NO340732B1 - Transportprotein som blir brukt til å innføre kjemiske forbindelser i nerveceller - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et transportprotein som definert i patentkravene, som binder seg til nevroner, opptas med reseptorformidlet endocytose og transfereres fra den sure, endosomale kompartementen i cytosol fra nevroner. Dette proteinet anvendes som en transportør, som transfererer andre kjemiske substanser (eksempelvis protease), som fysiologisk ikke kan trenge gjennom plasmamembranen i cytosolen i nerveceller. Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelsen av et transportprotein for inhibering av frisettingen av nevrotransmittere.

Nerveceller frigjør transmitterstoffer ved eksocytose. Som eksocytose betegnes sammensmeltingen av membranene til intracellulære vesikler med plasmamembranen. I en slik prosess blir samtidig det vesikulære innholdet i den synaptiske spalte uttømt. Fusjonen mellom de to membraner reguleres av kalsium, som reagerer med proteinet synaptotagmin. Sammen med andre kofaktorer kontrollerer synaptotagmin statusen til tre såkalte fusjonsproteiner, SNAP-25, synaptobrevin 2 og syntaksin IA. Mens syntaksin IA og synaptobrevin 2 er integrert i plasma- henholdsvis vesikkelmembranen, har SNAP-25 bare en svak binding til plasmamembranen. Ved en øking av den intracellulære kalsiumkonsentrasjon vil de tre proteinene binde seg til hverandre, idet de to membranene nærmer seg hverandre og deretter smelter sammen. Ved cholinerge nevroner frigjøres acetylcholin, som forårsaker muskelsammentrekninger, svetteutsondring og andre cholinergt formidlede reaksjoner.

De foran nevnte fusjonsproteiner er målmolekylene (substratene) i de lette kjedene av de klostridielle nevrotoksiner, som dannes av bakterien Clostridium botulinum.

Den anaerobe, gram-positive bakterien Clostridium botulinum produserer syv ulike typer av protein-nevrotoksiner. Disse betegnes som Botulinus nevrotoksin (BoNT/A til BoNT/G). Av disse er det særlig BoNT/A og BoNT/B som hos mennesker og dyr tilveiebringer en nevroparalyttisk sykdom, som betegnes som botulisme. Sporer av Clostridium botulinum finnes i jorden, men kan også utvikle seg i utilstrekkelig steriliserte og lukkede næringsmiddelkonserver fremstilt i husholdningen. Det er slike tilfeller som er årsaken til de fleste botulismustilfeller.

BoNT/A er den mest dødelige av alle kjente biologiske substanser. Bare ca. 5-6 pg renset BoNT/A representerer en MLD (Multiple Low Dose). En enhet (eng.: Unit, U) av BoNT defineres som den MLD, som etter en intraperitoneal injisering dreper halvparten av Swiss Webster-hunnmus med en vekt på 18-20 g. Syv immunologisk ulike BoNT erkarakterisert. De har betegnelsene BoNT/A, B, Ci, D, E, F og G og kan atskilles ved nøytralisering med sterotypspesifikke antilegemer. De ulike serotyper av BoNT atskiller seg ved de aktuelle dyrearter med hensyn til den forårsakede lammings alvorlighet og varighet. Således vil eksempelvis ved en rotte BoNT/A være 500 ganger kraftigere enn BoNT/B med hensyn på en lamming. Hertil kommer at BoNT/B ved primater har vist seg å være ikke-toksisk i en dosering på 480 U/kg kroppsvekt. Den samme mengden BoNT/A tilsvarer den 12 ganger letale dose (LD) av dette stoffet hos primater. Dessuten vil for mus lammingstiden etter en injisering av BoNT/A være 10 ganger lengre enn etter injisering av BoNT/E.

BoNT benyttes klinisk for behandling av nevromuskulære forstyrrelser, som forårsakes av hyperaktivitet i skjelettmuskler som følge av patologisk overaktive perifere nerver. US Food and Drug Administration tillater BoNT/A for behandling av Blepharospasmus, Strabismus og Hemifacialspasmer. Sammenlignet med BoNT/A har de øvrige BoNT-serotyper åpenbart en dårligere virkning og en kortere virkningstid. Kliniske effekter av perifert intramuskulært administrert BoNT/A vil vanligvis innstille seg i løpet av 1 uke. Varigheten av symptomundertrykkelsen ved en eneste intramuskulær injisering av BoNT/A, vil som regel være ca. 3 måneder.

De klostridielle nevrotoksiner hydrolyserer spesifikt ulike proteiner i fusjonsapparatet. BoNT/A, Ci og E spalter SNAP-25, mens BoNT/B, D, F, G så vel som tetanusnevrotoksin (TeNT) angriper det vesikkeassosierte membranprotein (VAMP) 2 - også benevnt synaptobrevin 2. BoNT/Ci spalter dessuten Syntaxin IA.

De klostride bakterier frigjør nevrotoksiner som enkj edet polypeptid med 1251-1315 aminosyrer. Deretter spalter endogene proteaser hvert av disse proteiner på et bestemt sted i to respektive kjeder ("nicking"), idet de to kjedene dog forblir forbundne med hverandre ved hjelp av en disulfidbro. Disse tokjedede proteiner betegnes som holotoksiner (se Shone et al. (1985), Eur J Biochem 151, 75-82). De to kjedene har ulike funksjoner. Mens det mindre delstykket, den lette kjeden (light chain = LC), danner en Zn<2+->avhengig endoprotease, vil den større enheten (tung kjede = HC) være transportøren av den lette kjeden. En behandling av HC med endopeptidaser gir ca. 50 kDa fragmenter (se Gimenez et al., (1993), J Protein Chem 12, 351-363). Den aminoterminale halvdelen (HN-fragment) integrerer seg ved lave pH-verdier i membranene og hjelper LC i å trenge inn i nervecellens cytosol. Den karboksyterminale halvdelen (Hc-fragment) binder seg til komplekse polysialogangliosider, som bare forekommer i nervecellemembranene, og til hittil ikke identifiserte proteinreseptorer (Halpern et al. (1993), Curr Top Microbiol Immunol 195, 221-241). Dette forklarer den høye nevroselektiviteten til klostridielle nevrotoksiner. Krystallstrukturer bekrefter at BoNT/A har tre domener, som kan bringes i samklang med de tre trinnene i virkningsmekanismen (se Lacy et al. (1998), Nat Struct Biol 5, 898-902). Dessuten kan man ut fra disse data slutte at det innenfor Hc-fragmentet foreligger to autonome underenheter (subdomener), hver på 25 kDa. Det første beviset for eksistensen av de to funksjonelle subdomenene ble oppnådd ved hjelp av den aminoterminale (Hcn) og den karboksyterminale halvdelen (Hcc) av Hc-fragmentet til TeNT, som ble eksprimert rekombinant og viste at Hcc-, men ikke HcN-domenet binder seg til nevroner (se Herreros et al. (2000), Biochem J 347, 199-204). Proteinreseptorbindingsstedene til synaptotagmin ble oppdaget i Hcc-domenene av BoNT/B og G, idet deres separate funksjonalitet ble påvist (se Rummel et al. (2004), J Biol Chem 279, 30865-70).

