JP2000245455A - 新規なエステル分解酵素 - Google Patents
新規なエステル分解酵素Info
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Abstract
の中間原料に必要な光学活性な物質の製造等に有用な酵
素を提供すること。 【解決手段】 アシネトバクター属に属する微生物を培
養し、トリベンゾイルグリセロール分解の有無でスクリ
ーニングして、目的の酵素を得る。
Description
解酵素に関する。
く分布する酵素であり、エステル結合を分解する。中で
も、リパーゼはトリグリセリドをモノ−及びジ−グリセ
リドと脂肪酸とに分解するだけでなく、非水溶媒系でエ
ステル交換反応、エステル化反応等を触媒する。非水溶
媒系におけるこのような反応は有機合成には非常に有用
であることから、エステル分解酵素(特にリパーゼ)が
種々の工業生産プロセスに用いられるようになってきて
おり(Andreeら、J. Appl. Biochem. 2: 218-219(1980)
及びBlokingら、Trends Biotechnol. 9: 360-363 (199
1))、パーム油のエステル交換反応によるカカオ代用脂
の製造に利用されている。
基質特異性を利用して、油脂あるいは種々の薬剤を改変
し、新たな付加価値を持たせる研究も進展しつつある。
例えば、脂質は人体内では、2−モノグリセリドの状態
で吸収されることから、トリグリセリドの2位に一定の
機能を有する置換基を導入できれば、パーム油等の油脂
を機能性食品に変換することができる。
ーゼ)はエステル結合近傍の官能基により著しく影響を
受け、官能基が嵩高い場合には加水分解されにくいとい
う問題がある。
テルに対しても特異性の高いエステル分解酵素(リパー
ゼ)が求められている。
い官能基を有するエステルに対しても特異性の高いエス
テル分解(リパーゼ)活性を有する酵素を提供すること
を目的とする。
を有する酵素を提供することにより、達成される。すな
わち、本発明のエステル分解酵素は、トリベンゾイルグ
リセロールを加水分解し得る。
酵素は、以下の性質: 基質特異性:トリベンゾイルグリセロールを加水分解す
る、 分子量 :変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±1kDa
及び非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±1kDa、 至適pH :約8.0、 pH安定性:約6.0〜8.0、 至適温度 :約45℃、及び 熱安定性 :35℃以下、 という性質を有する。
−ニトロフェニルベンゾエートに対する加水分解活性が
p−ニトロフェニルアセテートに対する加水分解活性よ
りも、少なくとも3倍以上高いという性質を有してい
る。
クター(Acinetobacter)属に属する微生物から得られ
る。
ル結合近傍で嵩高い官能基を有する化合物の合成、新機
能付与等の用途に用いられる。
施例で詳しく記載するが、まず、嵩高い基質、例えば、
オレイルベンゾエート(以下、OBという)を唯一の炭
素源として生育する微生物を選択し、ついで、トリベン
ゾイルグリセロール(以下、TBGという)を分解し得
るか否かをスクリーニングすることにより得られる。
(以下、本酵素ということがある)を生産する微生物と
しては、アシネトバクター(Acinetobacter)属に属す
る微生物が挙げられ、例えば、本発明者等が単離した、
Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus KM1
09株(工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、
寄託番号がFERM P−17224である)(以下、単にK
M109株ということがある)が、本酵素を生産する。
当業者が用いる適切な方法を組合せて得ることができ
る。アシネトバクター属の微生物を用いて取得する例を
挙げると、アシネトバクター属に属する微生物をNB培
地(肉エキス 1%、ポリペプトン 1%、NaCl 0.2
%)あるいは、LB培地(イーストエキス 0.5%、バ
クトトリプトン 1.0%、NaCl 1%)等の炭素源、窒
素源、各種ミネラル等を含む培地で培養する(ただし、
マルト培地では活性が低いので、使用しない方がよ
い)。培養に際して、OBと界面活性剤とを添加してお
くと、活性の誘導及び活性の向上が図れる。
