ES2326916T3 - Aparato y metodo para la produccion de compuestos biologicamente activos por fermentacion. - Google Patents
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Abstract
Aparato para la producción fermentativa de un compuesto biológico, caracterizado porque el citado aparato comprende por lo menos un primer aislador que contiene un fermentador y está rodeado por una cámara de trabajo, en el que la citada cámara de trabajo está conectada al medio ambiente mediante una compuerta a presión, en el que existe una presión baja en el aislador y en la cámara de trabajo, en el que la presión (con respecto a la presión ambiente) en el aislador es menor que la presión (con respecto a la presión ambiente) en la cámara de trabajo y en el que existe una sobrepresión (con respecto a la presión ambiente) en la compuerta a presión.
Description
Aparato y método para la producción de
compuestos biológicamente activos por fermentación.
La invención se refiere a un proceso y a un
aparato para la producción fermentativa de materiales biológicos
activos, en los que el fermentador está situado en un aislador que
a su vez está situado en una cámara de trabajo y en los que existe
un gradiente de presión con respecto a la presión ambiente tanto en
el aislador como en la cámara de trabajo.
Trabajar con compuestos biológicos activos
requiere mayores medidas de seguridad en la instalación de
producción para proteger a los empleados de riesgos e
intoxicaciones potenciales. Frecuentemente los compuestos biológicos
activos se producen o usan con fines farmacéuticos, razones por las
que se deben cumplir requisitos estrictos de limpieza durante su
fabricación. La construcción rutinaria de instalaciones para la
fabricación de compuestos ultrapuros está compuesta de una primera
cámara interna que está cenada exteriormente y rodeada por una
segunda cámara. En la segunda cámara están las personas que
trabajan con el material biológico mientras que el procesamiento
del material biológico se produce principalmente en la primera
cámara. Las dos cámaras están conectadas entre sí por compuertas
bloqueables. La primera cámara es típicamente una caja de guantes
por lo que las etapas del proceso pueden ser realizadas desde la
segunda cámara con ayuda de guantes. La segunda cámara está
típicamente aislada del exterior pero conectada a éste mediante
compuertas bloqueables. En las dos cámaras hay condiciones
idealmente estériles y requisitos de limpieza de las salas. Para
evitar contaminación del material biológico activo con partículas
circundantes, gérmenes biológicos, etc., en la primera cámara
existe una sobrepresión, que típicamente es una sobrepresión de 15
Pa. Por el contrario, en la segunda cámara existe una presión baja
en comparación con la primera cámara pero una sobrepresión con
respecto a la presión ambiente. Por lo tanto, se debe evitar que
partículas o gérmenes de la segunda cámara se infiltren en la
primera cámara. Así, el material biológico activo estará protegido
de contaminación del medio circundante.
La patente de los Estados Unidos 4.262.091 se
refiere a cajas de guantes para la preparación de nutrientes
sólidos en placas de Petri, que se pueden colocar adyacentes entre
sí. Las cajas de guantes tienen paredes rígidas capaces de mantener
una ligera presión positiva con respecto a la atmósfera
ambiente.
En el caso de la fabricación de compuestos
biológicos activos por un proceso fermentativo hay etapas del
proceso que se deben realizan en un aparato abierto, al menos
temporalmente. Por ejemplo, la inoculación es una de estas etapas.
En la mayoría de los casos esta etapa se tiene que realizar
manualmente. Durante este procedimiento en el que se abre el
dispositivo (recipiente, vial) que contiene el material de partida
(banco de células), aunque sea sólo brevemente, se puede formar un
aerosol. Esto también es válido para las etapas intermedias de las
fases de precultivo hasta el comienzo de la fermentación. Entonces
se abre una lumbrera, aunque sea sólo brevemente, por lo que se
puede formar un aerosol. También es posible que durante el
procesamiento del producto de la fermentación, es decir, de la
sustancia biológica activa, se forme un aerosol. Así, existe riesgo
de exposición a gérmenes, bacterias o sustancias tóxicas al medio
ambiente. Debido a la baja presión relativa existente en la segunda
cámara con respecto a la primera cámara, los aerosoles de la
primera cámara se pueden infiltrar en la segunda cámara, lo cual
puede originar un problema a las personas que trabajan en la segunda
cámara. Por lo tanto, para dar garantías de seguridad operativa, se
deben tomar más precauciones como, por ejemplo, vacunación de los
empleados, uso de ropas protectoras, etc.
Por lo tanto, hay necesidad de un proceso y un
aparato para la producción, por fermentación, de materiales
biológicos activos, en los que se protejan los materiales de
contaminación del medio ambiente y, al mismo tiempo, se reduzca o
evite totalmente la exposición del personal a aerosoles.