Under fysiologiske betingelser binder HC seg til nevronale gangliosider, opptas av reseptorformidlet endocytose i det indre av cellen og når det naturlige vesikkelkretsløpet via det endosomale kompartiment. I det sure miljøet til tidligere endosomer vil Hn, den aminoterminale halvdelen av Hc, trenge inn i vesikkelmembranen og danne en pore. Hver substans (X), som er forbundet med HC via en disulfidbro, blir skilt fra HC ved hjelp av intracellulære redokssystemer, som får adgang til og reduserer disulfidbroen. Avslutningsvis fremkommer X i cytosol.

I tilfelle klostridiell nevrotoksin er HC bæreren av en LC, som i det avsluttende trinnet spalter sitt spesifikke substrat i cytosol. Kompleksdannelsen og

-dissosiasjonssyklusen til fusjonsproteinene brytes og således hemmes uttømmingen av acetylcholin. Som følge herav lammes muskler, og sveisekjertler innstiller

sekresjonen. Virkningstiden til de enkelte BoNT-serotyper er forskjellig og vil være avhengig av tilstedeværelsen av intakt LC i cytosol. Da alle nevroner har reseptorer for klostridiell nevrotoksin, vil det ikke bare være uttømmingen av acetylcholin som påvirkes, men potensielt også uttømmingen av substansen P, fra noradrenalin, GABA, glysin, endorfin og andre transmittere og hormoner.

At den cholinerge transmisjon fortrinnsvis blokkeres, kan forklares med at HC trenger inn i nevronets periferi. Sentrale synapser beskyttes av blod-hjerne-skranken, som ikke kan overvinnes av proteiner.

HC har en høy affinitet til perifere nerveceller, som i overveiende grad formidles ved interaksjon med komplekse polysialogangliosider - dette er glykolipider som består av mer enn én sialinsyre (se Halpern et al. (1995), Curr Top Micrbiol Immunol 195, 221-41). Derfor vil bare de til HC bunne LC nå denne celletypen og bli virksom i disse cellene. BoNT/A og B binder bare et respektivt molekylgangliosid GTlb.

For utforskning av den rollen aminosyre spiller, hvilke aminosyrer bygger opp bindingslommer, ble det ifølge oppfinnelsen fremstilt rekombinant Hc-fragment. Denne metodikk muliggjorde utbytting av enkelte aminosyrer. Således kunne positivt ladede aminosyrer erstattes med negativt ladede eller nøytrale aminosyrer, og omvendt. Små endringer i overflaten til bindingslommen har dramatiske virkninger med hensyn til passeringsevnen til gangliosid. Det kunne påvises at affiniteten gikk tilbake mer enn 99 %, når eksempelvis aminosyre i posisjon 1266, tryptofan - som W i SXWY-motivet betegnet - ble byttet ut mot en alifatisk rest, eksempelvis leucin. Imidlertid observerte man også det motsatte. Utbyttingen av aminosyrer, som går inn i bindingslommen, medførte en øking av affiniteten til gangliosider. Da utformingen av bindingslommen således er avgjørende for affiniteten av HC til gangliosidreseptorer, vil samtidig med affiniteten av HC til gangliosidreseptoren også den proteolytiske potensen til anhengende LC avta eller øke i samklang med affiniteten.

I en ligandreseptorstudie ble derfor ifølge oppfinnelsen bestemte aminosyrerester i den gangliosidbindende lomme av BoNT/Akarakterisertog byttet ut, for derved å øke affiniteten til gangliosidreseptoren. Affiniteten av mutert Hc-fragment ble bestemt i gangliosid- og synaptosomenbindingsrekker. Således ble HC koblet med de samme mutasjoner til LC-A, idet det ble benyttet en trombinsensitiv aminosyresekvens. Det rekombinante protein ble aktivert ("nicked") med trombin og ga et tokjedet molekyl, hvor begge kjeder var forbundet med hverandre ved hjelp av én eneste disulfidbro. Virkningsstyrken til resultatet ble testet på synaptosomer fra rottehjerne - et preparat som frigjør transmitteren. Transmitteruttømmingens hemming ble benyttet som gradmåler for konstruktets eller resultatets virkningsstyrke. I tillegg ble potensen til de enkelte konstrukter analysert ved hjelp av det isolerte nerve-muskel-preparatet til musen (hemi-diafragma-assay = HD A), som representerte det fysiologiske målet for det klostridielle nevrotoksin.

Sykdommer og symptomer som skal behandles med TrapoX, følger sammen med en fokalt øket aktivitet av motonevroner og vegetative nerveceller. Den økede aktiviteten medfører smertefulle kramper i de av disse celler innerverte muskler og til en stor væskesekresjon fra kjertelcellene. Videre vil den økede aktiviteten medføre rynkedannelser i de ulike regioner. Årsaken er en patologisk øket frigjøring av acetylcholin fra de perifere nerveender. Injiseres TrapoX i den aktuelle muskelen, så vil det etter en latenttid på 1-3 dager skje en avslapping av muskelen, senking av sekresjonen og glatting av ansiktshuden. Dette skyldes en hemming av frigjøringen av acetylcholin som følge av bruken av TrapoX. Pasienten vil således være nesten problemfri og de av muskelkrampene utløste smerter vil bli mindre og etter hvert fullstendig forsvinne.

Frigjøringen av acetylcholin hemmes ikke bare hos mennesker, men også hos dyr. Derfor blir det for påvisning av BoNT ved forgiftninger så vel som også for aktivitetsbestemmelse av BoNT-medikamenter (Botox, Dysport, Xeomin) rutinemessig benyttet dyreforsøk. Aktiviteten av BoNT kvantifiseres, idet man gjennomfører en bestemmelse av LD50i mus. Man søker her å finne den dosen som dreper 50 % av dyrene i en populasjon. Det er åpenbart at det i tillegg til doser, som ikke dreper dyr, også gis doser som vil drepe 100 % av dyrene i en gruppe. Da giften gis systematisk (i.p.), vil altså en større andel av dyrene dø på en smertefull måte som følge av en pustelamming, utløst av en paralyse av pustemuskulaturen. For å unngå dyreforsøk innførte søkeren mus-hemidiafragma-assay. Forsøksmus døde i LDso-testen av en pustelammelse, som var forårsaket av paralyse av pustemuskulaturen. Man kan altså ta pustemuskelen inklusiv den innerverende nerve (nervus phrenicus) fra en mus og foreta en in vitro forgiftning. BoNT binder seg til sine reseptorer, opptas i cellen og transfereres. Avslutningsvis spaltes substratet, hvorpå muskelen paralyseres. Det finnes en streng korrelasjon mellom LD5o-verdien og paralysen av pustemuskelen. Denne in vitro gjennomførte test representerer på sett og vis en avspekket versjon av dyreforsøk (Wohlfarth K, Goeschel H, Frevert J, Dengler R, Bigalke H, Botolinum A toxis: units versus units. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1997 mars; 335(3):335-40).

