RU2676330C1 - Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro - Google Patents
Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro Download PDFInfo
- Publication number
- RU2676330C1 RU2676330C1 RU2018112057A RU2018112057A RU2676330C1 RU 2676330 C1 RU2676330 C1 RU 2676330C1 RU 2018112057 A RU2018112057 A RU 2018112057A RU 2018112057 A RU2018112057 A RU 2018112057A RU 2676330 C1 RU2676330 C1 RU 2676330C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- decontamination
- radiation
- media
- vitro
- animal cells
- Prior art date
Links
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 title abstract description 37
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 24
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 15
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 14
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 13
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 7
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UPCOSYBELNEQAU-UHFFFAOYSA-L (2-decoxy-2-oxoethyl)-[2-[(2-decoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]ethyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCC UPCOSYBELNEQAU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Natural products N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002729 catgut Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003608 radiolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- -1 syringes Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/02—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using physical phenomena
- A61L2/08—Radiation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Apparatus For Disinfection Or Sterilisation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и предназначено для культивирования животных клеток in vitro при производстве вирус-вакцин. Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro состоит в том, что предварительно перед облучением питательные среды подвергают термической обработке путем нагревания до температуры 55-60°С в течение 25-30 мин, а облучение проводят в дозе (0,8-1,5)×10Гр гамма-лучами. Использование изобретения позволяет повысить эффективность деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro. 4 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве вирус вакцин.
Известен способ деконтаминации питательных сред с использованием антибиотиков - бензилпенициллина, стрептомицина и канамицина по 100 Ед/мл (см. кн. Животная клетка в культуре // Методы и применение в биотехнологии / Под общ. ред. проф. Дьяконова Л.П. - М.: Издательство "Спутник+", 2009. - с. 423).
Известен также способ деконтаминации перевиваемых линий клеток ПГ-80 и СПЭВ с использованием ПАВ (этоний) в дозе 7,5 мкг/мл с тетрациклином (50 мкг/мл) и канамицином (250 мкг/мл).
Общим недостатком указанных способов деконтаминации питательных сред и культур клеток является, во-первых, токсичность используемых деконтаминантов (антибиотиков) для культур клеток и, во-вторых, привыкание к известным антибиотикам, что ведет к снижению эффективности их применения.
Между тем из области радиационной микробиологии известно бактерицидное действие ионизирующих излучений. Последующие исследования радиобиологов показали возможность практического использования бактерицидного действия радиации для стерилизации различных изделий медицинского назначения.
Стерилизация (деконтаминация), проводимая с помощью ионизирующего излучения, получила название радиационной или лучевой стерилизации. Ввиду того, что лучевая деконтаминация проводится без высокой температуры, она была названа также холодной стерилизацией.
Благодаря высокой проникающей способности гамма - излучения радиоактивных изотопов и других видов ионизирующего излучений, оказалось возможными стерилизовать медицинскую продукцию (лекарственные средства, шприцы, кетгут, шовный материал, посуду, сыворотки крови, питательные среды и т.д.) в промышленных масштабах. Используемые для радиационной стерилизации дозы излучения рассчитаны на бактерицидной эффект, гарантирующий надежное обеспечение деконтаминации.
Действие ионизирующей радиации на живую клетку (животную, растительную, микробную) основано на разложении (радиолиз) молекул воды, содержащейся в живых клетках, на ионы H2O+ и H2O-, которые, расщепляясь на свободные радикалы Н- и ОН-, обладают высокой токсичностью. Последние, взаимодействия с живой клеткой, вызывают глубокие изменения (распад ДНК, нуклеиновых кислот, ферментов, полисахаридов, пептидов, аминокислот, липидов, белков), которые приводят к разрушению и гибели клетки, что дает возможность использования их для инактивации животных, растительных и микробных клеток.
Учитывая перспективность использования ионизирующих излучений в медицине, в 1960-1970 гг. были проведены радиомикробиологические исследования в этой области, результаты которых показали, что облучение питательных сред гамма-лучами в дозах 10-30 кГр обеспечивает абсолютную стерильность питательных сред (см. кн. М.А. Туманяна и Д.А. Каушанского "Радиационная стерилизация". - М.: Медицина, 1974. - С. 66-91).