La presente invención cumple este objetivo
proporcionando el aparato y el proceso de acuerdo con las
reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se refiere a un aparato y
a un proceso para la producción, por fermentación, de agentes
biológicos activos, preferiblemente en forma ultrapura, en los que
se evita la contaminación del material biológico con partículas y
gérmenes del medio ambiente y, al mismo tiempo, se reduce el
potencial de riesgos al personal que trabaja con el material
biológico. Preferiblemente el proceso de fermentación incluye por
lo menos una etapa de inoculación. Más preferiblemente el proceso
de fermentación incluye por lo menos una etapa que se realiza
manualmente y lo más preferiblemente esta etapa es la etapa de
inoculación.
El proceso y el aparato de la presente invención
permiten el uso de técnicas de producción y purificación aprobadas,
que están o pueden estar asociadas con formación de aerosoles, sin
riesgo fundamental para las personas encargadas del proceso de
producción y/o de procesos de transformación o para el medio
ambiente debido a la formación de aerosoles. En otras palabras, el
aparato y el proceso de la presente invención reducen la exposición
de las personas relacionadas con la producción y del medio ambiente
a materiales biológicos activos, bacterias y/o gérmenes y, al mismo
tiempo, permite la aplicación de técnicas aprobadas que posibilitan
una producción y purificación eficientes del material biológico,
aunque estos materiales estén relacionados fundamentalmente con
formación de aerosoles.
El aparato de la presente invención incluye por
lo menos una cámara aislante (aislador) rodeada por una cámara de
trabajo o adyacente a ésta. La cámara de trabajo está conectada con
el medio ambiente mediante una compuerta a presión. Tanto en el
aislador como en la cámara de trabajo hay una presión baja en
comparación con la presión del medio ambiente, siendo la presión en
el aislador menor que la presión en la cámara de trabajo. En la
compuerta a presión hay una sobrepresión con respecto a la presión
ambiente. El aislador contiene por lo menos un fermentador en el
que se produce por fermentación el material biológico activo.
Usando el aparato de la presente invención, el
material biológico activo se produce y/o procesa en el aislador. En
la presente memoria, el aislador es un sistema definido hermético
con respecto a su entorno y que está en intercambio energético con
éste pero que no permite un transporte incontrolado de material con
su entorno. Un transporte controlado de material con su entorno,
por ejemplo, la carga o retirada respectivas de equipo, reactivos,
material de partida, productos intermedios y productos finales,
puede ser proporcionado por una o más compuertas, recipiente de
separador doble, esto es, las denominadas lumbreras \beta
relacionadas con recipientes \alpha o con bolsas \alpha. Es
posible el transporte controlado de material antes, durante y
después de la fermentación y/o purificación del producto de la
fermentación o del material biológico activo.
El aislador puede funcionar a presión alta o
baja regulada por equipos apropiados. También es posible generar en
el aislador una atmósfera de gas inerte. El aislador funciona
típicamente con uno o más conductos de entrada de aire y conductos
de salida de aire, equipados típicamente con filtros. Así, se puede
conseguir en el aislador un número de gérmenes preferiblemente menor
que 100, más preferiblemente menor que 10 y lo más preferiblemente
menor que 1 germen/m^{3}. Estos filtros son conocidos por los
expertos en la técnica. Un ejemplo de filtro es un filtro HEPA
[High Efficiency Particulate Filter (filtro de partículas de
alta eficiencia)].
El equipo, aparatos y objetos situados en el
aislador pueden ser movidos u operados desde el exterior mediante
un sistema de control o mediante entradas de guantes acopladas al
aislador que se acciona desde la cámara de trabajo.
Preferiblemente el aislador es total o
parcialmente de un material inerte biológicamente y fácil de
limpiar y que puede ser descontaminado o esterilizado in
situ, respectivamente. Por lo tanto se prefiere un material que
pueda ser esterilizado por formol, óxido de etileno o peróxido de
hidrógeno gaseoso. Estos materiales incluyen, por ejemplo, vidrio,
acero inoxidable o polímeros, como poli(cloruro de vinilo).
Preferiblemente el aislador se fabrica de modo que su superficie
interior sea total o parcialmente de vidrio, acero inoxidable u
otro material apropiado, como polímeros. Así, se pueden usar
polímeros duros y blandos (aisladores de paredes duras y blandas).
Los guantes son típicamente de neopreno, Hypalon®, vinilo u otros
materiales adecuados.
Típicamente el aislador dispone de una
instalación de control y regulación de la temperatura.
De acuerdo con la presente invención, el
aislador está situado en una cámara de trabajo. Hay un gradiente de
presión entre el aislador y la cámara de trabajo. Por lo tanto, en
el aislador existe una presión menor que en la cámara de trabajo
que, a su vez, está a una presión menor que la presión ambiente. La
presión ambiente es 101.325 Pa, aunque puede variar dependiendo de
la situación geográfica y de las condiciones metereológicas.
