JP2000245455A - 新規なエステル分解酵素 - Google Patents
新規なエステル分解酵素Info
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- JP2000245455A JP2000245455A JP11053822A JP5382299A JP2000245455A JP 2000245455 A JP2000245455 A JP 2000245455A JP 11053822 A JP11053822 A JP 11053822A JP 5382299 A JP5382299 A JP 5382299A JP 2000245455 A JP2000245455 A JP 2000245455A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 嵩高い基質の加水分解に有用であり、医薬品
の中間原料に必要な光学活性な物質の製造等に有用な酵
素を提供すること。 【解決手段】 アシネトバクター属に属する微生物を培
養し、トリベンゾイルグリセロール分解の有無でスクリ
ーニングして、目的の酵素を得る。
の中間原料に必要な光学活性な物質の製造等に有用な酵
素を提供すること。 【解決手段】 アシネトバクター属に属する微生物を培
養し、トリベンゾイルグリセロール分解の有無でスクリ
ーニングして、目的の酵素を得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なエステル分
解酵素に関する。
解酵素に関する。
【０００２】
【従来の技術】エステル分解酵素は、種々の微生物に広
く分布する酵素であり、エステル結合を分解する。中で
も、リパーゼはトリグリセリドをモノ−及びジ−グリセ
リドと脂肪酸とに分解するだけでなく、非水溶媒系でエ
ステル交換反応、エステル化反応等を触媒する。非水溶
媒系におけるこのような反応は有機合成には非常に有用
であることから、エステル分解酵素（特にリパーゼ）が
種々の工業生産プロセスに用いられるようになってきて
おり（Andreeら、J. Appl. Biochem. 2: 218-219(1980)
及びBlokingら、Trends Biotechnol. 9: 360-363 (199
1)）、パーム油のエステル交換反応によるカカオ代用脂
の製造に利用されている。
く分布する酵素であり、エステル結合を分解する。中で
も、リパーゼはトリグリセリドをモノ−及びジ−グリセ
リドと脂肪酸とに分解するだけでなく、非水溶媒系でエ
ステル交換反応、エステル化反応等を触媒する。非水溶
媒系におけるこのような反応は有機合成には非常に有用
であることから、エステル分解酵素（特にリパーゼ）が
種々の工業生産プロセスに用いられるようになってきて
おり（Andreeら、J. Appl. Biochem. 2: 218-219(1980)
及びBlokingら、Trends Biotechnol. 9: 360-363 (199
1)）、パーム油のエステル交換反応によるカカオ代用脂
の製造に利用されている。
【０００３】他方で、エステル分解酵素（リパーゼ）の
基質特異性を利用して、油脂あるいは種々の薬剤を改変
し、新たな付加価値を持たせる研究も進展しつつある。
例えば、脂質は人体内では、２−モノグリセリドの状態
で吸収されることから、トリグリセリドの２位に一定の
機能を有する置換基を導入できれば、パーム油等の油脂
を機能性食品に変換することができる。
基質特異性を利用して、油脂あるいは種々の薬剤を改変
し、新たな付加価値を持たせる研究も進展しつつある。
例えば、脂質は人体内では、２−モノグリセリドの状態
で吸収されることから、トリグリセリドの２位に一定の
機能を有する置換基を導入できれば、パーム油等の油脂
を機能性食品に変換することができる。
【０００４】しかし、一般に、エステル分解酵素（リパ
ーゼ）はエステル結合近傍の官能基により著しく影響を
受け、官能基が嵩高い場合には加水分解されにくいとい
う問題がある。
ーゼ）はエステル結合近傍の官能基により著しく影響を
受け、官能基が嵩高い場合には加水分解されにくいとい
う問題がある。
【０００５】そこで、近傍に嵩高い官能基を有するエス
テルに対しても特異性の高いエステル分解酵素（リパー
ゼ）が求められている。
テルに対しても特異性の高いエステル分解酵素（リパー
ゼ）が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、近傍に嵩高
い官能基を有するエステルに対しても特異性の高いエス
テル分解（リパーゼ）活性を有する酵素を提供すること
を目的とする。
い官能基を有するエステルに対しても特異性の高いエス
テル分解（リパーゼ）活性を有する酵素を提供すること
を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この目的は、以下の性質
を有する酵素を提供することにより、達成される。すな
わち、本発明のエステル分解酵素は、トリベンゾイルグ
リセロールを加水分解し得る。
を有する酵素を提供することにより、達成される。すな
わち、本発明のエステル分解酵素は、トリベンゾイルグ
リセロールを加水分解し得る。
【０００８】好ましい態様では、本発明のエステル分解
酵素は、以下の性質： 基質特異性：トリベンゾイルグリセロールを加水分解す
る、 分子量 ：変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±１kDa
及び非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±１kDa、 至適ｐH ：約8.0、 ｐH安定性：約6.0〜8.0、 至適温度 ：約45℃、及び 熱安定性 ：35℃以下、 という性質を有する。
酵素は、以下の性質： 基質特異性：トリベンゾイルグリセロールを加水分解す
る、 分子量 ：変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±１kDa
及び非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±１kDa、 至適ｐH ：約8.0、 ｐH安定性：約6.0〜8.0、 至適温度 ：約45℃、及び 熱安定性 ：35℃以下、 という性質を有する。
【０００９】本発明のエステル分解酵素は、さらに、ｐ
−ニトロフェニルベンゾエートに対する加水分解活性が
ｐ−ニトロフェニルアセテートに対する加水分解活性よ
りも、少なくとも３倍以上高いという性質を有してい
る。
−ニトロフェニルベンゾエートに対する加水分解活性が
ｐ−ニトロフェニルアセテートに対する加水分解活性よ
りも、少なくとも３倍以上高いという性質を有してい
る。
【００１０】好ましくは、本発明の酵素は、アシネトバ
クター（Acinetobacter）属に属する微生物から得られ
る。
クター（Acinetobacter）属に属する微生物から得られ
る。
【００１１】上記性質を有する本発明の酵素は、エステ
ル結合近傍で嵩高い官能基を有する化合物の合成、新機
能付与等の用途に用いられる。
ル結合近傍で嵩高い官能基を有する化合物の合成、新機
