EA014526B1 - Полипептид ботулинового нейротоксина в качестве транспортного белка и способы его применения - Google Patents
Полипептид ботулинового нейротоксина в качестве транспортного белка и способы его применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA014526B1 EA014526B1 EA200700408A EA200700408A EA014526B1 EA 014526 B1 EA014526 B1 EA 014526B1 EA 200700408 A EA200700408 A EA 200700408A EA 200700408 A EA200700408 A EA 200700408A EA 014526 B1 EA014526 B1 EA 014526B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- neurotoxin
- amino acid
- amino acids
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 39
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 15
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 title claims description 43
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 68
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 claims abstract description 56
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 claims abstract description 56
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 73
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 59
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 56
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 20
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 20
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 10
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 7
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 6
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 claims description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 6
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 230000036407 pain Effects 0.000 claims description 6
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 6
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 claims description 5
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004095 Hemifacial Spasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 208000019695 Migraine disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 claims description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 claims description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 4
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 claims description 4
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 claims description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010063006 Facial spasm Diseases 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 claims description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 208000008630 Sialorrhea Diseases 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 claims description 3
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 3
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 claims description 3
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 claims description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 claims description 2
- 206010027599 migraine Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001790 virustatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 19
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 abstract 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 210000003568 synaptosome Anatomy 0.000 description 11
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 10
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 10
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 7
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000003019 respiratory muscle Anatomy 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003786 Vesicle-associated membrane protein 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000169 Vesicle-associated membrane protein 2 Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 231100000668 minimum lethal dose Toxicity 0.000 description 3
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 2
- 101100484977 Danio rerio waca gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 2
- 208000010476 Respiratory Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 101150026794 SHO1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000013265 Syntaxin 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010090618 Syntaxin 1 Proteins 0.000 description 2
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000001830 phrenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003105 phrenic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000003699 striated muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000043168 Cyanophora biloba Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 1
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102100032489 Heat shock 70 kDa protein 13 Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001016638 Homo sapiens Heat shock 70 kDa protein 13 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710106950 Long neurotoxin 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710169959 Membrane protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101000720079 Stichodactyla helianthus DELTA-stichotoxin-She4a Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 210000000467 autonomic pathway Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002932 cholinergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000632 dystonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- -1 histidine amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000006122 isoprenylation Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5 Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=CC=C1 CWWARWOPSKGELM-SARDKLJWSA-N 0.000 description 1
- 230000004118 muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 108010074523 rimabotulinumtoxinB Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001148 spastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016978 synaptic transmission, cholinergic Effects 0.000 description 1
- 102000003137 synaptotagmin Human genes 0.000 description 1
- 108060008004 synaptotagmin Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
- A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/66—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/06—Antimigraine agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/08—Anti-ageing preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
- C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Изобретение относится к полипептиду ботулинового нейротоксина типа A (BoNT/A) Clostridium botulinum, который может быть получен посредством модификации тяжелой цепи, в которой в положениях аминокислот с 1092 по 1296 по меньшей мере одна аминокислота удалена или заменена другой аминокислотой, причем за счет этого указанный модифицированный полипептид связывается с нервными клетками с большим сродством, чем нативный нейротоксин. Также настоящее изобретение относится к конструкции, содержащей полипептид по изобретению, к содержащим полипептид по изобретению фармацевтическим и косметическим композициям и к их применению, а также к соответствующим вектору экспрессии и клетке-хозяину.
Description
Настоящее изобретение относится к полипептиду ботулинового нейротоксина в качестве транспортного белка, который связывается с нейронами, поглощается посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза и транслоцируется из кислого эндосомального компартмента в цитозоль нейронов. Этот белок находит применение в качестве транспортера, который транслоцирует другие химические вещества (например, протеазы), которые физиологически не могут проникнуть через плазматическую мембрану в цитозоль нервных клеток. Настоящее изобретение относится также к применению транспортных белков для ингибирования выделения нейромедиаторов.
Нервные клетки выделяют вещества-медиаторы посредством экзоцитоза. Под экзоцитозом понимают слияние мембраны внутриклеточной везикулы с плазматической мембраной. При этом процессе одновременно в синаптическую щель выбрасывается содержимое везикулы. Слияние двух мембран регулируется ионом кальция, который реагирует с белком синаптотагмином. Совместно с другими кофакторами синаптотагмин контролирует состояние трех так называемых белков слияния: 8ΝΆΡ-25, синаптобревина 2 и синтаксина 1А. В то время как синтаксин 1А и синаптобревин 2 встроены соответственно в плазматическую мембрану или мембрану везикул, 8ΝΑΡ-25 лишь слабо связан с плазматической мембраной. При повышении внутриклеточной концентрации кальция эти три белка связываются друг с другом, при этом две мембраны сближаются и в конечном счете сливаются. В случае холинергических нейронов высвобождается ацетилхолин, который вызывает сокращения мышц, выделение пота и другие холинергически-опосредованные реакции.
Вышеуказанные белки слияния являются целевыми молекулами (субстратами) легких цепей клостридиальных нейротоксинов, которые синтезируются бактерией ΟοδΙπάίιιιη ЬоиШпит.
Анаэробная грамположительная бактерия С1о51пбшт Ьо1и11пит продуцирует семь различных типов белковых нейротоксинов. Их называют ботулиновыми нейротоксинами (от ΒοΝΤ/Α до ΒοΝΤ/С). Из них, в частности, ВоКГ/А и ВоКГ/В вызывают у людей и животных нейропаралитическое заболевание, которое называется ботулизмом. Споры Оойпбшш ЬоиШпит обнаруживаются в земле, но они могут также развиваться в неправильно простерилизованных и закупоренных консервированных продуктах питания домашнего приготовления, которыми объясняют многие случаи ботулизма.
ВоКГ/А - это самое смертельное из всех известных биологических веществ. Всего 5-6 пг очищенного ВоКГ/А составляют МЛД (Минимальную Летальную Дозу). Одна единица ΒοNΤ определена как МЛД, которая после внутрибрюшинного введения убивает половину самок мышей линии 8^155 ХУсЬйсг весом 18-20 г. Было охарактеризовано семь иммунологически различных ВоКГ. Они обозначены как ВоКГ/А, В, С1, Ό, Е, Р и О, и их можно различить по нейтрализации серотип-специфическими антителами. Различные серотипы ВоКГ отличаются по тяжести и длительности вызываемого ими паралича у поражаемых видов животных. Так, например, в отношении паралича у крысы ВоКГ/А действует в 500 раз сильнее, чем ВоКГ/В. К этому надо добавить, что доказано, что ВоКГ/В у приматов в дозировке 480 Ед/кг веса тела является нетоксичным. Такое же количество ВоКГ/А соответствует 12 летальным дозам (ΕΌ) этого вещества у приматов. Кроме того, у мышей длительность паралича после инъекции ВоКГ/А в 10 раз больше, чем после инъекции ВоКГ/Е.
ВоКГ используются в клинике для лечения нервно-мышечных нарушений, которые характеризуются гиперактивностью скелетных мышц, обусловленной патологически гиперактивными периферическими нервами. Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (РИА) США разрешено использовать ВоКГ/А для лечения блефароспазма, страбизма и гемифациальных спазмов. По сравнению с ВоКГА, остальные серотипы ВоКГ обладают заметно меньшей эффективностью и меньшей длительностью эффекта. Клинические эффекты периферического внутримышечного введения ВоКГ/А обычно возникают в течение недели. Длительность подавления симптомов после единственной внутримышечной инъекции ВоКГ/А, как правило, составляет около 3 месяцев.
Клостридиальные нейротоксины специфически гидролизуют различные белки аппарата слияния. ВоКГ/А, С1 и Т расщепляют 8КАР-25, тогда как ВоКГ/В, Ό, Р, О и столбнячный тейротоксин (ГеОТ) разрушают мембранный белок-2, ассоциированный с везикулами (УАМР 2), который также называют синаптобревином 2. ВоКГ/Сь кроме того, расщепляет синтаксин 1А.
Клостридиальные бактерии продуцируют нейротоксины в виде одноцепочечных полипептидов, состоящих из 1251-1315 аминокислот. Затем эндогенные протеазы расщепляют эти белки в определенном месте на 2 цепи (разрезание), хотя обе цепи еще остаются связанными дисульфидным мостиком. Эти двухцепочечные белки называют голотоксинами (см. 81юпе е1 а1. (1985), Еиг. 1. Вюейет. 151, 75-82). Эти две цепи имеют различные функции. Если меньшая часть (легкая цепь = 1φ1ιΙ ейаш = ЬС) представляет собой ΖΐΓ'-зависимую эндопротеазу, то большая часть (тяжелая цепь = Неауу ейаш = НС) является транспортером легкой цепи. При обработке тяжелой цепи эндопептидазами образуются два фрагмента по 50 кДа (см. Сипетех е1 а1. (1993), 1. Рго1еш С1ет. 12, 351-363). Аминотерминальная часть (НК-фрагмент) при низком значении рН интегрируется в мембраны и помогает легкой цепи проникнуть в цитозоль нервной клетки. Карбокситерминальная часть (НС-фрагмент) связывается со сложными полисиалоганглиозидами, которые присутствуют только в мембранах нервных клеток, и с до сих пор не идентифицированными белковыми рецепторами (На1регп е1 а1. (1993), Сигг Гор М1егоЬю1 1ттипо1 195, 221-241). Это объясняет высокую нейроселективность клостридиальных нейротоксинов. Кристаллические структуры
- 1 014526 подтверждают, что ΒοΝΤ/Α содержит три домена, которые можно привести в соответствие с тремя этапами механизма действия (см. Ьасу е! а1. (1998), Ναι 81гис1 ΒίοΙ 5, 898-902). Далее эти данные позволяют сделать вывод о том, что внутри Нс-фрагмента существуют две автономные субъединицы (субдомены) размером по 25 кДа. Первое доказательство существования обоих функциональных субдоменов было получено с использованием аминотерминальной (ΗΕΝ) и карбокситерминальной (Нсс) частей НСфрагмента ΤеNΤ, которые были рекомбинантно экспрессированы и позволили узнать, что с нейроном связывается НСС-, но не Н,--домен (см. Негггегоз е! а1. (2000), Вюсйет 1 3476 199-204). Сайт связывания с белком-рецептором синаптотагмином был обнаружен в Нсс-доменах ΒοΝΤ/Β и С, при этом была показана их раздельная функциональность (см. Витте1 е! а1. (2004), 1 Βίο1 СПет 279, 30865-70).
При физиологических условиях тяжелая цепь (НС) связывается с нейрональными ганглиозидами, посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза поступает внутрь клетки и через эндосомальный компартмент вступает в естественный везикулярный цикл. В кислой среде ранних эндосом ΗΝ, аминотерминальная часть тяжелой цепи, проникает в мембрану везикул и образует пору. Любое вещество (X), связанное с НС дисульфидным мостиком, будет отделено от НС внутриклеточными окислительновосстановительными системами, которые получают доступ к дисульфидному мостику и восстанавливают его. В конечном итоге X появляется в цитозоле.
