EA012052B1 - Устройство и способ для ферментативного получения биологически активных соединений - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к способу и устройству для ферментативного получения биологически активных материалов, причем ферментер находится в изоляторе, который, в свою очередь, находится в рабочей камере или граничит с ней, причем как в изоляторе, так и в рабочей камере преобладает перепад давления относительно давления окружающей среды.

Description

Данное изобретение относится к способу и устройству для ферментативного получения биологически активных веществ, в котором ферментер находится в изоляторе, который, в свою очередь, находится в рабочей камере или граничит с рабочей камерой, причем как в изоляторе, так и в рабочей камере имеется перепад давления относительно давления окружающей среды.

Работа с биологически активными соединениями требует повышенных мер безопасности в их получении для предохранения сотрудников от возможных опасностей или отравлений.

Биологически активные соединения часто получают или применяют для фармацевтических целей, вследствие чего, в частности, в получении должны удовлетворяться высокие требования чистоты. Обычная конструкция установок для получения веществ высокой чистоты состоит из первой, внутренней камеры, которая закрыта наружу и которая окружена второй камерой. Во второй камере находятся работающие с этим биологическим материалом лица, в то время как обработка биологического материала имеет место в основном в первой камере. Обе камеры связаны одна с другой герметично закрывающимися шлюзами. Первая камера обычно является камерой с вмонтированными перчатками, так что стадии процесса могут проводиться с использованием перчаток из второй камеры. Вторая камера обычно герметично изолирована от окружающей среды, но связана с ней посредством герметично закрываемых шлюзов. В обеих камерах преобладают идеально стерильные условия или условия чистого помещения. Для предотвращения загрязнения биологически активного материала частицами окружающей среды, микробиологическими организмами и т.п. в первой камере преобладает избыточное давление, обычно давление 15 Па. Во второй камере, напротив, преобладает пониженное давление относительно первой камеры, однако избыточное давление относительно окружающей среды. Это препятствует проникновению частичек или микробов из второй камеры в первую камеру. Таким образом, биологически активный материал защищен от загрязнений из окружающей среды.

В случае получения биологически активных соединений ферментационным способом имеются стадии процесса, которые проводят в открытой по меньшей мере кратковременно аппаратуре. Подобной стадией процесса является, например, инокуляция (внесение посевного материала). Эта стадия большей частью должна проводиться вручную. В процессе, в котором устройство (сосуд, флакон) с исходным материалом (банк клеток) - пусть даже кратковременно открывают, может произойти образование аэрозоля. Это относится также к промежуточным ступеням стадий предварительного культивирования до начала ферментации. В это время присоединительный элемент ферментера - хоть и кратковременно открывают, благодаря чему может также произойти образование аэрозоля. Возможно также, что при переработке продукта ферментации, который является биологически активным веществом, происходит образование аэрозоля. При этом для окружающей среды существует опасность подвергнуться действию микробов, бактерий или токсических веществ. Вследствие пониженного давления во второй камере относительно первой камеры аэрозоли могут проникнуть из первой камеры во вторую камеру, что может привести к возникновению опасности для работающих во второй камере лиц. Чтобы, несмотря на это гарантировать безопасность работы, в этом случае должны быть предприняты дополнительные меры безопасности, такие как, например, прививка рабочего персонала, ношение защитных костюмов и т. д.

Поэтому существует потребность в способе и устройстве, при помощи которых биологически активные материалы могут быть получены посредством ферментации, причем эти материалы защищены от загрязнения из окружающей среды и одновременно уменьшается или полностью предотвращается действие аэрозолей на персонал.

Эта задача решена согласно данному изобретению при помощи устройства и способа в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.

Данное изобретение относится к устройству и способу для получения биологически активных веществ посредством ферментации, предпочтительно в высокоочищенной форме, причем загрязнение биологического материала частицами и микробами окружающей среды предотвращается и одновременно уменьшается возможность возникновения опасности для работающего с этим биологическим материалом персонала. Предпочтительно, способ ферментации содержит по меньшей мере одну стадию инокуляции. В частности, способ ферментации содержит по меньшей мере одну проводимую вручную стадию и, особенно предпочтительно, этой стадией является стадия инокуляции.

Способ согласно изобретению и применяемое для него устройство позволяют применять надежные способы получения и очистки, которые связаны или могут быть связаны с образованием аэрозоля, без вызывания при этом существенной опасности для лиц, которым поручен процесс получения и/или переработки, или для окружающей среды. Другими словами, устройство согласно данному изобретению и способ согласно данному изобретению уменьшают действие биологически активного материала, бактерий и/или микробов на лиц, имеющих дело с получением, уменьшают действие биологически активного материала, бактерий и/или микробов на окружающую среду и позволяют одновременно применять установленные способы, которые делают возможными эффективное получение и эффективную очистку биологического материала, хотя они в принципе связаны с образованием аэрозоля.