Man kan også gå ut fra at BoNT, som paralyserer mellomgulvet in vitro, også vil virke i den levende mus og også drepe den i en gitt dose. Denne dyreforsøk-erstatningsmetoden er så overbevisende at mus-hemidiafragma-assay i løpet av kort tid er blitt akseptert av EU-farmacopeia som en offisiell anerkjent prøvemetode med hensyn til BoNT for medlemsstatene i EU. Man kan av den økede virkningen av TrapoX på mus-mellomgulv-preparatet slutte seg til en øket virkning også for mennesker.

BoNT/A-komplekset har i den senere tid vært benyttet for behandling av motorisk dystoni, så vel som for demping av eksessiv sympatisk aktivitet (se Benecke et al.

(1995), Akt Neurol 22, 209ff) og for lindring av smerte og migrene (se Sycha et al.

(2004), J Neurol 251, 19-30). Dette komplekset består av nevrotoksinet, ulike hemagglutininer og et ikke-toksisk, ikke-hemagglutinerende protein. Ved en fysiologisk pH vil komplekset raskt dissosieres. Nevrotoksinet er den eneste bestanddelen av komplekset som er terapeutisk relevant og gir en symptomlindring. Da den tilgrunneliggende nevrologiske sykdom ikke heles, må komplekset injiseres på nytt i intervaller på fra 3-4 måneder. Noen pasienter vil i avhengighet av mengden av injisert fremmedprotein danne spesifikke BoNT/A-antilegemer. Disse pasienter blir da resistente mot nevrotoksinet. Når en antigensensitiv celle først har erkjent nevrotoksinet og dannet antilegemer, vil de aktuelle hukommelsescellene holde seg i flere år. Det er derfor viktig å behandle pasienter med preparater med høyeste aktivitet i minst mulig doseringer. Preparatene skal dessuten ikke inneholde ytterligere proteiner av bakteriell herkomst, da disse vil kunne virke som immunadjuvanter. Slike stoffer tiltrekker makrofagen, som erkjenner ikke bare immunadjuvantene, men også nevrotoksinene og presenterer lymfocytter, som deretter svarer med dannelsen av immunoglobuliner. For terapien bør det derfor bare anvendes produkter med den høyeste renhet og uten fremmedproteiner.

Ihara et al; Sequence of the gene for Clostridium botulinum type B neurotoxin associated with infant botulism, expression of the C-terminal half of heavy chain and its binding activity; Biochim. et Biophys Acta., vol. 1625, nr. 1, 20003, s. 19-26, ISSN 0167-4781, beskriver sekvensen av genet for Clostridium botulinum Typ B nevrotoksin, som er assosiert med barnebotulisme, ekspresjon av den C-terminale halvdelen av den tunge kjeden og bindingsaffiniteten derav.

Goodnough et al; Development of a delivery vehicle for intracellular transport of botulinum neurotoxin antagonists; FEBS letters, vol. 513, nr. 2-3, 2002, s. 163-168, ISSN 0014-5793, beskriver utviklingen av en bærer vehikkel for intracellulær transport av botulinum nevrotoksin antagonister.

Med foreliggende oppfinnelse tilveiebringes det et transportprotein (Trapo), hvormed man kan overvinne de foran nevnte problemer som hefter ved de hittil kjente metoder.

"Binding til nerveceller med høyere affinitet enn nativt nevrotoksin". Det naturlige nevrotoksin er her det native nevrotoksin av C. botulinum type A. Det rekombinant fremstilte Botulinus nevrotoksin av E. coli, som blant annet inneholder den med nativt Botulinus nevrotoksin identiske aminosyresekvens, forholder seg farmakologisk identisk som det native Botulinus nevrotoksin og benevnes rekombinant Botulinus nevrotoksin villtype. De her nevnte nerveceller er cholinerge motonevroner. Fortrinnsvis binder transportproteinet seg spesifikt til polysyalogangliosider på nervecellemembranoverflatene, så som eksempelvis GD la, GD lb eller GTlb. Bindingen bestemmes fortrinnsvis in vitro. Særlig foretrukket skjer bestemmelsen ved hjelp av en assay, hvilket vil bli beskrevet detaljert i eksemplene.

Uttrykket "modifisering av den tunge kjeden til C. botulinum dannet nevrotoksin". Aminosyre- og/eller nukleinsyresekvensen til den tunge kjeden (HC) til av C. botulinum dannede nevrotoksiner er generelt tilgjengelig i offentlig tilgjengelige databanker, for hver av de kjente serotyper A-G (se også tabell 1). Modifiseringen innbefatter her at i det minste én aminosyre deletert, addert, innføres i aminosyresekvensen, eller at i det minste én aminosyre av det native nevrotoksin substitueres med en annen naturlig eller ikke-naturlig forekommende aminosyre, og/eller at en aminosyre modifiseres post-translasjonalt i den gitte aminosyrefrekvensen. Post-translasjonale modifikasjoner innbefatter her glykosyleringer, acetyleringer, acyleringer, desamineringer, fosforyleringer, isoprenyleringer, glykosylfosfatidylinositoleringer samt ytterligere for fagmannen kjente modifikasjoner.

HC for av C. botulinum dannede nevrotoksiner innbefatter tre subdomener, nemlig det aminoterminale 50 kDa store translokasjonsdomenet Hn, det tilsluttende 25 kDa HcN-domene og det karboksylterminale 25 kDa Hcc-domenet. Sammenfattet betegnes Hcn- og Hcc-domenene som Hc-fragment. De tilsvarende aminosyreavsnittene i de respektive subdomener fremgår av tabell 1 for de enkelte serotyper og deres varianter.

For en detaljert beskrivelse av hybridproteiner med domener av ulike BoNT-serotype, blir det nedenfor innført følgende nomenklatur. Uttrykket scAtAAB betegner eksempelvis et enkj edet nevrotoksin (sc), bestående av de fire domenene LC, Hn, Hcn og Hcc, idet hvert domene er betegnet med den store bokstaven til den respektive serotypen i samsvar med avstamningen. Det vil si at i scAtAAB vil LC, Hn og Hcn stamme fra BoNT/A, idet Hcc-domenet av BoNT/A er byttet ut mot domenet til BoNT/B. Den lille bokstaven "t" symboliserer en innlagt trombinerkjennelsessekvens mellom LC og HN. Foreliggende oppfinnelse vedrører særlig et transportprotein, som oppnås ved modifisering av HCen til det av Clostridium botulinum dannede nevrotoksin, idet det nevnte protein binder seg med høyere affinitet enn det native nevrotoksin spesifikt til nerveceller, og opptas av disse celler ved hjelp av endocytose.

