТАСАИСТТТАСИаСААТТТОаАТТТАССА
АСТАААТТТСААДСТТАААТатТАаасСАААСТТАТАТТаСАСАСТАТАААТАСТТСАААСТТ
ТСАААСТТаТтТТАААТОаАТТСТАТТТАТААТАТАТСАЧЙААСОСТАТААТАТАААТААТТТА
ААДСИТАААТТТТАСАИСАСАСААТаСАААТТТАААТССТАСААТТАТТАСАССААТТАСА
СатТАСАпаАСТАаТААААААААТСАТТАСАТТТТаТАААААТАТТаТтТТТСТатАААдАдСас
АТААСОАААТСААТАТатТАТСАААТАААТААТОСТаАХаИ ТАТ ТТ ТИТаасСстТоСада
ААТАСТТАТААТИАТаАТААТАТАААТАСТОСТАААСАААТТОАСОАТАСАСТААСТТСА
ААТААТААТТАТОААДААТОАТТТАСАТСАСОИТТАТТТТАААТТТТААТАСТОаААТСАССА
ССТаОАСТТТСАСАТОАААААТТАААТТТААСТАТССААДААТИАТаСТТАТАТАССАААА
ТАТОАТТСТААТаСААСААаТаАТАТАСААСААСАТОаАТатТТААТОААСТТААТИатАТТТ
ТТ СТАТТТАСАТаСАСАСААдАаИТтассспААааТаААААТААТатСААТСТСАССТСТТСА
АТТОАТАСАЧСАТТАТТАСААСААССТААААТАТАТАСАТТ ТТ ТТСАТСАСААТТТАТТ
ААТААТаТтСААТАААССТатаСААДаСАаСАТТАТТТатТААДаСТапйАТАСААСААИаТтатТА
СТАСАТТТТАСТАСТаААДаСТААССААААААаТАСТаТТаАТААААТТаСАСАТАТТТСТ
АТАСТТОаТТоСАТАТАТАВИТСТТаСТТТАААТАТАЙСАААТаАдАаСАСААДАААСаСААДАТ
ТПТААДСАТаСАСТТОААТТАТТАВСАаСАСаТТАТТТТАТТАСААТТТаААСССОАЛдасТттТ
БО ТТААТТССТАСААТТТТАСТАТТСАСОСАТААДААТСТ ТТ ТТАСаТТСАТСТОАТААТААДА
ААТААДАСТТАТТААДИСААТАААТААТаСАТТОаАААСААдАСАСАТаАААААТайАААСАА
СТАТАТАСТТТТАТАЙТАТСИААТТаСАТОАСТААДААТТААТАСАСААТТТААТААААСИА
ААДАСААСААДАТатТАТСААИСТТТАСАААДАТСААИаТАААТаСААТТААААСААТААТАСАА
ТСТААСТАТААТАСТТАТАСТТ ТАСАССААДАААААТИАдаСТТАСАААТАААТАТОАТАТТ
ААДССАДАТАСААААТаААСТТААТСААДАДИа СТ ТТ СТАТАИСААТОААТААТАТАЧСАСАССИ
ТТ СТТААСТОАДААаИТТСТАТАТССТАТТТААТОАААТТААТААДАТОаААИТАААААТТААТ
ААДАТТААДСАСААТАТОАТаАСААТаТСААААСИатАТТТАТТЯААТТАТАТТАТАСААСАТ
СОАТСААТСТТапспАспАпАаТСАспСААпААСТАААТТСТАТИаСТААСТОаАТАСССТААДАТ
ААТАСТАТТССТТТТААаСТТ ТСТТСТТАТАСАСАТОаАТААААТТТТААТТТСАТАТТТТ 60 ААТААДАТТСТТТААДСАСААТТААААаТАаТТТСАСТТТТАААТАТОАСАТАТААДАДАТОАТ
АААТАСОИТАСАТАСТТСАСССАТАТОАТТСАААТАТАААТАТТААТавАСАТОаТАТАТААДАА
ТАТССААСТААТААААДАТСААТТТасСсААТАТАТААТИАТАААСТТАИТИаААсаТТААТАТА
ТСТСААААТаАТТАСАТТАТАТАТИОАТААТАААТАТАААААТТТТАСТАТТАИ,ТТТТТОаСа
С,ТААСААТТССТААСТАТИАТААТААСАТАС,ТАААТаТТААТААТаААТАСАСТАТААТА
ААТТатТАТаАСАСАТААТААТТСАааАТаспсАААаТтАТСТОТТААТСАТААТОИАААТААТТ тасАСАТТаСААСаАТААТаСАсаААТТААТСААДАААТТАИСАТТТААСТАТОСТААСасСА
ААТаСТАТТТСТОаАТТАТАТАААТАДСТасСАТТ ГПТатААСТАТААСТААТИОАТАСАТТА саАсСАТТСТАААСТТТАТАТТААТаСАААТТТААТАСАТСАААААТСААТТТТАААТТТА сатТААТАТТСАТаТтТАаТтаАСААТАТАТТАТТТААААТАСТТААТТаТтТАаТТАТАСАДИА
ТАТАТТаСТАТТАСАТАТТТТААТАТТ ТТ ТОАТАААСААТТАЧСАТаАААСАСАААТТСАА
АСТТТАТАТАВСААТИААССТААТАСАААТАТТТТадАдасаАТТ т тТасасСААДАТТАТТТа
СТТТАТИАСААДАСААТАСТАТТТАТТАААТататТААААССАААТААСТТТАТТаАТАСЄСС
АПСААААСАТТСТАСТТТААИСАТТААТААТАТААЧААаСАСТАТТСТТТТАССТААТАСА
ТТАТАТАСТаСААТААДААаТТАААДАТАСАААСАСТТААТААТАИ ТАС ТАСТААССАТААТ
СсТТатТАСАДАСААТаАТСАСИТтАТАТАТТААТТТТатАаССАаСААААСТСАСТТАТТТ
ССАТТАТАТаСТаАТАСА,СТАССАСААДАТАААСАСААДААСААТААДАААТАТСАТСАТСТ всаСААТАСАТТТААТСААСТАаТАаТТАТаААТТСАИТАСОаАААТААТТаТтТАСААТОИаААТ
ТТТАДАДААТААТААТавАААТААТАТТОССЯ ТТИТ ТАС ТТ СААпасСАСАТАСТОТАСТТ аСстТАатАСТТасСТтАТТАТАСАСАТАТИАСАСАТСАТАСАААСАаСААТапаАТИ ТТ Та
ААСТТТАТТТСТаААСААСАТасАтТааСААСАдАААТАА
Короткий опис фігур
Фігура 1
Елюйовані фракції з аніонообмінних колонок, на яких оцінювали відділення трипсину від
ВоМТ/Е1. Позначені пік для трипсину, ВОМТ/Е1 та градієнт солі. Фіг. ТА: О-сефароза НР; фіг. 18:
ОЕАЕ сефароза.
Фігура 2
Елюйовані фракції з колонок для хроматографії гідрофобних взаємодій, на яких оцінювали відділення трипсину від ВОМТ/Е1. Позначені пік для трипсину, ВОМТ/Е1 та градієнт солі. Фіг. 2А: феніл-сефароза НР; фіг. 28: бутил-сефароза НР; фіг. 2С: октил-сефароза ЕР.
Зо Фігура З
Рівень експресії розчинного гВоМТ/Еї у культурі, визначений за допомогою Вестерн- блотингу, порівняно із комерційним ВОМТ/Е1.
