CN101056888B - 用于将化合物导入神经细胞的转运蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种转运蛋白，其可以通过修饰肉毒杆菌形成的神经毒素重链而得到。该蛋白以比天然神经毒素更高的亲合力专一性地结合于神经细胞。本发明还涉及一种转运蛋白的生产方法、编码转运蛋白的核酸、含有药物的转运蛋白和美容组合物及其用途。

Description

用于将化合物导入神经细胞的转运蛋白
技术领域
本发明涉及一种结合于神经元的转运蛋白，其由受体介导的胞吞作用调节并且从酸性内体小室(endosomal compartment)转移进入神经元胞质液。该蛋白质被用作转运手段用于转移其它化学物质(例如蛋白酶)，该蛋白酶是不能生理学地穿过质膜渗入神经细胞胞质液。本发明涉及转运蛋白用于抑制神经递质释放的用途。
背景技术
神经细胞通过胞吐作用释放递质。胞内泡囊的膜与质膜的融合称为胞吐作用。在这一加工过程中，将泡囊的内容物同时地排至突触间隙。两种膜的融合由钙调节，与蛋白质突触结合蛋白(synaptotagmin)发生反应。与其它辅助因子突触结合蛋白一起控制三个所谓的融合蛋白SNAP-25、小突触泡蛋白2和突触融合蛋白1A的状态。而突触融合蛋白1A和小突触泡蛋白2被整合进入血浆和/或泡囊膜中，SNAP-25仅松弛地结合于质膜。三种蛋白质彼此结合至胞内钙浓度增加的程度，彼此两个膜靠近，接着融合在一起。在释放胆碱能神经元乙酰胆碱情况下，会引起肌肉收缩，出汗及其它胆碱能激发反应。
上述的融合蛋白是靶分子(底物)梭菌神经毒素轻链，由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)形成。
厌氧的革兰氏阳性细菌肉毒杆菌产生七种不同类型的蛋白质神经毒素。末尾的神经毒素称为肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A至BoNT/G)。其中，特别是BoNT/A和BoNT/B会引起人和动物神经性麻痹的机能障碍，称为肉毒中毒。在土壤中可以找到肉毒杆菌孢子，但在经不正确杀菌和密封的自制食品保存时也可以生长，许多肉毒中毒情况可归于此因。
BoNT/A是在已知生物制剂物质中最致命的。少至5-6pg的纯化BoNT/A代表一个最低致死剂量MLD(Multiple Low Dose)。每个重18-20g的雌性Swiss Webster鼠腹膜内注射后，杀死一半的一个单位(Engl.：单位U)BoNT定义为MLD。七种免疫不同的BoNT得到表征。它们标示为BoNT/A、B、C1、D、E、F和G，并且可以通过与特定血清型抗体的中和而辨别。就引起的麻痹严重程度和持续时间而言，在被影响的动物种类中不同血清型的BoNT是不同的。这样，就麻痹而言，例如BoNT/A在大鼠中的效力是500倍于BoNT/B。另外，已经证明在灵长类动物中480U/kg体重的BoNT/B剂量是无毒的。相同量的BoNT/A相当于该物质在灵长类动物中致死量(LD)的12倍。另一方面，在老鼠身上注射BoNT/A后麻痹持续时间比注射BoNT/E后长十倍。
BoNTs在临床上已经用于处理神经肌肉失调，通过骨骼肌机能亢进得到表征，是由病理性活动过度的周围神经引起的。BoNT/A已经被美国食品和药物管理局批准用于处理眼睑痉挛、斜视和半面痉挛。相比BoNT/A，残留的BoNT血清型明显地有效性较小，并且显示出较短的效力持续时间。周围肌肉注射给药BoNT/A的临床效果通常观察一周。通过一种单一肌肉注射BoNT/A的症状抑制持续时间通常是大约3个月。
梭菌神经毒素专一性地水解不同融合组织的蛋白质。BoNT/A、C1和E裂解SNAP-25，而BoNT/B、D、G以及破伤风神经毒素(TeNT)攻击泡囊相关膜蛋白(vesicle-associatedmembrane protein，VAMP)2-也称为小突触泡蛋白2-。此外BoNT/C1也裂解突触融合蛋白1A。
梭状芽孢杆菌细菌释放神经毒素，其为单链多肽，都具有1251至1315个氨基酸。其后内源蛋白酶在限定位置处将每一种这些蛋白质分解为2条链(切断)，然而两条残留的链通过二硫桥相连结。这些双链蛋白质称为赫勒毒素(holo-toxins)(参见Shone等(1985)，Eur JBiochem 151，75-82)。两条链具有不同的功能。较小的片段即轻链(轻链LC)代表Zn2+依赖性内切蛋白酶，而较大的单元(重链HC)代表轻链的转运手段。通过用内肽酶处理HC，产生两个50kDa片段(参见Gimenez等(1993)，J Protein Chem 12，351-363)。该氨基端的一半(HN片段)在低pH值下整合进入膜内，并且使得LC能够渗入神经细胞胞质液内。羧基端的一半(Hc片段)结合于复合物聚唾液酸神经节苷脂(polysialoganglioside)，该结合在神经细胞膜中排他性地发生，并且迄今为止未鉴定蛋白质受体(Halpern等(1993)，Curr Top MicrobialImmunol 195，221-241)。后者解释了梭菌神经毒素的高神经选择性(neuroselectivity)。晶态结构证实BoNT/A去掉了三个结构域，其可以通过三个步骤的作用机制进行调和(参见Lacy等(1998)，Nat Struct Biol 5，898-902)。此外，这些数据得出这样一种结论：在Hc片段内部有两个自主性的亚单元(亚结构域)存在，每个25kDa。存在两个功能性亚结构域的第一个证据是由TeNT的Hc片段的氨基端(HCN)和羧基端一半(Hcc)产生的，其表达为重组体形式，并且显示Hc-，但没有HCN结构域结合于神经元(参见Herreros等(2000)，Biochem J 347，199-204)，人们在BoNT/B和G的Hcc结构域内部发现了突触结合蛋白的蛋白质受体结合部位，证明它们有单独的功能性(参见Rummel等(2004)，J Biol Chem 279，30865-70)。