Наиболее близким к предлагаемому является способ деконтаминации сухих питательных сред (среда 199, среда Игла, гидролизата лактоальбумина-ГЛА, версена, Дульбекко, трипсина) с использованием деконтаминанта физической природы - гамма-лучей в дозах (1,5-6,5)×104 Гр (см. статью И.Д. Сперанской "Радиационная стерилизация питательных сред" // Сб. научн. тр. ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. - М., 1977. С. 67-68).
Несмотря на то, что питательные среды, простерилизованные (деконтаминированные) гамма-лучами, хотя и не утрачивали биологических свойств, необходимых для культур клеток, однако используемые для деконтаминации дозы гамма лучи очень высокие, а это приводит к увеличению времени облучения. Так, если мощность экспозиционной дозы излучения используемых радиационных установок не превышает 10 Р/мин, то для полной стерилизации питательных сред в дозах 1,5-60 кГр необходимо 14 часов непрерывного облучения, а это создает довольно серьезную как техническую задачу, так и радиационную опасность для обслуживающего персонала. Поэтому возникает необходимость поиска менее жестких условий облучения стерилизуемых (деконтаминируемых) питательных сред.
Известно, что одним из существенных факторов повышения эффективности радиостерилизации (радиодеконтаминации) является использование комбинированного радиационно-термического воздействие на микроорганизмы.
Так, на примере спорообразующего микроорганизма - возбудителя ботулизма (Cl. botulnus) установлено, что прогревание спор возбудителя резко повышает гибель микробных клеток (см. кн. М.А. Туманяна, Д.А. Каушанского - "Радиационная стерилизация". - М.: Медицина, 1974. - С. 30-31). Эти данные подтверждают гипотезу, согласно, который низкая температура снижает образование окисленных веществ и диффузию их к чувствительным участкам клетки, а предварительный нагрев питательных сред перед облучением может существенно снизить радиорезистентность бактерий, усиливая их бактерицидное действие.
Полученные данные позволяют предположить их синергетическое действие на фоне комбинированного воздействия - температуры и ионизирующего излучения. О действии губительных доз радиации в комбинации с температурным воздействием существует несколько гипотез. Согласно одной из них, нагревание приводит молекулы в состояние возбуждения, что усиливает действие радиации, облегчая денатурацию белков клетки; согласно другой - усиление действия радиации при одновременном нагревании объясняется проявлением кислородного эффекта, при этом кислород соединяется со свободными радикалами, образуя комплексы, смертельные для клеток (см. кн. M.A. Tumanjan. - Radiosterilisation of Meniral Products - IAEA, Vienna, 1967. - P. 199). Можно предположить, что при этом имеют место изменения химических реакций, которые возникают в клетке при повышении или понижении температуры, в результате которых образуются вещества, которые повреждают или защищают важные компоненты клетки, что способствует усилению действия радиации.
Вышеизложенное явилось основанием для проведения исследований по разработке способа деконтаминации питательных сред для культивирования клеток in vitro с использованием комбинированного термо-радиационного метода обработки питательных сред.
Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего эффективную деконтаминацию питательных сред, используемых в биотехнологии для культивирования клеток животных in vitro с целью получения на них вирус - вакцин и позволяющего снизить дозы, время облучения и обеспечить радиационную безопасность обслуживающего персонала.
Поставленная задача решается тем, что в способе деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro, предусматривающим облучение их гамма-лучами, предварительно перед облучением питательные среды подвергают термической обработке путем нагрева до температуры 55-60°С в течение 25-30 мин, а облучение проводят в дозе (0,8-1,5)×103 Гр. Способ осуществляют следующим образом.
Питательные среды различного состава (безбелковые: синтетические 199, минимальные - MEM), белковые: гидролизат лактоальбумина - ГЛА, сыворотка крупного рогатого скота - (СКРС), наиболее часто применяемые в биотехнологии для культивирования животных клеток in vitro с целью изготовления на их основе вирусвакцин, разливают во флаконы по 100-200 см3, и предварительно перед облучением подвергают термическому воздействию путем нагревания в сушильном шкафу или на водяной бане до температуры 55-60°С в течение 25-30 мин. По истечении указанной экспозиции подогретые питательные среды подвергают облучению в дозах (0,8-1,5)×103 Гр путем облучения на гамма установке "Исследователь" с источником излучения 60Со при мощности дозы излучения 3,45×102 А/кг. Подвергнутые комбинированному термо-радиационному воздействию питательные среды проверяют на стерильность путем высева их на бактериологические среды: мясопептонный бульон - МПБ и мясопептонный агар - МПА в количестве 0,5 мл, посевы культивируют в течение 7 сут, проводя ежедневные просмотры посевов, регистрируя количество выросших колоний на бактериологических средах.