В случае клостридиальных нейротоксинов НС является переносчиком ЬС, которая на конечной стадии расщепляет свой специфический субстрат в цитозоле. Цикл комплексообразования и диссоциации комплексов белков слияния прерывается, и за счет этого подавляется выделение ацетилхолина. Вследствие этого поперечнополосатые мышцы расслабляются, а потовые железы прекращают выделять свой секрет. Длительность эффекта отдельных серотипов ΒοΝΤ различна и зависит от присутствия интактных ЬС в цитозоле. Так как все нейроны имеют рецепторы клостридиальных нейротоксинов, влияние может быть оказано не только на выделение ацетилхолина, но потенциально и на выделение вещества Р, норадреналина, ГАМК, глицина, эндорфинов и других медиаторов и гормонов.
То, что преимущественно блокируется холинергическая передача, может объясняться тем, что НС проникает в периферические нейроны. Центральные синапсы защищены гематоэнцефалическим барьером, который не могут преодолеть белки.
НС обладают высоким сродством к периферическим нервным клеткам, которое преимущественно обусловлено взаимодействием со сложными полисиалоганглиозидами - это гликолипиды, которые состоят более чем из одной молекулы сиаловой кислоты (см. На1рет е! а1. (1995), Сигг Τορ М1сгоЬю1 1ттиηοΐ 195, 221-41). Вследствие этого связанные с ними ЬС достигают только клеток этого типа и являются эффективными только в этих клетках. Каждый из ΒοΝΤ/Α или В связывается только с одной молекулой ганглиозида СТ1Ь.
Для исследования роли аминокислот, образующих сайт (карман) связывания, согласно настоящему изобретению был получен рекомбинантный НС-фрагмент. Эта техника обеспечивает возможность заменять отдельные аминокислоты. Так, положительно заряженные аминокислоты можно заменить отрицательно заряженными или нейтральными аминокислотами и наоборот. Небольшие изменения поверхности сайта связывания оказывают огромное влияние на соответствие ганглиозидам. Удалось показать, что сродство снижалось более чем на 99%, если, например, аминокислоту в положении 1266 - триптофан, обозначенный буквой в 8Х\УУ-мотиве - заменяли алифатическим остатком, например - лейцином. Однако наблюдали и противоположное. Замена аминокислот, выступающих в полость сайта связывания, приводила к увеличению сродства к ганглиозидам. Так как форма полости сайта связывания имеет такое решающее значение для сродства НС к ганглиозидному рецептору, одновременно со сродством НС к ганглиозидному рецептору соответственно увеличивается или уменьшается также протеолитический потенциал присоединенной ЬС.
В исследовании лиганд-рецептор определенные аминокислотные остатки в ганглиозидсвязывающем сайте ΒοΝΤ/Α были согласно настоящему изобретению охарактеризованы и заменены с целью повышения сродства к ганглиозидному рецептору. Сродство мутированных НС-фрагментов было определено в анализах связывания с ганглиозидами и синаптосомами. Затем НС с теми же мутациями соединяли с ЬС-Α, для чего использовали последовательность аминокислот, чувствительную к тромбину. Рекомбинантный белок активировали тромбином (никинг), что приводило к двухцепочечной молекуле, в которой обе цепи были связаны одним дисульфидным мостиком. Эффективность конструкций испытывали на синаптосомах из мозга крысы - препарате, выделяющем медиатор. Степень подавления выделения медиатора служила мерой эффективности конструкций. Кроме того, эффективность отдельных конструкций анализировали с использованием изолированного нервно-мышечного препарата мыши (анализ на куполе диафрагмы = Пенн Фарйгадта аззау =НАЭ), который представляет собой физиологическую цель клостридиальных нейротоксинов.
Заболевания и симптомы, которые следует лечить препаратом ΤηροΧ. сопровождаются фокально повышенной активностью мотонейронов и вегетативных нервных клеток. Повышенная активность ведет к болезненным судорогам иннервируемых этими клетками мышц и к чрезмерной секреции жидкости из железистых клеток. Кроме того, из-за повышенной активности возникают морщины в различных зонах лица. Причиной является патологически повышенное высвобождение ацетилхолина из периферических
- 2 014526 нервных окончаний. Если ТгароХ инъецируют в пораженную мышцу, после латентного периода, равного 1-3 дням, происходит расслабление пораженных мышц, снижение секреции и разглаживание кожи лица. Это обусловлено подавлением высвобождения ацетилхолина препаратом ТгароХ. У пациента почти исчезают жалобы, а боли, вызванные судорогами мышц, ослабляются и полностью исчезают.
Высвобождение ацетилхолина подавляется как у людей, так и у животных. При этом опыты на животных рутинно используются для выявления ΒοΝΤ при отравлениях и для определения активности содержащих ΒοΝΤ медикаментов (Βοίοχ, Эухрой. Хеошш). Активность ΒοΝΤ оценивают количественно, проводя определения ЙЭ50 на мышах. При этом определяют дозу, которая убивает 50% животных из тестируемой группы. Очевидно, что наряду с дозами, которые не убивают животных, вводят также дозы, которые убивают 100% животных из группы. Так как яд вводят системно (внутрибрюшинно), большое число животных погибает из-за паралича дыхания, вызванного параличом дыхательной мускулатуры. Для исключения опытов на животных нами был использован анализ на куполе диафрагмы мыши (ΗΑΌ). При анализе на ЙЭ50 подопытные мыши умирают от паралича дыхания, вызванного параличом дыхательной мускулатуры. Следовательно, можно взять дыхательную мышцу мыши вместе с иннервирующим ее нервом (№гуи8 рйгешсик) и отравить ее ίη νίίτο. ΒοΝΤ связывается со своими рецепторами, проникает в клетку и транслоцируется, в конечном итоге он расщепляет свой субстрат, за счет чего мышца парализуется. Существует сильная корреляция между значением ЙЭ50 и параличом дыхательных мышц. Этот анализ ίη νίίτο до некоторой степени представляет собой урезанную версию опыта на животных (\Уо111Гаг111 К., Сое5с11е1 Η., Ртегей 1., ЭепДег В., Βι^ιΙΚο Η., Βοίи1^ηит Α ίοχίηκ: ιιηίΐδ гегеш ιιηίΚ №шпуп 8с1ишейеЬегд5 Агс1 Рйагтасо1. 1997 Маг; 335(3):335-40).
Можно также исходить из того, что ΒοΝΤ, который парализует диафрагму ίη νίίτο, действует и в живой мыши и убивает ее в соответствии с введенной дозой. Этот способ замены опытов на животных настолько убедителен, что анализ на куполе диафрагмы мыши вскоре будет принят Фармакопеей ЕС как официальный утвержденный способ испытания на ΒοΝΤ для государств-членов ЕС. Поэтому, исходя из повышенной эффективности ΤπψοΧ в отношении препарата диафрагмы мыши, мы можем сделать вывод о повышенной эффективности его для людей.
ΒοΝΤ/Α-комплекс в недавнем прошлом использовали для лечения моторных дистоний, а также для подавления избыточной симпатической активности (см. Βеηеске еί а1. (1995), Ак1 №шо1 22, 209 и далее) и облегчения болей и мигреней (см. §усйа еί а1. (2004), 1 №шо1 251, 19-30). Этот комплекс состоит из нейротоксина, различных гемагглютининов и нетоксичного, не гемагглютинирующего белка. При физиологическом рН этот комплекс быстро диссоциирует. Выделяющийся при этом нейротоксин является единственной составной частью комплекса, которая имеет терапевтическое значение и обуславливает облегчение симптомов. Лежащее в основе неврологическое заболевание не излечивается, комплекс необходимо вводить повторно с интервалами в три-четыре месяца. В зависимости от количества введенного чужеродного белка у некоторых пациентов образуются специфические антитела к ΒοΝΤ/Α. Эти пациенты становятся устойчивыми к нейротоксину Если чувствительные к антигену клетки хотя бы раз распознали нейротоксин и образовались антитела, соответствующие клетки памяти сохраняются в течение многих лет. Поэтому необходимо лечить пациентов препаратами с наивысшей активностью в как можно меньшей дозировке. Кроме того, препараты не должны содержать других белков бактериального происхождения, так как они могут действовать как иммуноадъюванты. Такие вещества привлекают макрофаги, которые распознают как иммуноадъюванты, так и нейротоксины и представляют их лимфоцитам, которые отвечают на это образованием иммуноглобулинов. Вследствие этого для лечения можно использовать только продукты наивысшей чистоты, которые не содержат чужеродных белков.
Настоящее изобретение обеспечивает транспортный белок (Угаро), который может обеспечить решение вышеуказанных проблем, связанных с известными ранее методами.
Предпочтительно обеспечивается транспортный белок (Угаро), сродство которого к сложным ганглиозидам повышено не менее чем в три раза.
Связывание с нервными клетками с большим сродством, чем у нативного нейротоксина. Нативный нейротоксин при этом предпочтительно является нативным нейротоксином из С. Βοίи1^ηит. Предпочтительно при этом нативный нейротоксин является ботулиновым нейротоксином А, и/или ботулиновым нейротоксином В, и/или ботулиновым нейротоксином О из С. ЬоШ1йшт. Полученный рекомбинантным способом из Е. сой ботулиновый нейротоксин, который, в частности, имеет последовательность аминокислот, идентичную с последовательностью аминокислот нативного ботулинового нейротоксина, ведет себя с фармакологической точки зрения идентично нативному ботулиновому нейротоксину, и называется рекомбинантным ботулиновым нейротоксином дикого типа. При этом упомянутыми нервными клетками являются холинергические мотонейроны (двигательные нейроны). Предпочтительно транспортный белок специфически связывается с полисиалоганглиозидами на поверхностях мембран нервных клеток, например с ОЭ1а, СЭ1Ь или ΟΤ16. Связывание предпочтительно определяется ίη νίίτο. Особо предпочтительным является определение с помощью анализа, который подробно описан в примерах.
Выражение модификация тяжелой цепи нейротоксинов С. ЬоШ1шит. Последовательность аминокислот и/или нуклеотидов тяжелой цепи (НС) нейротоксинов, образуемых С. ЬоШ1шит, может быть получена из общедоступных банков данных для каждого из известных серотипов А-0 (см. также табл. 1).
- 3 014526
Модификация при этом означает, что по меньшей мере одна аминокислота удалена, добавлена или внедрена в последовательность аминокислот, или что по меньшей мере одна аминокислота нативного нейротоксина заменена другой природной или не существующей в природе аминокислотой, и/или что одна аминокислота в данной последовательности аминокислот модифицирована посттрансляционно. Посттрансляционные модификации охватывают при этом гликозилирование, ацетилирование, ацилирование, дезаминирование, фосфорилирование, изопренилирование, гликозилфосфатидилинозитолирование и другие модификации, известные специалисту в данной области техники.
НС нейротоксинов, образуемых С. Ьо1и1шиш, содержит три субдомена, а именно: аминотерминальный транслокационный домен ΗΝ размером 50 кДа, прилегающий к нему П-.-домен размером 25 кДа и расположенный карбокситерминально НСс-домен размером 25 кДа. Η,-.,·- и НСс-домены совместно называют Нс-фрагментом. Соответствующие участки последовательности аминокислот соответствующих субдоменов для отдельных серотипов и их вариантов можно видеть в табл. 1.