Típicamente la presión operativa en el aislador
es una presión baja, en el intervalo de 20 a 200 Pa,
preferiblemente en el intervalo de 40 a 100 Pa y lo más
preferiblemente en el intervalo de 55 a 75 Pa, respectivamente, en
comparación con la presión ambiente (101.325 Pa).
Usualmente la presión operativa en el aislador
es aproximadamente 10 a 100, preferiblemente 20 a 80, más
preferiblemente aproximadamente 40 a 60 Pa menor que la existente
en la cámara de trabajo.
En una realización de la invención, el valor
típico de la diferencia de presión entre el aislador y la cámara de
trabajo, con fluctuaciones metrológicas y dependientes del equipo,
está en el intervalo de 35 a 57 Pa y preferiblemente es
aproximadamente 45 Pa, esto es, la presión en el aislador es
respectivamente aproximadamente 35 a 57 o aproximadamente 45 Pa
menor que la existente en la cámara de trabajo.
La entrada y salida de aire del aislador se
realiza preferiblemente a través de filtros, de modo que en el
aislador hay como máximo un número de gérmenes de 100,
preferiblemente de 10 y lo más preferiblemente de 1
germen/m^{3}.
La cámara de trabajo de la presente invención es
un sistema sellado hermético que, por un lado, está conectado
herméticamente con el aislador con el fin de intercambiar materia o
equipo a través de una o más aberturas bloqueables. Por otro lado,
está conectada para el intercambio y/o adquisición de materia o
equipo a través de por lo menos una compuerta a presión bloqueable
de manera hermética. La cámara de trabajo rodea o linda con el
aislador. La entrada y salida de aire de la cámara de trabajo se
realiza preferiblemente a través de filtros, de modo que en la
cámara de trabajo predomina como máximo un número de gérmenes de
200, preferiblemente de 100 y lo más preferiblemente de 10
gérmenes/m^{3}. Hay disponibles comercialmente estos filtros, por
ejemplo, bajo el nombre de filtros
HEPA.
HEPA.
La cámara de trabajo está preferiblemente a una
temperatura de aproximadamente 19 a 26ºC y a una humedad relativa
de 40 a 60%. El primer y el segundo aislador están,
independientemente uno del otro, a una temperatura y humedad
relativa común y adecuada para la producción y purificación del
material biológico activo.
En la cámara de trabajo hay una presión
operativa mayor que la existente en el aislador, pero existe un
gradiente de presión con respecto a la presión ambiente y a la
compuerta a presión.
Típicamente la presión en la cámara de trabajo
es 5 a 50, preferiblemente 10 a 30 y lo más preferiblemente 12 a 18
Pa menor que la presión ambiente.
En una realización de la presente invención, un
valor típico de la diferencia de presión, con fluctuaciones
metrológicas y dependientes del equipo, es 15 Pa con respecto a la
presión ambiente, esto es, la presión en la cámara de trabajo es
aproximadamente 15 Pa menor que la presión ambiente.
La cámara de trabajo está conectada al medio
circundante mediante por lo menos una compuerta a presión
bloqueable. En la compuerta hay una sobrepresión de 10 a 100 Pa,
preferiblemente de 20 a 80 Pa y lo más preferiblemente de 25 a 35
Pa, con respecto a la presión ambiente.
Generalmente entre la compuerta a presión y la
cámara de trabajo existe una diferencia de presión de 10 a 200 Pa,
preferiblemente de 20 a 100 Pa y lo más preferiblemente de 40 a 60
Pa.
En una realización de la presente invención, un
valor típico de la diferencia de presión entre la compuerta a
presión y la cámara de trabajo, con fluctuaciones metrológicas y
dependientes del equipo, es 90 Pa, esto es, la presión de trabajo en
el aislador es aproximadamente 90 Pa menor que la existente en la
compuerta a presión.
En una realización particularmente preferida, el
aparato de la presente invención comprende por lo menos otro
aislador. Este otro aislador puede estar situado en la misma cámara
de trabajo que el primer aislador o puede estar adyacente a la misma
cámara de trabajo y también puede estar conectado herméticamente al
primer aislador, por ejemplo, mediante una o más compuertas
bloqueables, recipiente de separador doble o lumbreras. Sin embargo,
los aisladores también pueden estar no conectados entre sí. Este
otro aislador tiene preferiblemente las mismas características que
el primer aislador antes descrito.
En el aislador de la presente invención se
realiza típicamente una etapa de fermentación, que preferiblemente
es una etapa de fermentación en la que se produce el material
biológico activo. Preferiblemente esta etapa de fermentación incluye
una o más inoculaciones. Así, el aislador de la presente invención
contiene por lo menos un fermen-
tador.
tador.
Típicamente en el aislador también se pueden
realizar una o más etapas de operaciones necesarias para la
purificación del material biológico activo. Por lo tanto, la
fermentación y purificación se pueden realizar en el mismo aislador
o también en aisladores diferentes, por ejemplo, la fermentación en
el primer aislador y la purificación en el segundo aislador.
La etapa de fermentación relacionada con la
síntesis del material biológico activo se realiza en un
fermentador. El fermentador se puede seleccionar de fermentadores
anaerobios y fermentadores aerobios. El fermentador se construye y
equipa de acuerdo con las condiciones particulares de la
fermentación y de acuerdo con los conocimientos de los expertos en
la técnica. El fermentador puede ser un fermentador discontinuo,
semicontinuo o continuo. Preferiblemente es un fermentador
discontinuo.
La etapa de fermentación también puede
comprender un precultivo o cultivo inicial a inocular al
fermentador principal. Las diferentes operaciones y equipos
correspondientes que se requieren para este fin son conocidos por
los expertos en la técnica y comprenden, entre otros, uno o más
fermentadores que permiten una primera y/o una segunda expansión
del material de vacuna de la cepa productora del material biológico
activo. Las operaciones asociadas comprenden también, por ejemplo,
establecimiento de un banco de células de trabajo, primera expansión
de las células, segunda expansión de las células y la etapa real de
fermentación, considerando que, en particular, la etapa real de
fermentación significa la síntesis del compuesto biológico activo.
Estas etapas se realizan preferiblemente a la temperatura o
gradiente de temperatura definido para el organismo productor
respectivo. Por lo tanto, si fuera aplicable, se debe adaptar de
modo continuo o discontinuo la temperatura a las condiciones de
producción.
Si es posible, la etapa o etapas de operaciones
necesarias para la purificación del material biológico activo se
realizan en el aislador. En consecuencia, el aislador contiene el
equipo necesario para ello.
La purificación del material biológico activo
también se puede realizar en un segundo aislador del aparato de la
presente invención. Como sólo una parte de las operaciones de
purificación se realizan en el segundo aislador, el resto de las
operaciones necesarias se realizan en el primer aislador o en uno o
más aisladores adicionales.
Ciertas operaciones necesarias o relacionadas
con la producción del material biológico activo también se pueden
realizar fuera del aislador, en particular si no están asociadas
con formación de aerosoles o si el material biológico activo está
disponible en una forma o en un recipiente que se supone no
peligroso para las personas encargadas de la producción u operación
o para el medio ambiente.
En cuanto a la fermentación que genera el
material biológico activo, es preferiblemente una fermentación de
bacterias, en particular una fermentación de bacterias de la
familia del Clostridium botulinum. Esto también es aplicable
a cepas recombinantes o modificadas genéticamente de Clostridium
botulinum así como a otros sistemas de expresión heteróloga
recombinante o modificada genéticamente (por ejemplo, E.
coli).
Usando el equipo instalado, se pueden producir
en principio todos los compuestos biológicos activos, en particular
proteínas, que pueden ser sintetizados mediante desarrollo
fermentativo de microorganismos.
El compuesto biológico activo que se puede
producir usando el proceso de fermentación es preferiblemente una
toxina, más preferiblemente una toxina botulínica y lo más
preferiblemente una neurotoxina botulínica.
La toxina botulínica es producida por la
bacteria Clostridium botulinum y existe en diferentes
serotipos: toxina botulínica de tipo A, B, C, D, E, F y G. La
toxina botulínica producida por Clostridium botulinum es un
complejo de la neurotoxina botulínica, esto es, la proteína
responsable del efecto tóxico, y proteínas complejantes que, como
tales, no son tóxicas. Estas proteínas son hemoaglutininas con
diferentes masas moleculares así como por lo menos una proteína no
hemoaglutinante. Los complejos de la neurotoxina botulínica y las
proteínas complejantes (bacterianas) se denominan en general
toxinas botulínicas. Los complejos de los tipos A, B y C están
disponibles comercialmente, por ejemplo, BOTOX® (complejo del tipo
A). Estos complejos permiten ser procesados adicionalmente para dar
complejos de diferente composición proteínica y pureza hasta la
propia neurotoxina botulínica. Por lo tanto, dentro del alcance de
la presente invención se usa el término "neurotoxina
botulínica" para describir la proteína responsable del efecto
tóxico, esto es, la toxina botulínica ultrapura exenta de proteínas
bacterianas complejantes. La toxina botulínica del tipo A tiene una
masa molecular de aproximadamente 150 kDa y se comercializa bajo el
nombre comercial XEOMIN®.
Elegibles dentro del alcance de la presente
invención son todas las formas de la "toxina botulínica",
especialmente los diferentes serotipos, los diferentes complejos de
neurotoxina botulínica y proteínas complejantes, la propia
neurotoxina botulínica así como toxinas o neurotoxinas botulínicas
modificadas o recombinantes producidas, incluidas las
correspondientes mutaciones, deleciones, etc. En cuanto a mutantes
apropiados, se hace referencia a los mutantes descritos en la
solicitud de patente internacional WO 2006/027207 A1. Además,
también es posible dentro del alcance de la presente invención
producir mezclas de diferentes serotipos (en forma complejada,
ultrapura y/o recombinante), por ejemplo, mezclas de toxinas
botulínicas de los tipos A y B o mezclas de neurotoxinas de los
tipos A y B.
La producción de neurotoxina botulínica de los
tipos A y B se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente
internacional WO 00/74703. Como resultado de las características de
carencia práctica de inmunogenicidad de la neurotoxina botulínica
(aislada), características ventajosas con respecto a las de
complejos de neurotoxina botulínica y proteínas complejantes, hay
en particular una tremenda necesidad de proporcionar aparatos y
procesos para la producción industrial segura y fiable de
neurotoxina botulínica, como hace la presente invención.
La selección y/o el número exacto de aisladores
usados podrán ser determinados fácilmente por lo expertos en la
técnica, dependiendo del compuesto biológico a producir. En la
purificación que se describe en la presente memoria con más detalle
se usan ventajosamente por lo menos dos aisladores. Así, los
aisladores varían particularmente en cuanto a la temperatura que
predomina en ellos o en una porción de ellos. Así, dentro del
alcance de la presente invención se prefiere que el primer aislador
funcione a una temperatura mayor, por ejemplo, de aproximadamente
20 a 50ºC, y que el segundo aislador funcione a una temperatura
menor, por ejemplo, en el intervalo de -5 a +25ºC. Así, en el
primer aislador se realizan las etapas de producción y purificación
que necesitan una temperatura adecuada mayor o que pueden
realizarse a esta temperatura. Estas etapas incluyen especialmente
la inoculación, la fermentación y/o la precipitación de la cepa
productora. Por el contrario, en el segundo aislador se realizan
las etapas del proceso de producción, y especialmente de
purificación de la neurotoxina, que necesitan una temperatura
adecuada menor y que se pueden realizar de una manera especialmente
beneficiosa en este intervalo de temperatura.
También se debe apreciar que las etapas de
producción en general y de fermentación y purificación en
particular que se pueden realizar en ambos intervalos de
temperatura y, por lo tanto, en cada uno de los dos aisladores, se
realizan finalmente en el aislador que sea ventajoso dadas sus
dimensiones y consumo de energía como resultado del
dimensionamiento para el mantenimiento de las condiciones
apropiadas de la reacción para la realización de las etapas de
reacción, especialmente la temperatura, o dada la facilidad de
manejo o viabilidad de las operaciones individuales.
El segundo aislador es en principio de
construcción similar al primer aislador pero va provisto de
instalaciones y equipo o características técnicas del equipo de
acuerdo con el aparato que se requieran para la realización de las
etapas de purificación planificadas en el segundo aislador o para
las operaciones de éste. Así, las etapas de purificación preferidas
que se realizan en el segundo aislador se seleccionan del grupo que
comprende precipitación, extracción, centrifugación, diálisis y
cromatografía. De acuerdo con esto, el segundo aislador incluye uno
o más equipos de precipitación, equipos de extracción, equipos de
centrifugación, equipos de diálisis y/o equipos de cromatografía.
Preferiblemente, el equipo de precipitación comprende un reactor en
el que está contenida la solución que produce la precipitación y
equipado con una tubería de alimentación para añadir el compuesto o
compuestos requeridos para la precipitación. Además, el equipo de
precipitación comprende básicamente medios para retirar el líquido
sobrenadante y el precipitado. Los expertos en la técnica conocen
equipos adecuados. El equipo de extracción comprende típicamente un
reactor en el que está contenida la solución para la extracción,
una tubería de alimentación para añadir el medio extractor y un
dispositivo para separar del fluido extractor el fluido que contiene
el extracto. El equipo de centrifugación comprende típicamente una
centrifuga para separar mezclas de sólido-sólido o
mezclas de líquido-sólido. El equipo de
cromatografía comprende una columna de cromatografía rellena con un
material de cromatografía y una entrada y salida y recipientes con
medios apropiados para la alimentación a la columna de
cromatografía y para el eluato. La cromatografía usada es, por
ejemplo, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) o cromatografía de afinidad.
Así, está dentro del alcance de la presente
invención que, si se usan dos o más aisladores, estos están
conectados entre sí de tal manera que simplemente la totalidad del
aparato que comprende los dos aisladores comprende un conducto de
entrada de aire y un conducto de salida de aire y que los dos
aisladores están conectados por uno o más conductos intermedios. Por
lo tanto, también está dentro del alcance de la presente invención
que el primer aislador así como el segundo aislador y/o cualquier
otro aislador adicional comprenden en cada caso e independientemente
uno del otro un conducto de entrada de aire y un conducto de salida
de aire.
El primer y el segundo aislador tienen
preferiblemente una presión interna menor que la presión externa.
Al mismo tiempo, está dentro del alcance de la presente invención
que los dos aisladores tengan una presión interna idéntica. Sin
embargo, también está dentro del alcance de la presente invención
que los dos aisladores tengan presiones internas diferentes. Por lo
tanto, se prefiere especialmente reducir la presión interna del
aislador en el que la probabilidad de formación de aerosoles sea
mayor debido a las etapas del proceso que se realizan en el
aislador respectivo.
Si se usan dos aisladores, es ventajoso disponer
de una conexión entre los aisladores en forma de paso, por ejemplo,
en forma de compuerta, porque asegura que la transferencia del
material producido y purificado a las diferentes etapas de
producción y procesamiento se pueda realizar sin romper la barrera
construida por el aislador. El diseño del aparato y de cada
aislador o por lo menos de un aislador del aparato de la presente
invención con un dispositivo de esterilización cumple básicamente
el mismo objetivo. Dispositivos de esterilización similares son
conocidos por los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo,
un generador de peróxido de hidrógeno gaseoso. Por lo tanto, el uso
de peróxido de hidrógeno gaseoso es especialmente beneficioso dadas
las condiciones de subpresión.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un proceso para la producción fermentativa de un
compuesto biológico activo, en el que el proceso comprende una
etapa de fermentación para la producción del compuesto biológico
activo y una etapa de purificación del compuesto biológico activo,
en el que la producción fermentativa y/o la purificación se
realizan total o parcialmente en uno o más aisladores.
Preferiblemente la etapa de fermentación y una o más partes de la
purificación se realizan en un primer aislador y una o más partes de
la purificación se realizan en un segundo aislador. Preferiblemente
esta etapa se realiza manualmente. También está dentro del alcance
de la presente invención usar aisladores adicionales. El material
biológico activo se refiere preferiblemente a una toxina botulínica,
especialmente una neurotoxina botulínica, como la descrita en la
presente memoria. Las características que se describen en relación
con la presente invención presentan también características, solas
o en cualquier combinación del proceso de la presente
invención.
Operaciones relacionadas con el trabajo son
centrifugación, diálisis, extracción, precipitación, precipitación
por sulfato de protamina, precipitación por sulfato amónico,
solubilización de precipitados que se producen generalmente en
forma de gránulos, etapas o procesos de cromatografía y filtración.
En cuanto al proceso de cromatografía, éste es una sucesión de
varios procesos individuales de cromatografía. Así, en cada caso,
puede ser el mismo proceso de cromatografía o diferentes procesos
de cromatografía. En el caso de que el compuesto farmacéutico
activo sea una neurotoxina del tipo A, es una sucesión de tres
etapas de cromatografía usando la columna apropiada. Por lo tanto,
es posible y preferible que el eluato particular sufra una diálisis
antes de aplicarlo a la siguiente columna.
Después de la fermentación real y de separar del
medio de fermentación las células, el medio de fermentación se
somete a una primera precipitación con el objetivo de eliminar
proteínas grandes. La precipitación se realiza preferiblemente en
el primer aislador. La centrifugación del precipitado obtenido de
esta manera se realiza preferiblemente en el segundo aislador. La
precipitación es preferiblemente precipitación por un ácido. Las
condiciones de la reacción de esta precipitación por un ácido son
conocidas por los expertos en la técnica. Típicamente se usa
H_{2}SO_{4} 3N para acidificar el líquido sobrenadante hasta un
pH de 3,5. La centrifugación se realiza usualmente durante 20
minutos a 2.400 g y 4ºC. Los gránulos obtenidos por centrifugación
se lavan con agua, preferiblemente varias veces.
La cepa de Clostridium usada
preferiblemente es C. botulinum tipo A, que se almacena en
un medio adecuado a temperaturas que garanticen su estabilidad. Para
la fermentación se usa el proceso descrito por B. R. DasGupta et
al. en Toxicon, vol. 22, núm. 3, pág. 414-424
(1984). Por lo tanto, se añaden 0,5% de extracto de levadura y 0,6%
de pasta de levadura calentada en un autoclave a 2% de medio tipo A
de amina N-Z, se ajusta el pH a 7,2 con ayuda de
NaOH 4N y el medio así preparado se calienta después en un
autoclave. A este medio se añade glucosa calentada por separado en
un autoclave (20% referido a peso/volumen) para obtener una
concentración final de glucosa de 0,5% en el medio. La incubación se
realiza a 37ºC sin agitar y la fermentación se detiene después de
96 horas. Está dentro del alcance de la presente invención que,
además de la fermentación discontinua antes descrita, se pueda
realizar una fermentación semicontinua, una fermentación
discontinua repetida o una fermentación continua. Las operaciones
requeridas para este fin y los requisitos relativos al aparato son
conocidos por los expertos en la técnica.
En una etapa adicional se disuelven de nuevo los
gránulos precipitados, con el objetivo de liberar de los gránulos
la toxina. Las operaciones para realizar esto son conocidas por los
expertos en la técnica y se describen, entre otros, por B. R.
DasGupta et al. Por ejemplo, se puede realizar durante una
hora una extracción con tampón de ácido cítrico
0,1M-citrato trisódico (pH 5,5). Después de esta
extracción, se realiza una etapa de centrifugación, usualmente
durante 20 minutos a 9.800 g y 4ºC. Los gránulos así obtenidos
pueden ser extraídos opcionalmente como se ha descrito
anteriormente. El líquido sobrenadante de la extracción, o los dos
líquidos sobrenadantes en caso de repetir la extracción, se someten
después a una precipitación por sulfato de protamina. Se deja que
la precipitación se realice durante una noche a 8ºC. En la etapa de
precipitación por sulfato de protamina, se separa especialmente
DNA.
El líquido sobrenadante obtenido después de la
centrifugación se somete a una precipitación por sulfato amónico,
en el primer aislador o en el segundo aislador, con lo que se
separan otras proteínas grandes. Después de la etapa de
precipitación por sulfato amónico, se realiza otra etapa de
centrifugación y posteriormente los gránulos así obtenidos se
vuelven a disolver y a someter opcionalmente a una diálisis. El
extracto obtenido por centrifugación y sometido posteriormente a
diálisis se centrifuga de nuevo y se somete a una sucesión de
etapas de cromatografía con el objetivo de purificar la neurotoxina
botulínica, especialmente para purificarla hasta que sea homogénea.
Cada una de las etapas de cromatografía sirve para separar el
sulfato de protamina, DNA remanente, partes de proteínas más
pequeñas y proteínas de tamaño medio así como las hemoaglutininas y
el complejo de neurotoxina botulínica-proteína
complejante. Para este fin, en una realización preferida se realiza
una sucesión de varias etapas de cromatografía. Después se filtra el
eluato. La filtración sirve para reducir los gérmenes del eluato
con lo que se obtiene un producto que contiene preferiblemente la
neurotoxina botulínica pura, sin proteína complejante.
Opcionalmente el eluato se puede diluir antes de la filtración y, en
consecuencia, se pueden añadir adyuvantes adecuados.
Durante etapas adicionales se realiza otra
filtración esterilizante después de añadir los adyuvantes. Por lo
tanto, la filtración tiene lugar en reactores que después se
someten a una liofilización, preferiblemente en una etapa distinta
del proceso. El producto liofilizado de esta manera se envasa en un
recipiente cerrado herméticamente.
Los expertos en la técnica deben apreciar que
antes de la inoculación así como después de diferentes etapas del
proceso, especialmente después de la precipitación por sulfato
amónico y la filtración en el primer recipiente, éste se somete a
una descontaminación y, en consecuencia, a una esterilización. La
esterilización se realiza preferiblemente mediante peróxido de
hidrógeno gaseoso.
Las características de la invención descrita en
la memoria precedente y en las reivindicaciones adjuntas pueden ser
esenciales para la puesta en práctica de la invención en sus
diferentes realizaciones, solas o en cualquier combinación.
Claims (28)
1. Aparato para la producción fermentativa de un
compuesto biológico, caracterizado porque el citado aparato
comprende por lo menos un primer aislador que contiene un
fermentador y está rodeado por una cámara de trabajo, en el que la
citada cámara de trabajo está conectada al medio ambiente mediante
una compuerta a presión, en el que existe una presión baja en el
aislador y en la cámara de trabajo, en el que la presión (con
respecto a la presión ambiente) en el aislador es menor que la
presión (con respecto a la presión ambiente) en la cámara de trabajo
y en el que existe una sobrepresión (con respecto a la presión
ambiente) en la compuerta a presión.
2. El aparato de acuerdo con la reivindicación
1, en el que la presión en el aislador es 20 a 200 Pa menor que la
presión ambiente.
3. El aparato de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, en el que la presión en el aislador es 5 a
50 Pa menor que la presión ambiente.
4. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la presión en la compuerta a
presión es 10 a 100 Pa mayor que la presión ambiente.
5. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el citado
aparato comprende por lo menos un segundo aislador, en el que el
citado segundo aislador preferiblemente no contiene un
fermentador.
6. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el aparato y/o
el primer aislador y/o el segundo aislador comprenden por lo menos
un conducto de entrada de aire y un conducto de salida de aire, en
el que el conducto de entrada de aire y el conducto de salida de
aire van provistos de un filtro y en el que el citado filtro es
preferiblemente un filtro HEPA.
7. El aparato de acuerdo con las
reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque la presión
interna del primer aislador es igual a la presión interna del
segundo aislador.
8. El aparato de acuerdo con las
reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque la presión
interna del primer aislador es diferente a la presión interna del
segundo aislador.
9. El aparato de acuerdo con uno de las
reivindicaciones 5 a 8, caracterizado porque el primer y el
segundo aislador están conectados entre sí mediante un paso, en el
que el citado paso permite el transporte de material desde el primer
aislador al segundo aislador y preferiblemente permite también el
transporte de material desde el segundo aislador al primer
aislador.
10. El aparato de acuerdo con la reivindicación
9, caracterizado porque el paso es una compuerta.
11. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el aparato
comprende un equipo de esterilización y/o un equipo de
desinfección.
12. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el primer
aislador comprende un fermentador de funcionamiento anaerobio.
13. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el primer
aislador comprende un equipo de precipitación.
14. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el primer
aislador comprende un equipo de filtración.
15. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 5 a 14, caracterizado porque el segundo
aislador comprende un equipo de extracción.
16. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 5 a 15, caracterizado porque el segundo
aislador comprende un equipo de precipitación.
17. El aparato de acuerdo con una de las
reivindicaciones 5 a 16, caracterizado porque el segundo
aislador comprende por lo menos un equipo de cromatografía.
18. Un proceso para la producción fermentativa
de un compuesto biológico activo, que comprende:
- -
- una etapa de fermentación para la producción del compuesto biológico activo y
- -
- una etapa de purificación del compuesto biológico activo, en el que el proceso se realiza en el aparato de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 17.
19. El proceso de acuerdo con la reivindicación
18, caracterizado porque el compuesto biológico activo es
una toxina u otra proteína obtenida por fermentación,
preferiblemente una toxina botulínica, más preferiblemente una
neurotoxina botulínica.
20. El proceso de acuerdo con la reivindicación
19, caracterizado porque la toxina botulínica es una toxina
botulínica que pertenece a Clostridium botulinum de los
tipos A, B, C, D, E, F y G o es una mezcla de dos o más de estos
tipos, preferiblemente una toxina botulínica del tipo A.
21. El proceso de acuerdo con la reivindicación
20, caracterizado porque la toxina botulínica o la mezcla de
toxinas botulínicas es una neurotoxina botulínica o una composición
de neurotoxinas botulínicas.
22. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque la etapa de
fermentación se realiza en el primer aislador y la (etapa de)
purificación se realiza total o parcialmente en el segundo
aislador.
23. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 18 a 22, caracterizado porque la etapa de
fermentación y una parte de la purificación se realizan en el
primer aislador y otra parte de la (etapa de) purificación se
realiza en el segundo aislador.
24. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 18 a 23, caracterizado porque la etapa de
fermentación y la precipitación y filtración del producto de la
etapa de fermentación se realizan en el primer aislador como parte
de la (etapa de) purificación.
25. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 18 a 24, caracterizado porque el primer
aislador y el segundo aislador funcionan a la misma temperatura o a
temperaturas diferentes.
26. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 18 a 25, caracterizado porque la
temperatura en el primer aislador y/o en el segundo aislador pueden
cambiar, dependiendo de cada etapa del proceso.
27. El proceso de acuerdo con la reivindicación
26, caracterizado porque la temperatura en el primer
aislador está en el intervalo de aproximadamente 20 a
aproximadamente 50ºC y la temperatura en el segundo aislador está en
el intervalo de aproximadamente -5 a aproximadamente +25ºC.
28. El proceso de acuerdo con una de las
reivindicaciones 18 a 27, caracterizado porque el proceso
comprende las etapas siguientes, preferiblemente en el orden
siguiente:
(a) en el primer aislador:
- -
- inocular, de preferencia manualmente, el medio de fermentación con la cepa productora del compuesto biológico activo,
- -
- fermentar la cepa productora,
- -
- separar de las células de la cepa productora el líquido sobrenadante, y
- -
- precipitar el líquido sobrenadante;
(b) en el segundo aislador:
- -
- centrifugar el líquido sobrenadante precipitado, para obtener unos gránulos,
- -
- extraer los gránulos, centrifugando y recogiendo el líquido sobrenadante,
- -
- precipitar el líquido sobrenadante y centrifugarlo posteriormente para obtener un líquido sobrenadante;
(c) en el primer o en el segundo aislador:
- -
- precipitar el líquido sobrenadante,
- -
- centrifugar el precipitado,
- -
- solubilizar los gránulos obtenidos por centrifugación del precipitado,
- -
- dializar los gránulos solubilizados y centrifugar el dializado,
- -
- realizar una cromatografía del dializado, y
- -
- filtrar el eluato obtenido.
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