在生理条件下，HC结合神经元的神经节苷脂，这是通过受体介导的胞吞作用在细胞内部得到接收，并且经由内体小室(endosomal compartment)到达固有的泡囊循环(vesiclecirculation)。在早期内体(early endosomes)的酸性介质内，HN即HC的氨基端一半渗入泡囊膜并且形成小孔。每种经由二硫桥与HC连接的物质(X)将通过胞内氧化还原系统从HC分裂出来，进入二硫桥并使其还原。X最终出现在胞质液内。
在梭菌神经毒素HC是LC载体情况下，在最后的步骤中于胞质液内裂解它的专一性底物。融合蛋白的复合物形成和分解周期中断，并且因此抑制了乙酰胆碱的释放。其结果是，横纹肌无力并且汗腺停止分泌。单独的BoNT血清型的活性周期各不相同，并且取决于胞质液内完整LC的存在。因为所有神经元都具有梭菌神经毒素受体，不仅乙酰胆碱的释放可能受影响，而且可能也影响P物质、去甲肾上腺素、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸、内啡肽及其它递质和激素的释放。
胆碱能传递优先受到阻塞，这可以通过在外围的HC进入神经元的事实得到解释。中心突触通过不能复盖有蛋白质的血脑屏障得到保护。
HC对周围神经细胞具有高的亲合力，其主要通过与复合物聚唾液酸神经节苷脂相互作用被传递，这些复合物聚唾液酸神经节苷脂是乙二醇类脂物，由一种以上唾液酸组成(参见Halpern等(1995)，Curr Top Microbiol Immunol 195，221-41)。其结果是，与它们相结合的LC仅到达该细胞类型并且仅在这些细胞中变得有活性。BoNT/A和B每个仅仅结合一分子神经节苷脂GT1b。
为了研究构建结合腔的氨基酸扮演的角色，根据本发明制造出一个重组体Hc片段。该技术允许交换单独的氨基酸，这样，荷正电的氨基酸可以由荷负的电或者中性的氨基酸代替，反之亦然。结合腔表面的轻微改变没有对神经节苷脂的通过能力产生显著效果。例如如果用脂肪族残基例如亮氨酸代替位于1266的氨基酸即在SXWY始动(SXWY-motive)中称作W的色氨酸，可以显示出亲合力降低99％以上。然而，也观察到相反的情况。扩展到结合腔中的氨基酸取代导致对于神经节苷脂亲合力的提高。因为结合腔的构造对于HC对神经节苷脂受体的亲合力如此具有决定性，相关联的LC蛋白水解效价随着HC对神经节苷脂受体的亲合力同步地增加或者降低，与亲合力相协调。
在进行配体-受体研究中，根据本发明神经节苷脂的BoNT/A结合腔中表征并取代特定的氨基酸残基，从而提高对神经节苷脂受体的亲合力。在神经节苷脂和突触体结合分析中测定突变Hc片段的亲合力。随后，显示出相同突变的HC与LC-A耦合，为此目的，使用凝血酶敏感的氨基酸序列。重组蛋白质被凝血酶活化(切开)，并且产生双链分子，两条链通过单一的二硫桥连结。在鼠脑--释放递质的标本的突触体中试验该构造的活性。抑制递质释放的程度被认为是该构造活度的测量。另外，通过分离的老鼠神经-肌肉标本的手段(半隔膜分析，HDA)，分析该独特构造的效价，其代表梭菌神经毒素的生理学目的。
将要用TrapoX处理的机能障碍和症状伴随有运动神经元和植物神经细胞活性的集中提高。提高的活性导致受这些细胞刺激的肌肉疼痛性痉挛，并导致腺细胞过度分泌液体。另外，由于活性提高，面部皱纹发生在不同的区域。原因是病理性增加的来自周围神经末端的乙酰胆碱释放。如果把TrapoX注入到损伤的肌肉，损伤肌肉的松弛、分泌物的干涸和面部皮肤的光滑在1-3天的潜伏期后发生。这是由于由TrapoX抑制了乙酰胆碱的释放。病人变得几乎无痛感，并且被肌肉痉挛激发的痛感减轻并完全消失。
在人以及动物身上，乙酰胆碱的释放都得到抑制。所以习惯上使用动物试验既作为中毒情况下BoNT证据，也用于BoNT药物活性测定(Botox、Dysport、Xeomin)。通过在老鼠身上进行LD50测定而进行BoNT活性定量。本文中，其值为测定杀死一个动物试验组中50％的剂量。很明显，不同于不伤害任何动物的剂量，可以对动物给药至杀死一组动物中的100％的剂量。因为毒物是系统性(腹腔注射)给药，这样很多动物痛苦地死于由呼吸肌麻痹引起的呼吸停止。为了避免动物试验，我们对于老鼠半隔膜分析进行介绍。LD50试验中，试验老鼠因由呼吸肌麻痹引起的呼吸麻痹致死。这意味着可以从老鼠身上除掉呼吸肌，包括刺激神经(膈神经)，并且在活体外给毒。BoNT将与其受体结合，进入细胞并移位，并且最终裂解其底物，在此处肌肉麻痹。在LD50值和呼吸肌麻痹之间有严格的相关性。体外试验代表，按照本来的情况打了折扣的动物试验模型(Wohlfarth K，Goeschel H，Frevert J，Dengler R，Bigalke H，Botolinum A中毒：单元对单元.Naunyn Schmiedeberg’s Arch Pharmacol.1997年3月；335(3)：335-40)。
所以可以假定在活体外使隔膜麻痹的BoNT也在活老鼠体内作用，根据给药剂量杀死活鼠。如此，该动物试验置换法证明，老鼠半隔膜分析不久将为欧盟成员国通过欧盟药典接受，作为官方的BoNT测试方法。在老鼠隔膜标本中增加的TrapoX功效表明在人身上功效也会提高。