能付与等の用途に用いられる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明のエステル分解酵素は、実
施例で詳しく記載するが、まず、嵩高い基質、例えば、
オレイルベンゾエート（以下、ＯＢという）を唯一の炭
素源として生育する微生物を選択し、ついで、トリベン
ゾイルグリセロール（以下、ＴＢＧという）を分解し得
るか否かをスクリーニングすることにより得られる。
施例で詳しく記載するが、まず、嵩高い基質、例えば、
オレイルベンゾエート（以下、ＯＢという）を唯一の炭
素源として生育する微生物を選択し、ついで、トリベン
ゾイルグリセロール（以下、ＴＢＧという）を分解し得
るか否かをスクリーニングすることにより得られる。
【００１３】ＴＢＧ分解活性を有するエステル分解酵素
（以下、本酵素ということがある）を生産する微生物と
しては、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属す
る微生物が挙げられ、例えば、本発明者等が単離した、
Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus KM1
09株（工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、
寄託番号がＦＥＲＭ Ｐ−17224である）（以下、単にK
M109株ということがある）が、本酵素を生産する。
（以下、本酵素ということがある）を生産する微生物と
しては、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属す
る微生物が挙げられ、例えば、本発明者等が単離した、
Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus KM1
09株（工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、
寄託番号がＦＥＲＭ Ｐ−17224である）（以下、単にK
M109株ということがある）が、本酵素を生産する。
【００１４】本酵素は、本酵素を生産する微生物から、
当業者が用いる適切な方法を組合せて得ることができ
る。アシネトバクター属の微生物を用いて取得する例を
挙げると、アシネトバクター属に属する微生物をＮＢ培
地（肉エキス １％、ポリペプトン １％、NaCl 0.2
％）あるいは、ＬＢ培地（イーストエキス 0.5％、バ
クトトリプトン 1.0％、NaCl １％）等の炭素源、窒
素源、各種ミネラル等を含む培地で培養する（ただし、
マルト培地では活性が低いので、使用しない方がよ
い）。培養に際して、ＯＢと界面活性剤とを添加してお
くと、活性の誘導及び活性の向上が図れる。
当業者が用いる適切な方法を組合せて得ることができ
る。アシネトバクター属の微生物を用いて取得する例を
挙げると、アシネトバクター属に属する微生物をＮＢ培
地（肉エキス １％、ポリペプトン １％、NaCl 0.2
％）あるいは、ＬＢ培地（イーストエキス 0.5％、バ
クトトリプトン 1.0％、NaCl １％）等の炭素源、窒
素源、各種ミネラル等を含む培地で培養する（ただし、
マルト培地では活性が低いので、使用しない方がよ
い）。培養に際して、ＯＢと界面活性剤とを添加してお
くと、活性の誘導及び活性の向上が図れる。
【００１５】適切な温度と時間（例えば、30℃、42時
間）培養後、菌体を遠心分離して除き、例えば、上清に
イソプロパノールを最終濃度60％となるように加えて、
粗酵素を回収し、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
交換樹脂処理、HPLC処理、限外濾過による濃縮、透析等
を単独でもしくは組合せて、本発明の酵素が精製され
る。
間）培養後、菌体を遠心分離して除き、例えば、上清に
イソプロパノールを最終濃度60％となるように加えて、
粗酵素を回収し、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン
交換樹脂処理、HPLC処理、限外濾過による濃縮、透析等
を単独でもしくは組合せて、本発明の酵素が精製され
る。
【００１６】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明はこの実施例に限定されない。
本発明はこの実施例に限定されない。
【００１７】Ａ：基質及び基質の合成 本発明に用いた酵素の基質は、ｐ−ニトロフェニルアセ
テート（ｐＮＰＡ）、ｐ−ニトロフェニルカプロエート
（ｐＮＰＣ）、ｐ−ニトロフェニルベンゾエート（ｐＮ
ＰＢ）、オレイルベンゾエート（ＯＢ）、トリベンゾイ
ルグリセロール（ＴＢＧ）である。ｐＮＰＡは、東京化
成工業（株）から購入し、ｐＮＰＣは東洋紡（株）から
購入した。その他の基質は、以下のようにして合成し
た。
テート（ｐＮＰＡ）、ｐ−ニトロフェニルカプロエート
（ｐＮＰＣ）、ｐ−ニトロフェニルベンゾエート（ｐＮ
ＰＢ）、オレイルベンゾエート（ＯＢ）、トリベンゾイ
ルグリセロール（ＴＢＧ）である。ｐＮＰＡは、東京化
成工業（株）から購入し、ｐＮＰＣは東洋紡（株）から
購入した。その他の基質は、以下のようにして合成し
た。
【００１８】（ｐＮＰＢの合成）ｐ−ニトロフェノール
4.7g（Mw.139.11、0.0338mol）、ピリジン5.0ml（0.061
8mol）、４‐ジメチルアミノピリジン0.21g（Mw.140.5
7、0.00149 mol）および溶媒としてヘキサン150 ml、ベ
ンゼン50 mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイ
ル5.0 g（Mw.140.57、0.0356mol）を滴下した。滴下終
了から２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応
させた。反応終了後、ＴＬＣ 上で展開後（ヘキサン：
酢酸エチル＝20：１）、ＵＶ吸収で生成物の確認し、生
成物は１Ｈ−ＮＭＲ（HITACHI R-24B）、ＩＲ（HORIBA
FT-210-IR）で、その構造を確認した。
4.7g（Mw.139.11、0.0338mol）、ピリジン5.0ml（0.061
8mol）、４‐ジメチルアミノピリジン0.21g（Mw.140.5
7、0.00149 mol）および溶媒としてヘキサン150 ml、ベ
ンゼン50 mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイ
ル5.0 g（Mw.140.57、0.0356mol）を滴下した。滴下終
了から２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応
させた。反応終了後、ＴＬＣ 上で展開後（ヘキサン：
酢酸エチル＝20：１）、ＵＶ吸収で生成物の確認し、生
成物は１Ｈ−ＮＭＲ（HITACHI R-24B）、ＩＲ（HORIBA
FT-210-IR）で、その構造を確認した。
【００１９】（ＯＢの合成）オレイルアルコール43.5ｇ
（Mw.268.48、0.162mol）、トリエチルアミン16.4ｇ（M
w.101.19、0.162mol）、４−ジメチルアミノピリジン0.
59ｇ（Mw.122.17、0.0048mol）および溶媒としてヘキサ
ン300mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル25.
0ｇ（Mw.140.57、0.178mol）を滴下した。滴下終了から
２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応させ
た。反応終了後、シリカゲル300ｇを用いたクロマトグ
ラフィーにより、ヘキサン８Ｌで溶出して精製した。生
成物の純度はＴＬＣ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル
＝9.1）、ＵＶ吸収（San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UV
G-54）、ＫＭｎＯ４発色で確認し、生成物は１H-NMR（H
ITACHI R-24B）、IR（HORIBA FT-210-IR）で、その構造
を確認した。
（Mw.268.48、0.162mol）、トリエチルアミン16.4ｇ（M
w.101.19、0.162mol）、４−ジメチルアミノピリジン0.
59ｇ（Mw.122.17、0.0048mol）および溶媒としてヘキサ
ン300mlに氷点下、よく攪拌しながら塩化ベンゾイル25.
0ｇ（Mw.140.57、0.178mol）を滴下した。滴下終了から
２時間経過した後、徐々に室温に戻し、一晩反応させ
た。反応終了後、シリカゲル300ｇを用いたクロマトグ
ラフィーにより、ヘキサン８Ｌで溶出して精製した。生
成物の純度はＴＬＣ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル
＝9.1）、ＵＶ吸収（San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UV
G-54）、ＫＭｎＯ４発色で確認し、生成物は１H-NMR（H
ITACHI R-24B）、IR（HORIBA FT-210-IR）で、その構造
を確認した。
【００２０】（ＴＢＧの合成）グリセロール2.18g（Mw9
2.07、0.0237mol）、４−ジメチルアミノピリジン２g
（Mw.122.17、0.0163mol）および溶媒としてジクロロメ
タン：ピリジン＝１：１の400mlに氷点下、よく攪拌し
ながら塩化ベンゾイル10ｇ（Mw.140.57、0.0711 mol）
を滴下した。滴下終了後、徐々に室温に戻し、一晩反応
させた。反応終了後、酢酸エチルに溶かし、ヘキサンを
加え室温で再結晶を行い精製した。生成物の純度はＴＬ
Ｃ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）、ＵＶ
吸収（San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UVG-50）で確認
し、生成物は１H-NMR（HITACHI R-24B）、IR（HORIBA F
T-210-IR）で、その構造を確認した。
2.07、0.0237mol）、４−ジメチルアミノピリジン２g
（Mw.122.17、0.0163mol）および溶媒としてジクロロメ
タン：ピリジン＝１：１の400mlに氷点下、よく攪拌し
ながら塩化ベンゾイル10ｇ（Mw.140.57、0.0711 mol）
を滴下した。滴下終了後、徐々に室温に戻し、一晩反応
させた。反応終了後、酢酸エチルに溶かし、ヘキサンを
加え室温で再結晶を行い精製した。生成物の純度はＴＬ
Ｃ上で展開後（ヘキサン：酢酸エチル＝９：１）、ＵＶ
吸収（San Gabriel、CA91778 U.S.A.、UVG-50）で確認
し、生成物は１H-NMR（HITACHI R-24B）、IR（HORIBA F
T-210-IR）で、その構造を確認した。
【００２１】Ｂ．加水分解活性の測定 加水分解活性の測定は、以下のように行った。50mM リ
ン酸カリウム（KPB、ｐH6.5）、2.5mM ｐ−ニトロフェ
ニルエステル、５％アセトニトリル、酵素を含む３mlの
反応液を、予め、37℃に加温しておき、これにドライア
セトニトリルに溶解したｐ−ニトロフェニルエステル
（50mM）150μ１を加えることによって反応を開始し
た。反応は、エタノールを３ml加えて停止した。反応に
より生成したｐ−ニトロフェノール量を、400ｎｍにお
ける吸光度（ε４００ｎｍ＝11,670）から求めた。１分
間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量
を１ユニットと定義した。
ン酸カリウム（KPB、ｐH6.5）、2.5mM ｐ−ニトロフェ
ニルエステル、５％アセトニトリル、酵素を含む３mlの
反応液を、予め、37℃に加温しておき、これにドライア
セトニトリルに溶解したｐ−ニトロフェニルエステル
（50mM）150μ１を加えることによって反応を開始し
た。反応は、エタノールを３ml加えて停止した。反応に
より生成したｐ−ニトロフェノール量を、400ｎｍにお
ける吸光度（ε４００ｎｍ＝11,670）から求めた。１分
間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量
を１ユニットと定義した。
【００２２】（スクリーニング用培地）一次スクリーニ
ング培地として、0.5％（NH４)２SO４、0.1％KH２P
O４、0.05％MgSO４、0.5％NaCl、及び1.0％ＯＢを含む
培地（ｐH7.2）を用いた。固形一次スクリーニング培地
は、上記組成に寒天を1.5％添加したものである。な
お、ＯＢは、植菌時に加えた。
ング培地として、0.5％（NH４)２SO４、0.1％KH２P
O４、0.05％MgSO４、0.5％NaCl、及び1.0％ＯＢを含む
培地（ｐH7.2）を用いた。固形一次スクリーニング培地
は、上記組成に寒天を1.5％添加したものである。な
お、ＯＢは、植菌時に加えた。
【００２３】二次スクリーニング培地として、一次スク
リーニング培地に0.2％ β‐サイクロデキストリン（日
本食品加工株式会社）を加え、よく攪拌することによっ
てＯＢを乳化させたものを用いた。固形二次スクリーニ
ング培地は、上記組成に寒天を1.5％添加したものであ
る。
リーニング培地に0.2％ β‐サイクロデキストリン（日
本食品加工株式会社）を加え、よく攪拌することによっ
てＯＢを乳化させたものを用いた。固形二次スクリーニ
ング培地は、上記組成に寒天を1.5％添加したものであ
る。
【００２４】（スクリーニング）大阪府下より得られた
土壌・水サンプルを、試験管中で一次スクリーニング培
地（液体：３ml）にて30℃、48時間集積培養を行った。
培地が白濁したものは、その１％を２度、同じ培地に植
え継いだ後、固形ＮＢ培地（ＮＢ培地に1.5％寒天を添
加したもの）上にて30℃、24時間培養し、シングルコロ
ニーを形成させた。シングルコロニーとして得られた菌
株は、固形スクリーニング培地上で30℃、24時間培養
し、その成育を確認した。成育の認められた菌株につい
ては、ＬＢ培地（３ml）で30℃、８時間培養し、培養液
を20％グリセロール溶液としたのち、使用まで−80℃で
保存した。
土壌・水サンプルを、試験管中で一次スクリーニング培
地（液体：３ml）にて30℃、48時間集積培養を行った。
培地が白濁したものは、その１％を２度、同じ培地に植
え継いだ後、固形ＮＢ培地（ＮＢ培地に1.5％寒天を添
加したもの）上にて30℃、24時間培養し、シングルコロ
ニーを形成させた。シングルコロニーとして得られた菌
株は、固形スクリーニング培地上で30℃、24時間培養
し、その成育を確認した。成育の認められた菌株につい
ては、ＬＢ培地（３ml）で30℃、８時間培養し、培養液
を20％グリセロール溶液としたのち、使用まで−80℃で
保存した。
【００２５】一次スクリーニングで得られた菌株を、固
形二次スクリーニング培地上に植菌し、30℃、７日間培
養した。培養２日目での生育状態と、７日目でのＯＢを
分解することによって生じるクリアゾーンの形成能を見
た。
形二次スクリーニング培地上に植菌し、30℃、７日間培
養した。培養２日目での生育状態と、７日目でのＯＢを
分解することによって生じるクリアゾーンの形成能を見
た。
【００２６】明瞭なクリアゾーンを形成した菌株を、50
0ml容坂口フラスコを用いてＯＢ0.5％を含むＬＢ培地
（50ml）で30℃、120s.p.m,46時間培養し、遠心分離
（５，500×ｇ、10分、４℃）により、菌体と培養上清
を得た。菌体は、１mM MgCl２を含むKPB（50mM、ｐH6.
5）に懸濁後、30秒×２回超音波（海上電機（株）、428
0型振動子）で破砕した。これを、再度遠心分離（12,00
0×ｇ、20分、４℃）して破砕菌体を取り除き、細胞抽
出液を得た。ｐＮＰＢを基質として、この細胞抽出液と
培養上清液の加水分解活性の測定をおこなった。
0ml容坂口フラスコを用いてＯＢ0.5％を含むＬＢ培地
（50ml）で30℃、120s.p.m,46時間培養し、遠心分離
（５，500×ｇ、10分、４℃）により、菌体と培養上清
を得た。菌体は、１mM MgCl２を含むKPB（50mM、ｐH6.
5）に懸濁後、30秒×２回超音波（海上電機（株）、428
0型振動子）で破砕した。これを、再度遠心分離（12,00
0×ｇ、20分、４℃）して破砕菌体を取り除き、細胞抽
出液を得た。ｐＮＰＢを基質として、この細胞抽出液と
培養上清液の加水分解活性の測定をおこなった。
【００２７】このスクリーニングにおいて、ｐＮＰＢに
高い活性を示した株を選択し、さらに、ｐＮＰＡ、ｐＮ
ＰＢおよびＯＢを基質としてスクリーニングした。この
なかから、ｐＮＰＢおよびｐＮＰＡに対して高い活性を
有する６株（ＫＭ016、ＫＭ069、ＫＭ083、ＫＭ109、Ｋ
Ｍ252、およびＫＭ264）が得られた。表１に結果を示
す。
高い活性を示した株を選択し、さらに、ｐＮＰＡ、ｐＮ
ＰＢおよびＯＢを基質としてスクリーニングした。この
なかから、ｐＮＰＢおよびｐＮＰＡに対して高い活性を
有する６株（ＫＭ016、ＫＭ069、ＫＭ083、ＫＭ109、Ｋ
Ｍ252、およびＫＭ264）が得られた。表１に結果を示
す。
【００２８】
【表１】
【００２９】ＫＭ109株は、ｐＮＰＢ活性がｐＮＰＡ活
性よりも３倍以上も高く、そして、唯一トリベンゾイル
グリセロールを分解した。この株が生産するエステル分
解酵素は、嵩高い基質に対して作用できると考えられた
ので、以下、まず、この株を同定し、エステル分解酵素
を単離精製した。
性よりも３倍以上も高く、そして、唯一トリベンゾイル
グリセロールを分解した。この株が生産するエステル分
解酵素は、嵩高い基質に対して作用できると考えられた
ので、以下、まず、この株を同定し、エステル分解酵素
を単離精製した。
【００３０】（ＫＭ109株の同定）ＫＭ109株の菌学的性
質を以下に示す。
質を以下に示す。
【００３１】 Ａ． 形 態 （１）細胞の形 球桿菌 （２）細胞の大きさ 0.9-1.6×1.5-2.5μm （３）運動性の有無 − （４）胞子の有無 − （５）グラム染色 − （６）抗酸性染色 −
【００３２】 Ｂ．各培地における生育状態 (１）標準寒天平板培養 薄茶色、光沢あり、スム−ズ、正円 （２）標準寒天斜面培養 薄茶色、光沢あり、スムーズ （３）標準液体培養 上層部がやや濃く、液面に薄い被膜 （４）標準ゼラチン穿刺培養 穿刺線に沿って弱い発育、液化は見られず （５）リトマスミルク 変化なし
【００３３】 Ｃ．生理学的性質 （１）硝酸塩の還元性 − （２）脱窒反応 − （３）メチルレッド試験 − （４）アセチルメチルカルビノールの生成 − （５）インドールの生成 − （６）硫化水素の生成 − （７）澱粉の加水分解 − （８）クエン酸の利用 ＋ （９）無機窒素源の利用 硝酸塩： ＋ アンモニウム塩：＋ （１０）色素の生成 − （１１）ウレアーゼ活性 − （１２）オキシターゼ活性 − （１３）カタラーゼ活性 ＋ （１４）生育の範囲 ｐH 4.0 −、 4.5 ＋、 7.0 ＋、 9.5 ＋、 10.0 − 温度 37℃ ＋、 41℃ ＋Ｗ、 45℃ − （１５）酸素に対する態度 好気性 （１６）ジオキシアセトンの生成 − （１７）馬尿酸の分解 ＋ （１８）アミノ酸の分解 リジン −、 アルギニン −、 オルニチン − （１９）フェニルアラニンの脱アミノ − （２０）温度抵抗性（85℃、10分） − （２１）塩化ナトリウムの耐性 2.0％ ＋、 5.0％ −、 7.0％ −、 10％ − （２２）サブロウ寒天培地の生育 ＋ （２３）0.001％リゾチーム培地の生育 ＋ （２４）チロシンの分解 − （２５）クエン酸・アンモニウム寒天 − でのアルカリ産生 （２６）カゼインの分解性 − （２７）ゼラチンの分解性 − （２８）嫌気性培地における発育性 − （２９）マッコンキ一培地生育性 ＋ （３０）レシチナ一ゼ反応 − （３１）ＶＰ培地におけるアルカリ産生能 − （３２）糖類の利用と生酸性 Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース ＋ 麦芽糖 − しょ糖 − 乳糖 ＋ トレハロース − Ｄ−ソルビット − Ｄ−マンニット − イノシット − グリセリン − デンプン − メリビオース ＋ サリシン − エタノール ＋ （３３）ＳＳ寒天での生育 − （３４）ＫＣＮ培地での生育 ＋ （３５）ＯＮＰＣ − （３６）ＤＮａsｅ −
【００３４】以上の菌学的性質から、単離した株はアシ
ネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calc
oaceticus subsp. antiratus）と同定された。この株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−17224）
ネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calc
oaceticus subsp. antiratus）と同定された。この株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−17224）
【００３５】（本発明の酵素の精製） Ａ．粗酵素の調製 Acinetobacter calcoaceticus subsp. antiratus KM109
株をＬＢ培地６mlに植菌し、30℃、120s.p.m.で４時間
培養した。得られた培養液５mlを、同じＬＢ培地500ml
に加え、30℃、１20s.p.m.、８時間培養し、前培養液を
得た。ＬＢ培地40Ｌを含む100Ｌ容ジャーファーメンタ
ー（（株）丸菱バイオエンジ、ＭＰＦ型）に、前培養液
を400ml添加して、200rpm、１vvm、30℃で、40時間、培
養した。
株をＬＢ培地６mlに植菌し、30℃、120s.p.m.で４時間
培養した。得られた培養液５mlを、同じＬＢ培地500ml
に加え、30℃、１20s.p.m.、８時間培養し、前培養液を
得た。ＬＢ培地40Ｌを含む100Ｌ容ジャーファーメンタ
ー（（株）丸菱バイオエンジ、ＭＰＦ型）に、前培養液
を400ml添加して、200rpm、１vvm、30℃で、40時間、培
養した。
【００３６】培養終了後、直ちに培養液を４℃ にまで
冷却し、混合塩（CaCl２：Na２HPO４＝１：２）を１％
（W／V〉となるように加え、よく攪拌した。菌体および
生じた不溶物は、連続遠心分離（15,000rpm：関西遠心
分離機製作所、Ｓ型超高速遠心分離機）で取り除き、培
養上清液を得た。
冷却し、混合塩（CaCl２：Na２HPO４＝１：２）を１％
（W／V〉となるように加え、よく攪拌した。菌体および
生じた不溶物は、連続遠心分離（15,000rpm：関西遠心
分離機製作所、Ｓ型超高速遠心分離機）で取り除き、培
養上清液を得た。
【００３７】得られた培養上清液を、限外濾過モジュー
ル（分子量カットオフ 6,000、旭化成工業株式会社、ラ
ボモジュールSIP 1013）を用いて3.5Ｌまで濃縮し、ド
ライアイスで−20℃にまで冷却したイソプロパノール
を、最終濃度30％となるように加え、タンパク質を不溶
化させた後、遠心分離（7,000×ｇ、20分、４℃）によ
り除いた。上清液に対し、さらに同様のイソプロパノー
ルを最終濃度60％となるように加え、タンパク質を不溶
化させ、遠心分離（12,000×ｇｍ、20分、４℃）により
回収し、−80℃にて凍結後、凍結乾燥（Refrigeration
for Science Inc.、RFS 200B）により残留イソプロパノ
ール、水分を除去し、粗酵素粉末を得て、以下の精製に
用いた。以下の精製は、４℃で行った。
ル（分子量カットオフ 6,000、旭化成工業株式会社、ラ
ボモジュールSIP 1013）を用いて3.5Ｌまで濃縮し、ド
ライアイスで−20℃にまで冷却したイソプロパノール
を、最終濃度30％となるように加え、タンパク質を不溶
化させた後、遠心分離（7,000×ｇ、20分、４℃）によ
り除いた。上清液に対し、さらに同様のイソプロパノー
ルを最終濃度60％となるように加え、タンパク質を不溶
化させ、遠心分離（12,000×ｇｍ、20分、４℃）により
回収し、−80℃にて凍結後、凍結乾燥（Refrigeration
for Science Inc.、RFS 200B）により残留イソプロパノ
ール、水分を除去し、粗酵素粉末を得て、以下の精製に
用いた。以下の精製は、４℃で行った。
【００３８】Ｂ．ゲル濾過による精製 凍結乾燥により得られた粉末1.0 g を、ノイゲンHCを
０．１％含む50mMリン酸バッファー（KPB、ｐH6.5）100
ml に溶解した。次に、同バッファーであらかじめ平衡
化させたセファローズＣＬ−68ゲル濾過クロマトグラフ
ィー（50×630mm：Pharmacia LKB Biotechnology ln
c．）にアプライし、同バッファーで溶出し、18mlず
つ、80フラクションに分画し、ｐＮＰＡ及びｐＮＰＢを
用いて加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢ活性を有する画
分を回収、濃縮（分子量カット20、000、東洋濾紙株式
会社、UP-20）し、ノイゲンＨＣを0.1％含む10mM トリ
ス−塩酸（ｐH8.0）に対し、透析をおこなった。
０．１％含む50mMリン酸バッファー（KPB、ｐH6.5）100
ml に溶解した。次に、同バッファーであらかじめ平衡
化させたセファローズＣＬ−68ゲル濾過クロマトグラフ
ィー（50×630mm：Pharmacia LKB Biotechnology ln
c．）にアプライし、同バッファーで溶出し、18mlず
つ、80フラクションに分画し、ｐＮＰＡ及びｐＮＰＢを
用いて加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢ活性を有する画
分を回収、濃縮（分子量カット20、000、東洋濾紙株式
会社、UP-20）し、ノイゲンＨＣを0.1％含む10mM トリ
ス−塩酸（ｐH8.0）に対し、透析をおこなった。
【００３９】Ｃ．イオン交換樹脂による精製 次に、同バッファーで予め平衡化したDEAE Sephacel 陰
イオン交換クロマトグラフィー（25×90mM、Pharmacia
Biotechnology inc．）に吸着させ、バッファー中のNaC
lの０〜0.5Ｍの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出
し、５mlずつ60フラクションに分画した。溶出画分のｐ
ＮＰＡ、ｐＮＰＢに対する加水分解活性を測定し、ｐＮ
ＰＢに対する活性が認められる画分を回収・濃縮した。
イオン交換クロマトグラフィー（25×90mM、Pharmacia
Biotechnology inc．）に吸着させ、バッファー中のNaC
lの０〜0.5Ｍの直線濃度勾配によりタンパク質を溶出
し、５mlずつ60フラクションに分画した。溶出画分のｐ
ＮＰＡ、ｐＮＰＢに対する加水分解活性を測定し、ｐＮ
ＰＢに対する活性が認められる画分を回収・濃縮した。
【００４０】Ｄ．HPLCによる精製 次に、0.1％ノイゲンＨＣ及び200mM NaClを含む50mM
KPB（ｐH6.5）で予め平衡化させたG2000SWXL（7.8×300
ｍｍ、東ソー株式会社）を用いた高速液体ゲル濾過クロ
マトグラフィー（日本分光株式会社、TRI ROTOR-V）に
アプライし、同バッファーにより0.5ml／分で溶出し
た。タンパク質は280ｎｍにおける吸光度として検出し
た（日本分光株式会社、UVIDEC-100-V）。11〜33分の保
持時間のものを30秒毎に分取し、ｐＮＰＡ、ｐＮＰＢを
基質として加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢに対する活
性が認められる画分を回収し、10mMトリス塩酸（ｐH8.
0）に対し、透析した。
KPB（ｐH6.5）で予め平衡化させたG2000SWXL（7.8×300
ｍｍ、東ソー株式会社）を用いた高速液体ゲル濾過クロ
マトグラフィー（日本分光株式会社、TRI ROTOR-V）に
アプライし、同バッファーにより0.5ml／分で溶出し
た。タンパク質は280ｎｍにおける吸光度として検出し
た（日本分光株式会社、UVIDEC-100-V）。11〜33分の保
持時間のものを30秒毎に分取し、ｐＮＰＡ、ｐＮＰＢを
基質として加水分解活性を測定し、ｐＮＰＢに対する活
性が認められる画分を回収し、10mMトリス塩酸（ｐH8.
0）に対し、透析した。
【００４１】Ｅ．ＭｏｎｏＱによる精製 次に、同バッファーであらかじめ平衡化させたMONO Q P
C1.6／５（1.6×50ｍｍ）を用いたＳＭＡＲＴＴＭシス
テム(Pharmacia LKB Biotechnology lnc.）に吸着さ
せ、バッファー中の NaCl濃度を０〜0.125Ｍおよび0.12
5Ｍ〜0.5Ｍの二段階の直線濃度勾配により酵素を溶出し
た。タンパク質は280ｎｍ、254ｎｍの吸光度として検出
した。15〜22分の保持時間の画分を15秒ごとに集め、ｐ
ＮＰＢによる加水分解活性測定を行い、活性画分を集め
た。
C1.6／５（1.6×50ｍｍ）を用いたＳＭＡＲＴＴＭシス
テム(Pharmacia LKB Biotechnology lnc.）に吸着さ
せ、バッファー中の NaCl濃度を０〜0.125Ｍおよび0.12
5Ｍ〜0.5Ｍの二段階の直線濃度勾配により酵素を溶出し
た。タンパク質は280ｎｍ、254ｎｍの吸光度として検出
した。15〜22分の保持時間の画分を15秒ごとに集め、ｐ
ＮＰＢによる加水分解活性測定を行い、活性画分を集め
た。
【００４２】Ｆ．SDS-PAGEによる精製度の測定 得られた酵素を10−20％ ready mixed gradient gel
（第一化学薬品株式会社、マルチゲル 10/20）を用いた
SDS-PAGEによって展開し、銀染色キット（和光純薬株式
会社、Silver stain II Kit Wako）を用いてプロトコル
に従い、染色・検出した。SDS-PAGEでは、単一の蛋白質
にまで精製されていた。以上の精製工程により、精製酵
素0.03mgが回収された。なお、以下にのべる酵素の特性
の決定には、0.71unit/mlの酵素を用いた。
（第一化学薬品株式会社、マルチゲル 10/20）を用いた
SDS-PAGEによって展開し、銀染色キット（和光純薬株式
会社、Silver stain II Kit Wako）を用いてプロトコル
に従い、染色・検出した。SDS-PAGEでは、単一の蛋白質
にまで精製されていた。以上の精製工程により、精製酵
素0.03mgが回収された。なお、以下にのべる酵素の特性
の決定には、0.71unit/mlの酵素を用いた。
【００４３】（本発明の酵素の特性） Ａ．SDS-PAGEによる分子量測定 得られた精製酵素の分子量を、変性−還元条件下のSDS-
PAGEで測定した。キャリブレーションの結果を図１に示
す。なお、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼ
ｂ：分子量94,000、ウシ血清アルブミン：分子量67,00
0、オバルブミン：分子量43,000、及び、carbonic anhy
drase：分子量30,000を用いた。
PAGEで測定した。キャリブレーションの結果を図１に示
す。なお、マーカータンパク質として、ホスホリラーゼ
ｂ：分子量94,000、ウシ血清アルブミン：分子量67,00
0、オバルブミン：分子量43,000、及び、carbonic anhy
drase：分子量30,000を用いた。
【００４４】変性−還元条件下におけるSDS-PAGEによる
分子量は、62kDa±１kDaであった。
分子量は、62kDa±１kDaであった。
【００４５】Ｂ．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分
子量測定 精製酵素の分子量を、Superdex 75 PC 3.2/30を用いる
ＳＭＡＲＴＴＭシステムで測定した。溶出は、200mM N
aClを含む50mM トリス塩酸（ｐH8.0）を用いて50μｌ／
分で行い、280ｎｍ、254ｎｍにおける吸光度として検出
した。マーカータンパク質としては、アルブミン：分子
量65,000、オバルブミン：分子量46,800、キモトリプシ
ノーゲンＡ：分子量20,600、及び、リボヌクレアーゼ
Ａ：分子量15,700を用いた。結果を図２に示す。
子量測定 精製酵素の分子量を、Superdex 75 PC 3.2/30を用いる
ＳＭＡＲＴＴＭシステムで測定した。溶出は、200mM N
aClを含む50mM トリス塩酸（ｐH8.0）を用いて50μｌ／
分で行い、280ｎｍ、254ｎｍにおける吸光度として検出
した。マーカータンパク質としては、アルブミン：分子
量65,000、オバルブミン：分子量46,800、キモトリプシ
ノーゲンＡ：分子量20,600、及び、リボヌクレアーゼ
Ａ：分子量15,700を用いた。結果を図２に示す。
【００４６】この結果から、非変性条件下のゲル濾過ク
ロマトグラフィーで、精製酵素の分子量は、50±１kDa
であると推定された、ゲル濾過クロマトグラフィーによ
る分子量がSDS-PAGEより若干低いが、これは、精製酵素
がカラム担体と相互作用した結果、溶出位置にずれが生
じたためと考えられる。
ロマトグラフィーで、精製酵素の分子量は、50±１kDa
であると推定された、ゲル濾過クロマトグラフィーによ
る分子量がSDS-PAGEより若干低いが、これは、精製酵素
がカラム担体と相互作用した結果、溶出位置にずれが生
じたためと考えられる。
【００４７】Ｃ．至適ｐH 酵素液10μlにKPBバッファー（ｐH６〜８）又はクエン
酸バッファー（ｐH３〜６）465μlを加え、これにｐＮ
ＰＢ(50mM)25μlを加えて反応を開始し、37℃、10分、
反応を行った。500μlのエタノールを加えて反応を停止
し、14,000rpm、５分の遠心分離を行い、その上清10μl
をHPLCでの分析に供した。分解活性は、アセトニトリ
ル：酢酸アンモニウム溶液（50mM、ｐH5.5）(1:1)を展
開溶媒として使用し、吸光度303nmで検出されるp-ニト
ロフェノールの量を測定した。検量線はp-ニトロフェノ
ールを用いて作製した。ｐH8.0付近で最大の分解活性が
測定された。この結果は、至適ｐHが約8.0であることを
示している。
酸バッファー（ｐH３〜６）465μlを加え、これにｐＮ
ＰＢ(50mM)25μlを加えて反応を開始し、37℃、10分、
反応を行った。500μlのエタノールを加えて反応を停止
し、14,000rpm、５分の遠心分離を行い、その上清10μl
をHPLCでの分析に供した。分解活性は、アセトニトリ
ル：酢酸アンモニウム溶液（50mM、ｐH5.5）(1:1)を展
開溶媒として使用し、吸光度303nmで検出されるp-ニト
ロフェノールの量を測定した。検量線はp-ニトロフェノ
ールを用いて作製した。ｐH8.0付近で最大の分解活性が
測定された。この結果は、至適ｐHが約8.0であることを
示している。
【００４８】Ｄ．ｐH安定性 ｐHを4.5から8.5まで0.5ずつ変化させた50mM KPBに110
量の酵素溶液を加えてｐHを変化させ、30分間 ４℃で保
持後、37℃において、ｐＮＰＢ加水分解活性を測定し、
ｐH安定性を測定した。結果を図３に示す。本酵素は、
ｐH6.0〜8.0の間で、安定である。
量の酵素溶液を加えてｐHを変化させ、30分間 ４℃で保
持後、37℃において、ｐＮＰＢ加水分解活性を測定し、
ｐH安定性を測定した。結果を図３に示す。本酵素は、
ｐH6.0〜8.0の間で、安定である。
【００４９】Ｅ．反応至適温度 20℃、28℃、37℃、40℃、45℃、52℃の各温度条件下、
ｐH7.0でｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。図４に、37
℃での活性を１とした相対活性を示す。この結果から、
至適反応温度は約45℃とした。
ｐH7.0でｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。図４に、37
℃での活性を１とした相対活性を示す。この結果から、
至適反応温度は約45℃とした。
【００５０】Ｆ．熱安定性 ４℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃の各温度に酵素液
を30分間処理し、４℃に冷却後、直ちに37℃において
ｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。４℃で処理した酵素
活性を１として、各処理温度における相対活性を図５に
示す。35℃までの温度では、ほぼコントロールの４℃と
同等の活性を保持していたが、それ以上の温度では次第
に失活し、50℃で処理した酵素は、40％しか残存してい
なかった。本酵素は35℃以下の温度では安定であると言
える。
を30分間処理し、４℃に冷却後、直ちに37℃において
ｐＮＰＢ加水分解活性を測定した。４℃で処理した酵素
活性を１として、各処理温度における相対活性を図５に
示す。35℃までの温度では、ほぼコントロールの４℃と
同等の活性を保持していたが、それ以上の温度では次第
に失活し、50℃で処理した酵素は、40％しか残存してい
なかった。本酵素は35℃以下の温度では安定であると言
える。
【００５１】（市販酵素との比較）本発明の酵素を市販
の酵素と比較した。比較した酵素は、リパーゼＯＦ（名
糖産業株式会社：Candida cylindrace由来）、リパー
ゼLP-051-1S（東洋醸造株式会社：Pseudomonas sp由
来）、ノボザイム435（ノボノルディスク工業：Candida
antractica由来）、リポプロテインリパーゼ（タイプ
Ａ）（東洋紡株式会社：Pseudomonas sp由来）であ
る。結果を表２に示す。
の酵素と比較した。比較した酵素は、リパーゼＯＦ（名
糖産業株式会社：Candida cylindrace由来）、リパー
ゼLP-051-1S（東洋醸造株式会社：Pseudomonas sp由
来）、ノボザイム435（ノボノルディスク工業：Candida
antractica由来）、リポプロテインリパーゼ（タイプ
Ａ）（東洋紡株式会社：Pseudomonas sp由来）であ
る。結果を表２に示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】本発明の酵素のみが、トリベンゾイルグリ
セロール分解活性を有しており、さらに、ｐＮＰＢ対し
て、高い特異性を有していることが判明した。
セロール分解活性を有しており、さらに、ｐＮＰＢ対し
て、高い特異性を有していることが判明した。
【００５４】
【発明の効果】本発明の酵素は、嵩高い基質の加水分解
に有用であり、医薬品の中間原料に必要な光学活性な物
質の製造等に有用であると考えられる。
に有用であり、医薬品の中間原料に必要な光学活性な物
質の製造等に有用であると考えられる。
【図１】SDS-PAGEによる分子量測定を示す図である。
【図２】ゲル濾過による分子量の測定を示す図である。
【図３】本発明の酵素のｐH安定性を示す図である。
【図４】本発明の酵素の至適反応温度を示す図である。
【図５】本発明の酵素の熱安定性を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】 トリベンゾイルグリセロールを加水分解
するエステル分解酵素。 - 【請求項２】 以下の性質： 基質特異性：トリベンゾイルグリセロールを加水分解す
る、 分子量 ：変性−還元条件下のSDS-PAGEで62±１kDa
及び非変性条件下のHPLCゲル濾過で50±１kDa 至適ｐH ：約8.0、 ｐH安定性：約6.0〜8.0、 至適温度 ：約45℃、及び 熱安定性 ：35℃以下、 を有する、エステル分解酵素。 - 【請求項３】 さらに、ｐ−ニトロフェニルベンゾエー
トに対する加水分解活性がｐ−ニトロフェニルアセテー
トに対する加水分解活性よりも、少なくとも３倍以上高
い、請求項１または２に記載のエステル分解酵素。 - 【請求項４】 アシネトバクター属に属する微生物を培
養して得られる、請求項１ないし３いずれかの項に記載
のエステル分解酵素。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05382299A JP4236323B2 (ja) | 1999-03-02 | 1999-03-02 | 新規なエステル分解酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05382299A JP4236323B2 (ja) | 1999-03-02 | 1999-03-02 | 新規なエステル分解酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000245455A true JP2000245455A (ja) | 2000-09-12 |
| JP4236323B2 JP4236323B2 (ja) | 2009-03-11 |
Family
ID=12953498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05382299A Expired - Fee Related JP4236323B2 (ja) | 1999-03-02 | 1999-03-02 | 新規なエステル分解酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4236323B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104762276A (zh) * | 2014-01-08 | 2015-07-08 | 中国科学院微生物研究所 | 酯酶蛋白及其编码基因以及它们的应用 |
| WO2019211969A1 (ja) * | 2018-05-02 | 2019-11-07 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
| CN113433085A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-09-24 | 四川新华西乳业有限公司 | 一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用 |
-
1999
- 1999-03-02 JP JP05382299A patent/JP4236323B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2019211969A1 (ja) * | 2018-05-02 | 2019-11-07 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
| CN112055751A (zh) * | 2018-05-02 | 2020-12-08 | 天野酶制品株式会社 | 修饰型酯酶和其用途 |
| JPWO2019211969A1 (ja) * | 2018-05-02 | 2021-05-13 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
| JP7311496B2 (ja) | 2018-05-02 | 2023-07-19 | 天野エンザイム株式会社 | 改変型エステラーゼ及びその用途 |
| CN113433085A (zh) * | 2021-06-24 | 2021-09-24 | 四川新华西乳业有限公司 | 一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用 |
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