Фігура 4
ЗО5-РАСЕ (електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) гВоМтТ/Е1 при відновних та невідновних умовах, що підтверджує утворення дволанцюгової структури.
Приклади
ПРИКЛАД 1
Конструювання оптимізованої послідовності нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е1
Послідовність ДНК спочатку конструювали за допомогою зворотної трансляції амінокислотної послідовності ВОМТ/Е1 (5ЕО ІЮ МО: 2). Послідовність рестрикції (Р5іЇ) додавали до М-кінця та стоп-кодон і додаткові послідовності рестрикції ХбаІ-стоп-кодон-Ніпан!! додавали до С-кінця. Послідовність ДНК потім оптимізували для експресії з урахуванням кількості та положення повільних кодонів (які визначені вище).
Послідовність оптимізували для добору проти повільних кодонів. Оптимізацію застосовували особливо на початку послідовності для одержання гарної ініціації та початку трансляції. У випадку, коли повільні кодони включали (для забезпечення можливості використання у відповідності з переважним використанням певних кодонів у хазяїна експресії), їх направляли у бік кінця послідовності (де початок послідовності визначається як точка, де відбувається ініціація трансляції).
Після конструювання послідовності оптимізовану послідовність ДНК синтезували у вигляді двох частин із застосуванням унікального/нативного сайту РоїЇ для подальшого збирання у ген токсину повної довжини. Послідовність першого гена включала сайт Маеї на аміно-кінці та сайт
РІЇ на карбоксильному кінці. Ця частина гена мала довжину 2895 п. о., кодуючи І С ВоМТ/Е1 та аміно-частину НС. Послідовність другого гена включала сайт Ро на М-кінці та сайт Ніпан на карбоксильному кінці, мала довжину 882 п.о. та кодувала карбоксильну частину НС ВоМТ/Е1.
ПРИКЛАД 2
Конструювання вектора експресії послідовності нуклеїнової кислоти ВОМТ/Е1
Використовували вектор експресії на основі вектора рЕТ-26Б(к) (Момадеп), який включає сайти рестрикції для клонування Має! та Ніпап, розташовані на початку та на кінці ДНК, що 60 кодує ОКЕ ВоМТ/Е1. Вектор рЕТ-265(к) був дефектним за здатністю до мобілізації, але міг бути мобілізований, якщо знаходився разом з іншими здатними до мобілізації плазмідами. Вектор рЕТ-265 (4) модифікували, щоб видалити гени з високою мобільністю та щоб зробити його нездатним до мобілізації.
Вектор експресії розщеплювали Маеї та Ре та очищений кістяк вектора лігували з першим фрагментом ДНК ВоМТ/ЕТ, який розщеплювали такими самими рестрикційними ферментами з одержанням проміжного продукту. На другій стадії клонування ДНК ВоМТ/Еї з другого фрагмента, який був розщеплений Рзї! та НіпаїІЇ, лігували у проміжний продукт із першої стадії (який також був розщеплений такими самими рестрикційними ферментами). Це приводило до утворення кінцевого продукту ДНК ВоМТ/Е1 у векторі експресії.
ПРИКЛАД З
Уведення вектору експресії ВОМТ/Е1 у хазяїна
Цей приклад оснований на застосуванні клітин Е. соїї ВІК (ОЕЗ), хоча процедури та способи в однаковій мірі застосовні до будь якого іншого штаму Е. соїї, що здатний до експресії.
Компетентні клітини Е. соїї ВК (СЕЗ) зберігали при температурі нижче -70 С до потреби.
Трансформацію клітин виконували із застосуванням адаптації протоколу виробника. Клітини розморожували на льоду та готували субаліквоти по 10 мкл. Аліквоту трансформували з використанням теплового шоку при температурі 42 "С протягом 80 секунд з 1 мкл плазмідної
ДНК. Після відновлення на льоду протягом 5 хвилин 90 мкл бульйону БОС, що не містив компонентів тваринного походження, додавали до середовищ транфсормації, які потім переносили до інкубаторів зі струшуванням та інкубували протягом 1 години при 37 "С та 250 об./хв. Після інкубування 90 мкл кожного середовища трансформації переносили та розподіляли на плашках ІВ агару, що не містив компонентів тваринного походження, доповненого 50 мкг/мл канаміцину. Плашки інкубували при 37 "С протягом 16 годин.
ПРИКЛАД 4
Культивування хазяїна та експресія розчинного білка гВОМТ/Е1
Одну колонію з трансформованим ВоМТ/ЕЇї у ВГК(ОЕЗ) клітинах використовували для інокуляції 250 мл конічної колби, що містила 100 мл модифікованого високопоживного бульйону (Тепіїіс Вгоїй) (тТВ), доповненого 0,295 глюкозаміну та 30 мкг/мл канаміцину. Цей спосіб буде в однаковій мірі застосовний при використанні бусин Місгорапк або гліцеринового маточного
Зо розчину (10-100 мкл) для інокуляції колби.
Колбу інкубували протягом 16 годин при 37 "С при струшуванні з 250 об./хв. 10 мл цієї стартової культури використовували для інокуляції 2 л конічних колб, кожна з яких містила 1 л, доповнений 0,2 95 глюкозаміну та 30 мкг/мл канаміцину. Клітини вирощували при 37 "С протягом - годин при 225 об./хв. до досягнення значення 00600 0,5. У цей момент температуру культури знижували до 16 "С. Після 1 години клітини індукували до експресії ВОМТ/ЕТ шляхом додавання 1 мм ІРТО протягом 20 годин. Клітини збирали шляхом центрифугування протягом 20 хв. при 4 "С, зважували та потім зберігали при -20 "С.
ПРИКЛАД 5
Екстракція білка ВОМТ/Е1 з хазяїна та аналіз рівня експресії
Пасти з клітин, що експресують гВоМТ/Е1, розморожували при кімнатній температурі та ресуспендували шляхом піпетування у З мл ресуспендувального буфера Тті5-Масі на грам клітин, доповненого 10 мкл бензонази. Клітини піддавали лізису шляхом обробки ультразвуком з амплітудою 4 мкм - 10 х 30 с в увімкненому стані ї- 245 с у вимкненому стані. Лізат центрифугували при 4000 д протягом 1 години при 4 "С з одержанням розчинного гВоОМТ/Е1 у супернатанті.
Аналіз методом Бредфорда для визначення концентрації загального білка у одержаних лізатах
Зразок (50 мкл), або розведеного лізату з ГВОМТ/Е!, або стандарту ВЗА додавали у 1 мл пластикові кювети. Додавали 450 мкл реактиву кумасі для аналізу методом Бредфорда до кожної кювети та забезпечували можливість інкубування при кімнатній температурі протягом 10 хвилин до зчитування 00600. Значення, одержані для стандартів ВБА використовували для визначення кількості білка у зразках лізатів.
Приготування зразків лізатів для напівкількісного аналізу Вестерн-блотинг
Комерційний зразок білка ВоМТ/Е!ї, придбаного у МеїаБіоіодіс5, використовували для приготування стандартів для 505-РАСЕ. Зразки для 505-РАСЕ потім приготували зі зразків лізатів з культур клітин, що експресували, з відомою концентрацією загального білка.
Вестерн-блотинг
Гелі завантажували та розганяли при напрузі 200 В протягом 55 хвилин та переносили при 0,4 мА протягом 1 години на нітроцелюлозну мембрану у буфері для блотингу, що не містив бо метанолу. Блоти на нітроцелюлозі блокували протягом 1 години 0,595 ВЗА у РВ5З-0,195 Гувеп
20 та потім мітили антитілом до ВоМТ/Еї протягом 1 години. Блоти детектували з використанням вторинного антитіла, кон'юЮгованого з НКР, яке проявляли за допомогою субстрату Зирегзідпа! Оигаумеві. Проявлені блоти візуалізували з використанням інструменту для візуалізації Зупдепе Ітадіпо Іпзігитепі (фігура 3).