在更多近年来的实践中，BoNT/A复合物用于处理运动肌张力障碍，而且用于减小过度的交感神经活性(参见Benecke等(1995)，Akt Neurol 22，209ff)，并且用于止痛和减轻偏头痛(参见Sycha等(2004)，J Neurol 251，19-30)。该复合物由神经毒素、多种血细胞凝聚素和无毒的无血细胞凝聚作用的蛋白质组成。该复合物在生理pH迅速分解。得到的神经毒素是复合物的唯一组分，与治疗相关，并且使症状减轻。因为深部的神经疾病没有治疗，该复合物需要每隔三到四个月再次注射。取决于注射异种蛋白质的数量，一些病人产生了专一性的BoNT/A抗体。这些病人变得对神经毒素有抵抗力。一旦抗原敏感细胞识别出神经毒素并且形成抗体，相关的脑细胞可以保存若干年。基于这个原因，用活性尽可能高的制剂、尽可能小的剂量治疗病人是很重要的。此外该制剂不含任何别的细菌源蛋白质，因为它们可以作为免疫佐剂。这样的物质会引诱巨噬细胞，巨噬细胞会同时识别出免疫佐剂和神经毒素，将它们递至淋巴细胞，于是通过形成免疫球蛋白而应答。因此，仅极纯的不含任何异种蛋白质的产品可以用于治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转运蛋白(Trapo)，其能克服迄今为止已知方法的上述问题。
优选提供一种转运蛋白(Trapo)，其对复合神经节苷脂的亲合力提高了至少三倍。
“以比天然神经毒素更高的亲合力结合于神经细胞”。本案中，天然神经毒素优选肉毒杆菌的天然神经毒素。在这里，优选天然神经毒素是来源于肉毒杆菌的肉毒杆菌神经毒素A和/或肉毒杆菌神经毒素B和/或肉毒杆菌神经毒素G。以重组体形式从大肠杆菌(E.coli)制备的肉毒杆菌神经毒素，其尤其含有和天然的肉毒杆菌神经毒素一致的氨基酸序列，以同一种药理学方式作用于天然的肉毒杆菌神经毒素，并且称为重组体肉毒杆菌神经毒素野生型。在本案中提及的神经细胞是胆碱能运动神经元。优选转运蛋白专一性结合于神经细胞膜表面上的聚唾液酸神经节苷脂，比如是结合于GD1a、GD1b或者GT1b。优选活体外测定该结合。特别优选通过利用在实施例中详细阐明的分析方法进行测定。
术语“肉毒杆菌形成的神经毒素重链的修饰”，肉毒杆菌形成的神经毒素重链(HC)的氨基酸和/或核酸序列通常购自公开的可进入的数据库，用于每一种已知的血清型A至G(也请参见表1)。在这里修饰包括：删除、添加至少一个氨基酸，将其插入氨基酸序列中，或者天然神经毒素中至少一个氨基酸被另一个天然产生或非天然产生的氨基酸取代，和/或在规定氨基酸序列中氨基酸进行翻译后修饰。在这里，翻译后修饰包括糖基化、乙酰化、酰化、脱胺化、磷酸化、异戊二烯化、糖基磷脂酰基肌醇化，和为本领域的技术人员所熟知的进一步修饰。
由肉毒杆菌形成的神经毒素的HC包括三个亚结构域，即位于氨基端的50kDa大小的易位结构域HN、其后25kDa大小的HCN结构域和位于羧基端的25kDa的Hcc结构域。HCN结构域和Hcc结构域一起标示为Hc片段。从表1明显可知单独血清型相应的各个亚结构域的氨基酸部分及其变化。
为了详细描述具有不同BoNT血清型结构域的杂合蛋白，引入下述术语。术语scAtAAB例如表示单链神经毒素(sc)，其由四个结构域LC、HN、HCN和Hcc组成，根据结构域起源，用各个血清型的大写字母标注每个结构域。这意味着scAtAAB衍生于LC、HN和HCN，同时BoNT/A的Hcc结构域由BoNT/B取代。小写字母“t”代表在LC和HN之间插入的凝血酶标记序列。
表1：氨基酸序列数据库编号和七种肉毒杆菌神经毒素的亚结构域分布。
Figure G200580038112520070510D000061
本发明特别涉及到一种通过修饰肉毒杆菌形成的神经毒素的HC而得到的转运蛋白，所述蛋白质以比天然神经毒素更高的亲合力专一性地结合于神经细胞，并且通过胞吞作用被这些细胞接受。
本发明提供的转运蛋白显示出提高了的其神经节苷脂结合结构域对于复合聚唾液酸神经节苷脂的专一性亲合力。亲合力提高优选通过氨基酸取代或缺失而实现。
根据优选实施方式，转运蛋白显示出比天然神经毒素至少高15％的亲合力。优选转运蛋白显示出比天然神经毒素至少高50％的亲合力，尤其优选比天然神经毒素至少高80％的亲合力，并且特别优选比天然神经毒素至少高90％的亲合力。
根据优选实施方式，HC修饰发生在给定神经毒素Hc片段区域。如果修饰包括取代、缺失、插入或附加，后者例如也可以通过特异性的诱变而进行，在本文中的方法已为本领域的技术人员所熟知。在这里，天然神经毒素中的氨基酸可以用天然或者非天然氨基酸修饰。氨基酸基本上被分成不同的物理化学组。天冬氨酸和谷氨酸属于荷负电氨基酸。
组氨酸、精氨酸和赖氨酸属于荷正电的氨基酸。天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸属于极性氨基酸。甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸属于非极性氨基酸。在氨基酸中组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中有芳香族侧基。一般来讲，优选用属于另一个物理化学组的不同的氨基酸来取代。
根据本发明的优选实施方式，转运蛋白是肉毒杆菌神经毒素血清型A至G。
在本发明的一个优选实施方式中，转运蛋白衍生于肉毒杆菌神经毒素类型A的蛋白质序列(数据库No.AAA23262和CAA51824)。
本发明另一个实施方式涉及一种转运蛋白，其中至少一个位于肉毒杆菌神经毒素类型A(数据库No.AAA23262和CAA51824)的蛋白质序列第1117、1202至1204、1252至1254、1262至1267、1270和1278至1279位的氨基酸被除去或者由天然或者非天然产生的氨基酸取代。
本发明另一个实施方式涉及一种转运蛋白，其中位于肉毒杆菌神经毒素类型A的蛋白质序列(数据库No.AAA23262和CAA51824)第1092至1296位的氨基酸--该区域包括神经节苷脂结合的结构域，已被下述序列取代：
