CN113433085A - 一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用 - Google Patents

一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食品分析检测技术领域，特别是一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用。该方法通过配制样品稀释液和脂肪酶稀释液；然后加入磷酸缓冲液和底物溶液，得到待测样品和加标样品；使用4‑硝基苯基辛酸酯为底物，使用脂肪酶粉末配制不同梯度的脂肪酶稀释液分解底物，产生可吸收316nm波长的物质，并以此建立吸光度‑脂肪酶活力函数关系；然后通过对原料乳离心处理，将下清液稀释后，利用紫外分光光度仪对待测样品和加标样品的吸光度测试，并通过吸光度‑脂肪酶活力函数关系判断原料乳中脂肪酶的活力。

Description

一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及食品分析检测技术领域，特别是一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法及其应用。
背景技术
牛乳中的脂肪酶主要有两种来源，一种是天然存在于生乳中的，称为天然脂肪酶，另一种是牛乳中的微生物代谢所产生的，称为微生物脂肪酶。而牛乳中的微生物脂肪酶主要来源于嗜冷菌，虽然嗜冷菌本身的繁殖不会严重影响牛乳的稳定性，且在较为温和的热处理中(如巴氏杀菌)也很容易将其杀死，但某些嗜冷菌的代谢产物是耐热性的脂肪酶，这些耐热的脂肪酶在经过巴氏杀菌甚至超高温灭菌后，仍不能被完全灭活。残留的耐热脂肪酶会分解牛乳中的脂肪球膜和脂肪，产生游离的脂肪和脂肪酸，造成灭菌乳脂肪上浮和风味异常，严重的破坏了灭菌乳的口感和风味，导致灭菌乳的货架期大幅缩短。所以，在灭菌乳生产的源头处，结合原料乳中脂肪酶活力，合理的评估原料奶的品质是十分必要的。
目前脂肪酶活力检测的方法种类较多，最常见的是使用动态滴定法进行脂肪酶的检测，其原理是脂肪酶水解甘油三酯产生脂肪酸，使反应体系pH降低，再通过滴定仪补加氢氧化钠溶液的方式平衡pH，补加氢氧化钠溶液的速率和脂肪酶活力成正比。该方法存在如下问题：首选该方法需要具备动态滴定的滴定仪，对于设备的要求较高，其次该方法较为繁琐，需要配制大量的试剂且实验全程耗时较长。而且该方法的检测限不能够有效适用脂肪酶活力区间较低的乳制品，使用该方会导致线性度较差，结果偏差较大。
发明内容
本发明的目的在于：本发明的目的在于针对当前原料乳中脂肪酶检测方法不完善，存在耗时长、成本高、准确性差的情况，提供一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法。使用该方法检测结果相对准确，成本低廉且较为快速。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法，包括如下步骤；
S1，配置样品稀释液，将原料乳脱脂处理，得到下清液；将所述下清液用磷酸缓冲液稀释，得到样品稀释液；配制脂肪酶稀释液；
S2，待测样品和加标样品的制备；
取第一容器，向第一容器中加入磷酸缓冲液，然后加入样品稀释液，最后加入底物溶液；混匀，得到待测样品；
取第二容器，向第二容器中加入磷酸缓冲液，然后加入样品稀释液，加入脂肪酶稀释液，最后加入底物溶液；混匀，得到加标样品；
第一容器和第二容器中加入的样品稀释液的量相同；
所述底物溶液为4-硝基苯基辛酸酯的二甲基亚砜溶液；
S3，预处理
将待测样品水浴孵育，加入终止液，得到待上机样品；
将加标样品水浴孵育，加入终止液，得到待上机加标样品；
待测样品和加标样品中加入的终止液的量相同；
S4，检测
检测待上机样品在316nm处的吸光度Y样品以及待上机加标样品在316nm处的吸光度Y加标，根据脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式计算得到待测样品的脂肪酶活力计算值和加标样品的脂肪酶活力计算值；
脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式为，
Y吸光度＝KX酶活力+B；
式中，Y吸光度为待上机测试溶液的吸光度，X酶活力为待测溶液的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；其中待测溶液经过水浴孵育加入终止液后，得到待上机测试溶液；K和B为系数；
计算回收率，回收率计算公式为：R回收率＝(X加标-X样品)*100％/C；
式中，X样品为待测样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；X加标为加标样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；C为加标量，单位为mU/mL；
再利用回收率计算待测样品中脂肪酶活力真实值，
脂肪酶活力真实值计算公式为：A真实值＝X样品/R回收率；
式中A真实值是指待测样品中的脂肪酶活力真实值，单位为mU/mL。
该方法通过使用4-硝基苯基辛酸酯为底物，使用脂肪酶粉末配制不同梯度的脂肪酶稀释液分解底物，产生可吸收316nm波长的物质，并以此建立吸光度-脂肪酶活力函数关系；然后通过原料乳进行离心分离，取下清液，避免脂肪对检测结果的影响，对下清液稀释一定倍数后，吸光度能够被准确检测，且位于标准曲线范围内；将待测样品的吸光度与标准曲线结合，从而判断原料乳中脂肪酶的活力。上述的脂肪酶活力的真实值A真实值是指待测样品中的脂肪酶活力。原料乳中的脂肪酶活力在配置样品稀释液时进行了稀释，从样品稀释液到待测样品时也进行了稀释。此两次的稀释，在日常操作中，通常采用固定的稀释比例。故待测样品中的脂肪酶活力与原料乳中的脂肪酶活力是倍数关系。可以采用待测样品的脂肪酶活力高低表征原料乳中的脂肪酶活力的高低。
这是因为动态滴定法的检测区间为1.5U/mL—4.0U/mL。而本申请的检测方法，监测区间为2mU/mL-20mU/mL，更适合于检测原料乳样品的脂肪酶活力。
进一步的，对原料乳脱脂处理后，及时取下清液样品。及时是指，避免脂肪再次溶解。在原料乳脱脂处理后，1分钟内取样。
进一步的，步骤S4中脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式Y吸光度＝KX酶活力+B，经过如下步骤获得；
取多个容器，分别向每个容器中加入相同量的磷酸缓冲液，然后向每个容器中分别加入不同量的脂肪酶稀释液，然后向每个容器中加入底物溶液；得到多个不同脂肪酶浓度的标准曲线样品；
将多个标准曲线样品水浴孵育，然后向多个标准曲线样品分别加入终止液，得到多个待上机标准曲线样品；
分别测试每个待上机标准曲线样品在316nm处的吸光度，获得不同脂肪酶浓度的标准曲线的吸光度，拟合一次回归方程，得到脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式中的K和B的数值。
进一步的，步骤S1中，将下清液和磷酸缓冲溶液按照体积比1:7-1:9混合，得到样品稀释液。
进一步的，回收率计算公式，R回收率＝(X加标-X样品)*100％/C；其中的C值的取值范围为5-15mU/mL。
进一步的，回收率计算公式，R回收率＝(A加标-A样品)*100％/C；其中C的值为10mU/mL。
进一步的，步骤S3中，所述终止液为乙腈和甲酸的混合物。
进一步的，所述终止液中乙腈和甲酸的体积比为12:1。
终止液是一种阻止某化学反应继续的试剂，通常由某种酸或碱配制。
终止液的比例应以加入终止液后，反应是否立即终止为选取规则，优选的，使用乙腈与甲酸的比例为12:1。
其他的终止液，例如使用2m mol/L的硫酸溶液作为终止液，其终止效果较差，体现在于其吸光度测试后放置10min再次检测，吸光度仍会增高。
更具体的方案中，原料乳中脂肪酶活力的检测方法，包括如下步骤：
S1，配置样品稀释液：将原料乳进行离心脱脂，吸取100μL下清液于900μL磷酸缓冲液中，得到样品稀释液；
配制脂肪酶稀释液：将脂肪酶粉末溶于水中，配制100mU/mL的脂肪酶稀释溶液；
S2，取待测样品离心管，向待测样品离心管中加入180μL磷酸缓冲液，然后向个待测样品离心管中加入300μL样品稀释液；最后向两个待测样品离心管分别加入120μL底物溶液，混匀，制成待测样品，待测样品的体积为600μL；
取加标样品离心管。向加标样品离心管中加入120μL磷酸缓冲液；然后向加标样品离心管中加入300μL的样品稀释液，然后加标样品离心管中加入60μL脂肪酶稀释液；最后向加标样品离心管中加入120μL底物溶液，混匀，制成加标样品，加标样品的体积为600μL；
所述底物溶液为浓度5mM的4-硝基苯基辛酸酯的二甲基亚砜溶液；
S3，预处理
将待测样品水浴孵育，水浴温度44℃，水浴孵育时间1小时，孵育时全程避光；向待测样品加入1.3mL终止液，混匀，样品颜色由透明的黄色或淡黄色变成透明无色；得到待上机样品；
将加标样品水浴孵育，水浴温度44℃，水浴孵育时间1小时，孵育时全程避光；向加标样品加入1.3mL终止液，混匀，样品颜色由透明的黄色或淡黄色变成透明无色；得到待上机加标样品；
所述终止液为乙腈和甲酸的混合溶液，乙腈和甲酸的体积比为12:1；
S4，检测
使用紫外分光光度仪，检测待上机样品在316nm处的吸光度Y样品以及待上机加标样品在316nm处的吸光度Y加标，根据脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式计算得到待测样品的脂肪酶活力计算值和加标样品的脂肪酶活力计算值；
脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式为，
Y吸光度＝KX酶活力+B；
式中，Y吸光度为待上机测试溶液的吸光度，X酶活力为待测溶液的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；其中待测溶液经过水浴孵育加入终止液后，得到待上机测试溶液；K和B为系数；
计算回收率，回收率计算公式为：R回收率＝(X加标-X样品)*100％/C；
式中，X样品为待测样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；X加标为加标样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；C为加标量，单位为mU/mL；
再利用回收率计算待测样品中脂肪酶活力真实值，
脂肪酶活力真实值计算公式为：A真实值＝X样品/R回收率；
式中A真实值是指待测样品中的脂肪酶活力真实值，单位为mU/mL；
步骤S4中脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式Y吸光度＝KX酶活力+B，经过如下步骤获得；
取4个离心管，作为标准曲线离心管，用作标准曲线的配制；
向第一个标准曲线离心管中，加入480μL的磷酸缓冲液，然后加入0μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品A，编号为标准曲线样品A；
向第二个标准曲线离心管中，加入450μL的磷酸缓冲液，然后加入30μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品B，编号为标准曲线样品B；
向第三个标准曲线离心管中，加入420μL的磷酸缓冲液，然后加入60μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品C，编号为标准曲线样品C；
向第一个标准曲线离心管中，加入360μL的磷酸缓冲液，然后加入120μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品D，编号为标准曲线样品D；
将标准曲线样品A、标准曲线样品B、标准曲线样品C、标准曲线样品D，4个样品置于44℃的水浴锅中，避光，水浴加热1小时；水浴后将离心管取出，每个离心管中加入1.3mL的终止液，摇匀，至离心管中液体由黄色透明变成无色透明；分别得到待上机标准曲线样品A、待上机标准曲线样品B、待上机标准曲线样品C、待上机标准曲线样品D；
用紫外分光光度仪测试待上机标准曲线样品A、待上机标准曲线样品B、待上机标准曲线样品C、待上机标准曲线样品D在316nm处的吸光度，拟合一次回归方程，得到脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式中的K和B的数值。
进一步的，步骤S1中，所述脂肪酶粉末应来源于荧光假单胞菌。
进一步的，步骤S1中，所述底物溶液在使用前应在流水下避光解冻。由于底物溶液在强光下极易分解，所以在底物解冻操作以及后续的实验过程中，底物均应避免接触强光。
进一步的，所述待测样品与加标样品一一对应，进行测试。即每一个待测样品都做一个加标样品与之对应同时测试。
进一步的，步骤S4中，进行分光光度测试时，采用石英比色皿。由于玻璃比色皿在316nm处有吸收值，对于检测结果会造成影响，所以应使用使用比色皿进行实验。
进一步的，步骤S1中，所述下清液中脂肪含量小于0.5g/100g。当脱脂效率超过90％时，加标样品回收率可以达到70％及以上，脱脂效率降低后，随着样品中的脂肪含量的增加，回收率随之下降，当脱脂效率降低到50％时，回收率普遍低于30％，检测结果线性度很差，导致检测结果不准确。
所述回收率受原料乳的脱脂效果的影响，为使检测结果准确，对脱脂效果的要求较为严格，操作者应将原料乳中脂肪尽可能的分离。
一种乳制品货架期评估方法，采用上述脂肪酶活力检测方法获得待测样品的脂肪酶活力真实值，将获得的脂肪酶活力真实值用于判断乳制品的货架期。
利用原料奶脂肪酶的定量检测来判断长保质期乳品的货架期，将原料乳中脂肪酶活力与长保质期乳品的货架期相关联，能够利用脂肪酶活力来对原料乳进行分级使用，并利用原料乳脂肪酶活力推测成品货架期。
进一步的，根据所述待测样品中的脂肪酶活力真实值，计算得到样品稀释液的脂肪酶活力真实值或者下清液中的脂肪酶活力真实值，将获得的样品稀释液的脂肪酶活力真实值或者下清液中的脂肪酶活力真实值用于判断乳制品的货架期。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，在脂肪酶的检测技术上更倾向于乳制品中的脂肪酶检测，使用该方法进行前处理的乳制品得到的样液澄澈无杂质，标准曲线的范围覆盖了原料乳中机会可能出现的所有酶活范围，且在该范围内标准曲线的吸光度线性关系良好，保证检测结果的准确，
2、本发明的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，检测速度更快，一般情况下从原料奶取样离心到得到最终结果通常在100分钟以内，所需仪器、试剂种类更为简单。
3、本发明的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，脂肪酶活力-吸光度的关系式的线性度普遍＞0.995，得到的结果更加准确可靠。
4、本发明的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，使用加标回收率反推的方式，最大程度的降低了脱脂后原料乳中残留脂肪对检测结果的影响。
5、本发明的货架期评价方法，通过利用大量原料乳脂肪酶活力的数据，并划分多个区间，对处于不同酶活区间的原料乳制成的成品进行了长期跟踪的口感品评，对其风味进行客观评价和描述，提供一种利用原料乳脂肪酶活力快速判断对应成品货架期的方法，帮助乳品生产工厂合理选用不同酶活区间的原料乳。
附图说明
图1是本发明实施例1中标准曲线样品的检测结果以及脂肪酶活力计算值-吸光度的曲线线性度结果。
图2是本发明实施例1中待测样品和加标样品的分光光度测试结果以及脂肪酶活力计算值以及真实值的计算结果。
图3是试验例2中原料乳中脂肪酶活力真实值统计直方图。
图4是试验例2中不同脂肪酶活力真实值的原料乳和成品风味的关系图。图4中，纵坐标轴上的“1”代表口感正常，“2”代表奶香味不足等轻微的风味变化，“3”代表豆腥味、陈腐味、氧化等异味。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明使用的原料和仪器如下：
4-硝基苯基辛酸酯，厂家：北京百灵威科技有限公司；规格：1g/瓶
脂肪酶粉末，厂家：Sigma，规格10g/瓶；
二甲基亚砜，厂家：诺尔施，规格500mL/瓶；
紫外分光光度计，厂家：天津普瑞斯仪器有限公司，型号752PC；
冷冻离心机，厂家：上海卢湘仪，型号：RGL-180T。
实施例1
脂肪酶稀释液的制备
准确称取0.025g 20000U/g脂肪酶粉末溶于100mL UP水中，混匀，制成5U/mL的脂肪酶母液；移取1ml 5U/ml的脂肪酶母液至9ml超纯水中，混匀后得到500mU/mL的脂肪酶二级母液，移取1mL二级母液至4mL超纯水中，得到100mU/mL的脂肪酶稀释液，待用。
其中脂肪酶母液存放于棕色额瓶中，避光2-6℃冷藏保存，有效期3天。脂肪酶稀释溶液应现用现配。
磷酸缓冲液的制备：
分别量取200mM 14mL磷酸二氢钠溶液和200mM 36mL磷酸氢二钠溶液，并向其中加入150mL UP水，加入0.1mL抗生素溶液，混匀后得到50mM，pH＝7.2磷酸缓冲液，2-6℃冷藏保存，有效期为2个月。其中磷酸二氢钠溶液与磷酸氢二钠溶液配制方法如下：
配制200mM磷酸二氢钠溶液；称取3.1202g磷酸二氢钠溶于30mL UP水中，并用容量瓶定容至100mL，2-6℃冷藏保存，有效期为2个月。
配制200mM磷酸氢二钠溶液；称取7.1628g磷酸氢二钠溶于30mL UP水中，并用容量瓶定容至100mL，2-6℃冷藏保存，有效期为2个月。
配制100mg/mL抗生素(头孢拉丁)溶液
将0.5g抗生素粉末溶于5mLUP水中。将溶解完成的抗生素溶液过滤灭菌，分装在灭菌的1.5mL或2.0mL的离心管中，2-6℃冷藏保存，有效期为1个月。
底物溶液的制备
称取0.1368g 4-硝基苯基辛酸酯溶于100mL二甲基亚砜中，将配制完成的溶液分装成10mL并用锡箔纸包裹避光，得到5mM的底物溶液；2-6℃冷藏保存，有效期为1个月。
终止液的制备
将乙腈(色谱纯)与甲酸(分析纯)按照12:1的比例混匀，现用现配。
样品稀释液的制备
准确移取30mL某牧场的原料乳于50mL离心管中，将离心管放入冷冻离心机中，调整参数：转速为10000转/min；离心时间为15min；除去脂肪，得到下清液。
取2个2mL离心管，作为缓冲液离心管；向两个缓冲液离心管中分别加入900μL磷酸缓冲液，吸取下清液100μL分别加入到两个缓冲液离心管中，得到两个样品稀释液，每个样品稀释液的体积均为1mL，两个样品稀释液作为平行样，两个样品稀释液编号分别为1#样品稀释液和2#样品稀释液，待用。
待测样品的制备
取2个2mL离心管，作为待测样品离心管。向两个待测样品离心管中分别加入180μL磷酸缓冲液，然后向其中一个待测样品离心管中加入300μL的1#样品稀释液，向另外一个待测样品离心管中加入300μL的2#样品稀释液；最后向两个待测样品离心管分别加入120μL底物溶液，混匀，制成两个待测样品，每个待测样品的体积为600μL，两个待测样品作为平行样，编号分别为BJ-1和BJ-2，待用。
加标样品的制备
取2个2mL离心管，作为加标样品离心管。向两个加标样品离心管中分别加入120μL磷酸缓冲液；然后向其中一个加标样品离心管中加入300μL的1#样品稀释液，向另外一个加标样品离心管中加入300μL的2#样品稀释液；然后向两个加标样品离心管分别中加入60μL脂肪酶稀释液；最后向两个加标样品离心管中分别加入120μL底物溶液，混匀，制成两个加标样品，每个加标样品的体积为为600μL，两个加标样品作为平行样，编号分别为“BJ-1-加标”和“BJ-2-加标”，待用。
标准曲线样品的制备
取4个离心管，作为标准曲线离心管，用作标准曲线的配制。
向第一个标准曲线离心管中，加入480μL的磷酸缓冲液，然后加入0μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品A，编号为标准曲线样品A。脂肪酶浓度0mU/mL。
向第二个标准曲线离心管中，加入450μL的磷酸缓冲液，然后加入30μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品B，编号为标准曲线样品B。脂肪酶浓度5mU/mL。
向第三个标准曲线离心管中，加入420μL的磷酸缓冲液，然后加入60μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品C，编号为标准曲线样品C。脂肪酶浓度10mU/mL。
向第四个标准曲线离心管中，加入360μL的磷酸缓冲液，然后加入120μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品D，编号为标准曲线样品D。脂肪酶浓度20mU/mL。
分光光度标准曲线标定
将标准曲线样品A、标准曲线样品B、标准曲线样品C、标准曲线样品D，4个样品置于44℃的水浴锅中，避光，水浴加热1小时。水浴后将离心管取出，每个离心管中加入1.3mL的终止液，摇匀，至离心管中液体由黄色透明变成无色透明。分别得到待上机标准曲线样品A、待上机标准曲线样品B、待上机标准曲线样品C、待上机标准曲线样品D；
将紫外分光光度计的波长设置为316nm，提前预热40min，预热结束后调零。取出石英比色皿，用超纯水清洗干净，分别得到待上机标准曲线样品A、待上机标准曲线样品B、待上机标准曲线样品C、待上机标准曲线样品D依次分别装入比色皿中，上机检测。其中，将0mU的待上机标准曲线样品A的读数结果调零，并在此基础上，检测后续三个的标准曲线样品。
记录检测结果，并标定曲线。将待上机标准曲线样品A的吸光度为0.000、待上机标准曲线样品B的吸光度为0.420、待上机标准曲线样品C的吸光度为0.800、待上机标准曲线样品D的吸光度为1.556。
使用excel表格进行标定曲线，如图1所示。曲线的线性度为0.9995，符合实验要求，并根据脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式：
Y吸光度＝0.0774X酶活力+0.0168
上式中，Y吸光度为待上机测试溶液的吸光度，X酶活力为待测溶液的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；其中待测溶液经过水浴孵育加入终止液后，得到待上机测试溶液。
待测样品和加标样品检测
将待测样品BJ-1、待测样品BJ-2、加标样品BJ-1-加标、加标样品BJ-2-加标置于44℃的水浴锅中，避光，水浴加热1小时。水浴后将离心管取出，每个离心管中加入1.3mL的终止液(即乙腈与甲酸12:1混匀制成)，摇匀，至离心管中液体由黄色透明变成无色透明。得到待上机样品BJ-1、待上机样品BJ-2、待上机加标样品BJ-1-加标、待上机加标样品BJ-2-加标。
将上述四个待上机样品用0.22μm滤头分别过滤至石英比色皿中再进行分光光度测试，读数。待上机样品BJ-1的吸光度为0.314、待上机样品BJ-2的吸光度为0.318、待上机加标样品BJ-1-加标的吸光度为0.849待上机加标样品BJ-2-加标的吸光度为0.878。
根据每组待测样品和加标样品的吸光度测试结果，代入到脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式中，得到待测样品的脂肪酶活力计算值X样品和加标样品的脂肪酶活力计算值X加标；其中，待测样品BJ-1和加标样品BJ-1-加标为第一组测试数据；待测样品BJ-2和加标样品BJ-2-加标为第二组测试数据。
计算回收率，
回收率计算公式为：R回收率＝(X加标-X样品)*100％/10
第一组测试数据的回收率为69.12％；第二组测试数据的回收率为72.35％。
根据回收率折算得到样品中的脂肪酶活力真实值。
样品中脂肪酶活力真实值计算公式：A真实值＝X样品/R回收率
计算得到待测样品BJ-1的脂肪酶活力真实值为5.56mU/mL，待测样品BJ-2的脂肪酶活力真实值为5.38mU/mL。
试验例1
回收率公式中加标量的确定
加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100％。
加标量的实验确定过程：
采用实施例1的方法，采用相同的待测样品，以及不同加标量的加标样品进行测试，确定加标量对检测结果的影响。
其中，在加标样品制备时，缓冲溶液和脂肪酶稀释液的加入量不同，在制备加标样品时，分别加入170μL、150μL、120μL、90μL、60μL、30μL磷酸缓冲液；加入样品稀释液后，再加入10μL、30μL、60μL、90μL、120μL、150μL脂肪酶稀释液，制得加标量分别为1.67mU/mL、5mU/mL、10mU/mL、15mU/mL、20mU/mL、25mU/mL的加标样品。经过孵育，加入终止液后，得到6个待上机加标样品，编号分别为加标量-1，加标量-2，加标量-3，加标量-4，加标量-5，加标量-6；测试得到本底吸光度为0.369，加标吸光度分别为0.399，0.598，0.831，0.995，1.021，1.118。加标回收率分别为22.2％，56.5％，57.0％，51.5％，40.2％，37.0％。测试结果汇总如下表，
表1，加标样品浓度和回收率的关系
编号 加标样品浓度(mU/mL) 吸光度 本底吸光度 加标回收率
加标量-1 1.67 0.399 0.369 22.2％
加标量-2 5.00 0.598 0.369 56.5％
加标量-3 10.00 0.831 0.369 57.0％
加标量-4 15.00 0.995 0.369 51.5％
加标量-5 20.00 1.021 0.369 40.2％
加标量-6 25.00 1.118 0.369 37.0％
实验中的加标量与标准曲线的范围相关，一般选取标准曲线最高点的四分之一至四分之三范围内作为加标的理论浓度，根据上述吸光度测试结果，选取5-15mU/mL的加标均能满足实验要求，更优选的，使用10mU/mL作为加标的理论浓度，更接近标准曲线中值。实验证明，当加标量超过20mU/mL时,加标样品检测结果的吸光度偏离标准曲线的线性范围，加标回收率降低(不足50％)。
试验例2
脂肪酶活力与成品风味的关系
采用实施例1的方式，分析多个牧场约115个原料乳的脂肪酶活力范围，原料乳中脂酶范围基本符合正态分布的规律，如图3所示。以正态分布的规律为基础，将测得脂肪酶活力后的不同牧场的原料奶对应的超高温灭菌(Ultra-high temperature instantaneoussterilization，UHT)成品进行常温储存，模拟货架陈列。
邀请60名志愿者进行盲评打分，志愿者在品尝前后用矿泉水漱口，感官品评小组在10/20/30/60/90/120天后进行口感品评，客观的记录其风味，感官评价结果如图4所示。
脂肪酶活力与成品风味之间的关系为：
当脂肪酶活力处于较高水平时(10mU/mL以上时)，对应成品储存30天时出现了奶香味不足、滋味寡淡的情况，在60天时，脂肪酶活力处于8.0-10.0mU/mL的实验组出现了奶香味不足的现象，而脂肪酶活力最高的实验组(＞13mU/mL)则出现了轻微的豆腥味。而脂肪酶水平低于8.0mU/mL一组在120天内，其滋气味均处于正常水平。在第90天，除脂肪酶活力最低的一组外，其余三组均出现了异味。
采用实施例1的测试方法，获得的脂肪酶活力数值，能有用于评估制品的货架期。进而能够快速推断出不同脂肪酶活力值的原料乳生产出对应的灭菌乳成品在常温条件下储存(25℃±2℃)的货架期时间。
例如实施例1中，检测得到的5.56mU/mL和5.38mU/mL的原料奶均低于8.0mU/mL，采用实施例1中的样品原料乳生产的成品在正常储运条件下，120天内不会出现明显的感官异常。
脂肪酶活力会随着运输和储存时间的增加而增加，一般在72小时达到顶峰，72小时之后，脂肪酶由于原料乳酸度的增加而失活，其活力开始降低。而脂肪酶活力较高的原料乳通常其微生物指标(菌落总数、嗜冷菌指标)相对较差，原料乳中脂肪酶活力基本符合正态分布，原料乳中脂肪酶活力通常处于3.0-9.0mU/mL之间，而脂肪酶活力处于9.0-12.0mU/mL，甚至高于12.0mU/mL的原料乳，相比于脂肪酶活力在3.0-9.0mU/mL之间的原料乳，制成的成品更早的出现奶香味不足、陈腐味以及豆腥味等异常风味。
试验例3
按照实施例1的方法，对同一原料乳，测试6个平行样品，测试结果如下：
表2，同一原料乳平行样测试结果
Figure BDA0003131971710000181
由上述实验结果可知，本发明的检测方法，检测结果CV值为3.62％，测试结果重现性良好，回收率稳定，能够符合实验要求。
试验例4
不同标准曲线线性度比较
按照实施例1中标准曲线样品的制备方法分别得到脂肪酶浓度为25mU/mL标准曲线样品E，脂肪酶浓度为35mU/mL标准曲线样品F。
将标准曲线样品E、标准曲线样品F分别置于44℃的水浴锅中，避光，水浴加热1小时。水浴后将离心管取出，每个离心管中加入1.3mL的终止液，摇匀，至离心管中液体由黄色透明变成无色透明。得到待上机标准曲线样品E、待上机标准曲线样品F；
将待上机标准曲线样品E、待上机标准曲线样品F装入比色皿中，上机检测。记录检测结果，待上机标准曲线样品E的吸光度为1.799，待上机标准曲线样品F的吸光度为2.025。
将浓度为0、5、10、20、25mU/mL的测试结果，拟合得到脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式为Y吸光度＝0.0728X酶活力+0.0416，曲线的线性度为0.9956。
将浓度为0、5、10、20、25、30mU/mL的测试结果，拟合得到脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式为Y吸光度＝0.0682X酶活力+0.0736，曲线的线性度为0.9889。
表3，不同脂肪酶浓度待测样品和吸光度的关系
编号 待测样品中的脂肪酶浓度(mU/mL) 待上机样品的吸光度
A 0.000 0.000
B 5.000 0.420
C 10.000 0.800
D 20.000 1.556
E 25.000 1.799
F 30.000 2.025
当浓度超过25mU/mL以上时，测试误差变大。
对比例1
对实施例1中经过离心分离后，未对下清液及时取样，经过0.5小时后，再进行取样。得到待测样品D-1和加标样品D-1-加标。按照实施例1的方法，得到待测样品D-1的脂肪酶活力真实值，测试结果为3.09mU/mL。测试结果明显低于实施例1和试验例3中的脂肪酶活力真实值。
这是因为在原料乳离心后未及时对下清液进行取样，造成脂肪复溶，导致样品中过多的脂肪影响脂肪酶对底物的分解，导致检测结果吸光度大大降低，不能得到准确的检测结果。
对比例2
在配制样品稀释液时，加入不同量的磷酸缓冲液，其中下清液和磷酸缓冲液的体积比如下表。分别吸取不同比例的样品稀释液300μL，按照实施例1的实验方法得到12个待测样品，经孵育后，加入终止液，编号分别为E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7、E-8、E-9、E-10、E-11、E-12。采用实施例1的方法测试吸光度。测试结果如下，
表4，下清液不同稀释比例对测试结果的影响
编号 稀释比例 下清液 磷酸缓冲液 吸光度
E-1 1:1 1000μL 1000μL 2.037
E-2 1:1 1000μL 1000μL 2.192
E-3 1:1 1000μL 1000μL 2.098
E-4 1:1 1000μL 1000μL 2.230
E-5 1:2 600μL 1200μL 1.765
E-6 1:2 600μL 1200μL 1.771
E-7 1:2 600μL 1200μL 1.820
E-8 1:2 600μL 1200μL 1.828
E-9 1:4 400μL 1600μL 0.544
E-10 1:4 400μL 1600μL 0.537
E-11 1:7 200μL 1400μL 0.446
E-12 1:7 200μL 1400μL 0.442
BJ-1 1:9 100μL 900μL 0.314
BJ-2 1:9 100μL 900μL 0.318
从上述实验结果可知，若稀释比例过低(1:1、1:2时)，会导致最终样品吸光度过高(甚至高于标准曲线的最高点)，使检测结果偏离标准曲线的线性范围，导致检测结果不准确。当稀释范围在1:7～1:9时，测试结果处于标准曲线范围之内，计算结果更准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤；
S1，配置样品稀释液，将原料乳脱脂处理，得到下清液；将所述下清液用磷酸缓冲液稀释，得到样品稀释液；配制脂肪酶稀释液；
S2，待测样品和加标样品的制备；
取第一容器，向第一容器中加入磷酸缓冲液，然后加入样品稀释液，最后加入底物溶液；混匀，得到待测样品；
取第二容器，向第二容器中加入磷酸缓冲液，然后加入样品稀释液，加入脂肪酶稀释液，最后加入底物溶液；混匀，得到加标样品；
第一容器和第二容器中加入的样品稀释液的量相同；
所述底物溶液为4-硝基苯基辛酸酯的二甲基亚砜溶液；
S3，预处理
将待测样品水浴孵育，加入终止液，得到待上机样品；
将加标样品水浴孵育，加入终止液，得到待上机加标样品；
待测样品和加标样品中加入的终止液的量相同；
S4，检测
检测待上机样品在316nm处的吸光度Y样品以及待上机加标样品在316nm处的吸光度Y加标，根据脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式计算得到待测样品的脂肪酶活力计算值和加标样品的脂肪酶活力计算值；
脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式为，
Y吸光度＝KX酶活力+B；
式中，Y吸光度为待上机测试溶液的吸光度，X酶活力为待测溶液的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；其中待测溶液经过水浴孵育加入终止液后，得到待上机测试溶液；K和B为系数；
计算回收率，回收率计算公式为：R回收率＝(X加标-X样品)*100％/C；
式中，X样品为待测样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；X加标为加标样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；C为加标量，单位为mU/mL；
再利用回收率计算待测样品中脂肪酶活力真实值，
脂肪酶活力真实值计算公式为：A真实值＝X样品/R回收率；
式中A真实值是指待测样品中的脂肪酶活力真实值，单位为mU/mL。
2.根据权利要求1所述的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，步骤S4中脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式Y吸光度＝KX酶活力+B，经过如下步骤获得；
取多个容器，分别向每个容器中加入相同量的磷酸缓冲液，然后向每个容器中分别加入不同量的脂肪酶稀释液，然后向每个容器中加入底物溶液；得到多个不同脂肪酶浓度的标准曲线样品；
将多个标准曲线样品水浴孵育，然后向多个标准曲线样品分别加入终止液，得到多个待上机标准曲线样品；
分别测试每个待上机标准曲线样品在316nm处的吸光度，获得不同脂肪酶浓度的标准曲线的吸光度，拟合一次回归方程，得到脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式中的K和B的数值。
3.根据权利要求1所述的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，步骤S1中，将下清液和磷酸缓冲溶液按照体积比1:7-1:9混合，得到样品稀释液。
4.根据权利要求1所述的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，回收率计算公式，R回收率＝(X加标-X样品)*100％/C；其中的C值的取值范围为5-15mU/mL。
5.根据权利要求3所述的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，回收率计算公式，R回收率＝(X加标-X样品)*100％/C；其中C的值为10mU/mL。
6.根据权利要求1所述的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，步骤S3中，所述终止液为乙腈和甲酸的混合物。
7.根据权利要求6所述的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，所述终止液中乙腈和甲酸的体积比为12:1。
8.根据权利要求1所述的原料乳中脂肪酶活力的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，配置样品稀释液：将原料乳进行离心脱脂，吸取100μL下清液于900μL磷酸缓冲液中，得到样品稀释液；
配制脂肪酶稀释液：将脂肪酶粉末溶于水中，配制100mU/mL的脂肪酶稀释溶液；
S2，取待测样品离心管，向待测样品离心管中加入180μL磷酸缓冲液，然后向个待测样品离心管中加入300μL样品稀释液；最后向两个待测样品离心管分别加入120μL底物溶液，混匀，制成待测样品，待测样品的体积为600μL；
取加标样品离心管。向加标样品离心管中加入120μL磷酸缓冲液；然后向加标样品离心管中加入300μL的样品稀释液，然后加标样品离心管中加入60μL脂肪酶稀释液；最后向加标样品离心管中加入120μL底物溶液，混匀，制成加标样品，加标样品的体积为600μL；
所述底物溶液为浓度5mM的4-硝基苯基辛酸酯的二甲基亚砜溶液；
S3，预处理
将待测样品水浴孵育，水浴温度44℃，水浴孵育时间1小时，孵育时全程避光；向待测样品加入1.3mL终止液，混匀，样品颜色由透明的黄色或淡黄色变成透明无色；得到待上机样品；
将加标样品水浴孵育，水浴温度44℃，水浴孵育时间1小时，孵育时全程避光；向加标样品加入1.3mL终止液，混匀，样品颜色由透明的黄色或淡黄色变成透明无色；得到待上机加标样品；
所述终止液为乙腈和甲酸的混合溶液，乙腈和甲酸的体积比为12:1；
S4，检测
使用紫外分光光度仪，检测待上机样品在316nm处的吸光度Y样品以及待上机加标样品在316nm处的吸光度Y加标，根据脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式计算得到待测样品的脂肪酶活力计算值和加标样品的脂肪酶活力计算值；
脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式为，
Y吸光度＝KX酶活力+B；
式中，Y吸光度为待上机测试溶液的吸光度，X酶活力为待测溶液的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；其中待测溶液经过水浴孵育加入终止液后，得到待上机测试溶液；K和B为系数；
计算回收率，回收率计算公式为：R回收率＝(X加标-X样品)*100％/C；
式中，X样品为待测样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；X加标为加标样品的脂肪酶活力计算值，单位为mU/mL；C为加标量，单位为mU/mL；
再利用回收率计算待测样品中脂肪酶活力真实值，
脂肪酶活力真实值计算公式为：A真实值＝X样品/R回收率；
式中A真实值是指待测样品中的脂肪酶活力真实值，单位为mU/mL；
步骤S4中脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式Y吸光度＝KX酶活力+B，经过如下步骤获得；
取4个离心管，作为标准曲线离心管，用作标准曲线的配制；
向第一个标准曲线离心管中，加入480μL的磷酸缓冲液，然后加入0μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品A，编号为标准曲线样品A；
向第二个标准曲线离心管中，加入450μL的磷酸缓冲液，然后加入30μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品B，编号为标准曲线样品B；
向第三个标准曲线离心管中，加入420μL的磷酸缓冲液，然后加入60μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品C，编号为标准曲线样品C；
向第一个标准曲线离心管中，加入360μL的磷酸缓冲液，然后加入120μL的脂肪酶稀释液，最后加入120μL底物溶液，混匀，得到标准曲线样品D，编号为标准曲线样品D；
将标准曲线样品A、标准曲线样品B、标准曲线样品C、标准曲线样品D，4个样品置于44℃的水浴锅中，避光，水浴加热1小时；水浴后将离心管取出，每个离心管中加入1.3mL的终止液，摇匀，至离心管中液体由黄色透明变成无色透明；分别得到待上机标准曲线样品A、待上机标准曲线样品B、待上机标准曲线样品C、待上机标准曲线样品D；
用紫外分光光度仪测试待上机标准曲线样品A、待上机标准曲线样品B、待上机标准曲线样品C、待上机标准曲线样品D在316nm处的吸光度，拟合一次回归方程，得到脂肪酶活力计算值-吸光度的关系式中的K和B的数值。
9.一种乳制品货架期评估方法，其特征在于，采用如权利要求1-9任一所述的脂肪酶活力检测方法获得待测样品的脂肪酶活力真实值，将获得的脂肪酶活力真实值用于判断乳制品的货架期。
10.根据权利要求9的乳制品货架期的评估方法，其特征在于，根据所述待测样品中的脂肪酶活力真实值，计算得到样品稀释液的脂肪酶活力真实值或者下清液中的脂肪酶活力真实值，将获得的样品稀释液的脂肪酶活力真实值或者下清液中的脂肪酶活力真实值用于判断乳制品的货架期。
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