ПРИКЛАД 6
Початкове очищення та активація цільового білка ВОМТ/Е1Ї з одержанням дволанцюгової форми
Даний приклад оснований на одній комбінації стадій захоплення та колонкової хроматографії проміжного продукту, хоча комбінацію можна змінювати або проводити у зворотному порядку з використанням тих же самих властивостей у різному порядку. Освітлений супернатант доводили до високої концентрації солі та завантажували на гідрофобну колонку для захоплення (бутил-сефарозну). Зв'язаний ГВОМТ/Е1 елюювали з колонки з використанням градієнту Тгіє-буфер з низьким вмістом солі. Елюйований білок додатково очищали з використанням іонообмінної колонки, такої як О-сефарозна, при елююванні з градієнтом Ттгів- буфер з високим вмістом солі. Трипсин потім додавали до зразка елюйованого гВоОМТ/ЕТ у кінцевій концентрації 2,5 мкг/мл та інкубували при 37 "С протягом 40 хв. Це розрізало активаційну петлю ВоМТ/Еї та утворювало кінцеву дволанцюгову структуру ВОоОМТ/Е!Т, яку підтверджували 505-РАСЕ у відновних умовах (фігура 4).
ПРИКЛАД 7
Кінцеве очищення цільового білка ВОМТ/ЕТ, що не містив активаційну протеазу
Зразок активованого гВоОМТ/Е!1 негайно завантажували у буфері з високим вмістом солі на гідрофобну колонку (бутил-сефарозну). Колонку промивали буфером із високим вмістом солі для видалення слабко зв'язаного трипсину до того, як застосовували градієнт Тгіз-буфер з низьким вмістом солі для додаткового видалення трипсину з колонки та зв'язування білка
ГВОоМТ/Е1. Білок гГВОМТ/Е1 потім елюювали у кінці градієнту, на відстані від трипсину.
Аналіз для визначення рівнів трипсину
Аналіз ЕГІ5А на трипсин розробили для визначення рівнів, присутніх у фракціях з колонки та у кінцевому зразку ВОМТ/Е1. Іммобілізоване антитіло до трипсину наносили у вигляді покриття на мікротитрувальні планшети на 1 годину при 37 "С. Стандарти трипсину та тестові зразки
Зо додавали на планшет (100 мкл/лунка) та інкубували протягом 1 години при 37 "С до виявлення з використанням другого антитіла до трипсину. Кількість трипсину у кожному зразку/фракції з колонки потім одержували на основі стандартів та накладали на хроматограму очищення для підтвердження відділення трипсину від ВОМТ/Е1 (фігура 2В).
ПРИКЛАД 8
Склад, що містить активний дволанцюговий ВОоМТ/Е1, практично не містить трипсину
Готували наступні шість рідких композицій, що містили активний дволанцюговий ВоМТ/Е1 (таблиця 3).
Таблиця З 11111112 | 3 4 5 1 6 и | і М мі мг/мл мг/мл
І Полоксгамер.// | 7777/7771 1111-10 | бб4мумл | Об4мг/мл
І Сахароза | 4Ом/мл | - | 4бму/имл | - | 4бм/мл | -
Ман 17771711 | 4бмимл|! 7-77 | 4Омимлу//////- 77 | 40мг/мло мг/мл мг/мл гістидин/Соляна | гістидин/ | динатрію/Безводна | динатрію/ | гістидин/Соляна | гістидин/Соляна кислота Соляна лимонна кислота Безводна кислота кислота кислота лимонна кислота
ВоМт/Е1
Вода, очищена у достат-ній у у достатній у у достатній у достатній за допомогою кількості до 1 достатній кількості до 1 мл достатній кількості до 1 кількості до 1 ет ММ жею| ню пою ЖДЕ до 1 мл до 1 мл
Усі шість композицій зберігали при 25 "С протягом 12 тижнів. Стабільність протеазної функції дволанцюгового ВоМТ/ЕЇ оцінювали впродовж цього періоду із застосуванням ендопептидазного аналізу в безклітинній системі. Щомісяця значення швидкості розпаду для шести складів становили менше 5 95 за місяць протягом періоду 12 тижнів, це показує, що протеазна функція дволанцюгового ВОМТ/ЕТ у шести композиціях залишається стабільною при "7С протягом щонайменше 12 тижнів.
Ве СИНТАКСИН ЯТНЕТЕД
ЩЕ БАРИ ЛОТКА
«БМ» рекамбінаитні нейбБотенсини сів5сеін Боснії лив «М ЗУ «МО» в 595058 «Бе З «БУ» васевела веротя 3.3 «в і «Ех ЗО «233» Втучна васліднаність «ВИЗ» битимізовама песпіднвнієсть нуклеїзевиау кнсязти Вам «В» вЕдссниваВ СсВасСсиеЕ саваствсвас сова зсавесЯкає овкссваках ОВ заховав світе сса чезосістас зааксттксх сага кова азс сскоо ЗО зісвксссоо сце саесадтакс зсосссос асесесассс сс Е «БО серазався псцетсвс твасссдає содвясувсє тесаотєвов совадважая 40 осв ес това ес сассаааВКс фісааесов теаасвасня ето З дпусаєсетоє сода анех асетвавост засос тові насоа сазєвесека ЕС явсзассває оса есов КОС сКЕ вес тдяза севанете тав Б сидцасяхес тостнссови сота: зуби о заесвоассє Зктсдавакє во аастексеуз асвжстстст зсув асзак сосакассуї стае Тесс КСх 5 амаснио ас: сосоаакис теж еСОВе сао свусакеАє що дао водно соос сесозесека зідсосваас зщатесассє стос Во ствтасовіє ссзазоутих сассаесвня тасаскиїса сссвувавса двасесо ТО зІсвсзаєсв сссвкоЧкас свасатсвая бат сскои сот вує есеваєека ва ваза ксов сстстнсткв дестаасе вістаєвеса зескостоає соска оВаВ що аванс їх севааєтцєє звану зскієтавсе сустяєтвав ссомасааа БО засне задстааасх своє вазон спот сесса ває З яесавсазає Сеавсвясиж секснаваяв