KR102596110B1 - 화학적 살생물제를 사용하지 않는 무균 세포 처리 및 제조 - Google Patents
화학적 살생물제를 사용하지 않는 무균 세포 처리 및 제조 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102596110B1 KR102596110B1 KR1020227016801A KR20227016801A KR102596110B1 KR 102596110 B1 KR102596110 B1 KR 102596110B1 KR 1020227016801 A KR1020227016801 A KR 1020227016801A KR 20227016801 A KR20227016801 A KR 20227016801A KR 102596110 B1 KR102596110 B1 KR 102596110B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- chamber
- enclosure
- temperature
- enclosure device
- Prior art date
Links
- 239000003139 biocide Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012545 processing Methods 0.000 title claims description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000012865 aseptic processing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 101
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 43
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 32
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 16
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 13
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 12
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 12
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 11
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 10
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 10
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 claims description 10
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 6
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000012855 volatile organic compound Substances 0.000 claims description 5
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 abstract description 13
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 8
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 241001331781 Aspergillus brasiliensis Species 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000219289 Silene Species 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- OSVXSBDYLRYLIG-UHFFFAOYSA-N dioxidochlorine(.) Chemical compound O=Cl=O OSVXSBDYLRYLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012569 microbial contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 239000004155 Chlorine dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical compound O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000019398 chlorine dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000004320 controlled atmosphere Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000002316 fumigant Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010916 pituitary tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006150 trypticase soy agar Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
- C12M37/04—Seals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
- C12M45/03—Means for pre-treatment of biological substances by control of the humidity or content of liquids; Drying
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/22—Testing for sterility conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
인클로저(enclosure) 전체에 걸쳐 습도 수준을 25% 이하의 상대습도(RH), 바람직하게는 20% 또는 15% 이하의 RH로 제어함으로써, 화학적 살생물제를 사용하지 않으면서 비멸균 인클로저 장치에서 세포를 무균 처리 및 생산하는 방법 및 장치를 개시한다. 추가로, 온도는 37℃로 제어되고, 일관된 가스 유동이 인클로저에서 유지된다. 인클로저 내에서 환경 모니터링에 의해 검출된 미생물 오염으로부터의 콜로니 형성 단위는 이 방법에서 유의미하게 감소된다.
Description
관련 출원에 대한 교차참조
본원은 2019년 10월 22일에 출원된 미국 특허출원 제62/924,322호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 화학적 살생물제를 사용하지 않고 세포를 부최적(suboptimal) 조건에 노출시키지 않으면서 습도, 온도 및 공기 유동을 조절함으로써 비멸균 장치에서 세포를 무균 처리 및 제조하는 방법에 관한 것이다.
세포 배양은 배타적으로는 아니지만 전형적으로 포유동물 세포를 체내 그의 천연 환경 외부에서 제어된 조건 하에서 생장시키고 조작하는 과정이다. 관심 있는 세포를 살아있는 조직으로부터 단리한 후, 이 세포를 조심스럽게 제어된 조건 하에서 유지할 수 있다. 이 조건은 각각의 세포 유형에 따라 다르나, 일반적으로 필수 영양소(아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄), 성장 인자, 호르몬 및 가스(CO2, O2)를 공급하는 기질 또는 배지를 가진 적합한 용기, 및 이 세포에 대한 최적 수준으로의 물리화학적 환경(pH 완충제, 삼투압, 온도)의 조절로 구성된다.
세포는 연구의 많은 적용 중 몇몇을 나열하자면 약물 발견, 암 생물학, 재생 의약 개발 및 기초 생명 과학 연구에 사용된다. 산업적으로 세포는 백신 및 생물제제 제조, 세포 요법 및 세포 기반 유전자 요법에도 사용된다.
생체외에서 세포를 생장시키는 것은 기술적으로 어렵다. 살아있는 세포의 건강과 품질을 유지하기 위해, 세포의 요구사항이 가능한 한 완전히 지원되어야 한다. 예를 들면, 생체외에서 생장된 세포는 그 자신을 미생물로부터 보호하는 면역 시스템을 갖지 않으므로, 미생물 오염으로부터의 보호가 요구된다. 신체 외부의 세포는 조건을 최적으로 유지하기 위한 신체를 더 이상 갖지 않는다. 온도, pH, 오스몰농도, 산소, 이산화탄소 등은 신체의 외부에서 최적 수준으로 제어되어야 하며, 그렇지 않으면 세포는 퇴화되고 사멸될 것이다. 기존 장치는 인큐베이터 또는 생물 반응기 내부에서만 시간제 최적화만을 제공한다. 예를 들면, 산소 농도는 세포 처리 및 생산에 매우 중요한 파라미터이다. 신체 내부의 세포는 공기 산소만큼 높은 산소 수준을 결코 보지 못한다. 생리학적 산소 수준은 훨씬 더 낮고, 체내에서 변동하지 않는다. 공기 산소 수준은 생리학적 수준이 아니고 세포를 손상시킬 수 있다. 따라서, 생체외에서 세포를 생장시키고 처리하는 것은 엄격히 제어되어야 하는 특별한 환경 조건을 요구한다.
일부 구현에서, 세포는 세포 처리, 조작 및 생산 적용에 특별히 맞게 조정된 특수 격리 챔버에서 생장된다. 예를 들면, 이러한 격리 챔버는 세포 생산 과정의 모든 단계들 또는 일련의 세포 과정 단계들을 둘러싸고 인접 단계로부터 특정 개별 단계를 격리하기 위해 구획화하도록 구성된 한 세트의 모듈식 상호연결된 챔버, 공동-챔버 및 서브-챔버를 포함할 수 있다. 이러한 장치의 일례는 뉴욕주 패리시의 바이오스페릭스 리미티드(BioSpherix Ltd)에 의해 제조된 XVIVO 시스템®이다. XVIVO 시스템®은 특히 세포 배양, 처리 및 생산 적용을 위해 한 세트의 모듈식 챔버, 박스, 글로브 박스, 캐비닛, 센서, 환경 조절 장치 및 기타 장치를 제공한다. 세포는 최종적으로 멸균될 수 없기 때문에 무균 처리에 의해 생산되어야 한다.
격리장치 또는 글로브 박스 또는 다른 유사한 유형의 인클로저(enclosure)와 같은 물리적 장벽을 이용하여 실내 공기 및 세포 취급자로부터 생체외 세포를 분리하는 것은 미생물 오염물질이 배양중인 세포에 도달할 가능성을 현저히 감소시킨다. 그러나, 미생물은 인클로저의 처음 밀폐 시 내부에 갇힐 수 있고, 관용적으로 인클로저 내로 들어오는 물질 및 공급물의 표면에서 제어된 인클로저 내로 들어갈 수 있다. 이러한 인클로저의 내부 표면을 닦아내거나 이러한 인클로저 내로 이동된 물품을 닦아낼 때 액체 소독제로서 적용되거나 이러한 인클로저 내부의 가스 훈증으로서 적용되는 화학적 살생물제("살균제"로서도 지칭됨)의 사용은 세포가 무균 처리 및 생산될 수 있도록 내부에 멸균 또는 거의 멸균 환경을 생성하기 위한 전형적인 미생물 위험 경감 기법이다. 문제점은 화학적 살생물제가 독성을 가질 수 있으므로 사람에게 위험할 수 있으며, 미생물 오염으로부터의 보호를 요구하는 배양물 중의 원하는 세포를 비롯한 모든 세포들에게 독성을 나타낼 수 있다는 점이다.
본 발명은 화학적 살생물제를 사용하지 않고 세포를 부최적 조건에 노출시키지 않으면서 세포를 무균 처리 및 생산하기 위해 제어된 환경 인클로저 내부에서 멸균 또는 거의 멸균 환경을 유지하는 방법에 관한 것이다. 화학적 살생물제를 사용하지 않는 이 방법은 화학적 살생물제와 마찬가지로 세포의 무균 처리 및 생산을 가능하게 하는 데 효과적이고, 처리되는 세포에 대한 독성을 나타내지 않으며, 세포 처리 장치를 작동하는 사람에게 안전하다.
