WO2019211969A1 - 改変型エステラーゼ及びその用途 - Google Patents

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WO2019211969A1
WO2019211969A1 PCT/JP2019/015709 JP2019015709W WO2019211969A1 WO 2019211969 A1 WO2019211969 A1 WO 2019211969A1 JP 2019015709 W JP2019015709 W JP 2019015709W WO 2019211969 A1 WO2019211969 A1 WO 2019211969A1
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WO
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amino acid
acid sequence
seq
esterase
modified
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PCT/JP2019/015709
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和典 吉田
哲也 ▲高▼橋
石川　一彦
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天野エンザイム株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a modified esterase. Specifically, a modified esterase with improved properties and uses thereof are provided.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2018-089443 filed on May 2, 2018, the entire contents of which are incorporated by reference.
  • Esterase is an enzyme that hydrolyzes esters, and many esterases have been isolated from various organisms. Esterase derived from Acinetobacter calcoaceticus, which has a unique and broad substrate specificity, has high industrial usefulness, for example, synthesis of organic compounds used in pharmaceutical and fine chemical fields, and harmful in food It can be used in a wide variety of applications up to decomposition of a compound (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • esterase is also a protein composed of amino acids
  • the application range may be limited because the catalytic function cannot be exerted by protein denaturation depending on the use conditions (strong acid / strong alkali, high temperature, high concentration organic solvent, etc.).
  • pharmaceutical intermediate synthesis reactions are often performed under conditions that are severe for enzymes (for example, reactions at high temperatures, reactions in organic solvents, reactions in an acidic pH range), and stability is particularly a problem. . Therefore, sufficient enzyme activity cannot be obtained depending on the reaction conditions, and the reaction efficiency (yield) decreases.
  • the present invention makes it possible to maximize a wide range of substrate specificities under various usage conditions by improving the properties of esterase derived from Acinetobacter calcoaceticus, thereby making it possible to use the esterase in a useful manner.
  • the challenge is to increase the utility value.
  • the improvement in characteristics brings about an improvement in reaction efficiency and the like in the existing applications, while allowing creation of new applications (that is, expansion of applications).
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 an amino acid sequence comprising one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of K7P, F13Y, V107M, L222M, V229I and S235T, or 91% or more identical to the amino acid sequence
  • the modified esterase according to [1] wherein the amino acid substitution contained in the amino acid sequence of the modified esterase is S235T and the specific activity is improved.
  • the amino acid sequence is different at positions other than 235 at threonine), compared with the esterase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, specific activity, high temperature stability, high temperature reactivity and Modified esterase in which one or more properties selected from the group consisting of pH stability was improved.
  • [7] A gene encoding the modified esterase according to any one of [1] to [6].
  • [8] The gene according to [7], comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 8 to 13.
  • a recombinant DNA comprising the gene according to [7] or [8].
  • An enzyme agent comprising the modified esterase according to any one of [1] to [6].
  • a method for preparing a modified esterase comprising the following steps (I) to (III): (I) a step of preparing a nucleic acid encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 7; (II) expressing the nucleic acid; and (III) recovering the expression product.
  • the specific activity of the mutant was compared with the wild type enzyme. High temperature stability of the mutant. The residual activity rate when treated at 80 ° C. for 30 minutes was compared with the wild-type enzyme. High temperature reactivity of the mutant. Relative activity (ratio of enzyme activity at 60 ° C to enzyme activity at 30 ° C) was compared to the wild-type enzyme. PH stability of the mutant. The residual activity rate when treated for 30 minutes under the condition of pH 4.0 was compared with the wild-type enzyme.
  • modified esterase is an enzyme obtained by modifying or mutating a reference esterase (hereinafter referred to as “reference esterase”).
  • reference esterase is typically an esterase from Acinetobacter calcoaceticus having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • esterase derived from Acinetobacter calcoaceticus means an esterase whose origin is Acinetobacter calcoaceticus, and uses the esterase produced by Acinetobacter calcoaceticus or the genetic information of the esterase And esterases expressed by other microorganisms.
  • amino acid substitution is performed as a modification or mutation. Therefore, when the modified esterase and the reference esterase are compared, some amino acid residues are different.
  • the modified esterase is also referred to as a modified enzyme or a mutant.
  • each amino acid is represented by one letter as follows.
  • the position of the mutation point is specified by the number assigned from the N-terminal to the C-terminal with the N-terminal amino acid residue as the first.
  • an amino acid residue to be subjected to amino acid substitution that is, “mutation point” is represented by a combination of a single letter representing the type of amino acid and a number representing the position of the amino acid.
  • “mutation” by amino acid substitution is expressed by adding one letter representing the type of amino acid after substitution to the right of the display of the mutation point.
  • the lysine at position 7 is a mutation point, it is expressed as “K7”, and if it is a mutation in which the lysine at position 7 is substituted with proline, it is expressed as “K7P”.
  • the first aspect of the present invention relates to a modified esterase (modified enzyme).
  • the modified enzyme of the present invention typically has an amino acid sequence comprising one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of K7P, F13Y, V107M, L222M, V229I and S235T in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is an esterase sequence derived from Acinetobacter calcoaceticus.
  • the high temperature in the high-temperature stability is 75 ° C to 85 ° C, and the high temperature in the high-temperature reactivity is 55 ° C to 65 ° C.
  • pH stability means stability in an acidic pH region.
  • the acidic pH range here is 3-5.
  • Specific activity can be evaluated based on, for example, the activity calculated by the measurement method shown in the examples described later.
  • the specific activity is higher than that of the reference esterase (that is, the esterase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • the specific activity of the modified enzyme is, for example, 1.1 to 1.3 times that of the reference esterase.
  • High temperature stability can be evaluated based on, for example, residual activity when treated at 80 ° C. for 30 minutes.
  • the activity remaining rate is higher than that of the reference esterase (that is, the esterase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • the activity remaining rate of the modified enzyme is, for example, 2 to 10 times the activity remaining rate of the reference esterase. Preferably, it is 3 to 10 times.
  • the high temperature reactivity can be evaluated based on, for example, the ratio of the enzyme activity at 60 ° C. to the enzyme activity at 30 ° C. (relative activity at 60 ° C. based on the activity at 30 ° C.).
  • the relative activity is higher than that of the reference esterase (that is, the esterase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • the relative activity of the modified enzyme is, for example, 1.2 to 2 times the relative activity of the reference esterase. Preferably, it is 1.5 to 2 times.
  • the pH stability can be evaluated based on, for example, the residual activity when treated for 30 minutes under the condition of pH 4.
  • the activity remaining rate is higher than that of the reference esterase (that is, the esterase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • the activity remaining rate of the modified enzyme is, for example, 1.08 to 1.3 times the activity remaining rate of the reference esterase. Preferably, it is 1.15 times to 3 times.
  • “including amino acid substitution” means that the mutation point (that is, the position of the amino acid residue at which the specific amino acid substitution occurs) is the amino acid after substitution. Therefore, when the amino acid sequence containing the amino acid substitution (mutated amino acid sequence) is compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (reference amino acid sequence) not containing the amino acid substitution, a difference in amino acid residue is observed at the position of the amino acid substitution. It will be.
  • K7P represents a mutation in which the 7th amino acid (lysine) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with proline.
  • F13Y represents a mutation in which the amino acid at position 13 (phenylalanine) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with tyrosine.
  • V107M represents a mutation in which amino acid 107 (valine) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine.
  • L222M represents a mutation in which amino acid 222 (leucine) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with methionine.
  • V229I represents a mutation in which amino acid 229 (valine) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine.
  • S235T represents a mutation in which amino acid 235 (serine) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with threonine.
  • modified enzyme of the present invention include an esterase comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 7 (in order, mutant 1 (K7P), mutant 2 (F13Y), mutant 3 (V107M), mutation) Body 4 (L222M), variant 5 (V229I), and variant 6 (S235T)).
  • esterase (variant 1 (K7P)) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has improved high-temperature stability
  • esterase variant 2 (variant 2 ( F13Y)
  • esterase variant 2 (variant 2 ( F13Y)
  • esterase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (variant 3 (V107M)) has improved pH stability
  • SEQ ID NO: 5 Esterase consisting of an amino acid sequence (variant 4 (L222M)) has improved high-temperature stability and pH stability
  • esterase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (variant 5 (V229I)) is stable at high temperature.
  • the high temperature reactivity and pH stability are improved
  • the esterase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (mutant 6 (S235T)) has improved specific activity, high temperature reactivity and pH stability.
  • the protein after the mutation may have the same function as the protein before the mutation. That is, the amino acid sequence mutation does not substantially affect the protein function, and the protein function may be maintained before and after the mutation.
  • the identity of the amino acid sequences of the two proteins is high, there is a high probability that both have the same characteristics.
  • amino acid sequence of the above modified enzyme ie, “in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, selected from the group consisting of K7P, F13Y, V107M, E132P, S155P, L222M, V229I and S235T”
  • Amino acids that show high identity, although not completely identical (ie 100% identity) with an amino acid sequence comprising one or more amino acid substitutions specifically examples of such amino acid sequences are those of SEQ ID NOs: 2-7)
  • an enzyme substantially the same esterase
  • the identity here is preferably 90% or more, more preferably 91% or more, still more preferably 92% or more, still more preferably 93% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, most preferably Preferably it is 99% or more. If the modified enzyme is compared with substantially the same esterase, a slight difference in amino acid sequence will be observed. However, the difference in amino acid sequence occurs at a position other than the position where the amino acid substitution is performed.
  • the identity standard is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a position other than 7-position proline
  • the identity standard is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • a position other than 13-position tyrosine is the sequence In the case of the amino acid sequence of No. 4, the position other than methionine at position 107, when the identity standard is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, the position other than 222 position methionine, and the standard of identity is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is used at a position other than position 229 isoleucine
  • the amino acid sequence differs at positions other than position 235 at threonine.
  • the 7th amino acid is proline.
  • the 13th amino acid is tyrosine
  • the 107th amino acid Is methionine
  • amino acid 222 in the amino acid sequence showing 91% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is methionine
  • the amino acid at the position is isoleucine
  • the amino acid sequence showing 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is threonine.