Устройство согласно данному изобретению содержит по меньшей мере одну изоляционную камеру (изолятор), которая окружена рабочей камерой или граничит с ней. Рабочая камера связана с окружающей средой посредством переходного шлюза. Как в изоляторе, так и в рабочей камере преобладает по

- 1 012052 ниженное давление в сравнении с давлением окружающей среды, причем давление в изоляторе является меньшим, чем давление в рабочей камере. В переходном шлюзе преобладает избыточное давление относительно давления окружающей среды. Изолятор содержит при этом по меньшей мере один ферментер, в котором посредством ферментации образуется биологически активный материал.

В устройстве согласно данному изобретению в изоляторе получается и/или перерабатывается биологически активный материал. Изолятор, применяемый здесь, является при этом воздухонепроницаемой (герметичной), отделенной от окружающей среды системой, которая в принципе находится в энергетическом обмене с окружающей его средой, но не допускает никакого неконтролируемого переноса вещества из среды. Контролируемый транспорт веществ со средой, например, загрузка или извлечение приборов, реагентов, исходных материалов, промежуточных продуктов и конечных продуктов, может производиться через один или несколько шлюзов, при помощи сосудов с двумя клапанами, через так называемые βотверстия в соединении с α-контейнерами или α-мешками. Контролируемый перенос веществ возможен до, во время или после ферментации и/или очистки продукта ферментации или биологически активного материала.

Изолятор, регулируемый посредством подходящих приспособлений, может эксплуатироваться при избыточном или пониженном давлении. Можно также создать в изоляторе атмосферу инертного газа. Обычно изолятор имеет один или несколько трубопроводов подачи воздуха и удаления воздуха, причем они обычно обеспечены фильтрами. Посредством этого в изоляторе предпочтительно достигается микробное число, меньше чем 100, предпочтительно меньше чем 10 и наиболее предпочтительно меньше чем 1 микроб/м³. Подобные фильтры известны специалисту. Одним примером подобного фильтра являются фильтры НЕРА (высокоэффективные в отношении присутствия частиц в воздухе).

Находящиеся в изоляторе устройства, аппаратура или предметы могут приводиться в действие, передвигаться или обслуживаться управлением снаружи или посредством находящихся на изоляторе изолированных отверстий для перчаток.

Изолятор изготовлен полностью или частично из материала, который является биологически инертным и легко очищается или допускает деконтаминацию или стерилизацию ίη зйи. При этом предпочтительным является материал, который, в частности, допускает стерилизацию формалином, этиленоксидом или парообразным пероксидом водорода (МНР). Подобными материалами являются, например, стекло, нержавеющая сталь или синтетические (полимерные) материалы (пластмассы), такие как, например, поливинилхлорид (РУС). Предпочтительно, изолятор изготовлен таким образом, что его внутренняя сторона полностью или частично состоит из стекла и/или нержавеющей стали или других подходящих материалов, например, синтетических материалов. При этом могут использоваться как жесткие, так и мягкие синтетические материалы (изоляторы с жесткой стенкой и мягкой стенкой). Перчатки обычно изготовлены из неопрена, гипалона, винила или других подходящих материалов.

Обычно изолятор имеет приспособление для контроля и регуляции температуры.

Изолятор находится обычно в рабочей камере или граничит с рабочей камерой. Между изолятором и рабочей камерой существует перепад давления. В изоляторе при этом преобладает меньшее давление, чем в рабочей камере, которая, в свою очередь, обнаруживает меньшее давление, чем давление окружающей среды. Давление окружающей среды составляет 101325 Па, но может варьироваться в зависимости от географического положения или метеорологических условий.

Обычно рабочее давление в изоляторе является пониженным давлением 20-200 Па, предпочтительно 40-100 Па и, наиболее предпочтительно 55-75 Па, причем пониженное давление принимается относительно давления окружающей среды (101325 Па). Обычно рабочим давлением в изоляторе является пониженное давление на приблизительно 10-100, предпочтительно на 20-100, особенно предпочтительно приблизительно на 40-60 Па меньше, чем в рабочей камере.

В одном варианте осуществления данного изобретения, типичный показатель перепада давлений между изолятором и рабочей камерой равен, в пределах связанных с измерительной техникой и обусловленных приборами колебаний, 35-57 Па и предпочтительно приблизительно 45 Па, т.е. давление в изоляторе на приблизительно 35-57 или на приблизительно 45 Па меньше, чем в рабочей камере.

Подача воздуха в изолятор и из изолятора происходит предпочтительно через фильтр, так что в изоляторе преобладает микробное число максимально 100, предпочтительно максимально 10 микробов/м³ и наиболее предпочтительно максимально 1 микроб/м³.

Рабочая камера согласно данному изобретению является воздухонепроницаемой (герметичной) закрытой системой, которая, во-первых, связана с изолятором с целью обмена веществ и обмена устройств через одно или больше закрываемых герметично отверстий и, во-вторых, для обмена веществ и устройств и/или доступа герметично связана через по меньшей мере один закрываемый переходный шлюз с окружающей средой. Рабочая камера окружает изолятор или граничит с ним. Подача воздуха в рабочую камеру и из рабочей камеры происходит предпочтительно через фильтр, так что в рабочей камере преобладает микробное число максимально 200, предпочтительно максимально 100 и наиболее предпочтительно максимально 10 микробов/м³. Подобные фильтры доступны в продаже, например, под названием НЕРА-фильтры.

- 2 012052

Рабочая камера предпочтительно имеет температуру приблизительно 19-26°С и относительную влажность воздуха 40-60%. Первый и второй изолятор обладают независимо один от другого температурой и относительной влажностью воздуха, которые являются обычными и подходящими для проведения получения и очистки биологически активного материала.

В рабочей камере преобладает рабочее давление, которое является более высоким, чем в изоляторе, однако существует перепад давления относительно давления окружающей среды и переходного шлюза.

Обычно давление в рабочей камере на 5-50, предпочтительно на 10-30, особенно предпочтительно на 12-18 Па меньше, чем давление окружающей среды.

В одном варианте осуществления данного изобретения типичный показатель перепада давления относительно давления окружающей среды составляет, в пределах связанных с измерительной техникой и обусловленных приборами колебаний, 15 Па, т. е. давление в рабочей камере приблизительно на 15 Па меньше, чем давление окружающей среды.

Рабочая камера связана с окружающей средой посредством по меньшей мере одного запираемого герметично переходного шлюза. В шлюзе преобладает избыточное давление относительно давления окружающей среды 10-100 Па, предпочтительно 20-80 и наиболее предпочтительно 25-35 Па.

Обычно существует перепад давления от переходного шлюза к рабочей камере 10-200, предпочтительно 20-100, особенно предпочтительно 40-60 Па.

В одном варианте осуществления данного изобретения типичный показатель перепада давления между переходным шлюзом и рабочей камерой составляет в пределах, связанных с измерительной техникой и обусловленных приборами колебаний, 45 Па, т.е. рабочее давление в рабочей камере приблизительно на 45 Па меньше, чем давление в переходном шлюзе.

Обычно перепад давления от переходного шлюза к изолятору составляет 10-300, предпочтительно 50-200, особенно предпочтительно 80-100 Па. Типичный показатель перепада давления между переходным шлюзом и изолятором составляет в пределах, связанных с измерительной техникой и обусловленных приборами колебаний, 90 Па, т.е. рабочее давление в изоляторе приблизительно на 90 Па меньше, чем давление в переходном шлюзе.

В особенно предпочтительном варианте осуществления устройство согласно данному изобретению включает в себя по меньшей мере один дополнительный изолятор. Этот по меньшей мере один дополнительный изолятор может находиться в той же самой рабочей камере, что и первый изолятор, или граничить с той же самой рабочей камерой, и он может быть также герметично связан с первым изолятором, например, посредством одного или нескольких закрываемых шлюзов, сосудов с двумя клапанами или отверстиями. Однако эти изоляторы могут не быть связанными друг с другом. Этот по меньшей мере один дополнительный изолятор имеет предпочтительно те же свойства, которые описаны выше для первого изолятора.

Обычно в изоляторе согласно данному изобретению проводят стадию ферментации, в которой образуется биологически активный материал. Предпочтительно, эта стадия ферментации включает в себя одну или несколько инокуляций. Поэтому изолятор согласно данному изобретению содержит по меньшей мере один ферментер.

Обычно в изоляторе проводят также одну или несколько стадий, требуемых для очистки биологического материала. При этом ферментация и очистка могут проводиться в одном и том же изоляторе или также в разных изоляторах, например, ферментация в первом изоляторе, а очистка в другом.

Стадия ферментации, которая имеет целью синтез биологически активного материала, происходит в ферментере. При этом речь может идти на выбор об анаэробно или аэробно работающем ферментере. Этот ферментер изготовлен технологически в соответствии с имеющимися в каждом случае условиями ферментации, как известно специалистам в данной области. В случае ферментера речь может идти о ферментере для периодической ферментации, полупериодической ферментации, повторяемой периодической ферментации или непрерывной ферментации. Предпочтительно, речь идет о ферментере для периодической ферментации.

Стадия ферментации может также включать в себя предварительное культивирование или начальные культивирования для инокуляции главного ферментера. Различные мероприятия и соответствующее технологическое оснащение, которое необходимо для этого, известны специалистам в данной области и включают в себя, среди прочего, один или несколько ферментеров, которые делают возможным первое и/или второе размножение посевного материала (инокулята) продуцирующего биологически активный материал штамма-продуцента. Связанные с этим меры включают в себя, например, также учреждение рабочего банка клеток, первое размножение клеточного материала, второе размножение клеточного материала и подлинную стадию ферментации, причем под подлинной стадией ферментации имеют в виду выращивание клеток для синтеза биологически активного соединения. Эти стадии предпочтительно проводят при определяемых в каждом случае организмом-продуцентом температуре или температурных градиентах. При этом температура условий получения в случае необходимости корректируется непрерывным или прерывистым образом.

В изоляторе могут также проводиться одна или несколько необходимых для очистки биологически активного материала стадий или мероприятий. В соответствии с этим изолятор содержит необходимые

- 3 012052 для этого приспособления.

Очистка биологически активного материала может проводиться также во втором изоляторе устройства согласно данному изобретению. Если только часть мероприятий для очистки проводят во втором изоляторе, другую часть необходимых мероприятий проводят в первом или одном из нескольких дополнительных изоляторов.

Определенные необходимые для получения биологически активного материала или связанные с ним мероприятия могут также проводиться вне изолятора, в частности, в том случае, если они не связаны с образованием аэрозоля или биологически активный материал присутствует в форме или в сосуде, из которой/из которого не исходит никакой угрозы для лиц, занимающихся этим получением или манипулированием, или для окружающей среды.

При ферментации, в которой создается биологически активный материал, речь идет предпочтительно о ферментации бактерий, особенно предпочтительными являются бактерии семейства С1о81пбшт Ьо1и1тит. Это относится также к рекомбинантным или генетически модифицированным штаммам С1о§Ιπάίιιιη Ьо1и1тит, а также к рекомбинантным или генетически модифицированным другим гетерологичным системам экспрессии (например, Е. сой).

С использованием установленного оборудования могут быть получены в принципе все биологически активные вещества, в частности, белки, которые синтезируются посредством ферментативного выращивания микроорганизмов.

Биологически активное вещество, которое получают при помощи ферментационного способа, является предпочтительно токсином, в частности, ботулиническим токсином (ботулотоксином), и наиболее предпочтительно ботулиническим нейротоксином.

Ботулинический токсин продуцируется бактерией ОоЧпбшт Ьо1и1тит и встречается в различных серотипах: ботулинический токсин типа А, В, С, Ό, Е, Е, О. Продуцируемый ОоЧпбшш Ьо1и1тит ботулинический токсин является комплексом из ботулинического нейротоксина, следовательно, ответственного за токсическое действие белка, и комплексообразующих белков, которые, как таковые, не являются токсичными. Эти белки являются гемагглютининами с различными молекулярными массами, как и по меньшей мере один не-гемагглютинирующий белок. Эти комплексы из ботулинического нейротоксина и (бактериальных) комплексных белков называют в целом ботулиническим токсином. Ботулинические токсины типа А, В и С являются коммерчески доступными, тип А, например, в виде ВОТОХ®. Эти комплексы могут быть переработаны дополнительно в комплексы различного белкового состава и разной чистоты до самого ботулинического нейротоксина. Поэтому в рамках данного изобретения понятие ботулинический нейротоксин применяется для того, чтобы описать белок, который является ответственным за токсическое действие, следовательно, ботулинический токсин высокой чистоты, который не содержит бактериальных комплексных белков. Ботулинический нейротоксин типа А обнаруживает молекулярную массу приблизительно 150 кДа и распространяется коммерческим путем заявителем под товарным названием Хеотт®.

В пределах данного изобретения находятся все формы «ботулинического токсина», в частности, различные серотипы, различные комплексы из ботулинического нейротоксина и комплексных белков, сам ботулинический нейротоксин, а также модифицированные или соответствующие рекомбинантно полученные ботулинические токсины или ботулинические нейротоксины, в том числе соответствующие мутации, делеции и т.д. В отношении подходящих мутантов авторы ссылаются на мутанты, которые описаны в \УО 2006/027207 А1. Кроме того, в рамках данного изобретения могут быть получены смеси различных серотипов (в комплексированной форме или в форме высокой чистоты и/или в рекомбинантной форме), например, смеси ботулинических токсинов типов А и В или смеси ботулинических нейротоксинов А и В.

Получение ботулинического нейротоксина типа А и В описано, например, в Международной заявке на патент \УО 00/74703. В отличие от комплексов из ботулинического нейротоксина и комплексных белков, вследствие полезного свойства практически отсутствующей иммуногенности (выделенного) ботулинического нейротоксина существует, следовательно, повышенная потребность в создании устройств и способов для безопасного и надежного промышленного получения ботулинического нейротоксина, что и описывается в данном изобретении.

Выбор и/или количество конкретно применяемых изоляторов свободно выбирается специалистом в зависимости от получаемого биологического соединения. В пределах подробно описанной здесь конкретной очистки, для ботулинического нейротоксина оказывается предпочтительным применение по меньшей мере двух изоляторов. При этом эти изоляторы отличаются, в частности, в отношении температуры, которая преобладает в нем или в одной частичной области в нем. Так, в рамках данного изобретения первый изолятор функционирует предпочтительно при более высокой температуре, например, приблизительно 20-50°С, а второй изолятор функционирует при более низких температурах в области, например, приблизительно -5 - +25°С. В первом изоляторе протекают те стадии получения, а также очистки, которые делают необходимой более высокую температуру или которые могут проводиться при такой температуре. К ним принадлежат инокуляция, ферментация и/или осаждение штамма-продуцента. На

- 4 012052 против, во втором изоляторе проводят те стадии способа получения и, в частности, очистки нейротоксина, которые требуют соответственно более низкой температуры или могут проводиться особенно предпочтительным образом при этом диапазоне температур.

Кроме того, признается, что все стадии получения в целом и ферментация и очистка, в частности, которые могут проводиться при обоих диапазонах температур и, следовательно, в каждом из обоих изоляторов, проводят в конечном счете в том изоляторе, который является предпочтительным с точки зрения выбора его размеров и полученного вследствие его размеров потребления энергии для поддержания соответствующих условий реакции для проведения этих стадий реакции, в частности, температуры, или с точки зрения легкости манипулирования или возможности проведения отдельных мероприятий.

Второй изолятор сконструирован в принципе подобно первому изолятору, однако с приспособлениями и предметами оборудования или технологическими особенностями оснащения, которые необходимы для проведения запланированных во втором изоляторе стадий очистки или мероприятий для этого. Соответствующие предметы оборудования известны специалистам в данной области. При этом предпочтительными стадиями очистки, которые проводят во втором изоляторе, являются мероприятия, которые выбраны из группы, состоящей из преципитации (осаждения), экстракции, центрифугирования, диализа и хроматографии. В соответствии с этим второй изолятор содержит одно или несколько приспособлений для преципитации (осаждения), приспособлений для экстракции, приспособлений для центрифугирования, приспособлений для диализа и/или приспособлений для хроматографии.

Предпочтительно приспособление для преципитации включает в себя реакционный сосуд, в котором содержится подлежащий преципитации раствор, снабженный подводящим трубопроводом для подачи необходимого для преципитации соединения. Кроме того, приспособление для преципитации включает в себя основное средство для удаления, для извлечения либо супернатанта, либо преципитата. Подходящие приспособления при этом известны специалисту. Приспособление для экстракции включает в себя обычно реакционный сосуд, в котором содержится подлежащая экстракции жидкость, подающий жидкость трубопровод для добавления экстракционной среды, а также приспособление для отделения содержащей экстракт жидкости от экстрагируемой жидкости. Приспособление для центрифугирования включает в себя обычно центрифугу для разделения смесей жидкость-жидкость или смесей жидкостьтвердые вещества. Приспособление для хроматографии включает в себя обычно одну хроматографическую колонку, которая наполнена хроматографическим материалом, а также одно впускное отверстие и одно выпускное отверстие, а также сосуды с подходящими средами для загрузки хроматографической колонки или для элюции этой колонки. В случае хроматографии речь может идти о гель-фильтрационной хроматографии, ВЖХ или аффинной хроматографии.

При этом в пределах данного изобретения находится то, что для случая использования двух или более изоляторов эти изоляторы связаны один с другим, так что только совокупность включающего в себя оба изолятора устройства включает в себя вытяжной вентиляционный канал и приточный вентиляционный канал и оба изолятора связаны с одним или несколькими промежуточными трубопроводами. Однако в пределах данного изобретения находится также то, что как первый изолятор, так и второй изолятор и/или каждый дополнительный изолятор в каждом случае и независимо один от другого имеют приточный вентиляционный канал и вытяжной вентиляционный канал.

Первый и второй изоляторы имеют предпочтительно пониженное внутреннее давление относительно наружного давления. При этом в пределах данного изобретения находится то, что оба изолятора имеют идентичное внутреннее давление. Однако также в пределах данного изобретения находится то, что оба изолятора имеют различные внутренние давления. При этом особенно предпочтительно, что внутреннее давление того изолятора является пониженным относительно другого изолятора, в котором вероятность образования аэрозоля, обусловленная проводимой в данном изоляторе стадией процесса, является более высокой.

При применении двух изоляторов имеется связь между изоляторами в форме прохода, например, в форме шлюза, между обоими изоляторами является преимуществом, так как таким образом гарантируется, что перенос продуцируемого или очищаемого материала к различным стадиям получения или обработки может происходить без разрушения создаваемых изолятором барьеров. В принципе, той же цели служит также оборудование этого устройства или каждого отдельного изолятора или по меньшей мере одного изолятора устройства согласно этому изобретению стерилизационным устройством. Соответствующие стерилизационные устройства известны специалистам в данной области и включают в себя, например, генератор парообразного пероксида водорода. Применение парообразного пероксида водорода является при этом ввиду условий пониженного давления в изоляторе (в изоляторах) особенно выгодным.

В следующем аспекте данное изобретение относится к способу ферментативного получения биологически активного соединения, причем этот способ включает в себя стадию ферментации для получения биологически активного соединения и очистку биологически активного соединения, причем ферментативное получение и/или очистка происходят полностью или частично в одном или нескольких изоляторах. Предпочтительно, стадия ферментации и одна или несколько частей очистки происходят в первом изоляторе и одна или несколько частей очистки происходят во втором изоляторе. В одном предпочтительном варианте осуществления стадия ферментации содержит по меньшей мере одну стадию инокуля

- 5 012052 ции. Предпочтительно, эту стадию проводят вручную. В пределах данного изобретения находится также то, что используют дополнительные изоляторы. В случае биологически активного материала речь идет предпочтительно о ботулиническом токсине (ботулотоксине), в частности, о ботулиническом нейротоксине. Раскрытые в связи с устройством согласно данному изобретению признаки представляют также признаки, как отдельно, так и в любой комбинации, способа данного изобретения.

Мероприятиями в связи с обработкой являются центрифугирование, диализ, экстракция, преципитация, преципитация сульфатом протамина, преципитация сульфатом аммония, солюбилизация обычно существующих в виде центрифужных комков осадков, диализ, хроматографические стадии или хроматографический процесс и фильтрование. В случае хроматографического процесса речь идет предпочтительно о последовательности нескольких отдельных хроматографических процессов. При этом речь в каждом случае может идти об одном и том же хроматографическом процессе или о различных хроматографических процессах. Предпочтительно, речь идет в случае, когда фармацевтически активным соединением является ботулинический нейротоксин типа А, о последовательности трех хроматографических стадий с использованием подходящих колоночных материалов. При этом возможно и предпочтительно, что соответствующий элюат перед нанесением на следующую колонку подвергается диализу.

После самой ферментации и отделения ферментационной среды от клеток ферментационную среду подвергают первой преципитации с целью удаления больших белков. Эту преципитацию предпочтительно проводят в первом изоляторе. Центрифугирование полученного таким образом преципитата происходит предпочтительно уже во втором изоляторе. Преципитация является предпочтительно кислотной преципитацией. Условия реакции для подобной кислотной преципитации известны специалистам с квалификацией в данной области. Обычно используют 3н. Н₂8О₄ для подкисления супернатанта до рН 3,5. Центрифугирование происходит обычно при 2400хд в течение 20 мин при 4°С. Полученный центрифугированием осадок промывают, предпочтительно несколько раз, водой.

В случае используемого штамма ΟοδΙπάίιιιη речь идет предпочтительно о С. Ьо1и1шит типа А, который хранили в виде культуры штамма в подходящей среде при обеспечивающих стабильность температурах. Для ферментации используют предпочтительно способ, описанный ΌαδΟιιρΙα В.К. с1 а1. ίη Τοχίсоп, Вапб 22, №. 3, 8сйсп 414-424, 1984. При этом 2% Ν-Ζ-Атт Тур А-среду смешивают с 0,5% дрожжевым экстрактом и 0,6% автоклавированной дрожжевой пастой и рН доводят до 7,2 4н ΝαΟΗ и после этого подготовленную таким образом среду автоклавируют. К этой среде добавляют автоклавированную отдельно глюкозу (20 масс.% на объем), что дает концентрацию глюкозы 0,5% в среде. Инкубирование происходило без перемешивания при 37°С, причем ферментацию прекращали после 96 часов. В пределах данного изобретения находится то, что, наряду с вышеописанной периодической ферментацией, могут проводиться также полупериодическая ферментация, повторяемые периодические ферментации или непрерывные ферментации. Необходимые для этого мероприятия и технологические требования известны квалифицированному в данной области специалисту.

В следующей стадии полученный из центрифужного осадка преципитат, в свою очередь, растворяют с целью высвобождения токсина из этого осадка. Операции для этого известны специалисту и, среди прочего, описаны ΌαδΟιιρΙα В. К. с1 а1. (в указанном месте). Например, экстракция может проводиться с использованием буфера, содержащего 0,1 М лимонную кислоту-тринатрийцитрат, рН 5,5, в течение одного часа. За экстракцией следует после этого стадия центрифугирования, обычно при 9800 х д в течение 20 мин при 4°С. Полученный таким образом центрифужный осадок может быть затем необязательно вновь экстрагирован, как описано выше. Супернатант экстракции, и для случая повторения экстракции, оба супернатанта экстракции, подвергали после этого преципитации сульфатом протамина. Преципитации давали проходить при 8°С в течение ночи. После этого преципитат снова центрифугировали в течение 20 мин при 4°С. При стадии преципитации сульфатом протамина удаляется, в частности, ДНК.

Полученный после центрифугирования супернатант подвергают либо в первом изоляторе, либо во втором изоляторе преципитации сульфатом аммония, причем в этом случае удаляются дополнительные более крупные белки. После преципитации сульфатом аммония снова проводят стадию центрифугирования и после этого полученный таким образом центрифужный осадок снова суспендируют и необязательно подвергают диализу.

Предпочтительно диализованный полученный из центрифужного осадка экстракт снова центрифугируют и подвергают последовательности хроматографических стадий с целью очистки ботулинического нейротоксина, в частности, очистки до гомогенности. При этом отдельные хроматографические стадии служат, в частности, для того, чтобы удалить сульфат протамина, остаточную ДНК, части малых белков и белков средней величины, а также гемагглютининов комплексов ботулинический нейротоксин-белок. Для этой цели в предпочтительном варианте осуществления проводят последовательность нескольких хроматографических стадий. Затем элюат фильтруют. При этом фильтрование служит для удаления микробов элюата, который предпочтительно содержит чистый ботулинический нейротоксин и больше не содержит комплексных белков. Перед фильтрованием элюат может быть необязательно разбавлен или могут быть добавлены подходящие вспомогательные вещества (адъюванты).

В следующих стадиях после добавления адъювантов следует новое стерильное фильтрование.

- 6 012052

Фильтрование происходит при этом в реакционных сосудах, которые затем, предпочтительно в отдельной стадии процесса, подвергают лиофилизации.

Лиофилизированный таким образом продукт герметично закрывают.

Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что перед инокуляцией, а также после различных стадий процесса, предпочтительно преципитации сульфатом аммония и фильтрования в первом изоляторе, этот изолятор подвергают дезактивации или стерилизации. В случае стерилизации речь идет, наиболее предпочтительно, о стерилизации, которую проводят при помощи парообразного пероксида водорода (УНР).

Раскрытые в предыдущем описании и пунктах формулы изобретения признаки данного изобретения могут быть существенными как по отдельности, так и в любой комбинации для осуществления данного изобретения в различных вариантах осуществления.

Claims (28)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Устройство для ферментативного получения биологически активного соединения, включающее по меньшей мере один изолятор, который содержит ферментер и который окружен рабочей камерой или граничит с ней, причем эта рабочая камера связана с окружающей средой посредством переходного шлюза, отличающееся тем, что в этом изоляторе и в рабочей камере в каждом случае преобладает пониженное давление, причем давление относительно давления окружающей среды в изоляторе является меньшим, чем давление относительно давления окружающей среды в рабочей камере, причем в переходном шлюзе преобладает избыточное давление относительно давления окружающей среды.
2. 2. Устройство по п.1, где давление в изоляторе на 20-200 Па меньше, чем давление окружающей среды.
3. 3. Устройство по п.1 или 2, где давление в рабочей камере на 5-50 Па меньше, чем давление окружающей среды.
4. 4. Устройство по одному из пп.1-3, где давление в переходном шлюзе на 10-100 Па больше, чем давление окружающей среды.
5. 5. Устройство по одному из пп.1-4, отличающееся тем, что это устройство включает в себя по меньшей мере второй изолятор, причем этот второй изолятор не содержит ферментер.
6. 6. Устройство по одному из пп.1-5, отличающееся тем, что это устройство и/или первый и/или второй изоляторы включают в себя по меньшей мере один приточный вентиляционный и один вытяжной вентиляционный каналы, причем этот приточный вентиляционный и вытяжной вентиляционный каналы снабжены фильтром, где этот фильтр является НЕРА-фильтром.
7. 7. Устройство по п.5 или 6, отличающееся тем, что внутреннее давление первого изолятора и второго изолятора является одинаковым.
8. 8. Устройство по п.5 или 6, отличающееся тем, что внутреннее давление первого изолятора является отличающимся от внутреннего давления второго изолятора.
9. 9. Устройство по одному из пп.5-8, отличающееся тем, что первый и второй изоляторы связаны один с другим через проход, причем этот проход делает возможным транспорт веществ из первого во второй изолятор и предпочтительно делает возможным также транспорт веществ от второго изолятора в первый изолятор.
10. 10. Устройство по п.9, отличающееся тем, что этим проходом является шлюз.
11. 11. Устройство по одному из пп.1-10, отличающееся тем, что это устройство включает в себя приспособление для стерилизации и/или приспособление для дезинфекции.
12. 12. Устройство по одному из пп.1-11, отличающееся тем, что первый изолятор включает в себя анаэробно функционирующий ферментер.
13. 13. Устройство по одному из пп.1-12, отличающееся тем, что первый изолятор включает в себя приспособление для преципитации.
14. 14. Устройство по одному из пп.1-13, отличающееся тем, что первый изолятор включает в себя приспособление для фильтрования.
15. 15. Устройство по одному из пп.5-14, отличающееся тем, что второй изолятор включает в себя приспособление для экстракции.
16. 16. Устройство по одному из пп.5-15, отличающееся тем, что второй изолятор включает в себя приспособление для преципитации.
17. 17. Устройство по одному из пп.5-16, отличающееся тем, что второй изолятор включает в себя, по меньшей мере, устройство для хроматографии.
18. 18. Способ ферментативного получения биологически активного соединения, предусматривающий стадию ферментации для получения биологически активного соединения и очистку биологически активного соединения, причем этот способ проводится в устройстве по одному из пп.1-17.
19. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что биологически активным соединением является токсин или другой полученный ферментацией белок, предпочтительно ботулинический токсин (ботулотоксин),

    - 7 012052 в частности ботулинический нейротоксин.
20. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что этим ботулиническим токсином является ботулинический токсин С1ох1пбшт Ьо1и1тит типов А, В, С, Ό, Е, Е или С или смесь двух или нескольких этих типов, предпочтительно ботулинический токсин типа А.
21. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что ботулиническим токсином или смесью ботулинических токсинов является ботулинический нейротоксин или смесь ботулинических нейротоксинов.
22. 22. Способ по одному из пп.18-21, отличающийся тем, что стадию ферментации осуществляют в первом изоляторе, а очистку полностью или частично осуществляют во втором изоляторе.
23. 23. Способ по одному из пп.18-22, отличающийся тем, что стадия ферментации и часть стадии очистки происходит в первом изоляторе, а другая часть стадии очистки происходит во втором изоляторе.
24. 24. Способ по одному из пп.18-23, отличающийся тем, что стадию ферментации, преципитации и фильтрования продукта со стадии ферментации осуществляют как часть стадии очистки в первом изоляторе.
25. 25. Способ по одному из пп.18-24, отличающийся тем, что первый изолятор и второй изолятор эксплуатируются при одинаковых температурах.
26. 26. Способ по одному из пп.18-25, отличающийся тем, что температуру в первом или втором изоляторе изменяют в зависимости от соответствующей стадии способа.
27. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что температура в первом изоляторе составляет от приблизительно 20 до приблизительно 50°С, а температура во втором изоляторе составляет от приблизительно 5 до приблизительно +25°С.
28. 28. Способ по одному из пп.18-27, отличающийся тем, что этот способ предусматривает следующие стадии:

    a) в первом изоляторе:

    инокуляцию ферментационной среды со штаммом-продуцентом для биологически активного соединения, предпочтительно вручную;

    ферментацию штамма-продуцента;

    отделение супернатанта от клеток штамма-продуцента; и преципитацию супернатанта;

    b) во втором изоляторе:

    центрифугирование преципитированного супернатанта с образованием центрифужного осадка; экстрагирование центрифужного осадка, центрифугирование и получение супернатанта; преципитацию супернатанта с последующим центрифугированием с образованием супернатанта;

    c) в первом или втором изоляторе: преципитацию супернатанта; центрифугирование преципитата;

    солюбилизацию полученного центрифугированием содержащего преципитат центрифужного осадка;

    диализ солюбилизированного центрифужного осадка и центрифугирование диализата; подвергание диализата хроматографии;

    фильтрование полученного элюата.