ссотакісте безесввокт свасстовсо іпоа весвааессс вобтсанате сеухсвоаєє тесатеувеє восасаната сетсвавнессу Зоо зетзасетах сооасвЗсє гаектвсвО: ст стаао Зссасасях сезсааесв каш завщетваєт зе цос зааорстзас седазессрс зозесакевс сссонекаеє КУ ооо совка засос сток зана акаїкоказо сустнаєва 00250 зезацазааа мас е сва сяє ен ає сет кнє часті овя За зассстствся ясвасовсва сатсвасасє ссвавцява ссозеасає са сасевех ї3З8о знсвасвнкї асдванасов сстоудасєвю сні асетеваєтс тойжстосх іа сеаовсст: стае зетовассв азссзессзая зеоБеоєкоя Сас ая їі зверни ств зедокаєсіс мренрерва сасаєваєа сеаасааниє засо еє Не чиє ве асасссвола това срозанавки асеккнассе зво 52 вісуасассу стетассооа зсвокєвиза вістасаєсх зе Ееє кава снеє їв весзнета асазаєсоЗх ссзодєсосє стікер сет ея ясвовесео зо яесовсттса ссассоваЗс саассазвава сте свеви зсвзаазссвс Вася 1805 дес єЄ сетасаєсви КСтоцесска аесассовсв зсдеаестсв двазовквас за
Стсввависи ссстоозасе ство ас еетоє коза їкеВ ассвоуаасее ке стдзусссва ссвтсстове сетсассВкс ааажевевеє КО КеККЄ феека са за засазааєта маска: севклаєцєє спразоває всуасованя зване ОО пеевастстх кратецентє таВстОцевО зесвааанея ВсассєВНцЄЄ свасвазеде Ой амери свая сасасснс сстссвоває саовесаасу ствесаваис сатсвусовя ТБ їсбааатасв зсїжттасяс ссбуОааовя зазазевявс сожесаасва зівсвсаке ЕК звасвозесв назасцанех завссноваа Зееестаєсв ставка свБесцясецЕ ОКО кісстовоса зас кстає сестєассто аіпизастса єсазсоавих ізаваксває З вваствсате важко сов азасоссвна аествсстоє совастасає сакосавювє ж
Стає тОоковя: теаосуена стався груркаєсюа саке аче Я застає сосна х зісмемас ассувсваєя азассствах свв о засжавттсх тЕзавсосах Са цкіся совет ав атакосорса саланаєдах 258 завтасессв асасесесво бак тнис забаксвоєх стае сВасом се Вевах ке тЕксевасва втаванассї ЗЕКсОООа сзбзвснася воєсоссвов виска жи тсесзазаса сів есаї гтасоаснає зазтасвяви зстЕтавсях кате єОО РВЕ актсесакас сезаксвій саатазааех зсазикасов акзасчаака сисевкеахае ЗБ застає еораєваєва себішнтоо заоокатсоє стозясеаєва созоветате. «ВВ киев есос за зотасааиє сема ст ваєва сваха свеВ 2 засопаатск савактвсве атаззасве зі а сєсаткасааа сзаєсзєвта БІБ зоспасткна заст вІВЕ сазтодсаях січасацаєє заявах сказ ЗВ чосзататтс врасететов тавсатсїто стсзааїє сТЗаЕссяє гтасаЄєтьще зо хахастовси тОСаКсВеКе саажажсееє давав сЗщсоаанє аа кссяу ЕКО десстотаєх свавспацеє савтаєтвиж згаттозааа Вісн гвастаєстЕ Яащо етяЕжтуЗкЗ заява кессстоаих зеаїсоаноє свавсважеЕ свя ЗО сасазазасз осасаетано сао вісти севтвскаєї засБАЯсВЕ що стстастско шіЗсВниВОЄ ЗиЗОоЗсКксва суцусеанжа ЗСЕКомекак сиЗОЯкЯх З сини та заонасвіса дан асаесвїс ват ксогой сбаосванає секс Зав седетітаси ссдатаєваоє свсоаснанє аааовяазав ссвтавянак ВероБвоє Зо вдихає ксзаєкняав: ашсватнасо зассстасву сдеаатаакто сасехсаає зЗща хесзааааса зсзаєюова сатана «есе саовеє бсвавоєкох сасавбодеи зЕБО зецїссвеєХ сосаєасас осасавосоо Заст акусу оС СО ЗИ зассєтаєкс свозаовася сдфоотуєсав дзанавтяа ЕМ: «Вій Х им» 4852 «а Біяе «ай сток нав вості лов
«щЮе
Мас вто Бу Мі АБИ ет Ка йо Ту Аби Ах ба чі дяк дор АКО ї 5 Кк, 5
Тнг жія іеб тує Жів ув вро БІУ 01» Суб бій вів ява ту руб баг 5 30
Врв дяи ЖІ век їж аа бі їтв жів Зв вро ді Аг ай чаї їв я 45
Фіж Тве Так Бее бій ар рве нія БРа беа Тнг бек фев вух аа Ту а БІ що и ее 5вР ТУК тує дав РО йха Тук сем Біб явг аж бів бів вух
ТО Ко що «Бр аАгО ВВЕ мов вух КТв жЩі їй вуз ів вве аа АРО Ї1є аа ав я: що 5
ЕВ ізи вет ТУ БІУ Хі бен бен Щі: Фу ев его АТ ван бе що це з
Тегі: іу аа Аяв аа Твг Бех ав аяа бій вве ніх хів бі аа вів бек а УВІ Їй Хі ух РВЕ Зак йза фу Жак бів аха тів Бех 138 135 зай ів в; Ак УВІ Щі Хі мес 1 АВ СІ РО Аа Би РН ЦК ТВ
ЩА ще 455 за
Аа Заг Заг аа ЗІ Яег Бу АгЕ аж аяи ТУ МЕС Кг Бере ава нів зх М ЕЕ «Ту вне бін чек їїв дів (їв УВІ не вве его ВУД ЮТЬ Тук Баг ВВЕ за НЕ хї ще зга ве ази йхр АБИ Хе меж аа біб вве Сів ій яв во АЇВ Ме зв зао 5
Те сем мех нія ЄНьіви їв ія щак ій із бу вен о тУук діуУ ад
Баг; а 230 вух шІУ ЖТЄ ТВе їМк Бу тує Тве їТе тВК цій гуз Їй ай вро Бе
Ку 30 а ЗО
Ї1Е ТВР йди Їіє ага СУ ТВе йви Хі бів й: Вбе без Те вБе пу 5 255 іх ТВК ав іш ан жі Хе Же бек АВа ші щеє аби аяв Хв тУе
Ва т КУ
Те ака ев вви ат вер тТук рух руб ЖІ ата Заг ЕМЄ Би БЕК Кук ух зве ях
УВІ бій УБі Заг Ази РГО Би Гб. аБЖ Ро Ту вуж аеро ці вне «18
Ка я З ків бух ТУ ШІу ев аа пут Аяр Дій хек ші» ї12 тую хек Уді кВ зах ца я Бе
Хв ажв Ух Бе ах а5в їі Ме Кух бек Бан тує же вве Твге бів
Зо Б йне ав ме; вій їйК вуз Біне ів У ух Сує ага а тТвк тк З1е
З 5 50 «У шів тук бує тут РЕ Бук Я Бас АшИ іа ев Ави АБИ Зак ЗВ я яко зв
Тек аа іє жо бів бі Ту» вав Х1в да аа ей бує МИ яв КВ
ЗТ 25 ЗВ «га бїУу ія дви 18 ап вен ев РО Яра їв хе тк БРО ЖТе тВе 5 За 95 БІ ді ага щік ев Уді бух ех їі їі ага вче Су кує ха ЗіБ Уа?