Для детального описания гибридных белков с доменами из различных серотипов ΒοΝΤ в дальнейшем вводится следующая номенклатура. Например, выражение δοΛίΛΛΒ обозначает одноцепочечный нейротоксин (§с), состоящий из четырех доменов ЬС, ΗΝ, Η,·Ν и Нсс, при этом все домены согласно их происхождению обозначаются заглавными буквами соответствующего серотипа. Это значит, что в 8сЛ1ЛЛВ ЬС, ΗΝ и Нз, ведут свое происхождение от ΒοΝΤ/Α, тогда как Нсс-домен от ΒοΝΤ/Α заменен соответствующим доменом от ΒοΝΤ/Β. Маленькая буква I символизирует вставленную между ВС и Н·-,· последовательность, распознаваемую тромбином.
Таблица 1. Номера аминокислотных последовательностей в банках данных и распределение субдоменов семи ботулиновых нейротоксинов
| ΒοΝΤ | Номер посл-ти белка в банке данных | Число аминокислот | НС | ||
| ΗΝ | Не | ||||
| Неи | Нсс | ||||
| ΒοΝΤ/Α | ААА23262 ААМ75961 ААСЮ6331 ВТС1АВ | 1296 | 449-866 | 867-1091 | 1092-1296 |
| Р10845 | 1296 | 449-866 | 867-1091 | 1092-1296 | |
| САА36289 | 1296 | 449-866 | 867-1091 | 1092-1296 | |
| САА51824 Ι40645 045894 | 1296 | 449-866 | 867-1091 | 1092-1296 |
- 4 014526
| ΒοΝΤ/Β | ΑΑί11499 ΑΑ 1.11498 | 1291 | 442-855 | 866-1078 | 1079-1291 |
| САА73968 | 1291 | 442-855 | 866-1078 | 1079-1291 | |
| ΑΑΚ97132 | 1291 | 442-855 | 866-1078 | 1079-1291 | |
| Α48940 ΑΑΑ23211 Ρ10844 | 1291 | 442-855 | 866-1078 | 1079-1291 | |
| ВАС22064 | 1291 | 442-855 | 866-1078 | 1079-1291 | |
| САА50482 140631 | 1291 | 442-855 | 866-1078 | 1079-1291 | |
| ΒοΝΤ/Ο1 | Α49777 ΒΑΑ14235 ΒΑΒ71749 САА51313 346431 | 1291 | 450-863 | 864-1092 | 1093-1291 |
| Ρ18640 | 1291 | 450-863 | 864-1092 | 1093-1291 | |
| ΒΑΑ08418 | 1280 | 450-863 | 864-1083 | 1084-1280 | |
| ΒΑΑ89713 | 1280 | 450-863 | 864-1083 | 1084-1280 | |
| ΒοΝΤ/ϋ | САА38175 Ρ19231 311455 | 1276 | 446-859 | 860-1079 | 1080-1276 |
| ΑΑΒ24244 | 1276 | 446-859 | 860-1079 | 1080-1276 | |
| ΒΑΑ07477 870582 | 1285 | 446-859 | 860-1088 | 1089-1285 | |
| ΒΑΑ90661 | 1285 | 446-859 | 860-1088 | 1089-1285 | |
| ΒοΝΤ/Ε | ΒΑΒ86845 САА44558 521178 | 1252 | 423-842 | 843-1066 | 1067-1252 |
| САА43999 000496 | 1251 | 423-842 | 843-1066 | 1067-1251 | |
| САА43998 Л40256 Ρ30995 | 1251 | 423-842 | 843-1066 | 1067-1251 | |
| ΒοΝΤ/Γ | 1901210Α ΑΑΑ23263 140813 Ρ30996 | 1274 | 440-860 | 861-1086 | 1087-1274 |
| САА73972 | 1280 | 440-861 | 862-1087 | 1088-1280 | |
| ΑΑΑ23210 САА57358 | 1278 | 440-861 | 862-1084 | 1085-1278 | |
| САА48329 333411 | 1268 | 432-853 | 854-1075 | 1076-1268 | |
| ΒοΝΤ/Θ | САА52275 060393 339791 | 1297 | 447-860 | 861-1086 | 1087-1297 |
Настоящее изобретение относится, прежде всего, к полипептиду ботулинового нейротоксина типа
- 5 014526
Α (ΒοΝΤ/Α) С1о§1пбшт Ьо1и1тит. который может быть получен посредством модификации тяжелой цепи, в которой в положениях аминокислот с 1092 по 1296 по меньшей мере одна аминокислота удалена или заменена другой аминокислотой. причем за счет этого указанный модифицированный полипептид связывается с нервными клетками с большим сродством. чем нативный нейротоксин. Этот полипептид проникает в нервные клетки посредством эндоцитоза.
Полученный согласно изобретению полипептид специфически связывается со сложными ганглиозидами холинергических мотонейронов. которые локализованы в плазматической мембране. предпочтительно СТ1Ь. Повышение сродства связывания предпочтительно обеспечивается за счет замены или делеции аминокислот в ганглиозидсвязывающем домене.
Согласно предпочтительной форме осуществеления изобретения полипептид по изобретению связывается с нервными клетками по меньшей мере на 15% с большим сродством. предпочтительно по меньшей мере на 50% с большим сродством. особо предпочтительно по меньшей мере на 80% с большим сродством. наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% с большим сродством чем нативный нейротоксин.
Согласно предпочтительной форме осуществления изобретения модификация НС производится в области Нс-фрагмента данного нейротоксина. Поскольку модификация охватывает замену. делецию. вставку или добавление аминокислот. она может проводиться. например. посредством целенаправленного мутагенеза. способы которого известны специалистам в данной области техники. Присутствующие в нативном нейротоксине аминокислоты заменяют либо существующими в природе. либо не существующими в природе аминокислотами. Принципиально аминокислоты можно разделить на различные физико-химические группы. К отрицательно заряженным аминокислотам относятся аспартат и глутамат. К положительно заряженным аминокислотам относятся гистидин. аргинин и лизин. К полярным аминокислотам относятся аспарагин. глутамин. серин. треонин. цистеин и тирозин. К неполярным аминокислотам относятся глицин. аланин. валин. лейцин. изолейцин. метионин. пролин. фенилаланин и триптофан. Ароматические боковые группы обнаруживаются у аминокислот гистидина. фенилаланина. тирозина и триптофана. В целом. предпочтительно. чтобы аминокислоту заменяли другой аминокислотой. которая относится к другой физико-химической группе.
Согласно предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения транспортный белок представляет собой ботулиновый нейротоксин серотипов Α-Ο.
В предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения транспортный белок происходит от последовательности аминокислот нейротоксина типа Α С1о81пбшш Ьо1и1тит (№№ в банке данных ААА23262 и САА51824).
Согласно одной из форм осуществления изобретения полипептид по изобретению содержит указанные замены или делеции аминокислот по меньшей мере в одном из положений 1117. 1202-1204. 12521254. 1262-1267. 1270. 1278-1279. Предпочтительна замена или делеция аминокислоты в положении 1117. Предпочтительно также. когда заменяющая аминокислота является аланином. цистеином. глутаматом. фенилаланином. изолейцином. лейцином. метионином. аспарагином. пролином. глутамином. серином. треонином или валином. Наиболее предпочтительно заменяющая аминокислота является аланином. цистеином или валином. В частности. в полипептиде по изобретению аминокислота в положении 1252 заменена на тирозин. или аминокислота в положении 1253 заменена на лизин.
В еще одной форме осуществления изобретения в полипептиде по изобретению две или три аминокислоты. выбранные из положений 1117. 1202-1204. 1252-1254. 1262-1267. 1270 и 1278-1279. удалены или заменены. причем предпочтительны положения 1117 вместе с 1252. 1117 вместе с 1253. 1117 вместе с 1262. 1117 вместе с 1278. 1117 вместе с 1279. 1117 вместе с 1252 и вместе с 1253. особо предпочтительны замены Υ1117Α вместе с Ρ1252Υ. Υ1117Α вместе с Н1253К. Υ1117Α вместе с ν1262Ι. Υ1117Α вместе с Ь1278Н. Υ1117Α вместе с 61279Ν. Υ11^ вместе с Ρ1252Υ. Υ11^ вместе с Н1253К. Υ11^ вместе с У12621. Υ11^ вместе с Ь1278Н. Υ11^ вместе с 61279Ν. Υ1117Υ вместе с Ρ1252Υ. Υ1117ν вместе с Н1253К. Υ1117ν вместе с ν1262Ι. Υ1117ν вместе с Ь1278Н. Υ1117ν вместе с 61279Ν. Υ1117Α вместе с Ρ1252Υ и вместе с Н1253К. У1117С вместе с Ρ1252ΥН вместе с Н1253К и Υ1117ν вместе с Ρ1252Υ и вместе с Н1253К.
Еще одна форма осуществления настоящего изобретения относится к полипептиду. в котором аминокислоты в положениях с 1092 по 1296 в ганглиозидсвязывающем домене. заменены на следующие последовательности: аминокислоты 1079-1291 белка нейротоксина типа В С1о81пбшт Ьо1и1тит. аминокислоты 1093-1291 белка нейротоксина типа С1 ОоЦпбшт Ьо1и1тит. аминокислоты 1080-1276 белка нейротоксина типа Ό ОоЦпбшт Ьо1и1тит. аминокислоты 1067-1252 белка нейротоксина типа Е С1о§1пбшт Ьо1и1тит. аминокислоты 1067-1251 белка нейротоксина типа Е ОоЦпбшт Ьи1уг1сит. аминокислоты 1085-1278 белка нейротоксина типа Ρ ОоЦпбшт Ьо1и1тит. аминокислоты 1076-1268 белка нейротоксина типа Ρ С1ойпбшт ЬагаШ. аминокислоты 1087-1297 белка нейротоксина типа С ОоЦпбшт Ьо1и1тит.
В одной форме осуществления настоящего изобретения белок нейротоксина типа В ОоЦпбшт Ьо1и1тит имеет № в банке данных ААА23211; белок нейротоксина типа С1 ОоЦпбшт Ьо1и1тит имеет № в банке данных САА51313; белок нейротоксина типа Ό ОоЦпбшт Ьо1и1тит имеет № в банке данных САА38175; белок нейротоксина типа Е ОоЦпбшт Ьо1и1тит имеет № в банке данных САА44558; белок
- 6 014526 нейротоксина типа Е С1о81пбшт ЬШупсит имеет № в банке данных САА43998; белок нейротоксина типа Е С1о51пбшш ЬоШБпит имеет № в банке данных САА57358; белок нейротоксина типа Е С1о81пбшт Ьага1и имеет № в банке данных САА48329; белок нейротоксина типа 6 С1обБтбшт ЬоШБпит имеет № в банке данных САА52275.
Другие подходящие для замены НСС-домены с положениями аминокислот следует взять из табл. 1.
Следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к конструкции, содержащей модифицированный полипептид по изобретению в качестве транспортного белка и по меньшей мере одну переносимую молекулу (X). Переносимая молекула может быть низкомолекулярным органическим соединением, пептидом или белком; предпочтительно она ковалентно связана с полипептидом при помощи пептидной связи, простой эфирной связи, сложноэфирной связи, сульфидной связи, дисульфидной связи или углерод-углеродной связи.
Предпочтительно низкомолекулярное органическое соединение является виростатиком, цитостатиком, антибиотиком или иммуноглобулином. Однако термин переносимая молекула охватывает дополнительно все известные терапевтически эффективные вещества.