Det ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebrakte transportprotein har en øket spesifikk affinitet av sitt gangliosidbindende domene til komplekse polysailogangliosider. Økingen av affiniteten oppnås fortrinnsvis ved substitusjon eller delesjon av aminosyrer.

Ifølge en foretrukket utførelsesform har transportproteinet en minst 15 % høyere affinitet enn det native nevrotoksin. Fortrinnsvis har transportproteinet en minst 50 % høyere, særlig foretrukket minst 80 % høyere, og særlig en minst 90 % høyere affinitet enn det native nevrotoksinet.

Ifølge oppfinnelsen skjer modifiseringen av HC i området til det gitte nevrotoksinets Hc-fragment. Dersom modifiseringen innbefatter en substitusjon, en delesjon, en insersjon eller addisjon, så kan modifiseringen eksempelvis gjennomføres ved hjelp av målrettet mutagenese, en fremgangsmåte som vil være kjent for fagmannen. De i det native nevrotoksinet forhåndenværende aminosyrer endres her enten med naturlig forekommende eller ikke naturlig forekommende aminosyrer. I prinsippet inndeles aminosyrer i ulike fysisk-kjemiske grupper. Til de negativt ladede aminosyrer hører aspartat og glutamat. Til de positivt ladede aminosyrer hører histidin, arginin og lysin. Til de polare aminosyrer hører aspargin, glutamin, serin, treonin, cystein og tyrosin. Til de ikke-polare aminosyrer hører glysin, alanin, valin, leucin, isoleucin, metionin, prolin, fenylalanin og tryptofan. Aromatiske sidegrupper finnes hos aminosyrene histidin, fenylalanin, tyrosin og tryptofan. Generelt foretrekkes at en aminosyre byttes med en annen aminosyre, som hører til en annen fysisk-kjemisk gruppe.

Ifølge oppfinnelsen er transportproteinet avledet fra proteinsekvensen til Clostridium botulinum nevrotoksiner av typen A (databanknr. AAA23262 og CAA51824).

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører et transportprotein, hvor i det minste én aminosyre i posisjonene 1117, 1252, 1253, 1270 og 1278-1279 i proteinsekvensen til Clostridium botulinum nevrotoksiner av type A (databanknr. AAA23262 og CAA51824) enten er fjernet eller er erstattet med en naturlig forekommende eller en ikke-naturlig forekommende aminosyre.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse vedrører et transportprotein, hvor aminosyrer i posisjonene 1092-1296 i proteinsekvensen til Clostridium botulinum nevrotoksiner av type A (databanknr. AAA12162 og CAA51824) - et område, som innbefatter de gangliosidbindende domener - er erstattet med sekvenser av

Clostridium botulinum nevrotoksin type B protein (databanknr. AAA23211), aminosyrer 1079-1291,

Clostridium botulinum nevrotoksin type Ci protein (databanknr. CAA51313), aminosyrer 1093-1291,

Andre, for utbyttingen egnede Hcc-domener med aminosyreposisjoner, finnes i tabell 1.

Nok en utførelsesform av foreliggende oppfinnelse vedrører en sammensetning, som inneholder et transportprotein ifølge oppfinnelsen og minst ett intervenerende molekyl (X). Det intervenerende molekylet kan være et lite organisk molekyl, en peptid eller et protein, fortrinnsvis kovalent bundet, eksempelvis ved hjelp av en peptid-, ester-, eter-, sulfid-, disulfid- eller karbon-karbon-binding.

Det intervenerende molekylet innbefatter i tillegg alle kjente terapeutisk virksomme stoffer. Foretrukket her er cytostatika, antibiotika, virusstatika, men også immunoglobulin.

For bedre utnyttelse av den økede affiniteten som transportproteinet har, ble det aminoterminalt bundet via en aminosyresekvens, som spesifikt ble erkjent fra proteasen trombin og saltet, til en LC av BoNT/A, hvorved det oppstod et bestemt TrapoX. Virkningsstyrken til det nevnte TrapoX var sammenlignet med nativt BoNT/A øket med en faktor på fortrinnsvis minst 3. Dette nye produktet, som var fritt for fremmedproteiner, gir en drastisk redusering av stimuleringen av immunsystemet som følge av materialets større renhet og lavere dosering.

Nok en utførelsesform av oppfinnelsen vedrører et transportprotein, hvor proteinet er en protease, som spalter ett eller flere proteiner i frisettingsapparatet til nevrotransmittere, idet proteasen velges fra gruppen av nevrotoksiner som består av LCen til Clostridium botulinum nevrotoksin, særlig av typene A, B, Ci, D, E, F og G eller et proteolytisk aktivt fragment av LC til Clostridium botulinum nevrotoksin, særlig et nevrotoksin av serotypen A, B, Ci, D, E, F og G, idet fragmentet oppviser minst 0,01 % av den proteolytiske aktiviteten til den native proteasen, fortrinnsvis minst 5 %, og særlig foretrukket minst 50 %, særlig minst 90 %. Fortrinnsvis er transportproteinet og proteasen avledet fra samme C. botulinum nevrotoksinserotyp, særlig foretrukket HN-domenet til transportproteinet og proteasen fra C. botulinum nevrotoksinserotype A. Sekvensene til proteasene er generelt tilgjengelige fra databanker og databanknummerne finnes i tabell 1. Den proteolytiske aktiviteten til protease bestemmes ved hjelp av en substratspaltingskinetikk (se Binz et al. (2002), Biochemistry 41(6), 1717-23).

LCene er kjennetegnet ved at de inneholder sekvensen His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)n-Arg-Xaa-Xaa-Tyr, idet Xaa kan være en hvilken som helst aminosyre. Transportproteinet ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at proteinet og proteasen stammer fra de foregående grupper av proteiner henholdsvis proteaser.