肉毒杆菌神经毒素类型B蛋白质(数据库No.AAA23211)，第1079至1291位氨基酸，
肉毒杆菌神经毒素类型C1蛋白质(数据库No.CAA51313)，第1093至1291位氨基酸，
肉毒杆菌神经毒素类型D蛋白质(数据库No.CAA38175)，第1080至1276位氨基酸，
肉毒杆菌神经毒素类型E蛋白质(数据库No.CAA44558)，第1067至1252位氨基酸，
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)神经毒素类型E蛋白质(数据库No.CAA43998)，第1067至1251位氨基酸，
肉毒杆菌神经毒素类型F蛋白质(数据库No.CAA57358)，第1085至1278位氨基酸，
巴拉蒂梭菌(Clostridium baratii)神经毒素类型F蛋白质(数据库No.CAA48329)，第1076至1268位氨基酸，
肉毒杆菌神经毒素类型G蛋白质(数据库No.CAA52275)，第1087至1297位氨基酸。
此外，从表1明显看出，Hcc结构域适合于与氨基酸位置互换。
本发明另一个实施方式涉及到一种含有根据本发明的转运蛋白和至少一种间插分子(X)的组合物。该间插分子可以是小的有机分子、肽或蛋白质；优选例如通过肽-，酯-，醚-，硫代-，二硫代-或者碳-碳键而共价成键。
另外，间插分子包括所有已知的治疗用活性物质。细胞静止剂、抗生素、抗病毒剂，并且在这里优选免疫球蛋白。
为了更好地利用亲合力提高的Trapo，将其氨基端经由氨基酸序列与BoNT/A、B、C1、D、E、F或者G的LC相结合，其被专一性地识别并被蛋白酶凝血酶分解，产生特异的TrapoX。与天然的BoNT/A相比，所述TrapoX的活性强度得到提高，并且尤其优选所述TrapoX的活性强度提高至少2倍。该不含异种蛋白的新产品，由于材料的更高纯度和低剂量，将显著地降低免疫系统刺激。
本发明另一个实施方式涉及一种转运蛋白，其中蛋白质是蛋白酶，该转运蛋白分解一种或者多种神经递质释放组织蛋白质，蛋白酶选自由肉毒杆菌神经毒素的LC组成的神经毒素组，特别是类型A、B、C1、D、E、F和G或者肉毒杆菌神经毒素的LC的蛋白水解活性片段，特别是血清型A、B、C1、D、E、F和G的神经毒素，该片段显示出至少0.01％的天然蛋白酶的蛋白质分解活性，优选至少5％，尤其优选至少50％，特别优选至少90％。优选转运蛋白和蛋白酶衍生于相同的肉毒杆菌神经毒素血清型，特别并优选转运蛋白的HN结构域，并且蛋白酶衍生于肉毒杆菌神经毒素血清型A。蛋白酶序列是通常可进入的数据库并且数据库编号从表1明显可见。蛋白酶的蛋白质分解活性通过底物分离动力学(参见Bina等，(2002)，Biochemistry 41(6)，1717-23)的方法进行测定。
这些LC的特征在于它们含有序列His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr，其中Xaa可以是任何氨基酸。本发明的转运蛋白的特征在于蛋白质和蛋白酶选自上述蛋白质和/或蛋白酶的组。
根据本发明的另一个实施方式，提供了一种用于生产转运蛋白的方法。在本案中，在第一步中提供了编码转运蛋白的核酸。在这里，编码核酸代表RNA、DNA或其混合物。鉴于其核酸酶抗性(nuclease resistance)，可以比如通过插入硫代磷酸酯(phosphorthioate)键进一步修饰该核酸。该核酸可以从起始核酸(starting nucleic acid)生产出来，后者是例如通过基因组或者cDNA的克隆-数据库而得到。此外，核酸可以直接通过由固相合成而生产出来。合适的方法已为本领域的技术人员所熟知。假定对例如通过定点特定突变可以产生对起始核酸的特异性修饰，导致至少在氨基酸水平上的一个附加、插入、缺失和/或取代。然后将核酸有效地连接至合适的启动子。用于在已知表达系统中表达的合适启动子已为本领域的技术人员所熟知。在本案中，启动子的选择取决于用于表达的表达系统。一般来讲，优选组成型启动子(constitutive promoter)，但诱导型启动子(inducible promoter)同样可以使用。用这样的方式生产的构造包括：至少一个部分载体，特别是调控元件；例如选自λ-衍生物、腺病毒、杆状病毒、牛痘苗病毒、猿猴肾病毒40(SV4O-viruses)和逆转录病毒的载体。优选载体能够在给定的寄主细胞内表达核酸。
本发明进一步提供了寄主细胞，其含有载体并且适合于表达载体。许多原核和真核表达系统已知属于现有技术，寄主细胞例如选自原核细胞，比如大肠杆菌(E.coil)或者巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，选自真核细胞，比如酿酒酵母(S.cerevisiae)和巴斯德比赤酵母(P.pastoris)。尽管也可以使用更高级的真核细胞，比如昆虫细胞或者哺乳动物细胞，然而寄主细胞优选像肉毒杆菌一样，不具有糖基化组织。
根据一种优选实施方式，核酸编码肉毒杆菌神经毒素的Hcc结构域。该核酸含有内切核酸酶界面(在编码Hc片段的核酸二侧)，其内切核酸酶位点与肉毒杆菌神经毒素的其它Hc片段位点一致，为了使得它们在编码转运蛋白的基因中容易进行模块置换，保持了氨基酸序列的相似性。
如果根据本发明提供一种组合物，除转运系统外，其进一步含有至少一个间插分子，并且用羧基端半胱氨酸或者巯基基团使该间插分子、肽或蛋白质功能化，然后，以与前述相类似的方式，可以通过重组法例如使用双载体或者多种寄主细胞来生产肽和/或蛋白质。如果相同的寄主细胞同时用于表达转运蛋白和肽或蛋白质，优选分子间二硫键原位形成。为了在相同的寄主细胞中进行更有效地生产，也可以在相同的阅读框中将编码肽或蛋白的核酸与编码转运蛋白的核酸一起翻译，结果生产出单链多肽。该情况下优选分子内二硫键是原位形成。为了简单水解在转运蛋白与肽和/或蛋白质之间同样出现的肽交联，将氨基酸序列插入转运蛋白氨基端，其被专一性地识别并且被蛋白酶凝血酶或被专一性的的寄主细胞内切蛋白酶分离。