Чтобы лучше использовать повышенное сродство Тгаро, его через последовательность аминокислот, специфически распознаваемую и расщепляемую протеазой тромбином, присоединяли аминотерминальным концом к ЬС ΒοΝΤ/Α, В, С1, Ό, Е, Е или О, в результате чего возникал определенный ТгароХ. Эффективность вышеуказанного ТгароХ была увеличена, по сравнению с нативным ΒοΝΤ/Α, в особо предпочтительном случае не менее чем в три раза. Этот новый продукт, не содержащий чужеродных белков, резко снижает стимуляцию иммунной системы из-за большой чистоты материала и низкой дозировки.
Следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к транспортному белку, в котором белок является протеазой, расщепляющей один или несколько белков аппарата высвобождения нейромедиаторов, причем протеаза выбрана из группы нейротоксинов, которая состоит из ЬС нейротоксинов С1о81ибшт Ьо1и1шит, в частности - типов А, В, С1, Ό, Е, Е и О, или протеолитически активного фрагмента ЬС нейротоксинов С1обБтбшт Ьо1и1шит, в частности серотипов А, В, С1, Ό, Е, Е и 6, причем фрагмент обнаруживает не менее 0,01% протеолитической активности нативной протеазы, предпочтительно не менее 5%, особо предпочтительно не менее 50% и наиболее предпочтительно не менее 90%. Предпочтительно транспортный белок и протеаза происходят от одного серотипа нейротоксина С. ЬоШБпит, особо предпочтителен Н4--домен транспортного белка и протеза от серотипа А нейротоксина С. Ьо1иБпит. Последовательности протеаз общеизвестны из банков данных, и их номера в банках данных приведены в табл. 1. Протеолитическую активность протеаз определяют на основании кинетики расщепления субстрата (см. Βίηζ е! а1. (2002), ВюсБетМгу 41(6), 1717-23).
ЬС характеризуются тем, что они содержат последовательность Н18-61и-Ьеи-Хаа-Н18-(Хаа)13-35-61и(Хаа)84-90-С1и-(Хаа)ц-Агд-Хаа-Хаа-Туг, причем Хаа может быть любой аминокислотой. Транспортный белок согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что белок и протеаза происходят из вышеупомянутых групп белков или протеаз соответственно.
Предпочтительно, когда протеаза расщепляет специфические субстраты внутри холинергических мотонейронов. Эти субстраты могут быть выбраны из белков, которые участвуют в высвобождении нейромедиаторов из периферических нервов, и белков, которые участвуют в каталитических реакциях внутри нервной клетки. Протеаза и транспортный белок могут быть ковалентно связаны через аминокислотную последовательность, которая специфически распознается и расщепляется эндопептидазой. После расщепления эндопептидазой транспортного белка протеаза и транспортный белок могут оставаться связанными дисульфидным мостиком, что, в свою очередь, приводит к образованию активного голотоксина.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая содержит полипептид или конструкцию по изобретению, и, при необходимости, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
Согласно изобретению такую композицию можно применять для лечения нарушения или заболевания, для которого показано лечение ботулиновым нейротоксином. Такое нарушение или заболевание может являться одним из следующих: гемифациальный спазм, спазматическая кривошея, спастика, дистония, мигрень, боль, заболевание шейного и поясничного отделов позвоночника, страбизм, гиперсаливация и депрессивное заболевание.
Настоящее изобретение предлагает также косметическую композицию, которая содержит полипептид или конструкцию по изобретению, и, при необходимости, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
Такая косметическая композиция применяется для устранения гипергидроза и сильно выраженных морщин лица.
Предложен также вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид или конструкцию по изобретению, а также клетка-хозяин, содержащая этот рекомбинантный вектор экспрессии, причем клетка-хозяин может быть выбрана из группы, включающей ЕзсБепсЫа сой, ЗассБаготусез сегеу181ае, Р1сБ1а ра81оп8 или ВасШиз теда1егшт.
Согласно настоящему изобретению предусмотрен способ получения транспортного белка. На пер
- 7 014526 вой стадии при этом получают нуклеиновую кислоту, кодирующую транспортный белок. Кодирующая нуклеиновая кислота при этом может быть РНК, ДНК или их смесью. Кроме того, нуклеиновые кислоты могут быть модифицированы в отношении их резистентности к нуклеазам, например, посредством вставки фосфотиоатных связей. Нуклеиновая кислота может быть получена из исходной нуклеиновой кислоты, при этом исходная нуклеиновая кислота может быть получена посредством клонирования нуклеиновых кислот из геномных банков или банков кДНК. Также нуклеиновая кислота может быть получена непосредственно путем твердофазного синтеза. Подходящие способы известны специалисту в данной области техники. Если исходить из исходной нуклеиновой кислоты, то можно, например посредством сайтнаправленного мутагенеза, провести целенаправленное изменений, которое на уровне аминокислот приведет к по меньшей мере одной добавке, вставке, делеции и/или замене. Затем нуклеиновые кислоты оперативно соединяют с подходящим промотором. Промоторы, подходящие для экспрессии в известных системах экспрессии, известны специалисту в данной области техники. Выбор промотора зависит при этом от используемой для экспрессии системы экспрессии. В целом, предпочтительны конститутивные промоторы, однако находят применение и индуцируемые промоторы. Полученная таким образом конструкция включает в себя, по меньшей мере часть вектора, в частности регуляторные элементы, причем вектор выбирают, например, из λ-производных, аденовирусов, бакуловирусов, вакциниявирусов, 8У40вирусов и ретровирусов. Вектор предпочтительно способен к экспрессии нуклеиновых кислот в определенной клетке-хозяине.
Далее изобретение предусматривает клетки-хозяева, которые содержат вектор и которые пригодны для экспрессии вектора. На современном уровне техники известны многочисленные прокариотические и эукариотические системы экспрессии, при этом клетки-хозяева выбраны, например, из прокариотических клеток, таких как Е. со11 или В. шсд-Испиш. или эукариотических клеток, таких как 8. ссгсуыас и Р. райоиБ. Хотя можно использовать и клетки эукариот, находящихся на более высоких уровнях развития, например клетки насекомых или клетки млекопитающих, все же предпочтительны такие клетки-хозяева, которые, также как и С. Ьо!и1тит, не используют аппарат гликозилирования.
Согласно предпочтительной форме осуществления изобретения нуклеиновая кислота кодирует Нссдомен нейротоксина С. Ьо!и1тит. Эта нуклеиновая кислота содержит сайты рестрикции эндонуклеазой, которые фланкируют нуклеиновую кислоту, кодирующую Нс-фрагмент, при этом сайты рестрикции эндонуклеазой совместимы с сайтами рестрикции других Нс-фрагментов из нейротоксинов С. Ьо!и1тит, чтобы был возможен легкий обмен модулей в гене, кодирующем транспортный белок, с сохранением сходства последовательности аминокислот.
Что касается конструкции согласно настоящему изобретению, то она наряду с транспортным белком содержит по меньшей мере одну переносимую молекулу, и эта переносимая молекула представляет собой пептид или белок, функционализированный карбокситерминальным цистеином или меркаптогруппой, и аналогично тому, как описано выше, этот пептид или белок можно получить рекомбинантным методом, например с использованием бинарных векторов или различных клеток-хозяев. Если эти клеткихозяева используются для экспрессии как транспортного белка, так и пептида или белка, то предпочтительно межмолекулярную дисульфидную связь образуют ίη зйи. Для более эффективного продуцирования в той же клетке-хозяине нуклеиновая кислота, кодирующая пептид или белок, может быть транслирована вместе с транспортным белком в одних и тех же рамках считывания, так что образуется одноцепочечный полипептид. При этом, предпочтительно, образуется внутримолекулярная дисульфидная связь ίη 8Йи. Для простого гидролиза существующей пептидной связи между транспортным белком и пептидом или белком к аминоконцу транспортного белка присоединяют последовательность аминокислот, которая распознается и расщепляется либо специфической протеазой тромбином, либо специфической эндопротеазой клетки-хозяина.
Если это невозможно, после раздельной очистки транспортного белка и белка можно получить соответствующую межмолекулярную дисульфидную связь с использованием известного специалисту в данной области техники окислительного способа. Пептид или белок также можно получить прямо посредством синтеза или конденсации фрагментов. Соответствующие способы известны специалисту в данной области техники.
Затем транспортный белок и, соответственно, пептид или белок очищают. При этом можно использовать известные специалисту в данной области техники способы, например хроматографический способ или электрофорез.
Следующая форма осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит транспортный белок и, по выбору, фармацевтически приемлемый носитель (эксципиент), разбавитель и/или добавку и пригодна для лечения следующих нарушений и заболеваний: гемифациальный спазм, спазматическая кривошея, спастики, дистонии, мигрени, боли, заболевания шейного и поясничного отделов позвоночника, страбизм, гиперсаливация и депрессивные заболевания.
Фармацевтическая композиция пригодна для орального, внутривенного, подкожного, внутримышечного и местного применения. При этом предпочтительным является внутримышечное введение. Единица дозировки фармацевтической композиции содержит приблизительно от 0,1 пг до 1 мг транспортного белка и/или конструкции согласно настоящему изобретению.
- 8 014526
Следующая форма осуществления настоящего изобретения представляет собой косметическую композицию, которая состоит из транспортного белка и фармацевтического носителя (эксципиента), разбавителя и/или добавки и пригодна для лечения гипергидроза и сильно выраженных морщин на лице. Косметическая композиция пригодна для орального, внутривенного, подкожного, внутримышечного и местного применения. При этом предпочтительным является внутримышечное введение. Единица дозировки фармацевтической композиции содержит приблизительно от 0,1 пг до 1 мг транспортного белка и/или конструкции согласно настоящему изобретению. Косметическая композиция пригодна для лечения гипергидроза и морщин на лице.
Описанный в настоящем изобретении транспортный белок может быть получен из подходящей клетки-хозяина, например: ЕксйепсЫа сой, Зассйаготусек сетеуШае, Р1сЫа ракЮпк или ВасШик теда1егшт, - которые размножают рекомбинантный вектор экспрессии, при этом вектор кодирует транспортный белок.
Настоящее изобретение будет разъяснено при помощи прилагаемых чертежей, при этом фиг. 1 показывает, что сродство мутированного Нс-фрагмента ΒοΝΤ/Α к препаратам мембран синаптосом из мозга крыса в три раза больше, чем сродство Нс-фрагмента дикого типа ΒοΝΤ/Α;
фиг. 2 показывает связывание различных мутеинов Нс-фрагмента ΒοΝΤ/Α мутеина с синаптосомами мозга крысы, при этом сродство Нс-фрагмента ΒοΝΤ/Α дикого типа было принято за 100% в качестве стандарта. В первом блоке показаны величины сродства ΒοΝΤ/Α-мутеинов, которые содержат мутации аминокислоты Υ1117, которые ведут к повышению сродства. Во втором блоке представлены другие ΒοΝΤ/Α-мутеины. В третьем блоке показаны величины сродства ΒοΝΤ/Α-мутеинов, которые содержат двойные мутации, которые усиливают связывание с мембранами нервных клеток (синаптосомами);
фиг. 3 показывает повышенную нейротоксичность Υ1117Α-мутеинов ΒοΝΤ/Α, по сравнению с ΒοΝΤ/Α дикого типа, в отношении изолированного препарата диафрагмального нерва (иегуик рйтешсик) диафрагмальной мышцы мыши;
фиг. 4 показывает связывание четырех гибридных Нс-фрагментов ΒοΝΤ-А: НСАВ, НСАС, ΗΑΕ и НСАТ (Т = столбнячный нейротоксин) - на мембраны нервных клеток (синаптосомы), при этом сродство Нс-фрагмента ΒοΝΤ/Α дикого типа было принято за 100% в качестве стандарта;
фиг. 5 показывает повышенную нейротоксичность общего гибридного токсина, состоящего из ΒοΝΤ/Α и или Нс-фрагмента, или Нсс-домена от ΒοΝΤ/Β, по сравнению с ΒοΝΤ/Α дикого типа, в отношении изолированного препарата диафрагмального нерва (иегуик рйтешсик) - диафрагмальной мышцы мыши.