Ох «а Я
Бег УЖІ уз СТУ КІВ АГО бух Бек Жіє Су Хе 46 їж аза аа вію а 5 БО і зей рне не Узі яї13 ав сів йти ав тТук азя ар Ахе аа в ко аз ки ТВтг Рез ух СТБ Хі ах Ах ТНК УДі тТВе баб АБ аа яп Тук
ЯМ «55 Я «із хи бер цем аз сів Уві Сів ве) ази Бве ази ее є це Яек АЇВ зх 420 25 Я
Рго ТУ ев бек Ак ШІ бує бе й зей ТР Хі ій ази яр АТа як Я «к тТуК ЖКія Кг вує тує аяр хек АВя БіЖ тк ше вв Її Ти щі ніх
З КО що вае Узі ан ОТ зем Ажи УВІ Бе ев Тек сво яв віз дій се уві
І ав 525 рге оі іУ Бін Аа ах умі да ме ЖК Бек ак хів ази ВЕ ях 53 За ща ев ів ів Вів Рго ух Кв Тук тв вве вне Зак ше бів ББе ЗЕ ча 55 355 ЗБ дей дан Уві вка цу бро чаї бій ій ів ям ббе Уа ее Тер ХВ з 57 575 сія бій Уві ке ух! др Ве так те ОЇ: АВ дян бів вуз ЗЕ Те 5НО 585 5 узі ка вуз Хі аз й її Зак Кіа УВІ жі вра тТук ТТБ ТУ Це т БО ах
Аїа за: Аа хів бі; ан ств ав Фів БУ5 Б1ІУ аяв Ре ух ар АЇВ
З БУ їм ші ев ьке Оу Аз Тк Тіє ев Без бія РНе бів вк 5ію ко ще ща ща щав їн ї16 Вго ТВг жів ев чаї ее Ве її Був бас вве сво біу Заг ай Бо 55 аг Аве ах сує аЖа бук ча! Щ18 ву азів Ге азни аа А1в бу вух
ВО Ва 50 «ів Ага йвВ вів сує ТК Був біз Уві туг бек вве ХТе Жаї ек ай
ІЗ в вих
Жев'неє Те їуз Хе аза їВк бів бе язп іує ака Би СТЬ бій ве 9 ва о
Жук вів їв ев бій йхв 1 УЗІ аби ата хі вже ТК ха ще Ні
ТО Как т то аг су Тут Ав За" тує ТВ сви Ти БТ) Був аха БІВ би Ве дея то 85 вх Туг аа хі2 вже бів БІБ КТ Авя Фі іже вв бій ух Ві Щек то тах ще їв аів мес ахв аа сів ав Ага бле ва їйг бів Зеє" дає ів Бек т з т
Чу се меж їух Бен Хв ав 1 Ма бує Х1в Ява вия ви ага 815
Уа тт тво тує ав бів аза чяї БУЄ ТНК Тук рев ре; ши ТУуг Сів те бів нів тВ5 т т яв сі заг хів ієе ТУ аз авг обів 5ів бів бер аз Заг меж ук Тв 85 що щі ажв їйг з ай ай бЗег тів вга ВН Ух Бер Бек бек тк тек АВ що вах я дже іув тів Бе Те Шек тує РВЕ Аа вує йНе ВВЕ Бу ака Хв Су я вка ВЗ ек Зве Заг щі іже дян Ме ага тує Бук вяп аже вує тТук МАЇ а5р
БЕ БУ їве ваг іУ Тук ав ев Аха їїе аа їТів ай БУ вв а Ту Був 85 Во 875 Вко
Жує Бго тТве ває их ден ій бе ші Хів тк дхв ар гук Бе Заг
ЕС ще 55 «ів мЕі аж Хі его бів ша ахр тур ті Х16 тує дер АЗИ ЦУЄ ТУР
КСВ х о ух акт рве Заг бів чек ВВЄ ТК Уві ак ів го аа тує вер вл
МУ ЖІ УЗ АЗИ УВІ вБа аа їн тує тт Же З1в ай сук меж Ага ча 35 ще
Варава Ав Бек біу ТВ Був Ма! бер веи аАвв нів аяв вію ЖІ Тв щу я я в
ТРе ТВ се с яр вв із сі тів ай бів Куб ав віз ре ав зах аа во тТже Біу аа аз ач йіжЖ Що бог дяв Тук Те ан вух ТКЕв ІТ ВН
ЗО ях ща
УЗ їВе їі Ще аза ай ака ве: бік аа Зег їж ве тТук С два ах зо їво:
Ту жа без їі АВ бій ув чає сіє Бер ян Без біт Ажя Те
МО їх що із УЗ! шег аз аа її іа; вне бух (16 Уві! а бух Зак о тжЖР 025 що о
Теве ака ТУ ЖКіЄ Ту їз аж отук рве аа хів Бе яв ув 15
МЕ з що
Ме ав Бі БР ЄВИ Же ші» ВК Бо. Ту» бет ахай бів вго дав
ЗК 5
Твк аа ЖІ 5 муз Аа ВН тер бію аж Тут би Беш ТУР ве я ех їп8а іже 1 Ту Тур вч бе аєв Маї феу бух бро вв вже вве 1 1385 МО ї095 ак ага Ага вує дав Зег НГ ія аг їв ав ах їв ага яке
М що ЕЖУК
Тве Кв ев вва Ав аа Ага м тут бе «15 КТЕ вже УКЛ БУЄ що ЕН Мах жів бів гу Уві АБИ АЗАа ВУ бек їВг аа ав АХА Бе УЯЇ ага що ЩІ св:
У аб ав ія Уді Туг бів ха вве Уаї віз бек ув Те
Я ЕТ ща їви ба вчи іш тУук вів з» ВР оОАіВ Те Те а су НІ ЖЕ що ЗУ КО твк жів вує хів Зак Бер Яве бію аяй аб ве аби їв Жаї УВі щих ВО 385
УКі мес Ба бег Уаі ТУ Аби АтА Єух ТВе Має аж бне ув жи 19 ї395 3 вка ви Зі Ан аша Хі Оу Бе ке і Ве вує. Ай Аа ЖНЕ 120 КК щі
УВІ Уаї їж баг те їгтротре Тук їн нія веб ака явні ЖВК
Ка Ки що аж Бе вжи Сі Си вве ТК аа бе хів хек ів бій Ні 1 ке зга тт вів їв вуз ї2 «і» З «іже 35 «ій» ДНК «ВЗ стоки ов ої воя хе відссаваяа сеааснаЄк снакізувас затескаєтв зізатвоває аажекатах щі пісзхассни оса скокся ацаассККаС зазесаесеа асимтаєаз заавакекоЗ ще зквашхай звицааатах заєсовеВся зссссссиаа аж саТеО зсстакевВ ї80 етанизантй зецисаоєава ска Ковс се таКє тасавнауєва кове що часа сама сасззазаєа Фета икона тааакавтая СС сяЗЦе щк
ВИС ЕКТаЄ фацвауаней Яксвннацю втссакак смшовасоа таажаскека зве писвассває зссвсатт совтасаєна садова есавасестє засаавє з сзавасатаєс таккасєтаз такса стаиз земзасяе зосставеЕє ЗЕттоааВс Зо засзакоежа аЄЗЕЕЕСЕСЕ задиваеаях табниіоссви зсватсвсва ТКС Ссх з аезостатаа тазове аесбраасях тету кзояе сеЗатозеВа савкаєвазе що азни ам ісескас зеткаесакЕа зерасуаак таз зе тОда що статасикн; стазановає састЯснаяє сесаствеза єасианняса зиатЕеєєта Та яіваєзаати сааозоукн важкі кана скат ва со ой заст ТК васаусаіта стаасостса аксєвасуа: актатаста ас еаас сааскаєвав ща зааатавсвє ставасттао сазаасасва осазстввакс саскасттаа тесковкнах ву защисесте явисзаацтя паста аваЗавта Зеобаакека ссання х БІ зкзаасназе скан как гЕгканаана Етасасацєк тає ЯО КОС КВОСя що зсмааєтес зацдскавасхо сабосваасс стае адтикаваса єтесанасте зОщо ткавакетах сазасватес сеасетасважх зсзсєвовно остаєватах захавекев Що ваоцтаааеЕ сезововася баасоваває ктзантсста баастветас восааєкаєя І щвозоЗас зо язязаи зассакевох скствІиаая каст тотазааВоє іа ауваодазає свита є созаакалає засо кавеє КЕ ваЕ зсув МВ васаоєстаєз са їцисав сатана свєт сстазауаза кіуасовЕає вокаасека ЗВО затакаат зкзазаасаа сусаоавсва чесаетктая вЕТекаитва вола кевоса. о кота сє садасдваза ассвавскта ястатссвах втасаскта сУсиюсжака. во тахваисса ато їоатаїзова сао ставі онасї хзациакех ІЖО жест есво асосзсвохи асасссова субзазаака акессватсь сасстектеев ЕВ зесоакасво састаєсвой асавсєства зкасатакак тку зааЗттсаЕЕ МБО атака асизасетах осяє ско на десаєнея яежацтаскя га стави та єтастюанос сазссваназ загаєтоєто вхазавтевє звання їОО аевостогує світає стос та забахадева зтозвевся званих ІВбИ
ЯкбазаВасо свсстрансх яЕсаооуааса ЗВБаеКаХ їзоаатева асксваВех Бе