Ifølge nok en utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes det en fremgangsmåte for fremstilling av transportproteinet. I et første trinn blir en nukleinsyre som koder transportproteinet tilveiebrakt. Den kodende nukleinsyre kan være RNA, DNA eller blandinger av disse. Nukleinsyren kan videre være modifisert med hensyn på sin nukleaseresistens, eksempelvis ved at det er innføyet fosfortioat-bindinger. Nukleinsyren kan være fremstilt av en utgangsnukleinsyre, idet utgangsnukleinsyren eksempelvis er tilgjengelig ved kloning av genomiske eller cDNA-banker. Videre kan nukleinsyren fremstilles direkte ved fastfasesyntese. Egnede fremgangsmåter vil være kjent for fagpersonen. Dersom det tas utgangspunkt i en utgangsnukleinsyre, så kan det eksempelvis ved hjelp av en stedsrettet mutagenese gjennomføres en målrettet forandring, som på aminosyreplanet fører til i det minste en addisjon, insersjon, delesjon og/eller substitusjon. Nukleinsyren forbindes således operativt med en egnet promotor. Egnede promotor for uttrykket i de kjente uttrykkssystemer vil være kjent for fagpersonen. Valg av promotor er bare avhengig av det for uttrykket anvendte uttrykks system. Generelt foretrekkes konstitutive promotorer, men også induserbare promotorer kan anvendes. Det på denne måten tilveiebrakte konstrukt innbefatter i det minste en del av en vektor, særlig regulatoriske elementer, idet vektoren eksempelvis velges fra X-derivater, adenovirer, bakulovirer, vaksiniavirer, SV40-virer og retrovirer. Vektoren kan fordelaktig uttrykke nukleinsyren i en gitt vertscelle.

Videre tilveiebringer oppfinnelsen vertsceller som inneholder vektoren og egner seg for uttrykking av vektoren. Innenfor teknikkens stand er det kjent tallrike prokaryote og eukaryote uttrykkssystemer, idet vertscellene eksempelvis velges fra prokaryote celler så som E. coli eller B. megaterium, fra eukaryote celler så som S. cerevisiae og P. pastoris. Riktig nok kan det også anvendes høyere eukaryote celler så som insektceller eller pattedyrceller, men det foretrekkes vertsceller som på samme måte som C. botulinum har et glykosyleringsapparat.

Dersom det tilveiebringes en sammensetning ifølge oppfinnelsen, som i tillegg til transportproteinet også inneholder minst ett intervenerende molekyl, og dette intervenerende molekyl er en peptid eller et protein som enten er funksjonalisert med en karboksylterminalcystein eller en merkaptogruppe, så kan på analog måte som beskrevet foran peptidet henholdsvis proteinet fremstilles rekombinant, eksempelvis under anvendelse av binære vektorer eller ulike vertsceller. Dersom disse vertscellene benyttes for uttrykkingen av transportproteinet og peptidet eller proteinet, så dannes det fortrinnsvis en intermolekykær disulfidbinding in situ. For mer effektiv produksjon i samme vertscelle kan nukleinsyren som koder peptidet eller proteinet også translateres med transportproteinet i den samme leserammen, slik at det produseres et enkj edet polypeptid. Derved dannes det fortrinnsvis en intramolekylær disulfidbinding in situ. For enkel hydrolyse av den eventuelt for hånden værende peptidknytning mellom transportproteinet og peptidet henholdsvis proteinet, blir det ved aminoterminusen til transportproteinet innføyet en aminosyresekvens, som enten er erkjent og spaltet spesifikt fra proteasetrombin eller en spesifikk endoprotease av vertscellen.

Dersom dette ikke er mulig, så kan man etter en separat rensing av transportproteinet og proteinet gjennomføre en tilsvarende intermolekylær disulfidbinding med en for fagpersonen kjent oksidasjonsmetode. Peptidet henholdsvis proteinet kan også oppnås direkte ved hjelp av syntese eller fragmentkondensasjon. Tilsvarende fremgangsmåter vil være kjent for fagpersonen.

Transportproteinet og peptidet henholdsvis proteinet blir deretter renset. Her kan det benyttes for fagpersonen kjente fremgangsmåter, så som kromatografi eller elektroforese.

Nok en utførelsesform av oppfinnelsen vedrører den farmasøytiske sammensetningen, som innbefatter transportproteinet og eventuelt en farmasøytisk aksepterbar nærer, et fortynningsmiddel og/eller additiv, og som egner seg for behandling av de følgende forstyrrelser og sykdommer: hemifacialspasmus, spasmodisk torticollis, spastisiteter, dystonier, migrene, smerter, sykdommer i hals-og ryggvirvelsøylen, strabismus, hypersalivasjon og depressive sykdommer.

Den farmasøytiske sammensetningen er egnet for oral, intravenøs, subkutan, intramuskulær og topisk administrering. Den intramuskulære administreringen foretrekkes. En doseenhet av den farmasøytiske sammensetningen inneholder ca. 0,1 pg til 1 mg transportprotein og/eller den ifølge oppfinnelsen tilveiebrakte sammensetning.

Nok en utførelsesform av oppfinnelsen er en kosmetisk sammensetning, bestående av transportproteinet og en farmasøytisk bærer, fortynningsmiddel og/eller additiv, og egnet for behandling av hyperhydrose og sterkt utpregede ansiktsrynker. Den kosmetiske sammensetningen egner seg for oral, intravenøs, subkutan, intramuskulær og topisk administrering. Den intramuskulære administreringen foretrekkes. En doseenhet av den kosmetiske sammensetningen inneholder ca. 0,1 pg til 1 mg transportprotein og/eller en sammensetning ifølge oppfinnelsen. Den kosmetiske sammensetningen egner seg for behandling av hyperhydrose og ansiktsrynker.

Det ifølge oppfinnelsen beskrevne transportprotein kan fremstilles med en egnet vertscelle, så som eksempelvis Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris eller Bacillus megaterium, som mangfoldiggjør en rekombinant uttrykkingsvektor, idet vektoren koder et transportprotein.

Foreliggende oppfinnelse vil også gå frem av tegningsfigurene, hvor

Fig. 1 viser at affiniteten av det muterte Hc-fragmentet av BoNT/A overfor synaptosemembranpreparater fra rottehjernen, er tre ganger høyere enn for Hc-fragmentet til den ville typen av BoNT/A. Fig. 2 viser bindingen av ulike BoNT/A Hc-fragmentmuteiner til rottehjernesynaptosomer, idet affiniteten av BoNT/A Hc-fragment-villtypen som standard er satt til 100 %. I den første blokken er affiniteten til BoNT/A-mutein vist, som viser mutasjoner til aminosyrene Yl 117, som fører til økinger. I den andre blokken er det vist andre BoNT/A-muteiner. I den tredje blokken er det vist affiniteter for BoNT/A-muteiner, med dobbeltmutasjoner, som forsterker bindingen til nervecellemembraner (synaptosomer). Fig. 3 viser den økede nevrotoksisiteten for Yl 117A-muteiner av BoNT/A sammenlignet med BoNT/A-villtyper av isolerte nervus phrenicus-mellomgulv-muskel-preparat av mus. Fig. 4 viser bindingen til fire BoNT/A Hc-fragmenthybrider HcAB, HcAC, HcAE og HcAT (T = tetanusnevrotoksin) til nervecellemembraner (synaptosomer), idet BoNT/A Hc-fragment-villtypen er satt som standard til 100 %. Fig. 5 viser den økte nevrotoksisiteten for Gesamttoksinhybrider bestående av BoNT/A og enten Hc-fragmentet eller Hcc-domenet av BoNT/B sammenlignet med BoNT/A-villtypen av isolert nervus phrenicus-mellomgulv-muskel-preparat av mus.