미생물은 온도(T) 및 상대습도(RH)에 대한 민감성을 가진다. 본 발명자들은 관심 있는 세포를 위한 최적 조건을 손상시키지 않으면서 화학적 소독제를 사용하지 않고 세포를 무균 처리 및 생산할 수 있게 하는 수준으로 인클로저 내부의 미생물 바이오버든(bioburden)을 감소시키고 유지하는 T 및 RH 조건을 발견하였다.
한 실시양태에서, 본 발명은 살생물제가 없는 비멸균 인클로저 장치에서 세포를 무균 처리 및 생산하는 방법 및 환경을 제공한다. 상기 방법은 원핵 또는 진핵 세포의 생체외 배양, 생장, 처리 또는 수송에 최적인 제어된 환경을 제공하는 인클로저 장치를 이용할 수 있고, 여기서 대기 가스, 상대습도(RH), 온도 및 가스 순환은 정밀하게 제어될 수 있다. 이 방법에서, 세포의 배양, 생장, 처리 또는 수송 단계를 위해 요구된 더 높은 RH를 필요한 구획에서만 필요한 최저 RH 수준으로 필요한 최단 지속시간 동안 일시적으로 제어한 후, 즉시 RH를 25% 이하로 복귀시키는 시간을 제외하고 24시간 동안 인클로저의 RH를 25% 이하로 유지한다. 실시양태에서, RH는 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 인클로저의 온도는 미생물 제어를 향상시키기 위해 약 37℃로 가온될 수 있지만, 세포에 부최적이 아닐 수 있다. 한 실시양태에서, 세포에 부최적이 아닌 연속 유동 대기는 건조를 가속화하고 혼합되어 인클로저 전체에 걸쳐 RH를 균질화한다.
이 방법은 예를 들면, 격리 장치의 초기 폐쇄 후 및 주기적 개방과 재폐쇄 후에 유용하고, 이때 인클로저 내의 모든 영역과 표면은 급속히 건조되어 세포 처리 및 생산 작업에 대한 미생물 오염 위험을 효과적으로 경감시킨다. 상기 방법은 임의의 물질, 물품 또는 장치가 외부 환경으로부터 인클로저 내로 이동할 때에도 유용하다. 이러한 진입은 인클로저 챔버의 작동에서 관용적이다. 이 방법에서, 인클로저 내로 이동된 물질은 급속히 건조된다.
인클로저 장치는, 챔버들 사이의 내부 도어에 의해 구획화되고, 영구적으로 연결되거나 일시적으로 연결되며, 일체식 또는 모듈식인, 한 세트의 상호연결된 챔버, 공동-챔버 및 서브-챔버일 수 있다. 인클로저 장치는 고정식 또는 이동식일 수 있다. 인클로저 장치는 강성 또는 연성 벽, 금속 또는 플라스틱 벽, 또는 이들의 임의의 조합으로 만들어질 수 있다. 한 실시양태에서, 억제된(contained) 환경의 내부 표면은 중합체, 금속, 및 유리로부터 선택된 물질로 만들어질 수 있다. 내부 표면은 소수성 또는 친수성을 나타낼 수 있다. 인클로저 장치는 영구적 또는 일시적인, 벽을 통과하는 밀봉 또는 반밀봉된 기능적 또는 물리적 입구/출구를 구비할 수 있다. 기능적 입구/출구는 예를 들면, 인클로저 장치의 챔버 사이에 있거나 인클로저 장치의 외부에 있는 와이어 또는 튜브를 지칭한다. 이들은 전력 도관, 통신 와이어, 가스 취급 튜브 등일 수 있다.
한 실시양태에서, 인클로저 장치 내의 대기 가스는 정밀하게 제어될 수 있고, 산소, 질소, 이산화탄소, 산화질소, 일산화탄소로 구성될 수 있고; VOC, 미립자 및 압력은 정밀하게 제어될 수 있다. 억제된 환경의 대기는 세포에 최적인 환경에 따라 0.1% 내지 35% v/v의 산소 수준, 및 0.1% 내지 20% v/v의 이산화탄소를 가질 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 밀봉된 포트를 통과하는 글로브 또는 원격조작기에 의해 수동식으로, 또는 통합된 프로세스 및 분석 기계에 의해, 또는 전부 또는 일부 자동화에 의해 인클로저 내부에서 처리 및 생산된다.
한 실시양태에서, 억제된 환경에서 생장되고 처리된 세포는 진핵 또는 원핵 세포이다. 진핵 세포는 포유동물 또는 곤충 세포 또는 기타 세포일 수 있다. 세포는 인간 또는 마우스 세포 또는 다른 세포일 수 있다. 세포는 신선한 1차 배양물, 초기 계대 배양물 또는 세포주일 수 있다.
한 실시양태에서, 급속한 건조 후, 침강 플레이트 또는 능동 공기 샘플링 플레이트를 포함하는 환경 모니터링에 의해 측정될 때 부유하는 측정 가능한 CFU(콜로니 형성 단위)가 검출되지 않는다. 이동 대기에서의 부유 또는 현탁은 세포 오염의 주요 경로이다. 접촉 플레이트에 의해 측정될 때, 검출될 수 있는 유일한 CFU는 표면에 강하게 부착되고, 이 표면에서 세포로부터 격리되고 통계적으로 세포를 오염시킬 가능성이 거의 없다.
도 1은 40% RH 및 21℃에서 제어된 환경 인클로저(XVIVO 시스템 챔버) 또는 기존 생물학적 안전 캐비닛(BSC) 내에서 본 발명의 조건인 15% 상대습도(RH) 및 37℃에 노출된 후 다양한 시간 간격에서 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로 접종된 폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸의 쿠폰(즉, 시험 표면)의 예로부터 로그 감소를 보여준다. 별표(*)는 (시간 0에 비해) 유의미한 군내 차이를 나타내는 반면, 파운드(#)는 이원 ANOVA에 이은 본페로니(Bonferroni)의 다중 비교 검정에 의해 확인된 유의미한 군간 차이를 나타낸다(* 또는 #, p<0.05; ** 또는 ##, p<0.01; *** 또는 ###, p<0.001; ****, p<0.0001).
도 2는 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 병원성 효모인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다.
도 3은 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 신체의 마이크로바이오타(microbiota)의 일반적인 구성원이나 다수의 병원성 질환들과 관련되어 있는 그람 양성 원형 세균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다.
도 4는 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 흔한 식품 오염물질이며 토양에 편재하는 진균인 아스퍼길러스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다.
도 5는 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 토양 및 반추동물과 인간의 위장관에서 발견되는 그람 양성 카탈라제(catalase) 양성 세균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다. 이 세균은 강한 보호성 내생포자를 형성함으로써, 극한의 환경 조건을 견딜 수 있게 한다.
도 6은 폴리프로필렌 및 스테인리스 스틸 시험 표면에 대해 실시예에서 연구된 유기체에 대한 CFU의 로그 감소를 요약한다.
도 7은 제어된 환경 인클로저 내에서 다양한 상대습도(RH) 수준 및 37℃에서 폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸 쿠폰 상에 접종된 스타필로코커스 아우레우스의 로그 감소를 보여준다. 별표(*)는 이원 ANOVA에 이은 시닥(Sidak) 다중 비교 검정에 의해 확인된, 37℃/5% RH 군과 21℃/40% RH 군 사이의 유의미한 군간 차이를 나타낸다(*, p<0.05).
도 8은 제어된 환경 인클로저 내에서 다양한 온도 수준 및 15% RH에서 폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸 쿠폰 상에 접종된 스타필로코커스 아우레우스의 로그 감소를 보여준다. 별표(*)는 이원 ANOVA에 이은 시닥의 다중 비교 검정에 의해 확인된 유의미한 군내 차이를 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001).
도 9는 건조된 마개로부터 공기 중에 있는 바실러스 서브틸리스를 시험하기 위해 오염된 마개를 가진 원심분리기 튜브에 인접한 PBI 공기 샘플러를 보여주는, 실시예 2에 상세히 기재된 실험의 사진이다.
도 10은 도 9에 나타낸 실험과 동일한 실험의 대안적 도면이다. 이 도면은 공기 샘플러 디바이스 상의 전면판/공기 흡입구를 보여준다.
도 2는 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 병원성 효모인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다.
도 3은 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 신체의 마이크로바이오타(microbiota)의 일반적인 구성원이나 다수의 병원성 질환들과 관련되어 있는 그람 양성 원형 세균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다.