ЇтВВттсска сЗатеЕеВО яса куася яхатсККТе зоба атаках що засазазтта ттязарсвах закзаснса сбозааоаяа озракозава зсовазжва о ква таце: бака нка пазу аехаазатта аби свзасававов МО зезазак сте сазас своя ах саацсаваєв савтєвизас Звевасвова КиК текааокаея аадткатає текванезая зазааконяає каевааева зЗкЗВаКаКЕ КІ ааканасно зазіааесх файісаваао зе аївО савани євя гесависяе «БО зник зав стає аксстаства зудазактяа сазасовях звався КЕ) завтізвазо застава ков азс асотакекає кома жкакає сасакааснх КЕ конст ково я евосавава с«кзЗиВЕкста сота Оа Состав АЕ «ЩО ватлаотаес сетІтазОсу СЕС СвИ: абсзозенита азасКеевах ТесКаКЕ 2520 авізанескх сти евак ваза ЕнОк СОН ЕКЕтаа за васа кававасцах ЗНО витає зхастесаоз згасваєтсса забасввота ссваєоцаца сЗсвсакваВ ВІ такссзаста зєважантсз зетбоднака хатазеєцава зассзютаа заставка ЗУЦ зекснааті Весасаксах згабозкане заататєвиза зесеаотях сао вов ЗУ жена ствастатуа авто севавесва ахзасавтв састатиаа ЕС засто аа ваза «есе зас аесв Вжнастикня кома Е ВИ тазасаєвос заважає зоззассвах садажасова вестися сцоакося ЯН закцосажтє стаєте зааєзаосво секс статзаєтсях совеаоаетя БІО
За сеста застєтакне сзатоданах сеаЗтаааєс виеватеснає тсевавккся ОК знана є нота сват иста «ета стано саа есатасевоа Зі2О тис тваса ставатаКсї жватасвту озтазааває сво оаває зоваакУкня ЗО зе осаабоваєс твахасаває «Кт анов асо о зак ЗЕ кІстаснсз зашеатаєта кстаттаває оБуєтаваає санасваееє ваткою за здазаациет ссастттаху сатани зеаацинаса ЄтаЕСЕх воставкая За6о ке охагсяаанає Євазакнсах яохествака авазснокає сиасоасаах ОК питав а завіса ев сте тасахх звести ссвусазаає сек зе сеаксмато ставав сассзеааях аазозааааа савсваанає аа ЗУ цосваїаові ттавесаВоаЄ ответ тето вассєветаз базаєваєто свеватовах ЗО кктваває «савсувхах сватактозо ксстаццеє ссововаа каста ЗВ стека сїк зоусаекасас азсатаоваа ааесахасав ясиазсавеа ОСС ЗВ засЕвЕВКеЕ скавадвяся кое за мнх ЯТ5а
Claims (14)
1. Спосіб одержання розчинного дволанцюгового білка ВОМТ/Е1, причому зазначений спосіб включає забезпечення розчинного одноланцюгового білка ВОМТ/ЕТ, що містить послідовність суміжних амінокислот, де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 9595 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 2, приведення зазначеного білка ВОМТ/Е1 у контакт із трипсином у розчині та відділення розчинного білка ВОМТ/Е!Ї від трипсину шляхом приведення розчину, що містить розчинний білок ВОМТ/Е1 та трипсин, у контакт із гідрофобною поверхнею, де розчинний білок ВоМТ/Е1 зв'язується з гідрофобною поверхнею.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зазначена послідовність суміжних амінокислот містить одну або декілька з наступних амінокислот і де нумерація амінокислотних положень починається з М-кінцевого амінокислотного залишку та закінчується С-кінцевим амінокислотним залишком у білку ВОМТ/Е1: гліцин у положенні 17 7; серин у положенні 198; аланін у положенні 340; лейцин у положенні 773; лейцин у положенні 963; глутамін у положенні 964; аланін у положенні 967; аспарагін у положенні 1195.
3. Спосіб за п. 1 або п. 2, де розчинний одноланцюговий білок ВОМТ/Е1Т забезпечують шляхом експресії у системі експресії Е. соїї послідовності нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність Зо суміжних нуклеотидів, де зазначена послідовність суміжних нуклеотидів характеризується щонайменше 90 905 ідентичністю послідовності з послідовністю нуклеїнової кислоти ЗЕОІО МО: 1, та де зазначена послідовність суміжних нуклеотидів кодує одноланцюговий білок ВОМТ/Е1.
4. Спосіб за п. 3, де нуклеїнова кислота містить максимум 160 повільних кодонів, вибраних з ТТ, ТАТ, ТОТ, САТ, САА, ССА, ССО, ТСА, ТСО, СО, ТТА та СТА.
5. Спосіб за п. З або п. 4, де зазначений одноланцюговий білок ВОМТ/Е1 містить послідовність суміжних амінокислот та де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 2.
б. Спосіб за будь-яким з пп. 3-5, де зазначена послідовність суміжних нуклеотидів характеризується щонайменше 785 синонімічними кодонами порівняно з послідовністю нуклеїнової кислоти ЗЕО ІЮ МО: З ВОМТ/Е1 дикого типу.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, де гідрофобна поверхня являє собою інертну матрицю, до якої прикріплений ліганд, що включає арильні або алкільні групи.
8. Спосіб за п. 7, де гідрофобна поверхня вибрана із групи, що включає бутильні, фенільні або октильні ліганди.
9. Активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1, де перший ланцюг містить послідовність суміжних амінокислот, та де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 9595 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю у положеннях 1-419 5ЕО ІЮО МО: 2; де другий ланцюг містить послідовність суміжних амінокислот, та де зазначена послідовність суміжних амінокислот характеризується щонайменше 9595 ідентичністю послідовності з амінокислотною послідовністю у положеннях 423-1252 5ЕО ІО МО: 2; де перший та другий ланцюги з'єднані разом дисульфідним зв'язком між цистеїном 412 у першому ланцюзі та цистеїном 426 у другому ланцюзі; який відрізняється тим, що зазначена послідовність суміжних амінокислот містить одну або декілька з наступних амінокислот і де нумерація амінокислотних положень починається з М- кінцевого амінокислотного залишку та закінчується С-кінцевим амінокислотним залишком у білку ВОМТ/Е 1: гліцин у положенні 177; серин у положенні 198; аланін у положенні 340; лейцин у положенні 773; лейцин у положенні 963; глутамін у положенні 964; аланін у положенні 967; аспарагін у положенні 1195; та де зазначена послідовність суміжних амінокислот не містить залишки 420, 421 та 422 5БО І Зо МО: 2.
10. Активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1, який можна одержати за допомогою способу за будь-яким з пп. 1-8.