如果这不可能，在分离提纯转运蛋白和蛋白质后，可以接着通过本领域的技术人员熟知的氧化工艺产生适当的分子间二硫键。也可以通过合成或者片段缩合直接得到肽或者蛋白质，合适的方法已为本领域的技术人员所熟知。
接着分别纯化转运蛋白和肽，或者蛋白质。为该目的所使用的方法例如色谱法或者电泳法，已为本领域的技术人员熟知。
本发明另一个实施方式涉及一种药物组合物，其包括转运蛋白和任意药用上可接受的赋形剂、稀释剂和/或添加剂，并且适合于治疗下述的机能障碍或者疾病：半面痉挛、痉挛性斜颈、痉挛状态、肌张力障碍、偏头痛、疼痛、颈部和腰椎脊柱机能障碍、斜视、唾液分泌过多和抑郁疾病。
该药物组合物适合于口服、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和表面给药。优选肌肉注射给药。药物组合物的一个剂量单位含有大约0.1pg～1mg转运蛋白和/或根据本发明的组合物。
本发明另一个实施方式包括一种美容组合物，由转运蛋白和药物赋形剂、稀释剂和/或添加剂组成，适合于治疗多汗和非常明显的面部皱纹。该美容组合物适合于口服、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和体表给药。优选肌肉注射给药。美容组合物的一个剂量单位含有大约0.1pg～1mg转运蛋白和/或根据本发明的组合物。该美容组合物适合于治疗多汗和面部皱纹。
在本发明中描述的转运蛋白可以由合适的寄主细胞比如大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或者巨大芽孢杆菌来生产，它们使重组体表达载体增殖，该载体编码转运蛋白。
附图说明
使用下述附图来解释本发明，其中：
图1显示了突变的BoNT/A上Hc片段对鼠脑的突触体膜标本的亲合力比野生型BoNT/A的Hc片段对鼠脑的突触体膜标本的亲合力高3倍。
图2显示了不同BoNT/A的Hc片段突变体与鼠脑突触体的结合情况，将BoNT/A的Hc片段野生型对鼠脑突触体的亲合力设定为100％作为标准。第一纵列显示了BoNT/A突变体的亲合力，这显示了导致提高的氨基酸Y1117的突变，。第二纵列显示了另一个BoNT/A突变体的亲合力。第三纵列显示了表现出双重突变的BoNT/A突变体的亲合力，增强了对神经细胞膜(突触体)的结合。
图3显示，与BoNT/A野生型对于分离的老鼠的膈神经-隔膜肌标本相比，BoNT/A的Y1117A突变体的神经毒性有了提高。
图4显示了四个BoNT/A的Hc片段杂交体HcAB、HcAC、HcAE和HcAT(T为破伤风神经毒素)在神经细胞膜(突触体)中的结合情况，将BoNT/A的Hc片段野生型设定为100％作为标准。
图5显示了在分离的老鼠隔神经-隔膜肌标本中，由BoNT/A和BoNT/B的Hc片段或Hcc结构域组成的总毒素杂交体与BoNT/A野生型相比神经毒性有了提高。
具体实施方式
具体地讲，本发明含有转运蛋白(Trapo)，其通过修饰由肉毒杆菌所产神经毒素的Hc而形成，优选专一性地结合于神经元，由受体介导的胞吞作用进行细胞内调节，并且从酸性内体小室易位进入神经元胞质液。该蛋白质被用作转运手段，以便将蛋白酶及结合于所述转运手段的其它物质导入细胞，不会生理学地渗入质膜并且到达神经细胞胞质液。该蛋白酶底物是细胞内定位蛋白质和参与递质释放的肽。在底物分离后，阻断了神经元的特定功能，细胞本身不受损害。这些功能之一是造成神经递质释放的胞吐作用，如果递质的释放得到抑制，从细胞到细胞的信号传送被阻断。例如，如果在神经肌肉接触点抑制了乙酰胆碱的释放，会使横纹肌麻痹。如果把TrapoX应用于痉挛或张力障碍肌肉的神经末端，可以临床使用该效果。其它活性物质例如是表现出抗病毒作用的物质。与Trapo相配合，它们可以用于治疗神经系统病毒感染。本发明也涉及到转运蛋白用于抑制神经递质释放的用途。
如果病人用天然形式的BoNT/A和BoNT/B治疗，注射这些非人源蛋白质，尽管剂量低，也会引起抗体形成，使得治疗必须停止以防止过敏性休克。通过施用具有相同作用机制、具有更高酶活性转运效率的物质，剂量可以大大降低，并且不会形成抗体。这些特性归因于在此描述的转运蛋白。
虽然实施例是应用的情形，但是合适的应用模式和剂量通常是由主治医生分别确定。这样的决定通常由精通相关专业领域的医生作出。这样，例如可以基于例如所选神经毒素溶解度或者待治疗痛感强度的标准，按照本发明在此的描述而选择应用模式和神经毒素剂量。
天然BoNT/A和BoNT/B的治疗间隔一般是平均三至四个月。延长该间隔将会降低形成抗体的风险，并且使得BoNT有较长的治疗周期。在胞质液中LC的增加将随时间延伸其分解，并且因此也延长了作用的持续时间。这里描述的转运蛋白表现出比天然HC-A更高的亲合力和接受速率(reception rate)。
下述实施例仅用于阐明本发明，并不得理解为一种对本发明的限制方式。
实施例
在大肠杆菌内基因工程TrapoX重组体的表达
通过PCR方法在肉毒杆菌(数据库No.AAA23262)染色体DNA上扩增BoNT/A中HC的DNA序列。为实现该目的，利用专一性的低聚核苷酸，由用于编码丙氨酸氨基酸残基的碱基三联体取代氨基酸酪氨酸1117的密码子。另外，基因的5’-端用DNA序列补平，用于编码凝血酶识别序列的氨基酸。将该DNA序列插入细菌表达载体。在该情况下，用于Trapo的插入基因在3′-端与低聚核苷酸融合，用于编码羧基端亲和肽比如Strep-day、6xHN-day或者His6-day。用这样的方式产生的表达载体pAR-Trapo，是用于添加载体分子比如BoNT的LC的起始碱基。