도 4는 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 흔한 식품 오염물질이며 토양에 편재하는 진균인 아스퍼길러스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다.
도 5는 도 1에 대해 논의된 조건과 동일한 조건 하에서, 토양 및 반추동물과 인간의 위장관에서 발견되는 그람 양성 카탈라제(catalase) 양성 세균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 접종된 쿠폰의 로그 감소를 보여준다. 이 세균은 강한 보호성 내생포자를 형성함으로써, 극한의 환경 조건을 견딜 수 있게 한다.
도 6은 폴리프로필렌 및 스테인리스 스틸 시험 표면에 대해 실시예에서 연구된 유기체에 대한 CFU의 로그 감소를 요약한다.
도 7은 제어된 환경 인클로저 내에서 다양한 상대습도(RH) 수준 및 37℃에서 폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸 쿠폰 상에 접종된 스타필로코커스 아우레우스의 로그 감소를 보여준다. 별표(*)는 이원 ANOVA에 이은 시닥(Sidak) 다중 비교 검정에 의해 확인된, 37℃/5% RH 군과 21℃/40% RH 군 사이의 유의미한 군간 차이를 나타낸다(*, p<0.05).
도 8은 제어된 환경 인클로저 내에서 다양한 온도 수준 및 15% RH에서 폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸 쿠폰 상에 접종된 스타필로코커스 아우레우스의 로그 감소를 보여준다. 별표(*)는 이원 ANOVA에 이은 시닥의 다중 비교 검정에 의해 확인된 유의미한 군내 차이를 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001).
도 9는 건조된 마개로부터 공기 중에 있는 바실러스 서브틸리스를 시험하기 위해 오염된 마개를 가진 원심분리기 튜브에 인접한 PBI 공기 샘플러를 보여주는, 실시예 2에 상세히 기재된 실험의 사진이다.
도 10은 도 9에 나타낸 실험과 동일한 실험의 대안적 도면이다. 이 도면은 공기 샘플러 디바이스 상의 전면판/공기 흡입구를 보여준다.
본 발명은 특히 다중구획 격리 챔버 및 인클로저 내에서 신체 외부(냉동 제외)의 세포 존재에 최적화된 세포를 무균 처리 및 생산하기 위한 환경을 제공한다. 용어 "세포 존재"는 신체 외부에 있는 세포의 유일한 4가지 존재 상태를 모두 의미한다:
1. 인큐베이션 상태에서 증식하거나 증식하지 않는 세포;
2. 취급되거나 조작되는 세포;
3. 일부 종류의 기계에서 처리되거나 분석되는 세포;
4. 상기 3가지 상태 중 임의의 상태 사이의 세포 수송.
이러한 세포 조작에 사용되는 환경은, 챔버들 사이의 내부 도어에 의해 구획화되고, 영구적으로 연결되거나 일시적으로 연결되며, 일체식 또는 모듈식인 한 세트의 상호연결된 챔버, 공동-챔버 및 서브-챔버를 포함할 수 있는 인클로저 장치 내에 있을 수 있다. 인클로저 장치는 고정식 또는 이동식일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 급속한 극한 건조는 세포에 바람직한 무균성 또는 거의 무균성인 환경을 생성하고 유지하는 데 이용되는 1차 물리적 기작이다. 극한 건조는 대다수의 미생물을 사멸시킬 수 있고 모든 다른 미생물들의 생장을 방지할 수 있다. 소수의 미생물은 건조에 대한 내성을 가질 수 있다. 이들 중 어느 것도 인클로저 내부로 들어가지 않는 경우, 이 방법은 무균 조건을 유지한다. 일부 건조 내성 미생물들이 내부로 들어가는 경우, 이 방법은 거의 무균성인 조건을 유지하지만, 살아있는 미생물이 표면 상에 고정됨으로써 세포로부터 격리되기 때문에 여전히 무균 세포 처리를 가능하게 한다. 이것은 전체 시스템에 걸쳐 습도 수준을 극도로 낮은 수준인 25% 미만의 상대습도(RH), 바람직하게는 20% 또는 15% 이하의 RH로 제어함으로써 달성된다. 또한, 37℃에서 전체에 걸쳐 연속적 침투 온도 제어는 습도 수준을 이 낮은 RH 수준으로 건조하는 살균 효과를 향상시킨다. 추가로, 이동하는 내부 대기는 건조를 가속화하고 인클로저 전체에 걸쳐 항미생물 조건을 균질화한다. 임의적으로, 세포를 위한 조건을 최적화하는 데 필요한 가변적 제어된 산소 및 가변적 제어된 이산화탄소는 이 소독 프로토콜을 방해하지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미생물"은 임의의 원치 않는 오염 유기체, 예를 들면, 세포 배양물을 오염시킬 수 있는 바람직하지 않은 세균 또는 진균을 지칭한다.
세포 존재에 관한 과정에서 단계를 위해 높은 습도 수준이 요구될 때마다, RH는 필요한 최소 시간 동안에만 필요한 구획에서만 최소한으로 필요한 수준으로 엄격하게 제어된 후, 즉시 건조 수준으로 복귀된다. 더 낮은 온도가 요구될 때마다, 온도는 필요한 시간 동안에만 필요한 구획에서만 필요한 온도보다 더 낮지 않은 온도로 엄격하게 제어된 직후, 37℃로 복귀된다. 37℃보다 더 높은 온도는 미생물 사멸을 향상시키나, 반드시 필요한 것은 아니다. 데이터는 이 방법이 세포를 부최적 조건에 노출시키지 않으면서 위험한 화학적 살생물제의 사용을 근본적으로 감소시키는 동시에 오염 위험을 근본적으로 감소시키는 쪽으로 국면을 성공적으로 전환시킴을 보여준다.
한 실시양태에서, RH, 온도 및 유동 대기는, 각각의 챔버에 대해 인클로저 장치 내의 임의의 다른 챔버와 독립적으로 제어될 수 있다. 예를 들면, 더 낮은 온도 또는 더 높은 습도를 요구하는 세포 최적화 프로토콜은 다중챔버 장치 내의 한 특정 챔버에서 수행될 수 있는 반면, 다른 챔버는 본 발명의 조건인 낮은 RH 및 고온을 유지한다. 한 실시양태에서, 다중챔버 인클로저 장치 내의 각각의 챔버의 환경은 임의의 다른 챔버와 독립적으로 제어될 수 있다.
중요한 것은 본 발명의 방법에서 화학적 살생물제(액체 또는 가스)가 사용되지 않는다는 점이다. 액체 화학적 살생물제의 예는 이소프로필 알코올, 4차 암모늄 염, 표백제 등을 포함한다. 가스 화학적 살생물제의 예는 기화된 과산화수소, 이산화염소, 포름알데하이드 등을 포함한다. 어느 것도 필요하지 않다. 본 발명자들은 낮은 습도, 고온, 및 난류 또는 층류 가스 유동이 세포에 최적화된 인클로저 및 챔버 내의 대기 및 표면을 포함하는 내부 환경을 충분히 살균할 수 있음을 발견하였다.
추정컨대, 본 발명의 낮은 습도 조건은 미생물 유기체가 건조에 민감하기 때문에 대다수의 미생물 유기체를 사멸시키고, 예를 들면, 포자 형성 세균 및 진균으로부터 낮은 습도 및 고온에서 생존할 수 있는 유기체의 경우, 이러한 유기체를 포함하는 모든 미생물들은 이러한 표면에의 강한 부착에 의해 내부 표면에 고정되는 것으로 발견되었다. 더욱이, 본 발명의 방법에 사용되는 가스 유동은 미생물 건조를 가속화하고 건조 및 따뜻한 조건이 인클로저 장치의 내부 내의 모든 모서리 및 함몰부까지 침투하는 것을 보장한다. 건조 조건 하에서 급속한 건조에 의해 표면 상에 고정된 포자 또는 다른 잠재적 감염성 입자는 본 발명에 사용된 인클로저에서 처리 및 생산된 세포에 대해 측정 가능한 오염 위험이 아니다.