Более подробно, настоящее изобретение относится к транспортному белку (Τηρο), который получают посредством модификации НС нейротоксина, продуцируемого сЪкйтбшт Ьοΐи1^ηит, который, предпочтительно, специфически связывается с нейроном, поступает внутрь клетки посредством опосредованного рецепторами эндоцитоза и транслоцируется из кислого эндосомального компартмента в цитозоль нейронов. Этот белок используется в качестве транспортера для переноса в клетки связанных с ним протеаз и других веществ, которые физиологически не могут преодолеть плазматическую мембрану и проникнуть в цитозоль нервных клеток. Субстратами протеаз являются локализованные внутриклеточно белки и пептиды, которые участвуют в высвобождении медиаторов. После расщепления субстрата блокируются специфические функции нейронов, при этом сами клетки не повреждаются. Одной из этих функций является экзоцитоз, который обеспечивает высвобождение медиатора. Если высвобождение медиаторов подавляется, то блокируется передача сигналов от клетки к клетке. Например, поперечнополосатые мышцы расслабляются (парализуются), если угнетается высвобождение ацетилхолина в точке нервно-мышечного контакта. Этот эффект может быть использован с терапевтической целью, если применять ΤηροΧ к нервным окончаниям спастичных или дистоничных мышц. Другими активными веществами являются, например, активные вещества с противовирусным действием. Конъюгированные с Тгаро, они могут быть полезными для лечения вирусных инфекций нервной системы. Настоящее изобретение относится также к применению транспортного белка для подавления высвобождения нейромедиаторов.
Если лечить пациентов нативными формами ΒοΝΤ/Α и В, инъекция этих не человеческих белков, несмотря на низкую дозу, приводит к образованию антител, так что приходится прекращать лечение, чтобы избежать анафилактического шока. Если же применить вещество с тем же механизмом действия с большей эффективностью транспортировки ферментативной активности, можно резко уменьшить дозу, и не будет происходить образования антител. Эти свойства присущи описанному в данной работе транспортному белку.
Хотя примеры применения приведены, подходящий способ применения и дозировка обычно определяются лечащим врачом. Такие решения приходится принимать в повседневной практике каждому врачу, занимающемуся профессиональной деятельностью. Так, например, способ применения и дозировку нейротоксина согласно настоящему изобретению можно выбрать на основании таких критериев, как растворимость выбранного нейротоксина или интенсивность болей, на которые необходимо воздействовать.
В настоящее время интервал между циклами лечения нативными ΒοΝΤ/Α и В в среднем составляет
- 9 014526 от трех до четырех месяцев. Увеличение этого интервала снизило бы риск образования антител и обеспечило бы большую длительность лечения с использованием ΒοΝΤ. Увеличение концентрации ЬС в цитозоле увеличило бы время ее распада и за счет этого увеличило бы длительность эффекта. Описанный в данной работе транспортный белок обладает большим сродством и большей скоростью поступления в клетку, чем нативная НС-А.
Приведенные ниже примеры служат исключительно для целей разъяснения, и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение.
Описание примеров осуществления изобретения
Пример 1. Рекомбинантная экспрессия ТгароХ, полученного способом генной инженерии, в Е. οοΐί.
ДНК-последовательность тяжелой цепи (НС) ΒοΝΤ/Α была амплифицирована на хромосомной ДНК С1о8йтйшш ЬоШйпит (№ в банке данных ААА23262) посредством ПЦР. При этом кодон аминокислоты тирозина в положении 1117 с помощью специфических олигонуклеотидов был заменен на базовый триплет, кодирующий аминокислоту аланин. Далее 5'-конец гена был дополнен ДНК-последовательностью, кодирующей аминокислоты последовательности, распознаваемой тромбином. Эту ДНКпоследовательность включали в бактериальный вектор экспрессии. При этом встроенный ген Тгаро на 3'конце был слит с олигонуклеотидом, который кодирует карбокситерминальный пептид сродства, например 81герТад, 6χΗΝ-Τ;·ΐβ или Н186-Тад. Полученный таким образом вектор экспрессии рАК.-Тгаро является основой для включения молекул переносчика, например ЬС ΒοΝΤ.
ДНК-последовательность легкой цепи (ЬС) ΒοΝΤ/Α была амплифицирована на хромосомной ДНКпоследовательности Скйпйшт ^ШИпит (№ в банке данных ААА23262) посредством ПЦР и встроена в вектор экспрессии рΑΚ.-Τ^арο выше закодированной последовательности, распознаваемой тромбином. Полученный таким образом вектор экспрессии рΑΚ.-Τ^арοX был трансформирован в штамм К12 Ε.οοίί, и экспрессия белка ΤπψοΧ была индуцирована в условиях, соответствующих второму уровню биологической безопасности, и с соблюдением отданных в отношении проекта распоряжений администрации округа Ганновер (номер дела 501д.40654/3/57/3). Экспрессированный ΤπψοΧ был выделен в виде одноцепочечного белка с молекулярным весом 150 кДа посредством аффинной хроматографии согласно инструкциям производителя. Затем белок был гидролизован при помощи тромбина, конъюгированного на сефарозе, при этом был получен чистый белок, две цепи которого оставались связанными дисульфидным мостиком.
Этот белок обнаруживал, по сравнению с диким типом ΒοΝΤ/Α, повышенное на 300% сродство к изолированному и иммобилизированному на планшетах для микротитрования ганглиозиду ΟΤ16 и к препаратам мембран синаптосом из мозга крысы (фиг. 1). Каталитическая активность ЬС-А не изменялась, что показало расщепление ίη νίίτο рекомбинантным 8ΝΑΡ-25. Эффективность Τ^арοX в отношении подавления высвобождения нейромедиатора из функциональных синаптосом из мозга крысы была повышена до 300%, по сравнению с выделенным из ΟοδΙπάίιιιη ^иИпит нативным ΒοΝΤ/Α. В отношении нервно-мышечного препарата мыши (ΗΑΌ) эффективность ΤπψοΧ также была повышена до 300%, по сравнению с нативным ΒοΝΤ/Α (фиг. 2).
Пример 2. Измерение связывания различных ΒοΝΤ/Α-мутеинов с синаптосомами из мозга крысы и измерение нейротоксичности с использованием ΗΑΌ.
Связывание радиоактивно меченых Нс-фрагментов с синаптосомами крысы было измерено так, как описано в работе Витте1 еί а1., Е Μο1. Βίο1. 326 (2003), 835-847. Нейротоксичность ΒοΝΤ/Α-мутеинов определяли так, как описано в работе НаЬегтапп еί а1., №шпуп 8сйт1ейеЬегд'5 ΑγοΙι. Ρйа^тасο1. 322 (1980), 33-40.
Связывание различных ΒοΝΤ/Α-мутеинов в сравнении с диким типом продемонстрировано в приведенной ниже таблице.
- 10 014526
Таблица 1 к фиг. 2
| Мутация | % по сравнению с диким типом | Стандартное отклонение |
| Дикий тип | 100,0 | 15,00 |
| Υ1117Α | 332,3 | 29,00 |
| Υ1117С | 324,2 | 44,75 |
| Υ11176 | 124,4 | 26,94 |
| Υ1117Ε | 183,3 | 27,95 |
| Υ1117Ε | 235,9 | 38,41 |
| Υ1117Θ | 112,8 | 21,34 |
| Υ1117Η | 120,0 | 22,29 |
| Υ1117Ι | 248,1 | 21,95 |
| Υ1117Ι- | 253,6 | 25,65 |
| Υ1117Μ | 182,8 | 18,41 |
| Υ1117Ν | 250,3 | 20,13 |
| Υ1117Ρ | 150,3 | 14,98 |
| Υ1117Ο | 187,3 | 28,19 |
| Υ1117Κ | 115,4 | 16,80 |
| Υ11173 | 199,2 | 32,65 |
| Υ1117Τ | 264,1 | 28,55 |
| Υ1117ν | 346,9 | 37,61 |
| Ε1252Υ | 208,0 | 38,36 |
| Н1253К | 153,0 | 9,24 |
| Υ1262) | 97,8 | 9,38 |
| Ο1270Ν | 122,3 | 37,81 |
| И278Н | 170,0 | 61,59 |
| Θ1279Ν | 153,6 | 44,54 |
| У1117С/Н1253К | 324,8 | 22,72 |
| Υ1117ν/Η1253Κ | 332,9 | 33,48 |
Мутация отдельных определенных аминокислот в пределах ганглиозидсвязывающей полости ΒοΝΤ/Α приводила к повышению связывания с нервными клетками. Предпочтительно тирозин в положении 1117 заменяли на аланин, цистеин или валин. В частности, замена тирозина в положении 1117 на аланин вдет к повышению сродства примерно до 330%.
Другие мутации отдельных аминокислот из ганглиозидсвязывающей полости в положениях 1252 и 1253 также приводили к повышению связывания. В частности, мутация Р1252 на тирозин и Н1253 на лизин приводила к повышению сродства на 110% или 50% соответственно.
Далее можно ожидать повышения связывания с нервными клетками при мутациях в положениях 1202, 1262, 1270, 1278 и 1279.
Кроме того, были испытаны также мутеины ΒοΝΤ/Α с двойными мутациями, при этом к повышению связывания с синаптосомами приводили, в частности, мутеины У1117С/Н1253К и У1117У/Н1253К (ср. фиг. 2).
Далее было установлено, что повышение связывания, в частности мутеином Υ1117Α ΒοΝΤ/Α, приводило к повышению нейротоксичности в анализе на нейротоксичность с использованием препарата диафрагмального нерва-диафрагмальной мышцы (НЭЛ-анализ) (фиг. 3).
Пример 3. Определение связывания и нейротоксичности Нсс-гибридов ΒοΝΤ/Α.
Определение связывания и нейротоксичности проводили так, как описано выше.
Результаты представлены в приведенной ниже таблице и, кроме того, на фиг. 4 и 5.
