BRPI0611752A2 - dispositivo e processo para produção fermentativa de compostos biologicamente eficazes - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO E PROCESSO PARA PRODUçãO FERMENTATIVA DE COMPOSTOS BIOLOGICAMENTE EFICAZES. A presente invenção refere-se a um processo e um dispositivo para a produção fermentativa de materiais biologicamente eficazes, sendo que o fermentador se encontra em um isolador, que se encontra novamente em uma câmara de trabalho ou é adjacente a esta e sendo que tanto no isolador, quanto também na câmara de trabalho predomina uma diferença de pressão em relação à pressão ambiente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSITIVOE PROCESSO PARA PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE COMPOSTOSBIOLOGICAMENTE EFICAZES".

A presente invenção refere-se a um processo e a um dispositivopara a produção fermentativa de materiais biologicamente eficazes, sendoque o fermentador se encontra em um isolador, que se encontra novamenteem uma câmara de trabalho ou é adjacente ao mesmo e em que tanto noisolador quanto também na câmara de trabalho predomina uma diferença depressão comparada com a pressão ambiental.

O trabalho com compostos biologicamente eficazes exige medi-das de segurança elevadas na produção, para resguardar funcionários depossíveis perigos ou envenenamentos. Compostos biologicamente eficazessão produzidos ou utilizados freqüentemente para fins farmacêuticos, razãopela qual eles precisam corresponder às altas exigências quanto a pureza,especialmente na produção. A construção usual de instalações para a pro-dução de substâncias altamente puras consiste em uma primeira câmarainterna, que é fechada para fora e é envolvida por uma segunda câmara. Nasegunda câmara encontram-se as pessoas que trabalham com o materialbiológico, enquanto a elaboração do material biológico se realiza principal-mente na primeira câmara. As duas câmaras estão ligadas uma com a outrapor comportas fecháveis. A primeira câmara é usualmente uma caixa de lu-va, de maneira que os estágios do processo podem ser efetuados com auxí-lio de luvas a partir da segunda câmara. A segunda câmara é usualmenteisolada do mundo exterior, mas está ligada com ele através de comportasfecháveis.

Nas duas câmaras predominam, de maneira ideal, condições es-téreis ou condições ambientais puras. Para impedir uma contaminação domaterial biologicamente eficaz com partículas ambientais, germes microbio-lógicos e similar, predomina um excesso de pressão na primeira câmara,tipicamente um excesso de pressão de 15 Pa. Na segunda câmara, ao con-trário, predomina uma subpressão comparada com a primeira câmara, noentanto, um excesso de pressão comparado com o meio ambiente. Comisso, impede-se, que partículas ou germes da segunda câmara penetrem naprimeira câmara. Dessa maneira, o material biologicamente eficaz é protegi-do contra contaminações do meio ambiente.

No caso da produção de compostos biologicamente eficazesatravés de um processo de fermentação, há estágios de processo, que sãoefetuados em um aparelho, pelo menos, aberto por um breve período. Umtal estágio de processo, por exemplo, é a inoculação. Este estágio precisaser efetuado, na maioria das vezes, manualmente. Neste procedimento, noqual o dispositivo (recipiente, frasco) com o material aberto (banco de célu-las) é aberto - mesmo que também por um breve período -, pode ocorrer aformação de aerossol. Isso também é válido para os passos intermediáriosdos estágios da pré-cultura até o início da fermentação. Aqui é aberta umaconexão do fermentador - mesmo também por um breve período -, com oque pode ocorrer a formação de aerossol. Do mesmo modo, é possível, quena elaboração do produto de fermentação, da substância biologicamenteeficaz, ocorra a formação de aerossol. Neste caso, há o perigo ambiental daexposição com germes, bactérias ou substâncias tóxicas. Devido a subpres-são relativa na segunda câmara em relação à primeira câmara, os aerossóispodem penetrar da primeira para a segunda câmara, o que pode pôr em ris-co as pessoas que trabalham na segunda câmara. Apesar disso, para garan-tir a segurança de trabalho, é preciso tomar outras medidas de segurança,tais como, por exemplo, vacinação do pessoal de trabalho, uso de uniformesde segurança e outras.

Por isso, há a necessidade de um processo e um dispositivo,com os quais os materiais biologicamente eficazes podem ser preparadosatravés de fermentação, em que os materiais são protegidos contra conta-minação do meio ambiente e simultaneamente a exposição do pessoal comaerossóis é reduzida ou inteiramente impedida.

Este objetivo é resolvido de acordo com a invenção, pelo dispo-sitivo e processo de acordo com as reivindicações anexas.

Conseqüentemente, a presente invenção refere-se a um disposi-tivo e a um processo para a produção de substâncias ativas biologicamenteativas por meio de fermentação, preferentemente em forma altamente pura,sendo impedida uma contaminação do material biológico com partículas egermes do meio ambiente e ao mesmo tempo, reduzida a possibilidade deum risco do pessoal que trabalha com o material biológico. Preferentemente,o processo de fermentação contém pelo menos um estágio de inoculação. Oprocesso de fermentação contém especialmente pelo menos um estágio efe-tuado manualmente e de modo particularmente preferido, este estágio é oestágio de inoculação.

O processo de acordo com a invenção e o dispositivo de acordocom a invenção, utilizado para esse fim, permitem a aplicação de técnicasde produção e purificação comprovadas, que estão ou podem estar ligadascom a formação de aerossol, sem que, neste caso, um risco fundamentaldas pessoas encarregadas com o processo de produção e/ou de elaboraçãoesteja ligado com o meio ambiente através da formação de aerossol. Emoutras palavras, o dispositivo de acordo com a invenção e o processo deacordo com a invenção diminuem a exposição das pessoas envolvidas coma produção e meio ambiente do material bíologicamente ativo, bactérias e/ougermes, e ao mesmo tempo, permite a aplicação de técnicas estabelecidas,que permitem uma produção e purificação eficientes do material bíologica-mente ativo, embora estas estejam fundamentalmente ligadas com uma for-mação de aerossol.

O dispositivo de acordo com a invenção, contém, pelo menos,uma câmara de isolamento (isolador), que é envolvida por uma câmara detrabalho ou é adjacente à mesma. A câmara de trabalho está ligada com omeio ambiente através de uma comporta de pressão. Tanto no isolador,quanto também na câmara de trabalho predomina uma subpressão emcomparação com a pressão do meio ambiente, sendo que a pressão no iso-lador é menor do que a pressão na câmara de trabalho. Na comporta depressão predomina um excesso de pressão em relação à pressão do meioambiente. Nesse caso, o isolador contém pelo menos um fermentador, noqual o material'biologicamente eficaz é preparado por fermentação.

No dispositivo de acordo com a invenção, o material biologica-mente eficaz é preparado e/ou elaborado no isolador. Neste caso, um isola-dor, tal como utilizado aqui, é um sistema delimitado hermeticamente frenteao meio ambiente, que se encontra fundamentalmente em permuta energéti-ca com seu meio, no entanto, não permite nenhum transporte de materialdescontrolado com seu meio. Transporte de material controlado com seumeio, por exemplo, a carga com ou a remoção de equipamentos, reagentes,materiais de partida, produtos intermediários e produtos finais, pode ser efe-tuado através de uma ou mais comportas, reservatórios basculantes duplos,através dos chamados β-ports em conexão com α-containers ou α-bags. Otransporte de material controlado é possível antes, durante ou após a fer-mentação e/ou a purificação do produto de fermentação ou do material bio-logicamente eficaz.

O isolador, regulado através de instalações apropriadas, podeser acionado com excesso de pressão ou subpressão. Do mesmo modo, épossível, que seja produzida uma atmosfera de gás inerte no isolador. O iso-lador dispõe tipicamente de um ou mais tubo(s) de alimentação e remoçãode ar, sendo que estes são providos tipicamente de filtros. Com isso, obtém-se no isolador preferentemente um número de germes menor do que 100,preferentemente menos do que 10 e de modo mais preferido, menos do que1 germe/m3. Tais filtros são conhecidos pelo técnico. Um exemplo de taisfiltros são os filtros HEPA (high efficiency particulate air).

Os equipamentos, aparelhos ou objetos que podem ser encon-trados no isolador podem ser movimentados ou servidos através de um co-mando externo ou através de entradas de luva isoladas encontradas no iso-lador, que são acionadas, movimentadas ou servidas a partir da sala de tra-balho.

O isolador é fabricado preferentemente inteira ou parcialmentede um material, que é biologicamente inerte ou de fácil limpeza ou permiteuma descontam inação ou esterilização in situ. Nesse caso, prefere-se ummaterial, que permite especialmente a esterilização com formalina, óxido deetileno ou peróxido de hidrogênio em forma de vapor (VHP). Tais materiaissão, por exemplo, vidro, aço inoxidável ou materiais plásticos, tal como, porexemplo, PVC. Preferencialmente, o isolador é fabricado de maneira tal, queseu lado interno consiste inteira ou parcialmente em vidro e/ou de aço inoxi-dável ou de outros materiais adequados, por exemplo, materiais plásticos.

Nesse caso, utilizam-se tanto materiais plásticos duros, quanto também ma-cios (isoladores hard- e soft-wall). Luvas são fabricadas tipicamente de neo-prene, hypalon, vinila ou outros materiais apropriados.

Tipicamente, o isolador dispõe de uma instalação para o controlee regulação de temperatura.

O isolador encontra-se tipicamente em uma sala de trabalho oué adjacente a esta. Entre o isolador e a sala de trabalho existe uma diferen-ça de pressão. No isolador predomina, nesse caso, uma pressão mais baixado que na sala de trabalho, que novamente apresenta uma pressão maisbaixa do que a pressão ambiental. A pressão ambiental perfaz 101325 Pa,mas pode variar conforme a situação geográfica ou condição das intempéries.

Tipicamente, a pressão de funcionamento no isolador é umasubpressão de 20 até 200 Pa, preferentemente de 40 até 100 Pa e do modomais preferido, de 55 até 75 Pa, sendo que a subpressão refere-se à pres-são do meio ambiente (101325 Pa).

Usualmente, a pressão de funcionamento no isolador é em tornode 10 até 100, preferentemente 20 até 80, de modo particularmente preferi-do, em tomo de 40 até 60 Pa mais baixa do que na câmara de trabalho.

Em uma forma de concretização da invenção, um valor típico dadiferença de pressão entre o isolador e a câmara de trabalho, dentro de osci-lações da técnica de medição e as condicionadas pelo equipamento, é de 35até 57 Pa e preferentemente de cerca de 45 Pa, isto é, a pressão no isoladoré em torno de cerca de 35 até 57 ou em torno de cerca de 45 Pa mais baixado que na câmara de trabalho.

A alimentação de ar para e do isolador ocorre preferentementeatravés de filtros, de modo que no isolador predomina um índice de germesde no máximo 100, preferentemente no máximo de 10 germes/m3 e do modomais preferido, preferentemente no máximo, de 1 germe/m3.

A câmara de trabalho de acordo com a invenção, é um sistemahermético, que por um lado, está ligado hermeticamente com o isolador a-través de uma ou mais aberturas fecháveis com a finalidade de trocar subs-tâncias e trocar equipamentos e, por outro lado, está ligado hermeticamentecom o meio ambiente para a troca de substâncias e equipamentos e/ou a-cesso através de, pelo menos uma comporta de pressão fechável. A câmarade trabalho envolve ou aproxima-se ao isolador. A alimentação de ar para eda câmara de trabalho ocorre preferentemente através de filtros, de maneiraque na câmara de trabalho predomina um índice de germes de no máximo200, preferentemente no máximo 100 e do modo mais preferido, de no má-ximo 10 germes/m3. Tais filtros estão à venda no comércio, por exemplo,pelo nome filtros HEPA.

A câmara de trabalho apresenta preferentemente uma tempera-tura de cerca de 19 até 26°C e uma umidade relativa do ar de 40 até 60 %.

O primeiro e o segundo isolador apresentam independentes um do outro,uma temperatura e uma umidade relativa do ar, tal como é usual e apropria-da para a execução da produção e purificação do material biologicamenteeficaz.

Na câmara de trabalho predomina uma pressão de funciona-mento que é maior do que a do isolador, no entanto, há uma diferença depressão em relação à pressão ambiente e para a comporta de pressão.

Tipicamente a pressão na câmara de trabalho é de 5 até 50, pre-ferentemente 10 até 30, de modo particularmente preferido, de 12 até 18 Pamais baixa do que a pressão ambiente.

Em uma forma de concretização da invenção, um valor típico dadiferença de pressão em relação à pressão ambiente dentro de oscilaçõesda técnica de medição e as condicionadas pelo equipamento, é de 15 Pa,isto é, a pressão na câmara de trabalho é de cerca de 15 Pa mais baixa doque a pressão ambiente.

A câmara de trabalho está ligada com o meio ambiente atravésde, pelo menos, uma comporta de pressão fechável. Na comporta predomi-na um excesso de pressão em relação à pressão ambiente de 10 até 100Pa, preferentemente de 20 até 80 e do modo mais preferido, de 25 até 35Pa.

Usualmente, há uma diferença de pressão da comporta de pres-são para a câmara de trabalho de 10 até 200, preferentemente de 20 até100, de modo particularmente preferido, de 40 até 60 Pa.

Em uma forma de concretização, um valor típico da diferença depressão entre a comporta de pressão e a câmara de trabalho dentro de osci-lações da técnica de medição e as condicionadas pelo equipamento, é de 45Pa, isto é, a pressão de trabalho na câmara de trabalho é cerca de 45 Pamais baixa do que na comporta de pressão.

Usualmente, há uma diferença de pressão da comporta de pres-são para o isolador de 10 até 300, preferentemente de 50 até 200, de modoparticularmente preferido, de 80 até 100 Pa. Um valor típico da diferença depressão entre a comporta de pressão e o isolador dentro das oscilações datécnica de medição e as condicionadas pelo equipamento, é de 90 Pa, istoé, a pressão de trabalho no isolador é em torno de cerca de 90 Pa mais bai-xa do que na comporta de pressão.

Em uma forma de concretização particularmente preferida, odispositivo de acordo com a invenção, abrange pelo menos um outro isola-dor. Esse ao menos outro isolador pode encontrar-se na mesma câmara detrabalho como o primeiro isolador ou ser adjacente à mesma câmara de tra-balho e ele também pode estar hermeticamente ligado com o primeiro isola-dor, por exemplo, através de uma ou mais comportas fechadas, reservató-rios basculantes duplos ou ports. No entanto, os isoladores também podemnão estar ligados uns com os outros. O, pelo menos um outro isolador tempreferentemente as mesmas propriedades tais como as mencionadas para oprimeiro isolador.

No isolador de acordo com a invenção, efetua-se tipicamente umestágio de fermentação, preferentemente um estágio de fermentação, noqual é produzido o material biologicamente ativo. Preferentemente, esse es-tágio de fermentação contém uma ou mais inoculações. Por isso, o isoladorde acordo com a invenção, contém pelo menos um fermentador.

No isolador são efetuados tipicamente também um ou mais es-tágios das medidas necessárias para a purificação do material biológico.Nesse caso, a fermentação e purificação podem ser efetuadas em um e nomesmo isolador ou também em diferentes isoladores, por exemplo, a fer-mentação no primeiro isolador e a purificação no segundo.

O estágio de fermentação, que tem por objeto a síntese do ma-terial biologicamente ativo, é efetuado em um fermentador. Nesse caso, po-de tratar-se eventualmente de um fermentador de funcionamento anaeróbioou aeróbio. Conforme a técnica do aparelho, o fermentador é equipado demaneira correspondente às respectivas condições de fermentação, como édo conhecimento dos técnicos nesse campo. No caso do fermentador podetratar-se de um fermentador para a fermentação em batelada, para a fer-mentação em semibatelada, fermentação em batelada repetida ou fermenta-ção contínua. Preferentemente, trata-se de um fermentador para a fermenta-ção em batelada.

O estágio de fermentação também pode abranger o pré-cultivoou cultivo inicial para a inoculação do fermentador principal. As diferentesmedidas e equipamento tecnológico de processo correspondente, que é ne-cessário para esse fim, é do conhecimento dos técnicos na área e abran-gem, entre outras, um ou mais fermentadores, que permitem uma primeirae/ou segunda expansão do material de vacina da cepa do produtor que pro-duz o material biologicamente eficaz. As medidas relacionadas com o mes-mo, abrangem, por exemplo, também o estabelecimento de um banco decélulas de trabalho, a primeira expansão do material celular, a segunda ex-pansão do material celular e o próprio estágio de fermentação, sendo quepelo próprio estágio de fermentação é entendido especialmente o crescimen-to das células para a síntese do composto biologicamente eficaz. Esses es-tágios são preferentemente efetuados na temperatura ou gradiente de tem-peratura definida pelo respectivo organismo produtor. Nesse caso, a tempe-ratura é adaptada eventualmente continuamente ou descontinuamente àscondições de produção.

No isolador também podem ser efetuados um ou mais estágiosou medidas necessárias para a purificação do material biologicamente efi-caz. De maneira correspondente, o isolador contém as instalações necessá-rias para este fim.

A purificação do material biologicamente eficaz também podeser efetuada em um segundo isolador do dispositivo de acordo com a inven-ção. Caso seja efetuada apenas uma parte das medidas para a purificaçãono segundo isolador, a outra parte das medidas necessárias é efetuada noprimeiro ou em um ou vários outros isoladores.

Determinadas medidas necessárias ou que estão em relaçãocom a produção do material biologicamente eficaz, também podem ser efe-tuadas do lado de fora de um isolador, especialmente quando essas nãoestão ligadas com a formação de um aerossol ou o material biologicamenteeficaz está presente em uma forma ou um recipiente, dos quais/do qual nãoparte nenhum risco das pessoas envolvidas com a produção ou manuseioou do meio.

No caso da fermentação, na qual é produzido o material biologi-camente eficaz, trata-se preferentemente da fermentação de bactérias, demodo particularmente preferidos são bactérias da família Clostridium botuli-num, Isso é igualmente válido para cepas de Clostridium botulinum recombi-nantes ou geneticamente modificadas, bem como para outros sistemas deexpressão heterólogos recombinantes ou geneticamente modificados (porexemplo, E. coli).

Com o equipamento instalado, podem ser fundamentalmenteproduzidos todas as substâncias biologicamente eficazes, especialmenteproteínas, que são sintetizadas através do cultivo fermentativo de microor-ganismos.

A substância biologicamente eficaz, que é produzida pelo pro-cesso de fermentação, é preferentemente uma toxina, especialmente umatoxina botulínica e a mais preferida, uma neurotoxina botulínica.

Toxina botulínica é produzida pelas bactérias Clostridium botuli-num e ocorre em diferentes tipos de soro: toxina botulínica do tipo A, B, C,D, E, F, G. A toxina botulínica produzida pelo Clostridium botulinum é umcomplexo da neurotoxina botulínica, isto é, da proteína responsável pelo e-feito tóxico e de proteínas complexantes, que como tais, não são tóxicas.Essas proteínas são hemaglutininas com diferentes massas molares, bemcomo pelo menos uma proteína não hemaglutinante. Os complexos da neu-rotoxina botulínica e da proteína de complexo (bacteriana) são geralmentedesignados como toxina botulínica. A do tipo A, B e C estão comercialmenteà venda, o tipo A, por exemplo, como BOTOX®. Esses complexos podem serulteriormente elaborados para complexos com diferentes composições daproteína e pureza até formar a própria neurotoxina botulínica. Por isso, otermo neurotoxina botulínica no âmbito desta invenção é utilizado para des-crever a proteína, que é responsável pelo efeito tóxico, isto é, pela toxinabotulínica de alta pureza, que é livre de proteínas bacterianas do complexo.

A neurotoxina botulínica do tipo A apresenta uma massa molecular de cercade 150 kDa e é vendida comercialmente pela requerente sob a marca regis-trada Xeomin®.

No âmbito desta invenção são apropriadas todas as formas da"toxina botulínica", especialmente os diversos tipos sorológicos, os diferen-tes complexos de neurotoxina botulínica e proteínas do complexo, a próprianeurotoxina botulínica, bem como toxinas botulínicas ou neurotoxinas botulí-nicas correspondente modificadas ou produzidas de forma recombinante,inclusive as correspondentes mutações, deleções e outras. Para mutantesapropriados, fazemos referência aos mutantes, que são descritos na WO2006/027207 A1. Além disso, no âmbito da presente invenção, podem serproduzidas misturas de diferentes tipos sorológicos (em forma complexanteou de alta pureza e/ou recombinante), por exemplo, misturas de toxinas bo-tulínicas dos tipos A e B ou misturas de neurotoxinas botulínicas dos tipos Ae B.

A produção de neurotoxina botulínica do tipo A e B é descrita,por exemplo, no pedido de patente internacional WO 00/74703. Em conse-qüência da propriedade vantajosa de uma imunogeneidade praticamenteinexistente de neurotoxina botulínica (isolada) frente aos complexos de neu-rotoxina botulínica e proteínas do complexo, há assim, especialmente umaimportante necessidade, de disponibilizar dispositivos e processos para aprodução industrial segura e confiável de neurotoxina botulínica, tal como ofaz a presente invenção.

A escolha e/ou número de isoladores concretamente utilizados éselecionada livremente pelo técnico em função do composto biológico a serproduzido. No âmbito da purificação concreta da neurotoxina botulínica deta-lhadamente descrita aqui, resulta vantajosamente a utilização de, pelo me-nos, dois isoladores. Nesse caso, os isoladores diferenciam-se especialmen-te com respeito à temperatura predominante neles ou em uma parte deles.Desse modo, no âmbito da presente invenção, é preferível que o primeiroisolador funcione a uma temperatura mais elevada, por exemplo, de cercade 20 até cerca de 50°C e o segundo isolador funcione a temperaturas maisbaixas na faixa de, por exemplo, cerca de -5 até +25°C. No primeiro isoladordecorrem aqueles estágios da produção, bem como da purificação, na medi-da em que tornem necessária uma temperatura correspondentemente maiselevada ou que podem ser efetuados nessa temperatura. Nesses incluem-seespecialmente a inoculação, a fermentação e/ou a precipitação da cepa pro-dutiva. Ao contrário, no segundo isolador são efetuados aqueles estágios doprocesso de produção e especialmente da purificação da neurotoxina, queexigem uma temperatura correspondentemente mais baixa ou que de manei-ra particularmente vantajosa, podem ser efetuados nessa faixa de temperatura.

Além disso, será reconhecido, que aqueles estágios na produ-ção geral e da fermentação e da purificação em especial, que podem serefetuados nas duas faixas de temperatura e, com isso, em cada um dos doisisoladores, são efetuados, por fim, naquele isolador, que é vantajoso sob oponto de vista de seu dimensionamento e do consumo de energia resultanteem conseqüência do dimensionamento para a manutenção das condiçõesde reação correspondentes para a execução dos estágios de reação, espe-cialmente da temperatura ou sob o ponto de vista da capacidade de manu-seio ou possibilidade de execução de cada uma das medidas.

O segundo isolador é construído fundamentalmente de maneirasemelhante ao do primeiro isolador, no entanto, é provido de instalações eobjetos de equipamento ou características de equipamentos técnicos de a-parelhos, tais como são necessários para a execução dos estágios de purifi-cação ou das medidas para esse fim planejados no segundo isolador. Osobjetos de equipamentos correspondentes são conhecidos pelos técnicosnesse campo. Estágios de purificação preferidos, que são efetuados no se-gundo isolador são, nesse caso, medidas, que são selecionadas do grupoabrangendo precipitação, extração, centrifugação, diálise e cromatografia.

De maneira correspondente, o segundo isolador contém uma ou várias insta-lações de precipitação, instalações de extração, instalações de centrifuga-ção, instalações de diálise e/ou instalações de cromatografia. Preferente-mente, uma instalação de precipitação abrange um reservatório de reação,no qual está contida a solução a ser submetida à precipitação, provida deum tubo de alimentação, para acrescentar o(s) composto(s) necessário(s)lpara a precipitação. Além disso, o dispositivo de precipitação abrange fun-damentalmente agentes de remoção, para remover ou o sobrenadante ou oprecipitado. Nesse caso, as instalações apropriadas são conhecidas pelotécnico. Uma instalação de extração abrange tipicamente um reservatório dereação, no qual está contido o líquido a ser extraído, um tubo de alimentaçãopara acrescentar o meio de extração, bem como um dispositivo, para sepa-rar o líquido contendo o extrato do líquido extraído. Uma instalação de centri-fugação abrange tipicamente uma centrífuga para separar misturas líquido-líquidas ou misturas líquidas-sólidas. A instalação de cromatografia abrangetipicamente uma coluna de cromatografia, que é enchida com material decromatografia, bem como uma admissão e uma saída, bem como reservató-rios com meios apropriados, para alimentar a coluna de cromatografia oupara eluir a mesma. No caso da cromatografia pode tratar-se, por exemplo,da cromatografia Size-Exciusion, HPLC ou cromatografia de afinidade.

Desse modo está no contexto da invenção, que no caso, de se-rem utilizados dois ou mais isoladores, estes estão ligados uns com os ou-tros, de modo que meramente todo o dispositivo que compreende os doisisoladores abrange um tubo de admissão e entrada de ar e saída de ar e osdois isoladores estão ligados com um ou mais tubos intermediários. No en-tanto, também está no contexto da presente invenção, que tanto o primeiroisolador, quanto também o segundo isolador e/ou cada outro isolador apre-sentam em cada caso e independentes uns dos outros, um tubo de entradade ar e um de saída de ar.

O primeiro e segundo isolador apresentam preferentemente umapressão interna reduzida comparada com a pressão externa. Desse modoestá no contexto da presente invenção, que ambos os isoladores apresen-tam uma pressão interna idêntica. No entanto, está também no contexto dapresente invenção, que ambos os isoladores apresentam pressões internasdiferentes. Nesse caso, é especialmente preferível, que a pressão internadaquele isolador seja mais baixa comparada com a do outro isolador, noqual a probabilidade da formação de aerossol condicionada pelos estágiosde processo efetuados no respectivo isolador seja maior.

Na utilização dos dois isoladores, a presença de um compostoentre os isoladores na forma de uma passagem, por exemplo, na forma deuma comporta entre os dois isoladores é vantajosa, pois desse modo, asse-gura-se que a transferência do material produzido ou purificado para os dife-rentes estágios da produção ou da elaboração possa ser realizada, sem quea barreira formada pelo isolador seja rompida. Em princípio, para o mesmoobjeto serve também a concretização do dispositivo ou de cada isolador in-dividual ou pelo menos de um isolador do dispositivo de acordo com a in-venção, com o dispositivo de esterilização. Dispositivos de esterilização cor-respondentes são conhecidos pelos técnicos na área e compreendem, porexemplo, um gerador para a produção de peróxido de hidrogênio em formade vapor. Nesse caso, a utilização de peróxido de hidrogênio em forma devapor é particularmente vantajosa, tendo em vista as condições de subpres-são no/nos isolador(es).

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um pro-cesso para a produção fermentativa de um composto biologicamente eficaz,sendo que o processo abrange um estágio de fermentação para a produçãodo composto biologicamente eficaz e uma purificação do composto biologi-camente eficaz, sendo que a produção fermentativa e/ou a purificação é in-teira ou parcialmente efetuada em um ou mais isoladores. Preferencialmen-te, o estágio de fermentação e uma ou várias partes da purificação em umprimeiro isolador e uma ou várias partes da purificação em um segundo iso-lador. Em uma forma de concretização preferida, o estágio de fermentaçãocontém pelo menos um estágio de inoculação. Preferencialmente, esse es-tágio é efetuado manualmente. Também está no contexto da presente in-venção, que são utilizados outros isoladores. No caso do material biologica-mente eficaz, trata-se preferentemente de uma toxina botulínica, especial-mente de uma neurotoxina botulínica, tal como descrito aqui. As característi-cas publicadas em relação com o dispositivo de acordo com a invenção, re-presentam também características, tanto individuais, quanto também emcombinação desejada do processo de acordo com a invenção.

Medidas em relação com a elaboração são centrifugação, diáli-se, extração, precipitação, precipitação de sulfato de protamina, precipitaçãode sulfato de amônio, solubilização de precipitados presentes tipicamentecomo pélletes, diálise, estágios de cromatografia ou processos de cromato-grafia e filtração. No caso dos processos de cromatografia, trata-se preferen-temente uma seqüência de vários processos de cromatografia individuais.Nesse caso, pode tratar-se em cada caso do mesmo processo de cromato-grafia ou de um processo de cromatografia diferente. Preferencialmente, nocaso de o composto farmaceuticamente ativo ser neurotoxina botulínica dotipo A, trata-se de uma seqüência de três estágios de cromatografia com autilização de materiais de coluna apropriados. Nesse caso, é possível e pre-ferível, que o respectivo eluato seja submetido a uma diálise antes de seraplicado na próxima coluna.

Após a própria fermentação e separação do meio de fermenta-ção das células, o meio de fermentação é submetido a uma primeira precipi-tação com o objetivo, de remover proteínas grandes. Essa precipitação éefetuada preferencialmente no primeiro isolador. A centrifugação do precipi-tado obtido dessa maneira é efetuada preferencialmente já no segundo iso-lador. A precipitação é preferencialmente uma precipitação ácida. Condiçõesde reação para uma tal precipitação ácida são conhecidas pelo técnico naárea. Tipicamente utiliza-se 3N H2SO4, para acidificar o sobrenadante paraum pH de 3,5. A centrifugação é efetuada tipicamente a 2400 χ g por 20 mi-nutos a 4°C. O pélete obtido através da centrifugação é lavado, preferente-mente repetidas vezes, com água.

No caso da cepa de Clostridium utilizada, trata-se preferente-mente de C. botulinum tipo A, que foi armazenado como cultura mãe em ummeio apropriado a temperaturas que asseguram a estabilidade. Para a fer-mentação utiliza-se preferentemente o processo descrito por DasGupta B. R.e outros em Toxicon, volume 22, n° 3, páginas 414 até 424, 1984. Nessecaso, 2 % do meio N-Z-amina tipo A são adicionados com 0,5 % de extratode levedura e 0,6 % de pasta de levedura autoclavada e com 4N NaOH éajustado um pH de 7,2 e em seguida, o meio preparado dessa maneira éautoclavado. Nesse meio é acrescentada glicose (20 % em peso, por volu-me) de glicose autoclavada separadamente, o que resulta em uma concen-tração de glicose de 0,5 % no meio. A incubação foi efetuada sem agitação a37°C, sendo que a fermentação foi interrompida após 96 horas. Está no con-texto da presente invenção, que além da fermentação às bateladas descritaacima, também podem ser efetuadas a fermentação em semibateladas fer-mentações às bateladas repetidas ou fermentações contínuas. As medidasnecessárias para esse fim e as necessidades técnicas de aparelhagem sãoconhecidas pelos técnicos na área.

Em um outro estágio, partindo do pélete, o precipitado é nova-mente dissolvido com o objetivo, de liberar a toxina do pélete. Medidas paraesse fim são conhecidas pelos técnicos e entre outras, descritas por Das-Gupta B. R. e outros (vide acima). Por exemplo, a extração pode ser efetua-da por meio de tampão de ácido cítrico-citrato trissódico a 0,1 M, pH 5,5 poruma hora. A essa extração segue-se, imediatamente um outro estágio decentrifugação, tipicamente com 9800 χ g por 20 minutos a 4°C. O pélete ob-tido dessa maneira pode ser eventualmente extraído outra vez tal como des-crito acima. O sobrenadante da extração e no caso da repetição da extração,os dois sobrenadantes, foi imediatamente submetido a uma precipitaçãocom sulfato de protamina. Foi permitido continuar a precipitação a 8°C du-rante a noite. Em seguida, o precipitado foi novamente centrifugado por 20minutos a 4°C e 12000 χ g. No estágio da precipitação de sulfato de prota-mina remove-se especialmente DNA.

O sobrenadante obtido após a centrifugação é submetido a umaprecipitação de sulfato de amônio ou no primeiro isolador ou no segundoisolador, sendo que aqui são removidas outras proteínas maiores. Após aprecipitação com sulfato de amônio, é novamente introduzido um estágio decentrifugação e em seguida, o pélete obtido dessa maneira é dissolvido ou-tra vez e opcionalmente submetido a uma diálise. Em seguida, o extrato ob-tido do pélete preferentemente dializado é novamente centrifugado e subme-tido a uma seqüência de estágios de cromatografia com o objetivo, de purifi-car a neurotoxina botulínica, purificar especialmente até a homogeneidade.Os estágios de cromatografia individuais servem, nesse caso, especialmentepara remover o sulfato de protamina, DNA residual, partes de pequenas pro-teínas e proteínas de tamanho médio, bem como as hemaglutininas do com-plexo de neurotoxina botulínica-proteína. Para esse fim, efetua-se uma se-qüência de vários estágios de cromatografia em uma forma de concretizaçãopreferida. Depois, o eluato é filtrado. Nesse caso, a filtração serve para re-duzir os germes do eluato, que depois contém preferentemente a neurotoxi-na botulínica pura e nenhuma proteína do complexo. Opcionalmente antesda filtração o eluato pode ser diluído ou acrescentados coadjuvantes apro-priados.

Em outros estágios, é efetuada uma nova filtração estéril após aadição dos coadjuvantes. Nesse caso, a filtração é efetuada em reservató-rios de reação, que em seguida, preferentemente em um estágio separadodo processo, são submetidos a uma liofilização. O produto Iiofilizado obtidodessa maneira é fechado.

Os técnicos na área reconhecerão, que antes da inoculação,bem como após diversos estágios do processo, preferentemente da precipi-tação do sulfato de amônio e da filtração no primeiro isolador, este é subme-tido a uma descontaminação ou a uma esterilização. No caso da esteriliza-ção trata-se preferentemente de um tal, que é efetuada por meio de peróxidode hidrogênio em forma de vapor (VHP).

As características da invenção publicadas no relatório descritivoacima e nas reivindicações podem ser essenciais tanto individualmente,quanto também em combinação desejada para a realização da invenção emdiversas formas de concretização.

Claims (28)

1. Dispositivo para a produção fermentativa de um compostobiologicamente eficaz, caracterizado pelo fato de que o dispositivo abrange,pelo menos, um primeiro isolador, que contém um fermentador e que é en-volvido por uma câmara de trabalho é adjacente a essa, sendo que a câma-ra de trabalho está ligada com o meio ambiente através de uma comporta depressão, sendo que no isolador e na câmara de trabalho predomina em cadacaso uma subpressão, em que a pressão (em relação à pressão ambiente)no isolador é mais baixa do que a pressão (em relação à pressão ambiente)na câmara de trabalho e sendo que na comporta de pressão predomina umexcesso de pressão em relação à pressão ambiente.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que a pres-são no isolador é de 20 até 200 Pa mais baixa do que a pressão ambiente.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que apressão na sala de trabalho é de 5 até 50 Pa mais baixa do que a pressãoambiente.

4. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 até 3, emque a pressão na comporta de pressão é de 10 até 100 Pa mais elevada doque a pressão ambiente.

5. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 até 4,caracterizado pelo fato de que o dispositivo abrange, pelo menos, um se-gundo isolador, sendo que o segundo isolador não contém preferentementenenhum fermentador.

6. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 até 5,caracterizado pelo fato de que o dispositivo e/ou o primeiro e/ou o segundoisolador abrange pelo menos um tubo de entrada de ar e um de saída de ar,sendo que o tubo de entrada de ar e de saída de ar está provido de um filtro,sendo que o filtro é preferentemente um filtro HEPA.

7. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteriza-do pelo fato de que a pressão interna do primeiro isolador e do segundo iso-lador é igual.

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteriza-do pelo fato de que a pressão interna do primeiro isolador é diferente dapressão interna do segundo isolador.

9. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 5 até 8,caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo isolador estão ligadosuns com os outros por uma passagem, sendo que a passagem permite umtransporte de substâncias do primeiro para o segundo isolador e preferente-mente também um transporte de substâncias do segundo isolador para oprimeiro isolador.

10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a passagem é uma comporta.

11. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 até 10,caracterizado pelo fato de que o dispositivo abrange uma instalação de este-rilização e/ou uma instalação de desinfecção.

12. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 até 11,caracterizado pelo fato de que o primeiro isolador abrange um fermentadorque trabalha anaerobicamente.

13. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 até 12,caracterizado pelo fato de que o primeiro isolador abrange uma instalaçãode precipitação.

14. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 até 13,caracterizado pelo fato de que o primeiro isolador abrange uma instalaçãode filtração.

15. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 5 até 14,caracterizado pelo fato de que o segundo isolador abrange uma instalaçãode extração.

16. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 5 até 15,caracterizado pelo fato de que o segundo isolador abrange uma instalaçãode precipitação.

17. Dispositivo de acordo com uma das reivindicações 5 até 16,caracterizado pelo fato de que o segundo isolador abrange pelo menos umainstalação de cromatografia.

18. Processo para a produção fermentativa de um composto bio-logicamente eficaz abrangendo- um estágio de fermentação para a produção do composto biologicamenteeficaz; e- uma purificação do composto biologicamente eficaz,sendo que o processo é efetuado em um dispositivo de acordo com uma dasreivindicações 1 até 17.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o composto biologicamente eficaz é uma toxina ou uma ou-tra proteína obtida por fermentação, preferentemente uma toxina botulínica,especialmente uma neurotoxina botulínica.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que a toxina botulínica é uma toxina botulínica de Clostridiumbotulinum dos tipos A, B1 C, D, E1 F ou G ou uma mistura de dois ou maistipos, preferentemente uma toxina botulínica do tipo A.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a toxina botulínica ou a mistura das toxinas botulínicas éuma neurotoxina botulínica ou uma mistura de neurotoxinas botulínicas.

22. Processo de acordo com uma das reivindicações 18 até 21,caracterizado pelo fato de que o estágio de fermentação é efetuado no pri-meiro isolador e a purificação é efetuada inteira ou parcialmente em um se-gundo isolador.

23. Processo de acordo com uma das reivindicações 18 até 22,caracterizado pelo fato de que o estágio de fermentação e uma parte da pu-rificação são efetuados no primeiro isolador e uma parte da purificação éefetuada no primeiro isolador e uma outra parte da purificação no segundoisolador.

24. Processo de acordo com uma das reivindicações 18 até 23,caracterizado pelo fato de que o estágio de fermentação e a precipitação efiltração do produto do estágio de fermentação como parte da purificaçãosão efetuados no primeiro isolador.

25. Processo de acordo com uma das reivindicações 18 até 24,caracterizado pelo fato de que o primeiro isolador e o segundo isolador fun-cionam com temperaturas iguais ou diferentes.

26. Processo de acordo com uma das reivindicações 18 até 25,caracterizado pelo fato de que a temperatura no primeiro/ou segundo isola-dor é alterada em função do respectivo estágio do processo.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que a temperatura no primeiro isolador perfaz de cerca de 20até cerca de 50°C e a temperatura no segundo isolador perfaz cerca de -5até cerca de +25°C.

28. Processo de acordo com uma das reivindicações 18 até 27,caracterizado pelo fato de que o processo abrange os seguintes estágios,preferentemente nesta ordem:a) no primeiro isolador- inoculação do meio de fermentação com a cepa produtora para o compostobiologicamente eficaz, de preferência, manualmente;- fermentação da cepa produtora;- separação do sobrenadante das células da cepa produtora; e- precipitação do sobrenadante;b) no segundo isolador:- centrifugação do sobrenadante precipitado com formação de um pélete;- extração do pélete, centrifugação e obtenção de um sobrenadante;- precipitação do sobrenadante com subsequente centrifugação com forma-ção de um sobrenadante;c) no primeiro ou segundo isolador:- precipitação do sobrenadante;- centrifugação do precipitado;- solubilização do pélete obtido através da centrifugação do precipitado;- diálise do pélete solubilizado e centrifugação do dialisado;- submissão do dialisado à cromatografia- filtração do eluato obtido.