  • “Slight difference in amino acid sequence” here is caused by amino acid deletion, substitution, addition, insertion, or a combination thereof. Typically, 1 to several (upper limit is 3, 5, 7, 10) amino acid deletions or substitutions constituting the amino acid sequence, or 1 to several (upper limit is 3, for example) It means that the amino acid sequence has been mutated (changed) by addition, insertion, or a combination thereof of 5, 7, 10) amino acids. “Slight differences in amino acid sequence” are preferably caused by conservative amino acid substitutions. As used herein, “conservative amino acid substitution” refers to substitution of a certain amino acid residue with an amino acid residue having a side chain having the same properties.
  • a basic side chain eg lysine, arginine, histidine
  • an acidic side chain eg aspartic acid, glutamic acid
  • an uncharged polar side chain eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine
  • Cysteine eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched side chains eg threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains eg tyrosine, phenylalanine, Like tryptophan and histidine
  • a conservative amino acid substitution is preferably a substitution between amino acid residues within the same family. It is known that the amino acid residues constituting the active center of esterase (SEQ ID NO: 1) derived from Acinetobacter calcoaceticus are 97th serine, 226th aspartic acid and 256th histidine. It is recommended that these amino acid residues should not be affected when applying. As an example in which a slight difference in the amino acid sequence does not substantially affect the protein function and the protein function is maintained before and after the mutation, amino acid 132 (glutamic acid) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is proline.
  • the identity (%) of two amino acid sequences or two base sequences can be determined, for example, by the following procedure.
  • two sequences are aligned for optimal comparison (eg, a gap may be introduced into the first sequence to optimize alignment with the second sequence).
  • a molecule amino acid residue or nucleotide
  • Gapped BLAST described in Altschul et al. (1997) Amino Acids Research 25 (17): 3389-3402 can be used.
  • the default parameters of the corresponding programs eg, XBLAST and NBLAST
  • an esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 that is, an esterase derived from Acinetobacter calcoaceticus is mutated (one or more of K7P, F13Y, V107M, L222M, V229I and S235T above).
  • the modified enzyme of the present invention is obtained.
  • the esterase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is further mutated (by one or a combination of two or more of K7P, F13Y, V107M, L222M, V229I and S235T).
  • an esterase consisting of an amino acid sequence having a high identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 such as an esterase derived from the same genus as the Acinetobacter calcoaceticus strain producing an esterase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a further mutation is added to the product obtained by the mutation.
  • the mutation points in the present invention positions 7, 13, 107, 222, The amino acid residue corresponding to the amino acid residue at position 229 or 235) is substituted.
  • esterase having an amino acid sequence having a high identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 an esterase derived from Acinetobacter guillouiae and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (98% amino acid sequence identity) ), Derived from Acinetobacter baumannii ABNIH3, esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 (97% identity of amino acid sequence), derived from Acinetobacter seifertii (SEQ ID NO: 17)
  • Esterase having an amino acid sequence identity of amino acid sequence 90%
  • Pseudomonas aeruginosa esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (80% identity of amino acid sequence)
  • Pseudomonas eruginosa Pseudomonas aeruginosa
  • Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa derived from esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 (80% identity
  • NBRC 110496 (Acinetobacter sp. NBRC 110496), derived from esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 (amino acid sequence identity 81%), Acinetobacter seifertii Esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 (90% identity of amino acid sequence), esterase derived from Acinetobacter sp. NIPH809 (Acinetobacter sp.
  • NIPH809 (identity of amino acid sequence 80 %), Derived from Pseudomonas fluorescens A506 (A506 Pseudomonas fluorescens A506), derived from esterase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 (80% identity of amino acid sequence), Pseudomonas sp. ABAC61 (Pseudomonas sp.
  • the term “corresponding” when used for amino acid residues means that the compared proteins (enzymes) make an equivalent contribution to the performance of their functions.
  • the amino acid sequence to be compared with the amino acid sequence of the reference esterase (the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) is arranged so that an optimal comparison can be made while considering partial homology of the primary structure (amino acid sequence).
  • the amino acid at the position corresponding to a specific amino acid in the reference amino acid sequence is identified as a “corresponding amino acid”.
  • the “corresponding amino acid” can also be specified by comparing three-dimensional structures (three-dimensional structures). A highly reliable comparison result can be obtained by using the three-dimensional structure information.
  • a method of performing alignment while comparing atomic coordinates of the three-dimensional structures of a plurality of enzymes can be employed.
  • the three-dimensional structure information of the enzyme to be mutated can be obtained from, for example, Protein Data Bank (http://www.pdbj.org/index_j.html).
  • Crystallize the protein is indispensable for determining the three-dimensional structure, but it also has industrial utility as a high purity protein purification method and a high density and stable storage method. In this case, it is preferable to crystallize a protein bound with a substrate or an analog compound thereof as a ligand.
  • Diffraction data is collected by irradiating the produced crystal with X-rays. In many cases, protein crystals are damaged by X-ray irradiation and the diffraction ability deteriorates. In that case, a cryogenic measurement technique in which the crystal is rapidly cooled to about ⁇ 173 ° C.
  • the heavy atom isomorphous substitution method is a method of obtaining phase information by introducing a metal atom having a large atomic number such as mercury or platinum into a crystal and utilizing the contribution of the metal atom to the X-ray diffraction data of the large X-ray scattering ability. .
  • the determined phase can be improved by smoothing the electron density of the solvent region in the crystal. Since water molecules in the solvent region have large fluctuations, almost no electron density is observed, so by approximating the electron density in this region to 0, it is possible to approach the true electron density and thus the phase is improved. . Further, when a plurality of molecules are contained in the asymmetric unit, the phase is further improved by averaging the electron density of these molecules. The protein model is fit to the electron density map calculated using the improved phase in this way. This process is performed on a computer graphic using a program such as QUANTA from MSI (USA). Thereafter, the structure is refined using a program such as X-PLOR of MSI, and the structural analysis is completed.
  • crystal structure of a similar protein When the crystal structure of a similar protein is known with respect to the target protein, it can be determined by a molecular replacement method using the atomic coordinates of the known protein. Molecular replacement and structural refinement can be performed using programs such as CNS_SOLVE ver.11.
  • the second aspect of the present invention provides a nucleic acid related to the modified enzyme of the present invention. That is, a gene encoding a modified enzyme, a nucleic acid that can be used as a probe for identifying a nucleic acid encoding the modified enzyme, and a primer for amplifying or mutating a nucleic acid encoding the modified enzyme Nucleic acids capable of being provided are provided.
  • the gene encoding the modified enzyme is typically used for the preparation of the modified enzyme. According to a genetic engineering preparation method using a gene encoding a modified enzyme, it is possible to obtain a modified enzyme in a more homogeneous state. This method can also be said to be a suitable method when preparing a large amount of modified enzyme.
  • the use of the gene encoding the modified enzyme is not limited to the preparation of the modified enzyme.
  • the nucleic acid can also be used as an experimental tool for elucidating the mechanism of action of the modified enzyme, or as a tool for designing or preparing a further modified enzyme.
  • a “gene encoding a modified enzyme” refers to a nucleic acid obtained by expressing the modified enzyme, and has a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the modified enzyme.
  • the nucleic acid includes, of course, a nucleic acid obtained by adding a sequence that does not encode an amino acid sequence to such a nucleic acid. Codon degeneracy is also considered.
  • SEQ ID NOs: 8 to 13 Examples of the sequence (base sequence) of the gene encoding the modified enzyme are shown in SEQ ID NOs: 8 to 13. These sequences encode the mutants shown in the examples described below, as described below.
  • the enzyme of the present invention does not have a signal sequence, it is not normally secreted outside the cells, but when it is desired to be secreted outside the cells, the 5 ′ end side of the above sequence (any one of SEQ ID NOs: 8 to 13)
  • a gene construct having a signal peptide-encoding sequence (signal sequence) added thereto may be introduced into the host.
  • the signal sequence may be selected depending on the host. Any signal sequence capable of expressing the target mutant can be used in the present invention.
  • ⁇ -factor signal peptide coding sequence Protein Engineering, 1996, vol9, p.1055-1061
  • SUC2 protein signal peptide A sequence encoding the signal peptide of the PHO5 protein, a sequence encoding the signal peptide of the BGL2 protein, a sequence encoding the signal peptide of the AGA2 protein, a sequence encoding the signal peptide of TorA (trimethylamine N-oxidoreductase) ,
  • PhoD phosphoesterase
  • a sequence encoding the signal peptide of LipA (esterase) derived from Bacillus subtilis and the signal peptide of Takaamylase derived from Aspergillus oryzae Sequence (JP 2009-60804)
  • the nucleic acid of the present invention can be obtained by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, chemical synthesis, etc. with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. It can be prepared in an isolated state.
  • nucleic acid having a partially different base sequence, although the function of the protein encoded by the same is equivalent to the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • homologous nucleic acid also referred to as “homologous base sequence”.
  • base sequence defining a homologous nucleic acid is also referred to as “homologous base sequence”).
  • a modified enzyme comprising a nucleotide sequence comprising substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or more bases based on the nucleotide sequence of a nucleic acid encoding the modified enzyme of the present invention And a DNA encoding a protein having a characteristic enzyme activity (that is, esterase activity).
  • Base substitution or deletion may occur at a plurality of sites.
  • plurality refers to, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases, although it varies depending on the position and type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the nucleic acid. It is.
  • the homologous nucleic acid is, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more, still more preferably about 90% or more, even more preferably, relative to the reference base sequence.
  • homologous nucleic acids include, for example, restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., site-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) It can be obtained by introducing mutations by mutation introduction methods (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Homologous nucleic acids can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • Another aspect of the present invention relates to a nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention. Still another embodiment of the present invention provides at least about 60%, 70%, 80%, 90%, 95% of the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention, or a base sequence complementary thereto, Nucleic acids having 99% and 99.9% identical base sequences are provided.
  • Still another embodiment of the present invention is a nucleic acid having a base sequence that hybridizes under stringent conditions to a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention or a base sequence complementary to the base sequence homologous thereto.
  • the “stringent conditions” here are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Such stringent conditions are known to those skilled in the art, such as Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987) Can be set with reference to.
  • hybridization solution 50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denaturation
  • 5 ⁇ Denhardt solution 1% SDS
  • 10% dextran sulfate 10 ⁇ g / ml denaturation
  • incubation at about 42 ° C to about 50 ° C using salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), followed by washing at about 65 ° C to about 70 ° C using 0.1 x SSC, 0.1% SDS can be mentioned.
  • Further preferable stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml as a hybridization solution. Of denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)).