11. Композиція, яка містить активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е!ї за п. 9 або п. 10, де зазначена композиція містить менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е! або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е!1, або менш ніж 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1.
12. Рідка фармацевтична композиція, яка містить: активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1 за п. 9 або п. 10; небілковий стабілізуючий засіб, що являє собою поверхнево-активну речовину; та воду; де зазначена рідка фармацевтична композиція не містить білкового стабілізуючого засобу; та де зазначена рідка фармацевтична композиція містить менш ніж 10 пг трипсину на 100 нг білка ВоМТт/Е1 або менш ніж 7 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1, або менш ніж 5 пг трипсину на 100 нг білка ВОМТ/Е1.
13. Рідка фармацевтична композиція за п. 12, де зазначена рідка фармацевтична композиція додатково містить: хлорид натрію, буфер для підтримання рН від 5,5 до 7,5 та дисахарид; де вода являє собою стерильну воду. БО
14. Активний дволанцюговий білок ВОМТ/Е1 за п. 9 або п. 10 або композиція за п. 11, або рідка фармацевтична композиція за п. 12 або п. 13 для застосування у терапії.
вка е ХИЛУКЕНИХ УМХКУКУККК вк ! рило 0 хво Рівень солі ж ! а "4 за ме за БЕ: й ! ! її. б ге
Е . я ко вени Ло во г сестро нн ВН ЖЕ М АК ен ее ее о ен Фк? мае хх во Ех КАН С нео а Беж «рракнія, ще За ізо Нео зва ва: За Ба Зо и
Фіг. ЛА Зх У Н ДИМУ МКУ кН 156 ЇЧаень гамі ЗЕ ; гвоМмтуї й БЕ Тузасви і й в КЕ й ей оо ен чи вн -знинннн по ще ло ЗД вже ща м Фіг 18 мак В й еле с олвмун КК Ріввнь сиді Тритвовв ЗУЄ ! а з і ! В Е ;: Б КК нь зок ни: й фу З : НУ ЕН що За КІ ХЕ іг. гА Фіг 2 пак. що Вівемь шоці пек мок М Турман В в і як : з | том БЖ Ж: я 7 Ка ! в: же ща ! й ! ва ж Ж | х зі | ! 3 Ж гне ЗК вх жан Ва В ОНИ АНА НЕЛЕНКАК НИКА КН НК М Я МЕ МИ ЕН Ва кх хк а МК пе УЖ Ба ще вх хи
Фіг. 28
МУя ОВК М КК ЖЖ ще Мо Вівень сові ГО ко Ї твановн - і во гвоМТуУєЗ м ще й й А я сені І ІТТ ІІ: що Но ХЕ З КОЖ КО
Фіг. 20 С ме КУ ай ще щі во ен ЕКО еК У я ще Ж х. де дує жу їх бу у ж К же ПО яв хо» Й З « КВ оту х У со м ВАЛИ КИ х соя У. щх «Е Фо ши ОМТУЄ шати БІО ке М а я - НН: я аж ЕКО ЕН шо жо У КВ оо КВК Я ХВ ЗЕККЕ ЗОБХХ ЗЕ ПО В що зо п . . МО о о о ПЕ Е ТЕ п го ї ть о. с : . с о З що. кН ша: ян ноїс. з г п пп
220 НТ Же о с о о -ш---щ- о о. с . чо г о.
ее . г с
Зо . п ч п о о в і с зо с
Фіг. 4 й 00 Комп'ютернаверсткаО. Гергіль 00000000 Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB201219602A GB201219602D0 (en) | 2012-10-31 | 2012-10-31 | Recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
| PCT/GB2013/052845 WO2014068317A1 (en) | 2012-10-31 | 2013-10-31 | Recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA118837C2 true UA118837C2 (uk) | 2019-03-25 |
Family
ID=47358958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201502159A UA118837C2 (uk) | 2012-10-31 | 2013-10-31 | Рекомбінантний нейротоксин clostridium botulinum |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10030238B2 (uk) |
| EP (3) | EP2914282B1 (uk) |
| JP (2) | JP2019068823A (uk) |
| KR (2) | KR102264478B1 (uk) |
| CN (2) | CN110499321A (uk) |
| AR (2) | AR093309A1 (uk) |
| AU (3) | AU2013340610B2 (uk) |
| BR (1) | BR112015005384A2 (uk) |
| CA (1) | CA2885519A1 (uk) |
| DK (2) | DK3326644T3 (uk) |
| EA (1) | EA201590794A8 (uk) |
| ES (2) | ES2662402T3 (uk) |
| GB (1) | GB201219602D0 (uk) |
| HK (1) | HK1208359A1 (uk) |
| HU (2) | HUE036764T2 (uk) |
| IL (1) | IL237623B (uk) |
| IN (1) | IN2015MN00436A (uk) |
| MX (2) | MX367080B (uk) |
| NO (1) | NO2914282T3 (uk) |
| NZ (1) | NZ705575A (uk) |
| PL (2) | PL2914282T3 (uk) |
| PT (2) | PT2914282T (uk) |
| SG (2) | SG10201701140WA (uk) |
| TW (3) | TWI626307B (uk) |
| UA (1) | UA118837C2 (uk) |
| WO (1) | WO2014068317A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA201501449B (uk) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201219602D0 (en) * | 2012-10-31 | 2012-12-12 | Syntaxin Ltd | Recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
| CN107548402B (zh) * | 2015-03-26 | 2022-08-19 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 工程改造的肉毒杆菌神经毒素 |
| WO2017063743A1 (en) | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Improvements to ultrasound-based therapy of photoaged tissue |
| US11969461B2 (en) | 2016-03-02 | 2024-04-30 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Composition comprising botulinum toxin |
| EP3263710A1 (en) * | 2016-07-01 | 2018-01-03 | Ipsen Biopharm Limited | Production of activated clostridial neurotoxins |
| EP3504226A1 (en) | 2016-08-24 | 2019-07-03 | President and Fellows of Harvard College | Engineered botulinum neurotoxin |
| JP7217700B2 (ja) | 2016-09-13 | 2023-02-03 | アラーガン、インコーポレイテッド | 安定化非タンパク質クロストリジウム毒素組成物 |
| US11952601B2 (en) | 2017-06-20 | 2024-04-09 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Recombinant botulinum toxin with increased duration of effect |
| ES2930237T3 (es) | 2017-07-06 | 2022-12-09 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Neurotoxinas botulínicas recombinantes nuevas con mayor duración de efectos |
| CA3083083A1 (en) * | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Ipsen Biopharm Limited | Non-neuronal snare-cleaving botulinum neurotoxins |
| WO2019158745A1 (de) * | 2018-02-16 | 2019-08-22 | Bontana Therapies Gmbh | Nukleinsäure-basiertes botulinum neurotoxin zur therapeutischen anwendung |
| GB201815844D0 (en) | 2018-09-28 | 2018-11-14 | Ipsen Biopharm Ltd | Therapeutic & comestic uses of botulinum neurotoxin serotype e |
| GB202011055D0 (en) | 2020-07-17 | 2020-09-02 | Ipsen Bioinnovation Ltd | Treatment of post-operative pain |
| GB202015618D0 (en) | 2020-10-01 | 2020-11-18 | Ipsen Biopharm Ltd | Method for producing beta-trypsin |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6967088B1 (en) * | 1995-03-16 | 2005-11-22 | Allergan, Inc. | Soluble recombinant botulinum toxin proteins |
| NZ308772A (en) * | 1995-05-17 | 1999-04-29 | Du Pont | Recombinant baculovirus insecticides |
| CA2336587A1 (en) | 1998-07-10 | 2000-01-20 | U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases | Botulinum neurotoxin vaccine |
| ES2277854T5 (es) | 1999-08-25 | 2011-02-04 | Allergan, Inc. | Neurotoxinas recombinantes activables. |