Таблица к фиг. 4
| Мутация | % по сравнению с диким типом | Стандартное отклонение |
| НсА иФ | 100,0 | 10,4 |
| НсАВ | 249,2 | 19,1 |
| НсАС | 393,4 | 57,9 |
| НсАЕ | 22,0 | 5,3 |
| НсАТ | 210,2 | 22,5 |
Замена Нсс-домена ΒοΝΤ/Α на другие серотипы, в частности на домены нейротоксина В
- 11 014526
Ο'.όοΐιιΐίηιιιη и нейротоксина С Ο'.όοΐιιΐίηιιιη, приводила к повышению связывания с нервными клетками. Кроме того, было обнаружено, что замена НСс-домена Нс-фрагмента ΒοΝΤ/Α на соответствующие домены столбнячного нейротоксина также приводила к повышению сродства к нервным клеткам. Изменения сродства происходили также при замене Нсс-домена во всем ΒοΝΤ/Α. При этом фиг. 5 демонстрирует, что в случае гибрида δοΑίΑΑΒ повышение сродства одновременно вызывает повышение нейротоксичности. Если вместо Нсс-домена заменяется весь Нс-фрагмент δοΑίΑΑΒ. наблюдаются соответствующие результаты. В частности, наблюдалось, что при замене Нсс-домена или Нс-фрагмента ΒοΝΤ/Α соответствующим доменом или фрагментом ΒοΝΤ/Β наблюдалось повышение нейротоксичности примерно на 350%.
Пример 4. Определение связывания ΒοΝΤ-мутеина с ганглиозидом 0Τ1Β.
Ганглиозид СТЧЬ [МАсМеиаЗСа1рЗЫАс6а!р4(ЫАсМеиа8МАсЫеиаЗ)<За1р4Сэ1сЗ] (§1дта-А1йг1сй) растворяли в метаноле и наносили на высокоаффинные 96-луночные полистироловые планшеты для микротитрования (ΟοΓηίη§: 1 мкг 0Τ1Β в 100 мкл/лунку) или, в случае конкурентного анализа с 125ΙΒοΝΤ на С8 (8шд1е Ьгеак 51пр р1а1е) планшеты высокого сродства (Огешег Βίο-οΗηο: 0,1 мкг СТ1Ь в 100 мкл/лунку). Растворитель испаряли при комнатной температуре и лунки три раза промывали буфером для связывания (10 мМ Τήδ-ΠΟ, 10 мМ №ьНРО+ 0,5% бычьего сывороточного альбумина (Β8Α), рН 7,2). Затем неспецифические сайты связывания блокировали посредством инкубирования в течение двух часов в РНУЪхееп [140 мМ №О, 7 мМ Кс1, 10 мМ №2НРО4, 1,8 мМ КН2РО4, 0,05% (об./об.) Ъхееп 20, рН 7,2] с добавлением 3% (вес./об.) Β8Α. Анализы связывания проводили в буфере для связывания (100 мкл/лунку) в течение 2 ч при комнатной температуре либо с увеличивающимися количествами дикого типа, либо с определенными количествами мутантов. Несвязанный белок удаляли посредством 3 циклов промывки с использованием каждый раз 250 мкл ΡΒί5/Τ^ееп-буфера. Связанные Нс-фрагменты выявляли посредством инкубации с конъюгатом Зйер-’Гасйп и щелочной фосфатазы (8Τ-ΑΡ, ΙΒΑ ОтЬН) в буфере для связывания в течение 2 ч при комнатной температуре согласно инструкции производителя. Субстратом для щелочной фосфатазы в конечном итоге служит р-нитрофенилфосфат (1 мг/мл в 100 мМ глицина, 1 мМ Мдс12, 1 мМ ΖηΟΚ рН 10,4). Реакцию дефосфорилирования останавливали посредством добавления 3 М раствора №1ОН и измеряли экстинкцию при 405 нм с использованием счетчика микропланшетов 8рес1га ΟοιιηΙ (Раскагй). Конкурентные анализы проводили в течение 2 часов при комнатной температуре в 100 мкл буфера для связывания при 700000 импульсов/лунку [1251]-ΒοΝΤ с различными количествами нативного ΒοΝΤ или рекомбинантного Нс-фрагмента. После инкубации и удаления супернатанта лунки три раза промывали ΡΒ§/Τ^ееп-буфером, просушивали и разделяли. Количества связанного радиоактивно меченого ΒοΝΤ затем определяли с помощью автоматического γ-счетчика (\Уа11ас 1480 Χνί/агй 3).
Claims (31)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Полипептид ботулинового нейротоксина типа Α (ΒοΝΤ/Α) скйпйшт Ьοΐи1шит, который может быть получен посредством модификации тяжелой цепи, в которой в положениях аминокислот с 1092 по 1296 по меньшей мере одна аминокислота удалена или заменена другой аминокислотой, причем за счет этого указанный модифицированный полипептид связывается с нервными клетками с большим сродством, чем нативный нейротоксин.
- 2. Полипептид по п.1, проникающий в нервные клетки посредством эндоцитоза.
- 3. Полипептид по п.1, который специфически связывается со сложными ганглиозидами холинергических мотонейронов, которые локализованы в плазматической мембране, предпочтительно СМЬ.
- 4. Полипептид по п.3, содержащий указанные замены или делеции аминокислот в ганглиозидсвязывающем домене.
- 5. Полипептид по любому из пп.1-4, который связывается с нервными клетками по меньшей мере на 15% с большим сродством, предпочтительно по меньшей мере на 50% с большим сродством, особо предпочтительно по меньшей мере на 80% с большим сродством, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% с большим сродством, чем нативный нейротоксин.
- 6. Полипептид по п.5, содержащий указанные замены или делеции аминокислот по меньшей мере в одном из положений 1117, 1202-1204, 1252-1254, 1262-1267,1270, 1278-1279.
- 7. Полипептид по п.6, содержащий замену или делецию аминокислоты в положении 1117.
- 8. Полипептид по п.7, в котором заменяющая аминокислота является аланином, цистеином, глутаматом, фенилаланином, изолейцином, лейцином, метионином, аспарагином, пролином, глутамином, серином, треонином или валином.
- 9. Полипептид по п.7, в котором заменяющая аминокислота является аланином, цистеином или валином.
- 10. Полипептид по п.6, в котором аминокислота в положении 1252 заменена на тирозин или аминокислота в положении 1253 заменена на лизин.
- 11. Полипептид по п.6, в котором две или три аминокислоты, выбранные из положений 1117, 12021204, 1252-1254, 1262-1267, 1270 и 1278-1279, удалены или заменены, причем предпочтительны положения 1117 вместе с 1252, 1117 вместе с 1253, 1117 вместе с 1262, 1117 вместе с 1278, 1117 вместе с 1279,- 12 0145261117 вместе с 1252 и вместе с 1253, особо предпочтительны замены Υ1117Α вместе с Ε1252Υ, Υ1117Α вместе с Н1253К, Υ1117Α вместе с У12621, Υ1117Α вместе с Ь1278Н, Υ1117Α вместе с 61279Ν, Υ1117Ο вместе с Ε1252Υ, Υ1117Ο вместе с Н1253К, Υ1117Ο вместе с У12621, Υ1117Ο вместе с Ь1278Н, Υ1117Ο вместе с 61279Ν, Υ1117ν вместе с Ε1252Υ, Υ1117Υ вместе с Н1253К, Υ1117Υ вместе с У12621, Υ1117ν вместе с Ь1278Н, Υ1117У вместе с 61279Ν, Υ1117Α вместе с Ε1252Υ и вместе с Н1253К, Υ1117С вместе с Ε1252Υ и вместе с Н1253К и У1117У вместе с Ε1252Υ и вместе с Н1253К.
- 12. Полипептид по п.4, в котором аминокислоты в положениях с 1092 по 1296 в ганглиозидсвязывающем домене заменены на следующие последовательности:аминокислоты 1079-1291 белка нейротоксина типа В С1о81пбшт ЬоШйпит, аминокислоты 1093-1291 белка нейротоксина типа С1 ОоЦпбшт ЬоШйпит, аминокислоты 1080-1276 белка нейротоксина типа Ό ОоЦпбЫш ЬоШйпит, аминокислоты 1067-1252 белка нейротоксина типа Е ОоЦпбШш ЬоШйпит, аминокислоты 1067-1251 белка нейротоксина типа Е ОоЦпбШш ЬШупсит, аминокислоты 1085-1278 белка нейротоксина типа Е С1о§1пбШт ЬоШйпит, аминокислоты 1076-1268 белка нейротоксина типа Е ОоЦпбЫш ЬагаШ, аминокислоты 1087-1297 белка нейротоксина типа С ОоЦпбЫш ЬоШйпит.
- 13. Конструкция, содержащая модифицированный полипептид по любому из пп.1-12 в качестве транспортного белка и по меньшей мере одну переносимую молекулу.
- 14. Конструкция по п.13, в которой переносимая молекула ковалентно связана с полипептидом при помощи пептидной связи, простой эфирной связи, сложноэфирной связи, сульфидной связи, дисульфидной связи или углерод-углеродной связи.
- 15. Конструкция по п.13, в которой переносимая молекула представляет собой низкомолекулярное органическое соединение, пептид или белок.
- 16. Конструкция по п.15, в которой низкомолекулярное органическое соединение является виростатиком, цитостатиком, антибиотиком или иммуноглобулином.
- 17. Конструкция по п.15, в которой белок представляет собой протеазу.
- 18. Конструкция по п.17, в которой протеаза происходит из нейротоксина ОоЦпбШш ЬоШйпит типа А, В, С1, Ό, Е, Е и С.
- 19. Конструкция по п.18, отличающаяся тем, что протеаза содержит последовательность НЫ-С1и^еи-Xаа-Н^8-(Xаа)зз-з5-С1и-(Xаа)84-90-С1и-(Xаа)11-Α^д-Xаа-Xаа-Τу^, при этом Хаа может быть любой аминокислотой.
- 20. Конструкция по п.18, отличающаяся тем, что протеаза расщепляет специфические субстраты внутри холинергических мотонейронов.
- 21. Конструкция по п.20, отличающаяся тем, что субстраты выбраны из белков, которые участвуют в высвобождении нейромедиаторов из периферических нервов, и белков, которые участвуют в каталитических реакциях внутри нервной клетки.
- 22. Конструкция по п.21, в которой протеаза и транспортный белок ковалентно связаны через аминокислотную последовательность, которая специфически распознается и расщепляется эндопептидазой.
- 23. Конструкция по п.22, в которой после расщепления эндопептидазой транспортного белка протеаза и транспортный белок остаются связанными дисульфидным мостиком, что в свою очередь приводит к образованию активного голотоксина.
- 24. Фармацевтическая композиция, которая содержит полипептид по любому из пп.1-12 или конструкцию по любому из пп.13-23 и, при необходимости, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
- 25. Применение фармацевтической композиции по п.24 для лечения нарушения или заболевания, для которого показано лечение ботулиновым нейротоксином.
- 26. Применение по п.25, где нарушение или заболевание являются одним из следующих: гемифациальный спазм, спазматическая кривошея, спастика, дистония, мигрень, боль, заболевание шейного и поясничного отделов позвоночника, страбизм, гиперсаливация и депрессивное заболевание.
- 27. Косметическая композиция, которая содержит полипептид по любому из пп.1-12 или конструкцию по любому из пп.13-23 и, при необходимости, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или добавку.
- 28. Применение фармацевтической композиции по п.27 для устранения гипергидроза и сильно выраженных морщин лица.
- 29. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид по любому из пп.1-12 или конструкцию по любому из пп.13-23.
- 30. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии по п.29.
- 31. Клетка-хозяин по п.30, выбранная из группы, включающей ЕксйепсЫа сой, 8ассйаготусе5 сегеУ181ае, РюЫа ракШпк или ВасШик тед-ИегШт.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102004043009A DE102004043009A1 (de) | 2004-09-06 | 2004-09-06 | Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen |
| PCT/EP2005/009554 WO2006027207A1 (de) | 2004-09-06 | 2005-09-06 | Transportprotein zum einbringen chemischer verbindungen in nervenzellen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200700408A1 EA200700408A1 (ru) | 2007-08-31 |
| EA014526B1 true EA014526B1 (ru) | 2010-12-30 |
Family
ID=35583367
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200700408A EA014526B1 (ru) | 2004-09-06 | 2005-09-06 | Полипептид ботулинового нейротоксина в качестве транспортного белка и способы его применения |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8293230B2 (ru) |
| EP (1) | EP1786832B1 (ru) |
| JP (2) | JP5357425B2 (ru) |
| KR (3) | KR101277280B1 (ru) |
| CN (1) | CN101056888B (ru) |
| AU (1) | AU2005281830B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0514943A (ru) |
| CA (1) | CA2578097C (ru) |
| DE (1) | DE102004043009A1 (ru) |
| DK (1) | DK1786832T3 (ru) |
| EA (1) | EA014526B1 (ru) |
| ES (1) | ES2390279T3 (ru) |
| HK (1) | HK1100291A1 (ru) |
| IL (1) | IL181481A (ru) |
| IN (1) | IN2014DN01950A (ru) |
| MX (1) | MX2007002737A (ru) |
| NO (1) | NO340732B1 (ru) |
| UA (1) | UA93359C2 (ru) |
| WO (1) | WO2006027207A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA200701896B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2673910C2 (ru) * | 2012-11-21 | 2018-12-03 | Ипсен Байоинновейшн Лимитед | Способ производства протеолитически процессированного полипептида |
Families Citing this family (75)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60032367T3 (de) | 1999-08-25 | 2011-03-10 | Allergan, Inc., Irvine | Aktivierbare rekombinante neurotoxine |
| US7138127B1 (en) | 2000-01-19 | 2006-11-21 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin derivatives and methods for treating pain |
| AU2005279741B2 (en) | 2004-09-01 | 2011-10-06 | Allergan, Inc. | Degradable clostridial toxins |
| DE102004043009A1 (de) | 2004-09-06 | 2006-03-23 | Toxogen Gmbh | Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen |
| US8021859B2 (en) | 2005-03-15 | 2011-09-20 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells |
| AU2006227816B2 (en) | 2005-03-15 | 2012-04-05 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced targeting capabilities for endogenous clostridial toxin receptor systems |
| DE102005019302A1 (de) | 2005-04-26 | 2006-11-16 | Toxogen Gmbh | Carrier zum Targeting von Nervenzellen |
| ES2326916T3 (es) * | 2005-06-17 | 2009-10-21 | MERZ PHARMA GMBH & CO. KGAA | Aparato y metodo para la produccion de compuestos biologicamente activos por fermentacion. |
| US20090269358A1 (en) * | 2005-10-07 | 2009-10-29 | Shone Clifford C | Proteins with Improved Solubility and Methods for Producing and Using Same |
| EP2038298A2 (en) * | 2006-07-11 | 2009-03-25 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells |
| AU2007347781B2 (en) * | 2006-07-11 | 2013-10-03 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capability and enhanced targeting activity |
| AU2007272517B2 (en) * | 2006-07-11 | 2013-09-26 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for non-clostridial toxin target cells |
| JP2008169166A (ja) * | 2007-01-14 | 2008-07-24 | Tokyo Univ Of Agriculture & Technology | 糖結合性ポリペプチド、複合材料、及び薬剤送達システム |
| KR20100020972A (ko) * | 2007-06-01 | 2010-02-23 | 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아 | 보툴리늄 톡신의 신경독 성분에 기초한 온도-안정한 근육 이완제를 제공하는 방법 |
| KR101087017B1 (ko) * | 2007-07-10 | 2011-12-09 | (주)메디톡스 | 보툴리눔 독소의 안정성이 개선된 약제학적 액상 조성물 |
| WO2009015840A2 (en) * | 2007-07-27 | 2009-02-05 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Polypeptide for targeting of neural cells |
| WO2009038770A2 (en) * | 2007-09-20 | 2009-03-26 | University Of Massachusetts Cvip | Detoxified recombinant botulinum neurotoxin |
| US8445650B2 (en) * | 2007-09-25 | 2013-05-21 | Thomas Jefferson University | Mutant botulinum neurotoxin serotype A polypeptide and uses thereof |
| EP2072039A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Merz Pharma GmbH & Co.KGaA | Use of a neurotoxic component of Clostridium botulinum toxin complex to reduce or prevent side effects |
| EP2072057A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Merz Pharma GmbH & Co.KGaA | Early administration of Botulinum toxin in the treatment of cerebrovascular event and spinal cord injury |
| US20110190216A1 (en) * | 2008-07-29 | 2011-08-04 | Florida State University Research Foundation | Materials and methods for treatment of spinal muscular atrophy and taxane-induced peripheral neuropathy (tipn) |
| EP2337790B1 (en) | 2008-08-29 | 2016-07-13 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Clostridial neurotoxins with altered persistency |
| DK2161033T3 (da) | 2008-09-09 | 2013-08-05 | Susanne Dr Grafe | Botulinustoxin til at indføre midlertidig infertilitet i et hvirveldyr (f.eks. et menneske) |
| EP2248518B1 (en) | 2009-04-17 | 2013-01-16 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Formulation for stabilizing proteins, peptides or mixtures thereof. |
| EP2246065A1 (en) | 2009-04-29 | 2010-11-03 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Intrastriatal botulinum toxin therapy |
| EP2399601A1 (en) | 2010-06-24 | 2011-12-28 | Merz Pharma GmbH & Co. KGaA | Botulinum toxin therapy |
| AU2011316111B2 (en) | 2010-10-12 | 2015-05-28 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Formulation suitable for stabilizing proteins, which is free of mammalian excipients |
| PT2854840T (pt) * | 2012-05-30 | 2018-03-02 | Harvard College | Neurotoxina botulínica geneticamente modificada |
| US9452205B2 (en) * | 2012-09-24 | 2016-09-27 | Montana State University | Recombinant Lactococcus lactis expressing Escherichia coli colonization factor antigen I (CFA/I) fimbriae and their methods of use |
| GB201219602D0 (en) * | 2012-10-31 | 2012-12-12 | Syntaxin Ltd | Recombinant clostridium botulinum neurotoxins |
| GB201312317D0 (en) | 2013-07-09 | 2013-08-21 | Syntaxin Ltd | Cationic neurotoxins |
| EP2952205B1 (en) | 2014-06-06 | 2017-08-09 | Kleiner-Fisman, Galit | Botulinum toxin for use in the treatment of paratonia |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| SG11201705019PA (en) | 2014-12-23 | 2017-07-28 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Botulinum toxin prefilled container |
| US10647750B2 (en) | 2015-01-09 | 2020-05-12 | Ipsen Bioinnovation Limited | Cationic neurotoxins |
| HUE057258T2 (hu) | 2015-03-26 | 2022-05-28 | Harvard College | Szerkesztett Botulinum neurotoxin |
| WO2016187076A1 (en) * | 2015-05-15 | 2016-11-24 | Pavlik Benjamin J | Engineered clostridium botulinum toxin adapted to deliver molecules into selected cells |
| CN108602861A (zh) | 2015-08-27 | 2018-09-28 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 用于治疗疼痛的组合物和方法 |
| GB201517450D0 (en) | 2015-10-02 | 2015-11-18 | Ipsen Biopharm Ltd | Method |
| CN108348415B (zh) * | 2015-11-20 | 2020-12-04 | 高露洁-棕榄公司 | 具有高纯偏磷酸盐磨料的单相增白洁齿剂 |
| GB201607901D0 (en) | 2016-05-05 | 2016-06-22 | Ipsen Biopharm Ltd | Chimeric neurotoxins |
| TWI737742B (zh) | 2016-06-22 | 2021-09-01 | 德商梅茲製藥有限兩合公司 | 肉毒桿菌毒素的預填充式注射器系統、具有其之套組以及其之使用 |
| EP3263710A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-03 | Ipsen Biopharm Limited | Production of activated clostridial neurotoxins |
| WO2018039506A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered botulinum neurotoxin |
| US20210277071A1 (en) * | 2016-09-29 | 2021-09-09 | Ipsen Biopharm Limited | Hybrid neurotoxins |
| EP3312290A1 (en) | 2016-10-18 | 2018-04-25 | Ipsen Biopharm Limited | Cellular vamp cleavage assay |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| TWI810228B (zh) | 2017-12-20 | 2023-08-01 | 英商艾普森生物製藥有限公司 | 自主神經系統障礙之治療 |
| WO2019243376A1 (en) | 2018-06-18 | 2019-12-26 | Ipsen Biopharm Limited | Intramuscular injection of botulinum toxin for the treatment of vulvodynia |
| GB201815817D0 (en) | 2018-09-28 | 2018-11-14 | Ispen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising and exogenous activation loop |
| CN113015812A (zh) | 2018-09-28 | 2021-06-22 | 益普生生物制药有限公司 | 基于细胞的梭菌神经毒素测定法 |
| GB201815844D0 (en) | 2018-09-28 | 2018-11-14 | Ipsen Biopharm Ltd | Therapeutic & comestic uses of botulinum neurotoxin serotype e |
| GB201900621D0 (en) | 2019-01-16 | 2019-03-06 | Ipsen Biopharm Ltd | Labelled polypeptides |
| GB201907016D0 (en) | 2019-05-17 | 2019-07-03 | Ipsen Biopharm Ltd | Screening method to determine suitability for participation in a clinical trial |
| GB201914034D0 (en) | 2019-09-30 | 2019-11-13 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of neurological disorders |
| GB202001353D0 (en) | 2020-01-31 | 2020-03-18 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of skin conditions |
| GB202011055D0 (en) | 2020-07-17 | 2020-09-02 | Ipsen Bioinnovation Ltd | Treatment of post-operative pain |
| GB202100566D0 (en) | 2021-01-15 | 2021-03-03 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of brain damage |
| GB202104294D0 (en) | 2021-03-26 | 2021-05-12 | Ipsen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising an exogenous activation loop |
| EP4297773A1 (en) | 2021-03-30 | 2024-01-03 | Ipsen Biopharm Limited | Catalytically inactive clostridial neurotoxins for the treatment of pain & inflammatory disorders |
| JP2024513191A (ja) | 2021-03-30 | 2024-03-22 | イプセン バイオファーム リミテッド | 疼痛及び炎症性障害の処置 |
| AU2022348206A1 (en) | 2021-09-16 | 2024-03-28 | Ipsen Biopharm Limited | Modified bont/a for use in the treatment of cervical dystonia |
| CA3228712A1 (en) | 2021-09-23 | 2023-03-30 | Nicolae GRIGORE | Modified bont/a for use in the treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject |
| GB202113602D0 (en) | 2021-09-23 | 2021-11-10 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of a disorder affecting an eyelid muscle of a subject |
| GB202116795D0 (en) | 2021-11-22 | 2022-01-05 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of visceral pain |
| CA3234608A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | Ipsen Biopharm Limited | Treatment of pain |
| GB202206362D0 (en) | 2022-04-29 | 2022-06-15 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of upper facial lines |
| GB202206353D0 (en) | 2022-04-29 | 2022-06-15 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of cervical dystonia |
| GB202206348D0 (en) | 2022-04-29 | 2022-06-15 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of limb spasticity |