Mer detaljert vedrører foreliggende oppfinnelse et transportprotein (Trapo), som oppstår ved modifisering av HC av Clostridium botulinum produsert nevrotoksin type A, fortrinnsvis bindes spesifikt til nevroner, opptas intracellulært ved reseptorformidlet endocytose og transfereres fra det sure endosomale kompartement og til cytosolen av nevroner. Dette proteinet benyttes som transportør, for derved å sluse i proteinet bundede proteaser og andre substanser, som fysiologisk ikke kan trenge gjennom plasmamembranen og inn i nervecellenes cytosol, inn i cellene. Proteasesubstratene er intracellulært lokaliserte proteiner og peptider, som deltar i transmitterfrisettingen. Etter spaltingen av substratene vil nevronenes spesifikke funksjoner være blokkert, idet cellene selv ikke er skadet. En av disse funksjonene er eksocytosen, som tilveiebringer frisettingen av nevrotransmitteren. Er frisettingen av transmittere hemmet, så vil overføringen av signaler fra celle til celle være blokkert. Eksempelvis lammes streifede muskler når frisettingen av acetylcholin i de nevromuskulære kontaktsteder hemmes. Denne virkningen kan benyttes terapeutisk, når TrapoX appliseres ved nerveavslutningene til spastiske eller dystone muskler. Andre aktive substanser er eksempelvis virkningsstoffer som har en antiviral virkning. Med Trapo konjugert, kan de være av nytte for en behandling av virale infeksjoner av nervesystemet. Foreliggende oppfinnelse bygger på bruken av et transportprotein for hemming av frisettingen av nevrotransmittere.

Når pasienter behandles med de native former av BoNT/A og B, så vil injeksjonen av disse ikke humane proteiner danne antilegemer til tross for de små dosene, slik at derved terapien må avbrytes, for å unngå et anafylaktisk sjokk. Ved å applisere en substans av samme virkningsmekanisme med en høyere transporteffektivitet av den enzymatiske aktivitet, kan dosene senkes drastisk, og det vil ikke danne seg antilegemer. Disse egenskaper har det her beskrevne transportprotein.

Selv om det gis eksempler på applikasjonen, så vil generelt den egnede applikasjonsmodus og doseringen bestemmes individuelt av den behandlende legen. Slike avgjørelser treffes rutinemessig av en hvilken som helst innenfor fagområdet bevandret lege. Således kan eksempelvis applikasjonsmodusen og doseringen av nevrotoksiner ifølge den her gitte oppfinnelse velges på basis av kriterier så som løseligheten til det valgte nevrotoksinet eller intensiteten til de smertene som skal behandles.

For tiden utgjør behandlingsintervallet for nativt BoNT/A og B gjennomsnittlig 3-4 måneder. En forlengelse av dette intervallet ville redusere faren for antilegemedannelse og muliggjøre en lengre behandlingstid med BoNT. Økingen av LC i cytosol ville strekke nedbrytingen over tid og dermed forlenge virkningstiden. Det her beskrevne transportprotein har en høyere affinitet og opptaksrate enn nativt

HC-A.

Det nedenfor gitte eksempel tjener bare til tydeliggjøring av oppfinnelsen.

Eksempler

Rekombinant uttrykking av det genteknisk fremstilte TrapoX i E . coli

DNA-sekvensen til HC fra BoNT/A ble amplifisert for kromosomalt DNA fra Clostridium botulinum (databanknr. AAA23262) ved hjelp av PCR. Kodonet for aminosyren tyrosin 1117 ble erstattet av en basetriplett ved hjelp av spesifikke oligonukleotider, hvilken basetriplett koder aminosyreresten av alanin. Videre ble den 5'-enden av genet tilføyd en DNA-sekvens, som koder aminosyrene i erkjennelsessekvensen av trombin. DNA-sekvensen ble innføyd i en bakteriell uttrykkingsvektor. Det innføyde gen for Trapo ble ved 3'-enden fusjonert med en oligonukleotid, som koder et karboksyterminalt affinitetspeptid så som StrepTag, 6xHN-tag eller Hiss-tag. Den på denne måten tilveiebrakte uttrykkingsvektoren pAR-Trapo er utgangsbasisen for tilføyelsen av bærermolekyler, så som LC i BoNT.

DNA-sekvensen for LC av BoNT/A ble amplifisert ved den kromosomale DNA-sekvensen av Clostridium botulinum (databanknr. AAA23262) med PCR-metoden og ble innføyd i uttrykkingsvektoren pAR-Trapo oppstrøms den kodede trombinerkjennelsessekvens. Den på denne måten fremkommende uttrykkingsvektor pAR-TrapoX ble transformert i en E. coli K12-stamme og uttrykkingen av proteinet TrapoX ble indusert under betingelsene for det biologiske sikkerhetstrinn 2 og i samsvar med de for prosjektet gitte forskrifter av Bezirksregierung Hannover, Az 501g.40654/3/57/3. Den overeksprimerte TrapoX ble isolert affinitetskromatografisk etter fremstillerens anvisninger, som et enkj edet protein med en molekylærvekt på 150 kDa. Deretter ble proteinet hydrolysert med sefarosekonjugert trombin, hvorved det ble dannet et rent protein, hvis to kjeder var forbundet med hverandre ved hjelp av en disulfidbro.

Dette proteinet hadde sammenlignet med villtypen av BoNT/A en med 300 % øket affinitet til isolert, på m ikr otiterp later immobilisert gangliosid GT lb og til synaptosomen membranpreparater av rottehjerne (fig. 1). Den katalytiske aktiviteten til LC-A var ikke endret, hvilket viste seg ved den in vitro foretatte spalting av rekombinant SNAP-25. Potensen til TrapoX med hensyn til en hemming av nevrotransmitterfrigjøringen i funksjonelle synaptosomer av rottehjerne var øket med 300 % sammenlignet med nativt BoNT/A utvunnet fra Clostridium botulinum. I nerve-muskel-preparater av mus (HDA) var potensen til TrapoX likeledes øket 300 % sammenlignet med det native BoNT/A (fig. 2).

Måling av bindingen til rottehjernesvnaptosomer og nevrotoksisiteten i HD A for ulike BoNT/ A- muteiner

Bindingen av radioaktivt markerte Hc-fragmenter til rottesynaptosomer ble målt som angitt hos Rummel et al., J. Mol. Biol. 326 (2003), 835-847. Nevrotoksisiteten til BoNT/A-muteinene ble bestemt som beskrevet hos Habermann et al., Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 311 (1980), 33-40.

Sammenligning av bindingen til de ulike BoNT/A-muteiner relativt villtypen er vist i den etterfølgende tabell:

Mumsjonan av enkelte bestemte aminosyrer i gangliosidbindingslommen for BoNT/A medførte en øking av bindingen til nerveceller. Fordelaktig blir i posisjon 1117 tyrosm erstattet av alanin, cystein eller valin. Særlig førte erstatningen av tyrosmresten , posisjon 1117 med alanin til en oking av affiniteten til oa 330 % Andre mutasjoner av enkelte aminosyrer fra gangliosididbindingslommen i posisjon 1252 og 1253 ga likeledes en øking av bindingen. Særlig førte mutasjonen av F1252 i tyrosin og H1253 i lysin til en øking av affiniteten på 110 % henholdsvis 50 %.

Videre er det ved mutasjoner i posisjonene 1202, 1262, 1270, 1278 og 1279 å forvente øking av bindingen til nerveceller.

Videre ble likeledes muteiner av BoNT/A med dobbeltmutasjoner testet, idet særlig muteinene Yl 117C/H1253K og Yl 117V/H1253K ga en øking av bindingen til synaptosomer (se fig. 2).

Videre ble det fastslått at økingen av bindingen særlig av muteinet Yl 117A av BoNT/A medførte en øking av nevrotoksisiteten i N. phrenicus - nøytrotoksisitetsassay (HDA-assay) (fig. 3).

Bestemmelse av bindingen og nevrotoksisiteten av BoNT/ A Hcc- hvbrider Bestemmelsen av bindingen og nevrotoksisiteten skjedde som beskrevet nedenfor.

Resultatene er vist i den etterfølgende tabell og i fig. 4 og 5.

Utbyttingen av Hcc-domenet til BoNT/A med de andre serotyper, særlig C. botulinum nevrotoksin B og C. botulinum nevrotoksin C, ga en øking av bindingen til nerveceller. Videre ble det observert at byttingen av Hcc-domenet til Hc-fragmentet av BoNT/A med tilsvarende domener av tetanus nevrotoksin likeledes ga en øking av affiniteten til nerveceller. Affinitetsendringene gjelder også for byttingen av Hcc-domenet i hele BoNT/A. Fig. 5 viser at ved en hybrid scAtAAB vil affinitetsstigningen ha en tilsvarende innvirkning på en øking av nevrotoksisiteten. Dersom man istedenfor Hcc-domenet bytter ut hele Hc-fragmentet scAtAAB, så kan man observere tilsvarende resultater. Særlig ble det observert at ved en bytting av Hcc-domenet eller Hc-fragmentet av BoNT/A med det til BoNT/B, ble det fastslått en bedring av nevrotoksisiteten på ca. 350 %.

Bestemmelse av bindingen av BoNT- muteiner til gangliosid GT lb

Gangliosid GT lb [NAcNeua3Galp3NAcGalp4(NaCNeua6NAcNeua3)Galp4Glcp]

(Sigma-Aldrich) ble løst i metanol og påført på høyaffine 96-skål polystyrol-mikrotiterplater (Corning; 1 \ ig GTlb i 100 (xl/skål) eller i tilfelle av

kompetisjonsassays med<125>I-BoNT på høyaffine C8 enkeltbruddstripeplater (Greiner Bio-ohne; 0,1 \ ig GTlb i 100 (xl/skål). Løsningsmidlet ble fordampet under romtemperatur og skålene ble vasket tre ganger med bindingsbuffer (100 mM Tris-HC1, 10 mM Na2HP04, 0,5 % BSA, pH 7,2). De uspesifiserte bindingssteder ble så blokkert ved inkubering i 2 timer i PBS/Tween [140 mM NaCl, 7 mM KC1, 10 mM Na2HP04, 1,8 mM KH2P04, 0,05 % (V/V) Tween 20, pH 7,2] med 3 %

(vekt/volum) BSA. Bindingsassayene ble gjennomført i bindingsbuffer (100 (xl/skål) i to timer i romtemperatur med enten stigende mengder av villtype eller bestemte mengder mutanter. Ubundet protein ble vasket i 3 vasketrinn, hver gang med 250 \ il PBS/Tween-buffer. Bundede Hc-fragmenter ble påvist i bindingsbuffer ved 2 timer i romtemperatur ifølge fremstillerens anvisning, med inkubasjon med streptaktin konjugert med alkalisk fosfatase (ST-AP, IBA GmbH), p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml i 100 mM glysin, 1 mM MgCh, 1 mM ZnCb, pH 10,4) tjente som substrat for den alkaliske fosfatase. Desfosforforyleringsreaksjonen ble stoppet med en tilføying av 3 M NaOH-løsning og ekstinksjonen ble målt ved 405 nm under anvendelse av et Spectra Count mikroplateleseapparat (Packard). Kompetisjonsassayene ble gjennomført i to timer under romtemperatur i 100 (xl bindingsbuffer med 700000 cpm/skål [<125>I]-BoNT, ulike mengder nativ BoNT eller rekombinant Hc-fragment. Etter inkubering og fjerning av restene ble skålene vasket tre ganger med PBS/Tween-buffer, tørket og atskilt. Mengdene av bundet radioaktivt markert BoNT ble så bestemt i en automatisk y-teller (Wallac 1480 Wizard 3).

Claims (30)

1. Transportprotein, karakterisert vedat det er tilveiebrakt ved modifisering av den tunge kjeden til nevrotoksinet dannet av Clostridium botulinum, der nevrotoksinet er botulinum nevrotoksin type A (BoNT/A) og der transportproteinet binder til nerveceller med høyere affinitet enn det native nevrotoksinet, der bindingsaktiviteten er bestemt i synaptosom-assayet, og der minst én aminosyre i posisjonene 1117, 1252, 1253, 1270, 1278 til 1279 i botulinum nevrotoksin type A proteinsekvensene er fjernet eller substituert med en aminosyre som enten er naturlig forekommende eller som er av ikke-naturlig opprinnelse.

2. Transportprotein, karakterisert vedat det er tilveiebrakt ved modifisering av den tunge kjeden til nevrotoksinet dannet av Clostridium botulinum nevrotoksin type A (BoNT/A), der transportproteinet binder til nerveceller med høyere affinitet enn det native nevrotoksinet, der bindingsaktiviteten er bestemt i synaptosom-assayet, og der aminosyrene 1092 til 1296 av Clostridium botulinum nevrotoksin type A, som inneholder gangliosidbindingsdomene, er substituert med de etterfølgende sekvensene: Clostridium botulinum nevrotoksin type B protein, aminosyrer 1079 til 1291, eller Clostridium botulinum nevrotoksin type Ciprotein, aminosyrer 1093 ti 1291, eller Hcc-domene av Clostridium tetani nevrotoksin proteiner.