通过PCR方法在肉毒杆菌(数据库No.AAA23262)染色体DNA序列上扩增BoNT/A中LC的DNA序列，并且将其插入被编码的凝血酶识别序列的表达载体pAR-Trapo上游。将这样产生的表达载体pAR-TrapoX转化进入E.coli K12菌株，并且在生物安全2级条件下和遵照汉诺威地区政府发布的用于该项目的规章制度(文件参考号501g.40654/3/57/3)，诱导蛋白质TrapoX表达。按照厂商的指导，用亲和色谱手段分离体外表达的TrapoX，得到分子量150kDa的单链蛋白质。接着用连接在琼脂糖凝胶上的凝血酶水解该蛋白，生产出纯的蛋白质，其两条链通过二硫桥保持连结。
与野生型BoNT/A相比较，该蛋白质表现出对固定在微型滴定板上的分离的神经节苷脂GT1b的亲合力、以及对鼠脑突触体膜标本的亲合力增加了300％(图1)。LC-A的催化活性未改变，如同在重组体SNAP-25体外分解中显示的那样。就抑制鼠脑功能性突触体中神经递质释放而言，与从肉毒杆菌回收的天然BoNT/A相比较，TrapoX效价增加了300％。在老鼠的神经肌肉标本(HDA)中，与天然BoNT/A相比较，TrapoX效价同样地增加了300％(图2)。
与鼠脑突触体的结合的测量和在不同BoNT/A突变体的HDA中神经毒性的测量。
按照Rummel等在J Mol Biol 326(2003)，835-847中陈述的方法，测量放射性标记的Hc片段与大鼠突触体的结合。按照Habermann等在Naunyn Schmiedeberg’s Arch Pharmacol311(1980)，33-40中描述的方法，测定BoNT/A突变体的神经毒性。
与野生型相比，不同的BoNT/A突变体的结合对比情况显示于下表：
与图2有关的表
  突变   相对于野生型(％)   标准偏差
  野生型   100.0   15.00
  Y1117A   332.3   29.00
  Y1117C   324.2   44.75
  Y1117D   124.4   26.94
  Y1117E   183.3   27.95
  Y1117F   235.9   38.41
  Y1117G   112.8   21.34
  Y1117H   120.0   22.29
  Y1117I   248.1   21.95
  Y1117L   253.6   25.65
  Y1117M   182.8   18.41
  Y1117N   250.3   20.13
  Y1117P   150.3   14.98
  Y1117Q   187.3   28.19
  Y1117R   115.4   16.80
  Y1117S   199.2   32.65
  Y1117T   264.1   28.55
  Y1117V   346.9   37.61
  F1252Y   208.0   38.36
  H1253K   153.0   9.24
  V1262I   97.8   9.38
  Q1270N   122.3   37.81
  L1278H   170.0   61.59
  G1279N   153.6   44.54
  Y1117C/H/1253K   324.8   22.72
  Y1117V/H1253K   332.9   33.48
在BoNT/A的神经节苷脂结合腔内部单独测定的氨基酸的突变导致与神经细胞的结合的提高。优选在1117位，由丙氨酸、半胱氨酸或者缬氨酸取代酪氨酸。具体地说，1117位酪氨酸残基被丙氨酸的取代导致亲合力提高大约330％。
在神经节苷脂结合腔1252和1253位的个别氨基酸的进一步突变同样导致结合性的提高。具体地说，酪氨酸中F1252突变和赖氨酸中H1253突变导致亲合力分别增加110％和50％。
此外，可以预期1202、1262、1270、1278和1279位的突变会导致与神经细胞结合的提高。
此外，BoNT/A的突变体也进行了双重突变试验，而在这种情况下，具体地说，突变体Y1117C/H1253K和Y1117V/H1253K导致与突触体结合的提高(参见图2)。
此外测定出结合的提高，尤其是BoNT/A的突变体Y1117A结合的提高导致在膈神经-神经毒性分析(HDA分析)中神经毒性的提高(图3)。
BoNT/A的Hcc杂交体的结合及神经毒性的测定
按如上所述方法进行结合及神经毒性的测定。
结果显示于下表中并进一步显示于图4和图5中。
与图4有关的表
  突变   相对于野生型(％)   标准偏差
  HcA wt   100.0   10.4
  HcAB   249.2   19.1
  HcAC   393.4   57.9
  HcAE   22.0   5.3
  HcAT   210.2   22.5
用其它血清型特别是肉毒杆菌神经毒素B和肉毒杆菌神经毒素C取代BoNT/A的Hcc结构域，导致与神经细胞结合的提高。此外观察到用破伤风神经毒素的相应结构域取代BoNT/A中Hc片段的Hcc结构域同样导致神经细胞中亲合力的提高。整个BoNT/A中Hcc结构域的取代也会导致亲合力变化。在这里，图5显示，在杂交体scAtAAB中亲合力提高对于神经毒性提高具有类似的影响。如果取代整个Hc片段scAtAAB来代替Hcc结构域，会观察到相应结果。具体地说，可以观察到当用BoNT/B取代BoNT/A中Hc片段的Hcc结构域时，神经毒性提高了大约350％。
BoNT突变体与神经节苷脂GT1b结合的测定
将神经节苷脂GT1b[NAcNeuα3Galβ3NAcGalβ4(NAcNeuα8NAcNeuα3)Galβ4Glcβ](Sigma-Aldrich公司)溶于甲醇，并且施涂到把高亲合力96孔聚苯乙烯微型滴定板(Corning公司；100μl/孔中含有1μgGT1b)，或者，在进行竞争分析情况下，施涂到具有125I-BoNTs(Greiner Bio-ohne公司；100μl/孔中含有0.1μg GT1b)的高亲合力CS单缝条形孔板(singlefracture strip plate)上。在室温下蒸发溶剂，并且所述孔用结合缓冲液(binding buffer，10mMTris-HCl、10mM Na2HPO4、0.5％BSA，pH7.2))漂洗三次。然后通过在PBS/Tween溶液[140mM NaCl、7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4、0.05％(V/V)Tween20，pH 7.2]中培育两小时以阻断非专一性的结合部位，溶液中补充3％(w/v)BSA。使用增加量的野生型，或使用特定量的突变体，在结合缓冲液(100μl/孔)中于室温下进行2小时的结合分析，在3次漂洗步骤中除去未结合的蛋白质，每个步骤使用250μlPBS/Tween缓冲液。按照厂商的指导，通过用与碱性磷酸酶(ST-AP，IBA GmbH)连接的Strep Tactin在结合缓冲液中于室温下培育2小时，鉴定已结合的Hc片段。P-硝基苯磷酸酯(在100mM甘氨酸、1mM MaCl2、1mM ZnCl2，pH 10.4溶液中含量1mg/ml)最终用作碱性磷酸酶底物。通过添加3M的NaOH溶液终止脱磷酸化反应，并且使用光谱计数微型板读数装置(Packard公司)测量405nm处的消光值。在100μl含有700000cpm/孔[1251]-BoNT、不同量的天然BoNT或者重组体Hc片段的结合缓冲液中，于室温下进行2小时竞争分析。在培育并除去上清液后，各孔用PBS/Tween缓冲液漂洗三次，干燥并且分离。然后在自动伽马计数器(Wallac 1480Wizard3型)上测定结合放射性标记BoNT的量。

Claims (38)

1.一种转运蛋白，其通过对肉毒杆菌形成的神经毒素重链修饰而获得，其中所述神经毒素是肉毒杆菌神经毒素类型A(BoNT/A)，并且所述蛋白结合于神经细胞的亲合力比天然神经毒素结合于神经细胞的亲合力更高，所述蛋白专一性地结合于胆碱能运动神经元的复合神经节苷脂，在质膜内定位，并且其中一个位于所述肉毒杆菌神经毒素类型A的蛋白质序列第1117、1202至1204、1252至1254、1262至1267、1270、1278至1279位的氨基酸被除去或被天然的或非天然源的氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的转运蛋白，其特征在于，所述蛋白专一性地结合于神经细胞并且通过胞吞作用进入细胞。
3.如权利要求1所述的转运蛋白，其特征在于，所述胆碱能运动神经元的复合神经节苷脂是GT1b，在质膜内定位。
4.如权利要求3所述的转运蛋白，其特征在于，所述转运蛋白的神经节苷脂结合结构域包含氨基酸的取代和缺失，对提高的亲合力有作用。
5.如权利要求1～4中任一项所述的转运蛋白，其特征在于，所述蛋白显示出比天然神经毒素高出至少15％的亲合力。
6.如权利要求5所述的转运蛋白，其特征在于，所述蛋白显示出比天然神经毒素高出至少50％的亲合力。
7.如权利要求6所述的转运蛋白，其特征在于，所述蛋白显示出比天然神经毒素高出至少80％的亲合力。
8.如权利要求7所述的转运蛋白，其特征在于，所述蛋白显示出比天然神经毒素高出至少90％的亲合力。
9.如权利要求1所述的转运蛋白，其特征在于，在所述肉毒杆菌神经毒素类型A蛋白质序列第1117位氨基酸被除去或被天然的或非天然源的氨基酸取代。
10.如权利要求9所述的转运蛋白，其特征在于，所述被用于取代的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸，天门冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸或者缬氨酸。 
11.如权利要求9所述的转运蛋白，其特征在于，所述被用于取代的氨基酸是丙氨酸、半胱氨酸或者缬氨酸。
12.如权利要求1所述的转运蛋白，其特征在于，所述肉毒杆菌神经毒素类型A的蛋白质序列第1252位的氨基酸被酪氨酸取代，或者第1253位的氨基酸被赖氨酸取代。
13.如权利要求1所述的转运蛋白，其特征在于，从所述肉毒杆菌神经毒素类型A的蛋白质序列中第1117、1202至1204、1252至1254、1262至1267、1270和1278至1279位中选出的两个或三个氨基酸被除去或取代。
14.如权利要求13所述的转运蛋白，其特征在于，选自下组位置的两个或三个氨基酸被除去或取代：1117/1252、1117/1253、1117/1262、1117/1278、1117/1279、1117/1252/1253。
15.如权利要求14所述的转运蛋白，其特征在于，选自下组位置的两个或三个氨基酸被除去或取代：Y1117A/F1252Y、Y1117A/H1253K、Y1117A/V1262I、Y1117A/L1278H、Y1117A/G1279N、Y1117C/F1252Y、Y1117C/H1253K、Y1117C/V1262I、Y1117C/L1278H、Y1117C/G1279N、Y1117V/F1252Y、Y1117V/H1253K、Y1117V/V1262I、Y1117V/L1278H、Y1117V/G1279N、Y1117A/F1252Y/H1253K、Y1117C/F1252Y/H1253K和Y1117V/F1252/H1253K。
16.如权利要求4所述的转运蛋白，其特征在于，含有神经节苷脂结合结构域的所述肉毒杆菌神经毒素类型A的1092～1296位氨基酸，被如下序列取代：
肉毒杆菌神经毒素类型B蛋白质，1079至1291位氨基酸；
肉毒杆菌神经毒素类型C1蛋白质，第1093至1291位氨基酸；
肉毒杆菌神经毒素类型D蛋白质，第1080至1276位氨基酸；
肉毒杆菌神经毒素类型E蛋白质，第1067至1252位氨基酸；
丁酸梭菌神经毒素类型E蛋白质，第1067至1251位氨基酸；
肉毒杆菌神经毒素类型F蛋白质，第1085至1278位氨基酸；
巴拉蒂梭菌神经毒素类型F蛋白质，第1076至1268位氨基酸；
肉毒杆菌神经毒素类型G蛋白质，第1087至1297位氨基酸。
17.一种转运蛋白，其通过对肉毒杆菌形成的神经毒素重链修饰而获得，其中所述神经毒素是肉毒杆菌神经毒素类型A(BoNT/A)，并且所述蛋白结合于神经细胞的亲合力比天然神经毒素结合于神经细胞的亲合力更高，所述神经毒素类型A的完整Hc片段被其它神经毒 素类型中一个的完整Hc片段取代。
18.如权利要求17所述的转运蛋白，其特征在于，所述取代是指BoNT/A的完整Hc片段(867～1296位氨基酸)被BoNT/B的Hc片段(866～1291位氨基酸)取代。
19.一种组合物，含有如权利要求1～18中任一项所述的转运蛋白，并且含有至少一个间插分子，其中所述间插分子包括小的有机分子、肽或者蛋白质。
20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述间插分子通过肽键、酯键、醚键、硫键、二硫键或者碳-碳键共价成键。
21.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述小的有机分子是抗病毒剂、癌细胞抑制剂、抗生素或者免疫球蛋白。
22.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述蛋白质包括蛋白酶。
23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶包括肉毒杆菌类型A、B、C、D、E、F和G的神经毒素蛋白质。
24.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶含有由肉毒杆菌类型A、B、C、D、E、F和G的蛋白质衍生的蛋白水解活性片段。
25.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，含有序列His-Glu-Leu-Xaa-His-(Xaa)33-35-Glu-(Xaa)84-90-Glu-(Xaa)11-Arg-Xaa-Xaa-Tyr，其中Xaa可以是任何氨基酸，并且其中所述蛋白酶在胆碱能运动神经元内部分解专一性底物。
26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述底物选自于在周围神经内神经递质的释放所涉及的蛋白质和能够在神经细胞内部催化反应的蛋白质。
27.如权利要求26所述的组合物，其特征在于，所述蛋白酶和转运蛋白通过氨基酸序列而共价成键，被内肽酶专一性地识别并分解。
28.如权利要求27所述的组合物，在被内肽酶分解后，蛋白酶和转运蛋白接着被二硫桥连结起来，导致活性全毒素的形成。
29.一种药物组合物，含有如权利要求1～18中任一项所述的转运蛋白或如权利要求19～28中任一项所述的组合物，以及可选的任何药用上可接受的赋形剂、稀释剂和/或添加剂。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于，该药物组合物用于治疗肉毒杆菌神 经毒素对其显示出治疗效果的机能障碍或疾病。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其特征在于，所述机能障碍或疾病是下述一种：半面痉挛、痉挛性斜颈、痉挛状态、肌张力障碍、偏头痛、疼痛、颈和腰椎脊柱的机能障碍、斜视、唾液分泌过多和抑郁疾病。
32.一种美容组合物，含有如权利要求1～15中任一项所述的转运蛋白或如权利要求19～28中任一项所述组合物，以及可选的任何药用上可接受的赋形剂、稀释剂和/或添加剂。
33.如权利要求32所述的美容组合物，其特征在于，所述美容组合物用于治疗美容适应症，所述美容适应症是多汗和非常明显的面部皱纹。
34.一种生产工艺，系通过已知重组方法来生产如权利要求1～18中任一项所述的转运蛋白或如权利要求19～28中任一项所述的组合物。
35.生产如权利要求17或18所述转运蛋白的工艺，其特征在于，用含有在蛋白酶侧面的内核界面的核酸编码神经节苷脂结合结构域，其中限制性内切核酸酶位点与其它肉毒杆菌神经毒素的神经节苷脂结合结构域相容，以便使得它们容易进行模块取代而又同时保持氨基酸序列的相似性。
36.一种寄主细胞，含有重组表达载体，所述表达载体用以编码如权利要求1～18中任一项所述的转运蛋白或如权利要求19～28中任一项所述的组合物。
37.如权利要求36所述的寄主细胞，其特征在于，所述寄主细胞可以是大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤氏酵母或巨大芽孢杆菌的细胞。
38.一种表达载体，其特征在于，包括用以编码如权利要求1～18中任一项所述转运蛋白或如权利要求19～28中任一项所述组合物的核酸。 
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