  • nucleic acid having a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention or a part of a base sequence complementary thereto.
  • a nucleic acid fragment can be used for detecting, identifying, and / or amplifying a nucleic acid having a base sequence of a gene encoding the modified enzyme of the present invention.
  • the nucleic acid fragment is, for example, a nucleotide portion continuous in the base sequence of the gene encoding the modified enzyme of the present invention (eg, about 10 to about 100 bases in length, preferably about 20 to about 100 bases, more preferably about 30 to about 100). It is designed to include at least a portion that hybridizes (100 base length).
  • a nucleic acid fragment can be labeled.
  • fluorescent substances, enzymes, and radioisotopes can be used.
  • Still another aspect of the present invention relates to a recombinant DNA containing the gene of the present invention (gene encoding a modified enzyme).
  • the recombinant DNA of the present invention is provided, for example, in the form of a vector.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleic acid inserted therein into a target such as a cell.
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and in consideration of the type of host cell. M13 phage or a variant thereof, ⁇ phage or a variant thereof, pBR322 or a variant thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.), pET21, etc., and a yeast host as pYepSec1, pMFa , PYES2, pPIC3.5K, etc. Examples of vectors that use insect cells as hosts include pAc and pVL, and examples of vectors that use mammalian cells as hosts include pCDM8 and pMT2PC.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell.
  • Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence / absence (and extent) of introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the nucleic acid of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press and New York, which can be referred to, are known methods using restriction enzymes and DNA ligases).
  • Neisseria gonorrhoeae for example, Aspergillus oryzae
  • Bacillus bacteria for example, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus aminoliquefaciens
  • Brevibacillus bacteria for example, Brevibacillus
  • -Microbes such as E. coli (Escherichia coli), budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) can be used, but any host cell that can replicate recombinant DNA and express a gene for a modified enzyme can be used. If available.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • budding yeast Sacharomyces cerevisiae
  • Acinetobacter microorganisms for example, Acinetobacter calcoaceticus can be used as a host.
  • E. coli BL21 DE3
  • E. coli JM109 can be used otherwise.
  • Examples of the budding yeast include budding yeast SHY2, budding yeast AH22, and budding yeast INVSc1 (Invitrogen).
  • microorganism that is, a transformant
  • the microorganism of the present invention can be obtained by transfection or transformation using the vector of the present invention.
  • calcium chloride method Frnal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), Volume 53, pp. 159 (1970)
  • Hanahan Method Journal of Molecular Biology, Volume 166, 557) (1983)
  • SEM Gene, 96, 23 (1990)
  • Chung et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86) Vol., P.
  • microorganism of the present invention can be used for producing the modified enzyme of the present invention.
  • the modified enzyme of the present invention is provided, for example, in the form of an enzyme agent.
  • the enzyme agent may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline and the like in addition to the active ingredient (modified enzyme of the present invention).
  • excipient starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like can be used.
  • Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • preservatives ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • modified esterases Further aspects of the present invention relate to the use of modified enzymes and enzyme agents, including various reactions using the modified enzymes or enzyme agents of the present invention, and methods for producing / manufacturing various compounds using the same.
  • the modified enzyme or enzyme agent of the present invention includes (1) production of an organic compound used for pharmaceuticals, (2) production of an ester compound considered to be used in the fine chemical field, and (3) lactone. It can be used for hydrolysis of compounds.
  • DL-MATI DL- ⁇ -acetylthioisobutyrate
  • DAT D- ⁇ -Acetylthioisobutyric acid
  • captopril D- ⁇ -Acetylthioisobutyric acid
  • a further aspect of the present invention relates to a method for preparing a modified enzyme.
  • a modified enzyme successfully obtained by the present inventors is prepared by a genetic engineering technique.
  • a nucleic acid encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 7 is prepared (step (I)).
  • the “nucleic acid encoding a specific amino acid sequence” is a nucleic acid from which a polypeptide having the amino acid sequence is obtained when it is expressed, not to mention a nucleic acid comprising a base sequence corresponding to the amino acid sequence.
  • nucleic acid encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 7 refers to sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing, and uses standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, It can be prepared in an isolated state by using a biochemical method or the like. Here, all of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 7 are obtained by mutating the amino acid sequence of Acinetobacter calcoaceticus-derived esterase.
  • nucleic acid encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 7 can also be obtained by adding necessary mutations to the gene encoding Acinetobacter calcoaceticus-derived esterase.
  • Many methods for position-specific base sequence substitution are known in the art (see, for example, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), and an appropriate method is selected from them. Can be used.
  • a position-specific mutation introducing method a position-specific amino acid saturation mutation method can be employed.
  • the position-specific amino acid saturation mutation method is a “Semi-rational, semi-random” technique in which amino acid saturation mutation is introduced by estimating the position where the desired function is involved based on the three-dimensional structure of the protein (J. Mol. Biol. 331, 585-592 (2003)).
  • a site-specific amino acid saturation mutation can be introduced by using a kit such as Quick change (Stratagene) and overlap extention PCR (Nucleic Acid Res. 16,7351-7367 (1988)).
  • a DNA polymerase used for PCR Taq polymerase or the like can be used.
  • it is preferable to use a highly accurate DNA polymerase such as KOD-PLUS- (Toyobo), Pfu turbo (Stratagene).
  • step (II) the prepared nucleic acid is expressed (step (II)).
  • an expression vector into which the nucleic acid is inserted is prepared, and a host cell is transformed using the expression vector.
  • the transformant is cultured under conditions where the modified enzyme, which is the expression product, is produced.
  • the transformant may be cultured according to a conventional method.
  • the carbon source used in the medium may be any assimitable carbon compound.
  • glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, pyruvic acid and the like are used.
  • the nitrogen source may be any nitrogen compound that can be used.
  • peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean cake alkaline extract, and the like are used.
  • phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary.
  • the culture temperature can be set within the range of 30 to 40 ° C (preferably around 33 to 37 ° C).
  • the culture time can be set in consideration of the growth characteristics of the transformant to be cultured and the production characteristics of the modified enzyme.
  • the pH of the medium is adjusted so that the transformant grows and the enzyme is produced.
  • the pH of the medium is about 6.0 to 9.0 (preferably around pH 7.0).
  • the expression product (modified enzyme) is recovered (step (III)).
  • the culture solution containing the cultured microbial cells can be used as it is or after concentration, removal of impurities, etc., it can be used as an enzyme solution.
  • the expression product is once recovered from the culture solution or microbial cells. If the expression product is a secreted protein, it can be recovered from the culture solution, and if not, it can be recovered from the fungus body.
  • the culture supernatant is filtered and centrifuged to remove insolubles, followed by concentration under reduced pressure, membrane concentration, salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, methanol, ethanol, acetone, etc.
  • chromatographic methods such as fractional precipitation, dialysis, heat treatment, isoelectric point treatment, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography (eg, Sephadex gel (GE Healthcare Bioscience)) Separation using a combination of gel filtration, DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), Octyl Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience), CM Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience) Purified to obtain a purified product of the modified enzyme It is possible. On the other hand, when recovering from the microbial cells, the microbial cells are collected by filtering, centrifuging, etc.
  • the culture solution, and then the microbial cells are subjected to mechanical methods such as pressure treatment, ultrasonic treatment, physical disruption treatment, or lysozyme.
  • mechanical methods such as pressure treatment, ultrasonic treatment, physical disruption treatment, or lysozyme.
  • a purified product of the modified enzyme can be obtained by separation and purification in the same manner as described above.
  • the purified enzyme obtained as described above in the form of powder by, for example, freeze drying, vacuum drying or spray drying.
  • the purified enzyme may be dissolved in a phosphate buffer, triethanolamine buffer, Tris-HCl buffer or GOOD buffer in advance.
  • a phosphate buffer or a triethanolamine buffer can be used.
  • PIPES, MES, or MOPS is mentioned as a GOOD buffer here.
  • cell-free synthesis system (cell-free transcription system, cell-free transcription / translation system) refers to a ribosome derived from a live cell (or obtained by a genetic engineering technique), not a live cell. This refers to the synthesis of mRNA or protein encoded by a template nucleic acid (DNA or mRNA) in vitro using transcription / translation factors.
  • a cell extract obtained by purifying a cell disruption solution as needed is generally used.
  • Cell extracts generally contain ribosomes necessary for protein synthesis, various factors such as initiation factors, and various enzymes such as tRNA.
  • various substances necessary for protein synthesis such as various amino acids, energy sources such as ATP and GTP, and creatine phosphate are added to the cell extract.
  • ribosome, various factors, and / or various enzymes prepared separately may be supplemented as necessary during protein synthesis.
  • cell-free transcription / translation system is used interchangeably with a cell-free protein synthesis system, in-vitro translation system or in-vitro transcription / translation system.
  • RNA is used as a template to synthesize proteins.
  • total RNA, mRNA, in vitro transcript and the like are used.
  • the other in vitro transcription / translation system uses DNA as a template.
  • the template DNA should contain a ribosome binding region and preferably contain an appropriate terminator sequence.
  • conditions to which factors necessary for each reaction are added are set so that the transcription reaction and the translation reaction proceed continuously.
  • SEQ ID NO: 1 Aiming to improve the properties of esterase derived from Acinetobacter calcoaceticus (SEQ ID NO: 1), mutation points from the viewpoint of strengthening hydrogen bonds, enhancing hydrophobicity, increasing density (improving packing properties) and strengthening loops ( Amino acid residues to be substituted) were selected, and 15 types of mutants (modified esterases) were designed. Each designed mutant was produced by the following method, and the characteristic was evaluated.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a mature form of esterase derived from Acinetobacter calcoaceticus (not including a signal peptide).
  • ⁇ PCR conditions Composition of reaction solution: 5 ⁇ l of 5 ⁇ PrimeSTAR GXL Buffer, 2 ⁇ l of dNTP Mixture (each 2.5 mM), 0.5 ⁇ l of forward primer, 0.5 ⁇ l of reverse primer, 0.25 ⁇ l of template, PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) Company) 1 ⁇ l (adjusted to 25 ⁇ l with sterilized distilled water) Reaction conditions: 15 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 15 seconds, 68 ° C for 2 minutes
  • each constructed esterase gene recombinant E. coli expression strain (host: E.coli BL21 (DE3)), culture solution (culture Attempt to acquire (bacteria).
  • the culture solution (cultured cells) of each esterase gene recombinant E. coli expression strain was obtained in two stages of culture. First, each esterase gene recombinant E. coli expression strain was inoculated into 5 mL of L Broth (Invitrogen) (Amp: 100 ⁇ g / mL) and cultured for 16 hours (150 rpm, 37 ° C.) in a shaking incubator.
  • Teriffic Broth (Invitrogen) (Amp: 100 ⁇ g / mL) 0.5 mL was inoculated into 50 mL. Thereafter, the cells were cultured for 48 hours under the conditions of 200 rpm and 33 ° C., and the expression of the enzyme was induced by adding 0.1 mM IPTG to the culture solution 24 hours after the start of the culture. After centrifuging 50 mL of the culture solution (7,000 g ⁇ 10 minutes, 4 ° C.), the cultured cells were recovered by removing the centrifugal supernatant.
  • the enzyme solution after ammonium sulfate precipitation was desalted and concentrated by ultrafiltration, and the conductivity was lowered to about 2 mS / cm. Subsequently, purification was performed by the following two-stage chromatography (DEAE-Sepharose column chromatography, phenyl-Sepharose column chromatography). In addition, after adding NaCl to the fraction collect
  • the elution fraction of phenyl-Sepharose column chromatography was collected and used as a purified enzyme sample.
  • Mutant characterization ⁇ activity measurement method 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) 2.1 mL, 5 mM 3,4-dihydrocoumarin (Tokyo Kasei (TCI)) solution (50 mM phosphate buffer (pH 7.0) (40% EtOH included)) 0.3 mL, enzyme 0.6 mL of the solution was mixed and reacted.
  • the change in absorbance of the product (3- (2-hydroxyphenyl) propionic acid) produced by the reaction is measured by kinetics (Abs. 270 nm, 30 ° C., 5 minutes).
  • the amount of enzyme that produces the product (3- (2-hydroxyphenyl) propionic acid) is defined as 1 unit (U).
  • mutant 1 mutant 1 (K7P), mutant 2 (F13Y), mutant 4 (L222M), mutant 5 (V229I)
  • mutant 1 mutant 1 (K7P), mutant 4 (L222M), and mutant 5 (V229I)
  • mutant 1 mutant 1 (K7P), mutant 4 (L222M), and mutant 5 (V229I) have high temperature stability.
  • the pH stability was evaluated using a purified enzyme sample.
  • the purified enzyme of each mutant was treated with a low pH (pH 4.0, 30 minutes).
  • a sample after treatment and a sample before treatment (untreated) were diluted to an appropriate concentration with a diluent (50 mM phosphate buffer (pH 7.0)), and then enzyme activity was measured by the above activity measurement method.
  • the residual activity was calculated from the measured value (enzyme activity) as follows, and the high temperature stability was evaluated.
  • Activity remaining rate (enzyme activity after low pH treatment / enzyme activity before treatment) ⁇ 100 (%)
  • mutant 2 (F13Y), mutant 3 (V107M), mutant 4 (L222M), mutant 5 (V229I), mutant 6 (S235T)) showed improved pH stability. It was. In particular, Mutant 2 (F13Y), Mutant 3 (V107M), Mutant 4 (L222M), and Mutant 5 (V229I) have high pH stability.
  • Mutant 1 SEQ ID NO: 2
  • Mutant 2 F13Y: SEQ ID NO: 3
  • Mutant 3 (V107M): SEQ ID NO: 4
  • Mutant 4 (L222M): SEQ ID NO: 5
  • Mutant 5 (V229I): SEQ ID NO: 6
  • S235T SEQ ID NO: 7
  • the properties (specific activity, high temperature reactivity, high temperature stability, pH stability) of the modified esterase of the present invention are improved. Therefore, its use or application range is wide, and improvement in reaction efficiency can be expected.

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Abstract

高い反応効率を期待でき、各種用途に適用可能な改変型エステラーゼを提供することを課題とする。配列番号１のアミノ酸配列において、K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と91%以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、比活性、高温安定性、高温反応性及びpH安定性からなる群より選択される一以上の特性が向上した改変型エステラーゼが提供される。

Description

改変型エステラーゼ及びその用途
　本発明は改変型エステラーゼに関する。詳しくは、特性が向上した改変型エステラーゼ及びその用途が提供される。本出願は、２０１８年５月２日に出願された日本国特許出願第２０１８－０８８９４３号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　エステラーゼはエステルを加水分解する酵素であり、様々な生物から数多くのエステラーゼが単離されている。ユニーク且つ幅広い基質特異性を有するアシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）由来のエステラーゼは産業上の有用性が高く、例えば、医薬品やファインケミカル分野などで利用される有機化合物の合成や食品中の有害化合物の分解まで、多岐に渡る用途で利用可能である（例えば非特許文献１を参照）。
Appl Microbial Biotechnol (2002) 60:288-292
　しかしながら、エステラーゼもアミノ酸で構成されるタンパク質である以上、使用条件（強酸・強アルカリ、高温、高濃度有機溶媒など）によってはタンパク変性により触媒機能を発揮できないため、適用範囲が限られる場合がある。例えば、医薬中間体の合成反応は酵素にとって厳しい条件下（例えば、高温下の反応、有機溶媒中での反応、酸性pH域での反応）で行われることが多く、特に安定性が問題となる。そのため、反応条件によっては十分な酵素活性が得られず、反応効率（収率）が低下する。
　そこで本発明は、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼの特性を改善することで幅広い基質特異性を様々な使用条件下で最大限に発揮することを可能とし、それによって当該エステラーゼの有用性ないし利用価値を高めることを課題とする。特性の改善は、既存の用途においては反応効率等の向上をもたらす一方、新たな用途の創出（即ち用途の拡大）を可能とする。
　上記課題を解決すべく本発明者らは、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼの改変を試みた。試行錯誤の末、その特性（比活性、高温安定性、高温反応性、pH安定性）の向上に有効な変異点（アミノ酸残基）を特定することに成功し、有用性の高い変異体（改変型エステラーゼ）が得られた。この成果は、特性の向上という目的を達成し得る変異体を設計、取得するための情報・手段を提供する点においても重要である。
　ところで、効果的な二つの変異を組み合わせることによって相加的又は相乗的効果が生まれる可能性が高いことも多く経験するところである。また、同種の酵素については構造（一次構造、立体構造）の類似性が高く、同様の変異が同様の効果を生む蓋然性が高いという技術常識に鑑みれば、配列番号１のアミノ酸配列を有するアシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼにおいて見出された有用な変異を、当該エステラーゼとの間で構造上の類似性が高い他のエステラーゼに対して適用すれば、同等の効果が奏される蓋然性が高く、また、当業者であれば、このような適用が有効であることを認識し得る。
　以下の発明は以上の成果及び考察に基づく。
　［１］配列番号１のアミノ酸配列において、K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と91%以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して比活性、高温安定性、高温反応性及びpH安定性からなる群より選択される一以上の特性が向上した改変型エステラーゼ。
　［２］改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がS235Tであり、比活性が向上している、［１］に記載の改変型エステラーゼ。
　［３］改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がK7P、F13Y、L222M又はV229Iであり、高温安定性が向上している、［１］に記載の改変型エステラーゼ。
　［４］改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がV229I又はS235Tであり、高温反応性が向上している、［１］に記載の改変型エステラーゼ。
　［５］改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がF13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tであり、pH安定性が向上している、［１］に記載の改変型エステラーゼ。
　［６］配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と91%以上の同一性を示すアミノ酸配列であり（但し、同一性の基準が配列番号２のアミノ酸配列の場合は7位プロリン以外の位置、同一性の基準が配列番号３のアミノ酸配列の場合は13位チロシン以外の位置、同一性の基準が配列番号４のアミノ酸配列の場合は107位メチオニン以外の位置、同一性の基準が配列番号５のアミノ酸配列の場合は222位メチオニン以外の位置、同一性の基準が配列番号６のアミノ酸配列の場合は229位イソロイシン以外の位置、同一性の基準が配列番号７のアミノ酸配列の場合は235位トレオニン以外の位置、においてアミノ酸配列の相違は生じている）、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して比活性、高温安定性、高温反応性及びpH安定性からなる群より選択される一以上の特性が向上した改変型エステラーゼ。
　［７］［１］～［６］のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼをコードする遺伝子。
　［８］配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含む、［７］に記載の遺伝子。
　［９］［７］又は［８］に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
　［１０］［９］に記載の組換えDNAを保有する微生物。
　［１１］宿主が、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミノリクファシエンス、ブレビバチルス・チョウシネンシスである、［１０］に記載の微生物。
　［１２］［１］～［６］のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼを含む酵素剤。
　［１３］以下のステップ(I)～(III)を含む、改変型エステラーゼの調製法：
　(I)配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
　(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
　(III)発現産物を回収するステップ。
変異体の比活性。変異体の比活性を野生型酵素と比較した。 変異体の高温での安定性。80℃で30分間処理した場合の残存活性率を野生型酵素と比較した。 変異体の高温での反応性。相対活性（30℃での酵素活性に対する60℃での酵素活性の比率）を野生型酵素と比較した。 変異体のpH安定性。pH4.0の条件で30分間処理した場合の残存活性率を野生型酵素と比較した。
　説明の便宜上、本発明に関して使用する用語の一部について以下で定義する。
（用語）
　用語「改変型エステラーゼ」とは、基準となるエステラーゼ（以下、「基準エステラーゼ」と呼ぶ）を改変ないし変異して得られる酵素である。基準エステラーゼは、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を有する、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）由来のエステラーゼである。
　用語「アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼ」とは、その起源がアシネトバクター・カルコアセティカスであるエステラーゼのことであり、アシネトバクター・カルコアセティカスが産生するエステラーゼ又は当該エステラーゼの遺伝情報を利用して他の微生物等で発現させたエステラーゼなどを含む。
　本発明では、改変ないし変異として「アミノ酸の置換」が行われる。従って、改変型エステラーゼと基準エステラーゼを比較すると、一部のアミノ酸残基に相違が認められる。尚、本明細書では、改変型エステラーゼのことを改変型酵素又は変異体とも呼ぶ。
　本明細書では慣例に従い、以下の通り、各アミノ酸を１文字で表記する。
　メチオニン：M、セリン：S、アラニン：A、トレオニン：T、バリン：V、チロシン：Y、ロイシン：L、アスパラギン：N、イソロイシン：I、グルタミン：Q、プロリン：P、アスパラギン酸：D、フェニルアラニン：F、グルタミン酸：E、トリプトファン：W、リジン：K、システイン：C、アルギニン：R、グリシン：G、ヒスチジン：H
　本明細書では、N末端のアミノ酸残基を１番目としてN末端からC末端に向かって付けた番号によって変異点の位置を特定する。
　慣例に従い、アミノ酸置換を施すアミノ酸残基、即ち「変異点」を、アミノ酸の種類を表す１文字とアミノ酸の位置を表す数字との組合せで表現する。また、アミノ酸置換による「変異」を、変異点の表示の右に置換後のアミノ酸の種類を表す１文字を追加したものによって表現する。従って、例えば、7位のリジンが変異点であれば「K7」と表現され、7位のリジンがプロリンに置換される変異であれば「K7P」と表現される。
１．改変型エステラーゼ
　本発明の第１の局面は改変型エステラーゼ（改変型酵素）に関する。本発明の改変型酵素は、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列において、K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。当該特徴により、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して比活性、高温安定性、高温反応性又はpH安定性、或いはこれらの中の二つ以上が向上している。尚、配列番号１のアミノ酸配列は、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼの配列である。
　改変型酵素の高温安定性及び高温反応性の理解や判断／判定を容易にするため、高温安定性における高温は「75℃～85℃」、高温反応性における高温は「55℃～65℃」、とする。また、pH安定性は酸性pH領域での安定性を意味する。pH安定性の理解や判断／判定を容易にするため、ここでの酸性pH領域は3～5とする。
　比活性は、例えば、後述の実施例に示す測定法で算出した活性に基づき評価することができる。比活性が向上した改変型酵素では、その比活性が基準エステラーゼ（即ち、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼ）よりも高くなる。改変型酵素の比活性は、例えば、基準エステラーゼの比活性の1.1倍～1.3倍である。
　高温安定性は、例えば、80℃で30分間処理した場合の残存活性に基づき評価できる。高温安定性が向上した改変型酵素では、その活性残存率が基準エステラーゼ（即ち、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼ）よりも高くなる。改変型酵素の活性残存率は、例えば、基準エステラーゼの活性残存率の2倍～10倍である。好ましくは、3倍～10倍である。尚、活性残存率は、以下の通り算出される。
　活性残存率＝（熱処理後の酵素活性／熱処理前の酵素活性）×100（％）
　高温反応性は、例えば、30℃での酵素活性に対する60℃での酵素活性の比率（30℃での活性を基準とした60℃での相対活性）に基づき評価できる。高温反応性が向上した改変型酵素では、その相対活性が基準エステラーゼ（即ち、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼ）よりも高くなる。改変型酵素の相対活性は、例えば、基準エステラーゼの相対活性の1.2倍～2倍である。好ましくは、1.5倍～2倍である。尚、相対活性は、以下の通り算出される。
　相対活性＝（60℃での酵素活性／30℃での酵素活性）×100（％）
　pH安定性は、例えば、pH4の条件で30分間処理した場合の残存活性に基づき評価できる。pH安定性が向上した改変型酵素では、その活性残存率が基準エステラーゼ（即ち、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼ）よりも高くなる。改変型酵素の活性残存率は、例えば、基準エステラーゼの活性残存率の1.08倍～1.3倍である。好ましくは、1.15倍～3倍である。尚、活性残存率は、以下の通り算出される。
　活性残存率＝（処理後の酵素活性／処理前の酵素活性）×100（％）
　本明細書において「アミノ酸置換を含む」とは、変異点（即ち、特定のアミノ酸置換が生ずるアミノ酸残基の位置）が置換後のアミノ酸になっていることを意味する。従って、アミノ酸置換を含むアミノ酸配列（変異アミノ酸配列）を、アミノ酸置換を含まない配列番号１のアミノ酸配列（基準アミノ酸配列）と比較すれば、当該アミノ酸置換の位置においてアミノ酸残基の相違が認められることになる。
　K7Pは配列番号１のアミノ酸配列における7位アミノ酸（リジン）がプロリンに置換される変異を表す。F13Yは配列番号１のアミノ酸配列における13位アミノ酸（フェニルアラニン）がチロシンに置換される変異を表す。V107Mは配列番号１のアミノ酸配列における107位アミノ酸（バリン）がメチオニンに置換される変異を表す。L222Mは配列番号１のアミノ酸配列における222位アミノ酸（ロイシン）がメチオニンに置換される変異を表す。V229Iは配列番号１のアミノ酸配列における229位アミノ酸（バリン）がイソロイシンに置換される変異を表す。S235Tは配列番号１のアミノ酸配列における235位アミノ酸（セリン）がトレオニンに置換される変異を表す。
　本発明の改変型酵素の具体例として、配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列からなるエステラーゼ（順に、変異体１（K7P）、変異体２（F13Y）、変異体３（V107M）、変異体４（L222M）、変異体５（V229I）、変異体６（S235T）が対応する）を挙げることができる。後述の実施例に示す通り、配列番号２のアミノ酸配列からなるエステラーゼ（変異体１（K7P））は高温安定性が向上していること、配列番号３のアミノ酸配列からなるエステラーゼ（変異体２（F13Y））は高温安定性とpH安定性が向上していること、配列番号４のアミノ酸配列からなるエステラーゼ（変異体３（V107M））はpH安定性が向上していること、配列番号５のアミノ酸配列からなるエステラーゼ（変異体４（L222M））は高温安定性とpH安定性が向上していること、配列番号６のアミノ酸配列からなるエステラーゼ（変異体５（V229I））は高温安定性、高温反応性及びpH安定性が向上していること、配列番号７のアミノ酸配列からなるエステラーゼ（変異体６（S235T））は比活性、高温反応性及びpH安定性が向上していること、が確認されている。
　一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部を変異させた場合において変異後のタンパク質が変異前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の変異がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が変異前後において維持されることがある。一方、二つのタンパク質のアミノ酸配列の同一性が高い場合、両者が同等の特性を示す蓋然性が高い。これらの技術常識を考慮すれば、上記改変型酵素のアミノ酸配列、即ち、「配列番号１のアミノ酸配列において、K7P、F13Y、V107M、E132P、S155P、L222M、V229I及びS235Tからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列（当該アミノ酸配列の具体例は配列番号２～７のアミノ酸配列）」と完全に同一（即ち100％の同一性）でないものの、高い同一性を示すアミノ酸配列を有し、且つ所望の特性が向上しているものであれば、上記改変型酵素と実質的に同一の酵素（実質同一エステラーゼ）であると見なすことができる。ここでの同一性は好ましくは90％以上、より好ましくは91%以上、更に好ましくは92％以上、一層好ましくは93％以上、より一層好ましくは95％以上、更に一層好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上である。上記改変型酵素と実質同一エステラーゼを比較すれば、アミノ酸配列の僅かな相違が認められることになる。但し、アミノ酸配列の相違は上記アミノ酸置換が施された位置以外の位置で生ずることとする。従って、同一性の基準が配列番号２のアミノ酸配列の場合は7位プロリン以外の位置、同一性の基準が配列番号３のアミノ酸配列の場合は13位チロシン以外の位置、同一性の基準が配列番号４のアミノ酸配列の場合は107位メチオニン以外の位置、同一性の基準が配列番号５のアミノ酸配列の場合は222位メチオニン以外の位置、同一性の基準が配列番号６のアミノ酸配列の場合は229位イソロイシン以外の位置、同一性の基準が配列番号７のアミノ酸配列の場合は235位トレオニン以外の位置、においてアミノ酸配列の相違が生じることになる。換言すれば、配列番号２のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列では、7位アミノ酸はプロリンである。同様に、配列番号３のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列では13位アミノ酸はチロシンであり、配列番号４のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列では107位アミノ酸はメチオニンであり、配列番号５のアミノ酸配列と91%以上の同一性を示すアミノ酸配列では222位アミノ酸はメチオニンであり、配列番号６のアミノ酸配列と91%以上の同一性を示すアミノ酸配列では229位アミノ酸はイソロイシンであり、配列番号７のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列では235位アミノ酸はトレオニンである。
　ここでの「アミノ酸配列の僅かな相違」は、アミノ酸の欠失、置換、付加、挿入、又はこれらの組合せにより生じる。典型的には、アミノ酸配列を構成する１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１～数個（上限は例えば３個、５個、７個、１０個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。「アミノ酸配列の僅かな相違」は、好ましくは保存的アミノ酸置換により生じている。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。尚、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼ（配列番号１）の活性中心を構成するアミノ酸残基は97位セリン、226位アスパラギン酸及び256位ヒスチジンであることが知られていることから、変異を施す際にはこれらのアミノ酸残基に影響がないようにするとよい。アミノ酸配列の僅かな相違がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が変異前後において維持されている例として、配列番号１のアミノ酸配列における132位アミノ酸（グルタミン酸）がプロリンであるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列における192位アミノ酸（グリシン）がセリンであるアミノ酸配列又は配列番号１のアミノ酸配列における244位アミノ酸（ロイシン）がプロリンであるアミノ酸配列が挙げられる。これらのアミノ酸配列を有するエステラーゼに関して、比活性と高温安定性を比較した結果、配列番号１と同等であった。
　ところで、二つのアミノ酸配列又は二つの塩基配列（以下、これらを含む用語として「二つの配列」を使用する）の同一性（％）は例えば以下の手順で決定することができる。まず、最適な比較ができるよう二つの配列を並べる（例えば、第一の配列にギャップを導入して第二の配列とのアライメントを最適化してもよい）。第一の配列の特定位置の分子（アミノ酸残基又はヌクレオチド）が、第二の配列における対応する位置の分子と同じであるとき、その位置の分子が同一であるといえる。二つの配列の同一性は、その二つの配列に共通する同一位置の数の関数であり（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数 × 100）、好ましくは、アライメントの最適化に要したギャップの数およびサイズも考慮に入れる。
　二つの配列の比較及び同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実現可能である。配列の比較に利用可能な数学的アルゴリズムの具体例としては、KarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68に記載され、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において改変されたアルゴリズムがあるが、これに限定されることはない。このようなアルゴリズムは、Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。等価なヌクレオチド配列を得るには例えば、NBLASTプログラムでscore = 100、wordlength = 12としてBLASTヌクレオチド検索を行えばよい。等価なアミノ酸配列を得るには例えば、XBLASTプログラムでscore = 50、wordlength = 3としてBLASTポリペプチド検索を行えばよい。比較のためのギャップアライメントを得るためには、Altschulら (1997) Amino Acids Research 25(17):3389-3402に記載のGapped BLASTが利用可能である。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合は、対応するプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）のデフォルトパラメータを使用することができる。詳しくはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較に利用可能な他の数学的アルゴリズムの例としては、MyersおよびMiller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムは、例えばGENESTREAMネットワークサーバー（IGH Montpellier、フランス）またはISRECサーバーで利用可能なALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合は例えば、PAM120残基質量表を使用し、ギャップ長ペナルティ＝12、ギャップペナルティ＝4とすることができる。
　二つのアミノ酸配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスを使用し、ギャップ加重＝12、10、8、6、又は4、ギャップ長加重＝2、3、又は4として決定することができる。また、二つの塩基配列の同一性を、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムを用いて、ギャップ加重＝50、ギャップ長加重＝3として決定することができる。
　典型的には、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼ、即ち、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼが変異（上記K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tの中の一つ又は二以上の組合せによる）することによって、本発明の改変型酵素となる。上記の実質同一エステラーゼについては、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼが変異（上記K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tの中の一つ又は二以上の組合せによる）したものに更に変異を加えること、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼを産生するアシネトバクター・カルコアセティカス株と同種同属由来のエステラーゼ等、配列番号１のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるエステラーゼに対して同等の変異を加えること、又は当該変異によって得られるものに更に変異を加えること、によって得ることができる。ここでの「同等の変異」では、配列番号１のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列において、本発明における変異点（配列番号１のアミノ酸配列の7位、13位、107位、222位、229位又は235位）のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基が置換されることになる。尚、配列番号１のアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるエステラーゼの例として、アシネトバクター・ギロイエ（Acinetobacter guillouiae）に由来し、配列番号１５のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性９８％）、アシネトバクター・バウマニABNIH3（Acinetobacter baumannii ABNIH3）に由来し、配列番号１６のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性９７％）、アシネトバクター・セイフェルティ（Acinetobacter seifertii）に由来し、配列番号１７のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性９０％）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に由来し、配列番号１８のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８０％）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に由来し、配列番号１９のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８０％）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に由来し、配列番号２０のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８０％）、バークホルデリア・ユボネンシス（Burkholderia ubonensis）に由来し、配列番号２１のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８１％）、パラバークホルデリア・フェラリエ（Paraburkholderia ferrariae）に由来し、配列番号２２のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８１％）、バークホルデリア・シュードマルチボランス（Burkholderia pseudomultivorans）に由来し、配列番号２３のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８１％）、アシネトバクター sp. NBRC 110496（Acinetobacter sp. NBRC 110496）に由来し、配列番号２４のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８１％）、アシネトバクター・セイフェルティ（Acinetobacter seifertii）に由来し、配列番号２５のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性９０％）、アシネトバクター sp. NIPH809（Acinetobacter sp. NIPH809）に由来し、配列番号２６のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８０％）、シュードモナス・フルオレセンスA506（A506Pseudomonas fluorescens A506）に由来し、配列番号２７のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８０％）、シュードモナス sp. ABAC61（Pseudomonas sp. ABAC61）に由来し、配列番号２８のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性７９％）、シュードモナス・プチダIFO12996（Pseudomonas putida IFO12996）に由来し、配列番号２９のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性７６％）、シュードモナス・プチダMR2068（Pseudomonas putida MR2068）に由来し、配列番号３０のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性７６％）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）に由来し、配列番号３１のアミノ酸配列を有するエステラーゼ（アミノ酸配列の同一性８０％）、を挙げることができる。
　本明細書においてアミノ酸残基について使用する場合の用語「相当する」とは、比較されるタンパク質（酵素）間においてその機能の発揮に同等の貢献をしていることを意味する。例えば、基準エステラーゼのアミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸配列）に対して比較対象のアミノ酸配列を、一次構造（アミノ酸配列）の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べたときに（このときに必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい）、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて立体構造（三次元構造）同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。立体構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数の酵素の立体構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法を採用できる。変異対象酵素の立体構造情報は例えばProtein Data Bank（http://www.pdbj.org/index_j.html）より取得することができる。
　Ｘ線結晶構造解析によるタンパク質立体構造の決定方法の一例を以下に示す。
（１）タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度で安定な保存法として産業上の有用性もある。この場合、リガンドとして基質もしくはそのアナログ化合物を結合したタンパク質を結晶化すると良い。
（２）作製した結晶にＸ線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はＸ線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々ある。その場合、結晶を急激に－173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及してきた。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
（３）結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が未知の場合、分子置換法で構造決定することは不可能であり、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなＸ線散乱能のＸ線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を０に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善されるのである。また、非対称単位に複数の分子が含まれている場合、これらの分子の電子密度を平均化することにより位相が更に大幅に改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、MSI社（アメリカ）のQUANTA等のプログラムを用いて行われる。この後、MSI社のX-PLOR等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。目的のタンパク質に対して、類縁のタンパク質の結晶構造が既知の場合は、既知タンパク質の原子座標を用いて分子置換法により決定できる。分子置換と構造精密化はプログラム CNS_SOLVE ver.11などを用いて行うことができる。
２．改変型エステラーゼをコードする核酸等
　本発明の第２の局面は本発明の改変型酵素に関連する核酸を提供する。即ち、改変型酵素をコードする遺伝子、改変型酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、改変型酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。
　改変型酵素をコードする遺伝子は典型的には改変型酵素の調製に利用される。改変型酵素をコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的調製法によれば、より均質な状態の改変型酵素を得ることが可能である。また、当該方法は大量の改変型酵素を調製する場合にも好適な方法といえる。尚、改変型酵素をコードする遺伝子の用途は改変型酵素の調製に限られない。例えば、改変型酵素の作用機構の解明などを目的とした実験用のツールとして、或いは酵素の更なる改変体をデザイン又は作製するためのツールとして、当該核酸を利用することもできる。
　本明細書において「改変型酵素をコードする遺伝子」とは、それを発現させた場合に当該改変型酵素が得られる核酸のことをいい、当該改変型酵素のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する核酸は勿論のこと、そのような核酸にアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる核酸をも含む。また、コドンの縮重も考慮される。
　改変型酵素をコードする遺伝子の配列（塩基配列）の例を配列番号８～１３に示す。これらの配列は、下記の通り、後述の実施例に示した変異体をコードする。
　配列番号８：変異体１（K7P）
　配列番号９：変異体２（F13Y）
　配列番号１０：変異体３（V107M）
　配列番号１１：変異体４（L222M）
　配列番号１２：変異体５（V229I）
　配列番号１３：変異体６（S235T）
　本発明の酵素はシグナル配列を持たないため通常は菌体外に分泌されないが、菌体外に分泌させたい場合には、上記の配列（配列番号８～１３のいずれか）の5'末端側にシグナルペプチドをコードする配列（シグナル配列）を付加した遺伝子コンストラクトで宿主に導入しても良い。シグナル配列は宿主に応じて選択すればよい。目的とする変異体を発現可能なシグナル配列である限り、本発明に使用できる。利用可能なシグナル配列として、α-因子のシグナルペプチドをコードする配列（Protein Engineering, 1996, vol9, p.1055-1061）、α-因子受容体のシグナルペプチドをコードする配列、SUC2タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、PHO5タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、BGL2タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、AGA2タンパク質のシグナルペプチドをコードする配列、TorA（トリメチルアミンＮ－オキシドレダクターゼ）のシグナルペプチドをコードする配列、バチルス・サチルス由来のPhoD（ホスホエステラーゼ）のシグナルペプチドをコードする配列、バチルス・サチルス由来のLipA（エステラーゼ）のシグナルペプチドをコードする配列、アスペルギルス・オリゼ由来タカアミラーゼのシグナルペプチドをコードする配列（特開２００９－６０８０４号公報）、バチルス・アミロリケファシエンス由来のα－アミラーゼのシグナルペプチドをコードする配列（Eur. J. Biochem. 155, 577-581 (1986)）、バチルス・サチルス由来の中性プロテアーゼのシグナルペプチドをコードする配列（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Apr. 1995, p. 1610-1613 Vol. 61, No. 4）、Bacillus属細菌由来セルラーゼのシグナルペプチドをコードする配列（特開２００７－１３００１２号公報）を例示することができる。
　本発明の核酸は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法、化学合成などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。
　本発明の他の態様では、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列と比較した場合にそれがコードするタンパク質の機能は同等であるものの一部において塩基配列が相違する核酸（以下、「相同核酸」ともいう。また、相同核酸を規定する塩基配列を「相同塩基配列」ともいう）が提供される。相同核酸の例として、本発明の改変型酵素をコードする核酸の塩基配列を基準として1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、改変型酵素に特徴的な酵素活性（即ちエステラーゼ活性）を有するタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該核酸がコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば2～40塩基、好ましくは2～20塩基、より好ましくは2～10塩基である。
　相同核酸は、基準となる塩基配列に対して、例えば60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80％以上、より一層好ましくは85％以上、さらに好ましくは約90％以上、更に一層好ましくは95％以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する。
　以上のような相同核酸は例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやDNAリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）による変異の導入などによって得られる。また、紫外線照射など他の方法によっても相同核酸を得ることができる。
　本発明の他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸に関する。本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列に対して少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％同一な塩基配列を有する核酸を提供する。
　本発明の更に別の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列又はその相同塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する核酸に関する。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、10×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃～約50℃でインキュベーションし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃～約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
　本発明の更に他の態様は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列、或いはそれに相補的な塩基配列の一部を有する核酸（核酸断片）を提供する。このような核酸断片は、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸などを検出、同定、及び／又は増幅することなどに用いることができる。核酸断片は例えば、本発明の改変型酵素をコードする遺伝子の塩基配列において連続するヌクレオチド部分（例えば約10～約100塩基長、好ましくは約20～約100塩基長、更に好ましくは約30～約100塩基長）にハイブリダイズする部分を少なくとも含むように設計される。プローブとして利用される場合には核酸断片を標識化することができる。標識化には例えば、蛍光物質、酵素、放射性同位元素を用いることができる。
　本発明のさらに他の局面は、本発明の遺伝子（改変型酵素をコードする遺伝子）を含む組換えDNAに関する。本発明の組換えDNAは例えばベクターの形態で提供される。本明細書において用語「ベクター」は、それに挿入された核酸を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいう。
　使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはM13ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）、pET21等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
　本発明のベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や、発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
　本発明の核酸のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えDNA技術（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる、制限酵素及びDNAリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
　宿主細胞としては、取り扱いの容易さの点から、麹菌（例えばアスペルギルス・オリゼ）、バチルス属細菌（例えばバチルス・サチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミノリクファシエンス）、ブレビバチルス属細菌（例えばブレビバチルス・チョウシネンシス）、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）などの微生物を用いることができるが、組換えDNAが複製可能で且つ改変型酵素の遺伝子が発現可能な宿主細胞であれば利用可能である。好ましくは大腸菌（エシェリヒア・コリ）、出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）を用いることができる。アシネトバクター属微生物（例えばアシネトバクター・カルコアセティカスを宿主にすることもできる。また、大腸菌の例としてT7系プロモーターを利用する場合は大腸菌BL21(DE3)、そうでない場合は大腸菌JM109を挙げることができる。また、出芽酵母の例として出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22あるいは出芽酵母INVSc1（インビトロジェン社）を挙げることができる。
　本発明の他の局面は、本発明の組換えDNAを保有する微生物（即ち形質転換体）に関する。本発明の微生物は、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって得ることができる。例えば、塩化カルシウム法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー(J.Mol. Biol.)、第53巻、第159頁 (1970)）、ハナハン（Hanahan）法（ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジー、第166巻、第557頁 (1983)）、SEM法（ジーン（Gene)、第96巻、第23頁(1990)）、チャング（Chung）らの方法（プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ USA、第86巻、第2172頁(1989)）、リン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション(Potter,H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 7161-7165(1984))、リポフェクション(Felgner, P.L. et al.,  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,7413-7417(1984))等によって実施することができる。尚、本発明の微生物は、本発明の改変型酵素を生産することに利用することができる。
３．改変型エステラーゼを含む酵素剤
　本発明の改変型酵素は例えば酵素剤の形態で提供される。酵素剤は、有効成分（本発明の改変型酵素）の他、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含有していてもよい。賦形剤としてはデンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはエタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。
４．改変型エステラーゼの用途
　本発明の更なる局面は改変型酵素及び酵素剤の用途に関し、本発明の改変型酵素又は酵素剤を用いた各種反応やそれを利用した各種化合物の生産／製造方法等が提供される。具体的には、本発明の改変型酵素又は酵素剤は、（１）医薬品などに利用される有機化合物の製造、（２）ファインケミカル分野での利用が考えられるエステル化合物の製造、（３）ラクトン化合物の加水分解、等に利用可能である。（１）の例として、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（ACE阻害薬）の1つであるカプトプリルやアラセプリルの医薬中間体であるDAT（D-β-Acetylthioisobutyric acid）のDL-MATI（DL-β-acetylthioisobutyrate）のエナンチオ選択的加水分解よる生成（Jounal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 38 (2006) 163-170を参照）を挙げることができる。一方、（２）の例として、側鎖に様々な置換基を有した直鎖のエステル化合物（Methyl (R)-3-bromo-2-methylpropionate、Methyl cetraxate hydrochlorideなど）の製造（Appl Microbiol Biotechnol (2002) 60: 288-292を参照）が挙げられる。また、（３）の例として、アルドンラクトン（D-ガラクトノ-γ-ラクトン、L-マンノノ-γ-ラクトンなど）や芳香族ラクトン（3,4-ジヒドロクマリン、ホモゲンチジン酸γ-ラクトンなど）の分解（Eur. J. Biochem. 267, 3-10 (2000)を参照）が挙げられる。
５．改変型エステラーゼの調製法
　本発明の更なる局面は改変型酵素の調製法に関する。本発明の調製法の一態様では、本発明者らが取得に成功した改変型酵素を遺伝子工学的手法で調製する。この態様の場合、配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意する（ステップ(I)）。ここで、「特定のアミノ酸配列をコードする核酸」は、それを発現させた場合に当該アミノ酸配列を有するポリペプチドが得られる核酸であり、当該アミノ酸配列に対応する塩基配列からなる核酸は勿論のこと、そのような核酸に余分な配列（アミノ酸配列をコードする配列であっても、アミノ酸配列をコードしない配列であってもよい）が付加されていてもよい。また、コドンの縮重も考慮される。「配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸」は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって、単離された状態に調製することができる。ここで、配列番号２～７のアミノ酸配列はいずれも、アシネトバクター・カルコアセティカス由来エステラーゼのアミノ酸配列に変異を施したものである。従って、アシネトバクター・カルコアセティカス由来エステラーゼをコードする遺伝子に対して必要な変異を加えることによっても、配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸（遺伝子）を得ることができる。位置特異的塩基配列置換のための方法は当該技術分野において数多く知られており（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照）、その中から適切な方法を選択して用いることができる。位置特異的変異導入法として、位置特異的アミノ酸飽和変異法を採用することができる。位置特異的アミノ酸飽和変異法は、タンパクの立体構造を基に、求める機能の関与する位置を推定し、アミノ酸飽和変異を導入する「Semi-rational,semi-random」手法である（J.Mol.Biol.331,585-592(2003)）。例えば、Quick change（ストラタジーン社）等のキット、Overlap extention PCR(Nucleic Acid Res. 16,7351-7367(1988)）を用いて位置特異的アミノ酸飽和変異を導入することが可能である。PCRに用いるDNAポリメラーゼはTaqポリメラーゼ等を用いることができる。但し、KOD-PLUS-（東洋紡社）、Pfu turbo（ストラタジーン社）などの精度の高いDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
　ステップ（I)に続いて、用意した核酸を発現させる（ステップ(II)）。例えば、まず上記核酸を挿入した発現ベクターを用意し、これを用いて宿主細胞を形質転換する。
　次に、発現産物である改変型酵素が産生される条件下で形質転換体を培養する。形質転換体の培養は常法に従えばよい。培地に使用する炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
　一方、培養温度は30℃～40℃の範囲内（好ましくは33～37℃付近）で設定することができる。培養時間は、培養対象の形質転換体の生育特性や改変型酵素の産生特性などを考慮して設定することができる。培地のpHは、形質転換体が生育し且つ酵素が産生される範囲内に調製される。好ましくは培地のpHを6.0～9.0程度（好ましくはpH7.0付近）とする。
　続いて、発現産物（改変型酵素）を回収する（ステップ(III)）。培養後の菌体を含む培養液をそのまま、或いは濃縮、不純物の除去などを経た後に酵素溶液として利用することもできるが、一般的には培養液又は菌体より発現産物を一旦回収する。発現産物が分泌型タンパク質であれば培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、減圧濃縮、膜濃縮、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを利用した塩析、メタノールやエタノール又はアセトンなどによる分別沈殿法、透析、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過や吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー（例えば、セファデックス（Sephadex）ゲル（GEヘルスケアバイオサイエンス）などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B （GEヘルスケアバイオサイエンス）、オクチルセファロースCL-6B （GEヘルスケアバイオサイエンス）、CMセファロースCL-6B（GEヘルスケアバイオサイエンス））などを組み合わせて分離、精製を行ことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。他方、菌体内から回収する場合には、培養液をろ過、遠心処理等することによって菌体を採取し、次いで菌体を加圧処理、超音波処理、物理破砕処理などの機械的方法またはリゾチームなどによる酵素的方法で破壊した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより改変型酵素の精製品を得ることができる。
　上記のようにして得られた精製酵素を、例えば凍結乾燥や真空乾燥或いはスプレードライなどにより粉末化して提供することも可能である。その際、精製酵素を予めリン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液やGOODの緩衝液に溶解させておいてもよい。好ましくは、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液を使用することができる。尚、ここでGOODの緩衝液としてはPIPES、MES又はMOPSが挙げられる。
　通常は、以上のように適当な宿主－ベクター系を利用して遺伝子の発現～発現産物（改変型酵素）の回収を行うが、無細胞合成系を利用することにしてもよい。ここで、「無細胞合成系（無細胞転写系、無細胞転写／翻訳系）」とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（DNAやmRNA）からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成することをいう。無細胞合成系では一般に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。細胞抽出液には一般に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNAなどの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、この細胞抽出液に各種アミノ酸、ATP、GTPなどのエネルギー源、クレアチンリン酸など、タンパク質の合成に必要なその他の物質を添加する。勿論、タンパク質合成の際に、別途用意したリボソームや各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
　タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系の開発も報告されている（Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。この合成系では、バクテリアのタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をtRNAに結合させる２０種類のアミノアシルtRNA合成酵素、及びメチオニルtRNAホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をin vitroで再構成している。本発明ではこのような再構成した合成系を利用してもよい。
　用語「無細胞転写／翻訳系」は、無細胞タンパク質合成系、in vitro翻訳系又はin vitro転写／翻訳系と交換可能に使用される。in vitro翻訳系ではRNAが鋳型として用いられてタンパク質が合成される。鋳型RNAとしては全RNA、mRNA、in vitro転写産物などが使用される。他方のin vitro転写／翻訳系ではDNAが鋳型として用いられる。鋳型DNAはリボソーム結合領域を含むべきであって、また適切なターミネータ配列を含むことが好ましい。尚、in vitro転写／翻訳系では、転写反応及び翻訳反応が連続して進行するように各反応に必要な因子が添加された条件が設定される。
＜特性の向上に有効な変異点の探索＞
　アシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼ（配列番号１）の特性の向上を目指し、水素結合の強化、疎水性の強化、高密度化（パッキング性の向上）及びループの強化の観点から変異点（置換するアミノ酸残基）を選択し、15種類の変異体（改変型エステラーゼ）を設計した。設計した各変異体を以下の方法で作製し、その特性を評価した。尚、配列番号１のアミノ酸配列はアシネトバクター・カルコアセティカス由来のエステラーゼの成熟体（シグナルペプチドを含まない）である。
１．変異体（改変型エステラーゼ）の取得
（１）変異の導入及び形質転換
　各変異導入点へランダム変異を導入するため、エステラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミド（pET21（Esterase））を鋳型として、ランダムプライマーを用いてPCR（PrimeSTAR　GXL　DNA　Polymerase（タカラバイオ株式会社））を行った。PCR後、Dpn I（タカラバイオ株式会社）を用いた鋳型プラスミドの処理（37℃、3時間）、及びT4 Kinase （東洋紡株式会社）、Ligation High （東洋紡株式会社）を用いたライゲーション反応（16℃、一晩）をした後、E.coli BL21（DE3）に形質転換して、各変異導入点にランダム変異導入されたランダム変異株を取得した。
＜PCR条件＞
　反応液の組成：5×PrimeSTAR GXL Bufferを5 μl、dNTP Mixture（各2.5 mM）を2 μl、フォワードプライマーを0.5 μl、リバースプライマーを0.5 μl、鋳型を0.25 μl、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(タカラバイオ株式会社)を1μl（滅菌蒸留水で全量25μlに調整）
　反応条件：98℃で10秒、60℃で15秒、68℃で2分を15サイクル
（２）形質転換体の培養及び酵素液（菌体抽出液）の取得
　構築した各エステラーゼ遺伝子組換えE.coli発現菌株（宿主：E.coli BL21（DE3））を用いて、培養液（培養菌体）の取得を試みた。各エステラーゼ遺伝子組換えE.coli発現菌株の培養液（培養菌体）の取得は、2段階の培養で行った。まず、各エステラーゼ遺伝子組換えE.coli発現菌株をL Broth（invitrogen社）（Amp : 100 μg/mL） 5mLに接種し、振とう培養機にて16時間、培養（150rpm, 37℃）した後、Teriffic Broth（invitrogen社）（Amp : 100 μg/mL） 50mLに0.5 mLを植菌した。その後、200rpm、33℃の条件で48時間培養し、培養開始から24時間の時点で0.1 mM IPTGを培養液に添加することで酵素の発現を誘導した。培養液50mLを遠心分離（7,000g×10分, 4℃）した後、遠心上清を除去することで培養菌体を回収した。
　取得した各培養菌体を100mM リン酸緩衝液 （pH7.0） 25mLに懸濁した後、ビーズ（0.1mm）(安井機器) 10gを添加して、ビーズショッカー（2,500rpm, on: 60秒, off: 30秒, 10サイクル, 4℃）（安井機器）にて物理破砕した。物理破砕液を遠心分離（7,000g×10分,4℃）した後、遠心上清を回収し、菌体抽出液とした。
（３）精製酵素の取得
　菌体抽出液をフィルター濾過し、液量を20mLにメスアップした。次に、以下の手順で硫安沈殿（40～80％画分を回収）を行った。まず、40％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。遠心分離し、上清を回収後、80％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。再び遠心分離し、遠心沈殿を回収した。回収した沈殿を10mLの10mMリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁した。
　硫安沈殿後の酵素溶液を限外濾過により脱塩濃縮し、電導度を約2mS/cmまで下げた。続いて、以下の二段階のクロマトグラフィー（DEAE-セファロースカラムクロマトグラフィー、フェニル-セファロースカラムクロマトグラフィー）で精製した。尚、DEAE-セファロースカラムクロマトグラフィーで回収したフラクションに2MとなるようにNaClを添加し電導度を調整した後、フェニル-セファロースカラムクロマトグラフィーに供した。
(i) DEAE-セファロースカラムクロマトグラフィー
　使用カラム：Deae-sepharoseFF　1mL（GEヘルスケア）
　緩衝液：10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
　溶出：NaClのリニアグラジエント（0→0.3M）により目的酵素を溶出
　チャージ量：5mL（脱塩濃縮サンプル全量）
　流速：1mL/分
(ii) フェニル-セファロースカラムクロマトグラフィー
　使用カラム：Phenyl-HP　1mL（GEヘルスケア）
　緩衝液：10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
　溶出：NaClのリニアグラジエント（2M→0M）により目的酵素を溶出
　チャージ量：10mL（DEAE精製フラクション全量）
　流速：1mL/分
　フェニル-セファロースカラムクロマトグラフィーの溶出フラクションを回収し、精製酵素サンプルとした。
２．変異体の特性評価
＜活性測定法＞
　50mM リン酸緩衝液（pH7.0） 2.1 mL、5 mM 3,4-dihydrocoumarin (東京化成（TCI）)溶液（50mMリン酸緩衝液(pH7.0)（40% EtOH含）） 0.3mL、酵素溶液 0.6mLを混合し、反応させた。本測定法では、反応により生じる生成物（3－（2－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸）の吸光値変化をカイネティクス測定（Abs. 270nm, 30℃, 5分）することで、1分間に1nmolの生成物（3-（2-ヒドロキシフェニル）プロピオン酸）を生成する酵素量を1単位(U)と定義している。尚、本測定において正確な測定値が得られるΔODは、ΔOD＝0.01～0.05／2分(Abs. 270nm)の範囲であり、必要に応じて酵素溶液を50mM リン酸緩衝液 pH7.0にて希釈する。
（１）比活性の評価
　精製酵素サンプルを用いて比活性を評価した。各変異体の精製酵素の酵素活性を上記活性測定法で測定し、比活性を算出した。タンパク質濃度は波長280 nmでの吸光度を測定し、A280nmの吸光度が1.0のときのタンパク質濃度を1 mg/mlとして算出した。各変異体の比活性を図１に示す。変異体６（S235T）に比活性の向上が認められた。
（２）高温安定性の評価
　精製酵素サンプルを用いて高温安定性を評価した。まず、各変異体の精製酵素を熱処理（80℃、30分間）した。熱処理後のサンプルと熱処理前（未処理）のサンプルを、希釈液（50mM リン酸緩衝液(pH7.0)）で適当な濃度に希釈後、上記活性測定法で酵素活性を測定した。測定値（酵素活性）から残存活性を以下の通り算出し、高温安定性を評価した。
　活性残存率＝（熱処理後の酵素活性／熱処理前の酵素活性）×100（％）
　評価結果を図２に示す。４種類の変異体（変異体１（K7P）、変異体２（F13Y）、変異体４（L222M）、変異体５（V229I））に高温安定性の向上が認められた。特に、変異体１（K7P）、変異体４（L222M）、変異体５（V229I）の高温安定性は高い。
（３）高温反応性の評価
　精製酵素サンプルを用いて高温反応性を評価した。まず、各変異体の精製酵素を希釈液（50mM リン酸緩衝液(pH7.0)）で適当な濃度に希釈後、各温度（30℃、60℃）で酵素活性を測定した。高温反応性は、以下の計算式で算出される相対活性（30℃での酵素活性に対する高温（60℃）での酵素活性の比率）で評価した。
　相対活性＝（高温（60℃）での酵素活性／30℃での酵素活性）×100（％）
　評価結果を図３に示す。２種類の変異体（変異体５（V229I）、変異体６（S235T））に高温反応性の向上が認められた。特に、変異体５（V229I）の高温反応性は高い。
（４）pH安定性の評価
　精製酵素サンプルを用いてpH安定性を評価した。まず、各変異体の精製酵素を低pH処理（pH4.0、30分間）した。処理後のサンプルと処理前（未処理）のサンプルを、希釈液（50mM リン酸緩衝液(pH7.0)）で適当な濃度に希釈後、上記活性測定法で酵素活性を測定した。測定値（酵素活性）から残存活性を以下の通り算出し、高温安定性を評価した。
　活性残存率＝（低pH処理後の酵素活性／処理前の酵素活性）×100（％）
　評価結果を図４に示す。７種類の変異体（変異体２（F13Y）、変異体３（V107M）、変異体４（L222M）、変異体５（V229I）、変異体６（S235T））にpH安定性の向上が認められた。特に変異体２（F13Y）、変異体３（V107M）、変異体４（L222M）、変異体５（V229I）のpH安定性は高い。
　以上の通り、特性が向上した8種類の変異体の取得に成功した。各変異体のアミノ酸配列を以下に示す。
　変異体１（K7P）：配列番号２
　変異体２（F13Y）：配列番号３
　変異体３（V107M）：配列番号４
　変異体４（L222M）：配列番号５
　変異体５（V229I）：配列番号６
　変異体６（S235T）：配列番号７
　本発明の改変型エステラーゼでは特性（比活性、高温反応性、高温安定性、pH安定性）が向上している。従って、その用途ないし適用範囲は広く、また、反応効率の向上を期待できる。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (13)

  1. 　配列番号１のアミノ酸配列において、K7P、F13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tからなる群より選択される一又は二以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と91%以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して比活性、高温安定性、高温反応性及びpH安定性からなる群より選択される一以上の特性が向上した改変型エステラーゼ。
  2. 　改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がS235Tであり、比活性が向上している、請求項１に記載の改変型エステラーゼ。
  3. 　改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がK7P、F13Y、L222M又はV229Iであり、高温安定性が向上している、請求項１に記載の改変型エステラーゼ。
  4. 　改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がV229I又はS235Tであり、高温反応性が向上している、請求項１に記載の改変型エステラーゼ。
  5. 　改変型エステラーゼのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸置換がF13Y、V107M、L222M、V229I及びS235Tであり、pH安定性が向上している、請求項１に記載の改変型エステラーゼ。
  6. 　配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と91%以上の同一性を示すアミノ酸配列であり（但し、同一性の基準が配列番号２のアミノ酸配列の場合は7位プロリン以外の位置、同一性の基準が配列番号３のアミノ酸配列の場合は13位チロシン以外の位置、同一性の基準が配列番号４のアミノ酸配列の場合は107位メチオニン以外の位置、同一性の基準が配列番号５のアミノ酸配列の場合は222位メチオニン以外の位置、同一性の基準が配列番号６のアミノ酸配列の場合は229位イソロイシン以外の位置、同一性の基準が配列番号７のアミノ酸配列の場合は235位トレオニン以外の位置、においてアミノ酸配列の相違は生じている）、配列番号１のアミノ酸配列からなるエステラーゼに比較して比活性、高温安定性、高温反応性及びpH安定性からなる群より選択される一以上の特性が向上した改変型エステラーゼ。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼをコードする遺伝子。
  8. 　配列番号８～１３のいずれかの塩基配列を含む、請求項７に記載の遺伝子。
  9. 　請求項７又は８に記載の遺伝子を含む組換えDNA。
  10. 　請求項９に記載の組換えDNAを保有する微生物。
  11. 　宿主が、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミノリクファシエンス、ブレビバチルス・チョウシネンシスである、請求項１０に記載の微生物。
  12. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の改変型エステラーゼを含む酵素剤。
  13. 　以下のステップ(I)～(III)を含む、改変型エステラーゼの調製法：
    　(I)配列番号２～７のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸を用意するステップ；
    　(II)前記核酸を発現させるステップ、及び
    　(III)発現産物を回収するステップ。
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