Степень деконтаминации подвергнутых термо-радиационному воздействию питательных сред определяют по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в бактериологических средах.
Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Определение оптимальной дозы гамма-лучей, обеспечивающей деконтаминацию питательных сред при спонтанной (случайной) контаминации их микроорганизмами.
Учитывая, что питательные среды в технологическом процессе (при транспортировке, длительном хранении, нарушении стерильности в процессе подготовки к использовано и т.д.) могут быть контаминированы различными видами микроорганизмов: бактерии, кокки, грибы, микоплазмы, проводили опыты по определенно оптимальной стерилизирующей (деконтаминирующей) дозы гамма-лучей.
Для этой цели использовали безбелковые (синтетическую среду 199 и минимальную среду - MEM) и белковые (сыворотку крупного рогатого скота - СКРС и гидролизат лактоальбумина - ГЛА) питательные среды, которые разливали во флаконы, закупоривали резиновыми пробками и размещали в облучательную камеру гамма-установки "Исследователь" и подвергали облучению в дозах 5×102, 1×103, 2×103, 4×103, 8×103, 1×104, 1,5×104, 2×104 Гр. Облученные в вышеуказанных дозах питательные среды подвергали бактериологическими исследованиям путем высева проб из каждой среды по 1 мл на мясо-пептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ) с последующим термостатированием бактериальных сред в течение 7 суток и с последующей регистрацией количества выросших колоний.
Степень деконтаминации облученных питательных сред определяли путем микроскопирования препаратов по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в исследуемых пробах.
Установлено, что в пробах из безбелковых питательных, облученных в дозах 0,8×103, 1,0×104 и 1,5×104 Гр роста микроорганизмов не наблюдалось, в то время как в пробах, из питательных сред, облученных в дозах 1×103, 5×102, 2×103, 4×103 Гр обнаружен рост единичных колоний микроорганизмов.
Результаты параллельных микробиологических исследований по радиодеконтаминации белковых питательных сред (СКРС, ГЛА) показали, что надежная стерилизация их наступала при облучении в дозах 1,5×104 - 2×104 Гр.
Следовательно, надежное обеззараживание (деконтаминация) безбелковых и белковых питательных сред при случайной контаминации их микроорганизмами достигается при облучении их гамма-лучами в дозах 8×103 - 2×104 Гр.
Пример 2. Определение оптимальных деконтаминирующих доз гамма-лучей при искусственной контаминации питательных сред аспорогеными и спорогенными видами микроорганизмов.
Поскольку при спонтанной (случайной) контаминации питательных сред концентрация микробных клеток может быть весьма низкой (единичные колонии), в определенных условиях (нарушение условий хранения, нарушение стерильности при хранении, отключение холодильников, попадание влаги в емкости и т.д.), попавшие в питательные среды контаминанты, активно размножаясь в питательных средах (особенно - в белковых), могут создать высокую концентрацию микробов, что диктует необходимость подбора оптимальных режимов деконтаминации.
С учетом изложенного, были поставлены опыты радиационной деконтаминации питательных сред при их искусственной контаминации аспорогенными и спорогенными микроорганизмами, обладающими различной радиорезистентностью.
Для этой цели, питательные среды, указанные в примере 1, подвергали искусственной контаминации путем внесения в питательные среды аспорогенных (St. aureus) и спорогенных (B. subtilis) микроорганизмов, обладающих высокой и весьма высокой резистентностью по отношению к химическим (антибиотики, дезинфектанты) и физическим (ионизирующие излучения) агентам. Искусственную контаминацию питательных сред проводили путем внесения вышеуказанных микроорганизмов в питательные среды в концентрации 1×107 микробных клеток на 1 мл питательной среды. Облучение искусственно контаминированных питательных сред (199, MEM, ГЛА и СКРС) проводили в дозах гамма-лучей 1,0×104, 2,0×104 и 3,0×104 Гр. Дальнейшую обработку питательных сред, микробиологические исследования и определение степени деконтаминации питательных сред проводили согласно примеру 1.
Установлено, что надежная деконтаминация искусственно контаминированных питательных сред, контаминированных St. aureus, достигалась при облучении их гамма-лучами в дозах 1×104 - 2×104 Гр (среда 199, MEM, ГЛА и СКРС) и 3×104 Гр (все среды контаминированные B. subtilis.
Следовательно, надежное обеззараживание (деконтаминация) питательных сред, контаминированных аспорогенной микрофлорой (St. aureus) достигается при облучении гамма-лучами в дозах (1-2)×104 Гр, а контаминированных радиорезистентными спорогенными микроорганизмами (B. subtilis) - при облучении в дозах (2-3,0)×104 Гр.
Пример 3. Изучение комбинированного действия повышенной температуры и ионизирующего излучения на наиболее вероятные контаминанты питательных сред.
Учитывая, что наиболее часто встречающимися контаминантами питательных сред являются стафилококки, кишечная палочка и сенная палочка, проводили опыты с культурой стафилококков, обладающих значительной термо-, химио-, радиорезистентностью.
Для этой цели готовили взвесь клеток St. aureus на физиологическом растворе, содержащую 1×107 стафилококков в 1 мл. Облучение клеток производили гамма-излучением 60Со в дозах 0,8×103 Гр, 1,0×103 Гр, 1,5×103 Гр. Одновременно флаконы с бактериями нагревали в сушильном шкафу при 45°, 50°, 55° и 60°С в течение 15, 20 и 30 мин. Эффективность комбинированного терморадиационного метода воздействия на испытуемые микробы определяли по выживаемости стафилококков путем учета выросших на питательном агаре в чашках Петри колоний.
Установлено, что полный бактерицидный эффект для 100% микробов наступал при предварительном нагревании питательных сред в течение 20-30 мин при температуре 55-60°С и облучении в дозе 1,5×103 Гр.
Полученные данные позволяют предположить синергетическое действие двух агентов физической природы (температуры и ионизирующего излучения), которые послужили основанием для проведения опытов по использованию комбинированного радиационно-термического метода стерилизации (деконтаминации) питательных сред, используемых в биотехнологии для культивирования на них животных клеток in vitro и выращивания на них вирусов с целью изготовления вирус - вакцин.
Пример 4. Проверка эффективности комбинированного терморадиационного метода деконтаминации питательных сред, используемых в биотехнологии для выращивания культур клеток животных in vitro.
Для этого питательные среды (199, MEM, ГЛА и СКРС), разлитые во флаконы емкостью 100 см3, перед облучением нагревали в сушильном шкафу при температуре 40°, 45°, 50°, 55°, и 60°С в течение 15, 20, 25, 30 мин, а затем подвергали облучению гамма-лучами 60Со в дозах 1×102, 2×103, 4×102, 8×102, 0,8×103, 1×103, 1,5×103, 2×103, 4×103, 8×103, 1×104 Гр.
Подвергнутые комбинированному терморадиационному воздействию питательные среды проверяли на стерильность (степень деконтаминации) путем высева проб из этих сред на бактериологические среды (МПА, МПБ) в количестве 0,5 мл, посевы культивировали в течение 7 сут, проводя ежедневные просмотры, регистрируя количество выросших колоний на бактериологических средах.
Установлено, что питательные среды, нагретые перед облучением до температуры 55-60°С в течение 25-30 мин, а затем облученные гамма-лучами в дозах (0,8-1,5)×103 Гр, оказались стерильными, поскольку в бактериологических средах роста микроорганизмов не обнаруживалось. Изменение указанных параметров терморадиационного воздействия в сторону снижения доз приводило к ослаблению степени деконтаминации, а увеличения их - к ухудшению питательных свойств деконтаминированных сред.
Таким образом, предлагаемый способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro позволяет обеспечить надежную стерилизацию питательных сред, снизить дозы облучения в 13,3 раза по сравнению с только облучением, сократить время облучения в 2 раза и обеспечить безопасность работы обслуживающего персонала.
Claims (1)
- Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro, предусматривающий облучение их гамма-лучами, отличающийся тем, что предварительно перед облучением питательные среды подвергают термической обработке путем нагревания их при температуре 55-60°С в течение 25-30 мин, а облучение проводят в дозе (0,8-1,5)×103 Гр.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018112057A RU2676330C1 (ru) | 2018-04-03 | 2018-04-03 | Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018112057A RU2676330C1 (ru) | 2018-04-03 | 2018-04-03 | Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2676330C1 true RU2676330C1 (ru) | 2018-12-28 |
Family
ID=64958567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018112057A RU2676330C1 (ru) | 2018-04-03 | 2018-04-03 | Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2676330C1 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1836104A3 (ru) * | 1990-06-05 | 1993-08-23 | Vladimir N Chupis | Cпocoб ctepилизaции пиtateльhыx cpeд b kohteйhepax |
| RU2059417C1 (ru) * | 1992-10-01 | 1996-05-10 | Данилевич Василий Николаевич | Способ стерилизации питательных сред |
| RU2161649C2 (ru) * | 1999-03-15 | 2001-01-10 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата |
| RU2477311C2 (ru) * | 2010-11-17 | 2013-03-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) | Способ стерилизации жидких питательных сред для культивирования биомассы |
-
2018
- 2018-04-03 RU RU2018112057A patent/RU2676330C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1836104A3 (ru) * | 1990-06-05 | 1993-08-23 | Vladimir N Chupis | Cпocoб ctepилизaции пиtateльhыx cpeд b kohteйhepax |
| RU2059417C1 (ru) * | 1992-10-01 | 1996-05-10 | Данилевич Василий Николаевич | Способ стерилизации питательных сред |
| RU2161649C2 (ru) * | 1999-03-15 | 2001-01-10 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Способ получения жидкой стерильной питательной среды на основе ферментативного гидролизата |
| RU2477311C2 (ru) * | 2010-11-17 | 2013-03-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство образования и науки Российской Федерации (Минобрнауки России) | Способ стерилизации жидких питательных сред для культивирования биомассы |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Moorer et al. | Evidence for antibacterial activity of endodontic gutta-percha cones | |
| Najdovski et al. | The killing activity of microwaves on some non-sporogenic and sporogenic medically important bacterial strains | |
| Yaldiz et al. | Effect of sterilization methods on the mechanical stability and extracellular matrix constituents of decellularized brain tissues | |
| Darmady et al. | Radiation sterilization | |
| Kumar et al. | Basic concepts of sterilization techniques | |
| RU2676330C1 (ru) | Способ деконтаминации питательных сред для культивирования животных клеток in vitro | |
| Kodoth et al. | The effects of ultraviolet light on Escherichia coli | |
| Tweij-Thu-Alfeqar Razzaq et al. | Sterilization of Surgical Tools: Removing Bacterial Endospores with a Combination of Povidone-iodine, Chlorhexidine Gluconate, Ethanol, and Methanol | |
| Shareef et al. | Sterilization of culture media for microorganisms using a microwave oven instead of autoclave | |
| Ashok et al. | Sterilization for biological products | |
| Attri et al. | Sterilization in bioprocesses | |
| Nguyen et al. | Validation of 15 kGy as a radiation sterilisation dose for bone allografts manufactured at the Queensland Bone Bank: application of the VD max 15 method | |
| RU2435864C1 (ru) | Способ пробиотической обработки клеток с содержащимися в них мелкими непродуктивными животными в условиях ветеринарного госпиталя | |
| Baggini | Sterilization in Microbiology | |
| RU2683684C1 (ru) | Способ восстановления активности защитных биопрепаратов после транспортировки, длительного или неправильного хранения | |
| Tarpley et al. | RADIATION STERILIZATION I: The Effect of High Energy Gamma Radiation from Kilocurie Radioactive Sources on Bacteria | |
| Thiyagarajan et al. | Portable plasma medical device for infection treatment | |
| RU2000811C1 (ru) | Способ стерилизации и дезинфекции медицинского оборудовани | |
| RU2098134C1 (ru) | Способ инактивации инфекционной активности возбудителей кишечных инфекций и вакцина для иммунизации животных | |
| RU2806168C2 (ru) | Применение растворов фотосенсибилизаторов в бактерицидных целях для обработки тушек птиц | |
| Makwana et al. | PHARMACEUTICAL MICROBIOLOGY | |
| RU2577995C1 (ru) | Способ элиминации бактериальных инфекций при культивировании клеточных культур растений с использованием наночастиц серебра | |
| Vaideanu et al. | Microbiological efficiency tests of the cosmetic tools disinfection procedures | |
| Tasnim et al. | Isolation and characterization of bacteria from human amniotic membrane and determination of radiation sensitivity of isolates | |
| Sharma et al. | Sterilization Techniques used in Fermentation Processes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200404 |