본 발명의 방법은 사전에 챔버 또는 인클로저의 화학적 멸균을 필요로 하지 않으며, 시스템의 임의의 부분에서 내부 표면의 소독제 닦아내기를 요구하지 않고, 인클로저 내로 이동된 임의의 물질 또는 장비의 소독제 닦아내기를 요구하지 않고, 세포를 신뢰 가능하게 무균 처리 및 생산하기 위해 내부 세척을 필요로 하지 않는다. 본 발명의 방법은 침강 플레이트 및 능동 공기 샘플링 플레이트를 사용한 집중적인 환경 모니터링에 의해 입증된 바와 같이 내부에 부유하는 콜로니 형성 단위(CFU)가 검출될 수 없도록 인클로저 장치의 내부를 충분히 소독하고 세정한다. 본 발명에 의해, 인클로저는 시간에 따라 점진적으로 더 무균 상태가 된다. 그러나, 본 발명의 방법은 화학적 살생물제의 사용과 양립 불가능하지 않고 세포를 위험에 빠뜨리지 않는 신중한 살생물제 처리와 상승작용적 효과를 나타낼 수 있다.
접촉 플레이트("터치 플레이트"로서도 지칭됨)는 표면의 미생물 오염을 모니터링하는 데 사용된다. 이 플레이트는 페트리 접시에 부어진 한천 배지를 갖고, 한천은 챔버의 표면과 접촉할 수 있다. 시험 표면 상의 임의의 미생물 오염은 한천에 부착될 것이다. 그 다음, 한천은 인큐베이션되고 미생물 오염은 증가할 것이고, 이것은 시험 표면 상의 오염도를 정량하기 위해 카운팅될 수 있는 "콜로니 형성 단위"(CFU)로서 지칭된다. 침강 플레이트는 유사하고 수동 공기 모니터링에 사용된다. 페트리 내의 한천 플레이트는 측정된 시간 동안 환경에 노출된다. 공기 중에 있는 미생물 입자는 한천에 떨어질 것이다. 그 후, 플레이트를 인큐베이션하고, CFU를 카운팅할 수 있다. 능동 공기 샘플링 플레이트는 공기 샘플러를 이용하여, 사전결정된 부피의 공기를 물리적으로 뽑아내어 한천 위로 통과시킨다. 그 다음, 상기 플레이트를 공기 샘플러로부터 제거하고 직접 인큐베이션한다. 이들을 이용하여 방법을 개발하였다.
본 발명에서, 건조 내성 미생물이 내부에 존재하지 않는 경우, 이 3가지 방법들 중 어느 방법에 의해서도 CFU가 검출되지 않고, 이때 본 발명의 방법은 실제로 인클로저를 멸균하고 인클로저를 무균 상태로 만든다. 그러나, 임의의 건조 내성 미생물이 내부에 존재하는 경우, 침강 플레이트 및 능동 샘플 플레이트에서만 CFU가 검출되지 않을 것이고, 고정이 아무리 적은 건조 내성 미생물이라도 본 발명의 물리적 조건에 따라 챔버에 있을 수 있도록 보장하기 때문에, 이 미생물은 표면에의 부착에 의해 부유되지 못하게 된다. 이러한 건조 내성 미생물은 생존할 수 있으며 접촉 플레이트에 의해 검출될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 방법은 내부가 멸균 상태가 아니거나, 단지 거의 멸균 상태이거나 거의 무균성인 상태이기 때문에 무균 환경, 또는 인클로저 내부의 무균 조건, 또는 멸균 인클로저를 생성하지 않는다. 그러나, 발명적으로, 상기 방법은 세포를 오염시킬 수 있는 생존 가능한 유일한 미생물이 표면에 격리되기 때문에 무균 처리를 가능하게 한다. 이 미생물은 접촉에 의해 다른 표면으로 전달될 수 있으나, 이 다른 표면으로부터 탈착되지 않는다. 따라서, 멸균 기법의 실시가 이들 소수의 미생물이 세포 또는 세포의 기질과 접촉될 임의의 표면과의 순차적 접촉점을 갖지 않을 것임을 보장하기 때문에 세포를 오염시키는 경로는 없다.
본 발명의 방법은 예를 들면, 인클로저 장치의 초기 설치와 폐쇄 후 및 주기적 개방과 재폐쇄 후에 사용될 수 있다. 이러한 장치는 챔버들 사이의 내부 도어에 의해 구획화되고, 영구적으로 연결되거나 일시적으로 연결되며, 일체식 또는 모듈식인 한 세트의 상호연결된 챔버, 공동-챔버 및 서브-챔버를 포함할 수 있다. 인클로저 장치는 고정식 또는 이동식일 수 있다. 인클로저 장치는 강성 또는 연성 벽, 금속 또는 플라스틱 벽, 또는 이들의 임의의 조합으로 만들어질 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 물질, 물품 및 장비가 인클로저 장치 내로 관용적으로 이동되는 빈번한 작업에 사용될 수도 있다. 이러한 관용적인 작업은 전형적으로 새로운 미생물 오염 위험의 단일 공급원이다. 그러나, 본원에서 제공된 급속한 건조 조건의 이용 시, 이 물질 및 장비 상의 미생물은 수분 이내에 고정되고 대다수는 수시간 이내에 사멸된다.
무균 처리 및 생산을 달성하기 위해 강한 액체 및 가스 화학적 살생물제의 빈번한 적용 및 과용에의 전통적인 의존은 원하는 세포에 큰 위험을 준다. 게다가, 살생물제 사용은 본질적으로 간헐적이다. 살생물제(액체 또는 가스)를 적용한 다음 중단한다. 그 사이에는 항미생물 활성이 없으므로, 바람직하지 않은 미생물이 생장하고 인클로저 내부의 장비 및 세포 배양물을 오염시킬 수 있는 창이 제공된다. 대조적으로, 이 물리적 접근법은 연중무휴로 연속적인 항미생물 활성을 유지하면서 일정하다.
나아가, 표면 적용범위에 의해 제한되는 액체 살생물제 효과와 달리, 이 물리적 접근법은 가스처럼 작용한다. 특히 챔버 내부의 가스 유동 패턴에 의해 구동될 때, 이것은 전체 시스템 내부의 구석구석까지 도달한다. 이 항미생물 작용은 모든 균열, 이음매, 틈새 및 캐비티를 포함하는, 도달될 수 있거나 도달될 수 없는 챔버 내의 모든 내부 표면들을 지속적으로 침투한다. 마지막으로, 각각의 화학적 살생물제 적용 후 남은 표면 잔류물 및 배기가스와 독성 증기에 대한 우려 대신에, 이 대안적 접근법은 물리적 접근법(이동하는 대기에 의해 가속화된, 실내 공기 조건보다 더 상승된 온도에서의 건조)이기 때문에 잔류물 또는 임의의 독성 배기가스 또는 증기를 남기지 않는다.
한 실시양태에서, 인클로저 장치 내부의 가스 유동은 본 발명에서 중요한 특징일 수 있다. 가스 유동은 난류 또는 층류일 수 있다. 가스 유동은 각각의 격리된 챔버 내에서 제어된 대기를 재순환시켜 챔버 내에서 어느 정도의 난류를 생성하는 팬에 의존한다. 한 실시양태에서, 재순환되는 가스는 HEPA 필터를 통과할 수도 있다. 대안적으로, 가스 유동은 단일 방향으로의 정상 유동을 의미하는 층류일 수 있다.
본 발명에서 RH 수준, 온도 및 가스 유동은 격리된 챔버 장치의 다른 환경 파라미터가 제어될 때 제어될 수 있다. 예를 들면, 수분이 없는 고도로 정제된 상태로 공급되는, 가스 탱크로부터의 건조 가스를 사용하여 RH를 제어할 수 있다. RH는 인클로저 내의 가스를 재생 가능한 화학적 건조제(예를 들면, 실리카 겔 또는 황산칼슘) 위로 통과시키고 인클로저 내로 다시 보내는 재순환 팬을 사용함으로써 확립된 대기에서 제어될 수도 있다. RH는 전자식 또는 압축기 제습기에 의해 제어될 수도 있다. 또한, HEPA 필터가 이러한 재순환 시스템에 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 건조 효과는 급속할 수 있으며, 이는 물체가 외부 환경으로부터 챔버 내로 이동될 때, 오염 미생물이 수분 이내에 고정되고 수시간 이내에 사멸되는 정도까지 물체의 습도 및 임의의 표면 수분이 건조되어, 본원에 개시된 바와 같이 미생물 오염물질의 사멸 또는 부착을 달성함을 의미한다. 이 급속한 건조는 미생물이 세포를 오염시킬 수 있는 주요 경로를 제거함으로써, 오염물질이 챔버 내에서 공기 중에 있게 되는 능력을 최소화한다.
미생물은 어셈블리 및 설치 동안 인클로저 장치 내부에 갇힐 수 있고, 시스템의 일부 또는 전체 시스템의 주기적 개방 및 재폐쇄 후에 갇힐 수 있다. 이 방법을 사용하면, 어느 것도 생식할 수 없고 대다수가 건조에 의해 사멸되기 때문에, 미생물이 제공하는 오염 위험이 시간에 따라 지속적으로 떨어진다. 그러나, 갇힌 소수의 미생물은 건조 내성을 가질 수 있다. 이의 발생률은 상이한 장소에서 상이할 가능성이 높고 계절에 따라 각각의 위치에서 달라질 가능성이 높다. 탈착되어 부유하는 임의의 물질은 처리 영역으로부터 즉시 제거되고 원격 필터에 영구적으로 격리됨으로써, 세포에 대한 위험으로서 제거된다. 내부 표면에 부착된 상태로 남아 있을 몇몇은 그 표면에 격리되기 때문에 동일한 이유로 측정 가능한 위험이 아니다. 정상 작동 조건 하에서, 이 잔류 격리된 생존 미생물의 발생률은 CFU가 침강 플레이트 및 능동 공기 샘플링 플레이트뿐만 아니라 접촉 플레이트도 사용하는 집중적인 환경 모니터링에 의해 내부에서 수일 이내에 검출될 수 없을 정도로 작다.
그 후, 유일한 새로운 바이오버든 위험은 시스템 내로 들어온 물질의 표면으로부터 비롯된다. 여기서 바이오버든은 들어오는 물품의 표면 상에서 살아있는 세균의 수로서 정의된다. 위험은 진입점 근처에서 가장 높으나, 물질이 내부로 이동할 때 이 물질과 접촉하는 처음 몇 개의 순차적인 접촉점을 따라 검출될 수 없는 수준까지 급격히 떨어진다. 급속한 건조는 건조 내성 미생물을 포함하는 모든 검출 가능한 부유 CFU 위험을 충분히 경감시킨다. 가스 또는 액체 화학적 살생물제는 관용적으로 세포를 무균 생산하는 데 요구되지 않는다.
한 실시양태에서, 억제된 환경 내의 대기는 산소 수준이 0.1% 내지 35% v/v이고 이산화탄소가 0.1% 내지 20% v/v이고 나머지가 질소이다. 본 발명에 기재된 억제된 환경에서 세포 처리 및 생산 프로토콜에 사용될 수 있는 다른 가스는 산화질소 및 일산화탄소를 포함할 수 있다. 제어될 수 있는 다른 대기 특징은 살생물제 물질, 챔버 대기 중의 미립자 및 대기압으로부터 도입될 수 있는 휘발성 유기 화합물(VOC)이다.
한 실시양태에서, 제어된 환경을 가진 챔버의 내부 표면은 소수성 또는 친수성을 띤다. 한 실시양태에서, 억제된 환경의 내부 표면은 폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸로 만들어질 수 있다. 폴리에틸렌 또는 다른 경질 플라스틱, 유리, 알루미늄, 및 기타 연마 또는 도장된 금속 물질을 비롯한 추가 물질은 본 발명의 범위 내에 있다.
한 실시양태에서, 제어된 환경 내에서 처리 및 생산된 세포는 포유동물 세포, 예를 들면, 새로 생검된 1차 배양물, 또는 다양한 조직으로부터의 초기 계대 배양물, 또는 GH3(래트 뇌하수체 종양) 및 PC12(래트 크롬친화세포종)과 같은 세포주를 포함하는 진핵 세포이다. 한 실시양태에서, 제어된 환경을 가진 챔버 내의 진핵 세포는 인간 세포, 예를 들면, 새로 생검된 1차 배양물, 초기 계대 배양물, 또는 세포주 MCF-7(유방암), MDA-MB-468(유방암), PC3(전립선암) 및 SaOS-2(골암)이다(단지 대표적인 예). 한 실시양태에서, 세포는 식물 세포, 곤충 세포 또는 원핵 세포일 수 있다.
실시예 1
유기체 및 배지. 하기 유기체들을 본 발명의 방법으로 시험하였다: BIOBALL®(BIOMERIEUX(미주리주 헤이즐우드 소재))로부터의 슈도모나스 애루기노사, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 서브틸리스, 아스퍼길러스 브라실리엔시스 및 칸디다 알비칸스. 시그마(미주리주 세인트루이스 소재)로부터의 트립틱 대두 한천을 함유하는 배양 플레이트 상에서 CFU를 어세이하였다. 아스퍼길러스 브라실리엔시스 플레이트를 36시간 내지 48시간 동안 25℃에서 배양한 반면, 다른 유기체를 콜로니 평가 전에 20시간 내지 24시간 동안 35℃에서 배양하였다. 환경 모니터링을 위해, BD(메릴랜드주 스파크스 소재)로부터의 BBLTM TrypticaseTM 대두 한천으로 접촉 플레이트를 만들었다. 접촉 플레이트를 적어도 20시간 내지 24시간 동안 35℃에서 인큐베이션하였다.
쿠폰 접종. 폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸(Amazon.com의 Beadthoven Jewelry)로 쿠폰(직경 10 mm)을 만들었다. 각각의 소독제 사이에 ddH2O로 3회 헹구면서 각각 30분 내지 60분 동안 담금으로써 TexQ(Texwipe, www.texwipe.com), 그 다음 SporKlenz(Steris, Inc.), 이어서 70% 에탄올로 쿠폰을 3회 세척/소독하였다. 상기 쿠폰을 층류 후드에서 공기 건조하였다. 건조된 쿠폰을 실온에서 멸균 50 ㎖ 원추형 튜브(CELLTREAT Scientific Products; 매사추세츠주 페퍼렐 소재) 내에서 저장하였다.
미생물 감소 어세이. 이 연구를 수행하기 적어도 하루 전에, 챔버의 가능한 위험 표면을 SporKlenz(Steris, Inc. www.steris.com)로 소독하였고 대기 가스를 새로운 3회 여과된 건조 탱크 가스(20% O2, 0.1% CO2, 나머지 N2)로 대체하여 임의의 소독제 연기를 제거하였다. 한 방울의 세균 배양물이 작업 표면을 오염시킨 것처럼 3회 세척/소독된 쿠폰을 PC 바닥 상의 제자리에서 접종하였다. 접종된 쿠폰을 실험 조건에 노출시키고 시간 간격으로 수집하였다. 수거된 쿠폰을 DPBS 중의 1 ㎖ 0.05% Tween-80에 넣고 10초 동안 5회 볼텍싱하였다. 미생물 현탁액을 한천 플레이트에 도말하기 전에 더 희석하였다. 실험 조건을 모르는 2명의 개인이 각각의 플레이트 상의 콜로니를 카운팅하였다. 10% 이상의 불일치 시, 제3자가 콜로니를 재카운팅하였다. 2개의 더 가까운 숫자의 평균을 데이터 분석에 사용하였다. 방정식 Ri= log (Y0) - log (Yi)을 이용하여 로그 감소를 계산하였다. Ri는 각각의 시점에 대한 로그 감소이고, 여기서 Y0는 시간 0에서 남아있는 미생물이고 Yi는 시간 i에서 남아있는 미생물이다. 도면 범례에 기재된 바와 같이 GraphPad Prism(버전 8.4.2, GraphPad Software, Inc.)을 이용하여 모든 통계 분석을 수행하였다. 데이터는 평균 + SEM으로 표시된다. 유의성을 p < 0.05에서 평가하였다.
본 발명의 조건은 미생물 의존적 방식으로 실내 공기 BSC 조건보다 더 큰 미생물 감소를 생성한다. 실험적 가설은 제어된 인클로저 조건과 기존 실내 공기 생물학적 안전 캐비닛(BSC) 조건에서 미생물 감염률의 차이가 있을 것이라는 것이었다. 전술된 쿠폰(폴리프로필렌 또는 스테인리스 스틸)을 각각의 챔버에서 알려진 수의 미생물로 접종하고 본 발명의 조건(37℃/15% RH) 하에서 XVIVO 시스템 처리 챔버, 또는 기존 실내 공기 BSC 조건(21℃/40% RH)으로 설정된 처리 챔버 내에서 인큐베이션하였다. 간격을 두면서 쿠폰을 수집하고 남아있는 생존 가능한 콜로니 형성 단위(CFU)에 대해 어세이하였다. 3회 이상의 독립적인 실험으로부터의 데이터를 조합하여 비교하였다. CFU의 통계적으로 유의미한 로그 감소는 두 가지 상이한 조건에서 5개 미생물 중 4개의 미생물에서 발견되었다. 이 감소는 임의의 항미생물 화학물질을 사용하지 않으면서 물리적 대기 조건에 노출시켰을 때에만 존재하였다.
폴리프로필렌 및 스테인리스 스틸 시험 표면 둘 다에 대해 각각의 조건에서 시간에 따라 회복된 CFU의 차이뿐만 아니라 다양한 시점에서 조건 사이의 차이도 보여주는 데이터는 도 1 내지 5에 제시되어 있다. 슈도모나스 애루기노사(도 1), 칸디다 알비칸스(도 2) 및 스타필로코커스 아우레우스(도 3)는 모두 상기 두 물질들 상에서 본 발명의 조건 및 실내 공기 BSC 조건 둘 다 하에서 연구된 시간 이내에 CFU의 현저하고 유의미한 로그 감소를 나타내었다. 아스퍼길러스 브라실리엔시스에 대한 결과(도 4)는 덜 현저하나 여전히 유의미하였다. 환경 조건에 대한 그의 알려진 내성과 일치하게, 시험된 임의의 조건 하에서 바실러스 서브틸리스 포자의 CFU 감소는 거의 확인되지 않았다(도 5). 각각의 조건에 대한 미생물 반응을 따로 비교하였을 때(도 6), 데이터는 환경 조건에 대한 그의 알려진 민감성과 일치하는, 세포 처리 챔버 조건에 대한 미생물 민감성의 스펙트럼을 명확하게 보여주었다. 이 경향은 시험된 2개의 표면 물질들 사이에 유사하였다. 도 1 내지 4에서 별표(*)는 (시간 0에 비해) 유의미한 군내 차이를 표시하는 반면, 파운드(#)는 이원 ANOVA에 이은 본페로니의 다중 비교 검정에 의해 확인된 유의미한 군간 차이(상이한 조건)를 나타낸다(* 또는 #, p<0.05; ** 또는 ##, p<0.01; *** 또는 ###, p<0.001; ****, p<0.0001).
제어된 환경 챔버의 다양한 습도 수준도 40% RH부터 5% RH까지 조사하였다(도 7). 습도가 감소함에 따라 폴리프로필렌 및 스테인리스 스틸 둘 다에서 CFU의 로그 감소의 유의미한 증가가 명확히 확인된다.
스타필로코커스 아우레우스에 대해 도 6에 나타낸 바와 같이 다양한 온도 수존도 조사하였다. 이 데이터는 21℃부터 37℃까지 온도 증가가 검출되는 CFU의 유의미한 감소를 야기하였음을 보여준다.
실시예 2
XVIVO SYSTEM 인클로저에서 능동 공기 샘플링 및 수동 공기 샘플링(침강 플레이트)을 이용하여 본 발명의 방법으로 급속히 건조한 후 공기 중에 있는 바실러스 서브틸리스를 정량하였다.
도 9 및 10에 도시된 바와 같이 설정된 실험에서, 전면판/공기 흡입구(3a)를 가진 공기 샘플링 기계(3)("PBI Air Sampler SAS Super 100")가 인클로저 바닥(2)을 가진 인클로저 챔버(1)에 설치되어 있다. 원심분리 튜브 마개(5)를 가진 원심분리 튜브(4)를 샘플 입구의 바로 업스트림에 있는 전면판(3a)의 몇 cm 이내에 배치하였다. 추가로, 여러 수동 공기 샘플링 한천 침강 플레이트(6)도 바닥 상에 위치시켰다. 인클로저 챔버 내의 대기 조작 정렬은 챔버에서 가스 유동 난류를 생성하였다.
마개(5)를 작은 방울의 식염수 중의 107 CFU의 바실러스 서브틸리스로 오염시키고 온도 37℃에서 15% RH와 난류 대기를 가진 챔버 내로 이동시켰다. 약 11분이 소요되는 가시적 건조 직후에, 한천 플레이트를 가진 능동 공기 샘플러를 이용하여, 마개(5)로부터 날아갔을 수 있는 임의의 바실러스 서브틸리스를 정량하였다. 바실러스 서브틸리스의 추가 검출은 공기 샘플러(3) 주변의 한천 침강 플레이트(6)의 어레이를 사용하였다. 4시간에 걸쳐 어떤 플레이트에서도 CFU가 검출되지 않았다. 능동 공기 샘플링을 90 L/분으로 설정하고 20분마다 새로운 플레이트로 4시간 동안 유지하였다
이 실험은 표면 상의 급속히 건조된 미생물이, 이 표면의 접촉 시 표면으로부터 표면으로 전달될 것이지만, 제자리에 고정되고 대기의 이동에도 불구하고 용이하게 탈착되지 않고 공기 중에 있게 되지 않는다는 것을 확인시켜주는 수십 개의 다른 실험 결과를 대표한다.
Claims (20)
- 살생물제를 사용하지 않으면서 거의 무균성인 인클로저(enclosure) 장치에서 세포를 무균 처리 및 생산하는 방법으로서,
a. 복수의 챔버를 가진 인클로저 장치 내의 적어도 하나의 챔버가, 원핵 또는 진핵 세포의 최적의 생체외 배양, 생장, 처리 또는 수송에 알맞도록 조정된 거의 무균성인 환경을 제공하고, 여기서 대기 가스, 상대습도(RH), 온도 및 가스 순환이 정밀하게 제어될 수 있는 것;
b. 세포에 최적인 거의 연속적인 유동 대기가 적어도 하나의 챔버 전체에 걸쳐 RH를 혼합하고 균질화하면서, 적어도 하나의 챔버의 RH가 20% 이하로 조절되는 것;
c. 적어도 하나의 챔버의 온도가 37℃, 또는 세포에 최적인 다른 고온으로 조절되는 것
을 포함하며;
d. 적어도 하나의 챔버 내의 RH, 온도 및 유동 대기는, 적어도 하나의 챔버의 내부의 대기에서 부유 또는 현탁되거나 또는 적어도 하나의 챔버의 내부 벽 또는 다른 표면 상의 임의의 미생물의 급속한 건조에 의해 인클로저 장치 내부를 살균 및 청소하는 물리적 항미생물 효과를 유도하며, 그 결과, 적어도 하나의 챔버의 임의의 표면 상의 모든 미생물들이 사멸되거나 부착에 의해 고정됨으로써, 미생물 생식이 방지되고, 부유하거나 공기 중에 있는 생존 가능한 바람직하지 않은 미생물이 검출될 수 없으며;
e. 세포의 배양, 생장, 처리 또는 수송을 위해 요구되는, 적어도 하나의 챔버 내의 임의의 더 높은 RH는, 필요한 최단 지속시간 동안 필요한 수준보다 더 높지 않은 RH 수준으로 제어되고, 이어서 즉시 RH는 20% 이하로 복귀되며;
f. 세포의 배양, 생장, 처리 또는 수송을 위해 요구되는, 적어도 하나의 챔버 내의 임의의 더 낮은 온도는, 필요한 최단 지속시간 동안 필요한 온도보다 더 낮지 않은 온도로 제어되고, 이어서 즉시 세포에 최적화된 37℃의 고온으로 복귀되고;
g. (i) 인클로저 장치의 초기 폐쇄시 및 각각의 주기적 개방과 재폐쇄 후, 인클로저 내의 모든 영역, 대기 및 표면은 급속히 건조되거나; 또는 (ii) 임의의 물질 또는 장치는, 외부 환경으로부터 인클로저 내로 이동될 때, 급속히 건조되어 세포의 생체외 배양에 최적화된 무균성 또는 거의 무균성 환경을 생성 및 유지하는 것인, 살생물제를 사용하지 않으면서 거의 무균성인 인클로저 장치에서 세포를 무균 처리 및 생산하는 방법. - 제1항에 있어서, 상대습도는 15% 이하 또는 10% 이하로 제어되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인클로저 장치는 2개 이상의 상호연결된 챔버, 공동-챔버 및 서브-챔버를 포함하고, 상기 챔버들은 챔버들 사이의 내부 도어에 의해 구획화되고, 영구적으로 연결되거나 일시적으로 연결되며, 일체식 또는 모듈식인 방법.
- 제3항에 있어서, RH, 온도 및 유동 대기는, 인클로저 장치에서 임의의 다른 챔버와 독립적으로 각각의 챔버에 대해 제어되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인클로저 장치는 고정식 또는 이동식인 방법.
- 제1항에 있어서, 인클로저 장치는 강성 또는 연성 벽, 금속 또는 플라스틱 벽, 또는 이들의 임의의 조합으로 제조된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 내부 표면은 소수성 또는 친수성인 방법.
- 제1항에 있어서, 인클로저 장치는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 스테인리스 스틸 및 유리로부터 선택된 물질로 제조된, 인클로저 장치 내의 적어도 하나의 챔버의 내부 표면을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인클로저 장치는, 인클로저 내부의 제어를 손상시키지 않으면서 통로에서 밀봉 또는 반밀봉되어 있고 영구적 또는 일시적이며 벽을 통과하는 기능적 또는 물리적 입구/출구를 구비하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 정밀하게 제어될 수 있는 인클로저 장치 내의 대기 가스는 산소, 질소, 이산화탄소, 산화질소, 일산화탄소를 포함하고; 휘발성 유기 화합물(VOC), 미립자 및 압력은 정밀하게 제어될 수 있는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 인클로저 장치는 0.1% 내지 35% v/v의 산소 수준, 및 0.1% 내지 20% v/v의 이산화탄소 수준을 갖는 인클로저 장치 내의 적어도 하나의 챔버의 대기를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포는 밀봉된 포트를 통과하는 글로브 또는 원격조작기에 의해 수동식으로, 또는 통합된 프로세스 및 분석 기계에 의해, 또는 전부 또는 일부 자동화에 의해 인클로저 내부에서 처리 및 생산되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 세포는 진핵 세포인 방법.
- 제13항에 있어서, 진핵 세포는 포유동물 세포인 방법.
- 제14항에 있어서, 포유동물 세포는 인간 세포인 방법.
- 제1항에 있어서, 건조 내성 미생물의 측정 가능한 CFU(콜로니 형성 단위)는, 인클로저 내부에서 침강 플레이트 또는 능동 공기 샘플링 플레이트를 사용한 환경 모니터링에 의해 측정될 때, 검출되지 않는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 건조에 민감한 미생물의 측정 가능한 CFU(콜로니 형성 단위)는, 침강 플레이트, 능동 공기 샘플링 플레이트 또는 접촉 플레이트를 사용한 환경 모니터링에 의해 측정될 때, 검출되지 않는 것인 방법.
- 살생물제를 사용하지 않으면서 비멸균 인클로저 장치에서 세포를 무균 처리 및 생산하기 위한 환경으로서,
a. 복수의 챔버를 가진 인클로저 장치 내의 적어도 하나의 챔버가, 원핵 또는 진핵 세포의 최적의 생체외 배양, 생장, 처리 또는 수송에 알맞도록 조정된 거의 무균성인 환경을 제공하고, 여기서 대기 가스, 상대습도(RH), 온도 및 가스 순환이 정밀하게 제어될 수 있는 것;
b. 세포에 최적인 거의 연속적인 유동 대기가 적어도 하나의 챔버 전체에 걸쳐 RH를 혼합하고 균질화하면서, 적어도 하나의 챔버의 RH가 20% 이하로 조절되는 것;
c. 적어도 하나의 챔버의 온도가 37℃, 또는 세포에 최적인 다른 고온으로 조절되는 것
을 포함하며;
d. 적어도 하나의 챔버 내의 RH, 온도 및 유동 대기는 적어도 하나의 챔버의 내부의 대기에서 부유 또는 현탁되거나 또는 적어도 하나의 챔버의 내부 벽 또는 다른 표면 상의 임의의 미생물의 급속한 건조에 의해 인클로저 장치 내부를 살균 및 청소하는 물리적 항미생물 효과를 유도하며, 그 결과, 적어도 하나의 챔버의 임의의 표면 상의 모든 미생물이 사멸하거나 또는 부착에 의해 고정됨으로써, 미생물 생식이 방지되고, 부유하거나 공기 중에 있는 생존 가능한 바람직하지 않은 미생물이 검출될 수 없으며;
e. 세포의 배양, 생장, 처리 또는 수송을 위해 요구되는, 적어도 하나의 챔버 내의 임의의 더 높은 RH는, 필요한 최단 지속시간 동안 필요한 수준보다 더 높지 않은 RH 수준으로 제어되고, 이어서 즉시 RH는 20% 이하로 복귀되며;
f. 세포의 배양, 생장, 처리 또는 수송을 위해 요구되는, 적어도 하나의 챔버 내의 임의의 더 낮은 온도는, 필요한 최단 지속시간 동안 필요한 온도보다 더 낮지 않은 온도로 제어되고, 이어서 즉시 세포에 최적인 37℃의 고온으로 복귀되고;
g. (i) 인클로저 장치의 초기 폐쇄시 및 각각의 주기적 개방과 재폐쇄 후, 인클로저 내의 모든 영역, 대기 및 표면은 급속히 건조되거나; 또는 (ii) 임의의 물질 또는 장치는, 외부 환경으로부터 인클로저 내로 이동될 때, 급속히 건조되어 세포의 생체외 배양에 최적화된 무균성 또는 거의 무균성 환경을 제공 및 유지하는 것인, 살생물제를 사용하지 않으면서 비멸균 인클로저 장치에서 세포를 무균 처리 및 생산하기 위한 환경. - 제18항에 있어서, 건조 내성 미생물의 측정 가능한 CFU(콜로니 형성 단위)는, 인클로저 내부의 침강 플레이트 또는 능동 공기 샘플링 플레이트를 사용한 환경 모니터링에 의해 측정될 때, 검출되지 않는 것인 환경.
- 제18항에 있어서, 건조에 민감한 미생물의 측정 가능한 CFU(콜로니 형성 단위)는, 침강 플레이트, 능동 공기 샘플링 플레이트 또는 접촉 플레이트를 사용한 환경 모니터링에 의해 측정될 때, 검출되지 않는 것인 환경.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201962924322P | 2019-10-22 | 2019-10-22 | |
| US62/924,322 | 2019-10-22 | ||
| PCT/US2020/056836 WO2021081188A1 (en) | 2019-10-22 | 2020-10-22 | Aseptic cell processing and production with no chemical biocides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220104704A KR20220104704A (ko) | 2022-07-26 |
| KR102596110B1 true KR102596110B1 (ko) | 2023-10-30 |
Family
ID=75620303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020227016801A KR102596110B1 (ko) | 2019-10-22 | 2020-10-22 | 화학적 살생물제를 사용하지 않는 무균 세포 처리 및 제조 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11326140B2 (ko) |
| EP (1) | EP4048775A4 (ko) |
| JP (1) | JP7409717B2 (ko) |
| KR (1) | KR102596110B1 (ko) |
| CN (1) | CN114945658B (ko) |
| AU (1) | AU2020370270B2 (ko) |
| BR (1) | BR112022007106A2 (ko) |
| CA (1) | CA3150905A1 (ko) |
| IL (1) | IL292223B2 (ko) |
| MX (1) | MX2022004705A (ko) |
| WO (1) | WO2021081188A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2020370270B2 (en) * | 2019-10-22 | 2024-01-11 | Biospherix Ltd | Aseptic cell processing and production with no chemical biocides |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3203002B2 (ja) * | 1991-01-23 | 2001-08-27 | カヤバ工業株式会社 | 位置制御装置 |
| KR101656732B1 (ko) * | 2015-03-05 | 2016-09-19 | 한소 주식회사 | 멸균 방법 및 이를 이용한 장치 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5482684A (en) * | 1994-05-03 | 1996-01-09 | Abtox, Inc. | Vessel useful for monitoring plasma sterilizing processes |
| US6297047B1 (en) * | 1999-08-25 | 2001-10-02 | Spx Corporation | Ultraviolet sterilization of CO2 cell-culture incubator internal environments |
| US20030092178A1 (en) * | 2001-11-15 | 2003-05-15 | Biospherix, Ltd. | Cell culture incubator with dynamic oxygen control |
| DE502004010672D1 (de) * | 2004-01-06 | 2010-03-11 | Thermo Electron Led Gmbh | Klimagerät mit keimdicht abgetrennten Bereichen |
| JP4606971B2 (ja) | 2005-08-19 | 2011-01-05 | 株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモ | チケット流通仲介装置、チケット流通仲介システム、及びチケット流通仲介方法 |
| JP5243038B2 (ja) * | 2005-11-01 | 2013-07-24 | 株式会社メディネット | 細胞培養装置 |
| WO2010047672A1 (en) | 2008-10-20 | 2010-04-29 | Rao Chamkurkishtiah P | Self-cleaning and sterilizing endotracheal and tracheostomy tube |
| EP2571534B1 (en) | 2010-05-20 | 2018-10-10 | Automatic Bar Controls, Inc. | Ultraviolet disinfecting device for beverage dispensers |
| US9056148B2 (en) | 2010-10-27 | 2015-06-16 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Method and apparatus for disinfecting and/or self-sterilizing a stethoscope using plasma energy |
| JP5852792B2 (ja) * | 2011-04-28 | 2016-02-03 | パナソニックヘルスケアホールディングス株式会社 | アイソレータ、培養物の移動方法 |
| KR20120124153A (ko) * | 2011-05-03 | 2012-11-13 | 한신메디칼 주식회사 | 건열 멸균 배양 장치 |
| IN2014KN02959A (ko) * | 2012-06-22 | 2015-05-08 | Suganit Systems Inc | |
| JP6121299B2 (ja) * | 2013-09-25 | 2017-04-26 | 東京エレクトロン株式会社 | 自動培養システム及び自動培養装置 |
| CN107922904A (zh) * | 2015-03-31 | 2018-04-17 | 兴盛生物科技股份有限公司 | 用于产生自体细胞疗法的细胞保持器 |
| JP2019013151A (ja) * | 2015-11-27 | 2019-01-31 | 東京エレクトロン株式会社 | 細胞培養システム |
| JP3203002U (ja) * | 2015-12-21 | 2016-03-03 | バイオメディカ・ソリューション株式会社 | 細胞培養システム |
| KR101912197B1 (ko) * | 2017-02-22 | 2018-10-26 | 주식회사 이뮤니스바이오 | 무인무균 자동 세포 배양 장치 |
| JP6886693B2 (ja) * | 2017-05-15 | 2021-06-16 | 株式会社エアレックス | インキュベータ |
| JP6409237B1 (ja) * | 2017-06-14 | 2018-10-24 | 株式会社伸光テクノス | 加水分解処理装置及び加水分解処理システム |
| AU2019297436A1 (en) * | 2018-07-03 | 2021-01-21 | Advanced Solutions Life Sciences, Llc | Modular storage units for perfusion and/or incubation of one or more specimens and storage assemblies |
| AU2020370270B2 (en) * | 2019-10-22 | 2024-01-11 | Biospherix Ltd | Aseptic cell processing and production with no chemical biocides |
-
2020
- 2020-10-22 AU AU2020370270A patent/AU2020370270B2/en active Active
- 2020-10-22 WO PCT/US2020/056836 patent/WO2021081188A1/en unknown
- 2020-10-22 CN CN202080073132.0A patent/CN114945658B/zh active Active
- 2020-10-22 KR KR1020227016801A patent/KR102596110B1/ko active IP Right Grant
- 2020-10-22 BR BR112022007106A patent/BR112022007106A2/pt unknown
- 2020-10-22 EP EP20879105.3A patent/EP4048775A4/en active Pending
- 2020-10-22 IL IL292223A patent/IL292223B2/en unknown
- 2020-10-22 CA CA3150905A patent/CA3150905A1/en active Pending
- 2020-10-22 MX MX2022004705A patent/MX2022004705A/es unknown
- 2020-10-22 JP JP2022523273A patent/JP7409717B2/ja active Active
-
2021
- 2021-02-19 US US17/179,468 patent/US11326140B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-18 US US17/658,439 patent/US20220235310A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3203002B2 (ja) * | 1991-01-23 | 2001-08-27 | カヤバ工業株式会社 | 位置制御装置 |
| KR101656732B1 (ko) * | 2015-03-05 | 2016-09-19 | 한소 주식회사 | 멸균 방법 및 이를 이용한 장치 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2020370270B2 (en) | 2024-01-11 |
| CN114945658B (zh) | 2023-05-16 |
| MX2022004705A (es) | 2023-02-14 |
| US20220235310A1 (en) | 2022-07-28 |
| EP4048775A4 (en) | 2023-07-26 |
| AU2020370270A1 (en) | 2022-03-24 |
| WO2021081188A1 (en) | 2021-04-29 |
| KR20220104704A (ko) | 2022-07-26 |
| US20210171894A1 (en) | 2021-06-10 |
| US11326140B2 (en) | 2022-05-10 |
| JP2023502196A (ja) | 2023-01-23 |
| BR112022007106A2 (pt) | 2022-08-02 |
| JP7409717B2 (ja) | 2024-01-09 |
| IL292223B1 (en) | 2023-07-01 |
| IL292223A (en) | 2022-06-01 |
| IL292223B2 (en) | 2023-11-01 |
| CA3150905A1 (en) | 2021-04-29 |
| EP4048775A1 (en) | 2022-08-31 |
| CN114945658A (zh) | 2022-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2006115798A (ja) | オートクレーブ滅菌を利用した自動細胞培養装置及びその使用方法 | |
| KR102596110B1 (ko) | 화학적 살생물제를 사용하지 않는 무균 세포 처리 및 제조 | |
| Hornschuh et al. | In vitro evaluation of contact-active antibacterial efficacy of Ti-Al-V alloys coated with the antimicrobial agent PHMB | |
| KR200488937Y1 (ko) | 문화재 보존을 위한 공기정화 및 유해미생물 제거용 공기소독장치 | |
| Medina-Cordoba et al. | Evaluation of the efficacy of a hydrogen peroxide disinfectant | |
| Kumar et al. | Basic concepts of sterilization techniques | |
| Nakamura | Sterilization efficacy of ultraviole i irradiation on microbial | |
| Shareef et al. | Sterilization of culture media for microorganisms using a microwave oven instead of autoclave | |
| Taran et al. | Plasma-chemical methods for control of biotic contaminants | |
| RU2577995C1 (ru) | Способ элиминации бактериальных инфекций при культивировании клеточных культур растений с использованием наночастиц серебра | |
| CN110721326A (zh) | 一种实验室多功能消毒清洗机制造及应用 | |
| Markova et al. | Isolation of bacteria of the family Enterobacteriaceae from plant tissues | |
| Rogers et al. | Large-scale inactivation of Bacillus anthracis Ames, Vollum, and Sterne spores using vaporous hydrogen peroxide | |
| Dangariya et al. | Detection and identification of microbial contaminants from plant tissue culture | |
| He et al. | Temperature and relative humidity control to reduce bioburden in a closed cell processing and production system without disinfectants | |
| RU2676330C1 (ru) | Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro | |
| RU2773465C1 (ru) | Дезинфицирующее средство для дезобработки с использованием генератора горячего тумана | |
| McDonnell | Biocides: Modes of action and mechanisms of resistance | |
| Jammalamadaka et al. | ARE YOUR CLEANROOM SANITIZATION PROCEDURES ADEQUATE? | |
| Roy et al. | EFFICIENCY DETERMINATION OF COMMONLY USED DISINFECTANTS OVER SEVEN DAYS OF STORAGE. | |
| Beran et al. | Viability of phytopathogenic bacteria after low-temperature plasma treatment | |
| Bhakta et al. | Microbial Control in Greenhouses by Spraying Slightly Acidic Electrolyzed Water. Horticulturae 2023, 9, 81 | |
| Richter et al. | A novel approach for conducting room-scale vaporous hydrogen peroxide decontamination of virulent Bacillus anthracis spores | |
| Bates et al. | Thermo Scientific Cell Locker System Prevents Entry of Microorganisms for Protection of Sensitive Cell Cultures | |
| Zhiburt et al. | Technologies for control of cleanness of rooms in blood centers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |