JP2013139454A - 神経細胞に化合物を導入するために用いられる輸送タンパク質 - Google Patents

Abstract

【課題】ニューロンと結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによって取り込まれ、酸性エンドソームコンパートメントからニューロンのサイトゾル中に輸送される輸送タンパク質を提供する。
【解決手段】ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖の改変によって得られる輸送タンパク質。該タンパク質は、天然の神経毒として高い親和性で神経細胞に特異的に結合する。また、輸送タンパク質、輸送タンパク質をコードする核酸、輸送タンパク質を含む医薬組成物および化粧料組成物の製造方法、並びにそれらの使用。
【選択図】なし

Description

本発明はニューロンと結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによって取り込まれ、酸性エンドソームコンパートメントからニューロンのサイトゾル中に輸送される輸送タンパク質に関する。このタンパク質は、原形質膜を通って神経細胞のサイトゾル中に生理学的には透過できないその他の化学物質（例えば、プロテアーゼ）を輸送するための輸送手段として用いられる。本発明は、神経伝達物質の放出を阻害するための輸送タンパク質の使用に関する。

神経細胞は、エキソサイトーシスによって伝達物質を放出する。細胞内小胞の膜の、原形質膜との融合がエキソサイトーシスと呼ばれる。このプロセスの過程では、シナプス間隙に小胞の内容物が同時に放出される。２種の膜の融合は、タンパク質シナプトタグミンと反応するカルシウムによって制御されている。シナプトタグミンは、その他の補助因子とともに、３種のいわゆる融合タンパク質、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン２およびシンタキシン１Ａの状態を制御する。シンタキシン１Ａおよびシナプトブレビン２は原形質膜および／または小胞膜に組み込まれており、ＳＮＡＰ−２５は原形質膜と軽くしか結合していない。細胞内カルシウム濃度が上昇する範囲内で、３種のタンパク質は互いに結合し、両方の膜が互いに接近し、続いて、一緒になって融合する。コリン作動性ニューロンの場合には、アセチルコリンが放出され、筋収縮、発汗およびその他のコリン作動性に誘発される反応を引き起こす。

上記の融合タンパク質が、細菌ボツリヌス菌によって形成されるクロストリジウムの神経毒の軽鎖の標的分子（基質）である。

嫌気性グラム陽性菌ボツリヌス菌は、７種の異なる種類のタンパク質神経毒を産生する。後者はボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ａ〜ＢｏＮＴ／Ｇ）と呼ばれる。これらの中でも、特に、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｂが、ヒトおよび動物においてボツリヌス中毒と呼ばれる神経麻痺性障害を引き起こす。ボツリヌス菌の胞子は、土壌中に見い出すことができるが、誤って滅菌され、密閉された自家製貯蔵食品中で発育する場合もあり、これが、ボツリヌス中毒の多くの場合の原因である。

ＢｏＮＴ／Ａは、全ての公知の生物学的物質のうちで最も致死的である。５〜６ｐｇほどの少量の精製ＢｏＮＴ／Ａが、ＭＬＤ（多重低用量(multiple low dose)）に相当する。ＢｏＮＴの１ユニット（Ｅｎｇｌ．：ユニット、Ｕ）は、腹腔内注射後に、各々体重１８〜２０ｇ雌のスイスウェブスターマウスの半数を死滅させるＭＬＤとして定義される。７種の免疫学的に異なるＢｏＮＴが特性決定された。それらはＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ₁、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧと表され、血清型特異的抗体での中和によって区別できる。ＢｏＮＴの種々の血清型は、引き起こされる麻痺の重篤度および期間に関して感染した動物種で異なる。したがって、麻痺に関しては、ＢｏＮＴ／Ａは、ラットでは、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂより５００倍より強力である。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂは、４８０Ｕ／体重１Ｋｇの投与量では霊長類では毒性ではないことが証明されている。同量のＢｏＮＴ／Ａは、霊長類におけるこの物質の致死量（ＬＤ）の１２倍に相当する。他方、マウスにおけるＢｏＮＴ／Ａ注射後の麻痺期間は、ＢｏＮＴ／Ｅの注射後よりも１０倍長い。

ＢｏＮＴは、病的に過敏性の末梢神経によって引き起こされる骨格筋の運動亢進を特徴とする神経筋障害を治療するために臨床使用されている。ＢｏＮＴ／Ａは、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣を治療するために米国食品医薬品局によって承認されている。ＢｏＮＴ／Ａと比較して、残りのＢｏＮＴ血清型は明らかにあまり有効でなく、短期間の効力しか示さない。末梢−筋内投与されるＢｏＮＴ／Ａの臨床効果は、通常、１週間以内に気付くことができる。ＢｏＮＴ／Ａの１回の単一筋内注射による症状抑制期間は、通常、約３ヶ月である。

クロストリジウム神経毒は、融合装置の種々のタンパク質を特異的に加水分解する。ＢｏＮＴ／Ａ、Ｃ₁およびＥはＳＮＡＰ−２５を開裂するのに対し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇならびに破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）は、小胞結合膜タンパク質（ＶＡＭＰ）２（シナプトブレビン２とも呼ばれる）を攻撃し、ＢｏＮＴ／Ｃ₁はさらに、シンタキシン１Ａを開裂する。

クロストリジウム細菌は、神経毒を、各々１２５１〜１３１５アミノ酸を有する一本鎖ポリペプチドとして放出する。その後、内在性プロテアーゼがこれらのタンパク質の各々を規定の位置で、各々２つの鎖に開裂する（「ニッキング」）が、２つの鎖はジスルフィド架橋によってまだ連結されている。これらの二重鎖タンパク質がホロ毒素と呼ばれる（ショーン(Shone)ら、（１９８５）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１５１、７５〜８２頁を参照のこと）。この２つの鎖は異なる機能を有する。小さい断片、軽鎖（light chain＝ＬＣ）がＺｎ²⁺依存性エンドプロテアーゼに相当し、大きいユニット（heavy chain（重鎖）＝ＨＣ）が軽鎖の輸送手段に相当する。ＨＣをエンドペプチダーゼで処理することによって、２つの５０ｋＤａの断片が得られた（ヒメネス(Gimenez)ら、（１９９３）、ジャーナル・オブ・プロテイン・ケミストリー(Journal of Protein Chemistry)１２、３５１〜３６３頁を参照のこと）。アミノ末端側の半分（Ｈ_N−断片）は、低ｐＨ値で膜に組み込まれ、ＬＣが神経細胞のサイトゾルに透過するのを可能にする。カルボキシ末端側の半分（Ｈ_C−断片）は、もっぱら、神経細胞膜に生じる複合体ポリシアロガングリオシドと、および今日まで同定されていないタンパク質受容体と結合する（ハルパーン(Halpern)ら、（１９９３）、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbialogy and Immunology)１９５、２２１〜２４１頁）。後者は、クロストリジウムの神経毒の高い神経選択性を説明している。結晶構造により、ＢｏＮＴ／Ａが３つのドメインを整理することが確認され、これは３ステップの作用機序と一致し得る（レイシー(Lacy)ら（１９９８）ネイチャー・ストラクチュラル・バイオロジー(Nature Structural Biology)５、８９８〜９０２頁を参照のこと）。さらに、これらのデータは、Ｈ_C−断片内に、各２５ｋＤａの２つの自律的サブユニット（サブドメイン）が存在するという結論につながる。２つの機能的サブドメインの存在についての第1の証拠は、ＴｅＮＴのＨ_C−断片のアミノ末端側（Ｈ_CNおよびカルボキシ末端側の半分（Ｈ_CC）によってもたらされ、これらは組換え型で発現され、Ｈ_CC−はニューロンと結合するがＨ_CNドメインは結合しないということを示した（エレロス(Herreros)ら（２０００）、バイオケミカル・ジャーナル(Biochemical Journal)３４７、１９９〜２０４頁を参照のこと）。シナプトタグミンのタンパク質受容体結合部位は、ＢｏＮＴ／ＢおよびＧのＨ_CC−ドメイン内に発見され、このことは、それらの別個の機能性を証明した（ルメル(Rummel)ら、（２００４）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７９、３０８６５〜７０頁を参照のこと）。

ＨＣは、生理学的条件下では、ニューロンのガングリオシドと結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の内側に受け入れられ、エンドソームコンパートメントを介して天然の小胞の循環に到達する。初期エンドソームの酸性媒質では、Ｈ_N、ＨＣのアミノ末端側の半分は小胞膜中に透過し、孔を形成する。ジスルフィド架橋を介してＨＣと結合している各物質（Ｘ）は、細胞内レドックスシステムによってＨＣから開裂されて離れ、ジスルフィド架橋に近づき、これを還元する。Ｘは最終的にはサイトゾル中に現れる。

クロストリジウムの神経毒の場合には、ＨＣはＬＣの担体であり、最終ステップでサイトゾルにおいてその特異的基質を開裂する。融合タンパク質の複合体の形成および解離のサイクルが妨げられ、その結果、アセチルコリンの放出が阻害される。その結果として、横紋筋が麻痺し、汗腺がその分泌を停止する。個々のＢｏＮＴ血清型の活性期間は異なり、サイトゾル中の無傷のＬＣの存在に応じて変わる。すべてのニューロンがクロストリジウムの神経毒の受容体を有するので、影響を受け得るのはアセチルコリンの放出だけではなく、サブスタンスＰの、ノルアドレナリンの、ＧＡＢＡ、グリシン、エンドルフィンおよびその他の伝達物質およびホルモンの放出も可能性がある。

コリン作動性伝達が選択的に遮断されることは、末梢のＨＣがニューロンに入るという事実によって説明できる。中枢シナプスは、タンパク質では克服できない血液−脳関門によって保護されている。

ＨＣは、複合体ポリシアロガングリオシド（これらは２以上のシアリン酸(sialine acid)からなるグリコール脂質である）との相互作用によって大部分が媒介される、末梢神経細胞に対する高親和性を有する（ハルパーン(Halpern)ら、（１９９５）、カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbiology and Immunology)１９５、２２１〜２４１頁参照のこと）。結果として、それらと結合しているＬＣがこの細胞種のみに到達し、これらの細胞においてのみ活性となる。ＢｏＮＴ／ＡおよびＢは各々、１分子のガングリオシドＧＴ１ｂとのみ結合する。

結合ポケットを構築するアミノ酸によって果たされる役割を探索するために、組換えＨ_C−断片を本発明にしたがって作製した。この技術によって、個々のアミノ酸を交換することが可能となる。したがって、正に荷電したアミノ酸を負に荷電したアミノ酸または中性のアミノ酸によって置換でき、その逆も可能である。結合ポケットの表面のわずかな改変は、ガングリオシドの通過能力に関して著しい効果をもたらさない。親和性は、例えば、位置１２６６のアミノ酸、トリプトファン（ＳＸＷＹ輸送性のＷと呼ばれる）が脂肪族残基、例えば、ロイシンによって置換されると、９９％よりも多く低下することがわかった。しかし、その逆も観察された。結合ポケットに及ぶアミノ酸の置換は、ガングリオシドの親和性の増大をもたらした。結合ポケットの立体配置は、ＨＣのガングリオシド受容体に対する親和性にとって極めて決定的であるので、結合しているＬＣのタンパク質分解効力は、ＨＣのガングリオシド受容体に対する親和性と同時に、親和性と調和して増大または減少する。

したがって、リガンド−受容体研究では、ＢｏＮＴ／Ａのガングリオシド結合ポケットにおいて、特異的アミノ酸残基を本発明によって特性決定し、ガングリオシド受容体に対する親和性を増大するよう、しかるべく置換した。変異Ｈ_C−断片の親和性は、ガングリオシドおよびシナプトソーム結合アッセイにおいて調べた。続いて、トロンビン感受性アミノ酸配列が用いられることを目的として、同一の変異を示すＨＣをＬＣ−Ａと結合した。トロンビンによって組換えタンパク質を活性化し（ニックを入れ）、両方の鎖が単一のジスルフィド架橋によって連結されている二重鎖分子を得た。構築物の活性は、ラット脳のシナプトソーム（伝達物質を放出する標本）において調べた。伝達物質放出阻害の程度を、構築物の活性の程度の尺度と考えた。さらに、個々の構築物の効力を、クロストリジウムの神経毒の生理学的対象に相当する、マウスの単離した神経筋標本（半横隔膜アッセイ＝ＨＤＡ）によって分析した。

ＴｒａｐｏＸで治療される障害および症状は、運動ニューロンおよび自律神経細胞の局所的に増大した活性を伴う。活性の増大は、これらの細胞によって活気を与えられる筋肉の有痛性の筋痙攣および腺細胞からの過度の液体分泌をもたらす。さらに、活性の増大によって、顔面のしわが種々の領域に生じる。原因は、末梢神経終末からのアセチルコリンの病的に増大した放出である。ＴｒａｐｏＸを感染筋肉に注射すると、感染筋肉が弛緩すること、分泌が途絶えることおよび顔面の皮膚が滑らかになることが、１〜３日の待ち時間の後に起こる。これは、ＴｒａｐｏＸによるアセチルコリンの放出の阻害によるものである。患者は、実質的に、疼痛がなくなり、筋痙攣によって引き起こされる疼痛は軽減され、完全に消失する。

アセチルコリンの放出は、ヒトならびに動物の両方において阻害される。したがって、通常、毒物事例におけるＢｏＮＴの証明として、ならびにＢｏＮＴ薬物（ボトックス(Botox)、ディスポート(Dysport)、キセオミン(Xeomin))の活性測定のための両方で動物試験が一般的に用いられる。ＢｏＮＴの活性は、マウスにおいてＬＤ₅₀の測定を実施することによって定量化される。これに関連して、ある試験群の動物の５０％を死滅させる用量を決定する。動物を全く破壊しない用量は別として、ある群の動物の１００％死滅させる用量を投与する場合もあることは明らかである。毒物は全身（ｉ．ｐ．）投与されるので、多数の動物は呼吸筋の麻痺によって引き起こされる呼吸停止で苦しんで死亡する。本発明者らは、動物試験を避けるため、マウス半横隔膜アッセイを導入した。ＬＤ₅₀試験を用いると、試験マウスは呼吸筋の麻痺によって引き起こされる呼吸麻痺で死亡する。これは、活気を与える神経（横隔神経)を含む呼吸筋をマウスから採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで毒物を与えることができるということを意味する。ＢｏＮＴはその受容体と結合し、細胞に入り、輸送され、最後にその基質を開裂し、するとすぐに筋麻痺が起こる。ＬＤ₅₀値と呼吸筋の麻痺の間には厳密な相関関係がある。このｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、言わば、動物試験の質を落とした変形に相当する（ウォールファース(wohlfarth)Ｋ、ゴッシェル(Goeschel)H、フレバート(Frevert)J、デングラー(Dengler)R、ビガルケ(Bigalke)H、ボトリナム・エー・トキシス：ユニッツ・バーサス・ユニッツ(Botolinum A toxis : units versus units)。ナウニン・シュミーデベルグス・アーカイブ・オブ・ファルマコロジー(Naunyn Schmiedeberg's Archives of Pharmacology)１９９７年３月、３３５（３）、３３５〜４０頁）。

したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで横隔膜を麻痺させるＢｏＮＴはまた、生存しているマウスにおいても作用し、投与される用量にしたがって後者を死亡させると推定できる。この動物試験代替法は確かなものであるので、マウス半横隔膜アッセイはＥＵ薬局方によってＢｏＮＴの公式の試験法としてＥＵ加盟国に間もなく承認されるであろう。したがって、マウス横隔膜標本におけるＴｒａｐｏＸの効力の増大は、同様にヒトにおける効力の増大を示唆する。

より最近では、ＢｏＮＴ／Ａ複合体は、運動ジストニアを治療するために、ならびに過度の交感神経活性を減弱するために（ベネック(Benecke)ら（１９９５）、エーケーティー・ニューロロジー(Akt Neurology)２２、２０９ｆｆ参照のこと）、また疼痛および片頭痛を軽減するために（シチャ(Sycha)ら（２００４）ジャーナル・オブ・ニューロロジー(Journal of Neurology)２５１、１９〜３０頁を参照のこと）用いられた。この複合体は、ニューロトキシン、種々の赤血球凝集素および非毒性の赤血球凝集性でないタンパク質からなる。この複合体は、生理学的ｐＨで迅速に解離する。結果として生じる神経毒は、治療上関連のある症状の軽減をもたらす、複合体の唯一の成分である。根本にある精神疾患は治療されないので、複合体は３〜４ヶ月間隔で再度注射される必要がある。注射される外来タンパク質の量に応じて、患者の中には、特異的ＢｏＮＴ／Ａ抗体を作るものもある。これらの患者は神経毒に対して耐性となる。抗原感受性細胞が神経毒を認識し、抗体が形成されると、関連する脳細胞は数年にわたって保存される。このために、できる限り少ない投与量の、できる限り高い活性の調製物を用いて患者を治療することが重要である。さらに、調製物は、細菌起源のいかなるさらなるタンパク質も含んではならないが、これはこれらが免疫アジュバントとして作用する可能性があるからである。このような物質は、マクロファージを誘引し、マクロファージは免疫アジュバントと神経毒の両方を認識し、それらをリンパ球に提示し、その結果、免疫グロブリンを形成することによって対応される。結果として、いかなる外来タンパク質も含まない極めて純粋な製品のみが治療用に使用できる。

本発明を、添付の図面によって明らかにする。
ラット脳から得たシナプトソーム膜標本に対するＢｏＮＴ／Ａの変異したＨ_C−断片の親和性が、ＢｏＮＴ／Ａの野生型のＨ_C−断片のものよりも３倍高いことを示す図である。 種々のＢｏＮＴ／Ａ Ｈ_C−断片変異体の、ラット脳シナプトソームとの結合を、ＢｏＮＴ／Ａ Ｈ_C−断片野生型の親和性を標準として１００％に設定して示す図である。第１の柱は、ＢｏＮＴ／Ａ変異体の親和性を示し、アミノ酸Ｙ１１１７の変異が増加をもたらすことを示す。第２の柱は、さらなるＢｏＮＴ／Ａ変異体を示す。第３のカラムは、神経細胞膜（シナプトソーム）との結合を増強する、二重の変異を示すＢｏＮＴ／Ａ変異体の親和性を示す。 マウスの単離した横隔神経−横隔膜筋標本に対する、ＢｏＮＴ／Ａ野生型と比較した、ＢｏＮＴ／ＡのＹ１１１Ａ変異体の神経毒性の増加を示す図である。 神経細胞膜（シナプトソーム）における４種のＢｏＮＴ／Ａ Ｈ_C−断片ハイブリッドＨ_CＡＢ、Ｈ_CＡＣ、Ｈ_CＡＥおよびＨ_CＡＴ（Ｔ＝破傷風神経毒）の結合を、ＢｏＮＴ／Ａ Ｈ_C−断片野生型を標準として１００％に設定して示す図である。 マウスの単離した横隔神経−横隔膜筋標本における、ＢｏＮＴ／Ａ野生型と比較した、ＢｏＮＴ／Ａと、ＢｏＮＴ／ＢのＨ_C−断片またはＨ_CC−ドメインのいずれかからなる全毒ハイブリッドの神経毒性の増加を示す図である。

本発明は、ここで、上記の、今日までに知られている方法の問題を克服できる輸送タンパク質（Ｔｒａｐｏ）を提供する。

複合体ガングリオシドに対する親和性が少なくとも３倍増大された輸送タンパク質（Ｔｒａｐｏ）が提供されることが好ましい。

「天然の神経毒よりも高い親和性での神経細胞との結合」。この場合には、天然の神経毒は、ボツリヌス菌の天然の神経毒であることが好ましい。この関連では、天然の神経毒は、ボツリヌス菌由来のボツリヌス神経毒Ａおよび／またはボツリヌス神経毒Ｂおよび／またはボツリヌス神経毒Ｇであることが好ましい。とりわけ、天然のボツリヌス神経毒と同一のアミノ酸配列を含む大腸菌由来の組換え型において調製されるボツリヌス神経毒は、天然のボツリヌス神経毒と薬理学的に同様に作用し、組換えボツリヌス神経毒野生型と呼ばれる。この場合に記載される神経細胞は、コリン作動性運動ニューロンである。輸送タンパク質は、神経細胞膜表面上のポリシアロガングリオシド、例えば、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂまたはＧＴ１ｂなどと特異的に結合することが好ましい。結合はｉｎ ｖｉｔｒｏで測定されることが好ましい。測定は、実施例において詳細に説明されるアッセイの使用によって実施されることが特に好ましい。

用語「ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖の改変」。ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖（ＨＣ）のアミノ酸および／または核酸配列は、既知の血清型Ａ〜Ｇの各々について、公的にアクセス可能なデータベースから一般に利用可能である（表１も参照のこと）。この関連では、改変は、少なくとも１個のアミノ酸が欠失していること、付加されていること、アミノ酸配列に挿入されていること、または天然の神経毒の少なくとも１個のアミノ酸が別の天然に生じるアミノ酸もしくは天然に生じないアミノ酸で置換されていることおよび／または記載されるアミノ酸配列中の１個のアミノ酸が翻訳後修飾されていることを含む。この関連では、翻訳後修飾として、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脱アミノ化、リン酸化、イソプレニル化、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加および当業者に公知のさらなる修飾が挙げられる。

ボツリヌス菌によって形成される神経毒のＨＣは、３つのサブドメイン、すなわち、アミノ末端側の５０ｋＤａの大きさの輸送ドメインＨ_Nと、それに続く２５ｋＤａのＨ_CN−ドメインと、カルボキシル末端側に位置する２５ｋＤａのＨ_CC−ドメインとを含む。Ｈ_CN−とＨ_CC−ドメインは一緒になって、Ｈ_C−断片と表される。個々の血清型およびその変形のそれぞれのサブドメインの対応するアミノ酸部分は表１から明らかである。

異なるＢｏＮＴ血清型のドメインを含むハイブリッドタンパク質を詳細に記載するために、以下では以下の命名法が取り入れられている。例えば、用語ｓｃＡｔＡＡＢは、４つのドメインＬＣ、Ｈ_N、Ｈ_CNおよびＨ_CCからなる一本鎖神経毒（ｓｃ）を表し、各ドメインがその起源により、それぞれの血清型の大文字で特徴付けられている。これは、ｓｃＡｔＡＡＢがＬＣ、Ｈ_NおよびＨ_CNに由来するが、ＢｏＮＴ／ＡのＨ_CC−ドメインはＢｏＮＴ／Ｂによって置換されたことを意味する。小文字「ｔ」は、ＬＣとＨ_N−の間に挿入されたトロンビンマーカー配列を表す。

本発明は、詳しくは、ボツリヌス菌によって形成される神経毒のＨＣを改変することによって得られる輸送タンパク質であって、天然の神経毒よりも高い親和性で神経細胞と特異的に結合し、エンドサイトーシスによってこれらの細胞によって受け入れられるタンパク質に関する。

本発明において提供される輸送タンパク質は、複合体ポリシアロガングリオシドに対するそのガングリオシド結合ドメインの特異的親和性の増大を示す。親和性の増大はアミノ酸の置換または欠失によって得られることが好ましい。

好ましい実施形態によれば、輸送タンパク質は、天然の神経毒よりも少なくとも１５％高い親和性を示す。輸送タンパク質は、天然の神経毒よりも少なくとも５０％高い、特に好ましくは、少なくとも８０％高い、とりわけ、少なくとも９０％高い親和性を示すことが好ましい。

好ましい実施形態によれば、ＨＣの改変は、所与の神経毒のＨ_C−断片の領域中に生じる。改変が置換、欠失、挿入または付加を含む場合には、後者は、例えば、特異的突然変異誘発、この関連では、当業者に公知の方法によって実施できる。天然の神経毒中に存在するアミノ酸は、この関連では、天然に生じるアミノ酸または天然に生じないアミノ酸のいずれかで改変される。原則として、アミノ酸は種々の物理化学的群に分けられる。アスパラギン酸およびグルタミン酸は、負に荷電したアミノ酸に属する。ヒスチジン、アルギニンおよびリジンは、正に荷電したアミノ酸に属する。アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システインおよびチロシンは極性アミノ酸に属する。グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンは、非極性アミノ酸に属する。芳香族側鎖基は、アミノ酸ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの中に見い出される。一般に、アミノ酸を、別の物理化学的群に属する異なるアミノ酸で置換することが好ましい。

本発明の好ましい実施形態によれば、輸送タンパク質はボツリヌス神経毒血清型Ａ〜Ｇである。

本発明の好ましい実施形態では、輸送タンパク質は、ボツリヌス菌神経毒Ａ型のタンパク質配列（データベース番号ＡＡＡ２３２６２およびＣＡＡ５１８２４）から導かれる。

本発明のさらなる実施形態は、ボツリヌス菌神経毒Ａ型のタンパク質配列（データベース番号ＡＡＡ２３２６２およびＣＡＡ５１８２４）の位置１１１７、１２０２〜１２０４、１２５２〜１２５４、１２６２〜１２６７、１２７０、１２７８〜１２７９中の少なくとも１個のアミノ酸が、除去されているか、または天然に生じるアミノ酸もしくは天然に生じないアミノ酸で置換されている、輸送タンパクに関する。

本発明のさらなる実施形態は、ボツリヌス菌神経毒Ａ型のタンパク質配列（データベース番号ＡＡＡ２３２６２およびＣＡＡ５１８２４）の位置１０９２〜１２９６（ガングリオシド結合ドメインを含む領域）中のアミノ酸が、
ボツリヌス菌神経毒Ｂ型タンパク質（データベース番号ＡＡＡ２３２１１）、アミノ酸１０７９〜１２９１、
ボツリヌス菌神経毒Ｃ₁型タンパク質（データベース番号ＣＡＡ５１３１３）、アミノ酸１０９３〜１２９１、
ボツリヌス菌神経毒Ｄ型タンパク質（データベース番号ＣＡＡ３８１７５）、アミノ酸１０８０〜１２７６、
ボツリヌス菌神経毒Ｅ型タンパク質（データベース番号ＣＡＡ４４５５８）、アミノ酸１０６７〜１２５２、
クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)神経毒Ｅ型タンパク質（データベース番号ＣＡＡ４３９９８）、アミノ酸１０６７〜１２５１、
ボツリヌス菌神経毒Ｆ型タンパク質（データベース番号ＣＡＡ５７３５８）、アミノ酸１０８５〜１２７８、
クロストリジウム・バラティー(Clostridium baratii)神経毒Ｆ型タンパク質（データベース番号ＣＡＡ４８３２９）、アミノ酸１０７６〜１２６８、
ボツリヌス菌神経毒Ｇ型タンパク質（データベース番号ＣＡＡ５２２７５）、アミノ酸１０８７〜１２９７の配列によって置換されている、輸送タンパク質に関する。

アミノ酸位置との互換性に適したさらなるＨ_CC−ドメインは、表１から明らかである。

本発明のさらなる実施形態は、本発明の輸送タンパク質と、少なくとも１種の介在分子（Ｘ）とを含む組成物に関する。介在分子は、例えば、ペプチド結合、エステル結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合または炭素−炭素結合によって共有結合していることが好ましい、小さい有機分子、ペプチドまたはタンパク質であり得る。

さらに、介在分子は、すべての既知の治療上活性な物質を含む。この関連では、細菌増殖抑制剤、抗生物質、ウイルス増殖抑制剤、さらに免疫グロブリンも好ましい。

Ｔｒａｐｏの親和性の増大をより良好に利用するために、プロテアーゼトロンビンによって特異的に認識され、開裂されるアミノ酸配列を介してＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｃ₁、Ｄ、Ｅ，ＦまたはＧのＬＣのアミノ末端側に結合し、特異的ＴｒａｐｏＸを得た。このＴｒｏｐｏＸの活性強度は、天然ＢｏＮＴ／Ａと比較して少なくとも３倍増大していたことが特に好ましい。外来タンパク質を含まないこの新規生成物は、材料の純度が高いことと、投与量が少ないことのために免疫系の刺激を著しく低減する。

本発明のさらなる実施形態は、神経伝達物質の放出装置の１種または複数のタンパク質を開裂するプロテアーゼである輸送タンパク質に関し、このプロテアーゼは、ボツリヌス菌神経毒、詳しくは、Ａ、Ｂ、Ｃ₁、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ型のＬＣ、または天然プロテアーゼのタンパク質分解活性の少なくとも０．０１％、好ましくは少なくとも５％、特に好ましくは、少なくとも５０％、とりわけ、少なくとも９０％を示す、ボツリヌス菌神経毒、詳しくは、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ₁、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ型の神経毒のＬＣのタンパク質切断的に活性な断片からなる神経毒の群から選択される。輸送タンパク質とプロテアーゼは同一のボツリヌス菌神経毒血清型に由来することが好ましく、詳しくは、輸送タンパク質のＨ_N−ドメインとプロテアーゼはボツリヌス菌神経毒血清型Ａに由来することが好ましい。プロテアーゼの配列は、データベースで一般に利用可能であり、データベース番号は表１から明らかである。プロテアーゼのタンパク質分解活性は基質分離動力学によって求める（ビナ(Bina)ら（２００２）、バイオケミストリー(Biochemistry)４１（６）、１７１７〜２３頁を参照のこと）。

ＬＣは、配列Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｈｉｓ−（Ｘａａ）₃₃〜₃₅−Ｇｌｕ（Ｘａａ）₈₄〜₉₀−Ｇｌｕ−（Ｘａａ）₁₁−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｙｒ(式中、Ｘａａはいずれのアミノ酸であってもよい)を含むことを特徴とする。本発明の輸送タンパク質は、タンパク質およびプロテアーゼが先タンパク質および／またはプロテアーゼの群に由来することを特徴とする。

本発明のさらなる実施形態によれば、輸送タンパク質を製造する方法を提供する。この場合には、第１のステップで、輸送タンパク質をコードする核酸を提供する。この関連では、コード核酸はＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの混合物に相当し得る。核酸は、例えば、ホスホロチオエート結合を挿入することによって、そのヌクレアーゼ耐性に関してさらに改変されていてもよい。核酸は出発核酸から製造することもでき、後者は、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡデータベースからクローニングすることによって到達できる。さらに、核酸は、固相合成によって直接製造することができる。適した方法は当業者には公知である。出発核酸を想定すれば、例えば、位置特異的突然変異誘発による特異的改変を引き起こし、アミノ酸レベルで少なくとも１個の付加、挿入、欠失および／または置換をもたらすことができる。次いで、核酸を、適したプロモーターに機能しうる形で連結する。公知の発現系において発現に適したプロモーターは、当業者には公知である。この場合、プロモーターの選択は、発現に用いる発現系に応じて変わる。一般に、構成的プロモーターが好ましいが、誘導性プロモーターも同様に使用できる。このようにして製造される構築物は、例えば、λ−誘導体、アデノウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ＳＶ−４０ウイルスおよびレトロウイルスから選択されるベクターの少なくとも１つの部分、詳しくは、調節エレメントを含む。ベクターは、所与の宿主において核酸を発現できることが好ましい。

本発明は、ベクターを含み、ベクターを発現するのに適した宿主細胞をさらに提供する。当技術分野の状態では、多数の原核生物の発現系および真核生物の発現系が知られており、宿主細胞は、例えば、大腸菌または巨大菌などの原核細胞から、Ｓ．セレビシエ(S.cerevisiae)およびＰ．パストリス(P.pastoris)などの真核細胞から選択される。昆虫細胞または哺乳類細胞などの高等真核細胞も同様に使用できるが、それでも、宿主細胞はボツリヌス菌同様、グリコシル化装置を有さないものが好ましい。

好ましい実施形態によれば、核酸はボツリヌス菌神経毒のＨ_CC−ドメインをコードする。この核酸は、Ｈ_C−断片をコードする核酸をフランキングするエンドヌクレアーゼインターフェースを含み、アミノ酸配列の類似性が保たれながら、輸送タンパク質をコードする遺伝子における容易なモジュラー置換を可能にするよう、エンドヌクレアーゼ部位はボツリヌス菌神経毒のその他のＨ_C−断片のものと適合する。

輸送システムとは別に、少なくとも１種の介在分子をさらに含む本発明の組成物が提供される場合には、この介在分子、ペプチドまたはタンパク質はカルボキシ末端システインまたはメルカプト基のいずれかで官能基をもたせ、次いで、上記と類似の方法で、ペプチドおよび／またはタンパク質を、例えば、バイナリーベクターまたは種々の宿主細胞を用いることによって組換えによって製造できる。輸送タンパク質とペプチドまたはタンパク質の両方の発現に同一宿主細胞を用いる場合には、分子間ジスルフィド結合がｉｎ ｓｉｔｕで形成されることが好ましい。同一宿主細胞におけるより効率的な製造には、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を、輸送タンパク質のものと同一のリーディングフレーム内で翻訳させることができ、その結果、一本鎖ポリペプチドが製造される。この場合には、分子内ジスルフィド結合がｉｎ ｓｉｔｕで形成されることが好ましい。輸送タンパク質とペプチドおよび／またはタンパク質の間を架橋する同様に存在するペプチドの簡単な加水分解のために、輸送タンパク質のアミノ末端に、プロテアーゼトロンビンによって、または宿主細胞の特異的エンドプロテアーゼによって特異的に認識され、分離されるアミノ酸配列を挿入する。

これが可能でなければ、輸送タンパク質およびタンパク質を別個に精製した後に、当業者に公知の酸化プロセスによって適当な分子間ジスルフィド架橋を続いてもたらすことができる。ペプチドまたはタンパク質はまた、合成または断片の縮合によって直接得ることもできる。適当な方法は当業者には公知である。

輸送タンパク質およびペプチドまたはタンパク質はそれぞれ、その後、精製する。この目的には、当業者に公知の方法、例えば、クロマトグラフィー法または電気泳動などを用いる。

本発明のさらなる実施形態は、以下の障害または疾患：片側顔面痙攣、痙性斜頸、痙縮、ジストニア、片頭痛、疼痛、頚部および腰椎柱の障害、斜視、流涎過多および鬱病性疾患を治療するのに適している、輸送タンパク質と、場合によって、製薬上許容される賦形剤、希釈剤および／もしくは添加物とを含有する薬剤組成物に関する。

薬剤組成物は経口、静脈内、皮下、筋内および局所投与に適している。筋内投与が好ましい。薬剤組成物の投薬単位は、およそ０．１ｐｇ〜１ｍｇの本発明の輸送タンパク質および／または組成物を含む。

本発明のさらなる実施形態は、多汗症および極めて顕著な顔面のしわを治療するのに適した、輸送タンパク質と、薬剤賦形剤、希釈剤および／もしくは添加物とからなる化粧料組成物を含む。化粧料組成物は、経口、静脈内、皮下、筋内および局所投与に適している。筋内投与が好ましい。化粧料組成物の投薬単位は、約０．１ｐｇ〜１ｍｇの本発明の輸送タンパク質および／または組成物を含む。化粧料組成物は、多汗症および顔面のしわを治療するのに適している。

本発明に記載される輸送タンパク質は、輸送タンパク質をコードする組換え発現ベクターを増殖させる、例えば、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)または巨大菌などの適した宿主細胞によって産生され得る。

詳細には、本発明は、ニューロンと特異的に結合し、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、酸性エンドソームコンパートメントからニューロンのサイトゾル中に輸送されることが好ましい、ボツリヌス菌によって産生される神経毒のＨＣの改変によって形成される輸送タンパク質（Ｔｒａｐｏ）を含む。このタンパク質を輸送手段として用い、原形質膜中に生理学的に透過できず、神経細胞のサイトゾルに到達することができない前記の輸送手段と結合しているプロテアーゼおよびその他の物質を細胞に導入する。プロテアーゼの基質は、細胞内に局在する伝達物質放出に関与するタンパク質およびペプチドである。基質が分離された後、ニューロンの特定の機能が遮断され、細胞自体は損傷を受けない。これらの機能の１つが、神経伝達物質放出を引き起こすエキソサイトーシスである。伝達物質の放出が阻害されれば、細胞から細胞へのシグナルの伝達が遮断される。例えば、アセチルコリンの放出が神経筋接触点で阻害されると、横紋筋が麻痺する。ＴｒａｐｏＸが痙性筋肉またはジストニアの筋肉の神経終末に適用される場合には、この作用を治療的に用いることができる。その他の活性物質としては、例えば、抗ウイルス作用を示す物質がある。それらは、Ｔｒａｐｏと結合させると、神経系のウイルス感染を治療するために使用できる。本発明はまた、神経伝達物質の放出を阻害するための、輸送タンパク質の使用に関する。

患者が天然型のＢｏＮＴ／ＡおよびＢで治療される場合は、これらの非ヒトタンパク質の注射は、低投与量にもかかわらず、抗体の形成を引き起こし、その結果、アナフィキラシーショックを防ぐために療法を停止しなくてはならない。酵素活性のより高い輸送効率を有する同一の活性機構を有する物質を適用することによって、投与量を著しく低減でき、抗体の形成が生じない。これらの特性は本明細書に記載される輸送タンパク質によって生じる。

適用のための実施例が記載されているが、一般に、適した適用様式および投与量は、治療している医師によって個々に決定される。このような決定は、関連する特定の分野に十分に精通した各医師によって日常的に行われる。したがって、神経毒の適用様式および投与量は、選択される神経毒の可溶性または治療される疼痛の強度などの基準に基づき、例えば、本明細書に記載される本発明にしたがって選択できる。

天然ＢｏＮＴ／ＡおよびＢの治療間隔は、現在、平均して３〜４ヶ月である。この間隔を延長することによって、抗体が形成される危険が減少し、ＢｏＮＴを用いる、より長期間の治療が可能となる。サイトゾル中のＬＣの増加は、その分解を時間に関して延長し、したがって、作用期間も延長する。本明細書に記載される輸送タンパク質は、天然のＨＣ−Ａよりもより高い親和性および受け入れ率を示す。

以下の実施例は単に説明に役立つものであって、制限するように解釈されてはならない。

大腸菌における遺伝子改変したＴｒａｐｏＸの組換え発現
ＰＣＲによって、ＢｏＮＴ／ＡのＨＣのＤＮＡ配列をボツリヌス菌の染色体ＤＮＡ（データベース番号ＡＡＡ２３２６２）において増幅した。このために、特異的オリゴヌクレオチドによって、アミノ酸チロシン１１１７のコドンを、アラニンのアミノ酸残基をコードする塩基トリプレットによって置換した。さらに、遺伝子の５’末端に、トロンビンの認識配列のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を加えた。このＤＮＡ配列を、細菌発現ベクターに挿入した。挿入されるＴｒａｐｏの遺伝子は、この場合には、３’末端でカルボキシ末端親和性ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド、例えば、Ｓｔｒｅｐ−ｄａｙ、６ｘＨＮ−ｄａｙまたはＨｉｓ₆−ｄａｙと融合させた。このように作製した発現ベクターｐＡＲ−Ｔｒａｐｏが、ＢｏＮＴのＬＣなどの担体分子を加えるための開始基礎である。

ＰＣＲ法によって、ボツリヌス菌の染色体ＤＮＡ配列（データベース番号ＡＡＡ２３２６２）においてＢｏＮＴ／ＡのＬＣのＤＮＡ配列を増幅し、発現ベクターｐＡＲ−Ｔｒａｐｏに、コードされるトロンビン認識配列の上流に挿入した。このように作製した発現ベクターｐＡＲ−ＴｒａｐｏＸを大腸菌Ｋ１２株に形質転換し、生物学的安全レベル(Biological Safety Level)２の条件下、ハノーバーの地方政府によるプロジェクトに出された
規則および規定、ファイル参照５０１ｇ．４０６５４／３／５７／３にしたがって、タンパク質ＴｒａｐｏＸの発現を誘導した。過剰に発現されたＴｒａｐｏＸを、製造業者の使用説明書に従ってアフィニティークロマトグラフィー法で、１５０ｋＤａの分子量を有する一本鎖タンパク質として単離した。続いて、このタンパク質をセファロースと結合しているトロンビンで加水分解し、２つの鎖がジスルフィド架橋によって連結したままである純粋なタンパク質を発生させた。

このタンパク質は、マイクロタイタープレート上に固定された、単離されたガングリオシドＧＴ１ｂに対して、およびラット脳から得たシナプトソーム膜標本に対して、野生型ＢｏＮＴ／Ａと比較して、３００％増大した親和性を示した（図１）。ＬＣ−Ａの触媒活性には変化がないことが、組換えＳＮＡＰ−２５のｉｎ ｖｉｔｒｏ開裂において示された。ラット脳から得た機能的シナプトソームにおける神経伝達物質放出の阻害に関するＴｒａｐｏＸの効力は、ボツリヌス菌から回収した天然ＢｏＮＴ／Ａと比較して３００％増大した。マウスの神経筋標本では（ＨＤＡ）、ＴｒａｐｏＸの効力は、天然ＢｏＮＴ／Ａと比較して３００％同様に増加した（図２）。

種々のＢｏＮＴ／Ａ変異体のＨＤＡにおけるラット脳シナプトソームとの結合および神経毒性の測定
放射活性物質によって標識されたＨ_C−断片の、ラットシナプトソームとの結合を、ルメル(Rummel)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)３２６（２００３）、８３５〜８４７頁に記載されるとおりに測定した。ＢｏＮＴ／Ａ変異体の神経毒性は、ハーバーマン(Habermann)ら、ナウニン・シュミーデベルグス・アーカイブ・オブ・ファルマコロジー(Naunyn Schmiedeberg's Archives of Pharmacology)３１１（１９８０）、３３〜４０頁に記載されるとおりに求めた。

野生型と比較した、種々のＢｏＮＴ／Ａ変異体の結合の比較を以下の表に示す。

ＢｏＮＴ／Ａのガングリオシド結合ポケット内の個々に決定されるアミノ酸の変異が、神経細胞との結合の増大をもたらした。位置１１１７のチロシンがアラニン、システインまたはバリンによって置換されることが好ましい。詳しくは、位置１１１７のチロシン残基のアラニンによる置換は、約３３０％の親和性の増大をもたらす。

位置１２５２および１２５３のガングリオシド結合ポケット由来の個々のアミノ酸のさらなる変異が、同様に結合の増大をもたらす。詳しくは、チロシンにおけるＦ１２５２およびリジンにおけるＨ１２５３の変異が、それぞれ親和性の１１０％および５０％の増大をもたらした。

さらに、神経細胞との結合の増大は位置１２０２、１２６２、１２７０、１２７８および１２７９における変異で期待することができる。

さらにまた、ＢｏＮＴ／Ａの変異を、二重変異を用いて試験し、この場合には、詳しくは、変異体Ｙ１１１７Ｃ／Ｈ１２５３ＫおよびＹ１１１７Ｖ／Ｈ１２５３Ｋが、シナプトソームとの結合の増大をもたらした（図２参照のこと）。

特に、ＢｏＮＴ／Ａの変異体Ｙ１１１７Ａの結合の増大が、神経毒性の増大をもたらすことを、横隔神経−神経毒性アッセイ（ＨＤＡ−アッセイ）においてさらに調べた（図３）。

ＢｏＮＴ／Ａ Ｈ_CC−ハイブリッドの結合および神経毒性の測定
結合および神経毒性の測定を、上記のとおりに実施した。

結果を以下の表およびさらに図４および５に示す。

ＢｏＮＴ／ＡのＨ_CC−ドメインの、その他の血清型、詳しくは、ボツリヌス菌神経毒Ｂおよびボツリヌス菌神経毒Ｃでの置換は、神経細胞との結合の増大をもたらした。ＢｏＮＴ／ＡのＨ_C−断片のＨ_CC−ドメインの、破傷風神経毒の対応するドメインによる置換も、神経細胞における親和性の増大を同様にもたらすということがさらに観察された。親和性の変化はまた、全ＢｏＮＴ／ＡにおけるＨ_CC−ドメインの置換にも当てはまる。これに関連して、図５は、ハイブリッドｓｃＡｔＡＡＢにおいて、親和性の増大が神経毒性の増大に対して同様の作用を有することを示す。Ｈ_CC−ドメインの代わりに、全Ｈ_C−断片ｓｃＡｔＡＡＢが置換されると、対応する結果が観察される。詳しくは、ＢｏＮＴ／ＡのＨ_CC−ドメインまたはＨ_C−断片を、ＢｏＮＴ／ＢのＨ_CC−ドメインまたはＨ_C−断片で置換した場合に、神経毒性の約３５０％の改善が認められることが観察された。

ＢｏＮＴ変異体の、ガングリオシドＧＴ１ｂとの結合の測定
メタノールにガングリオシドＧＴ１ｂ［ＮＡｃＮｅｕα３ＧａｌβＮＡｃＧａｌβ４（ＮＡｃＮｅｕα８ＮＡｃＮｅｕα３）Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ］（シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)）を溶解し、高親和性９６カップポリスチレンマイクロタイタープレート（コーニング(Corning)；１００μｌ／カップ中１μｇＧＴ１ｂ）に適用するか、競合アッセイの場合には、¹²⁵Ｉ−ＢｏＮＴ（グレイナー・バイオ−オーン(Greiner Bio-ohne)；１００μｌ／カップ中０．１μｇＧＴ１ｂ）を含む高親和性ＣＳシングルフラクチャー(single fracture)ストリッププレートに適用する。溶媒を室温で蒸発させ、カップを結合バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．２）で３回リンスする。次いで、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを補給したＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ［１４０ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１．８ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２］中で２時間インキュベートすることによって非特異的結合部位をブロッキングする。結合アッセイは、野生型の量または変異体の比状態量を漸増させて、結合バッファー（１００μｌ／カップ）中、室温で２時間実施する。各２５０μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファーを用いる３回のリンスステップにおいて結合していないタンパク質を除去する。製造業者の使用説明書に従い、結合バッファー中でアルカリホスファターゼと結合しているストレップタクチン(Strep Tactin)（ＳＴ−ＡＰ、ＩＢＡ社(IBA GmbH)）とともに、室温で２時間インキュベートすることによって、結合しているＨ_C−断片を同定する。最終的にアルカリホスファターゼの基質として働くｐ−ニトロフェニルホスフェート（１００ｍＭグリシン、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＺｎＣｌ₂、ｐＨ１０．４中１ｍｇ／ｍｌ）。３Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加することによって脱リン酸化反応を停止し、スペクトラカウントマイクロプレートリーダー装置（パッカード(packard)）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定する。
競合アッセイは、７０００００ｃｐｍ／カップ［１２５Ｉ］−ＢｏＮＴ、種々の量の天然ＢｏＴＮまたは組換えＨ_C−断片を含む結合バッファー１００μｌ中、室温で２時間かけて実施する。インキュベートし、上清を除去した後、カップをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファーで３回リンスし、乾燥させ、分離する。次いで、結合している放射活性物質によって標識されたＢｏＮＴの量を、自動γカウンター（ワラック(Wallac)１４８０ウィザード(Wizard)３）で測定する。

Claims (4)

1. ボツリヌス菌によって形成される神経毒の重鎖の改変によって得られる輸送タンパク質であって、
   前記神経毒がボツリヌス神経毒Ａ型（ＢｏＮＴ／Ａ）であり、
   前記タンパク質が天然の神経毒よりも高い親和性で神経細胞と結合し、
   前記神経毒Ａ型の完全Ｈ_C−断片が他の型の神経毒の完全Ｈ_C−断片によって置換され、または前記神経毒Ａ型のＨ_ccドメインが他の型の神経毒のＨ_ccドメインによって置換され、前記他の型の神経毒がＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、または破傷風神経毒である、
   輸送タンパク質。
2. データベース番号ＡＡＡ２３２６２の位置８６７〜１２９６の配列に対応するアミノ酸配列である、ＢｏＮＴ／Ａの完全Ｈ_C−断片が置換される、請求項１に記載の輸送タンパク質。
3. データベース番号ＡＡＡ２３２６２の位置８６７〜１２９６の配列に対応するアミノ酸配列である、ＢｏＮＴ／Ａの完全Ｈ_C−断片が、データベース番号ＡＡＡ２３２１１の位置８６６〜１２９１の配列に対応するアミノ酸配列である、ＢｏＮＴ／ＢのＨ_C−断片によって置換される、請求項１に記載の輸送タンパク質。
4. ガングリオシド結合ドメインを含む、データベース番号ＡＡＡ２３２６２のボツリヌス菌神経毒Ａ型の位置１０９２〜１２９６の配列に対応するアミノ酸配列が、以下の配列：
   （ａ） ボツリヌス菌神経毒Ｂ型タンパク質、データベース番号ＡＡＡ２３２１１の位置１０７９〜１２９１の配列に対応するアミノ酸配列、
   （ｂ） ボツリヌス菌神経毒Ｃ₁型タンパク質、データベース番号CAA51313の位置１０９３〜１２９１の配列に対応するアミノ酸配列、
   （ｃ） ボツリヌス菌神経毒Ｄ型タンパク質、データベース番号CAA38175の位置１０８０〜１２７６の配列に対応するアミノ酸配列、
   （ｄ） ボツリヌス菌神経毒Ｅ型タンパク質、データベース番号CAA44558の位置１０６７〜１２５２の配列に対応するアミノ酸配列、
   （ｅ） クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)神経毒Ｅ型タンパク質、データベース番号CAA43998の位置１０６７〜１２５１の配列に対応するアミノ酸配列、
   （ｆ） ボツリヌス菌神経毒Ｆ型タンパク質、データベース番号CAA57358の位置１０８５〜１２７８の配列に対応するアミノ酸配列、
   （ｇ） クロストリジウム・バラティー(Clostridium baratii)神経毒Ｆ型タンパク質、データベース番号CAA48329の位置１０７６〜１２６８の配列に対応するアミノ酸配列、
   （ｈ） ボツリヌス菌神経毒Ｇ型タンパク質、データベース番号CAA52275の位置１０８７〜１２９７の配列に対応するアミノ酸配列
   のいずれかによって置換される、請求項１に記載の輸送タンパク質。

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