3. Transportprotein, karakterisert vedat det er tilveiebrakt ved modifisering av den tunge kjeden til nevrotoksinet dannet av Clostridium botulinum nevrotoksin type A (BoNT/A), der transportproteinet binder til nerveceller med høyere affinitet enn det native nevrotoksinet, der bindingsaktiviteten er bestemt i synaptosom-assayet, og der det fullstendige Hc-fragmentet av BoNT/A (aminosyrer 867 til 1296) er substituert med Hc-fragmentet av BoNT/B (aminosyrer 866 til 1291).

4. Transportprotein ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert vedat transportproteinet binder seg spesifikt til nerveceller og opptas av cellene ved hjelp av endocytose.

5. Transportprotein ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert vedat transportproteinet binder seg spesifikt til komplekse gangliosider av cholinerge motornevroner, som er lokalisert i plasmamembranen, fortrinnsvis til GT lb.

6. Transportprotein ifølge hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat transportproteinet viser en affinitet som er minst 15 % høyere enn det native nevrotoksinet, fortrinnsvis minst 50 %, særlig foretrukket minst 80 %, særlig minst 90 % høyere.

7. Transportprotein ifølge krav 1, karakterisert vedat aminosyren i posisjon 1117 i botulinum nevrotoksin type A proteinsekvensen er fjernet eller substituert med en aminosyre som enten er naturlig forekommende eller som er av ikke-naturlig opprinnelse.

8. Transportprotein ifølge krav 7, karakterisert vedat den substituerte aminosyren enten er alanin, cystein, glutamat, fenylalanin, isoleucin, leucin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, serin, treonin eller valin.

9. Transportprotein ifølge krav 7, karakterisert vedat den substituerte aminosyren er alanin, cystein eller valin.

10. Transportprotein ifølge krav 1, karakterisert vedat aminosyren i posisjon 1252 av botulinum nevrotoksin type A proteinsekvensene er substituert med en tyrosin eller i posisjon 1253 substituert med en lysin.

11. Transportprotein ifølge krav 1, karakterisert vedat to eller tre aminosyrer valgt fra posisjoner 1117, 1252, 1253, 1270, 1278-1279 i Botulinum nevrotoksin type A proteinsekvensene er fjernet eller substituert, fortrinnsvis posisjoner 1117/1252, 1117/1253, 1117/1278, 1117/1279, 1117/1252/1253, særlig foretrukket Yl 117A/F1252Y, Y1117A/H1253K, Yl 117A/L1278H, Yl 117A/G1279N, Yl 117C/F1252Y, Y1117C/H1253K, Yl 117C/L1278H, Yl 117C/G1279N, Yl 117V/F1252Y, Y1117V/H1253K, Yl 117V/L1278H, Yl 117V/G1279N, Yl 117A/F1252Y/Hl253K, Y1117C/F1252Y/H1253K og Yl 117V/F1252/H1253K.

12. Sammensetning, karakterisert vedat den inneholder et transportprotein ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11, og minst ett intervenerende molekyl der det intervenerende molekylet enten omfatter et lite organisk molekyl, et peptid eller et protein..

13. Sammensetning ifølge krav 12, karakterisert vedat det intervenerende molekylet er kovalent bundet med en peptidbinding, esterbinding, eterbinding, sulfidbinding, disulfidbinding eller karbon-karbon-binding.

14. Sammensetning ifølge krav 12, karakterisert vedat det lille organiske molekylet er et virusstatikum, cytostatikum, antibiotikum eller et immunoglobulin.

15. Sammensetning ifølge krav 12, karakterisert vedat proteinet omfatter en protease.

16. Sammensetning ifølge krav 15, karakterisert vedat proteasen omfatter et nevrotoksinprotein av en Clostridium botulinum type A, B, Ci, D, E, F og G.

17. Sammensetning ifølge krav 15, karakterisert vedat proteasen inneholder et proteolytisk aktivt fragment, som er avledet fra proteinet av Clostridium botulinum type A, B, Ci, D, E, F og G.

18. Sammensetning ifølge krav 17, karakterisert vedat det inneholder sekvensen His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)n-Arg-Xaa-Xaa-Tyr, der Xaa kan være en hvilken som helst aminosyre, og der proteasen spalter spesifikke substrater inni det cholinerge motornevronet.

19. Sammensetning ifølge krav 18, karakterisert vedat substratene er valgt fra proteiner, som er involvert i en frigjøring av nevrotransmittere i perifere nerver, og fra proteiner, som kan gi katalytiske reaksjoner inni nervecellen.

20. Sammensetning ifølge krav 19, karakterisert vedat proteasen og transportproteinet er forbundet kovalent med en aminosyresekvens, som spesifikt kjennes og spaltes med en endopeptidase.

21. Sammensetning ifølge krav 20, karakterisert vedat etter spaltingen med endopeptidasen vil en disulfidbro forbinde proteasen og transportproteinet med hverandre, hvilket vil føre til dannelsen av et aktivt holotoksin.

22. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert vedat den inneholder transportproteinet ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, eller sammensetningen ifølge hvilket som helst av kravene 12-21, samt eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel og/eller additiv.

23. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 22 for behandling av en forstyrrelse eller sykdom, for hvilken en terapi med botulinum nevrotoksin er indikert.

24. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 23, der forstyrrelsen eller sykdommen er én av de følgende: hemifacialspasmus, spasmodisk torticolis, spastisiteter, dystoni, migrene, smerter, sykdommer i hals- og ryggvirvelsøylen, strabismus, hypersalivasjon og depressive sykdommer.

25. Kosmetisk sammensetning, karakterisert vedat den inneholder transportproteinet ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, eller sammensetningen ifølge hvilket som helst av kravene 12-21, samt eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel og/eller additiv.

26. Anvendelse av en kosmetisk sammensetning ifølge krav 25, som kosmetisk produkt, der de kosmetiske indikasjonene er hyperhidrose og sterkt utpregede ansiktsrynker.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av et transportprotein ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, eller en sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 12-21 med rekombinasjon ifølge kjente fremgangsmåter.

28. Vertscelle som inneholder en rekombinant uttrykkingsvektor,karakterisert vedat uttrykkingsvektoren koder et transportprotein ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, eller en sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 12-21.

29. Vertscelle ifølge krav 28, karakterisert vedat vertscellen kan være en celle av Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris eller Bacillus megaterium.

30. Uttrykkingsvektor, karakterisert vedat vektoren omfatter en nukleinsyre, som koder et transportprotein ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 eller en sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 12-21.