| US7374896B2 (en) | 2001-08-28 | 2008-05-20 | Allergan, Inc. | GFP-SNAP25 fluorescence release assay for botulinum neurotoxin protease activity |
| US7514088B2 (en) * | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
| US7825233B2 (en) * | 2004-06-30 | 2010-11-02 | Allergan, Inc. | Optimizing expression of active Botulinum Toxin type E |
| US20110111483A1 (en) | 2004-06-30 | 2011-05-12 | Allergan, Inc. | Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E |
| GB2416122A (en) * | 2004-07-12 | 2006-01-18 | Ipsen Ltd | Botulinum neurotoxin composition |
| DE102004043009A1 (de) * | 2004-09-06 | 2006-03-23 | Toxogen Gmbh | Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen |
| DE102005002978B4 (de) * | 2005-01-21 | 2013-04-25 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Rekombinante Expression von Proteinen in einer disulfidverbrückten, zweikettigen Form |
| BRPI0508299A (pt) * | 2005-03-03 | 2007-07-31 | Allergan Inc | sistema livre de produto animal e processo para purificação de uma toxina botulina |
| ES2369558T3 (es) * | 2005-09-19 | 2011-12-01 | Allergan, Inc. | Toxinas clostridiales y toxinas clostridiales activables. |
| US20070218084A1 (en) * | 2005-12-30 | 2007-09-20 | Fondazione Pierfranco E Luisa Mariani- Onlus | Method for the Mapping of the Epileptogenic Focus in the Pre-Surgical Evaluation of Patients with Intractable Epilepsy |
| EP2038299A2 (en) | 2006-07-11 | 2009-03-25 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells |
| US8486422B2 (en) | 2007-07-26 | 2013-07-16 | Allergan, Inc. | Methods of activating clostridial toxins |
| WO2010090677A1 (en) | 2008-12-10 | 2010-08-12 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin pharmaceutical compositions |
| GB0903006D0 (en) * | 2009-02-23 | 2009-04-08 | Syntaxin Ltd | Modified non-cytotoxic proteases |
| EP2419128B1 (en) * | 2009-04-14 | 2018-06-06 | Medical College of Wisconsin, Inc. | Engineered botulinum neurotoxin |
| CA2784666A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-11-17 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins comprising an integrated protease cleavage site-binding domain |
| WO2012112434A1 (en) | 2011-02-14 | 2012-08-23 | Allergan, Inc. | Inhibiting aberrant blood vessel formation using retargeted endopeptidases |
| GB201219602D0 (en) * | 2012-10-31 | 2012-12-12 | Syntaxin Ltd | Recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
| GB201407525D0 (en) * | 2014-04-29 | 2014-06-11 | Syntaxin Ltd | Manufacture of recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
| EP3504226A1 (en) * | 2016-08-24 | 2019-07-03 | President and Fellows of Harvard College | Engineered botulinum neurotoxin |
-
2012
- 2012-10-31 GB GB201219602A patent/GB201219602D0/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-10-31 MX MX2015005156A patent/MX367080B/es active IP Right Grant
- 2013-10-31 SG SG10201701140WA patent/SG10201701140WA/en unknown
- 2013-10-31 HU HUE13811605A patent/HUE036764T2/hu unknown
- 2013-10-31 PT PT138116058T patent/PT2914282T/pt unknown
- 2013-10-31 ES ES13811605.8T patent/ES2662402T3/es active Active
- 2013-10-31 PL PL13811605T patent/PL2914282T3/pl unknown
- 2013-10-31 DK DK17201198.3T patent/DK3326644T3/da active
- 2013-10-31 ES ES17201198T patent/ES2788199T3/es active Active
- 2013-10-31 NO NO13811605A patent/NO2914282T3/no unknown
- 2013-10-31 NZ NZ705575A patent/NZ705575A/en not_active IP Right Cessation
- 2013-10-31 US US14/427,234 patent/US10030238B2/en active Active
- 2013-10-31 PT PT172011983T patent/PT3326644T/pt unknown
- 2013-10-31 CA CA2885519A patent/CA2885519A1/en not_active Abandoned
- 2013-10-31 UA UAA201502159A patent/UA118837C2/uk unknown
- 2013-10-31 KR KR1020207026658A patent/KR102264478B1/ko active IP Right Grant
- 2013-10-31 SG SG11201502372SA patent/SG11201502372SA/en unknown
- 2013-10-31 AR ARP130103981A patent/AR093309A1/es active IP Right Grant
- 2013-10-31 IN IN436MUN2015 patent/IN2015MN00436A/en unknown
- 2013-10-31 TW TW102139558A patent/TWI626307B/zh not_active IP Right Cessation
- 2013-10-31 DK DK13811605.8T patent/DK2914282T3/en active
- 2013-10-31 EP EP13811605.8A patent/EP2914282B1/en active Active
- 2013-10-31 EP EP20153122.5A patent/EP3673914B1/en active Active
- 2013-10-31 WO PCT/GB2013/052845 patent/WO2014068317A1/en active Application Filing
- 2013-10-31 HU HUE17201198A patent/HUE048802T2/hu unknown
- 2013-10-31 PL PL17201198T patent/PL3326644T3/pl unknown
- 2013-10-31 CN CN201910795176.3A patent/CN110499321A/zh active Pending
- 2013-10-31 EA EA201590794A patent/EA201590794A8/ru unknown
- 2013-10-31 BR BR112015005384A patent/BR112015005384A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-10-31 KR KR1020157010099A patent/KR102188539B1/ko active IP Right Grant
- 2013-10-31 EP EP17201198.3A patent/EP3326644B1/en active Active
- 2013-10-31 TW TW107110108A patent/TWI673361B/zh not_active IP Right Cessation
- 2013-10-31 AU AU2013340610A patent/AU2013340610B2/en not_active Ceased
- 2013-10-31 CN CN201380047542.8A patent/CN104755098A/zh active Pending
- 2013-10-31 TW TW108125708A patent/TW202012622A/zh unknown
-
2015
- 2015-03-03 ZA ZA2015/01449A patent/ZA201501449B/en unknown
- 2015-03-08 IL IL237623A patent/IL237623B/en active IP Right Grant
- 2015-04-23 MX MX2019009222A patent/MX2019009222A/es unknown
- 2015-09-16 HK HK15109067.2A patent/HK1208359A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2018
- 2018-05-21 AU AU2018203556A patent/AU2018203556B2/en not_active Ceased
- 2018-12-10 JP JP2018230980A patent/JP2019068823A/ja not_active Ceased
-
2019
- 2019-12-26 AR ARP190103867A patent/AR117738A2/es unknown
-
2020
- 2020-02-05 JP JP2020017612A patent/JP2020078321A/ja active Pending
- 2020-09-30 AU AU2020244481A patent/AU2020244481A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA118837C2 (uk) | Рекомбінантний нейротоксин clostridium botulinum | |
| US20230285521A1 (en) | Composition comprising recombinant clostridium neurotoxin | |
| Chaddock et al. | Expression and purification of catalytically active, non-toxic endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxin type A | |
| AU2011288456B2 (en) | Selective manufacture of recombinant neurotoxin polypeptides | |
| JP2015534814A (ja) | 組換えクロストリジウムボツリヌス神経毒 |