間)培養後、菌体を遠心分離して除き、例えば、上清に
イソプロパノールを最終濃度60%となるように加えて、
粗酵素を回収し、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
交換樹脂処理、HPLC処理、限外濾過による濃縮、透析等
を単独でもしくは組合せて、本発明の酵素が精製され
る。
本発明はこの実施例に限定されない。
テート(pNPA)、p−ニトロフェニルカプロエート
(pNPC)、p−ニトロフェニルベンゾエート(pN
PB)、オレイルベンゾエート(OB)、トリベンゾイ
ルグリセロール(TBG)である。pNPAは、東京化
成工業(株)から購入し、pNPCは東洋紡(株)から
購入した。その他の基質は、以下のようにして合成し
た。
4.7g(Mw.139.11、0.0338mol)、ピリジン5.0ml(0.061
8mol)、4‐ジメチルアミノピリジン0.21g(Mw.140.5
7、0.00149 mol)および溶媒としてヘキサン150 ml、ベ
ンゼン50 mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイ
ル5.0 g(Mw.140.57、0.0356mol)を滴下した。滴下終
了から2時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応
させた。反応終了後、TLC 上で展開後(ヘキサン:
酢酸エチル=20:1)、UV吸収で生成物の確認し、生
成物は1H−NMR(HITACHI R-24B)、IR(HORIBA
FT-210-IR)で、その構造を確認した。
(Mw.268.48、0.162mol)、トリエチルアミン16.4g(M
w.101.19、0.162mol)、4−ジメチルアミノピリジン0.
59g(Mw.122.17、0.0048mol)および溶媒としてヘキサ
ン300mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル25.
0g(Mw.140.57、0.178mol)を滴下した。滴下終了から
2時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応させ
た。反応終了後、シリカゲル300gを用いたクロマトグ
ラフィーにより、ヘキサン8Lで溶出して精製した。生
成物の純度はTLC上で展開後(ヘキサン:酢酸エチル
=9.1)、UV吸収(San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UV
G-54)、KMnO4発色で確認し、生成物は1H-NMR(H
ITACHI R-24B)、IR(HORIBA FT-210-IR)で、その構造
を確認した。
2.07、0.0237mol)、4−ジメチルアミノピリジン2g
(Mw.122.17、0.0163mol)および溶媒としてジクロロメ
タン:ピリジン=1:1の400mlに氷点下、よく攪拌し
ながら塩化ベンゾイル10g(Mw.140.57、0.0711 mol)
を滴下した。滴下終了後、徐々に室温に戻し、一晩反応
させた。反応終了後、酢酸エチルに溶かし、ヘキサンを
加え室温で再結晶を行い精製した。生成物の純度はTL
C上で展開後(ヘキサン:酢酸エチル=9:1)、UV
吸収(San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UVG-50)で確認
し、生成物は1H-NMR(HITACHI R-24B)、IR(HORIBA F
T-210-IR)で、その構造を確認した。
ン酸カリウム(KPB、pH6.5)、2.5mM p−ニトロフェ
ニルエステル、5%アセトニトリル、酵素を含む3mlの
反応液を、予め、37℃に加温しておき、これにドライア
セトニトリルに溶解したp−ニトロフェニルエステル
(50mM)150μ1を加えることによって反応を開始し
た。反応は、エタノールを3ml加えて停止した。反応に
より生成したp−ニトロフェノール量を、400nmにお
ける吸光度(ε400nm=11,670)から求めた。1分
間に1μmolのp−ニトロフェノールを生成する酵素量
を1ユニットと定義した。
ング培地として、0.5%(NH4)2SO4、0.1%KH2P
O4、0.05%MgSO4、0.5%NaCl、及び1.0%OBを含む
培地(pH7.2)を用いた。固形一次スクリーニング培地
は、上記組成に寒天を1.5%添加したものである。な
お、OBは、植菌時に加えた。