| GB202206361D0 (en) | 2022-04-29 | 2022-06-15 | Ipsen Biopharm Ltd | Treatment of a facial dystonia |
| GB202213479D0 (en) | 2022-09-14 | 2022-10-26 | Ipsen Biopharm Ltd | Cell-free clostridial neurotoxin assays |
| GB202214229D0 (en) | 2022-09-28 | 2022-11-09 | Ipsen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising an activating endosomal protease cleavage site |
| GB202214232D0 (en) | 2022-09-28 | 2022-11-09 | Ispen Biopharm Ltd | Clostridial neurotoxins comprising an activating exogenous protease cleavage site |
| WO2024069191A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Ipsen Biopharm Limited | Clostridial neurotoxin for use in a treatment of bladder pain syndrome |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000055208A2 (en) * | 1999-03-18 | 2000-09-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chimeric toxins |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214787B1 (en) | 1993-09-21 | 2007-05-08 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
| GB9410871D0 (en) | 1994-05-31 | 1994-07-20 | Imperial College | Modification of tetanus toxin for use as a transport protein |
| US6967088B1 (en) | 1995-03-16 | 2005-11-22 | Allergan, Inc. | Soluble recombinant botulinum toxin proteins |
| GB9508204D0 (en) | 1995-04-21 | 1995-06-07 | Speywood Lab Ltd | A novel agent able to modify peripheral afferent function |
| US5939070A (en) | 1996-10-28 | 1999-08-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Hybrid botulinal neurotoxins |
| US7563874B2 (en) * | 1998-08-31 | 2009-07-21 | The Regents Of The University Of California | Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins |
| US7235521B1 (en) | 1999-05-17 | 2007-06-26 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Previns as specific inhibitors and therapeutic agents for botulinum toxin B and tetanus neurotoxins |
| DE60032367T3 (de) * | 1999-08-25 | 2011-03-10 | Allergan, Inc., Irvine | Aktivierbare rekombinante neurotoxine |
| US7368532B2 (en) | 1999-12-02 | 2008-05-06 | Syntaxin Limited | Constructs for delivery of therapeutic agents to neuronal cells |
| US7138127B1 (en) | 2000-01-19 | 2006-11-21 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin derivatives and methods for treating pain |
| US6670322B2 (en) | 2000-06-01 | 2003-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of targeting pharmaceuticals to motor neurons |
| US20020127247A1 (en) | 2000-11-17 | 2002-09-12 | Allergen Sales, Inc. | Modified clostridial neurotoxins with altered biological persistence |
| US7273722B2 (en) * | 2000-11-29 | 2007-09-25 | Allergan, Inc. | Neurotoxins with enhanced target specificity |
| US6787517B1 (en) | 2000-12-29 | 2004-09-07 | Allergan, Inc. | Agent and methods for treating pain |
| US7196189B2 (en) | 2001-10-09 | 2007-03-27 | Microbia, Inc. | love variant regulator molecules |
| US20070118934A1 (en) | 2001-10-26 | 2007-05-24 | Planet Biotechnology, Inc. | Chimeric toxin receptor proteins and chimeric toxin receptor proteins for treatment and prevention of anthrax |
| KR20030097047A (ko) * | 2002-06-18 | 2003-12-31 | 신찬영 | 초음파기화식냉풍기 |
| GB0216865D0 (en) * | 2002-07-19 | 2002-08-28 | Microbiological Res Authority | Targetted agents for nerve regeneration |
| US20040115727A1 (en) | 2002-12-11 | 2004-06-17 | Allergan, Inc., A Corporation | Evolved clostridial toxins with altered protease specificity |
| WO2005030119A2 (en) | 2003-04-11 | 2005-04-07 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin a peptides and methods of predicting and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy |
| US20050129677A1 (en) | 2003-12-10 | 2005-06-16 | Shengwen Li | Lipid rafts and clostridial toxins |
| US7514088B2 (en) | 2005-03-15 | 2009-04-07 | Allergan, Inc. | Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use |
| GB2416122A (en) * | 2004-07-12 | 2006-01-18 | Ipsen Ltd | Botulinum neurotoxin composition |
| GB2416692A (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-08 | Ipsen Ltd | Pharmaceutical composition containing botulinum neurotoxin |
| WO2006013370A1 (en) * | 2004-08-04 | 2006-02-09 | Ipsen Limited | Pharmaceutical composition containing botulinum neurotoxin a2 |
| DE102004043009A1 (de) | 2004-09-06 | 2006-03-23 | Toxogen Gmbh | Transportprotein zum Einbringen chemischer Verbindungen in Nervenzellen |
| US20070258992A1 (en) | 2004-10-06 | 2007-11-08 | Atassi M Zouhair | Determining and Reducing Immunoresistance to Botulinum Toxin Therapy Using Botulinum Toxin a Peptides |
| CA2588758C (en) | 2004-11-22 | 2017-01-03 | New York University | Genetically engineered clostridial genes, proteins encoded by the engineered genes, and uses thereof |
| AU2006227816B2 (en) | 2005-03-15 | 2012-04-05 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced targeting capabilities for endogenous clostridial toxin receptor systems |
| DE102005019302A1 (de) | 2005-04-26 | 2006-11-16 | Toxogen Gmbh | Carrier zum Targeting von Nervenzellen |
| ATE463506T1 (de) * | 2005-09-19 | 2010-04-15 | Allergan Inc | Mit clostriedientoxin aktivierbare clostridientoxine |
| DE102005051789B4 (de) | 2005-10-28 | 2014-08-07 | Toxogen Gmbh | Der Botulinus Neurotoxin A Proteinrezeptor und seine Anwendungen |
| AU2007347781B2 (en) | 2006-07-11 | 2013-10-03 | Allergan, Inc. | Modified clostridial toxins with enhanced translocation capability and enhanced targeting activity |
| US8445650B2 (en) | 2007-09-25 | 2013-05-21 | Thomas Jefferson University | Mutant botulinum neurotoxin serotype A polypeptide and uses thereof |
| US9005628B2 (en) | 2012-10-04 | 2015-04-14 | Dublin City University | Biotherapy for pain |
-
2004
- 2004-09-06 DE DE102004043009A patent/DE102004043009A1/de not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-09-06 MX MX2007002737A patent/MX2007002737A/es active IP Right Grant
- 2005-09-06 JP JP2007529343A patent/JP5357425B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-09-06 KR KR1020077005567A patent/KR101277280B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2005-09-06 ES ES05786305T patent/ES2390279T3/es active Active
- 2005-09-06 BR BRPI0514943-6A patent/BRPI0514943A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-09-06 UA UAA200702980A patent/UA93359C2/ru unknown
- 2005-09-06 CN CN2005800381125A patent/CN101056888B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-09-06 CA CA2578097A patent/CA2578097C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-09-06 AU AU2005281830A patent/AU2005281830B2/en not_active Ceased
- 2005-09-06 EA EA200700408A patent/EA014526B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-09-06 US US11/661,849 patent/US8293230B2/en active Active
- 2005-09-06 WO PCT/EP2005/009554 patent/WO2006027207A1/de active Application Filing
- 2005-09-06 EP EP05786305A patent/EP1786832B1/de active Active
- 2005-09-06 KR KR1020137009238A patent/KR20130043251A/ko active Application Filing
- 2005-09-06 DK DK05786305.2T patent/DK1786832T3/da active
- 2005-09-06 KR KR1020147012193A patent/KR101602128B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-02-21 IL IL181481A patent/IL181481A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-03-05 ZA ZA200701896A patent/ZA200701896B/xx unknown
- 2007-04-10 NO NO20071825A patent/NO340732B1/no not_active IP Right Cessation
- 2007-06-18 HK HK07106554.8A patent/HK1100291A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-09-10 US US13/608,631 patent/US9234011B2/en active Active
-
2013
- 2013-02-13 JP JP2013025913A patent/JP5833039B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-03-14 IN IN1950DEN2014 patent/IN2014DN01950A/en unknown
- 2014-08-05 US US14/451,668 patent/US9422344B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000055208A2 (en) * | 1999-03-18 | 2000-09-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chimeric toxins |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| GINALSKI A.V.K. ET AL.: "Structure-based sequence alignment for the beta-trefoil subdomain of the clostridial neurotoxin family provides residue level information about the putative ganglioside binding site" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 482, no. 1-2, 29 September 2000 (2000-09-29), pages 119-124, XP004337632 ISSN: 0014-5793 page 119 - page 124; figure 1 * |
| GOODNOUGH M.S. ET AL.: "Development of a delivery vehicle for intracellular transport of botulinum neurotoxin antagonists" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 513, no. 2-3, 27 February 2002 (2002-02-27), pages 163-168, XP004629890 ISSN: 0014-5793 the whole document * |
| IHARA H. ET AL.: "Sequence of the gene for Clostridium botulinum type V neurotoxin associated with infant botulism, expression of the C-terminal half of heavy chain and its binding activity" BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. GENE STRUCTURE AND EXPRESSION, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 1625, no. 1, 3 January 2003 (2003-01-03), pages 19-26, XP004402176 ISSN: 0167-4781 the whole document * |
| RUMMEL ANDREAS ET AL: "The Hcc-domain of botulinum neurotoxins A and B exhibits a singular ganglioside binding site displaying serotype specific carbohydrate interaction." MOLECULAR MICROBIOLOGY, Bd. 51, Nr. 3, Februar 2004 (2004-02), Seiten 631-643, XP002363868 ISSN: 0950-382X * |
| SUTTON J.M. ET AL.: "Tyrosine-1290 of tetanus neurotoxin plays a key role in its binding to gangliosides and functional binding to neurones" FEBS LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 493, no. 1, 23 March 2001 (2001-03-23), pages 45-49, XP004257397 ISSN: 0014-5793 the whole document * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2673910C2 (ru) * | 2012-11-21 | 2018-12-03 | Ипсен Байоинновейшн Лимитед | Способ производства протеолитически процессированного полипептида |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA014526B1 (ru) | Полипептид ботулинового нейротоксина в качестве транспортного белка и способы его применения | |
| US10883096B2 (en) | Carrier for targeting nerve cells | |
| Kumar et al. | The botulinum toxin as a therapeutic agent: molecular structure and mechanism of action in motor and sensory systems | |
| AU2002228684B9 (en) | Neurotoxins with enhanced target specificity | |
| KR20030009431A (ko) | 신경독의 말초 투여를 통한 동통 처치 방법 | |
| AU2014372689B2 (en) | Multiprotease therapeutics for chronic pain | |
| WO2018109447A1 (en) | Neurotoxins | |
| US20230028019A1 (en) | Bonded neurotoxins | |
| Calvo et al. | Clostridium tetani and Tetanus Toxin: A Therapeutic Approach with a Promising Molecule–Fragment C of Tetanus Toxin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| TC4A | Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |