KR20080018177A - 발효에 의해 생물학적 활성 화합물을 제조하기 위한 장치및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 발효기가 격리기 내에 위치하고 이 격리기는 작업 챔버 내에 또는 작업 챔버에 인접하여 위치하며 상기 격리기와 작업 챔버 내에는 주변 압력에 비해 저압이 형성되어 있는, 발효에 의해 생물학적 활성 물질을 제조하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.

Description

발효에 의해 생물학적 활성 화합물을 제조하기 위한 장치 및 방법{DEVICE AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS BY FERMENTATION}

본 발명은, 발효기가 격리기 내에 위치하고 상기 격리기는 작업 챔버 내에 또는 작업 챔버에 인접하여 위치하며, 상기 격리기와 작업 챔버 양자에 주변 압력에 대한 압력 구배가 형성되어 있는, 생물학적 활성 물질의 발효 제조를 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.

생물학적 활성 화합물을 이용한 작업은, 잠재적 위해 요인 또는 중독으로부터 작업자를 보호하기 위해, 제조 설비에 더 많은 안전 대책을 필요로 한다. 생물학적 활성 화합물은 대개 약학적 용도를 위해 제조되거나 사용되며, 이것이 제조 과정에서 엄격한 청정도 요건이 준수되어야 하는 이유이다. 초순수 화합물의 제조를 위한 설비의 통상적인 구조는 외측으로부터 폐쇄되어 있고 제2 챔버로 둘러싸여 있는 제1 내측 챔버로 구성된다. 생물학적 물질을 처리하는 작업자는 상기 제2 챔버 내에 체류하는 한편, 생물학적 물질의 처리는 주로 제1 챔버 내에서 이루어진다. 상기 두 챔버는 개폐식 슬루스(sluice)를 통해 서로 연결되어 있다. 상기 제1 챔버는 일반적으로 글러브 박스이며, 따라서 처리 단계는 글러브를 사용하여 제2 챔버로부터 이루어질 수 있다. 제2 챔버는 일반적으로 외부로부터 격리되어 있으나, 개폐식 슬루스를 통해 외부와 연결되어 있다. 상기 양 챔버에서는, 이상적으로는 멸균 상태와 청정실 요건이 유지된다. 생물학적 활성 물질이 미생물 병원균 등의 주변 입자들에 의해 오염되는 것을 방지하기 위해, 제1 챔버 내에는 과압, 일반적으로 15 Pa의 과압이 형성된다. 이와는 대조적으로, 제2 챔버 내에는, 제1 챔버에 비해서는 저압, 그러나 주변 압력에 비해서는 과압이 형성된다. 따라서, 제2 챔버로부터의 입자 또는 병원균이 제1 챔버로 침투하는 것이 방지된다. 이로써, 생물학적 활성 물질이 주변의 오염으로부터 보호된다.

발효 공정에 의해 생물학적 활성 화합물을 제조하는 경우, 공정 단계들이 적어도 일시적으로 개방되는 장치에서 수행되게 된다. 예를 들어, 접종이 그러한 공정 단계이다. 대부분의 경우, 이 단계는 수작업으로 이루어져야 한다. 출발 물질(세포 저장물)을 함유하는 장치(용기, 바이알)가 개방되는 이러한 과정에서, 순간적으로나마, 에어로졸이 형성될 수 있다. 이것은 발효 시작 시까지의 사전 배양 단계의 중간 단계에 있어서도 유효하다. 이때, 발효기의 포트가 순간적으로나마 개방되며, 이에 의해 에어로졸이 형성될 수 있다. 마찬가지로, 발효 생성물, 즉 생물학적 활성 물질의 처리 시에도, 에어로졸의 형성이 일어날 수 있다. 따라서, 환경에 대한 병원균, 박테리아 또는 독성 물질의 노출 위험이 존재한다. 제1 챔버에 비해 제2 챔버에서의 상대적 저압에 의해 발생된 제1 챔버로부터의 에어로졸이 제2 챔버로 침투하여, 제2 챔버에서 작업하는 작업자에게 위협이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 작업상의 안전성을 담보하기 위해, 이 경우 예를 들어 작업자의 백신 접 종, 보호용 의복 착용 등의 더 많은 사전 대책이 강구되어야 한다.

따라서, 생물학적 물질이 환경으로부터의 오염으로부터 보호됨과 동시에 작업자의 에어로졸 노출이 감소 또는 완전히 방지되는, 발효에 의한 생물학적 활성 물질의 제조를 위한 방법 및 장치가 요구되고 있다.

본 발명은 첨부하는 청구의 범위에 따른 장치 및 방법을 제공함으로써 상기 목적을 달성한다.

본 발명은, 환경으로부터의 입자 및 병원균에 의한 생물학적 물질의 오염을 방지함과 동시에, 생물학적 물질을 처리하는 작업자에 대한 위해 잠재성을 감소시키는, 발효에 의해, 바람직하게는 초순수 형태로 생물학적 활성 물질을 제조하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 상기 발효 공정은 적어도 접종 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 발효 공정이 수작업으로 수행되는 단계를 하나 이상 포함하는 것이 더 바람직하며, 상기 단계가 접종 단계인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 방법 및 장치는, 제조 공정 및/또는 처리 공정을 담당하고 있는 작업자에게 또는 에어로졸 형성을 통해 환경에 기본적으로 어떠한 위해도 주지 않고, 에어로졸 형성이 연관되어 있거나 연관될 수 있는 승인된 제조 기법 및 정제 기법을 사용할 수 있게 한다. 다시 말해서, 본 발명의 장치 및 본 발명의 방법은, 생물학적 물질이 에어로졸 형성과 근본적으로 연관이 있다 하더라도, 제조 공정을 담당하는 작업자 및 환경이 생물학적 활성 물질, 박테리아 및/또는 병원균에 노출되는 것을 감소시킴과 동시에, 생물학적 물질을 효율적으로 제조 및 정제할 수 있도록 하는 확립된 기법의 적용을 가능하게 한다.

본 발명의 장치는 작업 챔버에 의해 둘러싸이거나 그에 인접한 격리 챔버(격리기)를 하나 이상 포함한다. 작업 챔버는 압력 슬루스를 통해 환경과 연결되어 있다. 격리기와 작업 챔버 양자에는 환경의 압력에 비해 낮은 압력이 형성되어 있으며, 격리기 내의 압력은 작업 챔버 내의 압력보다 더 낮다. 압력 슬루스 내에는 주변 압력에 비해 과압이 형성되어 있다. 상기 격리기는 적어도 발효기를 포함하며, 그 발효기 내에서 발효에 의해 생물학적 활성 물질이 제조된다.

본 발명의 장치를 사용하면, 생물학적 활성 물질은 격리기 내에서 제조 및/또는 처리된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 격리기는 그 환경과 에너지 교환은 이루어지나 그 환경과 제어되지 않은 물질 수송은 허용하지 않는, 환경에 비해 정의된 기밀 시스템이다. 물질과 그 환경과의 제어된 수송, 예를 들어 장비, 시약, 출발 물질, 중간 생성물 및 최종 생성물 각각의 투입 또는 회수는 하나 이상의 슬루스, 이중 트랩 용기(즉, 소위, α-용기 또는 α-백이 결합된 β-포트)에 의해 이루어질 수 있다. 발효 생성물 또는 생물학적 활성 물질의 발효 및/또는 정제 전, 중 또는 후, 제어된 물질 수송은 가능하다.

격리기는 적절한 설비를 통해 조절되는 과압 또는 저압에서 작동될 수 있다. 또한, 상기 격리기 내에 비활성 기체 분위기를 생성할 수 있다. 상기 격리기는 통상, 일반적으로 필터가 장착되어 있는 하나 이상의 공기 공급관(들) 및 공기 배출관(들)을 구비한다. 따라서, 상기 격리기 내에는 m³당 병원균 수가 바람직하게는 100개 미만, 더 바람직하게는 10개 미만, 가장 바람직하게는 1개 미만이 된다. 상기 필터는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 필터의 예로는 HEPA(High Efficiency Particulate Filter; 고효율 미립자 필터)가 있다.

상기 격리기 내에 배치되는 장비, 장치 또는 부품은 외부로부터의 제어 시스템에 의해 또는 작업 챔버로부터 가동되는 격리기에 부착된 글러브 도입구를 통해 이동 또는 작동이 가능하다.

상기 격리기는 전부 또는 일부가, 생물학적으로 비활성이며 세척이 용이하고 각각 계내 오염 제거 또는 멸균이 가능한 재료로 제조되는 것이 바람직하다. 따라서, 포르말린, 산화에틸렌 또는 기상 과산화수소(VHP)를 사용한 멸균이 가능한 재료가 바람직하다. 상기 재료로는, 예를 들어 유리, 스테인레스강 또는 PVC 등의 중합체를 들 수 있다. 상기 격리기는 그 내면의 전부 또는 일부가 유리, 스테인레스강 또는 중합체 등의 다른 적절한 재료로 이루어지도록 제조되는 것이 바람직하다. 따라서, 경질 및 연질 중합체(경질 및 연질 벽 절연재)를 사용할 수 있다. 글러브는 일반적으로 네오프렌, 하이팔론, 비닐 또는 다른 적절한 재료로 제조된다.

일반적으로 격리기는 온도 제어 및 온도 조절을 위한 설비를 구비한다.

일반적으로 격리기는 작업 챔버 내에 또는 그에 인접하여 배치된다. 격리기와 작업 챔버 간에 압력 구배가 형성된다. 이로써, 격리기 내에는 작업 챔버의 압력에 비해 저압이 형성되고, 작업 챔버는 주변 압력에 비해 저압을 나타낸다. 주변 압력은 101,325 Pa이나, 지리적 위치 또는 기상 조건에 따라 달라질 수 있다.

일반적으로 격리기 내의 작동 압력은, 각각 주변 압력(101,325 Pa)에 비해 20∼200 Pa 범위, 바람직하게는 40∼100 Pa 범위, 가장 바람직하게는 55∼75 Pa 범위 더 낮은 압력이다.

통상, 격리기 내의 작동 압력은 작업 챔버에 비해 약 10∼100 Pa, 바람직하게는 20∼80 Pa, 더 바람직하게는 약 40∼60 Pa 더 낮다.

본 발명의 실시형태에 있어서, 격리기와 작업 챔버 간의 압력 차이의 전형적인 값은, 기상 및 장비에 의한 변동치 내에서, 35∼57 Pa의 범위, 바람직하게는 약 45 Pa이며, 즉, 격리기 내의 압력은 각각 작업 챔버 내에서의 압력보다 약 35∼57 Pa 또는 약 45 Pa 더 낮다.

격리기로의 공기의 유입 및 유출은, 격리기 내 병원균 수가 m³당 최대 100개, 바람직하게는 최대 10개, 가장 바람직하게는 최대 1개가 되도록, 필터를 통해 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 작업 챔버는 하나 이상의 개폐식 개구를 통한 물질 또는 장비의 교환을 위해 한편으로는 격리기에 기밀 연결되어 있는 기밀 밀폐된 시스템이다. 다른 한편으로, 상기 작업 챔버는 하나 이상의 개폐식 압력 슬루스를 통해 기밀 상태로 물질 또는 장비를 교환하고/하거나 출입하기 위해 환경과 연결되어 있다. 상기 작업 챔버는 격리기에 둘러싸이거나 이에 인접하여 위치한다. 작업 챔버로의 공기의 유입 및 유출은 작업 챔버 내 병원균 수가 m³당 최대 200개, 바람직하게는 최대 100개, 가장 바람직하게는 최대 10개가 되도록, 필터를 통해 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 필터의 예로는 HEPA 필터라는 상표명으로 시판되는 것을 들 수 있다.

상기 작업 챔버는 바람직하게는 온도가 약 19∼26℃이고 상대 습도가 40∼60%이다. 제1 격리기와 제2 격리기는, 서로 독립적으로, 생물학적 활성 물질의 제조 및 정제를 수행하는 데 있어서 일반적이고 적합한 온도 및 상대 습도를 나타낸다.

작업 챔버 내에는, 격리기의 압력보다 높은 작동 압력이 형성되어 있으나, 주변 압력과 압력 슬루스에 대해 압력 구배가 형성되어 있다.

일반적으로, 작업 챔버 내의 압력은 주변 압력에 비해 5∼50 Pa, 바람직하게는 10∼30 Pa, 가장 바람직하게는 12∼18 Pa 더 낮다.

본 발명의 실시형태에 있어서, 주변 압력과 비교한 압력 차이의 전형적인 값은, 기상 및 장비에 의한 변동치 내에서, 15 Pa이며, 즉, 작업 챔버 내의 압력이 주변 압력보다 약 15 Pa 더 낮다.

상기 작업 챔버는 하나 이상의 개폐식 압력 슬루스를 통해 주변에 연결된다. 상기 슬루스 내에는 주변 압력에 비해 10∼100 Pa, 바람직하게는 20∼80 Pa, 가장 바람직하게는 25∼35 Pa의 과압이 형성되어 있다.

일반적으로, 압력 슬루스와 작업 챔버 간에는 10∼200 Pa, 바람직하게는 20∼100 Pa, 가장 바람직하게는 40∼60 Pa의 압력 차이가 존재한다.

본 발명의 실시형태에 있어서, 압력 슬루스와 작업 챔버 간의 압력 차이의 전형적인 값은, 기상 및 장비에 의한 변동치 내에서, 45 Pa이며, 즉, 작업 챔버 내의 압력이 주변 압력보다 약 45 Pa 더 낮다.

일반적으로, 압력 슬루스와 격리기 간에는 10∼300 Pa, 바람직하게는 50∼200 Pa, 가장 바람직하게는 80∼100 Pa의 압력 차이가 존재한다. 압력 슬루스와 격리기 간의 압력 차이의 전형적인 값은, 기상 및 장비에 의한 변동치 내에서, 90 Pa이며, 즉, 격리기 내의 작동 압력이 압력 슬루스 내의 압력보다 약 90 Pa 더 낮다.

특히 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 장치는 하나 이상의 다른 격리기를 포함한다. 상기 하나 이상의 다른 격리기는 제1 격리기와 비교하여 동일한 작업 챔버 내에 위치할 수 있거나 또는 동일한 작업 챔버에 인접하여 위치할 수 있으며, 이것은 또한, 예를 들어 하나 이상의 개폐식 슬루스, 이중 트랩 용기 또는 포트를 통해 제1 격리기에 기밀 연결될 수 있다. 그러나 상기 격리기는 서로 연결되지 않을 수도 있다. 상기 하나 이상의 다른 격리기는 전술한 제1 격리기와 동일한 특징을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 격리기 내에서는, 일반적으로 발효 단계가 수행되며, 이것은 생물학적 활성 물질이 제조되는 발효 단계인 것이 바람직하다. 상기 발효 단계는 하나 이상의 접종을 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 격리기는 하나 이상의 발효기를 포함한다.

일반적으로 격리기 내에서 생물학적 물질의 정제에 필요한 하나 이상의 처리 단계 역시 수행된다. 따라서, 발효 및 정제는 하나의 동일한 격리기 내에서 또는 상이한 격리기 내에서도 수행될 수 있으며, 예를 들어 발효는 제1 격리기 내에서, 정제는 제2 격리기 내에서 수행될 수 있다.

생물학적 활성 물질의 합성이 수행되는 발효 단계는 발효기 내에서 이루어진다. 이때, 혐기성 작업 챔버 또는 호기성 작업 챔버 중 하나를 선택할 수 있다. 상기 발효기는, 당업자의 지식에 따라, 특정 발효 조건에 알맞게 구성하고 장착한다. 발효기는 회분식 발효용 발효기, 반회분식 발효용 발효기 또는 연속식 발효용 발효기일 수 있다. 회분식 발효용 발효기인 것이 바람직하다.

발효 단계는 또한 주 발효기에 접종하기 위한 사전 배양 또는 초기 배양을 포함할 수 있다. 이를 위해 필요한 다양한 처리법 및 해당 공정 장비는 당업자에게 알려져 있고, 특히, 생물학적 활성 물질을 생산하는 생산 균주의 백신 저장물의 1차 및/또는 2차 증폭을 가능하게 하는 하나 이상의 발효기를 포함한다. 이와 관련된 처리법은 또한, 예를 들어 제조용 세포 은행(working cell bank)의 확립, 세포 물질의 1차 증폭, 세포 물질의 2차 증폭 및 실제 발효 단계를 포함하며, 실제 발효 단계란, 특히, 생물학적 활성 화합물의 합성을 위한 세포의 생육 단계를 의미한다. 상기 단계들은 각각의 생산 유기체를 통해 정의되는 온도 또는 온도 구배에서 수행되는 것이 바람직하다. 따라서, 온도는, 경우에 따라, 연속적으로 또는 불연속적으로 제조 조건에 맞춘다.

생물학적 활성 물질의 정제에 필요한 하나 이상의 단계 또는 처리는 격리기 내에서 수행할 수 있다. 따라서, 격리기는 그에 필요한 장비를 포함한다.

생물학적 활성 물질의 정제는 본 발명 장치의 제2 격리기 내에서 수행할 수도 있다. 상기 제2 격리기 내에서는 정제 처리의 단지 일부분만 수행되고, 필요한 처리의 나머지 부분은 제1 격리기 또는 하나 이상의 추가 격리기 내에서 수행된다.

생물학적 활성 물질의 제조에 필요하거나 그와 관련이 있는 특정 처리는, 이들이 에어로졸 형성을 수반하지 않거나 또는 생물학적 활성 물질이 제조 또는 조작을 담당하는 작업자 또는 환경에 대한 위해가 없다고 생각되는 형태 또는 용기로 입수 가능하다면, 격리기 외부에서 수행할 수도 있다.

생물학적 활성 물질을 생산하는 발효는 바람직하게는 박테리아, 특히 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) 패밀리의 발효이다. 이것은 재조합 또는 유전적 변형 클로스트리듐 보툴리듐 균주뿐 아니라, 다른 재조합 또는 유전적 변형 이종성 발현 시스템[예를 들어, 이 콜라이(E. coli)]에도 적용될 수 있다.

설치된 장비를 사용하여, 대체로, 미생물의 발효 성장에 의해 합성되는 모든 생물학적 활성 화합물, 특히 단백질을 생산할 수 있다.

발효 공정을 이용하여 제조하는 생물학적 활성 화합물은 바람직하게는 독소이며, 더 바람직하게는 보툴리눔 독소, 가장 바람직하게는 보툴리눔 신경 독소이다.

보툴리눔 독소는 박테리아 클로스트리듐 보툴리눔에 의해 생산되며, 여러 가지의 혈청형, 즉, 보툴리눔 독소 A형, B형, C형, D형, E형, F형, G형으로 존재한다. 클로스트리듐 보툴리눔에 의해 생산되는 보툴리눔 독소는 보툴리눔 신경 독소, 즉, 독성 효과의 원인이 되는 단백질 및 그 자체로는 비독성인 복합체화 단백질의 복합체이다. 이러한 단백질로는 상이한 몰질량을 갖는 혈구응집소(헤마글루티닌) 및 하나 이상의 비혈구응집성 단백질이 있다. 보툴리눔 신경 독소 유래의 복합체 및 (박테리아) 복합체 단백질은 일반적으로 보툴리눔 독소라 불린다. A형, B형 및 C형의 복합체는 시판되고 있으며, A형은 예를 들어 BOTOX

로 시판되고 있다. 이러한 복합체들을 추가로 가공하여, 상이한 단백질 조성을 갖는 복합체를 생산하고 보툴리눔 신경 독소 자체로까지 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위 내에서, 보툴리눔 신경 독소란 용어는 독성 효과의 원인이 되는 단백질, 즉, 박테리아 복합체화 단백질을 함유하지 않는 초순수 보툴리눔 독소를 의미하는 것으로 사용된다. 보툴리눔 독소 A형은 분자량이 약 150 kDa이며, 본 출원인에 의해 상표명 Xeomin

으로 시판되고 있다.

본 발명의 범위 내에는, "보툴리눔 독소"의 모든 형태, 특히 다양한 혈청형, 보툴리눔 신경 독소와 복합체화 단백질의 다양한 복합체, 보툴리눔 신경 독소 그 자체와, 개질된 또는 상응하는 재조합 생산 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 신경 독소(상응하는 돌연변이, 결실 등 포함)가 적합하다. 적절한 돌연변이체로서 WO 2006/027207 A1에 기재된 돌연변이체를 들 수 있다. 또한, 다양한 혈청형(복합체 또는 초순수 및/또는 재조합 형태)의 혼합물, 예를 들어 A형 보툴리눔 독소와 B형 보툴리눔 독소의 혼합물 또는 A형 신경 독소와 B형 신경 독소의 혼합물을 제조하는 것도 본 발명의 범위 내에 속한다.

A형 및 B형 보툴리눔 신경 독소의 제조 방법은, 예를 들어 국제 특허 출원 WO 00/74703에 기재되어 있다. 보툴리눔 신경 독소 및 복합체화 단백질로 제조된 복합체에 비해 유익한, 실질적으로 면역원성을 상실한 (단리된) 보툴리눔 신경 독소의 특성으로 인하여, 본 발명도 그러한 바와 같이, 보툴리눔 신경 독소의 안전하고 신뢰할 만한 산업적 제조를 위한 장치 및 방법을 제공할 필요성이 특히 크다.

실제 사용되는 격리기의 선택 및/또는 수는 제조하고자 하는 생물학적 화합물에 따라 당업자가 자유롭게 선택할 수 있다. 본 명세서에서 보다 상세히 설명되어 있는 구체적 정제에는, 2개 이상의 격리기를 사용하는 것이 유익하다. 따라서, 격리기는 특히 그 안에 또는 그 안의 일부에 형성되어 있는 온도에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명의 범위에 있어서는, 제1 격리기는 고온에서, 예를 들어 약 20℃∼50℃에서 작동되고, 제2 격리기는 저온에서, 예를 들어 약 -5℃∼+25℃ 범위에서 작동되는 것이 바람직하다. 따라서, 제1 격리기 내에서는, 적절한 고온을 요하거나 이 온도에서 수행될 수 있는 제조 단계와 정제 단계가 수행된다. 여기에는 특히 생산 균주의 접종, 발효 및/또는 침전이 포함된다. 이와는 달리, 적절한 저온을 요하며 이 온도 범위에서 특히 유리하게 수행될 수 있는 신경 독소의 제조 공정과 특히 정제 단계는 제2 격리기 내에서 수행된다.

또한, 양 온도 범위에서, 즉, 상기 양 격리기 각각에서 수행될 수 있는, 일반적으로 제조 단계와, 특히 발효 및 정제 단계는, 반응 단계의 수행을 위한 적절한 반응 조건, 특히 온도의 유지를 위한 치수 조정(dimensioning) 및 이 치수 조정으로 인한 에너지 소비를 고려하거나, 또는 각 처리의 관리 용이성 또는 실행 가능성을 고려하면, 결국 하나의 격리기 내에서 수행되는 것이 유익하다는 점을 이해할 것이다.

상기 제2 격리기는 기본적으로 제1 격리기와 유사하게 제조되지만, 장치에 따라 설비 및 장비 또는 특징적 기술 장비가 장착되는데, 그 이유는 이것들이 제2 격리기 내에서 계획된 정제 단계의 수행 또는 그 처리에 필요하기 때문이다. 여기서, 제2 격리기 내에서 수행되는 바람직한 정제 단계는 침전, 추출, 원심분리, 투석 및 크로마토그래피를 포함하는 군에서 선택된다. 이에 따르면, 상기 제2 격리기는 하나 이상의 침전 설비, 추출 설비, 원심분리 설비, 투석 설비 및/또는 크로마토그래피 설비를 포함한다. 바람직하게는 침전 설비는, 침전에 필요한 화합물(들)을 첨가하기 위한 공급 파이프가 구비된, 침전을 수행하기 위한 용액이 포함된 반응 용기를 포함한다. 또한, 상기 침전 설비는 기본적으로 상청액 및 침전물을 배출하기 위한 수단을 포함한다. 적절한 설비는 당업자에게 알려져 있다. 추출 설비는 일반적으로 추출용 용액이 포함된 반응 용기, 추출 매질을 첨가하기 위한 공급 파이프 및 추출액으로부터 추출물 함유 유체를 분리하기 위한 장치를 포함한다. 원심분리 설비는 일반적으로 고체-고체 혼합물 또는 액체-고체 혼합물을 분리하기 위한 원심분리기를 포함한다. 크로마토그래피 설비는 일반적으로 크로마토그래피 물질이 충전되어 있는 크로마토그래피 컬럼과 유입구 및 유출구와 크로마토그래피 컬럼 공급용 및 용출용으로 사용되는 적절한 매질을 함유하는 용기를 포함한다. 사용되는 크로마토그래피는, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, HPLC 또는 친화성 크로마토그래피이다.

따라서, 2개 이상의 격리기가 사용된다면, 단지, 양 격리기를 포함하는 장치 전체가 공기 공급관 및 공기 배출관을 포함하고 양 격리기가 하나 이상의 중간 도관으로 연결되도록, 상기 격리기가 서로 연결되는 것이 본 발명의 범위 내에 속한다. 여기서, 제1 격리기 및 제2 격리기 및/또는 임의의 추가 격리기가 각각 서로 독립적으로 공기 공급관 및 공기 배출관을 포함하는 것 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.

상기 제1 격리기 및 상기 제2 격리기는 외압에 비해 낮은 내압을 나타낸다. 동시에, 양 격리기가 동일한 내압을 나타내는 것도 본 발명의 범위에 속한다. 그러나, 양 격리기가 상이한 내압을 나타내는 것 역시 본 발명의 범위에 속한다. 따라서, 각 격리기 내에서 수행되는 공정 단계로 인해 에어로졸 형성 가능성이 더 큰 격리기의 내압은 낮추는 것이 특히 바람직하다.

2개의 격리기를 사용한다면, 상기 격리기 사이에 통로 형태, 예를 들어 양 격리기 사이에 슬루스 형태의 연결부를 마련하는 것이 바람직한데, 그 이유는 제조 및 정제된 물질을 다른 제조 및 처리 단계로 이송하는 것은 격리기에 의해 형성된 장벽을 파괴하지 않고서는 이루어질 수 없기 때문이다. 본 발명의 장치, 본 발명 장치의 각각의 격리기 및 적어도 하나의 격리기가 멸균 장치를 갖도록 디자인하는 것 역시 기본적으로 동일한 목적을 만족시킨다. 해당 멸균 장치는 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 기상 과산화수소의 발생을 위한 발생기를 포함한다. 이때, 기상 과산화수소의 사용이 저압 조건의 관점에서 특히 유익하다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 생물학적 활성 화합물의 제조를 위한 발효 단계 및 상기 생물학적 활성 화합물의 정제 단계를 포함하는, 생물학적 활성 화합물의 발효 제조 방법에 관한 것으로, 발효 제조 및/또는 정제는 전부 또는 일부가 하나 이상의 격리기 내에서 수행된다. 바람직하게는, 상기 발효 단계와, 정제 단계 중 일부분 이상은 제1 격리기 내에서 수행되고, 정제 단계 중 일부분 이상은 제2 격리기 내에서 수행된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 발효 단계는 하나 이상의 접종 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 접종 단계는 수작업으로 이루어진다. 본 발명의 범위 내에는, 추가 격리기를 사용하는 것도 포함된다. 생물학적 활성 물질은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 보툴리눔 독소, 특히 보툴리눔 신경 독소이다. 본 발명과 관련하여 개시된 특징들은 본 발명 방법 단독 또는 임의의 조합의 특징들 역시 나타낸다.

후처리와 관련한 처리로는 원심분리, 투석, 추출, 침전, 황산프로타민 침전, 황산암모늄 침전, 일반적으로 펠릿으로서 형성되는 침전물의 가용화, 투석, 크로마토그래피 단계 또는 크로마토그래피 공정 및 여과가 있다. 크로마토그래피 공정이란, 연속된 개개의 여러 크로마토그래피 공정을 말한다. 따라서, 각각의 경우에, 이것은 동일한 크로마토그래피 공정 또는 상이한 크로마토그래피 공정들일 수 있다. 약학적 활성 화합물이 보툴리눔 신경 독소 A형인 경우, 이것은 적절한 컬럼 물질을 사용하는 연속된 3 단계의 크로마토그래피 단계이다. 이때, 다음 컬럼에 주입하기 전에 특정 용출물에 대해 투석을 실시하는 것이 가능하며 바람직하다.

실제 발효 공정 및 세포로부터 발효 배지를 분리한 후, 그 발효 배지에 대해, 대형 단백질을 제거하기 위한 1차 침전을 수행한다. 이 침전은 제1 격리기 내에서 수행하는 것이 바람직하다. 이와 같은 얻은 침전물의 원심분리는 제2 격리기 내에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 침전은 산 침전인 것이 바람직하다. 상기 산 침전에 대한 반응 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 상청액을 pH 3.5로 산성화하기 위해, 3 N H₂SO₄가 사용된다. 원심분리는 통상 4℃에서 2,400 x g로 20분 동안 이루어진다. 원심분리를 통해 얻은 펠릿은 물로, 바람직하게는 반복하여 세척한다.

바람직하게 사용되는 클로스트리듐 균주는, 안정성을 보장하는 온도에서 적절한 배지 중에서 저장된 C. 보툴리눔 A형이다. DasGupta B. R. 등의 문헌[Toxicon, vol. 22, No. 3, p. 414-424, 1984]에 기재된 발효법이 이용된다. 따라서, 0.5%의 효모 추출물 및 0.6%의 고압 증기 멸균 처리한 효모 페이스트를 2%의 N-Z-아민 A형 배지에 첨가하고, 4 N NaOH를 사용하여 pH 7.2로 조절하고, 그 후 이와 같이 제조된 배지를 고압 증기 멸균 처리한다. 이 배지에, 별도로 고압 증기 멸균 처리한 글루코스(부피당 20 중량%)를 첨가하여 배지 중의 최종 글루코스 농도가 0.5%가 되도록 한다. 항온처리는 37℃에서 교반하지 않고 수행하며, 이때 발효는 96 시간 후에 중단한다. 전술한 회분식 발효 이외에도, 반회분식 발효, 반복 회분식 발효 또는 연속식 발효를 수행하는 것도 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 목적에 필요한 처리와 상기 장치에 관한 요건은 당업자에게 공지되어 있다.

후속 단계에서는, 펠릿으로부터 독소를 방출시키기 위해, 펠릿으로부터 생성된 침전물을 다시 용해시킨다. 이를 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있고 특히 DasGupta B. R. 등의 상기 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 0.1 M 시트르산-시트르산삼나트륨 완충액(pH 5.5)을 사용한 추출을 1 시간 동안 수행할 수 있다. 그 후, 상기 추출에 이어, 일반적으로 4℃에서 9,800 x g로 20분 동안 추가 원심분리 단계를 수행한다. 그 후 이렇게 얻은 펠릿을 경우에 따라 전술한 바와 같이 다시 추출할 수 있다. 그 후 추출 상청액과, 추출을 반복한 경우에는 양 추출액에 대해 황산프로타민 침전을 수행하였다. 침전은 8℃에서 밤새 계속하였다. 그 후, 침전물을 4℃에서 12,000 x g로 20분 동안 다시 원심분리하였다. 황산프로타민 침전 단계에서 특히 DNA가 제거되었다.

제1 격리기 또는 제2 격리기 내에서, 원심분리 후에 얻은 상청액에 대해 황산암모늄 침전을 수행함으로써, 대형 단백질을 제거한다. 황산암모늄 침전 단계 후에 추가 원심분리 단계를 수행하고, 그 후 그와 같은 얻은 펠릿을 용해시키고 경우에 따라 투석을 실시한다. 그 후, 바람직하게는 투석하여 펠릿으로부터 얻은 추출물을 다시 원심분리하고, 이것으로, 보툴리눔 신경 독소를 정제하기 위한, 특히 균질하게 정제하기 위한 연속 크로마토그래피 단계를 수행한다. 여기서 각각의 크로마토그래피 단계는 황산프로타민, 잔류 DNA, 소형 단백질 및 중간 크기 단백질의 일부 및 보툴리눔 신경 독소 단백질 복합체의 혈구응집소를 제거하는 역할을 한다. 이를 위해, 바람직한 실시형태에서는, 몇 단계의 크로마토그래피 단계를 연속적으로 수행한다. 그 후, 용출물을 여과한다. 이 여과에 의해 용출물의 병원균이 감소되며, 그 후 상기 용출물은 바람직하게는 순수한 보툴리눔 신경 독소를 함유하고 복합 단백질은 더 이상 함유하지 않는다. 경우에 따라, 상기 용출물을 여과 전에 희석하고, 그에 따라 적절한 보조제를 첨가할 수 있다.

후속 단계 중에, 보조제를 첨가한 후 추가 멸균 여과를 수행한다. 이때, 여과는 반응 용기 내에서 수행하고, 그 후, 바람직하게는 별도의 공정 단계로 동결 건조를 수행한다. 그와 같이 동결 건조된 생성물은 밀봉한다.

당업자라면, 접종 전과 여러 공정 단계 후에, 특히 제1 용기 내에서의 황산암모늄 침전 및 여과 후에, 상기 용기에 대해 오염 제거 처리 및 그에 따른 멸균 처리가 수행된다는 것을 알 것이다. 멸균은 기상 과산화수소(VHP)를 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.

전술한 설명 및 청구의 범위에 개시된 본 발명의 특징들은 본 발명을, 본 발명의 다양한 실시형태들을 단독으로 또는 임의의 조합으로 수행하는 데 있어서 필수적인 것일 수 있다.

Claims (28)

1. 생물학적 활성 화합물의 발효 제조를 위한 장치로서, 이 장치는 발효기를 포함하고 작업 챔버로 둘러싸이거나 작업 챔버에 인접하여 위치하는 적어도 제1 격리기를 포함하며, 상기 작업 챔버는 압력 슬루스(sluice)를 통해 환경에 연결되고, 상기 격리기와 상기 작업 챔버 내에는 저압이 형성되어 있으며, 상기 격리기 내의 (주변 압력에 대한) 압력은 상기 작업 챔버 내의 (주변 압력에 대한) 압력보다 낮고, 상기 압력 슬루스 내에는 주변 압력에 비해 과압이 형성되는 것을 특징으로 하는 장치.
2. 제1항에 있어서, 상기 격리기 내의 압력은 주변 압력보다 20∼200 Pa 더 낮은 것인 장치.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 작업 챔버 내의 압력은 주변 압력보다 5∼50 Pa 더 낮은 것인 장치.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압력 슬루스 내의 압력은 주변 압력보다 10∼100 Pa 더 높은 것인 장치.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 적어도 제2 격리기 를 포함하며, 상기 제2 격리기는 바람직하게는 발효기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 장치.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치 및/또는 상기 제1 격리기 및/또는 상기 제2 격리기는 적어도 공기 공급관 및 공기 배출관을 포함하며, 상기 공기 공급관 및 공기 배출관에는 필터가 장착되고, 상기 필터는 바람직하게는 HEPA 필터인 것을 특징으로 하는 장치.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제1 격리기의 내압은 상기 제2 격리기의 내압과 동일한 것을 특징으로 하는 장치.
8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 제1 격리기의 내압은 상기 제2 격리기의 내압과 상이한 것을 특징으로 하는 장치.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 격리기와 상기 제2 격리기는 통로를 통해 서로 연결되며, 상기 통로는 제1 격리기로부터 상기 제2 격리기로의 물질 수송을 허용하고, 바람직하게는 또한 상기 제2 격리기로부터 상기 제1 격리기로의 물질 수송을 허용하는 것을 특징으로 하는 장치.
10. 제9항에 있어서, 상기 통로가 슬루스인 것을 특징으로 하는 장치.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 멸균 설비 및/또는 소독 설비를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 격리기가 혐기성 공정 발효기를 포함하는 것을 특징으로 장치.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 격리기가 침전 설비를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 격리기가 여과 설비를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
15. 제5항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 격리기가 추출 설비를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 격리기가 침전 설비를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 격리기가 적어도 크로 마토그래피 설비를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
18. 생물학적 활성 화합물의 발효 제조 방법으로서,

    - 생물학적 활성 화합물의 제조를 위한 발효 단계,

    - 상기 생물학적 활성 화합물의 정제 단계

    를 포함하며, 이 방법은 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 장치에서 수행하는 것인 발효 제조 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 생물학적 활성 화합물은 발효로부터 제조되는 독소 또는 다른 단백질이며, 바람직하게는 보툴리눔 독소이고, 더 바람직하게는 보툴리눔 신경 독소인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소는 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형 보툴리눔 독소이거나 상기 유형 중 2 이상의 혼합물이며, 바람직하게는 A형 보툴리눔 독소인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 독소의 혼합물은 보툴리눔 신경 독소 또는 보툴리눔 신경 독소의 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효 단계는 제1 격리기 내에서 수행하고, 상기 정제 (단계)는 그 전부 또는 일부를 제2 격리기 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효 단계 및 정제의 일부는 상기 제1 격리기 내에서 수행하고, 상기 정제 (단계)의 또 다른 일부는 상기 제2 격리기 내에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효 단계 및 상기 발효 단계 생성물의 침전 및 여과는 상기 제1 격리기 내에서 정제 (단계)의 일부로서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 격리기 및 상기 제2 격리기는 동일한 온도 또는 상이한 온도에서 작동되는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 격리기 내의 온도를 각 처리 단계에 따라 변화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 제1 격리기 내의 온도는 약 20℃∼약 50℃의 범위이고, 상기 제2 격리기 내의 온도는 약 -5℃∼약 +25℃의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를, 바람직하게는 하기 순으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    a) 제1 격리기 내에서

    - 생물학적 활성 화합물 생산 균주를 발효 배지에, 바람직하게는 수작업으로 접종하는 단계,

    - 상기 생산 균주를 발효시키는 단계;

    - 상기 생산 균주의 세포로부터 상청액을 분리하는 단계; 및

    - 상기 상청액을 침전시키는 단계;

    b) 제2 격리기 내에서

    - 상기 침전된 상청액을 원심분리하여 펠릿을 얻는 단계;

    - 상기 펠릿을 추출하고 원심분리하여 상청액을 얻는 단계;

    - 상기 상청액을 추가 원심분리로 침전시켜서 상청액을 얻는 단계;

    c) 상기 제1 또는 제2 격리기 내에서

    - 상청액을 침전시키는 단계;

    - 침전물을 원심분리하는 단계;

    - 상기 침전물을 원심분리하여 얻은 펠릿을 가용화시키는 단계;

    - 상기 가용화된 펠릿을 투석하고 투석물을 원심분리하는 단계;

    - 투석물로 크로마토그래피를 수행하는 단계;

    - 수득된 용출물을 여과하는 단계.