リーニング培地に0.2% β‐サイクロデキストリン(日
本食品加工株式会社)を加え、よく攪拌することによっ
てOBを乳化させたものを用いた。固形二次スクリーニ
ング培地は、上記組成に寒天を1.5%添加したものであ
る。
土壌・水サンプルを、試験管中で一次スクリーニング培
地(液体:3ml)にて30℃、48時間集積培養を行った。
培地が白濁したものは、その1%を2度、同じ培地に植
え継いだ後、固形NB培地(NB培地に1.5%寒天を添
加したもの)上にて30℃、24時間培養し、シングルコロ
ニーを形成させた。シングルコロニーとして得られた菌
株は、固形スクリーニング培地上で30℃、24時間培養
し、その成育を確認した。成育の認められた菌株につい
ては、LB培地(3ml)で30℃、8時間培養し、培養液
を20%グリセロール溶液としたのち、使用まで−80℃で
保存した。
形二次スクリーニング培地上に植菌し、30℃、7日間培
養した。培養2日目での生育状態と、7日目でのOBを
分解することによって生じるクリアゾーンの形成能を見
た。
0ml容坂口フラスコを用いてOB0.5%を含むLB培地
(50ml)で30℃、120s.p.m,46時間培養し、遠心分離
(5,500×g、10分、4℃)により、菌体と培養上清
を得た。菌体は、1mM MgCl2を含むKPB(50mM、pH6.
5)に懸濁後、30秒×2回超音波(海上電機(株)、428
0型振動子)で破砕した。これを、再度遠心分離(12,00
0×g、20分、4℃)して破砕菌体を取り除き、細胞抽
出液を得た。pNPBを基質として、この細胞抽出液と
培養上清液の加水分解活性の測定をおこなった。
高い活性を示した株を選択し、さらに、pNPA、pN
PBおよびOBを基質としてスクリーニングした。この
なかから、pNPBおよびpNPAに対して高い活性を
有する6株(KM016、KM069、KM083、KM109、K
M252、およびKM264)が得られた。表1に結果を示
す。
性よりも3倍以上も高く、そして、唯一トリベンゾイル
グリセロールを分解した。この株が生産するエステル分
解酵素は、嵩高い基質に対して作用できると考えられた
ので、以下、まず、この株を同定し、エステル分解酵素
を単離精製した。
質を以下に示す。
ネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter calc
oaceticus subsp. antiratus)と同定された。この株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る(寄託番号FERM P−17224)
株をLB培地6mlに植菌し、30℃、120s.p.m.で4時間
培養した。得られた培養液5mlを、同じLB培地500ml
に加え、30℃、120s.p.m.、8時間培養し、前培養液を
得た。LB培地40Lを含む100L容ジャーファーメンタ
ー((株)丸菱バイオエンジ、MPF型)に、前培養液
を400ml添加して、200rpm、1vvm、30℃で、40時間、培
養した。
冷却し、混合塩(CaCl2:Na2HPO4=1:2)を1%
(W/V〉となるように加え、よく攪拌した。菌体および
生じた不溶物は、連続遠心分離(15,000rpm:関西遠心
分離機製作所、S型超高速遠心分離機)で取り除き、培
養上清液を得た。
ル(分子量カットオフ 6,000、旭化成工業株式会社、ラ
ボモジュールSIP 1013)を用いて3.5Lまで濃縮し、ド
ライアイスで−20℃にまで冷却したイソプロパノール
を、最終濃度30%となるように加え、タンパク質を不溶
化させた後、遠心分離(7,000×g、20分、4℃)によ
り除いた。上清液に対し、さらに同様のイソプロパノー
ルを最終濃度60%となるように加え、タンパク質を不溶
化させ、遠心分離(12,000×gm、20分、4℃)により
回収し、−80℃にて凍結後、凍結乾燥(Refrigeration
for Science Inc.、RFS 200B)により残留イソプロパノ
ール、水分を除去し、粗酵素粉末を得て、以下の精製に
用いた。以下の精製は、4℃で行った。
0.1%含む50mMリン酸バッファー(KPB、pH6.5)100
ml に溶解した。次に、同バッファーであらかじめ平衡
化させたセファローズCL−68ゲル濾過クロマトグラフ
ィー(50×630mm:Pharmacia LKB Biotechnology ln
c.)にアプライし、同バッファーで溶出し、18mlず
つ、80フラクションに分画し、pNPA及びpNPBを
用いて加水分解活性を測定し、pNPB活性を有する画
分を回収、濃縮(分子量カット20、000、東洋濾紙株式
会社、UP-20)し、ノイゲンHCを0.1%含む10mM トリ
ス−塩酸(pH8.0)に対し、透析をおこなった。
イオン交換クロマトグラフィー(25×90mM、Pharmacia
Biotechnology inc.)に吸着させ、バッファー中のNaC
lの0〜0.5Mの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出
し、5mlずつ60フラクションに分画した。溶出画分のp
NPA、pNPBに対する加水分解活性を測定し、pN
PBに対する活性が認められる画分を回収・濃縮した。
KPB(pH6.5)で予め平衡化させたG2000SWXL(7.8×300
mm、東ソー株式会社)を用いた高速液体ゲル濾過クロ
マトグラフィー(日本分光株式会社、TRI ROTOR-V)に
アプライし、同バッファーにより0.5ml/分で溶出し
た。タンパク質は280nmにおける吸光度として検出し
た(日本分光株式会社、UVIDEC-100-V)。11〜33分の保
持時間のものを30秒毎に分取し、pNPA、pNPBを
基質として加水分解活性を測定し、pNPBに対する活
性が認められる画分を回収し、10mMトリス塩酸(pH8.
0)に対し、透析した。
C1.6/5(1.6×50mm)を用いたSMARTTMシス
テム(Pharmacia LKB Biotechnology lnc.)に吸着さ
せ、バッファー中の NaCl濃度を0〜0.125Mおよび0.12
5M〜0.5Mの二段階の直線濃度勾配により酵素を溶出し
た。タンパク質は280nm、254nmの吸光度として検出
した。15〜22分の保持時間の画分を15秒ごとに集め、p
NPBによる加水分解活性測定を行い、活性画分を集め
た。
(第一化学薬品株式会社、マルチゲル 10/20)を用いた
SDS-PAGEによって展開し、銀染色キット(和光純薬株式
会社、Silver stain II Kit Wako)を用いてプロトコル
に従い、染色・検出した。SDS-PAGEでは、単一の蛋白質
にまで精製されていた。以上の精製工程により、精製酵
素0.03mgが回収された。なお、以下にのべる酵素の特性
の決定には、0.71unit/mlの酵素を用いた。
PAGEで測定した。キャリブレーションの結果を図1に示
す。なお、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼ
b:分子量94,000、ウシ血清アルブミン:分子量67,00
0、オバルブミン:分子量43,000、及び、carbonic anhy
drase:分子量30,000を用いた。
分子量は、62kDa±1kDaであった。
子量測定 精製酵素の分子量を、Superdex 75 PC 3.2/30を用いる
SMARTTMシステムで測定した。溶出は、200mM N
aClを含む50mM トリス塩酸(pH8.0)を用いて50μl/
分で行い、280nm、254nmにおける吸光度として検出
した。マーカータンパク質としては、アルブミン:分子
量65,000、オバルブミン:分子量46,800、キモトリプシ
ノーゲンA:分子量20,600、及び、リボヌクレアーゼ
A:分子量15,700を用いた。結果を図2に示す。
ロマトグラフィーで、精製酵素の分子量は、50±1kDa
であると推定された、ゲル濾過クロマトグラフィーによ
る分子量がSDS-PAGEより若干低いが、これは、精製酵素
がカラム担体と相互作用した結果、溶出位置にずれが生
じたためと考えられる。
酸バッファー(pH3〜6)465μlを加え、これにpN
PB(50mM)25μlを加えて反応を開始し、37℃、10分、
反応を行った。500μlのエタノールを加えて反応を停止
し、14,000rpm、5分の遠心分離を行い、その上清10μl
をHPLCでの分析に供した。分解活性は、アセトニトリ
ル:酢酸アンモニウム溶液(50mM、pH5.5)(1:1)を展
開溶媒として使用し、吸光度303nmで検出されるp-ニト
ロフェノールの量を測定した。検量線はp-ニトロフェノ
ールを用いて作製した。pH8.0付近で最大の分解活性が
測定された。この結果は、至適pHが約8.0であることを
示している。
量の酵素溶液を加えてpHを変化させ、30分間 4℃で保
持後、37℃において、pNPB加水分解活性を測定し、
pH安定性を測定した。結果を図3に示す。本酵素は、
pH6.0〜8.0の間で、安定である。
pH7.0でpNPB加水分解活性を測定した。図4に、37
℃での活性を1とした相対活性を示す。この結果から、
至適反応温度は約45℃とした。
を30分間処理し、4℃に冷却後、直ちに37℃において
pNPB加水分解活性を測定した。4℃で処理した酵素
活性を1として、各処理温度における相対活性を図5に
示す。35℃までの温度では、ほぼコントロールの4℃と
同等の活性を保持していたが、それ以上の温度では次第
に失活し、50℃で処理した酵素は、40%しか残存してい
なかった。本酵素は35℃以下の温度では安定であると言
える。
の酵素と比較した。比較した酵素は、リパーゼOF(名
糖産業株式会社:Candida cylindrace由来)、リパー
ゼLP-051-1S(東洋醸造株式会社:Pseudomonas sp由
来)、ノボザイム435(ノボノルディスク工業:Candida
antractica由来)、リポプロテインリパーゼ(タイプ
A)(東洋紡株式会社:Pseudomonas sp由来)であ
る。結果を表2に示す。
セロール分解活性を有しており、さらに、pNPB対し
て、高い特異性を有していることが判明した。
に有用であり、医薬品の中間原料に必要な光学活性な物
質の製造等に有用であると考えられる。
Claims (4)
- 【請求項1】 トリベンゾイルグリセロールを加水分解
するエステル分解酵素。 - 【請求項2】 以下の性質: 基質特異性:トリベンゾイルグリセロールを加水分解す
る、 分子量 :変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±1kDa
及び非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±1kDa 至適pH :約8.0、 pH安定性:約6.0〜8.0、 至適温度 :約45℃、及び 熱安定性 :35℃以下、 を有する、エステル分解酵素。 - 【請求項3】 さらに、p−ニトロフェニルベンゾエー
トに対する加水分解活性がp−ニトロフェニルアセテー
トに対する加水分解活性よりも、少なくとも3倍以上高
い、請求項1または2に記載のエステル分解酵素。 - 【請求項4】 アシネトバクター属に属する微生物を培
養して得られる、請求項1ないし3いずれかの項に記載
のエステル分解酵素。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104762276A (zh) * | 2014-01-08 | 2015-07-08 | 中国科学院微生物研究所 | 酯酶蛋白及其编码基因以及它们的应用 |
WO2019211969A1 (ja) * | 2018-05-02 | 2019-11-07 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
CN113433085A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-09-24 | 四川新华西乳业有限公司 | 一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用 |
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1999
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CN112055751A (zh) * | 2018-05-02 | 2020-12-08 | 天野酶制品株式会社 | 修饰型酯酶和其用途 |
JPWO2019211969A1 (ja) * | 2018-05-02 | 2021-05-13 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
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CN113433085A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-09-24 | 四川新华西乳业有限公司 | 一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用 |
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